CA1340868C - Acide nucleique codant pour l'enzyme de conversion de l'angiotensine (eca) humaine, et ses applications, notamment pour le diagnostic in vitro de l'hypertension arterielle - Google Patents

Description

13~086~

ACIDE NUCLEIQIfJE CO1)ANT POUR L' ENZYME DE CONVERSION
DE L'ANGIOTENSINE (ECA) HUMAINE, ET SES
APPLICATIONS, NOTAMMENT POUR LE DIAGNOSTIC IN VITRO
DE L' HYPERTEN.~.~ION A:RTERIELLE .
L'invention concerne un acide nucleique codant pour 1'enzyme de conversion de 1'angiotensine (ECA) humaine ainsi que des vecteurs contenant cet acide nucleique et 1'utilisation de ces derniers pour la production d'ECA humaine. L'invention concerne egalement les applications de cet acide nucleique, notamment dans le domaine de la conception de nouveaux inhibiteurs de 1'ECA humaine.
L'ECA, ou peptidyl dipeptidase A (EC 3.4.15.1), ou encore kininase II, joue un role important dans la regulation de la pression arterielle, en hydrolysant 1'angiotensine I (peptide inactif libere apres clivage de 1'angiotensinogenE~ par la renine) en angiotensine II
vasopressive jouant un role dans les mecanismes de 1'hypertension arterielle (SKEGGS, L.T., et al (1986) J. Exp. Med., 7.03, 295-299).
L'inhibit:ion dea 1'activite de 1'ECA par 1'EDTA et les chelateurs de m~taux, indique qu'il s'agit dune metallopeptida~;e, plus particulierement dune peptidase a zinc, capable d'hydrolyser, non seulement, 1'angiotensine I, maps aussi la bradykinine (un peptide vasodilateur et: natriuretique qu'elle transforme en un heptapeptide inactif), et de nombreux autres peptides a activite biologique (YANG, H.Y.T. et al (1970) Biochim. Biophys. Acaa, 214, 374-376 ; ERDOS, E.G., et al (1987) Lab. Invest:., 56, 345-348).
L'ECA est une peptidase largement distribuee daps 1'organisme, que 1'on retrouve par exemple sous forme d' enzyme memb~ranair~e a la surface des cellules 13~~~6~

2 endotheliales vasculaires, et des cellules epitheliales renales, ainsi que sous forme d'enzyme circulant dans le plasma (ERDOS, et al (1987) sus-mentionne ;
CARDWELL, P.R.B. et al, (1976) Science, 191, 1050-1051 RYAN, U.S. et al (1976) Tissue Cell, 8, 125-145).
Des methodes dea purification de 1'ECA humaine ou animale ont de:ja ete decrites (notamment dans BULL H.G.
et al, (1985)J. Biol. Chem., 260, 2963-2972 ; HOOPER, N.M. et al, (1!387) Biochem. J., 247, 85-93).
Toutefois, la structure de 1'ECA humaine nest pas connue <~ 1'heure actuelle. Seules quelques sequences peptidique~s de 1'ECA d'origine animale ont ete publiees (BERrfSTEIN, K.E. et al (1988), Kidney Int., 33, 652-655: HARRIS, R.B. et al (1985) J. Biol.
Chem., 260, 228-2211; IWATA, K. et al (1982) Biochem.
Biophys. Res. Commun, 107, 1097-1103 ; IWATA, K. et al (1983) Arch. Biocheam. Biophys., 227, 188-201 ; ST
CLAIR, D.K. et al (1'986) Biochem. Biophys. Res. Commun, 141, 968-972 ; SOFFE1R, RL. et al (1987) Clin. Exp. Hyp.
A9, 229-234).
Quelques essais de clonage de 1'ADN codant pour 1'ECA animale ont ete effectues a partir de deux organes riches en EC:A, les reins et les poumons, mais aucun acide nuc:leique complet codant pour 1'ECA animale n'a cependant ete decrit ; seuls quelques fragments d'un tel aside nuc7Leique ont ete decrits (DELUCA-FLAHERTY, C. et: al (:L987) Int. J. Peptide Protein Res., 29, 678-684 ; BERN~~TEIN K.E. et al, (1988 J. Biol.
Chem., 263, 11021-11024)). Les quantites d'ARN messager (ARNm) codant pour 1'ECA sont probablement trop faibles daps ces organes pour permettre le clonage d'un ADN
compl2mentaire (ADNc;) de set ARNm. Aucun essai de ~.34U868

3 clonage de 1'ADN codant pour 1'ECA humaine n'a ete decrit jusqu'a maintenant.
Bien que le ro:le physiologique de 1'ECA dans les tissus extra-vascula~ires ne soit pas encore connu, il est desormais bien etabli que cette enzyme que 1'on retrouve dans 1'endothelium vasculaire et dans le plasma, joue un role essentiel dans 1'homeostasie circulatoire par son action de clivage du dipeptide carboxy-termin~~l dea 1'angiotensine I, activant ainsi cette derniere en la transformant en angiotensine II
qui est un ~~eptide vasoconstricteur, stimulant la production d'a:Ldosterone, et facilitant la transmission adrenergique.
Etant donne le role essentiel de 1'angiotensine II
dans le controle de la pression arterielle, une recherche active s'est developpee sur la synthese d'inhibiteurs de 1'E;CA. Le captopril a ete le premier inhibiteur oral de 1'ECA, suivi par de nombreux autres composes. Actuellement, les inhibiteurs de 1'ECA
occupent une ~~lace importante dans le traitement de 1'hypertension arterielle. La structure complete de 1'ECA n'etant pas connue,les inhibiteurs sus-mentionnes ont ete congus sur la base de la structure de proteases a zinc posseda.nt de;s proprietes enzymatiques voisines de celles de 1'ECA, notamment sur la base de la structure du site actif de la carboxypeptidase A
(ONDETTI, M.A. et al (1977) Science, 196, 441-444).
Ainsi, en 1'ab:aence d'indication precise sur la structure de 1'ECA, et plus particulierement sur le ou les sites) a~~tif(s) de cette derniere, on conroit facilement que les inhibiteurs de 1'ECA sus-mentionnes synthetises sur la base d'analogies avec la structure d'autres enz~rmes, peuvent etre des molecules ~~~!~$6~

4 insuffisamment actives, ou non totalement specifiques de 1'ECA et suscs:ptibles de posseder une action therapeutique insuffisante, ou de creer des effets secondaires indes~irables. Parmi ces effets indesirables, on distinguera notamment des phenomenes de toux, de t:roubleas digestifs, d'eruptions cutanees qui peuvent etre liEa a 1'inhibition d'autres systemes enzymatiques par les inhibiteurs de 1'ECA sus-men-tionnes.
Un des buts de la presente invention est de permettre la conception de nouveaux inhibiteurs de 1'ECA plus pui.ssant:~ et specifiques de cette derniere que ne le sont les actuels inhibiteurs sus-mentionnes, permettant eve:ntuel7_ement une meilleure efficacite a dose moindre, et limitant les risques d'effets indesirables de ces :nouveaux inhibiteurs.
La presence invention a pour obj et Le clonage et le sequen~age de 1'acide nucleique codant pour 1'ECA
humaine ; ce travail a ete realise a partir de deux banques d'ADN comp~lementaires d'ARNm provenant de cellules endotheliales de veines ombilicales humaines et de sondes nucleotidiques deduites a partir de sequences peptidiques obtenues par sequengage de fragments purifies de 1'ECA humaine. Les techniques utilisees pour le clonage et le sequen~age de 1'acide nucleique sel.on 1.'invention seront plus parti-culierement de~crites dans la description detaillee de 1'invention.
Il sera fait reference dans ce qui suit, au tableau I et aux figures dans lesquels .
- le tableau I represente les fragments peptidiques obt:enus ~3 partir de 1'ECA humaine purifiee.

.~340~68 - la figure 1 represente la comparaison des sequences en acide:~ amines aminoterminales de 1'ECA
humaine, et dens ECA provenant de lapins, de boeuf, de porc et de souris ;
- la figure 2 represente les positions respectives des acides nucleiques des trois clones utilises pour la determination de 1'acide nucleique codant pour 1'ECA
humaine;
- la figure 3 represente 1'acide nucleique ainsi que le polypep~tide, deduit de ce dernier, correspondant a 1'ECA humaine ;
- la figure 4 represente les homologies entre certaines sequences. peptidiques de 1'ECA humaine (ECAh), de la thermolysine (THERM), de 1'endopeptidase neutre de rat ou de lapin (rNEP), et de la collagenase de fibroblastea de p~eau humaine (COLLh) ;
Une etude: approfondie de 1'acide nucleique de 1'invention, ainsi clue du polypeptide deduit a partir de ce dernier cat cor:respondant a 1'ECA humaine, conduit aux observations suivantes .
- la phasEa de lecture ouverte de 1'acide nucleique de la figure 3 east constituee dune sequence d'ADN
delimitee par les nucleotides correspondant aux positions 23 et 109 de la figure 1 codant pour un peptide signal de 29 acides amines, et dune sequence d'ADN delimitee par les nucleotides situes aux positions 110 a 3940 de la figure 3, et codant pour une proteine m~iture de 1277 acides amines ;
- 1'acide nucle:ique de 1'invention est caracterise par une forte homologie interne (superieure a 60 %) entre la sequence d"ADN delimitee par les nucleotides situes aux position~~ 700 et 1770, et celle delimitee par les nucleoi~ides situes aux positions 2495 et 3565.

I34p8~g Les polypeptides d.e 257 acides amines codes res-pectivement par 7Les deux sequences d'ADN sus-mentionnees presentent egalement une forte homologie entre eux (de 1'o:rdre de 67,7 %). la plus forte homologie se situe au niveau des acides amines des parties centrales des deux polypeptides sus-mentionnes par exemple le polypeptide delimits par les acides amines situes aux positions 361 et 404, et celui delimits par l~es acides amines situes aux positions 951 et 1002, pre:~entenit un pourcentage d'homologies de 1'ordre de 85~ %. Les deux polypeptides homologues comprennent clhacun une sequence His-Glu-Met-Gly-His correspondant aux acides amines situes aux positions 361 a 365 et 959 .a 963 de la figure 3. Une etude comparative (representee sur la figure 4) de cette derniere sequence pe:ptidique de 5 acides amines amines, avec les sites act:ifs de plusieurs enzymes dont la thermolysine, :~ugger~e le fait que T une au moins de ces deux sequences de 5 acides amines, que 1'on retrouve dans les deux parties homologues de 1'ECA, pourrait constituer une parti~e du site actif de cette derniere ;
- le produit dEa la phase ouverte de lecture sus-mentionnee comprend 17 sites potentiels de glycosylation, dont la plupart sont groupes dans la region N-terminals de la molecule, et dans la region localises a la jomction entre les deux domaines d'acides amines homologues sus-mentionnes.
La presen.te invention concerns donc tout acids nucleique comprenant. la sequence nucleotidique de la figure 3 codant: pour 1'ECA humaine.
L'invention concerns plus particulierement tout acids nucleique~ comprenant la sequence d'ADN delimitee par les nucleoi~ides situes aux positions 23 et 3940 de 13408~g la figure 3, ea cod<~nt pour la pre-ECA humaine de 1306 acides amines : les 29 premiers acides amines du cote N-terminal rep~resent:ent le peptide signal, et les 1277 acides amine; restant representent 1'ECA humaine nature.
L'invention c:oncerne egalement tout acide nucleique comprenani~ la sequence d'ADN delimitee par les nucleotides situes aux positions 110 et 3940 de la figure 3, et codant pour 1'ECA humaine mature.
L'inventi~on a egalement pour objet tout acide nucleique issu de la sequence d' ADN de la figure 3 et codant pour un polypeptide susceptible de posseder des proprietes en~:ymatiques du type de celles de 1'ECA
humaine, notamment un polypeptide capable d'hydrolyser 1'angiotensine I et/ou les kinines, notamment la bradykinine, ou tout. acide nucleique ne se distinguant du precedent au niveau de sa sequence nucleotidique que par des substitutions de nucleotides n'entrainant la modification de la sequence en aminoacides du susdit polypeptide da.ns des conditions propres a lui faire perdre les susdites :proprietes.
A ce titre, 1'invention concerne plus particulierement tout acide nucleique comprenant T une ou 1'autre des regions homologues de 1'ECA sus-mentionnees.
Parmi lns acides nucleiques conformer a 1'invention, on citera notamment tout fragment d'ADN
contenant .
- une sequence d'ADN s'etendant entre, dune part, un nucleotide situe entre les positions 1 a 1177 et, d'autre part, un nuc:leotide situe entre les positions 3070 a 3940 ;

l3~pg~g - une sequence d'ADN s'stendant entre, dune part, un nucleotide situs entre les positions 110 a 1177, et d'autre part un nuc:leotide situe entre les positions 1276 ~ 1966 ;
- une sequence d'ADN s'etendant entre, dune part, le nucleotide situe entre les positions 1967 a 2971, et, d'autre part, le nucleotide situs entre les positions 3070 a 3940.
L'invention concerns aussi les acides nucleiques dont les ssquEances nuclsotidiques sont modifises dans les limites aotorisees par la degsnerescence du code genstique, des lors que les polypeptides codes par ces acides nucleiques conservent soit une structure primaire identique, soit leurs proprietss enzymatiques ou immunologiq~ues.
De telles modifications non limitatives conduisent par exemple a des acides nuclsiques variants qui se distinguent de;s acides nuclsiques ci-dessus .
- par addition et/ou - supprescsion d'un ou de plusieurs nucleotides et/ou - modific<~tion ~d'un ou de plusieurs nucleotides.
L'invention a plus particulierement pour objet tout acids nuc:leique~ presentant la caractsristique de s'hybrider spscifiquement avec 1'acide nuclsique represents su:r la figure 3, dans les conditions dsfinies ci-apses .
- traitemEant de prshybridation du support (filtre de nitrocellulose ou membrane de nylon), sur lequel est fixe 1'acide n.ucleique susceptible de s'hybrider avec celui de la figure 3, a 65°C pendant 6 heures avec une solution ayant la composition suivante . 4 x SSC, x Denhardt, ~3~086~3 - remplac:ement de la solution de pre-hybridation au contact du support par une solution tampon ayant la composition suivantea . 4 x SSC, 1 x Denhardt, 25 mM
NaP04 pH 7, 2 mM EDTA, 0,5 % SDS, 100 ,ug/ml d'ADN de sperme de saumon sonique, comprenant 1' acide nucleique de la figure 3 en tint que sonde, notamment de maniere radioactive, ea pre.alablement denaturee par un trai-tement a 100°C pendant 3 minutes, - incubation pendant 12 heures a 65°C, - lavages successifs avec les solutions suivantes .
. 2 x SSC, 1 x Denhardt, 0,5 % SDS, pendant 45 minutes a 65°C a quatre reprises, . 0,2 x S~SC, 0,1 x SSC pendant 45 minutes a 65°C a deux reprises, . 0,1 x S;SC, 0,1 % SDS pendant 45 minutes a 65°C.
I1 est ~~ rappeler que la composition de la solution de Denhardt. est la suivante . 1 % ficoll, 1 %
polyvinylpyrro:lidone, 1 % BSA (albumine de serum de boeuf), et que 1 x SSC est constituee de 0,15 M de NaCl et 0,015 M de citrate de sodium, pH 7.
L'invention concerne egalement tout acide nu-cleique presentant la caracteristique de s'hybrider specifiquement avec 1'acide nucleique de la figure 3 dans des conditions non stringentes reprenant les caracteristiques essentielles des conditions strin-gentes definie:~ ci-d~essus, sauf pour ce qui concerne la temperature qui est de 40°C dans les conditions non stringentes, et les lavages successifs qui, dans les conditions non stringentes, sont realises a 1 'aide de 2 x SSC a 45°C pendant 15 minutes a 2 reprises.
L'invention vise egalement les sondes nucleo-tidiques susce:ptibles de s'hybrider avec les acides nucleiques dec:rits precedemment, ou leurs sequences 13~08~~
complementaires, ai:nsi qu'avec Y ARN messager codant pour 1'ECA et aver le gene humain responsable de 1'expression de 1"ECA, daps les conditions d'hy-bridation definies c:i-dessus.
I1 va den soi que les conditions d'hybridation stringentes ou non. stringentes, definies ci-dessus constituent des conditions preferees pour 1'hybridation, mais ne sont nullement limitatives et peuvent etre modifiees sans affecter pour autant les proprietes de reconnaissance et d'hybridation des sondes et des acides nucleiques sus-mentionnes.
Les conditions salines et de temperature, au cours de 1'hybridation et du lavage des membranes, peuvent etre modifiees dans le sens dune plus grande ou d'une plus faible string~ence sans que la detection de 1'hybridation en soit affectee. Par exemple, il est possible d'ajouter de la formamide pour abaisser la temperature au cours de 1'hybridation.
L':invention concerne egalement le polypeptide dont 1<~ sequence en acides amines est representee sur la figure 3, ainsi que tous les polypeptides :ausceptibles de posseder une activite enzymatique du type ~de celle de 1'ECA et qui sont codes par les fragments d'.ADN sus-mentionnes issus de 1'acide nucleique de la figure 3.
Parmi l~es polypeptides sus-mentionnes, on distinguera noi~ammen~t - le po:Lypeptide s'etendant entre les acides amines correspondant: aux positions 1 et 619 de la figure 3 ;
- le po7Lypept:ide s' etendant entre les acides amines correspondant aux positions 620 et 1229 ;

~~~(~~6g - le polypept.ide s'etendant entre les acides amines correspondant aux positions 350 et 395 ;
- le polypept:ide s'etendant entre les acides amines correspondant: aux positions 948 et 993.
Les polyp~eptide~s precedents peuvent etre modifies des lors qu' il.s con;servent les proprietes biochimiques ou immunolog~iques ou pharmacologiques definies precedemment.
Par exem~ple, .et de fagon non limitative, des polypeptides clans le cadre de 1'invention peuvent se distinguer des polypeptides definis ci-dessus ;
- par addition et/ou - suppre;asion d'un ou plusieurs acides amines et/ ou - modification d'un ou de plusieurs acides amines, sous reserve que les proprietes biochimiques ou immunologiques ou p~harmacologiques comme indique ci-dessus soient ~~onservees.
On congoi.t que 1'homme de metier dispose de la possibilite d'identifier, voire de selectionner ceux des polypeptides de sequences plus courtes qui entrent dans le champ de _L'invention. A titre de 1'un des moyens generaux lui. permettant de proceder a cette identification, on mentionnera, par exemple, le traitement du polypeptide de la figure 3 avec une protease clivant le polypeptide sus-mentionne dans un site peptidiq~ue choisi, snit dans une region N-terminale, sort dans> une region C-terminals, suivi de la separation du fragment N-terminal ou du fragment C-terminal du restant dudit polypeptide, ce "restant"
~tant alors tests pour son activite enzymatique vis-a-vis de 1'angiovtensine et/ou de la bradykinine. En cas de reponse po;~itive, 1'on aura alors etabli que le 134~8~~

fragment N-terminal ou C-terminal, ne jouait pas un role signif:icatif, sinon essentiel pour la manifestation des proprietes enzymatiques dudit polypeptide. L'ope:ration peut eventuellement etre repetee pour autant: que 1'on dispose dune protease susceptible do reconnaitre un autre site specifique proche dune extremiite N-terminale ou C-terminale du polypeptide reatant. La perte par le polypeptide plus petit reconnu des p~_~oprietes enzymatiques du fragment plus long dont i.l etait issu pent conduire a 1'hypothese qL~e le dernier fragment separe jouait un role significatif dins la manifestation des proprietes enzymatiques du polypeptide de la figure 3.
Une autre variante, plus simple que la precedente, de detection ~des rE:gions de 1'ECA essentielles a la manifestation des activites enzymatiques de cette derniere, pent et:re basee sur des traitements enzymatiques dl'un acide nucleique codant pour 1'ECA, avant 1'incorporati.on de 1'acide nucleique ainsi obtenu, et presume c;oder pour un polypeptide possedant des activites enzymatiques du type de celle de 1'ECA, dans le vecteur d'expression utilise pour la mise en oeuvre d'un procede de production dudit polypeptide dans 1'hote ce:llulaire approprie (procede qui sera plus particulierement ~detaille dans ce qui suit). Ce traitement enz:ymatique peut alors consister soft en un emondage des eaxtremites de 1'acide nucleique initial (codant par exemple pour le polypeptide de la figure 3 en entier), par exemple par une enzyme exonucleolytiqixe, te~lle que Ba131, soft par une ou plusieurs enzymes de restriction choisie pour leurs sites de reconnais:~ance respectifs (le cas echeant amenages par :mutagenese ponctuelle dirigee) dans la 13408ti~

sequence de 1'acide nucleique initial, soit par 1'addition d'un fragment d'ADN synthetique de jonction entre le site de coupure de 1'enzyme de restriction et le debut de :La region a exprimer. L'acide nucleique tronque obtenu peut alors etre teste, apres incorporation dans :Le vecteur choisi et transformation de 1' hote cs~llula:ire avec le vecteur recombinant obtenu, pour sa capacite a exprimer un polypeptide tronque correspondant, possedant encore les susdites proprietes enzymatiques -- ou au contraire ne les possedant plu:a, d'ou la possibilite, comme dans la variante precedent:e, d'identifier au sein du polypeptide ds~ la figure 3, les sequences jouant un role important:, sinon essentiel dans la manifestation des proprietes enzymatiques de 1'ECA.
L'invention a egalement pour objet tout acide nucleique recombinant contenant tout fragment d'ADN du type sus-indic~ue codant pour la pre-ECA humaine, ou 1'ECA humaine mature, ou encore pour tout polypeptide susceptible ds: possceder une activite enzymatique du type de celle de 1'ECA, associe avec un promoteur et/ou un terminateur de transcription reconnu par les polymerases de' la cellule hote dans laquelle ledit acide nucleiq~ze recombinant est susceptible d'etre introduit.
L'introduction dudit acide nucleique recombinant dans la ce11u7Le hote, est avantageusement realisee a 1'aide de vecteurs, notamment du type plasmide, qui sont aptes a se repliquer dans ladite cellule hote et a y permettre 1'expression de la sequence codant pour 1'enzyme.
Ledit acide nuc:leique recombinant peut egalement etre introduit: dans~ la cellule hote a 1'aide d'un vecteur viral (virus recombinant) capable d'infecter ladite cellules note: et d'y permettre 1'expression du polypeptide .code par un acide nucleique selon 1'invention, ~~e dernier etant loos le controle d'un promoteur viral acti.f daps la cellule Note.
L'invention concerne donc un procede de production de 1'ECA humaine, ou des polypeptides sus-mentionnes issus de 1' EC:A, c~ai comprend la transformation des cellules hotel; au moyen des vecteurs sus-indigoes, la mise en culture des cellules notes transformees dans un milieu approprie et la recuperation desdits polypeptides snit directement a partir du milieu de culture, lor:aque ces derniers y sont secretes (notamment dans le c:as ou les polypeptides consideres sont precedes dune sequence signal lors de leur synthese dans la cel.lule note), soit apres lyse de la paroi de la cellule note dans le cal ou les polypeptides ne seraient pas secretes hors de cette derniere.
Le procede sus--mentionne comprend avantageusement one etape finale de purification, par exemple selon les techniques de chroma~tographie hybrophobe et d'affinite en faisant appel a un inhibiteur de toute ou partie de 1'ECA fixe sur la c:olonne (cf. description detaillee qui suit).
A ce tit:re, 1'invention a plus particulierement pour objet one: composition contenant de 1'ECA humaine pure, exempte de contaminants notamment de nature proteique.
Les cellules notes utilisees pour la mile en oeuvre du procede sus-mentionne peuvent etre des cellules procaryotea, notamment des cellules de E.
coli, ou, d'un~e maniere plus avantageuse, des cellules 13~0~6$
eucaryotes, ~qui pe~rmettent, notamment, d'obtenir des proteines sours le~ur forme glycosylee et mature (levures, cellules CHO, ou cellules d'insectes infectees par le bac:ulovirus) .
Ce proc~ede ~decrit ci-dessus est egalement realisable par trans;fection des cellules hotes avec des vecteurs d'ex~~ression ayant integre un gene modifie de 1'ECA. Soit c~u'il s'agisse de parties tronquees de 1'ADN compleme~ntairE, de YARN messager endothelial de 1'ECA, comprenant pa.r exemple un seul des deux domaines homologues, ou bien ampute de 1'extremite 3' codant pour le segment hydrophobe d'insertion membranaire. La transfection des cellules hotes est egalement realisable avec des vecteurs comprenant une forme mutee de 1'ECA, ou de ses fragments, les mutations portant en particulier sur les bases codant pour les acides amines impliques dans 1'activite enzymatique decrits ci-dessus.
I1 est p<irticulierement avantageux en vue de la cristallisatio:n de 1'enzyme recombinante de muter un ou plusieurs su=es potentiels de N glycosylation, c'est-a-dire les codons correspondants aux asparagine des sequences ~~sparagine-X-Threonine et asparagine-X-serine.
L'invention vise egalement un procede de preparation dees nouveaux polypeptides sus-mentionnes par synthese yui comprend soft 1'addition etape par etape des residus pe~ptidiques choisis, avec 1' addition ou 1'elimination de ~groupes protecteurs quelconques des fonctions amino et carboxyle, ou addition de residus peptidiques choisis afin de produire des fragments, suivie dune condensation desdits fragments en une sequence en ac:ides amines appropriee, avec addition ou elimination des groupes protecteurs choisis.
L' invention se rapporte egalement a des anticorps specifiques di.riges contre les polypeptides ci-dessus.
En particuli~er, 1'invention vise des anticorps monoclonaux d:iriges contre les sequences peptidiques paraissant impliquesas dans au moins une des activites enzymatiques de 1'EC'.A.
De tels anti.corps monoclonaux peuvent etre produits par la technique des hybridomes dont le principe general est rappels ci-apres.
Dans un premier temps, on inocule un des polypeptides c:i-des:aus a un animal choisi, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps con~.tre ce polypeptide. Ces lymphocytes producteurs d',anticorps sont ensuite fusionnes avec des cellules myelomateuses "immortelles" pour donner lieu a des hybridomes. .A partir du melange heterogene des cellules ainsi obtenu, on realise alors une selection des cellules capables de produire un anticorps particulier et. de :~e multiplier indefiniment. Chaque hybridome est multiplie sous la forms de clone, chacun conduisant a la production d'un anticorps monoclonal dont les proprietes de reconnaissance vis-a-vis des polypeptides de 1'i:nvention pourront etre testes par exemple sur co:Lonne d' affinite.
Parmi l~~s p~olypeptides utilises pour la fabrication des anticorps monoclonaux sus-mentionnes, on mentionnera notamment ceux delimites par les acides amines situes aux positions 350 et 395, ou 948 et 993 de la figure 3., L'invention concerns egalement une methods de depistage, ou de doaage, in vitro dune ECA, et plus l3~pg~g particuliereme:nt de: 1'ECA humaine, ou d'un produit derive de 1'ECA tel que les polypeptides sus-mentionnes ayant in viwo le:~ proprietes de 1'ECA, daps un prelevement biologic~ue susceptible de les contenir. Une telle methode de depistage selon 1'invention, peut etre realisee soft a 1'aide des anticorps monoclonaux sus-mentionnes, soit a 1'aide des sondes nucleotidiques de-crites ci-dessus.
Le prep=vement biologigue sus-mentionne est effectue soit dans des tissus fluides, tels que le sang, soit dans d.es organes, ce dernier type de prelevement permett:ant notamment d'obtenir des coupes fines de tis:aus sur lesquelles les anticorps sus-mentionnes sont ulterieurement fixes.
La methode de dosage selon 1'invention, procedant par 1'intermE~diaire des anticorps sus-mentionnes comprend notaaument les etapes suivantes .
- la mise en contact d'un anticorps reconnaissant specifiquement 1'ECA, ou un polypeptide derive de 1'ECA
selon 1'inveni~ion, avec le susdit prelevement bio-logique dans des conditions permettant la production eventuelle d'un co:mplexe immunologique forme entre 1'ECA ou produit qui en est derive et 1'anticorps sus-mentionne ;
- la detection ,a 1'aide de tout moyen approprie du susdit complex~~ immu:nologique.
Avantageu:~ement, les anticorps utilises pour la mise en oeuvre d'un tel procede sont marques notamment de maniere enz;~matiq~ue ou radio-active.
Une telle methode selon 1'invention peut notamment etre realisee suivant la methode ELISA (enzyme linked sorbent assay) qui comprend les etapes suivantes .

13~p868 - fixation dune quantite predeterminee d'anticorps sur un support solide, notamment a la surface d'un puits cl'une microplaque ;
- addition du prelevement biologique (sous forme liquide) sur ledit support ;
- incubation pendant une temps suffisant pour permettre la reaci:ion immunologique entre lesdits anticorps et :1'ECA ou produit qui en est derive sus-mentionne ;
- elimi:nation des parties non fixees du prelevement biologiclue et lavage du support solide (en particulier des puits de la microplaque) ;
- addition dune immunoglobuline marquee par une enzyme susceptible d'activer un substrat specifique de cette enzyme, - addition du substrat specifique de 1'activite enzymatique liberee lors de la reaction immunologique precedente ;
- detection, a 1'aide de tout moyen approprie, de la degradation du substrat par 1'enzyme : et - correlation d.e la quantite d' enzymes liberties a la concentration d'ECA humaine initialement presente dans le prelevement :biologique.
Selon un autre mode de realisation de la methode de dosage de 1'invention, les anticorps sus-mentionnes ne sont pas marques et la detection des complexes immunologiques forme;s entre les polypeptides et lesdits anticorps est realisee a 1'aide dune immunoglobuline marquee reconnaissant lesdits complexes.
La metho~ie de dosage selon 1'invention peut egalement etrEa rea:lisee par une technique immuno-enzymatique suivant un mecanisme de competition entre les polypeptid~es suscceptibles d'etre contenus dans le 13~0~~~

prslevement biologic~ue, et des quantitss prsdsterminses de ces memes polypeptides, vis-a-vis des anticorps sus-mentionnss. Dan: ce dernier cas, les polypeptides de 1'invention eon quantits prsdsterminse sont avantageusement marquss a 1'aide d'un marqueur enzymatique.
L'invention ne se limits nullement aux modes de realisation dE:crits ci-dessus pour le dosage in vitro des polypeptides de 1'invention, ce dosage pouvant etre realise a 1'a_'Lde de touts autre msthode immunologique approprise.
L'invention concerns sgalement une msthode de dspistage, ou de do:>age, in vitro d'un acids nuclsique codant pour touts ou partie de 1'ECA, rsalisse a partir d' un prelevem~snt b:iologique susceptible de contenir ledit acids nuclsique, caractsrisse en ce qu'elle comprend .
- la miss en contact dune sonde nuclsotidique dscrite ci-des;sus avec le susdit prslevement biologique dans des conditions permettant la production sventuelle d'un complexes d'hybridation forms entre 1'acide nuclsique et l~~dite sonde ;
- la detection a 1'aide de tout moyen appropris du susdit complexe d'hy:bridation.
Selon un mode de realisation de 1'invention, le prslevement bio7Logique sue-mentionns est, prsalablement ~~ la mdse en oeuvre du dspistage, traits de maniere a ce que lee cellules qu'il contient soient lysses et, e~rentue.llement, en ce que le materiel gsnomique contESnu daps lesdites cellules soit fragments a 1'aide d'enz:Ymes de restriction du type EcoRI, BamHI
etc..., ou que les ARN en soient isolss.

~3~0~6g Avantageu.sement, les sondes nucleotidiques de 1'invention sont marquees a 1'aide d'un marqueur enzymatique ou radio-actif. Les ADN, ou ARN, issus du prelevement biologi.que sont places sur un support approprie, notamment: sur un filtre de nitrocellulose ou autre, par exE;mple membrane de nylon, sur lequel sont ensuite additionnees; les sondes sus-mentionnees.
Selon un autre mode avantageux de realisation du procede sus-mentionne de 1'invention, des coupes histologiques sont realisees a partir du susdit prelevement biologic~ue et les sondes nucleotidiques de 1'invention sent mises en contact direct avec des coupes histologiques pour la detection des acides nucleiques de 1'invention par hybridation in situ.
L'invention a ~egalement pour objet 1'application des methodes de depistage, ou de dosage, sus-mentionnees au diagnostic in vitro de pathologies telles que 1"hyperitension, la sarcoidose et autres maladies granulomateuses, les dysfonctionnements thy-ro3diens et dune maniere generale toutes maladies correlees a des teneurs dans 1'organisme (dans le plasma ou d'autres tissus) en sequences d'acides amines de 1'im~ention, situees a 1'exterieur du domaine delimite par les valeurs extremes correspondant generalement a 1'etat physiologique d'un individu sain.
Les methodes de dosage in vitro de 1'invention procedant a 1'aide des anticorps sus-mentionnes permettent egalement. le suivi dans 1'organisme de la concentration <ies inlhibiteurs de 1'ECA par mesure de la quantite d'ant:icorps n'ayant pu se fixer sur le, ou les sites) act:if(s) de 1'ECA qui sont masques par 1'inhibiteur. Les methodes de dosage de 1'invention sont donc part.iculiE~rement avantageuses dans le cadre de la surveillance des traitements de patients par des inhibiteurs de: 1' ECA.
L'invention a E~galement pour objet des necessaires ou kits pour la rnise en oeuvre des methodes de depistage, ou de doscage, in vitro sus-mentionnes.
A titre d'exemple, de tels kits comprennent notamment:
- une quantit:e determinee d'un des anticorps monoclonaux sus-ment:ionnes susceptible de donner lieu a une reaction immunologique specifique avec 1'ECA ou avec un des polypeptides derives de 1'ECA selon 1'invention ;
- et/ou une quantite determinee d'ECA ou un polypeptide susceptible de dormer lieu a une reaction immunologique avec les anticorps sus-mentionnes - avantageusement, un milieu approprie a la formation dune reaction immunologique entre 1'ECA ou les polypeptides de 1'invention et les anticorps sus-mentionnes ;
- avantageusement, des reactifs permettant la detection des complexes immunologiques produits lors de la reaction im~;nunologique sus-mentionnee.
Dans le cadre de la mise en oeuvre d' une methode de depistage in vitro utilisant des sondes nucleotidiques, les kits utilises comprennent par exemple .
- une c~uantii:e determinee d' une des sondes nucleotidiques sus-aientionnees susceptible de dormer lieu a une re~~ction d'hybridation avec un des asides nucleiques su:a-mentionnes codant pour 1'ECA ou un polypeptide den~ive d~e 1'ECA selon 1'invention ;

1340~3~~

- avanta.geusement, des reactifs permettant la detection des complexes d'hybridation produits lors de la reaction d'hybridation sus-mentionnee.
L'invention concerne egalement 1'utilisation du polypeptide d.e la figure 3 ou de tout fragment peptidique appropri.e issu de ce dernier, pour la conception de nouveaux inhibiteurs de 1'ECA humaine, plus puissants, et/ou specifiques de cette derniere que ne le sont les actue:ls inhibiteurs de 1'ECA.
L' invention a E;galement pour obj et une methode de detection ou de dosage, d'un inhibiteur de 1'ECA, ou de quantification de son pouvoir inhibiteur, qui comprend la mise en contact d.u polypeptide de la figure 3, ou de tout fragment peptidique issu de de ce dernier et possedant une activi.te enzymatique du type de celle de 1'ECA, avec ledit i.nhibiteur, et la determination du coefficient d'inhibition de 1'enzyme par 1'inhibiteur, notamment par mesure de 1'eventuelle activite enzymatique rEaidue:Lle sur un substrat approprie de 1'ECA.
L'invention concerne egalement 1'utilisation du polypeptide de la figure 3, ou de tout fragment de ce dernier capable d'hydrolyser les kinines, notamment la bradykinine, ~dans le traitement des maladies in-flammatoires, ou infectieuses, de la pancreatite gigue, et plus ga_neralement de maladies ou une liberation de kinineas dans 1'organisme pourrait jouer un role pathogi:ne.
A ce titre, 1'invention concerne plus particulierement des compositions pharmaceutiques pour le traitement des maladies indiquees ci-dessus, caracterisee par 1'~association de tout ou partie du polypeptide de la figure 3, capable d'hydrolyser les 13~O~G8 kinines, nota:mment la bradykinine, avec un vehicule pharmaceutique:ment acceptable.
La prese.nte invention a egalement pour objet 1'utilisation des sondes nucleotidiques de 1'invention, capables de s'hybr:ider avec le gene responsable de 1'expression de 1'ECA humaine dans les conditions decrites ci-dessu~~, pour la determination des differentes formes a:lleliques du gene sus-mentionne.
Les hypertensions arterielles (HTA) sont classees en deux grandes categories selon leurs etiologies . les HTA secondaires eat 1'HTA essentielle. Les HTA
secondaires re:groupeant toutes les formes d'HTA que la medecine peut ratt:acher de fa~on univoque a une pathologie identifiee. I1 peut s'agir, notamment, dune hypersecretion hormonale d'origine tumorale (repine ou aldosterone, catecholamines, par exemple) ou vasculaire (stenose d'u.ne ,artere renale provoquant une hypersecretion de repine). Ces formes d'HTA secondaires representent e~nviron 5 % du total des HTA. Sous le vocable d'HTA essenitielle, sont regroupees toutes les formes d'HTA pour lesquelles aucune etiologie nest aujourd'hui identifiable et qui constituent les 95 %
restant des cars d'HT.A.
La patho~~enie de 1'HTA essentielle nest pas aujourd'hui connue mais de nombreuses etudes opt montre que des facteurs genetiques etaient impliques daps le developpement de 1'HTA. Les etudes familiales opt montre qu'il existait une agregation familiale des valeurs de prEassion arterielle et qu'une correlation existe entre l.a pression arterielle des parents et des enfants naturels alors que cette correlation n'existe pas avec les enfants adoptes. Les etudes menees sur des jumeaux mono ou dlizygotes opt egalement confirme 13~0~6~

1'heritabilitE: du niveau de pression arterielle. Enfin, 1'analyse gen~etique de la transmission du niveau de pression arte:riellea, chez 1'homme et dans les souches de rats genetiquement hypertendus, a montre que plusieurs genEa etaient impliques. La transmission de ce caractere, variable entre les individus, quest le niveau de pression arterielle passe donc par la transmission de forznes alleliques de genes entre les parents et lee erifants. Les genes que 1'on pent designer "candidate;" a la responsabilite de cette transmission sont, a.u premier chef, ceux impliques dans les principau~; systemes de regulation de la pression arterielle, tels que: lee genes, du systeme renine-angiotensine, dont c.elui codant pour 1'ECA.
La methode de choix pour reconnaitre, aujourd'hui, les formes alleliques d'un gene est d'identifier, pour ce gene, le polymorphisme de taille des fragments de restriction de ce gene (par taille des fragments de restriction on entend le nombre de paires de bases que comprennent lesdit.s fragments). Pour ce type d'experience, lee ADN de plusieurs individus sont isoles, clivEa pair une enzyme de restriction, transferes sur une membrane capable de lee fixer de fagon irreversible, et hybrides avec une sonde d'ADN
marquee corres~~ondant au gene etudie.
Cette mei~hode permet de distinguer lee formes alleliques d'u.n meme gene qui different entre elles d' un individu <~ 1' autre - par leur cari:e de :restriction, et/ou - par la pre:~ence dans T une des formes alleliques dune insertic>n (fragment d'ADN supplementaire dans 1'allele le moins frequent), ou d'une deletion (fragment d'ADN manquant dans 1'allele le moins 13~0~68 frequent) cet.te insertion n'existant pas chez les autres formes alleliques.
Dans le premier cas sus-mentionne (differences fondees sur la carte de restriction, ou encore polymorphismes de sites de restriction), sous 1'effet de la digestion par une enzyme de restriction donnee X, 1'allele possE:dant, au niveau dune region precise du genome, un site de restriction reconnu par cette enzyme est coupe par ladite enzyme, et celui ne possedant pas un tel site, au niveau de ladite region, nest pas clive. A 1'aide d'u.ne sonde nucleotidique susceptible de s'hybrider au ni~,eau de ladite region, on peut donc detecter deux fragments de restriction de tailles differentes selon que la region concernee a ete clivee ou non. A chac.une de: ces tailles correspond une forme allelique.
Dans le :>econd cas (presence dune insertion, ou dune deletion), leis fragments d'ADN genomique cor-respondant aux deux formes alleliques sont clives par 1'enzyme de restriction X au niveau d'un site iden-tique. On peut detecter, a 1'aide dune sonde telle que definie dans le paragraphe precedent, deux fragments de restriction de tail:les differences. A chacune de ces tailles correspond une forme allelique, la taille la plus elevee correspondant a la forme allelique comprenant 1'insertion sus-mentionnee.
Dans les deux cas precedents et chaque fois que 1'on detecte des fragments de restriction de tailles differentes (ou encore fragments de restriction polymorphes) d.ans un gene donne et d'un individu a 1'autre sous 1'eff~et de f action dune enzyme de restriction X, il se:ra fait reference au "polymorphisme X" de ce gene (par exemple "polymorphisme EcoRI" si 13~08~8 1'enzyme de restriction X est 1'enzyme EcoRI, ou polymorphisme TaqI si 1'enzyme de restriction est TaqI).
L'etude d'un polymorphisme X d'un allele choisi, dans une population donnee d'individus, presumes sains, permet de constater 1'existence de ce polymorphisme dans une proportion determinee des individus de cette population. La mesui°e de cette proportion conduit a ce que 1'on appelle ci-apres la "frequence allelique de reference".
Si la frequence: d'un allele choisi, mesure suivant la meme methode au sein dune population d'individus presentant une pathc~logie determinee, est differente de la frequence de reference, on pourra alors emettre 1'hypothese que 1'a7Llele en question est lie a ladite pathologie.
De meme, on pourra impliquer un allele dans le developpement de l.a maladie s'il existe une co-segregration entre l.a transmission de la maladie, dans les familles atteintes et informatives pour le polymorphisme, et la transmission de 1'allele permet d'impliquer cet allele dans le developpement de la maladie. (on dit dune famille qu'elle est informative pour le polym.orphiscme si le parent atteint par la maladie est helterozy~gote pour le site de restriction ce qui permet de' suiwre dans la descendance 1'allele responsable de la maladie).
La presente invention concerne les fragments de restriction po:Lymorplhes susceptibles de s'hybrider avec une sonde nucleotidique de 1'invention, notamment dans les conditions decrites ci-dessus, et qui sont issus du clivage des differentes formes alleliques du gene ~~~fl~6 codant pour 7.'ECA a 1'aide d'enzymes de restriction determinees.
L'invention concerne plus particulierement les fragments de restriction polymorphes susceptibles de s'hybrider avec une sonde nucleotidique selon 1'invention, E~lle-mi=me susceptible de s'hybrider avec 1' extremite 5' de 1' acide nucleique de la figure 3 et qui sont les suivanta .
- les fragments. de 5,8 kb et de 6 kb correspondant au polymorphisme TaqI, - les fragments. de 8,8 kb et de 9 kb correspondant au polymorphisme Dra.I, - les fragments de 8,5 kb et de 9 kb correspondant au polymorphisme BglII, - les fragments de 10,6 kb et de 11 kb cor-respondant au ;polymorphisme KpnI, - les fragments de 8,4 kb et de 8,8 kb cor-respondant au ;polymorphisme HindIII, - les fragmentssl de 4, 2 kb et 3, 0 kb dune part, et de 4 kb et 2,7 kb d'autre part, correspondant au polymorphisme ;BglI, - les fragments de 5, 2 kb et de 5, 7 kb correspondant au po:lymorphisme RsaI (avec presence ou non d'un fragment de 3,0 kb), - les fragments de 4,3 kb dune part, et de 2,2 et 2,5 kb d'autre part, correspondant au polymorphisme PvuII, - les fragments de 3,5 kb et de 3 kb correspondant au polymorphismes Xb;aI, - les fragments de 4,3 kb et de 2,7 kb cor-respondent au polymo:rphisme TaqI.
La difference de taille des fragments alleliques reconnus par les sondes de 1'invention chez les 13~0~~8 differents individu;s, correspond a une insertion d'un fragment genomique d'environ 400 paires de base avec la marge d'erreu.r due: a 1'analyse de taille de ces fragments par electrophorese sur gel d'agarose.
Cette insertion peut etre detectee a 1'aide de toute enzyme de restriction clivant 1'acide nucleique sus-mentionne du moment que les fragments engendres soient capables de s'hybrider au moins en partie, avec la sonde corresponda.nte.
La presente invention concerne un procede de depistage, in. vitro des polymorphismes du gene codant pour 1'expres~;ion de 1'ECA humaine, realise a partir d'echantillons biologiques, tels que le sang, sus-ceptibles de <:ontenir de 1'ADN genomique, et qui ont ete preleves dans une population donnee d'individus ne presentant pas d'HTA (ou encore individus normotendus), ou d'autres maladies de 1'endothelium vasculaire.
Les echantillons sus-mentionnes sont analyses suivant la metlhode suivante comprenant .
- le tra:itement des acides nucleiques issus des echantillons biologiques sus-mentionnes a 1'aide dune enzyme de restriction determinee daps des conditions permettant 1'obtention de fragments de restriction issus du cliva~~e desdits acides nucleiques au niveau de leurs sites de restriction reconnus par ladite enzyme, - la mise en contact dune sonde nucleotidique selon 1'invention susceptible de s'hybrider avec les fragments sus-mentio:nnes dans des conditions permettant la production event:uelle de complexes d'hybridation entre ladite sonde et les fragments de restriction sus-mentionnes,, notamment daps les conditions d'hybridation definies ci-dessus, I3~0~6g - la detection des susdits complexes d'hybri-dation, - la mesure de la taille des eventuels fragments de restriction polymorphes engages daps les complexes d'hybridation sus-me:ntionnes.
Parmi les sondes utilisees pour la mise en oeuvre d'un tel procede, on citera notamment 1'ADN com-plementaire (ou ADNc) de 1'acide nucleique decrit a la figure 3, ou, avant:ageusement, une fraction de cette ADNc susceptible de s'hybrider avec les differents fragments de restricaion correspondant aux differentes formes alleliques du. gene de 1'ECA.
Avantageusement., la sonde utilisee dans le procede sus-mentionne est marquee, notamment de maniere radioactive ou non radioactive, sous forme notamment de sonde biotinylee, pour permettre la detection des differents fragment, de restriction restant hybrides avec ladite so:nde.
La mesure de la taille des differents fragments de restriction p~olymorphes engages Bans des complexes d'hybridation avec :La sonde sus-mentionnee, peut etre realisee par mute methode connue en soi par 1'homme du metier ; la determination de la taille de ces fragments de restrict:Lon est realisee notamment par electrophorese sur gel d'agarose et evaluation de la taille desdit;s fragments par rapport a celles de fragments temo:ins.
La comparaison des tailles des fragments de restriction mesurees chez les individus de la population etudiee, permet d'etablir, au sein de cette population d'individus, les frequences alleliques de reference.

1.~40~~~
L'inventi.on concerne egalement la detection des differentes fo~rmes alleliques du gene codant pour 1'ECA
humaine, susceptibles d'etre liees au developpement chez un indi'ridu dune HTA, ou autres maladies de 1'endothelium vasculaire, notamment de 1'atherosclerose. Ce~tte detection est realisee suivant la meme methode au sein dune population d'individus presentant une pathologie sus-mentionnee. Si la frequence d'un allele mesuree au sein de cette population est diffe:rente de la frequence de reference, on pourra alors emet;tre 1'hypothese que cet allele est probablement lie a 1'HTA.
De meme, on pourra impliquer un allele dans le developpement de l.a maladie s'il existe, dans les familles atteintes x>ar la maladie et informatives pour le polymorphisme, une cosegregation entre la trans-mission de certaines formes alleliques du gene de 1'ECA
et la transmission de 1'HTA et/ou des maladies de 1'endothelium, notamment de 1'atherosclerose.
L'inventi~on a ~egalement pour objet 1'application des resultats de 1'etude des polymorphismes du gene codant pour 1'ECA humaine au diagnostic in vitro de 1'eventuelle predisposition genetique probable d'un individu a 1'hypert:ension arterielle, ou a d'autres maladies de :1'endothelium vasculaire, notamment de 1' atherosclero;se .

13~0~6~

La methode de diagnostic in vitro sus-mentionnee comprend la dE~tection eventuelle de fragments de res-triction polymorphe:~, issus du clivage par une enzyme de restriction determinee d'alleles probablement lies au mecanisme de 1'HTA, a 1'aide de sondes nucleotidiques selon 1'invention, susceptible de s'hybrider avec lesdits fragments de restriction polymorphes.
Les conditions daps lesquelles une telle methode de diagnostic in vitro pent etre mise en oeuvre sont celles decrites dins les articles concernant les techniques de detection des polymorphismes de longueur des fragments de re:atriction, plus connues encore sous 1'abreviation RFL:P (Restriction Fragment-length Polymorphism). De telles conditions sont plus particuliereme:nt decrites dans P article de GUSELLA
J.F. 'Recombinant D:NA techniques in the diagnosis of inherited disorders" paru dans Journal of Clinical Investigations (1986), 77, 1723-1726.
Selon un aspeci~ avantageux de 1'invention, outre le depistage des polymorphismes du gene codant pour 1'ECA humaine, la mE~thode de diagnostic in vitro sus-mentionnee compren~d egalement le depistage de polymorphismes d'un ou de plusieurs genes codant pour des proteines differentes de 1'ECA et impliquees dans le mecanisme de la regulation de la pression arterielle.
A ce tit:re, la methode de diagnostic in vitro selon 1'invention comprend le depistage de polymorphismes du gene de 1'ECA, et du gene de la renine, et/ou du gene de la kallikreine, et/ou du gene de 1'ANF.

~3~086g Parmi le:: polymorphismes sus-mentionnes des genes codant pour la renine, la kallikreine, et 1'ANF, on citera notamment ceux qui ont ete plus particulierement decrits dans .La demande de brevet PCT publiee sous le numero W087/02709 dE:posee le 23 octobre 1987.
A 1'aide de sondes appropriees, les auteurs de cette demande PCT ont decouvert les fragments de restriction suivants; .

- 5 kb et 9 kb correspondant au polymorphisme BglI du gene de la renine, - 0, 9 kb corr~aspond~ant au polymorphisme BglII du gene de la renine, - 20 kb et 24 kb correspondant au polymorphisme RsaI du gene de la renine,

- 6,2 kb et 9 kb correspondant au polymorphisme HindIII
du gene de la renine, - 9, 8 kb et 1:1 kb c:orrespondant au polymorphisme TaqI
du gene de la :renine, - 3, 9 kb correapondant au polymorphisme EcoRI du gene de la renine, - 1,4 kb et 1,~8 kb correspondant au polymorphisme BanII
du gene ANF, - 4,1 et 6,2 kb correspondant au polymorphisme BglI du gene ANF, - 9,1 kb et 6,!5 kb correspondant au polymorphisme BglII
du gene ANF, - 5,2 kb et 11,8 kb correspondant au polymorphisme EcoRI du gene i~IJF, - 15 kb correspondant au polymorphisme EcoRI du gene de la kallikreine,, - 3,1 kb correspondent au polymorphisme PstI du gene de la kallikreine,, ~~~os6s - 4,5 kb corre.spondant au polymorphisme StuI du gene de la kallikreine.
L'invention a egalement pour objet des kits pour la mise en oeuvre de la methode de diagnostic in vitro definie ci-dessus.
A titre d'exemple, de tels kits de diagnostic comprennent .
- une qu~antite determinee dune ou de plusieurs enzymes de restriction, - une quantite determinee dune sonde nucleotidique susceptible de reconnaitre les fragments de restriction issu.s du clivage du gene codant pour 1'ECA par 1'(ou les ) enzyme(s) sus-mentionne(s), - eventuelleme:nt une quantite determinee dune sonde susceptible de reconnaitre les fragments de restriction i:~sus du clivage du gene codant pour la renine par 1'(~ou les) enzymes) sus-mentionnes(s), - et/ou une quantite determinee dune sonde susceptible d~e reconnaitre les fragments issus du clivage du gene codant pour la kallikreine par 1'(ou les) enzymes) sus-mentionne(s), - et/ou une quantite determinee dune sonde susceptible de reconnaitre les fragments de restriction issus du clivage du gene codant pour 1'ANF par 1'(ou les) enzymes) sus-mentionne(s).
Les techniques classiques d'amplification genique, notamment celle decrite dans le brevet US n°4,683,202 depose le 25/10/1985, sont utilisables pour detecter le polymorphisme du gene codant pour 1'ECA en utilisant des amorces s'hybridant avec ce gene de part et d'autre de 1'insertion d'e:nviron 400 paires de base sus-mentionnee. Le:~ fragments d'ADN ainsi amplifies ont une 13~0~~~

taille differe.nte se:lon que le fragment d'ADN genomique contient ou ne conti.ent pas ladite insertion.
A ce titre, 1'invention a plus particulierement pour obj et toute sequence nucleotidique d' environ 10 a 40 nucleotides issue: de la sequence nucleotidique de la figure 3, ou sa sequence complementaire, ou susceptible de s'hybrider avec une partie de la sequence de la figure 3 ou avec la sequence complementaire de cette derniere, ut.ilisable en tant qu'amorces pour 1'amplification du gene codant pour 1'ECA.
Des caracte:ristiques supplementaires de 1'invention appara:itront encore au cours de la description qu~i suit du clonage de 1'acide nucleique codant pour 1'ECA humaine, ainsi que des sondes utilisees pour ce clonage, etant entendu que cette description ne saurait etre interpretee comme tendant a restreindre la portee des revendications.
I - PURIF'ICATIDN ET SEQUENCAGE DE L'ECA
L'ECA hum,aine sous sa forme complete membranaire a ete purifiee a partir de microsomes renaux. La fraction microsomale a ete preparee a partir d'homogenats de reins de cadavres humains de la fagon suivante . 600 g de cortex de rein ont ete haches, suspendus dans un tampon de phos~~hate de potassium 20 mM, pH 8, contenant 250 mM de saccharo:~e et un melange d'inhibiteurs de protease (tetrathionate de sodium 5 mM, N-ethylma-leimide 10 mM, fluorure de phenylmethanesulfonyle 2 mM), et homogeneise~~ pendant 3 minutes. Les debris de tissu ont ete elim:ines par centrifugation a 5000 g pendant 20 minutes et la fraction particulaire a ete sedimentee par centrifugation a 105000 g pendant 1 heure. Le culot a ete resuspendu dans un tampon de phosphate de potassium 150 mM,; pH 8 (tampon I, 200 ml) 1~~~~~6g et traite pendant 18 heures avec le detergent CRAPS 8 mM (Serva). Le surnageant, apres centrifugation 5 105000 g pendant 1 heure, a ete dialyse contre le tampon I pendant 24 heures afin d'eliminer le CHAPS.
Puis il a ete depose sur une colonne de phenyl-Sepharose* 4B (Pharmacia) et Blue a un taux de 24 ml/heure ; 60 % de 1'activite enzymatique a ete retenue 10 sur la colonne et eluee sous forme d'un pic unique apres avoir applic~ue un gradient lineaire de CHAPS
(3-(3-cholamidopropyl)dimethylammonio-1-propanesulfona-te) jusqu'a une concentration de 10 mM (800 ml).
L'eluat a etE: enrichi avec du ZnS04 et du KC1 a des 15 concentrations finales de 0,1 mM et de 330 mM
respectivemen~t de maniere ~ obtenir une liaison optimale avec 1'inhibiteur, puffs la purification a ete completee sur une colonne de lysinopril-Sepharose 4B
comme il a etc~ decr.it dans BULL, N.G. et al, (1985), J.
20 giol . Chem. , :?60, 2963-2972.
La prote:ine ainsi isolee ( 1, 2 mg) a ete analysee, apres reduction (2 mercaptoethanol a 5 %) et denaturation (ebullition pendant 3 minutes), par electrophoress~ sur gel de polyacrylamide Bans 6 % de 25 gel contenant NaDodS04 (LAEMMLI, U.A., (1970), Nature, 227, 680-685).
L'enzyme purifiee hydrolyse 1'angiotensine I, la bradykinine et: plusieurs substrats synthetiques, et est inhibee par l.e captopril et d'autres inhibiteurs de 30 1'ECA . la dEaermination de 1'activite enzymatique a ete realisee a 1'aide du substrat furanacryloyl-L-phenylalanyl-g~lycyl--glycine (FAPGG) dans les conditions decrites daps HOLMQUIST et al (1979), Anal. Biochem., 95, 540-548. hes pa:rametres de la reaction enzymatique 35 determinee a pH 7,5 sont de 136 ~m pour Km et 22100 * trademark ~.~~0~68 min.'s pour Kcat ; un traitement a 1'aide de bromure de cyanogene a et:e utilise pour cliver 1'enzyme au niveau des residus methionine generant ainsi des fragments pour le sequE~ngage. L'ECA purifiee (0,5 mg) a ete dissoute dens 1'acide formique 70 % (0,2 ml) et le bromure de cy~anogene (2,0 mg) a ete ajoute. Apres 16 heures de reaction a: temperature ambiante dens le noir, la solution a. ete diluee 20 fois avec de 1'eau et lyophilisee.
Les fr~~gments peptidiques ont ete isoles par HPLC en phase' inverse, en utilisant un systeme de gradient acide trifluoroacetique (TFA)-eau-acetonitrile (tampon A . 0,1 M d.e TFA dens 1'eau ; tampon B . 0,1 %
de TFA dens 1'acet.onitrile ; 1-100 % de B sur 32 minutes, taux d'elution 1 ml.min.'~). Les fractions correspondent a des pics differents ont ete separees et lyophilisees, et sequencees a 1'aide d'un sequenceur automatique. I~es fragments peptidiques ainsi obtenus ont ete regroupes sur le tableau I. La sequence amino-terminale de la proteine a ete determinee par la methode d'Edma:n a 1'aide d'un sequenceur automatique en utilisant la p:roteine ECA entiere.
La sequence suivante de 16 acides amines a ete obtenue NH2-Leu-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Pro-Gly-Asp-Phe-Ser-Ala-Asp-Glu-Ala-G1:~-COOH
II - CLO:NAGE DE L'ADN COMPLEMENTAIRE DE L'ARN
MESSAGER
A) Sonde nucleotidigue - a parti~r de la sequence peptidique Met-Trp-Ala-Mei~-Trp-,Ale-Gln-Ser-Trp-Glu-Asn-Ile (con~ue d'apres la sequence: CNBb du tableau I), 64 sondes nucleotidiques denom~mees HACE6 ont ete synthetisees a 13~08fg 1'aide d'un synthstiseur d'ADN automatique en utilisant la msthode au phosphoramidite.
Met-Trp-~,la-Lys-Ser-Trp-Glu-Asp-Ile- 3' TAC-ACC-C'.GA-TT'T-ACG-ACC-CTT-TTG-TA 5' G G: TG C A
- Marquage radio-actif . la sonde HACE6 a sts marquee au [yP3Z] ATP (activits spscifique . 5000 curies/mmole) a son extrsmits 5' par la T4 polynuclsotide kina~se. L'activits spscifique de la sonde est de 5 x 106 cpm/pmole.
B) Cribbage dune banctue d'ADN complementaires construite a partie d'ARN de cellules endothsliales Une banque d'ADNc de cellules endothsliales de veins ombilicale hu:maine amorcse avec de 1'oligo(dT), construite dams le phage agtll (Clontech Laboratories Inc.), et constituse de 1,5 x 106 recombinants indspendants, a sts criblse en utilisant la sonde HACE6 marqus au P32. L'AD:N des phages a sts transfers sur filtre de nitrocellulose selon la msthode de Benton et Davis (rsf. BE:NTON, W.D., et DAVIS R.W. (1977), Science (Wash), 196, 180-182.). Les hybridations avec HACE6 ont sts rsalisses dans . 6 x SSC, 0, 1 % de NaDodS04, tampon NaP04 50 mM ~~ pH 6, 8, 5 x Denhardt, 0, 1 mg/ml d'ADN dsnaturs de sperms de saumon a 50°C. Le lavage final des fili:res a sts effectus deux fois dans 2 x SSC, 0,1 % SDS, a 55°C pendant 15 minutes.
Dans ces conditions deux diffsrents types de clones hybrida:nt fortement avec la sonde HACE6 ont sts obtenus. I1 s'~agit des clones aHECl922 et aHEC2111. Les fragments d'AD1V inssrss dans les phages ont sts isolss apres coupure des phages par 1'enzyme de restriction EcoRI, et inssrss dins les deux sens dans le plasmide bluescript (St:ratagene) , au niveau du site EcoRI de ce dernier. A partir de ces plasmides doubles-brins des matrices mono-~brins ont ete obtenues en reinfectant des cultures bactnriennes portant ces plasmides a 1'aide d' un phage helper KC>7 .
La deternnination de la sequence nucleotidique de ces clones a ete Eaffectue par la methode de Sanger (SANGER, F. et: al (:1977) , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 74, 5463-5467) en utilisant soit 1'ADN polymerase de klenow, soit 1'ADN polymerase de T7 modifiee (Sequenase, U:c Bioc:hemical). Quelques regions ont ete sequencees en utilis,ant a la place de la deoxyguanosine tri-phosphate (dGTF~), le deoxyinosine tri-phosphate (dITP) ou le deaza-deoxyguanosine tri-phosphate (7-deaza dGTP). L'elect.rophorese des fragments marques par le [S35] dAT:P a ete pratiquee sur gel d'uree-polyacrylamide. Les sequences ont ete determinees en synthetisant des oligomeres de proche en proche toutes les 350 paires de base environ qui ont servi d'amorces echelonnees le long de la sequence.
Les sequences nucleotidiques inserees dans ces deux phages so:nt chevauchantes sur une longueur de 2323 paires de base:. La sequence peptidique deduite de ces clones contient 1'e:nsemble des sequences peptidiques obtenues par purification de 1'ECA humaine, et qui sont representees sour le: tableau I, a 1'exception de la region amino-t~~rminale.
De maniE:re zi obtenir 1'ADN complementaire correspondant ~~ 1'extremite 5' de Y ARN messager codant pour 1'ECA, une autre banque d'ADNc a ete construite en utilisant 5 ~g d'ARN poly(A) isole a partir de cellules endotheliales de 7La veine ombilicale en culture tertiaire. CEas cE:llules ont ete obtenues par dissociation ~~ 1'aide de collagenase comme il est decrit daps J~~FFE et al (JAFFE J.M. , et al (1973) , J.
Clin. Invest., 52, 2745-2756), et ont ete cultivees en presence de 20 % de serum foetal de veau, 100 ~g/ml d'heparine et de 2ng/ml de FGF (facteur de croissance de fibroblast~e) (GOSPORADOWICZ, D. et al (1983) J.
Cell . Biol. , 9~7, 16'77-1685) . L'ARN total a ete extra it des cellules ~~pres 3 sous-cultures par la methode de Chirgwin et al (CHIRGWIN, J.M. et al (1979) Biochemistry, 18, 5:?94-5299), et purifie sur cellulose oligo-d(T)7 (Pharmac:ia). La banque d'ADN complementaire a ete construite se7Lon la methode de Gubler et Hoffman (Gene (1983) 25, 263-269), en utilisant comme amorce un melange de deux oligonucleotides. Le premier oligonucleotide est une amorce specifique de 1'ARNm de 1'ECA, determine par la sequence des clones precedemment obtenus. I1 s'agit d'un oligomere de 17 bases (CP5-21) complementaire dune sequence localisee pres de 1'extremite 5' de 1'ADNc de 1'ECA (nucleotide 234 a 250 de la figure 3). La seconde amorce correspond a 1'oligo-d(T)12-18 mers (Pharmacia). Les ADNc ont ete traites et inseres dans le phage gGTlO coupe par 1'enzyme EcoRI selon la methode de Koenig et al (KOENIG, M. et al (1987), Cell, 50, 509-517).
Les phages recombinants ont ete cribles a 1'aide d'un fragment d'ADN genomique humain de 300 paires de base isole a partir dune banque genomique clonee daps le phage CHAR01'~4A et qui s'hybride avec CP5-21, et avec 1'oligonucleot.ide de' 44 bases obtenu a partir de la sequence amine-terminale deduite de 1'ECA purifiee selon la metho~3e decrite ci-dessus.
Ce fragme:nt de restriction (SacII-SacII) de 300 paires de base comprend la partie la plus 5' terminale de YARN messager de' 1'ECA ; il a ete marque avec une 13~0~~8 haute activitE~ specifique en utilisant la methode de marquage decri.te daps FEINBERG A. P. et al ( 1983 ) Anal .
Biochem., 132, 6-13, et utilise pour cribler 1,5 x 106 clones dans des conditions de stringence elevee.
Parmi leis clones positifs obtenus, le clone aCHDT32 a ete selectionne et sequence selon la meme methode decrite pour les clones precedents. I1 a ainsi ete determine que ce clone contenait une insertion de 246 paires de base cat qu'il demarrait 7 nucleotides en amont de 1'a~morce CP5-21 et qu'il s'arretait 25 nucleotides en amont de 1'ATG d'initiation de la traduction.
L'insertion daps ce clone partage 60 paires de base avec le c:lone ;~HEC2111 et contient 1' extremite 5' de la sequence codant pour 1'ECA.
La sequence nucleotidique de 1'ADNc codant pour 1'ECA obtenu par sequen~age des trois clones precedents comprend donc 4024 nucleotides. L'extremite 3' de cette sequence ne co:ntient pas de signal de polyadenylation.
La phase ouverte de lecture partant du premier codon ATG jusq~u'au codon stop TGA code pour 1306 acides amines. La :Leucine amino-terminale determine par sequen~age de la proteine est localisee apres un peptide signal de 29 residus.
Le clone aHEC19~22 a ete utilise comme sonde pour etudier 1'expression du gene codant pour 1'ECA par la methode dite "l~lorthern-blot" selon le procede de Thomas et al (THOMAS, P.S. et al (1983) Methods in Enzymology, N.Y. Academic Press, 100, 255-266). Un ARN messager d'environ 4,3 kb dEa cellules endotheliales de veine ombilicale en culture s'hybride avec la sonde sus-mentionnee. Dans ls' testicule, seul un ARN messager, plus court, de 3 kb a ete detects. Dans les reins, qui ~34~~6g sont une source riche en ECA, aucune hybridation n'a ete detectee d.ans leas conditions utilisees en utilisant 20 ~g d'ARN ;poly(A), ce qui laisse suggerer que la synthese et les tau~,: de turn-over de 1'ECA sont faibles dans cet organe.
Une anal~~se par "Southern blot" de 1'ADN humain dans des conditions stringentes a ete realisee avec un fragment EcoRI-BglII: de 300 paires de bases localise a 1'extremite 5' du clone aHEC2111. L'ADN humain a ete isole a partii~ de noyaux de cellules du placenta, par traitement avec la proteinase K suivi d'extractions par le melange phenol-c:hloroforme. L'ADN (14 ~cg) a ete digere avec HindIII,, separe sur gel d' agarose a 0, 7 %
et analyse par hybridation selon la methode "Southern Blot" (SOUTHERN, IE.M. (1975) J. Mol. Biol, 98, 503-517).
Les fragments d'ADN ont ete marques selon la methode decrite dans~ FEINBERG, A.P. et al (1983) anal.
Biochem., 132,, 6-1a. Cette sonde s'hybride avec un fragment de restriction unique de 9,5 kb.
Des resultats similaires ont ete obtenus en utilisant un fragment d'ADNc proche de 1'extremite 3'.
Ce result~at confirme la presence d'un seul gene.
La determination de 1'activite enzymatique de 1'ECA codee par le gene ainsi isole, ou de tout polypeptide actif s~elon 1'invention et issu de cette derniere, peut titre determinee notamment par la methode decrite par Ho:Lmquist et al (1979) precedemment cite.
Le dosage de ceatte ECA humaine peut titre realise par des techniques radioimmunologiques (RIA) decrites par HIVADA K., et al (1987) Lung, 267, 27-35.
III POLYM:ORPHI~51KES DU GENE DE L' ECA

~~4~~ss L'ADN de plusie:urs individus a sts isoles a partir des cellules nuclsees par lyse des globules rouges suivies dune lyse files globules blancs, d'un traitement a la protsinase K et: par extractions successives par le phenol et le c:hloro:Eorme suivies dune precipitation a 1'isopropanol.
Une quant,its dsterminee d'ADN est ensuite digsrse par une enzyme de restriction et migrse sur un gel d'agarose qui separe. les fragments d'ADN en fonction de leur taille. L'AD1V est ensuite denature par un traitement avec de l.a soude 0,5 N et transfers sur une membrane de nylon par buvardage pendant 12 heures.
L'ADN est ensuite fixe a la membrane par passage au four pendant 2 heures a 80°C.
La membr<~ne e;st ensuite pre-hybridee avec une solution 4 x SSC, 10 x Denhardt pendant au moms 6 heures a 65°C,. La membrane est ensuite hybridse avec une solution tampon 4 x SSC, 1 x Denhardt, 25 mM NaP04 pH 7, 2 mM ED'TA, 0,.5 % SDS, 100 ~Cg/ml d'ADN de sperms de saumon sonique comprenant la sonde marquee denatures par :La chaleur a 100°C pendant 3 minutes.
La sonde marquee est un melange des fragments ADNc de 1'ECA contenu dans les clones aHEC1922 et aHEC1922.
Les fragments d.'ADN purifies sont marquss a haute activits specifique~ par la technique d'amor~age statistique ut:ilisant le fragment de Klenow de la polymsrase de E. co7Li et un dsoxynuclsotide marqus au P32 a haute activits spscifique.
Les membranes sont hybridses en presence de la sonde pendant :l2 heu:res a 65 ° C .
Apres 1'hybrida~tion, la membrane est laves dans une solution 2 x SSC, 1 x Denhardt, 0,5 % SDS a 65°C
pendant 45 minutes a quatre reprises, laves ensuite Bans une solmtion 0,2 x SSC, 0,1 x SSC pendant 45 minutes a 65°C a deux reprises, puffs daps une solution 0,1 x SSC, 0,1 % SDS~ pendant 45 minutes a 65°C.
Les sequE~nces ayant hybride avec la sonde sont ensuite visua:Lisees par autographie des membranes a -80°C en presence ~d'un ecran intensificateur sur un film.
L'analyse de 1'ADN de plusieurs individus avec les sondes ADNc de 1"ECA ou des sondes equivalentes c'est-a-dire raccourcies a T une des deux extremites, ou allongees veers l.'extremite 3' ou 5' de la partie transcrite ou non transcrite du gene, ou des fragments d'ADN synthet:iques guff gardent la propriete de s'hybrider avec les fragments de restriction sus-mentionnes, pE:rmet de distinguer plusieurs types de fragments de restriction en fonction des coupures enzymatiques d~e 1'ADN. Ces fragments sont les suivants:
- 5,8 kb ou 6 :kb par digestion TaqI, - 8,8 kb ou 9 kb par digestion DraI, - 8,5 kb ou 9 kb par digestion DglII, - 10,6 kb ou 11 kb par digestion KpnI, - 8,4 kb ou 8,.8 kb par digestion HindIII, - 4,2 kb et 3,0 kb ou 4 kb et 2,7 kb par digestion BglI, - 5,2 kb ou 5,'7 kb par digestion RsaI, avec presence ou non dune bande a 3,0 kb.
- 3,5 kb ou 3 l~cb par digestion XbaI, - 4,3 kb ou 2,'7 par digestion TaqI.
Par digestion par 1' enzyme PvuII, on obtient deux profils ou pattern de restriction comportant la presence ou non d'un~e bande a 4,2 kb guff est associee a une bande plu:a faible de 2,2 et de 2,5 kb.

Claims (23)

1. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend toute ou partie de la séquence nucléique de la figure 3, et en ce qu'il code pour un polypeptide capable d'hydrolyser l'angiotensine I et/ou les kinines, ou tout acide nucleique ne se distinguant du précédent au niveau de sa séquence nucléotidique que par des substitutions de nucléotides n'entraînant pas la modification de la séquence en aminoacides du susdit polypeptide dans des conditions propres à lui faire perdre les susdites propriétés.

2. Acide nucleique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'ADN
délimitée par les nucléotides situées aux positions 110 et 3940 de la figure 3, codant pour l'ECA humaine mature.

3. Acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite séquence d'ADN codant pour l'ECA humain mature est précedée par une séquence d'ADN
délimitée par les nucléotides situés aux positions 23 et 109 de la figure 3, cette dernière codant pour un peptide signal de 29 acides amines.

4. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'ADN
s'étendant entre, d'une part, le nucléotide situé entre les positions 1 à 1177 et, d'autre part, le nucléotide situé entre les positions 3070 à 3940 de la figure 3.

5. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'ADN
s'étendant entre, d'une part, le nucléotide situé entre les positions 110 à 1177 et d'autre part, le nucléotide situé entre les positions 1276 à 1966 de la figure 3.

6. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une sequence d'ADN
s'étendant entre, d'une part, le nucléotide situé entre les positions 1967 à 2971 et, d'autre part, le nucléotide situé entre les positions 3070 à 3940 de la figure 3.

7. Acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 associée avec un promoteur sous le controle duquel la transcription de ladite séquence est susceptible d'être effectuée et, le cas échéant, une séquence d'ADN codant pour des signaux de terminaison de la transcription.

8. Vecteur recombinant choisi du groupe comprenant plasmide recombinant et virus recombinant, capable de transformer ou d'infecter une cellule hôte appropriée, ledit vecteur contenant un fragment d'ADN
selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 sous le contrôle d'éléments de régulations permettant l'expression de ce fragment d'ADN dans la cellule hôte.

9. Procédé de production de l'ECA humaine, mature ou non, ou d'un polypeptide issu de l'ECA humaine et capable d'hydrolyser l'angiotensine I et/ou les kinines, ce procédé comprenant la transformation de cellules hôtes au moyen du vecteur selon la revendication 8, la mise en culture des cellules hôtes transformées dans un milieu de culture approprié et la récupération de l'enzyme à partir de ces cellules ou du milieu de culture.

10. Polypeptide codé par l'acide nucléique selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend toute ou partie de la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions -29 à 1277 de la figure 3, et en ce qu'il est capable d'hydrolyser 1'angiotensine I et/ou les kinines.

11. Polypeptide selon la revendication 10, caractérisé par la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 et 619 de la figure 3.

12. Polypeptide selon la revendication 10, caractéérisé par la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 620 et 1229 de la figure 3.

13. Polypeptide selon la revendication 10, caractérisé par la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 350 et 395 de la figure 3.

14. Polypeptide selon la revendication 10, caractérisé par la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 948 et 993 de la figure 3.

15. Sonde nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence nucléotidique complémentaire de toute ou partie de l'acide nucléique de la revendication 1, ou toute sonde nucléotidique ne se distinguant de la précédente au niveau de sa séquence nucléotidique que par des substitutions de nucléotides n'entraînant: pas la modification des propriétés d'hybridation de ladite sonde avec l'acide nucléique de la revendication 1.

16. Procédé d'hybridation d'une sonde nucléotidique avec un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend, dans les conditions d'hybridation stringentes, les étapes suivantes :
- traitement de pré-hybridation du support sur lequel est fixé l'acide nucleique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, à 65 °C pendant 6 heures avec une solution ayant la composition suivante : 4 X SSC, 10 x Denhardt;
- remplacement de la solution de pré-hybridation au contact du support par une solution tampon ayant la composition suivante: 4 x SSC, 1 x Denhardt, 25mM NaPO4 pH 7, 2 mM EDTA, 0, 5 % SDS, 100µg/ml de sperme de saumon soniqué, comprenant la sonde nucléotidique marquée et préalablement dénaturée par un traitement à 100 °C
pendant 3 minutes;
- incubation pendant 12 heures à 65 °C;

- lavages successifs avec les solutions suivantes :
~ 2 x SSC, 1 x Denhardt, 0,5% de SDS pendant 45 minutes à 65 °C à quatre reprises, ~ 0,2 x SSC. 0,1 x SSC pendant 45 minutes à
65 °C à deux reprises, ~ 0,1 x SSC, 0,1% SDS pendant 45 minutes à
65 °C, ladite sonde nuclotidique étant caractérisé en ce qu'elle est constituée par une séquence nucléotidique complémentaire de toute ou partie de l'acide nucléique de la revendication 1, ou ne se distinguant de la précédente au niveau de sa séquence nucléotidique que par des substitutions de nucléotides n'entraînant pas la modification des propriétés d'hybridation de ladite sonde avec l'acide nucléique de la revendication 1.

17. Procédé d'hybridation d'une sonde nucléotidique avec un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend, dans les conditions d'hybridation non stringentes, les étapes suivantes :
- traitement de pré-hybridation du support sur lequel est fixé l'acide nucléique, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, à 40 °C pendant 6 heures avec une solution ayant la composition suivante:
4 x SSC, 10 x Denhardt;
- remplacement de la solution de pré-hybridation au contact du support par une solution tampon ayant la composition suivante : 4 x SSC, 1 x Denhardt, 25 mM
NaPO4 pH 7, 2 mM EDTA, 0,5 SDS, 100 µg/ml de sperme de saumon soniqué, comprenant la sonde nucléotidique marquée et préalablement dénaturée par un traitement à
100 °C pendant 3 minutes;
- incubation pendant 12 heures à 40 °C;
- lavages successifs avec 2 x SSC à 45 °C
pendant 15 minutes à deux reprises, ladite sonde nucléotidique étant caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence nucléotidique complémentaire de toute ou partie de l'acide nucléique de la revendication 1, ou ne se distinguant de la précédente au niveau de séquence nucléotidique que par des substitutions de nucléotides n'entraînant pas la modification des propriétés d'hybridation de ladite sonde avec l'acide nucléique de la revendication 1.

18. Méthode de dépistage ou de dosage in vitro d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans un prélèvement biologique susceptible de le contenir, caractérisée en ce qu'elle comprend :

- la mise en contact d'une sonde nucleotidique avec le susdit prélevement biologique dans des conditions permetaant la production éventuelle d'un complexe d'hybridation formé entre la sonde et l'acide nucléique sus-mentionnés, ladite sonde nucléotidique étant caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence nucléotidique complémentaire de toute ou partie de l'acide nucléique de la revendication 1, ou ne se distinguant de la précédente au niveau de sa séquence nucléotidique que par des substitutions de nucléotides n'entraînant pas la modification des propriétés d'hybridation de ladite sonde avec l'acide nucléique de la revendication 1; et - la détection du susdit complexe d'hybridation.

19. Méthode de dépistage ou de dosage in vitro selon la revendication 18, appliquée au diagnostic in vitro de pathologies choisies parmi le groupe comprenant l'hypertension, la sarcoïdose et autres maladies granulomateuses, et les dysfonctionnements thyroidiens.

20. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de depistage in vitro comprenant:
- une quantité déterminée d'une sonde nucléotidique susceptible de donner lieu à une réaction d'hybridation avec un acide nucleique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6;
- avantageusement, un milieu approprié à la formation d une réaction d'hybridation entre l'acide nucléique et la sonde sus-mentionnées; et - avantageusement, des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés entre l'acide nucléique et la sonde lors de la susdite réaction d'hybridation, ladite sonde nucléotidique étant caractérisé en ce qu'elle est constituée par une séquence nucléotidique complémentaire de toute ou partie de l'acide nucléique de la revendication 1, ou ne se distinguant de la précédente au niveau de sa séquence nucléotidique que par des substitutions de nucléotides n'entrainant pas la modification. des propriétés d'hybridation de ladite sonde avec l'acide nucléique de la revendication 1.

21. Méthode de détection ou de dosage d'un inhibiteur de l'ECA, ou de quantification de son pouvoir inhibiteur, qui comprend la mise en contact d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 10 à 14 avec ledit inhibiteur, et la détermination du coefficient d'inhibition de l'enzyme par l'inhibiteur, par mesure de l'éventuelle activité enzymatique résiduelle sur un substrat approprié de l'ECA.

22. Composition pour le traitement de maladies inflammatoires ou infectieuses caractérisée par l'association d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

23. Méthode de depistage in vitro des polymorphismes du gène codant pour l'ECA au sein dune population donnée d'individus, réalisée à partir d'un échantillon biologique prélevé dans ladite population, caractérisée en ce qu'elle comprend:
- le traitement de l'acide nucléique issu de l'échantillon biologique sus-mentionné réalisé à l'aide d'une enzyme de restriction dans des conditions permettant l'obtention de fragments de restriction issus du clivage dudit aside nucléique au niveau de ces sites de restrictions reconnus par ladite enzyme;
- la mise en contact dune sonde nucléotidique selon la revendication 15 susceptible de s'hybrider avec les fragments sus-mentionnés dans des conditions permettant la production éventuelle de complexes d'hybridation entre ladite sonde et les fragments de restriction sus-mentionnés, - la détection des susdits complexes d'hybridation, et - la mesure de la taille des éventuels fragments de restriction polymorphes engagés dans les complexes d'hybridation sus-mentionnés.