KR102461238B1 - 암을 치료하기 위한 항-프로가스트린 항체와 면역치료 사이의 병용 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항-프로가스트린 (항-hPG) 단일클론 항체 및 면역 관문 저해제를 포함하는 조합, 및 상기 조합을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 조합을 이용한 암 치료 방법이 또한 제공된다.

Description

암을 치료하기 위한 항-프로가스트린 항체와 면역치료 사이의 병용 치료

면역치료(immunotherapy)는 암 (cancer) 치료 분야의 획기점 전환점이 되어 왔다. 인간 암은 다수의 체세포 유전자 변이 및 후생적으로 변형된 유전자, 잠재적으로 외래 항원으로 인식될 수 있는 산물을 가진다. 종양 (tumour) 세포는 종양-특이적 T 세포 중에 내성을 유도함으로써 내인성 면역 반응을 피한다. 종양 항원이 반응을 자극하면 면역 염증 반응이 지속적으로 활성화되지 않도록 하기 위하여, 다수의 조정 장치 또는 “관문”이 가동 중이거나 활성화되어 있다. 이들 면역 관문은 주변의 종양 미세환경에서 세포 상의 리간드에 대한 T-세포 수용체의 결합에 의해 주로 나타나며, 그 때 T 세포의 기능을 조절하는 면역학적 시냅스를 형성한다.

항종양 면역 반응을 유발하는 하나의 접근법은 암 세포에 의해 활성화된 면역-억제 경로의 차단을 가리키는, “관문 차단”으로 지칭되었다. 면역 관문-기반 치료의 발전은 놀라운 속도로 진행되고 있다. 면역계 (병원체에 대한 유기체의 방어 시스템)에 작용하고 특정 암에 효과적인 새로운 분자의 도입에 따라 주요 전환점을 맞았다. 이 새로운 분자를 사용하면 일부 피부 흑색종 (cutaneous melanoma) 환자에서 종양 퇴행을 관찰할 수 있다. 니볼루맙 (nivolumab) (Opdivo), 펨브롤리주맙 (pembrolizumab) (Keytruda), 또는 아테졸리주맙 (atezolizumab) (Tecentriq)과 같은 세포독성 T 림프구 (CTL)-관련 항원-4―CD80/CD86 경로 (이필리무맙 (ipilimumab)/Yervoy) 및 PD-1―PD-L1/PD-L2 경로의 여러 차단제의 최근 승인으로, 면역 관문 (IC) 저해제 (ICI)가 진행성 암 (cancer) 치료의 주요 성분으로 도입되었다.

그러나, 흑색종 (melanoma)에서도, 대부분의 환자는 제한적이거나 일시적인 반응만을 보이는 반면, 유방암 (breast cancer), 전립선암 (prostate cancer), 또는 결장암 (colon cancer)과 같은 일반적인 암은 산발적으로만 반응한다. 또한, 췌장 및 결직장 선암종 (pancreatic and colorectal adenocarcinoma)은 이러한 치료 방식, 특히 단일 작용제 PD-1 차단에 의해 유지되며 이에 큰 내성을 갖는다. 관문-차단 항체에 대한 지속적인 반응이 관찰됨에도 불구하고, 면역치료-반응성 암의 서브세트 내에 있는 모든 환자가 종양 (tumour) 퇴행을 나타내는 것은 아니라는 것이 명백하다.

따라서, 기존 면역 관문 저해제 경로에 작용하고 추가적인 억제를 제공하는 추가적인 경로를 여전히 확인할 필요가 있다.

도 1: BALB/cAnNRj 마우스는 결직장 암종 (colorectal carcinoma) 세포주, CT26.WT가 이식되고, 대조군 항체, 항-PD-1 항체, 항-PG 항체, 또는 항-PD-1 항체 및 항-PG 항체의 조합물(combination)이 처리되었다: (A) 카플란-마이오 생존도 (Kaplan-Meier survival plot); (B) 생존 시간 (일수) 중앙값.
도 2: 결직장 암종 (colorectal carcinoma) 세포주, CT26.WT로 이종이식되고, 대조군 항체, 항-PD-1 항체, 항-PG 항체, 또는 항-PD-1 항체 및 항-PG 항체의 조합으로 처리된 BALB/cAnNRj 마우스 내 INFγ 발현의 qPCR 분석.

본 발명자들은 프로가스트린에 결합하는 분자 및 면역 관문 저해제의 조합이 암에 대해 보다 나은 치료 효능을 생성함을 입증하였다. 특히, 발명자들은 항-프로가스트린 단일클론 항체를 항-PD-1 항체와 같은 면역 관문 저해제와 병용 투여하는 것이 대장암 (colorectal cancer) 세포주 이종이식된 마우스의 생존을 유의하게 증가시킴을 입증하였다. 이는 각 치료 단독과 비교할 때 유의하게 증가된 생존시간 중앙값 (median)에 의해 나타난다. 나아가, 상기 항-프로가스트린 단일클론 항체 및 면역 관문 저해제의 조합은 2배 이상의 인터페론 γ 발현 수준으로 나타난다.

제1 양태에서, 본 발명은 프로가스트린-결합 분자 및 면역 관문 저해제를 포함하는 조합에 관한 것이다. 바람직하게, 본 발명은 프로가스트린-결합 분자 및 면역 관문 저해제의 조합에 관한 것이다.

면역 관문 저해제

본 명세서에서 사용되는 “관문 저해제”는 예를 들어, 저분자, 가용성 수용체, 또는 항체와 같은 분자를 말하며, 이들은 면역 관문을 표적하고 상기 면역 관문의 기능을 막는다. 보다 구체적으로, 본 명세서에서 사용되는 “관문 저해제”는 T 세포, 및 일부 암 (cancer) 세포와 같은 일부 종류의 면역계 세포에 의해 만들어지는 특정 단백질을 차단하는, 예를 들어, 저분자, 가용성 수용체, 또는 항체와 같은 분자이다. 이러한 단백질, 본 명세서에서 사용되는 “면역 관문” 또는 “면역 관문 단백질”은 면역계에서 T 세포 기능을 조절한다. 특히, 이들은 면역 반응을 제어하도록 도우며 T 세포가 암 세포를 죽이지 않도록 할 수 있다. 상기 면역 관문 단백질은 T 세포에 신호를 전달하고 T 세포 기능을 본질적으로 끄거나 이를 저해하는 특정 리간드와 상호작용함으로써 이러한 결과를 얻는다. 이들 단백질의 저해는 T 세포 기능 및 암 세포에 대한 면역 반응을 회복하도록 한다. 관문 단백질의 예로는 이에 제한되는 것은 아니나, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4 (CD2 분자 패밀리에 속하며 모든 NK, γδ, 및 기억 CD8+ (αβ) T 세포 상에 발현됨), CD 160 (BY55로도 지칭됨), CGEN-15049, CHK 1 및 CHK2 키나아제, IDO1, A2aR 및 다양한 B-7 패밀리 리간드가 포함된다.

제1 실시양태에서, 면역 관문 저해제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4 (CD2 분자 패밀리에 속하며 모든 NK, γδ, 및 기억 CD8+ (αβ) T 세포 상에 발현됨), CD 160 (BY55로도 지칭됨), CGEN-15049, CHK 1 및 CHK2 키나아제, IDO1, A2aR 및 임의의 다양한 B-7 패밀리 리간드 중 임의의 것의 저해제이다.

본 명세서에서 사용되는 “저해제” 또는 “길항제(antagonist)”는 저해할 수 있거나 그렇지 않으면 임의의 상술된 면역 관문 단백질과 같은 표적 단백질의 1 이상의 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 면역 관문 단백질의 저해제 (예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 길항제 항체)는 예를 들어, 상기 면역 관문 단백질을 발현하는 세포 (예를 들어, T 세포)의 활성화 및/또는 세포 신호전달 경로를 저해하거나 그렇지 않으면 감소시켜, 길항제가 없을 때의 생물학적 활성에 비해 세포의 생물학적 활성을 저해함으로써 작용할 수 있다.

예시적인 면역 관문 저해제에는 항-CTLA-4 항체 (예를 들어, 이필리무맙 (ipilimumab)), 항-LAG-3 항체 (예를 들어, BMS-986016), 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-Tim3 항체 (예를 들어, TSR-022, MBG453), 항-BTLA 항체, 항-KIR 항체, 항-A2aR 항체, 항 CD200 항체, 항-PD-1 항체 (예를 들어, 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 니볼루 (nivolumab), 세미플리맙 (cemiplimab), 피딜리주맙 (pidilizumab)), 항-PD-L1 항체 (예를 들어, 아테졸리주맙 (atezolizumab), 아벨루맙 (avelumab), 더발루맙 (durvalumab), BMS 936559), 항-VISTA 항체 (예를 들어, JNJ 61610588), 항-CD28 항체, 항-CD80 또는 -CD86 항체, 항-B7RP1 항체, 항-B7-H3 항체, 항-HVEM 항체, 항-CD137 항체 (예를 들어, 우렐루맙 (urelumab)), 항-CD137L 항체, 항-OX40 (예를 들어, 9B12, PF-04518600, MEDI6469), 항-OX40L 항체, 항-CD40 또는 -CD40L 항체, 항-GAL9 항체, 항-IL-10 항체, PD-1 리간드, 예를 들어 PDL-1 또는 PD-L2의 세포외 도메인 및 IgG1의 융합 단백질 (예를 들어, AMP-224), OX40 리간드, 예를 들어 OX40L의 세포외 도메인 및 IgG1의 융합 단백질 (예를 들어, MEDI6383), IDO1 약물 (예를 들어, 에파카도스타트 (epacadostat)) 및 A2aR 약물이 포함된다. 다수의 면역 관문 저해제는 승인되었거나 현재 임상 시험 중이다. 이러한 저해제는 이필리무맙 (ipilimumab), 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 니볼루맙 (nivolumab), 세미플리맙 (cemiplimab), 피딜리주맙 (pidilizumab), 아테졸리주맙 (atezolizumab), 아벨루맙 (avelumab), 더발루맙 (durvalumab), BMS 936559, JNJ 61610588, 우렐루맙 (urelumab), 9B12, PF-04518600, BMS-986016, TSR-022, MBG453, MEDI6469, MEDI6383, 및 에파카도스타트 (epacadostat)를 포함한다.

면역 관문 저해제의 예는 예를 들어 하기에 나열된다: Marin-Acevedo et al., Journal of Hematology & Oncology 11: 8, 2018; Kavecansky and Pavlick, AJHO 13(2): 9-20, 2017; Wei et al., Cancer Discov 8(9): 1069-86, 2018.

바람직하게, 면역 관문 저해제는 CTLA-4, LAG-3, Tim3, PD-1, PD-L1, VISTA, CD137, OX40, 또는 IDO1의 저해제이다.

일부 실시양태에서, 저해제는 저분자 약물이다. 일부 실시양태에서, 저해제는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, 저해제는 항체이다.

“저분자 약물”은 일반적으로 약 1000 미만의 분자량을 갖는 유기, 무기, 또는 유기금속 화합물을 지칭하기 위해 본 명세서에서 널리 사용된다. 본 발명의 저분자 약물은 약 1000 미만의 분자량을 갖는 올리고펩티드 및 다른 생체분자를 포함한다.

“가용성 수용체”는, 본 명세서에서 수용체의 세포외 도메인을 포함하지만, 그의 막관통(transmembrane) 또는 세포질 도메인은 포함하지 않는 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “항체”는 다클론 및 단일클론 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 항체 (또는 “면역글로불린”)는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질로 이루어진다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (또는 도메인) (본 명세서에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본 명세서에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 “상보성 결정 영역” (CDR) 또는 “초가변 영역”으로 지칭되는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있으며, 이는 항원이 에피토프에 결합에 주로 관여하고, 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보다 보존된 영역에 산재되어 있다. 항체의 경쇄 및 중쇄 내 CDR을 확인하고 그의 서열을 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 오해를 피하기 위해, 본문에 반대의 표시가 없는 경우, 표현 CDR은 IMGT에 의해 정의되는 항체의 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역을 의미하며, 여기서 IMGT 고유 넘버링은 프레임워크 영역 몇 상보성 결정 영역, CDR1-IMGT: 27 내지 38, CDR2의 표준화된 경계를 제공한다.

IMGT 고유 넘버링은 항원 수용체, 사슬 유형, 또는 종류에 상관 없이 가변 도메인을 비교하기 위해 정의되었다 [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommi

, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. 및 Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. IMGT 고유 넘버링에서, 보존된 아미노산은 항상 동일한 위치, 예를 들어 시스테인 23 (1번째-CYS), 트립토판 41 (보존된-TRP), 소수성 아미노산 89, 시스테인 104 (2번째-CYS), 페닐알라닌 또는 트립토판 118 (J-PHE 또는 J-TRP)을 갖는다. IMGT 고유 넘버링은 프레임워크 영역 (FR1-IMGT: 위치 1 내지 26, FR2-IMGT: 39 내지 55, FR3-IMGT: 66 내지 104 및 FR4-IMGT: 118 내지 128) 및 상보성 결정 영역: CDR1-IMGT: 27 내지 38, CDR2-IMGT: 56 내지 65 및 CDR3-IMGT: 105 내지 117의 표준화된 경계를 제공한다. 간격은 비어있는 위치를 나타내므로, CDR-IMGT 길이 (괄호 사이에 표시되며 점으로 구분됨 (예: [8.8.13]))는 중요한 정보가 된다. IMGT 고유 넘버링은 IMGT Colliers de Perles로 지정된 2D 그래픽 표시 [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], 및 IMGT/3Dstructure-DB의 3D 구조 [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]에 사용된다.

각 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어 이펙터 세포) 및 전형적인 보체 시스템의 제1 성분 (CIq)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 상이한 이소타입 (즉, IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)의 것일 수 있다.

“다클론 항체”는 1 이상의 기타, 비-동일한 항체 중에서 또는 그의 존재 하에서 생성되는 항체이다. 일반적으로, 다클론 항체는 비-동일한 항체를 생성하는 여러 다른 B-림프구의 존재 하에서 B-림프구로부터 생성된다. 보통, 다클론 항체는 면역화 동물로부터 직접 얻는다.

용어 “단일클론 항체”는 거의 균일한 항체 군집으로부터 나온 항체를 지칭하며, 여기서 군집은 최소한의 비율로 발견될 수 있는 소수의 가능한 자연-발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 항체를 포함한다. 단일클론 항체는 하이브리도마와 같은 단일 세포 클론의 성장으로부터 생성되며, 하나의 클래스 및 서브클래스의 중쇄, 및 한 종류의 경쇄를 특징으로 한다.

일부 실시양태에서, 저해제는 길항제 항체, 즉, 본 명세서에서 기술된 임의의 하나의 면역 관문 단백질과 같은, 항원의 1 이상의 생물학적 활성을 저해하거나 감소시키는 항체이다. 특정 길항제 항체는 상기 항원의 1 이상의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 저해한다. 항체와 관련하여 사용될 때, 용어 “저해” 또는 그의 문법적 등가물은 항체가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제, 저지 또는 감소시키는 항체를 지칭한다. 항체의 저해 효과는 항원의 생물학적 활성에서 측정가능한 변화를 초래하는 것일 수 있다.

실시양태에서, 면역 관문 저해제는 이필리무맙 (ipilimumab), 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 니볼루맙 (nivolumab), 세미플리맙 (cemiplimab), 피딜리주맙 (pidilizumab), 아테졸리주맙 (atezolizumab), 아벨루맙 (avelumab), 더발루맙 (durvalumab), BMS 936559, JNJ 61610588, 우렐루맙 (urelumab), 9B12, PF-04518600, BMS-986016, TSR-022, MBG453, MEDI6469, MEDI6383, 및 에파카도스타트 (epacadostat)로 이루어지는 군에서 선택된다.

실시양태에서, 면역 관문 저해제는 CTLA-4, PD-1, 또는 PD-L1의 저해제이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 면역 관문 저해제는 CTLA-4, PD-1, 또는 PD-L1 중 임의의 것에 대한 항체이다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 길항제 항체이다. 보다 더 바람직하게, 상기 길항제 항체는 이필리무맙 (ipilimumab), 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 니볼루맙 (nivolumab), 세미플리맙 (cemiplimab), 피딜리주맙 (pidilizumab), 아테졸리주맙 (atezolizumab), 아벨루맙 (avelumab), 및 더발루맙 (durvalumab) 중에서 선택된다.

실시양태에서, 면역 관문 저해제는 PD-1의 저해제이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 면역 관문 저해제는 PD-1에 대한 항체이다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 길항제 항체이다. 보다 더 바람직하게, 면역 관문 저해제는 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 니볼루맙 (nivolumab), 세미플리맙 (cemiplimab), 또는 피딜리주맙 (pidilizumab)이다.

항-hPG 항체

프로가스트린 (PG)은 결직장 종양 (colorectal tumour) 세포에 의해 생성되며, 세포사를 초래하는 과정을 포함하여 세포의 정상적인 분화 과정을 차단하는 신호 전달 경로를 작동시킴으로써 이들 세포의 증식을 촉진하는 것으로 생각된다. 프로가스트린을 암호화하는 가스트린 유전자 전사체의 고갈은 시험관내 (in vitro) 및 생체내 (in vivo) CRC 모델에서 종양 세포 내 세포 분화 및 예정세포사를 유도하여 종양 세포 증식을 감소시킨다. 임의의 작동 이론에 구애받지 않으나, 항-hPG 항체는 PG의 결합을 통해 그의 신호전달 파트너(들)와 상호작용하는 능력을 차단 또는 저해하는 것으로 생각된다. 이는, 차례로, 그렇지 않으면 증식으로 이어질 결직장 종양 세포 내 신호 전달 경로를 저해한다.

101 아미노산 펩티드 (아미노산 서열 참조: AAB19304.1)인 인간 전프로가스트린 (pre-gastrin)은 가스트린 유전자의 주요 번역 산물이다. 프로가스트린 (PG)은 전프로가스트린으로부터 처음 21개의 아미노산 (신호 펩티드)의 절단에 의해 형성된다. 프로가스트린의 80개의 아미노산 사슬은 효소를 여러 생물학적 활성 가스트린 호르몬 형태 (프로가스트린의 아미노산 38-71을 포함하는 가스트린 34 (G34) 및 글리신-연장된 가스트린 34 (G34-Gly), 프로가스트린의 아미노산 55 내지 71을 포함하는 가스트린 17 (G17) 및 글리신-연장된 가스트린 17 (G17-Gly))로 절단 및 개질함으로써 추가로 가공된다.

용어 “프로가스트린”은 포유류의 프로가스트린 펩티드, 그리고 특히 인간 프로가스트린을 지칭한다. 오해를 피하기 위해, 임의의 설명 없는, 표현 “인간 프로가스트린” 또는 “hPG”는 서열 서열번호 1의 인간 PG를 말한다. 인간 프로가스트린은 특히 상술한 생물학적 활성 가스트린 호르몬 형태로 존재하지 않는 N-말단 도메인 및 C-말단 도메인을 포함한다. 바람직하게, 상기 N-말단 도메인의 서열은 서열번호 2로 표시된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 C-말단 도메인의 서열은 서열번호 3으로 표시된다.

“프로가스트린-결합 분자”는, 본 명세서에서 프로가스트린에 결합하지만 가스트린-17 (G17), 가스트린-34 (G34), 글리신-연장된 가스트린-17 (G17-Gly), 또는 글리신-연장된 가스트린-34 (G34-Gly) 및 C-말단 측면 펩티드 (CTFP)에는 결합하지 않는 임의의 분자를 지칭한다. 본 발명의 프로가스트린-결합 분자는, 예를 들어, 항체 분자 또는 수용체 분자와 같은 임의의 프로가스트린-결합 분자일 수 있다. 바람직하게, 프로가스트린-결합 분자는 항-프로가스트린 항체 (항-hPG 항체) 또는 그의 항원-결합 단편이다.

“결합”, “결합하다” 등은 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 생리학적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체 (complex)를 형성하는 것을 의미한다. 2개의 분자가 결합하는지를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 BSA 또는 카세인과 같은 비-특이적 분자에 결합하는 그의 친화성보다 적어도 2배 큰 친화성으로 프로가스트린에 결합한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 프로가스트린에만 결합한다.

보다 구체적인 실시양태에서, 본 항-hPG 항체는 프로가스트린의 에피토프를 인식하며, 여기서 상기 에피토프는 프로가스트린의 N-말단 부분의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 hPG의 잔기 10 내지 14, hPG의 잔기 9 내지 14, hPG의 잔기 4 내지 10, hPG의 잔기 2 내지 10 또는 잔기 2 내지 14를 포함할 수 있으며, hPG의 아미노산 서열은 서열번호 1이다.

보다 구체적인 실시양태에서, 항-hPG 항체는 프로가스트린의 에피토프를 인식하며, 여기서 상기 에피토프는 프로가스트린의 C-말단 부분의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 hPG의 잔기 71 내지 74, hPG의 잔기 69 내지 73, hPG의 잔기 71 내지 80 (서열번호 40), hPG의 잔기 76 내지 80 또는 hPG의 잔기 67 내지 74를 포함할 수 있으며, hPG의 아미노산 서열은 서열번호 1이다.

보다 구체적인 실시양태에서, 항-hPG 항체는 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 측정 시, 프로가스트린에 대해 적어도 5000 nM, 적어도 500 nM, 100 nM, 80 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1nM, 50 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 또는 적어도 0.1 pM의 친화성을 갖는다.

바람직하게, 항-hPG 항체는 중화 항-hPG 항체이다.

표현 “중화 항-hPG 항체”는 PG에 결합하고 PG-의존적 신호전달을 차단하여, 종양 (tumour) 세포, 그리고 특히 CRC 종양 세포 내에서 PG-유도된 반응의 저해를 불러오는 항체를 말한다. 암 (cancer) 세포의 PG-유도된 반응의 저해는 세포 분화의 억제, 세포 사멸의 억제, 및/또는 세포 증식의 촉진에 의해 매개될 수 있다.

구체적인 실시양태에서, 상기 프로가스트린-결합 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 하기로 이루어지는 군에서 선택된다: 다클론 항체, 단일클론 항체, 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 카멜화된 항체, IgA1 항체, IgA2 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체 및 IgM 항체.

다른 구체적인 실시양태에서, 프로가스트린에 결합하는 항체는 당업자에 의해 알려진 면역법에 의해 얻어지며, 여기서 아미노산 서열이 프로가스트린의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 펩티드를 면역원으로 사용한다. 보다 구체적으로, 상기 면역원은 하기에서 선택된 펩티드를 포함한다:

- 아미노산 서열이 전장 프로가스트린의 아미노산 서열, 그리고 특히 서열번호 1의 전장 인간 프로가스트린을 포함하거나 이로 이루어지는 펩티드,

- 아미노산 서열이 프로가스트린의 일부 아미노산 서열, 그리고 특히 서열번호 1의 전장 인간 프로가스트린에 대응하는 펩티드,

- 아미노산 서열이 프로가스트린의 N-말단 부분의 일부 또는 전체 아미노산 서열에 대응하는 펩티드, 그리고 구체적으로 아미노산 서열: SWKPRSQQPDAPLG (서열번호 2)를 포함하거나 이로 이루어지는 펩티드, 및

- 아미노산 서열이 프로가스트린의 C-말단 부분의 일부 또는 전체 아미노산 서열에 대응하는 펩티드, 그리고 구체적으로 아미노산 서열: QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (서열번호 3)을 포함하거나 이로 이루어지는 펩티드,

- 아미노산 서열이 프로가스트린의 C-말단 부분의 일부 아미노산 서열에 대응하는 펩티드, 그리고 구체적으로 프로가스트린의 아미노산 71-80에 대응하는 아미노산 서열 FGRRSAEDEN (서열번호 40)을 포함하는 펩티드

당업자는 이러한 면역화가 원하는대로 다클론 또는 단일클론 항체를 생성하는데 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 이들 종류의 항체 각각을 얻는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 당업자는 임의의 주어진 항원에 대해 다클론 및/또는 단일클론 항체를 생성하는 방법을 용이하게 선택하고 구현할 것이다.

인간 프로가스트린 (N-최말단)의 아미노산 서열 1-14에 대응하는 아미노산 서열 “SWKPRSQQPDAPLG”를 포함하는 면역원을 사용하여 생성된 단일클론 항체의 예는 하기 지정된 단일클론 항체를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다: 하기 표 1 내지 표 4에서 기술되는 mAb3, mAb4, mAb16, 및 mAb19 및 mAb20. 다른 단일클론 항체가 기술되어 있으나, 이들 항체가 실제로 프로가스트린에 결합하는지는 분명하지 않다 (WO 2006/032980). 에피토프 맵핑(epitope mapping)의 실험 결과는 mAb3, mAb4, mAb16, 및 mAb19 및 mAb20이 상기 hPG N-말단 아미노산 서열 내에서 에피토프에 특이적으로 결합함을 보여준다. 서열번호 2로 표시되는 프로가스트린의 N-말단 내에서 에피토프를 특이적으로 인식하는 다클론 항체는 당업계에 기술되어 있다 (예를 들어, WO 2011/083088를 참조한다).

인간 프로가스트린의 아미노산 서열 55-80에 대응하는 아미노산 서열 “QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN” (프로가스트린의 C-말단 부분)을 포함하는 면역원을 사용하여 생성될 수 있는 단일클론 항체의 예로는 이에 제한되는 것은 아니나, 하기 표 5 및 6의 mAb8 및 mAb13으로 표기되는 항체가 포함된다. 에피토프 맵핑의 실험 결과는 mAb13이 상기 hPG C-말단 아미노산 서열 내 에피토프에 특이적으로 결합함을 보여준다.

다른 예로는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 면역원을 사용하여 생성된 항-hPG 단일클론 및/또는 다클론 항체가 포함된다.

용어 “N-말단 항-hPG 항체” 및 “C-말단 항-hPG 항체”는 각각, hPG의 N-말단 부분에 위치한 아미노산을 포함하는 에피토프 또는 hPG의 C-말단 부분에 위치한 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 바람직하게, 용어 “N-말단 항-hPG 항체”는 서열이 서열번호 2로 표시되는 프로가스트린의 도메인에 위치한 에피토프에 결합하는 항체를 말한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 용어 “C-말단 항-hPG 항체”는 서열이 서열번호 3으로 표시되는 프로가스트린의 도메인에 위치한 에피토프에 결합하는 항체를 말한다.

용어 “에피토프”는 항체에 의해 결합된 항원의 영역을 말한다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 서브세트이며 상호작용의 친화성에 직접적으로 기여하는 아미노산을 갖는다. 에피토프는 또한 입체구조적일 수 있다. 특정 실시양태에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 그룹, 또는 설포닐 그룹과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹인 결정기를 포함할 수 있고, 특정 실시양태에서, 특유의 3차원 구조 특성, 및/또는 특유의 전하 특성을 가질 수 있다. 항체에 의해 결합된 에피토프의 결정은 당업자에게 알려진 임의의 에피토프 맵핑 기법에 의해 수행될 수 있다. 에피토프는 단백질의 아미노산 서열 내 순차적으로 위치하는 상이한 아미노산을 포함할 수 있다. 에피토프는 단백질의 아미노산 서열 내 순차적으로 위치하지 않는 아미노산을 또한 포함할 수 있다.

구체적인 실시양태에서, 상기 항체는 하기로 이루어진 군에서 선택된 단일클론 항체이다:

· 아미노산 서열 서열번호 4, 5 및 6의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 4, 5 및 6과 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 7, 8 및 9의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 7, 8 및 9와 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체,

· 아미노산 서열 서열번호 10, 11 및 12의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 10, 11 및 12와 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 13, 14 및 15의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 13, 14 및 15와 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체,

· 아미노산 서열 서열번호 16, 17 및 18의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 16, 17 및 18과 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 19, 20 및 21의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 19, 20 및 21과 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체,

· 아미노산 서열 서열번호 22, 23 및 24의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 22, 23 및 24와 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 25, 26 및 27의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 25, 26 및 27과 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체,

· 아미노산 서열 서열번호 28, 29 및 30의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 28, 29 및 30과 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 31, 32 및 33의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 31, 32 및 33과 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체, 및

· 아미노산 서열 서열번호 34, 35 및 36의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 34, 35 및 36과 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 37, 38 및 39의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 37, 38 및 39와 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체.

본 발명의 맥락에서, 핵산 또는 아미노산의 2개 서열 간의 “백분율 동일성” 또는 “% 동일성”은 최적 정렬 이후 얻어진, 비교될 2개의 서열 사이에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 백분율을 의미하고, 이 백분율은 순수하게 통계학적이며 2개의 서열 간의 차이는 그 길이를 따라 무작위적으로 분산된다. 2개의 핵산 또는 아미노산 서열의 비교는 전통적으로 이들을 최적 정렬한 후의 서열을 비교하여 수행되며, 상기 비교는 분할에 의해 또는 “정렬 윈도우”를 사용함으로써 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 손으로 비교하는 것 이외에도 당업자에게 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

참조 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 나타내는 아미노산 서열에 대해, 바람직한 예로는 참조 서열, 특정 변형, 특히 적어도 하나의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환, 절단 또는 신장을 포함하는 것이 포함된다. 1 이상의 연속적 또는 비연속적 아미노산의 치환의 경우, 치환된 아미노산이 “동등한” 아미노산에 의해 대체되는 치환이 바람직하다. 여기서, 표현 “동등한 아미노산”은 대응하는 항체 및 하기 정의된 구체적인 예시의 생물학적 활성을 변경시키지 않고서 구조 아미노산 중 하나로 치환될 가능성이 있는 임의의 아미노산을 가리키는 것을 의미한다.

동등한 아미노산은 치환되는 아미노산과의 구조적 상동성 또는 생성될 가능성이 있는 다양한 항체 간의 생물학적 활성의 비교 시험의 결과에 따라 결정될 수 있다.

보다 구체적인 실시양태에서, 상기 항체는 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 단일클론 항체이다:

· 아미노산 서열 서열번호 41의 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 42의 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체;

· 아미노산 서열 서열번호 43의 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 44의 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체;

· 아미노산 서열 서열번호 45의 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 46의 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체;

· 아미노산 서열 서열번호 47의 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 48의 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체;

· 아미노산 서열 서열번호 49의 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 50의 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체; 및

· 아미노산 서열 서열번호 51의 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 52의 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체.

구체적인 실시양태에서, 본 조합의 항체는 키메라 항체이다.

본 명세서에서 사용되는 “키메라 항체”는, 불변 영역, 또는 그의 일부가 변형, 치환, 또는 교체되어, 가변 영역이 다른 종의 불변 영역 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 불변 영역과 연결된 항체이다. “키메라 항체”는 또한 가변 영역, 또는 그의 일부가 변형, 치환, 또는 교체되어, 불변 영역이 다른 종의 가변 영역 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 가변 영역과 연결된 항체를 지칭한다.

다른 구체적인 실시양태에서, 본 조합의 항체는 인간화 항체이다.

본 명세서에서 사용되는 표현 “인간화 항체”는 비인간 기원의 항체로부터 유래한 CDR 영역을 포함하는 항체를 의미하며, 항체 분자의 다른 부분은 하나 또는 여러 인간 항체로부터 유래한다. 또한, 당업자에게 공지된 기술에 따라, 일부 골격 분절 잔기 (프레임워크에 대해서는 FR이라 함)는 결합 친화성을 유지하기 위해 변형될 수 있다 (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986). 인간화의 목표는 항체의 완전한 항원 결합 친화성 및 특이성을 유지하면서, 인간으로의 도입을 위한, 마우스 항체와 같은 이종 항체의 면역원성 감소이다.

본 발명의 인간화 항체 또는 그의 단편은 당업자에게 알려진 기법 (예를 들어, 문헌 [Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992]에 기술된 것)에 의해 제조될 수 있다. 이러한 인간화 항체는 시험관내 진단 또는 생체내 예방적 및/또는 치료적 처치를 포함한 방법에서의 사용이 바람직하다. 다른 인간화 기술이 또한 당업자에게 공지되어 있다. 실제로, 항체는 CDR-이식 (EP 0 451 261; EP 0 682 040; EP 0 939 127; EP 0 566 647; US 5,530,101; US 6,180,370; US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,639,641; US 6,054,297; US 5,886,152; 및 US 5,877,293), 베니어링 또는 재표면화 (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; Roguska M.A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:969-973), 및 사슬 셔플링 (미국 특허 번호 5,565,332)을 포함한 다양한 기법을 이용하여 인간화될 수 있다. 인간 항체는 파지 디스플레이 방법을 포함한 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 하기를 또한 참조한다: 미국 특허 번호 4,444,887, 4,716,111, 5,545,806, 및 5,814,318; 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741.

보다 구체적인 실시양태에서, 상기 항체는 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 인간화 항체이다:

· 아미노산 서열 서열번호 4, 5 및 6의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 4, 5 및 6과 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 7, 8 및 9의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 7, 8 및 9와 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체,

· 아미노산 서열 서열번호 10, 11 및 12의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 10, 11 및 12와 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 13, 14 및 15의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 13, 14 및 15와 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체,

· 아미노산 서열 서열번호 16, 17 및 18의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 16, 17 및 18과 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 19, 20 및 21의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 19, 20 및 21과 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체,

· 아미노산 서열 서열번호 22, 23 및 24의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 22, 23 및 24와 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 25, 26 및 27의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 25, 26 및 27과 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체,

· 아미노산 서열 서열번호 28, 29 및 30의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 28, 29 및 30과 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 31, 32 및 33의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 31, 32 및 33과 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체, 및

· 아미노산 서열 서열번호 34, 35 및 36의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 34, 35 및 36과 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 37, 38 및 39의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 적어도 하나, 우선적으로 적어도 2개, 우선적으로 3개 포함하거나 서열 서열번호 37, 38 및 39와 각각 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체,

여기서 상기 항체는 또한 인간 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄의 불변 영역을 포함한다.

다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 항체는 하기 군에서 선택되는 인간화 항체이다:

· 아미노산 서열 서열번호 53의 중쇄 가변 영역, 및 경쇄 아미노산 서열 서열번호 54의 가변 영역을 포함하는 인간화 항체;

· 아미노산 서열 서열번호 55의 중쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 56의 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항체;

·서열번호 57, 58, 및 59 사이에서 선택되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 60, 61, 및 62 사이에서 선택되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항체;

· 서열번호 63, 64, 및 65 사이에서 선택되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 66, 67, 및 68 사이에서 선택되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항체;

· 서열번호 69 및 71 사이에서 선택되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 70 및 72 사이에서 선택되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항체; 및

· 서열번호 75 및 76 사이에서 선택되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 77 및 78 사이에서 선택되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항체;

여기서 상기 항체는 또한 인간 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄의 불변 영역을 포함한다.

보다 바람직하게, 상기 항체는 아미노산 서열 서열번호 71의 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 72의 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 항체는 또한 인간 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄의 불변 영역을 포함한다.

보다 더 바람직하게, 상기 항체는 아미노산 서열 서열번호 73의 중쇄 및 아미노산 서열 서열번호 74의 경쇄를 포함한다.

항체 단편

항체의 단편, 특히 그의 항원-결합 단편이 또한 본 발명에 포함된다.

“항체 단편”은 전장 항체의 일부, 일반적으로 항원 결합 영역 또는 그의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 단편 및 Scfv; 디아바디 (diabody); 선형 항체; 미니바디 (minibody) (Olafsen et al. (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323), Fab 발현 라이브러리에 의해 제조된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, CDR (상보성 결정 영역), 및 면역특이적으로 암 (cancer) 세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원에 결합하는 본 명세서에서 기술된 임의의 에피토프-결합 단편, 단일사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다가특이적 항체를 포함한다.

항체 (또는 “항원-결합 단편”)의 “항원-결합 도메인”라는 용어는 항원 (예를 들어, hPG)에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 항체의 1 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 항체의 “항원-결합 도메인”라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) V_L, V_H, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 다리로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab′₂단편; (iii) V_H 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔 (arm)의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어지는 Fv 단편, (v) V_H 도메인으로 이루어지는, 단일 도메인 또는 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 (vii) 선택적으로 합성 링커에 의해 연결될 수 있는 2 이상의 단리된 CDR의 조합이 포함된다. 나아가, Fv 단편의 2개의 도메인, V_L 및 V_H는 별개의 유전자에 의해 암호화되며, 이들은 V_L 및 V_H 영역이 1가 분자 (단일 사슬 Fv (scFv)로도 알려짐; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA　85:5879-5883]을 참조함)를 형성하기 위해 쌍을 이루는 단일 단백질 사슬로서 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 이용하여 연결될 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 “항원-결합 도메인”이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다.

이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 종래 기술을 이용하여 얻으며, 단편은 온전한 항체에 대해서와 동일한 방식으로 유용성이 스크리닝된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다.

항체 유도체

본 발명의 항-hPG 항체는 당업계에 공지되어 있고 쉽게 입수가능한 추가의 비단백성 모이어티를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 특히, 진단 및 치료 용도에 사용하기 위하여 유도체화, 공유 변형, 또는 다른 분자에 접합된 항-hPG 단일클론 항체가 본 명세서에 포함된다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니나, 유도체화된 항체는 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 연결 등에 의해 변형된 항체를 포함한다. 임의의 수많은 화학적 변형은 이에 제한되는 것은 아니나, 특정 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사 합성 등을 포함하는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 또한, 유도체는 1 이상의 비-전통적 아미노산을 포함할 수 있다.

바람직하게, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 폴리머이다. 수용성 폴리머의 비제한적인 예로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 무수 에틸렌/말레산 코폴리머, 폴리아미노산 (호모폴리머 또는 무작위 코폴리머), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 코폴리머, 폴리옥시에틸레이티드 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 그의 혼합물이 포함된다. 폴리머는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 결합하는 폴리머의 수는 다양할 수 있고, 1 이상의 폴리머가 결합된 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화를 위한 폴리머의 수 및/또는 유형은 이에 제한되는 것은 아니나, 항체 유도체가 정의된 조건 하에서의 치료에 사용될지 여부 등, 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능을 포함하는 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.

특정 예에서, 본 개시 내용의 항-hPG 항체는 폴리(에틸렌글리콜) (PEG) 모이어티에 부착될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 항체 단편이고 PEG 모이어티는 항체 단편에 위치한 임의의 이용 가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 히드록실 또는 카르복실기를 통해 부착된다. 이러한 아미노산은 항체 단편에서 자연 발생하거나 재조합 DNA 방법을 이용하여 단편 내로 조작되어 들어갈 수 있다. 예를 들어 미국 특허 번호 5,219,996을 참조한다. 복수의 위치가 2 이상의 PEG 분자에 부착되기 위해 사용될 수 있다. PEG 모이어티는 항체 단편에 위치한 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올기를 통해 공유적으로 연결될 수 있다. 티올기가 부착 지점으로 사용되는 경우, 적절히 활성화된 이펙터 모이어티, 예를 들어 말레이미드와 같은 티올 선택적 유도체 및 시스테인 유도체가 사용될 수 있다.

특정 예에서, 항-hPG 항체 접합체는 예를 들어, EP0948544에 개시된 방법에 따라, 페길화된, 즉, PEG (폴리(에틸렌글리콜))가 공유적으로 부착된 변형된 Fab' 단편이다. 또한 하기를 참조한다: Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris and S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D.C., 1997); 및 Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam and A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998); 및 Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545. PEG는 힌지 영역에서 시스테인에 부착될 수 있다. 일 예로, PEG-변형된 Fab' 단편은 변형된 힌지 영역에서 단일 티올기에 공유적으로 연결된 말레이미드기를 가진다. 리신 잔기는 말레이미드기에 공유적으로 연결될 수 있고 리신 잔기 상의 각 아민기에는 약 20,000 Da의 분자량을 갖는 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 폴리머가 부착될 수 있다. 따라서 Fab' 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 약 40,000 Da일 수 있다.

다른 실시양태에서, 항체 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백성 모이어티의 접합체가 제공된다. 일 실시양태에서, 비단백성 모이어티는 탄소 나노튜브 (Kam et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))이다. 방사선은 임의의 파장일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 보통의 세포에 유해하지 않으나, 비단백성 모이어티를 항체-비단백성 모이어티에 근접한 세포가 사멸되는 온도까지 가열시키는 파장을 포함한다.

면역접합체 (Immunoconjugate)

다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 항-hPG 항체를 포함하는 면역접합체 ("항체-약물 접합체," 또는 "ADC"로 교환가능하게 지칭됨)를 또한 제공하며, 상기 항체는 화학요법제, 약물, 성장 저해제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편)와 같은 1 이상의 세포독성제, 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된다.

면역접합체는 세포독성제, 즉, 암 치료에서, 세포를 죽이거나 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 약물의 국소 전달에 사용되어 왔다 (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146; Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172; 미국 특허 번호 4,975,278). 면역접합체는 약물 모이어티가 종양 (tumour)에 표적 전달되고 그 안에 세포내 축적될 수 있도록 하는데, 접합되지 않은 약물의 전신 투여는 제거되고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에도 허용되지 않는 수준의 독성을 초래할 수 있다 (Baldwin et al, Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe (1985) “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,”in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506). 다클론 항체 및 단일클론 항체 모두 이러한 전략에 유용한 것으로 보고되어 왔다 (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21 :183-87). 이러한 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신 (daunomycin), 독소루비신 (doxorubicin), 메토트렉세이트 (methotrexate), 및 빈데신 (vindesine) (Rowland et al., (1986) supra)을 포함한다. 항체-독소 접합체에 사용되는 독소는 디프테리아 (diphtheria) 독소와 같은 세균성 독소, 리신과 같은 식물 독소, 겔다나마이신 (geldanamycin) (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), 메이탄시노이드 (maytansinoid) (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), 및 칼리키아마이신 (calicheamicin) (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)과 같은 저분자 독소를 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 저해를 포함하는 매커니즘에 의해 세포독성 효과를 발휘할 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합될 때 불활성화되거나 덜 활성을 갖는 경향이 있다.

특정 실시양태에서, 면역접합체는 항체 및 화학요법제 또는 다른 독소를 포함한다. 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제가 본 명세서 (예를 들어, 상기)에 개시된다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-8연구균 (sarcin), 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca Americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 저해제, 컬신 (curcin), 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신 (phenomycin), 에노마이신 (neomycin), 및 트리코테신을 포함한다. 예를 들어, WO 93/21232 (1993.10.28에 공개)를 참조한다. 방사성 접합 항체의 생산을 위해 다양한 방사성핵종 (radionuclide)이 이용가능하다. 예로는 ²¹²Bi,　¹³¹I,　¹³¹In,　⁹⁰Y, 및 ¹⁸⁶Re가 포함된다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (예: 디메틸 아디피미데이트 염산염), 활성 에스테르 (예: 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예: 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예: 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)과 같은 다양한 이작용성 단백질-커플링제를 이용하여 제조된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et ah, Science, 238: 1098 (1987)]에 기술된 것과 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 l-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 킬레이트제의 예이다. WO94/11026을 참조한다.

항체 및 칼리키아마이신 (calicheamicin), 메이탄시노이드 (maytansinoid), 돌라스타틴 (dolastatin), 아우로스타틴 (aurostatin), 트리코테신 (trichothecene), 및 CC 1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체와 같은 1 이상의 저분자 독소의 접합체가 또한 본 명세서에서 고려된다.

본 발명의 면역접합체는 링커를 추가로 포함할 수 있다.

“링커”, “링커 유닛”, 또는 “링크”는 적어도 하나의 세포독성제에 결합 단백질이 공유적으로 부착하는 공유 결합 또는 원자의 사슬을 포함하는 화학적 모이어티를 의미한다.

링커는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (예: 디메틸 아디피미데이트 염산염), 활성 에스테르 (예: 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예: 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예: 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)과 같은 다양한 이작용성 단백질 커플링제를 이용하여 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 다루려는 시스템에 세포독성제를 접합시키기 위한 킬레이트제의 예이다. 다른 교차-링커 시약은 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Ill., U.S.A)의 것) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)일 수 있다.

링커는 “절단 가능하지 않은” 또는 “절단 가능한”일 수 있다.

핵산 및 발현 시스템

본 개시 내용은 항체, 특히 항-hPG 항체에 대한 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 및 본 개시 내용의 항체를 생산할 수 있는 숙주 세포를 포함한다.

제1 양태에서, 본 발명은 항체, 특히 상술한 프로가스트린에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 암호화하는 1 이상의 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

제1 실시양태는 상술한 항-hPG 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직하게, 상기 중쇄는 서열 서열번호 4, 5 및 6의 3개의 중쇄 CDR을 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 중쇄는 서열 서열번호 14의 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 보다 더 바람직하게, 상기 중쇄는 완전한 서열 서열번호 16을 갖는다.

다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 상술한 항-hPG 항체의 경쇄를 암호화한다. 바람직하게, 상기 중쇄는 서열 서열번호 7, 8 및 9의 3개의 중쇄 CDR을 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 중쇄는 서열 서열번호 15의 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 보다 더 바람직하게, 상기 중쇄는 완전한 서열 서열번호 17을 갖는다.

본 발명에 따르면, 다양한 발현 시스템은 본 발명의 항체를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 일 양태에서, 이러한 발현 시스템은 관심있는 암호화 서열이 생성되고 이어 정제될 수 있는 비히클(vehicle)를 나타내지만, 적절한 뉴클레오티드 암호화 서열로 일시적으로 형질감염될 때 IgG 항체를 원위치 발현할 수 있는 세포를 또한 나타낸다.

본 발명은 상술한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 일 실시양태에서, 벡터는 관심있는 항체 (예를 들어, 항-hPG 항체)의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 관심있는 항체 (예를 들어, 항-hPG 항체)의 경쇄를 암호화한다. 본 발명은 또한 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자, 및 그의 프로브를 포함하는 벡터를 제공한다.

관심있는 항체 (예를 들어, 항-hPG 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄를 발현하기 위하여, 상기 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 유전자가 전사 및 번역 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터에 삽입된다.

“작동가능하게 연결된” 서열은 관심 유전자와 인접한 발현 조절 서열, 및 관심 유전자를 제어하기 위해 가로질러서(in trans) 또는 멀리서 작용하는 발현 조절 서열을 모두 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “발현 조절 서열”은 이들이 결찰되는 암호화 서열의 발현 및 가공에 영향을 미치는데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종료, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열 (즉, 코작 (Kozak) 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 다르다; 원핵생물에서, 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함한다; 진핵생물에서, 일반적으로, 이러한 조절 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 “조절 서열”은 최소한, 그의 존재가 발현 및 가공에 필수적인 모든 성분을 포함하는 것으로 의도되며, 또한 존재하는 것이 유리한 추가 성분, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “벡터”는 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 하나의 유형은 “플라스미드”로, 이는 추가적인 DNA 분절이 결찰 (ligated)될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 벡터로, 여기서 추가적인 DNA 분절은 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다 (예를 들어, 세균 복제 개시점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포로 도입 시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다.

특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 “재조합 발현 벡터” (또는 간단히, “발현 벡터”)로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 플라스미드 형태이다. 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문에 본 명세서에서, “플라스미드” 및 “벡터”는 교환가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 세균 플라스미드, YAC, 코스미드, 레트로바이러스, EBV-유래 에피솜와 같은 형태의 발현 벡터, 및 당업자가 관심있는 항체 (예를 들어, 항-hPG 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄의 발현을 보장하는데 편리한 것으로 알고 있는 모든 다른 벡터를 포함하는 것으로 의도된다. 당업자는 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상이한 벡터 또는 동일한 벡터로 클로닝될 수 있음을 인식할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 2개의 벡터로 클로닝된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 이들 분자를 포함하는 벡터는 적합한 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “숙주 세포”는 관심있는 항체 (예를 들어, 항-hPG 항체)를 발현하기 위해 재조합 발현 벡터가 도입되는 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손도 지칭하는 것으로 의도되었음을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 특정 변형이 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 본 명세서에서 사용되는 용어 “숙주 세포”의 범위 내 여전히 포함된다.

형질전환은 폴리뉴클레오티드를 세포 숙주 내로 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며 덱스트란-매개 형질전환, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기 천공, 폴리뉴클레오티드의 리포좀으로의 캡슐화, DNA의 핵으로의 생물학적 주입 및 및 직접적 미량주사를 포함한다.

숙주 세포는 1 이상의 발현 벡터로 공동-형질감염될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 상술한 관심있는 항체 (예를 들어, 항-hPG 항체)의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 벡터로 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 관심있는 항체 (예를 들어, 항-hPG 항체)의 중쇄를 암호화하는 제1 벡터 및 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 제2 벡터로 형질감염될 수 있다. 포유류의 세포는 재조합 치료 면역글로불린의 발현, 특히 전체 재조합 항체의 발현에 일반적으로 사용된다. 예를 들어, 인간 거대세포바이러스로부터의 주요 중간의 초기 유전자 프로모터 성분을 지니는 것과 같은 발현 신호를 포함하는, HEK293 또는 CHO 세포와 같은 포유류의 세포는 벡터와 함께 본 발명의 인간화 항-hPG 항체를 발현하는 효과적인 시스템이다 (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:　2).

또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 숙주 세포가 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형 (예를 들어, 글리코실화) 및 가공은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 가공 및 변형을 위한 특징 및 특정 매커니즘을 갖는다. 발현된 관심있는 항체의 정확한 변형 및 가공을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택된다. 따라서, 일차 전사체의 적절한 처리, 유전자 산물의 글리코실화를 위한 세포 기구를 갖는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유류의 숙주 세포는 이에 제한되는 것은 아니나, CHO, COS, HEK293, NS/0, BHK, Y2/0, 3T3 또는 골수종 (myeloma) 세포를 포함한다 (모든 이들 세포주는 공공 기탁기관 (예: Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (Paris, France), 또는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, U.S.A.))으로부터 입수 가능하다).

장기적으로 재조합 단백질의 고수율 생산을 위하여, 안정적인 발현이 바람직하다. 본 발명의 일 실시양태에서, 항체를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 개시점을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 대신에, 숙주 세포는 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위, 및 당업자에게 공지된 다른 적절한 서열, 및 선택 마커를 포함하는 적절한 발현 조절 요소의 제어 하에 DNA로 형질전환된다. 외래 DNA의 도입 이후, 조작된 세포는 농축 배지에서 1일 내지 2일 동안 성장할 수 있으며, 이후 선택 배지로 이동된다. 재조합 플라스미드 상의 선택 마커는 선택에 대한 내성을 부여하며 세포가 플라스미드를 안정적으로 염색체에 통합시키고 세포주로 확장되도록 한다. 안정한 세포주를 구성하는 다른 방법이 당업계에 공지되어 있다. 구체적으로, 부위-특이적 통합 방법이 개발되었다. 이들 방법에 따르면, 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위, 및 다른 적절한 서열을 포함하는 적절한 발현 조절 요소의 제어 하에서 형질전환된 DNA는 미리 절단된 특정 표적 위치에서 숙주 세포 게놈에 통합된다 (Moele et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104(9): 3055-3060; US 5,792,632; US 5,830,729; US 6,238,924; WO 2009/054985; WO 03/025183; WO 2004/067753).

이에 제한되는 것은 아니나 각각 tk, hgprt 또는 aprt 세포 내의, 단순 헤르페스 바이러스 (Herpes simplex virus) 티미딘 키나아제 (Wigler et al., Cell 11:223, 1977), 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48: 202, 1992), 메티오닌 설폭시미드 존재 하의 글루타메이트 신타아제 선택 (Adv Drug Del Rev, 58: 671, 2006, 및 론자 (Lonza Group Ltd.)의 웹사이트 또는 문헌) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy et al., Cell 22: 817, 1980) 유전자를 포함하는 다수의 선택 시스템이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 내성은 하기 유전자에 대한 선택의 기초로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트 (methotrexate)에 대한 내성을 부여하는 dhfr (Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77: 357, 1980); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt (Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78: 2072, 1981); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo (Wu et al., Bi다른apy 3: 87, 1991); 및 히그로마이신 (hygromycin)에 대한 내성을 부여하는 hygro (Santerre et al., Gene 30: 147, 1984). 재조합 DNA 기술 분야에서 공지된 방법이 원하는 재조합 클론을 선택하는데 기계적으로 적용될 수 있으며, 이러한 방법은 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993)]에 기술되어 있다. 항체의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다. 항체를 발현하는 벡터 시스템 내 마커가 증폭가능한 경우, 배양물 내 저해제 수준의 증가는 마커 유전자의 카피수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 본 발명의 IgG 항체를 암호화하는 유전자와 관련되기 때문에, 상기 항체의 생산이 또한 증가될 것이다 (Crouse et al., Mol Cell Biol 3: 257, 1983). 본 발명의 유전자를 발현시키는 대안적인 방법이 존재하며 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자의 업스트림에 발현 조절 요소가 결합할 수 있도록 변형된 징크 핑거 단백질이 조작될 수 있고; 본 발명의 숙주 세포 내 상기 조작된 징크 핑거 단백질 (ZFN)의 발현은 단백질 생산을 증가시킨다 (예를 들어 문헌[Reik et al., Biotechnol. Bioeng., 97(5): 1180-1189, 2006]을 참조한다). 나아가, ZFN은 미리 결정된 게놈 위치로의 DNA 통합을 자극하며, 이로 인해 고효율 부위-특이적 유전자 첨가가 나타난다 (Moehle et al, Proc Natl Acad Sci USA, 104: 3055, 2007).

관심있는 항체 (예를 들어, 항-hPG 항체)는 원하는 항체를 발현하는데 필요한 배양 조건 하에서 형질전환된 숙주 세포의 배양물을 성장시켜 제조될 수 있다. 생산된 발현된 항체는 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제될 수 있다. 관심있는 항체 (예를 들어, 항-hPG 항체)의 가용 형태가 배양 상등액으로부터 회수될 수 있다. 이는 이후 면역글로불린 분자의 정제에 대해 당업계에서 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 Fc에 대한 단백질 A 친화도 등), 원심분리, 분별 용해도 (differential solubility) 또는 단백질 정제에 대한 임의의 기타 표준 기법에 의해 정제될 수 있다. 적합한 정제 방법은 당업자에게 명백할 것이다.

따라서 본 발명의 다른 양태는 본 명세서에서 기술된 항체 (예를 들어, 항-hPG 항체)의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 적절한 배양 조건에서 배양 배지 내 상기-기술된 숙주 세포를 성장시키는 단계; 및

b) 항체 (예를 들어, 항-hPG 항체)를 배양 배지 또는 상기 배양된 세포로부터 회수하는 단계.

약학 조성물

항-hPG 단일클론 항체 및 면역 관문 저해제의 조합은 조성물로 제형화될 수 있다. 선택적으로, 조성물은 하기 기술된 제3 치료제와 같은 1 이상의 추가적인 치료제를 포함할 수 있다. 조성물은 일반적으로 약제학적으로 허용되는 비히클 및/또는 부형제를 포함하는 멸균 약학 조성물의 일부로서 일반적으로 제공될 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 이렇게 하여 항-hPG 항체, 면역 관문 저해제, 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

이 조성물은 임의의 적합한 형태일 수 있다 (환자에게 투여하는 바람직한 방법에 따라). 본 명세서에서 사용되는 “투여”는 투여량의 화합물 (예를 들어, 상술한 항-hPG 항체 및/또는 면역 관문 저해제) 또는 조성물 (예를 들어, 약학 조성물, 예를 들어, 상술한 항-hPG 항체 및/또는 면역 관문 저해제를 포함하는 약학 조성물)을 개체에게 제공하는 방법을 의미한다. 본 명세서에 기재된 방법에 사용된 조성물은 예를 들어, 유리체내 (예를 들어, 유리체내 주사에 의해), 점안제에 의해, 근육내, 정맥내, 피부내, 경피로, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 흉강내, 기관내, 척추강내, 비강내, 질내, 직장내, 국소적으로, 종양내, 복강내, 피하, 결막하, 방광내, 점막으로, 심낭내, 제대내, 안구내, 안와내, 경구, 국소적으로, 경피, 흡입으로, 주사로, 이식으로, 주입으로, 연속 주입으로, 표적 세포를 직접적으로 씻어 내는 국소 관류에 의해, 카테터에 의해, 세척에 의해, 크림으로, 또는 지질 조성물로, 투여될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 방법에서 사용되는 조성물은 또한 전신 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 투여 방법은 다양한 인자 (예를 들어, 투여되는 화합물 또는 조성물 및 치료될 상태, 질환, 또는 질병의 심각성)에 따라 다양할 수 있다. 임의의 경우에 투여하기에 가장 적합한 경로는 특정 항체, 개체, 질환의 성질 및 심각성 및 개체의 건강 상태에 따라 달라질 것이다. 항-hPG 항체 및/또는 면역 관문 저해제는 수용액으로 제형화되고 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.

약학 조성물은 투여량 당 미리 결정된 양의 항-hPG 항체 및/또는 면역 관문 저해제를 포함하는 단위 용량 형태로 편리하게 제공될 수 있다. 이러한 단위는 예를 들어 5 mg 내지 5 g, 예를 들어 10 mg 내지 1 g, 또는 20 내지 50 mg을 제한 없이 포함할 수 있다. 본 개시 내용에 사용하기 위한 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어, 치료될 상태 또는 투여 경로에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다.

본 개시 내용의 약학 조성물은 원하는 순도를 갖는 항체를, 당업계에서 전형적으로 사용되는 선택적인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (이들 모두는 본 명세서에서 “담체”로 칭함), 즉, 완충제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비이온성 계면활성제, 산화방지제, 및 기타 첨가제와 혼합함으로써 동결건조 제제 또는 수용액으로 저장하기 위해 제조될 수 있다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)]을 참조한다. 이러한 첨가제는 사용된 투여량 및 농도에서 수혜자에게 무독성이어야 한다.

완충제는 생리학적 조건에 가까운 범위에서 pH를 유지하는 것을 돕는다. 이들은 약 2 mM 내지 약 50 mM의 범위의 농도로 존재할 수 있다. 본 개시 내용과 함께 사용하기에 적합한 완충제는 시트레이트 완충제 (예를 들어, 모노소듐 시트레이트-디소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-트리소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-모노소듐 시트레이트 혼합물 등), 숙시네이트 완충제 (예를 들어, 숙신산-모노소듐 숙시네이트 혼합물, 숙신산-소듐 히드록시드 혼합물, 숙신산-디소듐 숙시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충제 (예를 들어, 타르타르산-소듐 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-포타슘 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-소듐 히드록시드 혼합물 등), 푸마레이트 완충제 (예를 들어, 푸마르산-모노소듐 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-디소듐 푸마레이트 혼합물, 모노소듐 푸마레이트-디소듐 푸마레이트 혼합물 등), 글루코네이트 완충제 (예를 들어, 글루콘산-소듐 글루코네이트 혼합물, 글루콘산-소듐 히드록시드 혼합물, 글루콘산-포타슘 글루코네이트 혼합물 등), 옥살레이트 완충제 (예를 들어, 옥살산-소듐 옥살레이트 혼합물, 옥살산-소듐 히드록시드 혼합물, 옥살산-포타슘 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충제 (예를 들어, 락트산-소듐 락테이트 혼합물, 락트산-소듐 히드록시드 혼합물, 락트산-포타슘 락테이트 혼합물 등) 및 아세테이트 완충제 (예를 들어, 아세트산-소듐 아세테이트 혼합물, 아세트산-소듐 히드록시드 혼합물 등)와 같은 유기 및 무기산 및 그의 염을 포함한다. 또한, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및 Tris와 같은 트리메틸아민 염이 사용될 수 있다.

보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가될 수 있으며, 0.2%-1% (w/v) 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 본 개시 내용과 함께 사용하기에 적합한 보존제는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레솔, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드 (예를 들어, 클로라이드, 브로마이드, 및 아이오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 및 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 및 3-펜탄올을 포함한다. 때로 “안정화제”로 알려진 등장화제는 본 개시 내용의 액체 조성물의 등장성을 보장하기 위해 첨가될 수 있으며 폴리히드릭 당 알코올, 예를 들어 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨과 같은 트리히드릭 또는 그 이상의 당 알코올을 포함한다. 안정화제는 증량제부터, 치료제를 안정화시키거나 변성 또는 용기 벽에의 부착을 방지하도록 돕는 첨가제에 이르기까지 기능적으로 다양한 범위의 부형제를 지칭한다. 대표적인 안정화제는 폴리히드릭 당 알코올 (상기 열거된); 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등과 같은 아미노산, 이노시톨과 같은 시클리톨을 포함하여, 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 미오이노시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등과 같은 유기 당 또는 당 알코올; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 폴리머; 요소, 글루타티온, 티옥산, 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 소듐 티오 설페이트와 같은 황 함유 환원제; 저분자량 폴리펩티드 (예를 들어, 10 이하 잔기의 펩티드); 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 자일로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스와 같은 단당류; 락토스, 말토스, 수크로스와 같은 이당류 및 라피노스와 같은 삼당류; 및 덱스트란과 같은 다당류일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질 중량부 당 0.1 내지 10,000 중량의 범위로 존재할 수 있다.

비이온성 계면활성제 또는 세제 (“습윤제”로도 알려짐)는 치료제를 가용화하며 교반-유도 응집으로부터 치료용 단백질을 보호할 수 있도록 첨가될 수 있으며, 또한 제형이 단백질의 변성을 일으키지 않고 전단 표면 응력에 노출되도록 한다. 적합한 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 (20, 80 등), 폴리옥사머 (184, 188 등), 플루로닉 (Pluronic) 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (TWEEN®-20, TWEEN®-80 등)를 포함한다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 예를 들어 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재할 수 있다

추가적인 기타 부형제는 증량제 (예를 들어, 녹말), 킬레이트제 (예를 들어, EDTA), 산화방지제 (예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 및 공용매를 포함한다.

추가로 본 발명은 동시에, 별도로 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합 산물로서 적어도 하기를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다:

i) 하나의 항-hPG 항체 및

ii) 면역 관문 저해제.

본 명세서에서 사용되는 “동시 사용”은 본 발명에 따른 조성물의 2개의 화합물을 단일 및 동일한 제약 형태로 투여하는 것을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 “별도의 사용”은 본 발명에 따른 조성물의 2개의 화합물을 별개의 제약 형태로 동시에 투여하는 것을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 “순차적 사용”은 본 발명에 따른 조성물의 2개의 화합물을 각각 별개의 제약 형태로 연속 투여하는 것을 지칭한다.

항-hPG 항체 및 면역 관문 저해제의 조성물은 1 이상의 항-hPG 단일클론 항체 및/또는 1 이상의 면역 관문 저해제의 혼합물로서, 혼합물로 또는 암 (cancer), 특히 CRC의 치료에 유용하거나 암, 특히 CRC에 대한 다른 치료법에 보조적인 다른 제제와 조합하여, 개별적으로 투여될 수 있다. 적절한 조합 및 보조 치료법의 예는 하기에 제공된다.

본 개시 내용에는 상술한 중화 항-hPG 항체 (항체 접합체를 포함함) 및 면역 관문 저해제를 포함하는 약학 키트가 포함된다. 약학 키트는 중화 항-hPG 항체 및/또는 면역 관문 저해제 (예를 들어, 동결건조 형태로 또는 수용액으로) 및 하기 1 이상을 포함하는 패키지이다:

·예를 들어 하기 기술된 것과 같은 제3 치료제;

·중화 항-hPG 항체 및/또는 면역 관문 저해제를 투여하기 위한 장치로서, 예를 들어 펜, 니들 및/또는 주사기; 및

·항체 및/또는 저해제가 동결건조된 형태인 경우 항체를 재현탁하기 위한 제약 등급의 물 또는 완충제.

항-hPG 항체 및/또는 면역 관문 저해제의 각 단위 용량은 개별적으로 포장될 수 있고, 키트는 1 이상의 단위 용량 (예를 들어, 2개의 단위 용량, 3개의 단위 용량, 4개의 단위 용량, 5개의 단위 용량, 8개의 단위 용량, 10개의 단위 용량, 또는 그 이상)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 1 이상의 단위 용량은 주사기 또는 펜에 각각 보관된다

효과적인 투여량

항-hPG 항체 및 면역 관문 저해제의 조합은 일반적으로 의도된 결과를 얻기에 효과적인 양, 예를 들어 이를 필요로 하는 개체에서 암 (cancer)을 치료하기에 효과적인 양으로 사용될 것이다. 항-hPG 항체 및/또는 면역 관문 저해제를 포함하는 약학 조성물은 치료적으로 유효한 투여량으로 환자 (예를 들어, 인간 개체)에게 투여될 수 있다.

용어 “치료적으로 유효한 투여량”은 개체에서 원하는 생물학적 반응을 이끌어내는 활성 화합물 또는 접합체의 양을 의미한다. 이러한 반응에는 치료되는 질병 또는 장애의 증상 완화, 질병의 증상 또는 질병 자체의 재발 예방, 억제 또는 지연, 치료하지 않았을 때와 비교할 때 개체의 수명 증가, 또는 질병의 증상 또는 질병 자체의 진행 예방, 억제 또는 지연이 포함된다. 보다 구체적으로, 본 명세서에서 사용되는 “치료적으로 유효한” 용량은 치료적 이점을 부여하는 양이다. 치료적으로 유효한 투여량은 또한 제제의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료적으로 유익한 효과보다 더 큰 양이다. CRC 치료의 맥락에서, 치료적 이점은 암 (cancer) 진행 (예를 들어, 암의 한 단계에서 다음 단계로의 진행)을 정지시키거나 늦추는 것, 암의 증상 또는 징후의 악화 또는 심화를 정지 또는 지연시키는 것, 암 중증도 감소, 암 소멸 유도, 종양 (tumour) 세포 증식, 종양 크기, 또는 종양 수 억제, 또는 PG 혈청 수준의 감소 중 어느 하나 또는 그의 조합을 포함하는, 암 (cancer)의 임의의 개선을 의미한다.

유효량의 결정은 특히 본 명세서에서 제공된 상세한 설명에 비추어볼 때 당업자의 능력 내에서 충분히 가능하다. 화합물 또는 접합체의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 및 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 개체에 투여될 본 조합 또는 다른 치료제의 유효량은 다발성 골수종 (multiple myeloma)의 단계, 범주 및 상태 및 일반적인 건강, 나이, 성별, 체중 및 약물 내성과 같은 개체의 특성에 따라 달라질 것이다. 투여될 본 조합 또는 다른 치료제의 유효량은 또한 투여 경로 및 투여 형태에 따라 달라질 것이다. 투여량 및 간격은 원하는 치료 효과를 유지하기에 충분한 활성 화합물의 혈장 수준을 제공하기 위하여 개별적으로 조정될 수 있다.

투여되는 항-hPG 항체 및 면역 관문 저해제의 조합의 양은 치료될 CRC의 성질 및 단계, 투여의 형태, 경로 및 부위, 치료 요법 (예를 들어, 다른 치료제가 사용되는지 여부), 치료되는 특정 개체의 연령 및 상태, 치료되는 환자의 항-hPG 항체 및/또는 및 면역 관문 저해제에 대한 민감성을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 적절한 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 결국, 의사가 사용될 적절한 투여량을 결정할 것이다. 이 투여량은 적절한 만큼 자주 반복할 수 있다. 부작용이 발생하면 정상적인 임상 실무에 따라 투여량 및/또는 빈도가 변경되거나 감소될 수 있다. 적절한 투여량 및 치료 요법은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 치료의 진행을 모니터링함으로써 확립될 수 있다.

효과적인 투여량은 시험관내 어세이(in vitro assay)로부터 초기에 추정될 수 있다. 예를 들어, 동물에 사용하기 위한 초기 용량은, 시험관내 측정된 프로가스트린에 대한 항체의 결합 친화도 또는 그 이상의 인간화 항-hPG 항체의 순환 혈액 또는 혈청 농도에 이르도록 제제화될 수 있다. 마찬가지로, 동물에 사용하기 위한 초기 용량은, 시험관내 측정된 상응하는 면역 관문 단백질에 대한 저해제의 결합 친화도 또는 그 이상의 면역 관문 저해제의 순환 혈액 또는 혈청 농도에 이르도록 제제화될 수 있다. 특정 항체의 생체 이용률을 고려하여 이러한 순환 혈액 또는 혈청 농도에 이르기 위한 투여량의 계산은 당업자의 능력 내에서 충분히 가능하다. 참고로, 독자는 문헌 [Fingl & Woodbury, “General Principles” in Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Chapter 1, latest edition, Pagamonon Press] 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조한다.

초기 투여량은 동물 모델과 같은 생체내 데이터로부터 추정될 수 있다. CRC를 치료하기 위한 화합물의 효능을 시험하는데 유용한 동물 모델은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한, CRC의 동물 모델은 하기 실시예에 기재되어 있다. 통상의 기술자는 인간 투여에 적합한 투여량을 결정하기 위해 이러한 정보를 일상적으로 조정할 수 있다.

본 명세서에 기술된 항-hPG 항체 및 면역 관문 저해제의 조합의 유효한 투여량은 단일 (예를 들어, 1회분) 투여, 다중 투여 또는 연속 투여 당 약 0.001 내지 약 75 mg/kg의 범위일 수 있거나, 또는 단일 (예를 들어, 1회분) 투여, 다중 투여 또는 연속 투여 당 0.01-5000 μg/ml 혈청 농도의 혈청 농도, 또는 치료될 상태, 투여 경로 및 개체의 상태 연령, 중량 및 상태에 따른 임의의 유효 범위 또는 값에 이를 수 있다. 특정 실시양태에서, 각 용량은 체중 킬로그램 당 약 0.5 μg 내지 약 50 μg, 예를 들어 체중 킬로그램 당 약 3 μg 내지 약 30 μg 범위일 수 있다.

투여의 양, 빈도, 및 기간은 환자의 연령, 체중, 및 질병 상태와 같은 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 투여를 위한 치료 요법은 2주 동안 내지 무기한, 2 주 내지 6개월 동안, 3개월 내지 5년, 6개월 내지 1 또는 2년, 8개월 내지 18개월 등과 같은 기간 동안 지속될 수 있다. 선택적으로, 치료 요법은 반복 투여로, 예를 들어, 1일 1회, 1일 2회, 2일마다, 3일마다, 5일마다, 1주마다, 2주마다, 또는 1개월마다 제공된다. 반복 투여는 동일한 용량 또는 다른 용량일 수 있다. 투여는 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 이상 반복될 수 있다. 항-hPG 항체 및 면역 관문 저해제의 치료적으로 유효한 양은 단일 용량으로 또는 치료 요법의 과정 동안, 예를 들어 1주, 2주, 3주, 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 또는 그 이상에 걸쳐 투여될 수 있다.

치료 방법

본 발명의 항-hPG 항체 및 면역 관문 저해제의 조합의, 세포 증식을 포함하는 PG-의존적 반응을 차단하고 면역치료에 대한 반응을 개선시키는 능력은 암 치료에서 이들을 유용하게 한다. 따라서, 본 발명의 양태는 의약으로서 본 발명의 항-hPG 항체 및 면역 관문 저해제의 조합에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 개시 내용은 이를 필요로 하는 환자에서 암 (cancer)을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조합으로 치료될 수 있는 암은 특히 성장 및/또는 증식을 위해 프로가스트린에 의존하는 암이다. 바람직하게, 프로가스트린-의존성 암은 대장암 (colorectal cancer, CRC)이다. 일반적으로, 방법은 환자에 치료적으로 유효한 양의 본 명세서에서 기술된 항-hPG 항체 및 면역 관문 저해제의 조합을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 개시 내용은 CRC의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에서 기술된 항-hPG 항체 및 면역 관문 저해제의 조합을 제공한다.

본 발명의 항-hPG 항체 및 면역 관문 저해제의 조합이 투여되는 “개체” 또는 “환자”는 바람직하게 비-영장류 (예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 랫트 등) 또는 영장류 (예를 들어, 원숭이 또는 인간)와 같은 포유동물이다. 개체 또는 환자는 성인 환자 또는 소아 환자와 같은 인간일 수 있다.

항-hPG 항체/면역 관문 저해제 병용 치료에 적합한 환자는 CRC로 진단된 환자이다. CRC는 임의의 유형 및 임의의 임상 단계 또는 징후일 수 있다. 적합한 개체는 CRC 종양 (tumour) (수술가능하거나 수술 불가능한) 환자, 종양이 외과적으로 제거 또는 절제된 환자, 예를 들어, RAS 또는 APC와 같은 종양유전자에 돌연변이를 갖는 세포를 포함하는 CRC 종양을 가진 환자, 인간화 항-hPG 항체 치료와 함께 또는 이에 보조하여 CRC에 대한 다른 치료를 받아왔거나 받았던 환자를 포함한다. CRC에 대한 다른 치료는 이에 제한되는 것은 아니나, 하기 기술되는 화학요법 치료, 방사선 치료, 외과적 절제, 및 1 이상의 다른 치료용 항체에 의한 치료를 포함한다.

다른 실시양태에 따르면, 본 명세서에 개시된 항-hPG 항체 및 면역 관문 저해제의 조합은, 조성물로 전이성 결직장암의 예방할 필요가 있는 개체에 치료적으로 유효한 양으로 투여된다. 이러한 개체는 이에 제한되는 것은 아니나, 원발성 대장암 (colorectal cancer)을 갖는 것으로 결정되었으나 암이 원거리 조직 또는 기관으로 퍼진 것으로 알려지지 않은 개체를 포함한다. 이들 방법의 특정 실시양태에서, 항-hPG 항체는 인간화 항-hPG 항체이다.

또 다른 실시양태에 따르면, 본 명세서에 개시된 항-hPG 항체 및 면역 관문 저해제의 조합은, 조성물로 전이성 대장암 (colorectal cancer)의 재발을 예방할 필요가 있는 개체에 치료적으로 유효한 양으로 투여된다. 이러한 개체는 이에 제한되는 것은 아니나, 원발성 또는 전이성 결직장암으로 이전에 치료받았으며 이후 이러한 암이 명백히 사라진 개체를 포함한다. 이들 방법의 특정 실시양태에서, 항-hPG 항체는 인간화 항-hPG 항체이다.

다른 실시양태에 따르면, 본 명세서에 개시된 항-hPG 항체 및 면역 관문 저해제의 조합은 조성물로 전이성 대장암 (colorectal cancer) 줄기세포의 성장을 저해할 필요가 있는 개체에 치료적으로 유효한 양으로 투여된다. 이러한 개체는 이에 제한되는 것은 아니나, 결직장암의 성장 또는 전이가 개체 내 암 줄기세포의 존재에 적어도 부분적으로는 기여하는 결직장암을 갖는 개체를 포함한다. 다른 실시양태는 결직장암 줄기세포를 이러한 세포의 성장 예방 또는 억제에 효과적인 양의 항-PG 항체/면역 관문 저해제 조성물과 접촉시킴으로써 결직장암 줄기세포의 성장을 예방 또는 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 수행될 수 있다. 이들 방법의 특정 실시양태에서, 항-hPG 항체는 인간화 항-hPG 항체이다.

항-hPG 항체/면역 관문 저해제 병용 치료는 1 이상의 다른 치료와 조합하거나 이를 보조할 수 있다. 다른 치료는 화학요법 치료, 방사선 치료, 외과적 절제, 및 본 명세서에서 기술된 것과 같은 항체 치료를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

항-hPG 항체/면역 관문 저해제 병용 치료는 외과적 절제를 포함한, 다른 치료를 보조할 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 것과 같은 병용 치료는 환자에게 적어도 2개의 제제를 투여하는 것을 포함하며, 그 중 첫번째는 본 개시 내용의 항-hPG 항체/면역 관문 저해제 조합이고, 두번째는 다른 치료제이다. 본 실시양태에 따르면, 본 발명은 CRC의 치료를 위한 상술된 것과 같은 항-hPG 항체/면역 관문 저해제 조합에 관한 것으로, 여기서 상기 조합은 상기 다른 치료제와 함께 투여된다. 항-hPG 항체/면역 관문 저해제 조합 및 다른 치료제는 동시에, 연속적으로, 또는 별도로 투여될 수 있다.

“치료제”는 항체, 펩티드, 단백질, 효소, 및 화학요법제와 같은 생물학적 제제를 포함한다. 치료제는 또한 항체-약물 접합체 (ADC)와 같은 세포-결합제 (CBA) 및 화합물의 면역-접합체를 포함한다. 접합체 내 약물은 본 명세서에서 기술된 것과 같은 세포독성제일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 것과 같이, 항-hPG 항체/면역 관문 저해제 조합 및 다른 치료제는 동일한 날, 예를 들어 동일한 환자 방문 동안 환자에게 투여되는 경우 연속적으로 투여되는 것으로 언급된다. 연속 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8시간 간격으로 발생할 수 있다. 대조적으로, 본 개시 내용의 조합 및 다른 치료제는 환자에게 상이한 날에 투여되는 경우 별도로 투여되는 것으로 언급되며, 예를 들어, 본 개시 내용의 조합 및 다른 치료제는 1일, 2일 또는 3일, 1주, 2주 또는 월 간격으로 투여될 수 있다. 본 개시 내용의 방법에서, 본 개시 내용의 조합의 투여는 다른 치료제의 투여 이전 또는 이후에 수행될 수 있다.

비제한적인 예로서, 본 발명의 조합 및 다른 치료제는 일정 기간 동안 동시에 투여될 수 있으며, 이어 본 개시 내용의 인간화 항-hPG 항체 및 다른 치료제의 투여가 교대되는 제2 기간이 나타난다.

본 개시 내용의 병용 치료는 상가 효과보다 큰, 즉 상승 효과를 초래할 수 있어, 항-hPG 항체/면역 관문 저해제 조합 또는 다른 치료제가 단독으로, 치료적으로 유효한 양으로 투여되지 않는 경우의 치료적 이점을 제공한다. 따라서, 이러한 제제는 더 적은 양으로 투여될 수 있어, 부작용의 가능성 및/또는 심각성을 감소시킨다.

바람직한 실시양태에서, 다른 치료제는 화학요법제이다. 본 명세서에서 사용되는 “화학요법제”는, 개체에 투여될 때 개체의 몸의 암 (cancer)의 발병을 치료 또는 예방하는 물질을 지칭한다.

화학요법제는 이에 제한되는 것은 아니나, 알킬화제, 항-대사물질, 항-종양 항생제, 유사분열 저해제, 염색질 기능 저해제, 항-혈관형성제, 항-에스트로겐, 항-안드로겐 또는 면역조절제를 포함한다.

“알킬화제”는 세포 내에서 임의의 분자, 바람직하게 핵산 (예를 들어, DNA)을 가교시키거나 알킬화할 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 알킬화제의 예로는 메클로르에타민, 클로람부콜 (chlorambucol), 멜파렌 (melphalen), 클로리드레이트 (chlorydrate), 피포브로멘 (pipobromen), 프레드니무스틴 (prednimustin), 디소딕-포스페이트 또는 에스트라무스틴 (estramustine)과 같은 질소 머스타드; 시클로포스파미드, 알트레타민 (altretamine), 트로포스파미드 (trofosfamide), 설포포스파미드 (sulfofosfamide) 또는 이포스파미드 (ifosfamide)와 같은 옥사조포린 (oxazophorin); 티오테파 (thiotepa), 트리에틸렌아민 또는 알테트라민 (altetramine)과 같은 아지리딘 또는 이민-에틸렌; 카무스틴 (carmustine), 스트렙토조신 (streptozocin), 포테무스틴 (fotemustin) 또는 로무스틴 (lomustine)과 같은 니트로소우레아 (nitrosourea); 부설판 (busulfan), 트레오설판 (treosulfan) 또는 임프로설판 (improsulfan)과 같은 알킬-설포네이트; 다카바진 (dacarbazine)과 같은 트리아젠 (triazene); 또는 시스-플래티넘 (cis-platinum), 옥살리플라틴 (oxaliplatin) 및 카르보플라틴 (carboplatin)과 같은 백금 착염이 포함된다.

“항-대사물질”은 특정 활동, 일반적으로 DNA 합성을 방해함으로써 세포 성장 및/또는 대사를 차단하는 물질을 지칭한다. 항-대사물질의 예로는 메토트렉세이트 (methotrexate), 5-플루오르우라실, 플록스우리딘 (floxuridine), 5-플루오로디옥시우리딘, 카페시타빈 (capecitabine), 시타라빈 (cytarabine), 플루다라빈 (fludarabine), 시토신 아라비노시드, 6-메르캅토퓨린 (6-MP), 6-티오구아닌 (6-TG), 클로로데스옥시아데노신 (chlorodesoxyadenosine), 5-아자시티딘, 젬시타빈 (gemcitabine), 클라드리빈 (cladribine), 디옥시코포르마이신 (deoxycoformycin) 및 펜토스타틴 (pentostatin)이 포함된다.

“항-종양 항생제”는 DNA, RNA 및/또는 단백질 합성을 방지 또는 저해할 수 있는 화합물을 지칭한다. 항-종양 항생제의 예로는 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 발루비신 (valrubicin), 미톡산트론 (mitoxantrone), 닥티노마이신 (dactinomycin), 미트라마이신 (mithramycin), 플리카마이신 (plicamycin), 미토마이신 C (mitomycin C), 블레오마이신 (bleomycin), 및 프로카바진 (procarbazine)이 포함된다.

“유사분열 저해제”는 세포 주기 및 유사분열의 정상적인 진행을 방지한다. 일반적으로, 파클리탁셀 (paclitaxel) 및 도세탁셀 (docetaxel)과 같은 미세소관 저해제 또는 톡소이드는 유사분열을 저해할 수 있다. 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데신 (vindesine) 및 비노렐빈 (vinorelbine)과 같은 빈카 알카로이드 (Vinca alkaloid)가 또한 유사분열을 저해할 수 있다.

“염색질 기능 저해제” 또는 “토포이소머라제 저해제”는 토포이소머라제 I 또는 토포이소머라제 II와 같은 염색질 모델링 단백질의 정상적인 기능을 저해하는 물질을 지칭한다. 염색질 기능 저해제의 예로는 토포이소머라제 I의 경우, 캄프토테신 (camptothecine) 및 토포테칸 (topotecan) 또는 이리노테칸 (irinotecan)과 같은 그의 유도체, 및 토포이소머라제 II의 경우, 에토포시드 (etoposide), 에토포시드 포스페이트 및 테니포시드 (teniposide)가 포함된다.

“항-혈관형성제”는 혈관의 성장을 저해하는 임의의 약물, 화합물, 물질 또는 제제를 지칭한다. 예시적인 항-혈관형성제는 라족신 (razoxin), 마리마스타트 (marimastat), 바티마스타트 (batimastat), 프리노마스타트 (prinomastat), 타노스타트 (tanomastat), 일로마스타트 (ilomastat), CGS-27023A, 할로푸지논 (halofuginon), COL-3, 네오바스타트 (neovastat), BMS-275291, 탈리도미드 (thalidomide), CDC 501, DMXAA, L-651582, 스쿠알라민 (squalamine), 엔도스타틴 (endostatin), SU5416, SU6668, 인터페론-알파, EMD121974, 인터루킨-12, IM862, 안지오스타틴 (angiostatin) 및 비탁신 (vitaxin)이 포함되나, 결코 이에 제한되지는 않는다.

“항-에스트로겐” 또는 “항-에스트로겐 제제”는 에스트로겐의 작용을 감소, 길항 또는 억제하는 임의의 물질을 지칭한다. 항-에스트로겐 제제의 예로는 타목시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene), 라록시펜 (raloxifene), 드롤록시펜 (droloxifene), 이오독시펜 (iodoxyfene), 아나스트로졸 (anastrozole), 레트로졸 (letrozole), 및 엑스메스탄 (exemestane)이 있다.

“항-안드로겐” 또는 “항-안드로겐 제제”는 안드로겐의 작용을 감소, 길항 또는 억제하는 임의의 물질을 지칭한다. 항-안드로겐의 예로는 플루타미드 (flutamide), 닐루타미드 (nilutamide), 비칼루타미드 (bicalutamide), 스피로노락톤 (sprironolactone), 시프로테론 아세테이트 (cyproterone acetate), 피나스테리드 (finasteride) 및 시미티딘 (cimitidine)이 있다.

“면역조절제”는 면역계를 자극하는 물질이다.

면역조절제의 예로는 인터페론; 알데스루킨 (aldesleukine), OCT-43, 데니루킨 디필리톡스 (denileukin diflitox) 및 인터루킨-2와 같은 인터루킨; 타소너민 (tasonermine)과 같은 종양 괴사 인자; 또는 렌티난 (lentinan), 시조피란 (sizofiran), 로퀴니멕스 (roquinimex), 피도티모드 (pidotimod), 페가데마스 (pegademase), 티모펜틴 (thymopentine), 폴리 I:C 또는 5-플루오로우라실과 병용된 레바미솔 (levamisole)과 같은 다른 면역조절제가 포함된다.

보다 상세하게, 당업자는 “Association Fran

aise des Enseignants de Chimie Th

rapeutique"에 의해 편집된 매뉴얼을 참조할 수 있다 [제목 “Trait

de chimie th

rapeutique", vol. 6, M

dicaments antitumouraux et perspectives dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003].

이는 또한 화학적 제제 또는 세포독성제, 예를 들어, 제피티닙 (gefitinib) 또는 엘로티닙 (erlotinib)과 같은 모든 키나아제 저해제로서 언급될 수 있다.

보다 일반적으로, 적합한 화학요법제의 예로는 이에 제한되는 것은 아니나, 1-디히드로테스토스테론, 5-플루오로우라실 디카바진 (decarbazine), 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 악티노마이신 (actinomycin) D, 아드리아마이신 (Adriamycin), 알데스루킨 (aldesleukin), 알킬화제, 알로푸리놀 (allopurinol) 소듐, 알트레타민 (altretamine), 아미포스틴 (amifostine), 아나스트로졸 (anastrozole), 안트라마이신 (anthramycin (AMC)), 항-유사분열제, 시스-디클로로디아민 플래티넘 (II) (DDP) (시스플라틴 (cisplatin)), 디아미노 디클로로 플래티넘, 안트라사이클린 (anthracycline), 항생제, 항대사물질, 아스파라기나아제, 생 BCG (방광내), 베타메타손 (betamethasone) 소듐 포스페이트 및 베타메타손 아세테이트, 비칼루타미드 (bicalutamide), 블레오마이신 (bleomycin) 설페이트, 부설판 (busulfan), 칼슘 류쿠보린 (calcium leucouorin), 칼리키아마이신 (calicheamicin), 카페시타빈 (capecitabine), 카보플라틴 (carboplatin), 로무스틴 (lomustine) (CCNU), 카무스틴 (carmustine) (BSNU), 클로람부실 (Chlorambucil), 시스플라틴 (Cisplatin), 클라드리빈 (Cladribine), 콜키신 (Colchicin), 접합된 에스트로겐, 시클로포스파미드 (Cyclophosphamide), 시클로토스파미드 (Cyclothosphamide), 시타라빈 (Cytarabine), 시타라빈 (Cytarabine), 시토칼라신 (cytochalasin) B, 시톡산 (Cytoxan), 다카바진 (Dacarbazine), 닥티노마이신 (Dactinomycin), 닥티노마이신 (dactinomycin) (이전에는 악티노마이신 (actinomycin)), 다우니루비신 (daunirubicin) HCL, 다우노루비신 (daunorucbicin) 시트레이트, 데니루킨 디프티톡스 (denileukin diftitox), 덱스라족산 (Dexrazoxane), 디브로모만니톨 (Dibromomannitol), 디히드록시 안트라신 디온 (dihydroxy anthracin dione), 도세탁셀 (Docetaxel), 돌라세트론 메실레이트 (dolasetron mesylate), 독소루비신 (doxorubicin) HCL, 드로나비놀 (dronabinol), 대장균 (E. coli) L-아스파라기나아제, 에메틴 (emetine), 에포에틴 (epoetin)-알파, 에르위니아 (Erwinia) L-아스파라기나아제, 에스테르화 에스트로겐, 에스트라디올, 에스트라무스틴 (estramustine) 포스페이트 소듐, 에티듐 (Ethidium) 브로마이드, 에티닐 에스트라디올, 에티드로네이트 (etidronate), 에토포시드 시트로로럼 인자 (etoposide citrororum factor), 에토포시드 포스페이트, 필그라스팀 (filgrastim), 플록스우리딘 (floxuridine), 플루코나졸 (fluconazole), 플루다라빈 (fludarabine) 포스페이트, 플루오로우라실, 플루타미드 (flutamide), 폴리닌산 (folinic acid), 젬타시빈 (gemcitabine) HCL, 글루코코르티코이드 (glucocorticoid), 고세렐린 (goserelin) 아세테이트, 그라미시딘 (gramicidin) D, 그라니세트론 (granisetron) HCL, 히드록시우레아, 이다루비신 (idarubicin) HCL, 이포스파미드 (ifosfamide), 인터페론 α-2b, 이리노테칸 (irinotecan) HCL, 레트로졸 (letrozole), 류코보린 (leucovorin) 칼슘, 류프로리드 (leuprolide) 아세테이트, 레바미솔 (levamisole) HCL, 리도카인 (lidocaine), 로무스틴 (lomustine), 마이탄시노이드 (maytansinoid), 메클로르에타민 (mechlorethamine) HCL, 메드록시프로게스테론 (medroxyprogesterone) 아세테이트, 메게스트롤 (megestrol) 아세테이트, 멜팔란 (melphalan) HCL, 메르캅티퓨린 (mercaptipurine), 메스나 (mesna), 메토트렉세이트 (methotrexate), 메틸테스토스테론, 미트라마이신 (mithramycin), 미토마이신 (mitomycin) C, 미토탄 (mitotane), 미톡산트론 (mitoxantrone), 닐루타미드 (nilutamide), 옥트레오티드 (octreotide) 아세테이트, 온단세트론 (ondansetron) HCL, 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 파클리탁셀 (paclitaxel), 파미드로네이트 (pamidronate) 디소듐, 펜토스타틴 (pentostatin), 필로카르핀 (pilocarpine) HCL, 플리마이신 (plimycin), 카무스틴 (carmustine) 임플란트와 폴리페프로산 (polifeprosan) 20, 포르피머 (porfimer) 소듐, 프로카인 (procaine), 프로카바진 (procarbazine) HCL, 프로프라놀롤 (propranolol), 리툭시맙 (rituximab), 살그라모스팀 (sargramostim), 스트렙토조토신 (streptozotocin), 타목시펜 (tamoxifen), 탁솔 (taxol), 테가푸르 (tegafur), 테니포시드 (teniposide), 테노포시드 (tenoposide), 테스토락톤 (testolactone), 테트라카인 (tetracaine), 티오에파 클로람부실 (thioepa chlorambucil), 티오구아닌, 티오테파 (thiotepa), 토포테칸 (topotecan) HCL, 토레미펜 (toremifene) 시트레이트, 트라스투주맙 (trastuzumab), 트레티노인 (tretinoin), 발루비신 (valrubicin), 빈블라스틴 (vinblastine) 설페이트, 빈크리스틴 (vincristine) 설페이트, 및 비노렐빈 (vinorelbine) 타르트레이트가 포함된다.

본 명세서에서 개시된 항-hPG 항체/면역 관문 저해제 조합은 화학요법제의 조합을 투여받는 결직장암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 화학요법제의 예시적인 조합은 류코보린 (leucovorin) (폴리닌산 (folinic acid) 또는 LV)과 조합된 5-플루오로우라실 (5FU); 우라실 (UFT) 및 류코보린과 조합된 카페시타빈 (capecitabine); 우라실 (UFT) 및 류코보린과 조합된 테가푸르 (tegafur); 5FU 또는 카페시타빈과 조합된 옥살리플라틴 (oxaliplatin); 카페시타빈과 조합된 이리노테칸 (irinotecan), 5FU, 이리노테칸 또는 카페시타빈과 조합된 미토마이신 (mitomycin) C를 포함한다. 본 명세서에 개시된 화학요법제들의 다른 조합이 또한 가능하다.

관련 기술 분야에 공지된 것과 같이, 상이한 화학요법제의 조합을 사용한 대장암 (colorectal cancer)의 화학치료 요법은 임상 시험에서 표준화되어 있다. 이러한 요법은 흔히 약어로 알려져 있으며 5FU Mayo, 5FU Roswell Park, LVFU2, FOLFOX, FOLFOX4, FOLFOX6, bFOL, FUFOX, FOLFIRI, IFL, XELOX, CAPOX, XELIRI, CAPIRI, FOLFOXIRI를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Chau, I., et al., 2009, Br. J. Cancer 100:1704-19 및 Field, K., et al., 2007, World J. Gastroenterol. 13:3806-15]을 참조하며, 상기 문헌은 모두 참조로 포함된다.

항-hPG 항체/면역 관문 저해제 조합은 또한 다른 치료용 항체와 함께 조합될 수 있다. 따라서, 항-hPG 항체/면역 관문 저해제 병용 치료는 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 항-EGFR (EGF 수용체) 단일클론 항체 또는 항-VEGF 단일클론 항체와 같은 상이한 단일클론 항체와 함께 또는 이에 보조하여 투여될 수 있다. 항-EGFR 항체의 구체적인 예로는 세툭시맙 (cetuximab) 및 패니투무맙 (panitumumab)이 포함된다. 항-VEGF 항체의 구체적인 예는 베바시주맙 (bevacizumab)이다.

본 실시양태에 따르면, 본 발명은 CRC의 치료를 위한 상술한 항-hPG 항체/면역 관문 저해제 조합에 관한 것으로, 여기서 상기 조합은 화학요법제와 함께 투여된다. 항-hPG 항체/면역 관문 저해제 조합 및 화학요법제는 동시에, 연속적으로, 또는 별도로 투여될 수 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

실시예

실시예 1

BALB/cAnNRj 마우스에 1일차에 마우스 당 0.5 M의 CT26.WT (ATCC-CRL-2638) 세포를 측면 피하 주사하였다. 마우스를 하기 지시된 것과 같이 개별 처리 그룹으로 무작위화하였다 (그룹당 n=15 마리 마우스):

대조군: NaCl (5mL/kg) + 랫트 IgG2A (10mg/kg - 5mL/kg)를 주 2회 복강내 주사한 마우스 15마리.

그룹 항-PG: NaCl (5mL/kg) + 항-PG (30mg/kg - 5mL/kg)를 주 2회 복강내 주사한 마우스 15마리.

그룹 항-PD-1: NaCl (5mL/kg), + 항-PD1 (10mg/kg - 5mL/kg)을 주 2회 복강내 주사한 마우스 15마리.

그룹 4 항-PG + 항-PD1: 항-PG (30mg/kg - 5mL/kg) + 항-PD1 (10mg/kg - 5mL/kg)을 주 2회 복강내 주사한 마우스 15마리.

항-PG 항체는 CDR, V_H, 및 V_L이 표 5에 기술된 Mab8이다.

항-PD-1 항체는 29F.1A12 단일클론 항체 (BioXCell (10 Technology Dr, Suite 2B West Lebanon, NH 03784, USA)에서 얻음)이다.

디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하는 것과 동시에, 주 2회 동물을 관찰하고 무게를 재었다. 종양 크기는 다음 공식을 사용하여 계산하였다: V = 길이 x 너비² / 2, 여기서 길이는 가장 큰 종양 직경을 나타내고, 너비는 수직 종양 직경을 나타낸다. 연구 종료 후, 또는 종양이 1500 mm³의 부피에 이르렀을 때, 종양 궤양이 관찰되는 경우, 체중 감소가 20%를 초과하는 경우 또는 마우스 건강의 현저한 악화가 관찰된 경우 동물을 희생시켰다. 자궁경부 탈구에 의한 안락사는 기체 마취 (이소플루란) 후에 이루어졌다.

도 1은 각 그룹의 카플란-마이오 생존을 보여준다. 로그-랭크 (Log-rank) (Mantel-Cox) 테스트는 15일부터 20일까지의 생존율 중간값이 증가하여 (+33%, p<0.0001) 조합 그룹 (항-PG + 항-PD1)과 단일 처리 (항-PG 또는 항-PD1) 간의 생존율이 통계적으로 증가하였음을 보여주어, 각 단일요법과 비교하여 조합의 우수한 활성을 확인하였다.

실시예 2

BALB/cAnNRj 마우스에 1일차에 마우스 당 0.5 M의 CT26.WT (ATCC-CRL-2638) 세포를 측면 피하 주사하였다. 마우스를 하기 지시된 것과 같이 개별 처리 그룹으로 무작위화하였다:

대조군: NaCl (5mL/kg) + 랫트 IgG2A (10mg/kg - 5mL/kg)를 주 2회 복강내 주사한 마우스 15마리.

그룹 항-PG: NaCl (5mL/kg) + 항-PG (30mg/kg - 5mL/kg)를 주 2회 복강내 주사한 마우스 15마리.

그룹 항-PD-1: NaCl (5mL/kg), + 항-PD1 (10mg/kg - 5mL/kg)을 주 2회 복강내 주사한 마우스 15마리.

그룹 4 항-PG + 항-PD1: 항-PG (30mg/kg - 5mL/kg) + 항-PD1 (10mg/kg - 5mL/kg)을 주 2회 복강내 주사한 마우스 15마리.

처치 시작 1주 후, 그룹 당 마우스 4마리를 희생시키고 종양을 회수하여 RNA를 추출하고 qPCR을 수행하여 인터페론 감마 (INFγ)의 발현을 측정하였다. 실제로, 여러 간행물에서 다른 면역 관문 봉쇄 요법뿐만 아니라 CTLA-4 및 PD-1 저해제로 IFNγ 생산이 증가하는 것으로 나타났다. 도 2는 항-PD1 항체가 예상대로 현재 마우스 모델에서 IFNγ 생산을 유도함을 보여준다 (3.2배 증가). 보다 흥미롭게도, 항-PG + 항-PD1 항체 병용 치료에서 IFNγ 생산의 증가가 더 많이 관찰되어 (6배 증가), 각각의 단일요법에 비해 조합의 우수한 활성을 확인하였다.

SEQUENCE LISTING <110> PROGASTRINE ET CANCERS S.A.R.L. <120> COMBINATION THERAPY BETWEEN ANTI-PROGASTRIN ANTIBODY AND IMMUNOTHERAPY TO TREAT CANCER <130> B375304PCTD37823 <150> US 62/594,755 <151> 20171205 <160> 78 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Trp Lys Pro Arg Ser Gln Gln Pro Asp Ala Pro Leu Gly Thr Gly 1 5 10 15 Ala Asn Arg Asp Leu Glu Leu Pro Trp Leu Glu Gln Gln Gly Pro Ala 20 25 30 Ser His His Arg Arg Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val 35 40 45 Ala Asp Pro Ser Lys Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu 50 55 60 Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn 65 70 75 80 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acids 1-14 N-terminal extremity of human progastrin <400> 2 Ser Trp Lys Pro Arg Ser Gln Gln Pro Asp Ala Pro Leu Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acids 55-80 C-terminal extremity of human progastrin <400> 3 Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu 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<220> <223> synthetic peptide <400> 61 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 62 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 62 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 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Pro Arg Tyr Leu Met 35 40 45 Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp 85 90 95 Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 105 110 Glu Ile Lys 115 <210> 68 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 68 Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr 20 25 30 Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met 35 40 45 Glu Val Lys Lys Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp 85 90 95 Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 105 110 Glu Ile Lys 115 <210> 69 <211> 117 <212> PRT <213> 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Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 74 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 74 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Arg His Thr 20 25 30 Lys Gly Ile Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly 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Claims (20)

1. 항-프로가스트린 (항-hPG) 단일클론 항체 및 면역 관문 저해제를 포함하는 암 치료를 위한 제품의 조합물 (products of combination)로서,
   상기 항-hPG 항체가 각각 서열번호 28, 29 및 30인 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 및 각각 서열번호 31, 32 및 33인 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄를 포함하고,
   상기 면역 관문 저해제가 항-PD1 항체인, 제품의 조합물.
2. 제1항에 있어서, 상기 항-hPG 항체가 단일 사슬 항체, 카멜화된 항체, 키메라 항체, IgA1 항체, IgA2 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체 및 IgM 항체 중에서 선택되는, 제품의 조합물.
3. 제1항에 있어서, 상기 항-hPG 항체가 C-말단 항-프로가스트린 항체인, 제품의 조합물.
4. 제1항에 있어서, 상기 항-hPG 항체가 중화 항체인, 제품의 조합물.
5. 제1항에 있어서, 상기 항-hPG 항체가 서열번호 49의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 50의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체인, 제품의 조합물.
6. 제1항에 있어서, 상기 항-hPG 항체가 인간화 항체인, 제품의 조합물.
7. 제1항에 있어서, 상기 항-hPG 항체가 서열번호 69 및 71에서 선택되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 70 및 72에서 선택되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항체이고, 상기 항체가 또한 인간 항체에서 유래한 경쇄 및 중쇄의 불변 영역을 포함하는, 제품의 조합물.
8. 제1항에 있어서, 상기 항-hPG 항체가 서열번호 71의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 72의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체가 또한 인간 항체에서 유래한 경쇄 및 중쇄의 불변 영역을 포함하는, 제품의 조합물.
9. 제1항에 있어서, 상기 항-hPG 항체가 서열번호 73의 아미노산 서열의 중쇄 및 서열번호 74의 아미노산 서열의 경쇄를 포함하는, 제품의 조합물.
10. 제1항에 있어서, 상기 항-PD1 항체가 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 니볼루맙 (nivolumab), 세미플리맙 (cemiplimab), 또는 피딜리주맙 (pidilizumab)인, 제품의 조합물.
11. 제1항에 있어서, 암이 결장직장암 (colorectal cancer)인, 제품의 조합물.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 제품의 조합물, 약제학적으로 허용되는 비히클 (vehicle), 및/또는 부형제를 포함하는, 암 치료를 위한 약학 조성물.
13. 제12항에 있어서, 암이 결장직장암인, 약학 조성물.
14. 제12항에 있어서, 동시에, 별도로 또는 순차적으로 사용하기 위한, 약학 조성물.
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