KR20000022114A - 신규 아미노말단 보호기 유리효소 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질 및 펩티드의 아미노말단에 존재하는 보호기를 유리시키는 활성을 갖는 아미노말단 보호기 유리효소에 관한 것이다. 또 본 발명은, 이와 같은 아미노말단 보호기 유리효소를 코드하는 DNA 에 관한 것이다. 또 본 발명은, 이와 같은 아미노말단 보호기 유리효소의 유전자 재조합기술에 의한 제조방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은, 이와 같은 아미노말단 보호기 유리효소를 이용하는 아미노말단 보호기의 제거방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 이와 같은 제거방법을 이용하는 아미노산서열의 해석방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 상기 아미노말단 보호기 유리효소를 함유하는, 아미노산서열의 해석에 사용되는 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 상기 아미노말단 보호기 유리효소 또는 그 기능적 동등물에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 상기 DNA 와 하이브리다이즈하는 합성 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다.

Description

신규 아미노말단 보호기 유리효소
단백질 및 펩티드의 아미노말단 아미노산 서열을 결정하는 것은, 이들의 동정 또는 확인에 대하여 필수적인 분석이다.
그러나, 진핵세포 생물유래의 가용성 단백질의 60% 이상이 그 아미노말단의 α-아미노기를 아세틸기나 그 이외의 보호기로 블록되어 있다고 알려져 있어, 아미노말단으로부터의 아미노산서열 결정법으로 이미 확립되어 넓게 이용되고 있는 에드만분해법으로는, 보호기에 의해 아미노말단이 블록된 단백질 및 펩티드의 분석을 행할 수 없다.
단백질 및 펩티드의 아미노말단을 블록하고 있는 보호기로서는, 포르밀기, 아세틸기, 미리스토일기, 피로글루타밀기, 디메틸기, 글루큐로닐기, 글리코실기, 트리메틸기 등이 보고되어 있다. 이들 블록된 단백질의 아미노말단 아미노산서열 분석법으로서는, 보호기를 제거한 후에 에드만 분해법을 적용하는 방법이 이용된다.
보호기의 제거에는, 효소를 이용하는 방법과 화학적 방법이 있는데, 효소법으로는, 아세틸기의 경우에는 아실아미노산 유리효소, 피로글루타밀기의 경우에는 피로글루타밀펩티다아제를 이용하는 방식으로 보호기의 종류에 따라 이용하는 효소가 달라, 범용성이 결여된다는 결점을 갖고 있고, 화학적방법도 범용성이 있는 방법은 개발되어 있지 않다. 또, 아미노말단이 블록되어 있는 경우에 그 보호기를 동정하는 방법은 알려져 있지 않기 때문에, 실제로 보호기의 제거를 행할 때에는, 각각의 보호기의 종류에 따른 제거방법을 하나씩 시험해보는 것 이외의 방법은 없다, 또한, 미리스토일기로 블록된 단백질 및 펩티드에 대하여 유효한 보호기 제거방법이 없어, 아미노말단으로부터의 서열을 얻는 것은 불가능하다.
또한, 지금까지 피로코커스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus) 에 의해 단리된, 펩티드의 아미노말단부분에 작용하는 펩티다아제로서는 아미노펩티다아제 (일본공개특허공보 평6-319566호), 피로글루타밀펩티다아제 (일본 공개특허공보 평7-298881 호) 및 메티오닌아미노펩티다아제 (일본 공개특허공보 평8-9979 호) 가 알려져 있다. 이 중, 피로글루타밀펩티다아제는 아미노말단의 피로글루타밀기를 유리하는 활성을 갖고 있지만, 이 이외의 보호기, 예를 들면, 아세틸기에 대해서는 작용하지 않는다. 또, 다른 2 종의 효소는 보호기로 블록된 아미노말단에는 작용할 수 없다.
상기와 같이 보호기에 의해 아미노말단이 블록된 단백질 및 펩티드에 대한 현행의 아미노말단 아미노산서열 분석법은 범용성이 없다는 문제점을 갖는다.
본 발명은 단백질 및 펩티드의 아미노말단에 존재하는 보호기를 유리시키는 활성을 갖는 아미노말단 보호기 유리효소에 관한 것이다. 또 본 발명은, 이와 같은 아미노말단 보호기 유리효소를 코드하는 DNA 에 관한 것이다. 또 본 발명은, 이와 같은 아미노말단 보호기 유리효소의 유전자 재조합기술에 의한 제조방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은, 이와 같은 아미노말단 보호기 유리효소를 이용하는 아미노말단 보호기의 제거방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 이와 같은 제거방법을 이용하는 아미노산서열의 해석방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 상기 아미노말단 보호기 유리효소를 함유하는, 아미노산서열의 해석에 사용되는 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 상기 아미노말단 보호기 유리효소 또는 그 기능적 동등물에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 상기 DNA 와 하이브리다이즈하는 합성 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다.
도 1 은 플라스미드 pDAP3 의 제한효소지도를 나타내는 도면이다.
도 2 는 플라스미드 pDAP 의 제한효소지도를 나타내는 도면이다.
도 3 은 본 발명에서의 아미노말단 보호기 유리효소의 최적온도를 나타내는 그래프이다.
도 4 는 본 발명에서의 아미노말단 보호기 유리효소의 최적 pH를 나타내는 그래프이다. 도면 중, △ 는 아세트산나트륨 완충액, ● 는 PIPES-Na 완충액, ○ 는 붕산나트륨 완충액, ▲ 는 인산수소나트륨-수산화나트륨 완충액을 이용한 데이터를 나타낸다.
도 5 는 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소의 75 ℃ 에서의 온도안정성을 나타내는 그래프이다. 도면 중, ● 는 0.1 mM 의 CoCl2를 함유하는 완충액 중에서의 데이터, ○ 는 CoCl2를 함유하지 않은 완층액 중에서의 데이터를 나타낸다.
도 6 은 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소의 뉴로텐신에 대한 시간의 경과에 따른 작용을 나타내는 도면이다.
도 7 은 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소의 α-MSH 에 대한 시간의 경과에 따른 작용을 나타내는 도면이다.
도 8 은 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소의 Ac-Gly-Asp-Val- Glu-Lys 에 대응하는 시간의 경과에 따른 작용을 나타내는 도면이다.
도 9 는 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소의 For-Met-Leu-Phe-Lys 에 대한 시간의 경과에 따른 작용을 나타내는 도면이다.
도 10 은 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소의 Myr-Phe-Ala-Arg-Lys- Gly-Ala-Leu-Arg-Gln 에 대한 시간의 경과에 따른 작용을 나타내는 도면이다.
도 11 은 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소의 Myr-Gly-Ala-Gly-Ala- Ser-Ala-Glu-Glu-Lys 에 대한 시간의 경과에 따른 작용을 나타내는 도면이다.
도 12 는 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소의 환원 라이소자임에 대한 시간의 경과에 따른 작용을 나타내는 도면이다.
발명의 실시를 위한 최량의 양태
1. 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소
본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소는, 보호기에 의해 아미노말단이 블록된 펩티드에 작용하여 이 보호기를 유리시키는 활성 (아미노말단 보호기 유리활성)을 갖는 효소로서, 2 종 이상의 보호기에 대하여 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
여기에서 "펩티드" 란, 2 이상의 아미노산이 펩티드결합에 의해 연결된 것을 나타내고, "단백질" 로 기재되어 있는 것을 포함한다.
이 펩티드의 아미노말단에 존재하는 보호기로서는, 아세틸기, 피로글루타밀기, 포르밀기, 미리스토일기 등을 들 수 있는데, 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소는, 기질의 펩티드의 아미노말단으로부터 이들의 보호기중 적어도 2 종 이상의 보호기를 유리시키는 활성을 갖는다. 이와 같은 아미노말단 보호기 유리활성은, 아미노말단이 상기 보호기로 블록된 합성 펩티드 등을 기질로 이용함으로써 후술하는 방법에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소로서는, 아미노말단 보호기 유리활성을 갖는 효소, 아미노말단 보호기 유리활성을 갖고 또한 펩티드의 아미노말단에서 순차적으로 아미노산을 유리하는 아미노펩티다아제 활성을 갖는 효소를 들 수 있으며, 구체적으로는 그 일례로서 서열목록의 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산서열로 이루어지는 효소를 들 수 있다. 아미노펩티다아제 활성을 추가로 갖는 경우, 다른 펩티드아미노말단 분해법을 병용할 필요없이, 펩티드의 아미노산서열의 해석을 실시하는 것도 가능하다. 이와 같은 아미노펩티다아제 활성은 통상 이용되는 공지의 방법 (Arch.Biochem.Biophys.,제274권, 제241내지250면(1989)) 에 의해 측정할 수 있다.
아미노말단 보호기 유리활성을 갖고 또한 아미노펩티다아제 활성을 갖는 효소의 일례로서, 구체적으로는 서열목록의 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산서열로 이루어지는 효소를 들 수 있다. 본 발명의 효소는, 그 아미노말단이 유리의 상태이어도 되며, 또는 이 효소의 아미노말단 자체가 보호기에 의해 블록되어 있어도 된다. 따라서, 본 명세서에서 특별히 언급이 없는 한, 이 효소의 아미노말단은 어느 형태의 것도 함유하고 있다. 따라서, 서열번호: 1 에는 아미노말단이 유리상태인 것을 나타냈는데, 서열번호: 1 의 서열을 갖고, 아미노말단이 아세틸기 등의 보호기에 의해 블록되어 있는 것도 본 발명의 범위내이다.
본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소는, 예를 들면 1) 본 발명의 효소를 생산하는 미생물의 배양물로부터의 정제, 2) 본 발명의 효소를 코드하는 DNA 를 함유하는 형질전환체의 배양물로부터의 정제 등의 방법으로 제조할 수 있다.
1) 본 발명의 효소를 생산하는 미생물의 배양물로부터의 정제
본 발명의 효소를 생산하는 미생물에 대해서는, 효소활성을 지표로 한 스크리닝에 의해 이와 같은 미생물을 찾을 수 있다. 효소활성을 검출하는 방법으로서는, 아미노말단이 보호기로 블록된 아미노산이나 펩티드를 기질에 이용하여, 이 기질로부터의 보호기의 유리를 고속 액체크로마토그래피나 아미노산 분석법, 질량분석법 등으로 확인하는 방법이 있다. 또, 보호기로 블록된 아미노산에, 다시 적당한 발색기나 형광기를 부가한 합성기질 등을 이용할 수도 있다.
상기와 같이 하여, 아미노말단 보호기 유리효소의 생산이 확인된 미생물을 배양함으로써 이 효소를 제조할 수 있다. 미생물의 배양은 그 미생물의 생육에 최적한 조건으로 행하면 되고, 바람직하게는 목적의 효소의 발현량이 높아지는 배양조건이 이용된다. 이렇게 하여 균체 또는 배양액 중에 생산된 목적의 효소는, 통상의 효소정제에 이용되는 방법으로 정제할 수 있다.
상기의 스크리닝에 의해 밝혀진, 본 발명의 효소를 생산하는 미생물로서는, 피로코커스 푸리오수스 DSM 3638 을 들 수 있다.
이하, 피로코커스 푸리오수스 DSM 3638 을 예로서, 본 발명의 효소의 제조방법에 대하여 서술하는데, 이것에 한정되는 것은 아니다. 또한, 피로코커스 푸리오수스 DSM 3638 은, Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen und GmbH에서 입수가능한 균주이다.
이 균주의 배양에 있어서는, 통상, 초내열균의 배양에 이용되는 방법을 이용할 수 있고, 배지에 더해지는 영양원은 이 균주를 이용할 수 있는 것이면 된다. 탄소원으로서는, 예를 들면, 전분 등을 이용할 수 있고, 질소원으로서는, 예를 들면 트립톤, 펩톤, 효모엑기스 등을 이용할 수 있다. 배지 중에는, 마그네슘염, 나트륨염, 철염 등의 금속염을 미량 원소로 첨가하여도 된다. 또 예를 들면, 배지의 조제에 인공해수를 이용하는 것이 유리하다. 또 배지는 고형의 황을 함유하고 있지않은 투명한 배지가 바람직하고, 이 배지를 이용하면, 균체의 증식은 배양액의 혼탁도를 측정함으로써 용이하게 감시할 수 있다. 배양에 있어서는 정치(靜置)배양 또는 교반배양으로 행할 수 있는데, 예를 들면 어플라이드 앤드 인바이론멘탈 마이크로바이올로지, 제 55권, 제 2086 내지 2088 면 (1992) 에 기재된 바와 같이, 투석배양법을 이용하여도 된다. 일반적으로 배양온도는 95℃ 전후가 바람직하고, 통상 16 시간 정도로 아미노말단 보호기 유리효소가 배양물 중에 현저한 양으로 축적된다. 배양조건은, 사용하는 균체, 배지조성에 따라 아미노말단 보호기 유리효소의 생산량이 최대가 되도록 설정하는 것이 바람직하다.
아미노말단 보호기 유리효소를 채취하는데 있어서는, 예를 들면 배양액으로부터 원심분리, 여과 등에 의해 균체를 모으고, 이어서 균체를 파쇄하여 조(粗)효소액을 조제한다. 균체의 파쇄방법으로서는, 초음파파쇄, 비즈파쇄, 용균 효소처리 등 중에서 목적효소의 추출효과가 높은 방법을 선택하면 된다. 또, 배양액 중에 이 효소가 분비되고 있는 경우에는, 황안염석법(硫安鹽析法)이나 한외여과법 등으로 효소를 농축하여, 이를 조효소액으로 한다. 이렇게 하여 얻어진 조효소액으로부터 아미노말단 보호기 유리효소를 단리하는데 있어서는, 통상적으로 효소의 정제에 이용되는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 황안염석처리, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피 등의 방법을 조합하여 사용할 수 있다.
2) 본 발명의 효소를 코드하는 DNA 를 함유하는 형질전환체의 배양물로부터의 정제
본 발명에 관련되는 효소를 코드하는 DNA 는 적당한 미생물의 유전자 라이브러리의 스크리닝에 의해 얻을 수 있다. 미생물로서는 상기와 동일하게, 효소활성을 지표로 한 스크리닝에 의해 찾을 수 있다.
보다 구체적으로는, 예를 들면 피로코커스속에 속하는 세균, 예를 들면 피로코커스 푸리오수스 게놈의 코스미드 라이브러리에서 목적의 DNA 를 스크리닝하여 얻을 수 있다. 피로코커스 푸리오수스로서는 피로코커스 푸리오수스 DSM 3638 을 사용할 수 있다.
또, 이와 같은 미생물로 부터의 원하는 DNA 의 크로닝이나 본 발명의 효소를 코드하는 DNA 를 함유하는 형질전환체의 조제 및 배양, 배양물로 부터의 원하는 단백질의 정제 등의 방법은, 통상 행해지는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 이하, 피로코커스 푸리오수스 DSM 3638 를 예로 본 발명의 제조방법에 대하여 서술하는데, 이것에 한정되는 것은 아니다.
피로코커스 푸리오수스 게놈의 코스미드라이브러리는, 피로코커스 푸리오수스 게놈 DNA 를 제한효소 Sau3AI (다까라슈조사 제조) 로 부분절단하여 얻어진 DNA 단편을 트리플헬릭스 코스미드벡터 (스트라타진사 제조) 에 도입한 후, 인비트로패키징법으로 람다파지 입자 중에 패키징함으로써 제작할 수 있다. 다음으로 이렇게 하여 얻어진 라이브러리를 이용하여 적당한 대장균, 예를 들면 대장균 DH5αMCR (BRL사 제조)를 형질전환하고, 이 형질전환체 중의 본 발명에 관련되는 효소활성을 조사함으로써, 이 효소의 DNA 를 함유하는 클론을 얻을 수 있다.
또한 본 발명자들은, 이 효소활성의 스크리닝시에, 재료로 한 피로코커스 푸리오수스를 생산하는 효소가 높은 내열성을 갖는 점에 착안하여, 코스미드 라이브러리를 이용하여 얻어지는 형질전환체를 개별적으로 배양하고, 얻어진 균체로부터 내열성의 단백만을 함유하는 분해물을 조제하는 공정을 조합시켰다. 이 일군의 분해물은, 코스미드 단백질 라이브러리로 명명되어, 이 코스미드 단백질 라이브러리를 효소활성의 검출에 이용함으로써, 형질전환체의 콜로니를 이용하는 방법보다도 검출감도가 높아짐과 동시에, 숙주유래의 단백 등에 의한 백그라운드나 효소활성의 저해란 악영향을 열변성조작으로 제거할 수 있다.
즉, 먼저, 코스미드 라이브러리를 이용하여 얻어진 형질전환체를 배양하여 얻어지는 균체를 열처리 (100 ℃, 10 분간), 초음파처리, 재열처리 (100 ℃, 10분간) 한 후, 원심분리를 행하여 상등액 (분해물) 을 회수하여, 코스미드 단백질 러이브러리를 제작한다.
다음에, 이 라이브러리에 함유되는 각각의 분해물에 대하여 펩티다아제 활성의 유무를 조사하여, 펩티다아제를 발현하는 클론의 스크리닝을 행한다. 펩티다아제활성의 검출에는, 합성 펩티드인 아미노산-4-메틸쿠마릴-7-아미드 (이하, 아미노산-MCA 라 기재함) 를 기질로서 사용할 수 있고, 예를 들면, Met-MCA, Leu-MCA, Ala-MCA, His-MCA (펩티드연구소사 제조) 등을 사용할 수 있다. 펩티다아제 활성이 인정된 분해물은, 또한, 아미노말단이 아세틸기에 의해 블록된 펩티드인 α-MSH (α-멜라닌세포 자극호르몬 : 펩티드연구소사 제조) 를 기질로 이용함으로써, 아미노말단의 보호기를 유리하는 활성을 갖는지의 여부를 조사할 수 있다. 이로써, 보호기를 유리하는 활성을 발현하는 DNA 를 함유하는 코스미드 클론을 얻을 수 있다.
또한, 이와 같이 하여 얻어진 코스미드콜론에서 조제한 코스미드를 적당한 제한효소로 단편화하여, 각 단편을 삽입한 재조합 플라스미드를 제작할 수 있다. 다음에 이 플라스미드를 적당한 미생물에 도입하여 얻어지는 형질전환체에 의해 생산되는 Met-MCA 분해활성을 조사함으로써, 목적의 효소를 코드하는 DNA 를 함유하는 재조합 플라스미드를 얻을 수 있다.
상기의 코스미드 클론에서 조제한 코스미드를 BamHI (다까라슈조사 제조) 으로 절단하고, 얻어진 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pUC18 (다까라슈조사 제조) 의 BamHI 사이트에 삽입한 재조합 플라스미드를 제작할 수 있다. 다음에, 이 플라스미드를 도입한 대장균 JM109 (다까라슈조사 제조) 를 배양한 후, 얻어진 균체로부터 조제한 분해물 중의 펩티다아제 활성을 조사함으로써, 목적으로 하는 DNA 를 함유하는 플라스미드를 얻을 수 있다. 이 플라스미드는 플라스미드 pDAP1 으로 명명되고 있다.
다음에, 상기의 플라스미드 pDAP1 을 EcoRI (다까라슈조사 제조) 절단하고, 자가결찰을 행함으로써 재조합 플라스미드를 제작할 수 있다. 이 플라스미드를 도입한 대장균 JM109를 배양하여 얻어지는 균체의 분해물의 펩티다아제활성을 확인하여 목적으로 하는 DNA 를 함유하는 플라스미드를 얻을 수 있다. 이 플라스미드는 pDAP2 로 명명되고 있다.
또한, 상기 플라스미드 pDAP2에서 아미노말단 보호기 유리효소 유전자를 함유하지 않은 DNA 단편을 다음과 같이 제거할 수 있다. 즉, 상기 플라스미드 pDAP2를 SacI (다까라슈조사 제조) 절단하여 얻어지는 약 1.7 kb 의 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pUC18 (다까라슈조사 제조) 의 SacI 사이트에 삽입하여, 대장균 JM109에 도입한다. 얻어진 형질전환체로 조제한 분해물의 펩티다아제 활성을 측정하여, 활성을 나타내는 형질전환체로 플라스미드를 조제한다. 이 플라스미드는 pDNA3 이라 명명되고 있다. 도 1 에 그 제한효소 지도를 나타낸다. 도면 중, 굵은 실선이 플라스미드 벡터 pUC18로의 삽입 DNA 단편이다.
또한, 상기 플라스미드 pDAP3에서 아미노말단 보호기 유리효소 유전자를 함유하지 않는 DNA 단편을 다음과 같이 제거할 수 있다. 즉, 상기 플라스미드 pDAP3을 SnaBI (다까라슈조사 제조), SacI (다까라슈조사 제조) 절단하여 얻어지는 약 1.2 kb 의 SnaBI-SacI DNA 단편을 플라스미드벡터 pUC19 의 SmaI-SacI 사이트에 삽입하여, 대장균 JM109 에 도입한다. 얻어진 형질전환체로 조제한 분해물의 펩티다아제 활성을 측정한다. 또한, 분해물이 아세틸기를 아미노말단에서 유리하는 활성을 α-MSH 를 기질에 이용하여 확인하고, 활성을 나타내는 형질전환체로 플라스미드를 조제한다. 이 플라스미드는 플라스미드 pDAP 로 명명되고 있다. 도 2 에 그 제한효소지도를 나타낸다. 도면 중, 굵은 선이 플라스미드벡터 pUC19 로의 삽입 DNA 단편이다. 플라스미드 pDAP 를 도입한 대장균 JM109 는 Escherichia coli JM109/pDAP 로 명명되어, 일본국 이바라기껭 쓰구바시 히가시 1 쵸메 1 방 3 고 (우편번호 305) 의 통상산업성 공업기술원 생명공학기술연구소에 FERM BP-5804 로서 기탁되어 있다 (원기탁일 : 1996년 3월 29일, 국제기탁으로의 이관 : 1997년 1월 30일).
상기 플라스미드 pDAP 에 함유되는 피로코커스 푸리오수스 유래의 DNA 단편의 염기서열은 공지의 방법, 예를 들면, 디데옥시법을 이용하여 조사할 수 있다.
서열목록의 서열번호: 3 에 플라스미드 pDAP 에 삽입되어 있는 약 1.2 kb 의 DNA 단편의 염기서열을 나타낸다. 또, 이 서열중에 존재하는 오픈 리딩 프레임의 염기서열을 서열목록의 서열번호: 2 에 나타낸다. 즉, 서열목록의 서열번호: 2 는 본 발명에 의해 얻어지는 아미노말단 보호기 유리효소 유전자의 염기서열의 일례이다. 또한 서열번호: 1 에, 서열번호: 2 에 나타낸 염기서열에서 추정되는 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소의 아미노산서열을 나타낸다. 즉 서열목록의 서열번호: 1 은 본 발명에 의해 얻어지는 아미노말단 보호기 유리효소의 아미노산서열의 일례이다.
상기와 같이 하여 얻어지는, 플라스미드 pDAP를 도입한 Escherichia coli JM109/pDAP를 이용하여 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소를 얻을 수 있다.
즉, Escherichia coli JM109/pDAP 를 통상의 배양조건, 예를 들면, 100 ㎍/㎖ 의 암피시린을 함유하는 LB 배지 (트립톤 10g/리터, 효모엑기스 5g/리터, NaCl 15g/리터, pH7.2) 중, 37℃에서 배양함으로써, 배양균체 중에 아미노말단 보호기 유리효소를 발현시킬 수 있다.
배양종료후, 배양균체를 집균하여 얻어진 균체를 100 ℃, 10 분간의 열처리를 행한다. 조효소액은 열처리균체를 초음파처리후 원심분리한 상등액으로 얻어지고, 이 효소액의 100 ℃, 10 분간의 열처리에 의한 협잡단백질의 변성처리, 겔여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등의 통상적으로 효소의 정제에 이용되는 방법을 조합하여 이용함으로써 아미노말단 보호기 유리효소를 정제할 수 있다.
상기의 방법에 의해 Escherichia coli JM109/pDAP 에서 얻어진 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소의 효소화학적 및 이화학적 성질을 이하에 나타낸다.
(1) 작용
본 발명의 효소는, 펩티드의 아미노말단에 존재하는 각종 보호기 중, 적어도 아세틸기, 피로글루타밀기, 포르밀기, 미리스토일기를 유리한다. 또한 본 발명의 효소는 펩티드의 아미노말단에서 순차적으로 아미노산을 유리한다.
(2) 효소활성 측정법
본 발명의 효소활성은, Met-MCA를 기질에 이용하여, 이하에 나타낸 조작으로 측정된다.
a. 반응
효소활성을 측정하고자 하는 효소표준품을 적당하게 희석하여, 그 효소용액 5 ㎕ 에 20 mM PIPES-Na 완충액 (pH7.6) 100 ㎕을 더하고, 다시 1 mM Met-MCA (디메틸술폭시드에 용해한 것)을 5 ㎕ 첨가하여, 75 ℃에서 20 분간 반응시킨 후, 30% 아세트산을 10 ㎕ 첨가함으로써 반응을 정지한다.
b. 측정
반응에 의해 생성되는 7-아미노-4-메틸쿠마린을, 여기파장 355 ㎚, 측정파장 460 ㎚ 에서 타이타텍플루오로스캔 II (다이니뽕세이야꾸가부시끼가이샤 제조)를 이용하여 정량한다. 효소 1 단위는 Met-MCA 를 기질로 하여, pH7.6, 75 ℃에서 1 분간에 1 μmol 의 7-아미노-4-메틸쿠마린을 생성할 수 있는 효소량으로 한다. 본 발명의 효소는, 측정한 pH7.6, 75℃ 에서 Met-MCA 분해활성을 갖고 있었다. 동일하게, 본 발명의 효소는 Met-MCA 외에, Leu-MCA, Ala-MCA, His-MCA 등에 작용하여 아미노산을 유리하였다.
(3) 기질특이성
본 발명의 효소는, 펩티드의 아미노말단에 보호기가 존재하는 경우이더라도, 아미노말단에서 보호기를 유리하여, 다시 아미노산을 순차적으로 유리한다.
상기 활성은, 아미노말단이 블록되어 있는 합성 펩티드를 기질에 이용하여 확인할 수 있다. 즉, 효소반응에 따라 기질 펩티드에서 유리하는 아미노산량의 시간경과에 따른 변화를 아미노산분석으로 측정하고, 펩티드의 분해모식을 해석함으로써 확인할 수 있다. 또한, 이하에 나타낸 펩티드 중, 시판되고 있지않은 것은 공지의 방법, 예를 들면 펩티드합성기를 사용함으로써 화학적으로 합성하여 사용할 수 있다.
피로글루타밀기를 유리하는 활성은 뉴로텐신을 기질에 이용하여 조사할 수 있다. 서열목록의 서열번호: 4 에 뉴로텐신의 아미노산서열을 나타낸다. 즉 1 mM 뉴로텐신 (펩티드연구소사 제조) 10 ㎕ 에 0.12 밀리단위의 효소표준품 (5 ㎕), 40 mM PIPES-Na 완충액 (pH7.6) 50 ㎕, 증류수 35 ㎕을 첨가하여, 37 ℃에서 0 내지 5 시간 반응시킨 후, 아미노산 분석법으로 반응액 중의 유리아미노산의 측정을 행하였다. 이 결과, 반응시간의 경과에 따라 뉴로텐신의 아미노말단에서 피로글루타밀기를 잃은 루신 및 이것에 계속되는 아미노산이 순차적으로 유리되어 가는 것이 확인되어, 본 발명의 효소가 피로글루타밀기를 유리하는 활성을 갖고 있는 것이 나타났다.
아세틸기를 유리하는 활성은, α-MSH 및 Ac-Gly-Asp-Val-Glu-Lys 를 기질에 이용하여 조사할 수 있다. 서열목록의 서열번호: 5 및 서열번호: 6 에 각각 α-MSH, Ac-Gly-Asp-Val-Glu-Lys 의 아미노산서열을 나타낸다. 즉, 1 mM 의 상기 펩티드기질 용액 10 ㎕ 에 0.12 밀리단위의 효소표준품 (5 ㎕), 40 mM PIPES-Na (pH7.6) 완충액 50 ㎕, 증류수 35 ㎕을 첨가하여, 37 ℃에서 0 내지 5 시간 반응시킨 후, 아미노산 분석법으로 반응액 중의 유리아미노산의 측정을 행하였다. 이 결과, 어느 기질을 이용한 경우도 먼저 아세틸기를 잃은 아미노말단의 아미노산이 유리되어 있어, 본 발명의 효소가 아세틸기를 유리하는 활성을 갖고 있는 것이 나타났다. 또 반응시간의 경과에 따라 이에 이어지는 아미노산이 순차적으로 유리되어 가는 것도 확인되었다.
포르밀기를 유리하는 활성은, For-Met-Leu-Phe-Lys (BACHEM사 제조)를 기질에 이용하여 조사할 수 있다. 서열목록의 서열번호: 7 에 For-Met-Leu-Phe-Lys 의 아미노산서열을 나타낸다. 즉, 10 mM For-Met-Leu-Phe-Lys (30% 아세트산용액) 0.5 ㎕ 에 4 밀리단위의 효소표준품 (3.5 ㎕), 0.1M 의 N-에틸모르폴린 25 ㎕, 증류수 21 ㎕을 첨가하여, 37 ℃에서 0 내지 2 시간 반응시킨 후, 아미노산 분석법으로 반응액중의 유리아미노산의 측정을 행하였다. 이 결과, 반응액중에 포르밀기를 잃은 메티오닌이 유리되어 있는 것이 확인되어, 본 발명의 효소가 포르밀기를 유리하는 활성을 갖고 있는 것이 나타났다. 또 반응시간의 경과에 따라 이것에 이어지는 아미노산이 순차적으로 유리되어 가는 것도 확인되었다.
미리스토일기를 유리하는 활성은, Myr-Phe-Ala-Arg-Lys-Gly-Ala-Leu-Arg-Gln (BACHEM사 제조) 및 Myr-Gly-Ala-Gly-Ala-Ser-Ala-Glu-Glu-Lys 를 기질에 이용하여 조사할 수 있다. 서열목록의 서열번호: 8 및 서열번호: 9 에 각각 Myr-Phe-Ala- Arg-Lys-Gly-Ala-Leu-Arg-Gln, Myr-Gly-Ala-Gly-Ala-Ser-Ala-Glu-Glu-Lys 의 아미노산서열을 나타낸다. 즉, 1 mM 의 상기 펩티드기질용액 5 ㎕ 에 4 밀리단위의 효소표준품 (3.5 ㎕), 0.1M 의 N-에틸모르폴린 아세트산 완충액 (pH9.0) 25 ㎕, 증류수 16.5 ㎕ 을 첨가하여, 37 ℃에서 0 내지 9 시간 반응시킨 후, 아미노산 분석법으로 반응액중의 유리아미노산의 측정을 행하였다. 이 결과, 어느 기질을 이용한 경우도 먼저 미리스토일기를 잃은 아미노말단의 아미노산이 유리되어 있어, 본 발명의 효소가 미리스토일기를 유리하는 활성을 갖고 있는 것이 나타났다. 또 반응시간의 경과에 따라 이에 이어지는 아미노산이 순차적으로 유리되어 가는 것도 확인되었다.
또, 본 발명의 효소는 보호기에 따라 아미노말단이 블록되어 있지않은 펩티드의 아미노말단에도 작용하여, 아미노말단 아미노산을 유리하는 아미노펩티다아제 활성을 갖는다. 이 활성은, Arch.Biochem. Biophys., 제 274권, 제 241 내지 250 면 (1989) 에 기재된 방법에 의해 확인할 수 있다.
또한 본 발명의 효소는, 상기와 같은 1본쇄의 폴리펩티드 외에, 고분자량의 단백질의 아미노말단에도 작용할 수 있다. 예를 들면, 닭의 난백 환원 라이소자임을 기질로 이것을 확인할 수 있다. 즉, 1 mM 닭의 난백 환원 라이소자임(수용성, 분자량 약 14000, 와꼬우쥰야꾸고교사 제조) 5 ㎕ 에 8 밀리단위의 효소표준품 (1.6 ㎕), 0.1mM 의 CoCl2를 함유하는 50mM 의 인산수소나트륨-수산화나트륨 완충액 (pH11.0) 50 ㎕, 증류수 43.4 ㎕ 를 첨가하여, 50 ℃에서 0 내지 240 분간 반응시킨 후, 아미노산 분석법으로 반응액 중의 유리아미노산의 측정을 행하였다. 반응액 중에 생성된 아미노산의 시간경과에 따른 변화로부터, 환원 라이소자임의 아미노말단에서 아미노산이 순차적으로 유리되고 있는 것이 나타나, 본 발명의 효소가 단백질의 아미노말단에 대해서도 작용하는 것이 확인되었다.
(4) 최적온도
도 3 으로부터, 본 발명의 효소표준품의 최적온도는 pH7.6 에서 75 내지 95 ℃ 이다. 도면 중, 세로축은 최대활성 (95 ℃) 에 대한 상대활성 (%), 가로축은 반응온도 (℃) 를 나타낸다.
(5) 최적 pH
도 4 에 나타낸 바와 같이 본 발명의 효소의 최적 pH 는 6.5 내지 9.5 부근이었다. 도면 중, 세로축은 pH7.2 에서의 활성을 100 으로 한 상대활성 (%) 을, 가로축은 75 ℃ 에서의 pH 를 나타낸다.
(6) 각종 시약의 영향
본 발명의 효소의 활성은 아스마타틴 (펩티드연구소사 제조) 에 의해 저해를 받는다. 예를 들면 0.3 밀리단위의 본 발명의 효소를 5 nmol 의 아마스타틴으로 처리한 후, 그 활성을 Met-MCA 를 기질로 측정한 경우, 효소활성은 거의 완전히 손실된다.
또, 본 발명의 효소의 활성은 CoCl2에 의해 촉진된다.
(7) 분자량
본 발명의 효소는, SDS-폴리아크릴아미드 전기영동에 의해 약 4 만, 초원심법에 의해 약 40 만의 분자량을 나타낸다.
(8) 온도안정성
효소표준품을 75 ℃ 에서 열처리한 후의 잔존효소활성을 조사하여, 본 발명의 효소의 온도안정성을 조사하였다. 도 5 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 효소는 0.1 mM 의 CoCl2를 함유하는 0.1M 의 트리스-HC1 완충액 (pH8.0) 중에서는 5 시간 처리후에도 효소활성의 저하는 전혀 볼 수 없고 (도면 내의 ●), 또, CoCl2를 함유하지않은 완충액 중에서 5 시간 처리한 경우도 80 % 이상의 활성을 유지하였다 (도면 내의 ○). 도면 중, 세로축은 잔존하는 효소활성 (%), 가로축은 열처리의 시간 (시간)을 나타낸다.
본 발명에서의 아미노말단 보호기 유리효소는 상기 효소 외에, 서열목록의 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산서열의 전부 또는 그의 일부를 함유하는 것으로 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 효소, 또는 그 기능적 동등물을 들 수 있다.
본 명세서에 기재된 "기능적 동등물" 이란 이하와 같은 것을 말한다. 천연에 존재하는 단백질에는 이를 코드하는 DNA 의 다형이나 변이 외에, 생성후의 단백질의 생체내 및 정제 중의 수식반응 등에 의해 그 아미노산서열 중에 아미노산의 결실, 삽입, 부가, 치환 등의 변이가 일어날 수 있다. 그러나 이와 같은 변이가 이 단백질의 활성이나 구조의 유지에 관하여 중요하지 않은 부분에 존재하는 경우에는, 변이를 갖지 않은 단백질과 실질적으로 동등한 생리, 생물학적 활성을 나타낸다고 알려져 있다. 이와 같이 구조적으로 약간의 차이가 있어도 그 기능에 대해서는 큰 차이를 볼 수 없는 것을 본 명세서에서는 "기능적 동등물" 이라고 부른다.
인위적으로 단백질의 아미노산 서열에 상기와 같은 변이를 도입한 경우도 동일하고, 이 경우에는 또한 다종다양한 변이체를 제작할 수 있다. 예를 들면, 인체 인터루킨 2 (IL-2) 의 아미노산 서열중의 어느 시스테인잔기를 세린으로 치환한 폴리펩티드가 인터루킨 2 활성을 유지하는 것이 알려져 있다 [Science, 제 224 권, 1431 면 (1984)]. 따라서, 본 발명에 의해 개시된 아미노산서열 (서열목록의 서열번호: 1) 에 하나 또는 여러개의 아미노산잔기의 결실, 삽입, 부가, 치환이 발생한 아미노산서열에 의해 나타나는 것이더라도, 기능적으로 차이를 볼 수 없는 것이면 본 발명의 범위내에 속하는 것이다.
또, 어느 종류의 단백질은, 활성에는 필수가 아닌 펩티드영역을 갖고 있는 것이 알려져 있다. 예를 들면 세포외에 분비되는 단백질에 존재하는 시그널펩티드나, 프로테아제의 전구체 등에 보이는 프로서열 등이 이것에 해당하고, 이들 영역의 대부분은 번역후, 또는 활성형 단백질로의 전환시에 제거된다. 이와 같은 단백질는 일차구조상은 다른 형태로 존재하고 있지만, 최종적으로는 동등한 기능을 발현하는 단백질이다.
유전자공학적으로 단백질의 생산을 행하는 경우에는, 목적단백질의 아미노말단, 또는 카르복실말단에 이 단백질의 활성과는 무관한 펩티드사슬이 부가되는 일이 있다. 예를 들면, 목적단백질의 발현량을 올리기 위해, 사용되는 숙주중에서 고발현되고 있는 단백질의 아미노말단 영역의 일부를 목적단백질의 아미노말단에 부가한 융합단백질이 제작되는 일이 있다. 또는 발현된 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해, 특정의 물질에 친화성을 갖는 펩티드를 목적단백질의 아미노말단, 또는 카르복실말단에 부가하는 것도 행해지고 있다. 이들의 부가된 펩티드는 목적단백질의 활성에 악영향을 미치지 않는 경우에는 부가된 상태여도 되고, 또 필요하면 적당한 처리, 예를 들면 프로테아제에 의한 한정분해 등으로 목적단백질에서 제거되도록 할 수도 있다.
상기와 같은, 이 단백질의 기능에는 필수가 아닌 펩티드를 유지하거나 또는 부가된 것이더라도, 동등한 기능을 발현할 수 있는 한은 "기능적 동등물" 의 범위내에 속하는 것이다.
상기 아미노말단 보호기 유리효소의 기능적 동등물로서는, 예를 들면 서열목록의 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산서열에, 1 개 또는 복수의 아미노산잔기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환의 적어도 하나가 이루어지고, 또한 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 효소를 들 수 있다. 본 발명에서 기능적 동등물의 태양은 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소의 N 말단을 보호기에 의해 블록하기위해 아미노산서열을 개질된 개질효소가 예시된다. 예를 들면, 서열목록의 서열번호: 1 에 기재된 아미노산서열의 아미노산번호 2 의 발린이 아스파라긴산으로 치환된 효소를 들 수 있다.
이 개질효소는 예를 들면 유전자공학적 수법을 이용함으로써 얻을 수 있다. 즉 이 개질효소의 제작은 pDAP 플라스미드 DNA 상의 상기 효소를 코드한 DNA 영역에 공지의 핵산변이 도입기술을 이용하여 염기서열을 개질시킨 후, 적당한 숙주를 이용하여 단백을 발현시킴으로써 실시할 수 있다. 또한 이 개질효소의 N 말단 아미노산서열 Met-Asp 는 빵효모 중에서 아세틸기 부가 시그널서열로서 작용하는 것이 알려져 있다 [Journal of Biochemistry, 제 265 권, 제 19638 내지 19643 면 (1990)]. 따라서, 이 개질효소를 코드하는 DNA 영역을 적당한 효모용 발현벡터에 편성하여 적당한 숙주효모중에서 발현시킴으로써 N-말단이 아세틸화된 단백을 얻을 수 있다. 예를 들면, 효모용 발현벡터로는 pVT103-L [Gene, 제 52 권, 제 225 내지 233 면(1987)], 숙주효모로는 BJ2168 [FEMS Microbiology Review, 제 54권, 제 17 내지 46 면 (1988)] 을 사용할 수 있다. 또한 이와 같은 단백의 아미노말단 보호기 유리활성을 상기 기질특이성의 항에 기재한 방법을 이용하여 측정함으로써 이러한 단백이 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소인 것을 확인할 수 있다. 서열목록의 서열번호: 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 효소를 코드한 DNA 를 삽입된 pVT103-L 은 pAcDAP 로 명명되고, 이 플라스미드로 형질전환된 효모 BJ2168 은 Saccharomyces cerevisiae BJ2168/pAcDAP 로 명명되어, 일본국 이바라기껭 쓰꾸바시 히가시 1쵸메 1 방 3고 (우편번호 305) 의 통상산업성 공업기술원 생명공업기술연구소에 FERM BP-5952 로서 기탁되어 있다 (원기탁일 : 1997년 5월 23일). 이와 같은 수식효소이더라도, 2 종 이상의 아미노말단 보호기를 유리하는 활성을 갖는 효소이면 본 명세서에서의 기능적 동등물에 포함된다.
아미노산 서열의 개질에 의해 단백의 N 말단을 보호기에 의해 블록하는 방법으로서는 본 법에 한정되는 것이 아니고, 예를 들면 아세틸화의 다른 법 [Journal of Biological Chemistry, 제 260 권, 제 5382 내지 5391 면 (1985)] 나 미리스토일화의 방법 [Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 제 84 권, 제 2708 내지 2712 면 (1987)]을 이용하여도 된다. 또한 단백의 N-말단을 보호기에 의해 블록하는 방법은 상기와 같은 아미노산의 치환에 의한 방법에 한정되지 않고, 예를 들면 화학적인 방법 [Methods in Enzymology, 제 11 권, 제 565 내지 570 면 (1967)]을 이용하여도 된다.
2. 본 발명의 DNA
본 발명의 DNA 는, 상기와 같은 본 발명의 아미노 말단 보호기 유리효소를 코드하는 DNA 로, 구체적으로는 1) 서열목록의 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산서열의 전부 또는 그의 일부를 함유하는 것으로 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 것을 코드하는 DNA, 2) 서열목록의 서열번호: 2 에 나타낸 DNA 의 전부 또는 그의 일부를 함유하는 DNA, 3) 본 발명의 기능적 동등물을 코드하는 DNA 및 4) 상기 1) 내지 3) 의 DNA 에 하이브리다이즈 가능한, 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 단백질을 코드하는 DNA 등이다.
이와 같은 본 발명의 DNA 는, 예를 들면 다음과 같이 하여 얻을 수 있다.
먼저, 1) 및 2) 의 DNA 는, 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소의 설명 중에 기재된 바와 같이, 피로코커스 푸리오수스 DSM3638 에서 얻을 수 있다.
또, 본 발명에 의해 제공되는 아미노말단 보호기 유리효소를 코드하는 DNA6 의 염기서열을 기초로 본 발명의 효소와 동일한 활성을 갖는 단백질의 DNA 를 취득하는 것도 가능하다. 즉, 본 발명의 효소를 코드하는 DNA, 또는 그 염기서열의 일부를 하이브리다이제이션의 프로브, 또는 PCR 등의 유전자증폭법의 프라이머에 이용함으로써, 본 효소와 기능적으로 동등한 활성을 갖는 단백을 코드하는 DNA 를 스크리닝할 수 있다. 이와 같은 방법에 의해, 3), 4) 의 DNA 를 얻을 수 있다.
상기의 방법으로는 목적 DNA 의 일부만을 함유하는 DNA 단편이 얻어지는 일이 있는데, 이 때에는 얻어진 DNA 단편의 염기서열을 조사하여 그것이 목적 DNA 의 일부인 것을 확인한 후에, 이 DNA 단편, 또는 그의 일부를 프로브로서 하이브리다이제이션을 행하거나, 또는 이 DNA 단편의 염기서열에 근거하여 합성된 프라이머를 이용하여 PCR 을 행함으로써, 목적의 DNA 전체를 취득할 수 있다.
상기의 하이브리다이제이션은, 예를 들면 이하의 조건으로 행할 수 있다. 즉, DNA 를 고정한 멤블렌을 0.5% SDS, 0.1% 소혈청 알부민 (BSA), 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 피콜 400, 0.01% 변성 연어정자 DNA 를 함유하는 6×SSC (1×SSC 는 0.15M 의 NaCl, 0.015M 의 구연산나트륨, pH7.0) 중에서, 50 ℃ 에서 12 내지 20 시간, 프로브와 함께 인큐베이트한다. 인큐베이션 종료후, 0.5% SDS를 함유하는 2×SSC 중, 37 ℃ 에서의 세정부터 시작하여, SSC 농도는 0.1 배까지의 범위에서, 또, 온도는 50 ℃ 까지의 범위에서 변화시키고, 고정된 DNA 유래의 시그널이 백그라운드와 구별될 수 있도록 될 때까지 멤브레인을 세정한 후, 프로브의 검출을 행한다. 또, 이렇게 하여 얻어진 새로운 DNA 에 대하여, 그곳에 코드되어 있는 단백이 갖는 활성을 상기 동일한 방법으로 조사함으로써, 얻어진 DNA 가 목적으로 하는 것인지의 아닌지를 확인할 수 있다.
또한, 이들의 DNA 를 함유하는 형질전환체를 제작하고, 이것을 이용하여 상기의 아미노말단 보호기 유리효소를 공업적으로 생산하는 것도 가능해진다.
또한, 본 명세서에 개시된 염기서열과 동일한 염기서열이 아니어도, 이것이 본 명세서에 개시된 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 단백질을 코드하는 한, 이와 같은 염기서열은 본 발명의 범위에 함유되는 것은 상기와 같지만, 그 이유는 다음과 같다.
유전자 상에서 아미노산을 지정하는 코돈 (3 개의 염기의 조합) 은 아미노산의 종류마다 1 내지 6 종류씩이 존재하는 것이 알려져 있다. 따라서, 어느 아미노산 서열을 코드하는 DNA 는 그 아미노산서열에도 의하지만 다수 존재할 수 있다. DNA 는 자연계에서 결코 안정적으로 존재하고 있는 것이 아니라, 그 염기서열에 변이가 일어나는 일은 드물지는 않다. DNA 상에 일어난 변이가 그곳에 코드되는 아미노산 서열에는 변화를 주지않는 경우 (사일런트 변이라 칭함) 도 있고, 이 경우에는 동일 아미노산서열을 코드하는 다른 DNA 가 발생하였다고 할 수 있다. 따라서 어느 특정의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 가 단리되어도, 그것을 함유하는 생물이 계속 대를 이어가고 있는 중에 동일한 아미노산서열을 코드하는 다종류의 DNA 가 생겨날 가능성은 부정할 수 없다. 또한 동일한 아미노산서열을 코드하는 다종류의 DNA 를 인위적으로 제작하는 것은 여러 가지의 유전자공학적 수법을 이용하면 곤란한 것은 아니다.
예를 들면 유전자공학적인 단백질의 생산에 있어서, 목적단백질을 코드하는 본래의 DNA 상에서 사용되고 있는 코돈이 숙주중에서는 사용빈도가 낮았던 경우에는, 단백질의 발현량이 낮은 일이 있다. 이와 같은 경우에는 코드되어 있는 아미노산 서열에 변화를 주지않고, 코돈을 숙주에서 빈번하게 사용하고 있는 것으로 인위적으로 변환함으로써, 목적 단백질의 고발현을 도모하는 것이 행해지고 있다 (예를 들면 일본 특공평 7-102146 호). 이와 같이 특정의 아미노산서열을 코드하는 다종류의 DNA 는 인위적으로 작성가능한 것은 말할필요도 없고, 자연계에서도 생성될 수 있는 것이다.
또한, 단백에 특정의 성질을 갖게하기 위해 인위적으로 변이를 도입시킨 DNA 라 하더라도, 본 발명의 아미노말단 보호기 유리활성을 갖는 효소를 코드하고 있으면 본 발명의 DNA 에 포함된다. 이와 같은 DNA 로서 예를 들면 서열목록의 서열번호: 11 에 나타낸 염기서열을 갖는 DNA 를 들 수 있다. 이 DNA 는 서열목록의 서열번호: 2 에 기재된 염기서열의 염기번호 5 내지 6 에 존재하는 염기서열 TG 가 염기서열 AT 로 치환된 염기서열을 갖고, 이 DNA 에 코드된 단백을 효모중에서 발현시키면, 서열목록의 서열번호: 1 에 기재된 아미노산서열의 아미노산 번호 (2) 의 발린이 아스파라긴산으로 치환됨과 동시에 N-말단이 아세틸화된 아미노말단 보호기 유리효소를 얻을 수 있다.
3. 본 발명의 아미노말단 보호기의 제거방법
본 발명의 아미노말단 보호기의 제거방법은, 보호기에 의해 아미노말단이 블록된 펩티드에 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소, 또는 그 기능적 동등물을 작용시켜 아미노말단의 보호기를 유리시키는 것을 특징으로 한다.
구체적인 제거방법으로는, 예를 들면 서열목록의 서열번호: 1 기재의 아미노산서열로 이루어지는 효소를 이용하는 경우, 50 mM 의 PIPES-Na 완충액 (pH7.6) 중에서 기질과 50℃에서 반응시킴으로써 보호기를 유리시킬 수 있다. 단, 보호기의 종류, 펩티드에 의해 반응조건이 다른 것은 당연한 일이다. 또, 필요에 따라 본 효소의 활성을 상승시키는 CoCl2를 첨가할 수도 있다.
4. 본 발명의 아미노산서열의 해석방법
본 발명의 아미노산서열의 해석방법은, 보호기에 의해 아미노말단이 블록된 펩티드의 아미노산서열의 해석방법에 있어서, 상기의 제거방법에 의해 이 보호기를 유리시킨 후 아미노산서열의 해석에 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 보호기의 제거방법을 이용한, 아미노말단이 보호기에 의해 블록된 펩티드의 아미노산서열 해석방법으로는, 예를 들면, 서열을 결정하고자 하는 펩티드의 아미노말단 보호기를 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소를 이용하여 제거한 후, 새로 발생한 아미노말단에서 에드만분석법으로 서열을 결정해가는 방법을 들 수 있다.
또한 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소를 이용하여 효소처리한 시료를 에드만분석법에 의한 아미노산서열 해석에 이용한 경우, 과잉량의 효소의 사용에 의해 시료의 아미노산 서열정보에 대하여 효소처리에 이용한 본 발명의 효소의 아미노산 서열 정보가 노이즈로 혼입되는 것을 생각할 수 있다. 이 경우 예를 들면 서열목록의 서열번호: 10 에 나타난 아미노산서열을 갖는 아미노말단 보호기 유리효소를 이용하면, 아미노말단 보호기 유리효소자체가 에드만분해를 받지않고 혼입을 방지할 수 있다. 또한, 이 효소에서 N 말단의 보호기는 아세틸기에 특별히 한정되는 것은 아니다.
또, 아미노말단 보호기 유리효소가 아미노펩티다아제 활성을 갖고 있는 경우에는 보호기의 유리에 이어져 아미노산도 효소의 작용에 의해 순차적으로 유리되어 가지만, 효소의 작용을 제어할 수 있는 조건으로 하면, 아미노말단의 보호기만, 또는 보호기와 그에 이어지는 여러 잔기의 아미노산을 제거한 후에 에드만 분해법에 의해 아미노산서열을 결정할 수도 있다.
또한, 이 아미노펩티다아제 활성을 이용함으로써, 이하에 나타낸 바와 같은 방법으로 아미노산서열 해석을 행할 수 있다. 즉, 서열을 결정하고자 하는 펩티드에 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소를 작용시킨 후, 반응액 중에 유리되어 가는 아미노산의 시간경과에 따른 변화를 해석하여 서열을 결정하는 방법, 또는 반응액 중에 발생한 여러 가지의 부분절단 펩티드의 아미노산 조성을 동정하고, 이를 비교함으로써 서열을 결정하는 방법이 있고, 특히 후자에서는 질량분석법을 이용한 분자량측정에 의해 펩티드의 아미노산 조성을 동정하는 방법이 유리하다. 질량분석법을 이용한 방법에서는 부분절단 펩티드의 분자량의 차이에서 유리된 아미노산의 종류를 용이하게 결정할 수 있고, 또한 아미노말단에 존재하는 보호기의 종류를 동시에 결정하는 것도 가능하다.
5. 본 발명의 아미노산 서열해석용 키트
본 발명의 아미노산 서열해석용 키트는, 보호기에 의해 아미노말단이 블록된 펩티드의 아미노산서열의 해석에 사용되는 키트로서, 상기에 기재된 본 발명의 효소를 함유하는 것을 특징으로 한다. 이와 같은 키트를 이용함으로써, 보호기의 종류에 관계없이, 아미노말단이 블록된 펩티드의 아미노산 서열해석에 이용할 수 있다. 또, 본 키트 중에는, 펩티드의 아미노말단을 블록하고 있는 보호기의 동정을 행하기 위한, 보호기 화합물의 표준품을 추가할 수도 있다.
6. 본 발명의 항체, 프로브 또는 프라이머
통상적인 방법에 의해, 상기의 아미노말단 보호기 유리효소 또는 그 기능적 동등물에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 얻을 수 있다. 이러한 항체 등은, 본 발명의 효소의 정제나 검출에 유용하다. 또, 통상의 방법으로, 상기의 DNA 와 하이브리다이즈하는 합성 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 얻을 수 있다. 이러한 프로브나 프라이머는 본 발명의 DNA 의 검출이나 증폭에 유용하다.
이하에 본 발명의 실시예를 나타내는데, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 조금도 한정되는 것은 아니다. 또한, 실시예 중의 % 는 중량% 를 의미한다.
따라서, 본 발명의 목적은, 2 종 이상의 보호기에 대하여 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 아미노말단 보호기 유리효소나 그 기능적 동등물, 이 효소를 코드하는 DNA, 이 효소의 제조방법, 이 효소를 작용시키는 아미노말단 보호기의 제거방법, 이 방법을 이용하는 아미노산서열의 해석방법 및 상기 효소를 함유하는 아미노산 서열해석용 키트를 제공하는 것에 있다. 또한 본 발명의 목적은, 상기 아미노말단 보호기 유리효소 또는 그 기능적 동등물에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편이나, 상기 DNA 와 하이브리다이즈하는 합성 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 피로코커스 푸리오수스 유래의 코스미드 단백질 라이브러리를 검색하여, 아미노말단의 보호기를 유리하는 활성을 발현하는 1 개의 코스미드 클론을 취득하였다. 본 발명자들은, 이 클론 중에 함유되는 아미노말단 보호기 유리효소 유전자를 단리하여 그 염기서열을 결정하였다. 또 미생물에서 이 효소를 대량으로 발현하는 재조합 플라스미드의 구축을 행하여, 효소의 생산에 성공함과 동시에, 이 효소의 여러 가지의 효소학적 성질을 밝혔다. 또한, 이 효소가 아세틸기를 비롯한 복수의 아미노말단 보호기를 유리하는 활성을 갖는 것을 발견하였다. 또 이 효소의 기능적 동등물의 제작에 성공하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명의 요지는,
[1] 보호기에 의해 아미노말단이 블록된 펩티드에 작용하여 이 보호기를 유리시키는 활성 (이하 "아미노말단 보호기 유리활성" 이라 칭함) 을 갖는 효소로서, 2 종 이상의 보호기에 대하여 상기 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 아미노말단 보호기 유리효소,
[2] 아세틸기, 피로글루타밀기, 포르밀기 및 미리스토일기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2 종 이상의 보호기에 대하여 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 상기 (1) 기재의 효소,
[3] 또한 아미노펩티다아제활성을 갖는 청구항 1 또는 2 기재의 효소,
[4] 하기의 이화학적 성질을 갖는 상기 (1) 내지 (3) 의 어느 한항 기재의 효소,
(1) 최적온도 : pH7.6 에서 75 내지 95℃
(2) 최적 pH : pH6.5 내지 9.5
(3) 각종 시약의 영향 : 상기 활성은 아마스타틴에 의해 저해되고, CoCl2에 의해 촉진된다.
[5] 서열목록의 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산서열의 전부 또는 그의 일부를 함유하는 것으로 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는, 상기 (1) 내지 (4) 어느 한항 기재의 효소,
[6] 서열목록의 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산서열에, 1 개 또는 복수의 아미노산잔기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환의 적어도 하나가 되어 있고, 또한 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는, 상기 (5) 에 기재된 효소의 기능적 동등물,
[7] 아미노말단이 보호기에 의해 블록된 상기 (6) 기재의 기능적 동등물,
[8] 보호기가 아세틸기인 상기 (7) 기재의 기능적 동등물,
[9] 서열목록의 서열번호: 10 에 나타낸 아미노산서열을 갖는 상기 (8) 기재의 기능적 동등물,
[10] 상기 (1) 내지 (4) 어느 한항 기재의 아미노말단 보호기 유리효소를 코드하는 DNA,
[11] 서열목록의 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산서열의 전부 또는 일부를 함유하는 것으로 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드하는 DNA,
[12] 서열목록의 서열번호: 2 에 나타낸 DNA 의 전부 또는 일부를 함유하는 것으로 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드하는 DNA,
[13] 서열목록의 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산서열에, 1 개 또는 복수의 아미노산잔기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환의 적어도 하나가 되어 있고, 또한 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 단백질을 코드하는 DNA,
[14] 서열목록의 서열번호: 11 에 나타낸 염기서열을 갖는 상기 (13) 기재의 DNA,
[15] 상기 (10) 내지 (14) 의 어느 한항의 기재의 DNA 에 하이브리다이즈 가능한, 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 단백질을 코드하는 DNA,
[16] 상기 (10) 내지 (14) 어느 한항의 기재의 DNA 를 함유하여 이루어지는 재조합 DNA,
[17] 상기 (16) 기재의 재조합 DNA 가 삽입되어 있고, 미생물, 동물세포 또는 식물세포를 숙주세포로 하는 발현벡터,
[18] 상기 (17) 기재의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체,
[19] 상기 (18) 기재의 형질전환체를 배양하고, 이 배양물 중에서 아미노말단 보호기 유리활성을 갖는 단백질 또는 상기 단백질의 활성과 기능적으로 동등한 활성을 갖는 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는 아미노말단 보호기 유리효소 또는 그 기능적 동등물의 제조방법.
[20] 보호기에 의해 아미노말단이 블록된 펩티드에 상기 (1) 내지 (9) 어느 한항의 기재의 아미노말단 보호기 유리효소 또는 그 기능적 동등물을 반응시켜 아미노말단의 보호기를 유리시키는 것을 특징으로 하는 아미노말단 보호기의 제거방법.
[21] 보호기에 의해 아미노말단이 블록된 펩티드의 아미노산서열의 해석방법에 있어서, 상기 (20) 기재의 제거방법에 의해 이 보호기를 유리시켜 생성된 펩티드를 아미노산서열의 해석에 이용하는 것을 특징으로 하는 아미노산서열의 해석방법,
[22] 보호기에 의해 아미노말단이 블록된 펩티드의 아미노산서열의 해석에 사용되는 키트로서, 상기 (1) 내지 (9) 어느 한항의 기재의 아미노말단 보호기 유리효소 또는 기능적 동등물을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트,
[23] 상기 (1) 내지 (9) 어느 한항의 기재의 아미노말단 보호기 유리효소 또는 그의 기능적 동등물에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편,
[24] 상기 (10) 내지 (15) 어느 한항의 기재의 DNA 와 하이브리다이즈 가능한 합성 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다.
실시예 1
(아미노말단 보호기 유리효소의 조제)
(1) 피로코커스 푸리오수스 게놈 DNA 의 조제
피로코커스 푸리오수스 DSM 3638 의 배양은 이하와 같이 행하였다.
사용한 배지의 조성을 이하에 나타낸다 : 1% 트립톤, 0.5% 효모엑기스, 1% 가용성전분, 3.5% 쟈마린 S 고형물 (쟈마린 라보라토리), 0.5% 쟈마린 S 액체 (쟈마린 라보라토리), 0.003% MgSO4, 0.001% NaCl, 0.0001% FeSO4·7H2O, 0.001% CoSO4, 0.0001% CaCl2·7H2O, 0.0001% ZnSO4, 0.1 ppm CuSO4·5H2O, 0.1 ppm KA1(SO4)2, 0.1 ppm H3BO3, 0.1 ppm Na2MoO4·2H2O, 0.25 ppm NiCl2·6H2O.
상기 조성의 배지 2 리터를 2 리터용의 중간보틀에 넣고, 120 ℃, 20 분 살균한 후, 질소가스를 불어넣어 용존산소를 제거하였다. 이어서, 이것에 상기 균체를 접종하여 95 ℃, 16 시간 정치 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 균체를 모았다.
다음으로 집균체를 25% 수크로스를 함유하는 0.05 M 트리스-HC1 (pH8.0) 4 ㎖ 에 현탁하고, 이 현탁액에 0.8 ㎖ 의 라이소자임 [5 ㎎/㎖, 0.25 M 트리스-HC1 (pH8.0)], 2 ㎖ 의 0.2 M EDTA (pH8.0) 를 더하여, 20 ℃ 에서 1 시간 보온한 후, 24 ㎖ 의 SET 용액 [150 mM NaCl, 1mM EDTA, 20 mM 트리스-HC1 (pH8.0)] 을 더하고, 다시 5% SDS 4 ㎖, 프로티나아제 K (10 ㎎/㎖) 400 ㎕ 를 더하여, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 반응종료후, 페놀클로로포름 추출, 이어서 에탄올 침전을 행하여 약 3.2 ㎎ 의 게놈 DNA 를 조제하였다.
(2) 코스미드단백질 라이브러리의 제작
피로코커스 푸리오수스 게놈 DNA 400 ㎍ 를 Sau3AI 으로 부분절단한 후, 농도구배 초원심법에 의한 분획을 행하여, 35 내지 50 kb 에 상당하는 DNA 획분을 얻었다. 다음에, 트리플헬릭스 코스미드벡터 1 ㎍ 을 BamHI 절단하고, 상기의 35 내지 50 kb 의 DNA 획분 140 ㎍ 과 혼합하여 결찰시켜, "기가팩골드" (스타라타진사 제조) 를 이용한 인비트로패키징법에 의해 피로코커스 푸리오수스 게놈 DNA 의 단편을 람다파지 입자중에 패키징한 코스미드 라이브러리를 제작하였다.
얻어진 파지 용액의 일부를 이용하여 대장균 DH5αMCR 을 형질전환하여, 코스미드 클론을 얻었다. 얻어진 형질전환체 중 여러개를 선택하여 코스미드를 조제하고, 적당한 크기의 삽입단편이 있는 것을 확인한 후, 새로 500 개의 형질전환체를 100 ㎍/㎖ 의 앰피실린을 함유하는 150 ㎖ 의 LB 배지 (트립톤 10 g/리터, 효모엑기스 5g/리터, NaCl 15g/리터, pH7.2) 중에서 개별로 배양하였다. 이 배양물을 원심분리하여, 회수한 균체를 20 mM 트리스-HC1 (pH8.0) 1 ㎖ 에 현탁하고, 100 ℃ 에서 10 분간 열처리하였다. 이어서, 초음파열처리를 행하여 균체파쇄액을 다시 또 한번 100 ℃, 10 분간 열처리하였다. 원심후의 상등액으로 얻어지는 분해물을 코스미드 단백질 라이브러리로 하였다.
(3) 아미노말단 보호기 유리효소 유전자를 함유하는 코스미드의 선택
먼저 아미노산-MCA 를 기질로 사용하여 생성된 7-이미노-4-메틸크말린량을 정량함으로써 코스미드단백질 라이브러리 중의 펩타다아제 활성을 갖는 코스미드 클론을 선택하였다. 즉, 상기 코스미드 단백질 라이브러리에서 분해물 10 내지 30 ㎕ 씩을 추출하여 0.1M 의 PIPES-Na 완충액 (pH7.6) 100 ㎕ 및 18 종의 5 mM 아미노산-MCA (디메틸술폭시드에 용해한 것) 를 5 ㎕ 첨가하고, 90 ℃에서 1 내지 3 시간 반응시켰다. 그 후, 타이터테크플루오로스캔 II (다이니뽕세이야꾸가부시끼가이샤 제조) 를 이용하여 생성된 7-아미노-4-메틸쿠마린을 여기파장 355 ㎚, 측정파장 460 ㎚ 으로 측정하고, Met-MCA, Leu-MCA, Ala-MCA, His-MCA 에 대하여 분해활성을 갖는 분해물을 선택하였다. 또한 α-MSH 를 기질로 사용하여, 이들의 분해물에서 아세틸기 및 아미노산을 아미노말단에서 순차적으로 유리시키는 활성을 갖는 것을 선택하여, 이 분해물에 대응하는 코스미드클론을 얻었다.
(4) 아미노말단 보호기 유리효소 유전자를 함유하는 플라스미드 pDAP1 의 조제
상기와 같이 하여 얻어진, 아세틸기 및 아미노산을 아미노말단에서 순차적으로 유리시키는 활성을 갖는 코스미드 클론에서 코스미드를 조제하고, BamHI 절단에 의해 얻어진 DNA 단편을 플라스미드벡터 pUC18 의 BamH 사이트에 삽입하였다. 이 재조합 플라스미드를 대장균 JM109 에 도입한 후, 100 ㎍/㎖ 의 앰피실린을 함유하는 LB 플레이트 (트립톤 10g/리터, 효모엑기스 5g/리터, NaCl 15g/리터, 아가 15g/리터, pH7.2) 위에 뿌려, 얻어진 형질전환체를 개별로 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 5 ㎖ 의 LB 배지 중에서 배양을 행하였다. 이 배양물을 원심분리하여 회수한 균체를 50 mM 트리스-HC1 (pH8.0) 50 ㎕ 에 현탁하고, 100 ℃에서 10 분간 열처리를 행한 후, 초음파처리로 균체를 파쇄하였다. 균체파쇄액을 다시 한번, 100 ℃, 10 분간의 열처리를 행하여, 원심하여 분해물을 얻었다. 이 분해물에 대하여 펩티다아제 활성을 측정하였다.
즉 15 ㎕ 의 분해물에 0.1M 의 PIPES-Na 완충액 (pH7.6) 50 ㎕ 및 5 mM Met-MCA (디메틸술폭시드에 용해) 5 ㎕를 더하여, 90 ℃에서 1.5 시간 반응시켰다. 그 후, 타이타테크플루오로스캔 II (다이니뽕세이야꾸가부시끼가이샤 제조)를 이용하여, 생성되는 7-아미노-4-메틸쿠마린량을 여기파장 355 ㎚, 측정파장 460 ㎚ 으로 측정하였다. Met-MCA 분해활성을 갖는 형질전환체로 플라스미드를 조제하여, 이를 플라스미드 pDAP1 이라 명명하였다.
(5) 아미노말단 보호기 유리효소 유전자를 함유하는 플라스미드 pDAP2 의 조제
상기 플라스미드 pDAP1 에 대하여 EcoRI 절단하고, 자가결찰시켰다. 이 재조합 플라스미드를 대장균 JM109 에 도입하고, 얻어진 형질전환체로 조제한 분해물에 대하여 상술의 방법으로 펩티다아제 활성을 조사하였다. 이 효소활성이 인정된 형질전환체로 플라스미드를 조제하여, 이것을 플라스미드 pDAP2 라 명명하였다.
(6) 아미노말단 보호기 유리효소 유전자를 함유하는 플라스미드 pDAP3 의 조제
상기 플라스미드 pDAP2 를 SacI 절단하여 얻어지는 약 1.7 kb 의 DNA 단편을 플라스미드벡터 pUC18 의 SacI 부위에 삽입하였다. 이 재조합 플라스미드를 대장균 JM109 에 도입하고, 얻어진 형질전환체로 조제한 분해물에 대하여 상술의 방법으로 펩타다아제 활성을 조사하였다. 이 효소활성이 인정된 형질전환체로 플라스미드를 조제하여, 이를 플라스미드 pDAP3 이라 명명하였다. 도 1 에 플라스미드 pDAP3 의 제한효소지도를 나타낸다.
(7) 아미노말단 보호기 유리효소 유전자를 함유하는 플라스미드 pDAP 의 조제
상기 플라스미드 pDAP3 을 SnaBI, SacI 절단후, 아가로스 전기영동을 행하여, 약 1.2 kb 의 DNA 단편을 아가로스에서 회수하였다. 이 DNA 단편을 플라스미드벡터 pUC19 에 SmaI-SacI 부위를 이용하여 삽입하였다. 이 재조합 플라스미드를 대장균 JM109 에 도입하고, 얻어진 형질전환체로 조제한 분해물에 대하여 상술의 방법으로 펩티다아제 활성을 조사하였다. 이 분해물이 다시 아미노말단에 아세틸기를 갖는 α-MSH 에 대하여, 아세틸기 및 아미노산을 아미노말단에서 순차적으로 유리시키는 활성을 갖는 것을 확인하였다.
이 효소활성이 보인 콜로니에서 플라스미드를 조제하여, 이것을 플라스미드 pDAP 라 명명하였다. 도 2 에 플라스미드 pDAP 의 제한효소지도를 나타낸다. 플라스미드 pDAP 로 형질전환된 대장균 JM109 는 Escherichia coli JM109/pDAP 라 명명하여 표시되어, 일본국 이바라기껭 쓰꾸바시 히가시 1쵸메 1방 3고(우편번호 305) 의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 FERM BP-5804 로 기탁되어 있다 (원기탁일 : 1996년 3월 29일, 국제기탁으로의 이관 : 1997년 1월 30일).
(8) 아미노말단 보호기 유리효소 유전자의 염기서열의 결정
상기 플라스미드 pDAP 에 삽입된 아미노말단 보호기 유리효소 유전자를 함유하는 약 1.2 kb 의 DNA 단편을 여러 가지의 제한효소로 적당한 크기로 단편화하여, 이 단편을 플라스미드벡터에 삽입한 후, 각 단편의 염기서열을 결정하였다. 염기서열의 결정은 BcaBEST 디데옥시 시퀀싱 키트 (다까라슈조사 제조)를 이용한 디데옥시법으로 행하여, 얻어진 각 단편의 염기서열을 비교, 종합하고, 상기 1.2 kb DNA 단편의 전체 염기서열을 결정하였다.
서열목록의 서열번호: 3 에 플라스미드 pDAP 에 삽입된 아미노말단 보호기 유리효소를 코드하는 DNA 를 함유하는 약 1.2 kb 의 DNA 단편의 염기서열을 나타낸다. 서열번호 중, 염기번호 86번 내지 88번이 개시코돈, 염기번호 1130번 내지 1132번이 종결코돈으로, 이 사이의 오픈리딩프레임이 이 효소의 구조유전자 영역으로 추정되었다.
서열목록의 서열번호: 2 에 상기 오픈리딩프레임의 염기서열을 나타낸다. 또한, 서열목록의 서열번호: 1 에 서열번호: 2 에 나타낸 염기서열에서 추정되는 본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소의 아미노산서열을 나타낸다.
(9) 효소표준품의 조제
Escherichia coli JM109/pDAP 를 통상의 배양조건, 100 ㎍/㎖ 의 앰피실린을 첨가한 LB 배지 5 ㎖ 을 함유하는 12 개의 시험관에 각각 접종하고, 37 ℃ 에서 배양을 행하여, 배양액 탁도 A660= 1 일 때의 최종농도 1 mM 이 되도록 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드를 첨가하고, 다시 37 ℃에서 16 내지 18 시간 배양하였다.
상기에서 얻어진 배양액 총 60 ㎖ 을 원심분리하여 균체를 회수하였다. 얻어진 균체를 0.6 ㎖ 의 완충액 A (20 mM 트리스-HC1 pH8.0) 에 현탁하고, 100 ℃, 10 분간 열처리를 행한 후, 초음파처리에 의해 균체를 파쇄하였다, 추가로 다시한번 100 ℃, 10 분간의 열처리를 행하고, 원심분리하여 분해물을 얻었다. 얻어진 분해물을 미리 완충액 B (50 mM 트리스-HC1 : pH8.0) 으로 평형화한 50 ㎖ 의 세파크릴 S-300 HR (파마시아사 제조) 칼럼으로 겔여과를 행하여, Met-MCA 분해활성을 갖는 획분을 모았다. 또한, 이 활성획분을 미리 완충액 B 로 평형화한 5 ㎖ 의 에코노팩 highQ 카트리지 (바이오래트사 제조) 칼럼에 흡착시키고, 완충액 B 로 충분히 세정후, 0 내지 0.5 M 의 NaCl 직선농도균배를 갖는 완충액 B 로 용출하였다. 용출액에 대하여 Met-MCA 분해활성을 측정하고, 활성획분을 모아 정제효소 표준품으로 하였다.
얻어진 정제효소 표준품의 1 단위는, Met-MCA 를 기질로 하고, pH7.6, 75 ℃에서 1 분간에 1 μmol 의 7-아미노-4-메틸쿠마린을 생성할 수 있는 효소량으로 하였다.
실시예 2
(실시예 1에서 조제한 효소표준품의 이화학적 성질)
1) 최적온도
최적온도의 측정은 이하에 나타낸 조작으로 행하였다. 즉, 18 마이크로단위의 효소 표준품을 이용하여, Met-MCA 를 기질로 이용하는 효소활성 측정방법에 의해, 여러 가지의 온도에서 활성을 측정하였다. 도 3 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 효소는 측정된 pH7.6 에서 25 내지 95 ℃ 의 범위에서 활성이 있고, 측정을 행한 최고의 온도인 95 ℃ 에서 가장 높은 활성을 나타냈다. 도 3 에서, 본 발명의 효소 표준품의 최적온도는, pH7.6 에서 75 내지 95 ℃ 이었다. 도면 중, 세로축은 최대활성 (95℃) 에 대한 상대활성 (%), 가로축은 반응온도 (℃)를 나타낸다.
2) 최적 pH
최적 pH 의 측정은 이하에 나타낸 조작으로 행하였다. 즉, 18 마이크로단위의 효소표준품을 이용하여, 상기에 나타낸 Met-MCA 를 기질로 이용하는 효소활성 측정방법 중, 반응액에 더하는 완충액을 여러 가지의 pH 의 완층액으로 바꾸어 활성측정을 행하였다. 도 4 에 나타낸 바와 같이 본 발명의 효소의 최적 pH 는 pH 6.5 내지 9.5 부근이었다. 도면 중, 세로축은 pH7.2 에서의 활성을 100 으로 한 상대활성 (%)을, 가로축은 75 ℃ 에서의 pH 를 나타낸다. 활성측정에 이용하는 완충액에는, pH4.1 내지 pH5.1 에서는 20 mM 아세트산나트륨 완층액, pH5.8 내지 pH7.2 에서는 20 mM PIPES-Na 완충액, pH8.0 내지 9.5 에서는 20 mM 붕산나트륨 완충액, pH9.9 내지 10.6 에서는 20 mM 인산수소이나트륨-수산화나트륨 완충액을 이용하였다. 또한, 상기의 pH 는 75 ℃ 의 값이다.
3) 각종 시약의 영향
본 발명의 효소의 활성은 아마스타틴에 의해 저해를 받았다. 예를 들면, 3 밀리단위의 본 발명의 효소를 1 mM 아마스타틴을 함유하는 20 mM 붕산완충액 (pH10.0) 50 ㎕ 중에서 37 ℃, 30 분간 처리후, 그 5 ㎕ 를 상기의 2) 의 효소활성 측정법에 나타낸 방법으로 활성측정을 행하면, 아마스타틴을 함유하지 않은 완충액으로 처리한 것에 대하여, 1.5% 의 값을 나타냈다.
또, 본 발명의 효소의 활성은 CoCl2에 의해 촉진되었다. 예를 들면 상기의 Met-MCA 를 이용하는 측정계에 최종농도 91 ㎛ 가 되도록 CoCl2를 첨가한 경우, 첨가하지 않은 것에 비하여 약 6 배의 활성을 나타냈다.
4) 분자량
본 발명의 효소는, SDS-폴리아크릴아미드 전기영동에 의해 약 4 만, 초원심법으로 약 40 만의 분자량을 나타냈다.
5) 온도안정성
효소표준품을 열처리한 후의 잔존 효소활성을 조사하여, 본 발명의 효소의 온도안정성을 조사하였다. 즉, 26 밀리단위의 효소 표준품을 함유하는 0.1 M 트리스-HC1 완충액 (pH8.0), 또는 이것에 최종농도 0.1 mM 의 CoCl2를 첨가한 것을 75 ℃ 에서 0 내지 5 시간 처리한 후, 그의 일부를 이용하여 잔존하는 효소활성을 측정하였다. 또한, 활성측정은 상기의 Met-MCA 를 기질로 이용한 계에 의한 효소활성 측정방법으로 행하였다.
도 5 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 효소는 0.1mM 의 CoCl2를 함유하는 0.1M 의 트리스-HC1 완충액 (pH8.0) 중에서는 5 시간 처리후에도 효소활성의 저하는 전혀 볼 수 없고, 또 CoCl2를 함유하지 않은 완충액 중에서 5 시간 처리한 경우도 80% 이상의 활성을 유지하였다. 도면 중, 세로축은 잔존하는 효소활성 (%), 가로축은 열처리의 시간 (시간)을 나타낸다.
실시예 3
(실시예 1 에서 조제한 효소표준품의 아미노말단 보호기 유리활성의 확인)
실시예 1 에서 조제한 효소 표준품을 이용하여, 아미노말단이 블록되어 있는 합성펩티드에 대한 본 효소의 작용을 검토하였다.
(1) 피로글루타밀기에 대한 작용
1 mM 뉴로텐신 10 ㎕ 에, 0.12 밀리단위의 효소 표준품 (5 ㎕), 40 mM 의 PIPES-Na 완충액 (pH7.6) 50 ㎕, 증류수 35 ㎕ 를 첨가하여, 37 ℃ 에서 0, 1, 3, 5 시간 반응시켰다. 반응액의 일부를 L-8500 형 고속 아미노산 분석계 (히타치세이사꾸쇼사 제조) 를 이용한 아미노산분석을 행하여, 반응액 중에 생성된 유리아미노산을 정량하였다. 도 6 에 그 결과를 나타낸다. 도 6 에 나타낸 바와 같이 반응액 중에는 뉴로텐신의 아미노말단측에 존재하는 루신, 티로신, 글루타민산이 유리되어 있고, 그 생성량의 시간의 경과에 따른 변화로부터 본 효소가 뉴로텐신의 아미노말단측에서 작용하여 아미노산을 순차적으로 유리하고 있는 것이 나타났다. 또한, 루신이 유리아미노산으로 검출되고 있는 것으로부터, 본 효소가 피로글루타밀기와 루신간의 결합을 절단하고 있는 것도 명확해졌다.
(2) 아세틸기에 대한 작용
1 mM 의 α-MSH (10 ㎕) 에, 0.12 밀리단위의 효소 표준품 (5 ㎕), 40 mM 의 PIPES-Na (pH7.6) 완충액 50 ㎕, 증류수 35 ㎕ 를 첨가하고, 37 ℃에서 1, 3, 5 시간 반응시킨 후, 반응에 의해 생성된 유리아미노산을 상기와 동일한 조작으로 분석하였다. 도 7 에 그 결과를 나타낸다. 도 7 에 나타낸 바와 같이, α-MSH 에서 유리되는 아미노산의 양은 그 아미노말단측에 존재하는 것일수록 많고 (세린은 아미노말단, 및 아미노말단에서 3 번째의 2 개소에 존재하기 때문에, 다른 아미노산에 비하여 많이 검출되고 있음), 본 효소가 α-MSH 의 아미노말단측에서 작용한다는 것과 아세틸기와 세린의 사이의 결합을 절단한다는 것을 확인하였다.
또, 기질을 Ac-Gly-Asp-Val-Glu-Lys 로 대체하여 α-MSH 의 경우와 동일한 실험을 행한 결과를 도 8 에 나타냈다. 도 8 에 나타낸 바와 같이, 반응액 중에는 글리신이 유리되어 있고, 본 효소가 아세틸기와 글리신간의 결합, 이어서, 글리신-아스파라긴산간의 결합을 절단하고 있는 것이 시사되었다. 또한, 반응액 중에는 글리신 외에, 미량의 아스파라긴산 및 발린의 존재도 확인되었다.
(3) 포르밀기에 대한 작용
10 mM 의 For-Met-Leu-Phe-Lys (30% 아세트산용액) 0.5 ㎕ 에 4 밀리단위의 효소 표준품 (3.5 ㎕), 0.1 M 의 N-에틸모르폴린 25 ㎕, 증류수 21 ㎕ 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 0, 20, 40, 60, 120 분간 반응시킨 후, 반응에 의해 생성된 유리아미노산을 상기와 동일한 조작으로 분석하였다. 도 9 에 그 결과를 나타낸다. 도 9 에 나타낸 바와 같이, 반응액 중에는 먼저 포르밀기를 잃은 메티티오닌이 유리되어 있고, 본 발명의 효소가 포르밀기를 유리하는 활성을 갖고 있는 것이 나타났다. 또, 이 외의 아미노산 (루신, 페닐알라닌, 리신) 생성의 시간의 경과에 따른 변화로부터 본 효소가 상기 기질 펩티드의 아미노말단측에서 순차적으로 아미노산을 유리하고 있는 것도 나타났다.
(4) 미리스토일기에 대한 작용
1 mM 의 Myr-Phe-Ala-Arg-Lys-Gly-Ala-Leu-Arg-Gln 용액 5 ㎕ 에, 4 밀리단위의 효소 표준품 (3.5 ㎕), 0.1 M 의 N-에틸모르폴린 아세트산 완충액 (pH9.0) 25 ㎕, 증류수 16.5 ㎕ 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 0, 1.5, 3, 6, 9 시간 반응시킨 후, 반응에 의해 생성된 유리아미노산을 상기와 동일한조작으로 분석하였다. 도 10 에 그 결과를 나타낸다. 도 10 에 나타낸 바와 같이, 반응액 중에 먼저 미리스토일기를 잃은 페닐알라닌이 유리되어 있고, 본 발명의 효소가 밀리스리톨기를 유리하는 활성을 갖고 있는 것이 나타났다. 또 이 이외의 아미노산생성의 시간의 경과에 따른 변화로부터 본 효소가 상기 기질 펩티드의 아미노말단측에서 순차적으로 아미노산을 유리하고 있는 것도 나타났다.
또 기질을 Myr-Gly-Ala-Gly-Ala-Ser-Ala-Glu-Glu-Lys 로 대체하여 상기와 동일한 실험을 행한 결과를 도 11 에 나타냈다. 상기의 기질 펩티드는 분자내에 2 잔기의 글리신, 3 잔기의 알라닌을 갖고 있기 때문에 도 11 의 결과로부터 아미노산의 유리의 순서를 결정하는 것은 어렵지만, 본 발명의 효소가 기질의 아미노산말단측으로부터 작용하고 있는 것 및 본 발명의 효소가 미리스토일기를 유리하는 활성을 갖고 있는 것이 시사되었다.
실시예 4
(실시예 1 에서 조제한 효소표준품의 단백질에 대한 아미노펩티다아제 활성의 확인)
상기의 효소표준품의 단백질에 대한 작용을, 닭의 난백 환원 라이소자임을 기질로 사용하여 조사하였다.
1 mM 닭의 난백 환원 라이소자임 (수용성, 분자량 약 14000, 외꼬우쥰야꾸고교사 제조) 5 ㎕ 에, 8 밀리단위의 효소표준품 (1.6 ㎕), 0.1 mM 의 CoCl2를 함유하는 50 mM 인산수소이나트륨-수산화나트륨 완충액 (pH11.0) 50 ㎕, 증류수 43.4 ㎕ 를 첨가하고, 50 ℃ 에서 0, 40, 80, 120, 180, 240 분간 반응시켰다. 반응액의 일부를 L-8500 형 고속아미노산 분석계 (히타치세이사꾸쇼 제조) 를 이용한 아미노산 분석을 행하여, 반응액 중에 생성된 유리아미노산을 정량하였다. 도 12 에 그 결과를 나타낸다. 도 12 에 나타낸 바와 같이, 반응액 중에 환원 라이소자임의 아미노말단에 존재하는 리신, 발린, 페닐알라닌, 글리신, 알기닌이 유리되고 있고, 그 생성량의 시간의 경과에 따른 변화로부터 본 효소가 환원 라이소자임의 아미노말단측에서 작용하여 아미노산을 순차적으로 유리하고 있는 것이 나타났다.
또한, 여기에서 사용한 환원 라이소자임의 아미노말단으로부터의 아미노산 서열은, Lys-Val-Phe-Gly-Arg… 의 순서였다.
실시예 5
(N 말단이 아세틸기에 의해 블록된 아미노말단 보호기 유리효소의 제작)
(1) 아미노말단 보호기 유리효소 유전자의 개질
서열목록의 서열번호: 1 에 기재된 아미노산서열로 이루어지는 효소의 N-말단 아미노산서열이 아세틸기 부가 시그널 Met-Asp 가 되도록 pDAP 에 변이를 도입하였다. 구체적으로, 이 효소의 N-말단으로부터 2 번째의 아미노산인 발린 코돈을 아스파라긴산 코돈으로의 치환용인 서열목록의 서열번호: 12 에 기재된 염기서열로 이루어진 합성 DNA 와, 플라스미드 pDAP 상의 멀티 크로닝사이트 내의 서열에서 HindⅢ 및 SphI 각 제한효소사이트의 파괴용인 서열번호: 13 에 기재된 염기서열로 이루어진 합성 DNA 를 프라이머 쌍으로 사용하고, pDAP DNA 를 주형으로 하여 PCR 을 행하였다. PCR 반응후, 이 반응액을 SphI (다까라슈조사 제조) 로 효소처리하여 변이가 도입되지 않은 플라스미드를 절단한 후 대장균 JM109 (다까라슈조사 제조) 에 도입하여, 얻어진 형질전환체를 이용하여 원하는 변이도입 플라스미드를 조제하였다. 다음에 이 플라스미드 DNA 를 주형으로 하고, 이 DNA 의 단백코드 영역에서의 단백개시 코돈의 바로 상류에 BamHI 사이트의 도입용인 서열목록의 서열번호: 14 에 기재된 염기서열로 이루어지는 합성 DNA 와, 서열목록의 서열번호: 15 에 기재된 이 DNA 의 단백코드영역의 하류영역에 상보적인 염기서열로 이루어지는 합성 DNA 를 프라이머 쌍으로 사용하여 PCR 을 행하였다. 이 반응액을 아가로스 전기영동에 이용하여, 증폭된 약 1.2 kb 의 DNA 단편을 아가로스겔에서 회수하였다. 이 DNA 단편을 BamHI (다까라슈조사 제조) 및 HindⅢ (다까라슈조사 제조) 로 절단하고, 대장균과 효모의 셔틀벡터인 플라스미드벡터 VT103-L 의 BamHI, HindⅢ 사이트를 이용하여 삽입하였다. 이 재조합 플라스미드를 대장균 JM109 에 도입하고, 얻어진 형질전환체로 플라스미드 DNA 를 조제하였다.
(2) 개질효소의 발현
얻어진 플라스미드 DNA 를 효모 BJ2168 에 도입한 후, 영양요구성 플레이트 (이스트 질소 베이스 6.7g/리터, 글루코스 20g/리터, 트립토판 20 ㎎/리터, 히스티딘 20 ㎎/리터, 우라실 20 ㎎/리터, 아가 15g/리터) 상에서 얻어진 형질전환체를 개별로 YPD 배지 (효모엑기스 10g/리터, 펩톤 20g/리터, 글루코스 20g/리터) 5 ㎖을 함유하는 시험관에 접종하여, 30 ℃ 에서 16 시간 배양하였다. 각 배양액을 개별로 상기의 영양요구성배지 500 ㎖ 을 함유하는 삼각플라스크에 접종하여 30 ℃ 에서 16 시간 배양하였다. 이 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하였다. 얻어진 균체를 50 ㎖ 의 완충액 C (1M 솔비톨, 50 mM 트리스-HC1, pH7.5, 30 mM DTT) 에 현탁하고, 30 ℃에서 10 분간 보온후, 원심분리하여 얻은 균체를, 다시 10 ㎖ 의 완충액 D (1 M 솔비톨, 50 mM 트리스-HC1, pH7.5, 2mM DTT) 에 현탁하고, 자이모리에이스 100T (나마카가꾸고교사 제조) 를 최종농도 0.5 ㎎/㎖ 가 되도록 첨가하고, 300 ℃에서 30 분간 보온후 원심분리하여, 프로토플라스트를 얻었다. 얻어진 프로토플라스트를 20 ㎖ 의 완충액 E (50 mM 트리스-HC1, pH7.5, 2mM DTT) 에 현탁하고, EDTA, KC1, Triton X-100 을 각각 최종농도 1mM, 0.2 M, 0.2% 가 되도록 첨가하고, 37 ℃에서 5 분간 보온하였다. 이 현탁액을 100 ℃, 15 분간의 열처리를 행한 후, 원심분리하여 분해물을 얻었다. 얻어진 분해물로부터, Met-MCA 분해활성을 지표로 하여, 실시예 1 의 (9) 기재의 아미노말단 보호기 유리효소와 동등한 정제법에 따라 개질효소 표준품을 조제하였다. 또한, 이 개질효소 표준품의 1 단위는, Met-MCA 를 기질로 하여, pH7.6, 75℃에서 1 분간에 1 μmol 의 7-아미노-4-메틸쿠말린을 생성할 수 있는 효소량으로 하였다. 상기 단백질을 발현하는 효모는, Saccharomyces cerevisiae BJ2168/pAcDAP 라 명명, 표시되어, 일본국 이바라기껭 쓰꾸바시 히가시 1 쵸메 1 방 3고(우편번호 305) 의 통상산업성 공업기술원 생명공학기술연구소에 FERM BP-5952 로서 기탁되어 있다 (원기탁일 : 1997년 5월 23일).
(3) 개질효소의 아미노말단 보호기 유리활성의 측정
(2) 에서 조제한 개질효소 표준품의 아미노말단 보호기 유리활성을 실시예 3 의 (2) 및 (4) 기재의 방법에 따라 측정하였다. 그 결과, 이 개질효소는 펩티드 N 말단의 아세틸기 및 미리스토일기에 대한 유리활성을 나타내고, 또한 펩티드 N 말단에서 순차적으로 아미노산을 유리시키는 활성을 나타냈다.
(4) 개질효소의 N 말단 아세틸화의 확인
이 개질효소의 N 말단이 아세틸화되어 있는지에 대하여 질량분석으로 확인하였다. 즉, 실시예 1 에서 조제한 효소와 이 개질효소의 질량을 API/300 (PE-Sciex사 제조) 로 측정하여 그 질량차를 구하였다. 그 결과, 대장균에서 발현시키고, 실시예 1 에서 조제한 효소의 분자량은 38586 이고, 이 개질효소의 분자량은 38643 이었다. 2 종의 효소간의 분자량차 57 은 발린이 아스파라긴산으로 치환된 분자량차 15 및 아세틸기의 부가에 의한 분자량 증가분 42 의 합계에 일치하였다.
또한 이 개질효소를, 에드만분해에 의한 N-말단 아미노산 서열해석방법을 채용한 HP G1000A 단백질 시퀀서 (Hewlett Packard사 제조) 에 이용했는데 시그널은 얻어지지 않고, 이 개질효소는 에드만분석을 받지않는 것이 명확해졌다.
(5) 개질효소를 이용한 펩티드의 아미노말단 서열의 해석
개질효소의 기질로는 N-말단이 아세틸화된 소의 적혈구 슈퍼록시드 디스무타아제 (분자량 15551, 워싱톤 바이오케미칼 코포레이션사 제조) 의 카르복시메틸화물을 이용하였다. 이 기질을 0.4 mM 이 되도록 조제한 용액 5 ㎕ 에, (2) 에서 조제한 600 밀리단위의 개질효소 표준품 (52 ㎕), 100 mM 의 트리메틸아민-HC1 (pH11.0) 완충액 100 ㎕, 10 mM 의 CoCl22 ㎕, 증류수 41 ㎕ 를 첨가하여, 50 ℃에서 48 시간 반응후, 반응액을 그대로 HP G10000A 단백질 시퀀서에 이용하여 아미노산 서열분석을 행하였다. 얻어진 아미노산서열 데이터를 서열목록의 서열번호: 16 에 나타냈다. 이 서열은 기질로서 사용한 슈퍼록시드 디스무타아제의 공지된 아미노산서열과 일치하였다. 또, 아미노산서열분석에 있어서 상기 슈퍼록시드 디스무타아제의 아미노산서열 이외의 시그널의 혼입은 없었다.
실시예 6
(질량분석법을 이용한 펩티드의 아미노말단 서열의 해석)
실시예 1에서 조제한 효소 표준품과 기질로서 For-Met-Leu-Phe-Lys 를 사용하여, 질량분석법을 이용한 펩티드의 아미노말단 서열의 해석을 행하였다.
10 mM 의 For-Met-Leu-Phe-Lys (30 % 아세트산용액) 1.5 ㎕ 에 2.4 밀리단위의 효소 표준품 (2.1 ㎕), 0.1M 의 탄산수소암모늄 75 ㎕, 1mM 의 CoCl2(15 ㎕), 증류수 56.4 ㎕ 를 첨가하고, 30 ℃에서 4 시간 반응시킨 후, 포름산 15 ㎕ 를 첨가하여 반응을 정지하였다. 다음에 이 반응액을 DEVELOSIL ODS-HG-5 칼럼 (NOMURA CHEMICAL사 제조) 을 이용한 역상 HPLC (고속액체 크로마토그래피) 를 사용하여, 반응액중의 펩티드를 함유하는 4 개의 피크를 분리추출하였다. 또한, 각 피크에 함유되는 펩티드의 분자량을 JMS-HX100 이중수렴형 FAB 질량분석계 (JEOL사 제조)를 이용하여 측정하였다. 각 피크의 용출시간, 피크 중에 함유되는 펩티드의 분자량, 및 이 분자량에서 추정되는 각 펩티드의 서열을 표 1 에 나타낸다.
피크번호 용출시간(분) 측정분자량 추정배열
1 12.125 측정불가 -
2 21.008 407.3 Leu-Phe-Lys
3 27.358 538.3 Met-Leu-Phe-Lys
4 32.583 566.4 For-Met-Leu-Phe-Lys
표 1 에 나타난 바와 같이, 반응액 중에 생성된 펩티드 중 피크 4 로 분리된 것은 미반응의 기질 펩티드이었다. 또, 피크 3 에 함유되는 펩티드의 분자량은 기질 펩티드에서 포르밀기가 떨어진 것에, 추가로 피크 2 에 함유되지만 분자량은 기질펩티드에서 포르밀기, 및 메티오닌이 유리된 것에 각각 일치하였다. 이 결과에서 본 발명의 효소가 이 기질펩티드의 아미노말단측에서 작용하여, 포르밀기, 메티오닌을 유리해 가는 것이 명확해졌다. 또, 이와 같이 본 발명의 효소를 펩티드에 작용시켜 얻어지는 각종의 부분분해 펩티드의 분자량을 정확하게 측정하여, 이들을 비교함으로써, 아미노말단의 보호기의 종류를 함유한 펩티드의 아미노말단 서열을 결정할 수 있는 것이 나타났다.
본 발명의 아미노말단 보호기 유리효소는, 2 종 이상의 보호기에 대하여 아미노말단 보호기 유리활성을 나타낸다. 또 본 발명에 의해, 이와 같은 효소를 이용한 펩티드의 아미노말단 보호기의 제거방법이 제공된다. 이 효소는 펩티드, 특히 아미노말단이 미확인의 보호기에 의해 블록된 단백질 및 펩티드의 아미노산 서열해석에 유용하다. 또, 본 발명에 의해, 이와 같은 효소를 코드하는 DNA 나, 이 효소의 제조방법이 제공된다. 이 DNA 를 개질시켜 제작된 N 말단 아세틸화 아미노말단 보호기 유리효소는 에드만 분해를 받지않고, 특히 에드만분해를 이용한 아미노산서열 해석방법에서 이 효소유래의 아미노산서열 정보가 노이즈로 되지않아 유용하다.
[서열목록]
서열번호: 1
서열의 길이 : 348
서열의 타입 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 펩티드
서열의 기재방법: 서열번호: 1:
서열번호: 2
서열의 길이 : 1044
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 게놈 DNA
서열의 기재방법: 서열번호: 2:
서열번호: 3
서열의 길이 : 1247
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 게놈 DNA
서열의 기재방법: 서열번호: 3:
서열번호: 4
서열의 길이 : 12
서열의 타입 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 펩티드
서열특징 : 1 (N-피로글루타밀-루신)
서열의 기재방법: 서열번호: 4:
서열번호: 5
서열의 길이 : 13
서열의 타입 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 펩티드
서열특징 : 1 (N-아세틸-세린)
서열의 기재방법: 서열번호: 5:
서열번호: 6
서열의 길이 : 5
서열의 타입 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 펩티드
서열특징 : 1 (N-아세틸-글리신)
서열의 기재방법: 서열번호: 6:
서열번호: 7
서열의 길이 : 4
서열의 타입 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 펩티드
서열특징 : 1 (N-포르밀-메티오닌)
서열의 기재방법: 서열번호: 7:
서열번호: 8
서열의 길이 : 9
서열의 타입 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 펩티드
서열특징 : 1 (N-미리스토일-페닐알라닌)
서열의 기재방법: 서열번호: 8:
서열번호: 9
서열의 길이 : 9
서열의 타입 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 펩티드
서열특징 : 1 (N-미리스토일-글리신)
서열의 기재방법: 서열번호: 9:
서열번호: 10
서열의 길이 : 348
서열의 타입 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 펩티드
서열특징 : 1 (N-아세틸-메티오닌)
서열의 기재방법: 서열번호: 10:
서열번호: 11
서열의 길이 : 1044
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 게놈 DNA
서열의 기재방법: 서열번호: 11:
서열번호: 12
서열의 길이 : 24
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 기타 핵산 (합성 DNA)
서열의 기재방법: 서열번호: 12:
서열번호: 13
서열의 길이 : 20
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 기타 핵산 (합성 DNA)
서열의 기재방법: 서열번호: 13:
서열번호: 14
서열의 길이 : 27
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 기타 핵산 (합성 DNA)
서열의 기재방법: 서열번호: 14:
서열번호: 15
서열의 길이 : 24
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 기타 핵산 (합성 DNA)
서열의 기재방법: 서열번호: 15:
서열번호: 16
서열의 길이 : 151
서열의 타입 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 직쇄상
분자의 타입 : 펩티드
서열의 기재방법: 서열번호: 16:

Claims (24)

  1. 보호기에 의해 아미노말단이 블록된 펩티드에 작용하여 이 보호기를 유리시키는 활성 (이하 "아미노말단 보호기 유리활성" 이라 칭함) 을 갖는 효소로서, 2 종 이상의 보호기에 대하여 상기 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 아미노말단 보호기 유리효소.
  2. 제 1 항에 있어서, 아세틸기, 피로글루타밀기, 포르밀기 및 미리스토일기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2 종 이상의 보호기에 대하여 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 효소.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 추가로 아미노펩티다아제활성을 갖는 효소.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 하기의 이화학적성질을 갖는 효소.
    (1) 최적온도 : pH7.6 에서 75 내지 95℃
    (2) 최적 pH : pH6.5 내지 9.5
    (3) 각종 시약의 영향 : 상기 활성은 아마스타틴에 의해 저해되고, CoCl2에 의해 촉진된다.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, 서열목록의 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산서열의 전부 또는 그의 일부를 함유하는 것으로 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 효소.
  6. 서열목록의 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산서열에, 1 개 또는 복수의 아미노산잔기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환의 적어도 하나가 되어 있고, 또한 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 제 5 항 효소의 기능적 동등물.
  7. 제 6 항에 있어서, 아미노말단이 보호기에 의해 블록된 기능적 동등물.
  8. 제 7 항에 있어서, 보호기가 아세틸기인 기능적 동등물.
  9. 제 8 항에 있어서, 서열목록의 서열번호: 10 에 나타낸 아미노산서열을 갖는 기능적 동등물.
  10. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항의 아미노말단 보호기 유리효소를 코드하는 DNA.
  11. 서열목록의 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산서열의 전부 또는 그의 일부를 함유하는 것으로, 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드하는 DNA.
  12. 서열목록의 서열번호: 2 에 나타낸 DNA 의 전부 또는 그의 일부를 함유하는 것으로, 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드하는 DNA.
  13. 서열목록의 서열번호: 1 에 나타낸 아미노산서열에, 1 개 또는 복수의 아미노산잔기가 결실, 부가, 삽입 또는 치환의 적어도 하나가 되어 있고, 또한 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 단백질을 코드하는 DNA.
  14. 제 13 항에 있어서, 서열목록의 서열번호: 11 에 나타낸 염기서열을 갖는 DNA.
  15. 제 10 항 내지 제 14 항중 어느 한항의 DNA 에 하이브리다이즈 가능하며, 아미노말단 보호기 유리활성을 나타내는 단백질을 코드하는 DNA.
  16. 제 10 항 내지 제 14 항중 어느 한항의 DNA 를 함유하는 재조합 DNA.
  17. 제 16 항의 재조합 DNA 가 삽입되어 있고, 미생물, 동물세포 또는 식물세포를 숙주세포로 하는 발현벡터.
  18. 제 17 항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
  19. 제 18 항의 형질전환체를 배양하고, 이 배양물 중에서 아미노말단 보호기 유리활성을 갖는 단백질 또는 상기 단백질의 활성과 기능적으로 동등한 활성을 갖는 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는 아미노말단 보호기 유리효소 또는 그 기능적 동등물의 제조방법.
  20. 보호기에 의해 아미노말단이 블록된 펩티드에 제 1항 내지 제 9 항중 어느 한항의 아미노말단 보호기 유리효소 또는 그 기능적 동등물을 반응시켜 아미노말단의 보호기를 유리시키는 것을 특징으로 하는 아미노말단 보호기의 제거방법.
  21. 보호기에 의해 아미노말단이 블록된 펩티드의 아미노산서열의 해석방법에 있어서, 제 20 항에 따른 제거방법에 의해 이 보호기를 유리시켜 생성된 펩티드를 아미노산서열의 해석에 이용하는 것을 특징으로 하는 아미노산서열의 해석방법.
  22. 보호기에 의해 아미노말단이 블록된 펩티드의 아미노산서열의 해석에 사용되는 키트로서, 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한항의 아미노말단 보호기 유리효소 또는 그의 기능적 동등물을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
  23. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한항의 아미노말단 보호기 유리효소 또는 그의 기능적 동등물에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편.
  24. 제 10 항 내지 제 15 항중 어느 한항의 DNA 와 하이브리다이즈 가능한 합성 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머.
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