TWI537002B - 前胃泌激素之單株抗體及其用途 - Google Patents

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Description

前胃泌激素之單株抗體及其用途
本發明尤其關於前胃泌激素之單株抗體、產生該等抗體之組合物及方法，以及使用該等抗體例如診斷及/或治療結腸直腸癌之方法。
本申請案依據35 U.S.C.§ 119(e)主張2009年10月16日申請之臨時申請案第61/252,625號之權益，此臨時申請案之所有內容均以全文引用之方式併入本文中。
關於政府資助研究之聲明
無。
共同研究協議團體
無。
結腸直腸癌(CRC)為一種嚴重的公眾健康問題，每年超過1,000,000人患上此病且每年超過500,000人死於此病。CRC為由癌症所致死亡之第二大原因。僅在美國，2009年報導新增約147,000個病例且超過49,900例死於CRC。CRC存在三種形式：偶發性CRC；遺傳性非息肉病性結腸癌(HNPCC)，其係由DNA錯配修復基因出現生殖系突變所致；及家族性腺瘤性息肉病(FAP)，其係由APC基因出現生殖系突變所致。偶發性CRC佔近85%例，而HNPCC佔約5%且FAP佔約1%(Heyer等人，1999,Oncogene 18:5325-5333)。
對CRC之臨床處理通常包含手術切除腫瘤，常常伴有化學療法。目前，約50% CRC患者在診斷後5年內死亡。缺乏可靠篩檢測試且現有療法無效為造成高死亡率之主要原因。急切需要用於診斷CRC之新臨床方法，以及有效針對結腸直腸癌腫瘤，但對其他健康組織的不利影響最小之治療。
本申請案提供適用於診斷及/或治療動物(包括人類)之結腸直腸癌(CRC)的組合物及方法。本申請案中所述之各個發明在某種程度上係基於申請者發現如下單株抗體，該等單株抗體特異性結合一種由CRC腫瘤細胞產生之多肽前胃泌激素(PG)(例如人類前胃泌激素(hPG))且在活體外CRC模型中展現抗增殖特性。
前胃泌激素由CRC細胞產生，且認為其藉由引發阻斷細胞正常分化過程(包括導致細胞死亡之過程)之信號轉導路徑來刺激CRC細胞增殖。編碼前胃泌激素之胃泌激素基因轉錄物缺失會在活體外及活體內CRC模型中誘導腫瘤細胞之細胞分化及漸進式細胞死亡，減少腫瘤細胞增殖。雖然不欲受任何操作理論限制，但認為抗hPG抗體結合前胃泌激素，阻斷前胃泌激素與其信號傳導搭配物相互作用之能力。繼而抑制結腸直腸腫瘤細胞中另外引起增殖之信號轉導路徑。
因此，在一態樣中，本發明提供特異性結合PG(例如hPG)，但不結合胃泌激素基因之其他產物的單株抗體。參見圖1，胃泌激素基因轉譯成具有101個胺基酸之多肽，稱作前胃泌激素原，其含有信號序列(加下劃線)，該信號序列裂解，產生一種具有80個胺基酸之多肽，即前胃泌激素。前胃泌激素又裂解產生跨越前胃泌激素之殘基38至71之具有34個胺基酸的產物，此產物在羧基端經甘胺酸延伸，產生甘胺酸-G34(「G34-gly」)。此裂解之一個副產物為具有5個胺基酸之肽，即C端側接肽或CTFP，其跨越前胃泌激素之殘基75至80。G34-gly接著進一步裂解產生跨越前胃泌激素之殘基55至71之具有17個殘基的多肽，稱作G17-gly。移除末端甘胺酸且C端進行醯胺化，產生G34及G17，兩者皆進行醯胺化。因此，雖然前胃泌激素之最前面37個殘基為其所獨有，但殘基38至80亦存在於源自胃泌激素基因之其他肽產物中。
申請者已發現，雖然抗PG單株抗體可使用熟習此項技術者已知之方法產生，但抗原選擇亦為重要的。並非所有源自hPG之抗原皆可刺激在生理條件下特異性結合hPG之單株抗體產生。如下所述，多種用於產生hPG多株抗體之抗原，諸如全長重組人類前胃泌激素(參見例如Singh WO 08/076454)及對應於hPG C端之最後10個胺基酸之肽(參見例如Hollande WO 07/135542)，均無法產生抗hPG單株抗體。然而，申請者已發現hPG序列內可用於產生特異性結合hPG之單株抗體的抗原性N端及C端序列。極為意外地，申請者已發現，抗原不必僅限於前胃泌激素所獨有之前胃泌激素伸展段。具有與胃泌激素基因之其他產物(例如G17、G34及CTFP)重疊之序列的肽抗原可產生特異性結合hPG之單株抗體。
申請者亦已發現，特異性結合hPG之單株抗體可使用源自hPG分子之不同區域的抗原產生。使用序列對應於hPG之N端區域的肽抗原獲得之單株抗PG抗體在本文中稱作「N端抗hPG單株抗體」。可用於構築體及免疫原以獲得N端抗PG單株抗體之特定例示性抗原性區域對應於hPG之殘基1至14：SWKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO:25)。適用於獲得N端抗PG單株抗體之包括此抗原之例示性免疫原描述於表1A及實例部分中。
使用序列對應於hPG之C端區域的肽抗原獲得之單株抗PG抗體在本文中稱作「C端抗hPG單株抗體」。可用於構築體及免疫原以獲得C端抗PG單株抗體之特定例示性抗原性區域對應於hPG之殘基55至80：QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN(SEQ ID NO:27)。適用於獲得C端抗PG單株抗體之包括此抗原之例示性免疫原描述於表1B及實例部分中。
對於一些用途，需要抗hPG單株抗體對hPG具有高親和力。對於某些用途，諸如治療用途，需要至少約100 nM之親和力。對於需要特定親和力之應用，抗hPG單株抗體以至少約100 nM或甚至更高，例如至少約90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或更大之親和力特異性結合hPG。抗hPG單株抗體之親和力可使用此項技術中熟知或本文所述之技術，諸如ELISA、等溫滴定熱量測定(ITC)、BIAcore或螢光偏振檢定來測定。
hPG為相對小之多肽，長度僅為80個胺基酸。預期任何以相對高之親和力(例如在至少10-9 M或1 nM之範圍內)特異性結合hPG之單株抗體可阻斷PG與其信號傳導搭配物相互作用的能力且抑制CRC細胞增殖。然而，申請者發現並非所有抗PG單株抗體皆具有中和性。實際上，如實例部分中更詳細地論述，申請者發現一些抗PG單株抗體儘管展現高特異性及高親和力，但其並不中和PG。舉例而言，抗hPG MAb 14以約6 pM之KD結合hPG，但其在活體外不抑制CRC細胞生長，如下文實例部分中所詳述。特異性結合hPG之非中和性單株抗體適用於達成診斷目的，而中和PG之抗hPG單株抗體尤其適於治療CRC之治療應用。
如本文所述，「中和性抗hPG單株抗體」為與經非特異性單株抗體處理之對照樣品相比，使經抗hPG單株抗體處理之測試樣品中活CRC細胞數目出現統計顯著性降低的抗hPG單株抗體。評定任何特定抗hPG單株抗體中和hPG之能力的特定檢定描述於下文[實施方式]中。在此檢定中使活細胞數目降低至少約50%之抗hPG單株抗體咸信尤其適用於治療CRC，不過展現較低程度中和活性，例如在此檢定中使活細胞數目出現40%、30%、20%、15%或甚至10%統計顯著性降低之抗hPG單株抗體預期亦提供治療效益。
因此，在一些實施例中，抗PG單株抗體為中和性抗PG單株抗體。發現抗PG單株抗體中和PG之能力不依賴於抗原決定基。如實例部分中所例示，N端及C端抗PG抗體皆具有中和活性。
本發明之抗體可識別hPG之不同抗原決定基。抗原決定基定位顯示，N端抗PG單株抗體不皆結合同一抗原決定基，即使針對同一免疫原產生時。C端抗hPG單株抗體亦如此。如經由丙胺酸掃描及SPOT技術所鑑別，例示性N端及C端抗hPG單株抗體所結合之抗原決定基提供於實例部分表8及9中。在一些實施例中，抗hPG單株抗體結合胺基酸序列對應於hPG之N端部分的抗原決定基。在特定實施例中，抗hPG單株抗體結合包括hPG之殘基10至14(SEQ ID NO:28)、hPG之殘基9至14(SEQ ID NO:29)、hPG之殘基4至10(SEQ ID NO:30)、hPG之殘基2至10(SEQ ID NO:31)或hPG之殘基2至14(SEQ ID NO:32)之抗原決定基。在一些實施例中，抗hPG單株抗體結合胺基酸序列對應於hPG之C端區域之一部分的抗原決定基。在特定實施例中，抗hPG單株抗體結合包括hPG之殘基71至74(SEQ ID NO:33)、hPG之殘基69至73(SEQ ID NO:34)、hPG之殘基76至80(SEQ ID NO:35)或hPG之殘基67至74(SEQ ID NO:36)之抗原決定基。結合大致相同之抗原決定基之抗hPG單株抗體的CDR預期可互換以產生新的抗hPG單株抗體。
已鑑別若干對hPG具有高特異性及親和力且抗腫瘤活性優良之抗hPG單株抗體，且在一些情況下，已確定其互補決定區(CDR)及可變重(VH)鏈及可變輕(VL)鏈之序列。涵蓋包含本文所揭示之輕鏈及重鏈CDR 1、CDR 2及CDR 3序列的抗hPG單株抗體。特異性鼠類抗hPG單株抗體之CDR及可變重(VH)鏈及可變輕(VL)鏈序列以及所建議之人類化序列提供於本文中表1A及B、圖2及實例10中。
在一些實施例中，針對hPG之N端部分產生之抗hPG單株抗體具有三個可變輕鏈CDR及三個可變重鏈CDR，分別稱作CDR 1、CDR 2或CDR 3，隨後為例示性抗hPG單株抗體之編號(亦即MAb 3、4、16、19)，其中VL CDR1係選自QSIVHSNGNTY(「VL CDR 1.3」；SEQ ID NO:4)、QSLVHSSGVTY(「VL CDR 1.4」；SEQ ID NO:10)、QSLLDSDGKTY(「VL CDR 1.16」；SEQ ID NO:50)及SQHRTYT(「VL CDR 1.19」；SEQ ID NO:51)；VL CDR2係選自KVS(「VL CDR 2.3」及「VL CDR 2.4」；SEQ ID NO:5)、LVS(「VL CDR 2.16」；SEQ ID NO:53)及VKKDGSH(「VL CDR 2.19」；SEQ ID NO:54)；VL CDR3係選自FQGSHVPFT(「VL CDR 3.3」；SEQ ID NO:6)、SQSTHVPPT(「VL CDR 3.4」；SEQ ID NO:11)、WQGTHSPYT(「VL CDR 3.16」；SEQ ID NO:57)及GVGDAIKGQSVFV(「VL CDR 3.19」；SEQ ID NO:58)；VH CDR1係選自GYIFTSYW(「VH CDR 1.3」；SEQ ID NO:1)、GYTFSSSW(「VH CDR 1.4」；SEQ ID NO:7)、GYTFTSYY(「VH CDR 1.16」；SEQ ID NO:39)及GYSITSDYA(「VH CDR 1.19」；SEQ ID NO:40)；VH CDR2係選自FYPGNSDS(「VH CDR 2.3」；SEQ ID NO:2)、FLPGSGST(「VH CDR 2.4」；SEQ ID NO:8)、INPSNGGT(「VH CDR 2.16」；SEQ ID NO:43)及ISFSGYT(「VH CDR 2.19」；SEQ ID NO:44)；且VH CDR3係選自TRRDSPQY(「VH CDR 3.3」；SEQ ID NO:3)、ATDGNYDWFAY(「VH CDR 3.4」；SEQ ID NO:9)、TRGGYYPFDY(「VH CDR 3.16」；SEQ ID NO:47)及AREVNYGDSYHFDY(「VH CDR 3.19」；SEQ ID NO:48)。
在一些實施例中，針對hPG之C端部分產生之抗hPG單株抗體具有三個可變輕鏈CDR及三個可變重鏈CDR，分別稱作CDR 1、CDR 2或CDR 3，隨後為例示性抗hPG單株抗體之編號(亦即MAb 8或13)，其中VL CDR1係選自KSLRHTKGITF(「VL CDR 1.8」；SEQ ID NO:49)及QSLLDSDGKTY(「VL CDR 1.13」；SEQ ID NO:50)；VL CDR2係選自QMS(「VL CDR 2.8」；SEQ ID NO:52)及LVS(「VL CDR 2.16」；SEQ ID NO:53)；VL CDR3係選自AQNLELPLT(「VL CDR 3.8」；SEQ ID NO:55)及WQGTHFPQT(「VL CDR 3.13」；SEQ ID NO:56)；VH CDR1係選自GFTFTTYA(「VH CDR 1.8」；SEQ ID NO:37)及GFIFSSYG(「VH CDR 1.13」；SEQ ID NO:38)；VH CDR2係選自ISSGGTYT(「VH CDR 2.8」；SEQ ID NO:41)及INTFGDRT(「VH CDR 2.13」；SEQ ID NO:42)；且VH CDR3係選自ATQGNYSLDF(「VH CDR 3.8」；SEQ ID NO:45)及ARGTGTY(「VH CDR 3.13」；SEQ ID NO:46)。
在一些實施例中，N端抗hPG單株抗體之可變輕鏈(VL)CDR對應於可自融合瘤43B9G11(產生抗hPG MAb 1)、WE5H2G7(產生抗hPG MAb 2)、6B5B11C10(產生抗hPG MAb 3)、20D2C3G2(產生抗hPG MAb 4)、1E9A4A4(產生抗hPG MAb 15)、1E9D9B6(產生抗hPG MAb 16)、1C8D10F5(產生抗hPG MAb 17)、1A7C3F11(產生抗hPG MAb 18)、1B3B4F11(產生抗hPG MAb 19)及1C11F5E8(產生抗hPG MAb 20)獲得之單株抗體之VL。
在一些實施例中，N端抗hPG單株抗體之VL及VH CDR對應於來自上述融合瘤之單株抗體之VL及VH CDR。
在一些實施例中，C端抗hPG單株抗體之VL CDR對應於可自融合瘤1B4A11D11(產生抗hPG MAb 5)、1B6A11F2(產生抗hPG MAb 6)、1B11E4B11(產生抗hPG MAb 7)、1C10D3B9(產生抗hPG MAb 8)、1D8F5B3(產生抗hPG MAb 9)、1E1C7B4(產生抗hPG MAb 10)、2B4C8C8(產生抗hPG MAb 11)、2B11E6G4(產生抗hPG MAb 12)、2C6C3C7(產生抗hPG MAb 13)、2H9F4B7(產生抗hPG MAb 14)、1F11F5E10(產生抗hPG MAb 21)、1F11F5G9(產生抗hPG MAb 22)及1A11F2C9(產生抗hPG MAb 23)獲得之單株抗體之VL。
在一些實施例中，C端抗hPG單株抗體之VH CDR對應於可自上述融合瘤獲得之單株抗體之VH。
在一些實施例中，C端抗hPG單株抗體之VL及VH CDR對應於來自上述融合瘤之單株抗體之VL及VH CDR。
在一些實施例中，N端抗hPG單株抗體之VL CDR的序列對應於抗hPG MAb 3、MAb 4、MAb 16或MAb 19之VL CDR。
在一些實施例中，N端抗hPG單株抗體之VH CDR的序列對應於抗hPG MAb 3、MAb 4、MAb 16或MAb 19之VH CDR。
在一些實施例中，N端抗hPG單株抗體之VH及VL CDR的序列對應於抗hPG MAb 3、MAb 4、MAb 16或MAb 19之VH及VL CDR。
此等CDR之序列提供於表1A中。
在一些實施例中，C端抗hPG單株抗體之VL CDR的序列對應於抗hPG MAb 8或MAb 13之VL CDR。
在一些實施例中，C端抗hPG單株抗體之VH CDR的序列對應於抗hPG MAb 8或MAb 13之VH CDR。
在一些實施例中，C端抗hPG單株抗體之VH及VL CDR的序列對應於MAb 8或MAb 13之VH及VL CDR。
此等CDR之序列提供於表1B中。
本發明之抗hPG單株抗體包括與參考抗hPG單株抗體競爭結合hPG之抗體。參考抗hPG單株抗體可為本文所述之任何抗hPG單株抗體。非限制性實例包括：包含如本文所述之三個VL CDR及三個VH CDR之抗體；包含具有如本文所述之胺基酸序列之VH鏈及VL鏈的抗體；包含如本文所述之人類化重鏈及輕鏈多肽之抗體；由本文所揭示之任一融合瘤產生之抗體；結合於如本文所揭示之hPG內之抗原決定基的抗體。
本文所述之抗PG單株抗體可呈以下形式：全長抗體、多鏈或單鏈抗體及選擇性結合PG之其片段(包括(但不限於)Fab、Fab'、(Fab')2、Fv)、scFv(單鏈Fv)、替代抗體(surrobody)(包括替代輕鏈構築體)、單域抗體、駱駝化抗體及其類似者。其亦可具有或源自包括例如IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或IgM之任何同型。在一些實施例中，抗PG抗體為IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。抗PG單株抗體可具有人類或非人類起源。非人類起源之實例包括(但不限於)哺乳動物起源(例如猿、齧齒動物、山羊及兔)。抗PG單株抗體較佳具有人類起源。
在一些實施例中，本文所揭示之抗hPG單株抗體為人類化抗體。人類化抗體之特定實施例包括包含以下之抗體：(1)本文所揭示之任三個VL CDR及任三個VH CDR；(2)包含對應於SEQ ID NO:21之胺基酸序列的重鏈可變區及包含對應於SEQ ID NO:22之胺基酸序列的輕鏈可變區；(3)包含對應於SEQ ID NO:23之胺基酸序列的重鏈可變區及包含對應於SEQ ID NO:24之胺基酸序列的輕鏈可變區；(4)包含對應於SEQ ID NO:75之胺基酸序列的重鏈可變區及包含對應於SEQ ID NO:76之胺基酸序列的輕鏈可變區；(5)包含對應於SEQ ID NO:80之胺基酸序列的重鏈可變區及包含對應於SEQ ID NO:81之胺基酸序列的輕鏈可變區；(6)包含對應於SEQ ID NO:84之胺基酸序列的重鏈可變區及包含對應於SEQ ID NO:85之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(7)包含對應於SEQ ID NO:90之胺基酸序列的重鏈可變區及包含對應於SEQ ID NO:91之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在另一態樣中，本發明提供能夠用於產生抗PG單株抗體之核酸。提供編碼本文所述之抗hPG單株抗體之免疫球蛋白輕鏈基因及重鏈基因的核酸以及包含該等核酸之載體。另外，本文提供經該等載體轉型之原核及真核宿主細胞，以及經工程改造以表現本文所述之抗hPG單株抗體之輕鏈及重鏈多肽的真核(例如哺乳動物)宿主細胞。亦提供能夠表現輕鏈與重鏈且將本文所述之單株抗體分泌至培養宿主細胞之培養基中的宿主細胞。在一些實施例中，該宿主細胞為融合瘤。亦提供藉由培養宿主細胞產生抗hPG單株抗體之方法。
諸如抗hPG單株抗體之抗PG單株抗體結合PG且阻斷PG依賴性信號傳導，從而抑制CRC腫瘤細胞中PG誘導之反應。因此，本發明提供抑制CRC細胞中PG誘導之反應的方法，該等反應包括阻遏細胞分化及細胞死亡以及刺激細胞增殖。一般而言，該方法包含使CRC細胞接觸或細胞群體暴露於有效抑制CRC細胞中一或多種由PG誘導之反應之量的一種本文所述之抗PG單株抗體。該方法可在活體外或活體內，藉由向接觸CRC細胞之環境(可處於細胞培養物中或處於腫瘤中)投與抗hPG中和抗體來進行。
本發明之抗PG單株抗體抑制CRC腫瘤細胞之PG依賴性增殖，此使該等單株抗體成為適用於治療結腸直腸癌之治療劑。因此，本發明提供包含諸如抗hPG單株抗體之抗PG單株抗體及可接受之載劑、賦形劑及/或稀釋劑的醫藥組合物。組合物可經調配用於如本文所述之各種投藥途徑，其包含適用於所選途徑之載劑、賦形劑及/或稀釋劑。為治療人類及動物，包含例如抗hPG單株抗體之抗PG單株抗體的醫藥組合物可使用任何適合之投藥途徑(諸如注射及此項技術中已知用於基於抗體之臨床產品的其他投藥途徑)投與個體。對於治療用途，組合物可以單位劑量封裝以便於使用。
本文所述之抗PG單株抗體及包含該等抗PG單株抗體之組合物可根據本文所提供之方法用於治療CRC。一般而言，該等方法包含向有需要之個體投與有效提供治療效益之量的抗PG單株抗體。下文更詳細地描述之治療效益包括CRC之任何改善，例如減緩或制止CRC進展、減輕CRC嚴重程度、抑制CRC腫瘤生長或CRC細胞增殖、減小CRC腫瘤尺寸、或降低CRC患者之PG血清含量。個體可為人類或非人類，包括馴養動物(例如貓、狗、母牛、豬、馬)或非馴養動物。較佳地，抗PG單株抗體對所治療之物種的PG具有特異性。舉例而言，向人類患者投與抗hPG抗體，向犬類患者投與抗犬PG抗體，及其類似情況。抗hPG單株抗體療法適用之個體可為：處於疾病進展之任一階段(例如CRC第0階段、第I階段、第II階段、第III階段或第IV階段)的患者、已接受CRC療法(例如化學療法、放射療法、手術切除)之患者、或正接受其他CRC療法之患者。使用本文所述之抗PG單株抗體的治療可與其他療法組合，或輔助其他療法。如本文所述，其他CRC療法之非限制性實例包括化學治療、放射療法、手術切除及抗體療法。在一特定實例中，抗hPG單株抗體與化學治療劑組合投與。在另一特定實例中，投與抗hPG單株抗體以輔助手術切除。
具有CRC腫瘤之個體的循環PG含量(例如血清或血漿中)常升高。因此，抗hPG單株抗體可用於偵測PG含量，以達成診斷CRC之目的。另外，對於已診斷患有CRC之患者，可使用抗hPG單株抗體選擇適於抗PG療法之個體，或監測治療功效。如本文所揭示，診斷個體之結腸直腸癌的方法包含使用本發明之抗hPG單株抗體量測來自該個體之樣品中前胃泌激素之量，確定此量是否高於臨限含量。在一特定實施例中，臨限含量為50 pM。在一些實施例中，使用兩種抗PG抗體，即N端抗PG抗體與C端抗PG抗體，其中至少一者為本文所述之抗PG單株抗體。在一些實施例中，抗PG抗體為C端抗hPG單株抗體。在一些實施例中，抗PG單株抗體為N端抗hPG單株抗體。在一特定實施例中，N端與C端抗PG抗體為如本文所揭示之抗hPG單株抗體。
出於監測治療功效之目的，可使用本文所述之抗PG單株抗體，藉由比較在不同時間採集之樣品中PG之量來確定來自針對CRC已進行治療或正進行治療之個體的樣品中前胃泌激素含量是否隨時間推移而降低。在一些實施例中，使用兩種抗PG抗體，即N端抗PG抗體與C端抗PG抗體，其中至少一者為本文所述之抗PG單株抗體。在一些實施例中，抗PG抗體為C端抗hPG單株抗體。在一些實施例中，抗PG單株抗體為N端抗hPG單株抗體。在一特定實施例中，N端與C端抗PG抗體為如本文所揭示之抗hPG單株抗體。
本發明亦提供用於進行診斷CRC或監測CRC治療功效之方法的套組，其包含各自處於各別容器中之N端抗hPG抗體及C端抗hPG抗體以及適合試劑。所提供之N端及C端抗體中之至少一者為本文所述之抗PG單株抗體。在一些實施例中，N端抗體為抗hPG單株抗體。在一些實施例中，C端抗體為抗hPG單株抗體。在一些實施例中，C端抗hPG抗體為多株抗體。在一些實施例中，所提供之抗體中之一或兩者經標記。
本發明之特徵及優勢將自以下對實施例之詳細描述而進一步顯而易見。
 詳細描述
最初前胃泌激素(PG)鑑別為胃泌激素之前驅體，胃泌激素為一種刺激胃酸分泌之胃腸肽激素。胃泌激素以源自前胃泌激素之多種不同分子形式(G17、G34、甘胺酸延伸型G17、甘胺酸延伸型G34)存在。參看圖1。胃泌激素基因編碼具有101個胺基酸之產物，即前胃泌激素原。首次裂解移除信號肽，且產生PG，其為一種具有80個胺基酸之肽。hPG之已瞭解之已知多肽序列提供於SEQ ID NO:20中。如本文所用之人類前胃泌激素(hPG)為胃泌激素基因之具有80個胺基酸之多肽產物。前胃泌激素肽內之殘基自1編號至80，其中胺基最多之殘基為位置1。前胃泌激素之最開始40個胺基酸內的序列稱作「N端」，而殘基41至80內之序列稱作「C端」。
新近研究已展示CRC患者體內前胃泌激素含量升高。在正常生理環境下，人體內前胃泌激素佔全部分泌之肽的不到10%。在結腸直腸癌中，血漿與腫瘤組織中前胃泌激素之含量顯著升高，此可能由胃泌激素基因表現增強連同產物不完全加工所致。一項研究展示CRC患者與對照患者相比，血清前胃泌激素含量顯著更高，但經更多加工之胃泌激素形式無此種差異。Siddheshwar等人，2001,Gut 48:47-52。在所測試之CRC腫瘤樣品中，80%-100%之樣品展示PG含量增加。參見例如Ciccotosto等人，1995,Gastroenterology 109:1142-1153；Baldwin等人，1998,Gut 42:581-584；Van Solinge,1993,Gastroenterology 104:1099-1107。PG在CRC中之作用已進一步由如下實驗所證實，此實驗展示經致癌劑氧化偶氮甲烷處理之表現重組人類PG之小鼠與野生型小鼠或表現醯胺化胃泌激素之小鼠相比，結腸中異常隱窩病灶、腺瘤及腺癌數目顯著更多。Singh等人，2000,Gastroenterology 119:162-171。
近來，Hollande等人證明，前胃泌激素藉由抑制作為β-索烴素/Tcf4信號傳導之負向調節劑的ICAT來刺激β-索烴素/Tcf4路徑，且阻斷前胃泌激素會使ICAT重新表現。參見WO 2007/135542。雖然不欲受任何操作理論限制，但咸信阻斷前胃泌激素信號傳導可因ICAT表現增強而抑制β-索烴素/Tcf4誘導之增殖。在缺乏持續PG依賴性信號傳導下，細胞增殖遭到抑制，且引發細胞分化及/或細胞死亡(包括細胞凋亡)。
儘管急需治療及診斷CRC之新臨床方法，且有證據表明PG刺激CRC腫瘤細胞增殖，以及對治療癌症之單株抗體療法的關注不斷增加，但迄今為止，尚未報導任何能夠阻斷PG依賴性腫瘤細胞增殖或結合PG之單株抗體。首次呈現於本文中之該等抗體證明難以研發。作為第一個挑戰，申請者發現重組人類前胃泌激素無法在測試小鼠體內誘導單株免疫原性反應。因此，需要僅使用PG之肽片段來設計免疫原以產生對前胃泌激素而非其他胃泌激素基因產物具有特異性之抗體。在融合瘤純系產生結合抗原性肽之抗體後，發現與該肽結合並不預示能夠在生理環境下特異性或完全結合PG。如下文實例中更詳細地展示，多種融合瘤產生可結合免疫原中所用之PG肽但無法結合PG之抗體。本發明提供不僅可結合其所針對之肽抗原且亦特異性結合PG並可阻斷癌細胞增殖的抗hPG單株抗體。
抗hPG單株抗體
雖然不欲受任何操作理論限制，但認為抗hPG單株抗體阻斷前胃泌激素，抑制前胃泌激素引發結腸直腸腫瘤細胞中另外引起增殖、細胞分化及細胞死亡減少之信號轉導的能力。本發明單株抗體所結合之hPG之特異性抗原決定基並不重要；更確切地，重點在於對hPG之結合特異性超過其他源自胃泌激素基因之肽。適用於產生本發明抗hPG抗體之肽包含在經更多加工之多肽形式(諸如甘胺酸延伸型或醯胺化胃泌激素)中未發現之前胃泌激素特異性序列，但亦可包含在hPG之經加工形式或降解產物中發現之序列。在一些實施例中，抗hPG單株抗體針對胺基酸序列對應於hPGN端區域之肽抗原產生，且命名為N端抗hPG單株抗體。在特定實施例中，N端抗hPG單株抗體針對包含對應於hPG之殘基1至14(SWKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO:25))之胺基酸序列偶合於連接子序列的免疫原產生。在其他實施例中，抗hPG單株抗體針對胺基酸序列對應於hPGC端區域之肽抗原產生，且命名為C端抗hPG單株抗體。在特定實施例中，抗hPG單株抗體針對包含對應於hPG之殘基55至80(SEQ ID NO:27)之胺基酸序列偶合於連接子序列的免疫原產生。參見表1。
本發明之抗PG單株抗體結合PG且適用於自複雜混合物中偵測及分離PG。另外，本發明之抗PG單株抗體獨特地適用於結腸直腸癌之治療及/或診斷應用。在各種實施例中，抗hPG單株抗體(1)相比於其他胃泌激素基因產物，更特異性結合PG，(2)針對hPG具有高親和力，(3)在活體外及活體內抑制結腸直腸癌細胞增殖，(4)在活體內降低腫瘤尺寸及數目，(5)在含有其他源自胃泌激素基因之肽的複雜混合物中偵測PG。
胃泌激素基因經表現且廣泛加工，產生在正常生理穩態中起作用之若干蛋白質產物。另一方面，通常在健康個體之循環中無法偵測到前胃泌激素。本發明之單株抗體意欲靶向前胃泌激素而非其他源自胃泌激素基因之肽。因此，抗hPG單株抗體特異性結合人類及其他動物之前胃泌激素，但不結合其他胃泌激素基因產物(諸如(但不限於)甘胺酸延伸型或醯胺化胃泌激素或C端側接肽(CTFP))。
抗hPG單株抗體之特異性可使用如下ELISA來測定。在4℃下將96孔板以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中適當濃度之測試多肽(例如25 ng及50 ng重組人類PG以及50 ng及250 ng CTFP或其他源自胃泌激素基因之產物)培育隔夜，之後用洗滌溶液(PBS及0.1% Tween-20)洗滌各孔三次，接著在22℃下與每孔100 μL阻斷溶液(PBS、0.1% Tween-20、0.1%牛血清白蛋白或酪蛋白水解物)一起培育2小時。阻斷後，洗滌各孔三次且添加欲檢定之抗體(測試抗體)。向各孔中添加100 μL含測試抗體(0.3至1 ng/mL)之PBS及0.1% Tween-20。接著在22℃下培育各板2小時，之後棄去測試抗體溶液，且在洗滌步驟(3×100 μL如上所述之洗滌溶液)後用含有二次抗體(偶合於辣根過氧化酶之山羊抗小鼠IgG(Fc)抗體)之阻斷溶液替換。用二次抗體培育1小時後，向各孔中添加100 μL受質溶液(例如Fast OPD或鄰苯二胺二鹽酸鹽，得自Sigma-Aldrich Co.，根據製造商之說明書製備)且在暗處於22℃下培育20分鐘。藉由添加50 μL 4N硫酸停止反應，且藉由在492 nm下量測光密度(O.D.)來測定經催化之受質之量。受質轉化率與結合於抗原之一次(測試)抗體之量成正比。實驗進行一式兩份且繪製OD量測值隨抗原濃度而變之曲線。若針對hPG所量測之O.D.介於0.2與1.5之間且CTFP或任何其他源自胃泌激素基因之肽不存在高於背景信號之統計顯著性信號，則測試抗體評定為對PG具有特異性，其中背景信號為僅含有PBS之對照孔的平均信號。
發現若干本發明之抗hPG單株抗體具有高度特異性。在一些實施例中，抗hPG單株抗體對前胃泌激素之特異性為其對其他胃泌激素基因產物之特異性的100倍。在該等實施例中，需要100倍之抗原(例如甘胺酸延伸型或醯胺化胃泌激素)來產生與抗原為前胃泌激素時所觀測相同之結合。
測定結合之其他方法包括(但不限於)免疫螢光法、酶聯結免疫吸附劑檢定(ELISA)、放射性物質標記之免疫檢定(RIA)、夾心ELISA(Monoclonal Antibody Experiment Manual(由Kodansha Scientific,1987出版)；Second Series Biochemical Experiment Course，第5卷；Immunobiochemistry Research Method，由Tokyo Kagaku Dojin出版(1986))。
對PG具有高親和力之抗hPG單株抗體為治療及診斷用途所需。因此，本發明提供對前胃泌激素具有高結合親和力之單株抗體。單株抗hPG抗體以至少約100 nM之親和力特異性結合hPG，但親和力可更高，例如至少約90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM、10 pM、1 pM或甚至更高。在一些實施例中，單株抗體以在約1 pM至約100 nM之範圍內的親和力或介於任何上述值之間的範圍內之親和力特異性結合hPG。
抗hPG單株抗體對hPG之親和力可使用此項技術中熟知或本文所述之技術來測定，諸如(但不限於)ELISA、等溫滴定熱量測定(ITC)、BIAcore、Proteon或螢光偏振檢定。
使用來自hPGN端或C端區域之抗原，可產生識別hPG之不同抗原決定基的抗體。由單株抗體識別之抗原決定基將視用於產生抗體之特定抗原而定，且可使用熟習此項技術者已知之技術來定位，諸如丙胺酸掃描及SPOT分析(參見下文實例部分)。舉例而言，抗原決定基定位顯示，抗hPG MAb 2與MAb 4結合相同抗原決定基；抗hPG MAb 1與MAb 3結合大致相同之抗原決定基；MAb 17、MAb 18、MAb 19及MAb 20結合大致相同之抗原決定基；MAb 15與MAb 16結合大致相同之抗原決定基；抗hPG MAb 5、MAb 6、MAb 7、MAb 9及MAb 12結合相同抗原決定基且與抗hPG MAb 10結合大致相同之抗原決定基；且抗hPG MAb 11與MAb 14結合大致相同之抗原決定基。
可使用如本文所述之競爭檢定來確定抗hPG單株抗體是否識別特定抗原決定基，其中由參考抗體結合之抗原決定基已知。在一些實施例中，抗hPG單株抗體與結合胺基酸序列對應於hPG N端區域之抗原決定基的參考抗體競爭。在特定實施例中，抗hPG單株抗體與結合包括hPG之殘基10至14(SEQ ID NO:28)、hPG之殘基9至14(SEQ ID NO:29)、hPG之殘基4至10(SEQ ID NO:30)、hPG之殘基2至10(SEQ ID NO:31)或hPG之殘基2至14(SEQ ID NO:32)之抗原決定基的參考抗體競爭。在一些實施例中，抗hPG單株抗體與結合胺基酸序列對應於hPGC端區域之抗原決定基的參考抗體競爭。在特定實施例中，抗hPG單株抗體與結合包括hPG之殘基71至74(SEQ ID NO:33)、hPG之殘基69至73(SEQ ID NO:34)、hPG之殘基76至80(SEQ ID NO:35)或hPG之殘基67至74(SEQ ID NO:36)之抗原決定基的參考抗體競爭。
如本文所用，抗體(Ab)係指與特定抗原特異性結合或進行免疫反應之免疫球蛋白分子，且包括多株、單株、經基因工程改造及以其他方式修飾之形式的抗體，包括(但不限於)嵌合抗體、人類化抗體、及抗體之抗原結合片段(包括例如Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG及scFv片段)。在各種實施例中，抗hPG單株抗體包含抗體恆定區全部或一部分。在一些實施例中，恆定區為選自以下之同型：IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)及IgM。
如本文所用之術語「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。單株抗體係藉由此項技術中可用或已知之任何方式自單一純系獲得，該純系包括任何真核、原核或噬菌體純系。適用於本發明之單株抗體可使用此項技術中已知之各種技術來製備，包括使用融合瘤、重組體及噬菌體呈現技術或其組合。在包括活體內人類中使用抗hPG單株抗體及活體外偵測檢定在內的本發明多種用途中，可適宜使用嵌合、靈長類動物化、人類化或人類抗體。
術語「scFv」係指傳統抗體之重鏈及輕鏈之可變域接合形成單個鏈之單鏈Fv抗體。
「VH」係指抗體之免疫球蛋白重鏈(包括Fv、scFv或Fab之重鏈)之可變區。「VL」係指免疫球蛋白輕鏈(包括Fv、scFv、dsFv或Fab之輕鏈)之可變區。抗體(Ab)與免疫球蛋白(Ig)為具有相同結構特徵之醣蛋白。抗體對特定標靶展現結合特異性，而免疫球蛋白包括抗體及其他缺乏標靶特異性之抗體樣分子。天然抗體及免疫球蛋白通常為具有約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚醣蛋白，由兩個相同輕(L)鏈及兩個相同重(H)鏈構成。各重鏈在一末端處具有可變域(VH)，後面接有多個恆定域。各輕鏈在一末端處具有可變域(VL)，且在另一末端處具有恆定域。
本發明之抗hPG單株抗體包含互補決定區(CDR)。CDR亦稱作輕鏈與重鏈可變域中之高變區。可變域之較高度保守之部分稱作構架(FR)。如此項技術中所知，描繪抗體高變區之胺基酸位置/邊界可視背景及此項技術中已知之各種定義而變化。可變域內之一些位置可視作雜交高變位置，因為此等位置在一組標準下可視作在高變區內，而在不同組準則下可視作在高變區之外。此等位置中之一或多者亦可見於延伸之高變區中。本發明提供在此等雜交高變位置中包含修飾之抗體。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個FR區，該等FR區主要採用β片構型，由三個CDR連接，該等CDR形成連接β片結構且在一些狀況下成為β片結構之一部分的環。各鏈中之CDR由FR區緊密固持在一起且與另一鏈之CDR一起促成抗體之標靶結合位點的形成(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md. 1987)。
已鑑別出若干對hPG具有高特異性及親和力且抗腫瘤活性優良之抗hPG單株抗體，且其CDR及可變重鏈及輕鏈經測序。鼠類重鏈及輕鏈可變域在本文中稱作mVH及mVL，隨後為相應單株抗體之編號，例如對於抗hPG MAb3，稱作mVH.3及mVL.3。同樣，人類重鏈及輕鏈可變域在本文中稱作hVH及mVL，隨後為相應單株抗體之編號。
在一些實施例中，針對hPG之N端部分產生之抗hPG單株抗體具有三個可變輕鏈CDR及三個可變重鏈CDR，分別稱作CDR 1、CDR 2或CDR 3，隨後為例示性抗hPG單株抗體之編號(亦即MAb 3、4、16、19)，其中VLCDR1係選自QSIVHSNGNTY(「VL CDR 1.3」；SEQ ID NO:4)、QSLVHSSGVTY(「VL CDR 1.4」；SEQ ID NO:10)、QSLLDSDGKTY(「VL CDR 1.16」；SEQ ID NO:50)及SQHRTYT(「VL CDR 1.19」；SEQ ID NO:51)；VLCDR2係選自KVS(「VL CDR 2.3」及「VL CDR 2.4」；SEQ ID NO:5)、LVS(「VL CDR 2.16」；SEQ ID NO:53)及VKKDGSH(「VL CDR 2.19」；SEQ ID NO:54)；VL CDR3係選自FQGSHVPFT(「VL CDR 3.3」；SEQ ID NO:6)、SQSTHVPPT(「VL CDR 3.4」；SEQ ID NO:11)、WQGTHSPYT(「VL CDR 3.16」；SEQ ID NO:57)及GVGDAIKGQSVFV(「VL CDR 3.19」；SEQ ID NO:58)；VH CDR1係選自GYIFTSYW(「VH CDR 1.3」；SEQ ID NO:1)、GYTFSSSW(「VH CDR 1.4」；SEQ ID NO:7)、GYTFTSYY(「VH CDR 1.16」；SEQ ID NO:39)及GYSITSDYA(「VH CDR 1.19」；SEQ ID NO:40)；VH CDR2係選自FYPGNSDS(「VH CDR 2.3」；SEQ ID NO:2)、FLPGSGST(「VH CDR 2.4」；SEQ ID NO:8)、INPSNGGT(「VH CDR 2.16」；SEQ ID NO:43)及ISFSGYT(「VH CDR 2.19」；SEQ ID NO:44)；且VH CDR3係選自TRRDSPQY(「VH CDR 3.3」；SEQ ID NO:3)、ATDGNYDWFAY(「VH CDR 3.4」；SEQ ID NO:9)、TRGGYYPFDY(「VH CDR 3.16」；SEQ ID NO:47)及AREVNYGDSYHFDY(「VH CDR 3.19」；SEQ ID NO:48)。參見表1A。
在一些實施例中，針對hPG之C端部分產生之抗hPG單株抗體具有三個可變輕鏈CDR及三個可變重鏈CDR，分別稱作CDR1、CDR2或CDR3，隨後為例示性抗hPG單株抗體之編號(亦即MAb 8或13)，其中VL CDR1係選自KSLRHTKGITF(「VL CDR 1.8」；SEQ ID NO:49)及QSLLDSDGKTY(「VL CDR 1.13」；SEQ ID NO:50)；VL CDR2係選自QMS(「VL CDR 2.8」；SEQ ID NO:52)及LVS(「VL CDR 2.16」；SEQ ID NO:53)；VL CDR3係選自AQNLELPLT(「VL CDR 3.8」；SEQ ID NO:55)及WQGTHFPQT(「VL CDR 3.13」；SEQ ID NO:56)；VH CDR1係選自GFTFTTYA(「VH CDR 1.8」；SEQ ID NO:37)及GFIFSSYG(「VH CDR 1.13」；SEQ ID NO:38)；VH CDR2係選自ISSGGTYT(「VH CDR 2.8」；SEQ ID NO:41)及INTFGDRT(「VH CDR 2.13」；SEQ ID NO:42)；且VH CDR3係選自ATQGNYSLDF(「VH CDR 3.8」；SEQ ID NO:45)及ARGTGTY(「VH CDR 3.13」；SEQ ID NO:46)。參見表1B。
表1A中，所有胺基酸序列皆使用習知N→C取向來表示。對於各免疫原，前胃泌激素肽係用具有一個胺基己酸(Ahx)殘基，隨後為半胱胺酸之連接子，結合於牛血清白蛋白(「BSA」)或匙孔螺血氰蛋白(「KLH」)運載體來合成。
表1B中，所有胺基酸序列皆使用習知N→C取向來表示。對於各免疫原，前胃泌激素肽係用具有兩個胺基己酸(Ahx)殘基，隨後為半胱胺酸之連接子，結合於匙孔螺血氰蛋白(「KLH」)或白喉毒素(「DT」)運載體來合成。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之CDR為VHCDR1.3、VHCDR2.3及VHCDR3.3。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之胺基酸序列對應於mVH.3(SEQ ID NO:12)。參見圖2A。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VL鏈之CDR為VLCDR1.3、VLCDR2.3及VLCDR3.3。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體VL鏈之胺基酸序列對應於mVL.3(SEQ ID NO:13)。參見圖2B。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之CDR為VHCDR1.4、VHCDR2.4及VHCDR3.4。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之序列對應於mVH.4(SEQ ID NO:14)。參見圖2C。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VL鏈之CDR為VLCDR1.4、VLCDR2.4及VLCDR3.4。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體VL鏈之胺基酸序列對應於mVL.4(SEQ ID NO:15)。參見圖2D。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之CDR為VHCDR1.8、VHCDR2.8及VHCDR3.8。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之序列對應於mVH.8(SEQ ID NO:59)。參見圖2E。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VL鏈之CDR為VL CDR1.8、VL CDR2.8及VL CDR3.8。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體VL鏈之胺基酸序列對應於mVL.8(SEQ ID NO:63)。參見圖2F。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之CDR為VHCDR1.13、VHCDR2.13及VHCDR3.13。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之序列對應於mVH.13(SEQ ID NO:60)。參見圖2G。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VL鏈之CDR為VL CDR1.13、VL CDR2.13及VL CDR3.13。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體VL鏈之胺基酸序列對應於mVL.13(SEQ ID NO:64)。參見圖2H。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之CDR為VHCDR1.16、VHCDR2.16及VHCDR3.16。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之序列對應於mVH.16(SEQ ID NO:61)。參見圖2I。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VL鏈之CDR為VL CDR1.16、VL CDR2.16及VL CDR3.16。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體VL鏈之胺基酸序列對應於mVL.16(SEQ ID NO:65)。參見圖2J。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之CDR為VHCDR1.19、VHCDR2.19及VHCDR3.19。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之序列對應於mVH.19(SEQ ID NO:62)。參見圖2K。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VL鏈之CDR為VL CDR1.19、VL CDR2.19及VL CDR3.19。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體VL鏈之胺基酸序列對應於mVL.19(SEQ ID NO:66)。參見圖2L。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之CDR為VHCDR1.3、VHCDR2.3及VHCDR3.3，且VL鏈之CDR為VLCDR1.3、VLCDR2.3及VLCDR3.3。在一特定實施例中，抗PG單株抗體VH鏈之胺基酸序列對應於mVH.3(SEQ ID NO: 12)，且VL鏈之序列對應於mVL.3(SEQ ID NO:13)。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之CDR為VHCDR1.4、VHCDR2.4及VHCDR3.4，且VL鏈之CDR為VLCDR1.4、VLCDR2.4及VLCDR3.4。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之胺基酸序列對應於mVH.4(SEQ ID NO:14)，且VL鏈之胺基酸序列對應於mVL.4(SEQ ID NO:15)。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之CDR為VHCDR1.8、VHCDR2.8及VHCDR3.8，且VL鏈之CDR為VLCDR1.8、VLCDR2.8及VLCDR3.8。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體為本文所述之抗hPG MAb 8，且包含對應於mVH.8(SEQ ID NO:59)之胺基酸序列及對應於mVL.8(SEQ ID NO:63)之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之CDR為VHCDR1.3、VHCDR2.13及VHCDR3.13，且VL鏈之CDR為VLCDR1.13、VLCDR2.13及VLCDR3.13。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體為本文所述之抗hPG MAb 13，且包含對應於mVH.13(SEQ ID NO:60)之胺基酸序列及對應於mVL.13(SEQ ID NO:64)之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之CDR為VHCDR1.16、VHCDR2.16及VHCDR3.16，且VL鏈之CDR為VLCDR1.16、VLCDR2.16及VLCDR3.16。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體為本文所述之抗hPG MAb 16，且包含對應於mVH.16(SEQ ID NO:61)之胺基酸序列及對應於mVL.16(SEQ ID NO:65)之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗hPG單株抗體VH鏈之CDR為VHCDR1.19、VHCDR2.19及VHCDR3.19，且VL鏈之CDR為VLCDR1.19、VLCDR2.19及VLCDR3.19。在一特定實施例中，抗hPG單株抗體為本文所述之抗hPG MAb 19，且包含對應於mVH.19(SEQ ID NO:62)之胺基酸序列及對應於mVL.19(SEQ ID NO:66)之胺基酸序列。
本發明之抗hPG單株抗體包括完整分子與能夠特異性結合hPG之抗體片段(諸如Fab及F(ab')2片段)。相較於完整抗體，Fab及F(ab')2片段缺乏完整抗體之Fc片段，更快速地自動物或植物之循環中清除，且非特異性組織結合性更低(Wahl等人，1983,J. Nucl. Med. 24:316)。因此，抗體片段尤其適於治療應用。
術語「抗體片段」係指全長抗體之一部分，一般為標靶結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段。「Fv」片段為含有完整標靶識別及結合位點之最小抗體片段。此區由一重鏈可變域與一輕鏈可變域緊密地非共價締合而成之二聚體(VH-VL二聚體)組成。在該構型中，各可變域之三個CDR相互作用以在VH-VL二聚體之表面上界定標靶結合位點。通常，6個CDR使抗體具有標靶結合特異性。然而，在一些情況下，即使單個可變域(或僅包含三個對標靶具有特異性之CDR的半個Fv)亦可具有識別且結合標靶之能力，不過親和力低於完整結合位點。「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之VH及VL域，其中此等域存在於單個多肽鏈中。一般而言，Fv多肽另外包含介於VH與VL域之間的多肽連接子，該多肽連接子使sFv能夠形成標靶結合所需之結構。「單域抗體」由對hPG展現充足親和力之單個VH域或VL域構成。在一特定實施例中，單域抗體為駱駝化抗體(參見例如Riechmann,1999,Journal of Immunological Methods 231:25-38)。
Fab片段含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在於其重鏈CH1域之羧基端處添加數個殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。藉由使F(ab')2胃蛋白酶消化產物之鉸鏈半胱胺酸處的二硫鍵裂解來產生F(ab')片段。抗體片段之其他化學偶合為一般技術者所知。
本發明之抗hPG單株抗體可為嵌合抗體。如本文所用之術語「嵌合」抗體係指具有源自非人類免疫球蛋白(諸如大鼠或小鼠抗體)之可變序列及通常選自人類免疫球蛋白模板之人類免疫球蛋白恆定區的抗體。用於產生嵌合抗體之方法為此項技術中已知。參見例如Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi等人，1986,BioTechniques 4:214-221；Gillies等人，1985,J. Immunol. Methods 125:191-202；美國專利第5,807,715號、第4,816,567號及第4,816397號，皆以全文引用之方式併入本文中。
本發明之抗hPG單株抗體可為人類化抗體。非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式為含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白鏈或片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他結合標靶子序列)。一般而言，人類化抗體包含實質上所有之至少一個且通常兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，且所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白共同序列之FR區，且可稱作「CDR移植」抗體。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(通常為人類免疫球蛋白共同序列之免疫球蛋白恆定區)之至少一部分。抗體人類化之方法(包括設計人類化抗體之方法)為此項技術中已知。參見例如Lefranc等人，2003,Dev. Comp. Immunol. 27:55-77；Lefranc等人，2009,Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012；Lefranc,2008,Mol. Biotechnol. 40: 101-111；Riechmann等人，1988,Nature 332:323-7；Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號及第6,180,370號；EP239400；PCT公開案WO 91/09967；美國專利第5,225,539號；EP592106；EP519596；Padlan,1991,Mol. Immunol.,28:489-498；Studnicka等人，1994,Prot. Eng. 7:805-814；Roguska等人，1994,Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973；及美國專利第5,565,332號，皆以全文引用之方式併入本文中。
如下文實例中所述，自本發明之鼠類抗hPG單株抗體來設計人類化抗hPG單株抗體之序列。人類化抗體之特定實施例包括包含以下之抗體：(1)本文所揭示之任三個VL CDR及任三個VH CDR；(2)包含對應於SEQ ID NO:21之胺基酸序列的重鏈可變區及包含對應於SEQ ID NO:22之胺基酸序列的輕鏈可變區；(3)包含對應於SEQ ID NO:23之胺基酸序列的重鏈可變區及包含對應於SEQ ID NO:24之胺基酸序列的輕鏈可變區；(4)包含選自由SEQ ID NO:75、77及79組成之群的胺基酸序列之重鏈可變區及包含選自由SEQ ID NO:76及78組成之群的胺基酸序列之輕鏈可變區；(5)包含選自由SEQ ID NO:80及82組成之群的胺基酸序列之重鏈可變區及包含選自由SEQ ID NO:81及83組成之群的胺基酸序列之輕鏈可變區；(6)包含選自由SEQ ID NO:84、86及88組成之群的胺基酸序列之重鏈可變區及包含選自由SEQ ID NO:85、87及89組成之群的胺基酸序列之輕鏈可變區；(7)包含選自由SEQ ID NO:90、92及94組成之群的胺基酸序列之重鏈可變區及包含選自由SEQ ID NO:91、93及95組成之群的胺基酸序列之輕鏈可變區。
本發明之抗hPG單株抗體可為靈長類動物化抗體。術語「靈長類動物化抗體」係指包含猴可變區及人類恆定區之抗體。用於產生靈長類動物化抗體之方法為此項技術中已知。參見例如美國專利第5,658,570號、第5,681,722號及第5,693,780號，皆以全文引用之方式併入本文中。
抗hPG單株抗體包括與參考抗體，諸如多株抗hPG抗體或本文所揭示之任何抗hPG單株抗體競爭之抗體。與本發明抗hPG單株抗體競爭之抗體適於多種診斷及治療應用。適合參考抗hPG單株抗體之特定實施例包括本文所述之抗體，例如(但不限於)：包含本文所揭示之任三個VL CDR及任三個VH CDR的抗體；VH鏈之胺基酸序列對應於SEQ ID NO:12(mVH.3)且VL鏈之胺基酸序列對應於SEQ ID NO:13(mVL.3)的抗體；及VH鏈之胺基酸序列對應於SEQ ID　NO:14(mVH.4)且VL鏈之序列對應於SEQ ID NO:15(mVL.4)的抗體；VH鏈之胺基酸序列對應於SEQ ID NO:59(mVH.8)且VL鏈之胺基酸序列對應於SEQ ID NO:63(mVL.8)的抗體；VH鏈之胺基酸序列對應於SEQ ID NO:60(mVH.13)且VL鏈之胺基酸序列對應於SEQ ID NO:64(mVL.13)的抗體；VH鏈之胺基酸序列對應於SEQ ID NO:61(mVH.16)且VL鏈之胺基酸序列對應於SEQ ID NO:65(mVL.16)的抗體；VH鏈之胺基酸序列對應於SEQ ID NO:62(mVH.19)且VL鏈之胺基酸序列對應於SEQ ID NO:66(mVL.19)的抗體；或本文所揭示之VH與VL鏈的任何組合。
適合參考抗體亦包括以下抗體:由選自由43B9G11、WE5H2G7、6B5B11C10、20D2C3G2、1B4A11D11、1B6A11F2、1B11E4B11、1C10D3B9、1D8F5B3、1E1C7B4、2B4C8C8、2B11E6G4、2C6C3C7、2H9F4B7、1E9A4A4、1E9D9B6、1C8D10F5、1A7C3F11、1B3B4F11、1C11F5E8、1F11F5E10、1F11F5G9及1A11F2C9組成之群的融合瘤產生之抗體；結合包括hPG之殘基10至14(SEQ ID NO:28)、hPG之殘基9至14(SEQ ID NO:29)、hPG之殘基4至10(SEQ ID NO:30)、hPG之殘基2至10(SEQ ID NO:31)或hPG之殘基2至14(SEQ ID NO:32)的抗原決定基之抗體；及結合包括hPG之殘基71至74(SEQ ID NO:33)、hPG之殘基69至73(SEQ ID NO:34)、hPG之殘基76至80(SEQ ID NO:35)或hPG之殘基67至74(SEQ ID NO:36)的抗原決定基之抗體。
可使用如下競爭檢定來測試與本發明單株抗體競爭結合PG(例如hPG)之能力。在4℃下用捕捉抗體(識別前胃泌激素中與參考單株抗體所識別之抗原決定基不同之N端或C端區域的多株或單株抗體)以在1-10 μg/ml範圍內選擇之濃度塗佈96孔板隔夜(每孔0.1至1 μg)。在22℃下用含0.1% Tween-20/0.1% BSA之PBS(阻斷緩衝液)阻斷2小時後，添加濃度為10 pM至1 nM之重組人類前胃泌激素(每孔10至1000 pg)且在22℃下培育2小時。此後，生物素標記之參考抗hPG單株抗體或含有該參考單株抗體之混合物連同遞增濃度之未標記之測試抗體一起添加，且在22℃下培育1小時。洗滌後，藉由在22℃下與辣根過氧化酶之螢光受質一起培育1小時，隨後在光度計中定量相對光單位(RLU)來偵測。檢定進行一式兩份。與參考抗hPG單株抗體競爭之本發明抗體抑制參考抗體結合hPG。所結合之抗原決定基與對照抗體相同之抗體將能夠有效地競爭結合，因此將顯著減少(例如減少至少50%)參考抗體之結合，如結合之標記減少所證實。(標記)參考抗體在存在相關抗體下之反應性為對照高值。對照低值係藉由將未標記之測試抗體與表現前胃泌激素之細胞一起培育，接著將細胞/抗體混合物與標記之完全相同類型之對照抗體一起培育，在競爭出現且減少標記抗體之結合時獲得。在測試檢定中，標記抗體之反應性在測試抗體存在下顯著降低指示測試抗體識別實質上相同之抗原決定基。
結合抑制可表示為抑制常數或Ki，其根據下式來計算：Ki=IC50/(1+[參考Ab濃度]/Kd)其中測試抗體之IC50為測試抗體使參考抗體之結合減少50%之濃度，且Kd為參考抗體之解離常數，其為參考抗體對前胃泌激素之親和力的量度。與本文所揭示之抗hPG單株抗體競爭之抗體在本文所述之檢定條件下可具有10 pM至10 nM之Ki。
在各種實施例中，當使用濃度為0.01 μg/ml、0.08 μg/ml、0.4 μg/ml、2 μg/ml、10 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml或濃度在任何上述值之間的範圍內(例如濃度在2 μg/ml至10 μg/ml之範圍內)之未標記之本發明抗hPG單株抗體時，該抗hPG單株抗體使標記之參考抗體之結合減少至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、100%或在任何上述值之間的範圍內之百分比(例如本發明抗hPG單株抗體使標記之參考抗體之結合減少50%至70%)。
在參考抗體與任何測試抗體之間進行抗體競爭研究(不考慮物種或同型)時，可首先用可偵測標記(諸如生物素或酶(或甚至放射性)標記)來標記參考抗體以隨後可進行鑑別。在此狀況下，將標記之參考抗體(濃度固定或遞增)與已知量之前胃泌激素一起培育。接著將未標記之測試抗體添加至前胃泌激素與標記抗體之預先結合複合物中。量測結合之標記的強度。若測試抗體藉由結合重疊抗原決定基來與標記抗體競爭，則強度將相對於在不存在測試抗體下標記之對照抗體之結合有所降低。
競爭檢定為已知且可經修改以產生可比得上前述檢定之結果。檢定可為一系列基於抗體競爭之免疫檢定中之任一者，且參考抗體可藉助於偵測其標記來偵測，例如在生物素標記之抗體的狀況下藉由使用抗生蛋白鏈菌素，或藉由使用與酶標記有關之產色受質(諸如過氧化物酶之3,3'5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)受質)，或藉由簡單地偵測放射性標記或螢光標記來偵測。
本文亦包括經衍生化、共價修飾或結合於其他分子以用於診斷及治療應用的抗hPG單株抗體。舉例而言(但不限於)，衍生化抗體包括例如藉由糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、由已知之保護基/阻斷基衍生化、蛋白水解裂解、鍵聯於細胞配位體或其他蛋白質等進行修飾之抗體。多種化學修飾中之任一者皆可藉由已知之技術進行，該等技術包括(但不限於)特定化學裂解、乙醯化、甲醯化、衣黴素(tunicamycin)之代謝合成等。另外，衍生物可含有一或多個非經典胺基酸。
在另一實例中，本發明之抗體可連接於聚(乙二醇)(PEG)部分。在一特定實施例中，抗體為抗體片段且PEG部分經由任何位於抗體片段中之可用胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基(例如任何游離胺基、亞胺基、硫醇基、羥基或羧基)連接。該等胺基酸可天然存在於抗體片段中，或可使用重組DNA方法經工程改造至片段中。參見例如美國專利第5,219,996號。可使用多個位點來連接兩個或兩個以上PEG分子。PEG部分可經由至少一個位於抗體片段中之半胱胺酸殘基的硫醇基共價鍵聯。若硫醇基用作連接點，則可使用經適當活化之效應部分，例如硫醇選擇性衍生物，諸如順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸衍生物。
在一特定實例中，抗hPG單株抗體結合物為經修飾之Fab'片段，其例如根據EP0948544中所揭示之方法經聚乙二醇化，亦即共價連接有PEG(聚(乙二醇))。亦參見Poly(ethyleneglycol) Chemistry,Biotechnical and Biomedical Applications.(J. Milton Harris(編),Plenum Press,New York,1992)；Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications.(J. Milton Harris及S. Zalipsky編，American Chemical Society,Washington D.C.,1997)；及Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences,(M. Aslam及A. Dent編，Grove Publishers,New York,1998)；以及Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545。PEG可連接於鉸鏈區中之半胱胺酸。在一實例中，經PEG修飾之Fab'片段具有順丁烯二醯亞胺基共價鍵聯於經修飾之鉸鏈區中之單個硫醇基。離胺酸殘基可共價鍵聯於順丁烯二醯亞胺基，且分子量為約20,000 Da之甲氧基聚(乙二醇)聚合物可連接於離胺酸殘基上之各胺基。因此，連接於Fab'片段之PEG的總分子量可為約40,000 Da。
抗hPG單株抗體包括適用於診斷應用之標記抗體。該等抗體可在診斷上用以例如偵測相關標靶在特定細胞、組織或血清中之表現，或用以監測免疫反應之發展或進展作為臨床測試程序之一部分，以例如確定所給治療方案之功效。偵測可藉由使抗體與可偵測物質或「標記」偶合來推動。標記可直接或間接結合於本發明之抗hPG單株抗體。標記自身可偵測(例如放射性同位素標記、同位素標記或螢光標記)，或在酶標記之狀況下其可催化可偵測之受質化合物或組合物發生化學變化。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射性物質、使用各種正電子發射斷層攝影術之正電子發射金屬、及非放射性順磁性金屬離子。可偵測物質可使用此項技術中已知之技術直接偶合或結合於抗體(或其片段)，或經由中間物(諸如此項技術中已知之連接子)間接偶合或結合於抗體(或其片段)。酶標記之實例包括螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶；美國專利第4,737,456號)、蟲螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過氧化酶(諸如辣根過氧化酶(HRPO))、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙醯膽鹼酯酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、醣氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化酶、微過氧化酶及其類似物。適合輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；適合螢光物質之實例包括繖酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹醯氯、二甲胺-1-萘磺醯氯或藻紅素及其類似物；發光物質之實例包括魯米諾(luminol)；生物發光物質之實例包括螢光素酶、蟲螢光素及水母發光蛋白；適合同位素物質之實例包括13C、15N及氘；且適合放射性物質之實例包括125I、131I、111In或99Tc。
本發明包括所有起源物種之抗hPG單株抗體。非限制性例示性天然抗體包括源自人類、猿、雞、山羊、兔及齧齒動物(例如大鼠、小鼠及倉鼠)之抗體(參見例如Lonberg等人，WO93/12227；美國專利第5,545,806號；及Kucherlapati等人，WO91/10741；美國專利第6,150,584號，皆以全文引用之方式併入本文中)。天然抗體為宿主動物經諸如多肽之抗原免疫後所產生之抗體。
核酸及表現系統
本發明涵蓋編碼抗hPG單株抗體之免疫球蛋白輕鏈及重鏈基因的核酸分子、包含該等核酸之載體、及能夠產生本發明抗hPG單株抗體之宿主細胞。
本發明之抗hPG單株抗體可藉由在宿主細胞中重組表現免疫球蛋白輕鏈及重鏈基因來製備。為重組表現抗體，用攜有編碼抗體免疫球蛋白輕鏈及重鏈之DNA片段的一或多個重組表現載體轉染宿主細胞，以使輕鏈及重鏈在宿主細胞中表現，且視情況分泌至培養宿主細胞之培養基中，可自該培養基中回收該等抗體。使用標準重組DNA方法獲得抗體重鏈及輕鏈基因，將此等基因併入重組表現載體中且將載體引入宿主細胞中，諸如描述於下列文獻中之方法：Molecular Cloning;A Laboratory Manual，第二版(Sambrook,Fritsch及Maniatis(編),Cold Spring Harbor,N. Y.,1989)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,F.M.等人編，Greene Publishing Associates,1989)；及美國專利第4,816,397號。
為產生編碼該等抗hPG單株抗體之核酸，首先獲得編碼輕鏈及重鏈可變區之DNA片段。此等DNA可藉由例如使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增及修飾編碼輕鏈及重鏈可變序列之生殖系DNA或cDNA來獲得。人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列為此項技術中已知(參見例如Lefranc等人，2003,Dev. Comp. Immunol. 27:55-77；Lefranc等人，2009,Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012；Lefranc,2008,Mol. Biotechnol. 40: 101-111；「VBASE」人類生殖系序列資料庫；亦參見Kabat,E.A.等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services,NIH出版號91-3242；Tomlinson等人，1992,J. Mol. Biol. 22T:116-198；及Cox等人，1994,Eur. J. Immunol. 24:827-836；各自內容以引用的方式併入本文中)。
一旦獲得編碼抗hPG單株抗體相關VH及VL區段之DNA片段，該等DNA片段即可藉由標準重組DNA技術進一步操作，例如使該等可變區基因轉化為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操作中，編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接於編碼另一蛋白質(諸如抗體恆定區或可撓性連接子)之另一DNA片段。如此情況下所用之術語「可操作地連接」意欲意謂兩個DNA片段接合以使由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框。
可藉由將編碼VH之DNA可操作地連接於編碼重鏈恆定區(CH1、CH2、CH3及視情況存在之CH4)之另一DNA分子，使分離之編碼VH區之DNA轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知(參見例如Kabat,E.A.等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services,NIH出版號91-3242)，且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但在某些實施例中為IgG1或IgG4恆定區。對於Fab片段重鏈基因而言，編碼VH之DNA可操作地連接於僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。
可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接於編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子，使分離之編碼VL區之DNA轉化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知(參見例如Kabat,E. A.等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版(U.S. Department of Health and Human Services,NIH出版號91-3242))，且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但在某些實施例中為κ恆定區。為形成scFv基因，編碼VH之DNA片段及編碼VL之DNA片段可操作地連接於編碼可撓性連接子(例如編碼胺基酸序列(Gly4~Ser)3(SEQ ID NO:99))之另一片段，以使VH序列及VL序列可表現為連續單鏈蛋白質，其中VL與VH區藉由可撓性連接子接合(參見例如Bird等人，1988,Science 242:423-426；Huston等人，1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty等人，1990,Nature 348:552-554)。
為表現本發明之抗hPG單株抗體，將如上所述獲得之編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA插入表現載體中，以使該等基因可操作地連接於轉錄及轉譯控制序列。在此情況下，術語「可操作地連接」意欲意謂將抗體基因接合至載體中，以使該載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮所預期之調節抗體基因轉錄及轉譯的功能。表現載體及表現控制序列經選擇以與所用表現宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入各別載體中，或更通常地，將兩種基因插入同一表現載體中。
藉由標準方法(例如抗體基因片段及載體上互補限制性位點接合，或若不存在限制性位點則進行鈍端接合)將抗體基因插入表現載體中。在插入抗hPG單株抗體相關輕鏈或重鏈序列之前，表現載體可已攜有抗體恆定區序列。舉例而言，一種將抗hPG單株抗體相關VH及VL序列轉化為全長抗體基因的方法為，將該等序列分別插入已編碼重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中，以使VH區段可操作地連接於載體內之CH區段，且VL區段可操作地連接於載體內之CL區段。或者或另外，重組表現載體可編碼促進抗體鏈自宿主細胞分泌之信號肽。可將抗體鏈基因選殖至載體中，以使信號肽同框連接於抗體鏈基因之胺基端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(亦即非免疫球蛋白之蛋白質的信號肽)。
除抗體鏈基因外，本發明之重組表現載體攜有控制抗體鏈基因在宿主細胞中表現之調節序列。術語「調節序列」意欲包括啟動子、強化子及控制抗體鏈基因轉錄或轉譯之其他表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。該等調節序列描述於例如Goeddel,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185(Academic Press,San Diego,CA,1990)中。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計(包括調節序列之選擇)可視諸如待轉型之宿主細胞的選擇、所需蛋白質之表現量等因素而定。適於哺乳動物宿主細胞表現之調節序列包括指導哺乳動物細胞中蛋白質高量表現之病毒元件，諸如源自細胞巨大病毒(CMV)(諸如CMV啟動子/強化子)、猿病毒40(SV40)(諸如SV40啟動子/強化子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒之啟動子及/或強化子。關於病毒調節元件及其序列之進一步描述，參見例如Stinski之美國專利第5,168,062號、Bell等人之美國專利第4,510,245號及Schaffner等人之美國專利第4,968,615號。
除抗體鏈基因及調節序列以外，本發明之重組表現載體還可攜有其他序列，諸如調節載體在宿主細胞中複製之序列(例如複製起點)及可選擇性標記基因。可選擇性標記基因有助於選擇出已引入載體之宿主細胞(參見例如Axel等人之美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號)。舉例而言，通常可選擇性標記基因使已引入載體之宿主細胞具有藥物(諸如G418、潮黴素(hygromycin)或甲胺喋呤(methotrexate))抗性。適合之可選擇性標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於DHFR-宿主細胞中甲胺喋呤選擇/擴增)及neo基因(用於G418選擇)。對於輕鏈及重鏈之表現，藉由標準技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式均意欲涵蓋常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中之各種技術，例如電穿孔、脂質體轉染、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似技術。
本發明之抗體可在原核或真核宿主細胞中表現。在某些實施例中，抗體在最適宜分泌經適當摺疊且具免疫活性之抗體的真核細胞(例如哺乳動物宿主細胞)中表現。用於表現本發明之重組抗體之例示性哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括描述於Urlaub及Chasin,1980,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中之DHFR- CHO細胞，其與DHFR可選擇性標記一起使用，例如如Kaufman及Sharp,1982,Mol. Biol. 159:601-621中所述)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由將該等宿主細胞培養一段足以使抗體在宿主細胞中表現或抗體分泌至宿主細胞生長之培養基中的時間來產生該等抗體。可使用標準蛋白質純化方法自培養基中回收抗體。宿主細胞亦可用於產生完整抗體之部分，諸如Fab片段或scFv分子。應瞭解上述程序之變化在本發明之範疇內。舉例而言，可能需要用編碼本發明抗hPG單株抗體之輕鏈或重鏈(但非兩者)之DNA轉染宿主細胞。
重組DNA技術亦可用於移除一些或所有編碼非結合hPG所需之輕鏈及重鏈中之任一者或二者的DNA。本發明之抗體亦涵蓋該等截短型DNA分子所表現之分子。
為重組表現本發明之抗hPG單株抗體，可用兩種本發明之表現載體共轉染宿主細胞，第一載體編碼源自重鏈之多肽且第二載體編碼源自輕鏈之多肽。兩種載體可含有相同可選擇性標記，或各自可含有各別可選擇性標記。或者，可使用編碼重鏈與輕鏈多肽之單一載體。
獲得編碼抗hPG單株抗體之一或多個部分的核酸後，可將其他改變或突變引入編碼序列中，例如以產生編碼具有不同CDR序列之抗體、對Fc受體之親和力降低之抗體或不同亞類之抗體的核酸。
本發明之抗hPG單株抗體亦可藉由化學合成(例如藉由Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，1984 The Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.中所述之方法)產生。亦可使用無細胞平台產生變異型抗體(參見例如Chu等人，Biochemia No. 2,2001(Roche Molecular Biologicals))。藉由重組表現產生本發明之抗hPG單株抗體後，可藉由任何此項技術中已知用於純化免疫球蛋白分子之方法來純化，例如藉由層析(例如離子交換、親和力及尺寸排除管柱層析)、離心、差別溶解度或藉由任何其他用於純化蛋白質之標準技術來純化。此外，本發明之抗hPG單株抗體或其片段可融合於本文所述或此項技術中另外已知之異源多肽序列以有助於純化。
分離後，必要時可將抗hPG單株抗體例如藉由高效液相層析(參見例如Fisher,Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology(Work及Burdon編，Elsevier,1980))或藉由在SuperdexTM 75管柱(Pharmacia Biotech AB,Uppsala,Sweden)上進行凝膠過濾層析來進一步純化。
本發明提供能夠產生抗hPG單株抗體之宿主細胞。宿主細胞可為使用重組DNA技術進行工程改造以表現編碼重鏈及輕鏈基因之基因的細胞，或源自適合生物體且經選擇能夠產生所需抗體之融合瘤。用於產生融合瘤之方法為此項技術中已知(參見例如Kohler及Milstein,1975,Nature 256:495)且實例提供於下文中。一般而言，用諸如相關肽之免疫原使諸如小鼠之宿主動物免疫，以引起可產生能夠特異性結合該免疫原之抗體的淋巴細胞(例如脾細胞)形成。或者，可在活體外使分離之淋巴細胞，包括脾細胞、淋巴結細胞或周邊血淋巴細胞免疫。接著使用適合之融合劑(例如聚乙二醇)使淋巴細胞與永生化細胞株(諸如骨髓瘤細胞株)融合，形成融合瘤細胞株。適合之永生化細胞株可來源於哺乳動物，諸如鼠類、牛或人類。接著在任何含有一或多種抑制未融合之永生化細胞生長或存活之物質的適合培養基中培養融合瘤細胞。舉例而言，當使用缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)之親本細胞時，可使融合物在抑制親本末稠合細胞生長之含次黃嘌呤、胺基喋呤(aminopterin)及胸苷之培養基(「HAT」培養基)中生長。
在一實施例中，提供能夠產生重鏈可變區包含SEQ ID NO:12及輕鏈可變區包含SEQ ID NO:13之抗hPG抗體的宿主細胞。在一實施例中，提供能夠產生重鏈可變區包含SEQ ID NO:14及輕鏈可變區包含SEQ ID NO:15之抗hPG抗體的宿主細胞。在一實施例中，提供能夠產生重鏈可變區包含SEQ ID NO:59及輕鏈可變區包含SEQ ID NO:63之抗hPG抗體的宿主細胞。在一實施例中，提供能夠產生重鏈可變區包含SEQ ID NO:60及輕鏈可變區包含SEQ ID NO:64之抗hPG抗體的宿主細胞。在一實施例中，提供能夠產生重鏈可變區包含SEQ ID NO:61及輕鏈可變區包含SEQ ID NO:65之抗hPG抗體的宿主細胞。在一實施例中，提供能夠產生重鏈可變區包含SEQ ID NO:62及輕鏈可變區包含SEQ ID NO:66之抗hPG抗體的宿主細胞。
在一些實施例中，本發明之宿主細胞包含選自以下之核酸：編碼SEQ ID NO:12、14、59、60、61及62之重鏈可變區多肽的核苷酸序列；以及選自以下之核酸：編碼SEQ ID NO:13、15、63、64、65及66之輕鏈可變區多肽的核苷酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區由選自SEQ ID NO:16、18、67、68、69及70之核酸序列編碼。在一些實施例中，輕鏈可變區由選自SEQ ID NO:17、19、71、72、73及74之核酸序列編碼。
本發明亦提供編碼如本文所述之抗hPG單株抗體的聚核苷酸。聚核苷酸可如本文所述或根據此項技術中已知之任何標準技術來製備。在一些實施例中，抗hPG抗體包含由包含選自以下之核苷酸序列的核酸編碼之重鏈可變區：SEQ ID NO:16、18、67、68、69及70。在一些實施例中，抗hPG抗體包含由包含選自以下之核苷酸序列的核酸編碼之輕鏈可變區：SEQ ID NO: 17、19、71、72、73及74。
在一些實施例中，提供編碼人類化抗hPG單株抗體之重鏈可變區的聚核苷酸序列。特定實施例包括編碼具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽的聚核苷酸：SEQ ID NO:21、23、75、77、79、80、82、84、86、88、90、92及94。在一些實施例中，提供編碼人類化抗hPG單株抗體之輕鏈可變區的聚核苷酸序列。特定實施例包括編碼具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽的聚核苷酸：SEQ ID NO:22、24、76、78、81、83、85、87、89、91、93及95。
抗hPG單株抗體之生物活性
本發明之抗hPG單株抗體中和PG活性。如本文所述，PG與CRC腫瘤細胞增殖有關。雖然不欲受任何操作理論限制，但認為抗hPG單株抗體藉由結合PG且阻斷PG與其信號傳導搭配物相互作用的能力來抑制PG依賴性信號轉導。繼而抑制細胞對前胃泌激素之反應，該等反應諸如細胞增殖、細胞分化及/或死亡減少及促進腫瘤生長。由於具有此等活性，所以本發明之抗hPG單株抗體可用於多種活體外、活體內及離體情況以結合PG且阻斷PG依賴性信號傳導。
因此，本發明提供抑制CRC細胞中PG依賴性反應之方法。一般而言，該等方法包含使CRC細胞接觸或暴露於有效抑制CRC細胞增殖及/或存活之量的一或多種本文所述之抗體。可根據用於量測細胞數目、腫瘤數目或腫瘤尺寸隨時間推移之增加的檢定來測定活體外及活體內增殖或其抑制作用。抑制細胞及腫瘤增殖之檢定為此項技術中所熟知。
可如下量測抗hPG單株抗體之中和活性。如下文實例7中所述，將CRC LS174T細胞以每孔約50,000個細胞接種於6孔板中。接著如實例7中所述，用抗體濃度為約5 μg/mL之測試抗PG單株抗體或對照單株抗體以12小時時間間隔處理細胞48小時。若使用雙尾曼-懷特尼檢驗(two-tailed Mann-Whitney test)(當p<0.05時，差異視作具有顯著性)，經測試抗體處理之CRC癌細胞數目與經對照非特異性抗體處理之細胞數目相比，展示存活細胞數目至少10%統計顯著性減少，則測試抗體在該檢定中定義為具有中和性。相對於處理時段開始時(稱作T0)之細胞數目校正總細胞數目。
阻斷PG依賴性信號傳導可藉由增加細胞死亡來抑制CRC細胞存活。可藉由量測活癌細胞數目隨時間推移(例如24或48小時)之減少來測定活體外或活體內CRC細胞存活之抑制。細胞死亡檢定為此項技術中所熟知。另外，本文中提供細胞存活檢定之一實例。
研究進一步表明，抑制CRC腫瘤細胞中PG依賴性信號傳導可藉由引發漸進式細胞死亡或細胞凋亡來抑制CRC細胞存活。可藉由此項技術中已知之任何方式，包括(但不限於)量測具有促細胞凋亡或抗細胞凋亡活性之基因表現的變化來測定對細胞凋亡之誘導作用。舉例而言，促細胞凋亡基因(諸如Bax)之表現隨時間推移(例如48小時)而增加指示細胞凋亡增加。類似地，抗細胞凋亡基因(諸如(但不限於)Bcl-2)之表現隨時間推移(例如72或96小時)而減少指示細胞凋亡增加。用於量測基因表現變化之技術(諸如即時定量PCR)為此項技術中所熟知。參見例如Hollande等人，WO 2007/135542。
抑制前胃泌激素依賴性信號傳導亦會刺激細胞分化。因此，抑制CRC細胞增殖及/或存活之方法包含投與在活體外或活體內有效誘導CRC細胞分化之量的本發明抗hPG單株抗體。可藉由量測細胞分化之遺傳標記(諸如(但不限於)Muc-2或分化腸細胞(例如杯狀細胞)之其他標記)之表現隨時間推移(例如24或48小時)的增加來測定CRC細胞之分化。基因表現變化可藉由此項技術中已知之任何方式來量測。參見例如Hollande等人，WO 2007/135542。表現或阻遏依賴於PG之其他基因(諸如ICAT)亦可使用標準方法來檢定。參見上述。
醫藥組合物
抗PG單株抗體可調配成組合物。視情況，組合物可包含一或多種其他治療劑，諸如下文所述之第二治療劑，本文中提供該等組合物。組合物通常作為常包括醫藥學上可接受之載劑的無菌醫藥組合物之一部分供應。組合物可呈任何適合形式(視向患者投與該組合物所需之方法而定)。本發明之抗hPG單株抗體可藉由多種途徑投與患者，諸如經口、經皮、皮下、鼻內、靜脈內、肌內內、眼內、局部、鞘內及腦室內投與。在任何既定狀況下最適合之投藥途徑將視特定抗體、個體、及疾病性質及嚴重程度以及個體身體情況而定。抗體可調配成水溶液且藉由皮下注射投與。
醫藥組合物宜以每劑量含有預定量之本發明抗hPG單株抗體的單位劑量形式呈現。此類單位劑量可含有例如(但不限於)5 mg至5 g，例如10 mg至1 g或20至50 mg。用於本發明之醫藥學上可接受之載劑可採用各種形式，視例如欲治療之病況或投藥途徑而定。
可藉由將具有所需純度之抗體與此項技術中通常使用的視情況選用之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(在本文中均稱為「載劑」)，亦即緩衝劑、穩定劑、防腐劑、等張劑、非離子型清潔劑、抗氧化劑及其他各種添加劑混合，將本發明之醫藥組合物製備成凍乾調配物或水溶液以供儲存。參見Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(Osol編，1980)。該等添加劑在所用劑量及濃度下對接受者須無毒。
緩衝劑有助於將pH值維持在接近生理條件之範圍內。其濃度可在約2 mM至約50 mM之範圍內。適用於本發明之緩衝劑包括有機酸與無機酸及其鹽，諸如檸檬酸鹽緩衝液(例如檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、丁二酸鹽緩衝液(例如丁二酸-丁二酸一鈉混合物、丁二酸-氫氧化鈉混合物、丁二酸-丁二酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩衝液(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、反丁烯二酸鹽緩衝液(例如反丁烯二酸-反丁烯二酸一鈉混合物、反丁烯二酸-反丁烯二酸二鈉混合物、反丁烯二酸一鈉-反丁烯二酸二鈉混合物等)、葡糖酸鹽緩衝液(例如葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、丁二酸鹽緩衝液(例如丁二酸-丁二酸鈉混合物、丁二酸-氫氧化鈉混合物、丁二酸-丁二酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩衝液(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)及乙酸鹽緩衝液(例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。另外，可使用磷酸鹽緩衝液、組胺酸緩衝液及三甲胺鹽(諸如Tris)。
可添加防腐劑以阻止微生物生長，且其添加量可在0.2%-1%(w/v)範圍內。適用於本發明之防腐劑包括苯酚、苯甲醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯化十八基二甲基苯甲基銨、鹵化苯甲烴銨(benzalconium halide)(例如氯化苯甲烴銨、溴化苯甲烴銨及碘化苯甲烴銨)、氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)及對羥基苯甲酸烷酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇及3-戊醇。
可添加等張劑(有時稱為「穩定劑」)以確保本發明之液體組合物之等張性，且包括多羥基糖醇，例如三羥基或更多羥基糖醇，諸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。穩定劑係指一大類賦形劑，其功能在增積劑至溶解治療劑或幫助防止變性或與容器壁黏著之添加劑的範圍內。典型穩定劑可為多羥基糖醇(上文所列舉)；胺基酸，諸如精胺酸、離胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、丙胺酸、鳥胺酸、L-白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇，諸如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油及其類似物，包括環多醇，諸如肌醇(inositol)；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，諸如脲、麩胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量多肽(例如具有10個殘基或10個殘基以下之肽)；蛋白質，諸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；單醣，諸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；雙醣，諸如乳糖、麥芽糖、蔗糖；及三醣，諸如棉子糖；及多醣，諸如聚葡萄糖。每重量份活性蛋白質可存在0.1至10,000重量之範圍內的穩定劑。
可添加非離子型界面活性劑或清潔劑(亦稱為「濕潤劑」)，以幫助治療劑溶解以及保護治療蛋白質，使蛋白質不因攪動而聚集，該等試劑亦允許調配物暴露於承受應力之剪切表面而不引起蛋白質變性。適合之非離子型界面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、氧化異丙烯多元醇類、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(Tween-20、Tween-80等)。非離子型界面活性劑可在約0.05 mg/ml至約1.0 mg/ml，例如約0.07 mg/ml至約0.2 mg/ml之範圍內存在。
其他各種賦形劑包括增積劑(例如澱粉)、螯合劑(例如EDTA)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素B)及共溶劑。
抗PG單株抗體可單獨投與，以一或多種抗PG單株抗體之混合物形式投與，與其他適用於治療CRC之藥劑混合或組合投與，或輔助其他CRC療法投與。適合組合及輔助療法之實例提供於下文中。
本發明涵蓋含有本發明之抗hPG單株抗體(包括抗體結合物)的醫藥套組。醫藥套組為包含本發明抗hPG單株抗體(例如呈凍乾形式或水溶液形式)以及一或多種以下物質之包裝：
‧　第二治療劑，例如如下文所述之第二治療劑；‧　用於投與抗hPG單株抗體之裝置，例如筆式注射器(pen)、針及/或注射器；及‧　若抗體呈凍乾形式，則包含使抗體再懸浮之醫藥級水或緩衝液。
每一單位劑量之抗hPG單株抗體可單獨封裝，且套組可含有一或多個單位劑量(例如兩個單位劑量、三個單位劑量、四個單位劑量、五個單位劑量、八個單位劑量、十個單位劑量或十個以上單位劑量)。在一特定實施例中，一或多個單位劑量各自放於注射器或筆式注射器中。
有效劑量
本發明之抗PG單株抗體或其組合物通常以有效達成預期結果之量，例如有效治療有需要之個體的CRC之量使用。包含抗hPG單株抗體之醫藥組合物可以治療有效劑量投與患者(例如人類個體)。如本文所用之「治療有效」劑量為賦予治療效益之量。在CRC療法之情況下，治療效益意謂CRC之任何改善，包括以下任一者或組合：制止或減緩CRC進展(例如制止或減緩結腸直腸癌自一階段進展至下一階段)、制止或延遲CRC症狀或體征加重或惡化、降低CRC嚴重程度、促使CRC緩解、抑制CRC腫瘤細胞增殖、CRC腫瘤尺寸或CRC腫瘤數目、或降低PG血清含量。所投抗PG單株抗體之量將視多種因素而定，包括所治療之CRC的性質及階段、投藥形式、途徑及部位、治療方案(例如是否使用第二治療劑)、所治療之特定個體之年齡及情況、所治療患者對抗PG單株抗體之敏感性。適合劑量可易於由熟習此項技術者來確定。最終，醫師將確定欲使用之適合劑量。此給藥可重複適合次數。若產生副作用，則可根據正常臨床實踐改變或降低給藥之量及/或頻率。適當劑量及治療方案可藉由使用熟習此項技術者已知之習知技術監測療法進展來確定。
有效劑量最初可由活體外檢定估計。舉例而言，用於動物之初始劑量可經制定以達成抗PG單株抗體之循環血液或血清濃度等於或高於如活體外所量測之該抗體對前胃泌激素之結合親和力。熟習此項技術者完全能夠在考慮特定抗體之生體可用率下計算達成該等循環血液或血清濃度之劑量。關於指導，讀者請參見Fingl及Woodbury,「General Principles」,Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics，第1章，最新版，Pagamonon Press及其中引用之參考文獻。
初始劑量可自活體內資料(諸如動物模型)來估計。適用於測試化合物治療CRC之功效的動物模型為此項技術中所熟知。另外，CRC動物模型描述於下文實例中。一般技術者可按常規修改該資訊以確定適用於人類投藥之劑量。
本發明抗hPG單株抗體之有效劑量可在每單次(例如單次劑量)投藥、多次投藥或連續投藥約0.001 mg/kg至約75 mg/kg之範圍內，或每單次(例如單次劑量)投藥、多次投藥或連續投藥達成0.01-5000 μg/ml血清濃度之血清濃度，或為其中任何有效範圍或值，視所治療之病況、投藥途徑、及個體年齡、體重及情況而定。在某一實施例中，各劑量可在每公斤體重約0.5 μg至約50 μg之範圍內，例如每公斤體重約3 μg至約30 μg之範圍內。
投藥之量、頻率及持續時間將視多種因素而定，諸如患者年齡、體重及疾病病況。投藥之治療方案可持續2週至無限期、2週至6個月、3個月至5年、6個月至1或2年、8個月至18個月或其類似時間。視情況，治療方案提供重複投藥，例如每日一次、每日兩次、每兩天一次、每三天一次、每五天一次、每週一次、每兩週一次或每月一次。重複投藥之劑量可為相同或不同的。投藥可重複一次、兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或十次以上。治療有效量之抗hPG單株抗體可以單次劑量投與，或歷經治療方案之時程投與，例如經一週、兩週、三週、一個月、三個月、六個月、一年或更長之時程投與。
治療方法
本發明之抗hPG單株抗體阻斷PG依賴性反應(包括細胞增殖)之能力使其適用於治療結腸直腸癌。因此，在另一態樣中，本發明提供治療有需要之患者之CRC的方法。一般而言，該等方法包含向患者投與治療有效量之本發明抗hPG單株抗體。
投與本發明抗hPG單株抗體之「個體」或「患者」較佳為哺乳動物，諸如非靈長類動物(例如母牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類動物(例如猴或人類)。個體或患者可為人類，諸如成人患者或兒科患者。
適於抗hPG單株抗體療法之患者為經診斷患有CRC之患者。CRC可為任何類型且處於任何臨床階段或表現。適合之個體包括患有CRC腫瘤(可手術或不可手術)之患者、腫瘤已手術移除或切除之患者、患有包含攜有致癌基因(諸如RAS或APC)突變之細胞的CRC腫瘤之患者、已接受或正接受與抗hPG單株抗體療法組合或輔助抗hPG單株抗體療法之其他CRC療法的患者。其他CRC療法包括(但不限於)化學治療、放射療法、手術切除及以一或多種其他治療性抗體進行治療，如下文所詳述。
抗hPG抗體療法可組合或輔助一或多種其他治療。其他治療如本文所述包括(但不限於)化學治療、放射療法、手術切除及抗體療法。
抗hPG單株抗體療法可輔助其他治療，包括手術切除。如本文所提供之組合療法包含向患者投與至少兩種藥劑，第一種為本發明之抗hPG單株抗體，且第二種為第二治療劑。抗hPG單株抗體與第二治療劑可同時、依次或各別投與。
若在同一日，例如在同一次患者就診期間向該患者投與本發明之抗hPG單株抗體及第二治療劑，則如本文所用，稱兩者依次投與。依次投藥之間可相隔1、2、3、4、5、6、7或8小時。相反，若不在同一日向患者投與本發明之抗hPG單株抗體及第二治療劑，例如以1天、2天或3天、1週、2週或每月之時間間隔投與本發明之抗hPG單株抗體及第二治療劑，則稱兩者各別投與。在本發明方法中，可在投與第二治療劑之前或之後投與本發明抗hPG單株抗體。作為非限制性實例，可同時投與本發明抗hPG單株抗體及第二治療劑一段時間，接著交替投與本發明抗hPG單株抗體與第二治療劑第二段時間。
本發明之組合療法可產生大於累加效應之效應或協同效應，所提供之治療效益為抗hPG單株抗體或第二治療劑以治療有效量單獨投與下所無法達成的。因此，該等藥劑可以較低量投與，減小不利影響之可能性或嚴重程度。第二治療劑可為化學治療劑。化學治療劑包括(但不限於)放射性分子、毒素(亦稱作細胞毒素或細胞毒性劑，其包括任何損害細胞活力之藥劑)、藥劑及含有化學治療化合物之脂質體或其他微脂粒。適合化學治療劑之實例包括(但不限於)1-脫氫睪固酮、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、胺烯咪胺(decarbazine)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、放線菌素D(actinomycin D)、阿德力黴素(adriamycin)、阿地介白素(aldesleukin)、烷基化劑、別嘌醇鈉(allopurinol sodium)、六甲蜜胺(altretamine)、胺磷汀(amifostine)、阿那曲唑(anastrozole)、胺茴黴素(anthramycin，AMC)、抗有絲分裂劑、順-二氯二胺鉑(II)(DDP)(順鉑(cisplatin))、二胺基二氯鉑、蒽環黴素(anthracycline)、抗生素、抗代謝物、天冬醯胺酶、活BCG(膀胱內)、倍他米松磷酸鈉(betamethasone sodium phosphate)及醋酸倍他米松、比卡魯胺(bicalutamide)、硫酸博萊黴素(bleomycin sulfate)、白消安(busulfan)、甲醯四氫葉酸鈣(calcium leucouorin)、刺孢黴素(calicheamicin)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、順鉑、克拉曲濱(Cladribine)、秋水仙鹼(Colchicin)、結合雌激素、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、環硫磷醯胺(Cyclothosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、細胞遲緩素B(cytochalasin B)、癌得星(Cytoxan)、達卡巴嗪(Dacarbazine)、更生黴素(Dactinomycin)、更生黴素(先前稱作放線菌素)、鹽酸柔紅黴素(daunirubicin HCL)、檸檬酸柔紅黴素、地尼介白素-毒素連接物(Denileukin diftitox)、右雷佐生(dexrazoxane)、二溴甘露醇、二羥炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、多烯紫杉醇(Docetaxel)、甲磺酸多拉司瓊(dolasetron mesylate)、鹽酸小紅莓(doxorubicin HCL)、屈大麻酚(dronabinol)、大腸桿菌L-天冬醯胺酶、吐根素(emetine)、依泊汀-α(epoetin-α)、伊文氏桿菌屬L-天冬醯胺酶(Erwinia L-asparaginase)、酯化雌激素、雌二醇、雌莫司汀磷酸鈉(estramustine phosphate sodium)、溴化乙錠(ethidium bromide)、炔雌醇(ethinyl estradiol)、依替膦酸鹽(etidronate)、依託泊苷(etoposide)、嗜橙菌因子(citrororum factor)、磷酸依託泊苷、非格司亭(filgrastim)、氟尿苷(floxuridine)、氟康唑(fluconazole)、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)、氟尿嘧啶、氟他胺(flutamide)、醛葉酸(folinic acid)、鹽酸吉西他濱(gemcitabine HCL)、糖皮質激素、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、短桿菌素D(gramicidin D)、鹽酸格拉司瓊(granisetron HCL)、羥基脲、鹽酸黃膽素(idarubicin HCL)、異環磷醯胺(ifosfamide)、干擾素α-2b、鹽酸伊立替康(irinotecan HCL)、來曲唑(letrozole)、甲醯四氫葉酸鈣、醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、鹽酸左旋咪唑(levamisole HCL)、利多卡因(lidocaine)、洛莫司汀(lomustine)、類美登素(maytansinoid)、鹽酸氮芥(mechlorethamine HCL)、醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、鹽酸美法侖(melphalan HCL)、巰基嘌呤(mercaptipurine)、美司鈉(mesna)、甲胺喋呤、甲基睪固酮(methyltestosterone)、光神黴素(mithramycin)、絲裂黴素C(mitomycin C)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、尼魯米特(nilutamide)、醋酸奧曲肽(octreotide acetate)、鹽酸昂丹司瓊(ondansetron HCL)、奧賽力鉑(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸二鈉(pamidronate disodium)、噴司他丁(pentostatin)、鹽酸匹魯卡品(pilocarpine HCL)、吡利黴素(plimycin)、聚苯丙生20(polifeprosan 20)與卡莫司汀植入物、卟吩姆鈉(porfimer sodium)、普魯卡因(procaine)、鹽酸丙卡巴肼(procarbazine HCL)、普萘洛爾(propranolol)、利妥昔單抗(rituximab)、沙格司亭(sargramostim)、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、他莫西芬(tamoxifen)、紫杉醇(taxol)、喃氟啶(tegafur)、替尼泊甙(teniposide)、特諾波賽(tenoposide)、睾內酯(testolactone)、四卡因(tetracaine)、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、硫鳥嘌呤、噻替派、鹽酸拓朴替康(topotecan HCL)、檸檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、維甲酸(tretinoin)、戊柔比星(valrubicin)、硫酸長春鹼(vinblastine sulfate)、硫酸長春新鹼(vincristine sulfate)及酒石酸長春瑞濱(vinorelbine tartrate)。
本文所揭示之抗hPG單株抗體可投與需要治療結腸直腸癌且正接受化學治療劑組合之患者。例示性化學治療劑組合包括5-氟尿嘧啶(5FU)與甲醯四氫葉酸(醛葉酸或LV)組合；卡培他濱與尿嘧啶(UFT)及甲醯四氫葉酸組合；喃氟啶與尿嘧啶(UFT)及甲醯四氫葉酸組合；奧賽力鉑與5FU組合或與卡培他濱組合；伊立替康與卡培他濱組合；絲裂黴素C與5FU、伊立替康或卡培他濱組合。亦可使用本文所揭示之化學治療劑的其他組合。
如相關技術中所知，使用不同化學治療劑之組合治療結腸直腸癌的化學療法方案在臨床試驗中已標準化。該等方案常以首字母縮寫為人知曉，且包括梅奧5FU(5FU Mayo)、羅茲韋爾帕克5FU(5FU Roswell Park)、LVFU2、FOLFOX、FOLFOX4、FOLFOX6、bFOL、FUFOX、FOLFIRI、IFL、XELOX、CAPOX、XELIRI、CAPIRI、FOLFOXIRI。參見例如Chau,I.等人，2009,Br. J. Cancer 100:1704-19及Field,K.等人，2007,World J. Gastroenterol. 13:3806-15，兩者皆以引用的方式併入本文中。抗hPG單株抗體亦可與其他治療性抗體組合。因此，抗hPG單株抗體療法可組合或輔助不同單株抗體投與，該不同單株抗體諸如(但不限於)抗EGFR(EGF受體)單株抗體或抗VEGF單株抗體。抗EGFR抗體之特定實例包括西妥昔單抗(cetuximab)及帕尼單抗(panitumumab)。抗VEGF抗體之一特定實例為貝伐單抗(bevacizumab)。
使用抗hPG抗體偵測前胃泌激素
抗PG單株抗體亦適於依賴於PG偵測之應用，諸如診斷CRC或監測治療對個體CRC之作用。因此，在一態樣中，本發明提供一種診斷患者之結腸直腸癌的方法，其包含使用本發明之抗hPG單株抗體測定來自患者之樣品中前胃泌激素之量。一般而言，診斷患者之結腸直腸癌的方法包含使用本發明之抗hPG單株抗體量測自患者獲得之樣品中的前胃泌激素，其中在樣品中量測到20 pM至400 pM之前胃泌激素指示患有結腸直腸癌。可在例如血液、血清、血漿、組織及/或細胞之樣品中量測前胃泌激素。可使用此項技術中已知及/或本文所述之檢定，諸如ELISA、夾心ELISA、免疫墨點法(西方墨點法)、免測沈澱法、BIACORE技術及其類似技術偵測hPG。
如本文所述，前胃泌激素僅為由轉譯後加工胃泌激素基因產物所產生之多種不同多肽之一。與其他胃泌激素基因產物(包括降解產物)相對比，本發明之診斷性檢定特異性偵測hPG。因此，在特定實施例中，使用如本文所揭示之ELISA偵測hPG，其中使用兩種分別靶向hPG之 N端及C端的hPG抗體。在一些實施例中，用於偵測之兩種抗體之一為抗hPG單株抗體。對於夾心ELISA，使用兩種識別處於前胃泌激素之不同末端處之抗原決定基的抗體，其中至少一種抗體為如本文所揭示之抗hPG單株抗體。hPG含量在20 pM至400 pM之範圍內指示患有結腸直腸癌。一般而言，使用抗hPG單株抗體測定hPG含量之程序如下。準備已知量之針對hPG之第一「捕捉」抗體所結合的表面，諸如96孔板中之各孔。捕捉抗體可為例如與hPG之C端或N端結合之抗hPG抗體。阻斷後，將測試樣品塗覆於表面，隨後培育一段時間。接著洗滌表面以移除未結合之抗原，且塗覆含有針對hPG之第二「偵測」抗體的溶液。偵測抗體可為本文所述之任何抗hPG單株抗體，限制條件為偵測抗體與捕捉抗體所結合之抗原決定基不同。舉例而言，若捕捉抗體結合hPG之C端肽區域，則適合偵測抗體將為結合hPG之N端肽區域的抗體。接著可直接(例如偵測抗體結合於可偵測標記)或間接(經由結合偵測抗hPG抗體之標記之二次抗體)偵測前胃泌激素含量。
在一特定實施例中，如下量測測試樣品中之hPG含量。用0.5 μg/mL至10 μg/mL之兔C端抗hPG多株抗體塗佈96孔微量滴定板，且培育隔夜。接著以PBS-Tween(0.05%)洗滌各板三次，且用含2%(w/v)脫脂奶粉之PBS-Tween(0.05%)阻斷。在適合稀釋劑(例如PBS-Tween 0.05%)中各別製備測試樣品、對照樣品(空白或PG陰性血漿或血清樣品)及約5 pM(0.5×10-11 M)至約0.1 nM(1×10-10 M)之hPG參考標準品(於PG陰性血漿或血清中稀釋之凍乾hPG)。在37℃下於經塗佈之培養板上培育樣品2至4小時，或在21℃下培育12至16小時。培育後，用PBS-Tween(0.05%)洗滌各板三次，且在21℃下與0.001 μg/mL至0.1 μg/mL偶合於辣根過氧化酶(HRP)之如本文所述之N端抗hPG單株抗體(Nakane等人，1974,J. Histochem. Cytochem. 22(12): 1084-1091)一起培育30分鐘。接著以PBS-Tween(0.05%)洗滌各板三次，且在21℃下添加HRP受質，歷時15分鐘。藉由添加100 μL 0.5M硫酸停止反應，且在405 nm下量測光密度。藉由與根據自hPG參考標準品獲得之量測值所建立之標準曲線相比較來測定測試樣品之hPG含量。
通常基於侵入性程序，諸如對生檢組織之組織學評定以及如結腸鏡檢查之其他侵入性程序來診斷患者。CRC分為5個如下範圍內之階段：第0階段(癌症侷限於結腸或直腸最內層)、第1階段(癌症處於結腸或直腸之內壁中)、第2階段(癌症延伸穿過結腸壁但未在相鄰淋巴結中發現)、第3階段(癌症在結腸或直腸周圍之淋巴結及組織中發現)及第4階段(癌症已傳播至身體其他部分)。根據組織學觀點，結腸直腸腫瘤以自良性生長物至侵襲性癌症範圍內的多種贅瘤形式存在，且主要為上皮源性腫瘤(亦即腺瘤或腺癌)。病變可分為三組：非贅生性息肉、贅生性息肉(腺瘤性息肉、腺瘤)及癌症。腺瘤性息肉為可進行惡性轉化之良性腫瘤，且已分為三種組織學類型，按惡性潛能遞增為管狀型、管狀絨毛狀型及絨毛狀型。腺癌亦可根據其組織學分為黏液(膠樣)腺癌、印戒細胞腺癌、硬性腫瘤及神經內分泌腫瘤。
與當前用於診斷CRC之方式相反，本發明提供在不存在任何組織學分析或疾病分期下基於對可自血液樣品測定之hPG含量的量測來診斷患有CRC之個體的方法。此外，本發明之方法適用於選擇適於抗hPG單株療法的CRC患者，不管診斷患者之方式如何。
血清PG含量亦適用於評定CRC治療之功效。因此，本發明提供一種監測結腸直腸癌療法之功效的方法，其包含測定正治療CRC之患者體內的PG含量。監測結腸直腸癌療法之功效的方法包含使用本發明之抗PG單株抗體重複測定正治療結腸直腸癌之結腸直腸癌患者體內的hPG含量，其中患者循環hPG含量隨治療時段推移而降低指示具有治療功效。舉例而言，可對患者循環hPG含量進行首次量測，隨後在患者接收結腸直腸癌治療時或之後進行第二次量測。接著比較兩次量測，且hPG含量降低指示具有治療效益。
在一態樣中，本發明提供含有抗hPG單株抗體(包括抗體結合物)之診斷套組。診斷套組為包含至少一種本發明抗hPG單株抗體(例如呈凍乾形式或水溶液形式)及一或多種適用於進行診斷性檢定之試劑(例如稀釋劑、結合於抗hPG單株抗體之標記抗體、標記抗體之適合受質、呈適用作陽性對照及參考標準品、陰性對照形式之hPG)的包裝。在特定實施例中，套組包含兩種抗hPG抗體，其中至少一種抗體為抗hPG單株抗體。視情況，第二抗體為多株抗hPG抗體。在一些實施例中，本發明之套組包含如本文所述之N端抗hPG單株抗體。
抗hPG抗體可如上文所述來標記。或者，套組可包括結合抗hPG單株抗體且結合於酶之標記抗體。若抗hPG單株抗體或其他抗體結合於用於偵測之酶，則套組可包括該酶所需之受質及輔因子(例如提供可偵測發色團或螢光團之受質前驅體)。另外，可包括其他添加劑，諸如穩定劑、緩衝劑(例如阻斷緩衝液或裂解緩衝液)及其類似試劑。診斷套組中所包括之抗hPG單株抗體可固定於固體表面上，或者套組中包括可固定抗體之固體表面(例如載片)。各種試劑之相對量可廣泛變化，以提供使檢定靈敏度實質上最佳之試劑溶液濃度。抗體及其他試劑可(個別或組合地)以乾粉(通常凍乾)形式提供，包括使乾粉在溶解後即提供具有適當濃度之試劑溶液的賦形劑。
套組可包括含有關於實施診斷方法之說明(例如方案)的指導材料。雖然指導材料通常包含書寫或印刷材料，但其不限於該等材料。本發明涵蓋能夠儲存該等說明且將其傳達至最終使用者之媒體。該等媒體包括(但不限於)電子儲存媒體(例如磁碟、磁帶、盒式磁帶、晶片)、光學媒體(例如CD ROM)及其類似媒體。該等媒體可包括提供該等指導材料之網際網路網站的位址。
實例
下列實例為說明性的，且不欲為限制性的。
實例1：產生針對前胃泌激素之單株抗體
人類前胃泌激素之免疫原
產生若干免疫原以形成可產生針對人類前胃泌激素之單株抗體的融合瘤。先前用於產生之多株抗體的抗原，諸如全長人類前胃泌激素及基於hPG之殘基70至80之免疫原，無法引起單株免疫反應或產生PG特異性單株抗體。如下文更詳細描述，在蛋白質之N端與C端任一者處包括hPG獨有之序列的具有14個及14個以上胺基酸之抗原能夠在動物體內誘導充足免疫反應且用於形成可產生超過20種針對hPG之不同單株抗體的融合瘤。意外地，包括hPG之殘基55至80的若干免疫原(其中一些亦在其他源自胃泌激素基因之肽中發現)成功地用於產生對hPG具有特異性之單株抗體。下表總結所測試之免疫原。
表2中所列之免疫原係根據此項技術中已知之技術，使用肽序列及連接子之化學合成，接著使用適當交聯劑(例如MBS(間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-氫丁二醯亞胺酯)、戊二醛或磺基-SMCC(4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸磺基丁二醯亞胺酯))交聯於BSA、KLH或DT運載體來製備(Coligan JE等人，Current protocols in Immunology，第2卷，New York: John Wiley and Sons;1996，第9.0.1-9.0.15頁；Harlow DL. Antibodies: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory;1998，第72-87頁)。所用連接子為偶合於半胱胺酸殘基之一或兩個胺基己酸(Ahx)殘基。
在各三個實驗中，對於N端免疫原，注射Balb/c小鼠4至5次，且對於C端免疫原，注射2至4次。各次注射投與10 μg免疫原及Ribi、Alun或弗氏佐劑(Freund's adjuvant)。
細 胞融合及融合瘤篩檢
藉由ELISA針對免疫原測試各小鼠之血清且自具有最強烈免疫反應之小鼠獲得脾細胞。使用聚乙二醇將脾細胞與Sp2骨髓瘤細胞融合，且以每孔15,000至35,000個細胞之密度接種於96孔板中。使用含有次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷之培養基(HAT培養基)選擇融合細胞。
藉由ELISA篩檢能夠結合免疫原及全長前胃泌激素之融合瘤的上清液。進行三輪篩檢以確保僅選擇穩定產生可識別全長hPG及免疫原之抗體的融合瘤。
使用如下所述之ELISA技術篩檢融合瘤及單株抗體以確定結合於不同PG肽。此方案係用於篩檢融合脾細胞、第一及第二輪亞純系之PG結合，以及證實與其他源自胃泌激素基因之肽相比，抗體對PG具有特異性。
簡言之，在4℃下將96孔板以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中適當濃度之測試肽培育隔夜，之後用洗滌溶液(PBS及0.1% Tween-20)洗滌各孔三次，且在22℃下與每孔100 μL阻斷溶液(PBS、0.1% Tween-20、0.1%牛血清白蛋白或酪蛋白水解物)一起培育2小時。阻斷後，洗滌各孔三次且添加一次抗體，即欲檢定之抗體。為開始篩檢稠合脾細胞，將欲檢定之各培養物之50 μL培養物上清液添加至板中各孔中。在對單株抗體進行之檢定中，將100 μL含測試抗體之PBS及0.1% Tween-20添加至各孔中。接著在22℃下培育各板2小時，之後棄去一次抗體溶液且在洗滌步驟(3×100 μL如上所述之洗滌溶液)後用含有二次抗體之阻斷溶液替換，該二次抗體結合一次抗體且偶合於酶。二次抗體為偶合於辣根過氧化酶之山羊抗小鼠IgG(Fc)抗體。用二次抗體培育1小時後，向各孔中添加100 μL受質溶液(例如Fast OPD或鄰苯二胺二鹽酸鹽，得自Sigma-Aldrich Co.，根據製造商之說明書製備)且在暗處於22℃下培育20分鐘。接著藉由添加50 μL 4N硫酸停止反應，且藉由在492 nm下量測光密度(O.D.)來測定催化之受質之量。受質轉化率與結合於抗原之一次(測試)抗體之量成比例。實驗進行一式兩份且繪製OD量測值隨抗原或抗體濃度而變之曲線，視實驗目的而定。若所量測之O.D.介於0.2與1.5之間，則將樣品評定為對抗PG抗體呈陽性。使用相同O.D.等級來鑑別結合用於接種測試動物之免疫原性肽的抗體。
用於檢定中之例示性物質及試劑如下：
用於篩檢融合瘤及單株抗體之例示性肽如下：
重組人類前胃泌激素如McQueen等人，2002,J. Protein Chem. 21: 465-471中所述來製備，其中進行少量修改。簡言之，用在PGEX-GST-TEV主鏈中含有全長人類前胃泌激素序列之載體(GE Healthcare)使BL21 DE3 Star細菌細胞(InVitrogen)轉型。細菌在含有0.5 mM IPTG之LB培養基中於37℃下生長3小時。使用法式壓碎機(French Press)使細菌集結塊破裂，且藉由離心來分離溶解部分與不溶解部分。此後，使用麩胱甘肽親和管柱分離經GST標記之hPG，且用菸草蝕紋病毒NIa(TEV)蛋白酶使PG與GST裂解。最終，PG針對最終緩衝液(10 mM Hepes，0.5%BSA，pH 7.4)透析。
首先選殖融合瘤，接著進行次選殖且擴增。基於下列準則選擇陽性融合瘤：(1)PG及免疫原特異性，(2)相對抗體親和力，(3)融合瘤細胞生長，(4)抗體分泌，及(5)融合瘤之單株性。檢定及選擇準則如下。
對於特異性，藉由如上所述之ELISA檢定測試融合瘤之上清液(上清液於檢定培養基PBS中之50 μL 1:2稀釋液)。若在使用hPG或用於接種測試小鼠之免疫原的檢定中，O.D.量測值介於0.2與1.5之間，則融合瘤評定為陽性。作為特異性之另一準則，可基於缺乏與其他源自胃泌激素基因之肽的結合來選擇純系。缺乏結合係量測為來自測試孔之信號與來自僅含有PBS之對照孔的平均信號之間不存在統計顯著性差異。
為表徵親和力，如上所述，藉由ELISA檢定抗體之連續稀釋液與hPG之結合。檢定中所用之N端抗體標準稀釋液為0 ng/ml、0.1 ng/ml、0.3 ng/ml、1 ng/ml、3 ng/ml、10 ng/ml、30 ng/ml、100 ng/ml。檢定中所用之C端抗體標準稀釋液為0 ng/ml、0.03 ng/ml、0.1 ng/ml、0.3 ng/ml、1 ng/ml、3 ng/ml、10 ng/ml、30 ng/ml。
由在接種兩天後進行顯微鏡觀測來評定融合瘤細胞在多輪連續培養後之生長情況。細胞預期在接種後增殖且經48小時填滿該孔。進行連續稀釋(通常首先以1:5稀釋，隨後以1:10進一步稀釋至少2次)，隨後在第48小時進行顯微鏡觀測以確定生長充分。稀釋滿足此準則之融合瘤細胞且再接種，以待在48小時後顯微鏡下觀測。重複「稀釋-接種-觀測」循環3次，之後融合瘤評定為滿足「生長」準則。
藉由如上所述使用hPG對無細胞上清液之連續稀釋液(1/2、1/20、1/200、1/500、1/1000、1/2000)進行ELISA來測試抗體分泌。
藉由將純系或融合瘤以0.6個細胞/孔之密度接種於96孔板中且培育兩週來測定單株性。2週後，藉由ELISA檢定上清液之hPG結合，且基於至少90%含活細胞孔具有一致OD值來確定群體之純系性質。
針對全長前胃泌激素之單株抗體
用重組人類前胃泌激素(上文所述)接種三隻小鼠中之每一者。免疫原無法在小鼠體內引起任何可偵測之免疫反應：使用如上文所述之ELISA未偵測到與PG之結合。未進行融合。
針對前胃泌激素之N端單株抗體
如上所述，N端單株抗體係針對含有hPG之殘基1至14的抗原產生，該等殘基1至14藉助於該具有14個殘基之抗原(SWKPRSQQPDAPLG-Ahx-Cys(SEQ ID NO:26))之C端上之Ahx-Cys連接子連接於牛血清白蛋白(BSA)或匙孔螺血氰蛋白(KLH)。
在第一個實驗中，用連接BSA之N端肽接種三隻小鼠。在用來自三隻小鼠中之兩者的脾細胞進行之三次融合中，一融合未產生展示與PG或免疫原結合之純系。在其他兩次於96孔板中接種之融合中，一融合產生4種與PG結合且對PG具有特異性之融合瘤，自該等融合瘤中回收單一穩定之產生IgG之次純系。第二融合亦產生單一穩定之產生IgG1、結合PG且對PG具有特異性之融合瘤次純系。總體上，三隻小鼠中，17個第一輪融合瘤或0.74%所篩檢之融合瘤對與PG及免疫原之結合呈陽性，其中9個陽性細胞株經次選殖，9個陽性細胞株中有兩者為產生IgG之陽性細胞株。因此，第一個實驗在幾輪次選殖後產生兩個對免疫原及hPG保持強烈陽性信號(對「PG結合」呈陽性)且不結合其他源自胃泌激素基因之肽(對「PG特異性」呈陽性)的純系：融合瘤43B9G11及WE5H2G7，其分別產生抗hPG MAb1及抗hPG MAb 2。
在第二個實驗中，用連接KLH之N端肽接種小鼠。用Sp2骨髓瘤細胞進行兩次融合。此等融合中，僅一融合產生對PG及免疫原呈陽性且亦對PG具有特異性之純系。自此，接種1920個融合瘤。多個融合瘤經測試對免疫肽而非前胃泌激素呈陽性，或對PG無特異性。特定而言，297個融合瘤對免疫肽展示強烈陽性信號(約1920之15.5%)，其中124個融合瘤亦對前胃泌激素結合呈陽性(6.5%)。36個或1.8%之融合瘤對前胃泌激素而非所用之免疫原呈陽性。1920個所接種之融合瘤中僅12個融合瘤產生特異性結合前胃泌激素而非其他胃泌激素基因產物之抗體(總融合瘤之0.6%，在首次篩檢時對肽及/或前胃泌激素呈陽性之純系的3.6%)。在12個所選純系中，僅2個純系足夠穩定地形成永久純系且冷凍以供長期儲存。因此，在此第二個實驗中，在所接種之近2000個融合瘤中，僅回收2個分別產生抗hPG MAb3及MAb4之純系，即6B5B11C10(產生抗hPG MAb 3)及20D2C3G2(產生抗hPG MAb4)，其表現能夠結合hPG及免疫肽且對前胃泌激素之特異性超過其他胃泌激素基因產物且對hPG具有高親和力的單株抗體。兩個例示性抗體皆具有IgG1同型。
在第三個實驗中，用與第二個實驗中相同之免疫原接種小鼠。將來自免疫反應最強烈之兩隻小鼠的脾細胞與Sp2骨髓瘤細胞融合。接種來自融合之融合瘤(每隻小鼠每一次融合產生3840個融合瘤)且測試上清液之PG及免疫原結合情況以及PG特異性。各融合中，6個融合瘤展示PG特異性，自此6個融合瘤中選擇3個滿足針對生長、單株性、抗體分泌、相對親和力之進一步選擇之次純系。因此，總體上，2.9%之接種後經測試之融合瘤(220/7680)對PG及免疫原呈陽性，其中0.15%為陽性純系(12/7680)，最終回收之次純系佔所接種之初始融合瘤之0.15%(6/7680)。此實驗產生融合瘤1E9A4A4(產生抗hPG MAb 15)、1E9D9B6(產生抗hPG MAb 16)、1C8D10F5(產生抗hPG MAb 17)、1A7C3F11(產生抗hPG MAb 18)、1B3B4F11(產生抗hPG MAb 19)及1C11F5E8(產生抗hPG MAb 20)。
下表展示各實驗所接種之純系數目、所用免疫原以及產生識別免疫原與全長前胃泌激素之單株抗體之融合瘤的數目及百分比。
針對前胃泌激素之C端單株抗體
C端單株抗體係針對含有hPG之殘基55至80的抗原產生，該等殘基55至80藉助於該具有26個殘基之抗原(Cys-Ahx-Ahx-QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN(SEQ ID NO:96))之N端上之Cys-Ahx-Ahx連接子連接於匙孔螺血氰蛋白(KHL)或白喉毒素(DT)。試圖用僅含有hPG之殘基70至80(即Cys-Ahx-Ahx-FGRRSAEDEN(SEQ ID NO:97))結合於BSA或KLH的較小抗原產生融合瘤，但並不能產生任何純系。
進行三個實驗。在前兩個實驗中，使用較短之肽，未回收到次純系。特定而言，在第一個實驗中，向4隻小鼠注射連接於BSA之對應於SEQ ID NO:97之C端肽。無融合產生任何產生IgG之融合瘤。在第二個實驗中，向6隻小鼠注射在N端處連接於KLH之對應於SEQ ID NO:97之肽或在C端處連接於KLH之對應於SEQ ID NO:97之肽，每種肽各注射三隻小鼠。對於第一種免疫原，進行融合且回收融合瘤，但未分離出對PG結合及PG特異性呈陽性之次純系。對於第二種免疫原，小鼠中無一者產生免疫反應且未進行融合。
在第三個實驗中，使用包括非hPG所獨有之C端序列的具有26個胺基酸之肽。將包括對應於SEQ ID NO:96之肽連接於KLH或DT的免疫原注射至小鼠體內。將來自反應最強烈之兩隻小鼠的脾細胞與Sp2骨髓瘤細胞融合。自每隻小鼠之一次融合中接種3840個融合瘤。總體上，在所篩檢之7680個融合瘤中，382個(5%)融合瘤對PG呈陽性且對PG具有特異性，回收13個(0.17%)穩定之陽性次純系：1B4A11D11(產生抗hPG MAb 5)、1B6A11F2(產生抗hPG MAb 6)、1B11E4B11(產生抗hPG MAb 7)、1C10D3B9(產生抗hPG MAb 8)、D8F5B3(產生抗hPG MAb 9)、1E1C7B4(產生抗hPG MAb 10)、2B4C8C8(產生抗hPG MAb 11)、2B11E6G4(產生抗hPG MAb 12)、2C6C3C7(產生抗hPG MAb 13)、2H9F4B7(產生抗hPG MAb 14)、1F11F5E10(產生抗hPG MAb 21)、1F11F5G9(產生抗hPG MAb 22)及1A11F2C9(產生抗hPG MAb 23)。
下表展示各實驗所接種之純系數目、所用免疫原、所篩檢之融合瘤數目、產生與PG及免疫原結合且在三輪次選殖後具有PG特異性並滿足選擇準則(生長、單株性、相對親和力等)之單株抗體的融合瘤之數目及百分比。
單株抗體及產生其之穩定融合瘤詳述於下表中：
融合瘤細胞株1B4A11D11(MAb 5，註冊號CNCM I-4371)、1B6A11F2(MAb 6，註冊號CNCM I-4372)、1B11E4B11(MAb 7，註冊號CNCM I-4373)、2B4C8C8(MAb 11，註冊號CNCM I-4374)、2B11E6G4(MAb 12，註冊號CNCM I-4375)及1E9A4A4(MAb 15，註冊號CNCM I-4376)係根據達佩斯協定(Treaty of Budapest)寄存且於2010年10月6日由國家微生物菌種保藏(Collection Nationale de Cultures de Microorganisms，CNCM)(Institut Pasteur,Paris,France)接收。
抗hPG單株抗體之選殖及測序
由融合瘤產生之單株抗體可使用熟習此項技術者所知之技術來選殖及測序。如下文所述，對來自上表5中所列之融合瘤的單株抗體進行測序。
使用標準技術，對編碼由融合瘤6B5B11C10及20D2C3G2產生之單株抗體的序列進行選殖及測序。簡言之，使用RNABee試劑(AMSBio，目錄號CS-104B，根據製造商之說明書使用)，自冷凍細胞集結塊中分離出全部RNA。使用逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)，自mRNA製備可變區之cDNA，隨後進行5'cDNA末端快速擴增(RACE)。使用恆定區特異性引子合成cDNA，之後純化第一股產物，且使用末端脫氧核苷酸轉移酶將均聚物尾添加至cDNA之3'末端。接著藉由PCR使用引子對擴增「加尾」cDNA序列，其中均聚物尾與VH或VL區分別各使用一個引子。接著使用標準程序，將重鏈及輕鏈可變區PCR產物選殖至「TA」選殖載體(p-GEM-T easy，Promega，目錄號A 1360)中且測序。參見圖2A-B(MAb 3)、圖2C-D(MAb 4)。
如下測定編碼由融合瘤1C10D3B9、2C6C3C7、1B3B4F1及1E9D9B61產生之單株抗體的序列。使用RNAqueous-4PCR套組(Ambion，目錄號AM1914)(根據製造商說明書使用)，自冷凍細胞集結塊中分離出全部RNA。使用一組六個簡併引子池(HA至HF)擴增重鏈可變區mRNA，且使用一組八個簡併引子池(7個用於κ群之引子池(KA至KG)及1個用於λ群之引子池(LA))擴增輕鏈可變區mRNA。使用RT-PCR自mRNA製備可變區之cDNA。使用恆定區特異性引子合成cDNA，隨後使用5'鼠類信號序列之簡併引子池及IgGVH、IgκVL與IgλVL中每一者之3'恆定區之引子進行PCR(Jones等人，1991,Rapid PCR cloning of full-length mouse immunoglobulin variable regions,Bio/Technology 9:88-89)。接著使用標準程序將重鏈及輕鏈可變區PCR產物選殖至「TA」選殖載體(p-GEM-T easy，Promega，目錄號A 1360)中且測序。參見圖2E-F(MAb 8)、2G-H(MAb 13)、2I-J(Mab 16)及2K-L(Mab 19)。
實例2：抗hPG抗體之結合親和力
A.相對親和力
使用上文所述之ELISA方法量測例示性單株抗體之相對親和力，其中用含有50 ng前胃泌激素之肽溶液塗佈各孔，接著在如下遞增濃度之各單株抗體存在下培育：
圖3A展示以1 ng/mL至1 μg/mL之濃度測試之四種抗hPG單株抗體MAb 1-4的相對親和力。圖3B展示以0.1-100 ng/mL之抗體濃度測試之N端抗hPG單株抗體MAb 3及15-20的相對親和力。圖3C展示以0.03-30 ng/mL之抗體濃度測試之C端抗hPG單株抗體MAb 5-14及21-23的相對親和力。
B.量測親和力常數
為更絕對地定量單株抗體之親和力，根據Nahshol等人，2008,Analytical Biochemistry 383:52-60(以全文引用的方式併入本文中)使用Proteon技術(BioRad)量測親和力常數。簡言之，首先將抗小鼠IgG抗體(50 μg/ml)塗佈於感應器晶片上，確保在注射抗體後由晶片偵測到之信號處於10,000與11,500 RU(反應單位)之間。接著注射欲測試之鼠類單株抗體(典型濃度：30 μg/ml)。基於感應器晶片上至少500 RU之另一信號來確定欲測試之抗體充分結合。接著藉由注射不同濃度之前胃泌激素(例如200、100、50、25及12.5 nM)來量測單株抗前胃泌激素抗體與前胃泌激素之間的相互作用之時程，且偵測締合度。通常，若干通道可用於在單個實驗中同時測試多個抗體，從而可同時檢定不同濃度之測試抗體與PG之結合。通常，保留一個通道用於對PG不具特異性之鼠類單株抗體，作為非特異性結合之對照，且用單獨稀釋緩衝液注射另一通道，作為背景信號之基線。一般而言，在注射非特異性鼠類抗體之通道中不可偵測到結合。可針對較低前胃泌激素濃度(50、25、12.5、6.25及3.125 nM)測試在此配置中呈現高締合度之抗體(此可能引起由前胃泌激素截獲之單株抗體飽和)，以使量測更精確。
親和力常數(KD)計算為解離常數(kd)與締合常數(ka)之間的比率。藉由分析基於結合量測之實驗曲線與理論曲線之間的統計相關相似性來驗證實驗值。基於前胃泌激素分子與抗前胃泌激素單株抗體之間的1:1相互作用，Proteon實驗中用於選擇實驗曲線是否擬合理論模型之數學模型為朗繆爾模型(Langmuir model)。
實例3：抗hPG抗體之聚集
抗體聚集可藉由減少可用於結合標靶蛋白質之抗體量而降低治療功效。聚集程度極低之抗體較佳用於治療應用。各批次抗體相較於其他批次相同單株抗體而言有所不同。通常需要使用低聚集之批次。為定量抗體聚集，將抗體溶液置於分光螢光計(Photon Technology International)中且在280 nm下照射。在280 nm下量測擴散，而在330 nm下量測由芳族胺基酸(主要為色胺酸)所引起之發射。接著如Nomin 等人，2003,Biochemistry 42: 4909-4917中所述，藉由計算280 nm下之OD量測值相對於330 nm下之OD量測值的比率來定量聚集度。280/330 nm比率愈高，聚集量愈高。所用抗體濃度為15 μg/ml，為用於活體外處理之濃度的5至15倍。
結果展示於下表7及圖4中。
實例4：抗hPG單株抗體之結合特異性
PG僅為胃泌激素基因之一種肽產物。其他胃泌激素基因產物在正常生理穩態中起作用，但PG在CRC中起作用，使其成為適用於治療及診斷目的之標靶。本文所述之單株抗體對全長前胃泌激素之特異性超過所有其他由胃泌激素基因表現及加工所產生之肽，諸如甘胺酸延伸型(G17-gly)、醯胺化(胃泌激素17)胃泌激素及C端側接肽(CTFP)。此等肽存在於循環中。藉由使用上文在實例1中所述之ELISA檢定，針對人類前胃泌激素及其他源自胃泌激素基因之肽檢定抗體來測定抗hPG單株抗體之結合特異性。
特定而言，用含有指示量之下列肽之一的溶液塗佈各孔：前胃泌激素、匙孔螺血氰蛋白(KLH)、醯胺化胃泌激素-17(G17)、甘胺酸延伸型胃泌激素17(Ggly)或C端側接肽(CTFP)：
在第一個實驗中，使用3 ng/ml(0.3 ng)抗hPG MAb 3及1 μg/ml(0.1 μg)抗hPG MAb 1、2及4中之每一者。參見圖5A。在第二個實驗中，測試0.3 ng/mL抗hPG MAb 5至14及21-23之結合特異性，參見圖5B，且測試1 ng/mL之抗hPG MAb 3、15-20之結合特異性，參見圖5C。
抗體對與上述實例1中使小鼠免疫之一些免疫原中所用之抗原性肽偶合的高量KLH呈現弱反應。BSA對任何抗體(包括針對包括BSA作為運載體之免疫原產生之抗體)之PG結合均無可偵測之影響。所有抗體均顯示，對與全長hPG(以50 ng測試，接著以25 ng測試)之結合相較於其他源自胃泌激素基因之肽(諸如醯胺化胃泌激素-17、甘胺酸延伸型胃泌激素17及C端側接肽(一種在正常加工前胃泌激素以形成胃泌激素期間自該多肽裂解之具有5個胺基酸之肽))具有高度特異性。例示性抗體對除hPG以外之任何源自胃泌激素基因之肽未展示可偵測之結合(信號高於「單獨PBS」背景)。
實例5：競爭檢定
使用ELISA以「捕捉」抗hPG抗體及「偵測」抗hPG抗體測定抗hPG單株抗體與抗hPG多株抗體競爭結合前胃泌激素之能力。如下檢定抗hPG MAb 3：用針對由hPG之殘基71至80組成之肽產生的C端前胃泌激素多株抗體預先塗佈96孔板。接著將各板與100 pM前胃泌激素一起培育，隨後添加10 μg/ml生物素標記之針對由SEQ ID NO:25之胺基酸序列組成之肽產生的N端抗hPG多株抗體以及遞增濃度之抗hPG MAb 3單株抗體。根據標準方案，藉由將各板相繼與抗生蛋白鏈菌素-HRP及OPD一起培育來偵測生物素標記之N端抗hPG多株抗體之結合。藉由定量發光來量測結合。結果展示，遞增濃度(μg/ml)之抗hPG MAb 3降低多株抗hPG抗體結合前胃泌激素之能力，展示單株抗體與多株抗體競爭。參見圖6。
實例6：抗原決定基定位
使用分別如Laune,D.等人，2002,J. Immunol. Methods 267:53-70及Laune,D.,1997,J. Biol. Chem. 272:30937-30944中所述之SPOT技術及丙胺酸掃描來定位例示性單株抗體所結合之特定抗原決定基。在SPOT技術中，產生跨越推定抗原決定基之15個胺基酸肽序列且點樣於硝化纖維膜上，接著用測試抗體探測以確定抗體所識別之最小抗原決定基序列。使用丙胺酸掃描來測定抗原決定基中對抗體結合起關鍵作用之殘基：使推定抗原決定基中之各殘基逐個突變成丙胺酸，接著用測試抗體探測含丙胺酸之肽。鑑別出本發明之例示性抗體的抗原決定基家族。對於N端單株抗體hPG MAb 1-4及15-20，抗原決定基至少包含下列序列：DAPLG(SEQ ID NO:28)、PDAPLG(SEQ ID NO:29)、PRSQQPD(SEQ ID NO:30)、WKPRSQQPD(SEQ ID NO:31)或WKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO:32)，如下表8中所示。
對於C端單株抗體hPG MAb 5-7、9-12、14及21-23，抗原決定基至少包含下列序列：FGRR(SEQ ID NO:33)、MDFGR(SEQ ID NO:34)及GWMDFGRR(SEQ ID NO:36)，如下表9中所示。
實例7：抗hPG抗體對癌細胞株之中和活性
(A)抗hPG單株抗體之中和活性抗hPG單株抗體降低代表性結腸直腸癌細胞株之細胞存活率。適合之結腸直腸癌細胞株為此項技術中已知。舉例而言，HCT116、LS174T、SW480及SW620為常用於研究結腸癌之細胞株，其產生且分泌前胃泌激素。測試PG單株抗體抑制此等不同細胞株增殖之能力。使用不同抗hPG單株抗體測試來自HCT116、LST174T、SW480及SW620每一者之細胞的存活率。
對於各實驗，將50,000個細胞接種於6孔板中含有胎牛血清之培養基中，且培育8小時。對細胞進行血清饑餓隔夜，且在接種後第24小時(時間「T0」)開始，在缺乏胎牛血清下，用1 μg/ml單株對照抗體(小鼠抗人類IgG1，Calbiochem，參考號411451)(CT mAb)或1 μg/ml如所指示之抗hPG MAb 1-4每12小時處理細胞一式兩份，歷時48小時。在進一步定量單株抗體時，抗體經測定以約3至5 μg/ml使用。對於各實驗，計數對照孔中T0時之細胞數目。對於HCT116細胞，在0.5%胎牛血清存在下進行實驗。在開始處理後第48小時，以雙盲實驗計數各孔中存活細胞之數目三次。藉由計算存活之經抗hPG MAB處理之細胞佔經對照MAb處理之細胞的百分比來確定CRC細胞增殖或存活之降低。第48小時量測之測試及對照細胞數減去處理開始(T0)時之細胞數。特定而言，在第48小時計數經對照處理之孔與經抗hPG MAb處理之孔中活細胞之數目，接著計算各細胞數與T0時測定之細胞數之間的差值。接著將所得經抗hPG MAB處理之細胞數目表示為佔經對照MAb處理之細胞數目的百分比。
圖7A-C展示代表性實驗中抗hPG MAb 3及抗hPG MAb 4對SW480細胞、LS174T細胞及HCT116細胞之存活的作用。結果為來自兩次獨立實驗之4個孔的平均值+/- S.E.M.。相較於用對照抗體處理，用抗hPG單株抗體處理可顯著降低細胞數目。統計顯著性係使用史都登氏T試驗法(Student's T-test)來確定：*=p<0.05，**=p<0.01，且***=p<0.001。抗hPG抗體降低各細胞株之細胞存活率。在一細胞株LST174T中，經抗hPG抗體處理48小時結束時之細胞數目低於實驗開始時之細胞數目，此表明抗體除抑制細胞增殖外亦引起細胞死亡。
表10展示經四種單株抗hPG抗體之每一者處理之存活SW480結腸直腸癌細胞相較於經對照單株抗體(小鼠抗人類IgG1，Calbiochem，參考號411451)(CT mAb)處理之細胞的百分比。
相較於對照，經抗hPG單株抗體處理可使癌細胞存活率降低83.2%(抗hPG MAb 3)、51.3%(抗hPG MAb 4)、19.8%(抗hPG MAb 2)及15.6%(抗hPG MAb 1)。
下表展示經抗hPG MAb 3及4處理之存活LS174T及HCT-116細胞相較於經對照單株抗體處理之細胞的百分比。資料以圖示方式表示於圖7之對應圖中。
預期在活體外檢定條件下，不會完全抑制細胞生長。在細胞培養中，前胃泌激素不斷由癌細胞分泌出且積聚於培養細胞之培養基中。前胃泌激素含量預期隨時間推移增加，高於體內循環中存在之含量，增加標靶蛋白質與抗體之比率且稀釋抗體之中和效應。因此，在活體外觀測到之抗體的中和作用預期在活體內會更強，在活體內由腫瘤細胞分泌之前胃泌激素由血流帶走，減少其在原位積聚。
在另一實驗中，在一或多種CRC細胞株SW620、HCT116及LS47T中測定抗hPG MAb 5至23對細胞增殖之抑制。如上所述，在6孔板中使用5 μg/ml對照或測試(抗hPG)單株抗體進行檢定。對於HCT116及LS174T，每孔接種50,000個細胞，且對於SW620細胞，每孔接種100,000個細胞。下表提供個別代表性實驗中存活之經處理細胞相對於經對照處理之細胞的百分比。細胞株SW620、LS174T及HCT-116之平均結果分別圖示於圖7G-I中。
(B)抗hPG多株抗體之中和活性
如上所述進行檢定，其中進行下列修改。使用如實例5中所述之N端抗hPG多株抗體。作為對照，使用3 μg/ml多株(多株兔抗人類IgG，Affinity BioReagents，參考號SA1-600)(CT pAB)。對於抗PG處理，將3 μg/ml抗hPG多株抗體用於所有細胞株。在不含FCS之DMEM中用對照或N端抗hPG多株抗體處理SW480及LS174T 24至48小時，而在含0.5% FCS之DMEM中用抗hPG多株抗體處理HCT116 48小時。接著存活細胞以胰蛋白酶處理且計數，與經相同濃度之對照(抗人類IgG)多株抗體處理之細胞相比較。
代表性實驗之結果展示於下表及圖7D-F中。相較於用對照抗體處理，用抗hPG多株抗體處理顯著降低細胞數目。統計顯著性係使用史都登氏T試驗法來確定：*=p<0.05，**=p<0.01及***=p<0.001。相對於實驗開始(T0)時培養物中之細胞數目表示細胞數目。對於各實驗，對4個孔之每一者中之細胞計數三次。如同抗hPG單株抗體，抗hPG多株抗體亦抑制結腸直腸癌細胞增殖，此表明在前胃泌激素之多株抗體下所見之抗腫瘤作用合理地預示單株抗體阻斷前胃泌激素對癌細胞之作用的活性。
實例8：當將抗hPG單株抗體與經純化hPG一起預先培育時抗hPG單株抗體之中和作用消除
為表明抗hPG單株抗體之中和作用係藉由結合於hPG所介導，在例示性抗體抗hPG MAb 8與hPG或未與hPG一起預先培育下培養LS174T細胞。作為陽性及陰性對照，將細胞與單獨hPG、單獨對照抗體及與hPG一起預先培育之對照抗體一起培養。
特定而言，在室溫下，將33.3 nM(5 μg/mL)抗hPG MAb 8與20倍莫耳過量或667 nM(6.67 μg/mL)之重組hPG一起預先培育1小時。使用如實例1中所述製備之重組人類前胃泌激素。同時，類似地，將33.3 nM(5 μg/mL)鼠類抗人類IgG1(General BioScience，參考號AB23420)與hPG或未與hPG一起預先培育。
將5000個LS174T細胞接種於96孔板之各孔中含有10%胎牛血清之培養基中，且培育8小時，之後，將細胞轉換至無血清培養基中，且再生長12小時。在無血清培養基中生長12小時後，每12小時用下列物質之一處理細胞：對照抗體、與hPG一起預先培育之對照抗體、單獨抗hPG MAb 8、與hPG一起預先培育之抗hPG MAb 8、及單獨hPG。首次處理後第48小時，藉由用Promega CellTiter 96 Aqueous單溶液培育各板且記錄490 nM下之吸光度來定量剩餘活細胞。對經對照單株抗體(「對照MAb」)處理之細胞所量測之吸光度設為100%，且所有其他實驗條件均相對於經對照MAb處理之細胞的吸光度進行量測。結果展示於下表及圖8中。
添加hPG或將抗體與hPG一起培育可增加培養物中活細胞之數目。相反，用單獨抗hPG MAb 8處理細胞引起活細胞數目顯著降低。因此，抗hPG單株抗體中和PG活性之能力因添加hPG而消除，認為hPG結合於抗體且使抗體飽和。此結果證實抗hPG單株抗體之中和活性的特異性。
實例9：抗hPG抗體之活體內抗腫瘤活性
已研發大量活體內實驗模型用於研究結腸直腸癌。已研發小鼠異種移植研究，其中將腫瘤組織或來自人類癌細胞株之細胞移植至免疫缺陷(所謂之「裸」)小鼠體內。Pocard M.等人，In vivo(1996) 10(5): 463-469。亦已研發若干轉殖基因小鼠模型。鼠類模型包括結腸腺瘤性息肉病(APC)基因(諸如Apc Min 、Apc1638N、Apc716或ApcΔ14)之異型接合突變。APC腫瘤抑制基因編碼APC細胞溶質蛋白質，該蛋白質在完整時結合於細胞溶質中之β-索烴素且將其螯合於將β-索烴素靶向用於降解之蛋白酶體的多蛋白複合物內，從而防止β-索烴素活化核中轉錄因子Tc4。Heyer等人，Oncogene 18:5325-5333(1999)。APCΔ14小鼠攜有結腸腺瘤性息肉病(APC)基因中外顯子14之異型接合缺失。與70%以上偶發性結腸直腸癌患者中出現之情況相似，腸細胞中出現第二Apc對偶基因之體細胞異型接合喪失(LOH)，引起β-索烴素/Tcf-4轉錄複合物組成性活化，且此等動物體內自發形成腸腫瘤。小鼠異種移植模型之此等腺瘤及癌瘤之分子起源以及腫瘤形態(包括血管形成、發炎性反應及免疫細胞之存在)與人類腫瘤具有極高相似性，使得APCΔ14成為用於人類結腸直腸癌療法研究之高度相關模型。Colnot等人，2004,Lab. Invest. 84:1619-1630。其他轉殖基因小鼠模型係基於諸如MSH2、MSH6、CDX2、K-RAS之基因的突變以及APC突變與其他致癌基因突變組合之細胞株。Heyer等人，1999,Oncogene 18:5325-5333；Janssen KP等人，2002,Gastroenterology 123: 492-504。此等模型廣泛用於研究結腸直腸癌且測試關於結腸直腸癌治療之假說。
結腸腺瘤性息肉病基因外顯子14(APCΔ14)之異型接合缺失的轉殖基因小鼠用作結腸直腸癌模型，形成之腫瘤與人類結腸癌中所發現之腫瘤相似。在第一個實驗中，用含有等量針對以下產生之抗hPG多株抗體的製劑處理APCΔ14小鼠：(1)對應於SEQ ID NO:25之肽及(2)如Hollande等人，WO 07/135542中所述之C端肽。用對照多株抗體或抗hPG多株抗體處理3.5個月大之小鼠5週(每個處理組2隻小鼠)。藉由以10 mg/kg(150 μl注射體積)之劑量每週腹膜內注射兩次來投與抗體。在處理結束時，處死小鼠且用PBS洗滌腸，解剖用於數位成像且固定於4%三聚甲醛中供免疫組織化學分析用。記錄腫瘤數目及結腸直腸組織之影像。
腸組織之形態學評定展示，抗hPG抗體不影響健康鼠類腸上皮再生。對處理組及對照組進行腫瘤計數。經對照抗體處理之小鼠的腫瘤總數為27，相比之下，經抗hPG抗體處理之小鼠的腫瘤總數為4。因此，抗hPG抗體減少腫瘤數，使得經對照抗體處理之小鼠的腫瘤數為抗hPG抗體的6.5倍以上，同時不影響小鼠腸之健康上皮再生。
在第二個實驗中，研究抗hPG抗體在APCΔ14小鼠及正常(對照)小鼠(C57BL6J)中之作用。使用對照多株抗體(兔抗人類IgG抗血清(Jackson ImmunoResearch(參考號309-005-0089))或抗hPG多株抗體，藉由以9 mg/kg(150 μl注射體積)之劑量每週腹膜內注射兩次，每週處理4個月大之小鼠兩次，歷時6週。處理6週後，在處死小鼠前2小時，用溴-脫氧-尿苷(BrdU)(每隻小鼠2 mg，腹膜內注射)注射小鼠。用抗hPG多株抗體處理6隻APCΔ14小鼠且用對照多株抗體處理4隻APCΔ14小鼠。各向6隻正常(C57BL6J)小鼠投與對照抗體及抗hPG抗體。在來自任一組之任何小鼠體內均未偵測到腸異常，此進一步表明抗hPG抗體對正常腸組織而言為安全的且無不利之影響。
研究APCΔ14小鼠之處理組相對於對照組的腫瘤數目及尺寸(高度及長度)。藉由量測自如下製備之各動物的腸獲得之影像來測定腫瘤尺寸。如上文所述沖洗腸，縱向解剖，包埋於石蠟中，且使用「瑞士卷」(Swiss roll)技術加工用於免疫組織化學。使用影像J軟體量測腫瘤長度及高度行。
結果展示於表16及圖8A及B中。腫瘤尺寸之結果展示對照抗體處理組與抗hPG抗體處理組之間存在統計顯著性差異。使用曼-懷特尼檢驗確定統計顯著性：*=p<0.05，**=p<0.01且***=p<0.001。經對照抗體處理之小鼠展現總共125個腫瘤，平均每隻小鼠31.25個腫瘤。經抗hPG抗體處理之小鼠展現46個腫瘤或平均每隻小鼠7.6個腫瘤。此差異具有統計顯著性(曼-懷特尼檢驗，P=0.0095)，表明抗hPG抗體在活體內顯著減少結腸直腸癌腫瘤數目。
如鼠類結腸直腸癌模型之腫瘤數目及腫瘤尺寸之降低所量測，抗hPG抗體在活體內顯著抑制結腸直腸癌腫瘤，而對正常結腸直腸上皮無任何明顯之不利影響。因此，用抗hPG抗體治療結腸直腸癌腫瘤在活體內提供治療效益。
實例10：設計人類化抗hPG抗體
自鼠類抗hPG單株抗體MAb 3、4、8、13、16及19以「電子雜交(in silico)」方式設計人類化抗體。根據Lefranc等人，2003,Dev. Comp. Immunol. 27:55-77；Lefranc等人，2009,Nucl. Acids. Res. 37: D1006-1012；Lefranc,2008,Mol. Biotechnol. 40: 101-111中所述之方法設計人類化抗體。對於各鼠類單株抗體，藉由以下步驟來測定相應人類化VH及VL肽序列：使用IMGT-ONTOLOGY資料庫(Duroux等人，2008,Biochimie,90:570-583；Giudicelli及Lefranc,1999,Bioinformatics,15: 1047-1054)及IMGT資料庫及工具(Ehrenmann等人，2010,Nucl. Acids. Res.,38: D301-307；Brochet等人，2008,Nucl. Acids. Res.,36: W503-508)鑑別鼠類序列中之CDR及構架區，接著在IMGT/GENE-DB(Giudicelli等人，2005,Nucl. Acids. Res.,33: D256-261)中鑑別最接近之人類構架區序列之胺基酸序列，且將鼠類CDR序列移植於人類構架區上。更詳言之，使用IMGT/V-QUEST及IMGT/DomainGapAlign分析鼠類VH及VL域之核苷酸及胺基酸序列，以界定鼠類CDR及構架區，確定CDR長度且鑑別錨定胺基酸。錨定胺基酸為處於載有CDR1-IMGT、CDR2-IMGT、CDR3-IMGT之IMGT「珠圈(Collier de Perles)」(Kaas及Lefranc,2007,Current Bioinformatics,2:21-30；Kaas等人，Brief. Funct. Genomic Proteomic,2007,6: 253-264)的位置26、39、55、66、104及118上之殘基。鑑別與鼠類序列最接近之人類V(可變)及J(接合)基因且選擇最適合之基因。若藉由在雙層上使用IMGT珠圈與已知之三維結構(Kaas等人，2004,Nucl. Acids. Res. 32:208-210)相比認為鼠類構架區中之個別胺基酸可能有助於抗體特異性，則保留該等胺基酸。
MAb 3之VH CDR CDR 1、2及3之長度經測定分別為8個胺基酸、8個胺基酸及8個胺基酸。與鼠類MAb 3 VH之序列最接近之生殖系小鼠基因IGHV1-5*01有10個殘基不同，其中3個殘基定位於CDR且在人類化抗hPG單株抗體之設計中保留該3個殘基(CDR1中之I29、CDR2中之F56及S65)。另外，V39、G55及R66被認為對保存特異性具有潛在重要性且保留於設計中。最接近之人類生殖系基因為IGHV1-3*01(基於IGMT/DomainGapAlign，在胺基酸層面上63.3%一致)。在鼠類生殖系基因與人類生殖系基因之間，發現構架區1至3中有27個序列差異。在構架區4中，使蘇胺酸-123及白胺酸-124變為白胺酸-123及纈胺酸-124，以匹配人類IGHJ1*01基因。總言之，MAb3之人類化VH與IGHV1-46*03之可變區87.8%一致且四個構架區之91胺基酸中有88個胺基酸一致。
MAb 3之VL CDR CDR 1、2及3之長度經測定分別為11個胺基酸、3個胺基酸及9個胺基酸。與鼠類MAb 3 VL之序列最接近之生殖系小鼠基因IGKV1-117*01有單個殘基不同，該殘基定位於構架區。最接近之人類生殖系基因為IGKV2-30*02(基於IGMT/DomainGapAlign，在胺基酸層面上81%一致)。在鼠類生殖系基因與人類生殖系基因之間，發現構架區1至3中有14個序列差異。殘基E40及F68已保留於計劃之人類化序列中。在構架區4中，使白胺酸-124變為纈胺酸-124，以匹配人類IGKJ4*01基因。總言之，MAb 3之人類化Vκ序列與IGKV2D-29*02 93%一致，且四個構架區之89個胺基酸中有87個胺基酸一致。
計劃之VH及Vκ序列提供於下表中。
MAb 4之VH CDR CDR 1、2及3之長度經測定分別為8個胺基酸、8個胺基酸及11個胺基酸。與鼠類MAb 4 VH之序列最接近之生殖系小鼠基因IGHV1-9*01有11個殘基不同，其中4個殘基定位於CDR且在人類化抗hPG單株抗體之設計中保留該4個殘基(CDR1中之S35、S36及S37、CDR2中之F56)。另外，D66被認為對保存特異性具有潛在重要性且保留於設計中。最接近之人類生殖系基因為IGHV1-46*03(基於IGMT/DomainGapAlign，在胺基酸層面上64.9%一致)。在鼠類生殖系基因與人類生殖系基因之間，發現構架區1至3中有27個序列差異。在構架區4中，使丙胺酸-128變為絲胺酸-128，以匹配人類IGHJ5*01基因。總言之，MAb 4之人類化VH與IGHV1-46*03之可變區91.8%一致且四個構架區之91胺基酸中有90個胺基酸一致。
MAb 4之VL CDR CDR 1、2及3之長度經測定分別為11個胺基酸、3個胺基酸及9個胺基酸。與鼠類MAb 4 VL之序列最接近之生殖系小鼠基因IGKV1-110*01有3個殘基不同，其中2個殘基定位於CDR1(絲胺酸-34及纈胺酸-36)且在人類化抗hPG單株抗體之設計中保留該2個殘基。最接近之人類生殖系基因為IGKV2D-29*02(基於IGMT/DomainGapAlign，在胺基酸層面上81%一致)。在鼠類生殖系基因與人類生殖系基因之間，發現構架區1至3中有11個序列差異。在構架區4中，使絲胺酸-120變為麩醯胺酸-120，以匹配人類IGKJ2*01基因。總言之，MAb 4之人類化Vκ序列與IGKV2D-29*0292%一致，且四個構架區100%一致。
計劃之VH及Vκ序列提供於下表中。
MAb8之VH CDR CDR 1、2及3之長度經測定分別為8個胺基酸、8個胺基酸及10個胺基酸。與鼠類MAb 8 VH之序列最接近之生殖系小鼠基因IGHV5-9-3*01有5個殘基不同，其中4個殘基定位於CDR且在人類化抗hPG單株抗體之設計中保留該4個殘基。最接近之人類生殖系基因為IGHV3-21*01及IGHV3-21*02(基於IGMT/DomainGapAlign，在胺基酸層面上80.4%一致)。在鼠類生殖系基因與人類生殖系基因之間，發現構架區1至3中有12個序列差異。在構架區4中，使絲胺酸-123及白胺酸-124分別變為蘇胺酸-123及纈胺酸-124，以匹配人類IGHJ6*01基因。總言之，MAb 8之人類化VH與IGHV3-21*01及IGHV3-21*02之可變區92.8%一致，且四個構架區100%一致。在MAb 8之鼠類VH CDR3中存在潛在N-糖基化位點。
MAb 8之VL CDR CDR 1、2及3之長度經測定分別為11個胺基酸、3個胺基酸及9個胺基酸。與鼠類MAb 8 VL之序列最接近之生殖系小鼠基因IGKV2-109*01有6個殘基不同，其中4個殘基定位於CDR1且在人類化抗hPG單株抗體之設計中保留該4個殘基。最接近之人類生殖系基因為IGKV2-28*01及IGKV2D-28*01(基於IGMT/DomainGapAlign，在胺基酸層面上75%一致)。在鼠類生殖系基因與人類生殖系基因之間，發現構架區1至3中有12個序列差異。在構架區4中，使丙胺酸-120、白胺酸-124及白胺酸126分別變為甘胺酸-120、纈胺酸-124及異白胺酸-126，以匹配人類IGKJ4*01基因。總言之，MAb 8之人類化Vκ序列與IGKV2-28*01及IGKV2D-28*01 87%一致，且四個構架區100%一致。
計劃之VH及Vκ序列提供於下表中。
MAb 13之VH CDR CDR 1、2及3之長度經測定分別為8個胺基酸、8個胺基酸及7個胺基酸。與鼠類MAb 13 VH之序列最接近之生殖系小鼠基因IGHV5-6-3*01有10個殘基不同，其中5個殘基定位於CDR且在人類化抗hPG單株抗體之設計中保留該5個殘基。最接近之人類生殖系基因為IGHV3-7*01及IGHV3-7*02(基於IGMT/DomainGapAlign，在胺基酸層面上78.6%一致)。在鼠類生殖系基因與人類生殖系基因之間，發現構架區1至3中有13個序列差異。在構架區4中，使蘇胺酸-123及白胺酸-124分別變為白胺酸-123及纈胺酸-124，以匹配人類IGHJ4*01基因。總言之，MAb13之人類化VH與IGHV3-7*01及IGHV3-7*02之可變區91.8%一致，且四個構架區100%一致。
MAb 13之VL CDR CDR1、2及3之長度經測定分別為11個胺基酸、3個胺基酸及9個胺基酸。與鼠類MAb 13 VL之序列最接近之生殖系小鼠基因IGKV1-135*01有單個殘基不同，該殘基位於構架區中。最接近之人類生殖系基因為IGKV2-30*01及IGKV2-30*02(基於IGMT/DomainGapAlign，在胺基酸層面上81%一致)。在鼠類生殖系基因與人類生殖系基因之間，發現構架區1至3中有13個序列差異。在構架區4中，使白胺酸-124變為纈胺酸-124，以匹配人類IGKJ4*01基因。總言之，MAb 13之人類化Vκ序列與IGKV2-30*01及IGKV2-30*02 94%一致，且四個構架區100%一致。
計劃之VH及Vκ序列提供於下表中。
MAb 16之VH CDR CDR 1、2及3之長度經測定分別為8個胺基酸、8個胺基酸及10個胺基酸。與鼠類MAb 16 VH之序列最接近之生殖系小鼠基因IGHV1-53*01有7個殘基不同，其中2個殘基定位於CDR且在人類化抗hPG單株抗體之設計中保留該2個殘基。最接近之人類生殖系基因為IGHV1-46*01及IGHV1-46*03(基於IGMT/DomainGapAlign，在胺基酸層面上71.4%一致)。在鼠類生殖系基因與人類生殖系基因之間，發現構架區1至3中有25個序列差異。在構架區4中，使白胺酸-124變為纈胺酸-124，以匹配人類IGHJ6*01基因。總言之，MAb 16之人類化VH與IGHV1-46*01及IGHV1-46*03之可變區96.9%一致，且四個構架區100%一致。
MAb 16之VL CDR CDR 1、2及3之長度經測定分別為11個胺基酸、3個胺基酸及9個胺基酸。與鼠類MAb 16 VL之序列最接近之生殖系小鼠基因IGKV1-135*01有4個殘基不同，該等殘基位於構架區中。最接近之人類生殖系基因為IGKV2-30*01及IGKV2-30*02(基於IGMT/DomainGapAlign，在胺基酸層面上79%一致)，其不同之處為CDR1中之1個胺基酸。在鼠類生殖系基因與人類生殖系基因之間，發現構架區1至3中有15個序列差異。在構架區4中，使甘胺酸-120變為麩醯胺酸-120，以匹配人類IGKJ2*01基因。總言之，MAb 16之人類化Vκ序列與IGKV2-30*01及IGKV2-30*02 94%一致，且四個構架區100%一致。計劃之VH及Vκ序列提供於下表中。
MAb 19之VH CDR CDR 1、2及3之長度經測定分別為9個胺基酸、7個胺基酸及14個胺基酸。與鼠類MAb 19 VH之序列最接近之生殖系小鼠基因IGHV3-2*01有5個殘基不同，其中定位於CDR且在人類化抗hPG單株抗體之設計中保留該2個殘基。最接近之人類生殖系基因為IGHV4-30-4*01(基於IGMT/DomainGapAlign，在胺基酸層面上72.4%一致)。然而，由於此基因具有多形性，所以選擇IGHV4-31*02及IGHV4-31*03(基於IGMT/DomainGapAlign，在胺基酸層面上71.4%一致)。在鼠類生殖系基因與人類生殖系基因之間，發現構架區1至3中有21個序列差異。在構架區4中，使異白胺酸-123變為白胺酸-123，以匹配人類IGHJ4*01基因。總言之，MAb 19之人類化VH與IGHV4-31*02及IGHV4-31*03之可變區91.9%一致，且四個構架區100%一致。
MAb 19之VL CDR CDR 1、2及3之長度經測定分別為7個胺基酸、7個胺基酸及13個胺基酸。與鼠類MAb 19 VL之序列最接近之生殖系小鼠基因IGLV3*01有8個殘基不同，其中5個殘基位於CDR中。最接近之人類生殖系基因為IGLV4-69*01及IGLV4-69*02(基於IGMT/DomainGapAlign，在胺基酸層面上69.9%一致)。在鼠類生殖系基因與人類生殖系基因之間，發現構架區1至3中有23個序列差異。在構架區4中，使纈胺酸-124變為白胺酸-124，以匹配人類IGLJ3*01基因。或者，對於構架區4，可使用IGJK4*01基因。總言之，MAb 19之人類化VK序列與IGLV4-69*01及IGLV4-69*02 92.4%一致，且四個構架區100%一致。
計劃之VH及Vκ序列提供於下表中。
本申請案中所引用之所有公開案、專利、專利申請案及其他文獻皆出於所有目的以全文引用的方式併入本文中，其引用程度如同個別指示各個別公開案、專利、專利申請案或其他文獻出於所有目的以引用的方式併入本文中一般。雖然已說明且描述各種特定實施例，但應瞭解可在不背離本發明之精神及範疇下作出各種變化。
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<223>　Ahx
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<213>　人工序列
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<223>　對人工序列之描述：合成肽
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<221>　MOD_RES
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<223>　Ahx
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圖1提供：(A)前胃泌激素之胺基酸序列，其殘基以胺基端開始自1編號至80，經標記以展示對應於源自前胃泌激素之各肽的序列；及(B)展示源自胃泌激素基因之肽甘胺酸延伸型胃泌激素34(G34-gly)、甘胺酸延伸型胃泌激素17(G17-gly)、醯胺化胃泌激素34、醯胺化胃泌激素17及C端側接肽(CTFP)如何藉由加工前胃泌激素而產生的草圖；
圖2提供以下例示性抗hPG單株抗體之VH及VL鏈之多肽及相應聚核苷酸序列：抗hPG MAb 3(按出現順序分別為SEQ ID NO: 16、12、17及13)(圖2A、2B)、抗hPG MAb 4(按出現順序分別為SEQ ID NO: 18、14、19及15)(圖2C、2D)、抗hPG MAb 8(按出現順序分別為SEQ ID NO: 67、59、71及63)(圖2E、2F)、抗hPG Mab 13(按出現順序分別為SEQ ID NO: 68、60、72及64)(圖2G、2H)、抗hPG MAb 16(按出現順序分別為SEQ ID NO: 69、61、73及65)(圖2I、2J)及抗hPG MAb 19(按出現順序分別為SEQ ID NO: 70、62、74及66)(圖2K、2L)，其中各鏈之三個CDR框出；
圖3A-C提供說明在遞增抗體濃度之例示性抗hPG單株抗體MAb 1-4(圖3A)、MAb 5-14、20-23(圖3B)及MAb 3及15-19(圖3C)(μg/mL)下之相對結合親和力(量測為492 nm下之吸光度)的圖；
圖4提供說明相較於牛血清白蛋白(任意單位)之對照樣品，4種不同例示性抗hPG單株抗體在280 nm下之吸光度(光密度)與在330 nm下之吸光度的比率之圖；
圖5A-C提供說明相較於以下各者，23種不同例示性抗hPG單株抗體與25 ng或50 ng hPG之結合的圖：單獨緩衝液(陰性對照)、250 ng KLH(陰性對照)及源自胃泌激素基因之肽(50 ng及250 ng CTFP、G17或G-gly)，如所示。圖5A展示抗hPG MAb 1-4之結合，圖5B展示抗hPG MAb 5-14及21-23之結合，且圖5C展示抗hPG MAb 3及15-20之結合；
圖6提供說明在遞增濃度之抗hPG MAb3下多株N端抗hPG抗體與hPG之結合的圖；
圖7提供說明以下各增殖之圖：如下經抗hPG單株抗體處理之代表性CRC細胞株之增殖：如所示，經例示性抗hPG單株抗體MAb 3及MAb 4(分別為圖7A、7B、7C，展示活細胞數目在經抗體處理結束時相對於處理開始時(T0)之變化)或抗hPG多株抗體(分別為圖7D、7E、7F，展示活細胞數目在經抗體處理結束時相對於處理開始時(T0)之變化)處理之SW480、HCT-116、LS174T；經抗hPG MAb 5至MAb 23處理之CRC細胞株SW620之增殖(圖7G，展示經抗hPG處理之活細胞在處理結束時相對於處理開始時(T0)佔經對照抗體處理之細胞數目的百分比)；經抗hPG MAb 8、13、14、16及19處理之LS174T細胞之增殖(圖7H，展示經抗hPG處理之活細胞在處理結束時相對於處理開始時(T0)佔經對照抗體處理之細胞數目的百分比)；及經抗hPG單株抗體MAb 8、13、14、16、19處理之HCT-116細胞之增殖(圖7I，展示經抗hPG處理之活細胞在處理結束時相對於處理開始時(T0)佔經對照抗體處理之細胞數目的百分比)；
圖8提供說明活LS174T細胞在以對照單株抗體、抗hPG MAb 8(5 μg/mL)、預先與hPG一起培育之抗hPG MAb 8、預先與hPG一起培育之對照抗體或單獨hPG進行4次處理後第48小時之數目的圖；及
圖9提供說明相較於對照多株抗體，經抗hPG抗體處理之小鼠中每隻小鼠之腫瘤數目(圖9A)及平均腫瘤長度及高度(圖9B)的圖。
(無元件符號說明)

Claims (17)

  1. 一種抗hPG單株抗體，其特異性結合人類前胃泌激素(hPG)之C端區域，其包含下列VH及VL CDR：VH CDR 1.8、VH CDR 2.8、VH CDR 3.8、VL CDR 1.8、VL CDR 2.8及VL CDR 3.8。
  2. 如請求項1之抗hPG單株抗體，其與經非特異性單株抗體處理之對照樣品相比，使活體外處理之測試樣品中活的結腸直腸癌細胞數目出現統計上之顯著性降低。
  3. 如請求項1或2之抗hPG單株抗體，其經人類化。
  4. 如請求項3之抗hPG單株抗體，其包含具有選自以下VH及VL序列群組之一的VH及VL鏈：(i)hVH 8a(SEQ ID NO：75)及hVL 8a(SEQ ID NO：76)；(ii)hVH 8b(SEQ ID NO：77)及hVL 8b(SEQ ID NO：78)；(iii)hVH 8c(SEQ ID NO：79)及hVL 8a(SEQ ID NO：76)。
  5. 如請求項1或2之抗hPG單株抗體，其親和力為約1pM至約7nM之範圍。
  6. 如請求項2之抗hPG單株抗體，其在LS174T細胞之活體外檢定中中和hPG活性。
  7. 一種組合物，其包含如請求項1至6中任一項之抗hPG單株抗體及賦形劑、載劑及/或稀釋劑。
  8. 如請求項7之組合物，其經調配用於醫藥用途。
  9. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至6中任一項之抗hPG 單株抗體的可變輕鏈(VL)。
  10. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至6中任一項之抗hPG單株抗體的可變重鏈(VH)。
  11. 一種表現載體，其包含編碼如請求項1至6中任一項之抗hPG單株抗體之可變輕鏈(VL)的聚核苷酸。
  12. 一種表現載體，其包含編碼如請求項1至6中任一項之抗hPG單株抗體之可變重鏈(VH)的聚核苷酸。
  13. 一種宿主細胞，其以表現如請求項1至6中任一項之抗hPG單株抗體的聚核苷酸對(pair)轉型。
  14. 一種如請求項1至6中任一項之抗hPG單株抗體的用途，其係用於製造供治療結腸直腸癌的藥物。
  15. 一種如請求項1至6中任一項抗hPG單株抗體之用途，其係用於製造供抑制結腸直腸癌細胞增殖之藥物。
  16. 一種適用於偵測hPG之套組，其包含如請求項1至6中任一項之C端抗hPG單株抗體以及特異性結合hPG之N端區域的抗體。
  17. 如請求項16之套組，其中該特異性結合hPG之N端區域的抗體為多株抗體。
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