ES2678945T3 - Cultivos celulares optimizados metabólicamente - Google Patents

Abstract

Un método para cultivar células que comprende: (a) cultivar las células en un primer cultivo celular, (b) determinar que se produjo un cambio metabólico hacia el consumo de lactato en el primer cultivo celular, y (c) transferir las células a un segundo cultivo celular después que en las células se produjo el cambio metabólico hacia el consumo de lactato, en donde la concentración de lactato en el segundo cultivo celular indica el consumo neto de lactato.

Description

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DESCRIPCION

Cultivos celulares optimizados metabolicamente Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a celulas que se cambian metabolicamente hacia el consumo de lactato en cultivo de celulas. Un cambio hacia un perfil metabolico de consumo de lactato en un cultivo de tren de siembra tiene efectos beneficiosos en la produccion del cultivo. Despues de la inoculacion del reactor de produccion, las celulas exhiben un metabolismo del lactato mas eficiente con una baja tasa de produccion de lactato, bajos niveles pico de lactato, un cambio precoz hacia el consumo de lactato, y posteriormente un aumento en la productividad del cultivo discontinuo de celulas de mamfferos. Por lo tanto, se proporciona un metodo mejorado para la produccion a gran escala de protefnas y/o polipeptidos en cultivo celulares.

Antecedentes de la invencion

Los agentes biologicos, particularmente las protefnas y los polipeptidos, se desarrollan mas frecuentemente como productos farmaceuticos novedosos. Las celulas modificadas geneticamente que producen niveles inusualmente altos de la protefna de interes particular han llegado a ser crfticamente importantes para la produccion comercial exitosa de estas intervenciones farmaceuticas. El control y la optimizacion de las condiciones de los cultivos celulares varfan y tienen gran efecto en el nivel y la calidad de los productos terapeuticos proteicos producidos en cultivo.

Es usual producir protefnas a traves de cultivos celulares en un proceso de cultivo por lote o por lote alimentado. Las etapas tempranas de crecimiento del inoculo despues de la descongelacion del recipiente incluyen el cultivo de las celulas en un cultivo de siembra. Tfpicamente, las celulas se cultivan a una tasa de crecimiento exponencial, tal como en los biorreactores de tren de siembra, para aumentar progresivamente el tamano y/o el volumen de la poblacion celular. Despues que se aumenta la masa celular a traves de varias etapas del biorreactor, las celulas se transfieren entonces a un biorreactor de produccion mientras que las celulas se encuentran aun en crecimiento exponencial (fase logarftmica) (Gambhir, A. y otros, 2003, J Bioscience Bioeng 95(4):317-327). Generalmente se considera poco conveniente permitir que las celulas en el cultivo por lote, por ejemplo, cultivo de siembra, pasen de la fase logarftmica a la fase estacionaria. Se ha recomendado que los cultivos deben someterse a pases mientras esten en la fase logarftmica, antes de que las celulas, por ejemplo, las celulas adherentes, alcancen la confluencia debido a la inhibicion por contacto o a que la acumulacion de productos de desecho inhiba el crecimiento celular, entre otras razones (Cell Culture Basics, Gibco/Invitrogen Online Handbook,
www.invitrogen.com; ATCC® Animal Cell Culture Guide,
www.atcc.org).

Despues de la transferencia a un cultivo por lote alimentado, las celulas se cultivan durante un perfodo de tiempo mientras que la composicion del medio se supervisa y controla para permitir la produccion de la protefna o el polipeptido de interes. Despues que se alcanza un rendimiento o viabilidad celular particular, la acumulacion de desechos o el agotamiento de nutrientes determinan que el cultivo deberfa terminarse, y se afsla la protefna o el polipeptido de interes. En la decada pasada se hicieron avances significativos con la intencion de mejorar la produccion de protefnas recombinantes, que actualmente alcanza tftulos de multiples gramos por litro. Los avances en los procesos de produccion de protefnas, asf como tambien en las lfneas celulares modificadas geneticamente, los medios de cultivos celulares y los sistemas de alimentacion, contribuyeron a la ganancia en el rendimiento de protefnas.

La produccion por lote alimentado implica la adicion de pequenos volumenes de alimentos para complementar los nutrientes presentes en el biorreactor en la medida que las celulas crecen y progresa la produccion del producto. Se entiende que, en general, las celulas de mamfferos tienden a metabolizar los carbohidratos continuamente, lo que resulta en una acumulacion de lactato que, por lo tanto, requiere la adicion de bases para neutralizar el acido lactico. La adicion de bases aumenta la osmolalidad en el medio celular que a su vez restringe en gran medida la viabilidad celular y/o la productividad factible en el biorreactor. La acumulacion de lactato en el medio es perjudicial para el crecimiento celular y es uno de los factores comunes que limitan la productividad maxima que puede lograrse en el cultivo por lote. En un cultivo celular por lote tfpico, el crecimiento y la productividad se inhiben despues de que la concentracion de lactato en el cultivo alcanza aproximadamente 30-50 mM y/o la concentracion de amonio alcanza 3-5 mM (Ozturk, S.S., Riley, M.R., y Palsson, B.O. 1992. Biotechnol. and Bioeng. 39: 418-431). Hasta la fecha, los esquemas ampliamente adoptados incluyen complementar los nutrientes y el diseno de medios libres de suero definidos qufmicamente para sustentar el crecimiento continuo de las celulas y la secrecion optima del producto.

Los esfuerzos relacionados particularmente con la reduccion de la salida de productos de desechos metabolicos, tales como la acumulacion de lactato, en cultivos celular han mejorado la cantidad global de los tftulos de protefnas finales. Estos esfuerzos se enfocan en los procesos por lotes alimentados limitados en nutrientes o con glucosa controlada (ver por ejemplo, los documentos WO2004104186; US8192951B2), la mejora de las condiciones de los medios de cultivos celulares (por ejemplo los documentos US7390660; Zagari, y otros, 2013, New Biotechnol., 30(2):238-45), o la modificacion genetica de las celulas, que incluye el direccionamiento hacia las enzimas de la via

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de la glicolisis (por ejemplo, Kim, S.H. y Lee, G.M., 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 152-159; Kim, S.H. y Lee, G.M., 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol. 76, 659-665; Wlaschin, K.F. y Hu, W-S., 2007, J. Biotechnol. 131,168-176). La alimentacion controlada de las celulas se usa en un intento para alcanzar un fenotipo metabolico mas eficiente (Europa, A. F., y otros, 2000, Biotechnol. Bioeng. 67:25-34; Cruz y otros, 1999, Biotechnol Bioeng, 66(2):104- 113; Zhou y otros, 1997, Cytotechnology 24, 99-108; Xie y Wang, 1994, Biotechnol Bioeng, 43:1174-89). Sin embargo, esto es complicado por el hecho de que la carencia de nutrientes, asf como tambien los cambios rapidos en, por ejemplo, la concentracion de amonio observados en el cultivo por lote alimentado de alta densidad celular pueden inducir la apoptosis ("muerte celular programada") (Newland y otros, 1994, Biotechnol. Bioeng. 43(5):434-8). Por lo tanto, un enfoque comun de optimizacion es cultivar celulas hasta una densidad moderadamente alta en un cultivo por lote alimentado y despues inducir intencionalmente una fase estacionaria productiva, prolongada mediante, por ejemplo, un cambio de temperatura o pH (Quek y otros, 2010, Metab Eng 12(2): 161-71. doi: 10.1016/j.ymben.2009.09.002. Epub 2009 Oct 13).

Las tecnicas de optimizacion, tales como las discutidas mas arriba, se han enfocado en los cultivos celulares por lote alimentado y este proceso dependiente de nutrientes debe adaptarse para cada celula huesped modificada geneticamente para la produccion de un polipeptido de interes. Los metodos para adaptar las celulas al consumo de lactato en los cultivos son altamente convenientes en el proceso de produccion de productos terapeuticos biologicos. Optimizar una lfnea celular con un fenotipo metabolico para el consumo de lactato resultana beneficioso para la produccion comercial de polipeptidos. Mulukutla B.C. y otros describen un cambio metabolico hacia el consumo de lactato en un cultivo por lote alimentado de celulas de mamfferos. (2011, Metab Eng., 14(2):138-49). Zagari F. y otros describen el cambio del metabolismo de lactato en cultivo de celulas CHO y el papel de la actividad oxidativa mitocondrial (2013, N Biotechnol., 30(2):238-45). Young D.J. describe la reprogramacion del flujo metabolico en los cultivos de celulas de mamfferos (2013, Curr Opin Biotechnol., 24(6): 1108-1115). Zhou W. y otros describen el cultivo por lote alimentado de celulas recombinantes de mieloma NS0 con alta produccion de anticuerpos monoclonales (1997, Biotechnol Bioeng., 55(5):783-92). Li F. y otros describen los procesos de cultivos celulares para la produccion de anticuerpos monoclonales (2010, MAbs., 2(5):466-79). Le H. y otros describen el analisis multivariado de los datos del proceso biologico de los cultivos celulares y el consumo de lactato como indicador del proceso (2012, J Biotechnol. 162(2-3):210-23). El documento US8470552 B2 describe una estrategia para reducir la produccion de acido lactico y controlar el PH en cultivo de celulas animales. Sheikholeslami Z. y otros describen el impacto del momento de la induccion sobre el metabolismo y la productividad de las celulas CHO en cultivo (2013, Biochem Eng J., 79:162-171). Ma N. y otros describen una unica alimentacion de nutrientes que apoya los procesos por lote alimentados tanto de NS0 como de CHO definidos qufmicamente: Improved productivity and lactate metabolism (2009, Biotechnol Prog. 25(5):1353-63).

Resumen de la invencion

La invencion proporciona un metodo para cultivar celulas que comprende:

(a) cultivar las celulas en un primer cultivo celular,

(b) determinar que se produjo un cambio metabolico hacia el consumo de lactato en el primer cultivo celular, y

(c) transferir las celulas a un segundo cultivo celular despues que se produjo el cambio metabolico hacia el consumo de lactato en las celulas,

en donde la concentracion de lactato en el segundo cultivo celular indica el consumo neto de lactato.

La invencion proporciona, ademas, el metodo de la invencion, en donde las celulas se transfectan con el ADN que codifica un polipeptido de interes antes de cultivar las celulas en un primer cultivo celular, y que comprende mantener el segundo cultivo celular en condiciones que permitan la expresion del polipeptido de interes, y cosechar el polipeptido de interes a partir del segundo cultivo celular.

La descripcion proporciona las celulas y los metodos para cultivar las celulas que cambiaron metabolicamente hacia el consumo de lactato. Las celulas adaptadas metabolicamente son ideales para la produccion de protefnas a gran escala.

Un aspecto de la invencion es un metodo para cultivar las celulas que comprende transferir las celulas de un primer cultivo celular a un segundo cultivo celular despues que se produjo un cambio metabolico hacia el consumo de lactato en las celulas en el primer cultivo celular.

Otro aspecto de la invencion proporciona un metodo para cultivar celulas que comprende, cultivar las celulas en un primer cultivo celular, determinar que se produjo un cambio metabolico hacia el consumo de lactato en las celulas en el primer cultivo celular, y transferir las celulas a un segundo cultivo celular despues que se produjo en las celulas el cambio metabolico hacia el consumo de lactato, en donde la concentracion de lactato en el segundo cultivo celular indica el consumo neto de lactato durante el segundo cultivo. En una modalidad, el metodo proporciona, ademas, una disminucion en la acumulacion de lactato en el segundo cultivo celular en comparacion con la que se determino en un cultivo celular de otra manera identico en condiciones de otra manera identicas excepto porque la

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transferencia de las celulas al segundo cultivo celular se hizo antes de que se produjera un cambio metabolico en el primer cultivo celular.

Un segundo aspecto de la invencion proporciona un metodo para producir una protefna que comprende transferir las celulas desde un primer cultivo celular a un segundo cultivo celular despues que se produjo un cambio metabolico hacia el consumo de lactato en las celulas, y mantener el segundo cultivo celular durante un perfodo de tiempo de manera que la protefna se acumule en el cultivo celular. En un aspecto relacionado, la invencion proporciona un metodo para producir una protefna que comprende cultivar las celulas en un primer cultivo celular, determinar que en las celulas se produjo un cambio metabolico hacia el consumo de lactato en el primer cultivo celular, transferir las celulas a un segundo cultivo celular despues que se produjo el cambio metabolico hacia el consumo de lactato en las celulas, y mantener el segundo cultivo celular durante un perfodo de tiempo de manera que la protefna se acumule en el cultivo celular. En una modalidad, el metodo proporciona, ademas, un aumento en la productividad en el segundo cultivo celular en comparacion con la que se determino en un cultivo celular de otra manera identico en condiciones de otra manera identicas excepto porque la transferencia de las celulas al segundo cultivo celular se hizo antes de que se produjera un cambio metabolico en el primer cultivo celular.

Un tercer aspecto de la invencion proporciona un metodo mejorado para cultivar celulas, en donde las celulas comprenden un gen que codifica un polipeptido de interes, que comprende las etapas de: cultivar las celulas en un primer cultivo celular, mantener el primer cultivo celular en condiciones que permitan la expansion de la masa celular, transferir las celulas a un segundo cultivo celular despues que se produce el cambio metabolico hacia el consumo de lactato en las celulas, mantener el segundo cultivo celular en condiciones que permitan la expresion del polipeptido de interes, y cosechar el polipeptido de interes a partir del segundo cultivo celular. En una modalidad, el metodo comprende, ademas, determinar que se produjo un cambio metabolico hacia el consumo de lactato en las celulas en el primer cultivo celular.

Un cuarto aspecto de la invencion proporciona un metodo mejorado para producir un polipeptido en un cultivo celular que comprende las etapas de: transfectar las celulas con el ADN que codifica un polipeptido de interes, cultivar las celulas en un primer cultivo celular, transferir las celulas a un segundo cultivo celular despues que se produjo el cambio metabolico hacia el consumo de lactato en las celulas, en donde el polipeptido de interes se expresa en las condiciones de un segundo cultivo celular, y mantener el segundo cultivo celular durante un perfodo de tiempo de manera que el polipeptido de interes se acumule en el cultivo celular. En una modalidad, el metodo comprende, ademas, determinar que se produjo un cambio metabolico hacia el consumo de lactato en las celulas en el primer cultivo celular.

Un quinto aspecto de la invencion proporciona un metodo para producir una lfnea celular con cambios metabolicos, que comprende las etapas de: mantener una poblacion celular en un primer cultivo celular en condiciones que permitan la expansion de la masa celular, determinar cuando se produjo el cambio metabolico hacia el consumo de lactato en las celulas, transferir una fraccion de la poblacion celular desde el primer cultivo celular a un segundo cultivo celular despues que se produjo el cambio metabolico hacia el consumo de lactato en las celulas, mantener la poblacion celular en el segundo cultivo celular durante un perfodo de tiempo, y opcionalmente cosechar las celulas y de esa manera producir la lfnea celular con cambios metabolicos.

Otro aspecto de la descripcion proporciona una lfnea celular con cambios metabolicos producida mediante cualquiera de los metodos de la invencion descritos en la presente descripcion.

En algunas modalidades, la lfnea celular con cambios metabolicos producida mediante los metodos de la invencion comprende una secuencia de acido nucleico integrada de manera estable en el genoma celular en donde la secuencia de acido nucleico codifica un polipeptido o una protefna de interes. En otras modalidades, la celula con cambios metabolicos producida mediante los metodos de la invencion comprende un vector de expresion que codifica un polipeptido o protefna de interes.

En una modalidad, el cambio metabolico hacia el consumo de lactato se detecta mediante las mediciones del pH, lactato o base en el primer cultivo celular. En otras modalidades, las celulas se transfieren a un segundo cultivo celular cuando se detecta el consumo de lactato. Aun en otras modalidades, el cambio metabolico hacia el consumo de lactato se detecta despues que el pH aumenta en el medio del primer cultivo celular sin la adicion de base. En otras modalidades, el cambio metabolico hacia el consumo de lactato se detecta cuando los niveles de lactato se estabilizan en el primer cultivo celular. Aun en otras modalidades, el metodo comprende, ademas, determinar el cambio metabolico que comprende: medir el pH en el primer cultivo celular, adicionar una base para mantener el pH por encima de un lfmite inferior predeterminado, determinar que el pH se encuentra por encima del lfmite inferior predeterminado durante intervalos consecutivos, y dejar de adicionar una base, lo que determina de esta manera que se produjo el cambio metabolico hacia el consumo de lactato en el primer cultivo celular.

En otras modalidades, el cambio metabolico hacia el consumo de lactato se detecta mediante indicadores o productos del metabolismo celular, que incluyen pero no se limitan al consumo de oxfgeno, y metabolitos tales como glicina, triptofano, fenilalanina, adenina, acido palmftico, acido glutamico, metionina y asparagina. En otra modalidad, el cambio metabolico hacia el consumo de lactato se detecta mediante analisis metabolomico o analisis proteomico.

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En una modalidad, el cambio metabolico se produce cuando las celulas emergen de la fase logarftmica (es decir crecimiento exponencial) en el primer cultivo celular. En otra modalidad, las celulas se transfieren despues que las celulas emergen de la fase logarftmica en el primer cultivo celular.

En otra modalidad, el cambio metabolico se produce cuando las celulas han alcanzado la fase estacionaria de crecimiento en el primer cultivo celular. En otra modalidad, las celulas se transfieren despues que las celulas alcanzan la fase estacionaria de crecimiento en el primer cultivo celular.

En una modalidad, el cambio metabolico se produce en el primer cultivo celular en o despues de 3 dfas de crecimiento celular en el primer cultivo celular. En otra modalidad, el cambio metabolico se produce en el primer cultivo celular en o despues de 3,5 dfas de crecimiento celular en el primer cultivo celular.

En algunas modalidades, el primer cultivo celular es un cultivo de siembra. En algunas modalidades, el segundo cultivo celular es un cultivo por lote alimentado. En otras modalidades, el segundo cultivo celular es un cultivo de produccion. En otras modalidades, el segundo cultivo celular se realiza en un biorreactor de produccion.

Aun en otras modalidades, las celulas se transfieren al segundo cultivo celular a una densidad celular de partida mayor que, o igual a aproximadamente 0,5 x 106 celulas/mL. En algunas modalidades, las celulas se transfieren al segundo cultivo celular a una densidad celular de partida entre aproximadamente 0,5-3,0 x 106celulas/mL.

En algunas modalidades, la concentracion de lactato en el segundo cultivo celular indica el consumo neto de lactato, por ejemplo, el consumo neto de lactato se alcanza en o despues de 2 dfas, 3 dfas, 4 dfas o 5 dfas de crecimiento celular en el segundo cultivo celular. En mas modalidades, la disminucion en la acumulacion de lactato es una reduccion en la concentracion maxima de lactato en el segundo cultivo celular. En otras modalidades, la reduccion en la concentracion maxima de lactato se produce en el segundo cultivo celular en, o despues de 5 dfas de crecimiento celular en el segundo cultivo celular. En otras modalidades, la concentracion maxima de lactato en el segundo cultivo celular es menor que aproximadamente 6 g/L, 5 g/L, 4 g/L, 3 g/L, 2 g/L, o menor que aproximadamente 1 g/L.

En algunas modalidades de la invencion, la celula o celulas se seleccionan del grupo que consiste en CHO, COS, celulas de retina, Vero, CV1, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431, CV-1, U937, 3T3, celula L, celula C127, SP2/0, NS-0, MMT, PER.C6, celulas linfoides murina, y celulas de hibridomas murino.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1: Un recipiente de siembra de la lfnea celular CHO que produce protefnas de fusion se uso para inocular biorreactores de produccion replicados en (Figura 1A) tres estados metabolicos diferentes (pH en lfnea y lactato fuera de lfnea) y recuentos de celulas viables (VCC). Se muestra, ademas, el uso de una base normalizado a 1 para el recipiente de siembra. Los parametros (tiempo, pH, lactato, VCC y base) para cada cultivo celular (Condicion #1, #2, y #3) por los que se transfirieron las celulas a los biorreactores de produccion se indican mediante rectangulos abiertos (lfnea punteada). Todos los biorreactores de produccion se ejecutaron con las mismas condiciones de operacion. Se muestra el impacto de cada siembra en serie y su estado metabolico en el tftulo de protefna (Figura 1B) y lactato (Figura 1C) en un biorreactor de produccion. Las lfneas de tendencia del biorreactor de produccion representan el promedio de los biorreactores duplicados con barras de error que representan ± una desviacion estandar.

Figura 2: Un recipiente de siembra de la lfnea celular CHO productora de anticuerpos se uso para inocular biorreactores de produccion replicados en un proceso definido qufmicamente en (Figura 2A) cuatro estados metabolicos diferentes (pH y lactato fuera de lfnea) y recuentos de celulas viables (VCC). Los parametros (tiempo, pH, lactato, y VCC) para cada cultivo celular (Condicion #1, #2, #3 y #4) por los que se transfirieron las celulas a los biorreactores de produccion se indican mediante rectangulos abiertos (lfnea punteada). Todos los biorreactores de produccion se ejecutaron con las mismas condiciones de operacion. La Condicion #1 se perdio despues de una semana. Se muestra, ademas, el impacto de cada tren de siembra y su estado metabolico en el tftulo de protefna (Figura 2B) y en la acumulacion de lactato (Figura 2C) en un biorreactor de produccion. Las lfneas de tendencia del biorreactor de produccion representan el promedio de los biorreactores duplicados con barras de error que representan ± una desviacion estandar.

Descripcion detallada de la invencion

Debe entenderse que esta invencion no se limita a los metodos y condiciones experimentales particulares descritas, ya que estos metodos y condiciones pueden variar. Ademas, debe entenderse que la terminologfa usada en la presente descripcion es solamente para el proposito de describir modalidades particulares, y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invencion se define en las reivindicaciones.

Como se usa en esta descripcion y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “una”, y “el/la” incluyen

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las referencias plurales a menos que el contexto establezca claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a “un metodo” incluye uno o mas metodos, y/o etapas del tipo descrito en la presente descripcion y/o los que sean evidentes para los expertos en la tecnica despues de la lectura de esta descripcion.

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente descripcion tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque cualquiera de los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripcion pueden usarse en la practica de la presente invencion, ahora se describiran metodos y materiales particulares.

Cultivo celular

"Cultivo por lote" o "modo por lote", como se usa en la presente descripcion, es una frase que se refiere a una unidad (por ejemplo un recipiente de cultivo) que esta lleno de celulas y con un volumen de trabajo completo inicial de medio que nunca se intercambia. En tal cultivo por lote, todos los componentes para el cultivo celular se suministran al recipiente de cultivo al comienzo del proceso de cultivo. Usualmente el cultivo se ejecuta hasta que los nutrientes se agotan o los productos de desechos alcanzan niveles toxicos y las celulas detienen su crecimiento.

La frase "cultivo de siembra" o "tren de siembra" (referida ademas como tren de inoculacion), como se usa en la presente descripcion, incluye la fuente de inoculacion de una poblacion celular que se dejan expandir en el cultivo por lote, o en series de cultivos por lote, hasta que este lista para la escala de produccion. El proceso de expansion del tren de siembra constituye la fase de crecimiento inicial de las celulas, o fase de crecimiento del inoculo, despues de una descongelacion de las celulas congeladas. El intervalo entre la descongelacion de las celulas y la acumulacion de suficiente masa celular para inocular un biorreactor de produccion constituye la fase de expansion del tren de siembra. La masa celular puede ampliarse a traves de varias etapas del biorreactor en el cultivo de siembra, y las celulas se cultivan en el medio de cultivo celular en condiciones favorables para la supervivencia, el crecimiento y la viabilidad del cultivo celular. Se entendera que el tren de siembra se destina a maximizar la fase de crecimiento exponencial, o alcanzar la tasa de crecimiento maxima para el tipo de celula particular que se cultiva. Por lo tanto, el pase de las celulas de un biorreactor o recipiente a otro puede ser una via para lograr la tasa de crecimiento maxima. Las condiciones precisas variaran en dependencia del tipo de celula, el organismo del que se deriva la celula y la naturaleza y el caracter del polipeptido o protefna que se expresa. Un cambio en el metabolismo hacia el consumo de lactato puede producirse o detectarse en cualquiera de los recipientes de expansion del tren de siembra.

La frase "cultivo celular por lote alimentado" o "cultivo por lote alimentado" cuando se usa en la presente descripcion se refiere a un cultivo por lote en donde las celulas animales y el medio de cultivo se suministran inicialmente al recipiente de cultivo y los nutrientes adicionales del cultivo se suministran lentamente, continuamente o en incrementos discretos, al cultivo durante el proceso de cultivo, con o sin cosecha periodica de celulas y/o productos antes de finalizar el cultivo. El cultivo por lote alimentado incluye el "cultivo por lote alimentado semicontinuo" en donde periodicamente el cultivo completo (que puede incluir las celulas y el medio) se elimina y se sustituye por medio fresco. El cultivo por lote alimentado se diferencia del "cultivo por lote" simple en que todos los componentes del cultivo celular (que incluyen las celulas animales y todos los nutrientes del cultivo) se suministran al recipiente de cultivo al inicio del proceso de cultivo en un cultivo por lote. El cultivo por lote alimentado puede diferenciarse, ademas, del cultivo por perfusion en cuanto a que el sobrenadante no se elimina del recipiente de cultivo durante el proceso, mientras que en el cultivo por perfusion, las celulas se conservan en el cultivo mediante, por ejemplo, filtracion, y el medio de cultivo se introduce y se elimina continuamente o de manera intermitente del recipiente de cultivo. Sin embargo, se contempla la eliminacion de muestras con propositos de prueba durante el cultivo celular por lote alimentado. El proceso por lote alimentado continua hasta que se determina que se alcanzo el volumen de trabajo maximo y/o la produccion de protefna.

La frase "cultivo celular continuo" cuando se usa en la presente descripcion se refiere a una tecnica que se usa para cultivar celulas continuamente, usualmente en una fase particular de crecimiento. Por ejemplo, si se requiere un suministro constante de celulas, o se requiere la produccion de un polipeptido o protefna de interes particular, el cultivo celular puede requerir mantenimiento en una fase particular de crecimiento. Por lo tanto, las condiciones deben supervisarse y ajustarse continuamente en consecuencia para mantener las celulas en esa fase particular.

La frase "fase logarftmica", como se usa en la presente descripcion significa un perfodo de crecimiento celular tfpicamente caracterizado por la duplicacion celular. Las frases "fase de crecimiento exponencial" o "fase exponencial" se usan indistintamente con la fase logarftmica. En la fase logarftmica, el numero de celulas nuevas que aparecen por unidad de tiempo es proporcional a la poblacion celular presente, por lo tanto, representar graficamente el logaritmo natural del numero de celulas en funcion del tiempo produce una lfnea recta. Si el crecimiento no es limitado, la duplicacion continuara a un ritmo constante, de modo que tanto el numero de celulas como la tasa de crecimiento de la poblacion se duplicaran con cada perfodo de tiempo consecutivo.

La frase "fase estacionaria", como se usa en la presente descripcion, se refiere al punto donde la tasa de crecimiento

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celular es igual a la tasa de muerte celular. Cuando se representa en un grafico, la fase estacionaria se representa como una meseta, o "llanura" en la parte lineal horizontal de la curva.

El termino "celula" cuando se usa en la presente descripcion incluye cualquier celula que es adecuada para la expresion de una secuencia de acido nucleico recombinante. Las celulas incluyen aquellas de eucariotas, tales como celulas de animal no humano, celulas de mamfferos, celulas humanas, o fusiones celulares tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En determinadas modalidades, la celula es una celula humana, de mono, hamster, rata, o raton. En otras modalidades, la celula se selecciona a partir de las siguientes celulas: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), celulas de retina, Vero, CV1, rinon (por ejemplo,HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL- 60, Jurkat, Daudi, A431 (epidermicas), CV-1, U937, 3T3, celulas L, celulas C127, SP2/0, NS-0, celulas MMT, celula tumoral, y una lfnea celular derivada de una celula mencionada anteriormente. En algunas modalidades, la celula comprende uno o mas genes virales, por ejemplo, una celula de retina que expresa un gen viral (por ejemplo, una celula PER.C6®). En algunas modalidades, la celula es una celula CHO. En otras modalidades, la celula es una celula CHO K1.

Una "lfnea celular", como se usa en la presente descripcion, se refiere a una celula o celulas que se derivan de un linaje particular a traves de pases en serie o subcultivos de celulas. El termino "celulas" se usa indistintamente con "poblacion celular".

Dado el estado de la tecnica actual acerca de las estrategias de alimentacion, las celulas CHO han alcanzado numeros celulares tal como 11 x 106 celulas/mL (en el dfa 8) y tftulos de, por ejemplo, 2,3 g/L de IgG humana (cosechada en el dfa 14), numeros que son valores industriales tfpicos para cultivos por lote alimentado de celulas CHO (Kim, BJ, y otros, Biotechnol Bioeng. 2012 Jan;109(1):137-45. doi: 10.1002/bit.23289. Epub 2011 Oct 3). Incluso se ha informado una produccion de anticuerpos de mas de 10 g/L a partir de celulas CHO que han sido bien establecidas como una lfnea de celulas de mamfferos industrial importante (Omasa y otros, Current Pharmaceutical Biotechnology, 2010, 11: 233-240).

Los terminos "medio de cultivo celular" y "medio de cultivo" se refieren a una solucion de nutrientes que se usa para el crecimiento de celulas de mamfferos que proporciona, tfpicamente, los nutrientes necesarios para potenciar el crecimiento de las celulas, tales como una fuente de energfa de carbohidratos, aminoacidos esenciales, elementos traza, vitaminas, etcetera. El medio de cultivo celular puede contener extractos, por ejemplo, suero o peptonas (hidrolizados), que complementan la materia prima que sustenta el crecimiento celular. Los medios pueden contener extractos de soja o derivados de levadura, en lugar de extractos derivados de animales. El medio definido qufmicamente se refiere a un medio de cultivo celular en el que se conocen todos los componentes qufmicos. El medio definido qufmicamente es completamente libre de componentes derivados de animales, tales como suero o peptonas derivadas de animales.

Un aspecto de la invencion se refiere a una fase de crecimiento en donde las condiciones de cultivo celular se modifican para potenciar el crecimiento de celulas eucariotas recombinantes. En la fase de crecimiento, a un recipiente de cultivo en lote se suministran un medio de cultivo basal y las celulas.

El recipiente de cultivo se inocula con las celulas. Una densidad de siembra adecuada para la fase de crecimiento celular inicial varfa en dependencia de la lfnea celular de partida, por ejemplo, en el intervalo de 0,2 a 3 x 106 celulas/mL. Los recipientes de cultivo incluyen, pero no se limitan a placas de pocillos, matraces T, matraces de agitacion, recipientes agitados, matraces de agitacion, biorreactores con elevacion de aire, de fibra hueca, y similares. Un recipiente de cultivo celular adecuado es un biorreactor. Un biorreactor se refiere a cualquier recipiente de cultivo que se fabrica o disena para manipular o controlar las condiciones ambientales. Tales recipientes de cultivo se conocen bien en la tecnica.

Los procesos y sistemas de biorreactor se han desarrollado para optimizar el intercambio de gases, suministrar suficiente oxfgeno para mantener el crecimiento y la productividad de las celulas, y eliminar el CO2. Mantener la eficiencia del intercambio de gases es un criterio importante para garantizar una ampliacion exitosa del cultivo celular y la produccion de protefnas. Tales sistemas se conocen bien por el experto en la tecnica.

La fase de crecimiento exponencial o el cultivo de siembra (es decir el primer cultivo celular) tfpicamente es seguida por un segundo cultivo distinto, conocido como la fase de produccion de polipeptidos. En una modalidad, las celulas que experimentan un cambio metabolico hacia el consumo de lactato en un primer cultivo celular se transfieren a un segundo cultivo celular. En una modalidad, el segundo cultivo celular se realiza en un recipiente de cultivo diferente al de la fase de crecimiento celular o del cultivo de siembra. En algunas modalidades, el segundo cultivo celular tiene lugar en un biorreactor de produccion. En este contexto, la transferencia de celulas se refiere a la extraccion de una fraccion de la poblacion celular del primer recipiente de cultivo celular y la colocacion de la fraccion de la poblacion celular en un segundo recipiente de cultivo celular para iniciar el segundo cultivo celular.

En otros aspectos, la transferencia de celulas puede referirse a que un volumen de celulas que contiene las celulas del primer cultivo celular se coloca en un recipiente diferente y el volumen del inoculo es una fraccion del volumen

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final del segundo cultivo celular, por ejemplo, aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, o 50 %, o 60 %, o 70 % u 80 % del volumen final. En otros aspectos, la transferencia de celulas puede referirse a un volumen de celulas que contiene las celulas del primer cultivo celular que permanecen en el recipiente inicial y se agrega medio de manera que el volumen inicial (primer cultivo celular) es una fraccion del volumen final del segundo cultivo celular. En este contexto, el primer cultivo celular se diluye, de esa manera se transfieren las celulas a un segundo cultivo celular.

La frase "emergen de" o "emerge de" como se usa en la presente descripcion, se refiere a un cambio de una fase a otra fase, o a punto de cambiar de una fase a otra fase. Emerger de una fase particular, por ejemplo, una fase de crecimiento, incluye el perfodo de tiempo donde las mediciones indican que una primera fase disminuye su ritmo o casi termina, y que comienza la fase siguiente. Emerger de la fase logarftmica, por ejemplo, indica que las celulas se encuentran en la terminacion de la fase logarftmica, y/o que comienzan o han alcanzado la fase estacionaria. Tfpicamente, las fases de crecimiento se miden mediante la concentracion de celulas viables.

La frase "densidad celular" se refiere al numero de celulas por volumen de muestra, por ejemplo, como el numero total de celulas (viables y muertas) por mL. El numero de celulas puede contarse manualmente o mediante automatizacion, tal como con un citometro de flujo. Los contadores celulares automatizados se han adaptado para contar el numero de celulas viables o muertas o ambas, viables/muertas, mediante el uso, por ejemplo, de una tecnica estandar de absorcion de azul tripan. La frase "densidad de celulas viables" o "concentracion de celulas viables" se refiere al numero de celulas viables por volumen de muestra (denominado ademas como "recuento de celulas viables"). Para determinar la densidad celular pueden usarse una serie de tecnicas manuales o automatizadas bien conocidas. Las dimensiones de la biomasa en lfnea del cultivo pueden medirse, donde la capacitancia o la densidad optica se correlaciona con el numero de celulas por volumen.

La densidad celular final en un primer cultivo celular, tal como la densidad del tren de siembra, varfa en dependencia de la lfnea celular de partida, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1,0 a 10 x 106 celulas/mL. En algunas modalidades, la densidad final del tren de siembra alcanza 1,0 a 10 x 106 celulas/mL antes de la transferencia de las celulas a un segundo cultivo celular. En otras modalidades, la densidad final del tren de siembra alcanza 5,0 a 10 x 106 celulas/mL antes de la transferencia de las celulas a un segundo cultivo celular.

En algunas modalidades, una fraccion de la poblacion celular en el primer cultivo celular se transfiere al segundo cultivo celular. En otras modalidades, la poblacion celular en el primer cultivo celular se transfiere al segundo cultivo celular de manera que el primer cultivo celular es una fraccion del segundo cultivo celular. La densidad celular de partida del segundo cultivo puede elegirse por el experto en la tecnica. En algunas modalidades, la densidad celular de partida en el segundo cultivo celular esta entre aproximadamente 0,5 x 106 celulas/mL a aproximadamente 3,0 x 106 celulas/mL. En otras modalidades, la densidad celular de partida en el segundo cultivo celular es aproximadamente 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, o 3,0 x 106 celulas/mL.

En determinadas modalidades, el sobrenadante celular o lisado celular se cosecha despues de la fase de produccion. En otras modalidades, el polipeptido o protefna de interes se recupera del medio de cultivo o lisado celular, mediante el uso de tecnicas bien conocidas en la tecnica.

Las propiedades de las celulas y la ubicacion del producto producido dictan el metodo que se usa para el crecimiento y la produccion, y en consecuencia la seleccion de un tipo adecuado de biorreactor o recipiente de cultivo. (Bleckwenn, NA y Shiloach, J. 2004 "Large-scale cell culture" Curr Protoc Immunol. 59: Appendix 1U.1- Appendix 1U.44.)

Cambio Metabolico

La frase "cambio metabolico" cuando se usa en la presente descripcion se refiere a un cambio en el metabolismo celular, o al uso de fuentes de nutrientes de carbono, desde la produccion de lactato hasta el consumo neto de lactato. Sin estar atado a ninguna teorfa, las fuentes de nutrientes de carbono mas comunes en los medios libres de suero son la glucosa y la glutamina, que sustentan el crecimiento celular rapido. La glucosa puede oxidarse completamente a CO2 y H2O, o, en base a la disponibilidad de oxfgeno, convertirse en lactato, como en la glucolisis aerobica. Las celulas de crecimiento rapido consumen glucosa y glutamina rapidamente, lo que provoca un metabolismo oxidativo incompleto y, por lo tanto, un exceso de produccion de lactato. El metabolismo de los carbohidratos puede cambiar hacia el consumo de lactato, y por lo tanto, reducir la acumulacion de lactato.

La frase "consumo de lactato" cuando se usa en la presente descripcion se refiere al uso de lactato como una fuente de carbono en el metabolismo celular.

La frase "consumo neto de lactato" cuando se usa en la presente descripcion se refiere al consumo de lactato mientras que las celulas simultaneamente consumen lactato y producen lactato como un subproducto del metabolismo celular, y la tasa general de consumo es mayor que, o igual a la tasa de produccion de lactato. Cuando el consumo neto de lactato aumenta, la acumulacion total de lactato en un medio de cultivo celular disminuye.

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Al inicio de un cultivo por lote alimentado, la acumulacion de lactato, y posiblemente amonfaco, provocan que la viabilidad de las celulas disminuya rapidamente. Se ha informado que en cultivos por lote alimentado que no cambian metabolicamente, ninguno podia alcanzar una viabilidad superior al 90 % cuando la concentracion celular habfa alcanzado su maximo. (Xie y Wang, 1994, Biotechnol. Bioeng. 43(11):1175-1189). Tal metodo de cambio metabolico, aunque deseable para la realizacion de un proceso optimo, no es ni generico ni facilmente controlable (Zagari, y otros, 2013, New Biotechnol. 30(2):238-245). Los inventores descubrieron que el tiempo y las condiciones para la transferencia de las celulas de un primer cultivo por lote (por ejemplo, un cultivo de siembra) a un segundo cultivo por lote (por ejemplo, un cultivo por lote alimentado o cultivo de produccion) tienen un impacto significativo en los titulos de la proteina final. Se determino inesperadamente que las celulas cultivadas durante un perfodo de tiempo mas largo en un primer cultivo por lote cambiaran hacia el consumo de lactato y conferiran una preferencia metabolica, o fenotipo metabolico, para el consumo de lactato. Es un objetivo de esta invencion crear celulas en un estado con cambio metabolico constante, por lo tanto, celulas con una memoria metabolica para el consumo de lactato. El metodo de la invencion es muy apropiado para el condicionamiento previo de las celulas en un estado con cambios metabolicos, de manera que las celulas puedan usarse en cualquier segundo o posterior cultivo celular donde se prefiera el consumo de lactato.

En una modalidad, la acumulacion global de lactato disminuye en el segundo cultivo celular. En algunas modalidades, el consumo neto de lactato se alcanza durante el segundo cultivo celular, por ejemplo, el consumo neto de lactato se alcanza en, o despues de 2 dias, 3 dias, 4 dias o 5 dias de crecimiento celular en el segundo cultivo celular. En mas modalidades, la disminucion en la acumulacion de lactato es una reduccion en la concentracion maxima de lactato en el segundo cultivo celular. En otras modalidades, la reduccion en la concentracion maxima de lactato se produce en el segundo cultivo celular en, o despues de 5 dias de crecimiento celular en el segundo cultivo celular. En otras modalidades, la concentracion maxima de lactato en el segundo cultivo celular es menor que aproximadamente 6 g/L, 5 g/L, 4 g/L, 3 g/L, 2 g/L, o menor que aproximadamente 1 g/L.

En algunas modalidades, las celulas con cambios metabolicos producen valores de concentracion de lactato al menos 2 veces, o 3 veces, o 4 veces o 5 veces o hasta 10 veces menor en un segundo cultivo celular. En algunas modalidades adicionales, los valores de concentracion de lactato inferiores en un segundo cultivo celular o la disminucion de la acumulacion global de lactato en el segundo cultivo celular se comparan con la que se determino en un cultivo celular, de otra manera identico, en condiciones de otra manera identicas excepto porque la transferencia de las celulas al segundo cultivo celular se hace antes de que se produzca un cambio metabolico en el primer cultivo celular. Aun en otras modalidades, la acumulacion global de lactato disminuye en el segundo cultivo celular en, o despues de 5 dias de crecimiento celular en el segundo cultivo celular.

En otra modalidad, el tftulo global del producto aumenta en el segundo cultivo celular. En otras modalidades, las celulas con cambios metabolicos producen titulos del producto al menos 2 veces, o 2,5 veces, 3 veces, o 4 veces, o 5 veces, o hasta 10 veces mas altos en un segundo cultivo celular. Aun en otras modalidades, los valores de titulos de proteina mas altos en un segundo cultivo celular se comparan con los que se determino en un cultivo celular, de otra manera identico, en condiciones de otra manera identicas excepto porque la transferencia de las celulas al segundo cultivo celular se hace antes de que se produzca un cambio metabolico en el primer cultivo celular.

La optimizacion del control metabolico de las celulas en cultivo antes de la etapa de por lote alimentado o de produccion tiene muchas ventajas. El cambio metabolico hacia el consumo de lactato en un primer cultivo puede determinarse por multiples parametros. La determinacion de un cambio metabolico comprende un numero de metodos conocidos por los expertos en la tecnica para determinar el estado metabolico de las celulas en crecimiento.

La medicion de los valores de la concentracion de lactato en un primer cultivo celular puede realizarse mediante una variedad de sistemas de ensayos biologicos y kit bien conocidos por el experto en la tecnica, tales como los analizadores que usan electroqufmica (por ejemplo, Bioprofile® Flex, Nova Biomedical, Waltham, MA), o espectroscopfa Raman, y puede usarse para supervision fuera de lfnea o en lfnea, de la acumulacion de lactato en el cultivo celular.

Se entiende que la acumulacion de lactato tiene un efecto perjudicial sobre el cultivo celular, y posteriormente tiene un efecto negativo sobre el rendimiento del producto proteico.

En una modalidad, el cambio metabolico se determina en un primer cultivo celular cuando la acumulacion neta de lactato disminuye o cesa.

En una modalidad, el cambio metabolico hacia el consumo de lactato se detecta mediante las mediciones de lactato en el primer cultivo celular. En algunas modalidades, el cambio metabolico se determina en un primer cultivo celular cuando se determina una meseta, o lfnea esencialmente horizontal, en un grafico que representa la medicion consecutiva de los valores de la concentracion de lactato en el cultivo. En otras modalidades, el valor de la concentracion de lactato permanece por debajo del lfmite de tolerancia superior para mediciones consecutivas. Aun

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en otras modalidades, el limite de tolerancia superior para la concentracion de lactato no es mayor que 4 g/L. Se entiende que los niveles de lactato se estabilizan cuando las celulas experimentan un consumo neto de lactato.

En otras modalidades, la determinacion del cambio metabolico comprende medir lactato en el primer cultivo celular a intervalos, y determinar que el lactato esta por debajo del limite superior predeterminado para intervalos consecutivos, de esta manera se determina que en las celulas se produjo el cambio metabolico hacia el consumo de lactato.

El manejo y el control del pH es un aspecto importante del mantenimiento de las celulas en un cultivo de biorreactor. El crecimiento de la mayoria de las celulas es optimo dentro de limites estrechos del pH. Generalmente, el cultivo celular se mantiene a un pH neutro de 7,0, dentro de un rango de valores superiores e inferiores de los puntos establecidos. Los valores de los puntos establecidos los determina un experto en la tecnica en dependencia de la linea celular particular en cultivo, la composicion del medio y las condiciones optimas para el crecimiento de esa celula. Como se usa en la presente descripcion, la expresion "pH neutro" se refiere a un pH de aproximadamente 6,85 a aproximadamente 7,4. La expresion "pH neutro" incluye valores del pH de aproximadamente 6,85, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, y 7,4

La supervision del pH y la adicion de una base en linea, o "en tiempo real", puede realizarse mediante cualquiera de una serie de metodos conocidos por el experto en la tecnica. En un sistema en linea, las mediciones en tiempo real de los parametros biologicos y qufmicos en el cultivo celular, mediante conexion directa a un analizador, proporcionan la retroalimentacion para realizar acciones adicionales, por ejemplo, agregar una base o agregar nutrientes al medio de cultivo. Ademas, pueden realizarse las mediciones fuera de linea, mientras se realiza el muestreo periodico y la intervencion manual del operador. La medicion continua del pH permite supervisar el medio celular y se anade una base, por ejemplo, si la acidez alcanza un valor inferior al punto establecido fuera de los limites de tolerancia. Si el pH alcanza los limites superiores de tolerancia establecidos (es decir, se vuelve demasiado basico), puede anadirse CO2.

La supervision en linea puede realizarse mediante una variedad de metodos. Los electrodos, tales como los electrodos de flujo continuo, se usan comunmente para medir el pH u otros parametros como el O2 disuelto (dO2) y la temperatura en el medio de cultivo celular. Tales electrodos de flujo continuo se conectan directamente a cualquier registrador de grafico de banda estandar para el registro continuo o pueden interconectarse con cualquier medidor del pH o de milivoltios estandar de laboratorio. El pH puede medirse, ademas, por medio de una medicion optica con el uso de un punto de sensor fluorescente montado en el biorreactor.

Cualquier sistema de supervision de este tipo integrara un limite de tolerancia (o banda muerta) alrededor de los valores superiores e inferiores establecidos. La banda muerta evita que el sistema de dosificacion se encienda y se apague demasiado rapido. Durante el control del pH, no se realizara ninguna dosificacion o titulacion si la desviacion del pH a partir del punto establecido se encuentra dentro de los limites de tolerancia. Si los valores de la medicion del pH son mayores que el limite inferior de tolerancia (acido), entonces se agregara una base lfquida (por ejemplo, KOH, NaOH, NaHCO) o NH3 gaseoso. Si los valores de la medicion del pH estan por encima del limite superior de tolerancia (basico), se agregara un acido o CO2 gaseoso. El punto del pH establecido y la estrategia de control, por ejemplo, la banda muerta, se vinculan a multiples parametros tales como CO2 disuelto, consumo de una base para el control del pH, y por lo tanto, la osmolalidad. (Ver por ejemplo, Li, F., y otros, 2010, mAbs 2(5):466-479.)

En una modalidad, el cambio metabolico se determina en un primer cultivo celular cuando se detiene la adicion de una base (es decir, la titulacion). La tendencia de la base incluye una tendencia en linea en donde puede usarse un metodo de supervision automatico para determinar el pH y la adicion periodica de una base. En el presente metodo, los puntos establecidos del pH pueden variar, pero el aumento del pH fuera de la banda muerta inferior es indicativo de cambio metabolico en el primer cultivo celular. Los metodos en linea y manuales para medir la tendencia de la base se conocen en la tecnica, e incluyen metodos para supervisar el peso del recipiente, o la velocidad de flujo de la bomba para detectar la adicion de base o la detencion de la adicion de base.

En otra modalidad, el cambio metabolico se determina en un primer cultivo celular cuando la adicion de una base ya no es necesaria para elevar el pH por encima del limite de tolerancia inferior.

En algunas modalidades, el cambio metabolico se determina en un primer cultivo cuando el valor del pH aumenta sin adicion de una base. En otras modalidades, el valor del pH aumenta por encima del limite inferior de tolerancia durante mediciones consecutivas.

En otras modalidades, la determinacion del cambio metabolico comprende: (a) calibrar un instrumento de deteccion del pH para detectar el nivel de ruido en el primer cultivo celular, (b) medir continuamente el pH en el primer cultivo celular a intervalos regulares, (c) adicionar una base segun sea necesario para mantener el pH por encima de un limite inferior predeterminado; (d) determinar que el pH se encuentra por encima del limite inferior predeterminado durante varios intervalos consecutivos, y (e) dejar de adicionar una base para determinar, de esta manera, que en las celulas se produjo el cambio metabolico hacia el consumo de lactato.

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En una modalidad, el limite inferior de tolerancia es un pH de aproximadamente 6,5, 6,55, 6,6, 6,65, 6,7, 6,75, 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05 o aproximadamente 7,1.

En algunas modalidades, el cambio metabolico hacia el consumo de lactato se detecta mediante indicadores o productos del metabolismo celular en el primer cultivo celular. Uno de tales indicadores del metabolismo celular es el consumo de oxfgeno (Zagari, y otros, 2013, New Biotechnol. 30(2):238-245). Puede usarse una medida precisa de la tasa de deplecion de oxfgeno en el medio de cultivo celular para determinar la presencia de celulas viables en el cultivo despues de la inoculacion, asf como tambien, la tasa de crecimiento de las celulas en cultivo (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos num. 6,165,741 y la patente de Estados Unidos num. 7,575,890). La medicion del consumo de oxfgeno es bien conocida en la tecnica.

Otros indicadores del metabolismo celular, como enzimas y metabolitos, pueden medirse mediante tecnicas proteomicas o metabolomicas, tales como arreglos inmunologicos, resonancia magnetica nuclear (RMN) o espectrometrfa de masas. Los metabolitos, tales como glicina, triptofano, fenilalanina, adenina, acido palmftico, acido glutamico, metionina y asparagina se han correlacionado con un aumento de la biomasa celular (ver, por ejemplo, Jain, M., y otros, Science. 2012 May 25; 336(6084): 1040-1044. doi:10.1126/science.1218595; y De la Luz- Hdez, K., 2012, Metabolomics and Mammalian Cell Culture, Metabolomics, Dr Ute Roessner (Ed.), ISBN: 978-95351-0046-1, InTech, Disponible en:
http://www.intechopen.com/books/metabolomics/ metabolomics-and-mammalian- cell-cultures). Para determinar que se produjo un cambio metabolico pueden usarse cualquier cantidad de cambios moleculares que coincidan con, o que conduzcan directamente al cambio metabolico en el primer cultivo celular.

Produccion de Protefnas

Los metodos de la invencion producen una protefna o polipeptido de interes en un cultivo celular. Para facilitar la produccion de protefnas en los metodos de la invencion, las celulas se modifican geneticamente para expresar de manera recombinante el polipeptido o protefna de interes.

Las celulas se transfieren a un segundo cultivo celular, por ejemplo un cultivo de produccion, despues que en las celulas se produjo el cambio metabolico hacia el consumo de lactato, y se mantendran en el segundo cultivo celular durante un perfodo de tiempo de manera que el polipeptido o protefna se acumule en el cultivo celular.

Como se usa en la presente descripcion, un "polipeptido" es una cadena de polfmero lineal unica de aminoacidos que se unen entre sf mediante enlaces peptfdicos entre los grupos carboxilo y amino de los residuos de aminoacidos adyacentes. El termino "protefna" puede usarse, ademas, para describir un polipeptido grande, tal como una protefna de siete dominios que se extiende a traves de la membrana, con una estructura espacial o plegada particular. Como tal, el termino "protefna" se destina a incluir estructuras cuaternarias, estructuras ternarias y otras macromoleculas complejas compuestas por al menos un polipeptido. Si la protefna comprende mas de un polipeptido que se asocian ffsicamente entre sf, entonces el termino "protefna", como se usa en la presente descripcion, se refiere a los polipeptidos multiples que se acoplan ffsicamente y funcionan juntos como la unidad discreta. El termino "protefna" incluye polipeptido.

Los ejemplos de polipeptidos y protefnas producidos por los metodos de la invencion incluyen anticuerpos, protefnas de fusion, protefnas de fusion Fc, receptores, protefnas de fusion Fc-receptor, y similares.

El termino "inmunoglobulina" se refiere a una clase de glicoprotefnas relacionadas estructuralmente que consisten en dos pares de cadenas de polipeptidos, un par de cadenas ligeras (L) y un par de cadenas pesadas (H), que pueden interconectarse las cuatro mediante enlaces disulfuro. La estructura de las inmunoglobulinas se ha caracterizado bien. Ver por ejemplo, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, Nueva York (1989)). Brevemente, cada cadena pesada tfpicamente, comprende una region variable de la cadena pesada (abreviada en la presente descripcion como Vh o VH) y una region constante de la cadena pesada (Ch). La region constante de la cadena pesada tfpicamente comprende tres dominios, Ch1, Ch2, y Ch3. Los dominios Ch1 y Ch2 se unen mediante una bisagra. Cada cadena ligera comprende una region variable de la cadena ligera (abreviada en la presente descripcion como Vl o VL) y una region constante de la cadena ligera. En los humanos, y otros mamfferos hay dos tipos de cadenas ligeras: cadena kappa (k) y cadena lambda (A). La region constante de la cadena ligera tfpicamente comprende un dominio (Cl). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse, ademas, en regiones de hipervariabilidad, (o regiones hipervariables que pueden ser hipervariables en secuencia y/o formas de lazos definidos estructuralmente), denominados, ademas, regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que son mas conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada Vh y Vl se compone tfpicamente de tres CDR y cuatro FR, ordenados desde el amino terminal (N-terminal) hasta el carboxilo terminal (C- terminal) en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, Fr4 (ver ademas Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). Tfpicamente, la numeracion de los residuos de aminoacidos en esta region es de acuerdo con IMGT, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), o por el sistema de numeracion de la UE de Kabat (conocido, ademas, como "numeracion de la UE" o "fndice de la UE"), por ejemplo, como en Kabat, E.A. y otros Sequences of Proteins of

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Immunological interest. 5ta ed. US Department of Health and Human Services, NIH publicacion Num. 91-3242 (1991).

El termino "Fc" se refiere a una porcion de una region constante de la cadena pesada que comprende al menos los dominios CH2 y CH3 que se unen tfpicamente a un receptor de Fc por ejemplo, un FcyR, particularmente FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) o un FcRn, es decir, un receptor Fc neonatal. Se entiende que una protefna de fusion Fc puede contener todo o parte de un dominio Fc natural o contener deleciones, sustituciones y/o inserciones u otras modificaciones que lo hacen incapaz de unirse a cualquier receptor de Fc, en consecuencia hace que el dominio no sea funcional o "sin eficacia" en terminos de su funcion biologica tfpica como se logra a traves de un receptor de Fc.

El termino "anticuerpo" (Ab) como se usa en la presente descripcion, se refiere a una molecula de inmunoglobulina, o un derivado de esta, que tiene la capacidad de unirse especfficamente a un antfgeno. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de la molecula de inmunoglobulina contienen un dominio de union que interactua con un antfgeno como se describe anteriormente en "inmunoglobulina". Ademas, un anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecffico, diacuerpo o molecula similar (ver por ejemplo, Holliger, y otros, 1993, PNAS USA 90(14), 6444-8, para una descripcion de los diacuerpos). Ademas, se ha demostrado que la funcion de union a antfgeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa, es decir "fragmentos de union a antfgeno" o "protefnas de union a antfgeno". Al igual que con las moleculas de anticuerpo completo, las protefnas de union a antfgeno pueden ser monoespecfficas o multiespecfficas (por ejemplo, biespecfficas). Los ejemplos de moleculas o fragmentos de union comprendidos dentro del termino "anticuerpo" incluyen, pero no se limitan a (i) un Fab' o fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1, o un anticuerpo monovalente como se describio en la publicacion de patente internacional numero WO2007059782; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste esencialmente en los dominios Vh y Ch1; (iv) un fragmento Fv que consiste esencialmente en un dominio Vl y Vh, (v) un fragmento dAb (Ward y otros, 1989, Nature 341, 544-546), que consiste esencialmente en un dominio Vh y ademas los llamados anticuerpos de dominio (Holt y otros, 2003, Trends Biotechnol. 21(11):484-90); (vi) camelido o nanocuerpos (Revets y otros, 2005, Expert Opin Biol Ther. 5(1):111 -24) y (vii) una region determinante de complementariedad (CDR) aislada.

Los terminos "anticuerpo monoclonal" o "composicion de anticuerpo monoclonal" como se usan en la presente descripcion, se refieren a una preparacion de moleculas de anticuerpos de composicion molecular unica. Una composicion de anticuerpo monoclonal muestra una unica especificidad de union y afinidad para un epftopo particular.

El termino "anticuerpo humano", como se usa en la presente descripcion, pretende incluir los anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de la lfnea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoacidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la lfnea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas in vitro mediante mutagenesis aleatoria o especffica de un sitio, o durante los reordenamientos genicos o mediante mutacion somatica in vivo). El termino "anticuerpo monoclonal murino o de raton" se refiere a anticuerpos que muestran una unica especificidad de union que tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulinas de la lfnea germinal murina o de raton.

El termino "protefna de fusion", como se usa en la presente descripcion, incluye la protefna de fusion Fc y la protefna de fusion Fc-receptor. Una protefna de fusion puede ser cualquier polipeptido formado por la expresion de un gen quimerico obtenido mediante la combinacion de mas de una secuencia de ADN de diferentes orfgenes, tfpicamente mediante de la clonacion de un gen en un vector de expresion en el marco con un segundo gen de manera que los dos genes codifican un polipeptido continuo.

En un aspecto, la invencion proporciona un metodo descrito en la presente descripcion para producir una protefna o polipeptido recombinante de interes. En algunas modalidades, la protefna o polipeptido recombinante de interes se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, protefna de union a antfgeno, protefna de fusion, protefna de fusion Fc y protefna de fusion Fc-receptor.

Sistemas de expresion celular

El uso de sistemas de expresion celular es un requisito previo para la produccion elevada de tales polipeptidos o protefnas en el cultivo celular.

Un producto de acuerdo con la invencion es un polipeptido, o una protefna, que se expresa en las celulas y se cosecha a partir del sistema de cultivo, es decir, las celulas y/o el medio celular. Este puede ser cualquier polipeptido o protefna de interes (mas arriba).

Los vectores de expresion tfpicamente usan promotores genicos fuertes para conducir la transcripcion del ARNm del producto. En un aspecto adicional, la descripcion se refiere a un vector de expresion que codifica un polipeptido, por

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ejemplo, un anticuerpo, protefna de union a antfgeno o protefna de fusion, de interes. Tales vectores de expresion pueden usarse en los metodos de la invencion para la produccion recombinante de protefnas o polipeptidos de interes a traves del cultivo celular.

Un vector de expresion en el contexto de los metodos de la invencion puede ser cualquier vector adecuado, que incluye vectores cromosomicos, no cromosomicos, y de acidos nucleicos sinteticos (una secuencia de acido nucleico que comprende un conjunto adecuado de elementos de control de la expresion). Los ejemplos de tales vectores incluyen derivados de SV40, plasmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovirus, plasmidos de levaduras, vectores derivados de combinaciones de plasmidos y ADN de fagos, y vectores de acidos nucleicos virales (ARN o ADN). Tales vectores de acidos nucleicos y el uso de estos se conocen bien en la tecnica (ver, por ejemplo, los documentos US 5,589,466 y US 5,973,972).

Un vector que comprende una molecula de acido nucleico que codifica el polipeptido o protefna de interes se proporciona dentro de la celula huesped, en donde la molecula de acido nucleico se une operativamente a una secuencia de control de la expresion adecuada para la expresion en una celula huesped de mamffero.

Las secuencias control de la expresion se modifican geneticamente para controlar y conducir la transcripcion de los genes que codifican los polipeptidos de interes, y la expresion posterior de protefnas o polipeptidos en diversos sistemas celulares. Los plasmidos combinan un gen expresable de interes con secuencias de control de la expresion (es decir, casetes de expresion) que comprenden elementos deseables tales como, por ejemplo, promotores, potenciadores, marcadores de seleccion, operadores, etcetera. En un vector de expresion las moleculas de acido nucleico pueden comprender o asociarse con cualquier promotor, potenciador, marcador de seleccion, operador, protefna represora, secuencia de terminacion poliA y otros elementos que facilitan la expresion.

"Promotor", como se usa en la presente descripcion, indica una secuencia de ADN suficiente para dirigir la transcripcion de una secuencia de ADN a la que se une operativamente, es decir, se une de tal manera que controla la transcripcion de la secuencia de nucleotidos. La expresion de una secuencia de nucleotidos puede estar bajo el control de cualquier elemento promotor o potenciador conocido en la tecnica. Los ejemplos de tales elementos incluyen promotores fuertes de la expresion (por ejemplo, promotor/potenciador de CMV lE humano o promotor IE principal de CMV (CMV-MIE), asf como tambien el promotor tardfo de SV40, y los promotores de RSV, SL3-3, MMTV, ubiquitina (Ubi), ubiquitina C (UbC), y LTR de HIV).

En algunas modalidades, el vector comprende un promotor seleccionado del grupo que consiste en SV40, CMV, CMV-IE, CMV-MIE, RSV, SL3-3, MMTV, Ubi, UbC y LTR de HIV.

Las moleculas de acido nucleico que codifican la protefna o polipeptido de interes pueden unirse operativamente, ademas, a una secuencia de terminacion de poli (A) eficaz, un origen de replicacion para el producto plasmfdico en E. coli, un gen de resistencia a antibioticos como marcador de seleccion, y/o un sitio de clonacion conveniente (por ejemplo, un polienlazador). Los acidos nucleicos pueden comprender, ademas, un promotor inducible y regulable (que puede inducirse, reprimirse, regularse embriologicamente) en contraste con un promotor constitutivo tal como IE de CMV (el experto en la tecnica reconocera que dichos terminos son realmente descriptores de un grado de expresion genica en determinadas condiciones).

Los marcadores de seleccion son elementos bien conocidos en la tecnica. Bajo las condiciones selectivas, solo las celulas que expresan el marcador de seleccion apropiado pueden sobrevivir. Comunmente, los genes de los marcadores de seleccion expresan protefnas, usualmente enzimas que confieren resistencia a diversos antibioticos en el cultivo celular. En otras condiciones selectivas, las celulas que expresan un marcador de una protefna fluorescente se hacen visibles, y por lo tanto pueden seleccionarse. Las modalidades incluyen beta-lactamasa (bla) (resistencia a antibioticos betalactamicos o gen de resistencia a la ampicillina o ampR), bls (gen de acetil transferasa resistente a blasticidina), bsd (gen de resistencia a blastidinas-desaminasa), bsr (gen de resistencia a blasticidina-S), Sh ble (gen de resistencia Zeocin®), higromicina fosfotransferasa (hpt) (gen de resistencia a higromicina), tetM (gen de resistencia a tetraciclina o tetR), neomicina fosfotransferasa II (npt) (gen de resistencia a neomicina o neoR), kanR (gen de resistencia a kanamicina), y pac (gen de resistencia a puromicina). Los marcadores seleccionables (o de seleccion) se usan tfpicamente en el desarrollo de lfneas celulares estables.

En determinadas modalidades, el vector comprende uno o mas genes de los marcadores de seleccion seleccionados del grupo que consiste en bla, bls, BSD, bsr, Sh ble, hpt, tetR, tetM, npt, kanR y pac. En algunas modalidades, el vector comprende uno o mas genes de los marcadores de seleccion que codifican la protefna verde fluorescente (GFP), protefna verde fluorescente potenciada (eGFP), protefna ciano fluorescente (CFP), protefna ciano fluorescente potenciada (eCFP), protefna amarilla fluorescente (yFp), o similares.

Para los propositos de esta invencion, la expresion genica en celulas eucariotas puede regularse rigurosamente mediante el uso de un promotor fuerte que se controla mediante un operador que a su vez se regula mediante una protefna de fusion reguladora (RFP). La RFP consiste esencialmente en un dominio bloqueador de la transcripcion, y un dominio de union al ligando que regula su actividad. Los ejemplos de tales sistemas de expresion se describen en el documento US20090162901A1.

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Como se usa en la presente descripcion, "operador" indica una secuencia de ADN que se introduce en un gen de interes o cerca de este, de manera tal que el gen puede regularse por la union de la RFP al operador y, como un resultado, impide o permite la transcripcion del gen de interes. Varios de los operadores en celulas procariotas y bacteriofagos han sido bien caracterizados (Neidhardt, ed. Escherichia coli and Salmonella; Cellular and Molecular Biology 2d. Vol 2 ASM Press, Washington D.C. 1996). Estos incluyen pero no se limitan a, la region del operador del gen LexA de E. coli, que se une al peptido LexA, y los operadores lactosa y triptofano, que se unen a protefnas represoras codificadas por los genes LacI y trpR de E. coli. Estos incluyen, ademas, los operadores de bacteriofagos del fago lambda Pr y los genes del fago P22 ant/mnt que se unen a las protefnas represoras codificadas por lambda cl y P22 arc. En algunas modalidades, cuando el dominio bloqueador de la transcripcion de la RFP es una enzima de restriccion, tal como Notl, el operador es la secuencia de reconocimiento de esa enzima. Un experto en la tecnica reconocera que el operador debe ubicarse adyacente, o en posicion 3' al promotor de manera que sea capaz de controlar la transcripcion mediante el promotor. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos num. 5,972,650, especifica que las secuencias tetO se encontraran a una distancia especffica de la caja TATA.

En determinadas modalidades, el operador se selecciona del grupo que consiste en operador tet (tetO), secuencia de reconocimiento de Notl, operador de LexA, operador de lactosa, operador de triptofano y operador de Arc (AO). En algunas modalidades, la protefna represora se selecciona del grupo que consiste en TetR, LexA, Lacl, TrpR, Arc, LambdaCI y GAL4. En otras modalidades, el dominio bloqueador de la transcripcion se deriva de una protefna represora eucariota, por ejemplo un dominio represor derivado de GAL4.

En un sistema de expresion celular ilustrativo, las celulas se modifican geneticamente para expresar la protefna represora de la tetraciclina (TetR) y un polipeptido de interes se ubica bajo el control transcripcional de un promotor cuya actividad se regula por TetR. Dos operadores de TetR en tandem (tetO) se ubican inmediatamente corriente abajo de un promotor/potenciador de CMV-MIE en el vector. La transcripcion del gen que codifica la protefna de interes dirigida por el promotor de CMV-MIE en tal vector puede bloquearse por TetR en ausencia de tetraciclina o algun otro inductor adecuado (por ejemplo doxiciclina). En presencia de un inductor, la protefna TetR no es capaz de unirse a tetO, por lo tanto se produce la transcripcion y despues la traduccion (expresion) del polipeptido de interes. (Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos num. 7,435,553.

Tales sistemas de expresion celular pueden usarse para "activar" la produccion del polipeptido de interes solamente durante el cultivo de produccion. Por lo tanto, los antibioticos, tales como la tetraciclina u otros inductores adecuados, pueden anadirse al biorreactor para un primer cultivo celular.

Otro sistema de expresion celular ilustrativo incluye protefnas de fusion reguladoras tales como la protefna de fusion TetR-ERLBDT2, en la que el dominio bloqueador de la transcripcion de la protefna de fusion es TetR y el dominio de union al ligando es el dominio de union al ligando del receptor de estrogenos (ERlbd) con mutaciones T2 (ERlbdT2; Feil y otros, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:752-757). Cuando las secuencias tetO se ubicaron corriente abajo y proximas al promotor fuerte de CMV-MIE, la transcripcion de la secuencia de nucleotidos de interes a partir del promotor de CMV-MIE/tetO se bloqueo en presencia de tamoxifeno y se desbloqueo mediante la eliminacion de tamoxifeno. En otro ejemplo, el uso de la protefna de fusion Atc2-ERlbdT2, una protefna de fusion que consiste en un dfmero de cadena sencilla que consiste en dos protefnas Arc conectadas mediante un enlazador de 15 aminoacidos y ERlbdT2 (mas arriba), implica un operador de Arc (AO), mas especfficamente dos operadores de arc en tandem inmediatamente corriente abajo del promotor/potenciador de CMV-MIE. Las lfneas celulares pueden regularse mediante Atc2-ERlbdT2, en donde las celulas que expresan la protefna de interes se controlan por un promotor de CMV-MIE/ArcO2 y pueden inducirse mediante la eliminacion del tamoxifeno. (Ver, por ejemplo, el documento US 20090162901A1.) En algunas modalidades, el vector comprende un promotor hfbrido CMV-MIE/TetO o CMV-MIE/AO2.

Los vectores adecuados usados en los metodos de la invencion pueden emplear, ademas, las herramientas Cre-lox para la tecnologfa de recombinacion con el proposito de facilitar la replicacion de un gen de interes. Una estrategia Cre-lox requiere al menos dos componentes: 1) la recombinasa Cre, una enzima que cataliza la recombinacion entre dos sitios loxP; y 2) los sitios loxP (por ejemplo, una secuencia especffica de 34 pares de bases (pb) que consiste en una secuencia nucleo de 8 pb, donde tiene lugar la recombinacion, y dos repeticiones invertidas flanqueantes de 13 pb) o sitios lox mutantes. (Ver, por ejemplo Araki y otros, 1995, pNaS 92:160-4; Nagy, A. y otros, 2000, Genesis 26:99-109; Araki y otros, 2002, Nuc Acids Res 30(19):e103; y el documento US20100291626A1. En otra estrategia de recombinacion, la recombinasa FLP derivada de levadura puede usarse con la secuencia consenso FRT (ver ademas, por ejemplo Dymecki, S., 1996, PNAS 93(12): 6191-6196).

En otro aspecto, un gen (es decir, una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido recombinante de interes) se inserta en una secuencia potenciadora de la expresion del casete de expresion, y opcionalmente se une operativamente a un promotor, en donde el gen unido al promotor es flanqueado en 5' por un primer sitio de reconocimiento de recombinasas y en 3' por un segundo sitio de reconocimiento de recombinasas. Tales sitios de reconocimiento de recombinasas permiten la recombinacion mediada por Cre en la celula huesped del sistema de expresion. En algunos casos, un segundo gen unido a un promotor se encuentra corriente abajo (3') del primer gen y es flanqueado en 3' por el segundo sitio de reconocimiento de recombinasas. Aun en otros casos, un segundo gen

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unido a un promotor es flanqueado en 5' por el segundo sitio de recombinasas, y es flanqueado en 3' por un tercer sitio de reconocimiento de recombinasas. En algunas modalidades, los sitios de reconocimiento de recombinasas se seleccionan de un sitio loxP, un sitio lox511, un sitio lox2272, y un sitio FRT. En otras modalidades, los sitios de reconocimiento de recombinasas son diferentes. En una modalidad adicional, la celula huesped comprende un gen capaz de expresar una recombinasa Cre.

En otro aspecto, el vector comprende un primer gen que codifica una cadena ligera de un anticuerpo o una cadena pesada de un anticuerpo de interes, y un segundo gen que codifica una cadena ligera de un anticuerpo o una cadena pesada de un anticuerpo de interes.

Se entiende que uno o mas vectores que portan una o mas secuencias de acido nucleico que codifican y expresan la protefna de interes pueden usarse en tales sistemas de expresion.

Ademas, las celulas de la descripcion pueden modificarse geneticamente para aumentar la expresion del producto a traves de la coexpresion de protefnas tales como chaperonas, inhibidores de apoptosis, inhibidores de la degradacion de protefnas, u otras protefnas que pueden potenciar la expresion o la estabilidad del producto.

En algunos aspectos, el vector comprende, ademas, un gen de una protefna 1 de union a caja X (mXBP1) y/o un gen EDEM2 capaces de potenciar la produccion de protefnas/secrecion de protefnas a traves del control de la expresion de los genes implicados en el plegamiento de protefnas en el retfculo endoplasmico (ER). Ver, por ejemploRon D, y Walter P., 2007, Nat Rev Mol Cell Biol.8:519-529; Olivari y otros, 2005, J. Biol. Chem. 280(4): 24242428, Vembar y Brodsky, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 9(12): 944-957, 2008).

El uso de celulas transfectadas transitoriamente que rapidamente producen cantidades significativas del producto puede realizarse, ademas, para la optimizacion de un proceso de cultivo celular, sin embargo, la transfeccion estable se utiliza tfpicamente para escalas de produccion de gran volumen.

En el contexto de la presente descripcion, la celula con cambios metabolicos puede contener cualquiera o todos los elementos de un sistema de expresion celular necesarios para la produccion recombinante eficiente de una protefna de interes, como se describe en la presente descripcion.

En un aspecto aun mas amplio, la descripcion se refiere a una celula huesped eucariota recombinante con cambios metabolicos que produce una protefna de interes. Los ejemplos de celulas huesped incluyen celulas de mamfferos, tales como CHO, PER.C6, celulas linfoides murinas, y lfneas celulares de hibridomas murinos (mas arriba). Por ejemplo, en un aspecto, la presente descripcion proporciona una celula con cambios metabolicos que comprende una secuencia de acido nucleico integrada de manera estable en el genoma celular, que comprende una secuencia que codifica una protefna de interes. En otro aspecto, la presente descripcion proporciona una celula con cambios metabolicos que comprende una secuencia de acido nucleico no integrada (es decir, episomal), tal como un plasmido, cosmido, fagemido o elemento de expresion lineal, que comprende una secuencia que codifica una protefna de interes.

La "cosecha" o "cosecha celular" tiene lugar al final de un lote de produccion en un proceso anterior. Las celulas se separan del medio mediante una serie de metodos tales como filtracion, encapsulacion celular, adherencia celular a microportadores, sedimentacion celular o centrifugacion. La purificacion de protefnas tiene lugar en etapas adicionales para aislar el producto proteico. Los polipeptidos o protefnas pueden cosecharse a partir de las celulas o de los medios de cultivo celular.

Las estrategias de purificacion de protefnas se conocen bien en la tecnica. Las formas solubles del polipeptido, tales como anticuerpos, fragmentos de union a anticuerpos y protefnas que contienen Fc, pueden someterse a filtros de concentracion disponibles comercialmente, y posteriormente purificarse por afinidad mediante metodos bien conocidos, tales como resinas de afinidad, resinas de intercambio ionico, columnas de cromatograffa, y similares. Las formas del polipeptido unidas a membrana pueden purificarse mediante la preparacion de una fraccion de membrana total a partir de la celula de expresion y mediante la extraccion de las membranas con un detergente no ionico tal como TRITON® X-100 (EMD Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.). Las protefnas citosolicas o nucleares pueden prepararse mediante la lisis de las celulas huesped (a traves de fuerza mecanica, sonicacion, detergente, etcetera), la eliminacion de la fraccion de membranas celulares mediante centrifugacion y la retencion del sobrenadante.

En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un metodo para producir un anticuerpo, o protefna de union a antfgeno, o protefna de fusion de interes, dicho metodo comprende las etapas de a) cultivar celulas de acuerdo con el metodo, como se describe en la presente descripcion anteriormente, b) cosechar las celulas, y c) purificar el polipeptido o protefna, tal como anticuerpo, o protefna de union a antfgeno, o protefna de fusion, a partir de las celulas o medios de cultivo celular.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la tecnica como se realizan y se usan los metodos y composiciones de la invencion, y no se destinan a limitar el alcance de lo que los inventores consideran

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como su invencion. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precision con respecto a los numeros utilizados (por ejemplo las cantidades, concentraciones, temperatura, etcetera) pero deben considerarse algunos errores y desviaciones experimentales.

EJEMPLOS

Ejemplo 1- Determinacion de los parametros del cambio metabolico: Lfnea celular productora de protefnas de fusion

Las celulas CHO se transfectaron con ADN que expresa una protefna de fusion. La lfnea celular CHO productora de protefnas de fusion se incubo en un cultivo en recipiente de siembra, en medios patentados que contenfan soja, y se midieron y registraron parametros tales como pH en lfnea, lactato y recuento de celulas viables fuera de lfnea, para determinar el estado metabolico (ver #1, #2, o #3 de la Figura 1A). Ademas, el uso de una base se superviso y se normalizo a 1 para esta lfnea celular (ver, ademas, la Figura 1A).

Las celulas en la condicion #1 y en la condicion #2 se usaron para inocular biorreactores de produccion duplicados cuando el pH se controlo en el extremo inferior del intervalo de control y el lactato y la VCC aumentaron. Las celulas en la condicion #3 se inocularon cuando el pH comenzo a aumentar desde el lfmite inferior del intervalo de control es decir, se detuvo el uso de la base, lo que indica una remetabolizacion del lactato (es decir consumo). El crecimiento celular en la condicion #3 entro en la fase de crecimiento posterior a la fase exponencial. Todos los biorreactores de produccion se ejecutaron con las mismas condiciones de operacion.

Los tftulos de produccion (ver Figura 1B) y los perfiles de lactato (ver Figura 1C) se midieron en cada biorreactor de produccion mediante el uso de los metodos conocidos para determinar el impacto del estado metabolico del tren de siembra #1, #2 o #3. Las lfneas de tendencia del biorreactor de produccion representan el promedio de los biorreactores duplicados con barras de error que representan ± una desviacion estandar.

Las celulas de la condicion #3 tuvieron el efecto mas significativo sobre la productividad y la acumulacion de lactato en el segundo cultivo celular, que resulto en un aumento en el tftulo del producto mayor que 2 veces (en comparacion con las Condiciones #1 y #2), en el biorreactor de produccion (ver Figura 1B). Las celulas de la condicion #3 resultaron, ademas, en una disminucion en la concentracion de lactato despues de la transferencia al segundo cultivo celular (en comparacion con las Condiciones #1 y #2- ver Figura 1C). Las celulas de la Condicion #3 tienen un perfil de lactato indicativo del consumo neto de lactato (ver Figura 1C a los 8-12 dfas del cultivo celular). Las celulas que se transfirieron del primer cultivo en la Condicion #1 (es decir, antes de un cambio metabolico en el primer cultivo) no logran un consumo neto de lactato en el biorreactor de produccion.

Ejemplo 2- Determinacion de los parametros del cambio metabolico: Lfnea celular productora de anticuerpos

Se uso un recipiente de siembra de una lfnea de celulas CHO productora de anticuerpos para inocular biorreactores de produccion replicados similares al Ejemplo 1, sin embargo en un medio qufmicamente definido. Se midieron cuatro estados metabolicos diferentes (mediante la supervision del pH, el lactato y los recuentos de celulas viables fuera de lfnea- ver #1, #2, #3, y #4 de la Figura 2A). El VCC continuo en aumento durante la duracion de la incubacion del recipiente de siembra cuando se inocularon los biorreactores de produccion.

La Condicion #1 se inoculo muy temprano en el tren de siembra cuando el pH estaba aun en el extremo superior del intervalo de control y cuando el lactato estaba bajo pero en aumento. La Condicion #2 se inoculo cuando el pH comenzaba a disminuir y el lactato estaba en aumento y se aproximaba a niveles maximos. La Condicion #3 se inoculo cuando el pH estaba cerca del lfmite inferior del intervalo de control y el nivel de lactato estaba estacionario. La Condicion #4 se inoculo cuando el pH comenzaba a aumentar desde el lfmite inferior del intervalo de control y durante la remetabolizacion del lactato (es decir, consumo de lactato). Todos los biorreactores de produccion se ejecutaron con las mismas condiciones de operacion. La Condicion #1 se perdio despues de una semana.

Se determino el impacto del estado metabolico del tren de siembra en los tftulos del biorreactor de produccion (Figura 2B) y el perfil de lactato (Figura 2C). Las lfneas de tendencia del biorreactor de produccion representan el promedio de los biorreactores duplicados con barras de error que representan ± una desviacion estandar.

Las celulas de la Condicion #3 y #4 tuvieron el efecto mas significativo sobre la productividad en el segundo cultivo celular. Las celulas de la Condicion #3 y #4 resultaron, ademas, en una disminucion de la concentracion de lactato en el biorreactor de produccion (en comparacion con las Condiciones #1 y #2), que es indicativo de un fenotipo metabolico para el consumo de lactato (ver Figuras 2B y 2C). De manera similar al Ejemplo 2, las celulas que se transfieren del primer cultivo en la Condicion #1 no logran el consumo neto de lactato durante la fase de produccion. Las Condiciones #2, #3 y #4 logran el consumo neto de lactato durante la fase de produccion, sin embargo la Condicion #4 es la mas optima ya que el consumo neto de lactato se produce mas temprano que en las otras condiciones y el nivel maximo de lactato es el mfnimo.

Claims (17)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para cultivar celulas que comprende:

   (a) cultivar las celulas en un primer cultivo celular,

   (b) determinar que se produjo un cambio metabolico hacia el consumo de lactato en el primer cultivo celular, y

   (c) transferir las celulas a un segundo cultivo celular despues que en las celulas se produjo el cambio metabolico hacia el consumo de lactato,

   en donde la concentracion de lactato en el segundo cultivo celular indica el consumo neto de lactato.
2. 2. El metodo de conformidad con la reivindicacion 1, en donde las celulas se transfectan con ADN que codifica un polipeptido de interes antes de cultivar las celulas en un primer cultivo celular, y el metodo comprende mantener el segundo cultivo celular en condiciones que permitan la expresion del polipeptido de interes, y cosechar el polipeptido de interes a partir del segundo cultivo celular.
3. 3. El metodo de conformidad con la reivindicacion 1 o 2, en donde el cambio metabolico hacia el consumo de lactato se detecta mediante las mediciones del pH, lactato o base en el primer cultivo celular.
4. 4. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el cambio metabolico hacia el consumo de lactato se detecta despues que el pH aumenta en el medio del primer cultivo celular sin la adicion de base.
5. 5. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el cambio metabolico se produce cuando las celulas emergen de la fase logarftmica o alcanzan la fase estacionaria en el primer cultivo celular.
6. 6. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el cambio metabolico se produce cuando los niveles de lactato se estabilizan en el primer cultivo celular.
7. 7. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el cambio metabolico se produce en el primer cultivo celular en, o despues de 3 dfas de crecimiento de las celulas en el primer cultivo celular.
8. 8. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde las celulas transferidas tienen una densidad celular de inoculacion entre aproximadamente 0,5 x106 celulas/mL a aproximadamente 3,0 x106 celulas/mL en el segundo cultivo celular.
9. 9. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la etapa de determinacion del cambio metabolico comprende:

   (a) medir el pH en el primer cultivo celular,

   (b) adicionar una base para mantener el pH por encima de un lfmite inferior predeterminado,

   (c) determinar que el pH esta por encima del lfmite inferior predeterminado durante intervalos consecutivos, y

   (d) dejar de adicionar una base para determinar, de esta manera, que en el primer cultivo celular se produjo el cambio metabolico hacia el consumo de lactato.
10. 10. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el primer cultivo celular es un cultivo de tren de siembra.
11. 11. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el segundo cultivo celular es un cultivo de produccion.
12. 12. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la transferencia de las celulas a un segundo cultivo celular comprende transferir las celulas a un biorreactor de produccion.
13. 13. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-12, en donde el polipeptido de interes se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, una protefna de union a anticuerpo, y una protefna de fusion.
14. 14. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12 en donde una o mas secuencias de acido nucleico se integran de manera estable en el genoma celular de las celulas, y en donde las secuencias de acido nucleico codifican un polipeptido de interes.
15. 15. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-12, en donde las celulas comprenden uno o mas vectores que codifican un polipeptido de interes.

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16. 16. El metodo de conformidad con la reivindicacion 14 o la reivindicacion 15, en donde el polipeptido de interes se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, una protefna de union a anticuerpo, y una protefna de fusion.
17. 17. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde las celulas se seleccionan del grupo que consiste en CHO, COS, celulas de retina, Vero, CV1, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431, CV-1, U937, 3T3, celulas L, celulas C127, SP2/0, NS-0, MMT, PER.C6, celulas linfoides murinas, y celulas de hibridoma murino.