JPH11318465A

JPH11318465A - 白紋羽病菌の特異的検出法

Info

Publication number: JPH11318465A
Application number: JP10138388A
Authority: JP
Inventors: Satoko Kanematsu; 聡子兼松; Yoshihiro Otsu; 善弘大津
Original assignee: NATL INST OF FRUIT TREE SCIENC; NATL INST OF FRUIT TREE SCIENCE
Current assignee: NATL INST OF FRUIT TREE SCIENC; NATL INST OF FRUIT TREE SCIENCE
Priority date: 1998-05-20
Filing date: 1998-05-20
Publication date: 1999-11-24
Anticipated expiration: 2018-05-20
Also published as: JP2923778B1

Abstract

(57)【要約】【課題】白紋羽病菌の特異的検出法の提供。【解決手段】白紋羽病菌ロセリニア・ネカトリックス
(Rosellinia necatrix）の5.8sリボソームRNAをコード
する遺伝子を含むDNA、白紋羽病菌以外のロセリニア属
菌の5.8sリボソームRNAをコードする遺伝子を含むDNA、
白紋羽病菌に特異的な配列を有するDNAプライマー、該
プライマーを用いて、白紋羽病菌の5.8sリボソームRNA
をコードする遺伝子を含むDNAを増幅することを特徴と
する白紋羽病菌の検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、白紋羽病菌の5.8s
リボソ−ムRNAをコードする遺伝子を含むDNA、該DNAを
特異的かつ迅速に検出および同定するためのプライマー
セット、白紋羽病菌の検出方法、並びに白紋羽病菌の検
出用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】白紋羽病菌ロセリニア・ネカトリックス
(Rosellinia necatrix)は土壌伝染性の糸状菌であり、
果樹を含む主に樹木の根を腐朽させ枯死にいたらしめ
る。白紋羽病菌はヨーロッパ、中東、アメリカなど世界
中の温帯地域に広く分布しており、ナシ、リンゴ、ブド
ウ、キーウィフルーツなどの果樹栽培における大きな生
産阻害要因の一つとなっている。白紋羽病菌は土壌中の
植物残査上で増殖し、根に感染するため、感染場面を見
出し適切な防除を行うことは極めて困難である。

【０００３】また、白紋羽病菌は、土壌中で疑似菌殻と
いう耐久体をつくり、数年間生存が可能なため、発病の
前歴がある畑に果樹苗を栽植する際には、土壌中に白紋
羽病菌が存在しないことを確認する必要がある。白紋羽
病菌の簡易同定法としては、菌糸を検鏡し、白紋羽病菌
が持つ菌糸隔壁部の洋なし型の膨らみを観察する検鏡法
[日本蚕糸学会誌 33：161〜166(1964)]や、アニリンブ
ルー含有培地で培養すると白紋羽病菌は培地を黄変させ
る性質を利用した培養法[日本蚕糸学会誌 47：519-526
(1978)]がある。

【０００４】しかしながら、検鏡法の場合、菌糸が若い
段階では隔壁部に洋なし型菌糸を作らないことや成熟し
た菌体でも菌株によっては洋なし型菌糸を作りにくいも
のがあること、また培養法の場合、白紋羽病菌以外の糸
状菌においても、培地を黄変させる菌が存在し誤検出を
招くおそれのあることなどから、いずれの手法も白紋羽
病菌を正確に検出することが困難であり、信頼性のある
結果が得られにくい。現在までに白紋羽病菌の分類基準
である胞子形態が確認された菌株が少ないため、現在白
紋羽病菌として扱われているものが、本当に同種である
のか否かなどの、種内分化についてはほとんど検討され
ておらず、分離株の中には、コロニー形態が非常に特異
なものも含まれることがある。

【０００５】さらに、同属多種とされているものの中
に、子のう胞子などの形態において、白紋羽病菌との違
いがほとんど認められない菌も存在する[Francis, S.
M.：Sydowia 38：75-86(1985)，江塚昭典ら：茶業研究
報告40:26-30(1973)]などの分類上の混乱もある。そこ
で、白紋羽病菌の種内分化を明らかにするとともに、白
紋羽病菌を特異的、かつ迅速に検出・同定する手段の開
発が強く望まれていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、白紋羽病菌
の5.8sリボソ−ムRNAをコードする遺伝子を含むDNA、該
DNAを特異的かつ迅速に検出および同定するためのプラ
イマーセット、白紋羽病菌の検出方法、並びに白紋羽病
菌の検出用キットを提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、白紋羽病菌の
5.8sリボソ−ムRNAをコードする遺伝子を含むDNAを単離
し、さらに白紋羽病菌を迅速、高感度に検出し得るプラ
イマーを作製することに成功し、本発明を完成するに至
った。すなわち、本発明は、配列番号１〜４で表される
いずれかの塩基配列を含むDNAである。さらに、本発明
は、配列番号１〜４で表されるいずれかの塩基配列から
なるDNAの少なくとも一部とハイブリダイズすることが
できるオリゴヌクレオチドである。

【０００８】さらに、本発明は、配列番号１〜４で表さ
れるいずれかの塩基配列の少なくとも一部とハイブリダ
イスすることができる５'側プライマーと、配列番号１
〜４で表されるいずれかの塩基配列の少なくとも一部と
ハイブリダイズすることができる３'側プライマーとの
組み合わせからなるプライマーセットである。５'側プ
ライマーとしては、配列番号５で表されるものが挙げら
れ、３'側プライマーとしては配列番号６で表されるも
のが挙げられる。

【０００９】さらに、本発明は、上記のいずれかのプラ
イマーセットを用いて、白紋羽病菌の5.8sリボソームRN
Aをコードする遺伝子を含むDNAを含む遺伝子を増幅する
ことを特徴とする、白紋羽病菌の検出方法である。さら
に、本発明は、上記のいずれかのプライマーセットを含
む、白紋羽病菌の検出用キットである。以下、本発明を
詳細に説明する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の遺伝子は、白紋羽病菌の
5.8sリボソームRNAをコードするDNA及びその隣接領域(I
TS：Internal Transcribed Spacer)を含むものであり、
以下のようにして得ることができる。１．5.8SリボソームRNA遺伝子及びその隣接領域の単離 (1) ゲノムDNAの調製ゲノムDNAの供給源としては、白紋羽病菌及びロセリニ
ア・アーキュアータ(Rosellinia arcuata)、ロセリニア
・ペポ(Rosellinia pepo)、ロセリニア・ブノデス(Rose
llinia bunodes)、ロセリニア・クエルシナ(Rosellinia
quercina)、ロセリニア・アクイラ(Rosellinia aquil
a)その他のロセリニア属に属する糸状菌が挙げられる。

【００１１】例えば、上記菌株をポテト-デキストロー
ス培地、フスマ培地、麦芽培地などの液体又は固体培地
において、25℃で、４〜14日間、振盪又は静置培養す
る。培養後、濾過法、遠心分離法、掻き取り法などによ
り菌体を回収する。次いで、回収した菌体から界面活性
剤を用いる方法や、熱処理を行う方法などの通常の方法
によってゲノムDNAを抽出することができる。

【００１２】(2) PCRによる5.8ｓリボソームRNA遺伝子
及びその隣接領域の増幅一般に白紋羽病菌を含む糸状菌及び酵母などの真菌のゲ
ノムにおいて、5.8sリボソームRNAをコードする領域及
びその隣接領域は、図１のような構造であることが知ら
れている。真菌の5.8sリボソームRNA遺伝子及びその隣
接領域を増幅することができるホワイトらのオリゴヌク
レオチドプライマーITS1(配列番号７)及びITS4(配列番
号８) [White et al.：PCR Protocols, Academic Pres
s, San Diego, pp. 315(1990)]を用いて、上記(1)で得
られたゲノムDNAを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応
(PCRともいう)を行うことにより本発明のDNAを得ること
ができる。

【００１３】(3) 塩基配列の決定得られたPCR断片を、pBlueScriptSK(+)(STRATAGENE社
製)、pCR2.1(Invitrogen社製)等の適切なベクターにサ
ブクローニング後、塩基配列の決定を行う。又は、PCR
断片を用いてダイレクトシークエンシングを行う。塩基
配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、又はM
13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等
の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基
配列決定機（例えばPERKIN-ELMER社製373A DNAシークエ
ンサー等）を用いて配列決定が行われる。一旦本発明の
遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成に
よって、又は本遺伝子のcDNAないしゲノムDNAを鋳型と
したPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片
をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本
発明のDNAを得ることができる。

【００１４】(4) 白紋羽病菌検出用プライマーの合成配列番号１及び配列番号２に白紋羽病菌、配列番号２
(白紋羽病菌と同一の配列)、配列番号３、配列番号４に
その他のロセリニア属菌の5.8sリボソームRNA遺伝子及
びその隣接領域の塩基配列を例示する。そしてこれらの
塩基配列を比較し、白紋羽病菌に特徴的な配列を見出
し、その配列を有する合成オリゴヌクレオチドを白紋羽
病菌検出用プライマーとして用いることができる。

【００１５】例えば、白紋羽病菌検出に用いることがで
きる５'側プライマー及び３'側プライマーとしては、配
列番号１又は配列番号２で表される塩基配列の任意の領
域から選択することができる。但し、ロセリニア属に属
する菌株間で違いが認められ、GC含量の多い領域を含ま
ず、プライマー同志でハイブリダイズしないような領域
が好ましい。

【００１６】例えば、５'側プライマーとしては、配列
番号１又は配列番号２において、ロセリニア属に属する
種間で違いの見られる第12〜25番目、第65〜126番目、
及び第150〜174番目などの、少なくとも10〜50塩基、よ
り好ましくは15〜25塩基からなる領域が好ましい。ま
た、３'プライマーとしては、同様にロセリニア属に属
する種間で違いの見られる第384〜402番目、第437〜472
番目、及び第494〜510番目などの、少なくとも10〜50塩
基、より好ましくは15〜25塩基からなる領域が好まし
い。またこれらのプライマーは、あらゆる任意の組み合
わせで用いることができる。

【００１７】本発明のプライマーの塩基配列を、配列番
号５及び配列番号６に例示するが、配列番号１〜４で表
されるいずれかの塩基配列からなるDNAを含む遺伝子の
少なくとも一部とハイブリダイズすることができるオリ
ゴヌクレオチドも本発明のプライマーに含まれる。ま
た、本発明において用いられるプライマーは、これらに
限定されるものではない。

【００１８】２．本発明のプライマーを用いた白紋羽病
菌の検出 (1) 被検体サンプル溶液の調製白紋羽病菌を含むと思われる被検体サンプル溶液の調製
は、白紋羽病菌の感染が疑われる根、土壌、培養菌、土
壌から植物枝などに捕捉された菌糸体から界面活性剤を
用いる方法や、熱処理を行う方法などの通常の方法によ
ってDNAを抽出すればよく、これをフェノール、クロロ
ホルム、エタノール等を使用して精製し、被検体サンプ
ル溶液とする。

【００１９】(2) PCRによる白紋羽病菌の検出白紋羽病菌の検出は、上記１．に記載の白紋羽病菌特異
的プライマーを用いて5.8sリボソームRNA遺伝子及びそ
の隣接領域を増幅させ、増幅断片をアガロースゲル電気
泳動法やポリアクリミドゲル電気泳動法などにより分画
後、ゲルをエチジウムブロマイドなどを用いて染色し、
UVランプ下で増幅断片の有無を確認することにより行う
ことができる。

【００２０】増幅は、標準的なプロトコル[例えばSambr
ook,Jら、Molecular Cloning, ColdSpring Harbor Labo
ratory Press(1989)を参照]に従ったPCRによって行うこ
とができるが、例えばサイキらによって報告されたPCR
法[Saiki, R. K.：Science,239：487-491(1988),特開昭
61-274697]、その変法および改良法を用いるのが好まし
い。これらのPCR法等により、少量のサンプルから目的
のDNA断片を特異的に増幅させることができる。

【００２１】すなわち、DNAサンプルを変性して一本鎖
にする。次いで、目的のDNA配列の一方の鎖の５'側に相
補的な５'側プライマー、及び他方の鎖の３'側に相補的
な３'側プライマー、鋳型として用いるDNA配列、４種の
デオキシヌクレオシド三リン酸（dATP, dCTP, dGTP, お
よびdTTPもしくはdUTP）及びDNAポリメラーゼを含有す
る反応系を用い、鋳型DNAと上記２種のプライマーをア
ニーリングさせる。次いでDNAポリメラーゼと４種のデ
オキシヌクレオシド三リン酸とから各鋳型上に相補鎖を
合成させる。そして生成した二本鎖を熱変性によって一
本鎖にした後、それぞれの鎖を鋳型として上記と同じア
ニーリング、相補鎖の合成の手順を繰り返すことによ
り、プライマーに挟まれた部分のみを指数関数的に増や
すことができる。

【００２２】このように、プライマーに挟まれた部分の
DNA配列は上記一連の操作をＮサイクル(Ｎ＝20〜40)行
うことにより、理論上、２^N倍に増幅されたDNA断片が得
られる。DNAポリメラーゼは１分間に数百から数千塩基
の合成が行えるので、１サイクルは５〜７分で行うこと
ができる。従って、例えば25サイクルの増幅であれば、
３時間程度で終了し、この場合、各サイクルの効率が90
％であると仮定すれば、(1+0.9)²⁵すなわち約100万倍に
増幅させることができる。

【００２３】なお、PCR法等に用いるDNAポリメラーゼと
してはDNAの開裂温度において耐熱性であるポリメラー
ゼ、例えば、Taq, Tthポリメラーゼなどを用いることが
好ましい。従って、各サイクルの熱変性のたびに該酵素
の補充をする必要がほとんどなくなるので、PCR法等に
より簡便、迅速に行うことができる。

【００２４】本発明において、増幅されるDNA断片は、
白紋羽病菌が保有する5.8sリボソームRNA遺伝子及びそ
の隣接領域の一部分を含むDNA断片である。PCR法等にお
いてはプライマーに挟まれる部分のDNA配列が増幅され
るため、そのDNA断片の大きさは、用いるプライマーの
種類に依存する。本発明の１例では、上記プライマーを
用いると313bpのDNA断片が増幅される。次に、増幅され
たDNA断片は、アガロースゲルやアクリルアミドゲルを
用いて電気泳動に供し、その後エチジウムブロマイドな
どを用いて染色し、UVランプ下で増幅断片の有無を確認
することができる。

【００２５】また、本発明の方法を使用することによ
り、菌糸隔壁部分を観察する検鏡法やアニリンブルー含
有培地を用いる培養法では判別困難であった白紋羽病菌
や、コロニー形態が肉眼では通常の白紋羽病菌とは異な
るように観察される白紋羽病菌も正確に同定することが
できる。また従来、子のう胞子の形態に差がなく、白紋
羽病菌と同種ではないかと考えられていながら分類学上
は別種として位置付けられてきた、ロセリニア・アーキ
ュアータ(Rosellinia arcuata)などのロセリニア属に属
する糸状菌についても、遺伝子レベルでは白紋羽病菌と
別種と考える根拠が薄いことが示された。さらに、本発
明のプライマーは、白紋羽病菌を検出するためのキット
として使用することができる。

【００２６】

【実施例】以下に、本発明の実施例を示して具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。〔実施例１〕ロセリニア属菌の5.8sリボソームRNAをコ
ードする遺伝子を含むDNAの単離 (1) ロセリニア属菌からのDNAの調製白紋羽病菌(Rosellinia necatrix)R-4-株とR-24-
株、ロセリニア・ペポ(R. pepo)CBS350.36、ロセリニア
・アーキュアータ(R. arcuata)CBS347.29およびロセリ
ニア・クエルシナ(R. quercina)ATCC36702をポテトデキ
ストロースブロース培地 (Difco社製)中、25℃で、４〜
10日間培養した。次いで４℃、12,000×gで３分間遠心
することにより集菌後、菌体を滅菌水で２回洗浄した。

【００２７】得られた湿重量約50mgの菌体を、230μlの
菌体破砕用緩衝液(50mM Tris-HCl(pH 7.2), 50mM EDTA,
１％ SDS, １％2-メルカプトエタノール)に懸濁し、菌
体懸濁液を乳棒を用い乳鉢中で磨り潰した。次いで菌体
摩砕液をマイクロチューブに移した後、65℃の水浴中
で、１時間インキュベートすることにより菌体破砕液を
得た。

【００２８】この菌体破砕液に、TE飽和フェノール(1M
Tris-HCl(pH 8.0)を飽和させた0.1％8-ヒドロキシキノ
リンを含有するフェノール)及びクロロホルム／イソア
ミルアルコール(24:1)の等量混合物を230μl加え、激し
く混合後、12,000×gで10分間遠心した。遠心分離後、
上層を新しいマイクロチューブに移し、1/10量の3M酢酸
ナトリウムおよび54/100量のイソプロパノールを加え、
約30分間静置した。

【００２９】次いで、４℃、15,000×gで10分間遠心分
離しDNAをペレット化した。得られたDNAの沈殿物を70％
冷エタノールでリンス後、再度４℃、15,000×gで10分
間遠心分離した。このDNAの沈殿物を乾燥後、300μｌの
TE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH 8.0), １mM EDTA)に溶解
し，95℃で２分間熱変性後、氷冷したものをDNA試料溶
液として凍結保存した。

【００３０】(2) プライマーの作製プライマーは、ホワイトらの方法[White et al.：PCR P
rotocols, Academic Press, San Diego, pp. 315(199
0)]に従い、真菌の5.8SリボソームRNA遺伝子を含むITS
領域を増幅するためのプライマー[White et al.：PCR P
rotocols, Academic Press, San Diego, pp. 315(199
0)]を合成した。すなわち、５'センスプライマー配列
(プライマーITS１ともいう)として5'-TCCGTAGGTGAACCTG
CGG-3' (配列番号７)を、３'アンチセンスプライマー配
列(プライマーITS４ともいう)として5'-TCCTCCGCTTATTG
ATATGC-3' (配列番号８)を合成した。なお、合成オリゴ
ヌクレオチドは、全自動DNA合成機を使用して化学合成
した。

【００３１】(3) PCRによるロセリニア属菌の5.8sリボ
ソームRNAをコードする遺伝子を含むDNAの増幅鋳型としては上記(1)で調製したDNAを用い、プライマー
としては上記(2)で作製したプライマーITS１及びプライ
マーITS４を用いてPCRを行った。PCRの反応液の組成は
以下の通りである。

【００３２】 DNA溶液 1.0μl 10×PCR緩衝液(TOYOBO社製) 2.5μl 2mM dNTPs 2.5μl 25mM MgCl₂ 1.5μl 2μMセンスプライマー(ITS1) 5.0μl 2μMアンチセンスプライマー(ITS4) 5.0μl 5U/μl Taq ポリメラーゼ 0.15μl 蒸留水 7.35μl 全量 25.0μl

【００３３】PCRは、サーマルサイクラー（ASTEC社製、
PC-800型)を用いて、94℃で１分間の熱変性、55℃で２
分間のアニーリング、72℃で１分間の伸長反応の条件を
１サイクルとして、30サイクル行った。得られたPCR産
物をダイターミネーターサイクルシークエンシングFSレ
ディーリアクションキット(ABI社製)を用い、蛍光自動D
NAシーケンサー(ABI社製、377型)により解析した。

【００３４】その結果、図２及び図３に示すように、ロ
セリニア・アーキュアータCBS347.29由来の配列とロセ
リニア・ネカトリックスR-24-株由来の配列とは、配
列決定した549bpの全塩基配列が一致した(配列番号
２)。ロセリニア・ネカトリックスR-4-株由来の配列
(配列番号１)は、ロセリニア・ネカトリックスR-24-
株由来の配列(配列番号２)と、52番目の塩基１塩基のみ
異なっていた。一方ロセリニア・ペポCBS350.36(配列番
号３)及びロセリニア・クエルシナATCC36702由来の配列
(配列番号４)は、ロセリニア・ネカトリックスR-4-
株、ロセリニア・ネカトリックスR-24-株、及びロセ
リニア・アーキュアータCBS347.29由来の配列とは若干
異なっていた。

【００３５】〔実施例２〕白紋羽病菌の5.8sリボソーム
RNAをコードする遺伝子を含むDNAのPCR法による増幅お
よびDNA断片の検出 (1) 5.8sリボソームRNA遺伝子を含むITS領域を含有する
白紋羽病菌DNAの調製白紋羽病菌(Rosellinia necatrix)
49菌株（表１）のDNAを実施例１と同様の手順で調製し
た。

【００３６】

【表１】

【００３７】(2) オリゴヌクレオチドプライマーの選択
及び合成実施例１で解読した、白紋羽病菌(Rosellinia necatrix
R-4-株, R-24-株)、ロセリニア・ペポCBS350.36、
ロセリニア・アーキュアータCBS347.29、ロセリニア・
クエルシナATCC36702の5.8sリボソームRNA遺伝子及びそ
の隣接領域の塩基配列を比較検討し、種間で違いが認め
られ、GC含量の多い領域を含まず、プライマー同志でハ
イブリダイズしないような塩基配列領域を選択した(図
２及び図３、陰影部分)。すなわち、センスプライマー
として、5'-GCATTGAATTCTGAACACA-3' (配列番号５)を、
アンチセンスプライマーとして、5'-CCATAGGCGAGATGAGA
AATC-3' (配列番号６)を選択した。上記プライマーの化
学合成は常法に従って行った。

【００３８】(3) 白紋羽病菌の5.8sリボソームRNA遺伝
子及びその隣接領域の一部を含むDNA断片の増幅上記(1)で調製したDNAを実施例１と同様の方法でPCR法
を用いて増幅させた。ただし、プライマーは上記(2)で
合成したプライマーを使用した。 (4) 増幅DNA断片の検出上記工程(3)によるPCRで得られた増幅DNA断片を含む反
応液３μｌをDNAサイズマーカーとともに２％アガロー
スゲルにて電気泳動を行った後、エチジウムブロマイド
染色した。その結果の一部を図４に示す。図４に示すよ
うに313塩基対の特異的DNA断片が、分離した宿主、分離
地およびコロニー形態を問わずに供試した49菌株すべて
において認められた。

【００３９】〔実施例３〕交叉性の検定 (1) 本発明のプライマーを用いた交叉性の検定実施例１工程Ａにおいて調製したDNAおよびロセリニア
・ブノデスCBS 347.36とロセリニア・アクイラMAFF4200
64から実施例１と同様の手順で調製したDNAを用いて、
実施例２と同様の手順に従い、ロセリニア属に属する糸
状菌の内、根に病原性がある５種について交叉性の検定
を行った。その結果を図５に示す。

【００４０】図５に示すように該特異的プライマーを使
用してPCRを行うと、白紋羽病菌（R. necatrix）および
ロセリニア・ネカトリックスと同種であること指摘され
ているロセリニア・アーキュアータ[Francis, S. M.：S
ydowia 38：75-86(1985)，江塚昭典ら：茶業研究報告4
0:26-30(1973)]のみで増幅断片が認められ、他の４種か
らは検出されなかった。このことから、本プライマーは
近縁種間においても反応せず、白紋羽病菌を特異的に検
出するプライマーであることが確認された。

【００４１】(2) 本発明のプライマーを用いた白紋羽病
菌の検出実施例２と同様の手順に従い、白紋羽病に高い感受性を
示すナシ根から分離した菌株からランダムに29菌株選抜
し、交叉性の検定を行った。その結果の一部を図６に示
す。該プライマーを用いたPCRでは、白紋羽病菌のみか
ら313塩基対の特異的DNA断片が増幅され、その他の菌株
からは増幅されなかった。

【００４２】

【発明の効果】本発明により、白紋羽病菌の特異的かつ
迅速な検出および同定するための遺伝子、プライマー、
検出方法が提供される。

【００４３】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：549 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Rosellinia necatrix 株名：R-４- 配列 AGGGATCATT AAAGAGTTCT ATAACTCCCA AAACCCATGT GAACATACCA CACGTTGCCT 60 CGGCAGGTCG CGTCCTACCC CGAAGTGCCC TACCCTGTTA GGGCCTACCC GGTGGGCGCG 120 GGCCAACCTG CCGGCGGCCC ACGAAACTCT GTTTAGCATT GAATTCTGAA CACATAACTA 180 AATAAGTTAA AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGAA GAACGCAGCG 240 AAATGCGATA AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACA 300 TTGCGCCCAT TAGTATTCTA GTGGGCATGC CTGTTCGAGC GTCATTTCAA CCCTTAAGCC 360 CCTGTTGCTT AGTGTTGGGG GCCTGCAGCG CCTGCTGCAG CCCCTCGAAG TCAGTGGCGG 420 AGTCGGTCAC ACACTCTAGA CGTAGTAGAT TTCTCATCTC GCCTATGGTT GTGCCGGTCC 480 CCTGCCGTAA AACACCCCCC TATACCAAAG GTTGACCTCG GATCAGGTAG GAATACCCGC 540 TGAACTTAA 549

【００４４】配列番号：２配列の長さ：549 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Rosellinia necatrix 株名：R-24- 起源生物名：Rosellinia arcuata 株名：CBS347.29 配列 AGGGATCATT AAAGAGTTCT ATAACTCCCA AAACCCATGT GAACATACCA CGCGTTGCCT 60 CGGCAGGTCG CGTCCTACCC CGAAGTGCCC TACCCTGTTA GGGCCTACCC GGTGGGCGCG 120 GGCCAACCTG CCGGCGGCCC ACGAAACTCT GTTTAGCATT GAATTCTGAA CACATAACTA 180 AATAAGTTAA AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGAA GAACGCAGCG 240 AAATGCGATA AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACA 300 TTGCGCCCAT TAGTATTCTA GTGGGCATGC CTGTTCGAGC GTCATTTCAA CCCTTAAGCC 360 CCTGTTGCTT AGTGTTGGGG GCCTGCAGCG CCTGCTGCAG CCCCTCGAAG TCAGTGGCGG 420 AGTCGGTCAC ACACTCTAGA CGTAGTAGAT TTCTCATCTC GCCTATGGTT GTGCCGGTCC 480 CCTGCCGTAA AACACCCCCC TATACCAAAG GTTGACCTCG GATCAGGTAG GAATACCCGC 540 TGAACTTAA 549

【００４５】配列番号：３配列の長さ：537 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：Rosellinia pepo 株名：CBS350.36 配列 AGGGATCATT ACAGAGCGCA CAAGCTCCCA AACCCACTGT GAACATACCA CACGTTGCCT 60 CGGCGGGGGG CTTTCAGGGC CCGAGAAGGG CCCCGAAGCG AGCCCGCCGG CGGCCCACGA 120 AACTCCGTCT AGCCATTGAT ATCTCTGAAC TTGATAACTG AATCAGTTAA AACTTTCAAC 180 AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGAA GAACGCAGCG AAATGCGATA AGTAATGTGA 240 ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACA TTGCGCCCGC TAGTATTCTA 300 GCGGGCATGC CTGTTCGAGC GTCATTTCAA CCCTTAAGCC CCAGCTGCTT AGTGTTGGGG 360 GCCCGCGGCG CGCCACACTG CCCGCGGCCC CTCGAAGTTA GTGGCGGAGT CGGTTGCCCA 420 CCCCAGGCGT AGTAGATCTC TCGTCTCGCC TGCGGCGGCG CCGGTCCCCT GCCGTAAAAC 480 CCCCCATCTA TCCAAAAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGA ATACCCGCTG AACTTAA 537

【００４６】配列番号：４配列の長さ：553 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Rosellinia quercina 株名：ATCC36702 配列 AGGGATCATT ACAGAGTTTA TCTTAACTCC CAAACCCCAT GTGAACATAC CTTACGTTGC 60 CTCGGCAGGT CGCGTCGTAC CCGGGAGGGC CCTACCCTGT AGGGCATGAC CTGGTGCGCG 120 CGGGTAACCC TGCCGGCGGC CCCTGAAACT CTGTTTTTTA CATTAGAATT CTGAATCTAT 180 AACTAAATAA GTTAAAACTT TCAACAACGG ATCTCTTGGT TCTGGCATCG ATGAAGAACG 240 CAGCGAAATG CGATAAGTAA TGTGAATTGC AGAATTCAGT GAATCATCGA ATCTTTGAAC 300 GCACATTGCG CCCATTAGTA TTCTATTGGG CATGCCTGTT CGAGCGTCAT TTCAACCCTC 360 AAGCCCCCGT TGCTTGGTGT TGGGAGCCTA CGGCGACGTA GCTCCTCAAA GTTAGTGGCG 420 GAGTCGGCTC GCACTCTAGA CGTAGTAGAA TCTTTTTATC TCGCCTGTAG TGTGTGCCGG 480 TCCCCTGCCG TAAAACCCCC CCAATTATCA AAAGGTTGAC CTCGGATCAG GTAGGAATAC 540 CCGCTGAACT TAA 553

【００４７】配列番号：５配列の長さ：19 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 GCATTGAATT CTGAACACA 19

【００４８】配列番号：６配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列 CCATAGGCGA GATGAGAAAT C 21

【００４９】配列番号：７配列の長さ：19 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 TCCGTAGGTG AACCTGCGG 19

【００５０】配列番号：８配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 TCCTCCGCTT ATTGATATGC 20

【図面の簡単な説明】

【図１】真菌のゲノムDNA上で5.8sリボソームRNAをコー
ドする領域及びその隣接領域を示す図である。

【図２】ロセリニア・ペポ(R. pepo)、ロセリニア・ネ
カトリックス(R. necatrix) R-4-株、ロセリニア・ネ
カトリックスR-24-株、ロセリニア・アーキュアータ
(R. arcuata)およびロセリニア・クエルシナ(R. querci
na)の5.8sリボソームRNA遺伝子を含むITS領域の塩基配
列（ただしITS１とITS４のプライマー部位は除く）とそ
のアラインメントを示す図である。陰影部分は今回特異
的検出のためにプライマーとして用いた部位である。各
配列は、さらに図３中の対応する配列へと続いている。

【図３】ロセリニア・ペポ(R. pepo)、ロセリニア・ネ
カトリックス(R. necatrix) R-4-株、ロセリニア・ネ
カトリックスR-24-株、ロセリニア・アーキュアータ
(R. arcuata)およびロセリニア・クエルシナ(R. querci
na)の5.8sリボソームRNA遺伝子を含むITS領域の塩基配
列（ただしITS１とITS４のプライマー部位は除く）とそ
のアラインメントを示す図である。陰影部分は今回特異
的検出のためにプライマーとして用いた部位である。図
中の各配列は、図２中の対応する配列の続きである。

【図４】白紋羽病菌から本発明により開発したプライマ
ーで特異的DNA断片を増幅した結果を示す電気泳動写真
である。

【図５】本発明の白紋羽病菌特異的プライマーを用いた
PCRによる増幅結果を示す電気泳動写真である。

【図６】ナシ根から分離した糸状菌由来のDNAを鋳型と
して、本発明の白紋羽病菌特異的プライマーでの増幅結
果を示す電気泳動写真である。

【手続補正書】

【提出日】平成１１年２月２４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:645）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１〜４で表されるいずれかの塩
基配列を含むDNA。
【請求項２】配列番号１〜４で表されるいずれかの塩
基配列からなるDNAの少なくとも一部とハイブリダイズ
することができるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】配列番号１〜４で表されるいずれかの塩
基配列の少なくとも一部とハイブリダイスすることがで
きる５'側プライマーと、配列番号１〜４で表されるい
ずれかの塩基配列の少なくとも一部とハイブリダイズす
ることができる３'側プライマーとの組み合わせからな
るプライマーセット。
【請求項４】５'側プライマーが配列番号５で表され
るものである請求項３に記載のプライマーセット。
【請求項５】３'側プライマーが配列番号６で表され
るものである請求項３に記載のプライマーセット。
【請求項６】請求項３〜５のいずれか１項に記載のプ
ライマーセットを用いて、白紋羽病菌の5.8sリボソーム
RNAをコードする遺伝子を含むDNAを増幅することを特徴
とする、白紋羽病菌の検出方法。
【請求項７】請求項３〜５のいずれか１項に記載のプ
ライマーセットを含む、白紋羽病菌の検出用キット。