JP3755040B2 - ポリヌクレオチド、ポリペプチド及び解糖系酵素の製造方法 - Google Patents
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ナカダ T(Nakada T)他,"Trichinella spiralis由来のミオシン重鎖遺伝子様抗原タンパク質(An antigenic peptide of myosin heavy chain-like protein from Trichinella spiralis.)",Japanese Journal of Tropical Medicine and Hygiene,2002年,30巻,p.15-21 ナガノ I(Nagano I)他,"Trichinella spiralis由来のセリンプロテイナーゼ抑制遺伝子のクローニング及び性状解析(Molecular cloning and characterization of a serine proteinase inhibitor from Trichinella spiralis.)",Parasitology,2001年,123巻,p.77-83 ナガノ I(Nagano I)他,"Trichinella pseudospiralisから分泌された21kDaタンパク質のクローニング及び性状解析(Molecular cloning and characterization of a 21kDa protein secreted from Trichinella pseudospiralis.)",Journal of Helminthology,2001年,75巻,p.273-278
請求項3に記載の発明のポリヌクレオチドは、請求項1又は請求項2に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と、該ポリヌクレオチドの5'末端又は3'末端に結合するとともに融合ペプチドをコードする塩基配列とからなるものである。
請求項5に記載の発明の解糖系酵素の製造方法は、解糖系酵素を製造する方法であって、請求項1から請求項3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが発現可能となるように組込まれた組替えベクターを導入して形質変換した細胞である形質転換体を増殖させた後に該形質転換体から請求項4に記載のポリペプチドを精製するものである。
請求項1から請求項3に記載の発明のポリヌクレオチド及び請求項4に記載の発明のポリペプチドによれば、エノラーゼ活性を容易に利用することができる。請求項5に記載の発明の解糖系酵素の製造方法によれば、エノラーゼ活性を備えた解糖系酵素を容易に製造することができる。
本実施形態の第一のポリヌクレオチドは、配列番号1で表される塩基配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列を含有するものである。例えば、前記塩基配列及び該配列の3’末端に結合するとともに融合ペプチドをコードする塩基配列からなるものが挙げられる。ここで、結合とは、各塩基配列が連続して配列されることをいう。これら第一のポリヌクレオチドは、いずれもエノラーゼ(2-phospho-D-glycerate hydrolylase:enolase)活性を有するポリペプチド(解糖系酵素)をコードする。ここで、エノラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするとは、前記塩基配列の5’末端にシグナル配列が結合されていない、即ち前記塩基配列の5’末端側にシグナル配列が連続して配列されていないことを意味する。
・ 本実施形態のポリヌクレオチドは、旋毛虫(Trichinella spiralis)よりクローニングされた新規な塩基配列に基づいて提供され、該配列の5’末端にはシグナル配列が結合されていない。第一及び第二のポリヌクレオチド(PN1+及びPN1)は、いずれもエノラーゼ活性を有する(第一又は第二の)ポリペプチドをコードしていることから、そのエノラーゼ活性を人為的に有効利用することにより代謝改善薬等として利用することができる。
・ 前記解糖系酵素を腫瘍マーカーとして用いてもよい。この場合には、例えば血中における本実施形態の解糖系酵素の量を測定することにより、癌の発見、癌の進行状況を判断することができる。
旋毛虫(Trichinella spiralis) (ISS413)感染15日後のマウスから筋肉幼虫(muscle larvae)を採取してmRNAを抽出した。続いて、前記mRNAを、Timesaver cDNA synthesis kit(Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いてλZAPIIベクター(Stratagene社製)に組込んだ後、Gigapack Gold III packaging extract(Stratagene社製)にパッケージしてcDNAライブラリーを作製した。このライブラリーの作製方法の詳細は、Nagano,I.et.al.Parasitology 123:77-83を参照。
<RT-PCRによる解糖系酵素遺伝子の存在確認及び発現量の定量>
旋毛虫(Trichinella spiralis)(ISS413)の成虫、新生幼虫、15日齢筋肉幼虫又は35日齢筋肉幼虫より、TRIZOL(Life Technologies社製)を用いてトータルRNAをそれぞれ単離した後、DNase(Promega社製)を用いて処理した。続いて、DNase処理済みのトータルRNAから、RT-PCRによってエノラーゼ活性を有する解糖系酵素に相当すると考えられる遺伝子(以下、解糖系酵素遺伝子という。)をクローニングした。ここで、RT-PCRにはReady-To-Go RT-PCR Kit(Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いるとともに、配列番号5及び6で表される塩基配列かなら一対のPCRプライマーを用いた。
<リコンビナントタンパクの発現と精製>
前記クローンTsENOが組込まれたプラスミドを、配列番号7及び8で表される塩基配列からなる一対のPCRプライマーにてPCR増幅することにより増幅フラグメントを得た。この増幅フラグメントは、配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。次に、前記増幅フラグメントをBamHI及びKpnIで切出し、pTrcHis発現ベクター(Invitrogen社製)に組込んで組替えベクターを作製した後、大腸菌DH5α細胞内に導入して形質転換細胞を作製した。続いて、形質転換細胞の培養液にIPTG(isopropyl β-D-thiogalactopyranaside)を終濃度1mM添加し、37℃で3時間インキュベートしてポリヒスチジン融合リコンビナントタンパクの発現を誘導した。そして、前記リコンビナントタンパクの発現が誘導された形質転換細胞を集めた後に20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)中で超音波処理により破壊し、同緩衝液中に終濃度6Mの尿素を添加して可溶化させた後にHis Trap カラム(Amarsham Pharmacia Biotech社製)にリコンビナントタンパクを吸着させた。
<プロリコンビナントタンパクに対する抗体等の作製及び免疫染色>
前記プロリコンビナントタンパク100μgをBALB/cマウスに注射した後、同プロリコンビナントタンパク約100μgを2週間毎に4回注射してプロリコンビナントタンパクに対する抗体を作製した。また、Trichinella spiralisの幼虫300匹をBALB/cマウスに感染させ、2月後にTrichinella spiralisに対する抗体を抗血清として得た。
<プロリコンビナントタンパクのエノラーゼ活性の測定>
エノラーゼ活性は、Kustrzeba-Wojcicka, I., and M. Golczak. 2000. Enolase from Candida albicans-purification and characterization. Comparative Biochemistry and Physilogy Part B 126:109-120.の方法に従い、ホスホエノールピルビン酸(phosphoenolpyruvate:PEP)の吸光度測定により行った。即ち、まず0.05Mイミダゾール緩衝液(1mM 2ホスホグリセリン酸(2-phospho-glyceric acid:2PGA),3mM MgSO4,pH6.0-8.0)及び0.05nmolのリコンビナントタンパクを混合し、全量が0.5mlの反応液を調製した。ここで、リコンビナントタンパクとしては実施例としてのプロリコンビナントタンパク又は比較例としてのプレプロリコンビナントタンパクを用いた。次いで、反応液を25℃で1時間インキュベートするとともに240nmでの吸光度の変化を測定し、吸光度の変化よりPEP量を求めた。ここで、前記条件下では、吸光度の0.2の上昇は、基質である2PGAがPEPに0.226μmol変換されたことに相当する。また、コントロールとしてウサギ由来のエノラーゼ(Sigma社製)を用いた。各pHにおける測定結果を図1に示す。
Claims (5)
- ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは配列番号1で表される塩基配列からなり、該配列番号1で表される塩基配列は配列番号3の173〜1360番目で表される塩基配列よりなり、かつエノラーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは配列番号4の42〜437番目で表されるアミノ酸配列をコードし、かつエノラーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
- 請求項1又は請求項2に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と、該ポリヌクレオチドの5'末端又は3'末端に結合するとともに融合ペプチドをコードする塩基配列とからなることを特徴とするポリヌクレオチド。
- 請求項1から請求項3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
- 解糖系酵素を製造する方法であって、請求項1から請求項3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが発現可能となるように組込まれた組替えベクターを導入して形質変換した細胞である形質転換体を増殖させた後に該形質転換体から請求項4に記載のポリペプチドを精製することを特徴とする解糖系酵素の製造方法。
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