ES2920283T3 - Terapia de combinación entre un anticuerpo antiprogastrina y la inmunoterapia para tratar el cáncer - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a combinaciones que comprenden anticuerpos monoclonales anti-propastrina (anti-HPG) e inhibidores del punto de control inmunitario, así como composiciones farmacéuticas que comprenden dichas combinaciones. También se proporcionan métodos de tratamiento del cáncer utilizando dichas combinaciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia de combinación entre un anticuerpo antiprogastrina y la inmunoterapia para tratar el cáncer

Introducción

La inmunoterapia ha supuesto un punto de inflexión en el campo de la terapia del cáncer. Los cánceres humanos portan una multitud de mutaciones genéticas somáticas y genes alterados epigenéticamente, los productos de los cuales son potencialmente reconocibles como antígenos foráneos. Las células tumorales escapan a la respuesta inmunitaria endógena mediante la inducción de tolerancia entre las células T específicas tumorales. Con el fin de garantizar que no se activa constantemente una respuesta inflamatoria inmunitaria una vez los antígenos tumorales han estimulado una respuesta, se establecen o activan múltiples controles o "puntos de control" (“checkpoints”). Dichos puntos de control inmunitario están representados mayoritariamente por la unión de receptores de células T a ligandos sobre células en el microambiente tumoral circundante, formando sinapsis inmunitarias que a continuación regulan la función de la célula T.

Un enfoque a la inducción de respuestas inmunitarias antitumorales ha sido denominado "bloqueo de puntos de control", en referencia al bloqueo de rutas inhibitorias del sistema inmunitario activadas por células cancerosas. Se están realizando desarrollos en la terapia basada en los puntos de control inmunitario a ritmo vertiginoso. Se ha producido un importante punto de inflexión con la llegada de nuevas moléculas que actúan sobre el sistema inmunitario (sistema de defensa del organismo frente a los patógenos) y resultan eficaces en determinados cánceres. La utilización de dichas nuevas moléculas ha permitido observar la regresión tumoral en algunos pacientes con melanoma cutáneo. Las recientes autorizaciones de varios bloqueantes de la ruta de antígeno-4-CD80/CD86 asociados a linfocitos C citotóxicos (CTL) (Ipilimumab/Yervoy) y la ruta de PD-1-PD-L1/PD-L2, tal como nivolumab (Opdivo), pembrolizumab (Keytruda) o atezolizumab (Tecentriq) han abierto la puerta a los inhibidores (ICI) de punto de control inmunitario (IC) como componente clave en el tratamiento avanzado del cáncer.

Sin embargo, incluso en el melanoma, la mayoría de pacientes solo muestran una respuesta limitada o transitoria, mientras que estos cánceres comunes, tales como el cáncer de mama, el cáncer de próstata o el cáncer de colon, solo responden esporádicamente. Además, los adenocarcinomas pancreático y colorrectal por lo general mantienen la resistencia a dichas modalidades de tratamiento, específicamente el bloqueo del agente único PD-1. A pesar de la observación de respuestas duraderas a los anticuerpos de bloqueo de punto de control, de esta manera resulta evidente que no todos los pacientes, incluso en los subgrupos de cánceres sensibles a la inmunoterapia, muestran regresión tumoral.

Katoh et al. (Int. J. Oncol. 51 (5):1357-1369, 2017) es una revisión de la señalización WNT canónica y no canónica en células madre de cáncer. Se da a conocer además la utilización de tratamientos con diana en la señalización WNT en combinación con bloqueantes de punto de control inmunitario, tales como, por ejemplo, ipilimumab, nivolumab y pembrolizumab (ver el resumen, página 1363, columna derecha, primeros dos párrafos, fig. 3).

Sanborn et al. (Cancer Res. 76 (supl. 14): CT023, 2016) y Tsukihara (en: Abstracts of the 76th annual meeting of the Japanese cancer association, 28-30 de sept. de 2017, Yokohama, Japón & Cancer Science 109 (supl. 1), 847, 2018) dan a conocer ambos una terapia de combinación del cáncer (colorrectal) que utiliza una combinación que comprende un inhibidor de punto de control inmunitario, es decir, un anticuerpo anti-PD-1, tal como nivolumab.

Prieur, A. et al. (2017) en: Clinical Cancer Research, vol. 23, n° 17, 5267 - 5280, dan a conocer la construcción y caracterización de anticuerpos monoclonales (mAb) (humanizados) dirigidos contra hPG y, además, que los tres de entre los 10 mAb Hz mantuvieron su afinidad para la progastrina en comparación con su ancestro murino. La bioactividad de los anticuerpos humanizados antiprogastrina se sometió a ensayo sobre el crecimiento del cáncer colorrectal in vitro, es decir, basándose en las características bioquímicas y los perfiles biológicos. Hz8CV2 era el anticuerpo terapéutico primario.

Dicho mAb anti-hPG Hz8CV2 corresponde al mAb8 dado a conocer en la presente memoria (ver la tabla 5, ejemplo 1).

Se ha observado que Hz8CV2 reduce la proliferación celular e incrementa la muerte celular, así como la frecuencia de células madre en estirpes celular de cáncer colorrectal. Además, se ha adaptado el modelo de xenoinjerto subcutáneo de ratón BALBc/desnudo como entorno in vivo para el análisis ELDA (análisis de dilución limitante extrema) y animales tratados con Hz8CV2 solo o con Hz8CV2 en combinación con irinotecán. El análisis posterior mostró que el anticuerpo era capaz de inhibir las propiedades migratorias/invasivas de las células de cáncer colorrectal y de reducir la quimiorresistencia de las estirpes celulares de cáncer colorrectal.

Además, la neutralización de la progastrina por Hz8CV2 presentó un efecto similar sobre la frecuencia de células madre de cáncer de las células T84 en comparación con el inhibidor ICG-001 de señalización Wnt in vitro. En el modelo de ratón ApcA14/+ de tumorigénesis intestinal controlada por Wnt, pudo observarse una reducción de 75% del número de tumores en animales tratados con el anticuerpo antiprogastrina en comparación con los controles, y el tratamiento con anticuerpos antiprogastrina no indujo ningún signo detectable de toxicidad. Aunque Prieur, A. et al. 2017, dio a conocer una combinación de dicho anticuerpo anti-hPG e irinotecán para el tratamiento del cáncer colorrectal, no dio a conocer una combinación que comprendía dicho anticuerpo junto con un inhibidor de punto de control inmunitario, es decir, anticuerpo anti-PD1.

Todavía existe una necesidad de identificación de rutas adicionales que proporcionan agonismo o inhibición adicional de las rutas actuales de inhibidores de punto de control inmunitario.

Descripción

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y cualesquiera otros aspectos o formas de realización proporcionadas en la presente memoria se proporcionan exclusivamente a título informativo.

En particular, la presente invención se refiere a una combinación que comprende un anticuerpo monoclonal antiprogastrina (anti-hPG) y un inhibidor de punto de control inmunitario, en la que dicho anticuerpo anti-hPG comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 28, n° 29 y n° 30, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 31, n° 32 y n° 33, respectivamente, y en la que dicho inhibidor de punto de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD1.

Los presentes inventores han mostrado que la combinación de una molécula de unión a progastrina y un inhibidor de punto de control inmunitario resulta en mayor eficacia terapéutica contra el cáncer. Se destaca que los inventores mostraron que la administración de un anticuerpo monoclonal antiprogastrina en combinación con un inhibidor de punto de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-PD-1 incrementa significativamente la supervivencia de los ratones xenoinjertados con estirpes celulares de cáncer colorrectal. Lo anterior se ilustra mediante una mediana de tiempo de supervivencia que se incrementa significativamente en comparación con cada una de las terapias individualmente. Además, la combinación de dicho anticuerpo monoclonal antiprogastrina e inhibidor de punto de control inmunitario conduce a un nivel de expresión de interferón ^y incrementado a más del doble.

En un primer aspecto, la presente divulgación se refiere a una combinación que comprende una molécula de unión a progastrina y un inhibidor de punto de control inmunitario. Preferentemente, la divulgación se refiere a una combinación de una molécula de unión a progastrina y un inhibidor de punto de control inmunitario.

Inhibidores de punto de control inmunitario

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "inhibidor de punto de control" se refiere a una molécula, tal como, por ejemplo, una molécula pequeña, un receptor soluble o un anticuerpo con diana en un punto de control inmunitario y bloquea la función de dicho punto de control inmunitario. Más específicamente, un "inhibidor de punto de control" tal como se utiliza en la presente memoria es una molécula, tal como, por ejemplo, una molécula pequeña, un receptor soluble o un anticuerpo, que bloquea determinadas proteínas producidas por algunos tipos de células del sistema inmunitario, tales como células T, y algunas células de cáncer. Dichas proteínas, los "puntos de control inmunitario" o "proteínas de punto de control inmunitario", tales como las utilizadas en la presente memoria, regulan la función de las células T en el sistema inmunitario. Cabe destacar que ayudan a controlar las respuestas inmunitarias y pueden evitar que las células T eliminen las células de cáncer. Dichas proteínas de punto de control inmunitario consiguen dicho resultado mediante la interacción con ligandos específicos que envían una señal al interior de las células T y esencialmente desactivan o inhiben la función de las células T. La inhibición de dichas proteínas resulta en la restauración de la función de las células T y una respuesta inmunitaria a las células de cáncer. Entre los ejemplos de proteínas de punto de control se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4 (pertenece a la familia de CD2 de moléculas y se expresa sobre todas las células NK, ^y§, y T CD8+ de memoria (aB)), CD 160 (asimismo denominado BY55), CGEN-15049, cinasas CHK1 y CHK2, IDO1, A2aR y diversos ligandos de la familia de B-7.

Preferentemente, el inhibidor de punto de control inmunitario es un inhibidor de cualquiera de entre CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4 (pertenece a la familia de CD2 de molécula y se expresa sobre todas las células NK, ^y§, y T CD8+ de memoria (aB)), CD 160 (asimismo denominado BY55), c Ge N-15049, cinasa CHK1 y CHK2, IDO1, A2aR y cualquiera de los diversos ligandos de la familia de B-7.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "inhibidor" o "antagonista" se refiere a una molécula que es capaz de inhibir o, de otro modo, reducir una o más de las actividades biológicas de una proteína diana, tal como cualquiera de las proteínas de punto de control inmunitario indicadas anteriormente. En algunos casos, un inhibidor de una proteína de punto de control inmunitario (por ejemplo, un anticuerpo antagonista proporcionado en la presente memoria) puede, por ejemplo, actuar mediante la inhibición o, de otro modo, la reducción de la activación y/o de las rutas de señalización celular de las células que expresan dicha proteína de punto de control inmunitario (por ejemplo, las células T), inhibiendo de esta manera la actividad biológica de las células respecto a la actividad biológica en ausencia del antagonista.

Entre los inhibidores ejemplificativos de punto de control inmunitario se incluyen anticuerpo anti-CTLA-4 (por ejemplo, ipilimumab), anticuerpo anti-LAG-3 (por ejemplo, BMS-986016), anticuerpo anti-B7-H3, anticuerpo anti-B7-H4, anticuerpo anti-Tim3 (por ejemplo, TSR-022, MBG453), anticuerpo anti-BTLA, anticuerpo anti-KIR, anticuerpo anti-A2aR, anticuerpo anti CD200, anticuerpo anti-PD-1 (por ejemplo, pembrolizumab, nivolumab, cemiplimab y pidilizumab), anticuerpo anti-PD-L1 (por ejemplo, atezolizumab, avelumab, durvalumab y BMS 936559), anticuerpo anti-VISTA (por ejemplo, JNJ 61610588), anticuerpo anti-CD28, anticuerpo anti-CD80 o anti-CD86, anticuerpo anti-B7RP1, anticuerpo anti-B7-H3, anticuerpo anti-HVEM, anticuerpo anti-CD137 (por ejemplo, urelumab), anticuerpo anti-CD137L, anti-OX40 (por ejemplo, 9B12, PF-04518600 y MEDI6469), anticuerpo anti-OX40L, anticuerpo anti-CD40 o anti-CD40L, anticuerpo anti-GAL9, anticuerpo anti-IL-10, proteína de fusión del dominio extracelular de un ligando de PD-1, por ejemplo PDL-1 o PD-L2, e IgG1 (por ejemplo, AMP-224), proteína de fusión del dominio extracelular de un ligando de OX40, por ejemplo OX40L, e IgG1 (por ejemplo, MEDI6383), fármaco IDO1 (por ejemplo, epacadostat) y fármaco A2aR. Se han autorizado varios inhibidores de punto de control inmunitario o se encuentran actualmente en ensayos clínicos. Entre dichos inhibidores se incluyen ipilimumab, pembrolizumab, nivolumab, cemiplimab, pidilizumab, atezolizumab, avelumab, durvalumab, BMS 936559, JNJ 61610588, urelumab, 9B12, PF-04518600, BMS-986016, TSR-022, MBG453, MEDI6469, MEDI6383, y epacadostat.

Se proporcionan ejemplos de inhibidores de punto de control inmunitario en Marin-Acevedo et al., Journal of Hematology & Oncology 11: 8, 2018; Kavecansky y Pavlick, AJHO 13(2): 9-20, 2017; Wei et al., Cancer Discov 8(9): 1069-86, 2018.

Preferentemente, el inhibidor de punto de control inmunitario es un inhibidor de CTLA-4, LAG-3, Tim3, PD-1, PD-L1, VISTA, CD137, OX40, o IDO1.

En algunos casos, el inhibidor es un fármaco de molécula pequeña. En algunos casos, el inhibidor es un receptor soluble. En algunos casos, el inhibidor es un anticuerpo.

Un "fármaco de molécula pequeña" se utiliza ampliamente en la presente memoria para referirse a un compuesto orgánico, inorgánico u organometálico que típicamente presenta un peso molecular inferior a aproximadamente 1000. Los fármacos de molécula pequeña comprenden oligopéptidos y otras biomoléculas con un peso molecular inferior a aproximadamente 1000.

La expresión "receptor soluble" hace referencia en la presente memoria a un péptido o un polipéptido que comprende el dominio extracelular de un receptor, aunque no los dominios transmembranales o citoplasmáticos del mismo.

El término "anticuerpo" tal como se utiliza en la presente memoria pretende incluir anticuerpos policlonales y monoclonales. Un anticuerpo (o "inmunoglobulina") consiste en una glucoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región (o dominio) variable de cadena pesada (abreviadamente en la presente memoria, HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviadamente en la presente memoria, LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio: CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de complementariedad" (CDR), o "regiones hipervariables", que son responsables principalmente de la unión de un epítopo a un antígeno, y que se encuentran dispersas entre regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). El método para identificar las CDR dentro de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo y el método para determinar su secuencia son bien conocidos por el experto en la materia. A fin de evitar toda duda, en ausencia de cualquier indicación en el texto en sentido contrario, la expresión CDR se refiere a las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo según se define en IMGT, en el que la numeración única de IMGT proporciona una delimitación estandarizada de las regiones marco y de las regiones determinantes de complementariedad, CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2.

La numeración única de IMGT ha sido definida para comparar los dominios variables con independencia del receptor de antígeno, el tipo de cadena o la especie [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) /Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. y Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. En la numeración única de IMGT, los aminoácidos conservados siempre presentan la misma posición, por ejemplo, la cisteína 23 (1°-CYS), el triptófano 41 (TRP-CONSERVADO), el aminoácido hidrófobo 89, la cisteína 104 (2°-CYS), la fenilalanina o triptófano 118 (J-PHE o J-TRP). La numeración única de IMGT proporciona una delimitación estandarizada de las regiones marco (FR1-IMG, posiciones 1 a 26; FR2-IMGT: 39 a 55; FR3-IMGT: 66 a 104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones determinantes de complementariedad: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3IMGT: 105 a 117. Debido a que los huecos representan posiciones no ocupadas, las longitudes de CDR-IMGT (mostradas entre corchetes y separadas por puntos, por ejemplo, [8.8.13]) se convierten en información crucial. La numeración única de IMGT se utiliza en representaciones gráficas 2D, denominadas IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) /Kaas, Q. y Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], y en estructuras 3D en IMGT/estructura 3D-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Cada VH y cada VL está compuesto de tres CDR y cuatro FR, dispuestos de extremo aminoterminal a extremo carboxiterminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con el antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (CIq) del sistema clásico del complemento. Los anticuerpos pueden ser de diferentes isotipos (concretamente, IgA, IgD, IgE, IgG o IgM).

Un "anticuerpo policlonal" es un anticuerpo que ha sido producido entre o en presencia de otro u otros anticuerpos no idénticos adicionales. En general, los anticuerpos policlonales se producen a partir de un linfocito B en presencia de otros varios linfocitos B productores de anticuerpos no idénticos. Habitualmente, los anticuerpos policlonales se obtienen directamente de un animal inmunizado.

La expresión "anticuerpo monoclonal" designa un anticuerpo que se genera a partir de una población de anticuerpos prácticamente homogénea, en la que la población comprende anticuerpos idénticos excepto por unas cuantas mutaciones naturales posibles que pueden encontrarse en proporciones mínimas. Un anticuerpo monoclonal aparece a partir del crecimiento de un único clon celular, tal como un hibridoma, y se caracteriza por cadenas pesadas de una clase y subclase, y cadenas ligeras de un tipo.

El inhibidor puede ser un anticuerpo antagonista, es decir, un anticuerpo que inhibe o reduce una o más de las actividades biológicas de un antígeno, tal como cualquiera de las proteínas de punto de control inmunitario indicadas en la presente memoria. Determinados anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente una o más de las actividades biológicas de dicho antígeno. El término "inhibir", o un equivalente gramatical del mismo, utilizado en el contexto de un anticuerpo se refiere a un anticuerpo que suprime, restringe o reduce una actividad biológica del antígeno al que se une el anticuerpo. El efecto inhibitorio de un anticuerpo puede ser uno que resulte en un cambio medible en la actividad biológica del antígeno.

En particular, el inhibidor de punto de control inmunitario se selecciona de entre el grupo que consiste en ipilimumab, pembrolizumab, nivolumab, cemiplimab, pidilizumab, atezolizumab, avelumab, durvalumab, BMS 936559, JNJ 61610588, urelumab, 9B12, PF-04518600, BMS-986016, TSR-022, MBG453, MEDI6469, MEDI6383 y epacadostat.

Específicamente, el inhibidor de punto de control inmunitario puede ser un inhibidor de CTLA-4, PD-1 o PD-L1. Preferentemente, dicho inhibidor de punto de control inmunitario es un anticuerpo contra cualquiera de CTLA-4, PD-1 o PD-L1. Más preferentemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo antagonista. Todavía más preferentemente, dicho anticuerpo antagonista se selecciona de entre ipilimumab, pembrolizumab, nivolumab, cemiplimab, pidilizumab, atezolizumab, avelumab y durvalumab.

Más específicamente, el inhibidor de punto de control inmunitario puede ser un inhibidor de PD-1. Preferentemente, dicho inhibidor de punto de control inmunitario es un anticuerpo contra PD-1. Más preferentemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo antagonista. Todavía más preferentemente, el inhibidor de punto de control inmunitario es pembrolizumab, nivolumab, cemiplimab o pidilizumab.

Anticuerpos anti-hPG

La progastrina (PG) es producida por células tumorales colorrectales y se cree que estimula la proliferación de estas células mediante la inducción de una ruta de transducción de señales que bloquea los procesos de diferenciación normales de las células, incluyendo aquellos procesos que conducen a la muerte celular. El agotamiento del transcrito del gen de la gastrina que codifica la progastrina induce la diferenciación celular y la muerte celular programada en las células tumorales en modelos de CRC in vitro e in vivo, reduciendo la proliferación de las células tumorales. Aunque sin pretender limitarse a ninguna teoría de funcionamiento, a través de la unión de PG se cree que los anticuerpos anti-hPG bloquean o inhiben su capacidad de interactuar con su pareja o parejas de señalización. Lo anterior a su vez inhibe una ruta de transducción de señales en las células tumorales colorrectales que de otro modo conduciría a la proliferación.

La preprogastrina humana, un péptido de 101 aminoácidos (secuencia de aminoácidos de referencia: AAB19304.1), es el producto de traducción principal del gen de la gastrina. La progastrina (PG) se forma por la escisión de los primeros 21 aminoácidos (el péptido de señal) de la preprogastrina. La cadena de 80 aminoácidos de la progastrina es procesada adicionalmente por enzimas de corte y modificación en varias formas de hormona gastrina biológicamente activas: gastrina 34 (G34) y gastrina 34 extendida por glicina (G34-Gly), que comprende los aminoácidos 38 a 71 de la progastrina, gastrina 17 (G17) y gastrina 17 extendida por glicina (G17-Gly), que comprende los aminoácidos 55 a 71 de la progastrina.

El término "progastrina" designa el péptido progastrina de mamífero, y particularmente la progastrina humana. A fin de evitar toda duda, sin ninguna especificación, la expresión "progastrina humana", o "hPG", se refiere a la PG humana de secuencia SEC ID n° 1. La progastrina humana comprende especialmente un dominio N-terminal y un dominio C-terminal que no se encuentran presentes en las formas de hormona gastrina biológicamente activas indicadas anteriormente. Preferentemente, la secuencia de dicho dominio N-terminal se representa mediante la SEC ID n° 2. En otro aspecto preferido, la secuencia de dicho dominio C-terminal se representa mediante la SEC ID n° 3.

La expresión "molécula de unión a gastrina" en la presente memoria se refiere a cualquier molécula que se une a la gastrina, pero que no se une a gastrina-17 (G17), gastrina-34 (G34), gastrina-17 extendida por glicina (G17-Gly) o gastrina-34 extendida por glicina (G34-Gly) y el péptido flanqueante C-terminal (CTFP). La molécula de unión a progastrina puede ser cualquier molécula de unión a progastrina, tal como, por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una molécula de receptor. Preferentemente, la molécula de unión a progastrina es un anticuerpo antiprogastrina (un anticuerpo anti-hPG) o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

El término "unión", "se une", o similar, se refiere a que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, forma un complejo con un antígeno que, bajo condiciones fisiológicas, es relativamente estable. Los métodos para determinar si dos moléculas se unen son bien conocidos en la técnica y entre ellos se incluyen, por ejemplo, la diálisis de equilibrio, la resonancia del plasmón superficial, y similares. En particular, dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a la progastrina con una afinidad que es por lo menos dos veces superior a su afinidad para la unión a una molécula no específica, tal como BSA o caseína. Más particularmente, dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une únicamente a la progastrina.

Más específicamente, el presente anticuerpo anti-hPG reconoce un epítopo de la progastrina, en el que dicho epítopo incluye una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal de la progastrina, en la que dicha secuencia de aminoácidos puede incluir los residuos 10 a 14 de la hPG, los residuos 9 a 14 de la hPG, los residuos 4 a 10 de la hPG, los residuos 2 a 10 de la hPG o los residuos 2 a 14 de la hPG, en la que la secuencia de aminoácidos de la hPG es SEC ID n° 1.

Más específicamente, el anticuerpo anti-hPG reconoce un epítopo de la progastrina, en el que dicho epítopo incluye una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de la progastrina, en la que dicha secuencia de aminoácidos puede incluir los residuos 71 a 74 de la hPG, los residuos 69 a 73 de la hPG, los residuos 71 a 80 de la hPG ^{( S e C} ID n° 40), los residuos 76 a 80 de la hPG o los residuos 67 a 74 de la hPG, en la que la secuencia de aminoácidos de la hPG es SEC ID n° 1.

Más particularmente, el anticuerpo anti-hPG presenta una afinidad para la progastrina de por lo menos 5000 nM, de por lo menos 500 nM, 100 nM, 80 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, 50 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, o de por lo menos 0.1 pM, según se determina mediante un método tal como se indica en la presente memoria.

Preferentemente, el anticuerpo anti-hPG es un anticuerpo anti-hPG neutralizador.

La expresión "anticuerpo anti-hPG neutralizador" designa un anticuerpo que se une a la PG y bloquea la señalización dependiente de PG, resultando en la inhibición de las respuestas inducidas por PG en las células tumorales, y particularmente en las células tumorales CRC. Las respuestas de inhibición inducidas por PG de las células cancerosas pueden estar mediadas por la represión de la diferenciación celular, la represión de la muerte celular y/o la estimulación de la proliferación celular.

En particular, dicho anticuerpo de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se selecciona de entre el grupo que consiste en anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos camelizados, anticuerpos IgA1, anticuerpos IgA2, anticuerpos IgD, anticuerpos IgE, anticuerpos IgG1, anticuerpos IgG2, anticuerpos IgG3, anticuerpos IgG4 y anticuerpos IgM.

En otro caso particular, el anticuerpo de unión a prograstrina se ha obtenido mediante un método de inmunización conocido por el experto en la materia, en el que la utilización como inmunógeno de un péptido cuya secuencia de aminoácidos comprende la totalidad o una parte de la secuencia de aminoácidos de la progastrina. Más particularmente, dicho inmunógeno comprende un péptido seleccionado de entre:

• un péptido cuya secuencia de aminoácidos comprende, o consiste en la secuencia de aminoácidos de la progastrina de longitud completa, y particularmente la progastrina humana de longitud completa de SEC ID n° 1,

• un péptido cuya secuencia de aminoácidos corresponde a una parte de la secuencia de aminoácidos de la progastrina, y particularmente la progastrina humana de longitud completa de SEC ID n° 1,

• un péptido cuya secuencia de aminoácidos corresponde a una parte o a la secuencia de aminoácidos completa de la parte N-terminal de la progastrina, y en particular péptidos que comprenden, o que consisten en la secuencia de aminoácidos: SWKPRSQQPDAPLG (SEC iD n° 2), y

• un péptido cuya secuencia de aminoácidos corresponde a una parte o a la secuencia de aminoácidos completa de la parte C-terminal de la progastrina, y en particular péptidos que comprenden, o que consisten en la secuencia de aminoácidos: QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (SEC ID n° 3),

• un péptido cuya secuencia de aminoácidos corresponde a una parte de la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de la progastrina, y en particular péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos FGRRSAEDEN (SEC ID n° 40), correspondiente a los aminoácidos 71 a 80 de la progastrina.

El experto en la materia conocerá que dicha inmunización puede utilizarse para generar anticuerpos policlonales o monoclonales, según se desee. Los métodos para obtener cada uno de dichos tipos de anticuerpos son bien conocidos de la técnica. De esta manera, el experto en la materia seleccionará e implementará fácilmente un método para generar anticuerpos policlonales y/o monoclonales contra cualquier antígeno dado.

Los anticuerpos monoclonales contra la progastrina anteriormente ya eran conocidos (ver, por ejemplo, el documento Wo 2017/114976; Prieur, A. et al. (2017) Clin. Cancer Res., 23(17): 5267-5280). Entre los ejemplos de anticuerpos monoclonales que se han generado mediante la utilización de un inmunógeno que comprende la secuencia de aminoácidos "SWKPRSQQPDAPLG", correspondiente a la secuencia de aminoácidos 1-14 de la progastrina humana (extremo N-terminal) se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, anticuerpos monoclonales designados como: mAb3, mAb4, mAb16 y mAb19 y mAb20, tal como se indica en las tablas 1 a 4 a continuación. Se han descrito otros anticuerpos monoclonales, aunque no está claro si estos anticuerpos realmente se unen a la progastrina (documento WO 2006/032980). Los resultados experimentales de mapeado de epítopos muestran que mAb3, mAb4, mAb16, mAb19 y mAb20 sí se unen específicamente a un epítopo dentro de dicha secuencia de aminoácidos N-terminal de hPG. Los anticuerpos policlonales que reconocen específicamente un epítopo dentro del extremo N-terminal de la progastrina representada por la SEC ID n° 2, han sido descritos en la técnica (ver, por ejemplo, el documento WO 2011/083088).

Tabla 1

Tabla 2

Tabla 3

Tabla 4

Entre los ejemplos de anticuerpos monoclonales que pueden generarse mediante la utilización de un inmunógeno que comprende la secuencia de aminoácidos "^q G^pW ^l EEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN" (parte C-terminal de la progastrina) correspondiente a la secuencia de aminoácidos 55-80 de la progastrina humana se incluyen, aunque sin limitación, los anticuerpos designados como mAb8 y mAb13 en las tablas 5 y 6, a continuación. Los resultados experimentales de mapeado de epítopos muestran que mAb13 sí se une específicamente a un epítopo dentro de dicha secuencia de aminoácidos C-terminal de hPG.

Tabla 5

Tabla 6

Entre otros ejemplos se incluyen anticuerpos monoclonales y/o policlonales anti-hPG generados mediante la utilización de un inmunógeno que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 40.

Las expresiones "anticuerpos anti-hPG N-terminales" y "anticuerpos anti-hPG C-terminales" designan anticuerpos que se unen a un epítopo que comprende los aminoácidos situados en la parte N-terminal de la hPG o a un epítopo que comprende aminoácidos situados en la parte C-terminal de la hPG, respectivamente. Preferentemente, la expresión "anticuerpos anti-hPG N-terminales" se refiere a anticuerpos que se unen a un epítopo situado en un dominio de la progastrina cuya secuencia se representa mediante SEC ID n° 2. En otro aspecto preferido, la expresión "anticuerpos anti-hPG C-terminales" se refiere a anticuerpos que se unen a un epítopo situado en un dominio de la progastrina cuya secuencia se representa mediante ^s E^c ID n° 3.

El término "epítopo" se refiere a una región de un antígeno a la que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subgrupo de los epítopos estructurales y poseen aquellos aminoácidos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos asimismo pueden ser conformacionales. Entre los epítopos pueden incluirse determinantes que son agregados de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales sacáridas, grupos fosforilo o grupos sulfonilo, y en determinados casos, pueden presentar características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. La determinación del epítopo al que se une un anticuerpo puede llevarse a cabo mediante cualquier técnica de mapeado de epítopos conocida por el experto en la materia. Un epítopo puede comprender diferentes aminoácidos que están situados secuencialmente dentro de la secuencia de aminoácidos de una proteína. Un epítopo puede comprender, además, aminoácidos que no están situados secuencialmente dentro de la secuencia de aminoácidos de una proteína.

En particular, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en:

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 7, n° 8 y n° 9, respectivamente, o secuencias con una identidad por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 7, n° 8 y n° 9, respectivamente.

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDRHl, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 10, n° 11 y n° 12, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 10, n° 11 y n° 12, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 13, n° 14 y n° 15, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 13, n° 14 y n° 15, respectivamente.

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 16, n° 17 y n° 18, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 16, n° 17 y n° 18, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 19, n° 20 y n° 21, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 19, n° 20 y n° 21, respectivamente.

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 22, n° 23 y n° 24, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 22, n° 23 y n° 24, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 25, n° 26 y n° 27, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 25, n° 26 y n° 27, respectivamente.

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 28, n° 29 y n° 30, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 28, n° 29 y n° 30, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 31, n° 32 y n° 33, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 31, n° 32 y n° 33, respectivamente, y

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 34, n° 35 y n° 36, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 35, n° 35 y n° 36, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 37, n° 38 y n° 39, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 37, n° 38 y n° 39, respectivamente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el "porcentaje de identidad" o "% de identidad" entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se refiere al porcentaje de nucleótidos o residuos aminoácidos idénticos entre las dos secuencias que se comparan, obtenido después de la alineación óptima, en donde dicho porcentaje es puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias están distribuidas aleatoriamente a lo largo de su longitud. La comparación de las dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos tradicionalmente se lleva a cabo mediante comparación de las secuencias después de la alineación óptima de las mismas, en donde dicha comparación puede llevarse a cabo por segmento o mediante la utilización de una "ventana de alineación". La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, además de comparar manualmente, por medio de métodos conocidos por el experto en la materia.

Para la secuencia de aminoácidos que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia, entre los ejemplos preferentes se incluyen los que contienen la secuencia de referencia, determinadas modificaciones, especialmente una deleción, adición o sustitución de por lo menos un aminoácido, el truncado o la extensión. En el caso de la sustitución de uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos, resultan preferidas las sustituciones en las que los aminoácidos sustituidos se sustituyen por aminoácidos "equivalentes". En la presente memoria, la expresión "aminoácidos equivalentes" pretende indicar cualesquiera aminoácidos que es probable que se sustituyan por uno de los aminoácidos estructurales sin modificar, sin embargo, las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y de los ejemplos específicos definidos posteriormente.

Pueden determinarse los aminoácidos equivalentes a partir de su homología estructural con los aminoácidos a los que sustituyen o a partir de los resultados de pruebas comparativas de actividad biológica entre los diversos anticuerpos que es probable que se generarán.

Más particularmente, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en:

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 41 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 42,

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 43 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 44,

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 45 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 46,

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 47 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 48,

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 49 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 50, y

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 51 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 52.

En particular, el anticuerpo de la presente combinación es un anticuerpo quimérico.

Un "anticuerpo quimérico", tal como se utiliza en la presente memoria, es un anticuerpo en el que la región constante, o una parte de la misma, ha sido alterada, sustituida o intercambiada, de manera que la región variable está unida a una región constante de una especie diferente, o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpos. "Anticuerpo quimérico" se refiere, además, a un anticuerpo en el que la región variable, o una parte de la misma, ha sido alterada, sustituida o intercambiada, de manera que la región constante está unida a una región variable de una especie diferente, o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpos.

En otro aspecto particular, el anticuerpo de la presente combinación es un anticuerpo humanizado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano, en el que las demás partes de la molécula de anticuerpo derivan de uno o varios anticuerpos humanos. Además, algunos de los residuos del segmento esquelético (denominado FR por marco (“framework”)) pueden modificarse para conservar la afinidad de unión, según técnicas conocidas por el experto en la materia (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986). El objetivo de la humanización es reducir la inmunogenicidad de un anticuerpo xenogénico, tal como un anticuerpo murino, para la introducción en un ser humano, manteniendo simultáneamente la afinidad y especificación de unión a antígeno completas del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos pueden prepararse mediante técnicas conocidas por el experto en la materia (tales como, por ejemplo, las descritas en el documento Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992. Dichos anticuerpos humanizados resultan preferidos para la utilización en métodos que implican diagnósticos in vitro o el tratamiento preventivo y/o terapéutico in vivo. Otras técnicas de humanización asimismo son conocidas por el experto en la materia. En efecto, los anticuerpos pueden humanizarse mediante la utilización de técnicas entre las que se incluyen la injertación de CDR (documentos EP 0451 261, EP 0682040, EP 0939 127, EP 0 566 647, patentes US n° 5.530.101, US n° 6.180.370, US n° 5.585.089, US n° 5.693.761, US n° 5.639.641, US n° 6.054.297, US n° 5.886.152 y US n° 5.877.293), la inactivación o la resuperficialización (documentos EP 0 592 106 y EP 0 519 596; Padlan E. A., 1991 , Molecular Immunology 28(4/5): 489­ 498; Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; Roguska M.A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:969-973) y el intercambio de cadenas (patente US n° 5.565.332). Pueden producirse anticuerpos humanos mediante una diversidad de métodos conocidos de la técnica, incluyendo métodos de expresión fágica. Ver asimismo las patentes US n° 4.444.887, n° 4.716.111, n° 5.545.806 y n° 5.814.318, y solicitudes publicadas de patente internacional WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741.

Más particularmente, dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado, seleccionado de entre el grupo que consiste en:

• Un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 7, n° 8 y n° 9, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 7, n° 8 y n° 9, respectivamente.

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 10, n° 11 y n° 12, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 10, n° 11 y n° 12, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 13, n° 14 y n° 15, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 13, n° 14 y n° 15, respectivamente.

• Un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 16, n° 17 y n° 18, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 16, n° 17 y n° 18, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 19, n° 20 y n° 21, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 19, n° 20 y n° 21, respectivamente.

• Un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 22, n° 23 y n° 24, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 22, n° 23 y n° 24, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 25, n° 26 y n° 27, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 25, n° 26 y n° 27, respectivamente.

• Un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 28, n° 29 y n° 30, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 28, n° 29 y n° 30, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 31, n° 32 y n° 33, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 31, n° 32 y n° 33, respectivamente, y

• Un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 34, n° 35 y n° 36, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 35, n° 35 y n° 36, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n° 37, n° 38 y n° 39, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 37, n° 38 y n° 39, respectivamente,

en el que dicho anticuerpo comprende además regiones constantes de la cadena ligera y de la cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano.

En otro aspecto más particular, dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado seleccionado de entre el grupo que consiste en:

• un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 53 y una región variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 54,

• un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 55 y una región variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 56,

• un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre s Ec ID n° 57, n° 58 y n° 59, y una región variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n° 60, n° 61 y n° 62,

• un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre ^s E^c ID n° 63, n° 64 y n° 65, y una región variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n° 66, n° 67 y n° 68,

• un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n° 69 y n° 71, y una región variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n° 70 y n° 72, y

• un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n° 75 y n° 76, y una región variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n° 77 y n° 78,

en el que dicho anticuerpo comprende además regiones constantes de la cadena ligera y de la cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano.

Más preferentemente, dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 71 y una región variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 72, en el que dicho anticuerpo comprende además regiones constantes de la cadena ligera y de la cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano.

Todavía más preferentemente, dicho anticuerpo comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 72 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n° 74.

Fragmentos de anticuerpo

Los fragmentos de un anticuerpo, especialmente fragmentos de unión a antígeno del mismo, asimismo se dan a conocer en la presente memoria.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una parte de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región de unión a antígeno o variable del mismo. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv y scFv; diacuerpos, anticuerpos lineales, minicuerpos (Olafsen et al., (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323), los fragmentos producidos mediante una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id), CDR (región determinante de complementariedad) y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los indicados en la presente memoria que se unen inmunoespecíficamente a antígenos de células cancerosas, antígenos víricos o antígenos microbianos, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpo.

La expresión "dominio de unión a antígeno" de un anticuerpo (o "fragmento de unión a antígeno") se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, hPG). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Entre los ejemplos de fragmentos de unión comprendidos en la expresión "dominio de unión a antígeno" de un anticuerpo se incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V^l, V^h, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un enlace disulfuro en la región de bisagra ; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un único brazo de un anticuerpo, (v) un único dominio o fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio V^h; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislado o (vii) una combinación de dos o más CDR aisladas que pueden unirse opcionalmente mediante un conector sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VLy Vh, están codificados por genes separados, pueden unirse mediante métodos recombinantes, mediante un conector sintético que les permite convertirlos en una única cadena proteica en la que las regiones Vl y Vh se emparejan formando moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); ver, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426, y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Asimismo se pretende que dichos anticuerpos de cadena sencilla se encuentren comprendidos dentro de la expresión "dominio de unión a antígeno" de un anticuerpo.

Dichos fragmentos de anticuerpo se obtienen mediante la utilización de técnicas convencionales conocidas por el experto en la materia, y los fragmentos se criban para su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Las partes de unión a antígeno pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante corte enzimático o químico de inmunoglobulinas intactas.

Derivados de anticuerpos

Los anticuerpos anti-hPG pueden modificarse adicionalmente para que contengan fracciones no proteicas adicionales que son conocidas en la técnica y se encuentran fácilmente disponibles. En particular, en la presente memoria se incluyen anticuerpos monoclonales anti-hPG que están derivatizados, modificados covalentemente, o conjugados con otras moléculas, para la utilización en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Por ejemplo, aunque sin limitación, entre los anticuerpos derivatizados se incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, corte proteolítico, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de entre numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, incluyendo, aunque sin limitación, el corte químico específico, la acetilación, la formilación, la síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Preferentemente, las fracciones adecuadas para la derivatización del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Entre los ejemplos no limitativos de polímeros solubles en agua se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unido al anticuerpo puede variar, y en el caso de que se una más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros utilizados para la derivatización puede determinarse basándose en consideraciones entre las que se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que debe mejorarse, la opción de que el derivado de anticuerpo se utilice en una terapia bajo condiciones definidas, etc.

En un ejemplo específico, los anticuerpos anti-hPG de la presente divulgación pueden unirse a fracciones de poli(etilenglicol) (PEG), por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo y las fracciones de PEG unidas mediante cualquier cadena lateral de aminoácido disponible o grupo funcional de aminoácido terminal localizado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Dichos aminoácidos pueden encontrarse naturalmente en el fragmento de anticuerpo o pueden introducirse artificialmente en el fragmento mediante la utilización de métodos de ADN recombinante. Ver, por ejemplo, la patente US n° 5.219.996. Pueden utilizarse múltiples sitios para unir dos o más moléculas de PEG. Las fracciones PEG pueden unirse covalentemente mediante un grupo tiol de por lo menos un residuo de cisteína localizado en el fragmento de anticuerpo. En el caso de que se utilice un grupo tiol como el punto de unión, pueden utilizarse fracciones efectoras apropiadamente activadas, por ejemplo, derivados selectivos para tiol, tales como maleimidas y derivados de cisteína.

En un ejemplo específico, un conjugado de anticuerpo anti-hPG es un fragmento Fab' modificado que está PEGilado, es decir, presenta PEG (poli(etilenglicol)) unido covalentemente al mismo, por ejemplo según el método dado a conocer en el documento EP 0948544. Ver asimismo Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris y S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D.C., 1997), y Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam y A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998), y Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545. PEG puede unirse a una cisteína en la región bisagra. En un ejemplo, un fragmento Fab' modificado con PEG presenta un grupo maleimida unido covalentemente a un único grupo tiol en una región bisagra modificada. Un residuo de lisina puede unirse covalentemente al grupo maleimida y a cada uno de los grupos amina en el residuo de lisina puede unirse un polímero metoxipoli(etilenglicol) que presenta un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total del PEG unido al fragmento Fab', por lo tanto, puede ser de aproximadamente 40.000 Da.

Se proporcionan además conjugados de un anticuerpo y una fracción no proteica que puede calentarse selectivamente mediante exposición a radiación. La fracción no proteica puede ser un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, aunque sin limitarse a ellas, longitudes de onda que no dañan las células ordinarias, pero que calientan la fracción no proteica hasta una temperatura a la que las células próximas al anticuerpo-fracción no proteica resultan eliminadas.

Inmunoconjugados

En otro aspecto, la divulgación se refiere además a inmunoconjugados (intercambiablemente denominados "conjugados de anticuerpo-fármaco" o "CAA") que comprenden un anticuerpo anti-hPG tal como se indica en la presente memoria, en el que dicho anticuerpo que se conjuga con uno o más agentes citotóxicos, tal como un agente quimioterápico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina proteica, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

Se han utilizado inmunoconjugados para la administración local de agentes citotóxicos, es decir, fármacos que eliminan o inhiben el crecimiento o proliferación de las células, en el tratamiento del cáncer (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146; Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172; patente US n° 4.975.278). Los inmunoconjugados permiten la administración dirigida de una fracción de fármaco en un tumor, y la acumulación intracelular en el mismo, en donde la administración sistémica de fármacos no conjugados podría resultar en niveles inaceptables de toxicidad para las células normales además de para las células tumorales que se busca eliminar (Baldwin et al, Lancet (15 de marzo de 1986) páginas 603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en: Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) páginas 475­ 506. Se ha informado de que tanto los anticuerpos policlonales como los anticuerpos monoclonales resultan útiles en dichas estrategias (Rowland et al. (1986), Cancer Immunol. Immunother. 21 :183-87). Entre los fármacos utilizados en dichos métodos se incluyen daunomicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al. (1986), supra). Entre las toxinas utilizadas en conjugados de anticuerpo-toxina se incluyen toxinas bacterianas, tales como la toxina diftérica, toxinas vegetales tales como la ricina, toxinas de molécula pequeña, tales como la geldanamicina (Mandler et al. (2000), J. Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) y la caliqueamicina (Lode et al. (1998) Cancer Res.

58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos mediante mecanismos que incluyen la unión de tubulina, la unión de ADN o la inhibición por topoisomerasas. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos al conjugarse con anticuerpos de gran tamaño o ligandos de receptores de proteínas.

En determinados casos, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo y un agente quimioterápico u otra toxina. En la presente memoria (por ejemplo, anteriormente) se describen agentes quimioterápicos útiles en la generación de inmunoconjugados. Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse se incluyen la cadena A diftérica, fragmentos activos no ligantes de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modeccina, la alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, las proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAPS-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Ver, por ejemplo, el documento WO 93/21232, publicado el 28 de octubre de 1993. Se encuentra disponible una diversidad de radionucleidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Entre los ejemplos se incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Pueden prepararse conjugados de un anticuerpo y un agente citotóxico mediante la utilización de una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (PSPD), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ejemplificativo para la conjugación de nucleótidos radioactivos con el anticuerpo. Ver el documento WO94/11026.

Asimismo se encuentran contemplados en la presente memoria conjugados de un anticuerpo con una o más toxinas de molécula pequeña, tales como caliqueamicina, maitansinoides, dolastatinas, aurostatinas, un tricoteceno y CC 1065, y los derivados de dichas toxinas que presentan actividad de toxina.

El inmunoconjugado dado a conocer en la presente memoria puede comprender además un conector.

"Conector", "unidad conectora" o "conexión" se refiere a una fracción química que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que une covalentemente una proteína de unión a por lo menos un agente citotóxico.

Pueden prepararse conectores mediante la utilización de una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (PSPD), ciclohexán-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (CCSM), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-(p-diazonio-benzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilén-triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ejemplificativo para la conjugación de agentes citotóxicos con el sistema de direccionamiento. Otros reactivos reticuladores pueden ser BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato), que se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., EE. UU.).

El conector puede ser "no escindible" o "escindible".

Ácidos nucleicos y sistemas de expresión

La presente divulgación comprende polinucleótidos codificantes de genes de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina para anticuerpos, especialmente anticuerpos anti-hPG, vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos y células hospedadoras capaces de producir los anticuerpos de la divulgación.

En un primer aspecto, la presente divulgación se refiere a uno o más polinucleótidos codificantes de un anticuerpo, especialmente un anticuerpo capaz de unirse específicamente a la progastrina tal como se ha indicado anteriormente.

De esta manera, en la presente memoria se proporciona un polinucleótido codificante de la cadena pesada de un anticuerpo anti-hPG indicado anteriormente. Preferentemente, dicha cadena pesada comprende tres CDR de cadena pesada de secuencias SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6. Más preferentemente, dicha cadena pesada comprende una cadena pesada que comprende la región variable de secuencia SEC ID n° 14. Todavía más preferentemente, dicha cadena pesada presenta una secuencia completa SEC ID n° 16.

Alternativamente, el polinucleótido codificante la cadena ligera de un anticuerpo anti-hPG indicado anteriormente. Preferentemente, dicha cadena pesada comprende tres CDR de cadena pesada de secuencias SEC ID n° 7, n° 8 y n° 9. Más preferentemente, dicha cadena pesada comprende una cadena pesada que comprende la región variable de secuencia SEC ID n° 15. Todavía más preferentemente, dicha cadena pesada presenta una secuencia completa SEC ID n° 17.

Puede utilizarse una diversidad de sistemas de expresión para expresar el presente anticuerpo. En un aspecto, dichos sistemas de expresión representan vehículos mediante los que pueden producirse las secuencias codificantes de interés y posteriormente purificarse, aunque asimismo representan células que pueden, al transfectarse transitoriamente con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresar un anticuerpo IgG in situ.

Los vectores que comprenden los polinucleótidos indicados anteriormente se proporcionan en la presente memoria. El vector puede contener un polinucleótido codificante de una cadena pesada del anticuerpo de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-hPG). Alternativamente, dicho polinucleótido puede codificar la cadena ligera del anticuerpo de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-hPG). En la presente memoria se proporcionan además vectores que comprenden moléculas de polinucleótido codificantes de proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpo y sondas de los mismos.

Con el fin de expresar la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-hPG), los polinucleótidos codificantes de dichas cadenas pesadas y/o ligeras se insertan en vectores de expresión de manera que los genes se encuentran ligadas funcionalmente a secuencias transcripcionales y traduccionales.

Entre las secuencias "ligadas funcionalmente" se incluyen tanto secuencias de control de la expresión que son contiguas al gen de interés como secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a cierta distancia en el control del gen de interés. La expresión "secuencia de control de la expresión" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a secuencia polinucleótidas que resultan necesarias para afectar a la expresión y procesamiento de secuencias codificantes a las que se ligan. Entre las secuencias de control de la expresión se incluyen secuencias apropiadas de inicio de transcripción, de terminación, promotores e intensificadores; señales eficientes de procesamiento de ARN, tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficiencia de la traducción (es decir, secuencias de consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de la proteína, y en caso que se desee, secuencias que potencian la secreción de las proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere según el organismo hospedador: en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen promotor, un sitio de unión ribosómica y una secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, entre dichas secuencias de control se incluyen promotores y una secuencia de terminación de la transcripción. La expresión "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia resulta esencial para la expresión y el procesamiento, y puede incluir además componentes adicionales cuya presencia resulta ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de pareja de fusión.

El término “vector”, tal como se utiliza en la presente memoria, pretende referirse a una molécula de ácidos nucleicos capaz de transportar otro ácido nucleico al que ha sido unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN circular de doble cadena en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en la célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos con un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Pueden integrarse otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora y de esta manera se replican junto con el genoma del hospedador.

Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se encuentran ligados funcionalmente. Dichos vectores se denominan en la presente memoria "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante se encuentran en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse intercambiablemente, ya que el plásmido es la forma de vector utiliza más habitualmente. Sin embargo, dichas formas de vectores de expresión, tales como plásmidos bacterianos, YAC, cósmidos, retrovirus, episomas derivados del VEB, y la totalidad de los demás vectores que conocerá el experto en la materia que resultan convenientes para garantizar la expresión de las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-hPG), se encuentran incluidos en la presente memoria. El experto en la materia conocerá que los polinucleótidos codificantes de las cadenas pesadas y ligeras pueden clonarse en diferentes vectores o en el mismo vector. Preferentemente, dichos polinucleótidos se clonan en dos vectores.

Los polinucleótidos indicados en la presente memoria y los vectores que comprenden dichas moléculas pueden utilizarse para la transformación de una célula hospedadora adecuada. La expresión "célula hospedadora", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende referirse a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante con el fin de expresar el anticuerpo de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-hPG). Debe entenderse que dichos términos pretenden referirse no sólo a la célula objeto particular, sino asimismo a la progenie de dicha célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias medioambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, aunque todavía se encuentra comprendida dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora" tal como se utiliza en la presente memoria.

Puede llevarse a cabo la transformación mediante cualquier método conocido de introducción de polinucleótidos en una célula hospedadora. Dichos métodos son bien conocidos del experto en la materia y entre ellos se incluyen la transformación mediada por dextrano, la precipitación con fosfato cálcico, la transfección mediada por polibreno, la fusión de protoplastos, la electroporación, el encapsulado del polinucleótido en liposomas, la inyección biolística y la microinyección directa del ADN en los núcleos.

La célula hospedadora puede cotransfectarse con uno o más vectores de expresión. Por ejemplo, una célula hospedadora puede transfectarse con un vector codificante de tanto la cadena pesada como la cadena ligera del anticuerpo de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-hPG), tal como se ha indicado anteriormente. Alternativamente, la célula hospedadora puede transformarse con un primer vector codificante de la cadena pesada del anticuerpo de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-hPG) y con un segundo vector codificante de la cadena ligera de dicho anticuerpo. Las células de mamífero se utilizan habitualmente para la expresión de inmunoglobulinas terapéuticas recombinantes, especialmente para la expresión de anticuerpos recombinantes completos. Por ejemplo, las células de mamífero, tales como las células HEK293 o las células CHO, junto con un vector que contiene la señal de expresión, tal como uno que porte el elemento promotor del gen temprano intermedio mayor del citomegalovirus humano, son un sistema eficaz para expresar el anticuerpo anti-hPG humanizado descrito en la presente memoria (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2).

Además, puede seleccionarse una célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico de la manera específica que se desea. Dichas modificaciones (por ejemplo, la glucosilación) y el procesamiento de productos proteicos pueden ser importantes para el funcionamiento de la proteína. Diferentes células hospedadoras presentan características y mecanismos específicos para el procesamiento postraduccional y la modificación de las proteínas y productos génicos. Se seleccionan estirpes celulares o sistemas hospedadores apropiados para garantizar la modificación y procesamiento correctos del anticuerpo de interés expresado. Por lo tanto, se utilizan células hospedadoras eucarióticas, que poseen la maquinaria celular para el procesamiento correcto del transcrito primario, la glucosilación del producto génico. Entre dichas células hospedadoras de mamífero se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las células CHO, COS, HEK293, NS/0, BHK, Y2/0, 3T3 o de mieloma (todas estas estirpes celulares se encuentran disponibles de depósitos públicos, tales como la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes, Paris, Francia, o la American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE. UU.).

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, resulta preferida la expresión estable. Por ejemplo, pueden construirse estirpes celulares que expresen establemente el anticuerpo. Al contrario que la utilización de vectores de expresión que contienen orígenes de replicación víricos, las células hospedadoras se transforman con ADN bajo el control de los elementos reguladores de la expresión apropiados, incluyendo promotores, intensificadores, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación y otras secuencias apropiadas conocidas por el experto en la materia, y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN foráneo, las células construidas pueden dejarse crecer durante uno a dos días en un medio enriquecido y después transferirse a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren establemente el plásmido en un cromosoma y se expandan formando una estirpe celular. Se conocen en la técnica otros métodos de construcción de estirpes celulares estables. En particular, se han desarrollado métodos para la integración específica de sitio. Según dichos métodos, el ADN transformado bajo el control de los elementos reguladores de la expresión apropiados, incluyendo promotores, intensificadores, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación y otras secuencias apropiadas, se integra en el genoma de la célula hospedadora en un sitio diana específico que ha sido previamente cortado (Moele et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104(9): 3055-3060; patentes US n° 5.792.632, US n° 5.830.729, US n° 6.238.924, y documentos WO 2009/054985, WO 03/025183 y WO 2004/067753).

Pueden utilizarse varios sistemas de selección, incluyendo, aunque sin limitación, genes de timidina cinasa del virus herpes simplex (Wigler et al., Cell 11:223, 1977), de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 202, 1992), selección de glutamato sintasa en presencia de metionina sulfoximida (Adv. Drug Del. Rev., 58: 671, 2006, y sitio web o literatura de Lonza Group Ltd.) y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22: 817, 1980) en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, puede utilizarse la resistencia antimetabolitos como base de selección para los genes siguientes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 357, 1980); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072, 1981); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido, G-418 (Wu et al., Biotherapy 3: 87, 1991) e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30: 147, 1984). Los métodos conocidos de la técnica de la tecnología de DNA recombinante pueden aplicarse rutinariamente para seleccionar el clon recombinante deseado, y dichos métodos se describen en, por ejemplo, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993). Los niveles de expresión de un anticuerpo pueden incrementarse mediante amplificación del vector. En el caso de que un marcador en el sistema vector que expresa un anticuerpo sea amplificable, un incremento del nivel de inhibidor presente en el cultivo incrementará el número de copias del gen marcador. Debido a que la región amplificada está asociada al gen codificante del anticuerpo IgG dado a conocer en la presente memoria, asimismo se incrementará la producción de dicho anticuerpo (Crouse et al., Mol Cell Biol 3: 257, 1983). Existen métodos alternativos para expresar el gen indicado en la presente memoria y son conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, puede construirse una proteína de dedo de cinc modificada que es capaz de unirse a los elementos reguladores de la expresión cadena arriba del gen de interés; la expresión de dicha proteína de dedo de cinc (ZFN) en la célula hospedadora conduce a un incremento de la producción de proteína (ver, por ejemplo, Reik et al., Biotechnol. Bioeng., 97(5): 1180-1189, 2006). Además, z Fn puede estimular la integración de un ADN en una localización genómica predeterminada, resultando en la adición génica específica de sitio de alta eficiencia (Moehle et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 3055, 2007).

El anticuerpo de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-hPG) puede prepararse mediante el cultivo de las células hospedadoras transformadas bajo condiciones de cultivo necesarias para expresar el anticuerpo deseado. El anticuerpo expresado resultante puede purificarse a continuación a partir del medio de cultivo o extractos celulares. Pueden recuperarse formas solubles del anticuerpo de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-hPG) a partir del sobrenadante de cultivo. A continuación, puede purificarse mediante cualquier método conocido de la técnica de purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente afinidad de proteína A para Fc, y similares), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Los métodos adecuados de purificación resultarán evidentes para el experto ordinario en la materia.

De esta manera, otro aspecto se refiere a un método para la producción de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-hPG) indicado en la presente memoria, en el que dicho método comprende las etapas de:

a) cultivar la célula hospedadora anteriormente indicada en un medio de cultivo bajo condiciones de cultivo adecuadas, y

b) recuperar el anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-hPG), a partir del medio de cultivo o a partir de dichas células en cultivo.

Composiciones farmacéuticas

La combinación de anticuerpos monoclonales anti-hPG e inhibidores de punto de control inmunitario puede formularse en composiciones. Opcionalmente, las composiciones pueden comprender uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como los terceros agentes terapéuticos indicados posteriormente. Las composiciones habitualmente se suministran como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluye un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, de esta manera se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-hPG, un inhibidor de punto de control inmunitario y un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Dicha composición puede encontrarse en cualquier forma adecuada (según el método deseado de administración de la misma en un paciente). Tal como se utiliza en la presente memoria, "administrar" se refiere a un método de proporcionar una dosis de un compuesto (por ejemplo, un anticuerpo anti-hPG y/o un inhibidor de punto de control inmunitario, tal como se ha indicado anteriormente) o una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica, por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo anti-hPG y/o un inhibidor de punto de control inmunitario, tal como se ha indicado anteriormente) en un sujeto. Las composiciones utilizadas en los métodos indicados en la presente memoria pueden administrarse, por ejemplo, por vía intravítrea (por ejemplo, mediante inyección intravítrea), mediante gotas oculares, por vía intramuscular, intravenosa, intradérmica, percutánea, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intratecal, intranasal, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, intraorbital, oral, tópica, transdérmica, mediante inhalación, mediante inyección, mediante implantación, mediante infusión, mediante infusión continua, mediante baño de perfusión localizada de las células diana directamente, mediante catéter, mediante lavado, en cremas, o en composiciones lipídicas. Las composiciones utilizadas en los métodos indicados en la presente memoria asimismo pueden administrarse por vía sistémica o local. El método de administración puede variar según diversos factores (por ejemplo, el compuesto o composición que se administra y la gravedad de la afección, enfermedad o trastorno bajo tratamiento). La vía de administración más adecuada en cualquier caso dado dependerá del anticuerpo particular, del sujeto y de la naturaleza y gravedad de la enfermedad y la condición física del sujeto. El anticuerpo anti-hPG y/o el inhibidor de punto de control inmunitario pueden formularse en forma de una solución acuosa y administrarse mediante inyección subcutánea.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en formas de dosis unitaria que contienen una cantidad predeterminada de un anticuerpo anti-hPG y/o un inhibidor de punto de control inmunitario por dosis. Dicha unidad puede contener, por ejemplo, aunque sin limitación, 5 mg a 5 g, por ejemplo 10 mg a 1 g, o 20 a 50 mg. Los portadores farmacéuticamente aceptables para la utilización en la divulgación pueden adoptar una amplia diversidad de formas, según, por ejemplo, la afección que debe tratarse o la vía de administración.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden prepararse para el almacenamiento en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mediante la mezcla del anticuerpo que presenta el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales típicamente utilizados en la técnica (la totalidad de los cuales se denominan en la presente memoria "portadores"), es decir, agentes tamponadores, agentes estabilizadores, conservantes, isotonificantes, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos varios. Ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición (Osol, ed. 1980). Dichos aditivos deben ser no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas.

Los agentes tamponadores ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden encontrarse presentes a una concentración comprendida entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 50 mM. Entre los agentes tamponadores adecuados para la utilización con la presente divulgación se incluyen ácidos tanto orgánicos como inorgánicos y sales de los mismos, tales como tampones de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), tampones de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínicosuccinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido sódico, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato sódico, mezcla de ácido tartárico-tartrato potásico, mezcla de ácido tartárico-hidróxido sódico, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódicofumarato disódico, etc.), tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gluconato sódico, mezcla de ácido glucónico-hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico-gluconato potásico, etc.), tampones de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato sódico, mezcla de ácido oxálico-hidróxido sódico, mezcla de ácido oxálico-oxalato potásico, etc.), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato sódico, mezcla de ácido láctico-hidróxido sódico, mezcla de ácido láctico-lactato potásico, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato sódico, mezcla de ácido acético-hidróxido sódico, etc.). Además, pueden utilizarse tampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina, tales como Tris.

Pueden añadirse conservantes para retrasar el crecimiento microbiano y pueden añadirse en cantidades comprendidas entre 0.2% y 1% (p/v). Entre los conservantes adecuados para la utilización con la presente divulgación se incluyen fenol, alcohol bencílico, metacresol, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), cloruro de hexametonio y alquilparabenos, tales como metilparabeno o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol. Los isotonificantes, en ocasiones conocidos como "estabilizantes", pueden añadirse para garantizar la isotonicidad de las composiciones líquidas de la presente divulgación y entre ellos se incluyen alcoholes de azúcares, por ejemplo, alcoholes de azúcar trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizantes se refieren a una amplia categoría de excipientes que pueden comprenderen función desde un agente de carga, a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a evitar la desnaturalización o adherencia a las paredes del recipiente. Los estabilizantes típicos pueden ser alcoholes de azúcar polihídricos (indicados anteriormente); aminoácidos, tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc.; azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol y similares, incluyendo ciclitoles, tales como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato sódico, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato sódico; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, péptidos de 10 residuos o menos); proteínas, tales como albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona y monosacáridos, tales como xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacáridos, tales como lactosa, maltosa y sucrosa; y trisacáridos, tales como rafinosa, y polisacáridos, tales como dextrano. Los estabilizantes pueden encontrarse presentes en el intervalo de entre 0.1 y 10,000 partes en peso por parte en peso de proteína activa.

Pueden añadirse tensioactivos o detergentes no iónicos (asimismo conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger la proteína terapéutica frente a la agregación inducida por agitación, que asimismo permite la exposición de la formulación a tensiones superficiales de cizalla sin causar la desnaturalización de la proteína. Entre los tensioactivos no iónicos adecuados se incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), polioles plurónicos, monoéteres de polioxietilén-sorbitano (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden encontrarse presentes en un intervalo de entre aproximadamente 0.05 mg/ml y aproximadamente 1.0 mg/ml, por ejemplo, de entre aproximadamente 0.07 mg/ml y aproximadamente 0.2 mg/ml.

Entre los excipientes misceláneos adicionales se incluyen agentes de carga (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina o vitamina E) y cosolventes.

Además, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica, en la que dicha composición comprende por lo menos:

i) un anticuerpo anti-hPG y

ii) un inhibidor de punto de control inmunitario,

como productos de combinación para la utilización simultánea, separada o secuencial.

"Utilización simultánea" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la administración de los dos compuestos de la composición en una única e idéntica forma farmacéutica.

"Utilización separada" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la administración, simultáneamente, de los dos compuestos de la composición en formas farmacéuticas diferentes.

"Utilización secuencial" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la administración sucesiva de los dos compuestos de la composición, cada uno en una forma farmacéutica diferente.

Las composiciones de los anticuerpos anti-hPG e inhibidores de puntos de control inmunitario pueden administrarse individualmente, como mezclas de uno o más anticuerpos monoclonales anti-hPG y/o uno o más inhibidores de punto de control inmunitario o combinación con otros agentes útiles para el tratamiento del cáncer, especialmente el CRC, o complementariamente a otras terapias para el cáncer, especialmente el CRC. Se proporcionan posteriormente ejemplos de terapias de combinación y complementarias adecuadas.

Se encuentran comprendidos en la presente divulgación unos kits farmacéuticos que contienen anticuerpos antihPG neutralizantes (incluyendo conjugados de anticuerpos) e inhibidores de punto de control inmunitario indicados en la presente memoria. El kit farmacéutico es un recipiente que comprende un anticuerpo anti-hPG neutralizante y/o un inhibidor de punto de control inmunitario (por ejemplo, en forma liofilizada o en forma de una solución acuosa) y uno o más de los siguientes:

• Un tercer agente terapéutico, por ejemplo, tal como se indica posteriormente;

• Un dispositivo para administrar el anticuerpo anti-hPG neutralizante y/o un inhibidor de punto de control inmunitario, por ejemplo, un lápiz, aguja y/o jeringa, y

• agua o tampón de grado farmacéutico para resuspender el anticuerpo en el caso de que el anticuerpo y/o el inhibidor se encuentren en forma liofilizada.

Cada dosis unitaria del anticuerpo anti-hPG y/o inhibidor de punto de control inmunitario puede envasarse por separado, y un kit puede contener una o más dosis unitarias (por ejemplo, dos dosis unitarias, tres dosis unitarias, cuatro dosis unitarias, cinco dosis unitarias, ocho dosis unitarias, diez dosis unitarias o más). En un aspecto específico, la dosis unitaria o cada una de las dosis unitarias está alojada en una jeringa o lápiz.

Dosis eficaces

Las combinaciones de anticuerpos anti-hPG e inhibidores de punto de control inmunitario se utilizarán generalmente en una cantidad eficaz para conseguir el resultado deseado, por ejemplo, una cantidad eficaz para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesita. Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos antihPG y/o inhibidores de punto de control inmunitario pueden administrarse en pacientes (por ejemplo, sujetos humanos) a dosis terapéuticamente eficaces.

La expresión "dosis terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de compuesto activo o conjugado que induce la respuesta biológica deseada en un sujeto. Dicha respuesta incluye el alivio de los síntomas de la enfermedad o trastorno bajo tratamiento, prevención o inhibición, o el retardo en la recurrencia de un síntoma de la enfermedad, o de la enfermedad misma, un incremento de la longevidad del sujeto en comparación con la ausencia del tratamiento, prevención o inhibición, o el retraso de la progresión del síntoma de la enfermedad, o de la enfermedad misma. Más específicamente, una dosis "terapéuticamente eficaz" tal como se utiliza en la presente memoria es una cantidad que confiere un beneficio terapéutico. Una dosis terapéuticamente eficaz asimismo es una dosis a la que cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales del agente se ven superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. En el contexto de la terapia del CRC, un beneficio terapéutico se refiere a cualquier mejora del cáncer, incluyendo cualquiera de entre, o combinación de, detener o retrasar el avance del cáncer (por ejemplo, de un estadio de cáncer al siguiente), detener o retrasar el agravamiento o deterioro de los síntomas o signos de cáncer, reducir la gravedad del cáncer, inducir la remisión del cáncer, inhibir la proliferación de las células tumorales, el tamaño tumoral o el número de tumores, o reducir los niveles séricos de PG.

La determinación de la cantidad eficaz se encuentra perfectamente dentro de las capacidades del experto en la materia, especialmente a partir de la divulgación detallada proporcionada en la presente memoria. La toxicidad y la eficacia terapéutica de un compuesto o un conjugado pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares y en animales experimentales. La cantidad eficaz de la presente combinación u otros agentes terapéuticos que deben administrarse en el sujeto dependerán del estadio, categoría y estado del mieloma múltiple y las características del sujeto, tales como la salud general, la edad, el sexo, el peso corporal y la tolerancia farmacológica. La cantidad eficaz de la presente combinación u otro agente terapéutico que debe administrarse asimismo dependerá de la vía de administración y la forma de administración. La cantidad y el intervalo de las dosis pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles plasmáticos del compuesto activo que resulten suficientes para mantener los efectos terapéuticos deseados.

La cantidad de la combinación de anticuerpo anti-hPG y de inhibidores de punto de control inmunitario administrada dependerá de una diversidad de factores, incluyendo la naturaleza y el estadio del CRC bajo tratamiento, la forma, vía y sitio de administración, el régimen terapéutico (por ejemplo, si se utiliza o no otro agente terapéutico), la edad y el estado del sujeto particular bajo tratamiento, la sensibilidad del paciente bajo tratamiento frente a los anticuerpos anti-hPG y/o inhibidores de punto de control inmunitario. La dosis apropiada podrá ser fácilmente determinada por el experto en la materia. En última instancia, el médico determinará las dosis apropiadas que deben utilizarse. Dicha dosis puede repetirse con la frecuencia que resulte apropiada. En el caso de que se desarrollen efectos secundarios, puede alterarse o reducirse la cantidad y/o la frecuencia de la dosis, de acuerdo con la práctica clínica normal. La dosis y régimen de tratamiento apropiados pueden establecerse mediante monitorización del progreso de la terapia mediante la utilización de técnicas convencionales conocidas por el experto en la materia.

Las dosis eficaces pueden estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, puede formularse una dosis inicial para la utilización en animales para alcanzar una concentración circulante en sangre o suero de anticuerpo anti-hPG humanizado que es igual o superior a la afinidad de unión del anticuerpo para la progastrina según medición in vitro. De manera similar, puede formularse una dosis inicial para la utilización en animales para conseguir una concentración circulante en sangre o suero de inhibidor de punto de control inmunitario igual o superior a la afinidad de unión del inhibidor para la proteína de punto de control inmunitario correspondiente según medición in vitro. El cálculo de las dosis para conseguir dichas concentraciones circulantes en sangre o suero considerando la biodisponibilidad del anticuerpo particular se encuentra perfectamente dentro de las capacidades del experto en la materia. Para una guía, se remite al lector a Fingl & Woodbury, "General Principles", en: Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, capítulo 1, última edición, Pagamonon Press, y las referencias citadas en el mismo.

Las dosis iniciales pueden estimarse a partir de datos in vivo, tal como modelos animales. Los modelos animales útiles para someter a ensayo la eficacia de los compuestos para tratar el CRC son bien conocidos en la técnica. Además, se describen modelos animales de CRC en los Ejemplos, a continuación. El experto ordinario en la materia puede adaptar rutinariamente dicha información a fin de determinar las dosis adecuadas para la administración humana.

La dosis eficaz de una combinación de anticuerpo anti-hPG e inhibidor de punto de control inmunitario tal como se indica en la presente memoria puede estar comprendida entre aproximadamente 0.001 y aproximadamente 75 mg/kg por cada administración única (por ejemplo, de bolo), múltiples administraciones o la administración continua, o para alcanzar una concentración sérica de entre 0.01 y 5000 pg/ml por cada administración individual (por ejemplo, de bolo), múltiples administraciones o la administración continua, o cualquier intervalo eficaz o valor en el mismo según la condición bajo tratamiento, la vía de administración y la edad, peso y condición del sujeto. En un caso determinado, cada dosis puede estar comprendida entre aproximadamente 0.5 pg y aproximadamente 50 pg por kilogramo de peso corporal, por ejemplo, entre aproximadamente 3 pg y aproximadamente 30 pg por kilogramo de peso corporal.

La cantidad, frecuencia y duración de la administración dependerán de una diversidad de factores, tales como la edad y peso del paciente, y el estado de enfermedad. El régimen terapéutico para la administración puede continuar durante 2 semanas hasta indefinidamente, durante 2 semanas a 6 meses, durante 3 meses a 5 años, durante 6 meses a 1 o 2 años, de 8 meses a 18 meses, o similar. Opcionalmente, el régimen terapéutico proporciona la administración repetida, por ejemplo, una vez al día, dos veces al día, cada dos días, tres días, cinco días, una semana, dos semanas o un mes. La administración repetida puede ser a la misma dosis o a dosis diferentes. La administración puede repetirse una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más veces. La cantidad terapéuticamente eficaz de una combinación de anticuerpo anti-hPG e inhibidor de punto de control inmunitario puede administrarse en forma de una única dosis o durante el curso de un régimen terapéutico, por ejemplo durante el curso de una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, tres meses, seis meses, un año o más tiempo.

Métodos terapéuticos

La capacidad de las presentes combinaciones de anticuerpos anti-hPG e inhibidores de punto de control inmunitario para bloquear las respuestas dependientes de PG, incluyendo la proliferación celular y para mejorar la respuesta a la inmunoterapia, los convierte en útiles para tratar el cáncer. De acuerdo con lo anterior, un aspecto de la presente divulgación se refiere de esta manera a la presente combinación de anticuerpo anti-hPG e inhibidores de punto de control inmunitario a modo de medicamento.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento del cáncer en un paciente que requiere del mismo. Los cánceres que pueden tratarse con la presente combinación son especialmente los cánceres que son dependientes de la progastrina para el crecimiento y/o la proliferación. Preferentemente, el cáncer dependiente de la progastrina es el cáncer colorrectal (CRC). Generalmente, los métodos comprenden administrar en el paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la combinación de anticuerpo anti-hPG e inhibidor de punto de control inmunitario indicada en la presente memoria. La presente divulgación proporciona además la combinación de anticuerpo anti-hPG e inhibidor de punto de control inmunitario indicada en la presente memoria para la utilización en el tratamiento del CRC.

Un "sujeto" o "paciente" en el que se administra la presente combinación de anticuerpo anti-hPG e inhibidor de punto de control inmunitario es preferentemente un mamífero, tal como un no primate (por ejemplo, vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata, etc.) o un primate (por ejemplo, mono o ser humano). El sujeto o paciente puede ser un ser humano, tal como un paciente adulto o un paciente pediátrico.

Los pacientes adecuados para la terapia de combinación de anticuerpo anti-hPG/inhibidor de punto de control inmunitario son pacientes en los que se ha diagnosticado CRC. El CRC puede ser de cualquier tipo y encontrarse en cualquier estadio clínico o manifestación. Entre los sujetos adecuados se incluyen pacientes con tumores de CRC (operables o no), pacientes cuyos tumores han sido extirpados o resecados quirúrgicamente, pacientes con un tumor de CRC que comprende células portadoras de una mutación en un oncogén, tales como, por ejemplo, RAS o APC, pacientes que han recibido o que reciben otra terapia para CRC en combinación con, o complementaria a, terapia de anticuerpos anti-hPG humanizados. Entre otras terapias para el CRC se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, el tratamiento quimioterápico, la terapia de radiación, la resección quirúrgica y el tratamiento con otro u otros anticuerpos terapéuticos, tal como se detalla a continuación.

Asimismo pueden administrarse combinaciones de anticuerpos anti-hPG e inhibidores de punto de control inmunitario tal como se da a conocer en la presente memoria, en una composición en el sujeto que requiere la prevención de cáncer colorrectal metastásico, en una cantidad terapéuticamente eficaz. Entre dichos sujetos se incluyen, aunque sin limitación, los que se ha determinado que presentan cáncer colorrectal primario, aunque no se conoce que el cáncer se haya extendido a tejidos u órganos distantes. En determinados casos de dichos métodos, los anticuerpos anti-hPG son anticuerpos anti-hPG humanizados.

Las combinaciones de anticuerpos anti-hPG e inhibidores de punto de control inmunitario tal como se da a conocer en la presente memoria asimismo pueden administrarse en una composición en el sujeto que requiere de prevención de la recurrencia de cáncer colorrectal metastásico en una cantidad terapéuticamente eficaz. Entre dichos sujetos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los tratados anteriormente para cáncer colorrectal primario o metastásico, en los que dicho cáncer aparentemente ha desaparecido después del tratamiento. En determinados casos de dichos métodos, los anticuerpos anti-hPG son anticuerpos anti-hPG humanizados.

Las combinaciones de anticuerpos anti-hPG e inhibidores de punto de control inmunitario tal como se da a conocer en la presente memoria asimismo pueden administrarse en una composición en el sujeto que requiere de inhibición del crecimiento de células madre de cáncer colorrectal en una cantidad terapéuticamente eficaz. Entre dichos sujetos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los que presentan un cáncer colorrectal cuyo crecimiento o metástasis es atribuible por lo menos parcialmente a la presencia en su interior de células madre de cáncer. Los métodos de prevención o inhibición del crecimiento de las células madre de cáncer colorrectal mediante la puesta en contacto de dichas células madre con una cantidad de una composición de anticuerpo anti-hPG/inhibidor de punto de control inmunitario eficaz para prevenir o inhibir el crecimiento de dichas células, asimismo se proporcionan en la presente memoria. Dichos métodos pueden llevarse a cabo in vitro o in vivo. En determinados casos de dichos métodos, los anticuerpos anti-hPG son anticuerpos anti-hPG humanizados.

La terapia de combinación de anticuerpo anti-hPG/inhibidor de punto de control inmunitario puede combinarse o complementarse con otro u otros tratamientos. Entre otros tratamientos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el tratamiento quimioterápico, la terapia de radiación, la resección quirúrgica y la terapia de anticuerpos, tal como se indica en la presente memoria.

La terapia de combinación de anticuerpo anti-hPG/inhibidor de punto de control inmunitario puede ser complementaria a otro tratamiento, incluyendo la resección quirúrgica.

La terapia de combinación proporcionada en la presente memoria implica la administración de por lo menos dos agentes en un paciente, el primero de los cuales es una combinación de anticuerpo anti-hPG/inhibidor de punto de control inmunitario de la divulgación, y el segundo de los cuales es otro agente terapéutico. De acuerdo con lo anterior, en la presente memoria se proporciona además la combinación de anticuerpo anti-hPG/inhibidor de punto de control inmunitario indicado anteriormente, para el tratamiento del CRC, en el que dicha combinación se administra con dicho otro agente terapéutico. La combinación de anticuerpo anti-hPG/inhibidor de punto de control inmunitario y el otro agente terapéutico pueden administrarse simultáneamente, sucesivamente o por separado.

Un "agente terapéutico" comprende agentes biológicos, tales como un anticuerpo, un péptido, una proteína, un enzima y agentes quimioterápicos. El agente terapéutico comprende además inmunoconjugados de agentes de unión celular (AUC) y compuestos químicos, tales como conjugados de anticuerpo-fármaco (CAA). El fármaco en los conjugados puede ser un agente citotóxico, tal como uno indicado en la presente memoria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la combinación de anticuerpo anti-hPG/inhibidor de punto de control inmunitario y el otro agente terapéutico se afirma que se administran sucesivamente en el caso de que se administren en el paciente el mismo día, por ejemplo, durante la misma visita del paciente. La administración sucesiva puede realizarse con una separación de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas. En contraste, la combinación de la divulgación y el otro agente terapéutico se afirma que se administra por separado en el caso de que se administre en el paciente en días diferentes, por ejemplo, la combinación de la divulgación y el otro agente terapéutico pueden administrarse a intervalos de 1 día, 2 días, 3 días, una semana, 2 semanas o mensualmente. En los métodos de la presente divulgación, la administración de la combinación de la divulgación puede preceder o seguir a la administración del otro agente terapéutico.

A título de ejemplo no limitativo, la combinación de la invención y el otro agente terapéutico puede administrarse concurrentemente durante un periodo de tiempo, seguido de un segundo periodo de tiempo en el que se alterna la administración del anticuerpo anti-hPG humanizado de la divulgación y del otro agente terapéutico.

Las terapias de combinación de la presente divulgación pueden resultar en un efecto más que aditivo, o sinérgico, que proporciona beneficios terapéuticos en el caso de que ni la combinación de anticuerpo anti-hPG/inhibidor de punto de control inmunitario ni el otro agente terapéutico se administre en una cantidad que, por sí sola, sea terapéuticamente eficaz. De esta manera, dichos agentes pueden administrarse en cantidades inferiores, reduciendo la posibilidad y/o gravedad de los efectos adversos.

Preferentemente, el otro agente terapéutico es un agente quimioterápico. Un "agente quimioterápico", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una sustancia que, administrada en el sujeto, trata o previene el desarrollo de cáncer en el cuerpo del sujeto.

Entre los agentes quimioterápicos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, inhibidores mitóticos, inhibidores de la función de la cromatina, agentes antiangiogénesis, antiestrógenos, antiandrógenos o inmunomoduladores.

"Agente alquilante" se refiere a cualquier sustancia que pueda reticular o alquilar cualquier molécula, preferentemente ácido nucleico (por ejemplo, ADN) dentro de una célula. Entre los ejemplos de agentes alquilantes se incluyen mostaza nitrogenada, tal como mecloretamina, clorambucol, melfalán, clorhidrato, pipobromén, prednimustina, fosfato disódico o estramustina; oxaforinas, tales como ciclofosfamida, altretamina, trofosfamida, sulfofosfamida o ifosfamida; aziridinas o imina-etilenos, tales como tiotepa, trietilenamia o altetramina; nitrosoureas, tales como carmustina, estreptozocina, fotemustina o lomustina; sulfonatos de alquilo, tales como busulfán, treosulfán o improsulfán; triazenos, tales como dacarbazina; o complejos de platino, tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino.

"Antimetabolitos" se refiere a sustancias que bloquean el crecimiento y/o metabolismo celular mediante la interferencia con determinadas actividades, habitualmente la síntesis del ADN. Entre los ejemplos de antimetabolitos se incluyen metotrexato, 5-fluorouracilo, floxuridina, 5-fluorodesoxiuridina, capecitabina, citarabina, fludarabina, arabinósido de citosina, 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), clorodesoxiadenosina, 5-azacitidina, gemcitabina, cladribina, desoxicoformicina y pentostatina.

"Antibióticos antitumorales" se refiere a compuestos que pueden bloquear o inhibir la síntesis de ADN, ARN y/o proteínas. Entre los ejemplos antitumorales se incluyen doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, valrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, mitramicina, plicamicina, mitomicina C, bleomicina y procarbazina.

Los "inhibidores mitóticos" evitan el avance normal del ciclo celular y la mitosis. En general, los inhibidores de los microtúbulos o taxoides, tales como el paclitaxel y el docetaxel, son capaces de inhibir la mitosis. Los alcaloides vinca, tales como la vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina, asimismo son capaces de inhibir la mitosis.

Los "inhibidores de la función de la cromatina" o "inhibidores de topoisomerasa" se refieren a sustancias que inhiben el funcionamiento normal de las proteínas modeladoras de la cromatina, tales como la topoisomerasa I o la topoisomerasa II. Entre los ejemplos de inhibidores de la función de la cromatina se incluyen, para la topoisomerasa I, la camptotecina y sus derivados, tales como el topotecán o el irinotecán, y para la topoisomerasa II, el etopósido, el fosfato de etopósido y el tenipósido.

"Agente antiangiogénesis" se refiere a cualquier fármaco, compuesto, sustancia o agente que inhiba el crecimiento de los vasos sanguíneos. Entre los agentes antiangiogénesis ejemplificativos se incluyen, aunque en modo alguno de modo limitativo, razoxina, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS-27023A, halofuginon, COL-3, neovastat, BMS-275291, talidomida, CDC 501, DMXAA, L-651582, escualamina, endostatina, SU5416, SU6668, interferón-alfa, EMD121974, interleucina-12, IM862, angiostatina y vitaxina.

"Antiestrógeno" o "agente antiestrogénico" se refiere a cualquier sustancia que reduce, antagoniza o inhibe la acción del estrógeno. Son ejemplos de agentes antiestrógeno, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, yodoxifeno, anatrozol, letrozol y exemestano.

"Antiandrógenos" o "agentes antiandrógeno" se refiere a cualquier sustancia que reduce, antagoniza o inhibe la acción de un andrógeno. Son ejemplos de antiandrógenos, flutamida, nilutamida, bicalutamida, espironolactona, acetato de ciproterona, finasterida y cimitidina.

Los "inmunomoduladores" son sustancias que estimulan el sistema inmunitario.

Entre los ejemplos de inmunomoduladores se incluyen interferón, interleucinas, tales como aldesleucina, OCT-43, denileuqina diflitox e interleucina-2; factores de necrosis tumoral, tales como tasonermina u otros inmunomoduladores, tales como lentinano, sizofirano, roquinimex, pidotimod, pegademasa, timopentina, poli I:C o levamisol junto con 5-fluorouracilo.

Para más información, el experto en la materia puede hacer referencia al manual editado por la "Association Frangaise des Enseignants de Chimie Thérapeutique" and entitled "Traité de chimie thérapeutique", vol. 6, Médicaments antitumouraux et perspectives dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003.

Asimismo, pueden mencionarse como agentes químicos o agentes citotóxicos, todos los inhibidores de cinasa, tales como, por ejemplo, gefitinib o erlotinib.

Más generalmente, entre los ejemplos de agentes quimioterápicos adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, 1-deshidrotestosterona, 5-fluorouracildecarbazina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, actinomicina D, adriamicina, aldesleucina, agentes alquilantes, alopurinol sodio, altretamina, amifostina, anastrozol, antramicina (AMC)), agentes antimitóticos, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), diamino dicloro platino, antraciclinas, antibióticos, antimetabolitos, asparaginasa, BCG viva (intravesical), betametasona fosfato sódico y acetato de betametasona, bicalutamida, sulfato de bleomicina, busulfán, leucouorina calcio, caliqueamicina, capecitabina, carboplatino, lomustina (CCNU), carmustina (BSNU), clorambucilo, cisplatino, cladribina, colchicina, estrógenos conjugados, ciclofosfamida, ciclotosfamida, citarabina, citarabina, citocalasina B, citoxano, dacarbazina, dactinomicina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), HCl de daunorrubicina, citrato de daunorucbicina, denileucina diftitox, dexrazoxano, dibromomanitol, dihidroxiantracina diona, docetaxel, mesilato de dolasetrón, HCl de doxorrubicina, dronabinol, L-asparaginasa de E. coli, emetina, epoetina-a, L-asparaginasa de Erwinia, estrógenos esterificados, estradiol, estramustina fosfato sódico, bromuro de etidio, etinilestradiol, etidronato, etopósido factor citrororum, fosfato de etopósido, filgrastim, floxuridina, fluconazol, fosfato de fludarabina, fluorouracilo, flutamida, ácido folínico, HCl de gemcitabina, glucocorticoides, acetato de goserelina, gramicidina D, HCl de granisetrón, hidroxiurea, HCl de idarrubicina, ifosfamida, interferón a-2b, HCl de irinotecán, letrozol, leucovorina calcio, acetato de leuprólido, HCl de levamisol, lidocaína, lomustina, maitansinoide, HCl de mecloretamina, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, HCl de melfalán, mercaptipurina, mesna, metotrexato, metiltestosterona, mitramicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, acetato de octreótida, HCl de ondansetrón, oxaliplatino, paclitaxel, pamidronato disódico, pentostatina, HCl de pilocarpina, plimicina, polifeprosán 20 con implante de carmustina, porfímero sodio, procaína, HCl de procarbazina, propranolol, rituximab, sargramostim, estreptozotocina, tamoxifeno, taxol, tegafur, tenipósido, tenopósido, testolactona, tetracaína, tiotepa, clorambucilo, tioguanina, tiotepa, HCl de topotecán, citrato de toremifeno, trastuzumab, tretinoína, valrubicina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina y tartrato de vinorelbina.

Las combinaciones de anticuerpo anti-hPG/inhibidor de punto de control inmunitario dadas a conocer en la presente memoria pueden administrarse en un paciente que requiere de tratamiento para cáncer colorrectal que recibe una combinación de agentes quimioterápicos. Entre las combinaciones ejemplificativas de agentes quimioterápicos se incluyen 5-fluorouracilo (5-FU) en combinación con leucovorina (ácido folínico o LV); capecitabina, en combinación con uracilo (UFT) y leucovorina; tegafur en combinación con uracilo (UFT) y leucovorina; oxaliplatino en combinación con 5-FU, o en combinación con capecitabina; irinotecán en combinación con capecitabina; mitomicina C en combinación con 5-FU, irinotecán o capecitabina. La utilización de otras combinaciones de agentes quimioterápicos dados a conocer en la presente memoria asimismo resulta posible.

Tal como es conocido en la técnica relevante, los regímenes quimioterápicos para el cáncer colorrectal con combinaciones de diferentes agentes quimioterápicos se han estandarizado en ensayos clínicos. Dichos regímenes con frecuencia se conocen por sus acrónimos, y entre ellos se incluyen 5FU Mayo, 5FU Roswell Park, LVFU2, FOLFOX, FOLFOX4, FOLFOX6, bFOL, FUFOX, FOLFIRI, IFL, XELOX, CAPOX, XELIRI, CAPIRI o FOLFOXIRI. Ver, por ejemplo, Chau, I., et al., 2009, Br. J. Cancer 100:1704-19 y Field, K., et al., 2007, World J. Gastroenterol. 13:3806-15, ambos incorporados como referencia.

Las combinaciones de anticuerpo anti-hPG/inhibidor de comprobación inmunitaria asimismo pueden combinarse con otros anticuerpos terapéuticos. De acuerdo con lo anterior, la terapia de combinación de anticuerpo antihPG/inhibidor de comprobación inmunitaria puede combinarse con, o administrarse complementariamente con un anticuerpo monoclonal diferente, tal como, por ejemplo, aunque de modo no limitativo, un anticuerpo monoclonal anti-EGFR (receptor de EGF) o un anticuerpo monoclonal anti-VEGF. Entre los ejemplos específicos de anticuepros anti-EGFR se incluyen cetuximab y panitumumab. Un ejemplo específico de un anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab.

En particular, de esta manera se proporciona en la presente memoria la combinación de anticuerpo antihPG/inhibidor de punto de control inmunitario indicado anteriormente, para el tratamiento del CRC, en el que dicha combinación se administra con un agente quimioterápico. La combinación de anticuerpo anti-hPG/inhibidor de punto de control inmunitario y el agente quimioterápico pueden administrarse simultáneamente, sucesivamente o por separado.

Leyendas de figura

Figura 1: en ratones BALB/cAnNRj se implantó la estirpe celular de carcinoma colorrectal CT26.WT y se trataron con un anticuerpo de control, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PG o una combinación de un anticuerpo anti-PD-1 y un anticuerpo anti-PG. (A) Gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier, (B) mediana de tiempo de supervivencia (en días).

Figura 2: análisis de qPCR de la expresión de IFN^y en ratones BALB/cAnNRj xenoinjertados con una estirpe celular de carcinoma colorrectal CT26.WT y se trataron con un anticuerpo de control, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PG o una combinación de un anticuerpo anti-PD-1 y un anticuerpo anti-PG.

Ejemplos

Ejemplo 1

En ratones BALB/cAnNRj se implantaron en un flanco por vía subcutánea 0.5 M de células CT26.WT (ATCC n° CRL-2638) en cada ratón el día 1. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a grupos de tratamiento individual (n=15 ratones en cada grupo) tal como se indica:

Grupo de control: 15 ratones inyectados con NaCl (5 ml/kg) IgG2a de rata (10 mg/kg - 5 ml/kg) por vía intraperitoneal, dos veces a la semana.

Grupo anti-PG: 15 ratones inyectados con NaCl (5 ml/kg) anti-PG (30 mg/kg - 5 ml/kg) por vía intraperitoneal, dos veces a la semana.

Grupo anti-PD-1: 15 ratones inyectados con NaCl (5 ml/kg) anti-PD-1 (10 mg/kg - 5 ml/kg) por vía intraperitoneal, dos veces a la semana.

Grupo 4 anti-PG anti-PD1: 15 ratones inyectados con anti-PG (30 mg/kg - 5 ml/kg) anti-PD-1 (10 mg/kg - 5 ml/kg) por vía intraperitoneal, dos veces a la semana.

El anticuerpo anti-PG era mAb8, cuyas CDR, Vh y Vl se indican en la tabla 5.

El anticuerpo anti-PD-1 es el anticuerpo monoclonal 29F.1A12 (obtenido de BioXCell, 10 Technology Dr, Suite 2B West Lebanon, NH 03784, EE. UU.).

Los animales fueron observados y pesados dos veces a la semana, al mismo tiempo que se medían los volúmenes tumorales utilizando un calibrador digital. Se calculó el tamaño tumoral utilizando la fórmula a continuación: V = longitud x anchura2 / 2, en la que la longitud representa el diámetro tumoral más grande y la anchura representa el diámetro tumoral perpendicular. Los animales fueron sacrificados al final del estudio o una vez los tumores habían alcanzado un volumen de 1500 mm3, en el caso de que se observase ulceración tumoral, en el caso de que la pérdida de peso corporal excediese el 20% o en el caso de que se observase un deterioro significativo de la salud del ratón. Se llevó a cabo la eutanasia mediante dislocación cervical tras la anestesia gaseosa (isoflurano).

La figura 1 muestra la supervivencia de Kaplan-Meier para cada grupo. La prueba de rangos logarítmicos (prueba de Mantel-Cox) muestra el incremento estadístico de la supervivencia entre el grupo de combinación (anti-PG anti-PD-1) y el tratamiento individual (anti-PG o anti-PD-1) con un incremento de la mediana de supervivencia de 15 a 20 días (+33%, p<0.0001), confirmando la actividad superior de la combinación en comparación con cada una de las monoterapias.

Ejemplo 2

En ratones BALB/cAnNRj se implantaron en un flanco por vía subcutánea 0.5 M de células CT26.WT (ATCC n° CRL-2638) en cada ratón el día 1. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a grupos de tratamiento individual (n=15 ratones en cada grupo) tal como se indica:

Grupo de control: 15 ratones inyectados con NaCl (5 ml/kg) IgG2a de rata (10 mg/kg - 5 ml/kg) por vía intraperitoneal, dos veces a la semana.

Grupo anti-PG: 15 ratones inyectados con NaCl (5 ml/kg) anti-PG (30 mg/kg - 5 ml/kg) por vía intraperitoneal, dos veces a la semana.

Grupo anti-PD-1: 15 ratones inyectados con NaCl (5 ml/kg) anti-PD-1 (10 mg/kg - 5 ml/kg) por vía intraperitoneal, dos veces a la semana.

Grupo 4 anti-PG anti-PD1: 15 ratones inyectados con anti-PG (30 mg/kg - 5 ml/kg) anti-PD-1 (10 mg/kg - 5 ml/kg) por vía intraperitoneal, dos veces a la semana.

Una semana después del inicio del tratamiento, se sacrificaron 4 ratones de cada grupo y se recuperó el tumor para extraer el ARN y llevar a cabo una qPCR para medir la expresión del interferón-gamma (IFNy). En efecto, varias publicaciones han demostrado que los inhibidores de CTLA-4 y de PD-1, así como otras terapias de bloqueo de puntos de control inmunitario, resultan en un incremento de la producción de IFN^y. La figura 2 muestra que el anticuerpo anti-PD-1 induce la producción de IFN^y en el presente modelo murino, tal como se esperaba (factor de incremento de 3.2). Resulta más interesante la observación de un mayor incremento de la producción de IFN^y con la terapia de combinación de anticuerpos anti-PG anti-PD-1 (factor de incremento de 6), confirmando la actividad superior de la combinación en comparación con cada una de las monoterapias.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Combinación que comprende un anticuerpo monoclonal antiprogastrina (anti-hPG) y un inhibidor de punto de control inmunitario, en la que dicho anticuerpo anti-hPG comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 28, 29 y 30, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 31, 32 y 33, respectivamente, y en la que dicho inhibidor de punto de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD1.

2. Combinación según la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo anti-hPG se selecciona de entre anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos camelizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos IgA1, anticuerpos IgA2, anticuerpos IgD, anticuerpos IgE, anticuerpos IgG1, anticuerpos IgG2, anticuerpos IgG3, anticuerpos IgG4 y anticuerpos IgM.

3. Combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que dicho anticuerpo anti-hPG es un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 49 y una cadena ligera de la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 50.

4. Combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que dicho anticuerpo anti-hPG es un anticuerpo humanizado.

5. Combinación según la reivindicación 4, en la que dicho anticuerpo anti-hPG es un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n° 69 y 71, y una región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n° 70 y 72, en la que dicho anticuerpo comprende asimismo las regiones constantes de la cadena ligera y la cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano.

6. Combinación según la reivindicación 4 o 5, en la que dicho anticuerpo anti-hPG comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 71 y una región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 72, comprendiendo asimismo dicho anticuerpo las regiones constantes de la cadena ligera y la cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano.

7. Combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que dicho anticuerpo anti-hPG comprende una cadena pesada de la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 73 y una cadena ligera de la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 74.

8. Combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho anticuerpo anti-PD1 es pembrolizumab, nivolumab, cemiplimab o pidilizumab.

9. Combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la utilización como un medicamento.

10. Combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la utilización en el tratamiento del cáncer colorrectal.

11. Composición farmacéutica que comprende la combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un excipiente.

12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, para la utilización simultánea, separada o secuencial.