CN104152395A

CN104152395A - 合理设计的细胞培养基

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Publication number: CN104152395A
Application number: CN201410370624.2A
Authority: CN
Inventors: 栾严同; 王文格; 瑞安·诺兰; 丹尼斯·德拉波
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2006-11-08
Filing date: 2007-11-07
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2027-11-07
Also published as: CA2668771C; RU2009114855A; US20130084593A1; SI2078071T1; MX2009004974A; AR063623A1; CN104152395B; IL198486A0; AU2007323978A1; ZA200903170B; NO20091607L; CA2668771A1; JP2014128276A; WO2008063892A2; ES2538986T3; US8232075B2; PE20081655A1; AU2007323978B2; TW200827445A; PT2078071E

Abstract

本发明涉及合理设计的细胞培养基。该细胞培养基包含以下必需氨基酸：15.2mM ARG、5.5mM HIS、13.2mM ILE、20.0mM LEU、16.5mM LYS、6.3mM MET、12.5mM PRO、15.7mM THR、3.2mM TRP、15.4mM Val。使用本发明的细胞培养基可以实现多肽的大规模生产。

Description

合理设计的细胞培养基

本申请为申请日2007年11月07日，申请号200780041158.1，名称为“合理设计的细胞培养基”的发明专利申请的分案申请。

相关申请交叉参考案

本申请案主张优先于在2006年11月8号提出申请的美国临时专利申请案第60/858,289号的权益，所述案件的内容全部以引用的方式纳入本文中。

技术领域

本发明涉及合理地设计用于细胞培养物(例如，应用于多肽生产的细胞培养物)的细胞培养基的方法；用所揭示方法设计的细胞培养基；使用所述培养基产生大量相关多肽(例如，抗体)的方法；使用本文所揭示方法和培养基产生的多肽；及含有所述多肽的医药组合物。本发明特别可用于大规模细胞培养物。本文所揭示方法和组合物特别可用于在分批、补料分批和灌注动物细胞培养物中产生大量多肽。

背景技术

大部分生物技术产品(无论是在市场上有售或者只是在研发中)是蛋白治疗剂；因此，人们需要在细胞培养物中产生这些多肽。而且，经常需要动物细胞(与(例如)细菌细胞形成对照)的细胞机器产生许多形式的多肽治疗剂(例如，糖基化蛋白或杂交瘤产生的单克隆抗体(MAb))。因此，人们越来越需要优化这些多肽在细胞培养物中且特别是在动物细胞培养物中的产生。

与细菌细胞培养物相比，动物细胞培养物具有更低的生产速率且通常会产生更低的产率。因此，大量研究集中在可优化多肽产量的动物细胞培养条件上，即，支持高细胞密度和高效价的条件。举例来说，已确定将细胞培养基的葡萄糖浓度维持在低浓度下且在生产阶段中于约400至600mOsm摩尔渗透压浓度下培养细胞会增加动物细胞培养物的重组蛋白产量，其中在所有阶段的培养也应在选定谷酰胺浓度(优选地，介于约0.2至约2mM之间)下进行。还确定了在补料分批过程中对动物细胞培养物限量补加葡萄糖可控制乳酸产生而无需以恒定速率补加葡萄糖。此外，已知改良在大规模细胞培养培养基中的全部氨基酸累积浓度、个别氨基酸浓度、及个别氨基酸彼此间(例如，谷酰胺与天冬酰胺)和个别氨基酸与全部氨基酸间(例如，谷酰胺与全部氨基酸)的比率能够在实质上改善大规模多肽生产。

传统上，对动物细胞培养物的培养基研究集中在3种技术上：1)向起始培养基中补加培养基组份及增加培养物补加频率；2)对不同的培养基强度和不同的组份浓度应用多因数设计；及3)分析条件(使用过的)培养基的氨基酸、维生素、及其它组份，并添加低含量或耗尽的那些组份。这些方法通常使用细胞密度、存活率和效价响应作为优化指标。

然而，上述方法只是根据最后结果(即，细胞密度、存活率和效价)间接地检测细胞的营养素需求而非检测并提供优化蛋白生产的实际细胞营养素需求。

发明内容

本发明涉及合理地设计用于(例如)应用于多肽生产的大规模细胞培养物的细胞培养基(例如，大规模细胞培养基)的方法；用所揭示方法设计的细胞培养基(例如，大规模细胞培养基)；使用所述培养基产生大量相关多肽(例如，抗体)的方法；使用本文所揭示方法和培养基产生的多肽；及含有所述多肽的医药组合物。这些方法和组合物可用于培养(例如，分批、补料分批和灌注培养)细胞。这些方法和组合物特别可用于大规模培养(例如，分批、补料分批及灌注培养)动物细胞，例如，哺乳动物细胞。

本发明的合理设计的培养基含有用于细胞群细胞群的计算浓度的氨基酸、用于细胞维持的计算浓度的氨基酸、及纳入相关多肽中的计算浓度的氨基酸。

在一个实施例中，本发明提供一种在细胞培养物中产生多肽的方法，所述方法包含提供细胞培养物，所述细胞培养物包含细胞(包含编码相关多肽的核酸)及期望细胞培养基(包含用于细胞群细胞群的计算浓度的氨基酸、用于细胞维持的计算浓度的氨基酸、及纳入相关多肽中的计算浓度的氨基酸)；并将所述细胞培养物维持在可使所述相关多肽表达的条件下。在一个本发明实施例中，所述期望细胞培养基包含依据等式A＝[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F计算的经基线调整氨基酸浓度A，其中X是每单位细胞群细胞群所用氨基酸浓度，P是针对每单位多肽效价纳入相关多肽中的氨基酸浓度，M是所述细胞培养物的期望峰值细胞密度的乘数，N是相关多肽的期望浓度的乘数，Y是细胞维持因数；且F是基线因数。

在另一实施例中，本发明提供一种在细胞培养物中产生多肽的方法，所述方法包含提供细胞培养物，所述细胞培养物包含细胞，所述细胞包含编码相关多肽的核酸；及起始细胞培养基，其中所述起始细胞培养基的体积是期望细胞培养基体积的约60-99％；对所述细胞培养物提供补加细胞培养基，其中所述补加细胞培养基的体积是期望细胞培养基体积的约1-40％，且其中所得期望细胞培养基包含用于细胞群细胞群的计算浓度的氨基酸、用于细胞维持的计算浓度的氨基酸、及纳入相关多肽中的计算浓度的氨基酸；并将所述细胞培养物维持在可使所述相关多肽表达的条件下。在一个本发明实施例中，所得期望细胞培养基具有依据等式A＝[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F计算的经基线调整氨基酸浓度A，其中X是每单位细胞群细胞群所用氨基酸浓度，P是针对每单位多肽效价纳入相关多肽中的氨基酸浓度，M是所述细胞培养物的期望峰值细胞密度的乘数，N是相关多肽的期望浓度的乘数，Y是细胞维持因数；且F是基线因数；并将所述细胞培养物维持在可使所述相关多肽表达的条件下。在另一本发明实施例中，所述起始细胞培养基包含依据等式B＝[A-(Z*V)]/(1V)计算的浓度B的氨基酸，其中Z是补加细胞培养基的氨基酸浓度，且V是作为所述期望细胞培养基体积一部分的补加培养基体积。在本文所揭示方法的另一实施例中，Y为0至约1.5。在本文所揭示方法的又一实施例中，F为约1至约1.5。在本文所揭示方法的再一实施例中，Y为0至约1.5且F为约1至约1.5。

在本文所揭示方法的一个实施例中，所述期望细胞培养基包含大于或等于约3mM的酪氨酸。在本文所揭示方法的另一些实施例中，所述期望细胞培养基包含：介于约7mM与约30mM之间的亮氨酸；介于约7mM与约30mM之间的赖氨酸；介于约7mM与约30mM之间的苏氨酸；介于约7mM与约30mM之间的脯氨酸；及/或介于约7mM与约30mM之间的缬氨酸。在本文所揭示方法的再一实施例中，亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸和缬氨酸在期望细胞培养基中的组合浓度是介于约35mM与约150mM之间。在又一实施例中，亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和缬氨酸在期望细胞培养基中的组合浓度是全部必需氨基酸在所述期望细胞培养基中浓度的介于约60％与约80％之间。

在本文所揭示方法的一个实施例中，必需氨基酸在期望细胞培养基中的组合浓度是全部必需氨基酸在所述期望细胞培养基中浓度的介于约30％与约50％之间。在本文所揭示方法的另一实施例中，氨基酸在所述期望细胞培养基中的浓度是介于约120mM与约350mM之间。在本文所揭示方法的再一实施例中，将脯氨酸在细胞培养物中的浓度维持在大于约1mM。在本文所揭示方法的又一实施例中，将脯氨酸在细胞培养物中的浓度维持在大于约2mM。在生产多肽方法的一些实施例中，所述细胞培养物是大规模细胞培养物。在其它实施例中，所述细胞是动物细胞。

本发明的又一方面提供依据本文所揭示方法产生的多肽。本发明的另一方面提供一种医药组合物，其包含依据本文所揭示方法产生的多肽及医药上可接受的载剂。

本发明的又一方面提供一种细胞培养的方法，所述方法包含：提供细胞培养物，所述细胞培养物包含：细胞及期望细胞培养基，所述期望细胞培养基包含用于细胞群细胞群的计算浓度的氨基酸及用于细胞维持的计算浓度的氨基酸；并将所述细胞培养物维持在所述细胞可于所述细胞培养物中生长和复制的条件下。在一个本发明实施例中，所述期望细胞培养基包含依据等式A′＝[(M*X)+(Y*M*X)]*F计算的经基线调整氨基酸浓度A′，其中X是每单位细胞群细胞群所用氨基酸浓度，M是所述细胞培养物的期望峰值细胞密度的乘数，Y是细胞维持因数；且F是基线因数。在所述细胞培养方法的一些实施例中，所述细胞培养物是大规模细胞培养物。在其它实施例中，所述细胞是动物细胞。

本发明的又一方面提供细胞培养基，其包含介于约120mM与约350mM之间的氨基酸总浓度。本发明的另一方面提供一种用于生产相关多肽的细胞培养基，其包含介于约120mM与约350mM之间的氨基酸总浓度。

本发明的另一方面提供一种用于生产相关多肽的细胞培养基，其包含用于细胞群细胞群的计算浓度的氨基酸、用于细胞维持的计算浓度的氨基酸、及纳入相关多肽中的计算浓度的氨基酸。在一个本发明实施例中，用于生产相关多肽的细胞培养基包含依据等式A＝[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F计算的经基线调整的氨基酸浓度A，其中X是每单位细胞群细胞群所用氨基酸浓度，P是针对每单位多肽效价纳入相关多肽中的氨基酸浓度，M是所述细胞培养物的期望峰值细胞密度的乘数，N是相关多肽的期望浓度的乘数，Y是细胞维持因数；且F是基线因数。

本发明的再一方面提供一种细胞培养基，其包含依据等式A′＝[(M*X)+(Y*M*X)]*F计算的经基线调整氨基酸浓度A′，其中X是每单位细胞群细胞群所用氨基酸浓度，M是所述细胞培养物的期望峰值细胞密度的乘数，Y是细胞维持因数，且F是基线因数。在一些实施例中，所述细胞培养基是大规模细胞培养基。在其它实施例中，所述细胞培养基是动物细胞培养基。

本发明的再一方面提供一种确定在可于细胞培养物中产生相关多肽的细胞培养基中所用优化氨基酸浓度的方法，所述方法包含：确定所述细胞在细胞培养物中于目标细胞密度下形成细胞群细胞群所需氨基酸浓度；确定在细胞培养物中于目标多肽效价下产生相关多肽所需氨基酸浓度；确定所述细胞在细胞培养物中的细胞维持所需氨基酸浓度；并加合所述各浓度以提供在细胞培养物中可产生相关多肽的细胞培养基中所用优化氨基酸浓度。

本发明的又一方面提供确定在可于细胞培养物中产生相关多肽的细胞培养基中所用氨基酸的优化氨基酸浓度A的方法，所述方法包含：确定所述细胞于设定细胞密度下形成细胞群细胞群所需氨基酸浓度X；确定于设定多肽效价下产生相关多肽所需氨基酸浓度P；及依据等式A＝[(M*X)+(N*P)+(M*Y*X)]*F确定优化氨基酸浓度A，其中M是所述细胞培养物的期望目标细胞密度的乘数，N是相关多肽的期望目标浓度的乘数，Y是细胞维持因数；且F是基线因数。在确定优化氨基酸浓度的方法的一些实施例中，所述细胞培养物是大规模细胞培养物。在其它实施例中，所述细胞是动物细胞。

从下述具体实施方式和上述权利要求书可明了本发明的其它特征和优点。

附图说明

图1描绘经改造可表达抗-IL-22的CHO细胞的细胞密度(Y轴；“细胞密度(10⁶个细胞/mL)”)随时间(X轴；“天数”)的变化。在实例2的合理设计的培养基中培养细胞。

图2描绘经改造可表达抗-IL-22的CHO细胞的抗-IL-22抗体效价(Y轴；“效价(g/L)”)随时间(X轴；“天数”)的变化。在实例2的合理设计的培养基中培养细胞。

图3描绘经改造可表达抗-IL-22的CHO细胞的细胞密度(Y轴；“细胞密度(10⁶个细胞/mL)”)随时间(X轴；“天数”)的变化。在实例3的合理设计的培养基中培养细胞。

图4描绘经改造可表达抗-IL-22的CHO细胞的抗-IL-22抗体效价(Y轴；“效价(g/L)”)随时间(X轴；“天数”)的变化.在实例3的合理设计的培养基中培养细胞。

图5描绘经改造可表达抗-IL-22的CHO细胞的抗-IL-22抗体效价(Y轴；“效价(g/L)”)随时间(X轴；“天数”)的变化。在“传统培养基”(一种基于传统细胞培养物要求的培养基，参见，例如，美国公开专利申请案第2006/0121568号)、使用本文方法制备的“合理设计的培养基”、或含有额外添加至“传统培养基”中的3.7mM脯氨酸的“传统培养基+脯氨酸”中培养细胞(参见实例4)。

图6描绘经改造可表达抗-IL-22的CHO细胞的细胞密度(Y轴；“细胞密度(10⁶个细胞/mL)”随时间(X轴；“天数”)的变化。在“传统培养基”、“合理设计的培养基”、或“传统培养基+脯氨酸”中培养细胞(参见实例4)。

图7描绘经改造可表达抗-IL-22的CHO细胞的细胞存活率(Y轴；“存活率[％]”)随时间(X轴；“天数”)的变化。在“传统培养基”、“合理设计的培养基”、或“传统培养基+脯氨酸”中培养细胞(参见实例4)。

图8描绘细胞经改造可表达抗-IL-22的CHO细胞的指定氨基酸((图8A)脯氨酸；(图8B)苏氨酸；(图8C)缬氨酸；(图8D)色氨酸；或(图8E)酪氨酸)浓度(Y轴；“[μM]””)随时间(X轴；“天数”)的变化。在“传统培养基”、“合理设计的培养基”、或“传统培养基+脯氨酸”中培养细胞(参见实例4)。

图9描绘经改造可表达抗-IL-22的CHO细胞的细胞密度(Y轴；“细胞密度(10⁶个细胞/mL)”)随时间(X轴；“天数”)的变化。在“合理设计的培养基”或“不涉及维持因数和基线因数的合理设计的培养基”中培养细胞。所述图是5个独立同样试验(n＝5)的代表图(参见实例6)。

图10描绘经改造可表达抗-IL-22的CHO细胞的细胞存活率(Y轴：“存活率(％)”)随时间(X轴；“天数”)的变化。在“合理设计的培养基”或“不涉及维持因数和基线因数的合理设计的培养基”中培养细胞。所述图是5个独立同样试验(n＝5)的代表图(参见实例6)。

图11描绘经改造可表达抗-IL-22的CHO细胞的抗体效价(Y轴；“效价(g/L)”)随时间(X轴；“天数”)的变化。在“合理设计的培养基”或“不涉及维持因数和基线因数的合理设计的培养基”中培养细胞。所述图是5个独立同样试验(n＝5)的代表图(参见实例6)。

具体实施方式

如本文所用术语“分批培养”是指一种培养细胞的方法，其中在所述培养过程开始时提供最终会用于培养所述细胞的所有组份，包含所述培养基以及细胞本身。通常在某个时刻停止分批培养并收获及(视需要)纯化所述培养基中的细胞及/或组份。

如本文所用术语“补料分批培养”是指一种培养细胞的方法，其中在所述培养过程开始后的某个时刻对所述培养物提供额外的组份。所提供组份通常包含在所述培养过程中耗尽了的细胞营养补剂。通常在某个时刻停止补料分批培养并收获及(视需要)纯化所述培养基中的细胞及/或组份。在本发明的优选实施例中，所述细胞培养是动物细胞培养(例如，哺乳动物细胞培养)，其为分批培养或补料分批培养。

如本文所用术语“灌注培养”是指一种培养细胞的方法，其中在所述培养过程开始后以连续方式或半连续方式对所述培养物提供额外组份。所提供组份通常包含在所述培养过程中耗尽了的细胞营养补剂。所述培养基中的细胞及/或组份部分通常以连续或半连续方式收获并视需要经纯化。

如本文所用术语“生物反应器”是指供原核细胞或真核细胞培养物(例如，动物细胞培养物，例如，哺乳动物细胞培养物)生长所用任何容器。所述生物反应器可具有任一大小，只要其可用于培养细胞，例如，哺乳动物细胞。通常，所述生物反应器可为至少30ml且可为1升、10升、100升、250升、500升、1000升、2500升、5000升、8000升、10,000升、12,0000升或更大、或任一中间体积。在培养期间通常需控制所述生物反应器的内部条件，包括但不限于pH和温度。所述生物反应器可由任何适用于在本发明培养条件下容纳悬浮于培养基中的哺乳动物细胞培养物的材料制成。如本文所用术语“生产型生物反应器”是指在相关多肽或蛋白生产中所用最终生物反应器。大规模细胞培养物生产型生物反应器的体积一般大于约100ml，通常为至少约10升，且可为500升、1000升、2500升、5000升、8000升、10,000升、12,0000升或更大、或任一中间体积。一名普通技术人员可认识到且能够选择用于实践本发明的适宜生物反应器。

如本文所用术语“细胞密度”、“细胞浓度”或类似词组是指存于给定体积培养基中的细胞数目、重量、质量等。“峰值细胞密度”或类似词组是指在给定体积培养基中可达到的最大细胞数目，且“期望峰值细胞密度”或类似词组是指实践人员期望在给定细胞体积中获得(例如，目标)的最大细胞数目。那些所属领域的技术人员会明了所述目标值的变动，例如，一名所属领域的技术人员可以期望细胞群细胞群这一术语来表达目标值，且所述目标值可以一个或多个适当的度量单位(例如，期望峰值细胞群细胞群单位)计。

如本文所用术语“细胞存活率”是指细胞在培养物中于一组给定培养条件或实验变动条件下生存的能力。所述如本文所用术语也指在特殊时间时活着的细胞占此时存于培养物中细胞(活着的及死亡的)总数目的比例。

如本文所用术语“培养物”和“细胞培养物”是指在适合细胞群体生存及/或生长的条件下悬浮于细胞培养基中的细胞群体。如本文所用这些术语可指包含所述细胞群体(例如，动物细胞培养物)与其中悬浮有所述群体的培养基的组合。

如本文所用术语“整合活细胞密度”或“IVC”是指活细胞在培养过程中的平均密度乘以培养进行的时间。假如所产生多肽量及/或蛋白量与在培养过程中所存在活细胞数目成比例，则整合活细胞密度是评定在培养过程中所产生多肽量及/或蛋白量的有用工具。

如本文所用术语“培养基(medium)”、“细胞培养基(cell culture medium)”、和“培养基(culture medium)”是指含有为正在生长中动物(例如，哺乳动物)细胞提供养分的营养素的溶液。通常，这些溶液提供所述细胞最小生长及/或生存所需要的必需和非必需氨基酸、维生素、能量来源、脂质及微量元素。所述溶液还可含有促进生长及/或生存(高于最小速率)的组份，包括激素和生长因子。将所述溶液以优选方式调配到最适合细胞生存和增殖的pH和盐浓度。在一个实施例中，所述培养基是确定成份培养基。确定成份培养基是其中所有组份具有已知化学结构的培养基。在另一本发明实施例中，所述培养基可含有源自所属领域已知的任何来源或方法的氨基酸，包括但不限于源自单一氨基酸添加物或源自蛋白胨或蛋白水解产物(包含动物或植物来源)添加物的氨基酸。

如本文所用术语“接种”是指对生物反应器或另一容器提供细胞培养物的过程。所述细胞可能先前已在另一生物反应器或容器中繁殖。另一选择，所述细胞在将其提供给生物反应器或容器之前(例如，即将提供给生物反应器或容器之前)经冷冻和解冻。所述术语是指许多细胞，包含单一细胞。

如本文所用术语“效价”是指借助动物细胞培养物产生的相关多肽的总量除以给定培养基体积量；因此“效价”是指浓度。效价通常以毫克多肽/毫升培养基为单位表达。

如本文所用术语“抗体”包括包含至少一个(且通常两个)VH域或其部分及/或至少一个(且通常两个)VL域或其部分的蛋白。在某些实施例中，所述抗体是两个免疫球蛋白重链与两个免疫球蛋白轻链的四聚体，其中所述免疫球蛋白重链和轻链通过(例如)二硫键相互连接。所述抗体或其一部分可从任何来源获得，包括但不限于啮齿类动物、灵长类动物(例如，人类及非人类灵长类动物)、骆驼科动物等，或其可以重组方式产生，例如，嵌合、人源化及/或活体外产生的，例如，通过那些所属领域的技术人员熟知的方法获得。

涵盖于术语“抗体的抗原-结合片段”中的结合片段的实例包括但不限于(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL及CH1域构成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，其是包含2个在铰链区中由二硫桥键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH及CH1域构成的Fd片段；(iv)由单臂抗体的VL和VH域构成的Fv片段；(v)dAb片段，其由VH域构成；(vi)骆驼科动物或骆驼科动物源化重链可变域(VHH)；(vii)单链Fv(scFv；参见下文)；(viii)双重特异性抗体；及(ix)一个或多个与Fc区融合的免疫球蛋白分子片段。此外，尽管Fv片段的两个域VL和VH通过不同基因编码，但所述域可使用重组方法借助合成连接子来连接，所述合成连接子能够使其作为其中VL和VH区配对形成单价分子的蛋白单链(称作单链Fv(scFv))制备；参见(例如)伯德(Bird)等人，(1988)科学(Science)242：423-26；休斯顿(Huston)等人(1988)美国国家科学研究院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)85：5879-83)。所述单链抗体还欲涵盖于术语“抗体的抗原结合部分”中。可借助那些所属技术领域人员已知的习用技术获得这些片段且以与完整抗体相同的方式评价有用的片段。

“抗原-结合片段”可视需要进一步包括可增强(例如)稳定性、效应细胞功能或补体结合中的一者或多者的部分。举例来说，所述抗原结合片段可进一步包括聚乙二醇部分、白蛋白、或重链及/或轻链恒定区。

应理解，除“双特异性”或“双功能性”抗体外，抗体应理解为其各结合位点均为相同的。“双特异性抗体”或“双功能性抗体”是一种具有2个不同重链/轻链配对及2个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可借助各种方法(包括融合杂交瘤或链接Fab′片段)来产生。参见，例如，Songsivilai及拉赫曼(Lachmann)(1990)临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)79：315-21；克斯特尼(Kostelny)等人(1992)免疫学杂志(J.Immunol.)148：1547-53。

词组“蛋白”或“蛋白产物”是指一种或多种氨基酸链。如本文所用术语“蛋白”与“多肽”同义且如所属领域通常所理解，是指通过顺序肽键链接的至少一种氨基酸链。在某些实施例中，“相关蛋白”或“相关多肽”是通过已转化到宿主细胞中的外源核酸分子编码的蛋白。在某些实施例中，其中“相关蛋白”由用于转化宿主细胞的外源DNA编码，所述外源DNA的核酸序列决定了氨基酸的序列。在某些实施例中，“相关蛋白”是一种通过宿主细胞内源性核酸分子编码的蛋白。在某些实施例中，可通过用外源核酸分子转染宿主细胞来改变此相关内源性蛋白的表达，所述外源核酸分子可(例如)含有一个或多个调控序列及/或编码可增强相关蛋白表达的蛋白。本发明的方法和组合物可用于生产任何相关蛋白，包括但不限于具有医药特性、诊断特性、农用特性及/或可用于商业、实验及/或其它应用中各种其它特性的任一种特性的蛋白。另外，相关蛋白可为蛋白治疗剂。即，蛋白治疗剂是一种对其在体内的一个作用区域或对其通过中间体远程作用的一个身体区域具有生物效用的蛋白。蛋白治疗剂的实例更详细地陈述于下文中。在某些实施例中，使用本发明方法及/或组合物产生的蛋白可经加工及/或改良。举例来说，可依据本发明产生的蛋白可经糖基化。

本发明可用于培养细胞以有利地生产任何治疗性蛋白，例如，医药上或商业上相关酶、受体、抗体(例如，单克隆及/或多克隆抗体)、Fc融合蛋白、细胞因子、激素、调控因子、生长因子、凝结/凝血因子、抗原结合因子等。一名普通技术人员应可认识到能够依据本发明生产的其它蛋白且应能够使用本文所揭示方法来生产所述蛋白。

重组宿主细胞的表达构建体和产生

本发明使用重组宿主细胞，例如，原核或真核宿主细胞，即，经含有编码相关多肽的核酸的表达构建体转染的细胞。词组“动物细胞”涵盖无脊椎动物细胞、非哺乳动物脊椎动物(例如，鸟类、爬行动物和两栖动物)细胞、及哺乳动物细胞。无脊椎动物细胞的非限制性实例包括下列昆虫细胞：草地粘虫(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊虫)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊虫)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)、及家蚕(Bombyx mori)(桑蚕/蚕蛾)。

许多哺乳动物细胞系是用于相关多肽重组表达的适宜宿主细胞。哺乳动物宿主细胞系包括(例如)COS、PER.C6、TM4、VERO076、MDCK、BRL-3A、W138、Hep G2、MMT、MRC5、FS4、CHO、293T、A431、3T3、CV-1、C3H10T1/2、Colo205、293、HeLa、L细胞、BHK、HL-60、FRhL-2、U937、HaK、Jurkat细胞、Rat2、BaF3、32D、FDCP-1、PC12、M1x、鼠科动物骨髓瘤(例如，SP2/0及NS0)及C2C12细胞、以及经转化灵长类动物细胞系、杂交瘤、正常二倍体细胞、及源白原代组织及原代细胞(primary explant)活体外培养的细胞株。能够表达相关多肽的任何真核细胞可用于所揭示培养基设计方法。许多细胞系可白商业来源获得，例如，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)。在一个本发明实施例中，所述细胞培养(例如，大规模细胞培养)采用杂交瘤细胞。抗体产生杂交瘤细胞的构建为业内所熟知。在一个本发明实施例中，所述细胞培养(例如，大规模细胞培养)采用CHO细胞。

另一选择，可能在低级真核生物(例如，酵母菌)或在原核生物(例如，细菌)中以重组方式产生相关多肽。适宜酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母菌株(Kluyveromyces strains)、念珠菌属(Candida)、或能够表达相关多肽的任何酵母菌株。适宜细菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、或能够表达相关多肽的任何细菌株。在细菌中表达可形成纳入所述重组蛋白中的包涵体。因此，可能需要重组蛋白再折叠以产生活性或更具活性材料。若干从细菌包涵体获得经恰当地折叠的异源性蛋白的方法为所属领域所知。这些方法通常涉及使所述蛋白白所述包涵体溶解，随后使用离液剂使所述蛋白完全变性。当在所述蛋白的基本氨基酸序列中存在半胱氨酸残基时，经常必需在可恰当地形成二硫键(氧化还原系统)的环境中完成所述再折叠。再折叠的通用方法揭示于科诺(Kohno)(1990)酶学方法(Meth.Enzymol.)185：187-95，欧洲专利EP 0433225和美国专利第5,399,677号中。

本发明使用由至少一种编码相关多肽的聚核苷酸构成的构建体，其呈质粒、载体、及转录或表达盒形式。载体能够引导以可操作方式与其链接的基因表达。所述载体在本文中称作“重组表达载体”或“表达载体”。总的来说，在重组DNA技术中可用表达载体经常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意欲包括具有等效功能的其它形式的表达载体，包括但不限于病毒载体(例如，复制缺陷型反转录病毒、经改造甲病毒(alphaviruses)、腺病毒及腺伴随病毒)。

适用于在动物细胞中蛋白表达的构建体为所属领域所熟知。举例来说，聚核苷酸可以可操作方式链接到表达控制序列，例如，那些存于揭示于(例如)考夫曼(Kaufman)等人(1991)核酸研究(Nuc.Acids Res.)19：4485-90中的pMT2或pED表达载体中的表达控制序列。其它适宜表达控制序列可发现于所属领域已知的载体中且包括但不限于：HaloTag^TM pHT2、pACT、pBIND、、pCI、phRG、phRL(普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊(Madison)，WI)；pcDNA3.1、pcDNA3.1-E、pcDNA4/HisMAX、pcDNA4/HisMAX-E、pcDNA3.1/Hygro、pcDNA3.1/Zeo、pZeoSV2、pRc/CMV2、pBudCE4pRc/RSV(英杰生命技术公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，CA)；pCMV-3Tag载体、载体、pCMV-Tag载体、pSG5载体(吉泰公司(Stratagene)，拉由拉市(La Jolla)，CA)；pDNR-Dual、pDNR-CMV(克隆泰公司(Clonetech)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，CA)；及pSMEDA(惠氏公司(Wyeth)，麦迪逊，WI)。表达重组蛋白的通用方法也为人们所知且例示于(例如)考夫曼(1990)酶学方法(Meth.Enzymol.)185：537-66中。

如本文所定义“以可操作方式链接”意指以酶促方式或以化学方式连接以在拟表达聚核苷酸与表达控制序列之间以可通过转染宿主细胞表达编码蛋白的方式形成共价键。

本发明的重组表达构建体可携带额外序列，例如，调控序列(例如，可调控载体复制(例如，编码相关多肽(或肽)的核酸序列的复制、转录起点)或所述编码多肽表达的序列)、标签序列(例如，组氨酸)、及可选择标记基因。术语“调控序列”意欲包括启动子、增强子及任何其它可控制转录、复制或转译的表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号、转录剪接位点)。所述调控序列阐述于(例如)戈德尔(Goeddel)，基因表达技术(Gene Expression Technology)：酶学方法(Methods in Enzymology)，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，CA(1990)中。那些所属领域的技术人员应会意识到包括调控序列选择在内的表达载体设计将取决于各种因素，包括宿主细胞的选择和期望蛋白表达程度。供蛋白在哺乳动物宿主细胞中表达的优选调控序列包括针对高程度蛋白表达的病毒元件，例如，源自FF-la启动子和BGH poly A、巨细胞病毒(CMV)的启动子及/或增强子(例如，CMV启动子/增强子)、源自猿病毒40(SV40)的启动子及/或增强子(例如，SV40启动子/增强子)、源自腺病毒的启动子及/或增强子(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))及源自多瘤病毒的启动子及/或增强子。病毒调控元件及其序列阐述于(例如)美国专利第5,168,062号、第4,510,245号及第4,968,615号中，所有所述案件的全文均以引用的方式纳入本文中。

可选择或构建含有适当调控序列的适宜载体，所述调控序列包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因及其它序列，视情况而定。在所揭示方法中还可使用通过使用具有诱导型启动子序列的载体(例如，四环素诱导型载体，例如，pTet-On^TM和pTet-Off^TM(克隆泰(Clontech)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，CA))所实现的诱导型蛋白表达。关于表达载体的其它详情，参见，例如，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：a Laboratory Manual)(第2版)萨姆布鲁克(Sambrook)等人编写，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(ColdSpring Harbor)，NY(1989)。关于核酸操控(例如，在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA导入细胞中、基因表达、及蛋白分析中)的许多已知技术和方案还详细地阐述于最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology)(第2版)奥苏贝尔(Ausubel)等人编写，约翰威利父子出版社(Wiley&Sons)，阿拉梅达(Alameda)，CA(1992)中。

插入表达构建体以产生相关多肽的聚核苷酸可编码任何能够在细胞培养物中所用宿主细胞中表达的多肽。因此，所述聚核苷酸可编码全长基因产物、部分全长基因、肽、或融合蛋白。所述聚核苷酸可由基因组DNA或cDNA构成且可源自任何动物。聚核苷酸可通过所属领域熟知的方法(例如，PCR或RT-PCR)从细胞或生物体分离或可通过已知习用化学合成方法来生产。所述以化学方式合成的聚核苷酸可与天然聚核苷酸拥有若干同样的生物特性且因此可用作天然聚核苷酸的替代物。

多肽还可通过在一种或多种昆虫细胞表达载体(例如，杆状病毒载体)中以可操作方式链接所述编码相关多肽的聚核苷酸与适宜控制序列并采用昆虫细胞表达系统来以重组方式产生。用于杆状病毒/Sf9表达系统的材料和方法可以试剂盒形式自市场上购得(例如，试剂盒，英杰生命技术公司，卡尔斯巴德，CA)。

可通过所属领域熟知的许多方法来实现所述表达构建体对宿主细胞(例如，动物细胞)的转染。细胞可经瞬时转染或经稳定转染。存在可用于将分子(特别是核酸)递送到宿主细胞(例如，动物细胞)中的若干不同的公认方法。随细胞类型、期望转染(即，瞬时或稳定)、及具体实验要求(例如，不同细胞系或原发细胞的转染、转染分子类型(基因组DNA、DNA、寡核苷酸)、或所选表达构建体)而定，各转移方法具有那些所属领域的技术人员已知的优点和缺点。常用转染方法包括(例如)磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、基因枪、电穿孔、纳米粒子递送、聚胺、附加体、及聚乙烯亚胺。另外，许多转染试剂盒和试剂可从诸如下述等公司购得：英杰生命技术公司(VOYAGER^TM，)、EMD生命科学公司(EMDBiosciences)，圣地亚哥，CA(GENEJUICE^TM)、起安捷(Qiagen)，杰曼镇(Germantown)，MD(SUPERFECT^TM)、奥比杰(Orbigen)，圣地亚哥，CA(SAPPHIRE^TM)，且许多其它转染试剂盒和试剂为那些所属领域的技术人员所知。转染方案还可发现于分子生物学的基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)(第2版)Davis等人编写，阿普顿朗格出版社(Appleton and Lange)，CT(1994)中。

本发明使用细胞培养物(例如，大规模动物细胞培养物)来产生大量相关多肽。大规模瞬时转染方法揭示于大规模哺乳动物细胞培养物技术(Large-scale MammalianCell Culture Technology)(生物技术和生物工艺系列(Biotechnology and BioprocessingSeries))，Lubiniecki编写，马塞尔.德克尔出版社(Marcel Dekker)，NY(1990)；Kunaparaju等人(2005)生物技术生物工程(Biotechnol.Bioeng.)91：670-77；米尔瑞拉(Maiorella)等人(1988)生物/技术(Bio/Technology)6：1406-10；巴尔迪(Baldi)等人，上述；兰·范(Lan Pham)等人，上述；迈斯纳(Meissner)等人，上述；杜罗切(Durocher)等人，上述)。一般来说，哺乳动物细胞培养物的大规模瞬时基因表达可采用若干类型常用转染模式中的任一种(例如，聚乙烯亚胺、电场脉冲、CALFECTION^TM或磷酸钙沉淀)以在期望规模或体积(例如，大于10升)下达成高转染效率(德鲁慈(Derouazi)等人，上述；罗斯(Rols)等人(1992)欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)206(1)：115-21；伍木和伯纳德(Wurm and Bernard)(1999)生物技术新见(Curr.Opin.Biotechnol.)10(2)：156-59；斯莱格和克里斯坦森(Schlaegerand Christensen)(1999)细胞技术(Cytotechnology)30(1-3)：71-83；乔丹(Jordan)等人(1998)细胞技术(Cytotechnology)26(1)：39-47；林德(Lindell)等人(2004)生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)1676(2)：155-61)。这些大规模培养物一般是在具有搅拌板的生物反应器、振荡器或培养箱中生长，且还可称作“旋动”或“悬浮”培养物。因此，与其中细胞附着于板或烧瓶上的传统转染相反，所揭示方法一般使用悬浮培养物。大规模细胞培养物一般视为具有大于约100ml体积的细胞培养物。

在一些情形中，可能先产生表达相关多肽的细胞系且随后使用所述细胞系接种大规模细胞培养物。表达相关蛋白的稳定细胞系可通过各种熟知的方法(包括用于本文所揭示瞬时转染的方法)来产生。一般来说，稳定细胞系可通过在化学成份确定的培养基中长期生长和选择来产生。举例来说，经编码相关多肽的核酸转染(例如，通过磷酸钙沉淀、或脂质体转染)的细胞可伴随经携带新霉素抗性基因的载体转染，此赋予对新霉素/遗传霉素的抗性(G418)。经转染细胞随后在含有G418的培养基中生长且生存的细胞无性系地繁殖扩大以产生稳定表达的细胞系。此细胞系等份试样随后可用于接种大规模培养物并产生大量相关蛋白。

转染细胞需要优化若干变量，包括细胞接种密度(例如，约1x10⁵个至约3x10⁶个细胞/mL培养物)、血清浓度(例如，0-10％)、培育温度(例如，约20-38℃)、转染媒介或试剂(化学或电)、培养体积(例如，约5ml-20升)、及培育时间(例如，约24-144小时)。对于各细胞类型来说，最佳参数会有所变化。然而，对于利用选定宿主细胞转染的特定细胞类型，商业供应商一般会提供用于其转染的优化指导，如那些所属领域的技术人员已知的各种参考文献所述。此等资料来源可用于指导所选宿主细胞的转染，或可用作起始点，自所述起始点可使用简单的反复试验来提供最佳转染参数。

细胞培养物

生产相关多肽的典型程序包括分批培养和补料分批培养。在传统上，分批培养过程包括用特殊细胞密度的接种培养物接种大规模生产培养物，使所述细胞在有助于细胞生长和存活的条件下生长，当所述细胞达到指定细胞密度时收获所述培养物，并纯化经表达多肽。补料分批培养程序包括如下额外步骤：用在所述细胞生长期间消耗的营养素和其它组份补充分批培养物。一名普通技术人员应可意识到本发明可应用于任何可在其中培养细胞的系统，包括但不限于分批系统、补料分批系统和灌注系统。在本发明的某些优选实施例中，使所述细胞在补料分批系统中生长。

传统培养(例如，分批培养和补料分批培养)的持久未解决的问题是代谢废物的产生，所述代谢废物对细胞生长、存活和表达多肽产生具有不利作用。具有特别不利作用的两种代谢废物是乳酸和铵，其分别是由于葡萄糖和谷酰胺代谢而产生的。除了由于谷酰胺代谢而以酶促方式产生外，铵还会由于随时间进行非代谢性降解而聚集于细胞培养物中。

传统培养基调配物(包括市售培养基，例如，Ham′s F10(西格玛(Sigma))、最低必需培养基([MEM]，西格玛)、RPMI-1640(西格玛)和杜贝克氏改良鹰氏培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)([DMEM]，西格玛))具有较高葡萄糖和谷酰胺含量(后者是相对于其它氨基酸来说)。先前，据信，需要丰富的这些组份，这是因为所述组份是细胞初级代谢的能量来源。然而，这些营养素迅速地被消耗，造成乳酸和铵聚集，如上文所述。另外，葡萄糖和谷酰胺的初始高含量与乳酸和铵的后来聚集均会产生高摩尔渗透压浓度，此情况本身经常会对细胞生长、细胞存活和多肽产生不利。本文所揭示合理设计的培养基可经改良以减少有害代谢产物的聚集。所述改良形式可发现于(例如)美国公开专利申请案第2005/0070013号(限制葡萄糖补加)和第2006/0121568号(改良氨基酸含量和比率)中，所述两个案件的全文均以引用的方式纳入本文中。

合理的培养基设计和调配

与本发明的培养基调配物相比，传统培养基调配物以较低氨基酸总含量开始。举例来说，DME-F12(杜贝克氏改良鹰氏培养基与Ham′s F12培养基的50∶50混合物)的总氨基酸含量为7.29mM且称为RPMI-1640的传统细胞培养基的总氨基酸含量为6.44mM(参见，例如，莫顿(Morton)(1970)活体外(In Vitro)6：89-108；汉姆(Ham)(1965)美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.)53：288-93；穆尔(Moore)等人(1967)美国医学会期刊(J.Am.Medical Assn.)199：519-24，所有参考文献均以引用的方式纳入本文中)。最新培养基调配物(例如，揭示于美国公开专利申请案第2006/0121568号中的培养基)含有更高浓度的氨基酸和营养素。然而，传统调配物并非基于实际计算的细胞要求(其包括细胞生长、细胞维持)和(对于用于生产重组多肽的细胞培养物来说)生产要求。使用本文所提供这些变量是确定具有更高而且无毒性总氨基酸浓度的培养基调配物的方法。

本文所述细胞培养基调配物(例如，大规模细胞培养基调配物)在依据(例如)本文所述其它培养步骤及依据(例如)诸如那些发现于(例如)美国公开专利申请案第2006/0121568号中的改良形式等改良形式使用时可优化细胞密度和多肽效价。本文所述培养基调配物的氨基酸浓度是基于1)细胞群细胞群；2)细胞维持；和3)多肽生产所需氨基酸浓度。在一个本发明实施例中，细胞培养基含有用于细胞群细胞群的计算浓度的氨基酸、用于细胞维持的计算浓度的氨基酸、及纳入相关多肽中的计算浓度的氨基酸。在另一本发明实施例中，细胞培养基含有通过等式A＝[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F表示的浓度A的氨基酸，其中X是每单位细胞群细胞群所用氨基酸浓度，P是针对每单位多肽效价纳入相关多肽中的氨基酸浓度，M是期望细胞群细胞群(即，期望细胞群细胞群峰值单位)的乘数，N是相关多肽的期望浓度(即，期望或目标多肽效价)的乘数，Y是细胞维持因数；且F是基线因数。

在上述等式中针对每单位多肽效价纳入相关多肽中的氨基酸浓度P是基于重组蛋白的一级结构，即，所述多肽的氨基酸含量。因此，P将根据拟通过所述大规模细胞培养生产的相关多肽而有所变化。随后可使用相关多肽的期望浓度(即，期望或目标多肽效价)的乘数N将P转化成对相关多肽目标浓度的氨基酸要求。在下文一些本发明代表性实例中，多肽效价的基本单位是1g/L。在含有使用本文所提供等式所获得代表性计算值的下文表1中，在10g/L效价下相关多肽所需细胞培养基的氨基酸浓度(第4列)可通过在1g/L下所需氨基酸浓度P(第2列)乘以乘数N来确定，其中N＝10。

表1：在期望细胞群细胞群下10g/L抗体目标效价所需经基线调整氨基酸浓度的代表性确定值，其中期望细胞群细胞群是通过15x10⁶个细胞/mL的期望峰值细胞密度来表示。

可通过(例如)将特定细胞系的整合活细胞密度(IVC)乘以单位生产率(qp)来计算乘数N(N＝IVC*qp)。举例来说，如果特定细胞系的接种密度是0.8x10⁶个细胞/mL，在第6天和第10天的细胞密度是15x10⁶个细胞/mL，且在第18天的细胞密度是11x10⁶个细胞/mL(即，在第6天和第15天是该数值的73％)，那么IVC＝211x10⁶(个细胞/mL)*天(即，[(0.8+15)/2]*6天+[(15+15)/2]*4天+[(15+11)/2]*8天)。如果所选细胞系的平均单位生产率(qp)是(例如)47μg/10⁶个细胞/天，那么在第18天N＝10g/L(即，211x10⁶(个细胞/mL)*天x47μg/10⁶细胞/天)。一名熟悉所属技术领域的人员会了解可对任何细胞系进行这些计算或可根据细胞特征和来源来估计此N值。另一选择，所述乘数N不需要从IVC和qp计算且可简化为特殊细胞培养物的合理目标效价。阐述IVC和qp计算以及合理N和M值的进一步选择的预计实例作为实例5在下文中提供。

如本文所用“细胞群细胞群”、“细胞密度”和类似词组是指一群细胞。举例来说，细胞群细胞群可指细胞沉淀物。如本文所用“期望细胞群细胞群”及类似词组是指实践人员期望在细胞培养物中获得的一群细胞，例如，细胞沉淀物。如本文所用“细胞群细胞群单位”及类似词组反映表示细胞群细胞群的许多方式，例如，细胞数目、细胞密度、细胞体积、堆积细胞体积、细胞干重等。一名所属领域的技术人员会知道对于特定实验条件来说如何最方便或适当地表示细胞群细胞群单位等。一名所属领域的技术人员还应理解随细胞群细胞群单位而定，期望细胞群细胞群乘数M(即，期望细胞群细胞群峰值单位)可通过期望峰值细胞数目、期望峰值细胞密度、期望峰值细胞体积、期望峰值堆积细胞体积、期望峰值干重等来表示。

在一个本发明实施例中，通过细胞密度表示细胞群细胞群单位且通过期望峰值细胞密度表示期望细胞群细胞群。在另一实施例中，通过细胞干重或质量表示细胞群细胞群单位。经脱水细胞群细胞群基本上是由存于此细胞群细胞群中的所有蛋白、碳水化合物、脂质和核酸构成。因此，氨基酸浓度X可以实验方式测定，通过首先旋动已知数目的细胞以形成细胞沉淀物，对所述细胞沉淀物进行干燥且接下来将经干燥沉淀物暴露于酸水解，借此使所述细胞沉淀物的细胞蛋白溶解以产生个别氨基酸，随后通过氨基酸分析仪定量所述氨基酸(参见，例如，实例1)。此提供给定数目细胞的氨基酸浓度X，随后使用M，期望峰值细胞密度的乘数将所述氨基酸浓度X转化成期望峰值细胞密度的氨基酸要求。在表1中，15x10⁶个细胞/mL期望峰值细胞密度所需细胞培养基的总氨基酸浓度(第5列)可通过将10⁶个细胞/mL所需氨基酸浓度X(第3列)乘以乘数M来确定，其中M＝15。因此，在本发明的一些代表性实例中，所述细胞群细胞群单位是10⁶个细胞/mL。另一选择，例如，对于已知可能会降解的氨基酸来说，在上文等式中所用氨基酸浓度X可从文献值确定，例如，妮柏格(Nyberg)等人(1999)生物技术生物工程(Biotechnol.Bioeng.)62：324-35；纳多(Nadeau)等人(2000)代谢工程(Metab.Eng.)2：277-92；及伯纳里斯(Bonarius)(1996)生物技术生物工程(Biotechnol.Bioeng.)50：299-318，或揭示于所述出版物或所属领域已知的类似出版物中的方法。

当期望细胞群细胞群的乘数M代表期望峰值细胞密度时，M可选择为(例如)特定细胞系的峰值密度，即所述细胞系生产率达最大时的密度，或细胞系在特定时期时基于具体生长速率的预测密度。

细胞维持所需细胞培养基的氨基酸浓度Y是期望细胞群细胞群(例如，期望峰值细胞密度)所需氨基酸浓度的百分比。在一个本发明实施例中，维持要求可介于期望细胞群要求的0％与300％之间，此可在无营养素引发毒性风险的情况下提供足够营养素以供细胞使用。在另一本发明实施例中，维持要求可介于期望细胞群要求的0％至150％之间，此可在无营养素引发毒性风险的情况下提供足够营养素以供细胞使用。维持要求随着培养时程增加而增加(例如，对于21天培养来说维持要求为100-150％)。在表1中，细胞维持所需细胞培养基的氨基酸浓度(第6列)可通过将期望峰值细胞密度所需氨基酸浓度(第5列)乘以细胞维持因数Y来确定，在此代表性实例中，所述细胞维持因数Y是100％，从而可获得延长的培养期。对于不同的细胞(和不同的细胞系)来说，维持因数Y会有所不同，此随细胞在培养物中的独特代谢需求而定。而且，细胞在培养物中的维持要求也会因在过程中的变动(例如，接种密度、培养时程、温度转变的时间等)而有所不同。作为初始指导，人们可(例如)在第0至5天为培养物提供0％维持(每日)，在第6至10天为培养物提供3％至5％维持(每日)，及在第11至21天为培养物提供7％至10％维持(每日)。对于大于21天的过程来说，对那些额外天数可提供2％至5％维持(每日)培养物。一名普通技术人员会了解调整维持因数Y以优化密度和效价仅为常规反复试验的问题。依据细胞维持要求调整氨基酸浓度对于增加存活率及细胞培养物生产率来说十分重要且因此是本发明的一个重要方面。举例来说，依据细胞维持要求调整氨基酸浓度能够使所述细胞培养物持续更高细胞密度、细胞存活率并产生更高多肽效价(参见，例如，实例6)。

一旦确定期望：1)细胞群(第5列)；2)细胞维持(第6列)；和3)对于目标效价来说的多肽生产(第4列)的氨基酸要求，就可获得所述目标细胞培养物的总氨基酸浓度计算值。在表1中，目标细胞培养物所需细胞培养基的总氨基酸浓度计算值(第7列)可通过将在10g/L效价下相关多肽所需细胞培养基的氨基酸浓度(第4列)、15x10⁶个细胞/mL期望峰值细胞密度所需细胞培养基的氨基酸浓度(第5列)、及选定细胞维持水平所需细胞培养基的氨基酸浓度(第6列)加合来确定。

一旦按照上文所述获得目标细胞培养物所需细胞培养基的总氨基酸浓度计算值，就可通过基线因数F将所述值调整到期望细胞培养基氨基酸浓度A，此会产生氨基转移的驱动力，例如，细胞群转移所需额外氨基酸、驱动转运跨过细胞膜所需额外氨基酸等。此经调整的数值A在本文中称作“基线调整的氨基酸浓度”或“优化浓度”。经基线调整的氨基酸浓度A表示会递送到培养物中且相对于培养物最终体积表达的累积氨基酸总量，所述培养物最终体积包括起始培养基的体积加上灌注或补料分批培养的任何补料的体积。将总氨基酸浓度调整到基线调整的氨基酸浓度是本发明的一个重要方面，这是因为此容许更高细胞存活率、细胞密度和多肽效价(参见，例如，实例6)。

可将细胞培养基的总氨基酸浓度计算值增加高达200％的基线因数F可介于1(0％增加)至3(200％增加)之间。在一个本发明实施例中，F的范围是介于1与1.5之间。在另一本发明实施例中，低于1的F值可通过改良细胞培养基的总氨基酸浓度计算值而偏置(表1，第7列)，此可通过改良期望细胞群所需氨基酸浓度、细胞维持所需氨基酸浓度及/或引入相关多肽中所需氨基酸浓度来实现。举例来说，0.5基线因数可通过将细胞培养基的总氨基酸浓度计算值增加(例如)两倍(或更多倍)而偏置，此可通过改变M、X、N、P及/或Y来实现。在表1中，目标效价和期望峰值细胞密度所需细胞培养基的经基线调整氨基酸浓度A(第8列)可通过将细胞培养基的总氨基酸浓度计算值(第7列)乘以基线因数F来确定，所述基线因数F在表1的代表性实例中为1.3(对应于30％增加，相对于细胞培养基的总氨基酸浓度值来说)。

含有基线调整浓度A的氨基酸的培养基在本文中称作“期望细胞培养基”。因此，“期望细胞培养基”表示具有基线调整浓度A的目的培养基(goal medium)。此培养基包含至少一种通过上述等式确定浓度的氨基酸。优选地，所述期望细胞培养基含有一种以上通过上述等式确定浓度的氨基酸。更优选地，所述期望细胞培养基含有至少12种通过上述等式确定的经调整浓度的氨基酸，例如，经调整浓度的精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸。一名所属技术领域的人员应理解，期望细胞培养基的经基线调整氨基酸浓度A可通过许多方式来获得，所述方式包括但不限于分别添加各氨基酸、添加蛋白胨或其它蛋白水解产物及/或通过向起始细胞培养基(或起始细胞培养基混合物，例如，培养基粉末)中添加另一浓缩细胞培养基(例如，补加细胞培养基(或培养基混合物，例如，培养基粉末)。一名所属技术领域的人员应理解添加蛋白胨(或其它蛋白水解产物)可通过所选特定蛋白胨产品的氨基酸含量来指导或通过确定由特定蛋白胨所提供氨基酸浓度来指导，例如，一般来说，5g/L蛋白胨可提供约40mM至约50mM的总氨基酸浓度。

期望细胞培养基的氨基酸浓度是基于至少一种通过本文所揭示本发明等式确定的基线调整浓度A的氨基酸；然而，此浓度以及所述期望细胞培养基的其它氨基酸浓度可能因受若干因素的影响而与经基线调整氨基酸浓度有所不同。举例来说，某些氨基酸可能在培养期间产生且因此可保持在低含量。其它氨基酸可基于公开数值(参见，例如，美国公开专利申请案第2006/0121568号)而有所变化。而且，一些氨基酸(例如，甲硫氨酸)可以更大速率被特定细胞类型消耗且因此应添加过量。另一些氨基酸(例如，脯氨酸)为细胞生长和多肽生产提供驱动力(参见实例4)，且这些氨基酸在一些情况下应以比通过上述本发明等式所确定量更高的量提供。另外，如果使用上述等式获得的浓度被视为具有毒性，那么人们可改良经基线调整氨基酸浓度(例如，考虑丝氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸的含量)。在获得在期望细胞培养基中所用氨基酸的经基线调整氨基酸浓度A后，依据诸如那些上文所指定因数等因数改变所述经基线调整氨基酸浓度是在一名所属技术领域人员的知识范围内。

可从(或基于)各来源(例如，美国公开专利申请案第2005/0070013号及第2006/0121568号)来计算额外培养基组份(例如，维生素、盐、葡萄糖、元素)。而且，可改良使用上述等式所获得氨基酸的经基线调整氨基酸浓度A以提供相对于另一氨基酸的特定比率(例如，谷酰胺与天冬酰胺的比率)或使其在期望组合浓度范围内(例如，谷酰胺与天冬酰胺的组合浓度)。举例来说，已知高天冬酰胺、低谷酰胺培养基结合温度转变可促进乳酸吸收，借此对细胞培养物进行解毒(美国公开专利申请案第2006/0121568号)。因此，人们可能希望改良谷酰胺及/或天冬酰胺的基线调整浓度A以获得最佳比率。

应注意，从表1的代表性实例可见，在期望细胞培养基中所用各基线调整的氨基酸浓度的组合浓度较高，即，高于243mM。因此，本文揭示如下发现：如果此浓度是基于目标细胞密度和多肽效价的计算氨基酸要求，那么高浓度氨基酸可在无毒性或效价损害的情况下用于期望细胞培养基。在一个本发明实施例中，期望细胞培养基中各氨基酸的组合浓度是介于约120mM与约250mM之间。在其它实施例中，期望细胞培养基中各氨基酸的组合浓度为大于约250mM，例如，约260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500或510mM，或任何中间值。

用于期望细胞培养基的氨基酸的上述确认基线调整浓度A可用于分批培养、补料分批培养和灌注培养。当用于分批培养时，在期望细胞培养基中所用初始氨基酸浓度是经基线调整的氨基酸浓度A。当用于补料分批培养或灌注培养时，经基线调整氨基酸浓度A表示可递送给培养物的累积氨基酸总量，其包括起始培养基的体积加上所有补料的体积。因此，对于使用连续补料(例如，在第3-21天补料)或周期性补料(例如，每2-3天补料)的补料分批培养来说，改造起始培养基以使其含有依据等式B＝[A-(Z*V)]/(1-V)确定的起始氨基酸浓度B，其中Z是补加细胞培养基的氨基酸浓度，且V是占期望细胞培养基体积一定比例的补加培养基体积。获得起始氨基酸浓度B所需计算的代表性实例提供于下文表2中。在表2中，根据17％补料体积(V＝17％)和补加培养基氨基酸浓度Z(第4列)将一些经基线调整氨基酸浓度A(第2列)转化成起始培养基氨基酸浓度B(第5列)。在此实例中，改变若干经基线调整氨基酸浓度A(第2列)和起始氨基酸浓度B(第5列)以获得在第3列和第6列中以粗体显示的数值。天冬酰胺、门冬氨酸、谷酰胺和半胱氨酸浓度的改良是基于由美国公开专利申请案第2006/0121568号所提议浓度；将甲硫氨酸调整50％以补偿其比预测值更高的量的消耗；丙氨酸、谷氨酸和甘氨酸通过培养物产生(且因此保持在低浓度)；且丝氨酸、酪氨酸和缬氨酸浓度降低至无毒性含量。因此，应理解，所述起始氨基酸浓度B可基于经基线调整氨基酸浓度A或基于改良经基线调整氨基酸浓度。

一名所属技术领域的人员应意识到，在补料分批和灌注细胞培养期间获得期望细胞培养基所用补加培养基应尽可能的高度浓缩以避免从于其中进行培养的容器(例如，生物反应器或振荡烧瓶)中溢出及避免稀释培养基组份。在表2中所述实例中，优选补加培养基表示“补料培养基”，且补料培养基的氨基酸浓度Z陈述于第4列中。然而，可使用任何高度浓缩补加培养基或任何可为起始细胞培养基提供高度浓缩氨基酸的方法，只要可以目标体积达到期望经基线调整的氨基酸浓度A。经常使用为细胞培养物提供高度浓缩氨基酸的所述方法且所述方法为一名所属技术领域的人员熟知。

一名所属技术领域的人员应理解，起始细胞培养基的起始氨基酸浓度B可通过许多方式来实现，所述方式包括但不限于分别添加各氨基酸、添加蛋白胨及/或其它蛋白水解产物及/或向起始细胞培养基(或起始细胞培养基混合物，例如，培养基粉末)中添加另一浓缩培养基(或培养基混合物，例如，培养基粉末)。一名所属技术领域的人员还应理解，补加细胞培养基的氨基酸浓度Z可通过许多方式来实现，所述方式包括但不限于分别添加各氨基酸、添加蛋白胨及/或其它蛋白水解产物、及/或向补加细胞培养基(或补加细胞培养基混合物，例如，培养基粉末)中添加另一浓缩培养基(或培养基混合物，例如，培养基粉末)。

应注意，从表2的代表性实例可见，在起始细胞培养基中所用各氨基酸的组合浓度较高，即，高于125mM。因此，本文揭示如下发现：如果所述起始氨基酸浓度是基于期望峰值细胞密度和期望多肽效价的计算氨基酸要求，那么高浓度氨基酸可在无毒性或效价损害的情况下用于起始细胞培养基。在一个本发明实施例中，各氨基酸的组合浓度是介于约70mM与约510mM之间。在一个本发明实施例中，各氨基酸的组合浓度是介于约120mM与约350mM之间。在另一本发明实施例中，各氨基酸在起始细胞培养基中的组合浓度是介于约70mM与约140mM之间。在另一本发明实施例中，各氨基酸在起始细胞培养基中的组合浓度是大于约140mM。

表2：对于10g/L抗体目标效价、15x10⁶个细胞/mL期望峰值细胞密度和17％补料来说，起始氨基酸浓度的代表性确定

如在表3A和表3B中所示，可针对任何期望目标多肽效价和期望峰值(目标)细胞密度计算在期望细胞培养基中所用氨基酸的经基线调整氨基酸浓度A的确定值和在起始细胞培养基中所用起始氨基酸浓度B的确定值。对于补料分批培养来说，大规模培养物的期望峰值细胞密度可介于约3x10⁶个细胞/mL与约40x10⁶个细胞/mL之间。在一个本发明实施例中，期望峰值细胞密度可介于约5x10⁶个细胞/mL至约20x10⁶个细胞/mL之间。大规模培养的目标效价可介于约3g/L至约25g/L之间。在又一本发明实施例中，大规模培养的目标效价可介于约5g/L至约20g/L之间。举例来说，在表3中，期望峰值细胞密度介于10x10⁶个细胞/mL至15x10⁶个细胞/mL之间，且目标效价可在3g/L至10g/L之间变化。

表3A：对于各种目标效价(如通过目标多肽效价的乘数，N所表示)和期望峰值细胞密度(如通过期望峰值细胞密度的乘数，M所表示)来说，基线调整的氨基酸浓度A的代表性实例

A	N＝10 M＝15	N＝5 M＝12.5	N＝3 M＝10
				氨基酸浓度	mM	mM	mM
ALA	17.2	12.5	9.50
				ARG	8.5	6.3	4.81
ASN	9.2	6.5	4.89
				ASP	15.1	11.3	8.68
CYS	6.1	4.3	3.20
				GLU	11.3	7.7	5.60
GLN	16.5	12.1	9.14
				GLY	16.0	11.3	8.43
HIS	4.8	3.3	2.46
				ILE	7.9	6.0	4.60
LEU	16.2	11.4	8.50
				LYS	16.0	11.1	8.18
MET	3.5	2.5	1.87
				PHE	7.7	5.4	3.99
PRO	13.8	8.9	6.36
				SER	25.9	17.4	12.66
THR	16.8	11.0	7.93
				TRP	3.6	2.3	1.61
TYR	9.1	6.1	4.43
				VAL	18.7	12.4	8.94
总量	243.8	169.8	125.8

表3B：对于各种目标效价(如通过目标多肽效价的乘数，N所表示)和期望峰值细胞密度(如通过期望峰值细胞密度的乘数，M所表示)来说，起始培养基氨基酸浓度B的代表性实例；通过从经基线调整氨基酸浓度扣除补料和其它变化值来确定起始培养基氨基酸浓度。

使用所述等式确定经基线调整氨基酸浓度并开发大规模多肽生产的期望细胞培养基调配物，本发明者已确认出可获得高效价和高细胞密度培养物的若干标准。通过在表4中所示数值表示的产生高于5g/L效价的标准包括但不限于下述中的一个或多个：大于或等于约3mM酪氨酸；介于约7mM与约30mM之间的脯氨酸；介于约7mM与约30mM之间的缬氨酸；介于约7mM与约30mM之间的亮氨酸；介于约7mM与约30mM之间的苏氨酸；介于约7mM与约30mM之间的赖氨酸；介于约35mM与约150mM之间的亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苏氨酸和缬氨酸的组合浓度；占期望细胞培养基中全部必需氨基酸的介于约60％至约80％之间的亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和缬氨酸的组合浓度；占期望细胞培养基中全部必需氨基酸的介于约30％至约50％之间的期望细胞培养基中必需氨基酸的组合浓度；及/或介于约75mM与约510mM之间的全部氨基酸组合浓度。

表4：对于各种目标效价和期望峰值细胞密度来说，合理设计的培养基的氨基酸含量和关系的代表性实例(如上文所示，多肽效价的基本单位是1g/L，且细胞群的基本单位是10⁶个细胞/mL)。

在表4中，粗体氨基酸是缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸和赖氨酸，斜体氨基酸是必需氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和缬氨酸；且对于CHO细胞培养物来说，脯氨酸也是必需氨基酸；一名所属技术领域的人员可认识到必需氨基酸定义随其应用于不同细胞而可有所变动)。表4提供CHO细胞在各种目标细胞密度(M)、目标效价(N)、细胞维持要求(Y)、和基线调整(F)下的代表性期望细胞培养基。

一名所属技术领域的人员会意识到，本发明的合理设计的培养基可用于生产相关多肽，或可用于并非设计用于多肽生产的细胞培养物。因此，合理设计的培养基可用于所揭示的细胞培养方法中，例如，用于不含改造用于产生外源相关多肽的宿主细胞或并非培养用于产生内源相关多肽的细胞培养物(例如，大规模细胞培养物)的有效生长、复制及/或维持。在此情形中，期望细胞培养基不需要考虑纳入相关多肽中所需氨基酸，而是含有基于1)期望细胞群和2)细胞维持所需氨基酸浓度的氨基酸浓度。用于所揭示细胞培养方法的此期望细胞培养基含有依据等式A′＝[(M*X)+(Y*M*X)]*F确定的基线调整浓度A′的氨基酸，其中X是每单位细胞群所用氨基酸浓度，M是细胞培养物的期望峰值细胞群(例如，期望峰值细胞密度等)的乘数，Y是细胞维持因数，且F是基线因数。随后对处于容许细胞在细胞培养物中生长和复制的条件下的细胞培养物提供依据此等式所产生期望细胞培养基。在一个本发明实施例中，所述细胞培养方法使用大规模细胞培养物。在另一本发明实施例中，所述细胞培养方法使用动物细胞。

向细胞培养基添加脯氨酸

使用本文所揭示合理的培养基设计方法确定了在细胞培养物(例如，大规模细胞培养物)的培养期间维持高脯氨酸含量会达成多肽效价增加及细胞密度增加。此脯氨酸“阈值”介于约1mM至约2mM之间，且脯氨酸在维持上述此阈值的细胞培养物中的含量似乎为产生高细胞密度、高效价大规模细胞培养物的驱动力。令人感兴趣的是，脯氨酸驱动的多肽效价和细胞存活率增加同时会增加培养物对额外氨基酸的要求(以满足提高的消耗速率)，此至少可部分地解释为什么本文合理设计的培养基调配物含有高浓度的氨基酸。

提供细胞培养物

制备通过分批和补料分批培养来生产多肽的哺乳动物细胞的各种方法为所属领域所熟知。如上文所述，可通过许多熟知技术将足以达成表达的核酸(通常为含有编码相关多肽的核酸及任何以可操作方式链接的基因控制元件的载体)引入宿主细胞系中。通常，需筛选细胞以确定那些宿主细胞实际上收纳了所述载体并表达相关多肽或蛋白。检测通过哺乳动物细胞表达的特定相关多肽或蛋白的传统方法包括但不限于免疫组织化学技术、免疫沉淀技术、流式细胞仪技术、免疫荧光显微术、SDS-PAGE、西方点渍分析技术、酶联免疫吸附分析(ELISA)技术、高效液相色谱(HPLC)技术、生物活性分析和亲和色谱法。一名普通技术人员可认识到其它适当技术也可检测经表达多肽或蛋白。如果诸多宿主细胞表达所述相关多肽或蛋白，那么可使用一些或所有列举技术来确定哪些细胞以最高程度表达所述多肽或蛋白。

一旦确认表达相关多肽或蛋白的细胞，就可通用一名普通技术人员熟知的各种方法中的任一种来使所述细胞在培养物中繁殖。表达相关多肽或蛋白的细胞通常可通过使所述细胞在有助于所述细胞生存、生长和存活的温度和培养基中生长来繁殖。初始培养物可具有任何体积，但经常具有比在相关多肽或蛋白最终生产中所用生产型生物反应器的培养物体积更小的体积，且通常使细胞在接种所述生产型生物反应器之前在大体积生物反应器中传代若干次。细胞培养物可经搅动或振荡以增强培养基氧化及营养素向细胞分散。另一选择或另外，可使用所属领域熟知的特殊鼓泡装置来增强及控制培养物氧化。依据本发明，一名普通技术人员应理解，控制或调控细胞培养物的一些内部条件可为有益的，所述内部条件包括但不限于pH(例如，6.6至7.6)、温度(例如，25℃至42℃)、氧和二氧化碳的含量(例如，O₂：10％至80％且CO₂：7％至15％，在整个培养中)、及摩尔渗透压浓度(例如，起始摩尔渗透压浓度为260mOsm/kg至340mOsm/kg)等等。

如本文所用术语“接种物”用于指含有表达相关多肽的核酸的细胞体积，其用于接种其中会发生大规模动物细胞培养的生产型容器，例如，生产型生物反应器。在一个本发明实施例中，所述接种物体积占最终体积的约60％至80％。

生产型生物反应器的起始细胞密度可由一名普通技术人员选择。依据本发明，生产型生物反应器的起始细胞密度可低达单一细胞每培养体积。在本发明的优选实施例中，生产型生物反应器的起始细胞密度可介于约0.1x10⁶个活细胞/mL至约10x10⁶个活细胞/mL之间且可更高。

在接种下一中间或最终生产型生物反应器之前，初始和中间细胞培养物可生长达任何期望密度。在一个本发明实施例中，接种物细胞密度为约0.5-1x10⁶个细胞/mL。优选地，大部分细胞在接种前保持活着，但并不需要全部或近乎全部存活。在一个本发明实施例中，可从上清液中取出所述细胞，举例来说，通过低速离心。在接种下一生物反应器之前还可能需要用培养基洗涤所取出细胞以去除任何不需要的代谢废物或培养基组份。所述培养基可为先前细胞已于其中生长的培养基或者其可为不同的培养基或由本发明实践人员选择的洗涤溶液。

随后将所述细胞稀释达适当密度以供接种所述生产型生物反应器。可在另一培养基或溶液(例如，起始细胞培养基或期望细胞培养基)中稀释所述细胞，随本发明实践人员的需要和期望或细胞本身的特定要求(例如，倘若细胞拟在接种生产型生物反应器之前短期储存)而定。

初始生长阶段

一旦按照上文所述接种所述生产型容器，就可使用借助本文所揭示的本发明等式所获得的期望细胞培养基将动物细胞培养物维持在初始生长阶段且在有助于所述细胞培养物生存、生长和存活的条件下。确切的条件可有所变化，随细胞类型、获得细胞的生物体、及表达的多肽或蛋白的性质和特征而定。

生产型生物反应器可具有适合多肽或蛋白大规模生产的任何体积。在一优选实施例中，生产型生物反应器的体积为至少500升。在其它优选实施例中，生产型生物反应器的体积是1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或更大，或任何中间体积。一名普通技术人员应可认识到且能够选择用于实践本发明的适宜生物反应器。所述生产型生物反应器可由任何有助于细胞生长和存活且不会影响所产生多肽或蛋白的表达或稳定性的材料制成。

细胞培养物在初始生长阶段中的温度可主要根据细胞培养物保持存活的温度范围来选择。举例来说，在初始生长阶段期间，CHO细胞在37℃下生长得很好。一般来说，大部分哺乳动物细胞在约35℃至39℃范围内生长得很好。在一个本发明实施例中，生长阶段(第0天至第3天)的温度是37℃且生产阶段(在第3天后)的温度是31℃。那些所属领域的普通技术人员应能够选择适合细胞生长的温度，此随细胞需要和实践人员的生产要求而定。

在一个本发明实施例中，将初始生长阶段的温度维持在单一恒定的温度。在另一实施例中，将初始生长阶段的温度维持在一温度范围内。举例来说，所述温度在初始生长阶段期间可稳定地升高或降低。另一选择为，所述温度可在初始生长阶段于各时刻升高或降低不连续的量。一名普通技术人员应能够确定是否使用单一温度或多个温度及是否应稳定地或以不连续的量调整所述温度。

可使所述细胞在初始生长阶段期间生长更长或更短的时间，此随实践人员的需要和细胞本身的要求而定。在一个实施例中，可使所述细胞生长足以达成占最大活细胞密度给定百分比的活细胞密度的时间，所述最大活细胞密度是细胞在生长不受打扰时会最后达到的活细胞密度。举例来说，可使所述细胞生长一段足以达成期望活细胞密度的时间，所述期望活细胞密度占最大活细胞密度的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或更大。

在另一实施例中，可使所述细胞生长指定时间。举例来说，随细胞培养物的起始浓度、细胞生长的温度、及细胞的固有生长速率而定，所述细胞可生长0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或更多天。在一些情况下，可使所述细胞生长一个月或更长时间。如果细胞在接种生物反应器中于初始生长阶段温度下的生长足以使所述生产型生物反应器在接种细胞时的活细胞密度为最大活细胞密度的期望百分比，那么可使细胞在生产型生物反应器中生长0天。本发明的实践人员应能够选择初始生长阶段的时程，此随多肽或蛋白生产要求和细胞本身的需要而定。

细胞培养物在初始培养阶段期间可经搅动或振荡以增强氧化及营养素向细胞分散。依据本发明，一名普通技术人员应理解，控制或调控生物反应器在初始生长阶段的某些内部条件可为有益的，所述内部条件包括但不限于pH、温度、氧化等。举例来说，可通过提供适量酸或碱来控制pH且可用所属领域技术人员熟知的鼓泡装置来控制氧化。

转变培养条件

在初始生长阶段结束时，可转变培养条件以便于应用第二组培养条件且在培养中发生代谢转变。抑制性代谢产物(最值得注意的是乳酸和氨)积聚会抑制生长。可通过(例如)减少乳酸比生产速率与葡萄糖比消耗速率的比率来表征通过(例如)改变温度、pH、摩尔渗透压浓度或细胞培养物的化学感应物含量所完成的代谢转变。在一个非限制性实施例中，通过改变培养物温度来转变培养条件。在另一本发明实施例中，在第1至7天发生温度转变。在另一本发明实施例中，所述温度转变至29℃-32℃。在另一本发明实施例中，在第3天发生温度转变且温度转变为31℃。关于温度转变和代谢转变的教导可发现于所属领域中(参见，例如，美国公开专利申请案第US2006/0121568号)。

后续生产阶段

一旦按照上文所论述转变所述细胞培养条件，就可将所述细胞培养物在后续生产阶段中维持在有助于细胞培养物生存和存活且可以足够(例如，在工业上视为足够)程度适当表达期望多肽或蛋白的第二组培养条件下。

如上文所述，可通过转变许多培养条件中的一个或多个条件来转变培养，所述培养条件包括但不限于温度、pH、摩尔渗透压浓度、和丁酸钠含量。在一个实施例中，转变所述培养物温度。依据此实施例，在后续生产阶段期间，将培养物维持在比初始生长阶段的温度或温度范围更低的温度或温度范围。举例来说，在后续生产阶段期间，CHO细胞在肯定介于25℃至35℃之间的温度下表达重组多肽和蛋白。在一个本发明实施例中，生产阶段在第3天后开始。在另一本发明实施例中，生产阶段在31℃下进行。如在美国公开专利申请案第US 2006/0121568号中所述，可采用多个独立的温度转变来增加细胞密度或存活率或增强重组多肽或蛋白的表达。

依据本发明等式，选择期望细胞群(例如，细胞密度)和生产效价(例如，目标效价)以确立经基线调整氨基酸浓度A和起始氨基酸浓度B。因此，一般来说，将所述细胞维持在后续生产阶段直至达到期望细胞密度或生产效价或接近期望细胞密度或生产效价的数值。在一个实施例中，将所述细胞维持在后续生产阶段直至重组多肽或蛋白的效价达到最大值。在其它实施例中，可在此时之前收获培养物，随实践人员的生产要求或细胞本身的需要或存活而定。举例来说，可将所述细胞维持一段足以达到占最大活细胞密度1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或更大的活细胞密度的时间。在一些情况下，可能需要使活细胞密度达到最大值且随后使活细胞密度下降至某一水平，然后收获所述培养物。在一极端实例中，可能需要使活细胞密度在收获所述培养物之前接近或达到零。

在本发明另一实施例中，使所述细胞在后续生产阶段期间生长指定时间。举例来说，随细胞培养物在后续生长阶段开始时的起始浓度、细胞生长的温度、及细胞的固有生长速率而定，所述细胞可生长1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或更多天。在一些情况下，可使所述细胞生长一个月或更长时间。本发明的实践人员应能够选择后续生产阶段的时程，此随多肽或蛋白生产要求和细胞本身的需要而定。所述培养时程应有助于确定细胞维持所需氨基酸浓度，其在本发明中可介于细胞群所需氨基酸浓度的(例如)0％至150％之间。

在某些情况下，在后续生产阶段期间用已经细胞耗尽或代谢的营养素或其它培养基组份补充所述细胞培养物(即，补料给细胞培养物)可为有益的或必需的。举例来说，用在监测细胞培养物期间观测到已耗尽的营养素或其它培养基组份补充所述细胞培养物可为有利的(参见下文“监测细胞培养条件”部分)。另一选择或另外，在后续生产阶段之前补充所述细胞培养物可为有益的或必需的。作为非限制性实例，用激素及/或其它生长因子、特殊离子(例如，钠离子、氯离子、钙离子、镁离子、和磷酸根离子)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低最终浓度存在的无机化合物)、脂质、氨基酸、或葡萄糖(或另一能量来源)补充所述细胞培养物可为有益的或必需的。

可将这些补充组份一次全部添加(即，补加)到细胞培养物中或将所述补充组份分若干次添加到所述细胞培养物中。在一个本发明实施例中，所述补充组份可分多次以成比例的数量提供给细胞培养物。在另一实施例中，可能需要在开始时只提供某些补充组份且在稍后提供其余组份。在又一本发明实施例中，对所述细胞培养物连续地补加这些补充组份。

依据本发明，添加到细胞培养物中的总体积最佳应保持在最小量。举例来说，添加到细胞培养物中的含有补充组份的补加培养基或溶液的总体积可占在提供所述补充组份前的细胞培养物体积的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。因此，应浓缩补加培养基以避免从生物反应器溢出或培养基组份受到稀释。所述补加培养基以优选方式提供以维持培养物具有相同的pH、温度等，但相对于起始培养基，营养素浓度升高。在一个本发明实施例中，所述补加培养基是在表2第4列中指定为“补料培养基”的补加培养基。

在一个本发明实施例中，用额外氨基酸补充具有起始氨基酸浓度B的细胞培养物以达成经基线调整氨基酸浓度A。在另一本发明实施例中，在第3至21天对所述细胞培养物提供连续补料或在第2至3天提供周期性补料。在另一本发明实施例中，在约第3天至约第20天(对于21天培养来说)以浓注补料(bolus feeds)进行补加。在另一本发明实施例中，所述补加以周期性补料(periodic feeds)约每2-3天补加一次。在又一本发明实施例中，补加体积占细胞培养物总体积的约1％至约40％。

细胞培养物在后续生产阶段期间可经搅动或振荡以增强氧化及营养素向细胞分散。依据本发明，一名普通技术人员应理解，控制或调控生物反应器在后续生长阶段的某些内部条件可为有益的，所述内部条件包括但不限于pH、温度、氧化等。举例来说，可通过提供适量酸或碱来控制pH且可用所属领域熟知的鼓泡装置来控制氧化。

监测细胞培养条件

在某些本发明实施例中，实践人员可发现周期性地监测细胞培养物生长的特定条件是有益的或必需的。监测细胞培养条件可使实践人员确定所述细胞培养物是否在次佳水平下产生重组相关多肽或所述培养物是否即将进入次佳生产阶段。为了监测某些细胞培养条件，可能必需取出若干小培养物等份进行分析。一名普通技术人员应理解此取出可能会对细胞培养物造成污染且应采取适当措施以最小化此污染风险。

作为非限制性实例，监测温度、pH、细胞密度、细胞存活率、整合活细胞密度、乳酸含量、铵含量、摩尔渗透压浓度、或表达多肽的效价可为是有益的或必需的。一名普通技术人员可利用所属领域熟知的许多技术来量测这些条件。举例来说，可使用血球计数器、库尔特计数器或细胞密度检查仪(尹诺沃特斯(Innovatis)，马尔文(Malvern)，PA)测量细胞密度。活细胞密度可通过用锥虫蓝(Trypan blue)对培养物试样进行染色来测定。因为只有死细胞吸收锥虫蓝(即，活细胞排斥所述染剂)，因此可通过计数总细胞数目、用吸收所述染剂的细胞数目除以总细胞数目、并取倒数来确定活细胞密度。HPLC可用于确定乳酸、铵或表达多肽或蛋白的含量。另一选择，可通过诸如SDS-PAGE凝胶的考马斯染色(Coomassie staining)、西方点渍分析、布氏蛋白定量分析(Bradford assays)、罗氏蛋白定量分析(Lowry assays)、缩二脲蛋白定量分析(biuret assays)、和紫外线吸收(UV absorbance)等标准分子生物技术来确定表达多肽或蛋白的含量。监测所述表达多肽或蛋白的转译后改造(包括磷酸化和糖基化)也可为有益的或必需的。

收获通过细胞培养产生的多肽

随后可从培养基或从细胞提取物纯化通过所述细胞培养产生的相关多肽以用于各种应用中。可从条件培养基纯化所述多肽的可溶形式。可通过从所述表达细胞制备总膜部分并用诸如X-100(EMD生物科学，圣地亚哥，CA)等非离子型清洁剂提取所述膜来纯化所述多肽的膜结合形式。可通过使宿主细胞溶解(借助机械力、帕尔轰击(Parr-bomb)、超声波处理、清洁剂等)，通过离心去除细胞膜部分并保留上清液来制备胞质蛋白或核蛋白

可使用那些所属技术领域人员已知的其它方法来纯化所述多肽。举例来说，可使用市售蛋白浓缩过滤器(例如，或超滤设备(密理博(Millipore)，(比勒里卡)Billerica，MA))来浓缩通过所揭示方法产生的多肽。在此浓缩步骤后，可将浓缩物应用于纯化培养基(例如，凝胶过滤培养基)中。另一选择，可采用阴离子交换树脂(例如，MonoQ柱，阿莫仙生物科技(Amersham Biosciences)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，NJ)；所述树脂含有具有侧链二乙基氨基乙基(或汽巴蓝(Cibacron blue)3GA(东曹生物科技(Tosoh Biosciences)，圣弗朗西斯科，EAE)或聚乙烯亚胺(PEI)基团的基质或底物。纯化所用基质可为丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或通常用于蛋白纯化的其它类型基质。另一选择，可使用阳离子交换步骤来纯化蛋白。适宜阳离子交换剂包括各种包含磺基丙基或羰基甲基的不溶性基质(例如，柱，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，圣路易斯(St.Louis)，MO)。

从培养上清液纯化多肽还可包括一个或多个使用亲和性树脂的柱步骤，例如，伴刀豆球蛋白A-琼脂糖、AF-HEPARIN650、或汽巴蓝(Cibacronblue)3GA(东曹生物科技(Tosoh Biosciences)，圣弗朗西斯科(SanFrancisco)，CA)；使用诸如苯基醚、丁基醚或丙基醚等树脂的疏水作用色谱柱；或使用经标记蛋白的抗体的免疫亲和性柱。最后，可采用一个或多个高效液相色谱(HPLC)步骤来进一步纯化所述蛋白，所述高效液相色谱(HPLC)步骤采用疏水性HPLC基质，例如，具有侧链甲基或其它脂肪族基团的硅胶(例如，Ni-NTA柱)。另一选择，所述多肽可以方便纯化的形式以重组方式表达。举例来说，所述多肽可作为与诸如麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、或硫氧化还原蛋白(TRX)等蛋白的融合体加以表达。表达和纯化融合蛋白的试剂盒可分别从新英格兰生物实验室(New EnglandBioLabs)(贝弗莉(Beverly)，MA)、法玛西亚(Pharmacia)(皮斯卡塔韦(Piscataway)，NJ)和英杰生命技术公司(卡尔斯巴德，CA)购得。所述蛋白还可用小抗原决定部位(例如，His、myc或Flag标签)标记且接下来使用所选抗原决定部位的特异性抗体来确认或纯化。常见抗原决定部位的抗体可从许多商业来源获得。

作为传统色谱纯化模式(例如，流通和结合-洗脱色谱纯化模式)的替代模式，通过本发明方法所产生多肽可通过以弱分配模式操作色谱纯化柱来纯化，此为一种其中至少一种在制剂中所含产物与至少一种污染物或杂质二者均结合色谱树脂或基质的技术。在弱分配模式中，至少一种杂质比所述多肽产物与所述基质结合更紧密；且随着加载(加载物流体)继续，未结合多肽产物选择性地经过所述基质且从柱流出物回收所述未结合多肽产物。此纯化可大大地减少杂质的量并达成高产物回收率。此纯化可使用所属领域已知的基质和树脂来实现，包括但不限于带电离子交换型基质、疏水作用色谱树脂、固定化金属亲和色谱树脂、和羟基磷灰石树脂。在至少一个实施例中，随着加载物流体经过基质/树脂，杂质/污染物在弱分配条件下被去除，所述基质/树脂结合至少2.8mg产物/mL基质/树脂。在至少另一个实施例中，随着加载物流体在由至少为0.1的分配系数界定的作业条件下经过基质/树脂，杂质/污染物在弱分配条件下被去除。从含有基质/树脂的柱的流出物回收纯化产物。

表5概述在流通(FT)模式、结合-洗脱(B-E)模式、和弱分配(WP)模式的各特征之间的不同.

分配系数(Kp)是吸附产物浓度(Q)与产物在溶液中浓度(C)的比率；因此，弱分配模式的Kp应为流通模式Kp与结合-洗脱模式Kp之间的中间值，例如，介于约0.1与20之间。为了确定合适的条件(例如，盐、缓冲液、pH等)，对于弱分配纯化模式来说，可能实施高高通量筛选或分批纯化筛选研究。因此，一名所属领域的技术人员能够根据作业条件确定产物分配系数Kp(参见实例7.1)。

使用弱分配模式的纯化方法详细地阐述于美国专利申请案第11/372,054号及第1l/510,634号中，所述两个案件的全文均以引用的方式纳入本文中。

可采用某些或所有上述纯化步骤的各种组合或所述纯化步骤与其它已知方法来纯化通过本文所述大规模动物细胞培养方法和培养基产生的相关多肽。

含有通过细胞培养物产生的多肽的医药组合物

上述细胞培养基(例如，大规模细胞培养基)和培养细胞的方法可提供相关多肽，例如，抗体、可溶性受体、融合蛋白等。通过所揭示细胞培养方法及借助本文所揭示新颖培养基和相关方法产生的多肽(包括抗体及其片段)可用于活体外、活体内或纳入医药组合物中及投与有需要的个体(例如，人类个体)。若干考虑确定是否投与本发明多肽的药物基因组学方法为一名所属领域的技术人员所熟知且包括全基因组关联、候选基因方法和基因表达谱。本发明的医药组合物可经调配以适应其预期投药途径(例如，口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载剂)。投药途径的其它非限制性实例包括非经肠(例如，静脉注射)、皮内、皮下、经口(例如，吸入)、经皮(外敷)、经粘膜、及经直肠投药。适应各期望途径的医药组合物在所属领域中为众人所熟知。

本发明的多肽在与医药上可接受的载剂组合时可作为一种医药组合物使用。此组合物除了含有本发明多肽外还含有载剂、各种稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、及所述领域熟知的其它材料。术语“医药上可接受的”意指不会影响具生物活性活性成份的效能的无毒性材料。载剂的特征应取决于投药途径。

本发明的医药组合物还可含有用于治疗特定靶向病症的额外治疗因子或治疗剂。举例来说，用于治疗2型糖尿病的医药组合物还可包括口服抗糖尿病药剂。所述医药组合物可含有血栓溶解因子或抗血栓形成因子，例如，纤溶酶原激活剂和第八因子(Factor VIII)。所述医药组合物可进一步含有消炎剂。所述额外因子及/或药剂可包括于医药组合物中以与本发明多肽产生协同作用或者以最小化由本发明多肽造成的副作用。

本发明医药组合物可呈脂质体形式，其中本发明多肽与诸如脂质等两性剂以及其它医药上可接受的载剂组合，所述两性剂可以聚集形式作为胶团、不溶性单层、液晶或薄层存于水性溶液中。适用于脂质体调配的脂质包括但不限于单甘油酯、二甘油酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。

如本文所用术语“治疗有效量”意指医药组合物或方法的各活性组份的总量足以展现富有意义的患者受益，例如，改善所述病况的病症、治愈所述病况或增加所述病况的治愈率。当应用于单独投与的个别活性成份时，所述术语是单独指此成份。当应用于组合时，所述术语是指可产生治疗效果的各活性成份的组合量，无论其是组合投与、依序投与还是同时投与。

在实践本发明治疗方法或用途中，将治疗有效量的本发明多肽投与个体，例如，哺乳动物(例如，人类)。本发明的多肽可依据本发明方法单独或结合其它疗法投与。当与一种或多种药剂一起投与时，本发明的多肽可与第二药剂同时或依序投与。如果依序投与，则主治医生可确定投与本发明多肽以及其它药剂的适当顺序。

当经口投与治疗有效量的本发明多肽时，所述结合剂可呈片剂、胶囊、粉剂、溶液或酏剂形式。当以片剂形式投与时，本发明的医药组合物可额外含有诸如明胶等固体载剂或佐剂。所述片剂、胶囊和粉剂含有约5％至95％的结合剂且优选地，含有约25％至90％的结合剂。当以液体形式投与时，可添加液体载剂，诸如水、石油、动物来源油或植物来源油，诸如花生油(当心花生过敏)、矿物油、大豆油或芝麻油、或合成油等。液体形式的医药组合物可进一步含有生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇等二醇。当以液体形式投与时，所述医药组合物含有约0.5重量％至约90重量％的结合剂且优选地，含有约1重量％至约50重量％的结合剂。

当通过静脉内注射、表皮注射或皮下注射投与治疗有效量的本发明多肽时，本发明的多肽可呈非经肠可接受的无热原水溶液形式。那些所属领域的技术人员在考虑pH、等渗性、稳定性及类似特性后可制备所述非经肠可接受的蛋白溶液。用于静脉内注射、表皮注射或皮下注射的优选医药组合物除含有本发明多肽外还应含有等渗媒剂，例如，氯化钠注射液、林格注射液(Ringer′s injection)、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸化林格注射液、或所属技术领域已知的其它媒剂。本发明的医药组合物还可含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或任何其它为那些所属领域的技术人员已知的添加剂。

本发明多肽在本发明医药组合物中的量将取决于所治疗病况的性质和严重程度以及患者以前所接受治疗的性质。最终，主治医师将决定用于治疗各个患者的本发明医药组合物或多肽的量。最初，主治医师将投与低剂量的本发明医药组合物或多肽并观测患者的反应。可投与较大剂量的本发明医药组合物或多肽直到对于该患者获得最佳治疗效果为止，且自此时起一般不再增加剂量。预计，用于治疗有需要的个体的各种医药组合物应含有约0.1μg至约100mg本发明多肽/kg体重。

使用本发明医药组合物的静脉内(i.v.)疗法的时程可有所变化，此取决治疗疾病的严重性及各个患者的情况和潜在种特异性反应。预计，每次施用本发明医药组合物或多肽的时程可在(例如)1-12小时、6-18小时或12-24小时连续或间歇静脉注射投药范围内。还预计，使用本发明医药组合物可实现皮下注射(s.c.)疗法。所述疗法可每日、每周或(更优选地)每两周或每月施用一次。最后，当使用本发明医药组合物时主治医生会确定适当的i.v.或s.c.疗法或小分子疗法的时程及所述疗法的投药时间。

本申请案所列举的所有参考文献、专利、专利申请案和出版物的全文均以引用的方式纳入本文中。

实例

阐述下列实例以有助于理解本发明，但并非意欲且不应诠释为以任何方式限制本发明的范围。所述实例并不包括诸如重组DNA技术等习用方法的详细说明。所述方法为那些所属领域的普通技术人员所熟知。

实例1

定量CHO细胞的氨基酸组成

为了定量抗体-表达CHO细胞和重组蛋白-表达CHO细胞的氨基酸组成，即，每一氨基酸相对于细胞群(生物质)氨基酸总量的摩尔百分比，实施下列程序。简单地说，使过度表达抗体或重组蛋白(更具体来说，抗-IL-22抗体(重组人类抗-IL-22抗体)、Myo-029抗体(抗-GDF8IgG1单克隆抗体)和重组人类BMP-2)的3种CHO细胞系在摇瓶中生长1天(BMP-2)或3天(Myo-029和抗-IL-22)。在最后一天，收获培养物并旋转细胞以达10⁶个细胞/mL浓度。用1X PBS将含有10⁶个细胞的沉淀物洗涤两次并将所述沉淀物重新悬浮于500μL5N HCl中。将含有细胞的悬浮液在100℃下加热24小时，在此时对所述悬浮液进行真空离心。将所得沉淀物重新悬浮于500μL PBS中并使用气相或液相色谱实施氨基酸分析。

酸解确定了甲硫氨酸和色氨酸两者在酸解期间会降格；因此，这些氨基酸在实例2和实例3中的浓度是基于CHO细胞的文献值。另外，已确定了谷酰胺和天冬酰胺在水解期间会转化成其酸性形式，分别为谷氨酸和天冬氨酸；因此，根据在文献中所报告谷酰胺/谷氨酸和天冬酰胺/天冬氨酸比率调整这4种氨基酸在实例2和实例3中的浓度。除此以外，确定了这些CHO细胞系拥有相似的氨基酸组成及与其它哺乳动物细胞接近匹配的报告数值(数据未示出)(参见布纳里斯(Bonarius)(1996)生物技术生物工程(Biotechnol.Bioeng.)50：299-318)。

实例2

使用合理设计的培养基以32％体积补料在CHO细胞(细胞系1)中达成15x10⁶个细胞/mL期望峰值细胞密度和9g/L目标抗-IL-22抗体效价

实例2.1：合理设计的培养基

使用本文所揭示等式，确定在CHO细胞系1中产生9g/L抗-IL-22抗体，15x10⁶个细胞/mL所需氨基酸的经基线调整的氨基酸浓度A(表6，第2列)(细胞维持设定为50％，即，Y＝0.5)。调整各种氨基酸的经基线调整的氨基酸浓度A(表6，第2列)以获得如在表6第3列中所示改良经基线调整总氨基酸浓度。进行下列调整：依据美国公开专利申请案第US2006/0121568A1号设定Asn、Asp和Gln的含量；2)由于Ala、Glu、Gly是由细胞培养物产生，因此应将其浓度调整到较低数值；3)鉴于胱氨酸也用于补加培养基的事实，调整了Cys的含量且将胱氨酸的培养基数值设定为在美国公开专利申请案第US2006/0121568A1号中所述数值；4)鉴于使用含有设定氨基酸组成的补料粉末来制造期望细胞培养基的事实，Arg、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe的浓度比经基线调整氨基酸浓度A高20％至100％，因而不可能达成精确匹配。从如在表6第3列中所示改良经基线调整总氨基酸浓度计算起始培养基氨基酸浓度B(表6，第4列)。

表6：期望细胞培养基调配

实例2.2：响应合理设计的培养基的细胞密度和抗体效价

细胞系1细胞(抗-IL-22-表达CHO细胞)是从含有第3天培养物的摇瓶获得且其在第0天以0.7x10⁶个细胞/mL接种到存于1L生物反应器(Applikon 2L，(阿普利肯公司(Applikon Inc)，福斯特市(Foster City)，CA))中的起始细胞培养基中。在第3天(约80小时)，将温度从37℃转变到31℃且在第3天、第5天、第6天、第7天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第17天、第20天分别以3.75体积％、4体积％、4体积％、9体积％、2体积％、1体积％、1体积％、1体积％、3体积％、2体积％和1体积％添加补料培养基(参见表2的第4列)以获得含有如在表6，第3列中所示氨基酸浓度的期望细胞培养基。将细胞培养物保持在pH7.0下、于30％溶解氧含量中和在200rpm下搅动。每日采取试样以测试细胞密度(细胞计数仪器(尹诺沃提斯(Innovatis)，马尔文(Malvern)，PA))、存活率()和某些代谢产物的含量(诺瓦生物剖面分析仪(Nova BioProfile Analyzer)，诺瓦生物医学公司(NovaBiomedical Cooperation)，沃尔瑟姆(Waltham)，MA)。将离心后培养基保存在-80℃下，以供使用蛋白A HPLC进行抗体效价分析。

结果示于图1和图2中。如从图1中可见，在培养第11天时达成最高细胞密度(约11x10⁶个细胞/mL)，此后细胞密度降低。在培养第21天时获得最高抗体效价(约7g/L)。因此，可使用所述合理设计的培养基来产生高细胞密度和高抗体效价。

实例3

使用合理设计的培养基以33％体积补料可在CHO细胞(细胞系2)中达成15x10⁶个细胞/mL期望峰值细胞密度和10g/L目标抗-IL-22抗体效价

实例3.1：合理设计的培养基

使用本文所揭示等式，确定15x10⁶个细胞/mL和10g/L抗-IL-22抗体(上文所述)所需氨基酸的经基线调整氨基酸浓度A(细胞维持设定为50％，即，Y＝0.5)。按照在实例2中所述调整各种氨基酸的经基线调整氨基酸浓度A(表7，第2列)以获得如在表7的第3列中所示改良经基线调整的总氨基酸浓度。另外，对于此培养基调配来说，从现存粉末以固定组成制备起始细胞培养基和补料培养基且因此不可能实现确切的匹配。从如在表7第3列中所示改良经基线调整的总氨基酸浓度计算起始培养基氨基酸浓度B(表7，第4列)。

表7：期望细胞培养基调配

实例3.2：响应合理设计的培养基的细胞密度和抗体效价

细胞系2细胞(抗-IL-22-表达CHO细胞)是从含有第3天培养物的摇瓶获得且其在第0天以0.7x10⁶个细胞/mL接种到存于1L生物反应器(Applikon 2L)中的起始细胞培养基中。在第3天(约80小时)，将温度从37℃转变到31℃且用自动补加泵连续添加补料(1.8体积％/天)以获得含有如在表7，第3列中所示氨基酸浓度的期望细胞培养基。将细胞培养物维持在pH7.0下、于30％溶解氧含量中和在200rpm下搅动。每日采取试样以测试细胞密度(细胞计数仪器)、存活率()和某些代谢产物含量(诺瓦生物剖面分析仪(Nova Enzymatic analyzer))。将离心后培养基保存在-80℃下以供使用蛋白A HPLC进行抗体效价分析。

结果示于图3和图4中。如从图3中可见，在培养第10天时达成最高细胞密度(超过12x10⁶个细胞/mL)，此后细胞密度降低。在培养第19天时获得最高抗体效价(超过10g/L)。因此，可使用所述合理设计的培养基来产生高细胞密度和高抗体效价。

实例4

脯氨酸添加对细胞培养效能的影响

在pH受控摇瓶(工作体积为100mL的500mL烧瓶)中培养产生抗-IL-22抗体的CHO细胞并维持在～100rpm的振荡器上温度受控的7％CO₂培养箱中。以0.7x10⁶个细胞/mL接种细胞。培养时程为18天。在前3天，将细胞维持在37℃下，此后将温度转变到31℃以进行其余培养。在前3天用1M碳酸氢钠控制pH。细胞培养基是由基于传统细胞培养要求的培养基(称为“传统培养基”)和合理设计的培养基(即，借助本文所揭示合理的设计调配的培养基，称为“合理设计的培养基”)构成以达成10x10⁶个细胞/mL和10g/L抗体。在这两种调配物之间值得注意的主要差别在于若干氨基酸(PRO、THR、GLY、TYR、TRP、VAL和PHE)在“合理设计的培养基”中比在“传统培养基”中的浓度更高。所提出第3个条件是需向传统培养基中额外添加3.7mM脯氨酸以获得在“合理设计的培养基”中的脯氨酸含量，称为“传统培养基+脯氨酸”。这些调配物示于下表8中。以23体积％总量向培养物中添加惠氏(Wyeth)室内补料培养基(“补料培养基”，参见表2)，包含在第3-4天、第9-14天、第17天的2％每日补料、第5-6天的1％每日补料和在第7天的3％每日补料。

表8：用于脯氨酸研究的培养基调配物

这些实验的结果示于图5-7中。向传统培养基添加脯氨酸，即，“传统培养基+脯氨酸”(图5)在14天中产生与“合理设计的培养基”相等的抗体产量。如在图6中所示，将3种培养基全部维持在高细胞密度，其中在第12天出现最高密度。如在图7中所示，将3种培养基全部保持在高细胞密度，其中与“传统培养基”和“传统培养基+脯氨酸培养基”的培养物相比，“合理设计的培养基”的培养物在第15-18天维持更大存活率。由于各自含有一合理设计浓度的甘氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸的各种其它培养基不产生可产生比“传统培养基”更高抗体效价(数据未示出)的细胞培养物，因此脯氨酸用作达成高效价所需速率限制氨基酸。此例示于图8A-E中，所述图8A-E展示到第14天时“传统培养基+脯氨酸”中的许多氨基酸达极低含量(注意：酪氨酸耗尽)，因此可防止这些氨基酸被进一步纳入抗体中。此结果还可在效价图(图5)中观测到，随着“传统培养基+脯氨酸”的斜率在第14天后降低，同时“合理设计的培养基”在18天中维持抗体生产，所述“合理设计的培养基”含有较高含量的其它氨基酸。

令人感兴趣的是，“传统培养基”中的脯氨酸浓度从未降低到低于1mM(图8A)；然而，脯氨酸对纳入抗体中全部氨基酸的影响在第11天后降低。此发现表明存在脯氨酸阈值，即，在整个培养期间必须将脯氨酸浓度维持在高于1mM。

实例5

预言性实例：用于新颖细胞系的优化细胞培养基

本文所揭示培养基设计方法可用于任何细胞培养物，包括使用新颖细胞/细胞系的细胞培养物。与新颖细胞系一起使用的优化培养基可含有至少一种依据等式A＝[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F确定的经基线调整氨基酸浓度A的氨基酸。

当将上述等式应用于新颖细胞培养物时，乘数M可选自(例如)1-20x10⁶个细胞/mL。一名所属技术领域的人员应能够通过将在生长阶段期间的最大细胞密度乘以二来计算有用的M数值，此最大细胞密度可基于生长速率来计算。

当将上述等式应用于新颖细胞培养物时，可通过(例如)将IVC乘以细胞qp来计算乘数N。一名所属技术领域的人员应能够按照在标题为“合理的培养基设计和调配”部分中所述方法通过评定生长特性来计算所述IVC。一名所属技术领域的人员应能够通过测量基于每一细胞的抗体或重组蛋白产量来计算所述qp。

当将上述等式应用于新颖细胞培养物时，可通过开始使用Y＝1(即，期望细胞群所需100％氨基酸)且随后推敲Y值(增高或减低)来估计细胞维持因数Y。

当将上述等式应用于新颖细胞培养物时，可通过开始使用F＝1.3(即，30％额外氨基酸)且随后推敲F数值(增高或减低)来估计基线因数F。

实例6

维持因数和基线因数对细胞培养效能的影响

为了证明维持因数Y和基线因数F对于细胞培养效能来说是重要的/关键的，以0.7x10⁶个细胞/mL接种抗-IL-22-表达CHO细胞并将其在2L生物反应器中培养21天，pH设定值为7.0且溶解氧(DO)设定值为30％。借助2N Na₂CO₃/NaHCO₃控制pH且通过通入空气(含有7％CO₂)来控制DO。在前3天，培养物温度为37℃且在3天后培养物温度转变为31℃并保持在31℃下直到培养结束。(1)在含有目标蛋白效价和期望峰值细胞密度(但不考虑维持因数或基线因数)所需氨基酸的培养基中(即，“不涉及维持因数和基线因数的合理设计的培养基”)或在(2)“合理设计的培养基”中将细胞培养21天。

如在图9和图10中所例示，不考虑维持因数和基线因数的培养基展现存活率明显降低(在细胞培养第21天时几乎接近0％)及细胞密度明显降低。而且，图11表明在细胞培养第21天时，此相同培养基只能够支持5g/L抗体效价。

相比之下，合理设计的培养基(包括维持因数和基线因数)展现更高存活率、细胞密度和抗体效价(图9-11)。在细胞培养第21天时，合理设计的培养基能够支持10g/L抗体效价。

这些发现表明在确定期望细胞培养基的氨基酸浓度时考虑维持因数和基线因数可改善细胞效能，如通过细胞存活率、细胞密度和多肽效价测量的。

实例7

使用阴离子交换型色谱以弱分配模式进行多肽纯化

实例7.1.进行高通量筛选以确立弱分配和流通条件

首先实施初步筛选研究，此确定了在各种溶液条件下的分配系数及/或结合树脂的产物浓度，从而界定对于Mab-AAB、相关多肽和TMAE-HiCap(M)培养基来说弱分配(WP)模式和流通(FT)模式的作业区。此筛选改变了氯化钠浓度和pH以确定其对Mab-AAB和过程相关杂质(蛋白A和HCP)与TMAE培养基的结合程度的影响。

使用蛋白A酶联免疫吸附分析(ELISA)来测量蛋白A残留物在测试试样中的含量。使用分析型大小排除色谱(SEC)分析测量高分子量聚集体的量。使用HCP ELISA测量宿主细胞蛋白(HCP)的含量。所有筛选和柱研究均在室温下进行。

向96孔过滤板的每个孔中添加50μLTMAE HiCap基质。使每个孔在由50mM甘氨酸和可变量的Tris缓冲液(取决于经中和以达在表9中所指明pH所需量)和氯化钠(在表10中指明)组成的溶液中达平衡。pH介于7.6至9.0之间且氯化钠介于0mM至80mM之间。

使用自动移液系统(帝肯(Tecan)100RST)稀释每行中所用缓冲溶液。用经HCl酸化至pH3.0的500mM甘氨酸制造用于缓冲剂的储备溶液且接下来用2M Tris Base中和达在表9中所指定pH值。此滴定所产生Tris含量取决于缓冲剂的pH。在对储存缓冲剂浓度稀释1倍至10倍(其对应于通过自动移液系统所实现的稀释)下测量缓冲液pH。作为甘氨酸酸化至pH3.0的结果，所述缓冲剂对最终溶液贡献约10mM离子强度。对树脂实施两次加载(加载物流体)攻击：5mg/mL以测量分配系数Kp；及122mg/mL以测量树脂去除杂质和结合产物的能力，Q，用浓度大约等于柱加载物浓度的蛋白溶液平衡。

表9：在每个孔中的缓冲液类型和pH目标

	所有柱
		A	50mM甘氨酸，8.8mM Tris，pH7.6
B	50mM甘氨酸，13.6mM Tris，pH7.8
		C	50mM甘氨酸，16.0mM Tris，pH8.0
D	50mM甘氨酸，19.6mM Tris，pH8.2
		E	50mM甘氨酸，28.4mM Tris，pH8.4
F	50mM甘氨酸，37.2mM Tris，pH8.6
		G	50mM甘氨酸，64.0mM Tris，pH8.8
H	50mM甘氨酸，100mM Tris，pH9.0

表10：在每个孔中的NaCl含量(以mM计)和蛋白攻击(mg/mL)

在高通量筛选的第一阶段，使每个孔在如在表9和表10中所述NaCl和pH条件下以6∶1相体积比率(300μL溶液：50μL树脂)达平衡。将该过滤板摇动20分钟以使其达平衡。随后通过离心所述过滤板来去除溶液。将此平衡循环重复三次。

在第二阶段，在适当NaCl浓度和pH下以6∶1体积比率(300μL溶液：50μL树脂)用浓MAb-AAB溶液以5mg/mL树脂攻击每个孔中的树脂。将Mab-AAB存于1mMHEPES，10mM NaCl，pH7.0，搀有300ppm蛋白A中的36mg/mL溶液用作储备溶液。将经加载板摇动20分钟以使所述树脂和溶液达平衡。通过离心从所述滤板取出上清液并将收集于收集盘中。通过在A280nm下吸收来确定每个孔中上清液的蛋白浓度。

在第三阶段，通过添加指定NaCl溶液且在表10中所列举pH条件下洗涤树脂。在摇动20分钟后取出上清液。在第四阶段，添加2M NaCl以去除结合树脂的其余蛋白。每个孔的分配系数是使用从第3阶段和第4阶段洗脱出的物质及第2阶段的产物浓度来计算且示于表11中。

表11：用于MAb-AAB的96孔HTS筛的分配系数(Kp)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	0.22	0.32	0.35	0.17	0.24	0.23	0.21	0.24	0.21	0.19	0.17	0.16
B	0.37	0.36	0.38	0.25	0.24	0.08	0.28	0.26	0.22	0.24	0.18	0.16
													C	0.63	0.48	0.47	0.27	0.15	0.20	0.31	0.28	0.26	0.20	0.23	0.16
D	1.24	1.12	0.68	0.36	0.30	0.17	0.42	0.39	0.34	0.23	0.23	0.18

E	3.24	1.89	1.05	0.59	0.35	0.15	0.68	0.58	0.41	0.29	0.21	0.18
													F	8.37	3.37	1.56	0.61	0.31	0.32	0.87	0.74	0.51	0.32	0.25	0.21
G	18.36	9.49	3.16	0.82	0.49	0.34	0.91	0.88	0.69	0.39	0.24	0.20
													H	125.73	23.79	6.58	1.23	0.58	0.43	1.18	1.02	0.78	0.42	0.27	0.24

如在表11中所示，Kp值可用于阐述其中MAb-AAB以不同强度结合TMAE基质的区域。可通过改变流通区(K≤0.1)、弱分配区(0.1＜K＜20)和结合区(K≥20)的pH条件和氯离子浓度来操控MAb-AAB结合TMAE基质的强度。

从每个区中处于加载阶段的各孔中取上清液试样并对所述上清液试样进行蛋白A分析。这些试样的分析结果概述于表12中。存在一个pH和电导性范围，其中TMAE色谱步骤能够十分显著地去除蛋白A同时使树脂仅发生有限的蛋白损失。发现此范围与分配系数值Kp密切相关且与任何指定pH或氯离子浓度无关。

表12：来自HTS筛的MAb-AAB结合数据的蛋白A去除值对数(LRV)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	2.11	1.89	2.12	1.85	1.22	1.00	1.63	1.02	1.00	0.92	0.85	1.02
B	2.79	2.37	2.42	1.96	1.23	1.13	1.77	1.81	1.22	0.85	0.94	1.52
													C	＞3.05	＞3.03	2.74	2.16	1.37	1.11	2.25	2.15	1.96	1.16	1.06	0.95
D	＞3.41	＞2.98	＞3.06	2.50	1.94	1.18	3.39	3.11	2.57	1.41	1.02	0.89
													E	＞2.87	＞2.93	＞3.01	＞2.95	2.13	1.75	＞3.09	3.27	3.09	1.66	1.89	0.99
F	＞2.64	＞2.89	＞2.99	＞3.11	2.29	1.82	＞3.07	＞3.11	＞3.15	2.19	1.24	0.84
													G	＞2.33	＞2.58	＞2.89	＞3.07	2.41	2.14	＞3.09	＞3.11	＞3.14	2.80	1.46	0.85
H	＞1.63	＞2.36	＞2.76	＞3.01	2.86	2.37	＞2.98	＞3.05	＞3.15	3.16	3.45	0.85

实例7.2.流通条件下的柱流动

下列实验以流通(FT)模式进行，其中MAb-AAB与柱的相互作用十分弱。以110mg/ml和200mg/ml树脂加载物攻击进行两次试验。

对于所有TMAE(HiCapM)阴离子交换型色谱试验来说，使用下列条件(注意在个别实验描述中的例外情况)。

可作业流速-150-300cm/hr

平衡1-50mM Tris，2.0M NaCl，pH7.5(5倍柱体积)

平衡2-如指定值，大约等于加载物pH和氯离子含量

加载后洗涤-如指定值，大约等于加载物pH和氯离子含量

缓冲带-50mM Tris，2.0M NaCl，pH7.5(5倍柱体积)

Mabselect蛋白A色谱

使用连接到密理博K普莱姆(Millipore K-prime)400色谱系统的MabSelect柱(2,389mL)以中试规模纯化含有单克隆抗体的培养物。用5倍柱体积的50mM Tris/150mM NaCl，pH7.5以300cm/hr流速使Mabselect蛋白A柱达平衡。随后以大约40mg产物/ml树脂加载物加载所述柱。此后在1M NaCl，50mM Tris，pH7.5中进行5倍柱体积的(CV)洗涤且5CV洗涤剂含有10mM Tris，75mM NaCl，pH7.5洗涤剂。随后使用50mM甘氨酸，75mM NaCl，pH3.0洗脱所述柱。使用2M Tris，pH8.5将产物池中和达pH7.6。中和峰值具有约90mM的氯离子浓度。

TMAE HiCap(M)色谱

经过TMAE步骤进一步纯化中和蛋白A池，其中平衡、加载和洗涤溶液在pH7.5(用50mM Tris和75mM氯化钠达成)下。使用5倍柱体积的洗涤剂。这两个研究的柱尺寸和加载物攻击为：试验1：7.0cm直径x20.6cm床身高度(体积-793mL)，加载物浓度为11.9mg/mL；及试验2：7.0cm直径x13cm床身高度(体积-500mL)，加载物浓度为17.6mg/mL。

这些加载条件在流通(FT)区域中(表13)。分批结合研究用于测量分配系数(Kp)，且通过使用UV吸收确定在柱蛋白吸收带中的结合产物。此确定结合产物的方法通常会低估在加载期间结合产物的数量，此由在洗涤期间产物的等梯度洗脱造成的。测量在加载物和产物池中的蛋白A、HCP和高分子量聚集体(HMW)的含量且计算去除程度。结果呈现于表13中。蛋白A和HMW去除程度较差且HCP含量减少适中。

表13：在FT条件下HCP、蛋白A和HMW去除

*杂质含量为38.5ppm ProA和51,943ppm HCP(试验1)、8.8ppm ProA和25,398ppmHCP(试验2)。

实例7.3.在弱分配条件下柱试验(高产物攻击)

TMAE(HiCap M)阴离子交换型色谱

基本上按照在实例7.2中所述实施若干Mabselect蛋白A试验以产生这些试验的加载材料。经过TMAE柱进一步纯化来自蛋白A步骤的部分纯化抗体池。TMAE柱的加载物是在50mM Tris，pH8.2中。柱直径为0.5cm且床身高度为10cm床身高度(体积-2.0mL)。用500mg/mL树脂加载物攻击所述柱，其中加载物浓度为27.7mg/mL。

用含有50mM Tris，2M NaCl，pH7.5的溶液(5CV)使所述柱达平衡，然后以50mM Tris，pH8.2溶液实施另一平衡步骤。随后对所述柱加载500mg产物/ml树脂，其中中和蛋白A峰值来自先前步骤且回收在加载循环期间存于柱流出物及某些柱体积洗涤部分中的产物。

这些加载条件是在弱分配区中。使用分批结合研究来测量分配系数(Kp)及在高蛋白浓度下的产物结合。在pH8.2及约12mM氯离子含量下，分配系数Kp估计为1.9(通过HTS筛选求数据集的内插值)。

在表示约250、375和500mg/ml树脂加载物攻击的加载阶段期间测量三个部分的HCP和蛋白A的含量。实例7.3的结果呈现于表14中。这些结果表明在不漏过杂质的情况下可以弱分配模式达成极高产物攻击。达成极好的HCP和蛋白A减少以及HMW含量减少50％。与在表13中以流通模式作业的结果相比，弱分配模式的杂质去除更佳。

表14：对于500mg/ml TMAE加载物攻击来说，HCP、蛋白A和HMW的去除

*在加载物中的杂质是25,398ppm HCP、99.5ppm蛋白A和2.3％HMW

实例7.4.在弱分配条件下的柱试验(可靠性研究)

为了进一步确实TMAE柱在弱分配区中的效能，设计若干试验，改变加载物的pH和NaCl浓度以测试过程可靠性。所有试验在250mg/ml树脂加载物攻击下进行。基本上按照在实例7.2中所述实施若干Mabselect蛋白A试验以产生这些试验的加载材料。在这些试验中唯一改变的因数是蛋白A洗脱的氯化钠浓度，改变所述氯化钠浓度以与特定实验的TMAE加载物的NaCl浓度匹配。所述柱借助Equil2缓冲剂达平衡且用洗涤缓冲剂洗涤，所述洗涤缓冲剂与加载物具有相同的pH和氯化钠含量。

这些加载条件是在弱分配区中。分批结合研究用于测量分配系数(Kp)。借助在表15中所列举分配系数对所述试验进行分级。结合产物是通过使用UV吸收测量柱带的蛋白来确定且介于7.8mg/mL至25.3mg/mL之间。这些实验的蛋白A、HCP和HMW结果也呈现于表15中。发现所有杂质能在作业范围内被可靠去除，所述作业范围涵盖13.5-38.8mM氯离子总浓度和pH7.8-8.4。

表15：对WP模式的HCP、蛋白A和HMW去除的过程可靠性研究

*杂质含量为38.5ppm ProA和51,943ppm HCP(试验1)，8.8ppm ProA和25,398ppmHCP(试验2)。

+包括来自NaCl、缓冲剂和滴定剂的Cl-离子贡献

实例7.5.内容

从这些研究可见蛋白A去除(LRV)随着Kp明显地变化，而HCP LRV在等于或高于0.26时于所有Kp值下均为极好的，但在Kp＝0.17下明显降低(在流通条件下)。流通条件与弱分配条件相比，宿主细胞蛋白去除降低一个对数数量级以上，即使对于低加载物攻击来说也是如此。当将这些弱分配条件施加于树脂与单克隆抗体的此组合时，结合产物介于7.8mg/ml至25mg/ml之间。分配系数似乎最佳在0.41＜Kp＜5.4范围内。在Kp＝0.17及1.4-3.3mg/mL结合产物下，实例7.2的条件下似乎并非最佳。

这些研究表明纯化使用合理设计的培养基细胞培养物产生的多肽的替代模式，其会明显地减少所存在杂质、高分子量聚集体、DNA、宿主细胞蛋白等。

Claims

1.一种细胞培养基，其包含如下所列的必需氨基酸。

氨基酸浓度(mM) ARG 15.2 HIS 5.5 ILE 13.2 LEU 20.0 LYS 16.5 MET 6.3 PRO 12.5 THR 15.7 TRP 3.2 VAL 15.4

2.如权利要求1所述的细胞培养基，其进一步包含大于或等于3mM的酪氨酸。

3.如权利要求1或权利要求2所述的细胞培养基，其中亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸和缬氨酸的组合浓度是全部必需氨基酸在所述细胞培养基中浓度的60％到80％之间。

4.如权利要求1或权利要求2所述的细胞培养基，其中必需氨基酸的组合浓度是全部氨基酸浓度的30％到50％之间。

5.如权利要求1或权利要求2所述的细胞培养基，其包含介于120mM与350mM之间的氨基酸总浓度。

6.一种在细胞培养物中产生多肽的方法，所述方法包含：

(1)提供细胞培养物，其包含：

a.细胞，所述细胞包含编码相关多肽的核酸；及

b.如权利要求1至5中任一权利要求所述的细胞培养基；和

(2)将所述细胞培养物维持在可使所述相关多肽表达的条件下。

7.如权利要求6所述的方法，其进一步包含自加载物流体回收经纯化多肽的方法，所述回收方法包含如下步骤：

使所述加载物流体在作业条件下经过存于柱中的基质，所述作业条件可使所述基质结合至少2.8mg多肽/mL基质，其中所述基质选自由下述组成的群组：带电离子交换型基质、疏水作用色谱树脂、及固定化金属亲和色谱树脂；和

从所述柱的流出物回收所述经纯化多肽。

8.如权利要求6所述的方法，其进一步包含自加载物流体回收经纯化多肽的方法，所述回收方法包含如下步骤：

使所述加载物流体在由至少为0.1的分配系数界定的作业条件下经过存于柱中的基质；和

从所述柱的流出物回收所述经纯化多肽。

9.一种在细胞培养物中产生多肽的方法，所述方法包含：

(1)提供细胞培养物，其包含

a.细胞，所述细胞包含编码相关多肽的核酸；及

b.起始细胞培养基，其中所述起始细胞培养基的体积占期望细胞培养基体积的60-99％；

(2)对步骤(1)的所述细胞培养物提供补加细胞培养基，其中所述补加细胞培养基的体积占所述期望细胞培养基体积的1-40％，且其中所得期望细胞培养基为如权利要求1至5中任一权利要求所述的细胞培养基；和

(3)将所述细胞培养物维持在可使所述相关多肽表达的条件下。

10.如权利要求6至9中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞培养物是大规模细胞培养物。

11.如权利要求6至9中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞是动物细胞。

12.如权利要求6和9中任一权利要求所述的方法，其中所述多肽是经纯化的。

13.如权利要求6至9中任一权利要求所述的方法，其中所述培养基是确定成份培养基，其中所有组份具有已知化学结构的培养基。