FR2601034A1 - Inhibiteur de l'activite de la c1-esterase plasmatique (c1-inhibiteur) et d'autres enzymes proteolytiques du groupe des proteases a serine, son procede de preparation, acides nucleiques codant pour cet inhibiteur, methodes de detection d'affections correlees aux defauts dudit inhibiteur a l'aide d'anticorps ou de sondes nucleotidiques et medicaments contenant ledit inhibiteur de synthese - Google Patents

Abstract

INHIBITEUR C1-INH, OU FRAGMENTS DE CELUI-CI, PREPARE EN UTILISANT UN PROCEDE DE CONSTRUCTION DE CLONES BACTERIENS OU RECOMBINANTS, OU DE CELLULES EUCARYOTES RECOMBINANTES CONTENANT UN ADNC CODANT POUR LE C1-INH HUMAIN. PROCEDE DE CONSTRUCTION DESDITS CLONES OU CELLULES. APPLICATION NOTAMMENT A LA DETECTION ET AU TRAITEMENT D'AFFECTIONS CORRELEES AUX DEFAUTS DUDIT INHIBITEUR ET EN PARTICULIER DE L'ANGIOEDEME HEREDITAIRE.

Description

La présente invention est relative a un inhibiteur de l'activité de la C1-estérase plasmatique et d'autres enzymes protéolytiques du groupe des protéases à sérine, à son procédé de préparation, å des acides nucléiques codant-pour cet inhibiteur, à des méthodes de détection d'affections, corrélées aux défauts dudit inhibiteur, à l'aide d'anticorps ou de sondes nucléotidiques et à des médicaments contenant ledit inhibiteur de synthèse.

les différentes classes des inhibiteurs de protéases représentent une fraction importante des protéines du plasma et ils jouent des rôles déterminants dans le contrôle spécifique des différents processus protéolytiques. Les mieux étudiés de ces inhibiteurs sont les inhibiteurs des sérines- protéases tels que l'inhibiteur d'α1-protéase (α1-PI ou α1-antitrypsine). Des comparaisons des séquences protéiques ont conduit à la constatation que l'ovalbumine et l'angio- tensinogène présentent, de même que d'autres inhibiteurs de sérines-protéases que le α;1-PI, des similitudes des structures primaires avec ce dernier, et que toutes ces protéines appartiennent à une mê"e famille fonctionnellement Giversi- fiée, à laquelle a été attribué le nom de famille des Serpines (Serine Protéinase Inhibitors) par CARRELL et TRAVIS (TIBS, 10, (1985) 20-24).

Comme on le sait, le C1-inhibiteur ou C1-INH est une glycoprotéine à chaîne unique dont le PN est d'environ 100000 et qui contient 35% d'hydrates de carbone. le C1-INH a été identifié à l'origine ne comme étant un inhibiteur de la forme activée du premier composant c; complément sérique C1, à savoir le complexe (C1q + (C1r)2 i (C1s)2). I est le seul inhibiteur plasmatique connu du C1r et du C1s, qui sont les sous-composants enzymatiques du C1. Ce C1-lNH inhibe égalment la kallicréine du plasma, les facteurs XIa et XIIa et la plasmine. De plus, le C1-INH réagit avec les formes non activées du C1r et du Cis, empêchant ainsi l'activation spontanée du C1.

Certains Auteurs ont cherché à déterminer au moins en partie la séquence du site réactif du C1-INH humain. Cependant les informations fragmentaires dont on dispose jusqu'à présent sur la séquence en question, ne font apparaître qu'une communauté structurale entre le C1-INH et les serpines typiques ( 1-PI, 1Achy, AT III, ovalbumine, angiotensino gène) limitée à l'emplacement du site réactif dans la partie carboxyterminale de la molécule (cf. SALVESEN et Al., THe
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 260, N 4, 25 Pévrier 1985, p. 2432-2436); de plus, les 40 résidus aminoterminaux du C1-INH humain décrits par HARRISON (BIOCHEMISTRY, 22, 1983, p. 5001-5007) ne présentent pas d'homologie séquence tielle significative avec les serpines connues.

Or, il est d'une importance déter=inante ce pouvoir identifier la séquence du C1-INH et ses liens avec les autres - ou d'autres - serpines : en effet, comme on le sait, des taux insuffisants de C1-INH fonctionnel dans le sérum humain sont à l'origine d'une affection héréditaire grave, transmise comme caractère autosomal dominant, l'angioedème héréditaire (IlAt). Cette affection se traduit par des crises paroxystiques d'oedème localisé qui sont particulièrement graves lorsqu'elles affectent les muqueuses gastro-intestinales et les muqueuses des voies respiratoires aériennes supérieures. Les crises qui atteignent le larynx comportent un taux ce mortalité élevé par asphyxie.

On a introduit avec succès des traitements prophylactiques de l'HAE à l'aide d'agents hormonaux (androgènes à fable pouvoir virilisant et d'ager.ts antifibrinoly@iques (acide tranexamique). Cependant les traitements hormanaux sont mal tolérés par les femmes et contre-indiqués chez les femmes enceintes et les enfants en cours de croissance, etc .... De plus, les agents androgèniques et les agents antifibrinolytiques sont peu efficaces lorsque la crise a déjà commencé.

Il a donc été proposé de remplacer les tratements hormonaux et antifibrinolytiques par un traitement constitué par une préparation de C1-INH partiellement purifiée obtenue à partir de plasma humain (cf. GADEK et Al. THE NEW ENGLAND
JOURNAL OF MEDICINE, Vol. 302, N 10, 6 Mars 1980, p. 542-546). Or si les préparations de C1-lNH constituent le traitement de choix de ce type d'affection, les quantités de
C1-INH d'origine plasmatique humaine susceptibles d'être col lectées sont nécessairement limitées et, surtout, le r fiabi- lité dépend de la qualité du controle visant à exclure toute contamination virale.

Il est donc nécessaire de pouvoir disposer d'autres sources de C1-INH à la fois pour permettre une meilleure com- préhension des propriétés fonctionnelles du C1-INH et pour disposer d'une source d'agent thérapeutique constante et sans aléas.

C'est pour atteindre les tuts ainsi définis que les
Inventeurs se sont tournés, pour acquérir une meilleure compréhension des propriétés fonctionnelles de la protéine qui constitue le C1-IIiE et pour développer une source alternative de C1-INE en tant qu'agent prophylactique et thérapeutique du
HAE, vers la production des peptides du C1-INH par génie génoétique. Une autre application commerciale d'une source alternative de C1-inhibiteur serait dans le domaine du dosage immunochimique de cette protéine des le sérum humain. Ce dosage fait partie de la routine du diagnostic de l'angioedème soit héréditaire, soit acquis.Le C1-inhibiteur préparé à plus grandie échelle et sans contam ration possible due à d'autres protéines plasmatiques pcrrait être utilisé dans le dosage immunochimique par compétition et d'autre part faciliterait la production d'anticorps spécifiques à utiliser dans le dosage direct.

la présente invention a pour objet le C1-inhibiteur ou des fragments de celui-ci prépares en utilisant un procédé de construction de clones bactériens recombinants ou de cellules eucaryotes recombinantes contenant un ADN complémen- taire "ADNc" codant pour le C1-INH humain. Conformément à 11 invention, ledit procédé de construction de clones est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - une première étape qui consiste à extraire l'ARN total de fragments de foie humain prélevé post-ortem; - une deuxième étape qui consiste à isoler l'ARN polyadénylé, par chromatographie sur du Poly(U)-Sephadex, suivie d'élution à 420C par du formamide à 50%; - une troisième étape qui consiste à dénaturer l'ARN polyadénylé, par de l'hydroxyde de méthylmercure et à le fractionner par sédimentation par un gradient isocinétique de saccharose de 10 à 33% poids/volume; - une quatrième étape qui consiste à identifier les fractions d'AWi qui sont enrichies en messagers codant pour le C1-INH; - une cinquième étape qui consiste à synthétiser de l'ADNc doublebrin à partir d'une fraction d'ARN enrichie en ARN messagers codant pour le C1-INH, en rendant une extrémité de l'ADNc homopolymère et en l'intégrant dans le vecteur pUC9 à extrémité poly(dG), puis en introduisant les plasmides recombinants formés, dans des bactéries . coli compétentes; - une sixième étape qui consiste à cribler les bactéries qui possèdent l'information génétique nécessaire à la production du
C1-INH et à isoler les clones d'ADNc qui codent pour le Ci-INE humain.

Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de préparation de clones d'ADNc codant pour le C1-INH, le criblage des clones recombinants a été réalisé à l'aide d'un mélan- ge marqué de huit icosamères synthétiques couvrant les awino- acides LVPEVQQ, qui sont une partie du peptide séquencé et positionné par SALVESEN et Al. (Loc. cité) au site réactif, à proximité de l'extrémité carboxyle de la protéine, lesquels icosatères synthétiques sont constitués par des oligonucléotides de formule A ci-apRèS ::
5' 3' #C-T-G-T/C-T-G-C-A-C-T/C-T-C-A/G-A-A-G-A-C-C-A#
(A) qui constitue une sonde moléculaire synthétique pour le C1-INn humain et d'autres mammifères.

La présente invention a, en outre, pour objet la séquence en nucléotides codant pour tout ou partie du
C1-inhibiteur, les ADN recombinants et les clones contenant lesdits ADN, obtenus par le procédé mis en oeuvre. es clones codent pour au moins une partie de l'inhibiteur C1-INH humain ou d'une protéine très voisine de ce dernier par sa structure primaire ou son activité biologique.

L'invention couvre également tant la séquence nucléotidique et en acides aminés complète du C1-inhibiteur que les fragments de celui-ci caractérisés par les séquences porteuses de l'activité biologique de ce dernier. l'invention couvre, de même, les variants nucléotidiques du gel codant pour le C1-inhibiteur, permettant la synthèse d'un Eroduit d'activité similaire au C1-inhibiteur.

Conformément à l'invention, les clones sont constitués par un plasmide dénommé pHC1-INH/1, déposé à la CNCM de l'Institut Pasteur en date du 25 Juin 1986 sous le lie 1-573.

Ce plasmide contient la séquence représentée à la ligure 1 annexée.

L'invention couvre également les constructions obtenues en mettant en oeuvre un plasmide d'expression ou des phages de type Agtlfl dans le cas où l'hotte est un procaryote, par exemple E. coli. Dans le cas où l'hôte est une cellule eucaryote animale (cellules Vero par exemple) ou une levure, permettant les modifications post-traducticnnelles correspondantes à la protéine naturelle (glycosylation par exemple), on peut utiliser des vecteurs viraux tels que le FSV (herpes), le virus de vaccine, le BPV (bovine papillo- mavirus) ou l'HPV (human papillomavirus), contenant la séquence nucléotidique codant pour le C1-inhibiteur o- un fragment de celui-ci.Toutes les techniques-permettant de transférer les ADN recombinants codant pour tout ou partie du C1-inhibiteur constitué par un plasmide selon l'invention, à un autre système d'expression (phages, virus, etc..) sont connues de l'homme de l'Art.

Selon un mode de réalisation préféré des clones conformes à l'invention, ceux-ci sont caractérisés en ce qu'ils présentent une séquence de nucléotides de leur ADNc inséré qui code pour la phase de lecture ouverte (ORF = open reading frame) de 288 codons qui répond à la formule représentée à la Figure 2 annexée.

Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le C1--INH présentes une séquence d'amino-acides définie à la Figure 3 annexée, laquelle séquence est déduite du plasmide pHC1-INH/1.

Outre les dispositions qu précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.

Pour la mise en oeuvre de l'invention, on procède comme suit (a) Préparation d'ARN de foie
Des fragments de foie humain prélevé post-mortem sont ajoutés à de l'azote liquide dans un mélangeur et sont réduits en poudre fine. L'ARN est extrait par la technique d'AUFFRAY et ROUGEON (Eur. J. BIOCHEM. 107 (1980) p. 303-324) au chlorure de lithium/urée. L'ARN polyadénylé est isolé par chromatographie sur Poly(U)-Sephadex, l'élution étant réalisée à 42-C avec du formamide à 50%. L'ARN polyadénylé obtenu est dénaturé par de l'hydroxyde de réthylmercure (îC zM) et fractionné par sédimentation sur un gradient isocinér 10-33% poids/volure de saccharose.

(b) Traduction en milieu accellulaire et immunosélection
Du lysat de réticulocytes de lapin a été préparé t nis en oeuvre conforméemnt à la technique de PELHAM et
JACKSON (EUR. J. BIOCHEM. 67 (1976) p. 247-256) modifiée par @OSI et
Al. (IMMUNOL. REVIEWS. 78, (1985) p. 151-183). Les immunosélections ont été réalisées conformément à la méthode de SALERNO et Al. (PROC. NATL.

ACAD. Sci. USA, 81, (1984) p. 110-114) avec des anticorps anti-c1r ou anti-C1s fixés à du Protéine A-Sépharose.

(c) Construction d'une banque d'ADNc de foie humain.

De 1'ADN double-brin a été synthétisé à partir d'ARN fractionné sur un gradient de saccharose, en utilisant la méthode de GUBLER et HOFF.MAN (GENE, 25 (1983) p. 263 26 ). On homopolymérise une extrémité de l'ADNc et on insère celui-ci dans le vecteur PUC9 décrit par VIEIRA et MESSING (GENE 19 (1982) p. 259-268) à extrémité en poly(dG), en utilisant les méthodes désormais classiques décrites par MA-
ISATIS et Al. dans leur manuel de laboratoire intitulé "Molecular Cloning" paru en 1982 aux Ed. COLD SPRING HARBOR
LABORATORY. Des bactéries E. coli 5K (HUBACEK et GLOVER,
J. MOL. BIOL., 50, (1979), p. 111-127) ou la souche E. coli
HB101 (BOLIVAR et BACKMAS, METHODS ENZYMOL. 68, (1979), p. 245), rendues compétentes (HANAHAN, D. , J. MOI.BIOL., 166 (1983), p. 557-580) sont utilisées pour la réalisation de la banque d'ADNc qui comprend 50000 transformants indépendants et qui est amplifiée environ 500 fois. Après une étape d'amplification, la banque d'ADNc est conservée sous forme d'échantillons congelés en présence de 15 % de glycérol.

L'ADNc double-brin a été synthétisé, corne indi qué plus haut, par la méthode de GUBLER et Al. et inséré dans le site PstI du vecteur pUC9 comportant une extrémité poly dG.

(d) Criblage à l'aide d'une sonde moléculaire
Des aliquots appropriés de la banque d'ADNc amplifée, représentant au total environ 20000 colonies (éventuel
lement conservés jusqu'à l'emploi, par congélation rapide dans un bouillon L contenant 15% de glycérol) ont été mis s-r gélose à raison de 5000-10000 bactéries ampicilline- résistantes par plaque (NUNC, de 22 x 22 cm) et transférés sur les filtres de Nylon (de marque PALL-BIODYNE tra@tés comme décrit dans MANIATIS et Al. (Loc. cité).

Le criblage des clones de C1-INH a été réalisé à l'aide d'un mélange de huit icosamères synthétisés par la technique de la phosphoramidite, à l'aide d'un synthétiseur d'ADN (fourni par APPLIED BIOSYSTEMS, référence 380A) et portant un marquage terminal par la ( -32P)ATP et la T4polynucléotide-kinase (MANIATIS et Al. Loc. cité). Ce mélange marqué couvre les amino-acides LVFEVQQ, qui sont une fraction du peptide séquencé et positionné par SALVESEN et Al.

ILoc. cité) au site réactif, à proximité de l'extrémité carboxyle de la protéine. Les oligonucléotides qui le composent ont été isolés dans toute leur longueur, après marquage, à partir d'un gel acrylamide 20%/urée 8b:, puis purifiés sur du SEPHADEX G10 (fourni par PHARMA
Le choix pour cette sonde oligonucléotidique, d'une séquence
5' 3 #C-T-G-T/C-T-G-C-A-L-T/C-T-C-A/G-A-A-G-A-C-C-A# a été déterminé par la prise en considération de toutes les possibilités de codons pour les trois amino-acides internes (F, E et Q) avec une dégénérescence de deux cotons.

Les filtres utilisés pour ie criblage ont été pré- hybridés dans un tampon comprenant 93 ml de Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM d'EDTA, 0,9 M de NaCl, 0,1% de Na DodSO4, 400 pg /ml d'ARN de levure, 5x de solution de Denhardt (0,1%
Ficoll, 0,1% polyvinylpyrrolidone, 0,1% SA) et 100 Rg/ml d'ADN d'E. coli fragmenté et dénaturé. l'hybridation des filtres a été réalisée à 37 C pendant 8 heures dans un tampon analogue, cependant dépourvu de solution de Denhardt et d'ADN d'E. coli, puis la sonde d'oligonucléotide a été aoutée à une concentration de 0,2 picomoles/ml (4 x 105cpm/ml). les filtres ont été soigneusement 1 avés à 37 C dans du tampon contenant 0,9M NaCl, 90 mM citrate de sodium, 0,1% Na DodSO4.

Après deux eéries de criblages, douze colonies positives ont été isolées et leur ADN de plasmide a été analysé par coupure par les endonucléases de restriction PstI ou PvuII.

Les hybridations effectuées avec la sonde moléculaire synthétique conforme à l'invention ont permis d'identifier dans les clones de C1-INH un petit fragment obtenu par digestion avec PstI d'environ 140 bp qui contient des séquences complémentaires de ladite sonde synthétique.

(e) Analyse de la séquence
On a dressé la carte des sites d'endonucléase de restriction de l'insertion du clone CNCM " I-573 mentionné précédemment pHC1-INH/1, par marquage terminal et digestions partielles conformément à la méthode de SMITH et BIRNSTIEL (Nucleic Acids Res., 3, (1976) p. 2387-2398) coite cela est montré à la Figure 4 annexée. les deux brins de chaque frag- ment PstI ont été sous-clonés dans le vecteur M13/mp (décrit par MESSING et VIEIRA, Loc. cité) et séquencés à l'aide de la "méthode au dideoxy" de SANGER et Al. (Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 74 (1977) p. 5463-5467). La séquence a été vérifiée par sous-clonage et séquençage des fragments figurant en hachuré dans la Figure 4.

La séquence d'amino-acides déduite du plasmide pHC1-INH/1 confirme la présence de 5 résidus VA (Valine,
Alanine, Arginine, Thréonine, leucine) restants du peptide séquencé par SALVESEN et Al. (Loc. cité) et non couverts par la sonde synthétique de formule A. A titre d'exemple, on peut se reporter à la Figure 1.

1Ja séquence aminoacides autour du site réactif est hautement spécifique de chaque inhibiteur de sértne- protéase; c'est pourquoi la parfaite concordance de la sé quence d'amino-acides obtenue confirme que le plasmide pHC1-INH/1 code pour une partie de l'inhibiteur de C1 humain ou pour une partie d'une protéine étroitement apparentée à cet inhibiteur par sa structure primaire.

(f) Sélection de l'ARNm par hybridation avec de l'ADN de
plasmide immobilisé
La preuve que le clone pHC1-INH/1 non seulement correspond bien à une protéine apparentée à C1-Il;H mais qu'il s'agit effectivement de celle identifiée par l'antisérum, a été obtenue par l'isolement des ARN messagers correspondants à la séquence portée par le plasmide pHC1-INH/1. De 1'ADN de plasmide dénaturé linéarisé (10 g) fixé sur de la poudre de cellulose a été agité à 50 C pendant 15 heures en présence de 400 g d'ARN de foie total dissous dans 200 l d'une solution de formamide à 50% contenant de l'Repes de sodium (50 mM, pn 7,5), du NaCl (400 mM), de l'EDTA (i mM) et 0,25 de DodSO4 de sodium.La poudre de cellulose a été lavée à 5 reprlses à 40 C par 2 ml de la solution ci-dessus sans forma:nde et contenant 50 mM de NaCl, et à 5 reprises à 65 C dans cette dernière solution dans laquelle l'Hepes de sodium avait été abaissé à 10 mM et le NaCl augmenté à 150 mM. Après deux la-.

vages supplémentaires dans cette solution sans DodSO4 de Na, l'ARN a été élué par incubation de la poudre de cellulose trois fois dans 100 pl d'eau stérile contenant de l'.'?.';t de foie de veau (7 g) et de l'hydroxyde de méthylmercure (10 mM). L'ARN a été traité par du 2-mercaptoéthanol (30 mM) avant de le précipiter par de l'éthanol.

La Figure 5 annexée représente la traduction in vitro d'ARNm sélectionné par hybridation sur le plasmide pHC1-INH/1, obtenue par hybridation d'ARN de foie total (400 g) à 10 g d'ADN de plasmide recombinant dénaturé fixé par covalence à de la poudre de cellulose : l'ARN élue est traduit dans un système acellulaire, comme indiqué plus haut. Le fluorogramme, représenté à la Pigure 5, d'un gel de
PA-SDS à 12,5 représente les polypeptides produits e l'absence d'ARN exogène (colonne 1) et eux synthétisés par l'ARNm sélectionné à l'aide du plasmide pHC1-INH/1 (colon- nes 4 et 5).Alors qu'un quart des produits de traduction de l'ARNm hybride sélectionné est chargé directement sur la colonne 4, les produits restants de cette traduction sont immunosélectionnés par des anticorps anti-C1-INH (colonne 5). La colonne 3 représente une immunosélection témoin des produits de traduction de l'ARN total, par les mêmes anticorps anti-Cî-INH. Comme le montre la Figure 5, les messagers qui s'hybrident au plasmide pHC1-INH/1 dirigent la synthèse de polypeptides qui migrent conjointement avec la protéine précurseur du C1-INH précédemment identifiée, represertée à la colonne 4, et sont reconnus par des anticorps anti-C1-INH (colonne 5). le plasmide pHC1-INH/1 identifie donc dans le foie humain une seule espèce maeure d'ARNt qui est traduite in vitro en polypeptides de taille homogène, qui présentent une réaction antigènique avec un antisérum C1-INH-spécifique.

(g) Examen des homologies de séquence du C1-INH et de membres
de la famille des serpines
Une comparaison de la séquence du C1-INH déduite du clone pHC1-INH/1 conforme à l'invention avec les séquences de la1-antitrypsine (a1-PI) et de l'antithrombine III roumaine (AT-III), fait apparaître une identité de 27% des a=no- acides entre le C1-INH et l'a1-PI et une identité un peu moindre entre le C1-INH et l'AT-III (23%).

La constatation d'une parenté de structure entre le
C1-INH et l'α1-PI permet d'utiliser la structure tridimensionnelle connue de la forme clivée de cette dernière protéine ne comme modèle de première approximation pour le C1-INH. De même, les informations relatives à la pathologie moléculaires des déficiences d'α1-PI qui sont données par la littérature, fournissent également un modèle pour l'étude des formes dys- fonctionnelles du C1-INH.

En outre, les sondes moléculaires pour le @ humain sont susceptibles de contribuer dans une mesure importante à la compréhension au niveau -::éWulaire, des différen- tes formes d'HAE qui résultent des taux insuffisants dP
C1-INH dans le sérum, et à l'étude de la régulation du gènF normal.

afin, les peptides de C1-'1;H produits par génie génétique devraient permettre le développement de médicaments pour le traitement préventif et le traitement de crise des
HAE. A titre indicatif, on peut utiliser la séquence sui vante
SIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTET
GVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, a; se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exeIn- ples de mise en oeuvre, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLES
EXEMPLE 1 - PREPARATION D'ADN RECOMBINANT CODANT POUR LE
C1-INH HUMAIN 1ère Etape : Préparation d'ARN de foie
Des fragments de foie humain prélevé post-mortem ont été
ajoutés à de l'azote liquiae dans un mélangeur et ont
été réduits en poudre fine. L'ARN a été extrait par la
méthode en chlorure de lithium/urée (AUFFRAY et ROUGEON,
1980). L'ARN polyadénylé a été isolé par chromatographie
sur du Poly(U)-Sephadex, conformément aux instructions
du Fournisseur (BETHESDA RESEARCH LABORATORY) sauf que
l'élution a été effectuée à 42"C avec du formamide à
50%.

L'ARN polyadénylé a été dénaturé par 10 mM d'hydroxyde
de méthylmercure et fractionné par sédimentation sur un
gradient isocinétique de saccharose à 10-33% poids/vo
lume.

2ème Etape : Construction d'une banque d'ADNc de foie humain
enrichi
De l'ADNc double-brin a été synthétisé à partir de 8 mi
crogrammes d'ARN fractionné par le gradient de saccha
rose, conformément à la méthode de GUBLER et HOFFMAN
(1983). Des procédures standards ont été mises en oeuvre
(MANIATIS et Al. 1982) pour obtenir de l'ADNc à extréiti-
tés homopolymères et l'insérer dans le vecteur pUC9 à
extrémité Poly(dG) (VIERA et MESSING, 1982), Des bacté
ries E. coli 5K compétentes ont été préparées conforme
ment à HANAHAN (1983) pour réaliser un banque d'ADNc. On
peut également- utiliser la souche E. coli HB101 (Réfé-
rence : Methods inzymol., 1979, 68 Bolivaretal).

La banque d'ADNc, qui comprend 50000 transformants indé-
pendants a été amplifiée environ 500 fois et des ali
quots sont rapidement congelés dans du bouillon conte
nant 15% de glycérol. En vue du criblage, 5000 à 10000
bactéries ampicilline résistantes ont été placées sur
des plaques NUNC (de 22 cm x 22 cm). Les colonies ont
été transférées sur des filtres de Nylon "Pall-Biodyne"
préalablement traités comme décrit par MANATIS et Al.

3*me Etape : Criblage par des oligonucléotides synthétiques
Un mélange radiomarqué de 8 icosamères couvrant les
amino-acides LOFEZ a été synthétisé par la technique
de la phosphoamidite, à l'aide d'un synthétiseur d'AtN
(APPlIED BIOSYSTEMS 380 A); après marquage terminal par
la ( -32P)ATP et la T4-polynucléotide-kinase, les oligo
nucléotides ont été isolés à partir d'un gel d'aery-
laide 20%/urée BM. le criblage a été réalisé avec des
filtres préhybridés dans un tampon contenant 90 mM de
Tris-HCl (pH 7,5), 6mM d'EDTA, 0,9 M de NaCl, 0,1% de
Na DodSO4, 400 pg/ml d'ARN de levure, de la solution de
Denhardt et 100 g/ml d'ADN d'L. coli fragmenté et déna
turé, puis hybridés pendant 8 heures à 37 C dans le même
tampon sans solution de Denhardt ni ADN d'E. coli, avec
addition de la sonde oligonucléotidique à une concentra
tion de 0,2 picomoles/ml (4 x 1ú5 cpm/ml), après quoi
les filtres ont été lavés à fond à 37 C dans du tampon
contenant 0,9 M de NaCl, 90 mM de citrate de Na, 0,1% de
Na DodSO4.

Après deux séries de criblages, douze colonies positives
ont été isolées et leur ADN de plasmide analysé par cou
pure par les endonucléases de restriction Pstl ou
PvuII. Les hybridations avec le même mélange d'oligo-
nucléotides que ci-dessus ont démontré que dix des douze
clones probables de C1-INH ont le même petit fragment
obtenu pr digestion par PstI, de l'ordre de 140 b, qui
contient les séquences complémentaires à la sonde oligo
nucléotidique conforme à l'invention. Seul le clone
pHC1-INH/1, qui contient l'insertion la plus longue, a
été ensuite analysé pour dresser la carte de ses sites
de restriction et pour déterminer sa séquence en nucléo
tides.

4ème Etape : Sélection de l'ARNm par hybridation par de l'ADN
de plasmide immobilisé
10 g d'ADN de plasmide dénaturé linéarisé fixé à de la
poudre de cellulose ont été agités à 50 C pendant
15 heures e. présence de 400 g d'ARN total de fo- mise
sous dans 200 l d'une solution de formamide à 500 con
tenant 50 mM de tampon Hepes de Na, pH 7,5, 400 -: e
NaCl, 1 mM d'EDTA et 0,2% de Na DodSO4.La poudre de
cellulose a été lavée 5 fois à 40 C, par 2 ml de la mê
me solution toutefois dépourvue de formamide et conte
nant 50 mM de NaCl, et 5 fois à 65 C dna scette dernière
solution ne contenant plus que 10 mM d'Hepes de Na et
dans laquelle le NaCl avait été porté à 180 mK. Après deux lavages finaux dans cette solution dépourvue de
Na DodSO4 , l'ARN a été élué par incubation de la poudre de cellulose 3 fois dans 100 til d'eau stérile contenant 7 g d'ARNt de foie de veau et 10 mM d'hydroxyde de méthylmercure. L'ARN a été traité par 30 mM de 2-mercaptoéthanol préalablement à sa précipitation par de l'éthanol.

EXEMPLE 2 - SYNTHESE D'UN POLYPEPTIDE D'ACTIVITE SIMILAIRE
AU Cl-INH
L'ADN recombinant constitué par le plasmide pHC1-INH/1
selon l'invention permet la production dans E. coli de
polypeptides correspondant à une partie du C1-INH et
contenant le site réactif. Pour mettre en oeuvre la
production de ces polypeptides, on procède aux étapes
suivantes.

1ère Etave - Transfert de l'insertion du plasmide pHC1-INH/1
OL d'une partie de cette insertion dans un
vecteur spécialement conçu pour une production
optimale de la protéine C1-INH.

Plusieurs vecteurs de ce type sont disponibles et leur
mode d'utilisation est connu. A titre d'exemple, on peut
utiliser des vecteurs qui portent un promoteur fort dé
rivé du bactériophage Lambda (ZETTLMEISSL et Al., Gene
41, (1986) p. 103 ; CROWL et Al., Gene 38, (1985) p.

31).

2ème Etape - Dosage quantitatif et qualificatif des peptides
C1-INH produits-par génie génétique.

Ce dosage se fait par exemple par marquage de cultures
bactériennes, contenant les plasmides recombinants, en
utilisant des acides aminés radioactifs. Les polypepti-
des C1-INH sont mis en évidence par immunoprécipitation
avec des anticorps anti-C1 inhibiteur, suivie par
PA-SDS gel électrophorèse. Des méthodes irrL-OJnoenzyr.a-
ticues peuvent également être utilisées.

L'activité des peptides contenant le site réactif du
C1-INH est déterminée en dosant leur pouvoir de fixer
un des substrats naturels du C1-INH, par exemple le C1s.

Dans le cas où l'activité des peptides C1-INH produits
dans la bactérie E. coli se révélait trop faible, on
mettrait en oeuvre l'expression de la protéine C1-INH
dans des cellules eucaryotes (de levures ou de mammi
fères), comme déjà indiqué précédemment, afin d'assurer
les modifications post-traductionnelles de cette pro
téine.

EXEMPLE 3 - UTILISATION DU C1-INH OBTENU SELON L'INVENTION
POUR LE DOSAGE DAl1S LE SERUM DU C1-INH NATUREL
Le C1-inhibiteur obtenu selon l'invention est utilisé
comme antigène afin d'immuniser des animaux en vue d'ob-
tenir des anticorps polyclonaux ou monoclonaux (prépara
tion d'hybridomes selon la technique de Yôhler et
Wlstein, Nature 1975). Ces anticorps permettent le do
sage du C1-inhibiteur naturel.

EXEMPLE 4 - COFFRET DE DIAGNOSTIC
Gn mode de réalisation d'un coffret de diagnostic con
forme à l'invention peut contenir
- une gamme standard de C1-inhibiteur,
- solution tampon (borate par exemple),
- des anticorps monoclonaux de souris ou polyclonaux de
lapin anti-C1-inhibiteur,
- des anticorps anti-C1-inhibiteur marqués par marqueurs
enzymatiques ou fluorescents ou radioactifs, par exe
ple,
- le (ou les) substrats nécessaires à la révélation du
marqueur par exemple de l'activité enzymatique dans le
cas d'un ELISA.

EXEMPLE 5 - UTILIDATION DU C1-INHIPITEUR POUR DE TRAITEMEN
DES MALADES
Le C1-inhibiteur ou un fragment de celui-ci por
teur de l'activité peut être administré aux malades com-
me médicament. Une solution de C1-inhibiteur o un frag-
ment de celui-ci est préparé dans un véhicule pharmaceu
tiquement acceptable. Le traitement peut se faire par
voie intraveineuse ou par inhalation avec un aérosol
contenant une suspension du produit actif. La dose acti
ve est déterminée au cas par cas.

EXEMPLE 6 - DIAGNOSTIC A L'AIDE DE SONDES D'ADN OU D'ARN
la sonde conforme à la présente invention qui est repré
sentée à la Figure 1 et les sondes obtenues contenant
cette séquence ou une partie de celle-ci peuvent être
utilisées pour détecter les variations structurales des
gènes, ou des messagers codant pour des formes défec
tueuses dudit inhibiteur.

Les techniques mises en oeuvres sont
- prélèvement des cellules des sujets à risque,
- extraction de l'ADN génomique,
- coupure de cet ADN par des enzymes de restriction
appropriés,
- séparation des fragments d'ADN obtenus par électro
phorèse et transfert de ces fragments sur une membrane
et hybridation avec la sonde ADN ou ARN marquée par un
marqueur radioactif ou enzy=.atique par exemple,
- révélation des produits d'rybridation par autoradio-
graphie en cas d'utilisation d'une sonde radioactive.

Cette technique est connue sous le nom de technique de
Southern (Southern blotting).

L'analyse des résultats par rapport à des témoins nor
maux et à des témoins malades, de préférence appartenant
à la meme famille que le sue testé, permet d'identi
fier les porteurs de cette maladie génétique.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1) ADN recombinant, caractérisé en ce qu'il code pour au.moins une partie de l'inhibiteur C1-INH ou d'une protéine très voisine de ce dernier par sa structure primaire ou son activité biologique.

2) ADN recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour au moins une partie de l'inhibi- teur C1-INH humain ou d'une protéine très voisine de ce der

nier par sa structure primaire ou son activité biologique.

3) ADN recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par un plasmide dénommé pHC1-INH/1, déposé à la CNCM de l'Institut Pasteur en date du 25 Juin 1986 sous le Ne 1-573.

4) ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce- qu'il présente une séquence de nucléotides de son ADNc inséré, qui code pour la phase de lecture ouverte de 288 codons qui répond à la formule ci-après:

@ T T @ C @ T S V S Q I F N S P D L A I S D T @ T S A S @ T L T S S S P @ V L S

CTTCACCACCAAACCTCTCACCTCACTCTCTCACATCTTCCACACCCCACACCTCCCCATAACCCACACCTTTCTCAATCCCTCTCCCACCCTCTACACCACCACCCCCACACTCCTAAC

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

N @ S D A N L @ L I @ T W V A K @ T N N @ I S @ L L D S L P S D T @ L V L L N A

CAACAACACTCACCCCAACTTCCACCTCATCAACACCTCCCTCCCCAACAACACCAACAACAACATCACCCCCCTCCT@CACACTCTCCCCTCCCATACCCCCCTTCTCCTCCTCAATCC

130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240

I Y L S A @ @ @ T T P S P E S T S @ E P @ N F @ @ S V I E V P @ @ @ S @ @ T P V

TATCTACCTCACTCCCAACTCCAACACAACATTTCATCCCAACAAAACCACAATCCAACCCTTTCACTTCAAAAACTCACTTATAAAACTCCCCATCATCAATACCAACAACTACCCTCT

250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360

A S P I D Q T L K A L V C Q L Q L S H @ L S L V I L V P Q N L @ @ S L @ D M E Q

CCCCCATTTCATTCACCAAACTTTCAAACCCAACCTCCCCCACCTCCACCTCTCCCACAATCTCACTTTCCTCATCCTCCTACCCCACAACCTCAAACATCCTCTTCAACACATCCAACA

370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480

A L S P S V P @ A I M E E L E @ S @ @ C P T L L T L P @ I @ V T T S @ D N L S I

CCCTCTCACCCCTTCTCTTTTCAACCCCATCATCCACAAACTCCACATCTCCAACTTCCACCCCACTCTCCTAACACTACCCCCCATCAAACTCACCACCACCCACCATATCCTCTCAAT

490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600

@ L K L E P T D T S Y D L @ L C C L T @ D P D L Q V S A M @ @ Q T V L @ L T @ T

CATCCACAAATTCCAATTCTTCCATTTTTCTTATCACCTTAACCTCTCTCCCCTCACACACCACCCACATCTTCACCTTTCTCCCATCCACCACCACACACTCCTCCAACTCACACACAC

610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720

C @ V Y D P R A

CCCCCCACTATATCACCCCACCCCC

@50 @60

5) Séquence d'acides amines déduite du plasmide pHC1-INH/1 selon $la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule ci-après :

FTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNRSRTLVSSSPRVLSNNSDANQELINTWVAKNTNN

KISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPV

AHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQ PTLLTLPRIKVTTSQD@LSIMEKLEFFDFSYDLNICGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTET

GVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDOOHKFPVFMGRVYDPRA

6) Séquence d'acides aminés contenant le site réac- tif du C1-INH, qui s'identifie avec la formule ci-après

SIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTET

GVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA

7)Sonde pour le diagnostic précoce ou prénatal, au niveau de l'ADN génomique humain, du deficit qui cause la maladie angioedème héréditaire et qui s'identifie avec l'insertion du plasmide.pHCi-IH/i qui répond à la formule selon la revendication 3 ou avec une partie de la même insertion.

8) Procédé de préparation d'un clone d'ADN recombinant constitué par la séquence visée à la revendication 4.

9) Procédé de préparation de l'ADN recombinant codant pour le C1-INH humain ou ANIMAL ou une protéine voisine de celui-ci, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - une première étape ci consiste à extraire

L'ARN total de fragments de foie - une deuxième étape qui consiste à isoler l' ARN polyadénylé , par chromatographie sur du Poly(U)-Sephadex, suivie d'solution à 42*C par du formamide à 50%; - une troisième étape qui consiste à dénaturer l'ARN polyadénylé, par de l'hydroxyde de méthylmercure et à le fractionner par sédimentation par un gradient isocinétique de saccharose de 10 à 33% poids/volu me; - une quatrième étape qui consiste à identifier les fractions d'ARN qui sont enrichies en messagers codant pour le

C1-INH; - une cinquième étape qui consiste à synthétiser de l'ADNc double-brin à partir d'une fraction d'ARN enrichie en

ARN messagers codant pour le C1-lNH, en rendant une extrémité de l'ADNc homopolymere et en l'intégrant dans le vecteur pUC9 à extrémité poly(dG), puis en introduisant les plasmides recombinants formés, dans des bactéries E. coli compétentes; ; - une sixième étape qui consiste à cribler les bactéries qui possèdent l'information génétique nécessaire à la production du C1-INH et à isoler les clones d'ADNc qui codent pour le

C1-INH

10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le criblage des clones recombinants est réalisé à l'aide d'un mélange marqué de huit icosamères synthétiques couvrant les amino-acides LVFEVQQ, qui sont une partie du peptide séquence et positionné au site réectif du

C1-inhibiteur humain, à proximité de I'extrémité carboxyle de la protéine, lesquels icosamères synthétiques sont constitues par des oligonucléotides de formule A ci-après

5' 3' #C-T-G-T/C-T-G-C-A-C-T/C-T-C-A/G-A-A-G-A-C-C-A#

(A)