JP2021502406A - 生体分子のコンジュゲートおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
R1−R2−R3−R4−S−cys−R5
を有する生体分子のコンジュゲートを提供し、式中、
R5は、1つまたは複数のシステイン残基が変異により導入された生体分子を表し;
cysは、R5に含まれるシステイン残基(複数可)を表し;
Sは、前記システイン残基(複数可)の硫黄原子(複数可)を表し;
R1は、R5がその抗原、リガンド、または受容体に結合するのを防止する基であり;
R2は、不在であるか、またはR2は、1つもしくは複数のタンパク質分解酵素により活性化することのできる切断可能なリンカーアーム、もしくは病態の微小環境において酸性で活性化することのできる化学結合であり;
R3は、不在であるか、またはR3は、R2が切断された後に自動的に脱落することのできるリンカーアーム、もしくは病態の微小環境において酸性で活性化することのできる化学結合であり;但し、R2が不在であるとき、R3は、病態の微小環境において酸性で活性化することのできる前記化学結合であり;
R4は、R5に含まれる前記システイン残基(複数可)の硫黄原子(複数可)を介して共有結合によりR5に連結された基であり、部分R1−R2−R3が切断された後にR5の抗原、リガンド、または受容体への結合能を回復、維持、または促進する基である。
R4−S−cys−R5
化合物を提供し、式中、
上式で、R3は、R4のR4−cを介してR4に連結し、R4−aの各式に示された波線は、R4−aがR4−bに連結する位置を標示する。
本開示の範囲内で、上記に述べられた技術的特徴のそれぞれ、および以降に本明細書に述べられる技術的特徴のそれぞれ、例えば実施例などは、互いに組み合わされて好適な技術的解決策を構成することができることを理解するべきである。さらに、本開示は、記載される具体的な実施形態に限定されず、それゆえにもちろん変わることがある。また、別段に規定のない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有することを理解されたい。本明細書に記載されるものに同様または等しい任意の方法および材料も、本発明の実践または試験に使用することができるとはいえ、好適な方法および材料がこれより記載される。本明細書に述べられた全ての刊行物は、その刊行物が関連して引用される方法および/または材料を開示および記載するために、本明細書に参照により組み込まれる。
Raは、C1−12アルキル、C1−12アルコキシ、C1−12アルキルカルボニル、任意選択的に1つまたは2つのハロゲンによって置換されたフェノキシまたはフェニルアミノ、C1−12アルキルアミノ、C1−12アルコキシ−C1−12アルキルアミノ、C1−12アルキルカルボニルオキシ、C1−12アルキル−C3−8シクロアルキルカルボニルオキシ、(C1−4アルキル−O)p−C1−12アルキルカルボニルオキシ、C1−12アルキルカルボニルアミノ−(C1−4アルキル−O)p−C1−12アルキルカルボニルオキシ、C1−12アルキルカルボニルアミノ、およびフェニル−C1−12アルキルカルボニルアミノからなる群から選択され;
pは、1から10の範囲の整数、例えば1から5の範囲の整数などであり;
R3は、R4のRaを介してR4に、およびR4のマレイミド基を介してR5のチオール基に連結され、
R2がアミノ酸配列Ala−Ala−Asnを有し、R3がPABC(R3−5)である際の、合成スキームを下記に示す。
抗PD−1抗体1のアミノ酸配列は、WO200815712A1に開示されており、そのDNA配列を、宿主における発現用に最適化して合成した(ジーンウィズ社、蘇州、中国)。抗PD−1抗体2のアミノ酸配列は、WO2006121168A2に開示されており、そのDNA配列を、宿主における発現用に最適化して合成した(ジーンウィズ社、蘇州、中国)。抗CTLA−4抗体のアミノ酸配列は、米国特許出願公開第20150283234号に開示されており、そのDNA配列を最適化して合成した(ジーンウィズ社、蘇州、中国)。抗TNFα抗体のアミノ酸配列は、米国特許出願公開第009534046号に開示されており、そのDNA配列を、宿主における発現用に最適化して合成した(ジーンウィズ社、蘇州、中国)。抗CD28抗体のアミノ酸配列は、米国特許出願公開第007939638号に開示されており、そのDNA配列を、宿主における発現用に最適化して合成した(ジーンウィズ社、蘇州、中国)。合成されたDNAを消化し、改変型pTT5ベクター(バイオベクター)に連結して、pTT5−anti−PD−1−1、pTT5−anti−PD−1−2、pTT5−anti−CTLA−4、pTT5−anti−TNFα、およびpTT5−anti−CD28を作製した。pTT5−anti−PD−1−1,pTT5−anti−CTLA−4,pTT5−anti−TNFα、およびpTT5−anti−CD28を鋳型として使用し、コドンを変異位置でシステインのものに置き換えるようにプライマーを設計し、変異された断片を改変型pTT5ベクター内へとPCRおよび消化および構築することによって、システイン変異を導入した。
表7〜16に示されるように、軽鎖または重鎖のCDRに変異を有する抗体を、コンジュゲーション用の小分子のライブラリー中のR4にコンジュゲートし、それらの結合活性を、野生型抗体と比較して(抗体とのコンジュゲートの結合活性/野生型抗体の結合活性*100%)、分子間力を付与し結合活性を増強するものとなるコンジュゲーションの方式を得た。
抗体は、2本の同一の軽鎖(LC)と2本の同一の重鎖(HC)とを含む4本のペプチド鎖からなる。これらの鎖は、ジスルフィド結合(複数可)および非共有結合によって単量体を形成する。2タイプの軽鎖、すなわちκおよびλと、5タイプの重鎖、すなわちμ、δ、γ、ε、およびαがある。抗体は、全体としては、定常領域と可変領域とに分けられる。可変領域は、Y形状構造の2本のアームの末端に位置する。ヒト化抗体またはヒト抗体は、ある特定の一般性を有するが、すなわち、それらは全て、Y形状構造の2本のアームの末端において重鎖または軽鎖に4つのループを含有する(図3)。3つのループは、可変性が高く、抗原との結合性に直接的に予期する。これらのループ内にある領域はCDRと称され、CDR1、CDR2、およびCDR3はそれぞれ、これらの3つのループに存在する。他のループも同じ側に存在し、そこでは、抗体は、四次元空間から抗原に結合する。いくつかのループは、保存された構造を有するだけでなく、保存された配列も有する。
病態の微小環境でタンパク質分解酵素により活性化される間、活性化されたリンカーアームが生体分子に結合する部位およびその立体配座は、活性化効率に異なる効果をもたらす。立体障害および構造−活性相関は、活性化による切断の効果を決定する。酵素または病態環境中の酸による活性化に及ぼされる、病態環境における実施例3のコンジュゲートの生体分子の立体配座の効果を検討するために、以下のin vitro活性化の検討を実施した。
PBS(pH7.2)を用いて、リガンド分子PD1、TNFα、CTLA−4、CD28を1ug/mLにそれぞれ希釈した。次いで、各希釈溶液を用いて、96ウェルプレート(ヌンク)に一晩固定した。1×ブロッキングBSA(サーモフィッシャー)を用いて、プレートを2時間ブロッキングした。抗PD−1抗体、抗TNFα抗体、抗CTLA−4抗体、および抗CD28抗体の対応のコンジュゲートをそれぞれ等濃度で添加して、37℃で1時間結合させた。プレートをPBSTで3回洗浄した。HRP酵素−コンジュゲートヒト抗体を二次抗体として37℃で1時間反応させて、次いで、PBSTで3回洗浄した。HRP酵素により認識されるTMB基質(Solarbio社)を用いて、暗所中、37℃で15分間反応した。1/2体積の停止溶液を使用して、反応を停止させた。吸光強度(OD450)を読み取った。相対結合効率を、活性化前後のコンジュゲートの結合効率と野生型抗体の結合効率とのパーセンテージ比により計算した。結果を表24〜表26に示した。
1.抗PD−1抗体はT細胞がIFN−γを分泌することを促進した
ヒト全血(上海瑞金病院)を希釈し、等量のPBSに均一に混合した。希釈溶液を、リンパ球分離溶液含む別の遠沈管へ、遠沈管の壁伝いにゆっくりと移して、希釈溶液がリンパ球分離溶液の上に分離層を形成するようにした。界面を明瞭に保った。管を2000rpmで20分間遠心分離した。遠心分離後、遠沈管を取り出した。管内の溶液は層を形成していた。単核細胞層を50mL遠沈管に抜き取った。5倍容量のPBSを添加して均一に混合し、混合物を2000rpmで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿をPBSに再懸濁した。次いで、結果として得られた混合物を、1500rpmで10分間遠心分離し、結果として得られたヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、5%加熱非働化ヒト血清を含有するRPMI1640完全培地に再懸濁した。ヒトPBMCを96ウェルプレートにウェル当たり1〜2×105細胞個の濃度で播種した。細胞を0.1ug/mL SEBにより3日間刺激した。非接着細胞(主に単核細胞)を採集して、新しい96ウェルプレートに均一に播種した。変異のない各種濃度の抗PD−1抗体またはPD−1−Ab−Cys28−S−S13コンジュゲートを添加し、37℃、5%CO2で4日間培養した。上清を採集し、細胞毒性因子IFN−γの濃度をELISAキットによって検出した。結果は、図11に示されるように、活性化された抗PD−1抗体が、IFN−γを分泌する活性を僅差でまたは顕著にさえ向上して呈することを示していた。
当技術分野に周知されているように、抗PD−1抗体は腫瘍の治療に有効な薬剤であるにも関わらず、現在の臨床研究で、抗PD−1抗体が2つの主要な課題を呈することが見出された。一方の課題は、患者が抗体の投与後に高熱と偽増悪という副作用を呈するものとなることであるが、その機構は不明である。我々は、非疾患環境での曝露時間または活性薬剤の用量を低減するように、抗体をコンジュゲートによって阻害または遮断し、局所環境に達した後に放出すれば、これらの副作用が改善される可能性があるものと推定した。この理由から、I型糖尿病に罹患した(NOD)マウスを用いて実験を実施した。この種類のマウスの糖尿病は自己免疫疾患であり、その場合、自己活性化されたTリンパ球細胞が膵島β細胞を破壊し、その結果、インスリンの分泌が不十分となる。まず、10週齢の雌NOD(北京維通利華実験動物技術有限公司)に、対照IgG、低容量(1mpk)、培地(5mpk)、または高用量(15mpk)の抗体または抗体のコンジュゲートをそれぞれ、0日目に注射した。尿中グルコースおよび2つの血糖レベルを含む糖尿病の指標を、尿グルコースの新しい指標が観察されなくなるまで、12日間にわたって毎日観察した。
CD8+T細胞およびCD4+T細胞を、ヒト末梢血単核細胞から、CD8またはCD4の磁気ビーズ(Dynabeads)を用いて、キットの仕様書に示された特定のステップに従って単離し、計数し、CFSE仕様書に従って染色した。細胞を96ウェルプレートにウェル当たり1〜2×105細胞個の濃度で播種した。適切な量の対照抗CD3/抗CD28抗体、0.3ug/mlの抗CD28抗体または抗CD28抗体のコンジュゲートをそれぞれ添加した。
ヒトPD−1融合タンパク質を形質転換されたトランスジェニックC57BL/6マウス(上海南方模式生物研究中心)に、MC38細胞をマウス当たり濃度2×106細胞で皮下接種した。1週間後、MC38腫瘍を移植されたマウスを無作為に4群に分けた。週2回、2週間にわたって、第1群には10mg/kg抗PD−1抗体キイトルーダを注射し、第2群には2mg/kg抗PD−1抗体キイトルーダを注射し、第3群には1mg/kgPD−1−Ab−G28C−S13コンジュゲートを注射し、第4群には溶媒対照を注射した。マウス内の腫瘍を週3回記録した。結果を図15に示した。
IL2のアミノ酸配列は、天然のヒトIL2タンパク質である。そのDNA配列を、宿主における発現用に最適化して合成した(ジーンウィズ社、蘇州、中国)。合成されたDNAを消化して改変型pTT5ベクター(バイオベクター)にライゲーションし、pTT5−IL2を作製した。pTT5−IL2を鋳型として使用し、変異位置でコドンをシステインのものに置き換えるようにプライマーを設計し、変異された断片を改変型pTT5ベクター内へとPCR、消化、および構築することによって、変異型ベクターを構築した。IL2遺伝子の合成、変異、およびトランスフェクションを、実施例2に記載された方法にしたがって実施した。リガンドIL2RaまたはIL2Rbとのその結合活性を、変異位置にしたがってIPおよびELISAにより解析した。
CD8+T細胞とCD4+T細胞とを、キットの仕様書に示された具体的なステップに従って、ヒト末梢血単核細胞からCD8またはCD4の磁気ビーズ(Dynabeads)により単離し、計数し、CFSEの仕様書にしたがって染色した。細胞を96ウェルプレートにウェル当たり1〜2×105細胞個の濃度で播種した。適切な量の対照抗CD3抗体、0.05ug/mlのIL2タンパク質またはS16にコンジュゲートされたコンジュゲートIL2−T41C−S16コンジュゲートをそれぞれ添加した。図16は、S16とのIL2−T41C(IL2−Thr41Cys)のコンジュゲーションを示す。図17は、コンジュゲーション前後のIL2受容体アルファとの結合を示す。図18は、活性化前後でIL2−C41−S16コンジュゲーションがT細胞の増殖に及ぼす効果を示す。.
マウス当たり0.5×106個のB16F10細胞を、C57BL/6マウスに皮下接種した。1週間後、腫瘍体積が100mm3に達した際に、メラノーマを移植したマウスを無作為に4群に分けて群当たりマウス6頭とした。第1群には、毎週、2.5mg/kgのIL2−T37C−S14タンパク質コンジュゲートを注射した。第2群には、毎週、0.5mg/kgのIL2−Thr37Cysタンパク質コンジュゲートを注射した。第3群には、週2回、3mg/kgのアルデスロイキン(対照)を注射した。第4群には、週2回、溶媒(対照)を注射した。全群に、3週間にわたって継続的に投与した。マウスの腫瘍を週2回測定し、マウスを週2回秤量した。
1.変異体IL2サイトカインの発現および精製
改変型pTT5ベクター(バイオベクター)にライゲーションされた変異体IL2のDNA配列は、293T細胞での発現のために最適化し合成(ジーンウィズ社、蘇州、中国)したものである。変異体IL2のDNAのトランスフェクションを実施した。4〜7日間のインキュベーションの後、変異体IL2を含有する上清を採集した。
APASSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(配列番号11)。
PTSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(配列番号12)。
様々なIL2変異体を、293T細胞によって発現し、培地.に分泌させた。IL2変異体を含有する上清を、第1節に記載されたように遠心分離を介して取得した。次いで、1ugのHisタグ付IL2RαまたはIL2Rβを、上述の1mLの上清に添加し、穏やかに振盪しながら4℃で1時間インキュベートした。50uLの予洗浄済みNi−NTAレジンを、上清とIL2RαまたはIL2Rβとの混合溶液に移し、穏やかに振盪しながら4℃で1時間インキュベートした。混合物を、遠心分離に供し、上清を廃棄した。結果として得られたペレットを、25mMイミダゾールを含有する500uLのPBSで3回洗浄した。IL2変異体とIL2Rα/Rβとの量を、IL2抗体および抗Hisタグモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより可視化した。
変異体IL2タンパク質を、上記第1節に記載されたように生成して精製した。精製された変異体IL2を、5mM EDTAを含有する50mMリン酸緩衝液(pH7.4)中、濃度0.3mg/mLでインキュベートした。TCEP溶液を変異体IL2にモル比100:1で添加し、結果として得られた混合物を、穏やかに振盪しながら4℃で4時間インキュベートした。次いで、混合物を、150mM NaClを含有する50mMリン酸緩衝液(pH7.4)により、4℃で2時間透析した。その後、S47を直ちに混合物にモル比20:1で添加し、結果として得られた混合物を、穏やかに振盪しながら25℃で16時間インキュベートした。反応を停止し、残存するS47を除去した。酵素切断の前に、IL2−S47(IL2 TMEAkine、腫瘍の微小環境により活性化されるIL2サイトカイン)のコンジュゲートに使用された緩衝液を、酵素に使用された緩衝液に、透析を介して変換した。次いで、酵素をIL2 TMEAkine溶液に添加し、混合物を37℃で16時間インキュベートした。図22は、in vitroでの酵素切断後の変異体IL2、IL2 TMEAkine、および回復活性IL2についてのコロイダルブルー染色による、SDS−PAGEの結果を示す。
1ugのIL2Rα−Fc/IL2Rβ−Fc溶液を含有する60uLのPBS緩衝液を、ウェルに分注した。シールテープをプレートの上部に貼り、次いで、プレートを4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、テープを取り外して、各ウェルを吸引した。PBSTで3回洗浄した後、2%BSAを含有する200uLのPBS緩衝液を各ウェルに分注することによってプレートをブロッキングし、次いで、プレートを室温で2時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、60uLの系列希釈された試料を適切なウェルに添加した。プレートを室温で1.5時間インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、60uLの1ug/mL IL2ビオチン化抗体溶液を各ウェルに分注し、結果として得られた混合物を室温で1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、次いで、60uLのストレプトアビジン溶液を各ウェルに分注した。次いで、プレートを室温で30分間インキュベートした。3回洗浄した後、100ulのHRP基質溶液を各ウェルに分注し、プレートを37℃で15分間インキュベートした。発色を展開させた後、50uLの停止溶液を各ウェルに分注し、各ウェルの吸光度を直ちに波長450nmで測定した。ELISAの結果を図23に示すが、ここでは、in vitroでの酵素切断前後のIL2 TMEAkineのIL2RαまたはRβとの結合活性が示されている。野生型IL2とIL2RαおよびIL2Rβとの結合活性に比べて、IL2 TMEAkineは、IL2Rαにははるかに低い結合親和性で結合するが、IL2Rβにはほぼ同じ結合親和性で結合する。酵素による活性化後、IL2 TMEAkineのIL2Rαとの結合親和性は、野生型IL2のIL2Rαとのものに等しい。
IL2受容体は、細胞表面で会合して以下のヘテロマーを形成する:中位親和性の受容体:IL2に対するIL2Rβγ(Kd=1nM)および低親和性の受容体:IL2に対するIL2Rα(Kd=10nM)。低親和性の結合(Kd=10nM)ゆえに、結合親和性を回復するためのR4基に連結するのに用いる位置をスクリーニングするのは、抗体のCDR領域よりも容易である。我々は、R4−S−IL2とIL2Rαとの間の結合親和性を増加させようとは思わなかったため、天然の結合親和性を回復することのできる、特別なR4を有するコンジュゲートIL2を選択した。場合によっては、結合親和性を増強することのできるR4基がいくつかあるが、我々はそれらを薬剤候補として選択しなかった。我々は、R−1、R4−7、R4−5、R4−8、およびR4−12を、我々のCMC開発における大規模合成用に選んだ。S47はレグマインにより切断される。切断後、そのR4−7化学基は残される。薬剤候補を選択するために、我々はまた、スクリーニング発現と、IL2RαおよびIL2Rβを結合するドメイン内のIL2の全アミノ酸とのS47のコンジュゲーション反応を実施した。我々は、将来性のある薬剤候補を取得したので、結果を以下の表31〜表33に示す。
IL2−T41C−S47溶液とヒト血清とを比1:19(v/v)で混合し、混合物を37℃で0時間、8時間、24時間、および48時間、それぞれインキュベートした。次いで、IL2−T41C−S47の量をウェスタンブロットによって検出し、対応の結果を図24に示した。IL2−T41C−S47は、48時間後にヒト血清中で安定であり、このことは、in vitroでのヒト血清中で、IL2−T41C−S47がIL2よりもはるかに安定であった可能性があることを示している。IL2変異体の他のコンジュゲートのヒト血清中での安定性を表35に示した。
マウスは、単回のIL2−T41C−S47(0.8mg/kg)の静脈内注射を受け、サンプリング時間当たりマウスn=3頭となるものとした。およそ200uLの血液をK2EDTA被覆チューブに採集した。遠心分離後に血漿を分離し、分析まで−80℃で凍結した。次いで、定量ELISAを用いてIL2−T41C−S47濃度を測定した。結果を図25に示した。in vivoでの薬物動態試験は、IL2 TMEAkineがIL2に比べて半減期が長く血漿中曝露が高いことを示していた。
C57BL/6マウスは、5日間にわたってPBSもしくは25ugのIL2の腹腔内注射を毎日、または等モルのIL2−T41C−S47の腹腔内注射を5用量について5日毎に、それぞれ受けるものとした。マウスを屠殺し、肺を10%ホルマリン溶液により固定し、パラフィン包埋された切片をヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した。その結果を図26に示す。肺の測量(湿重量)ならびにヘマトキシリンおよびエオシンにより染色された切片は、IL2 TMEAkineが野生型IL2よりも低い毒性を肺に誘導することを示している。
試験目的:CT26腫瘍モデルの治療のためのBALB/CマウスにおけるIL2−T41C−S47およびIL2−T41C−S47の抗PD−1抗体との併用の抗腫瘍の有効性を検討する。
1.動物:5週齢のBALB/Cマウス、全て雌。
1)CT26細胞をアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)から購入し、ATCCにより提供された仕様書に従って識別した。細胞を、10%ウシ胎児血清を含有するRPMI1640培養溶液中、37℃、5%CO2で培養した。細胞を3日毎に継代し、9継代以内の細胞を使用した。
各群に6頭の動物を含む5つの群があった。含めたのは、0日目、5日目、および11日目に治療された対照群、ならびに3つの単剤群(抗PD−1抗体により2日目、4日目、7日目、9日目、13日目、および15日目に、またはIL2により0日目、5日目、11日目に、またはIL2−T41C−S47により0日目、5日目、および11日目に治療)、ならびにIL2−T41C−S47治療(0日目、5日目、および11日目に投与)が開始された後に抗PD−1抗体治療(2日目、4日目、7日目、9日目、13日目、および15日目に投与)を行った併用免疫療法群であった。
BALB/Cマウスに対し、CT26細胞を右側腹部に皮下移植した。移植後7日目に、腫瘍が200mm3と測定された際に、動物にIL2−T41C−S47(2mg/kg×1)を投与した。24時間、48時間、96時間、および192時間後、腫瘍、肺、および心臓を採取して(観察時間当たりn=2)、プロテアーゼ阻害剤および0.25%酢酸を含有する氷冷PBS中でホモジナイズし、遠心分離して上清を得た。IL2−T41C−S47レベルを定量するためにELISAを実施し、その際には、PEG抗体を捕捉抗体として使用し、IL2ビオチン化抗体を検出抗体として使用した。IL2−T41C−S47および活性IL2レベルを定量するためにELISAを実施し、その際には、IL2モノクローナル抗体を捕捉抗体として使用し、IL2ビオチン化抗体を検出抗体として使用した。結果を図29に示したが、ここでは、腫瘍における活性IL2の曝露が高いことが標示されており、このことは、肺および心臓において抗腫瘍効果の有効性が高く活性IL2の曝露が低いことに一致し、これは肺水腫の毒性が低いことに一致する。
R2−R3は、天然のペプチド配列リンカーに比べて高い活性化効率を示す、化学修飾リンカーである。R1が5kDaのPEGでありR4がR4−2および対照リンカー(表に示されるC1−C4)である各種R2−R3リンカーの活性化を、活性化アッセイで評価した。R1−R2−R3−R4コンジュゲートを溶解し、10回希釈して終濃度0.1mM/mLとした。37℃で、試験化合物を100μgの酸性化ヒト乳房がん(MDA−MB435)腫瘍組織ホモジネート(pH6.0)に濃度1mg/mLで添加した。腫瘍組織ホモジネート中の酵素は、R1を放出することができた。放出されたR1をHPLCにより検出し、それによって、リンカーの活性化効率を比較した。結果を表37〜表39に示した。
R1を5kDaのPEGとし、かつR4をR4−2とした6つのR1−R2−R3−R4コンジュゲートを、各種ヒト腫瘍組織で検出した。R1−R2−R3−R4コンジュゲートをそれぞれ溶解し、10回希釈して終濃度0.1mM/mLとした。37℃で、試験化合物を100μgの各種酸性化ヒト腫瘍組織ホモジネート(pH6.0)に濃度1mg/mLで添加した。腫瘍組織ホモジネート中の酵素は、R1を放出することができた。放出されたR1をHPLCにより検出し、それによって、リンカーの活性化効率を比較した。結果を表40に示した。
R4−1は、例示されたR4基のうち最も短い化学基である。各種生体分子を、R1−R2−R3−R4にコンジュゲートし、ここでは、R1を5kDaのPEGとし、R2−R3を以下の表に示されるものとし、R4をR4−1とした。コンジュゲートを溶解し、10回希釈して終濃度0.1mM/mLとした。37℃で、コンジュゲートをそれぞれ、100μgの各種酸性化ヒト腫瘍組織ホモジネート(pH6.0)に濃度1mg/mLで添加するか、またはレグマイン溶液(0.1ug/ml)もしくはグランザイムB溶液(0.1ug/ml)に添加した。腫瘍組織ホモジネート中の酵素は、R1を放出することができた。放出されたR1をHPLCにより検出し、それによって、リンカーの活性化効率を比較した。結果を表41に示した。
化学修飾リンカーR2−R3の安定性を、ヒト血清中で試験した。R1を5kDaのPEG(PEG500)とし、R2−R3を以下の表に示されたものとし、R4をR4−1とした、R1−R2−R3−R4コンジュゲートを調製した。このコンジュゲートを溶解し、10回希釈して終濃度0.1mM/mLとした。コンジュゲートを濃度1mg/mLで、100μgのヒト血清に、37℃で48時間、それぞれ添加した。無傷のコンジュゲートは、ELISAアッセイによって検出することができる。残存するコンジュゲートの濃度を比較することによって、安定性を計算することができた。結果を表42および表43に示した。
小規模のコンジュゲーションのために、各種バリアントについて5〜10mgのIgGを、限外濾過チューブ(メルクミリポア)により、2mM EDTAを含有する50mM Tris−HCl、pH7.5へと、遠心分離の繰り返しによって緩衝液交換した。次いで、抗体を、DTTによりモル比1:20〜1:200にて、室温で4〜16時間、穏やかに還元した。次いで、還元された抗体を、50mM Tris−HCl、150mM NaCl、pH7.5内に透析し、Cu2SO4orデヒドロアスコルビン酸(DHAA,Sigma)によりモル比1:50〜1:200にて、室温で1〜3時間、再酸化した。次いで、フリーのスルフヒドリルを有する再酸化された抗体を、S13化学リンカーにより比1:10、1:20、1:50、または1:100にて、室温で4時間、コンジュゲートした。コンジュゲーション効率を還元SDS−PAGEによって示した。表44に示されるように、異なるコンジュゲーション効率を得た。
我々は、CTLA−4抗体のフレームワーク領域(FR)内で各非システインアミノ酸をシステインに変異して、実験に用いるシステイン変異体を作出した。いくつかの変異部位は、ほぼ100%のコンジュゲーション効率を示した。各種変異体についてのコンジュゲーション効率は、CTLA4−抗体:S13=1:100の条件では高く、これを表46および表47にまとめた。いくつかの変異は、非常に低いコンジュゲーションを示し、このことは、Cysが抗体の内部に埋もれている可能性が有ることを示す。
我々は、R4−7または他のR4リンカーにコンジュゲートした後に活性を復活させることができた上記の部位を、腫瘍の微小環境で活性化される抗体(TMEAbody)のスクリーニングに用いる候補部位として選択したが、それはなぜなら、プロテアーゼ切断後、このコンジュゲート抗体が、抗体変異体−s−R4形態と同一の構造に留まるものとなるためである。S13(5kDの官能基)にコンジュゲートされた後の遮断効果を、まず、実施例1のようなELISAアッセイにより評価した。表51に示されるように、S13リンカーとのコンジュゲーション後、それらのいくつかは、抗原タンパク質に対する結合活性の顕著な遮断効果を示した。我々はまた、表51に示されるように、<30%活性を有するこれらの部位をクラスAとして、他の部位をBクラスとして分類した。
フレームワーク(非CDR)領域は、保存された配列であり、CDR領域に連結して異なる抗体を形成するのに用いられている。表51および表52に示されるように、いくつかのアミノ酸の側鎖が変わると結合が低減し(クラスB)、このことは、アミノ酸の側鎖が相互作用または空間をもたらして、CDRと共に抗原結合性の一助となりうることを示す。通常は、フレームワークと抗原との相互作用は、CDR領域と抗原とのものよりも弱い。PD−1抗体(ニボルマブ)の選択された変異位置に異なるR4をコンジュゲートすることによって、我々は、野生型抗体に比べて、より高い親和性を得るかまたは化学修飾抗体の親和性を維持する機会がある。
ヒト抗体は、2本の同一の軽鎖(LC)と2本の同一の重鎖(HC)とを含む4本のペプチド鎖からなる。これらの鎖は、ジスルフィド結合(複数可)および非共有結合によって単量体を形成する。2タイプの軽鎖、すなわちκおよびλと、5タイプの重鎖、すなわちμ、δ、γ、ε、およびαがある。抗体は、全体としては、定常領域と可変領域とに分けられる。可変領域は、Y形状構造の2本のアームの末端に位置する。ヒト化抗体またはヒト抗体は、ある特定の一般性を有するが、すなわち、それらは全て、Y形状構造の2本のアームの末端において重鎖または軽鎖に4つのループを含有する。3つのループは、可変性が高く、抗原との結合性に直接的に予期する。これらのループ内にある領域はCDRと称され、CDR1、CDR2、およびCDR3はそれぞれ、これらの3つのループに存在する。
CTLA−4は、腫瘍の微小環境のT細胞表面上にある。我々は、抗体のCDR領域内の各アミノ酸を変異させ、結合親和性を維持または増加するために異なるR4基によってスクリーニングした。場合によっては、結合親和性を増強することのできたR4基がいくつかあったが、我々はそれらを開発における薬剤候補として選択しなかった。我々は、R−1、R4−7、R4−5、R4−8、およびR4−12を、薬剤開発における大規模合成と安定性のために採択した。R4を含むコンジュゲート型CTLA−4抗体は、R4の化学修飾成熟のライブラリースクリーニングによりいくつかの位置で結合活性>60%を回復することができる。
構築されたCTLA−4 TMEAbodyの結合ELISA特性解析
薬剤開発において、我々は、さらに進んだ開発のために、遮断効率および復活した活性の良好な部位を収集した。S47とのコンジュゲーション後、ヒト抗体は、腫瘍の微小環境により活性化される抗体となり、TMEAbodyと称される。
次いで、CTLA−4タンパク質とのTMEAbodyの結合の減少によって、B7−1 CTLA−4相互作用に対するイピリムマブの遮断の有効性も減少するものとなることを証明するために、受容体遮断活性(RBA)アッセイを利用した。0.5μg/mLのヒトCTLA−4Fc融合タンパク質(R&Dシステムズ)をMaxisorp ELISAプレート(ヌンク)上に吸収させて、次いで、プレートを2%BSAによりブロッキングした。0.02μg/mLのビオチン化ヒトB7−1またはB7−2タンパク質と各種濃度のTMEAbodyまたはWTのイピリムマブとを、プレートを用いて完全にインキュベートし、次いで、標準ELISAの手順のようなストレプトアビジン−HRP(サーモフィッシャーサイエンティフィック)とのインキュベーションとそれに続くTMB反応とを用いて、受容体遮断活性を測定した。
TMEAbodyが腫瘍の微小環境で特異的に活性化されたが末梢リンパ器官では活性化されなかったか否かを見極めるために、メカニズム試験を実施した。イピリムマブ療法について提唱されているメカニズムの1つは、イピリムマブが抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)効果を介してTreg細胞の集団を下方制御し、それゆえに腫瘍に対する免疫応答を活性化することができるというものである。CD4マーカー、CD25マーカー、およびFoxp3マーカーをそれぞれ用いたフローサイトメトリーにより、Treg集団を解析した。図36に示されるように、イピリムマブTMEAbodyは、WTイピリムマブと同様の有効性で、腫瘍においてTreg集団を有意に下方制御した。しかしながら、脾臓または末梢血では、イピリムマブTMEAbodyは、Treg集団の調節を非常に低く示したかまたは全く示さなかった。これらの結果は、イピリムマブTMEAbodyが、特異的な活性を腫瘍の微小環境で示したが、末梢リンパ器官または末梢血では示さなかったことを実証していた。
血清中でのTMEAbodyの安定性を評価するために、1ugのCTLA−4 TEMAbody(S13のコンジュゲーションを有するIpi053)を20uLのマウス血清に入れ、37℃で2時間、4時間、24時間、48時間、および96時間、それぞれ保った。次いで、試料を抗ヒトFabHRP抗体(シグマ)によるウェスタンブロット用に調製した。ゲル強度をImageJソフトウェアにより分析し、相対強度をGraphPadにより解析した。以下の図37に示されるように、TMEAbodyは、マウス血清中において、37℃で96時間後に有意に分解することなく、高い安定性を示した。
TMEAbodyの薬物動態特性を調節する際の化学コンジュゲーションの潜在的な効果を評価するために、単回IV用量の1mg/kgのWTイピリムマブまたはイピリムマブTMEAbodyを、Balb/cマウスに注射した。0.5時間後、2時間後、4時間後、8時間後、1日後、2日後、5日後、10日後、15日後、20日後、総抗体および活性抗体の濃度の決定のELISA試験に用いるために血漿を収集した。総抗体濃度の決定には、抗ヒトFc抗体(インビトロジェン)をELISAプレート(ヌンク)上に被覆し、注射された抗体を抗ヒトFab HRP二次抗体(インビトロジェン)によって検出した。活性抗体濃度の決定では、ヒトCTLA−4タンパク質(シノバイオロジカル)をELISAプレート上に被覆した。次いで、活性抗体を抗ヒトFc HRP二次抗体(インビトロジェン)によって検出した。標準曲線をWTイピリムマブまたはイピリムマブTEMAbodyの系列希釈物によって描き、4パラメーターフィッティングを介して標準結合曲線を確立した。総抗体または活性抗体の濃度を、標準曲線へのY値の外挿を介して計算した。図38(a)に示されるように、TMEAbodyの半減期は、40kd官能基とのコンジュゲーション後に、WTイピリムマブ抗体またはイピリムマブプロボディ(マスキングペプチドとしてMY11を、切断部分として2011を用いたWO2018/085555A1)に比べて増加した。さらに、CTLA−4TMEAbodyは、図38(b)に示されるように、血漿中で時間と共にイピリムマブプロボディよりも少ない活性化を示した。
さらに動物モデルで腫瘍を治療する際のTMEAbodyのin vivo有効性の特徴を明らかにするために、イピリムマブTMEAbody、ならびにWTイピリムマブおよび対照ヒトIgGを、ヒトCTLA−4ノックインC57BL/6マウスのMC38結腸腺癌腫瘍モデルに投与した。ヒトCTLA−4ノックインC57BL/6マウスに、2E6MC38細胞を腹腔左下四分円部に皮下注射した。7日間の腫瘍成長後、動物を、類似の平均腫瘍体積を有する群に分けた。動物に、標示された単回用量の対照ヒトIgG、WTイピリムマブ、または等モルのTMEAbody(抗体の濃度、n=6)をそれぞれ投与し、各動物について腫瘍体積をモニタリングした。図39に示されるように、イピリムマブTMEAbodyが、WTイピリムマブと同等の有効性で腫瘍サイズを制御するのに対し、対照のヒトIgGは、何ら有効性を示せなかった。腫瘍体積阻害率を表61にまとめた。この結果は、イピリムマブTMEAbodyを腫瘍の微小環境内で活性化し、抗腫瘍免疫応答を惹起できたことを意味する。
TMEAbodyの免疫原性を評価するために、3つの群のBalb/cマウスs(各n=5)を、完全フロイントアジュバント(CFA)を含む50μgのイピリムマブTMEAbody、WTイピリムマブ、またはイピリムマブプロボディ(マスキングペプチドとしてMY11を、切断部分として2011を用いたWO2018/085555A1)により免疫した。一次免疫の14日後、動物を、不完全フロイントアジュバント(IFA)を含む25μgのイピリムマブTMEAbody、WTイピリムマブ、またはイピリムマブプロボディにより追加免疫した。追加免疫の7日後、血清を取得し、イピリムマブTMEAbody、WTイピリムマブ、またはイピリムマブプロボディに対する抗体力価について、それぞれ試験した。1%ヒト血清を血清希釈緩衝液中に使用して、ヒトIgGの定常領域に対するどの抗体も遮断するものとした。図40に示されるように、TMEAbodyが、WTイピリムマブと同等かまたはそれより低い抗体価で、極めて低い免疫応答を動物に引き起こした。しかしながら、イピリムマブプロボディは、免疫原性の劇的な増加を引き起こし、それは軽鎖のN末端に含まれる外来配列に起因する可能性があった。
抗PD−1と抗CTLA−4の抗体の併用がメラノーマの治療に有効(ORR)であるにも関わらず、現在の臨床研究で、併用が55%のグレード3〜4のTRAEを呈し、患者の30%がその療法を中断せねばならないことが見出されたことが、当技術分野に周知である。我々は、非疾患環境での曝露時間または活性薬剤の用量を低減するように、抗体をコンジュゲートによって阻害または遮断し、局所環境に達した後に放出すれば、これらのTRAEが改善される可能性があるものと推定した。この理由から、I型糖尿病に罹患した(NOD)マウスを用いて実験を実施した。この種類のマウスの糖尿病は自己免疫疾患であり、その場合、自己活性化されたTリンパ球細胞が膵島β細胞を破壊し、その結果、インスリンの分泌が不十分となる。まず、10週齢の雌NOD(北京維通利華実験動物技術有限公司)に、対照IgG、高用量(15mpk)の抗PD−1および抗CTLA−4の抗体、または15mpk用量の抗PD−1および抗CTLA−4のTMEAbody(S47−Ipi053)をそれぞれ、0日目に注射した。尿中グルコースおよび2つの血糖レベルを含む糖尿病の指標を、尿グルコースの新しい指標が観察されなくなるまで、12日間にわたって毎日観察した。
上記のイピリムマブTMEAbodyスクリーニングの実施例に示されたように、抗PD−1抗体(ペムブロリズマブ)の複数の部位を、部位特異的コンジュゲーションのためにシステインに変異させた。抗PD−1抗体(ペムブロリズマブ)の重鎖の変異位置は、(カバット付番則または他の抗体付番則を用いずにN末端からC末端まで連続的に付番して)Ser7、Gly8、Gly15、Ala16、Ser17、Ala24、Ser25、Gly26、Tyr27、Thr28、Thr30、Asn31、Tyr32、Tyr33、Tyr35、Ala40、Gly42、Gly44、Leu45、Gly49、Gly50、Ile51、Asn52、Ser54、Asn55、Gly56、Gly57、Thr58、Asn59、Lys63、Lys65、Thr69、Leu70、Thr71、Thr72、Asp73、Ser74、Ser75、Thr76、Thr77、Thr78、Ala79、Leu83、Ser85、Leu86、Thr91、Ala92、Arg99、Asp100、Tyr101、Arg102、Asp104、Gly106、Gly111、Gly113、Thr114、115Thr、117Thr、Ser119、Ser120、Ala121、Ser122、Thr123、Lys124、Gly125、およびSer127からなる群から選択され;軽鎖の変異位置は、Ile2、Thr5、Ser7、Ala9、Thr10、Leu11、Ser12、Leu13、Ser14、Gly16、Ala19、Thr20、Ala25、Ser26、Lys27、Gly28、Ser30、Thr31、Ser32、Gly33、Tyr34、Ser35、Tyr36、Leu37、Gly45、Ala47、Leu50、Leu51、Ile52、Tyr53、Leu54、Ala55、Ser56、Tyr57、Leu58、Ser60、Gly61、Ala64、Ser67、Gly68、Ser69、Gly70、Ser71、Gly72、Thr73、Ala76、Thr78、Ser80、Ser81、Ser95、Arg96、Asp97、Leu98、Leu100、Thr101、Phe102、Gly104、Ile110、Lys111、およびK130からなる群から選択される。ヒトFcタグ付PD−1タンパク質(シノバイオロジカル)によるELISA特性解析を実施して、遮断効率および回復効率の良い候補部位を特定した。表62に示されるように、遮断効率>5倍(すなわち活性<20%)と酵素消化後に復活された活性(EC50変化<2倍、またはすなわち活性>50%)とを有する部位を、さらに別の展開のために選択した。
ヒトPBMC(Allcells)をウェル当たり1×105細胞個の濃度で96ウェルプレートに播種した。細胞を0.1ug/mL SEBにより3日間刺激した。異なる濃度のWT抗PD−1抗体、TMEAbody、または活性化されたTMEAbodyを添加し、37℃、5%CO2で4時間培養した。上清を採集し、細胞毒性因子IFN−γの濃度をELISAキット(R&D)によって検出した。機能性の遮断効率および回復率を表63にまとめた。
上記のイピリムマブおよびペムブロリズマブのTMEAbodyのスクリーニングの実施例に示されるように、抗PD−1抗体(ニボルマブ)の複数の部位を、部位特異的コンジュゲーションのためにシステインに変異させた。抗PD−1抗体(ニボルマブ)の重鎖の変異位置は、Gln3、Ser7、Gly8、Gly9、Gly10、Gly15、Ser17、Lys23、Ala24、Ser25、Gly26、Ile27、Asn31、Thr28、Ser30、Ser32、Gly33、Ala40、Gly42、Gly44、Leu45、Ala49、Ile51、Tyr53、Asp54、Gly55、Ser56、Lys57、Tyr59、Tyr60、Ala61、Asp62、Ser63、Lys65、Gly66、Thr69、Ile70、Ser71、Arg72、Asp73、Asn74、Ser75、Lys76、Asn77、Thr78、Leu79、Leu81、Ser85、Leu86、Ala88、Thr91、Ala92、Thr98、Asn99、Asp100、Asp101、Tyr102、Gly104、Gly106、Thr107、Leu108、Thr110、Ser112、Ser113、Ala114、Ser115、Thr116、Lys117、Gly118、およびSer120からなる群から選択され;軽鎖の変異位置は、Ile2、Leu4、Thr5、Ser7、Ala9、Thr10、Leu11、Ser12、Leu13、Ser14、Gly16、Ala19、Thr20、Leu21、Ala25、Ser26、Ser28、Ser30、Ser31、Tyr32、Leu33、Ala34、Tyr36、Gly41、Ala43、Leu46、Leu47、Ile48、Tyr49、Asp50、Ala51、Ser52、Asn53、Arg54、Ala55、Thr56、Gly57、Ile58、Ala60、Arg61、Ser63、Gly64、Ser65、Gly66、Ser67、Gly68、Thr69、Thr72、Leu73、Thr74、Ile75、Ser76、Ser77、Leu78、Ala84、Ser91、Ser92、Asn93、Arg96、Thr97、Phe98、Gly99、Gly101、Thr102、Ile106、Lys107、Thr109、Ala111、Ala112、Ser114、Ile117andSer121からなる群から選択される。遮断効率>5倍と酵素消化後に復活された活性(EC50変化<2倍)とを有する部位を、表64に示すようにさらに別の展開のために選択した。
ヒトPBMC(Allcells)をウェル当たり1×105細胞個の濃度で96ウェルプレートに播種した。細胞を0.1ug/mL SEBにより3日間刺激した。異なる濃度の抗PD−1抗体(ニボルマブ)、TMEAbody(ニボルマブ)、または活性化されたTMEAbody(ニボルマブ)を添加し、37℃、5%CO2で4時間培養した。上清を採集し、細胞毒性因子IFN−γの濃度をELISAキット(R&D)によって検出した。機能性の遮断効率および回復率を表65にまとめた。
動物モデルで腫瘍を治療する際の抗PD−1 TMEAbodyのin vivo有効性の特徴をさらに明らかにするために、抗PD−1 TMEAbody(ペムブロリズマブをベースとしたPem−se010 TMEAbodyおよびニボルマブをベースとしたNiv−se007 TMEAbody)、ならびにWTPD−1抗体s(ペムブロリズマブおよびニボルマブ)および対照ヒトIgGを、ヒトPD−1ノックインC57BL/6マウスにおけるMC38結腸腺癌腫瘍モデルに投与した。ヒトPD−1ノックインC57BL/6マウスに、2E6MC38細胞を腹腔左下四分円部に皮下注射した。7日間の腫瘍成長後、動物を、類似の平均腫瘍体積を有する群に分けた。動物に10mg/kgの単回用量のPD−1 TMEAbody(PEGリンカーを含まない抗体の濃度)、WT PD−1抗体、または対照ヒトIgGを投与し、各動物について腫瘍体積をモニタリングした。
ハムスター抗マウスPD−1抗体配列は、米国特許出願公開公報第20170044259号A1に開示されていた。マウス内での免疫原性を低減するために、この抗体のこの重鎖を、マウスIgG2aにリフォーマットした。上記のスクリーニング方法のように、遮断効率の高いTMEAbodyのスクリーニングのために、複数の部位を設計した。最終的に、LC上のSer95を、その高効率の遮断(マウスPD−1タンパク質を用いたELISAアッセイで35倍)ゆえにTMEAbodyの生成のために選択した。SN38マウス腫瘍モデルに、WT J43v2抗体またはJ43v2 TMEAbodyの10mg/kgの単回用量投与を行った(各群n=8)。投与後17日目に、J43v2 TMEAbodyは、75%の腫瘍阻害を示し、WT J43v2抗体(83%)と同等の阻害有効性であった。この結果は、PD−1抗体を活性化することができ、その抗腫瘍活性in vivoで発揮したことを示す。
さらに別の機能性試験および毒性試験に用いるマウスCTLA−4サロゲートTMEAbodyを生成するために、我々は、抗マウスCTLA−4抗体とその変異体バリアント(9D9クローン、mIgG2bアイソタイプ、WO2007/123737A2に示される配列)を作製して精製した。上記のスクリーニング方法のように、遮断効率の高いTMEAbodyのスクリーニングのために、複数の部位を設計した。最終的に、LC上のTyr54を、その高効率の遮断(マウスCTLA−4タンパク質を用いたELISAアッセイで26倍)ゆえにTMEAbodyの生成のために選択した。CT26マウス腫瘍モデルに、WT 9D9抗体または9D9 TMEAbodyの10mg/kgの単回用量投与を行った(各群n=8)。投与後17日目に、9D9 TMEAbodyは、69%の腫瘍阻害を示し、WT 9D9抗体(74%)と同等の阻害有効性であった。この結果は、9D9 TMEAbodyを活性化することができ、その抗腫瘍活性in vivoで発揮したことを示す。
抗PD−1と抗CTLA−4の抗体の併用がメラノーマの治療に有効(ORR)であるにも関わらず、現在の臨床研究で、併用が55%のグレード3〜4のTRAEを呈し、患者の30%がその療法を中断せねばならないことが見出されたことが、当技術分野に周知である。我々は、非疾患環境での曝露時間または活性薬剤の用量を低減するように、抗体をコンジュゲートによって阻害または遮断し、腫瘍の局所環境に達した後に放出すれば、これらのTRAEが改善される可能性があるものと推定した。この理由から、I型糖尿病に罹患した(NOD)マウスを用いて実験を実施した。この種類のマウスの糖尿病は自己免疫疾患であり、その場合、自己活性化されたTリンパ球細胞が膵島β細胞を破壊し、その結果、インスリンの分泌が不十分となる。まず、0日目に、10週齢の雌NOD(北京維通利華実験動物技術有限公司)に、対照IgG、高用量(15mpk)の抗マウスPD−1抗体(J43v2)および抗マウスCTLA−4抗体(9D9)を注射するか、またはこれら2つの抗体のうち一方もしくは両方をそのTMEAbody体に置き換えた。尿中グルコースおよび2つの血糖レベルを含む糖尿病の指標を、尿グルコースの新しい指標が観察されなくなるまで、12日間にわたって毎日観察した。
上記の方法の通りに、抗PD−1抗体配列を特許出願WO2017/124050Alからダウンロードし、部位のスクリーニングを実施して、遮断効率の良いTMEAbodyを特定した。抗PD−1抗体の重鎖の変異位置は、Ser28、Ser31、Tyr33、Asn36、Gly50、Tyr51、Ser53、Tyr54、Asp55、Ser57、Lys58、Asn59、Tyr60、Asn61、Lys65、Asn66、Thr69、Thr74、Gly100、Asp105、Tyr106からなる群から選択され;軽鎖の変異位置は、Lys24、Gln27、Ser28、Asp31、Asp32、Asn33、Asn34、Gln35、Lys36、Asn37、Tyr38、Ser58、Arg60、Glu61、Ser62、Gly63、Gly70、Ser73、Thr75、Gln95、Gln96、Tyr98、Thr100、Tyr102からなる群から選択される。結合ELISAを、Fcタグ付ヒトPD−1タンパク質(シノバイオロジカル)を用いて実施し、遮断効率(EC50変化>5倍)および回復(EC50変化<2倍)の良い選択された部位を表66にまとめた。
4−1BB抗体配列を米国特許出願公開公報第2018/0194851A1(クローンMOR7480.1)からダウンロードした。抗4−1BB抗体の重鎖の変異位置は、Thr31、Tyr32、Ser35、Lys50、Tyr52、Asp55、Ser56、Tyr57、Thr58、Asn59、Tyr60、Ser61、Gln65、Gly66、Gly99、Tyr100、Gly101、Asp104、Tyr105からなる群から選択され;軽鎖の変異位置は、Ser23、Gly24、Asp25、Asn26、Gly28、Asp29、Gln30、Tyr31、Gln49、Asp50、Lys51、Asn52、Arg53、Ser55、Gly56、Thr89、Tyr90、Thr91、Gly92、Gly94、Ser95からなる群から選択される。ヒト4−1BBタンパク質をELISA特性解析に使用して、遮断効率が良く(EC50変化>5倍)ならびにプロテアーゼ消化後の回復が良い(EC50変化<2倍)変異体部位を特定した。選択された部位を表67および表68にまとめた。
トラスツズマブの重鎖配列および軽鎖配列を、Drug Bank(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00072)からダウンロードし、部位スクリーニングを実施して、遮断効率の良い抗Her2 TMEAbodyを特定した。抗Her2抗体(トラスツズマブ)の重鎖の変異位置は、Arg19、Lys30、Asp31、Tyr33、Arg50、Tyr62、Asn55、Tyr57、Arg59、Tyr60、Asp62、Lys65、Asp102、Tyr105からなる群から選択され;軽鎖の変異位置は、Asp1、Gln3、Gln27、Asp28、Asn30、Tyr49、Tyr55、Arg66、Asp70、Tyr92からなる群から選択される。Hisタグ付Her2タンパク質(シノバイオロジカル)をELISAに使用した。遮断効率が良く回復が良い選択された部位を表69にまとめた。
アダリムマブの重鎖配列および軽鎖配列を、Drug Bank(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00051)からダウンロードし、部位スクリーニングを実施して、遮断効率の良い抗TNFa TMEAbodyを特定した。抗TNFα抗体の重鎖の変異位置は、Ser7、Gly8、Gly9、Gly10、Leu11、Gly15、Ser17、Leu18、Leu20、Ala24、Ser25、Gly26、Thr28、Asp30、Asp31、Tyr32、Ala33、Ala40、Gly42、Gly44、Leu45、Ser49、Ala50、Ile51、Thr52、Asn54、Ser55、Gly56、Ile58、Asp59、Tyr60、Ala61、Asp62、Ser63、Glu65、Gly66、Phe68、Thr69、Ile70、Ser71、Asp73、Asn74、Ala75、Lys76、Ser78、Leu79、Tyr80、Leu81、Ser85、Leu86、Ala88、Thr91、Ala92、Lys98、Ser100、Tyr101、Leu102、Ser103、Thr104、Ala105、Ser106、Ser107、Leu108、Asp109、Tyr110、Gly112、Gly114、Thr115、Leu116、Thr118、Ser120、Ser121、Ala122、Ser123、およびThr124からなる群から選択され;軽鎖の変異位置は、Asp1、Thr5、Ser7、Ser9、Ser10、Leu11、Ser12、Ala13、Ser14、Gly16、Thr20、Ile21、Ala25、Ser26、Gln27、Gly28、Ile29、Arg30、Asn31、Tyr32、Leu33、Ala34、Tyr36、Lys39、Gly41、Lys42、Ala43、Leu48、Leu47、Ile48、Tyr49、Ala50、Ala51、Ser52、Thr53、Leu54、Gln55、Ser56、Gly57、Ser60、Ser63、Gly64、Ser65、Gly66、Ser67、Gly68、Thr69、Asp70、Thr72、Leu73、Thr74、Ile75、Ser76、Ser77、Leu78、Ala84、Thr85、Tyr91、Asn92、Arg93、Ala94、Tyr96、Thr97、Phe98、Gly99、Gly101、Thr102、Ile106、Lys107、Thr109、およびAla111からなる群から選択される。TNFaタンパク質(シノバイオロジカル)をELISA特性解析に使用し、遮断効率が良く(EC50変化>5倍)回復が良い(EC50変化<2倍)選択された部位を表70にまとめた。
抗PD−L1抗体(アテゾリズマブ)の重鎖配列および軽鎖配列をDrug Bank(https://www.drugbank.ca/drugs/DB11595)からダウンロードし、部位スクリーニングを実施して、遮断効率の良い抗TNFa TMEAbodyを特定した。抗PD−L1抗体(アテゾリズマブ)の重鎖の変異位置は、Gln3、Asp31、Tyr54、Tyr59、Tyr60、Asp62、Lys65、Asp73、Lys76、Asn77、Arg99からなる群から選択され;軽鎖の変異位置は、Arg24、Gln27、Asp28、Tyr49、Tyr55、Asp70、Gln89、Gln90、Tyr91、Tyr93からなる群から選択される。Fcタグ付ヒトPD−L1タンパク質(シノバイオロジカル)をELISA特性解析に使用し、遮断効率が良く(EC50変化>5倍)回復が良い(EC50変化<2倍)選択された部位を表71にまとめた。
抗ヒトCD28抗体重鎖配列および軽鎖配列を、米国特許第8709414号B2からダウンロードし、部位スクリーニングを実施して、遮断効率の良い抗CD28 TMEAbodyを特定した。抗CD28抗体の重鎖の変異位置は、Ser7、Gly8、Gly15、Ala16、Ser17、Ser21、Ala24、Ser25、Gly26、Tyr27、Thr28、Thr30、Ser31、Tyr32、Ala40、Gly42、Gly44、Gly49、Tyr52、Gly54、Thr58、Ala68、Thr69、Thr71、Thr74、Ser75、Ser77、Thr78、Ala79、Ser84、Leu86、Ser88、Thr91、Ala92、Thr97、Ser99、Tyr101、Gly102、Leu103、Gly113、Thr114、Thr115、Thr117、Ser119、Ser120、Ala121、Ser122、およびThr123からなる群から選択され;軽鎖の変異位置は、Thr5、Ser7、Ser9、Ser10、Ser11、Ser12、Ala13、Ser14、Gly16、Thr20、Thr22、Ala25、Ser26、Ser27、Ile29、Tyr30、Ala43、Leu46、Leu47、Tyr49、Lys50、Ala51、Ser52、Leu54、Thr56、Gly57、Ser60、Ser63、Gly64、Ser65、Gly66、Ser67、Gly68、Thr69、Asp70、Thr72、Thr74、Ser76、Ser77、Ala84、Thr85、Gly91、Thr93、Tyr94、Tyr96、Thr97、Phe98、Gly99、Gly100、Gly101、Thr102、Thr109、およびAla111からなる群から選択される。Fcタグ付ヒトCD28タンパク質(シノバイオロジカル)をELISA特性解析に使用して、遮断効率が良く(EC50変化>5倍)回復が良い(EC50変化<2倍)選択された部位を表72に示す。
1.変異体IL−10サイトカインの発現および精製
改変型pTT5ベクター(バイオベクター)にライゲーションされた変異体IL−10のDNA配列は、293T細胞の発現のために最適化し合成(ジーンウィズ社、蘇州、中国)したものである。変異体IL−10のDNAのトランスフェクションを実施し、4〜7日間のインキュベーションの後、変異体IL−10を含有する上清を採集した。
変異体IL−10タンパク質を、上記に記載されたように生成して精製した。精製された変異体IL−10を、2mM EDTAを含有する20mMTris緩衝液(pH7.4)中、濃度0.5mg/mLとして実施した。TCEP溶液を変異体IL−10にモル比100:1で添加し、穏やかに振盪しながら4℃で4時間インキュベートした。次いで、変異体 IL−10 溶液を、150mM NaClを含有する20mMTris緩衝液(pH7.4)により、4℃で4時間透析した。その後、S48を直ちに変異体 IL−10 溶液にモル比20:1で添加し、穏やかに振盪しながら25℃で16時間インキュベートした。残存するS48を除去することによって、反応を停止した。酵素切断の前に、IL−10TMEAkine緩衝液を、透析を介して酵素緩衝液に交換した。活性化のために、酵素をIL−10TMEAkine溶液に添加し、37℃で16時間インキュベートした。
1ugのIL−10R1−Fc/IL−10R2−Fc/His溶液を含有する60uLのPBS緩衝液を、ウェルに分注した。シールテープをプレートの上部に貼り、プレートを4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、テープを取り外して、各ウェルを吸引した。PBSTで3回洗浄した後、2%BSAを含有する200uLのPBS緩衝液を各ウェルに分注することによってプレートをブロッキングし、プレートを室温で2時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、60uLの系列希釈された試料を適切なウェルに添加した。プレートを室温で1.5時間インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、60uLの2ug/mL IL−10ビオチン化抗体溶液を各ウェルに分注し、室温で1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、次いで、60uLのストレプトアビジン溶液を各ウェルに分注した。プレートを室温で30分間インキュベートした。3回洗浄した後、100ulのHRP基質溶液を各ウェルに分注し、プレートを37℃で15分間インキュベートした。発色を展開させた後、50uLの停止溶液を各ウェルに分注し、各ウェルの吸光度を直ちに波長450nmで測定した。
細胞表面のIL−10受容体は、2つの異なる形態を形成する:高親和性の受容体:IL−10に対するIL−10R1(Kd=50〜200pM)および低親和性の受容体:IL10に対するIL−10R2。低親和性の結合(Kd=10nM)ゆえに、結合親和性を回復するためのR4基に連結するのに用いる位置をスクリーニングするのは、抗体のCDR領域よりも容易である。R4にコンジュゲートされたIL−10は、R4ライブラリースクリーニングの化学修飾成熟により、いくつかの位置で>80%の結合を回復することができる。薬剤候補を選択するために、我々はまた、スクリーニング発現と、IL−10R1およびIL−10R2を結合するドメイン内のIL−10の全アミノ酸とのS48のコンジュゲーション反応を実施した。我々は、将来性のある薬剤候補を取得したので、結果を以下の表73に示す。
試験目的:4T1腫瘍モデルの治療のためのBALB/CマウスにおけるIL10−K34C−S48の抗腫瘍の有効性を検討する。試験薬剤:IL10−K34C−S48およびIL−10の注射剤であり、試験時にPBSによって対応の濃度に希釈。
1.動物:5週齢のBALB/Cマウス、全て雌。
1)4T1細胞をアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)から購入し、ATCCにより提供された仕様書に従って識別した。細胞を、10%ウシ胎児血清を含有するRPMI1640培養溶液中、37℃、5%CO2で培養した。細胞を3日毎に継代し、13継代以内の細胞を使用した。
R1をS13、R3をR3−5、R4をR4−7、かつR2を表75に示される群のそれぞれとしたコンジュゲートの切断効率を、異なる組織で評価した。コンジュゲートをそれぞれ溶解し、10回希釈して濃度0.1mM/mLとした。37℃で、コンジュゲートを100μgの各種酸性化ヒト腫瘍組織ホモジネート(pH6.0)に濃度0.2mg/mLで添加した。腫瘍組織ホモジネート中の酵素は、R1を放出することができた。放出されたR1をHPLCにより検出し、それによって、リンカーの活性化効率を比較した。結果を表75に示した。
ベバシズマブの重鎖配列および軽鎖配列を、Drug Bank(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00112)からダウンロードし、部位スクリーニングを実施して、遮断効率の良い抗VEGF TMEAbodyを特定した。抗VEGF抗体(ベバシズマブ)の重鎖の変異位置は、Tyr32、Asn35、Tyr54、Tyr60、Lys65、Arg66、Tyr102、Tyr103、およびTyr109からなる群から選択され;軽鎖の変異位置は、Ser24、Ser26、Asp28、Tyr32、Tyr49、Thr51、Tyr91、Ser92、およびThr93からなる群から選択される。Hisタグ付VEGFタンパク質をELISAに使用した。遮断効率が良く回復が良い選択された部位を表76にまとめた。
ベバシズマブの重鎖配列および軽鎖配列を、Drug Bank(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00073)からダウンロードし、部位スクリーニングを実施して、遮断効率の良い抗CD20 TMEAbodyを特定した。抗CD20抗体(リツキシマブ)の重鎖の変異位置は、Tyr32、Asn33、Tyr52、Asn55、Lys63、Lys65、Tyr101、Tyr102、およびTyr107からなる群から選択され;軽鎖の変異位置は、Ser26、Ser28、Tyr31、Tyr48、Thr50、Asn52、Thr91、およびThr96からなる群から選択される。Hisタグ付CD20タンパク質をELISAに使用した。遮断効率が良く回復が良い選択された部位を表77にまとめた。
標示されたコンジュゲーションにおけるコンジュゲートの遮断および切断効果を評価した。コンジュゲートをそれぞれ溶解し、10回希釈して終濃度0.1mM/mLとした。37℃で、コンジュゲートを100μgのMDA−MB231ヒト腫瘍組織ホモジネート(pH7)に濃度1mg/mLで8時間添加した。コンジュゲートされ放出された生体分子を、ELISAにより結合を検出し、それによってリンカーの活性化効率を比較した。結果を表78に示した。
試験目的:免疫治療のための、マウスCTLA−4抗体とコンジュゲートされたS27、S39、S40、S47、S48、およびS65の抗腫瘍の有効性を検討する。
1)CT26細胞をATCCから購入した。細胞を、10%ウシ胎児血清を含有するDMEM培養溶液中、37℃、5%CO2で培養した。細胞を3日毎に継代し、15継代以内の細胞を使用した。
ヒトTNF/β−グロビン(TNFグロビン)組換え遺伝子構築物を用いて、TgTCマウスを生成した。上記構築物は、hTNFα遺伝子の全コード領域とプロモーターとを含む2.8kbの断片を含有し、この断片は、hTNFαの3’非翻訳領域(UTR)およびポリアデニル化部位に換えて、ヒトβ−グロビンのそれらを含む0.77kb断片に融合されている。上記断片を、次いで、FVB/J近交系統の受精卵の前核内にマイクロインジェクションした。最後に、注射された受精卵を、8週齢の雌の偽妊娠ICRマウスの卵管内に移植した。トランスジェニック創始個体をFVB/J近交系統と戻し交配することによって、トランスジェニック系統を確立した。ルーチンの尾部ジェノタイピングと同様に、ジェノタイピングをPCRにより実施して、トランスジェニック動物をスクリーニングした。導入遺伝子特異的PCRプライマーは、
5’−GAACTCCCTCGATGTTAACCA−3’(フォワードプライマー、配列番号87);および
5’−TTCAATCCCCAAATCCTAGCC−3’(リバースプライマー、配列番号88)とした。
トラスツズマブの重鎖配列および軽鎖配列を、Drug Bank(https://www.drugbank.ca/drugs/DB00072)からダウンロードし、部位スクリーニングを実施して、遮断効率の良い抗Her2のscFv体を特定した。軽鎖の変異位置は、Asp1、Gln3、Gln27、Asp28、Asn30、Tyr49、Tyr55、Arg66、Asp70、およびTyr92からなる群から選択される。軽鎖の変異位置は、Arg19、Lys30、Asp31、Tyr33、Arg50、Tyr62、Asn55、Tyr57、Arg59、Tyr60、Asp62、Lys65、Asp102、およびTyr105からなる群から選択される。上記の選択された変異体のscFv体を、C末端の6Hisタグと共にHEK293で発現し、Ni−NTAカラムにより精製し、対応する化学リンカーにコンジュゲートした。結合ELISAは、Hisタグ付ヒトHer2タンパク質を抗原として、抗ヒトカッパ鎖を二次抗体として用いて行った。遮断効率を表84にまとめた。
試験目的:静脈内注射を介した融合型TMEAbodyの急性毒性を検討すること。
試験目的:静脈内注射を介した融合型TMEAbodyの急性毒性を検討すること。
動物モデルにおいて腫瘍を治療する際の単鎖のCD3−Her2 TMEAbodyのin vivo有効性の特徴をさらに明らかにするために、単鎖のCD3−Her2 TMEAbody、ならびに単鎖のCD3−Her2抗体を、腫瘍異種移植片内に投与した。腫瘍異種移植片を発生させるために、3×106個のKPL−4細胞を、雌の重症複合免疫不全(SCID)ベージュマウスの右側の最後から2番目の鼠径部の乳房の脂肪体内に、同所移植した。移植後、治療の開始前に、腫瘍を成長させた(KPL4で20日間)。KPL−4腫瘍(100mm3)を有するマウスを、試験期間にわたって、標示された薬剤(5週間、毎日10mg/kg)により治療した。腫瘍体積および体重を週に2回測定した。腫瘍体積阻害率を表88にまとめた。結果は、単鎖のCD3−Her2 TMEAbodyが腫瘍の微小環境で活性化され、単鎖のCD3−Her2抗体の有効性を増強できることを意味していた。
Claims (39)
- 以下の構造:
R1−R2−R3−R4−S−cys−R5
を有し、式中、
R5は、1つまたは複数のシステイン残基が変異により導入された生体分子を表し;
cysは、R5に含まれるシステイン残基(複数可)を表し;
Sは、前記システイン残基(複数可)の硫黄原子(複数可)を表し;
R1は、R5がその抗原、リガンド、または受容体に結合するのを防止する基であり;
R2は、不在であるか、またはR2は、1つもしくは複数のタンパク質分解酵素により活性化することのできる切断可能なリンカーアーム、もしくは病態の微小環境において酸性で活性化することのできる化学結合であり;
R3は、不在であるか、またはR3は、R2が切断された後に自動的に脱落することのできるリンカーアーム、もしくは病態の微小環境において酸性で活性化することのできる化学結合であり;但し、R2が不在であるとき、R3は、病態の微小環境において酸性で活性化することのできる前記化学結合であり;
R4は、R5に含まれる前記システイン残基(複数可)の硫黄原子(複数可)を介して共有結合によりR5に連結された基であり、部分R1−R2−R3が切断された後にR5の抗原、リガンド、または受容体への結合能を回復、維持、または促進する基である、
生体分子のコンジュゲート。 - R1は、ポリエチレングリコール−C1−5アルキルカルボニル、
からなる群から選択され、
式中、各Rは、独立してC1−4アルキルであり;各nは、独立して1から30000の範囲の整数、例えば1〜150、1〜50、1〜20、または3〜12などであり;前記ポリエチレングリコールまたはpegmは、44から132000の範囲の分子量を有するポリエチレングリコール、例えば1000から50000または10000から30000の分子量を有するポリエチレングリコールであり;mは、前記ポリエチレングリコールの分子量を表し;波線は、R2に連結しているR1の位置を標示する、
請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - R1は:
からなる群から選択される、請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - R2は、1つまたは複数のタンパク質分解酵素、プロテアーゼ、またはペプチダーゼにより活性化または切断することのできるペプチドであり、前記プロテアーゼは、システインプロテアーゼ、アスパラギンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、ゼラチナーゼ、メタロプロテイナーゼ、またはアスパラギンペプチドリアーゼからなる群から選択され;
好ましくは、R2は、レグマイン、グランザイム、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンK、カテプシンL、カリクレイン、hKl、hKlO、hK15、プラスミン、コラゲナーゼ、IV型コラゲナーゼ、アストロメリシン,第Xa因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ−3、Mirl−CP、パパイン、HIV−1プロテアーゼ、HSVプロテアーゼ、CMVプロテアーゼ、キモスム(chymosm)、ペプスム(pepsm)、マトリプターゼ、プラスメプスム(plasmepsm)、ネペンテシン、メタロエクソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、MMPl、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMPlO、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14,ADAMlO、ADAM12、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)、ネンテロキナーゼ(nenterokinase)、前立腺特異的抗原(PSA、hK3)、インターロイキン−113転換酵素、トロンビン、FAP(FAP−a)、メプリン、ジペプチジルペプチダーゼ、およびジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV/CD26)からなる群から選択される酵素のうち少なくとも1つにより切断することのできるペプチドである、
請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - R2は、−R2a−、−R2b−、−R2a−N−、−R2a−D−、−R2a−AAN−、−R2a−AAD−、または−R2a−R2b−によって表されるペプチドであり;式中、R2aは、1つまたは複数のタンパク質分解酵素によりアミド結合で切断することのできるペプチドであり;R2bは、R3と共にカルバメートを形成する側鎖にその窒素を有するペプチドであり、前記カルバメートは、1つまたは複数のタンパク質分解酵素により切断することができ;Aは、アラニンであり;Nは、R3と共にカルバメートを形成する側鎖にその窒素を有するアスパラギンであって、前記カルバメートは、レグマインにより切断することができ;Dは、R3と共にカルバメートを形成する側鎖にその窒素を有するアスパラギン酸であって、前記カルバメートは、グランザイムBにより切断することができ;
好ましくは、R2は、トリペプチドであり、式中、R1に連結された前記トリペプチドの第1のアミノ酸残基は、Ala、Thr、Val、およびIleからなる群から選択され、中位の第2のアミノ酸残基は、Ala、Thr、Val、およびAsnからなる群から選択され、R3に連結された第3のアミノ酸残基は、AsnおよびAspからなる群から選択され;R2は、前記第1のアミノ酸残基のアミノ基を介してアミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、またはヒドラゾン結合の連結様式でR1に連結し、前記第3のアミノ酸残基のカルボキシ基を介してアミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、またはヒドラゾン結合の連結様式でR3に連結し;好ましくは、前記トリペプチドは、Ala−Ala−AsnおよびAla−Ala−Aspからなる群から選択される、
請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - R2は、病態の微小環境の酸性条件で切断可能な結合であり、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、およびヒドラゾン結合からなる群から選択され;
好ましくは、R1−R2−R3−R4の構造は:
によって表され、
式中、XおよびYは、それぞれ独立してNR’またはOであり、Zは、HまたはC1−10アルキルであり、R’は、HまたはC1−4アルキルであり;R3は、R1およびR4に、XおよびYをそれぞれ介してアミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、またはヒドラゾン結合の連結様式で連結する、
請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - R2は、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、およびヒドラゾン結合からなる群から選択される病態の微小環境の酸性条件で切断可能な結合であり、R1−R2−R3−R4の構造は:
によって表される、請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - R3は:
からなる群から選択され、
式中、XおよびYは、それぞれ独立してNR’またはOであり、Zは、HまたはC1−10アルキルであり、Rは、C1−4アルキルであり、R’は、HまたはC1−4アルキルであり;R4は、上記式のYまたはNを介して、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、またはヒドラゾン結合の連結様式で、R3に連結する、
請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - R3は、−NH−フェニル−CH2O−、−NH−フェニル−CH=N−、−NH−フェニル−C(CH3)=N−、−O−フェニル−CH=N−、および−O−フェニル−C(CH3)=N−からなる群から選択される、請求項8に記載の生体分子のコンジュゲート。
- R3は、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、およびヒドラゾン結合からなる群から選択される、請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。
- R3は:
からなる群から選択される、請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - R4は、−R4−a−R4−b−R4−c−によって表され、R4−aは:
からなる群から選択され、式中、RaおよびRbは、それぞれ独立して、HおよびC1−6アルキルまたはC1−6アルコキシルからなる群から選択され;
R4−bは:
からなる群から選択され、式中、式R4−b1では、Rcは、不在であるか、またはC1−12アルキル、C1−12アルコキシ−C1−12アルキル、C1−12アルキル−C3−8シクロアルキル、(C1−4アルキル−O)p−C1−12アルキル、C1−12アルキルカルボニルアミノ−(C1−4アルキル−O)p−C1−12アルキル、フェニル−C1−12アルキル、C3−8シクロアルキル、C1−12アルキル−C3−8シクロアルキル−C1−12アルキル、およびC1−12アルキル−フェニル−C1−12アルキルからなる群から選択され;式R4−b2では、Rcは、アミノ基のN原子で置換されたRa−1およびRa−2を有するC1−12アルキルアミノであり、式4−b3では、Rcは、Ra−1、Ra−2、およびR2−3により置換されているアルキルの終端に最後のC原子を有するC1−12アルキルであり、式中、Ra−1、Ra−2、およびRa−3は、それぞれ独立して、C1−12アルキル、C1−12アルキル−OH、およびC1−12アルキル−NR’’R’’’からなる群から選択され、式中、R’’およびR’’’は、それぞれ独立して、HおよびC1−12アルキルからなる群から選択され;式R4−b2およびR4−b3では、R4−bは、Ra−1、Ra−2、およびRa−3のうち少なくとも1つを介してR4−cに連結し;
R4−cは:
からなる群から選択され、式中、Rxは、H、ハロ、およびC1−4アルキルからなる群から選択され;pは、1から10の範囲の整数、例えば1から5の整数であり;qは、1から4の整数、例えば1から2の整数であり;但し、R4−aが式R4−a2、R4−a3、およびR4−a4からなる群から選択されるとき、R4−cが不在であり;
上式で、R3は、R4のR4−cを介してR4に連結し、R4−aの各式に示された波線は、R4−aがR4−bに連結する位置を標示する、
請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - R4は:
からなる群から選択される、請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - R5は、そのアミノ酸のうち1つまたは複数がシステインに変異されているタンパク質であり、R5は、前記システインのチオール基を介してR4に連結し;
好ましくは、R5は、そのアミノ酸のうち1つまたは複数がシステインに変異されている抗体である、
請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - R5は、抗体であり、前記変異は、抗体分子の可変領域の非相補性決定領域にあり;好ましくは、前記生体分子のコンジュゲートは、最終的にコンジュゲーションを介して200超に増えた分子量を得た、請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。
- R5は、そのタンパク質配列のそのアミノ酸のうち1つまたは複数がシステインに変異されているサイトカインを表す、請求項14に記載の生体分子のコンジュゲート。
- R5は、抗体分子の可変領域の相補性決定領域に1つまたは複数の変異を有する抗体を表し、好ましくは、R5は、前記相補性決定領域のG、A、S、T、L、I、F、E、K、D、およびYからなる群から選択されるアミノ酸残基のうち1つまたは複数がシステインに変異された抗体を表す、請求項14に記載の生体分子のコンジュゲート。
- R5は、抗体分子の可変領域の非相補性決定領域に1つまたは複数の変異を有する抗体を表し、好ましくは、R5は、前記非相補性決定領域のG、A、S、T、L、I、F、E、K、D、およびYからなる群から選択されるアミノ酸残基のうち1つまたは複数がシステインに変異された抗体を表す、請求項14に記載の生体分子のコンジュゲート。
- 前記生体分子は、G、A、S、T、L、I、F、E、K、D、およびYからなる群から選択されるアミノ酸残基のうち1つまたは複数がシステインに変異されたサイトカインである、請求項16に記載の生体分子のコンジュゲート。
- R5は、抗体の可変領域の非相補性決定領域に1つまたは複数の変異を有する抗体、好ましくは、VHの非相補性決定領域のGln3、Ser7、Ser26、Glu46、Thr68、Asp72、およびVLの非相補性決定領域のThr5、Tyr49、Arg61、Ser63、Ser65、Ser67、Thr72、Thr74、Ser76、Asp82のうち1つまたは複数がシステインに変異された抗体を表す、請求項14に記載の生体分子のコンジュゲート。
- 変異前に、
R5が、IL−2、IL−7、IL−10、IL−11、IL−12、IL−15、IL−21、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、G−CSF、GM−CSF、TNF−α、TRAP、およびTRAILからなる群から選択される生体分子に相当するか;
R5が、抗Her2抗体、抗EGFR抗体、抗VEGFR抗体、抗CD20抗体、抗CD33抗体、抗PD−L1抗体、抗PD−1抗体、抗CTLA−4抗体、抗TNFα抗体、抗CD28抗体、抗4−1BB抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体、抗CD27抗体、抗b−CD40抗体、もしくは抗ICOS抗体、抗CD25抗体、抗CD30抗体、抗CD3抗体、抗CD22抗体、抗CCR4抗体、抗CD38抗体、抗CD52抗体、抗補体C5抗体、抗RSV−Fタンパク質,抗GD2抗体、抗GITR抗体、抗糖タンパク質受容体lib/Illa抗体、抗ICOS抗体、抗IL2R抗体、抗LAG3抗体、抗インテグリンα4抗体、抗lgE抗体、抗PDGFRa抗体、抗RANKL抗体、抗SLAMF7抗体、抗LTIGIT抗体、抗TIM−3抗体、抗VEGFR2抗体、抗VISTA抗体からなる群から選択される抗体もしくはその機能性断片に相当するか;または
R5が、ウトミルマブ、ウレルマブ、ADG106、ポテリジオ(商標)(モガムリズマブ)、ポテリジオ(商標)(モガムリズマブ)、ベキサール(商標)(トシツモマブ)、ゼヴァリン(商標)(イブリツモマブ・チウキセタン)、リツキサン(商標)(リツキシマブ)、アーゼラ(商標)(オファツムマブ)、ガザイバ(商標)(オビヌツズマブ)、ベスポンサ(商標)(イノツズマブ・オゾガマイシン)、ゼナパックス(商標)(ダクリズマブ)、バリルマブ、セラリズマブ、アドセトリス(商標)(ブレンツキシマブ・ベドチン)、マイロターグ(商標)(ゲムツズマブ)、ダラザレックス(商標)(ダラツムマブ)、CDX−1140、SEA−CD40、RO7009789、JNJ−64457107、APX−005M、Chi Lob 7/4、キャンパス(商標)(アレムツズマブ)、ラプティバ(商標)(エファリズマブ)、ソリリス(商標)(エクリズマブ)、ヤーボイ(商標)(イピリムマブ)、トレメリムマブ、アービタックス(商標)(セツキシマブ)、ベクティビックス(商標)(パニツムマブ)、ポートラーザ(商標)(ネシツムマブ)、TheraCIM(商標)(ニモツズマブ)、シナジス(商標)(パリビズマブ)、ユニツキシン(商標)(ジヌツキシマブ)、TRX−518、MK−4166、MK−1248、GWN−323、INCAGN0186、BMS−986156、AMG−228、レオプロ(商標)(アブシキシマブ)、ハーセプチン(商標)(トラスツズマブ)、パージェタ(商標)(ペルツズマブ)、カドサイラ(商標)(Ado−トラスツズマブ・エムタンシン)、GSK−3359609、JTX−2011、シムレクト(商標)(バシリキシマブ)、タイサブリ(商標)(ナタリズマブ)、BMS−986016、REGN3767、LAG525、ゾレア(商標)(オマリズマブ)、タボリマブ、PF−04518600、BMS−986178、MOXR−0916、GSK−3174998、INCAGN01949、IBI−101、キイトルーダ(商標)(ペムブロリズマブ)、オプジーボ(商標)(ニボルマブ)、ラルトルボ(商標)(オララツマブ)、テセントリク(商標)(アテゾリズマブ)、BMS−936559、バベンチオ(商標)(アベルマブ)、イミフィンジ(商標)(デュルバルマブ)、プロリア(商標)(デノスマブ)、エムプリシティ(商標)(エロツズマブ)、MTIG7192A、TSR−022、MBG−453、レミケード(商標)(インフリキシマブ)、ヒュミラ(商標)(アダリムマブ)、アバスチン(商標)(ベバシズマブ)、ルセンティス(商標)(ラニビズマブ)、サイラムザ(商標)(ラムシルマブ)、およびJNJ−61610588からなる群から選択される抗体もしくはその機能性断片に相当する、
請求項14に記載の生体分子のコンジュゲート。 - IL2の変異位置が、Lys32、Lys35、Thr37、Met39、Thr41、Lys43、Tyr45、Lys48、Lys49、Lys64、Leu72、Ala73、Ser75、Lys76、Leu94、Thr101、Thr102、Tyr107、Ala108、Thr111、Ala112、Leu12、His16、Leu19、Met23、Gly27、Ser75、Arg81、Leu85、Ser87、およびAsn88からなる群から選択されるか;または
IL10の変異位置が、Thr6、Ser8、Ser11.Thr13、Gly17、Arg24、Ser31、Arg32、Lys34、Thr35、Lys40、Leu46、Lys49、Ser51、Lys57、Gly58、Ser66、Tyr72、Lys88,,His90、Ser93、Lys99、Thr100、Arg104、Lys117、Ser118、Lys119、Lys125、Lys130、Lys134、Gly135、Tyr137、Tyr149、Thr155、Lys157、およびArg159からなる群から選択されるか;または
抗PD−1抗体ペムブロリズマブの重鎖の変異位置が、Ser7、Gly8、Gly15、Ala16、Ser17、Ala24、Ser25、Gly26、Tyr27、Thr28、Thr30、Asn31、Tyr32、Tyr33、Tyr35、Ala40、Gly42、Gly44、Leu45、Gly49、Gly50、Ile51、Asn52、Ser54、Asn55、Gly56、Gly57、Thr58、Asn59、Lys63、Lys65、Thr69、Leu70、Thr71、Thr72、Asp73、Ser74、Ser75、Thr76、Thr77、Thr78、Ala79、Leu83、Ser85、Leu86、Thr91、Ala92、Arg99、Asp100、Tyr101、Arg102、Asp104、Gly106、Gly111、Gly113、Thr114、115Thr、117Thr、Ser119、Ser120、Ala121、Ser122、Thr123、Lys124、Gly125、およびSer127からなる群から選択され;軽鎖の変異位置が、Ile2、Thr5、Ser7、Ala9、Thr10、Leu11、Ser12、Leu13、Ser14、Gly16、Ala19、Thr20、Ala25、Ser26、Lys27、Gly28、Ser30、Thr31、Ser32、Gly33、Tyr34、Ser35、Tyr36、Leu37、Gly45、Ala47、Leu50、Leu51、Ile52、Tyr53、Leu54、Ala55、Ser56、Tyr57、Leu58、Ser60、Gly61、Ala64、Ser67、Gly68、Ser69、Gly70、Ser71、Gly72、Thr73、Ala76、Thr78、Ser80、Ser81、Ser95、Arg96、Asp97、Leu98、Leu100、Thr101、Phe102、Gly104、Ile110、Lys111、およびK130からなる群から選択されるか;;または
抗PD−1抗体ニボルマブの重鎖の変異位置が、Gln3、Ser7、Gly8、Gly9、Gly10、Gly15、Ser17、Lys23、Ala24、Ser25、Gly26、Ile27、Asn31、Thr28、Ser30、Ser32、Gly33、Ala40、Gly42、Gly44、Leu45、Ala49、Ile51、Tyr53、Asp54、Gly55、Ser56、Lys57、Tyr59、Tyr60、Ala61、Asp62、Ser63、Lys65、Gly66、Thr69、Ile70、Ser71、Arg72、Asp73、Asn74、Ser75、Lys76、Asn77、Thr78、Leu79、Leu81、Ser85、Leu86、Ala88、Thr91、Ala92、Thr98、Asn99、Asp100、Asp101、Tyr102、Gly104、Gly106、Thr107、Leu108、Thr110、Ser112、Ser113、Ala114、Ser115、Thr116、Lys117、Gly118、およびSer120からなる群から選択され;軽鎖の変異位置が、Ile2、Leu4、Thr5、Ser7、Ala9、Thr10、Leu11、Ser12、Leu13、Ser14、Gly16、Ala19、Thr20、Leu21、Ala25、Ser26、Ser28、Ser30、Ser31、Tyr32、Leu33、Ala34、Tyr36、Gly41、Ala43、Leu46、Leu47、Ile48、Tyr49、Asp50、Ala51、Ser52、Asn53、Arg54、Ala55、Thr56、Gly57、Ile58、Ala60、Arg61、Ser63、Gly64、Ser65、Gly66、Ser67、Gly68、Thr69、Thr72、Leu73、Thr74、Ile75、Ser76、Ser77、Leu78、Ala84、Ser91、Ser92、Asn93,Arg96、Thr97、Phe98、Gly99、Gly101、Thr102、Ile106、Lys107、Thr109、Ala111、Ala112、Ser114、Ile117、およびSer121からなる群から選択されるか;
抗CTLA−4抗体イピリムマブの重鎖の変異位置が、Gln3、Arg19、Leu20、Ser25、Gly26、Phe27、Thr28、Phe29、Ser30、Ser31、Tyr32、Thr33,Met34,His35、Gly44、Phe50、Ile51、Ser52、Tyr53、Asp54、Gly55、Asn56、Asn57、Lys58、Tyr59、Tyr60、Thr69、Ser71、Arg72、Asp73、Asn74、Ser75、Lys76、Asn77、Thr99、Gly100、Trp101、Leu102、Gly103、およびPro104からなる群から選択され;軽鎖の変異位置が、Gln6、Arg24、Ala25、Ser26、Gln27、Ser28、Val29、Gly30、Ser31、Ser32、Tyr33、Ile49、Tyr50、Gly51、Ala52、Phe53、Ser54、Arg55、Ala56、Phe53、Ser54、Arg55、Ala56、Thr57、Gly58、Ile59,Pro60、Asp61、Arg62、Ser68、Gly69、Thr70、Gln90、Gln91、Tyr92、Gly93、Ser94、Ser95,Pro96、およびTrp97からなる群から選択されるか;
抗TNFα抗体重鎖の変異位置が、Ser7、Gly8、Gly9、Gly10、Leu11、Gly15、Ser17、Leu18、Leu20、Ala24、Ser25、Gly26、Thr28、Asp30、Asp31、Tyr32、Ala33、Ala40、Gly42、Gly44、Leu45、Ser49、Ala50、Ile51、Thr52、Asn54、Ser55、Gly56、Ile58、Asp59、Tyr60、Ala61、Asp62、Ser63,Glu65、Gly66、Phe68、Thr69、Ile70、Ser71、Asp73、Asn74、Ala75、Lys76、Ser78、Leu79、Tyr80、Leu81、Ser85、Leu86、Ala88、Thr91、Ala92、Lys98、Ser100、Tyr101、Leu102、Ser103、Thr104、Ala105、Ser106、Ser107、Leu108、Asp109、Tyr110、Gly112、Gly114、Thr115、Leu116、Thr118、Ser120、Ser121、Ala122、Ser123、およびThr124からなる群から選択され;軽鎖の変異位置が、Asp1、Thr5、Ser7、Ser9、Ser10、Leu11、Ser12、Ala13、Ser14、Gly16、Thr20、Ile21、Ala25、Ser26、Gln27、Gly28、Ile29、Arg30、Asn31、Tyr32、Leu33、Ala34、Tyr36、Lys39、Gly41、Lys42、Ala43、Leu48、Leu47、Ile48、Tyr49、Ala50、Ala51、Ser52、Thr53、Leu54、Gln55、Ser56、Gly57、Ser60、Ser63、Gly64、Ser65、Gly66、Ser67、Gly68、Thr69、Asp70、Thr72、Leu73、Thr74、Ile75、Ser76、Ser77、Leu78、Ala84、Thr85、Tyr91、Asn92、Arg93、Ala94、Tyr96、Thr97、Phe98、Gly99、Gly101、Thr102、Ile106、Lys107、Thr109、およびAla111からなる群から選択されるか;
抗CD28抗体の重鎖の変異位置が、Ser7、Gly8、Gly15、Ala16、Ser17、Ser21、Ala24、Ser25、Gly26、Tyr27、Thr28、Thr30、Ser31、Tyr32、Ala40、Gly42、Gly44、Gly49、Tyr52、Gly54、Thr58、Ala68、Thr69、Thr71、Thr74、Ser75、Ser77、Thr78、Ala79、Ser84、Leu86、Ser88、Thr91、Ala92、Thr97、Ser99、Tyr101、Gly102、Leu103、Gly113、Thr114、Thr115、Thr117、Ser119、Ser120、Ala121、Ser122、およびThr123からなる群から選択され;軽鎖の変異位置が、Thr5、Ser7、Ser9、Ser10、Ser11、Ser12、Ala13、Ser14、Gly16、Thr20、Thr22、Ala25、Ser26、Ser27、Ile29、Tyr30、Ala43、Leu46、Leu47、Tyr49、Lys50、Ala51、Ser52、Leu54、Thr56、Gly57、Ser60、Ser63、Gly64、Ser65、Gly66、Ser67、Gly68、Thr69、Asp70、Thr72、Thr74、Ser76、Ser77、Ala84、Thr85、Gly91、Thr93、Tyr94、Tyr96、Thr97、Phe98、Gly99、Gly100、Gly101、Thr102、Thr109、およびAla111からなる群から選択されるか;
抗4−1BB抗体の重鎖の変異位置が、Thr31、Tyr32、Ser35、Lys50、Tyr52、Asp55、Ser56、Tyr57、Thr58、Asn59、Tyr60、Ser61、Gln65、Gly66、Gly99、Tyr100、Gly101、Asp104、およびTyr105からなる群から選択され;軽鎖の変異位置が、Ser23、Gly24、Asp25、Asn26、Gly28、Asp29、Gln30、Tyr31、Gln49、Asp50、Lys51、Asn52、Arg53、Ser55、Gly56、Thr89、Tyr90、Thr91、Gly92、Gly94、およびSer95からなる群から選択されるか;または
抗Her2抗体の重鎖の変異位置が、Arg19、Lys30、Asp31、Tyr33、Arg50、Tyr62、Asn55、Tyr57、Arg59、Tyr60、Asp62、Lys65、Asp102、およびTyr105からなる群から選択され;軽鎖の変異位置が、Asp1、Gln3、Gln27、Asp28、Asn30、Tyr49、Tyr55、Arg66、Asp70、およびTyr92からなる群から選択されるか、
抗PD−L1抗体アテゾリズマブの重鎖の変異位置が、Gln3、Asp31、Tyr54、Tyr59、Tyr60、Asp62、Lys65、Asp73、Lys76、Asn77、およびArg99からなる群から選択され;軽鎖の変異位置が、Arg24、Gln27、Asp28、Tyr49、Tyr55、Asp70、Gln89、Gln90、Tyr91、およびTyr93からなる群から選択される、
請求項21に記載の生体分子のコンジュゲート。 - R5は、システイン変異されている1つまたは複数のアミノ酸残基を含有する融合タンパク質であり;
好ましくは、前記融合タンパク質は、抗体の抗原結合性ドメインと、任意選択的にサイトカインとを含有し;好ましくは、前記融合タンパク質は、HER2、CD19、EGFR、CD22、CD3、TROP2、糖タンパク質NMB、グアニル酸シクラーゼC、CEA、CD79b、PSMA、ENPP3、メソテリン、CD138、NaPi2b、CD56、CD74、FOLR1、DLL3、CEACAM5、CD142、SLAMF7、CD25、SLTRK6、CD37、CD70、AGS−22、C4.4A、FGFR2、Ly6E、MUC16、BCMA、pカドヘリン、エフリン−A、LAMP1、MUC1、CD19、PDL1、HER2、NY−ESO−1、BCMA、WT1、MUC1、CD20、CD23、ROR1、CD123、CD33、CD44v6、CD174、CD30、CD133、cMet、EGFR、FAP、EphA2、GD2、GPC3、IL−13Ra2、LewisY、メソテリン、SS1、CEA、CD171、EGFR、EGFRvIII、VEGFR2、NY−ESO−1、MUC−1、およびMAGE−A3からなる群から選択される抗原に対する抗原結合性ドメインを含有する二重特異性抗体であり;好ましくは、前記二重特異性抗体は、単鎖の二重特異性抗体であり;
好ましくは、前記融合タンパク質は、抗体の抗原結合性ドメインと、IL−2、IL−7、IL−10、IL−11、IL−12、IL−15、IL−21、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、G−CSF、GM−CSF、TNF−α、TRAP、およびTRAILからなる群から選択されるサイトカインとを含有し;好ましくは、前記融合タンパク質は、抗PD−l抗体とIL2との融合タンパク質である、
請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - R1−R2−R3−R4は、以下の構造:
のいずれかによって表され、
式中、R1は、請求項2または3にあるように規定される、
請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - R1−R2−R3−R4は、以下の構造:
および
のいずれかによって表され、
pegmは、44から132000の範囲の分子量を有するポリエチレングリコール、例えば1000から50000または10000から30000の範囲の分子量を有するポリエチレングリコールなどであり、mは、前記ポリエチレングリコールの分子量を表し;nは、1から30000の範囲の整数、例えば1〜3000、1〜500、1〜300、1〜20、または5〜12の範囲の整数などであり;
Zは、カルボニル置換基を含有するナフチル、キノリル、フルオレニル、またはアダマンチルであり、Zは、そのカルボニル基を介して前記アミノに連結し、;好ましくは、Zは:
からなる群から選択される、
請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - 前記生体分子のコンジュゲートにおいて、R1−R2−R3−R4は:
からなる群から選択される、請求項1に記載の生体分子のコンジュゲート。 - 以下の構造:
R4−S−cys−R5
を有し、上式で、
R4は、−R4−a−R4−b−R4−cによって表され、式中、R4−a は:
からなる群から選択され、式中、RaおよびRbは、それぞれ独立して、HおよびC1−6アルキルまたはC1−6アルコキシルからなる群から選択され;
R4−bは:
からなる群から選択され、式中、式R4−b1では、Rcは、不在であるか、またはC1−12アルキル、C1−12アルコキシ−C1−12アルキル、C1−12アルキル−C3−8シクロアルキル、(C1−4アルキル−O)p−C1−12アルキル、C1−12アルキルカルボニルアミノ−(C1−4アルキル−O)p−C1−12アルキル、フェニル−C1−12アルキル、C3−8シクロアルキル、C1−12アルキル−C3−8シクロアルキル−C1−12アルキル、およびC1−12アルキル−フェニル−C1−12アルキルからなる群から選択され;式R4−b2では、Rcは、アミノ基のN原子で置換されたRa−1およびRa−2を有するC1−12アルキルアミノであり、式4−b3では、Rcは、Ra−1、Ra−2、およびR2−3により置換されているアルキルの終端に最後のC原子を有するC1−12アルキルであり、式中、Ra−1、Ra−2、およびRa−3は、それぞれ独立して、C1−12アルキル、C1−12アルキル−OH、およびC1−12アルキル−NR’’R’’’からなる群から選択され、式中、R’’およびR’’’は、それぞれ独立して、HおよびC1−12アルキルからなる群から選択され;式R4−b2およびR4−b3では、R4−bは、Ra−1、Ra−2、およびRa−3のうち少なくとも1つを介してR4−cに連結し;
R4−cは:
からなる群から選択され、式中、Rxは、H、ハロ、およびC1−4アルキルからなる群から選択され;pは、1から10の範囲の整数、例えば1から5の整数などであり;qは、1から4の整数、例えば1から2の整数などであり;但し、R4−aが式R4−a2、R4−a3、およびR4−a4からなる群から選択されるとき、R4−cが不在であり;
上式で、R4−aの各式に示された波線は、R4−aがR4−bに連結する位置を標示し、R4−cの各式に示された波線は、R4−cがR4−bに連結する位置を標示する、
コンジュゲート。 - R4は:
からなる群から選択される、請求項27に記載の化合物。 - 治療有効量の請求項1〜26のいずれかの前記生体分子のコンジュゲートまたは請求項27もしくは28の化合物を、それを必要とする対象に提供することを含む、腫瘍または自己免疫疾患を治療するための方法。
- 前記腫瘍は、膀胱、脳、乳房、子宮頸部、結腸・直腸、食道、腎臓、肝臓、肺、上咽頭、膵臓、前立腺、皮膚、胃、子宮、卵巣、精巣、または血液におけるがんである、請求項29に記載の方法。
- R1−R2−R3−R4によって表される化合物であって、式中、R1は、Hであるか、または請求項1〜3のいずれかに規定され;R2は、請求項1および4〜7のいずれかに規定され;R3は、請求項1および8〜11のいずれかに規定され;R4は、請求項1および12〜13のいずれかに規定される、化合物。
- 前記化合物は:
によって表され、式中、XおよびYは、それぞれ独立してNR’またはOであり、Zは、HまたはC1−10アルキルであり、R’は、HまたはC1−4アルキルであり;式中、それぞれアミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、またはヒドラゾン結合の連結様式で、R1はXに連結し、R4はYまたはNに連結する、
請求項31に記載の化合物。 - 前記化合物は:
によって表される、請求項31に記載の化合物。 - または
によって表され、式中、XおよびYは、それぞれ独立してNR’またはOであり、Zは、HまたはC1−10アルキルであり、R’は、HまたはC1−4アルキルであり;式中、それぞれアミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、またはヒドラゾン結合の連結様式で、R2はXに連結し、R4はYまたはNに連結する、
請求項31に記載の化合物。 - からなる群から選択され、式中、
R1は、Hであるか、または請求項 2または3に規定される通りであり;
R4は、請求項12〜13のいずれかにあるように規定される、
化合物。 - からなる群から選択される化合物。
- 相補性決定領域のG、A、S、T、L、I、F、E、K、D、およびYからなる群から選択されるアミノ酸残基のうち1つまたは複数および/または非相補性決定領域のG、A、S、T、L、I、F、E、K、D、およびYからなる群から選択されるアミノ酸残基のうち1つまたは複数がシステインに変異された抗体またはその機能性断片であって;
好ましくは、前記抗体は、抗Her2抗体、抗EGFR抗体、抗VEGFR抗体、抗CD20抗体、抗CD33抗体、抗PD−L1抗体、抗PD−1抗体、抗CTLA−4抗体、抗TNFα抗体、抗CD28抗体、抗4−1BB抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体、抗CD27抗体、抗b−CD40抗体、もしくは抗ICOS抗体、抗CD25抗体、抗CD30抗体、抗CD3抗体、抗CD22抗体、抗CCR4抗体、抗CD38抗体、抗CD52抗体、抗補体C5抗体、抗RSV−Fタンパク質、抗GD2抗体、抗GITR抗体、抗糖タンパク質受容体lib/Illa抗体、抗ICOS抗体、抗IL2R抗体、抗LAG3抗体、抗インテグリンα4抗体、抗lgE抗体、抗PDGFRa抗体、抗RANKL抗体、抗SLAMF7抗体、抗LTIGIT抗体、抗TIM−3抗体、抗VEGFR2抗体、抗VISTA抗体からなる群から選択されるか;または
さらに好ましくは、前記抗体は、ウトミルマブ、ウレルマブ、ADG106、ポテリジオ(商標)(モガムリズマブ)、ポテリジオ(商標)(モガムリズマブ)、ベキサール(商標)(トシツモマブ)、ゼヴァリン(商標)(イブリツモマブ・チウキセタン)、リツキサン(商標)(リツキシマブ)、アーゼラ(商標)(オファツムマブ)、ガザイバ(商標)(オビヌツズマブ)、ベスポンサ(商標)(イノツズマブ・オゾガマイシン)、ゼナパックス(商標)(ダクリズマブ)、バリルマブ、セラリズマブ、アドセトリス(商標)(ブレンツキシマブ・ベドチン)、マイロターグ(商標)(ゲムツズマブ)、ダラザレックス(商標)(ダラツムマブ)、CDX−1140、SEA−CD40、RO7009789、JNJ−64457107、APX−005M、ChiLob7/4、キャンパス(商標)(アレムツズマブ)、ラプティバ(商標)(エファリズマブ)、ソリリス(商標)(エクリズマブ)、ヤーボイ(商標)(イピリムマブ)、トレメリムマブ、アービタックス(商標)(セツキシマブ)、ベクティビックス(商標)(パニツムマブ)、ポートラーザ(商標)(ネシツムマブ)、TheraCIM(商標)(ニモツズマブ)、シナジス(商標)(パリビズマブ)、ユニツキシン(商標)(ジヌツキシマブ)、TRX−518、MK−4166、MK−1248、GWN−323、INCAGN0186、BMS−986156、AMG−228、レオプロ(商標)(アブシキシマブ)、ハーセプチン(商標)(トラスツズマブ)、パージェタ(商標)(ペルツズマブ)、カドサイラ(商標)(Ado−トラスツズマブ・エムタンシン)、GSK−3359609、JTX−2011、シムレクト(商標)(バシリキシマブ)、タイサブリ(商標)(ナタリズマブ)、BMS−986016、REGN3767、LAG525、ゾレア(商標)(オマリズマブ)、タボリマブ、PF−04518600、BMS−986178、MOXR−0916、GSK−3174998、INCAGN01949、IBI−101、キイトルーダ(商標)(ペムブロリズマブ)、オプジーボ(商標)(ニボルマブ)、ラルトルボ(商標)(オララツマブ)、テセントリク(商標)(アテゾリズマブ)、BMS−936559、バベンチオ(商標)(アベルマブ)、イミフィンジ(商標)(デュルバルマブ)、プロリア(商標)(デノスマブ)、エムプリシティ(商標)(エロツズマブ)、MTIG7192A、TSR−022、MBG−453、レミケード(商標)(インフリキシマブ)、ヒュミラ(商標)(アダリムマブ)、アバスチン(商標)(ベバシズマブ)、ルセンティス(商標)(ラニビズマブ)、サイラムザ(商標)(ラムシルマブ)、およびJNJ−61610588からなる群から選択され;
さらに好ましくは、前記抗体またはその機能性断片は、請求項22に規定された変異のうち1つまたは複数を含有する、
抗体またはその機能性断片。 - G、A、S、T、L、I、F、E、K、D、およびYからなる群から選択されるアミノ酸残基のうち1つまたは複数がシステインに変異されたサイトカインであって;
好ましくは、IL−2、IL−7、IL−10、IL−11、IL−12、IL−15、IL−21、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、G−CSF、GM−CSF、TNF−α、TRAP、およびTRAILからなる群から選択され;
さらに好ましくは、請求項22に規定された変異のうち1つまたは複数を含有する、
サイトカイン。 - 以下の構造:
のいずれかによって表され、
式中、サイトカインおよび抗体は、請求項15〜23のいずれかにあるように規定され、好ましくは、前記抗体およびサイトカインは、配列番号1〜83のいずれかからなる群から選択される、
生体分子のコンジュゲート。
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