KR20010073658A - 인간 인터페론 알파의 발현 분비벡터 및 이를 이용한인터페론 알파의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대장균의 변형된 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열 유전자 및 그의 3'-말단에 연결된 인간 인터페론 알파(human Interferon α: hIFN α) 유전자를 포함하는 인간 인터페론 알파의 분비생산용 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포주 및 상기 세포주를 배양하여 인간 인터페론 알파를 분비 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법을 이용하면 아미노 말단에 추가의 메티오닌이 첨가되지 않고 활성화된 가용화 형태의 인간 인터페론 알파를 대장균 페리플라즘 내로 대량으로 분비 생산할 수 있다.

Description

인간 인터페론 알파의 발현 분비벡터 및 이를 이용한 인터페론 알파의 생산 방법{EXPRESSION AND SECRETION VECTOR FOR HUMAN INTERFERON ALPHA AND PROCESS FOR PRODUCING HUMAN INTERFERON ALPHA BY EMPLOYING SAME}
본 발명은 대장균의 변형된 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열 유전자 및 그의 3'-말단에 연결된 인간 인터페론 알파(human Interferon α: hIFN α) 유전자를포함하는 인간 인터페론 알파의 분비생산용 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포주 및 상기 세포주를 배양함으로써 아미노 말단에 추가의 메티오닌이 첨가되지 않은 인터페론 알파를 페리플라즘으로 분비시켜 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
인터페론은 1957년 이삭스(Isaacs)와 린덴만(Lindenmann)이 닭을 인플루엔자 A 바이러스로 감염시키면 바이러스를 억제하는 인자가 있음을 발견하여 알려지게 되었다 (Isaacs, K. and Lindenmann,J., Proc. R. Soc. Lond., B147, 258-267 (1957)).
인간 인터페론은 일종의 싸이토카인으로 생체내 면역반응 또는 바이러스의 증식을 저해하는 단백질로서 이들은 생성되는 세포의 종류에 따라 알파 인터페론, 베타 인터페론 및 감마 인터페론으로 나누어진다 (Kirchner, H., et al.,Tex. Rep. Biol. Med., 41, 89-93(1981) : Stanton, G. J., et al.,Tex. Rep. Biol. Med., 41, 84-88(1981)). 즉, 알파 인터페론은 B 임파구 세포 (B lymphocytes), 눌 임파구세포 (Null lymphocytes) 및 거식세포 (Macrophage)에 의해 생성되며, 감마 인터페론은 거식세포의 도움으로 T 임파구 세포에서 생성된다.
인터페론은 항 바이러스 기능, 항암기능, NK (Natural Killer) 세포의 활성화 및 골수세포의 억제 기능에 서로 상승작용을 갖고 있는 것으로 알려져 있다(Klimpel, et al.,J. Immunol., 129, 76-78(1982); Fleischmann, W. R., et al.,J. Natl. Cancer Inst., 65, 863-966(1980); Weigent., et al.,Infec. Immun., 40, 35-38(1980)). 그 후 수 많은 연구 결과에서 인터페론이 항바이러스기능 뿐만 아니라 세포내 유전자의 발현, 구조 그리고 기능의 조절인자로 작용함이 알려졌으며, 직접적인 항증식효과 (Antiproliferative effect)가 있음이 밝혀졌다. 또한 인터페론들은 여러 가지 바이러스성 질병등에 효과적으로 작용하며, 여러 가지 암에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
알파 인터페론은 B 세포 분열인자 (mitogen), 바이러스 또는 암세포 등에 의해 백혈구가 자극 받았을 때 생성되는 것으로 현재까지 20 여종 이상의 인터페론 유전자가 존재함이 밝혀졌고, 이들은 대부분 165 또는 166개의 아미노산으로 구성된 것으로 알려져 있다.
최초의 임상시험에 사용된 알파 인터페론은 센다이 바이러스 (Sendai virus)로 자극된 연층 백혈구 (buffy coat leukocyte)에서 얻어진 것으로 이때 순도는 겨우 1% 정도에 불과하였다 (Cantell, K. and Hirvonen.,Tex. Rep. Biol. Med., 35, 138-144(1977)).
80년대에 들어서 유전공학의 발달로 생리활성을 갖는 유전자 재조합 알파 인터페론을 대량 생산할 수 있게 되었으며 (Goedell, D. V. et al.,Nature, 287, 411-416(1980)), 이러한 재조합 인간 알파 인터페론을 이용한 임상시험 결과 여러 고형암의 치료에 효과가 있는 것으로 알려졌다. 특히, 방광암, 신장암과 후천성 면역결핍증에 관련된 카포시육종 등에 효과가 있는 것으로 알려졌다 (Torti, F.M.,J. Clin. Oncol., 6, 476-483(1988); Vugrin, D., et al.,Cancer Treat. Rep., 69, 817-820(1985); Rios, A., et al.,J. Clin. Oncol., 3, 506-512(1985)). 또한 최근에는 C형 간염바이러스의 치료에도 효과가 있는 것으로 알려지는 등 (Davis,G. G., et al.,N. Engl. J. Med., 321, 1501-1506(1989)) 의약품 치료제로서의 적용 범위가 날로 확대되고 있다.
백혈구로부터 알파 인터페론 유전자를 클로닝(cloning)한 결과 알파 인터페론이 적어도 10개의 다른 유전자로 구성된 유전자 부류에 의해 암호화된다는 것이 밝혀졌는데, 이는 DNA 서열의 유전자 생성물이 하나의 균일한 단백질을 구성하지 않으며, 알파 인터페론이 유사한 단백질의 혼합물임을 의미하는 것이다. 이러한 아형(subtype)은 문헌에서 인터페론 α-1,2,3,...등으로 칭한다(Nature 290, 20-26(1981)).
여러 종류의 인터페론 중에서, 인간의 백혈구로부터 순수 분리된 인간 알파 인터페론은 분자량이 17,500에서 21,000 정도이고, 고유 활성은 단백질 mg당 2 x 108IU 정도로 매우 높은 역가를 가지고 있다. 생체내 알파 인터페론은 165개의 아미노산으로 구성된 단백질로서 23번째 아미노산이 라이신인 경우가 인터페론 α-2a(서열번호: 1), 23번째 아미노산이 알지닌인 경우가 인터페론 α-2b(서열번호: 2)이다.
인간 알파 인터페론을 생산하는 방법으로서, 초기에는 세포배양법을 이용하는 방법이 알려졌으나, 이 방법은 생산성이 1 L당 250 ㎍ 정도에 불과하여 대규모의 생산 방법에는 적합치 않은 것으로 산업화하기에 부적당하였다.
따라서 그 후에는 유전자 재조합 기술에 의해 미생물로부터 비교적 간편한 방법으로 많은 양의 인터페론을 생산하는 기술이 개발되어 현재까지 사용되고 있다.
가장 일반적으로 사용되고 있는 대장균을 이용한 방법에서는, 발현된 인터페론 알파의 대부분이 소위 불용성 봉입체의 형태로 세포내에 존재하게 되므로 발현된 인터페론 알파를 정제공정에서 반드시 산화시켜 재폴딩시켜야 하는 문제점이 있다. 또한, 원핵세포를 이용하여 비당쇄화된 알파 인터페론을 수득하는 방법에 있어서는 사용한 대장균의 특성에 따라 개시코돈 위치에 존재하는 ATG 코돈에 의해 아미노 말단 위치에 메티오닌 잔기가 하나 더 첨가된 165개 또는 166개 아미노산으로 구성된 알파 인터페론이 만들어지게 되는데, 부가된 메티오닌 잔기로 인해 인체성장호르몬 같은 경우는 인체에 유해한 면역반응이 유발될 수 있다고 알려져 있다(유럽 특허공개 제 256,843 호). 인터페론 알파의 경우는 세포내에서 부분적으로 첫 번째 아미노산인 메티오닌이 스스로 제거되는 경우가 간혹 존재한다. 그러나 어느 경우든지 기존의 방법처럼 대장균을 숙주로 사용하면, 대부분의 알파 인터페론은 불용성 물질로 세포질 내에 축적되므로 리폴딩 공정을 거쳐 활성화된 형태로 얻어야 한다. 이 공정은 매우 비효율적이어서 알파 인터페론이 부분적으로 환원된 상태로 존재하거나, 분자간 이황화 결합체 또는 잘못된 이황화 결합체 등을 형성하게 되고 이를 정제공정에서 다시 제거시켜야 하는 어려움이 따르게 된다. 그리고 이때 역가의 손실이 많게 되고, 특히 미스 폴딩(misfolding)된 것과 같은 원치 않는 인터페론의 제거가 매우 어렵게 된다.
이러한 문제점들을 해결하기 위하여, 최근에는 균체내 생산보다는 아미노 말단에 메티오닌의 부가 없이 가용화 상태로 유용단백질을 생산하는 방법이 개발되고있다.
최근, 미생물의 단백질 분비에 관여하는 여러 인자들이 알려지고, 이를 이용해서 단백질을 효율 좋게 분비 생산하는 방법에 대한 연구가 진행되고 있는데, 그 하나로 분비서열에 대한 연구를 들 수 있다. 미생물이 단백질을 분비하기 위해서는, 상술한 바와 같이 세포질 내에서 합성된 융합단백질이 세포질막을 투과해서, 프로세싱에 의해 정확히 절단되어야 한다.
가용화 상태로 단백질을 생산하는 방법에서, 목적하는 재조합 단백질은 N-말단에 분비서열이 부가된 융합 단백질로서 발현된다. 이 융합 단백질이 세포질막을 투과할 때, 분비서열은 대장균내의 효소에 의해 프로세싱되어 절단되고 천연형 형태로 목적 단백질이 분비된다. 분비 생산방법에서는 아미노산 배열 및 고차구조가 모두 천연형과 동일한 단백질을 얻을 수 있으므로 균체내 생산방법보다 유리하다.
그러나 분비 생산방법은 균체내 생산방법에 비해서 막투과 및 프로세싱의 과정이 필요하기 때문에 생산량이 낮다. 특히, 포유류 유래의 단백질을 원핵생물을 사용해서 분비 생산하면, 원핵생물 유래의 단백질을 분비 생산시킨 경우에 비해 생산 효율이 매우 낮은 것으로 알려져 있으므로, 보다 뛰어난 분비 생산방법이 요망된다. 이를 위해 대장균의 알칼라인 포스파타제의 분비서열을 이용하여 알파 인터페론의 대량 생산을 시도한 바는 있으나 배양액 L당 109IU (10 mg/배양액 L)정도로 매우 소량 생산에만 성공한 바 있다(대한민국 특허공고 제93-1387호).
따라서, 미생물을 이용하여 아미노 말단에 메티오닌 잔기가 부가되지 않은가용성 알파 인터페론을 대량으로 얻을 수 있는 방법이 절실히 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 예의 연구한 결과, 이미 알려진 대장균(E. coli)의 분비 단백질인 열안정성 엔테로톡신 II의 분비서열을 변화시켜 높은 발현률을 나타내는 새로운 분비서열을 제조하였고(한국 특허출원 제98-38061호, 한국 특허출원 제99-27418호), 이를 이용하여 천연형 알파 인터페론을 대량으로 얻을 수 있음을 알게 되었다. 즉, 대장균의 열안정성 엔테로톡신 II의 변형된 분비서열 다음에 엔테로톡신 유전자 대신 알파 인터페론 유전자를 연결시킨 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하고 이를 이용하여 대장균을 형질전환시킴으로써 미생물의 분비 시스템을 이용하여 생물학적 활성을 갖는 천연형 알파 인터페론을 산업적으로 발현시키는데 성공하였다. 또한 인터페론 알파-2a 및 2b의 단백질 서열 차이에 의한 알파 인터페론의 아형에 따른 발현도 연구함으로써 알파 인터페론의 종류에 간섭을 받지 않는 생산시스템을 개발하게 되었다. 다시 말하면 알파 인터페론의 유전자를 분비서열과 연결하여 발현시킬 경우 아미노 말단에 메티오닌 잔기가 부가되지 않은 형태로 페리플라즘으로 대량생산할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 알파 인터페론을 분비생산할 수 있는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 아미노 말단에 메티오닌 잔기가 부가되지 않은 가용성 알파 인터페론을 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 플라스미드 pT-IFNα-2a의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 2는 플라스미드 pT14SIα-2a의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 3은 플라스미드 pT14SSIα-2a의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 4는 플라스미드 pT140SSIα-2a-4T22Q의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 5a는 재조합 균주로부터 인터페론 알파-2a(IFNα-2a)의 발현여부 및 발현된 INFα-2a의 정제도를 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이고, 도 5b는 발현된 IFNα-2b의 분자량을 확인한 웨스턴 블라팅의 결과를 나타낸 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 대장균의 변형된 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열("STII 변이체") 유전자 및 그의 3'-말단에 연결된 인간 인터페론 알파(human Interferon α: hIFN α) 유전자를 포함하는 인간 인터페론 알파의 분비생산용 발현벡터가 제공된다.
본 발명의 벡터를 제조하기 위해 사용되는 인간 인터페론 알파 유전자로는 천연형 인간 인터페론 알파-2a(서열번호: 1), 2b(서열번호: 2), 인터페론 알파-1, 인터페론 알파-3 등 임의의 인간 알파 인터페론 아형을 코드하는 유전자도 포함될 수 있으며, 이에 코드된 아미노산의 변화없이 염기만이 변화된 재조합 유전자도 역시 포함될 수 있다.
인터페론 알파를 분비생산하기 위한 목적으로 본 발명의 벡터에서 인터페론 알파의 5'-말단앞에 연결되는 대장균의 변형된 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열의 유전자는 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 대장균의 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변형체, 특히, 4, 20 및 22번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변형체를 코드하는 유전자를 포함한다. 그러한 유전자는, 예를 들어, 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 대장균의 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열(STII)로부터 4번 아미노산이 트레오닌으로 치환되거나([Thr4] STII); 4번 아미노산이 트레오닌으로, 22번 아미노산이 글루타민으로 각각 치환되거나([Thr4, Gln22] STII); 4번 아미노산이 트레오닌으로, 20번 아미노산이 발린으로, 22번 아미노산이 글루타민으로 각각 치환되거나([Thr4, Val20, Gln22] STII); 4번 아미노산이 트레오닌으로, 20번 아미노산이 발린으로 각각 치환된([Thr4, Val20] STII) 변형체들을 코드하는 것으로서, 바람직하게는 각각 서열번호: 4, 5, 6 및 7의 염기 서열을 가진다. 그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 본 발명의 변이체를 코딩하는 다양한 유전자가 존재할 수 있으며, 특히 아미노산 서열에 영향을 주지 않고 대장균이 선호하는 코돈을 선택하여 변화된 유전자를 사용함으로써 인터페론 알파의 발현량을 훨씬 증가시킬 수도 있다.
또한, 본 발명의 벡터는 인터페론 알파의 발현 및 분비량을 더욱 증가시키기 위해 대장균의 열안정성 엔테로톡신 II 라이보솜 결합 서열(Shine-Dalgarno sequence; SD 서열)(서열번호:8) 또는 이의 변형체를 변형된 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열 유전자의 5'-말단 앞에 추가로 포함할 수 있다. 상기 SD 서열의 변형체는 서열번호: 8의 대장균의 열안정성 엔테로톡신 II SD 서열 중 5'-말단의 GAGG이하에서 1개 또는 2개의 염기가 결실되어 그 염기수가 정상인 7개(TGATTTT)보다 감소된 6개 또는 5개를 갖는 것들로, 이들을 사용하면 인터페론 알파의 분비 발현율이 현저히 증가한다. 그러나 상기 염기수가 4개 이하로 줄어들 경우에는 발현율이 현저히 감소하게 된다. 본 발명에서는, 서열번호: 9의 서열을 갖는 대장균의 열안정성 엔테로톡신 II SD 서열 변형체를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 벡터에서 프로모터로서는 미생물에서 이종 단백질의 발현에 사용될 수 있는 임의의 프로모터도 사용할 수 있으며, 대장균에서 발현시킬 경우 T7 프로모터, Tac 프로모터, 아라비노즈 프로모터 등을 예로 들 수 있다.
본 발명에서는 상기 벡터로 미생물, 예를 들어 대장균 BL21(DE3)(노바젠사), 대장균 XL-1 blue(노바젠사)와 같은 대장균 균주들을 형질전환시켜 제조된 형질전환체가 역시 제공된다. 이러한 형질전환체로서는 본 발명의 실시예에서 제조된 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T(HM 10603; 기탁번호: KCCM-10175), 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T22Q(HM 10611; 기탁번호: KCCM-10176), 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T(HM 10703; 기탁번호: KCCM-10177) 및 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T22Q(HM 10711; 기탁번호: KCCM-10178)를 예시할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 형질전환체를 적절한 조건하에 배양함으로써 아미노 말단에 추가의 메티오닌이 첨가되지 않은 인터페론 알파를 대장균 페리플라즘 내로 대량 분비 생산하는 방법을 제공한다. 배양 조건은 미생물 형질전환체의 통상적인 배양조건과 동일하다.
본 발명의 방법을 이용하여 분비생산할 수 있는 인터페론 알파로는 165개의 아미노산으로 이루어진 천연형 인간 인터페론 알파-2a(서열번호: 1) 및 2b(서열번호: 2)뿐만 아니라, 인터페론 알파-1, 인터페론 알파-3 등 임의의 인간 알파 인터페론 아형도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 베타 인터페론 및 감마 인터페론 등 다른 인터페론의 분비 생산에도 적용될 수 있다.
본 발명의 분비 생산방법에 따르면, 대장균 형질전환체를 이용하는 경우 생산된 인터페론 알파 중 80% 이상이 페리플라즘 내로 분비되므로 인터페론 알파를 배양배지 1 L당 1 g 이상의 높은 수율로 분비 생산할 수 있고, 이렇게 대량 생산된 인터페론 알파는 아미노 말단 부위에 다른 아미노산의 부가없이 천연형과 동일한 아미노산 서열을 가지며 세포내에서 천연형의 인터페론 알파와 동일한 생물학적 역가를 나타낸다.
본 발명은 하기 실시예를 통하여 상세히 설명되고 있다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인터페론 알파-2a 유전자의 제작
인간 인터페론 α-2a 유전자를 얻기 위하여, 인간 게놈 DNA(Clontech #6550-1)를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이때 프라이머로는 IFN α-2a의 첫번째 아미노산인 시스테인 앞에 제한효소 Nde I 인지서열인 5'-CATATG-3'을, 또한 종료코돈 뒷부분에는 제한효소 BamH I 인지서열인 5'-GGATCC-3'를 삽입시키기 위해 고안된 서열번호: 10 및 서열번호: 11의 염기서열을 가지는 올리고머를 사용하였다. 인간 인터페론 알파-2a는 인트론을 포함하고 있지 않아 성숙한 인간 인터페론 알파 2a 유전자는 인간 게놈 DNA로부터 용이하게 얻을 수 있다.
PCR 산물을 NdeI과 BamHI으로 절단한 후, 시판되고 있는 플라스미드 pET-14b(노바젠사)를 Nde I과 BamH I으로 절단한 NdeI/BamHI 부위 사이로 상기 삽입체 DNA 단편을 삽입함으로써 인터페론 알파-2a 유전자를 가진 pT-IFNα-2a 벡터를 제작하였다. 상기 제작 과정은 도 1에 도시되어 있다.
실시예 2
(a) 엔테로톡신 분비서열 및 IFN α-2a 유전자를 함유한 벡터의 제작
엔테로톡신 분비서열의 ATG 개시코돈 앞에 제한효소 Nco I과 상보적인 제한효소 BspH I 인지서열을 추가하고 3'-말단 위치에는 아미노산의 변화없이 코돈만을 변화시켜 제한효소 Mlu I 인식부위를 갖도록 제조한 서열 번호: 12 및 13의 합성 올리고누클레오타이드들을 이용하여 엔테로톡신 분비서열을 함유한 DNA 단편을 제조하였다. 이 DNA 단편을 플라스미드 pUC19의 Sma I 부위로 삽입하여 엔테로톡신 분비서열의 아미노 말단에 제한효소 BspH I 인지부위가 존재하며, 카르복실기 말단에 제한효소 Mlu I 인지부위를 갖는 플라스미드 pUC19ST를 제작하였다.
또한, 엔테로톡신 분비서열과 IFN α-2a의 유전자를 연결하기 위해서, IFN α-2a 유전자를 함유한 실시예 1의 플라스미드 pT-IFNα-2a를 주형으로하고, IFN α-2a 유전자의 5'-말단에 대응하거나 종료코돈 뒤에 제한효소 BamH I 인지서열인 5'-GGATCC-3'를 삽입시키도록 각각 디자인된 서열번호: 14 및 15의 올리고누클레오타이드 프라이머들을 사용하여 PCR법에 의해 천연형 IFN α-2a를 코드하는 서열을함유한 DNA 단편을 얻은 후 이를 제한효소 Mlu I과 BamH I으로 절단하여 Mlu I과 BamH I 말단을 가진 IFN α-2a DNA 단편을 제조하였다.
한편, 엔테로톡신 분비서열을 함유한 플라스미드 pUC19ST를 제한효소 Mlu I 으로 절단한 후 제한효소 BamH I으로 소화하여 Mlu I과 BamH I 말단을 가진 벡터 단편을 얻었다. 이 벡터 단편을 상기의 IFN α-2a DNA 단편과 연결하여 플라스미드 pUC19SIα-2a를 제작하였다.
플라스미드 pUC19SIα-2a를 다시 제한효소 BspH I과 BamH I으로 절단하여 DNA 단편(564 bp)을 회수하고, 노바젠사(Novagen)로부터 구입한 플라스미드 pET14b를 Nco I과 BamH I으로 절단하여 벡터 단편을 만든 후, 상기 DNA 단편과 벡터 단편을 서로 연결시켜 플라스미드 pT14SIα-2a를 제작하였다. 상기 제작과정은 도 2에 상세히 도시되어 있다. 이어서, 대장균 BL21(DE3) 균주를 70 mM 염화칼슘 용액으로 처리하여 컴피턴트 대장균으로 만들고, 10 mM 트리스 완충액(pH 7.5) 중 플라스미드 pT14SIα-2a의 현탁액을 가하였다. 플라스미드에 의해 전달된 항생물질에 대한 내성 및 감수성을 이용하여 통상적인 방법으로 형질전환주를 선택함으로써 IFN α-2a를 발현하는 대장균 형질전환주 HM 10600을 제조하였다.
또한, 플라스미드 pT14SIα-2a를 주형으로하고 서열번호: 16 및 17의 합성 올리고누클레오타이드를 이용한 PCR법에 의해 엔테로톡신의 샤인-달가르노 서열을 가지며 엔테로톡신 분비서열에 연결된 IFN α-2a 유전자를 함유한 DNA 단편을 얻은 후, 이를 Xba I과 BamH I으로 절단하여 삽입체를 획득하였다. 한편, 플라스미드 pET14b(Novagen사)를 Xba I 과 BamH I으로 절단한 벡터 단편과 상기의 삽입체를 연결시켜 플라스미드 pT14SSIα-2a를 제작하였다. 상기 제작 과정은 도 3에 도시되어 있다. 상기에서와 같은 방법으로 플라스미드 pT14SSIα-2a로 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시켜 대장균 형질전환주 HM 10601을 제조하였다.
(b) INF α-2b 발현벡터의 제조
공지된 방법인 특정부위 치환법(site directed mutagenesis 방법)을 이용하여 플라스미드 pT14SSIα-2a의 23번 위치의 라이신 코돈을 아르기닌 코돈으로 바꾸어 줌으로써 INF α-2b 유전자를 가진 발현벡터를 제조하였다. 주형으로 플라스미드 pT14SSIα-2a를 이용하고, 변형된 코돈을 함유하는 하기 서열번호: 19 및 20의 합성 올리고뉴클레오타이드와 잡종분자를 형성시키며 이 올리고뉴클레오타이드를 지나서 5' → 3' 방향으로 연장시키는 pfu(스트라타진사)와 4개의 뉴클레오타이드 트리포스페이트들(ATP, GTP, TTP, CTP)을 사용하여 유전자 증폭을 수행하였다:
인터페론 알파-2b 서열
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
Leu Leu Ala Gln Met ArgArgIle Ser Leu Phe Ser Cys (서열번호: 18)
CTC CTG GCA CAG ATG AGGAGAATC TCT CTT TTC TCC TGC (서열번호: 19)
GCA GGA GAA AAG AGA GATTCTCCT CAT CTG TGC CAG GAG (서열번호: 20)
증폭된 유전자를 회수하고 제한효소 Dpn I을 첨가하여 증폭전에 넣어 준 기존의 플라스미드를 완전히 제거하였다.
상기와 같이 수득한 변형체 플라스미드를 대장균 XL-1 blue(노바젠사)에 형질전환시킨 후, 형질전환된 콜로니로부터 DNA를 회수하고, 염기서열을 결정하여 IFN α-2a의 23번 아미노산이 라이신에서 아르기닌으로 바뀌어진 IFN α-2b의 유전자를 포함하는 플라스미드 pT14SSIα-2b를 제조하였다.
이어서, 상기 플라스미드 pT14SSIα-2b를 이용하여 상기 (a)에서와 같은 방법으로 대장균 BL21(DE3) 균주를 형질전환시켜 대장균 형질전환주 HM 10701을 수득하였다. 이 형질전환주를 배양한 후 아미노 말단 아미노산 분석 결과 천연형과 동일한 아미노산 서열을 가진 인터페론 알파-2b의 발현을 확인하였다.
(c) 엔테로톡신 변형체 분비서열을 함유한 벡터의 제작
(i) [Thr4] STII를 포함하는 벡터의 제작
엔테로톡신 분비서열 펩타이드 내의 특정 아미노산 잔기만을 변형시키기 위해 공지된 방법인 특정부위 치환법(site directed mutagenesis 방법)을 이용하여 엔테로톡신 변형체 분비서열을 가진 발현벡터를 다음과 같이 제조하였다.
우선, 엔테로톡신 분비서열 펩타이드의 4번째 아미노산을 Thr으로 치환하기 위하여, 상기 (a)에서 제조된 플라스미드 pT14SSIα-2a 및 서열 번호: 22 및 23의 올리고누클레오타이드를 이용하여 (b)에서와 같은 특정부위 치환법에 의해 변형된 플라스미드를 제조하였다.
Met Lys LysThrIle Ala Phe Leu (서열번호: 21)
5'-GGTGATTTT-ATG-AAA-AAG-ACA-ATC-GCA-TTT-CTT-C-3' (서열번호: 22)
3'-CCACTAAAA-TAC-TTT-TTC-TGT-TAG-CGT-AAA-GAA-G-5' (서열번호: 23)
상기와 같이 수득한 변형체 플라스미드로 대장균 XL-1 blue를 형질전환시킨 후 DNA를 회수하고 염기서열을 결정하여 엔테로톡신 분비서열의 4번째 아미노산이 Thr로 변형된 플라스미드를 수득하였다. 이 플라스미드를 Xba I과 Mlu I으로 절단하여 변형된 엔테로톡신 분비서열 삽입체를 획득하였다. 이어서, 플라스미드 pT14SSIα-2a를 Xba I과 Mlu I으로 절단한 벡터 단편과 상기의 삽입체를 연결시켜 플라스미드 pT14SSIα-2a-4T를 제작하였다.
이어서, 상기 플라스미드 pT14SSIα-2a-4T를 이용하여 상기 (a)에서와 같은 방법으로 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시켜 대장균 형질전환주 HM 10602를 수득하였다.
또한 같은 방법으로 pT14SSIα-2b를 이용하여 pT14SSIα-2b-4T 벡터를 제조한 후 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시켜 대장균 형질전환주 HM10702를 수득하였다.
(ii) [Thr4, Gln22] STII를 포함하는 벡터의 제작
4번 아미노산이 Thr로 치환된 엔테로톡신 분비서열 펩타이드의 22번째 아미노산을 Gln으로 더 치환하기 위하여, 상기 (i)에서 제조된 플라스미드 pT14SSIα-2a-4T 및 서열 번호: 25 및 26의 올리고누클레오타이드를 이용하여 (b)에서와 같은 특정부위 치환법에 의해 변형된 플라스미드를 제조하였다.
Asn AlaGlnAla Cys Asp Leu Pro (서열번호: 24)
5'-CA-AAT-GCC-CAA-GCG-TGT-GAT-CTG-CCT-3' (서열번호: 25)
3'-GT-TTA-CGG-GTT-CGC-ACA-CTA-GAC-GGA-5' (서열번호: 26)
상기와 같이 수득한 변형체 플라스미드를 대장균에 형질전환시킨 후 DNA를 회수하고, 염기서열을 결정하여 엔테로톡신 분비서열의 4번째 아미노산이 Thr으로, 22번째 아미노산이 Gln으로 각각 변형된 플라스미드 pT14SSIα-2a-4T22Q를 수득하였다. 이어서, 상기 플라스미드 pT14SSIα-2a-4T22Q를 이용하여 상기 (a)에서와 같은 방법으로 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시켜 대장균 형질전환주 HM 10604를 수득하였다.
상기와 같이 변형된 엔테로톡신 분비서열 펩타이드의 샤인-달가르노 서열을 서열번호: 9와 같이 변형시키기 위하여, 상기에서 제조된 플라스미드 pT14SSIα-2a-4T 및 pT14SSIα-2a-4T22Q 를 주형으로 하고 서열 번호: 27 및 28의 올리고누클레오타이드를 이용하여 (b)에서와 같은 특정부위 치환법에 의해 변형된 플라스미드를 제조하였다.
상기와 같이 수득한 변형체 플라스미드를 대장균에 형질전환시킨 후 DNA를 회수하고, 염기서열을 결정하여 엔테로톡신 분비서열의 샤인-달가르노 서열을 변형시킨 플라스미드 pT14OSSIα-2a-4T와 pT14OSSIα-2a-4T22Q를 수득하였다. 플라스미드 pT14OSSIα-2a-4T22Q의 제작 과정은 도 4에 도시되어 있다.
이어서, 상기 플라스미드 pT14OSSIα-2a-4T와 pT14OSSIα-2a-4T22Q를 이용하여 상기 (a)에서와 같은 방법으로 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시켜 대장균 형질전환주 HM 10603과 HM 10611을 수득하였고, 이를 1999년 12월 29일자로 국제기탁기관인 한국 종균협회 부설 한국 미생물 보존 센타(KCCM, 대한민국 서울시 서대문구 신촌동 134 소재)에 기탁번호 제 KCCM-10175 호 및 제 KCCM-10176 호로 기탁하였다.
또한 같은 방법으로 pT14SSIα-2b를 이용하여 pT14OSSIα-2b-4T와 pT14OSSIα-2b-4T22Q의 벡터를 제조한 후 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시켜 대장균 형질전환주 HM 10703과 HM 10711을 수득하였고, 이를 1999년 12월 29일자로 국제기탁기관인 한국 종균협회 부설 한국 미생물 보존 센타(KCCM, 대한민국 서울시 서대문구 신촌동 134 소재)에 기탁번호 제 KCCM-10177 호 및 제 KCCM-10178 호로 기탁하였다.
(iii) [Thr4, Val20, Gln22] STII를 포함하는 벡터의 제작
4번 아미노산이 Thr로, 22번 아미노산이 Gln으로 치환된 엔테로톡신 분비서열 펩타이드의 20번째 아미노산을 Val으로 더 치환하기 위하여, 상기 (ii)에서 제조된 플라스미드 pT14OSSIα-2a-4T22Q 및 pT14OSSIα-2b-4T22Q를 각각 주형으로하고 서열 번호: 29 및 30의 올리고누클레오타이드를 이용하여 (b)에서와 같은 특정부위 치환법에 의해 변형된 플라스미드 pT14OSSIα-2a-4T20V22Q와 pT14OSSIα-2b-4T20V22Q를 제조하였다.
상기와 같이 수득한 변형체 플라스미드를 대장균에 형질전환시킨 후 DNA를 회수하고, 염기서열을 결정하여 엔테로톡신 분비서열 중 4번째, 20번째 및 22번째 아미노산이 각각 아스파라진, 아스파라진, 타이로신에서 트레오닌, 발린 및 글루타민으로 치환된 염기서열을 가진 인터페론 알파 발현 플라스미드 pT14OSSIα-2a-4T20V22Q 및 pT14OSSIα-2b-4T20V22Q를 수득하였고, 이 플라스미드들로 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시켜 대장균 형질전환주 HM 10612 및 HM 10712를 각각 수득하였다.
(d) 열안정성 엔테로톡신 II 라이보솜 결합 서열 변형체 제조
상기에서 제조된 발현벡터에 포함된 열안정성 엔테로톡신 II 라이보솜 결합 서열 중, 라이보솜 결합 부위와 대장균의 변형된 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열의 개시 코돈인 첫 번째 ATG 서열 사이의 염기 숫자를 줄이기 위하여 상기의 (b)에서와 같은 특정부위 치환법에 의해 변형된 플라스미드를 제조하였다.
즉, 라이보솜 결합 부위 GAGG로부터 개시 코돈인 첫 번째 ATG 서열까지의 염기 숫자를 5개로 줄이기 위해 상기 (c)(ii)에서 제조된 플라스미드 pT14OSSIα-2a-4T22Q를 주형으로 하고 서열 번호: 31 및 32의 올리고누클레오타이드를 이용하여 (b)에서와 같은 특정부위 치환법에 의해 변형된 플라스미드 pT14NSSIα-2a-4T22Q를 제조하였다. 또한 라이보솜 결합 부위 GAGG로부터 개시 코돈인 첫 번째 ATG 서열까지의 염기 숫자를 4개로 줄이기 위해 pT14NSSIα-2a-4T22Q를 주형으로 하고 서열 번호: 33 및 34의 올리고누클레오타이드를 이용하여 (b)에서와 같은 특정부위 치환법에 의해 변형된 플라스미드 pT14MSSIα-2a-4T22Q를 제조하였다.
상기와 같이 수득한 변형체 플라스미드를 대장균에 형질전환시킨 후 DNA를 회수하고, 염기서열을 결정하여 라이보솜 결합 부위 GAGG로부터 개시 코돈인 첫 번째 ATG 서열 까지의 염기 숫자가 5개와 4개로 각각 감소된 염기서열을 가진 인터페론 알파 발현 플라스미드 pT14NSSIα-2a-4T22Q 및 pT14MSSIα-2a-4T22Q를 수득하였고, 이 플라스미드로 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시켜 대장균 형질전환주 HM 10613 및 HM 10614를 수득하였다.
실시예 3: 인터페론 알파-2의 발현량 비교
상기 실시예 2에서 수득한 대장균 형질전환체들을 각각 LB 배지에서 배양한 후 적절한 유도제(예: IPTG)를 가하여 3시간 동안 항온처리하거나, 또는 유도제를 가하지 않고 15시간 이상 충분히 배양하였다. 배양액을 원심분리 또는 여과한 후, 세포덩어리를 삼투압 쇼크법(Nossal, G. N.,J. Biol. Chem.,241, 3055(1966))에 의해 다음과 같이 처리하였다. 즉, 배양액을 6000 rpm에서 20분간 원심분리함으로써 균체를 침전구획분에 회수하고, 원래 배양액량의 10분의 1량의 등장액(20 % 슈크로스, 1 mM EDTA를 함유한 10mM 트리스-염산 완충액(pH 7.0))에 현탁하였다. 이 현탁액을 30분간 방치한 후, 원심분리해서 균체를 회수하였다. 다음에, 회수된 균체를 4℃의 냉수에 현탁함으로써 균체의 페리플라즘 속에 존재하는 단백질을 추출하였다. 현탁액을 원심분리해서 균체 성분을 제거하고, 상청을 페리플라즘 구획분으로서 회수하였다. 페리플라즘 구획분에 회수된 인터페론 알파-2의 농도를 인터페론 알파-2에 대한 항체(알앤드디사)를 사용한 통상의 효소면역측정법에 따라 측정하고, 그 측정치로부터 배양배지 1 L 당의 인터페론 알파-2의 분비량을 환산하여 표 1에 나타내었다.
인터페론 알파-2의 발현량 비교
발현숙주 실시예 발현벡터 STII 내의 아미노산 변형잔기 페리플라즘내IFNα-2 생산량 *
HM 10600 2(a) pT14SIα-2a 82 ±40
HM 10601 2(a) pT14SSIα-2a 325 ±75
HM 10701 2(b) pT14SSIα-2b 288 ±90
HM 10602 2(c) pT14SSIα-2a-4T Thr4 550 ±120
HM 10603 2(c) pT14OSSIα-2a-4T Thr4 1,020 ±135
HM 10604 2(c) pT14SSIα-2a-4T22Q Thr4, Gln22 680 ±105
HM 10611 2(c) pT14OSSIα-2a-4T22Q Thr4, Gln22 1,220 ±120
HM 10612 2(c) pT14OSSIα-2a-4T20V22Q Thr4, Val20, Gln22 1,130 ±180
HM 10613 2(d) pT14NSSIα-2a-4T22Q Thr4, Gln22 750 ±144
HM 10614 2(d) pT14MSSIα-2a-4T22Q Thr4, Gln22 420 ±100
HM 10702 2(c) pT14SSIα-2b-4T Thr4 370 ±90
HM 10703 2(c) pT14OSSIα-2b-4T Thr4 735 ±117
HM 10711 2(c) pT14OSSIα-2b-4T22Q Thr4, Gln22 1,070 ±150
HM 10712 2(c) pT14OSSIα-2b-4T20V22Q Thr4, Val20, Gln22 820 ±160
* IFN α mg / 100 O.D600 nm/ L 배양액
실시예 4: 후처리 및 정제
실시예 3에서와 같은 방법으로 본 발명의 대장균 형질전환체들 중 대장균 형질전환주 HM 10611을 배양한 후 배양액을 6,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 세포를 수확하고 삼투압 쇼크법에 의해 페리플라즘 분획을 수확하였다.
이 후 차례로 컬럼을 이용하여 정제를 실시하였다. 이때는 이온교환수지, 흡착 및 겔 여과 컬럼 또는 항체 컬럼이 적절하다. 먼저 수확된 페리플라즘 분획을 pH 5.0 ∼ 5.5로 조정한 후 pH 5.3으로 미리 평형화된 S-세파로즈(S-Separose; 파마시아사) 컬럼에 결합시키고 25 mM NaCl 용액으로 충분히 세척하였다. 그 후 50 mM, 100 mM, 200 mM 및 1 M NaCl 용액이 포함된 아세트산 완충용액으로 활성을가진 분획을 수확하였다. 이 분획을 블루 세파로즈(Blue Separose; 파마시아사) 컬럼을 통과시켜 2M 이상의 NaCl처리로 활성 분획을 얻은 후, 투석후 최종적으로 pH 5.8에서 DEAE 음이온 교환수지 컬럼을 이용하여 염 분획을 실시한 후 99% 이상의 순도를 가진 인터페론 알파-2a를 정제하였다. 또한, 대장균 형질전환주 HM 10711을 이용하여 동일한 실험을 반복하여 인터페론 알파-2b를 정제하였다. 정제된 인터페론 알파-2의 농도 및 순도는 나트륨 도데실 설페이트/아크릴아마이드 겔 또는 HPLC를 사용하여 분석함으로써 검사하고 농도는 실시예 3에서와 같은 통상의 효소면역 측정법을 이용하여 분석하였다. 또한 아미노 말단 서열 25개를 분석한 결과 첨가된 메티오닌 없이 정상적인 인터페론 알파-2a 및 2b의 서열로 확인되었다.
실시예 5: 재조합 균주로부터 생성된 인터페론 알파-2a의 분자량 비교
SDS-PAGE 및 웨스턴 블라팅을 이용하여 재조합 균주로부터 인터페론 알파-2의 발현여부와 분자량을 확인하였다.
우선, 실시예 4에서 얻은 대장균 형질전환주 HM 10611의 페리플라즘 분획 및 정제된 인터페론 알파-2a 및 2b를 인터페론 알파-2a 상용대조품(3 X 106IU/㎖)을 대조군으로하여 통상의 방법에 따라 SDS-PAGE로 분석하였다. 이 결과는 도 5a에 나타나 있고, 여기에서 레인 1은 인터페론 알파-2a 대조군이고, 레인 2는 대장균 형질전환주 HM 10611의 페리플라즘 분획의 1차 정제 분획이며, 레인 3은 정제된 인터페론 알파-2a이다. 이로부터 정제된 인터페론 알파-2a가 천연형 인터페론 알파-2a와 동일한 분자량을 갖고, 대장균 형질전환주 HM 10611의 페리플라즘 분획에 대량으로 포함되어 있음을 확인하였다.
또한, 형질전환주 HM 10711의 발효후 페리플라즘 분획, 1차 S-세파로스 컬럼 크로마토그래피로 정제된 분획 및 최종 정제된 인터페론 알파 2b를 사용하여 통상의 방법으로 SDS-PAGE를 수행하였다. 나이트로셀룰로스 막(바이오래드사, 미국)을 블라팅용 완충액(170 mM 글리신(glicine), 25 mM Tris·HCl(pH 8), 20 % 메탄올)에 충분히 적셔준 후 상기에서 SDS-PAGE된 겔을 이용하여 블라팅 키트로 3시간 가량 블라팅을 수행하였다. 그 후 나이트로셀룰로스 막을 1 % 카제인 용액에 1시간동안 방치하고 0.05% 트윈 20을 포함하는 PBST 용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 토끼 항-인터페론 알파 항체(Chemicon사, # AB1434, 미국)를 PBS로 희석하여 가한 후 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완결된 후 PBST 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 항체를 제거하였다. 여기에 HRP(horseradish peroxidase)-콘쥬게이트된 염소 항-토끼 IgG(바이오래드사, 미국) 용액을 PBS에 희석하여 가한 후 상온에서 2시간 동안 더 반응시켰다. 그 후 PBST로 세척하고 퍼옥시다아제 기질 키트(바이오래드사, 미국) 용액을 가하여 발색시켰다. 그 결과는 도 5b에 나타나 있으며, 본 실시예의 결과로부터, 본 발명의 재조합 대장균 균주로부터 인터페론 알파가 가용화 형태로 페리플라즘에서 대량으로 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 방법에 따라 인터페론 알파-2a 및 2b의 유전자를 대장균의 변형된열안정성 엔테로톡신 II 분비서열 유전자에 연결하여 발현시키면 아미노 말단에 추가의 메티오닌이 첨가되지 않고 가용화 형태로 천연형과 동일한 아미노산 서열을 갖는 인터페론 알파-2a 및 2b를 페리플라즘으로 분비시켜 대량으로 생산할 수 있다.

Claims (18)

  1. 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 대장균의 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열의 4, 20 및 22번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변형된 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열을 코드하는 유전자 및 그의 3'-말단에 연결된 인간 인터페론 알파 유전자를 포함하는 인간 인터페론 알파의 분비생산용 발현벡터.
  2. 제 1 항에 있어서,
    변형된 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열이 하기 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 발현벡터:
    서열번호: 3의 아미노산 서열 중 4번 아스파라긴이 트레오닌으로 치환된 것,
    서열번호: 3의 아미노산 서열 중 4번 아스파라긴 및 22번 타이로신이 각각 트레오닌 및 글루타민으로 치환된 것,
    서열번호: 3의 아미노산 서열 중 4번 및 20번 아스파라긴이 각각 트레오닌 및 발린으로 치환된 것,
    서열번호: 3의 아미노산 서열 중 4번 아스파라긴, 20번 아스파라긴 및 22번 타이로신이 각각 트레오닌, 발린 및 글루타민으로 치환된 것.
  3. 제 1 항에 있어서,
    인간 인터페론 알파의 유전자가 서열번호: 1의 인터페론 알파-2a 또는 서열번호: 2의 인터페론 알파-2b를 코드하는 것인 발현벡터.
  4. 제 1 항에 있어서,
    변형된 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열을 코드하는 유전자의 5'-말단 앞에 대장균의 열안정성 엔테로톡신 II의 라이보솜 결합 서열(서열번호: 8) 또는 그의 변형체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  5. 제 4 항에 있어서,
    대장균의 열안정성 엔테로톡신 II의 라이보솜 결합 서열의 변형체가 서열번호: 8의 서열에서 5'-말단의 GAGG 이후에 1개 또는 2개의 뉴클레오티드가 결실된 것인 발현벡터.
  6. 제 4 항에 있어서,
    대장균의 열안정성 엔테로톡신 II의 라이보솜 결합 서열의 변형체가 서열번호: 9의 서열을 갖는 것인 발현벡터.
  7. 제 1 항에 있어서,
    플라스미드 pT14SSIα-2a-4T, pT14OSSIα-2a-4T, pT14SSIα-2a-4T22Q, pT14OSSIα-2a-4T22Q, pT14OSSIα-2a-4T20V22Q, pT14NSSIα-2a-4T22Q, pT14MSSIα-2a-4T22Q,pT14SSIα-2b-4T, pT14OSSIα-2b-4T, pT14OSSIα-2b-4T22Q 또는 pT14OSSIα-2a-4T20V22Q인 발현 벡터.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 발현벡터로 형질전환된 미생물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    대장균임을 특징으로 하는 미생물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    대장균 BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T(HM 10602), 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T(HM 10603; 기탁번호: KCCM-10175), 대장균 BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T22Q(HM 10604), 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T22Q(HM 10611; 기탁번호: KCCM-10176), 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T20V22Q(HM 10612), 대장균 BL21(DE3)/pT14NSSIα-2a-4T22Q(HM 10613), 대장균 BL21(DE3)/pT14MSSIα-2a-4T22Q(HM 10614), 대장균 BL21(DE3)/pT14SSIα-2b-4T(HM 10702), 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T(HM 10703; 기탁번호: KCCM-10177), 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T22Q(HM 10711; 기탁번호: KCCM-10178), 또는 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T20V22Q(HM 10712)인 미생물.
  11. 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 대장균의 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열의4, 20 및 22번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변형된 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열을 코드하는 유전자 및 그의 3'-말단에 연결된 인간 인터페론 알파 유전자를 포함하는 인간 인터페론 알파의 분비생산용 발현벡터로 미생물을 형질전환시키고, 형질전환된 미생물을 적절한 조건하에서 배양함으로써 아미노 말단에 메티오닌이 첨가되지 않은 인터페론 알파를 분비 생산하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    변형된 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열이 하기 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법:
    서열번호: 3의 아미노산 서열 중 4번 아스파라긴이 트레오닌으로 치환된 것,
    서열번호: 3의 아미노산 서열 중 4번 아스파라긴 및 22번 타이로신이 각각 트레오닌 및 글루타민으로 치환된 것,
    서열번호: 3의 아미노산 서열 중 4번 및 20번 아스파라긴이 각각 트레오닌 및 발린으로 치환된 것,
    서열번호: 3의 아미노산 서열 중 4번 아스파라긴, 20번 아스파라긴 및 22번 타이로신이 각각 트레오닌, 발린 및 글루타민으로 치환된 것.
  13. 제 11 항에 있어서,
    인간 인터페론 알파의 유전자가 서열번호: 1의 인터페론 알파-2a 또는 서열번호: 2의 인터페론 알파-2b를 코드하는 것인 방법.
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 발현벡터가 변형된 열안정성 엔테로톡신 II 분비서열을 코드하는 유전자의 5'-말단 앞에 대장균의 열안정성 엔테로톡신 II의 라이보솜 결합 서열(서열번호: 8) 또는 그의 변형체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    대장균의 열안정성 엔테로톡신 II의 라이보솜 결합 서열의 변형체가 서열번호: 8의 서열에서 5'-말단의 GAGG 이후에 1개 또는 2개의 뉴클레오티드가 결실된 것인 발현벡터.
  16. 제 14 항에 있어서,
    대장균의 열안정성 엔테로톡신 II의 라이보솜 결합 서열의 변형체가 서열번호: 9의 서열을 갖는 것인 발현벡터.
  17. 제 11 항에 있어서,
    상기 발현벡터가 플라스미드 pT14SSIα-2a-4T, pT14OSSIα-2a-4T, pT14SSIα-2a-4T22Q, pT14OSSIα-2a-4T22Q, pT14OSSIα-2a-4T20V22Q, pT14NSSIα-2a-4T22Q, pT14MSSIα-2a-4T22Q, pT14SSIα-2b-4T, pT14OSSIα-2b-4T, pT14OSSIα-2b-4T22Q또는 pT14OSSIα-2a-4T20V22Q인 방법.
  18. 제 11 항에 있어서,
    상기 형질전환된 미생물이 대장균 BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T(HM 10602), 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T(HM 10603; 기탁번호: KCCM-10175), 대장균 BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T22Q(HM 10604), 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T22Q(HM 10611; 기탁번호: KCCM-10176), 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T20V22Q(HM 10612), 대장균 BL21(DE3)/pT14NSSIα-2a-4T22Q(HM 10613), 대장균 BL21(DE3)/pT14MSSIα-2a-4T22Q(HM 10614), 대장균 BL21(DE3)/pT14SSIα-2b-4T(HM 10702), 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T(HM 10703; 기탁번호: KCCM-10177), 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T22Q(HM 10711; 기탁번호: KCCM-10178), 또는 대장균 BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T20V22Q(HM 10712)인 방법.
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