WO2024104412A1 - Attenuated interferon proteins and fragments and multifunctional polypeptides and conjugates - Google Patents

Attenuated interferon proteins and fragments and multifunctional polypeptides and conjugates Download PDF

Info

Publication number
WO2024104412A1
WO2024104412A1 PCT/CN2023/131937 CN2023131937W WO2024104412A1 WO 2024104412 A1 WO2024104412 A1 WO 2024104412A1 CN 2023131937 W CN2023131937 W CN 2023131937W WO 2024104412 A1 WO2024104412 A1 WO 2024104412A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polypeptide
alkyl
group
seq
ifnα2b
Prior art date
Application number
PCT/CN2023/131937
Other languages
French (fr)
Inventor
Feifei CUI
Xue LI
Jian Li
Guiliang Xu
Xi Chen
Original Assignee
I-Mab Biopharma Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by I-Mab Biopharma Co., Ltd. filed Critical I-Mab Biopharma Co., Ltd.
Publication of WO2024104412A1 publication Critical patent/WO2024104412A1/en

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Provided herein are modified IFNα2b proteins and functional fragments thereof. Also provided are polypeptides, such as bi-functional and multi-functional ones, which further include a biological moiety such as an antibody or antigen-binding fragment thereof, as well as conjugates of such polypeptides.

Description

ATTENUATED INTERFERON PROTEINS AND FRAGMENTS AND MULTIFUNCTIONAL POLYPEPTIDES AND CONJUGATES
FIELD OF THE DISCLOSURE
The disclosure relates to modified IFNα2b proteins and functional fragments thereof, as well as multifunctional polypeptides and immunoconjugates comprising the IFNα2b or fragments.
BACKGROUND
Human IFNα2b belongs to type I interferons (IFNs-I) , which are clustered on chromosome 9p. It signals through a heterodimeric complex of interferon α/β receptor 1 (IFNAR1) and interferon α/β receptor 2 (IFNAR2) to elicit TYK2 and JAK1 activation, thereby triggering a cascade of immune related interferon stimulating genes (ISGs) which are critical for immune activation.
There is evidence showing that endogenous type I IFNs including IFNα2b can enhance the antitumor activity of chemotherapies, radiotherapies and some targeted therapies. Though recombinant IFNα2b has demonstrated efficacy for cancer treatment, such as melanoma, renal cell carcinoma and various hematological malignancies, patients on the therapy normally suffer from adverse effects, which present a significant challenge for the development of IFN-mediated therapeutics.
SUMMARY
The present application addresses the clinical needs. Certain embodiments provide modified IFNα2b with reduced adverse effects and improved efficacy for clinical use.
In a first aspect, provided is an IFNα2b or a functional fragment thereof, wherein the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified to attenuate binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with interferon α/β receptor. In some embodiments, the interferon α/β receptor is selected from IFNAR1, IFNAR2, and the combination thereof.
In some embodiments, the binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with the interferon α/β receptor is attenuated by at least 10 folds, 102 folds, 103 folds, 104 folds or 105 folds. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is  modified to attenuate activation of Type I interferon signaling induced by the IFNα2b or the functional fragment thereof. In some embodiments, the activation of INFα signaling is attenuated by at least 10 folds, 102 folds, 103 folds, 104 folds, or 105 folds.
In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified by an amino acid substitution at one or more residues corresponding to the residues selected from the group consisting of R12, L15, M16, R22, L26, F27, L30, R33, R33, H34, D35, A145, M148, R149, S152, L153, and N156 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the modification comprises an amino acid substitution at the residue corresponding to S152 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the modification comprises an amino acid substitution with cysteine at the residue corresponding to S152 of SEQ ID NO: 1.
In some embodiments, the IFNα2b comprises an amino acid sequence having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified by a chemical moiety.
In some embodiments, the chemical moiety comprises a structure of formula (I) :
R1-R2-R3-R4 (I) ,
wherein,
R1 is which is optionally further substituted with 1, 2 or 3 R*group (s) ;
L1 is selected from CH or N;
R1a is absent, or is selected from the group consisting of - (CH2) 0-3-C (O) -, - (CH2) 0-3-OC (O) -, and - (CH2) 0-3-NHC (O) -;
each R1b is independently absent, or is independently selected from the group consisting of -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, -C (O) O-, -C (O) NH-, -NH-C1-6 alkyl-, -O-C1-6 alkyl-, -C (O) -C1-6 alkyl-, -OC (O) -C1-6 alkyl-, -C (O) O-C1-6 alkyl-and -C (O) NH-C1-6 alkyl-;
each R1c is independently selected from the group consisting of H, C1-6 alkyl, and C1-6 haloalkyl;
m is an integer in a range of 1 to 30000;
R*is selected from H, halogen, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C1-6 alkoxy, C2-6 alkenyl, or C2-6 alkynyl;
R2 is a linker which is cleavable under tumor environment;
R3 is 
X is selected from -NH-or -O-;
Y is selected from -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, -C (O) -C (O) -or -NHC (O) -;
each Rx and Ry is independently selected from H, halogen, C1-6 alkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 haloalkyl, C2-6 alkenyl or C2-6 alkynyl;
n is 0, 1, 2, 3, 4, or 5;
R4 is 
Ra and Rb are each independently selected from the group consisting of H, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl and C1-6 alkoxyl;
R4a is absent, or is selected from the group consisting of - (CH2) 1-12-, - (CH2) 1-12-O-, -O- (CH2) 1-12-, -O- (CH2) 1-12-O-, - (CH2) 1-12-O- (CH2) 1-12-, (C1-6 alkylene-O) p- (CH2) 1-12, - (CH2) 1-12-C3-8 cycloalkylene-, - (CH2) 1-12-C3-8 cycloalkylene- (CH2) 1-12, - (CH2) 1-12-C6-10 arylene-, and - (CH2) 1-12-C6-10 arylene- (CH2) 1-12;
R4a is optionally further substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 R#group (s) ;
R4b is selected from the group consisting of -NH-, -O-, -C (O) -, -C (O) O-, -OC (O) -, -C (O) -C (O) -, -C (O) NH-or -NHC (O) -;
R#is selected from the group consisting of H, halogen, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C1-6 alkoxy, C2-6 alkenyl or C2-6 alkynyl;
p is 1, 2, 3, 4 or 5;
wherein R3 links to R2 via the X of R3, and links to R4 via the Y of R3.
In some embodiments, R1 is which is optionally further substituted with 1, 2 or 3 R*group (s) ;
L1 is selected from CH or N;
R1a is absent, or is selected from the group consisting of -C (O) -, -OC (O) -, and -NHC (O) -;
each R1b is independently absent, or is independently selected from the group consisting of -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, -C (O) O-, -C (O) NH-, -NH-C1-4 alkyl-, -O-C1-4 alkyl-, -C (O) -C1-4 alkyl-, -OC (O) -C1-4 alkyl-, -C (O) O-C1-4 alkyl-and -C (O) NH-C1-4 alkyl-;
each R1c is independently selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl;
each m is independently an integer in a range of 1 to 5000;
R*is selected from H, halogen, C1-6 alkyl or C1-6 haloalkyl;
alternatively, R1 is which is optionally further substituted with 1, 2 or 3 R*group (s) ;
R1a is absent, or is -C (O) -;
R1c is selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl;
m is an integer in a range of 1 to 3000;
R*is selected from H, halogen or C1-4 alkyl;
still alternatively, R1 is R1c is selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl, m is an integer in range of 1 to 1000, 100 to 500 or 400 to 500; yet alternatively, R1 is a linear polyethylene glycol having a molecular weight of about 20000.
In some embodiments, R2 is selected from the group consisting of matrix metalloprotease (MMP) cleavable linker, a disintegrin and metalloprotease domain-containing (ADAM) metalloprotease cleavable linker, a prostate specific antigen (PSA) protease cleavable linker, a urokinase-type plasminogen activator (uPA) protease cleavable linker, a membrane type serine protease 1 (MT-SP1) protease cleavable linker, a matriptase protease cleavable linker (ST14) and a legumain protease cleavable linker.
In some embodiments, R2 is a matrix metalloprotease (MMP) cleavable linker and comprises an amino acid sequence of anyone selected from SEQ ID NO: 21-35. In some embodiments, R2 is a prostate specific antigen (PSA) protease cleavable linker and comprises an amino acid sequence of anyone selected from SEQ ID NO: 14-16. In some embodiments, R2 is urokinase-type plasminogen activator (uPA) protease cleavable linker and comprises an amino acid sequence of anyone selected from SEQ ID NO: 11-13. In some embodiments, R2 is a legumain protease cleavable linker and comprises an amino acid sequence of any one selected from SEQ ID NOs: 18-19 or AAN or Cbz-AAN-AMC. “Cbz” and “AMC” in Cbz-AAN-AMC represent benzyloxycarbonyl and 7-amino-4-methylcoumarin, respectively.
In some embodiments, the chemical moiety comprises a structure of formula (II) :
wherein R1, R3 and R4 are as defined above.
In some embodiments, R3 is 
wherein,
X is selected from -NH-or -O-;
Y is selected from -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, or -NHC (O) -;
each Rx and Ry is independently selected from H, halogen, C1-4 alkyl or C1-4 haloalkyl;
n is 0, 1, 2 or 3;
alternatively,
R3 is 
X is selected from NH or O;
Y is selected from -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, or -NHC (O) -.
In some embodiments, the chemical moiety comprises a structure of formula (III) :
wherein,
X is selected from NH or O;
Y is selected from -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, or -NHC (O) -;
wherein R1, R2 and R4 are as defined above.
In some embodiments, the chemical moiety comprises a structure of formula (IV) :
wherein R1 and R4 are as defined above.
In some embodiments,
R4 is 
Ra and Rb are each independently selected from the group consisting of H, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl and C1-6 alkoxyl;
R4a is absent, or is selected from the group consisting of - (CH2) 1-12-, - (CH2) 1-12-O-, -O- (CH2) 1-12-, -O- (CH2) 1-12-O-, - (CH2) 1-12-O- (CH2) 1-12-, (C1-6 alkylene-O) p- (CH2) 1-12, - (CH2) 1-12-C3-8 cycloalkylene- and - (CH2) 1-12-C3-8 cycloalkylene- (CH2) 1-12;
R4a is optionally further substituted with 1, 2, 3 or 4 R#group (s) ;
R4b is -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, -C (O) O-, -C (O) NH-or -NHC (O) -;
R#is selected from the group consisting of H, halogen, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C2-6 alkenyl or C2-6 alkynyl;
p is 1, 2, 3 or 4;
alternatively,
Ra and Rb are each independently selected from the group consisting of H and C1-4 alkyl;
R4a is selected from the group consisting of - (CH2) 1-12-, - (CH2) 1-12-O-, -O- (CH2) 1-12-, -O- (CH2) 1-12-O-, - (CH2) 1-12-O- (CH2) 1-12-and (C1-4 alkylene-O) p- (CH2) 1-12;
R4a is optionally further substituted with 1, 2 or 3 R#group (s) ;
R4b is -NH-, -O-or -C (O) -;
R#is selected from the group consisting of H, halogen, C1-6 alkyl and C1-6 haloalkyl;
p is 1, 2 or 3;
still alternatively,
Ra and Rb are H;
R4a is - (CH2) 2-12-;
R4b is -NH-;
R4a is optionally further substituted with 1 or 2 R#group (s) ;
R#is selected from the group consisting of H, halogen and C1-4 alkyl.
In some embodiments, the chemical moiety comprises a structure of formula (V) :
wherein R1, R2 and R3 are as defined above.
In some embodiments, the chemical moiety comprises a structure of formula (VI) :
wherein, the PEGm is R1c is selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl, m is an integer in range of 1 to 1000, 100 to 500 or 400 to 500.
In some embodiments, the PEGm is a linear polyethylene glycol having a molecular weight of about 20000.
In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified by the chemical moiety at a residue corresponding to the residue selected from the group consisting of R12, L15, M16, R22, L26, F27, L30, R33, R33, H34, D35, A145, M148, R149, S152, L153, and N156 of SEQ ID NO: 1.
In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof comprises an amino acid substitution with a cysteine at a position corresponding to the position selected from the group consisting of R12, L15, M16, R22, L26, F27, L30, R33, R33, H34, D35, A145, M148, R149, S152, L153, and N156 of SEQ ID NO: 1, and the chemical moiety is linked to the IFNα2b or the functional fragment via the cysteine.
In some embodiments, the R4 of the chemical moiety is linked to the S atom of the cysteine residue via a maleimide, an acetylene, a vinyl, a mono-substituted butenedioic acid, or a disubstituted maleimide.
In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is conjugated to a biomolecule specifically binding to a target. In some embodiments, the IFNα2b or the  functional fragment thereof is conjugated to the biomolecule directly. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is conjugated to the biomolecule via a linker.
In some embodiments, the biomolecule comprises an antibody or an antigen binding fragment thereof. In some embodiments, the antibody or the antigen binding fragment thereof is selected from the group consisting of a full-length antibody, a Fab, Fab’, a F (ab’) 2, a Fd, a Fd’, a Fv, a scFv, a ds-scFv, a sdAb and a nanobody.
In some embodiments, the target is PD-L1 or PD-1. In some embodiments, the biomolecule comprises a sdAb comprising a CDR1, a CDR2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 6, and the CDR1, CDR2 and CDR3 are according to Kabat numbering scheme. In some embodiments, the biomolecule comprises a sdAb comprising:
(i) a CDR1 comprising the amino acid sequence of FRHYVMG (SEQ ID NO: 3) ,
(ii) a CDR2 comprising the amino acid sequence of AISWSGSGSYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) , and 
(iii) a CDR3 comprising the amino acid sequence of DMTTRMSQASREYDY (SEQ ID NO: 5) .
In some embodiments, the biomolecule comprises a sdAb, and the sdAb comprises a sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO: 6.
In some embodiments, the target is PD-L1 or PD-1. In some embodiments, the biomolecule comprises a sdAb comprising a CDR1, a CDR2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 6, and the CDR1, CDR2 and CDR3 are according to Kabat numbering scheme. In some embodiments, the biomolecule comprises a sdAb comprising:
(i) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SGTQFSDSKID (SEQ ID NO: 50) ,
(ii) a CDR2 comprising the amino acid sequence of GIFQTGSTIYEDSVKG (SEQ ID NO: 51) , and
(iii) a CDR3 comprising the amino acid sequence of IGRGTLA (SEQ ID NO: 52) .
In some embodiments, the biomolecule comprises a sdAb, and the sdAb comprises a sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO: 49.
In some embodiments, the biomolecule further comprises a Fc region.
In some embodiments, the IFNα2b comprises the amino acid sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
Also provided, in some embodiments, is a multi-functional polypeptide, comprising an IFNα2b or a functional fragment thereof of the present disclosure, and an antibody or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the multi-functional polypeptide includes a single copy of the IFNα2b or functional fragment thereof. In some embodiments, the multi-functional polypeptide comprises an Fc fragment.
In some embodiments, the IFNα2b or a functional fragment thereof is disposed on the C-terminal side of the Fc fragment. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is disposed on the N-terminal side of the Fc fragment. In some embodiments, the Fc fragment comprises knob-in-hole substitutions as compared to the corresponding wild-type Fc fragment.
In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof has specificity to a tumor associated antigen or immune checkpoint protein. In some embodiments, the tumor associated antigen is selected from the group consisting of EGFR, Her2, EpCAM, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD133, CD73, CEA, gpA33, Mucins, TAG-72, CIX, PSMA, folate-binding protein, GD2, GD3, GM2, VEGF, VEGFR, Integrin, αVβ3, α5β1, ERBB2, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Tenascin, and Claudin 18.2.
In some embodiments, the immune checkpoint protein is selected from the group consisting of PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, CD28, CD122, 4-1BB, TIM3, OX-40, OX40L, CD40, CD40L, LIGHT, ICOS, ICOSL, GITR, GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM, BTLA, KIR, and CD47. In some embodiments, antibody or antigen-binding fragment thereof is an anti-PD-L1 or anti-PD-1 single domain antibody (sdAb) .
Also provided, in one embodiment, is an immunoconjugate comprising a multi-functional polypeptide of the present disclosure, conjugated with a chemical moiety.
In some embodiments, the chemical moiety comprises a structure of formula (VI) :
wherein, the PEGm is R1c is selected from the group consisting of H, C1-4  alkyl and C1-4 haloalkyl, m is an integer in range of 1 to 1000, 100 to 500 or 400 to 500; alternatively, the PEGm is a linear polyethylene glycol having a molecular weight of about 20000.
In some embodiments, the immunoconjugate further comprises a Fc region.
In a third aspect, provided is a polynucleotide encoding the polypeptide of any one of the present application, or the immunoconjugate of the present application.
In a fourth aspect, provided is a vector comprising the polynucleotide of the present application.
In a fifth aspect, provided is a host cell comprising the vector of the present application.
In a sixth aspect, provided is a pharmaceutical composition comprising the polypeptide, the immunoconjugate, or the polynucleotide of the present application.
In a seventh aspect, provided is a method for treating a disorder in a subject in need thereof, comprising administrating an effective amount of the polypeptide, the immunoconjugate, or the nucleic acid of the present application to the subject. In some embodiments, the disorder is cancer.
It is to be understood that one, some, or all of the properties of the various embodiments described herein may be combined to form other embodiments of the present disclosure. These and other aspects of the disclosure will become apparent to one of skill in the art. These and other embodiments of the disclosure are further described by the detailed description that follows.
BRIEF DESCRIPTIONS OF THE DRAWINGS
FIG. 1 illustrates exemplary immunoconjugates of the present application in different formats.
FIG. 2A-2B illustrate an exemplary structure of the immunoconjugates of the present application comprising an IFNα2b modified by a chemical moiety, and SDS-PAGE of the immunoconjugate.
FIG. 3A-3B illustrate binding affinity of the immunoconjugates of the present application with PD-L1.
FIG. 4 illustrates activation of PD-1/PD-L1 signaling by the immunoconjugates of the present application.
FIG. 5A-5B illustrate binding affinity of the immunoconjugates of the present application with IFN receptors.
FIG. 6A-6B illustrate activation of Type I interferon signaling by the immunoconjugates of the present application.
FIG. 7A-7B illustrate a system for evaluating in vitro anti-tumor efficacy, and the in vitro tumor killing efficacy of the immunoconjugates of the present application.
FIG. 8 illustrates in vivo tumor inhibition of the immunoconjugates of the present application.
FIG. 9 illustrates toxicology analysis of the immunoconjugates of the present application.
FIG. 10 illustrate the structures of two bi-functional polypeptides.
FIG. 11 shows the activity testing results for the bi-functional polypeptides and their counterpart immunoconjugates with respect to binding to interferon receptors.
FIG. 12 shows the activity testing results for the bi-functional polypeptides and their counterpart immunoconjugates with respect to inhibition of PD-L1/PD-1 signaling.
FIG. 13 shows the in vivo tumor inhibition activities of these bi-functional polypeptides and their counterpart immunoconjugates in a SCID RKO animal model.
DETAILED DESCRIPTION
Definitions
Before describing the embodiments in detail, it is to be understood that the present disclosure is not limited to particular compositions or biological systems, which can, of course, vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to be limiting.
As used in this specification and the appended claims, the singular forms “a” , “an” and “the” include plural referents unless the content clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “a molecule” optionally includes a combination of two or more such molecules, and the like.
The term “about” as used herein refers to the usual error range for the respective value readily known to the skilled person in this technical field. Reference to “about” a value or parameter herein includes (and describes) embodiments that are directed to that value or parameter per se.
It is understood that aspects and embodiments of the present disclosure include “comprising, ” “consisting, ” and “consisting essentially of” aspects and embodiments.
As used herein, the term “antibody” is used in the broadest sense and specifically covers intact antibodies (e.g., full length antibodies) , antibody fragments (including without limitation Fab, F (ab’) 2, scFv, scFv-Fc, single domain antibodies (sdAb, also known as nanobody) , single heavy chain antibodies, and single light chain antibodies) , monoclonal antibodies, and polyclonal antibodies, so long as they exhibit the desired biological activity (e.g., epitope binding) .
As used herein, the term “isolated” antibody may refer to an antibody that is substantially free of other cellular material. In one embodiment, an isolated antibody is substantially free of other proteins from the same species. In another embodiment, an isolated antibody is expressed by a cell from a different species and is substantially free of other proteins from the different species. In some embodiments, an “isolated” antibody is one which has been identified and separated and/or recovered from a component of its natural environment. Contaminant components of its natural environment are materials which would interfere with diagnostic or therapeutic uses for the antibody, and may include enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. An antibody may be rendered substantially free of naturally associated components (or components associated with the cellular expression system used to produce the antibody) by isolation, using protein purification techniques well known in the art. In some embodiments, the antibody will be purified (1) to greater than 75%by weight of antibody as determined by the Lowry method, and most preferably more than 80%, 90%, 95%or 99%by weight, or (2) to homogeneity by SDS-PAGE under reducing or nonreducing conditions using Coomassie blue or, preferably, silver stain. Isolated antibody includes the antibody in situ within recombinant cells since at least one component of the antibody’s natural environment will not be present. Ordinarily, however, isolated antibody will be prepared by at least one purification step.
As used herein, the term “native antibodies and immunoglobulins” are usually heterotetrameric glycoproteins of about 150,000 daltons, composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Each light chain is linked to a heavy chain by one  covalent disulfide bond (also termed a “VH/VL pair” ) , while the number of disulfide linkages varies between the heavy chains of different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain also has regularly spaced intrachain disulfide bridges. Each heavy chain has at one end a variable domain (VH) followed by a number of constant domains. Each light chain has a variable domain at one end (VL) and a constant domain at its other end; the constant domain of the light chain is aligned with the first constant domain of the heavy chain, and the light chain variable domain is aligned with the variable domain of the heavy chain. Particular amino acid residues are believed to form an interface between the light-and heavy-chain variable domains. See, e.g., Chothia et al., J. Mol. Biol., 186: 651 (1985) ; Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 4592 (1985) .
As used herein, the term “variable” refers to the fact that certain portions of the variable domains differ extensively in sequence among antibodies and are used in the binding and specificity of each particular antibody for its particular antigen. However, the variability is not evenly distributed throughout the variable domains of antibodies. It is concentrated in three segments called complementarity-determining regions (CDRs) or hypervariable regions both in the light-chain and the heavy-chain variable domains. The more highly conserved portions of variable domains are called the framework (FR) . The variable domains of native heavy and light chains each comprise four FR regions, largely adopting a β-sheet configuration, connected by three CDRs, which form loops connecting, and in some cases forming part of, the β-sheet structure. The CDRs in each chain are held together in close proximity by the FR regions and, with the CDRs from the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding site of antibodies. See, e.g., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991) . The constant domains are not involved directly in binding an antibody to an antigen, but exhibit various effector functions, such as participation of the antibody in antibody-dependent cellular toxicity. Variable region sequences of interest include the humanized variable region sequences for CD47 antibodies described in detail elsewhere herein.
The term “hypervariable region (HVR) ” or “complementarity determining region (CDR) ” may refer to the subregions of the VH and VL domains characterized by enhanced sequence variability and/or formation of defined loops. These include three CDRs in the VH domain (H1, H2, and H3) and three CDRs in the VL domain (L1, L2, and L3) . H3 is believed to be critical in imparting fine binding specificity, with L3 and H3 showing the highest level of diversity. See Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human  Press, Totowa, N.J., 2003) .
A number of CDR/HVR delineations are known. The Kabat Complementarity Determining Regions (CDRs) are based on sequence variability and are the most commonly used (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . Chothia refers instead to the location of the structural loops (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) ) . The AbM HVRs represent a compromise between the Kabat HVRs and Chothia structural loops, and are used by Oxford Molecular’s AbM antibody modeling software. The “contact” HVRs are based on an analysis of the available complex crystal structures. The residues from each of these HVRs/CDRs are noted below. “Framework” or “FR” residues are those variable domain residues other than the HVR/CDR residues
“Extended” HVRs are also known: 24-36 or 24-34 (L1) , 46-56 or 50-56 (L2) and 89-97 or 89-96 (L3) in the VL and 26-35 (H1) , 50-65 or 49-65 (H2) and 93-102, 94-102, or 95-102 (H3) in the VH (Kabat numbering) .
“Numbering according to Kabat” may refer to the numbering system used for heavy chain variable domains or light chain variable domains of the compilation of antibodies in Kabat et al., supra. The actual linear amino acid sequence may contain fewer or additional amino acids corresponding to a shortening of, or insertion into, a FR or HVR of the variable domain. The Kabat numbering of residues may be determined for a given antibody by alignment at regions of homology of the sequence of the antibody with a “standard” Kabat numbered sequence. Typically, the Kabat numbering is used when referring to a residue in the variable domains (approximately residues 1-107 of the light chain and residues 1-113 of the heavy chain) , whereas the EU numbering system or index (e.g., the EU index as in Kabat, numbering according to EU IgG1) is generally used when referring to a residue in the heavy chain constant  region.
As used herein, the term “antibody fragment” , and all grammatical variants thereof, are defined as a portion of an intact antibody comprising the antigen binding site or variable region of the intact antibody which, in certain instances, is free of the constant heavy chain domains (i.e. CH2, CH3, and/or CH4, depending on antibody isotype) of the Fc region of the intact antibody. Examples of antibody fragments include Fab, Fab’, Fab’-SH, F (ab’) 2, and Fv fragments; diabodies; any antibody fragment that is a polypeptide having a primary structure consisting of one uninterrupted sequence of contiguous amino acid residues (referred to herein as a “single-chain antibody fragment” or “single chain polypeptide” ) , including without limitation (1) single-chain Fv (scFv) molecules, (2) single chain polypeptides containing only one light chain variable domain, or a fragment thereof that contains the three CDRs of the light chain variable domain, without an associated heavy chain moiety, and (3) single chain polypeptides containing only one heavy chain variable region, or a fragment thereof containing the three CDRs of the heavy chain variable region, without an associated light chain moiety. In an antibody fragment comprising one or more heavy chains, the heavy chain (s) can contain any constant domain sequence (e.g. CH1 in the IgG isotype) found in a non-Fc region of an intact antibody, and/or can contain any hinge region sequence found in an intact antibody, and/or can contain a leucine zipper sequence fused to or situated in the hinge region sequence or the constant domain sequence of the heavy chain (s) .
The Fab fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. Fab’ fragments differ from Fab fragments by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain including one or more cysteines from the antibody hinge region. Fab’-SH is the designation herein for Fab’ in which the cysteine residue (s) of the constant domains bear a free thiol group. F (ab’) 2 antibody fragments originally were produced as pairs of Fab’ fragments which have hinge cysteines between them. Other chemical couplings of antibody fragments are also known.
A single-domain antibody (sdAb) , also known as a nanobody, is an antibody fragment consisting of a single monomeric variable antibody domain. Like a whole antibody, it is able to bind selectively to a specific antigen. With a molecular weight of only 12-15 kDa, single-domain antibodies are much smaller than common antibodies (150-160 kDa) which are composed of two heavy protein chains and two light chains, and even smaller than Fab fragments (～50 kDa, one light chain and half a heavy chain) and single-chain variable fragments (～25 kDa, two variable domains, one from a light and one from a heavy chain) . The first  single-domain antibodies were engineered from heavy-chain antibodies found in camelids; these are called VHH fragments.
The term “specific binding” as used herein refers to that the binding is selective for the antigen/receptor and can be discriminated from unwanted or non-specific interactions. The ability of the binding pair can be measured either through an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or other techniques known to the art, e.g. Surface Plasmon Resonance (SPR) technique (analyzed on a BIACORE instrument) , and additional binding assays. In some embodiments, the extent of binding of an antibody/cytokine to an unrelated protein is less than about 10%of the binding to the antigen/receptor as measured, e.g. by SPR. In some embodiments, an immunoglobulin/cytokine that binds to the antigen/receptor has a dissociation constant (KD) of ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, or ≤0.001 nM (e.g. 10-8 M or less, e.g. from 10-8 M to 10-13 M, e.g. from 10-9 M to 10-13 M) .
As used herein, the term “affinity” or “binding affinity” refers to the strength of the sum total of non-covalent interactions between a single binding site of a molecule (e.g. an antibody or cytokine) and its binding partner (e.g. an antigen or receptor) . Unless indicated otherwise, as used herein, “binding affinity” refers to intrinsic binding affinity which reflects a 1: 1 interaction between members of a binding pair (e.g. antibody and antigen) . The affinity of a molecule X for its partner Y can generally be represented by the dissociation constant (KD) , which is the ratio of dissociation and association rate constants (koff and kon, respectively) . Thus, equivalent affinities may comprise different rate constants, as long as the ratio of the rate constants remains the same. Affinity can be measured by common methods known in the art, including those described herein.
“Reduced binding” , for example reduced binding to an IFN receptor, refers to a decrease in affinity for the respective interaction, as measured for example by SPR or ELISA. For clarity, the term also includes reduction of the affinity to zero (or below the detection limit of the analytic method) , i.e. complete abolishment of the interaction. Conversely, “increased binding” refers to an increase in binding affinity for the respective interaction.
As used herein, the term “treatment” refers to clinical intervention designed to alter the natural course of the individual or cell being treated during the course of clinical pathology. Desirable effects of treatment include decreasing the rate of disease progression, ameliorating or palliating the disease state, and remission or improved prognosis. For example, an individual  is successfully “treated” if one or more symptoms associated with cancer are mitigated or eliminated, including, but are not limited to, reducing the proliferation of (or destroying) cancerous cells, decreasing symptoms resulting from the disease, increasing the quality of life of those suffering from the disease, decreasing the dose of other medications required to treat the disease, and/or prolonging survival of individuals. In some embodiments, “treating” a disease such as cancer refers to delaying progression of the disease, i.e., deferring, hindering, slowing, retarding, stabilizing, and/or postponing development of the disease (such as cancer) . This delay can be of varying lengths of time, depending on the history of the disease and/or individual being treated. As is evident to one skilled in the art, a sufficient or significant delay can, in effect, encompass prevention, in that the individual does not develop the disease. For example, a late stage cancer, such as development of metastasis, may be delayed.
As used herein, the term “percent (%) amino acid sequence identity” with respect to a sequence is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical with the amino acid residues in the specific sequence, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved in various ways that are known to the art, for instance, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared.
As used herein, the term “substituting” or “substitution of an amino acid” as used herein refers to substituting the original amino acid residue for one or more other amino acid residue (s) .
An “effective amount” is at least the minimum amount required to effect a measurable improvement or prevention of a particular disease (e.g., cancer) . An effective amount herein may vary according to factors such as the disease state, age, sex, and weight of the patient, and the ability of a therapeutic agent (or combination of therapeutic agents) to elicit a desired response in the individual. An effective amount is also one in which any toxic or detrimental effects of the treatment are outweighed by the therapeutically beneficial effects. For therapeutic use, beneficial or desired results include clinical results such as decreasing one or more symptoms resulting from the disease, increasing the quality of life of those suffering from the disease, decreasing the dose of other medications required to treat the disease, enhancing effect  of another medication such as via targeting, delaying the progression of the disease, and/or prolonging survival. In the case of cancer or tumor, an effective amount of the drug may have the effect in reducing the number of cancer cells; reducing the tumor size; inhibiting (i.e., slow to some extent or desirably stop) cancer cell infiltration into peripheral organs; inhibit (i.e., slow to some extent and desirably stop) tumor metastasis; inhibiting to some extent tumor growth; and/or relieving to some extent one or more of the symptoms associated with the disorder. An effective amount can be administered in one or more administrations. For purposes of this disclosure, an effective amount of drug, compound, or pharmaceutical composition is an amount sufficient to accomplish therapeutic treatment either directly or indirectly. As is understood in the clinical context, an effective amount of a drug, compound, or pharmaceutical composition may or may not be achieved in conjunction with another drug, compound, or pharmaceutical composition. Thus, an “effective amount” may be considered in the context of administering one or more therapeutic agents, and a single agent may be considered to be given in an effective amount if, in conjunction with one or more other agents, a desirable result may be or is achieved.
As used herein, the term “drug antibody ratio” or “DAR” , refers to the number of chemical moieties conjugated to a polypeptide of the instant disclosure. For instance, when DAR is 1 (DAR1) , a single chemical moiety is conjugated to one of the chains of a bifunctional polypeptide of the instant disclosure, on average. Likewise, when DAR is 2 (DAR2) , an average of two chemical moieties are conjugated to the bifunctional polypeptide of the instant disclosure. The DAR can range from 1 to 4, although higher loads, e.g., 10, are also possible depending on the number of linkage site in the polypeptide.
As used herein, the term “subject” for purposes of treatment refers to any animal classified as a mammal, including humans, domestic and farm animals, and zoo, sports, or pet animals, such as dogs.
Interferons and Attenuated Interferons
Interferons (IFNs) belong to the large class of proteins known as cytokines, molecules used for communication between cells to trigger the protective defenses of the immune system. IFNs are named for their ability to “interfere” with viral replication by protecting cells from virus infections. They also have various other functions, including activating immune cells such as natural killer cells and macrophages, and increasing host defenses by up-regulating antigen presentation by virtue of increasing the expression of major histocompatibility complex (MHC)  antigens.
More than twenty distinct IFN genes and proteins have been identified in animals, including humans. They are typically divided among three classes: Type I IFN, Type II IFN, and Type III IFN. Human IFNα2b belongs to Type I IFN, which are clustered on chromosome 9p. It signals through a heterodimeric complex of interferon α/β receptor 1 (IFNAR1) and interferon α/β receptor 2 (IFNAR2) to elicit TYK2 and JAK1 activation, thereby triggers a cascade of immune related interferon stimulating genes (ISGs) which are critical for immune activation.
Several different types of interferon therapy have been approved for use in humans. For example, in January 2001, the Food and Drug Administration (FDA) approved Pegintron, a PEGylated interferon-alpha-2b. Approval for Pegasys, a PEGylated interferon-alpha-2a, followed in October 2002. The PEGylated drug could prolong in vivo half-life of interferon, and can be injected once weekly, rather than administering two or three times per week as is necessary for conventional interferon-alpha. When used with the antiviral drug ribavirin, PEGylated interferon is effective in treatment of hepatitis C. Interferon therapy has been developed and used in combination with chemotherapy and radiation as a treatment for some cancers, including hematological malignancy such as leukemia and lymphomas, chronic myeloid leukemia, nodular lymphoma, and cutaneous T-cell lymphoma, as well as melanomas. However, patients on the therapy normally suffer from adverse effects. Therefore, modified IFNα2b with reduced adverse effects and improved efficacy is in need in clinical.
In one aspect, provided herein is an IFNα2b or a functional fragment thereof that is modified to attenuate activity. As demonstrated in the experimental examples, such attenuated IFNα2b or functional fragments thereof not only had greatly improved safety, they also demonstrated excellent treatment effects. In fact, when adopted into a bifunctional polypeptide that further contained an PD-L1 moiety, the resulting molecule (e.g., 112_08-IFM-knob) demonstrated superior in vivo anti-tumor activities over Tecentriq in combination with PEGylated interferon alpha (Tecentriq +PEG-IFNa) (see, e.g., FIG. 12) .
Accordingly, in one embodiment of the present disclosure, provided is a modified IFNα2b (as compared to the wild-type IFNα2b protein, such as the human IFNα2b protein) or a functional fragment thereof that has reduced binding affinity to interferon α/β receptor. In some embodiments, the interferon α/β receptor is selected from IFNAR1, IFNAR2, and the  combination thereof. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified to attenuate binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with IFNAR1. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified to attenuate binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with IFNAR2. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified to attenuate binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with IFNAR1 and IFNAR2.
In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is attenuated such that its affinity to the interferon α/β receptor is attenuated by at least about 10 folds, at least about 102 folds, at least about103 folds, at least about 104 folds, or at least about 105 folds. In some embodiments, the binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with IFNAR1 is reduced by at least about 10 folds, at least about 102 folds, at least about103 folds, at least about 104 folds or at least about 105 folds. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified to attenuate binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with IFNAR2 by at least about 10 folds, at least about 102 folds, at least about103 folds, at least about 104 folds or at least about 105 folds. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified to attenuate binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with IFNAR2 by at least about 10 folds. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified to attenuate binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with IFNAR2 by at least about 102 folds. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified to attenuate binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with IFNAR2 by at least about103 folds. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified to attenuate binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with both IFNAR1 and IFNAR2 by at least about 10 folds, at least about 102 folds, at least about103 folds, at least about 104 or at least about 105 folds.
In some embodiments, the binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with interferon α/β receptor is attenuated to reduce adverse effect of the IFNα2b or the functional fragment thereof after administration to a subject in need thereof. In some embodiments, the adverse effect includes acute toxicity, subacute side effect and chronic side effect. In some embodiments, the acute toxicity includes the flu-like symptoms such as fever, chills, myalgia, headache, and nausea. In some embodiments, the subacute side effect includes but is not limited to hematological side effects such as anemia, decrease in leukocyte and platelet counts and decreased platelet aggregation; hepatic side effects such as raised  transaminases and inhibition of cytochrome P450 enzymes; gastro-intestinal side effects such as loss of appetite, nausea, vomiting and diarrhea; psychiatric side effects such as depression, difficulties in cognition and delirium; neurological side effects such as seizures, neuropathies, multiple-sclerosis like disease and mysthenia gravis; renal side effects such as proteinuria; cardiovascular side effects such as arrythmias, ischemic heart disease, cardiomyopathy and retinal abnormalities; pulmonary side effects such as pneumonitis; endocrine side effects such as thyroid disorder, diabetes mellitus, decrement of sex hormone levels and hypopituitarism; dermatological side effects such as alopecia, erythema and induration at injection site, rash, pruritus, vitiligo, lichen planus, psoriasis.
In some embodiments, the side effect includes autoimmune disorders such as thyroid disorder, liver dysfunction, connective tissue diseases, dermatological disorders, hematologic disorders, neurological disorders, pulmonary disorder and metabolic disorder. In some embodiments, the side effect results in disorders including but not limited to subacute lymphocytic thyroiditis, graves’ disease, permanent hypothyroidism, autoimmune hepatitis, primary biliary cirrhosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, psoriasis, leucocytoclastic vasculitis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thrombocytopenia, inflammatory demyelinating polyneuropathy, multiple sclerosis-like disease, axonal neuropathy and hearing loss, bell’s palsy, mononeuropathy multiplex, myasthenia gravis, abducent nerve paralysis, interstitial pneumonitis and diabetes mellitus.
In another aspect, provided herein is a polypeptide comprising an IFNα2b or a functional fragment thereof, wherein the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified to attenuate activation of Type I interferon signaling induced by the IFNα2b or the functional fragment thereof. In some embodiments, the activation of INFα signaling is attenuated by at least 10 folds, 102 folds, 103 folds, 104 or 105 folds. In some embodiments, the activation of INFα signaling is attenuated by at least 102 folds. In some embodiments, the activation of INFα signaling is attenuated by at least 103 folds. In some embodiments, the activation of INFα signaling is attenuated by at least 104 folds.
In some embodiments, the activation of Type I interferon signaling is attenuated to reduce adverse effect of the IFNα2b or the functional fragment thereof after administration to a subject in need thereof. In some embodiments, the adverse effect includes acute toxicity, subacute side effect and chronic side effect. In some embodiments, the acute toxicity includes the flu-like symptoms such as fever, chills, myalgia, headache, and nausea. In some  embodiments, the subacute side effect includes but is not limited to hematological side effects such as anemia, decrease in leukocyte and platelet counts and decreased platelet aggregation; hepatic side effects such as raised transaminases and inhibition of cytochrome P450 enzymes; gastro-intestinal side effects such as loss of appetite, nausea, vomiting and diarrhea; psychiatric side effects such as depression, difficulties in cognition and delirium; neurological side effects such as seizures, neuropathies, multiple-sclerosis like disease and mysthenia gravis; renal side effects such as proteinuria; cardiovascular side effects such as arrythmias, ischemic heart disease, cardiomyopathy and retinal abnormalities; pulmonary side effects such as pneumonitis; endocrine side effects such as thyroid disorder, diabetes mellitus, decrement of sex hormone levels and hypopituitarism; dermatological side effects such as alopecia, erythema and induration at injection site, rash, pruritus, vitiligo, lichen planus, psoriasis.
In some embodiments, the side effect includes autoimmune disorders such as thyroid disorder, liver dysfunction, connective tissue diseases, dermatological disorders, hematologic disorders, neurological disorders, pulmonary disorder and metabolic disorder. In some embodiments, the side effect results in disorders including but not limited to subacute lymphocytic thyroiditis, graves’ disease, permanent hypothyroidism, autoimmune hepatitis, primary biliary cirrhosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, psoriasis, leucocytoclastic vasculitis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thrombocytopenia, inflammatory demyelinating polyneuropathy, multiple sclerosis-like disease, axonal neuropathy and hearing loss, bell’s palsy, mononeuropathy multiplex, myasthenia gravis, abducent nerve paralysis, interstitial pneumonitis and diabetes mellitus.
In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified to improve the performance of the polypeptide after administration to a subject in need thereof. In some embodiments, the performance includes but is not limited to pharmacokinetics (PK) , pharmacodynamics (PD) , efficacy, and safety. In some embodiments, the efficacy includes anti-tumor efficacy. In some embodiments, the anti-tumor efficacy includes but is not limited to inhibiting tumor growth, reducing tumor volume, increasing survival of a subject and inducing protection against tumor recurrence.
In some embodiments, the modification includes introducing an amino acid mutation to wild type IFNα2b (SEQ ID NO: 1) . The term “amino acid mutation” as used herein is meant to encompass amino acid substitutions, deletions, insertions, and modifications. Any combination of substitution, deletion, insertion, and modification can be made to arrive at the polypeptide of  the present application, provided that the polypeptide possesses the desired characteristics, e.g., reduced binding to IFNAR1 and/or IFNAR2, or reduced activation of Type I interferon signaling.
In some embodiments, the amino acid mutations are amino acid substitutions. In some embodiments, the polypeptide of the present application is obtained by replacing one amino acid with another amino acid having different structural and/or chemical properties. In some embodiments, the amino acid substitutions include replacing a hydrophobic by a hydrophilic amino acid. In some embodiments, the amino acid substitutions include replacement by non-naturally occurring amino acids or by naturally occurring amino acid derivatives of the twenty standard amino acids (e.g. 4-hydroxyproline, 3-methylhistidine, ornithine, homoserine, 5-hydroxylysine) . Standard amino acids, the abbreviations and the properties thereof are as listed in Table 1 below.
Table 1. Standard amino acids
It is contemplated that amino acid residues on the binding interface of IFNα2b to its binding target play important roles in the binding. Accordingly, substitution of one or more of such residues to a non-conservative amino acid can attenuate the binding affinity or biological activity of IFNα2b. Amino acid residues on the binding interface of IFNα2b are known. For instance, Thomas et al. “Structural linkage between ligand discrimination and receptor activation by type I interferons, ” Cell (2011) 146 (4) : 621-32 reported that residues R12, L15,  M16, R22, L26, F27, L30, R33, H34, D35, A145, M148, R149, S152, L153, and N156 are located on the binding interface.
In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof of the present disclosure includes an amino acid substitution at one or more residues of R12, L15, M16, R22, L26, F27, L30, R33, H34, D35, A145, M148, R149, S152, L153, and N156 (location according to SEQ ID NO: 1) . In some embodiments, the substitution is a non-conservative substitution. In some embodiments, the substitution is with cysteine (C) which has the added benefit of serving as the site for conjugation.
In some embodiments, it is contemplated that substitutions at residues C29, D35, R144, or E146 of SEQ ID NO: 1 can achieve the same purpose. In some embodiments, therefore, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified by an amino acid substitution at C29, D35, R144, or E146 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the substitution is a non-conservative substitution.
In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified at the residue corresponding to S152 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified by an amino acid substitution at S152 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the modification comprises an amino acid substitution with cysteine (C) at S152 of SEQ ID NO: 1.
In some embodiments, the IFNα2b or fragment thereof comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%identity with the sequence of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the IFNα2b comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the IFNα2b comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%identity with the sequence of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the IFNα2b comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
In some embodiments, the IFNα2b or fragment thereof comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%identity with the sequence of SEQ ID NO: 1, while retaining any one or more of the substitutions as disclosed herein. For instant, the amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%identity with the sequence of SEQ ID NO: 1 includes one or more substitutions at R12, L15, M16, R22, L26, F27, L30,  R33, H34, D35, A145, M148, R149, S152, L153, and/or N156 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the substitution is with a cysteine (C) residue. In some embodiments, the amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%identity with the sequence of SEQ ID NO: 1 includes a cysteine (C) residue at residue 152.
Multi-Functional Polypeptides
It is demonstrated herein that the modified IFNα2b or the functional fragment thereof can be suitably incorporated into a bi-for multi-functional polypeptide that includes one or more biological moieties, such as antibodies and cytokines.
In a particular embodiment, multifunctional polypeptide includes one or more of the IFNα2b or the functional fragment thereof and one or more antibodies. In some embodiments, the multifunctional polypeptide further includes an Fc fragment, such as a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 Fc (CH2 and CH3) . Multiple formats of these multifunctional polypeptides have been tested, as illustrated in FIG. 1 and 10.
In one embodiment, the multifunctional polypeptide is symmetric and includes two identical polypeptide chains. Each chain includes an antibody or antigen-binding fragment, a Fc portion, and an IFNα2b or the functional fragment thereof. In some embodiments, in each peptide chain, both the antibody/fragment and the IFNα2b or the functional fragment thereof are located at the N-terminal side of the Fc fragment (Format 1) . In some embodiments, the antibody/fragment is located at the N-terminal side of the Fc fragment, while the IFNα2b or the functional fragment thereof is located at the C-terminal side of the Fc fragment (Format “L1IF” ) .
In one embodiment, the multifunctional polypeptide is asymmetric and includes two polypeptide chains that have different sequences. In some of aspects of this embodiment, the multifunctional polypeptide includes just one copy of the IFNα2b or the functional fragment thereof. In other words, only one peptide chain includes the IFNα2b or the functional fragment thereof, while the other peptide chain does not. In some of these asymmetric formats, e.g., Formats 2 and 3, the single copy of the IFNα2b or the functional fragment thereof is located at the C-terminal side of one of the two chains of the Fc fragment, while each chain further contains an antibody/fragment at the N-terminal end. Knob-in-hole substitutions can be made to improve proper pairing of these asymmetric peptides.
In Formats 3-5, the single copy of the IFNα2b or the functional fragment thereof is  placed at the N-terminal side of the Fc fragment, either between one of the antibodies/fragments and the Fc (Format 6) , or the far N-terminal side of both (Format 5) , or the Fc (Format 4) .
The symmetric format “L1IF” proved to an excellent format, demonstrating potent in vitro and in vivo activities with excellent safety profile (Examples 2-9) . Formats 1 and 2 (asymmetric with a single IFNα2b or fragment at the C-terminal side of the Fc) exhibited even greater anti-tumor activities (see, e.g., FIG. 13) , including polypeptides alone, or further with conjugated chemical moieties.
In accordance with one embodiment of the present disclosure, therefore, provided is a multi-functional polypeptide that includes an IFNα2b or a functional fragment thereof of the present disclosure and an antibody or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the multi-functional polypeptide includes two or more of the IFNα2b or functional fragments thereof. In a preferred embodiment, the multi-functional polypeptide includes a single copy of the IFNα2b or functional fragment thereof.
In some embodiments, the multi-functional polypeptide includes an Fc fragment. In some embodiments, the IFNα2b or a functional fragment thereof is disposed on the C-terminal side of the Fc fragment. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is disposed on the N-terminal side of the Fc fragment.
In some embodiments, Fc fragment comprises knob-in-hole substitutions as compared to the corresponding wild-type Fc fragment. Example substitutions to implement the knob-in-hole include S354C: T366W (EU numbering) in the CH3 to form a knob and Y349C: T366S: Y407V (EU numbering) to make a hole.
In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof has specificity to a tumor associated antigen or immune checkpoint protein. Non-limiting examples of tumor associated antigen include EGFR, Her2, EpCAM, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD133, CD73, CEA, gpA33, Mucins, TAG-72, CIX, PSMA, folate-binding protein, GD2, GD3, GM2, VEGF, VEGFR, Integrin, aVb3, a5b1, ERBB2, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Tenascin, and Claudin 18.2.
Non-limiting examples immune checkpoint protein include PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, CD28, CD122, 4-1BB, TIM3, OX-40, OX40L, CD40, CD40L, LIGHT, ICOS, ICOSL, GITR, GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM, BTLA, KIR, and CD47. In a  particular embodiment, the immune checkpoint protein is PD-L1.
PD-L1/PD-1 antibodies
Programmed death-1 (PD-1) is a cell surface receptor that functions as a T cell checkpoint and plays a central role in regulating T cell exhaustion. Binding of PD-1 to its ligand, programmed death-ligand 1 (PD-L1) , activates downstream signaling pathways and inhibits T cell activation. Moreover, abnormally high PD-L1 expression on tumor cells and antigen-presenting cells in the tumor microenvironment mediates tumor immune escape. Immunotherapies that target PD-1/PD-L1 signaling pathway have shown unprecedented success in a wide variety of human cancers.
As used herein, the term “PD-1/PD-L1 antibody” refers to any antibody that blocks the binding of PD-L1 expressed on a cancer cell to PD-1 expressed on an immune cell (T cell, B cell or NKT cell) and preferably also blocks binding of PD-L2 expressed on a cancer cell to the immune-cell expressed PD-1. Alternative names or synonyms for PD-1 and its ligands include: PDCD1, PD1, CD279 and SLEB2 for PD-1; PDCD1L1, PDL1, B7H1, B7-4, CD274 and B7-H for PD-L1; and PDCD1L2, PDL2, B7-DC, and CD273 for PD-L2. PD-1/PD-L1 antibody that can be used in the present application includes but is not limited to a monoclonal antibody (mAb) , or antigen binding fragment thereof, which specifically binds to PD-1 or PD-L1, and preferably specifically binds to human PD-1 or human PD-L1. In some embodiments, the antibody includes but is not limited to a polyclonal antibody, a bispecific antibody, and a multispecific antibody. In some embodiments, the antigen binding fragment includes but is not limited to Fab, scFv, diabody, triabody, minibody, VHH, sdAb and nanobody.
Any suitable “PD-1 antibody” known in the art can be used in the present application. In some embodiments, the PD-1 antibody that can be used in the present application includes but is not limited to polyclonal antibody, monoclonal antibody, Fab, scFv, diabody, triabody, minibody, VHH, sdAb and nanobody. Exemplary PD-1 antibodies include but are not limited to pidilizumab, cemiplimab, sintilimab, cetrelimab, spartalizumab, camrelizumab, tislelizumab, balstilimab, toripalimab, dostarlimab, ABBV-181, penpulimab, pembrolizumab, genolimzumab, retifanlimab, sasanlimab, AMP-224, AB122, F-520, MEDI-3387, MEDI-5771, MEDI-0680, SG-001, nivolumab, BCD-100, BAT-1306, BI-754091, CBT-501, GLS-010, LZM-009, Sym-021, CS-1003, HLX-10, AK-103, AM-0001, ENUM-244C8, ENUM-388D4, JTX-4014, RXI-762, STI-A1110, HLX-20, SSI-361, APL-501, TJ0141H, SNA-01, and an antigen binding fragment thereof.
Any suitable “PD-L1 antibody” known in the art can be used in the present application. In some embodiments, the PD-L1 antibody that can be used in the present application includes but is not limited to polyclonal antibody, monoclonal antibody, Fab, scFv, diabody, triabody, minibody, VHH, sdAb and nanobody. Exemplary anti-PD-L1 antibodies include but are not limited to manelimab, atezolizumab, avelumab, cosibelimab, durvalumab, envafolimab, socazolimab, BGB-A333, CK-301, CS-1001, FAZ-053, APL-502, MDX-1105, IMC-001, KD-005, Gensci-047, LY-3300054, SHR-1316, MSB-2311, AVA-004, CBT-502, JS-003, B12, KY-1003, and an antigen binding fragment thereof.
In some embodiments, the “PD-L1” antibody used in the present application is a single domain antibody (sdAb, also referred as “nanobody” herein) . In some embodiments, the sdAb has binding specificity to the human PD-L1 protein and comprises a complementarity determining region 1 (CDR1) , a CDR2 and a CDR3. In some embodiments, the sdAb comprises a CDR1, a CDR2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the sdAb comprises a CDR1, a CDR2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 6, and the CDR1, CDR2 and CDR3 are according to Kabat numbering scheme. In some embodiments, the sdAb comprises a CDR1, a CDR2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 6, and the CDR1, CDR2 and CDR3 are according to IMGT numbering scheme. In some embodiments, the sdAb comprises a CDR1, a CDR2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 6, and the CDR1, CDR2 and CDR3 are according to Chothia numbering scheme.
In some embodiments of the PD-L1 antibody of the present application, the PD-L1 antibody comprises: (1) a CDR1 comprising the amino acid sequence of FRHYVMG (SEQ ID NO: 3) or an amino acid sequence with one or more substitutions as compared to SEQ ID NO: 3, (2) a CDR2 comprising the amino acid sequence of AISWSGSGSYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) or an amino acid sequence with one or more substitutions as compared to SEQ ID NO: 4, and (3) a CDR3 comprising the amino acid sequence of DMTTRMSQASREYDY (SEQ ID NO: 5) or an amino acid sequence with one or more substitutions as compared to SEQ ID NO: 5.
In some embodiments of the PD-L1 antibody of the present application, the PD-L1 antibody comprises the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 6, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity with SEQ ID NO: 6.
In some embodiments, the sdAb has binding specificity to the human PD-L1 protein and comprises a complementarity determining region 1 (CDR1) , a CDR2 and a CDR3. In some  embodiments, the sdAb comprises a CDR1, a CDR2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 49. In some embodiments, the sdAb comprises a CDR1, a CDR2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 49, and the CDR1, CDR2 and CDR3 are according to Kabat numbering scheme. In some embodiments, the sdAb comprises a CDR1, a CDR2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 49, and the CDR1, CDR2 and CDR3 are according to IMGT numbering scheme. In some embodiments, the sdAb comprises a CDR1, a CDR2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 49, and the CDR1, CDR2 and CDR3 are according to Chothia numbering scheme.
In some embodiments of the PD-L1 antibody of the present application, the PD-L1 antibody comprises: (1) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SGTQFSDSKID (SEQ ID NO: 50) or an amino acid sequence with one or more substitutions as compared to SEQ ID NO: 50, (2) a CDR2 comprising the amino acid sequence of GIFQTGSTIYEDSVKG (SEQ ID NO: 51) or an amino acid sequence with one or more substitutions as compared to SEQ ID NO: 51, and (3) a CDR3 comprising the amino acid sequence of IGRGTLA (SEQ ID NO: 52) or an amino acid sequence with one or more substitutions as compared to SEQ ID NO: 52.
In some embodiments of the PD-L1 antibody of the present application, the PD-L1 antibody comprises the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 49, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity with SEQ ID NO: 49.
Modification with Chemical Moiety
In some embodiments of the polypeptide of the present application, the IFNα2b or the functional fragment is modified by a chemical moiety. In some embodiments, the chemical moiety comprises a structure of formula (I) : R1-R2-R3-R4 (I) , wherein R1 is  which is optionally further substituted with 1, 2 or 3 R*group (s) ; L1 is selected from CH or N; R1a is absent, or is selected from the group consisting of - (CH2) 0-3-C (O) -, - (CH2) 0-3-OC (O) -, and - (CH2) 0-3-NHC (O) -; each R1b is independently absent, or is independently selected from the group consisting of -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, -C (O) O-, -C (O) NH-, -NH-C1-6 alkyl-, -O-C1-6 alkyl-, -C (O) -C1-6 alkyl-, -OC (O) -C1-6 alkyl-, -C (O) O-C1-6 alkyl-and -C (O) NH-C1-6 alkyl-; each R1c is independently selected from the group consisting of H, C1-6 alkyl, and C1-6 haloalkyl; m is an  integer in a range of 1 to 30000; R*is selected from H, halogen, C1-6 alkyl or C1-6 haloalkyl, C1-6 alkoxy, C2-6 alkenyl, or C2-6 alkynyl; R2 is a linker which is cleavable under tumor environment; R3 is X is selected from -NH-or -O-; Y is selected from -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, -C (O) -C (O) -or -NHC (O) -; each Rx and Ry is independently selected from H, halogen, C1-6 alkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 haloalkyl, C2-6 alkenyl or C2-6 alkynyl; n is 0, 1, 2, 3, 4, or 5; R4 is Ra and Rb are each independently selected from the group consisting of H, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl and C1-6 alkoxyl; R4a is absent, or is selected from the group consisting of - (CH2) 1-12-, - (CH2) 1-12-O-, -O- (CH2) 1-12-, -O- (CH2) 1-12-O-, - (CH2) 1-12-O- (CH2) 1-12-, (C1-6 alkylene-O) p- (CH2) 1-12, - (CH2) 1-12-C3-8 cycloalkylene-, - (CH2) 1-12-C3-8 cycloalkylene- (CH2) 1-12, - (CH2) 1-12-C6-10 arylene-, and - (CH2) 1-12-C6-10 arylene- (CH2) 1-12; R4a is optionally further substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 R#group (s) ; R4b is selected from the group consisting of -NH-, -O-, -C (O) -, -C (O) O-, -OC (O) -, -C (O) -C (O) -, -C (O) NH-or -NHC (O) -, as long as the chemistry permits; R#is selected from the group consisting of H, halogen, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C1-6 alkoxy, C2-6 alkenyl or C2-6 alkynyl; p is 1, 2, 3, 4 or 5; wherein R3 links to R2 via the X of R3, and links to R4 via the Y of R3.
R1
In a specific embodiment, R1 is such as which is optionally substituted; in another specific embodiment, R1 is in another specific embodiment, R1 isin another specific embodiment, R1 is in another specific embodiment, R1 is PEGm, which is a linear polyethylene glycol having a molecular weight of about 20000.
In a specific embodiment, R1 is not further substituted with an R*group; in a specific embodiment, R1 is further substituted with 1 R*group; in a specific embodiment, R1 is further substituted with 2 R*groups; in a specific embodiment, R1 is further substituted with 3 R* groups.
L1
In a specific embodiment, L1 is CH; in another specific embodiment, L1 is N.
R1a
In a specific embodiment, R1a is absent; in another specific embodiment, R1a is - (CH2) 0-3-C (O) -, such as -C (O) -; in another specific embodiment, R1a is - (CH2) 0-3-OC (O) -, such as -OC (O) -; in another specific embodiment, R1a is - (CH2) 0-3-NHC (O) -, such as -NHC (O) -; as long as the chemistry permits.
R1b
In a specific embodiment, R1b is absent; in another specific embodiment, R1b is NH-; in another specific embodiment, R1b is -O-; in another specific embodiment, R1b is -C (O) -; in another specific embodiment, R1b is -OC (O) -; in another specific embodiment, R1b is -C (O) O-; in another specific embodiment, R1b is -C (O) NH-; in another specific embodiment, R1b is -NH-C1-6 alkyl-, preferably -NH-C1-4 alkyl-; in another specific embodiment, R1b is -O-C1-6 alkyl-, preferably -O-C1-4 alkyl-; in another specific embodiment, R1b is -C (O) -C1-6 alkyl-, preferably -C (O) -C1-4 alkyl-; in another specific embodiment, R1b is -OC (O) -C1-6 alkyl-, preferably -OC (O) -C1-4 alkyl-; in another specific embodiment, R1b is -C (O) O-C1-6 alkyl-, preferably -C (O) O-C1-4 alkyl-; in another specific embodiment, R1b is -C (O) NH-C1-6 alkyl-, preferably -C (O) NH-C1-4 alkyl-.
R1c
In a specific embodiment, R1c is H; in another specific embodiment, R1c is C1-6 alkyl, preferably C1-4 alkyl; in another specific embodiment, R1c is C1-6 haloalkyl, preferably C1-4 haloalkyl.
m
In a specific embodiment, m is an integer in a range of 1 to 30000; in another specific embodiment, m is independently an integer in a range of 1 to 5000; in another specific embodiment, m is independently an integer in a range of 1 to 3000; in another specific embodiment, m is independently an integer in a range of 1 to 1000; in another specific  embodiment, m is independently an integer in a range of 100 to 500; in another specific embodiment, m is independently an integer in a range of 400 to 500.
R*
In a specific embodiment, R*is H; in another specific embodiment, R*is halogen; in another specific embodiment, R*is C1-6 alkyl, preferably C1-4 alkyl; in another specific embodiment, R*is C1-6 haloalkyl, preferably C1-4 haloalkyl; in another specific embodiment, R*is C1-6 alkoxy, preferably C1-4 alkoxy; in another specific embodiment, R*is C2-6 alkenyl; in another specific embodiment, R*is C2-6 alkynyl.
R2 
In a specific embodiment, R2 is a linker which is cleavable under tumor environment; in another specific embodiment, R2 is a cleavable linker, and the cleavable linker is selected from the group consisting of matrix metalloprotease (MMP) cleavable linker, a disintegrin and metalloprotease domain-containing (ADAM) metalloprotease cleavable linker, a prostate specific antigen (PSA) protease cleavable linker, a urokinase-type plasminogen activator (uPA) protease cleavable linker, a membrane type serine protease 1 (MT-SP1) protease cleavable linker, a matriptase protease cleavable linker (ST14) or a legumain protease cleavable linker.
In a specific embodiment, R2 is a matrix metalloprotease (MMP) cleavable linker, and the matrix metalloprotease (MMP) cleavable linker comprises an amino acid sequence of AHGL (SEQ ID NO: 54) or PRQV (SEQ ID NO: 61) .
In a specific embodiment, R2 is a prostate specific antigen (PSA) protease cleavable linker, and the prostate specific antigen (PSA) protease cleavable linker comprises an amino acid sequence of HSSKLQ (SEQ ID NO: 15) .
In a specific embodiment, R2 is urokinase-type plasminogen activator (uPA) protease cleavable linker, and the urokinase-type plasminogen activator (uPA) protease cleavable linker comprises an amino acid sequence of SGRSA (SEQ ID NO: 11) .
In a specific embodiment, R2 is a legumain protease cleavable linker, and the legumain protease cleavable linker comprises an amino acid sequence of AAN.
R3
In a specific embodiment, R3 is in another specific embodiment, R3 is  
X
In a specific embodiment, X is -NH-; in another specific embodiment, X is -O-.
Y
In a specific embodiment, Y is -NH-; in another specific embodiment, Y is -O-; in another specific embodiment, Y is -C (O) -; in another specific embodiment, Y is -OC (O) -; in another specific embodiment, Y is -C (O) -C (O) -; in another specific embodiment, Y is -NHC (O) -; as long as the chemistry permits.
Rx
In a specific embodiment, Rx is H; in another specific embodiment, Rx is halogen; in another specific embodiment, Rx is C1-6 alkyl, preferably C1-4 alkyl; in another specific embodiment, Rx is C1-6 alkoxy, preferably C1-4 alkoxy; in another specific embodiment, Rx is C1-6 haloalkyl, preferably C1-4 haloalkyl; in another specific embodiment, Rx is C2-6 alkenyl; in another specific embodiment, Rx is C2-6 alkynyl.
Ry
In a specific embodiment, Ry is H; in another specific embodiment, Ry is halogen; in another specific embodiment, Ry is C1-6 alkyl, preferably C1-4 alkyl; in another specific embodiment, Ry is C1-6 alkoxy, preferably C1-4 alkoxy; in another specific embodiment, Ry is C1-6 haloalkyl, preferably C1-4 haloalkyl; in another specific embodiment, Ry is C2-6 alkenyl; in another specific embodiment, Ry is C2-6 alkynyl.
n
In a specific embodiment, n is 0; in another specific embodiment, n is 1; in another specific embodiment, n is 2; in another specific embodiment, n is 3; in another specific embodiment, n is 4; in another specific embodiment, n is 5.
R4
In a specific embodiment, R4 is 
Ra
In a specific embodiment, Ra is H; in another specific embodiment, Ra is C1-6 alkyl, preferably C1-4 alkyl; in another specific embodiment, Ra is C1-6 haloalkyl, preferably C1-4 haloalkyl; in another specific embodiment, Ra is C1-6 alkoxyl, preferably C1-4 alkoxyl.
Rb 
In a specific embodiment, Rb is H; in another specific embodiment, Rb is C1-6 alkyl, preferably C1-4 alkyl; in another specific embodiment, Rb is C1-6 haloalkyl, preferably C1-4 haloalkyl; in another specific embodiment, Rb is C1-6 alkoxyl, preferably C1-4 alkoxyl.
R4a
In a specific embodiment, R4a is absent; in another specific embodiment, R4a is - (CH2) 1-12-; in another specific embodiment, R4a is - (CH2) 1-12-O-; in another specific embodiment, R4a is -O- (CH2) 1-12-; in another specific embodiment, R4a is -O- (CH2) 1-12-O-; in another specific embodiment, R4a is - (CH2) 1-12-O- (CH2) 1-12-; in another specific embodiment, R4a is (C1-6 alkylene-O) p- (CH2) 1-12; in another specific embodiment, R4a is - (CH2) 1-12-C3-8 cycloalkylene-; in another specific embodiment, R4a is - (CH2) 1-12-C3-8 cycloalkylene- (CH2) 1-12; in another specific embodiment, R4a is - (CH2) 1-12-C6-10 arylene-; in another specific embodiment, R4a is - (CH2) 1-12-C6-10 arylene- (CH2) 1-12.
In a specific embodiment, R4a is not further substituted with an R#group; in a specific embodiment, R4a is further substituted with 1 R#group; in a specific embodiment, R4a is further substituted with 2 R#groups; in a specific embodiment, R4a is further substituted with 3 R#groups; in a specific embodiment, R4a is further substituted with 4 R#groups; in a specific embodiment, R4a is further substituted with 5 R#groups.
R4b
In a specific embodiment, R4a is -NH-; in another specific embodiment, R4a is -O-; in  another specific embodiment, R4a is -C (O) -; in another specific embodiment, R4a is -C (O) O-; in another specific embodiment, R4a is -OC (O) -; in another specific embodiment, R4a is -C (O) -C (O) -; in another specific embodiment, R4a is -C (O) NH-; in another specific embodiment, R4a is -NHC (O) -; as long as the chemistry permits.
R#
In a specific embodiment, R#is H; in another specific embodiment, R#is halogen; in another specific embodiment, R#is C1-6 alkyl, preferably C1-4 alkyl; in another specific embodiment, R#is C1-6 haloalkyl, preferably C1-4 haloalkyl; in another specific embodiment, R#is C1-6 alkoxy, preferably C1-4 alkoxy; in another specific embodiment, R#is C2-6 alkenyl; in another specific embodiment, R#is C2-6 alkynyl.
p
In a specific embodiment, p is 1; in another specific embodiment, p is 2; in another specific embodiment, p is 3; in another specific embodiment, p is 4; in another specific embodiment, p is 5.
Definitions of specific functional groups and chemical terms are described in more detail below.
When a range of values is listed, it is intended to encompass each value and sub-range within the range. For example, “C1-6 alkyl” is intended to include C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5 and C5-6 alkyl.
“C1-6 alkyl” refers to a radical of a straight or branched, saturated hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms. In some embodiments, C1-4 alkyl is alternative. Examples of C1-6 alkyl include methyl (C1) , ethyl (C2) , n-propyl (C3) , iso-propyl (C3) , n-butyl (C4) , tert-butyl (C4) , sec-butyl (C4) , iso-butyl (C4) , n-pentyl (C5) , 3-pentyl (C5) , pentyl (C5) , neopentyl (C5) , 3-methyl-2-butyl (C5) , tert-pentyl (C5) and n-hexyl (C6) . The term “C1-6 alkyl” also includes heteroalkyl, wherein one or more (e.g., 1, 2, 3 or 4) carbon atoms are subsituted with heteroatoms (e.g., oxygen, sulfur, nitrogen, boron, silicon, phosphorus) . Alkyl groups can be optionally substituted with one or more substituents, for example, with 1 to 5 substituents, 1 to 3 substituents or 1 substituent. Conventional abbreviations of alkyl include Me (-CH3) , Et (-CH2CH3) , iPr (-CH (CH3) 2) , nPr (-CH2CH2CH3) , n-Bu (-CH2CH2CH2CH3) or i-Bu (-CH2CH (CH3) 2) .
“C2-6 alkenyl” refers to a radical of a straight or branched hydrocarbon group having 2 to 6 carbon atoms and at least one carbon-carbon double bond. In some embodiments, C2-4 alkenyl is alternative. Examples of C2-6 alkenyl include vinyl (C2) , 1-propenyl (C3) , 2-propenyl (C3) , 1-butenyl (C4) , 2-butenyl (C4) , butadienyl (C4) , pentenyl (C5) , pentadienyl (C5) , hexenyl (C6) , etc. The term “C2-6 alkenyl” also includes heteroalkenyl, wherein one or more (e.g., 1, 2, 3 or 4) carbon atoms are replaced by heteroatoms (e.g., oxygen, sulfur, nitrogen, boron, silicon, phosphorus) . The alkenyl groups can be optionally substituted with one or more substituents, for example, with 1 to 5 substituents, 1 to 3 substituents or 1 substituent.
“C2-6 alkynyl” refers to a radical of a straight or branched hydrocarbon group having 2 to 6 carbon atoms, at least one carbon-carbon triple bond and optionally one or more carbon-carbon double bonds. In some embodiments, C2-4 alkynyl is alternative. Examples of C2-6 alkynyl include, but are not limited to, ethynyl (C2) , 1-propynyl (C3) , 2-propynyl (C3) , 1-butynyl (C4) , 2-butynyl (C4) , pentynyl (C5) , hexynyl (C6) , etc. The term “C2-6 alkynyl” also includes heteroalkynyl, wherein one or more (e.g., 1, 2, 3 or 4) carbon atoms are replaced by heteroatoms (e.g., oxygen, sulfur, nitrogen, boron, silicon, phosphorus) . The alkynyl groups can be substituted with one or more substituents, for example, with 1 to 5 substituents, 1 to 3 substituents or 1 substituent.
“C1-6 alkylene, C2-6 alkenylene or C2-6 alkynylene” refers to a divalent group of the “C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl or C2-6 alkynyl” as defined above.
“C1-6 alkylene” refers to a divalent group formed by removing another hydrogen of the C1-6 alkyl, and can be substituted or unsubstituted. In some embodiments, C1-4 alkylene is yet alternative. The unsubstituted alkylene groups include, but are not limited to, methylene (-CH2-) , ethylene (-CH2CH2-) , propylene (-CH2CH2CH2-) , butylene (-CH2CH2CH2CH2-) , pentylene (-CH2CH2CH2CH2CH2-) , hexylene (-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-) , etc. Examples of substituted alkylene groups, such as those substituted with one or more alkyl (methyl) groups, include, but are not limited to, substituted methylene (-CH (CH3) -, -C (CH3) 2-) , substituted ethylene (-CH (CH3) CH2-, -CH2CH (CH3) -, -C (CH3) 2CH2-, -CH2C (CH3) 2-) , substituted propylene (-CH (CH3) CH2CH2-, -CH2CH (CH3) CH2-, -CH2CH2CH (CH3) -, -C (CH3) 2CH2CH2-, -CH2C (C H3) 2CH2-, -CH2CH2C (CH3) 2-) , etc.
“C2-6 alkenylene” refers to a C2-6 alkenyl group wherein another hydrogen is removed to provide a divalent radical of alkenylene, and which may be substituted or unsubstituted. In  some embodiments, C2-4 alkenylene is yet alternative. Exemplary unsubstituted alkenylene groups include, but are not limited to, ethenylene (-CH=CH-) and propenylene (e.g., -CH=CHCH2-, -CH2-CH=CH-) . Exemplary substituted alkenylene groups, e.g., substituted with one or more alkyl (methyl) groups, include but are not limited to, substituted ethylene (-C (CH3) =CH-, -CH=C (CH3) -) , substituted propylene (e.g., -C (CH3) =CHCH2-, -CH=C (CH3) CH2-, -CH=CHCH (CH3) -, -CH=CHC (CH3) 2-, -CH (CH3) -CH=CH-, -C (CH3) 2-CH=CH-, -CH2-C (CH3) =CH-, -CH2-CH=C (CH3) -) , and the like.
“C2-6 alkynylene” refers to a C2-6 alkynyl group wherein another hydrogen is removed to provide a divalent radical of alkynylene, and which may be substituted or unsubstituted. In some embodiments, C2-4 alkynylene is yet alternative. Exemplary alkynylene groups include, but are not limited to, ethynylene (-C≡C-) , substituted or unsubstituted propynylene (-C≡CCH2-) , and the like.
“Halo” or “halogen” refers to fluorine (F) , chlorine (Cl) , bromine (Br) and iodine (I) . Thus, “C1-6 haloalkyl” refers to the above “C1-6 alkyl” , which is substituted by one or more halogen. In some embodiments, C1-4 haloalkyl is yet alternative, and still alternatively C1-2 haloalkyl. Exemplary haloalkyl groups include, but are not limited to, -CF3, -CH2F, -CHF2, -CHFCH2F, -CH2CHF2, -CF2CF3, -CCl3, -CH2Cl, -CHCl2, 2, 2, 2-trifluoro-1, 1-dimethyl-ethyl, and the like. The haloalkyl can be substituted at any available point of attachment, for example, with 1 to 5 substituents, 1 to 3 substituents or 1 substituent.
“C3-8 cycloalkyl” refers to a radical of a non-aromatic cyclic hydrocarbon group having from 3 to 8 ring carbon atoms and zero heteroatoms. In some embodiments, C3-6 cycloalkyl is yet alternative, and still alternatively C5-6 cycloalkyl. The cycloalkyl also includes a ring system in which the cycloalkyl described herein is fused with one or more aryl or heteroaryl groups, wherein the point of attachment is on the cycloalkyl ring, and in such case, the number of carbon atoms continues to represent the number of carbon atoms in the cycloalkyl system. Exemplary cycloalkyl groups include, but are not limited to, cyclopropyl (C3) , cyclopropenyl (C3) , cyclobutyl (C4) , cyclobutenyl (C4) , cyclopentyl (C5) , cyclopentenyl (C5) , cyclohexyl (C6) , cyclohexenyl (C6) , cyclohexadienyl (C6) , cycloheptyl (C7) , cycloheptenyl (C7) , cycloheptadienyl (C7) , cycloheptatrienyl (C7) , etc. The cycloalkyl can be substituted with one or more substituents, for example, with 1 to 5 substituents, 1 to 3 substituents or 1 substituent.
“C3-8 cycloalkylene” refers to a C3-8 cycloalkyl wherein another hydrogen is removed to provide a divalent radical of cycloalkylene, and which may be substituted or unsubstituted. In some embodiments, C3-7 alkenylene is yet alternative.
“C6-10 aryl” refers to a radical of monocyclic or polycyclic (e.g., bicyclic) 4n+2 aromatic ring system having 6-10 ring carbon atoms and zero heteroatoms (e.g., having 6 or 10 shared π electrons in a cyclic array) . In some embodiments, the aryl group has six ring carbon atoms ( “C6 aryl” ; for example, phenyl) . In some embodiments, the aryl group has ten ring carbon atoms ( “C10 aryl” ; for example, naphthyl, e.g., 1-naphthyl and 2-naphthyl) . The aryl group also includes a ring system in which the aryl ring described above is fused with one or more cycloalkyl or heterocyclyl groups, and the point of attachment is on the aryl ring, in which case the number of carbon atoms continues to represent the number of carbon atoms in the aryl ring system. The aryl can be substituted with one or more substituents, for example, with 1 to 5 substituents, 1 to 3 substituents or 1 substituent.
“C6-10 arylene” refers to a C6-10 aryl wherein another hydrogen is removed to provide a divalent radical of arylene, and which may be substituted or unsubstituted. In some embodiments, phenylene is yet alternative.
“Oxo” represents =O.
Alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, and aryl as defined herein are optionally substituted groups. Exemplary substituents on carbon atoms include, but are not limited to, halogen, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -ORaa, -ON (Rbb) 2, -N (Rbb) 2, -N (Rbb) 3 +X-, -N (ORcc) Rbb, -SH, -SRaa, -SSRcc, -C (=O) Raa, -CO2H, -CHO, -C (ORcc) 2, -CO2Raa, -OC (=O) Raa, -OC O2Raa, -C (=O) N (Rbb) 2, -OC (=O) N (Rbb) 2, -NRbbC (=O) Raa, -NRbbCO2Raa, -NRbbC (=O) N (Rbb) 2, -C (=NRbb) Raa, -C (=NRbb) ORaa, -OC (=NRbb) Raa, -OC (=NRbb) ORaa, -C (=NRbb) N (Rbb) 2, -OC (=NRbb) N (Rbb) 2, -NRbbC (=NRbb) N (Rbb) 2, -C (=O) NRbbSO2Raa, -NRbbSO2Raa, -SO2N (Rbb) 2, -SO2 Raa, -SO2ORaa, -OSO2Raa, -S (=O) Raa, -OS (=O) Raa, -Si (Raa) 3, -OSi (Raa) 3, -C (=S) N (Rbb) 2, -C (=O) SRaa, -C (=S) SRaa, -SC (=S) SRaa, -SC (=O) SRaa, -OC (=O) SRaa, -SC (=O) ORaa, -SC (=O) Raa, -P (=O) 2Raa, -OP (=O) 2Raa, -P (=O) (Raa) 2, -OP (=O) (Raa) 2, -OP (=O) (ORcc) 2, -P (=O) 2N (Rbb) 2, -OP (=O) 2N (Rbb) 2, -P (=O) (NRbb) 2, -OP (=O) (NRbb) 2, -NRbbP (=O) (ORcc) 2, -NRbbP (=O) (NRbb) 2, -P (Rcc) 2, -P (Rcc) 3, -OP (Rcc) 2, -OP (Rcc) 3, -B (Raa) 2, -B (ORcc) 2, -BRaa (ORcc) , alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2,  3, 4 or 5 Rdd groups; or two geminal hydrogen on a carbon atom are replaced with =O, =S, =NN (Rbb) 2, =NNRbbC (=O) Raa, =NNRbbC (=O) ORaa, =NNRbbS (=O) 2Raa, =NRbb or =NORcc groups; each of the Raa is independently selected from alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, or two of the Raa groups are combined to form a heterocyclyl or heteroaryl ring, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2, 3, 4 or 5 Rdd groups; each of the Rbb is independently selected from hydrogen, -OH, -ORaa, -N (Rcc) 2, -CN, -C (=O) Raa, -C (=O) N (Rcc) 2, -CO2Raa, -SO2Raa, -C (=NRc c) ORaa, -C (=NRcc) N (Rcc) 2, -SO2N (Rcc) 2, -SO2Rcc, -SO2ORcc, -SORaa, -C (=S) N (Rcc) 2, -C (=O) SRcc, -C (=S) SRcc, -P (=O) 2Raa, -P (=O) (Raa) 2, -P (=O) 2N (Rcc) 2, -P (=O) (NRcc) 2, alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, or two Rbb groups are combined to form a heterocyclyl or a heteroaryl ring, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2, 3, 4 or 5 Rdd groups; each of the Rcc is independently selected from hydrogen, alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, or two Rcc groups are combined to form a heterocyclyl or a heteroaryl ring, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2, 3, 4 or 5 Rdd groups; each of the Rdd is independently selected from halogen, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -ORee, -ON (Rff) 2, -N (Rff) 2, -N (Rff) 3 +X-, -N (OR ee) Rff, -SH, -SRee, -SSRee, -C (=O) Ree, -CO2H, -CO2Ree, -OC (=O) Ree, -OCO2Ree, -C (=O) N (Rff) 2, -OC (=O) N (Rff) 2, -NRffC (=O) Ree, -NRffCO2Ree, -NRffC (=O) N (Rff) 2, -C (=NRff) ORee, -OC (=NRff) Ree, -OC (=NRff) ORee, -C (=NRff) N (Rff) 2, -OC (=NRff) N (Rff) 2, -NRffC (=NRff) N (Rff) 2, -NRf fSO2Ree, -SO2N (Rff) 2, -SO2Ree, -SO2ORee, -OSO2Ree, -S (=O) Ree, -Si (Ree) 3, -OSi (Ree) 3, -C (=S) N (Rff) 2, -C (=O) SRee, -C (=S) SRee, -SC (=S) SRee, -P (=O) 2Ree, -P (=O) (Ree) 2, -OP (=O) (Ree) 2, -OP (=O) (ORee) 2, alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2, 3, 4 or 5 Rgg groups, or two geminal Rdd substituents can be combined to form=O or =S; each of the Ree is independently selected from alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heterocyclyl, and heteroaryl, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2, 3, 4 or 5 Rgg groups;
each of the Rff is independently selected from hydrogen, alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl,  cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, or two Rff groups are combined to form a heterocyclyl or a heteroaryl ring, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2, 3, 4 or 5 Rgg groups; each of the Rgg is independently selected from halogen, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -OC1-6 alkyl, -ON (C1-6 alkyl) 2, -N (C1-6 alkyl) 2, -N (C1-6 alkyl) 3 +X-, -NH (C1-6 alkyl) 2 +X-, -NH2 (C1-6 alkyl) +X-, -NH3 +X-, -N (OC1-6 alkyl) (C1-6 alkyl) , -N (OH) (C1-6 alkyl) , -NH (OH) , -SH, -SC1-6 alkyl, -SS (C1-6 alkyl) , -C (=O) (C1-6 alkyl) , -CO2H, -CO2 (C1-6 alkyl) , -OC (=O) (C1-6 alkyl) , -OCO2 (C1-6 alkyl) , -C (=O) NH2, -C (=O) N (C1-6 alkyl) 2, -OC (=O) NH (C1-6 alkyl) , -NHC (=O) (C1-6 alkyl) , -N (C1-6 alkyl) C (=O) (C1-6 alkyl) , -NHCO2 (C1-6 alkyl) , -NHC (=O) N (C1-6 alkyl) 2, -NHC (=O) NH (C1-6 alkyl) , -NHC (=O) NH2, -C (=NH) O (C1-6 alkyl) , -OC (=NH) (C1-6 alkyl) , -OC (=NH) OC1-6 alkyl, -C (=NH) N (C1-6 alkyl) 2, -C (=NH) NH (C1-6 alkyl) , -C (=NH) NH2, -OC (=NH) N (C1-6 alkyl) 2, -OC (NH) NH (C1-6 alkyl) , -OC (NH) NH2, -NHC (NH) N (C1-6 alkyl) 2, -NHC (=NH) NH2, -NHSO2 (C1-6 alkyl) , -SO2N (C1-6 alkyl) 2, -SO2NH (C1-6 alkyl) , -SO2NH2, -SO2C1-6 alkyl, -SO2OC1-6 alkyl, -OSO2C1-6 alkyl, -SOC1-6 alkyl, -Si (C1-6 alkyl) 3, -OSi (C1-6 alkyl) 3, -C (=S) N (C1-6 alkyl) 2, C (=S) NH (C1-6 alkyl) , C (=S) NH2, -C (=O) S (C1-6 alkyl) , -C (=S) SC1-6 alkyl, -SC (=S) SC1-6 alkyl, -P (=O) 2 (C1-6 alkyl) , -P (=O) (C1-6 alkyl) 2, -OP (=O) (C1-6 alkyl) 2, -OP (=O) (OC1-6 alkyl) 2, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl, C3-C7 cycloalkyl, C6-C10 aryl, C3-C7 heterocyclyl, C5-C10 heteroaryl; or two geminal Rgg substituents may combine to form =O or =S;wherein X-is a counter-ion.
Exemplary substituents on nitrogen atoms include, but are not limited to, hydrogen, -OH, -ORaa, -N (Rcc) 2, -CN, -C (=O) Raa, -C (=O) N (Rcc) 2, -CO2Raa, -SO2Raa, -C (=NRb b) Raa, -C (=NRcc) ORaa, -C (=NRcc) N (Rcc) 2, -SO2N (Rcc) 2, -SO2Rcc, -SO2ORcc, -SORaa, -C (=S) N (Rcc) 2, -C (=O) SRcc, -C (=S) SRcc, -P (=O) 2Raa, -P (=O) (Raa) 2, -P (=O) 2N (Rcc) 2, -P (=O) (NRcc) 2, alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, or two Rcc groups attached to a nitrogen atom combine to form a heterocyclyl or a heteroaryl ring, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2, 3, 4 or 5 Rdd groups, and wherein Raa, Rbb, Rcc and Rdd are as described herein.
In some embodiments of the polypeptide of the present application, the chemical moiety comprises a structure of formula (I) : R1-R2-R3-R4 (I) , wherein R1 is  which is optionally further substituted with 1, 2 or 3 R*group (s) ; L1 is selected from CH or N; R1a is absent, or is selected from the group consisting of -C (O) -, -OC (O) -, and -NHC (O) -; each R1b is independently absent, or is independently selected from the group consisting of -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, -C (O) O-, -C (O) NH-, -NH-C1-4 alkyl-, -O-C1-4 alkyl-, -C (O) -C1-4 alkyl-, -OC (O) -C1-4 alkyl-, -C (O) O-C1-4 alkyl-and -C (O) NH-C1-4 alkyl-; each R1c is independently selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl; each m is independently an integer in a range of 1 to 5000; R*is selected from H, halogen, C1-6 alkyl or C1-6 haloalkyl; alternatively, R1 is which is optionally further substituted with 1, 2 or 3 R*group (s) ; R1a is absent, or is -C (O) -; R1c is selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl; m is an integer in a range of 1 to 3000; R*is selected from H, halogen or C1-4 alkyl; still alternatively, R1 is R1c is selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl, m is an integer in range of 1 to 1000, 100 to 500 or 400 to 500; yet alternatively, R1 is a linear polyethylene glycol having a molecular weight of about 20000.
In some embodiments of the polypeptide of the present application, the chemical moiety comprises a structure of formula (I) : R1-R2-R3-R4 (I) , wherein R2 is selected from the group consisting of matrix metalloprotease (MMP) cleavable linker, a disintegrin and metalloprotease domain-containing (ADAM) metalloprotease cleavable linker, a prostate specific antigen (PSA) protease cleavable linker, a urokinase-type plasminogen activator (uPA) protease cleavable linker, a membrane type serine protease 1 (MT-SP1) protease cleavable linker, a matriptase protease cleavable linker (ST14) and a legumain protease cleavable linker. In some embodiments, R2 is a matrix metalloprotease (MMP) cleavable linker. In some embodiments, the MMP cleavable linker comprises an amino acid sequence of any one selected from SEQ ID NOs: 21-35. In some embodiments, R2 is a prostate specific antigen (PSA) protease cleavable linker. In some embodiments, the PSA protease cleavable linker comprises an amino acid sequence of any one selected from SEQ ID NOs: 14-16. In some embodiments, R2 is urokinase-type plasminogen activator (uPA) protease cleavable linker. In some embodiments, the uPA protease cleavable linker comprises an amino acid sequence of any one selected from  SEQ ID NOs: 11-13. In some embodiments, R2 is a legumain protease cleavable linker. In some embodiments, the legumain protease cleavable linker comprises an amino acid sequence of any one selected from SEQ ID NOs: 18-19 or AAN or Cbz-AAN-AMC.
In some embodiments, the chemical moiety comprises a structure of formula (II) : wherein R1, R3 and R4 are as defined above.
In some embodiments of the polypeptide of the present application, the chemical moiety comprises a structure of formula (I) : R1-R2-R3-R4 (I) , wherein R3 is wherein X is selected from -NH-or -O-; Y is selected from -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, or -NHC (O) -; each Rx and Ry is independently selected from H, halogen, C1-4 alkyl or C1-4 haloalkyl; n is 0, 1, 2 or 3; alternatively, R3 is X is selected from NH or O; Y is selected from -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, or -NHC (O) -. In some embodiments, the chemical moiety comprises a structure of formula (III) :
wherein R1, R2 and R4 are as defined above. In some embodiments, the chemical moiety comprises a structure of formula (IV) wherein R1 and R4 are as defined above.
In some embodiments of the polypeptide of the present application, the chemical moiety comprises a structure of formula (I) : R1-R2-R3-R4 (I) , wherein R4 is Ra and Rb are each independently selected from the group consisting of H, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl and  C1-6 alkoxyl; R4a is absent, or is selected from the group consisting of - (CH2) 1-12-, - (CH2) 1-12-O-, -O- (CH2) 1-12-, -O- (CH2) 1-12-O-, - (CH2) 1-12-O- (CH2) 1-12-, (C1-6 alkylene-O) p- (CH2) 1-12, - (CH2) 1-12-C3-8 cycloalkylene- and - (CH2) 1-12-C3-8 cycloalkylene- (CH2) 1-12; R4a is optionally further substituted with 1, 2, 3 or 4 R#group (s) ; R4b is -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, -C (O) O-, -C (O) NH-or -NHC (O) -; R#is selected from the group consisting of H, halogen, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C2-6 alkenyl or C2-6 alkynyl; p is 1, 2, 3 or 4; alternatively, Ra and Rb are each independently selected from the group consisting of H and C1-4 alkyl; R4a is selected from the group consisting of - (CH2) 1-12-, - (CH2) 1-12-O-, -O- (CH2) 1-12-, -O- (CH2) 1-12-O-, - (CH2) 1-12-O- (CH2) 1-12-and (C1-4 alkylene-O) p- (CH2) 1-12; R4a is optionally further substituted with 1, 2 or 3 R#group (s) ; R4b is -NH-, -O-or -C (O) -; R#is selected from the group consisting of H, halogen, C1-6 alkyl and C1-6 haloalkyl; p is 1, 2 or 3; still alternatively, Ra and Rb are H; R4a is - (CH2) 2-12-; R4b is -NH-; R4a is optionally further substituted with 1 or 2 R#group (s) ; R#is selected from the group consisting of H, halogen and C1-4 alkyl. In some embodiments, the chemical moiety comprises a structure of formula (V) :
wherein R1, R2 and R3 are as defined above.
In some embodiments, the chemical moiety comprises a structure of formula (VI) : wherein the PEGm is R1c is selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl, m is an integer in range of 1 to 1000, 100 to 500 or 400 to 500. In some embodiments, the PEGm is a linear polyethylene glycol having a molecular weight of about 20000.
In some embodiments of the polypeptide of the present application, the IFNα2b or the functional fragment is modified by the chemical moiety at a residue corresponding to one or more selected from the group consisting of R12, L15, M16, R22, L26, F27, L30, R33, R33, H34, D35, A145, M148, R149, S152, L153, and N156 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments,  the IFNα2b or the functional fragment is modified by the chemical moiety at the residue corresponding to S152 of SEQ ID NO: 1.
In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment comprises an amino acid substitution at a position corresponding to the position selected from the group consisting of R12, L15, M16, R22, L26, F27, L30, R33, R33, H34, D35, A145, M148, R149, S152, L153, and N156 of SEQ ID NO: 1, and the chemical moiety is linked to the IFNα2b or the functional fragment at the substituted amino acid. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment comprises an amino acid substitution with a cysteine at a position corresponding to the position selected from the group consisting of R12, L15, M16, R22, L26, F27, L30, R33, R33, H34, D35, A145, M148, R149, S152, L153, and N156 of SEQ ID NO: 1, and the chemical moiety is linked to the IFNα2b or the functional fragment via the cysteine. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment comprises an amino acid substitution with a cysteine at a position corresponding to the position of S152 of SEQ ID NO: 1, and the chemical moiety is linked to the IFNα2b or the functional fragment via the cysteine.
In some embodiments, R4 of the chemical moiety is linked to the S atom of the cysteine residue via a maleimide, an acetylene, a vinyl, a mono-substituted butenedioic acid, or a disubstituted maleimide. In some embodiments, R4 of the chemical moiety is linked to the S atom of the cysteine residue via a maleimide.
In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment comprises an amino acid substitution with a cysteine at a position corresponding to S152 of SEQ ID NO: 1, and the chemical moiety is linked to the cysteine through R4 of the chemical moiety via a maleimide, an acetylene, a vinyl, a mono-substituted butenedioic acid, or a disubstituted maleimide. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment comprises an amino acid substitution with a cysteine at a position corresponding to S152 of SEQ ID NO: 1, and the chemical moiety is linked to the cysteine through R4 of the chemical moiety via a maleimide. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment comprises an amino acid substitution with a cysteine at a position corresponding to S152 of SEQ ID NO: 1, and a chemical moiety comprising a structure of formula (VI) is linked to the cysteine via the  maleimide: wherein the PEGm is R1c is selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl, m is an integer in range of 1 to 1000, 100 to 500 or 400 to 500; alternatively, the PEGm is a linear polyethylene glycol having a molecular weight of about 20000.
Bifunctional Immunoconjugates
In another aspect, provided herein is an immunoconjugate comprising the IFNα2b or the functional fragment thereof of the present application, and a biomolecule. In some embodiments, the biomolecule specifically binds to a target. In some embodiments, the biomolecule comprises an antibody or an antigen binding fragment thereof. In some embodiments, the antibody or the antigen binding fragment thereof is selected from the group consisting of a full-length antibody, a Fab, Fab’, a F (ab’) 2, a Fd, a Fd’, a Fv, a scFv, a ds-scFv, a sdAb and a nanobody. In some embodiments, the antibody specifically targets PD-L1 or PD-1. In some embodiments, the biomolecule is a PD-L1/PD-1 antibody as described herein.
In some embodiments of the immunoconjugate of the present application, the biomolecule is a PD-L1 antibody. In some embodiments, the PD-L1 antibody is a sdAb. In some embodiments, the PD-L1 antibody is a sdAb comprising a CDR1, a CDR2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the PD-L1 antibody is a sdAb comprising a CDR1, a CDR2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 6, and the CDR1, CDR2 and CDR3 are according to Kabat numbering scheme. In some embodiments, the biomolecule is a PD-L1 antibody, and the PD-L1 antibody comprises: (1) a CDR1 comprising an amino acid sequence of FRHYVMG (SEQ ID NO: 3) or an amino acid sequence with one or more substitutions as compared to SEQ ID NO: 3, (2) a CDR2 comprising an amino acid sequence of AISWSGSGSYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) or an amino acid sequence with one or more substitutions as compared to SEQ ID NO: 4, and (3) a CDR3 comprising an amino acid sequence of DMTTRMSQASREYDY (SEQ ID NO: 5) or an amino acid sequence with one or more substitutions as compared to SEQ ID NO: 5.
In some embodiments, the biomolecule is a PD-L1 antibody, and the PD-L1 antibody comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 6, or an amino acid sequence  having at least 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity with SEQ ID NO: 6.
In some embodiments, the immunoconjugates comprises any suitable number of the sdAb as described above. In some embodiments, the immunoconjugates comprises 1-4 of the sdAbs as described above. In some embodiments, the immunoconjugates comprises one of the sdAb as described above. In some embodiments, the immunoconjugates comprises two of the sdAbs as described above. In some embodiments, the immunoconjugates comprises four of the sdAbs as described above.
In some embodiments, the immunoconjugate comprises the IFNα2b or the functional fragment thereof as described herein. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified to attenuate binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with interferon α/β receptor. In some embodiments, the binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with interferon α/β receptor is attenuated to reduce adverse effect of the immunoconjugate after administration to a subject in need thereof. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified to attenuate activation of Type I Interferon Signaling induced by the IFNα2b or the functional fragment thereof. In some embodiments, the activation of Type I Interferon Signaling is attenuated to reduce adverse effect of the immunoconjugate after administration to a subject in need thereof.
In some embodiments, the adverse effect includes acute toxicity, subacute side effect and chronic side effect. In some embodiments, the acute toxicity includes the flu-like symptoms such as fever, chills, myalgia, headache, and nausea. In some embodiments, the subacute side effect includes but is not limited to hematological side effects such as anemia, decrease in leukocyte and platelet counts and decreased platelet aggregation; hepatic side effects such as raised transaminases and inhibition of cytochrome P450 enzymes; gastro-intestinal side effects such as loss of appetite, nausea, vomiting and diarrhea; psychiatric side effects such as depression, difficulties in cognition and delirium; neurological side effects such as seizures, neuropathies, multiple-sclerosis like disease and mysthenia gravis; renal side effects such as proteinuria; cardiovascular side effects such as arrythmias, ischemic heart disease, cardiomyopathy and retinal abnormalities; pulmonary side effects such as pneumonitis; endocrine side effects such as thyroid disorder, diabetes mellitus, decrement of sex hormone levels and hypopituitarism; dermatological side effects such as alopecia, erythema and induration at injection site, rash, pruritus, vitiligo, lichen planus, psoriasis.
In some embodiments, the side effect includes autoimmune disorders such as thyroid disorder, liver dysfunction, connective tissue diseases, dermatological disorders, hematologic disorders, neurological disorders, pulmonary disorder and metabolic disorder. In some embodiments, the side effect results in disorders including but not limited to subacute lymphocytic thyroiditis, graves’ disease, permanent hypothyroidism, autoimmune hepatitis, primary biliary cirrhosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, psoriasis, leucocytoclastic vasculitis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thrombocytopenia, inflammatory demyelinating polyneuropathy, multiple sclerosis-like disease, axonal neuropathy and hearing loss, bell’s palsy, mononeuropathy multiplex, myasthenia gravis, abducent nerve paralysis, interstitial pneumonitis and diabetes mellitus.
In some embodiments of the immunoconjugate of the present application, the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified to improve the performance of the immunoconjugates after administration to a subject in need thereof. In some embodiments, the performance includes but is not limited to pharmacokinetics (PK) , pharmacodynamics (PD) , efficacy, and safety. In some embodiments, the efficacy includes anti-tumor efficacy. In some embodiments, the anti-tumor efficacy includes but is not limited to inhibiting tumor growth, reducing tumor volume, increasing survival of a subject and inducing protection against tumor recurrence.
In some embodiments, the immunoconjugate of the present application comprises the IFNα2b or the functional fragment thereof modified by an amino acid substitution at one or more residues corresponding to one or more selected from the group consisting of R12, L15, M16, R22, L26, F27, L30, R33, R33, H34, D35, A145, M148, R149, S152, L153, and N156 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the immunoconjugate of the present application comprises the IFNα2b or the functional fragment thereof modified by an amino acid substitution at R12, L15, M16, R22, L26, F27, L30, R33, R33, H34, D35, A145, M148, R149, S152, L153, and N156 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the immunoconjugate of the present application comprises the IFNα2b or the functional fragment thereof modified by an amino acid substitution at S152 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the immunoconjugate of the present application comprises the IFNα2b or the functional fragment thereof having an amino acid substitution with cysteine at the residue corresponding to S152 of SEQ ID NO: 1.
In some embodiments, the immunoconjugate of the present application comprises the IFNα2b or the functional fragment, and the IFNα2b comprises an amino acid sequence having  at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the immunoconjugate of the present application comprises the IFNα2b or the functional fragment, and the IFNα2b comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the immunoconjugate comprises the IFNα2b, and the IFNα2b comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the immunoconjugate of the present application comprises the IFNα2b or the functional fragment, and the IFNα2b comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
In some embodiments, the immunoconjugate of the present application comprises the IFNα2b or the functional fragment, wherein the IFNα2b comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and is further modified by a chemical moiety at residue C152 of SEQ ID NO: 2, wherein the chemical moiety comprises a structure of formula (VI) : and the PEGm is R1c is selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl, m is an integer in range of 1 to 1000, 100 to 500 or 400 to 500; alternatively, the PEGm is a linear polyethylene glycol having a molecular weight of about 20000.
In some embodiments, the immunoconjugates comprises any suitable number of the IFNα2b or the functional fragment as described above. In some embodiments, the immunoconjugates comprises 1-4 of the IFNα2b or the functional fragments as described above. In some embodiments, the immunoconjugates comprises one of the IFNα2b or the functional fragment as described above. In some embodiments, the immunoconjugates comprises two of the IFNα2b or the functional fragments as described above. In some embodiments, the immunoconjugates comprises four of the IFNα2b or the functional fragments as described above.
In some embodiments of the immunoconjugate of the present application, the immunoconjugate further comprises an Fc region. The term “Fc-region” as used herein refers to the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain of human origin that contains at  least a part of the hinge region, the CH2 domain and the CH3 domain. Any suitable Fc region known in the art can be used in the immunoconjugate of the present application. In some embodiments, the Fc region can be derived from any suitable IgG isotype, such as IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4. In some embodiments, the Fc region is derived from IgG1. In some embodiments, the Fc region further comprises one or more mutation to enhance ADCC function.
In some embodiments, the Fc region comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 7. In some embodiments, the Fc region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
In some embodiments of the immunoconjugate of the present application, the IFNα2b or the functional fragment thereof is conjugated to the N terminus of the biomolecule. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is conjugated to the C terminus of the biomolecule. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is conjugated to the C terminus of the Fc region. In some embodiments of the immunoconjugate, the IFNα2b or the functional fragment thereof is conjugated to the N terminus of the Fc region. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is conjugated to the biomolecule through a linker. In some embodiments, the IFNα2b or the functional fragment thereof is conjugated to the Fc region through a linker. Any suitable linker known in the art can be used for the conjugation. In some embodiments, the linker is selected from the group consisting of (GGGGS) n (SEQ ID NO: 53) , (GGGS) n (SEQ ID NO: 54) , (GGS) n, (GmS) n, and (XmS) n, and n is an integer between 1-8.
Exemplary formats of the immunoconjugates of the present application are as illustrated in FIG. 1.
In some embodiments, the immunoconjugate comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 9. In some embodiments, the immunoconjugate comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
In some embodiments, the immunoconjugate comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the immunoconjugate comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
In some embodiments, the immunoconjugate comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 36 and an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 37. In some embodiments, the immunoconjugate comprises the amino acid sequences of SEQ ID NO: 36 and 37.
In some embodiments, the immunoconjugate comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 38 and an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 39. In some embodiments, the immunoconjugate comprises the amino acid sequences of SEQ ID NO: 38 and 39.
In some embodiments, the immunoconjugate comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 40 and an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 41. In some embodiments, the immunoconjugate comprises the amino acid sequences of SEQ ID NO: 40 and 41.
In some embodiments, the immunoconjugate comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 42 and an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 43. In some embodiments, the immunoconjugate comprises the amino acid sequences of SEQ ID NO: 42 and 43.
In some embodiments, the immunoconjugate comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 44 and an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 45. In some embodiments, the immunoconjugate comprises the amino acid sequences of SEQ ID NO: 44 and 45.
In some embodiments, the immunoconjugate comprises an amino acid sequence having  at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 46 and an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 47. In some embodiments, the immunoconjugate comprises the amino acid sequences of SEQ ID NO: 46 and 47.
In another aspect, provided herein is a polynucleotide encoding the polypeptide or the immunoconjugate of the present application. In some embodiments, the polynucleotide comprises the nucleic acid sequence having at least about 70%, at least about 80%, at least about 85%, at least about 90%, at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, at least about 99%identity with SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the polynucleotide comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 8.
In another aspect, provided herein is a vector comprising the polynucleotide as described in the present application. In some embodiments, the term “vector” refers to a DNA molecule that is used to introduce and direct the expression of a specific gene to which it is operably associated in a target cell. In some embodiments, the vector comprises an expression cassette that comprises polynucleotide sequences that encode the polypeptides or immunoconjugates of the present application.
In another aspect, provided herein is a host cell comprising the vector as described in the present application. As used herein, the term “host cell” refers to any kind of cellular system which can be engineered to generate the polypeptides or immunoconjugates of the present application. Host cells suitable for replicating and for supporting expression of the polypeptides or immunoconjugates are well known in the art. Such cells may be transfected or transduced as appropriate with the particular expression vector and large quantities of vector containing cells can be grown for seeding large scale fermenters to obtain sufficient quantities of polypeitide or immunoconjugate for clinical applications. Suitable host cells include prokaryotic microorganisms, such as E. coli, or various eukaryotic cells, such as Chinese hamster ovary cells (CHO) , insect cells, or the like. For example, polypeptides may be produced in bacteria in particular when glycosylation is not needed. After expression, the polypeptide may be isolated from the bacterial cell paste in a soluble fraction and can be further purified. In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable cloning or expression hosts for polypeptide-encoding vectors, including fungi and yeast strains whose glycosylation pathways have been “humanized, ” resulting in the production of a polypeptide  with a partially or fully human glycosylation pattern. Suitable host cells for the expression of (glycosylated) polypeptides are also derived from multicellular organisms (invertebrates and vertebrates) . Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. Numerous baculoviral strains have been identified which may be used in conjunction with insect cells, particularly for transfection of Spodoptera frugiperda cells. Plant cell cultures can also be utilized as hosts. Vertebrate cells may also be used as hosts. For example, mammalian cell lines that are adapted to grow in suspension may be useful. Other examples of useful mammalian host cell lines are monkey kidney CV1 line transformed by SV40 (COS-7) ; human embryonic kidney line (293 or 293T cells) , baby hamster kidney cells (BHK) , mouse sertoli cells (TM4 cells, monkey kidney cells (CV1) , African green monkey kidney cells (VERO-76) , human cervical carcinoma cells (HELA) , canine kidney cells (MDCK) , buffalo rat liver cells (BRL 3A) , human lung cells (W138) , human liver cells (Hep G2) , mouse mammary tumor cells (MMT 060562) , TRI cells) , MRC 5 cells, and FS4 cells.
Treatments
In another aspect, provided herein is method for treating a disorder in a subject in need thereof, comprising administrating an effective amount of the polypeptide, the immunoconjugate, or the nucleic acid of the present application to the subject. In some embodiments, the disorder is cancer. In some embodiments, the disorder is a PD-1/PD-L1 antibody treatment resistant cancer.
All publications and patent applications cited in this specification are herein incorporated by reference as if each individual publication or patent application were specifically and individually indicated to be incorporated by reference.
EXAMPLES
The following examples are put forth so as to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present disclosure, and are not intended to limit the scope of what the inventors regard as their disclosure nor are they intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (e.g. amounts, temperature, etc. ) but some experimental errors and deviations should be accounted for. Unless indicated otherwise, parts are parts by weight, molecular weight is weight average molecular weight, temperature is in degrees Centigrade, and pressure is at or near atmospheric.
Example 1. Preparation of bifunctional polypeptides and immunoconjugates
Bifunctional molecules that included IFNα2b or a functional fragment and were also capable of targeting PD-L1/PD-1 were designed and expressed in HEK293-based mammalian expression system. The structures of these polypeptides are illustrated in FIG. 1 and their sequences are shown Table 2 below.
Table 2. Amino acid sequences of immunoconjugates




As shown in FIG. 1, various different formats of the bifunctional polypeptides were used. Two of these formats were symmetric, each containing two anti-PD-L1 nanobodies and two IFNα2b molecules. In the first symmetric format (L1IF) on the far left, the two nanobodies were disposed on the N-terminal side of an IgG1 Fc fragment, while the two IFNα2b molecules were on the C-terminal side of the Fc fragment. By contrast, in L1-G4S-IF-Fc (format 1) , the two IFNα2b molecules were between the nanobodies and the Fc fragment.
Five different asymmetric bifunctional polypeptides were made. In L1-Fc (H) +L1-Fc-IF (K) (format 2) , only a single IFNα2b molecule was included, and was fused to the C-terminus of one of the CH3 domains of the Fc fragment. In all of the asymmetric formats, knob-into-hole substitutions were made to reduce mis-pairing. In format 2, the IFNα2b molecule was fused to the CH3 that included the knob. In format 3 (L1-Fc (K) +L1-Fc-IF (H) ) , the IFNα2b molecule is fused to the CH3 that includes the hole.
In format 4 (L1*2-Fc (H) +IF-Fc (K) ) , two anti-PD-L1 nanobodies were connected, in series, to one of the chains (hole) of the Fc fragment while a single IFNα2b was fused to the N-terminus of the other chain (knob) . In format 5 (L1-Fc (H) +IF-G4S-L1-Fc (K) ) , each of the two anti-PD-L1 nanobodies was fused to each of the two Fc chains, while one of the chains further included an IFNα2b molecule at the far N-terminal end. Finally, in format 6 (L1-Fc (H) +L1-G4S-IF-Fc (K) ) , the single IFNα2b molecule was between an N-terminal anti-PD-L1 nanobody and the C-terminal Fc.
In some versions of the bifunctional polypeptides, the IFNα2b molecule was wild-type (WT) . In some of them, the IFNα2b molecule included a S152C substitution (position according to SEQ ID NO: 1) . Bifunctional polypeptides with the S152C substitution is referred to as L1IF M205.
Immunoconjugates, which were based on these bifunctional polypeptides and further included chemical moieties of the present application (L1IF M205 DAR1) were also designed and prepared, as illustrated in FIG. 2A and 2B. The chemical moiety was prepared mainly as described previously (see WO2019091384A1) .
As shown in FIG. 2A, L1IF M205 adopted a symmetric format with bivalent of  L1-Fc-IF arm, in which a substitution at residue S152 (location according to SEQ ID NO: 1) of the IFNa2b component with Cysteine (C) . Then a chemical moiety comprising a maleimide chemical linker, PABC, a legumain cleavable linker and a 20K PEG was linked to the cysteine introduced at residue 152 of IFNa2b in one arm (L1IF M205 DAR1) or both arms of L1IF M205 (L1IF M205 DAR2) . The PEG structure can be cleaved by legumain accumulated in the tumor environment so as to release the active form of the molecule. FIG. 2B shows the SDS-PAGE of L1IF M205 DAR1 and L1IF M205 DAR2 with DTT (left) or without DTT (right) .
Example 2. Binding of the immunoconjugate with PD-L1
Biacore assay was performed to evaluate the binding affinity of the immunoconjugates towards human PD-L1.
Briefly, PD-L1 mAb (SEQ ID NO: 6) , L1IF WT, L1IF M205 and L1IF M205 DAR1 were captured on Protein A chip, respectively, and the flow rate was 10 μL/min. Recombinant human PD-L1 protein served as analyte. The concentration of analyte was 400, 200, 100, 50, 25, 0 nM and the injection rate of analyte was 30 μL/min with 180s association period. The result was analyzed by using 1: 1 Binding fit model. Then KD of L1IF WT, L1IF M205 group and L1IF M205 DAR1 group were normalized to PD-L1 mAb group, respectively, as shown in Table 3 below.
Table 3. Binding affinity of the immunoconjugates of the present application with PD-L1
As shown in Table 3, the binding affinity of L1IF WT, L1IF M205 and L1IF M205 DAR1 with PD-L1 was comparable with that of PD-L1 mAb used in the immunoconjugate, indicating conjugation with the IFNα2b or IFNα2b modified with the chemical moiety of the present application does not affect the binding affinity of the PD-L1 antibody with PD-L1.
Then the binding of the PD-L1 arm of the immunoconjugates was further evaluated by ELISA. Briefly, recombinant human PD-L1 protein was coated in 96-well plate. PD-L1 mAb (SEQ ID NO: 6) , L1IF WT, L1IF M205 and L1IF M205 DAR1 were serially diluted and added to the plate. Goat anti-human IgG Fc HRP was further added as the secondary antibody for  analysis. As shown in FIG. 3A, EC50 of L1IF M205 DAR1 group was 1.292 nM, 3.6 folds change as compared to PD-L1 mAb, while EC50 values of L1IF WT and L1IF M205 groups were comparable with PD-L1 mAb.
In order to mimic the PD-L1 antigen exposure more accurately, the PD-L1 antigen protein was expressed on CHO-K1 cells. Then, the binding activity of the immunoconjugates of the present application to PD-L1 on CHO-K1 cells was detected via FACS. As shown in FIG. 3B, L1IF M205 and L1IF WT exhibited comparable binding capability with PD-L1 mAb, while L1IF M205 DAR1 exhibited slightly reduced binding capability.
Example 3. Activation of PD-L1/PD-1 signaling by the immunoconjugate
To evaluate activation of the PD-L1/PD-1 signaling by the immunoconjugate of the present application, an artificial functional assay system comprising CHO-K1 APCs stably expressing human PD-L1 and OKT3 and Jurkat effector cells stably expressing PD-1, CD3 and NFAT reporter gene was established. In this system, when an antagonist of PD1/PD-L1 signaling is introduced into the system, the inhibition of PD1 to CD3 pathway would be abrogated and NFAT reporter gene induced by CD3 can be detected.
As shown in FIG. 4, after incubation, L1IF WT and L1IF M205 resulted in comparable expression of NFAT report gene with the PD-L1 mAb, while L1IF M205 DAR1 resulted in slightly reduced expression of NFAT reported gene as compared with the PD-L1 mAb.
Example 4. Binding of the immunoconjugate with IFN receptor
Biacore assay was performed to test the binding affinity of the immunoconjugates of the present application with IFN receptor IFNAR1 and IFNAR2. The results are as summarized in Table 4 below.
Table 4. binding affinity of the immunoconjugates with IFNAR1 and IFNAR2
As shown in Table 4, as compared to the control, a commercial available PEG-IFNa2b  without the modification of the present application, L1IF WT exhibited comparable binding affinity with IFNAR1 and IFNAR2; L1IF M205 with S152C substitution in the IFNa2b component of the immunoconjugate exhibited comparable binding affinity with IFNAR1 but attenuated binding with IFNAR2, in which the KD was increased by104 folds; L1IF M205 DAR1 with S152C substitution and an additional chemical moiety attached to the substituted residue in the IFNa2b component of the immunoconjugate exhibited further attenuated binding to both IFNAR1 and IFNAR2 as compared to L1IF M205.
Then the binding capability of the immunoconjugates with IFNAR1 and IFNAR2 was evaluated by ELISA. Briefly, recombinant human IFNAR1 or IFNAR2 protein (1μg/ml) was coated on 96-well plate overnight at 4℃. Then 100μl diluted immunoconjugates in 1%BSA/PBST were supplemented and incubated with IFNAR1 or IFNAR2 for 1 hour. 100μl goat anti-human IgG Fc HRP was added for analysis by spectrophotometer at 450nm.
As shown in FIG. 5A and FIG. 5B, consistent with the Biacore results, L1IF M205 with S152C substitution in the IFNa2b component of the immunoconjugate exhibited comparable binding affinity with IFNAR1 but attenuated binding with IFNAR2 as compared with L1IF WT, and L1IF M205 DAR1 with S152C substitution and an additional chemical moiety attached to the substituted residue in the IFNa2b component of the immunoconjugate exhibited further attenuated binding to both IFNAR1 and IFNAR2 as compared to L1IF M205.
Example 5. Activation of INFα signaling by the immunoconjugates
IFNα2b signaling reporter assay and Daudi proliferation inhibition assay were performed to evaluate activation of INFα signaling by the immunoconjugate of the present application. Briefly, HEK-Blue IFN-α/β cells (at a density of 5.0 x 104 cells per well) were plated in a white 96-well plate. Then immunoconjugates including L1IF WT, L1IF M205, L1IF M205 DAR1 and L1IF M205 DAR2 were supplemented, respectively, and incubated with the cells at 37℃ for 6 hours, followed by measurement of luminescence.
As shown in FIG. 6A, L1IF M205 with S152C substitution in the IFNa2b component of the immunoconjugate exhibited reduced activation of Type I interferon signaling as compared with L1IF WT, and L1IF M205 DAR1 and L1IF M205 DAR2 with S152C substitution and an additional chemical moiety attached to the substituted residue in the IFNa2b component of the immunoconjugate exhibited further reduced activation of Type I interferon signaling as compared to L1IF M205.
Daudi cells (at a density of 2.0 x 104 cells per well) were plated in a 96-well plate. Then immunoconjugates including L1IF WT, L1IF M205, L1IF M205 DAR1 and L1IF M205 DAR2 were supplemented, respectively, and incubated with the cells at 37℃ for 3 days. Then titer-glo detection buffer (Promega) was added and incubated for 3 mins, followed by measurement of luminescence via Envision.
As shown in FIG. 6B, L1IF M205 with S152C substitution in the IFNa2b component of the immunoconjugate exhibited significant inhibition on Daudi proliferation, L1IF M205 DAR1 and L1IF M205 DAR2 with S152C substitution and an additional chemical moiety attached to the substituted residue in the IFNa2b component of the immunoconjugate exhibited further inhibition on Daudi proliferation as compared to L1IF M205.
Example 7. In vitro efficacy of the immunoconjugate
In vitro tumor killing efficacy of the immunoconjugates of the present application was evaluated by using human colon rectal cancer cell line RKO cells as target cells and primary CD8 T cells as effector cells, as illustrated in FIG. 7A.
Briefly, primary CD8 T cells were isolated from human PBMC through Milteny kit and then co-cultured at a density of 5.0 x 104 cells per well with 1.0 x 104 RKO cells labeled with CellTrace in a 96-well plate. The immunoconjugates of the present application including L1IF WT, L1IF M205, L1IF M205 DAR1 and L1IF M205 DAR2 respectively were serially diluted and added to the plate and incubated with the cells for 3 days, followed by analysis of the counts of viable RKO cells through FACS.
As shown in FIG. 7B, similarly as L1IF WT, L1IF M205 exhibited dose dependent tumor killing activity. In contrast, L1IF M205 DAR1 and L1IF M205 DAR2 did not exhibit tumor killing activity, indicating attenuation of activation of Type I interferon signaling due to the modification by the chemical moiety of the present application. After cleavage by Legumain, dose dependent tumor killing activity of L1IF M205 DAR1was resumed, as shown in L1IF M205 active group.
Example 8. In vivo efficacy of the immunoconjugates
In vivo anti-tumor activity of the immunoconjugates of the present application was evaluated in CB-17 SCID RKO mouse model.
Briefly, RKO cells (PD-L1 positive but anti-PD-L1 treatment resistant colorectal cancer  cell line) were s. c inoculated into human PBMC reconstruction CB-17 mice (purchased from Vital River Laboratory) . When the tumor volume reached to about 40 mm3, the mice were randomly divided into 6 groups, and the immunoconjugates including L1IF WT, L1IF M205, and L1IF M205 DAR1 were administrated to the mice based on the regimen shown in FIG. 8.
As shown in FIG. 8, in the model, L1IF WT, L1IF M205, L1IF M205 DAR1 all exhibited stronger TGI anti-tumor efficacy as compared to the Tecentriq group, and L1IF WT demonstrated superior antitumor efficacy over Tecentriq plus peg-IFNα2b group (TGI 47.81 %vs 18.10%) . At the dose of 3mg/kg, L1IF M205 DAR1 exhibited even superior anti-tumor efficacy as compared to L1IF WT (TGI 66.73%vs 47.81%) , suggesting resumed and improved anti-tumor activity of L1IF M205 DAR1.
Example 9. Toxicology of the immunoconjugates
In vivo toxicity of the immunoconjugates of the present application was further evaluated. As shown in FIG. 9, after administration, L1IF M205 DAR 1 exhibited more stable lymphocytes and platelet counts, indicating reduced hematologic toxicity induced by L1IF M205 DAR1.
Example 10. Bifunctional polypeptides with new anti-PD-L1 antibody
In this example, a new anti-PD-L1 nanobody (112_08) was generated, and used to prepare immunoconjugates similar to those described above. The 112_08 nanobody has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.
Two formats of bifunctional polypeptides were made, as illustrated in FIG. 10 and their sequences are shown in Table 6 below. One of them (112_08-IFM) was symmetrical, containing two copies of the IFNα2b S152C variant at the C-terminus of the Fc fragment. The other one (112_08-IFM-knob) contained a single IFNα2b S152C variant, and the knob-in-hole substitutions to reduce mispairing. Immunoconjugates based on these two bifunctional polypeptides were prepared, each containing a single chemical moiety 112_08-IFM DAR1 and 112_08-IFM-knob DAR1.
Table 6. Amino acid sequences of immunoconjugates

The activities of these bi-functional polypeptides and the corresponding immunoconjugates were tested with ELISA, IFNa reporter assay and Daudi cell binding assay, as described above. As shown in FIG. 11, the bi-functional polypeptides exhibited high activity while the immunoconjugates had much attenuated infinity towards IFNAR2.
112_08-IFM-knob was also subjected to testing for binding and inhibiting PD-L1. Encouragingly, it exhibited more potent binding and greater inhibitory activity than Tecentriq (FIG. 12) .
Moreover, the in vivo anti-tumor activities of these bi-functional polypeptides and  immunoconjugates were tested in the CB-17 SCID RKO model (see methodology in Example 8) . As shown in FIG. 13 and Table 5, at least the asymmetric112_08-IFM-knob and both immunoconjugates outperformed the combination of Tecentriq and PEG-IFNα.
Table 5. In vivo antitumor efficacy
This example, therefore, has demonstrated the excellent performance of the new anti-PD-L1 nanobody in the context of bi-functional polypeptides and immunoconjugates.
***
The present disclosure has been described in terms of particular embodiments found or proposed by the present inventor to comprise preferred modes for the practice of the disclosure. It will be appreciated by those of skill in the art that, in light of the present disclosure, numerous modifications and changes can be made in the particular embodiments exemplified without departing from the intended scope of the disclosure. For example, due to codon redundancy, changes can be made in the underlying DNA sequence without affecting the protein sequence. Moreover, due to biological functional equivalency considerations, changes can be made in protein structure without affecting the biological action in kind or amount. All such modifications are intended to be included within the scope of the appended claims.
SEQUENCE LISTING





Claims (60)

  1. A polypeptide comprising an IFNα2b or a functional fragment thereof, wherein the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified, as compared to the wild-type IFNα2b protein, to attenuate binding affinity to interferon α/β receptor, wherein (a) the polypeptide is a multi-functional polypeptide or (b) the polypeptide is conjugated to a chemical moiety.
  2. The polypeptide of claim 1, wherein the interferon α/β receptor is selected from IFNAR1, IFNAR2, and the combination thereof.
  3. The polypeptide of claim 1 or 2, wherein the binding affinity of the IFNα2b or the functional fragment thereof with the interferon α/β receptor is attenuated by at least 10 folds, 102 folds, 103 folds, 104 folds or 105 folds.
  4. A polypeptide comprising an IFNα2b or a functional fragment thereof, wherein the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified, as compared to the wild-type IFNα2b protein, to attenuate activity to induce Type I interferon signaling.
  5. The polypeptide of claim 4, wherein the activity to induce Type I interferon signaling is attenuated by at least 10 folds, 102 folds, 103 folds, 104 folds or 105 folds.
  6. The polypeptide of any one of claims 1-5, wherein the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified by an amino acid substitution at one or more residues corresponding to the residues selected from the group consisting of R12, L15, M16, R22, L26, F27, L30, R33, H34, D35, A145, M148, R149, S152, L153, and N156 of SEQ ID NO: 1.
  7. The polypeptide of any one of claims 1-6, wherein the modification comprises an amino acid substitution at the residue corresponding to S152 of SEQ ID NO: 1.
  8. The polypeptide of any one of claims 1-7, wherein the modification comprises an amino acid substitution with cysteine at the residue corresponding to S152 of SEQ ID NO: 1.
  9. The polypeptide of any one of claims 1-8, wherein the IFNα2b comprises an amino acid sequence having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  10. The polypeptide of any one of claims 1-9, wherein the IFNα2b or the functional fragment thereof is conjugated to a chemical moiety.
  11. The polypeptide of claim 10, wherein the chemical moiety comprises a structure of formula (I) :
    R1-R2-R3-R4   (I) ,
    wherein,
    R1 iswhich is optionally further substituted with 1, 2 or 3 R*group (s) ;
    L1 is selected from CH or N;
    R1a is absent, or is selected from the group consisting of - (CH2) 0-3-C (O) -, - (CH2) 0-3-OC (O) -, and - (CH2) 0-3-NHC (O) -;
    each R1b is independently absent, or is independently selected from the group consisting of -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, -C (O) O-, -C (O) NH-, -NH-C1-6 alkyl-, -O-C1-6 alkyl-, -C (O) -C1-6 alkyl-, -OC (O) -C1-6 alkyl-, -C (O) O-C1-6 alkyl-and -C (O) NH-C1-6 alkyl-;
    each R1c is independently selected from the group consisting of H, C1-6 alkyl, and C1-6 haloalkyl;
    m is an integer in a range of 1 to 30000;
    R*is selected from H, halogen, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C1-6 alkoxy, C2-6 alkenyl, or C2-6 alkynyl;
    R2 is a linker which is cleavable under tumor environment;
    R3 is
    X is selected from -NH-or -O-;
    Y is selected from -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, -C (O) -C (O) -or -NHC (O) -;
    each Rx and Ry is independently selected from H, halogen, C1-6 alkyl, C1-6 alkoxy, C1-6 haloalkyl, C2-6 alkenyl or C2-6 alkynyl;
    n is 0, 1, 2, 3, 4, or 5;
    R4 is
    Ra and Rb are each independently selected from the group consisting of H, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl and C1-6 alkoxyl;
    R4a is absent, or is selected from the group consisting of - (CH2) 1-12-, - (CH2) 1-12-O-, -O- (CH2) 1-12-, -O- (CH2) 1-12-O-, - (CH2) 1-12-O- (CH2) 1-12-, (C1-6 alkylene-O) p- (CH2) 1-12, - (CH2) 1-12-C3-8 cycloalkylene-, - (CH2) 1-12-C3-8 cycloalkylene- (CH2) 1-12, - (CH2) 1-12-C6-10 arylene-, and - (CH2) 1-12-C6-10 arylene- (CH2) 1-12;
    R4a is optionally further substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 R#group (s) ;
    R4b is selected from the group consisting of -NH-, -O-, -C (O) -, -C (O) O-, -OC (O) -, -C (O) -C (O) -, -C (O) NH-or -NHC (O) -;
    R#is selected from the group consisting of H, halogen, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C1-6 alkoxy, C2-6 alkenyl or C2-6 alkynyl;
    p is 1, 2, 3, 4 or 5;
    wherein R3 links to R2 via the X of R3, and links to R4 via the Y of R3.
  12. The polypeptide of claim 11, wherein,
    R1 iswhich is optionally further substituted with 1, 2 or 3 R*group (s) ;
    L1 is selected from CH or N;
    R1a is absent, or is selected from the group consisting of -C (O) -, -OC (O) -, and -NHC (O) -;
    each R1b is independently absent, or is independently selected from the group consisting of -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, -C (O) O-, -C (O) NH-, -NH-C1-4 alkyl-, -O-C1-4 alkyl-, -C (O) -C1-4 alkyl-, -OC (O) -C1-4 alkyl-, -C (O) O-C1-4 alkyl-and -C (O) NH-C1-4 alkyl-;
    each R1c is independently selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl;
    each m is independently an integer in a range of 1 to 5000;
    R*is selected from H, halogen, C1-6 alkyl or C1-6 haloalkyl;
    alternatively, R1 iswhich is optionally further substituted with 1, 2 or 3 R*group (s) ;
    R1a is absent, or is -C (O) -;
    R1c is selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl;
    m is an integer in a range of 1 to 3000;
    R*is selected from H, halogen or C1-4 alkyl;
    still alternatively, R1 isR1c is selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl, m is an integer in range of 1 to 1000, 100 to 500 or 400 to 500; yet alternatively, R1 is a linear polyethylene glycol having a molecular weight of about 20000.
  13. The polypeptide of claim 11 or 12, wherein R2 is selected from the group consisting of matrix metalloprotease (MMP) cleavable linker, a disintegrin and metalloprotease domain-containing (ADAM) metalloprotease cleavable linker, a prostate specific antigen (PSA) protease cleavable linker, a urokinase-type plasminogen activator (uPA) protease cleavable linker, a membrane type serine protease 1 (MT-SP1) protease cleavable linker, a matriptase protease cleavable linker (ST14) and a legumain protease cleavable linker.
  14. The polypeptide of claim 13, wherein R2 is a matrix metalloprotease (MMP) cleavable linker and comprises an amino acid sequence of anyone selected from SEQ ID NOs: 21-35.
  15. The polypeptide of claim 13, wherein R2 is a prostate specific antigen (PSA) protease cleavable linker and comprises an amino acid sequence of anyone selected from SEQ ID NOs: 14-16.
  16. The polypeptide of claim 13, wherein R2 is urokinase-type plasminogen activator (uPA) protease cleavable linker and comprises an amino acid sequence of anyone selected from SEQ ID NOs: 11-13.
  17. The polypeptide of claim 13, wherein R2 is a legumain protease cleavable linker and comprises an amino acid sequence of anyone selected from SEQ ID NOs: 18-19 or AAN or Cbz-AAN-AMC.
  18. The method of any one of claims 11-13 and 17, wherein the chemical moiety comprises a structure of formula (II) :
    wherein R1, R3 and R4 are as defined in any one of claims 11-13 and 17.
  19. The polypeptide of any one of claims 11-18, wherein
    R3 is
    wherein,
    X is selected from -NH-or -O-;
    Y is selected from -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, or -NHC (O) -;
    each Rx and Ry is independently selected from H, halogen, C1-4 alkyl or C1-4 haloalkyl;
    n is 0, 1, 2 or 3;
    alternatively,
    R3 is
    X is selected from NH or O;
    Y is selected from -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, or -NHC (O) -.
  20. The method of any one of claims 11-19, wherein the chemical moiety comprises a structure of formula (III) :
    wherein,
    X is selected from NH or O;
    Y is selected from -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, or -NHC (O) -;
    wherein R1, R2 and R4 are as defined in any one of claims 11-19.
  21. The polypeptide of any one of claims 11-20, wherein the chemical moiety comprises a structure of formula (IV) :
    wherein R1 and R4 are as defined in any one of claims 11-20.
  22. The polypeptide of any one of claims 11-21, wherein:
    R4 is
    Ra and Rb are each independently selected from the group consisting of H, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl and C1-6 alkoxyl;
    R4a is absent, or is selected from the group consisting of - (CH2) 1-12-, - (CH2) 1-12-O-, -O- (CH2) 1-12-, -O- (CH2) 1-12-O-, - (CH2) 1-12-O- (CH2) 1-12-, (C1-6 alkylene-O) p- (CH2) 1-12, - (CH2) 1-12-C3-8 cycloalkylene- and - (CH2) 1-12-C3-8 cycloalkylene- (CH2) 1-12;
    R4a is optionally further substituted with 1, 2, 3 or 4 R#group (s) ;
    R4b is -NH-, -O-, -C (O) -, -OC (O) -, -C (O) O-, -C (O) NH-or -NHC (O) -;
    R#is selected from the group consisting of H, halogen, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C2-6 alkenyl or C2-6 alkynyl;
    p is 1, 2, 3 or 4;
    alternatively,
    Ra and Rb are each independently selected from the group consisting of H and C1-4 alkyl;
    R4a is selected from the group consisting of - (CH2) 1-12-, - (CH2) 1-12-O-, -O- (CH2) 1-12-, -O- (CH2) 1-12-O-, - (CH2) 1-12-O- (CH2) 1-12-and (C1-4 alkylene-O) p- (CH2) 1-12;
    R4a is optionally further substituted with 1, 2 or 3 R#group (s) ;
    R4b is -NH-, -O-or -C (O) -;
    R#is selected from the group consisting of H, halogen, C1-6 alkyl and C1-6 haloalkyl;
    p is 1, 2 or 3;
    still alternatively,
    Ra and Rb are H;
    R4a is - (CH2) 2-12-;
    R4b is -NH-;
    R4a is optionally further substituted with 1 or 2 R#group (s) ;
    R#is selected from the group consisting of H, halogen and C1-4 alkyl.
  23. The polypeptide of any one of claims 11-22, wherein the chemical moiety comprises a structure of formula (V) :
    wherein R1, R2 and R3 are as defined in any one of claims 11-22.
  24. The polypeptide of any one of claims 11-23, wherein the chemical moiety comprises a structure of formula (VI) :
    wherein, the PEGm isR1c is selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl, m is an integer in range of 1 to 1000, 100 to 500 or 400 to 500.
  25. The polypeptide of claim 24, wherein the PEGm is a linear polyethylene glycol having a molecular weight of about 20000.
  26. The polypeptide of any one of claims 11-25, wherein the IFNα2b or the functional fragment thereof is modified by the chemical moiety at a residue corresponding to the residue selected from the group consisting of R12, L15, M16, R22, L26, F27, L30, R33, R33, H34, D35, A145, M148, R149, S152, L153, and N156 of SEQ ID NO: 1.
  27. The polypeptide of claim 26, wherein the IFNα2b or the functional fragment thereof comprises an amino acid substitution with a cysteine at a position corresponding to the position selected from the group consisting of R12, L15, M16, R22, L26, F27, L30, R33, R33, H34, D35, A145, M148, R149, S152, L153, and N156 of SEQ ID NO: 1, and the chemical moiety is linked to the IFNα2b or the functional fragment via the cysteine.
  28. The polypeptide of claim 27, wherein the R4 of the chemical moiety is linked to the S atom of the cysteine residue via a maleimide, an acetylene, a vinyl, a mono-substituted butenedioic acid, or a disubstituted maleimide.
  29. The polypeptide of any one of claims 1-28, wherein the IFNα2b or the functional fragment thereof is conjugated to a biomolecule specifically binding to a target.
  30. The polypeptide of claim 29, wherein the IFNα2b or the functional fragment thereof is conjugated to the biomolecule directly.
  31. The polypeptide of claim 29, wherein the IFNα2b or the functional fragment thereof is conjugated to the biomolecule via a linker.
  32. The polypeptide of any one of claims 29-31, wherein the biomolecule comprises an antibody or an antigen binding fragment thereof.
  33. The polypeptide of claim 32, wherein the antibody or the antigen binding fragment thereof is selected from the group consisting of a full-length antibody, a Fab, Fab’, a F (ab’) 2, a Fd, a Fd’, a Fv, a scFv, a ds-scFv, a sdAb and a nanobody.
  34. The polypeptide of any one of claims 28-33, wherein the target is PD-L1 or PD-1.
  35. The polypeptide of claim 34, wherein the biomolecule comprises a sdAb comprising a CDR1, a CDR2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 49, and the CDR1, CDR2 and CDR3 are according to Kabat numbering scheme.
  36. The polypeptide of claim 34, wherein the biomolecule comprises a sdAb comprising:
    (i) aCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50,
    (ii) aCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and 
    (iii) aCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.
  37. The polypeptide of claims 35 or 36, wherein the biomolecule comprises a sdAb, and the sdAb comprises a sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO: 49.
  38. The polypeptide of any one of claims 35 to 37, wherein the biomolecule further comprises a Fc region.
  39. A multi-functional polypeptide, comprising an IFNα2b or a functional fragment thereof of any one of claims 1-28, and an antibody or antigen-binding fragment thereof.
  40. The multi-functional polypeptide of claim 39, which includes a single copy of the IFNα2b or functional fragment thereof.
  41. The multi-functional polypeptide of claim 39 or 40, which comprises an Fc fragment.
  42. The multi-functional polypeptide of claim 41, wherein the IFNα2b or a functional fragment thereof is disposed on the C-terminal side of the Fc fragment.
  43. The multi-functional polypeptide of any one of claims 39 to 42, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof is disposed on the N-terminal side of the Fc fragment.
  44. The multi-functional polypeptide of any one of claims 41 to 43, wherein the Fc fragment comprises knob-in-hole substitutions as compared to the corresponding wild-type Fc fragment.
  45. The multi-functional polypeptide of any one of claims 41 to 44, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof has specificity to a tumor associated antigen or immune checkpoint protein.
  46. The multi-functional polypeptide of claim 45, wherein the tumor associated antigen is selected from the group consisting of EGFR, Her2, EpCAM, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD133, CD73, CEA, gpA33, Mucins, TAG-72, CIX, PSMA, folate-binding protein, GD2, GD3, GM2, VEGF, VEGFR, Integrin, aVb3, a5b1, ERBB2, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Tenascin, and Claudin 18.2.
  47. The multi-functional polypeptide of claim 45, wherein the immune checkpoint protein is selected from the group consisting of PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, CD28, CD122, 4-1BB, TIM3, OX-40, OX40L, CD40, CD40L, LIGHT, ICOS, ICOSL, GITR, GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM, BTLA, KIR, and CD47.
  48. The multi-functional polypeptide of claim 47, wherein antibody or antigen-binding fragment thereof is an anti-PD-L1 or anti-PD-1 single domain antibody (sdAb) .
  49. The multi-functional polypeptide of claim 48, wherein the anti-PD-L1 sdAb comprises a CDR1, a CDR2 and a CDR3 of SEQ ID NO: 49, and the CDR1, CDR2 and CDR3 are according to Kabat numbering scheme.
  50. The multi-functional polypeptide of claim of 48, wherein the anti-PD-L1 sdAb comprises:
    (i) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50,
    (ii) a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and 
    (iii) a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.
  51. The multi-functional polypeptide of claim of 49 or 50, wherein the anti-PD-L1 sdAb comprises a sequence having at least 80%identity to SEQ ID NO: 49.
  52. The multi-functional polypeptide of any one of claims 39-51, wherein the IFNα2b comprises the amino acid sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  53. An immunoconjugate comprising a multi-functional polypeptide of any one of claims 39-52 conjugated with a chemical moiety.
  54. The immunoconjugate of claim 53, wherein the chemical moiety comprises a structure of formula (VI) :
    wherein, the PEGm isR1c is selected from the group consisting of H, C1-4 alkyl and C1-4 haloalkyl, m is an integer in range of 1 to 1000, 100 to 500 or 400 to 500;
    alternatively, the PEGm is a linear polyethylene glycol having a molecular weight of about 20000.
  55. A polynucleotide encoding the polypeptide of any one of claims 1-38, or the multi-functional polypeptide of any one of claims 39-52.
  56. A vector comprising the polynucleotide of claim 55.
  57. A host cell comprising the vector of claim 56.
  58. A pharmaceutical composition comprising the polypeptide of claims 1-38, multi-functional polypeptide of any one of claims 39-52, the immunoconjugate of claim 53 or 54, or the polynucleotide of claim 55.
  59. A method for treating a disorder in a subject in need thereof, comprising administrating an effective amount of the polypeptide of claims 1-38, multi-functional polypeptide of any one  of claims 39-52, the immunoconjugate of claim 53 or 54, or the polynucleotide of claim 55 to the subject.
  60. The method of claim 59, wherein the disorder is cancer.
PCT/CN2023/131937 2022-11-16 2023-11-16 Attenuated interferon proteins and fragments and multifunctional polypeptides and conjugates WO2024104412A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2022132200 2022-11-16
CNPCT/CN2022/132200 2022-11-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024104412A1 true WO2024104412A1 (en) 2024-05-23

Family

ID=91083866

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2023/131937 WO2024104412A1 (en) 2022-11-16 2023-11-16 Attenuated interferon proteins and fragments and multifunctional polypeptides and conjugates

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024104412A1 (en)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101514229A (en) * 2009-04-03 2009-08-26 海南四环心脑血管药物研究院有限公司 Human interferon alpha derivative and polyethylene glycol modified substance thereof
CN104203982A (en) * 2011-10-28 2014-12-10 特瓦制药澳大利亚私人有限公司 Polypeptide constructs and uses thereof
WO2018144999A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences, Inc. Targeted engineered interferon and uses thereof
CN108727504A (en) * 2018-04-16 2018-11-02 中国科学院生物物理研究所 The fusion protein and its application of a kind of IFN and anti-PD-L1 antibody
WO2019091384A1 (en) * 2017-11-08 2019-05-16 Yafei Shanghai Biolog Medicine Science & Technology Co., Ltd. Conjugates of biomolecule and use thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101514229A (en) * 2009-04-03 2009-08-26 海南四环心脑血管药物研究院有限公司 Human interferon alpha derivative and polyethylene glycol modified substance thereof
CN104203982A (en) * 2011-10-28 2014-12-10 特瓦制药澳大利亚私人有限公司 Polypeptide constructs and uses thereof
WO2018144999A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences, Inc. Targeted engineered interferon and uses thereof
WO2019091384A1 (en) * 2017-11-08 2019-05-16 Yafei Shanghai Biolog Medicine Science & Technology Co., Ltd. Conjugates of biomolecule and use thereof
CN108727504A (en) * 2018-04-16 2018-11-02 中国科学院生物物理研究所 The fusion protein and its application of a kind of IFN and anti-PD-L1 antibody

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102426765B1 (en) Novel bispecific polypeptide for CD137
TWI772586B (en) Tri-chain antibody, preparation method and use thereof
CN112867734A (en) PD-1 targeting heterodimeric fusion proteins comprising an IL-15/IL-15Ra Fc fusion protein and a PD-1 antigen binding domain and uses thereof
JP2020512814A (en) Immunoconjugate
KR20180028548A (en) SIRP-alpha domain or a variant thereof
CN113423734A (en) PD-1 targeted IL-15/IL-15R alpha FC fusion protein and application thereof in combination therapy
CN113195523A (en) IL-12 heterodimer Fc fusion proteins
JP2021528988A (en) New bispecific agonist 4-1BB antigen-binding molecule
EP4017594A1 (en) Novel il-21 prodrugs and methods of use thereof
CN113301919A (en) Bispecific antibodies that activate immune cells
US20230272110A1 (en) Antibodies that bind psma and gamma-delta t cell receptors
TW202219065A (en) Immune activating Fc domain binding molecules
CN113811549A (en) Non-targeted and targeted IL-10 FC fusion proteins
WO2019129054A1 (en) Triabody, preparation method and use thereof
US20230331809A1 (en) Fusion proteins comprising a ligand-receptor pair and a biologically functional protein
KR20210027254A (en) Antibodies to TIM-3 and uses thereof
WO2022224997A1 (en) Anti-cldn4/anti-cd137 bispecific antibody
JP2022553129A (en) Antibodies against poliovirus receptor (PVR) and uses thereof
EP4194002A1 (en) Tgf-? rii mutant and fusion protein thereof
TW202235104A (en) Bi-functional molecules
CN116888153A (en) Antibodies that bind to gamma-delta T cell receptors
WO2024104412A1 (en) Attenuated interferon proteins and fragments and multifunctional polypeptides and conjugates
CA3191454A1 (en) Fusion protein comprising il-12 and anti-fap antibody, and use thereof
CA3164646A1 (en) Antibodies conjugated with fatty acid molecules and uses thereof
CN114867751A (en) 4-1BB and OX40 binding proteins and related compositions and methods, anti-4-1 BB antibodies, anti-OX 40 antibodies