JPH0330673A - アシルアミノ酸遊離酵素様ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアシルアミノ酸遊離酵素のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド及びそのＤＮＡ配列に関する。

〔従来の技術〕

アシルアミノ酸遊離酵素は、Ｎ末端がアシル化されてい
るタンパク質・ペプチドよりアシルアミノ酸を遊離する
タンパク質加水分解酵素である。各種動物組織に広く存
在しており、細胞内でのタンパク質の翻訳後修飾の最も
一般的なＮ末端アセチル化を起こすＮ“−アセチルトラ
ンスフェラーゼと共に重要な役割を演じているのではな
いかと考えられている。

タンパク質Ｎ末端アセチル化は、動物、植物及びそのウ
ィルスに広く見られる現象である。

更に、数種の真核細胞中では半数以上の細胞内可溶性タ
ンパク質のＮ末端がアセチル化を受けていることが知ら
れている。例えば、マウスＬ細胞可溶性タンパク質の８
０％がアセチル化を受けていることがＪ、Ｌ、ブラウン
（Ｊ、Ｌ。

Ｂｒｏｗｎ）らによって報告されている〔ジャーナルオ
ブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌｏ
ｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ、ｙ）第
２５４巻、第１４４７頁（１９７９））。また、アセチ
ル化を受けているタンパク質のＮ末端アミノ酸には特異
性があり、グリシン、アラニン、セリン、メチオニン、
アスパラギン酸がＮ末端に来るとアセチル化が起き易い
ことが知られている〔メソッズ　イン　エンザイモロジ
ー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ１３ｎｚｙｍｏ１ｏｇｙ）第
１０６巻、第１６５頁（１９８４）〕。

このように、Ｎ末端がアセチル化されているタンパク質
は割合として多く、また末端アミノ酸の種類も多い。こ
のＮ末端アセチル化の生化学的意義について数種の説が
出されている。１つはＮ末端アセチル化という翻訳後修
飾によって、タンパク質加水分解酵素から細胞内タンパ
ク質を保護するするという説であり、タンパク質の生体
内での代謝との関係が考えられている。

また、分泌性タンパク質が生体膜を通り抜けるのにＮ末
端アセチル化が関与しているという報告もあるが、この
両説は共にまだ未知の部分が多い。

これらＮ末端アセチル化の生化学的意義の研究にアシル
アミノ酸遊離酵素は効果的である。

すなわち、Ｎ末端アセチル化を研究するためには、タン
パク質・ペプチド中のアセチル化されているアミノ酸残
基を微量で同定しなければならない。このためには、Ｎ
”−アセチル基、又はＮ″−アセチルアミノ酸を遊離さ
せることが必要であるが、いまだ、Ｎ′ｘ−アセチル化
されたタンパク質からアセチル基を遊離する方法は見つ
かっていない。しかし、アセチルアミノ酸を遊離する方
法は知られており、アシルアミノ酸遊離酵素がこの目的
達成に供されている。その方法は、まずＮ末端がアシル
化を受けているタンパク質を特異性の高いタンパク質加
水分解酵素で切断し、アシルアミノ酸遊離酵素が作用し
易い短いペプチドに分解する。それからアシルアミノ酸
遊離酵素を作用させてアシルアミノ酸を遊離させ、残っ
たペプチドは２番目のアミノ酸からエドマン分解法によ
り、アミノ酸配列分析を行い、アシルアミノ酸はマスス
ペクトル分析、逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃによる分析等で同定す
るというものである。

このようにアシルアミノ酸遊離酵素は、Ｎ末端アシル化
タンパク質の一次構造解析に極めて有効な手段である。

更にアシルアミノ酸遊離酵素をコードするＤＮＡ配列は
、了シルアミノ酸遊離酵素の生体内での発現を調べるの
に有用である。

〔発明が解決しようとする課題〕

アシルアミノ酸遊離酵素は、動物組織に広く分布し、ラ
ット肝臓や脳、ブタ肝臓、ウシ肝臓、ヒツジ赤血球、ヒ
ト赤血球、ヒト胎盤からの精製が報告されている〔ジャ
ーナル　オブ　バイオケ　ミ　ス　ト　リ　−（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第７
７巻、第８９頁（１９７５）　　ジャーナルオブ　ニュ
ーロケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕ−ｒ
ｏｃｈｍｉｓｔｒｙ）第４１巻、第２０１頁（１９８３
）ジャーナル　オブ　バイオケミストリー第９３巻、第
１２１７頁（１９８３）　　ジャーナルオブ　バイオロ
ジカル　ケミトスリー第２５３巻、第５０１２頁（１９
７８）　　ジャーナルオブ　バイオロジカル　ケミスト
リー第２４７巻、第２２１７頁（１９７２）　、バイオ
ケミカル　アンド　バイオフィジカル　リサーチ　コミ
ュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　
Ｂｉｏｐｈｙ−ｓｌｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍ
ｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）第１２６巻、第９３３頁（１
９８５）、ユーロピアン　ジャーナル　才ブ　バイオケ
ミストリー（ＢｕｒｏｐｉａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第９７巻、第２０５頁（１
９７９））。しかし、その遺伝子構造やアミノ酸配列は
依然として不明である。

本発明の目的は、アシルアミノ酸遊離酵素の遺伝子構造
とアミノ酸配列を明らかにし、遺伝子工学的に本酵素を
製造する可能性を明らかにすることにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は第１図で表
されるアミノ酸配列を有していることを特徴とするアシ
ルアミノ酸遊離酵素様ポリペプチドに関する。

また、本発明の第２の発明は第１の発明のポリペプチド
をコードする塩基配列に関する。

本発明者らは、ブタｍ　−ＲＮ　Ａよりｃ　ＤＮＡライ
ブラリーを作製し、そこから、ブタアシルアミノ酸遊離
酵素をコードするｃＤＮＡクロ−ンを選び出し、その塩
基配列分析から、ブタアシルアミノ酸遊離酵素のアミノ
酸配列を決定し、本発明を完成させた。

以下本発明を具体的に説明する。

ブタアシルアミノ酸遊離酵素をコードするｃＤＮＡのク
ローニングの方法は公知の方法が用いられる。例えば、
ブタアシルアミノ酸遊離酵素が分布する肝臓や脳等から
、ポＩＪ（Ａ）を含むＲＮＡを抽出し、これをオリゴ（
ｄＴ）を結合させたセルロース担体等で精製する。これ
をテンプレート（鋳型）として逆転写酵素を作用させて
ｃＤＮＡ合成を行い、岡山−バーブ法あるいはガブラー
ーホフマン法（Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍ−ａｎｎ法）
等の方法により、プラスミドやファージベクターに接続
して、宿主に導入し、ｃＤＮＡライブラリーを作製する
。このようなライブラリーは、市販もされており、例え
ばクローンチック社から購入することもできる。既にｃ
ＤＮＡの一部が得られている場合には、ブライマー伸長
法によるｃＤＮＡライブラリーの作製も行われる。この
方法は５′側のｃＤＮＡをクロニングするのに特に有効
である。

ｃＤＮＡライブラリーから目的のブタアシルアミノ酸遊
離酵素をコードするｃＤＮＡクローンをスクリーニング
するためには、まずブタアシルアミノ酸遊離酵素の部分
アミノ酸配列を決定し、それから推定した合成りＮＡプ
ローブを作成しなければならない。部分アミノ酸配列を
決定するためには、まず精製ブタアシルアミノ酸遊離酵
素に特異性の高いタンパク質加水分解酵素を作用させ加
水分解し、ペプチドを逆相ＨＰＬＣを用いて分離精製す
る。これをエドマン分解法によりアミノ酸配列分析を行
い、決定するのが効果的である。この部分アミノ酸配列
から合成りＮＡプローブをデザインするには２種類の方
法がある。一つは考えられる組合せの配列をすべて合成
してゆく方法である。もう一つは、今まで調べられてき
たコドンの使用頻度の高いものを用いて長いＤＮＡを合
成して使う方法である。

ＤＮＡプローブでライブラリーをスクリーニングする手
段としては、まずライブラリーをプレート上で増幅させ
、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロースや
ナイロンのフィルターに移し取り、変性処理によりＤＮ
Ａをフィルターに固定する。このフィルターをあらかじ
め３２ｐ等で標識したＤＮＡプローブを含む溶液中でイ
ンキュベートし、フィルター上のＤＮＡと、プローブＤ
ＮＡとのハイブリッドを形成させる（以下、この操作を
ハイブリダイゼーションと略す）。インキュベーション
の温度は、用いるプローブのＴｍ　（融解温度）を目安
として設定する。ハイブリダイゼーション後、非特異的
吸着を洗い流し、オートラジオグラフィーにより、プロ
ーブとハイブリッドを形成したクローンを同定する。こ
の操作を再度行ってクローンを単離し、次の分析を行う
。

組換え体が大腸菌の場合は、試験管等で少量培養を行い
、プラスミドを常法によって抽出、制限酵素による切断
反応を行い、アガロース又はアクリルアミドゲル電気泳
動に付して、クローン化された挿入断片の生成を調べる
。更にその泳動パターンをニトロセルロースやナイロン
膜に移し取り、前述の方法によりハイブリダイゼーショ
ンを行って挿入断片がＤＮＡプローブとハイブリッドを
形成するか否かを調べる。最終的には挿入断片の塩基配
列を公知の方法により決定する。組換え体がファージの
場合も基本的には同様のステップでクローンの分析を行
う。

あらかじめ培養した宿主大腸菌にクローン化ファージを
感染させ、その溶菌液からファージＤＮＡを調製する。

ファージＤＮＡの具体的な調製法に関しては、例えば続
生化学実験講座１「遺伝子研究法■」の第１００頁（東
京化学同人出版）に記載されている。ファージＤＮＡを
制限酵素で切断してゲル電気泳動に付し、挿入断片の確
認を行い、更に、プローブＤＮＡとハイブリダイ、ズす
ることを調べる。最終的には塩基配列を決定することに
より、クローンの１ｇ認を行う。

決定された塩基配列を、ブタアシルアミノ酸遊離酵素の
Ｎ末端、Ｃ末端分析や、アミノ酸組成分析、分子量等と
比較してその遺伝子構造及びアミノ酸配列を知ることが
できる。

以上述べてきたごとく、本発明により、ブタアシルアミ
ノ酸遊離酵素の一次構造及び遺伝子構造が明らかになっ
た。

〔実施例〕

次に本発明の実施例を示すが、これらは本発明を限定す
るものではない。

実施例１　ブタアシルアミノ酸遊離酵素ｃＤＮＡクロー
ニング （１−１）　　ｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニ
ング ＜ｍＲＮＡの抽出、精製・ｃ　ＤＮＡライブラリーの調
製〉 と殺直後の正常ブタ肝臓を液体窒素で凍結し、−７０℃
で保存していたもの４ｇよりアマジャム社（英国）製Ｒ
ＮＡ抽出キット（コード番号ＲＰＮ、１２６４）を用い
てＲＮＡの抽出を行い、３．６ｍｇの全ＲＮＡを得た。

これをオリコ（ｄ　Ｔ）セルロースカラムに通シて１３
０μｇのポリ　（Ａ）ＲＮＡを得た。このポリ　（’Ａ
）ＲＮＡ８μｇよりアマジャム社製ｃＤＮＡ合成キット
　（コード番号ＲＰＮ、１２５６）を使って、オリコ（
ｄ　Ｔ）ブライマーによりｃＤＮＡを合成した。次に同
じくアマジャム社製ｃＤＮＡクローニングシステム・λ
ｇｔｌｏ（コード番号ＰＲＮ、１２５７）を使って、無
細胞系で、ｃＤＮＡをλｇｔｌＯのＥｃｏＲＩサイトに
組込んだものを、ラムダ−ファージにパッケージングし
た。

ただし、パッケージには、ストラテジーン社（米国）の
ギガパックゴールド（ＧＩＧＡＰＡＣＫＧＯＬＤ　）を
用いた。

〈ポジティブクローンの同定、単離〉 前記ｃＤＮＡライブラリーを宿主菌としてＣ６００Ｈｆ
１株を用い、１４ｃｍＸ１０ｃｍの角シャーレ２０枚に
、１枚当り約２０．０００個のプラークを形成させた。

すなわち４　ｍｇ　／　ｒｎｌのマルトースを含むＬ培
地でＣ６００Ｈｆｌを３７℃で一晩培養した培養液０．
２ｍｌ！に、ファージ液　０．１−を混ぜ３７℃で１５
分間保温した。これに軟寒天（Ｌ培地に終濃度０．６％
となるようにアガロースを加え、オートクレーブで処理
した後、５０℃に保ったもの）８ｍｌを加え、Ｌ−プレ
ート上に広げ、固化後３７℃で１０時間程度保温してフ
ァージのプラークを形成させた（以下、この操作をブレ
ーティングと略す）。

次にこのプレートより２枚のハイブリダイゼーション用
フィルターを調製した。すなわち、プレート表面にアマ
ジャム社製ナイロン膜〔商品名ハイボンド（Ｈｙｂｏｎ
ｄ−Ｎ）　］を３０秒間接触させ、これを０．５Ｍ　Ｎ
ａ０ｆｌ　、　１．５Ｍ　ＮａＣ１の溶液に浸した口紙
上で５分間（変性）、０．５Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）−ｔ
ｌｃ１緩衝液（ｐＨ７，０）　　　１．５ＭＮａＣ１の
溶液に浸した口紙上で５分間（中和）処理した後、２ｘ
ＳＳＣ［：ＮａＣ１１７，５３ｇ　、クエン酸ナトリウ
ム８．８２ｇを１βの水に溶かしたもの〕でリンスし、
口紙上で乾燥させた（以下この処理をフィルター処理と
略す）。２枚目のフィルター処理は、プレートとナイロ
ン膜の接触時間を２分間として行った。ＵＶランプで５
分間このフィルターを照射してＤＮＡを固定化した。

ハイブリダイゼーションのプローブとしては、アシルア
ミノ酸遊離酵素の部分アミノ酸配列より推定した１１０
＋ｎｅｔの合成りＮＡを用いた。

部分アミノ酸配列は、精製されたブタ肝臓アシルアミノ
酸遊離酵素をタンパク質加水分解酵素アクロモバクタ−
プロテアーゼＩ消化後ＨＰＬＣで分取し、気相式ペプチ
ドシークエンサーで決定した。合成りＮＡは、Ｒ，ラセ
（Ｒ，Ｌａｔｈｅ）の方法〔文献：ジャーナル　オブ　
モレキュラバイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　
）第１８３巻、第１〜１２頁（１９８５）　］によりデ
ザインした。この合成りＮＡ２２５ｎｇを宝酒造社製メ
ガラベルキット　（コード番号６０７０）を用いて３２
Ｆで標識し、１．８Ｘ　１０　’　ｃｐｍ　／μｇの比
活性のプローグを得た。このプローブの全量と上記調製
したフィルターを用い、６ｘＳＳＣ，１％ＳＤ３１００
μｇ／ｒｎｌのニシン精子ＤＮＡ。

５Ｘデンハルト　（口ｅｎｈａｒｄｔ　）　　［ウシ血
清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそ
れぞれ０．１％の濃度で含む〕を含む約１００−の溶液
中で６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。次
に室温の６ｘＳＳＣ中で１０分間フィルターを洗浄した
。更に室温の２ＸＳＳＣ中で１０分間を２回洗浄した後
、４０℃の０．２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ中で３０分間を２回洗
浄した。フィルターを口紙上に移し余分な水分を除いた
後、ワットマン３ＭＭ口紙にはりつけ、増感紙を当てて
一晩−７０℃でオートラジオグラフを行った。その結果
合計で５個のポジティブシグナルを得た。

これらのシグナルに相当する位置のプラークを寒天ごと
０．２ｍｊ！の３Ｍ溶液［：　ＮａＣ１５，８ｇ。

Ｍｇ５Ｌ・７Ｌ０２　ｇｌｌＭ）リス−ＨＣｌ緩衝液（
ｐＨ７，５）　５０ｎｅ、２％ゼラチン５ｒｎｌを水に
溶かし全量を１１とする〕中に回収、懸濁し、適度に希
釈してブレーティングしく約３００プラーク／φ９　ｃ
ｍ丸形シャーレ）上記と同様の操作を行った（以下、２
次スクリーニングと略す）。その結果、全クローンに関
してシングルプラークを単離することができた。これら
のクローンをλＡ□Ｅ４１９、λＡＡ、４５０、λＡＡ
ＲＥ４５１、λＡＡ、１Ｅ４５２、λＡＡＲＥ４５３と
命名した。

〈λＤＮＡの調製〉 クローン化できたファージを宿主菌として大腸菌Ｌ８７
株を用いて液体培養（遺伝子研究法■、第１００頁、東
京化学同人出版）を行った。

これによって４０ｍ１の培養液から調製し、約４０μｇ
のλＤＮＡを得た。

く挿入断片の同定と抽出精製〉 調製した上記ＤＮＡ２０μｇを１００μ１１ｘＥｃｏＲ
Ｉ緩衝液（組成は全酒造・遺伝子工学用試薬カタログ記
載）中１２０ユニットのＥｃｏＲＩと共に３７℃　１．
５時間保温し、更に終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように
ＲＮａ５ｅＡを加え１０分間保温した。この反応液中か
ら５μｌを取出し、１μｌの６倍濃縮電気泳動用緩衝液
［０，２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシ
レンシアツール、３０％グリセロール、以下、６　ｘＥ
Ｐ緩衡液と略す〕を加え１．０％アガロースゲルで電気
泳動し挿入断片を同定した。その結果、以下のような大
きさの断片が挿入されていることが判明した。λＡＡＲ
Ｅ４１９　１．９　ｋ　ｂ。

ｐｏｌ　λＡＡ１１１４５０　１．１　ｋｂ、ｐｌ、λ
ＡＡｌｌ［４５１−１，３ｋｂ、ｐ、、λＡＡ□４５２
−１．８　ｋ　ｂ、ｐ、、λＡＡＩＥ４５３　０，６　
ｋｂ、ｐ。

次にＥｃｏＲＩ消化した残りの反応液に２０μｌの６ｘ
ＢＰ緩衝液を加え、１．０％アガロースゲルで電気泳動
した。泳動後ゲルを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイ
ド溶液で１０分間染色した後、紫外線照射下で目的の挿
入断片を含む部分をゲルから切出した。これを電気抽出
用緩衝液（０，００４Ｍ　　）リス−酢酸、０．１ｍＭ
　　ＥＤＴＡｐＨ８，Ｏ１以下、ＥＥ緩衝液と略す）を
満たした透析チューブに挿入し、外液も同じ溶液を満た
し、１７Ｖ／ｃｍで２０分間通電した。

透析チューブからゲルを静かに抜き出した後、内液をよ
くかくはんして取出した。このＤＮＡ溶液に、等容のフ
ェノール／クロロホルム混液を加えかくはんし、１０．
００　Ｏｒｐｍで５分間遠心した後上層を回収した（以
下、フェノール／クロロホルム抽出と略す）。上層に１
／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液と２倍量のエタノー
ルを加えＤＮＡを沈殿させた（以下、エタノール沈殿と
略す）　−７０℃に１５分間放置した後、１０．００　
Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿を８０％エタノー
ルでリンスした後減圧乾燥させ２０μβＴＥ緩衝液［１
０ｍＭ　　）リスＨＣＩ　ｐＨ７，５，０，１ｍＭ　　
ＥＤＴＡＩに溶解した。

〈挿入断片の制限酵素認識配列の同定〉得られた各クロ
ーンの挿入断片上にどのような制限酵素サイトがあるか
を調べるために、まず一番長い、λＡ□１１４１９の挿
入断片Ｌｏｎｇを、Ｍ１３ｍｐ１８のポリリンカーシー
フェンス内に認識配列が存在する制限酵素と、その他数
種の６塩基認識の制限酵素で消化し、電気泳動で切断パ
ターンを解析した。その結果、３ａｃＩ、ｐｓｔＩ、５
ｃａｌの認識配列が存在することが判明した。

次にｌｋｂ、ｐ、以上の断片をもつλＡＡ■４５０〜４
５２の３クロ一ン各１０ｎｇを５ａｃＩＸＰｓｔｌ、５
ｃａＩの制限酵素単独で消化し、λＡＡＲＥ４１９の挿
入断片とどのように重なっているかを調べた。

く挿入断片の塩基配列決定〉 λＡＡ、、４１９の挿入断片ＤＮＡ溶液１μｌと、Ｍ１
３ｍｐ１８（宝酒造）のＲＦＤＮＡをＥｃ。

Ｒｉ消化したもの５０ｎｇを、ライゲーションキット　
（宝酒造コード番号６０２１）を用いてライゲーション
を行った。このライゲーション反応液の１１５量を用い
て大腸菌ＪＭＩ　０９を形質転換し、４０μｇ／ｍｌの
濃度のＸ−Ｇａ１（５ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシド）と２０μｇ　／　ｍｌの
濃度の■ＰＴＧ　（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トシド）を含む軟寒天に、ＪＭＩ　０９をＬ培地で一晩
培養した培養液０．２ｍｊ２と共に混ぜＬ−プレートに
まいた。このプレートを３７℃で一晩保温し、形成した
白いプラークを選ぶことによって、断片が挿入されてい
る組換え体を得た。同様にしてλＡＡ□４５０．４５１
．４５２の断片については、Ｍ１３ｍｐ１９（宝酒造）
に組込んだ組換え体を得た。各クローンをＭＡＡＲＢ４
１９．４５０．４５１．４５２と命名した。

得られた組換え法名１２クローンのファージをプラーク
からとり、ＪＭＩ　Ｏ９株の一晩培養液をＬ培地で３／
１０００に希釈したちの５　ｍｌにうえることにより感
染させ、３７℃で６時間振とう培養した。これを９．０
０Ｏｒｐｍで遠心分離し、菌体の沈殿からアルカリ溶菌
法〔文献：１９８２年、コールド　スプリング　ハーバ
−ラボラトリ−発行、Ｔ、マニアステイス（、Ｔ。

Ｍａ旧ａｓｔｉｓ）ほか著、モレキュラー・クローニン
グ、ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ［１ｏｎｉｎｇ　　八Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａ
ｎｕａｌ）　、第３６８頁〕によってＲＦＤＮＡを調製
し、３０μβのＴＥ緩衝液に溶解した。このＤＮＡ溶液
３μβを１２ユニツトのＥｃｏＲＩで３７℃１時間酵素
消化し、５０ｔ−ｔｇ／ｍｌとなるようにＲＮａ５ｅＡ
を加え、３７℃１０分間保温した。６ｘＥＰ緩衝液を加
え、１％アガロースゲルで電気泳動し、切断パターンか
ら各挿入断片が入っていることを確認した。。

次に挿入断片の方向を決定するために、各ＲＦＤＮＡを
その挿入断片に認識配列がある制限酵素で消化した。す
なわちＭＡＡｕＥ４１９は５ａｃ１、　ＭＡＡＲＨ４５
０は５ｃａｌ、Ｈｉｎｃ　ＩＩ、ＭＡＡＩＩ［：４５１
はＳ　ｃａ　Ｉ　、　Ｐ　ｓｔ　Ｉ　、　ＭＡＡｕｓ４
５２は５ｃａＩ、ＨｉｎｃＩ［消化を行い、１％アガロ
ースゲルの電気泳動によって方向を決定し、各断片につ
いて逆向きに挿入断片が入ったＭ１３のクローンを得た
。そのクローンをそれぞれ、ＭＡＡＲＨ４１９−３、Ｍ
ＡＡＲＩ１４１９　４、ＭＡＡＩＩＥ４５０−１、ＭＡ
ＡｌｌＥ４５０　２、ＭＡＡＲＩｌ１４５１−１、ＭＡ
ＡＩｌ［１４５１−３、ＭＡＡｌｌ、４５２−１、ＭＡ
ＡｌｌＢ４５２−２と命名した。

次に一番長い挿入断片であるλＡＡ、１Ｅ４１９の断片
の全塩基配列を決定するために、タカラ（ＴａＫａＲａ
）キロシーフェンス用デレージョンキット　（宝酒造）
を用いＭ　ＡＡ□４１９＝３、Ｍ　ＡＡ□４１９−４．
２種類の向きのクローンについて、シーフェンス用ブラ
イマーアニーリング位置の側から挿入断片を１分解して
ゆき、いろいろな大きさの挿入断片を持つ誘導体を作製
した（以後、この操作をデレージョンと略す）ＭＡＡ、
８４１９−３より誘導したクローンをＭＡＡａＨ４１９
Ｆ１〜２Ｂ、Ｒ１０１〜１２４、Ｍ　ＡＡＲＲ４１９−
４より誘導したクローンをＭ　ＡＡ□４１９Ｒ１〜２８
、Ｒ１０１〜１２４と命名した。

上記誘導体クローンの中から適当なものを、ジデオキシ
法によってＤＮＡシークエンシングを行って、λＡＡＩ
Ｉｌ１４１９の挿入断片の全塩基配列とλＡＡ、４５０
〜４５．２の挿入断片の両端の塩基配列を決定した。そ
の結果を第３図に示す。

すなわち第３図はブタアシルアミノ酸遊離酵素ｃＤＮＡ
の制限酵素地図及び得られたクローンの位置を示す図で
ある。

（１−２）　　プライマー伸長法によるｃＤＮＡクロニ
ング 次に上記λＡＡＲ１１：４１９の挿入断片ではカバーさ
れていない構造遺伝子の一部をカバーするクローンを得
るため、ｍ　ＲＮ　Ａのプライマー伸長法によるｃＤＮ
Ａクローニングを行った。

くポジティブクローンの同定単離〉 ブライマーとして、λＡＡｌｌＨ４１９の挿入断片の５
′側より４０５−４２１の位置と５０６−５２２の位置
に存在する塩基配列に相補的な２種類の１７ｂ、９０合
成りＮＡＰ４．Ｐ５の混合物を用いた。前述のようにし
て得たボＩＪ（Ａ）ＲＮＡ８μｇと、ブライマー混合物
１．２μｇを加え、アマジャム社製ｃＤＮＡ合成キット
を使ってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを前述のと
おり、λｇｔｌｏのＥｃｏＲＩサイトに組込んだものを
、ラムダファージにパッケージした。このｃ　ＤＮＡラ
イブラリーをＣ６００Ｈｆ１株を用いてブレーティング
を行い、角シャーレ２３枚に、１枚当り１３．０００個
のファージを形成させ、これをフィルターに移し、フィ
ルター処理を行った。プローブとして塩基配列の６８−
９２の配列に相補的な２６ｂ、９．の合成りＮＡＰ７を
用いた。

合成りＮＡプローブＰ７の５０ｎｇを、メガラベル（全
酒造）を用いて３２ｐで標識し、１．７×１０　’　ｃ
ｐｍ　／μｇの比活性のプローブを得た。

このプローブ２，７Ｘ　１０　’　ｃｐｍと先に調製し
たフィルターを用い前述のハイブリダイゼーション用緩
衝液４０ｍ１！中６５℃で一部ハイブリダイゼーション
を行った。次に室温のａｘｓｓｃ中で１０分間フィルタ
ーを洗浄した。更に室温の２ＸＳＳＣ中で３０分間を２
回洗浄した後、フィルターを口紙上に移し余分な水分を
除いた後、ワットマン３ＭＭ口紙にはりつけ、増感紙を
あてて、−晩−７０℃でオートラジオグラフを行った。

その結果２個のポジティブシグナルを得た。この２個の
ファージに対し２次スクリーニングを行い、シングルプ
ラークを単離した（λＡＡ□５２１、λＡＡ□５２２と
命名した）。

くλＤＮＡの調製と挿入断片の同定〉 ファージを前述のとおり、液体培養法によって４０ａｌ
ｌ！の培養液より調製し、これから約２０μｇのＤＮＡ
を得た。このＤＮＡ０．３μｇを１２ユニツトのＥｃｏ
ＲＩで３７℃２時間酵素消化し、１．０％アガロースゲ
ルで電気泳動を行ったが、挿入断片は確認できなかった
。そこで０．３μｇのλＤＮＡを１Ｏ−Ｌ＝ワットＢｇ
ｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ単独と、ＢｇＩｎ、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ両方とで３７℃２時間酵素消化して、１．０％アガロ
ースゲルで電気泳動を行った。ｌμｇ　／　ｍｊ’エチ
ジウムブロマイド溶液に１０分間浸し、染色写真撮影後
、サザンプロット法（文献：遺伝子研究法■、第２１８
〜２２１頁、東京化学同人）によりアマジャム社製ナイ
ロン膜にＤＮＡを移した。このフィルターをＵＶランプ
で５分間照射してＤＮＡを固定化し、プラークハイブリ
ダイゼーションの時と同じ条件でハイブリダイゼーショ
ンを行い、洗浄後オートラジオグラフを行った。その結
果λＡＡ□５２１では４ｋｂ、ｐｏ、λＡＡ、、５２２
では２．２ｋｂ、Ｐ、の断片がポジティブのシグナルを
与えた。

く断片の塩基配列の決定〉 次にこの断片を得るために、各λＤＮＡ１５μｇを２０
０μｊ２１ＸＢｇｌｆｆ緩衝液中６０ユニットのＢｇｌ
ｎと６０ユニツトのＨｉｎｄＩ［Ｉ５０μｌ　／ｍｊ！
ＲＮａ５ｅ　Ａと共に３７℃２時間保温した。この反応
液をフェノール／クロロホルム処理を行って各酵素を失
活させた後エタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収した。

これを１００μｌの１×クレノウフラグメント緩衝液（
組成は全酒造、遺伝子工学用試薬カタログ記載）に溶解
し、４ユニツトのフレノウフラグメントを加え３７℃で
３０分間保温してＤＮＡの末端を平滑化した。

この反応液に２０μｌの６ＸＥＰ緩衝液を加え、１％ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、目的のＤＮＡ断片を含む
部分を切出し、ＤＮＡを電気的に抽出し、約２００ｎｇ
を得た。得られたＤＮＡ断片６０ｎｇとＭ１３＋ｎｐ１
８　　ＲＦＤＮＡＨｉｎｃＩＩ消化物５００ｇをライゲ
ーションキット（全酒造）を用いて、ライゲーションを
行った。

このライゲーション反応液５μｍを用いてＪＭ１０９株
を形質転換し、前述した方法と同様にして組換え体クロ
ーンを得た。λＡＡ□５２１の断片より得られたそれぞ
れ逆向きのクローンをＭＡＡＲＲ５２１Ａ　−８、ＭＡ
Ａ、ｔ＋５２１　Ａ−１５と命名した。λＡＡ□５２２
の断片より得られたクローンは、一方の向きしか得られ
なかった。これをＭＡＡＩｌ［１５２２−１と命名した
。

これらのクローンについてデレージョンを行い、いろい
ろな挿入断片を持つ誘導体を作製した。Ｍ　ＡＡ□５２
１Ａ−８、ＭＡＡ、［１５２１Ａ−１５より誘導した欠
失クローンをそれぞれＭ　Ａ　Ａ　ＨＥ５２１ＡＦ１〜
２８、Ｆ１０１〜１２８、Ｍ　ＡＡＩＩＥ　５２１　Ａ
　Ｒ１〜２８、ＲＩＯＩ〜１２８、ＭＡＡ、ｐ、５２２
−１より誘導したクローンをＭ　Ａ　ＡＲｒ、　Ｆ　１
〜４２と命名した。これら誘導体クローンの中から適当
なものをジテ゛オキシ法によってＤＮＡシークエンシン
グを行ってλＡＡＲＥ　５２１のＢ　ｇｌｌＩ　Ｈｉｎ
ｄ　ＩＩ［断片とλＡＡｉｉＥ５２２８ｇｌ■断片の塩
基配列を調べた。

実施例（１−１）　、及び（１−２）での塩基配列分析
の結果からブタアシルアミノ酸遊酵素構成遺伝子の全塩
基配列及びアミノ酸配列が決定された。

その結果を第２図に示す。すなわち第２図はｃＤＮＡの
塩基配列分析より得たアシルアミノ酸遊離酵素の１例の
塩基配列及びそれに対応するアミノ酸配列を示す図であ
る。

〔発明の効果〕

以上の結果から、本発明によりブタアシルアミノ酸遊離
酵素のアミノ酸配列及びそのＤＮＡ配列が明らかとなり
、ブタアシルアミノ酸遊離酵素様ポリペプチドを遺伝子
工学的に製造する可能性が明らかになった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のアシルアミノ酸遊離酵素様ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す図、第２図はｃＤＮＡの塩基配
列分析より得た本発明のアシルアミノ酸遊離酵素の１例
の塩基配列及びそれに対応するアミノ酸配列を示す図、
第３図はブタアシルアミノ酸遊離酵素ｃＤＮＡの制限酵
素地図及び得られたクローンの位置を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、図面の第１図で表されるアミノ酸配列を有している
   ことを特徴とするアシルアミノ酸遊離酵素様ポリペプチ
   ド。 ２、請求項１記載のポリペプチドをコードする塩基配列
   。 ３、請求項２記載の塩基配列が、図面の第２図で表され
   るものである塩基配列。