EA045030B1 - Метаболически оптимизированная клеточная культура - Google Patents
Метаболически оптимизированная клеточная культура Download PDFInfo
- Publication number
- EA045030B1 EA045030B1 EA202291408 EA045030B1 EA 045030 B1 EA045030 B1 EA 045030B1 EA 202291408 EA202291408 EA 202291408 EA 045030 B1 EA045030 B1 EA 045030B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- cell culture
- lactate
- cell
- culture
- Prior art date
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims description 198
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 287
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 133
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 69
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 57
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 56
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 56
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 55
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 34
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 25
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 25
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 22
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 20
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 17
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 10
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 235000020938 metabolic status Nutrition 0.000 claims description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 claims description 3
- AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-n-ethylnitrous amide Chemical compound CCN(N=O)C(C)(C)C AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 98
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 61
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 61
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 13
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 8
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 8
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 6
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 101150024821 tetO gene Proteins 0.000 description 6
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 238000002705 metabolomic analysis Methods 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001431 metabolomic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 2
- 108091005941 EBFP Proteins 0.000 description 2
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 101150015970 tetM gene Proteins 0.000 description 2
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 1
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 229940088872 Apoptosis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101100394813 Bacillus subtilis (strain 168) hprT gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100064677 Homo sapiens EDEM2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 1
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 1
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101100030550 Nocardia iowensis npt gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000701835 Salmonella virus P22 Species 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010035430 X-Box Binding Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100038151 X-box-binding protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006536 aerobic glycolysis Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 101150073130 ampR gene Proteins 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 239000000158 apoptosis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 101150047832 hpt gene Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037447 lactate metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 229910000069 nitrogen hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021049 nutrient content Nutrition 0.000 description 1
- 235000018343 nutrient deficiency Nutrition 0.000 description 1
- 230000004783 oxidative metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012883 sequential measurement Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- -1 such as an antibody Proteins 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 101150006320 trpR gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Description
Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с 35 USC § 119(e) в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США № 61/889815, поданной 11 октября 2013 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к клеткам, которые характеризуются метаболическим сдвигом на потребление лактата в клеточной культуре. Переход на метаболический профиль потребления лактата в культуре в системе посевных ферментеров характеризуется благоприятными эффектами на производственную культуру. При инокуляции производственного реактора клетки проявляют более эффективный метаболизм лактата с низкой скоростью производства лактата, низкими максимальными содержаниями лактата, ранним переходом на потребление лактата и, следовательно, повышенной продуктивностью в периодической культуре клеток млекопитающего с подпиткой. Таким образом, предусмотрен улучшенный способ крупномасштабного производства белков и/или полипептидов в клеточной культуре.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Биологические средства, в частности белки и полипептиды, все чаще разрабатываются в качестве новых фармацевтических продуктов. Сконструированные клетки, которые производят нетипично высокие содержания конкретного представляющего интерес белка, становятся критически важными для успешного коммерческого производства указанных фармацевтических средств. Контроль и оптимизация условий культивирования клеток подвергаются изменениям и оказывают значительное влияние на содержание и качество произведенного в культуре терапевтического белка.
Общепринятым является производство белков посредством клеточной культуры в способе периодических культур или периодических культур с подпиткой. Ранние стадии роста инокулята после оттаивания флакона включают в себя культивирование клеток в затравочной культуре. Как правило, клетки выращивают при экспотенциальной скорости роста, такой как в биореакторах с системой посевных ферментеров, для обеспечения непрерывного увеличения размера и/или объема клеточной популяции. После пропорционального увеличения клеточной массы в результате прохождения через несколько стадий в биореакторе клетки переносят в производственный биореактор, пока клетки все еще находятся в фазе экспотенциального роста (фаза логарифмического роста) (Gambhir, A. et al., 2003, J Bioscience Bioeng 95(4):317-327). Как правило, считается нежелательным позволять клеткам в периодической культуре, например, затравочной культуре, переходить в стационарную фазу, минуя фазу логарифмического роста. Согласно рекомендациям культуры необходимо пересевать, пока они находятся в фазе логарифмического роста, до того, как клетки, например прилипающие клетки, достигают конфлюэнтности вследствие контактного торможения, или накопление отходов ингибирует рост клеток, среди прочих причин (Cell Culture Basics, Gibco/Invitrogen Online Handbook, www.invitrogen.com; ATCC® Animal Cell Culture Guide, www.atcc.org).
После переноса в периодическую культуру с подпиткой клетки культивируют в течение определенного периода времени, при этом осуществляют мониторинг и контроль за составом среды для обеспечения возможности производства представляющего интерес белка или полипептида. После достижения определенного выхода продукта или уровня жизнеспособности клеток накопление отходов или истощение питательных веществ является определяющим для решения о прекращении культивирования, и осуществляют выделение произведенного белка или полипептида. За последнее десятилетие были осуществлены многочисленные значительные достижения, направленные на улучшение выхода рекомбинантного белка, который в настоящее время достигает титров порядка граммов на литр. Достижения в способах производства белка, а также в конструировании клеточных линий и разработке сред для клеточных культур и систем подпитки вносят свой вклад в увеличении выхода белка.
Производство с использованием периодической культуры с подпиткой предусматривает добавление небольших объемов подпитки для восполнения питательных веществ, находящихся в биореакторе, по мере роста клеток и производства продукта. Следует понимать, что клетки млекопитающего, как правило, характеризуются тенденцией осуществлять непрерывный метаболизм углеводов, что приводит к накоплению лактата, таким образом, требуя добавления основания для нейтрализации молочной кислоты. Добавление основания повышает осмолярность в клеточной среде, что в свою очередь сильно ограничивает общую достижимую жизнеспособность и/или продуктивность клеток в биореакторе. Накопление лактата в среде негативно влияет на рост клеток и является одним из распространенных факторов, ограничивающих максимальную продуктивность, которая может быть достигнута в периодической культуре. В типичной периодической клеточной культуре рост и продуктивность ингибируются после того, как концентрация лактата в культуре достигает приблизительно 30-50 мМ, и/или концентрация аммиака достигает 3-5 мМ (Ozturk, S.S., Riley, M.R., and Palsson, В.О. 1992. Biotechnol. and Bioeng. 39: 418-431). В настоящее время широко применяемые схемы предусматривают восполнение питательных веществ и разработку бессывороточных сред с установленным химическим составом для поддержки непрерывного клеточного роста и оптимальной секреции продукта.
Попытки, относящиеся, в частности, к снижению выхода отходов метаболизма, таких как накопление лактата, в клеточной культуре, улучшили общее количество конечных титров белка. Указанные попытки сфокусированы на способах с применением периодической культуры с подпиткой с контролируе- 1 045030 мым содержанием глюкозы или ограниченным содержанием питательных веществ (см., например, WO2004104186; US8192951B2), улучшенных условиях среды для культивирования клеток (например, US7390660; Zagari, et al., 2013, New Biotechnol., 30(2):238-45) или клеточной инженерии, включая в себя направление ферментов в гликолитический путь (например, Kim, S.H. and Lee, G.M., 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 152-159; Kim, S.H. and Lee, G.M., 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol. 76, 659-665; Wlaschin, K.F. and Hu, W-S., 2007, J. Biotechnol. 131,168-176).
Контролируемая подпитка клеток используется в попытке достичь более эффективного метаболического фенотипа (Europa, A. F., et al., 2000, Biotechnol. Bioeng. 67:25-34; Cruz et al., 1999, Biotechnol Bioeng, 66(2): 104-113; Zhou et al., 1997, Cytotechnology 24, 99-108; Xie and Wang, 1994, Biotechnol Bioeng, 43:1174-89). Тем не менее, это осложняется тем фактом, что недостаточность питательных веществ, а также быстрые изменения, например, концентрации аммиака, наблюдаемые в периодической культуре с подпиткой с высокой плотностью клеток, могут индуцировать апоптоз (программируемую клеточную смерть) (Newland et al., 1994, Biotechnol. Bioeng. 43(5):434-8). Следовательно, общепринятый подход к оптимизации состоит в том, чтобы выращивать клетки до умеренно высокой плотности в периодической культуре с подпиткой и затем преднамеренно индуцировать пролонгированную, продуктивную стационарную фазу, например, путем изменения температуры или рН (Quek et al., 2010, Metab Eng 12(2): 16171. doi: 10.1016/j.ymben.2009.09.002. Epub 2009 Oct 13).
Обсуждаемые выше техники оптимизации были сфокусированы на периодической культуре с подпиткой клеточная, и этот зависимый от питательных веществ способ необходимо адаптировать для каждой клетки-хозяина, сконструированной для производства представляющего интерес полипептида. Способы адаптации клеток к потребителям лактата в культуре крайне необходимы в процессе производства биологических терапевтических средств. Оптимизация клеточной линии с метаболическим фенотипом, характеризующимся потреблением лактата, оказалась бы полезной для коммерческого производства полипептидов.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Согласно настоящему изобретению предусмотрены клетки и способы культивирования клеток, в которых произошел метаболический сдвиг на потребление лактата. Метаболически адаптированные клетки являются оптимальными для крупномасштабного производства белка.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предусмотрен способ культивирования клеток, предусматривающий перенос клеток из первой клеточной культуры во вторую клеточную культуру после того, как в первой культуре произошел метаболический сдвиг на потребление лактата в клетках.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрен способ культивирования клеток, предусматривающий культивирование клеток в первой клеточной культуре, определение того, что метаболический сдвиг на потребление лактата в клетках произошел в первой клеточной культуре, и перенос клеток во вторую клеточную культуру после того, как произошел метаболический сдвиг на потребление лактата в клетках, причем концентрация лактата во второй клеточной культуре показывает чистое потребление лактата во время культивирования второй культуры. Согласно одному варианту осуществления способ дополнительно предусматривает уменьшение накопления лактата во второй клеточной культуре по сравнению с указанным параметром, определенным в идентичной в других отношениях клеточной культуре при идентичных в других отношениях условиях за исключением того, что перенос клеток во вторую клеточную культуру происходит до того, как в первой клеточной культуре произошел метаболический сдвиг.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения предусмотрен способ получения белка, предусматривающий перенос клеток из первой клеточной культуры во вторую клеточную культуру после того, как произошел метаболический сдвиг на потребление лактата в клетках, и поддержание второй клеточной культуры в течение некоторого периода времени так, чтобы белок накапливался в клеточной культуре. Согласно родственному аспекту согласно настоящему изобретению предусмотрен способ производства белка, предусматривающий культивирование клеток в первой клеточной культуре, определение того, что метаболический сдвиг на потребление лактата в клетках произошел в первой клеточной культуре, перенос клеток во вторую клеточную культуру после того, как произошел метаболический сдвиг на потребление лактата в клетках, и поддержание второй клеточной культуры в течение некоторого периода времени так, чтобы белок накапливался в клеточной культуре. Согласно одному варианту осуществления способ дополнительно предусматривает увеличение продуктивности во второй клеточной культуре по сравнению с указанным параметром, определенным в идентичной в других отношениях клеточной культуре при идентичных в других отношениях условиях за исключением того, что перенос клеток во вторую клеточную культуру происходит до того, как в первой клеточной культуре произошел метаболический сдвиг.
Согласно третьему аспекту настоящего изобретения предусмотрен улучшенный способ культивирования клеток, при котором клетки содержат ген, кодирующий представляющий интерес полипептид, предусматривающий следующие стадии: культивирование клеток в первой клеточной культуре, поддержание первой клеточной культуры при условиях, которые обеспечивают наращивание клеточной массы, перенос клеток во вторую клеточную культуру после того, как произошел метаболический сдвиг на по- 2 045030 требление лактата в клетках, поддержание второй клеточной культуры при условиях, которые обеспечивают экспрессию представляющего интерес полипептида, и сбор представляющего интерес полипептида из второй клеточной культуры. Согласно одному варианту осуществления способ дополнительно предусматривает определение того, что в первой клеточной культуре произошел метаболический сдвиг на потребление лактата в клетках.
Согласно четвертому аспекту настоящего изобретения предусмотрен улучшенный способ получения полипептида в клеточной культуре, предусматривающий следующие стадии: трансфекция клеток ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, культивирование клеток в первой клеточной культуре, перенос клеток во вторую клеточную культуру после того, как произошел метаболический сдвиг на потребление лактата в клетках, причем представляющий интерес полипептид экспрессируется при условиях второй клеточной культуры, и поддержание второй клеточной культуры в течение некоторого периода времени так, чтобы полипептид накапливался в клеточной культуре. Согласно одному варианту осуществления способ дополнительно предусматривает определение того, что в первой клеточной культуре произошел метаболический сдвиг на потребление лактата в клетках.
Согласно пятому аспекту настоящего изобретения предусмотрен способ получения характеризующейся метаболическим сдвигом клеточной линии, предусматривающий следующие стадии: поддержание клеточной популяции в первой клеточной культуре при условиях, которые обеспечивают наращивание клеточной массы, определение того, когда произошел метаболический сдвиг на потребление лактата в клетках, перенос фракции клеточной популяции из первой клеточной культуры во вторую клеточную культуру после того, как произошел метаболический сдвиг на потребление лактата в клетках, поддержание клеточной популяции во второй клеточной культуре в течение некоторого периода времени, и необязательно сбор клеток, тем самым получая характеризующуюся метаболическим сдвигом клеточную линию.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрена характеризующаяся метаболическим сдвигом клеточная линия, полученная любым из раскрытых в настоящем документе способов согласно настоящему изобретению.
Согласно некоторым вариантам осуществления характеризующаяся метаболическим сдвигом клетка содержит последовательность нуклеиновой кислоты, стабильно интегрированную в клеточный геном, причем последовательность нуклеиновой кислоты кодирует представляющий интерес полипептид или белок. Согласно другим вариантам осуществления характеризующаяся метаболическим сдвигом клетка содержит экспрессионный вектор, кодирующий представляющий интерес полипептид или белок.
Согласно одному варианту осуществления метаболический сдвиг на потребление лактата обнаруживают с помощью измерений рН, содержания лактата или основания в первой клеточной культуре. Согласно другим вариантам осуществления клетки переносят во вторую клеточную культуру, когда обнаруживают потребление лактата. Согласно другим вариантам осуществления метаболический сдвиг на потребление лактата обнаруживают после повышения рН в первой среде для культивирования клеток без добавления основания. Согласно другим вариантам осуществления метаболический сдвиг на потребление лактата обнаруживают, когда уровни содержания лактата в первой клеточной культуре выходят на плато. Согласно другим вариантам осуществления способ дополнительно предусматривает определение метаболического сдвига, предусматривающее следующее: измерение рН в первой клеточной культуре, добавление основания для поддержания значения рН выше заданного нижнего предела, определение того, что значение рН выше заданного нижнего предела в течение последовательных временных интервалов, и прекращение добавления основания, тем самым определяя, что в первой клеточной культуре произошел метаболический сдвиг на потребление лактата.
Согласно другим вариантам осуществления метаболический сдвиг на потребление лактата обнаруживают с помощью индикаторов или продуктов клеточного метаболизма, включая в себя без ограничения потребление кислорода и такие метаболиты, как глицин, триптофан, фенилаланин, аденин, пальмитиновая кислота, глутаминовая кислота, метионин и аспарагин. Согласно другому варианту осуществления метаболический сдвиг на потребление лактата обнаруживают с помощью метаболомического анализа или протеомного анализа.
Согласно одному варианту осуществления метаболический сдвиг происходит, когда клетки выходят из фазы логарифмического (т.е. экспотенциального) роста в первой клеточной культуре. Согласно другому варианту осуществления клетки переносят после того, как клетки выходят из фазы логарифмического роста в первой клеточной культуре.
Согласно другому варианту осуществления метаболический сдвиг происходит, когда клетки достигли фазы стационарного роста в первой клеточной культуре. Согласно другому варианту осуществления клетки переносят после того, как клетки достигли фазы стационарного роста в первой клеточной культуре.
Согласно одному варианту осуществления метаболический сдвиг происходит в первой клеточной культуре на 3 день или через 3 дня роста клеток в первой клеточной культуре. Согласно другому варианту осуществления метаболический сдвиг происходит в первой клеточной культуре на 3,5 день или через 3,5 дня роста клеток в первой клеточной культуре.
- 3 045030
Согласно некоторым вариантам осуществления первая клеточная культура представляет собой затравочную культуру. Согласно некоторым вариантам осуществления вторая клеточная культура представляет собой периодическую культуру с подпиткой. Согласно другим вариантам осуществления вторая клеточная культура представляет собой производственную культуру. Согласно другим вариантам осуществления культивирование второй клеточной культуры осуществляют производственном биореакторе.
Согласно другим вариантам осуществления клетки переносят во вторую клеточную культуру при начальной плотности клеток, составляющей больше чем или равной приблизительно 0,5х106 клеток/мл. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки переносят во вторую клеточную культуру при начальной плотности клеток, составляющей приблизительно 0,5-3,0х106 клеток/мл.
Согласно некоторым вариантам осуществления концентрация лактата во второй клеточной культуре показывает чистое потребление лактата, например, чистое потребление лактата достигается на 2, 3, 4 или 5 день или через 2 дня, 3 дня, 4 дня или 5 дней роста клеток во второй клеточной культуре. Согласно другим вариантам осуществления уменьшение накопления лактата представляет собой снижение максимальной концентрации лактата во второй клеточной культуре. Согласно другим вариантам осуществления снижение максимальной концентрации лактата происходит во второй клеточной культуре на 5 день или через 5 дней роста клеток во второй клеточной культуре. Согласно другим вариантам осуществления максимальная концентрация лактата во второй клеточной культуре составляет меньше чем приблизительно 6 г/л, 5 г/л, 4 г/л, 3 г/л, 2 г/л или меньше чем приблизительно 1 г/л.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения клетка или клетки выбраны из группы, состоящей из следующего: клетка СНО, COS, ретинальная клетка, клетка Vero, CV1, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL60, Jurkat, Daudi, A431, CV-1, U937, 3Т3, клетка L, клетка С127, SP2/0, NS-0, ММТ, PER.C6, мышиные лимфоидные клетки и клетки мышиной гибридомы.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1: Посевной сосуд с производящей слитый белок клеточной линией СНО использовали для инокуляции производственных биореакторов в параллелях при (фиг. 1А) трех различных метаболических состояниях (измерение рН в режиме реального времени и измерение содержания лактата в автономном режиме) и количествах жизнеспособных клеток (VCC). Также показано потребление основания, нормированное к 1 для посевного сосуда. Параметры (время, рН, содержание лактата, VCC и содержание основания) для каждой клеточной культуры (условие № 1, № 2 и № 3), для которой клетки переносили в производственные биореакторы, указаны белыми прямоугольниками (пунктирная линия). Все производственные биореакторы функционировали при одинаковых условиях эксплуатации. Показано воздействие каждой системы посевных ферментеров и ее метаболического состояния на титр белка (фиг. 1В) и лактата (фиг. 1С) в производственном биореакторе. Линии, отражающие основную тенденцию, характерную для производственного биореактора, представляют собой среднее значение от биореакторов в двух параллелях, при этом планки погрешностей представляют ± одно стандартное отклонение.
Фиг. 2: Посевной сосуд с производящей антитело клеточной линией СНО использовали для инокуляции производственных биореакторов в параллелях в химически установленном способе при (фиг. 2А) четырех различных метаболических состояниях (измерение значения рН и содержания лактата в автономному режиме) и количествах жизнеспособных клеток. Параметры (время, рН, содержание лактата и VCC) для каждой клеточной культуры (условие № 1, № 2, № 3 и № 4), для которой клетки переносили в производственные биореакторы указаны белыми прямоугольниками (пунктирные линии). Все производственные биореакторы функционировали при одинаковых условиях эксплуатации. Условие № 1 утрачивалось через одну неделю. Также показана воздействие каждой системы посевных ферментеров и ее метаболического состояния на титр белка (фиг. 2В) и накопление лактата (фиг. 2С) в производственном биореакторе. Линии, отражающие основную тенденцию, характерную для производственного биореактора, представляют собой среднее от биореакторов в двух параллелях, при этом планки погрешностей представляют ± одно стандартное отклонение.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными способами и описанными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут изменяться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, представлена исключительно с целью описания конкретных вариантов осуществления, и не предусмотрено, чтобы она являлась ограничивающей, поскольку объем настоящего изобретения определяется формулой изобретения.
Используемые в настоящем описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя ссылки на формы множественного числа, если только контекст ясно не диктует иное. Таким образом, например, ссылка на способ включает в себя один или несколько способов и/или стадий типа, описанного в настоящем документе и/или который станет очевидным специалистам в настоящей области техники при чтении настоящего раскрытия.
Если не указано иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины имеют такое же значение, которое в большинстве случаев понятно специалисту в настоящей области
- 4 045030 техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя при практическом осуществлении настоящего изобретения могут быть использованы любые способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в настоящем документе, далее описаны конкретные способы и материалы. Все публикации, упомянутые в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.
Клеточная культура.
Используемая в настоящем документе фраза периодическая культура или периодический режим представляет собой фразу, которая относится к установке (например, сосуду для культивирования), которая заполнена клетками и характеризуется исходным полным рабочим объемом среды, которая никогда не заменяется. В такой периодической культуре все компоненты для культивирования клеток поставляют в сосуд для культивирования в начале процесса культивирования. Культивирование, как правило, происходит до тех пор, пока не исчерпаются питательные вещества, или отходы не достигнут токсических уровней, и клетки прекратят расти.
Используемая в настоящем документе фраза затравочная культура или система посевных ферментеров (которая также называется система для инокуляции) включает в себя источник инокуляции клеточной популяции, который, как предусмотрено, размножается в периодической культуре, или серии периодических культур, пока они не будут готовы к промышленному масштабу. Процесс наращивания клеток в системе посевных ферментеров представляет начальную фазу роста клеток, или фазу роста инокулята, после оттаивания замороженных клеток. Интервал между оттаиванием клеток и накоплением достаточной клеточной массы, чтобы инокулировать производственный биореактор, составляет фазу наращивания в системе посевных ферментеров. Клеточная масса может пропорционально увеличиваться, проходя через несколько стадий в биореакторе в затравочной культуре, и клетки выращивают в среде для культивирования клеток при условиях, благоприятных для выживания, роста и жизнеспособности клеточной культуры. Следует понимать, что система посевных ферментеров предусмотрена для того, чтобы сделать максимальной фазу экспотенциального роста, или достичь максимальной скорости роста для конкретного типа клеток, подлежащего культивированию. Следовательно, пассирование клеток из одного биореактора или сосуда в другой может представлять собой один путь достижения максимальной скорости роста. Точные условия будут варьировать в зависимости от типа клеток, организма, из которого происходят клетки, и природы и характера экспрессированного полипептида или белка. Сдвиг на метаболизм, характеризующийся потреблением лактата, может происходить или может быть обнаружен в любом из сосудов в системе наращивания клеток в посевных ферментерах.
Используемая в настоящем документе фраза периодическая клеточная культура с подпиткой или периодическая культура с подпиткой относится к периодической культуре, для которой характерно то, что клетки животного и культуральную среду поставляют в сосуд для культивирования изначально и дополнительные питательные вещества для культивирования медленно добавляют, непрерывно или с дискретными шагами приращения, в культуру во время культивирования, с периодическим сбором клеток и/или продукта перед прекращением культивирования или без него. Периодическая культура с подпиткой включает в себя полунепрерывную периодическую культуру с подпиткой, которая характеризуется тем, что периодически всю культуру (которая может включать в себя клетки и среду) удаляют и заменяют свежей средой. Периодическая культура с подпиткой отличается от простой периодической культуры, поскольку в периодической культуре все компоненты для культивирования клеток (включая в себя клетки животного и все питательные вещества для культивирования) поставляют в сосуд для культивирования в начале процесса культивирования. Периодическая культура с подпиткой может дополнительно отличаться от перфузионного культивирования тем, что супернатант не удаляют из сосуда для культивирования во время процесса, тогда как в перфузионном культивировании клетки удерживают в культуре, например, с помощью фильтрации, и культуральную среду непрерывно или периодически вводят и удаляют из сосуда для культивирования. Тем не менее, предусмотрено удаление образцов с целью исследования во время периодического культивирования клеток с подпиткой. Процесс периодического культивирования с подпиткой продолжается, пока не определят, что достигнут максимальный рабочий объем и/или производство белка.
Используемая в настоящем документе фраза непрерывная клеточная культура относится к технике, используемой для выращивания клеток непрерывно, как правило, в конкретной фазе роста. Например, если требуется постоянная подача клеток или требуется получение конкретного представляющего интерес полипептида или белка, может быть необходимо, чтобы клеточная культура поддерживалась в конкретной фазе роста. Таким образом, условия необходимо непрерывно подвергать мониторингу и регулировать соответствующим образом для поддержания клеток в этой конкретной фазе.
Используемая в настоящем документе фраза фаза логарифмического роста означает период роста клеток, как правило, характеризующийся удвоением количества клеток. Фразы фаза экспотенциального роста или экспотенциальная фаза используются взаимозаменяемо с фазой логарифмического роста. В фазе логарифмического роста количество новых клеток, появившихся в единицу времени, пропорционально существующей клеточной популяции, следовательно, график зависимости натурального логарифма количества клеток от времени представляет собой прямую линию. Если рост не ограничивают,
- 5 045030 удвоение будет продолжаться с постоянной скоростью, следовательно, как количество клеток, так и скорость роста популяции увеличивается вдвое за каждый последующий период времени.
Используемая в настоящем документе фраза стационарная фаза относится к точке, где скорость роста клеток равна скорости гибели клеток. При построении графика стационарную фазу представляют как плато, или сглаженную, горизонтальную линейную часть кривой.
Используемый в настоящем документе термин клетка включает в себя любую клетку, которая является подходящей для экспрессии рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты. Клетки включают в себя клетки эукариот, такие как клетки не являющегося человеком животного, клетки млекопитающего, клетки человека или слияния клеток, такие как, например, гибридомы или квадромы. Согласно определенным вариантам осуществления клетка представляет собой клетку человека, обезьяны, не относящейся к человекообразным, человекообразной обезьяны, хомяка, крысы или мыши. Согласно другим вариантам осуществления клетка выбрана из следующих клеток: клетки СНО (например, СНО K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (например, COS-7), ретинальные клетки, клетки Vero, CV1, клетки почки (например, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431 (эпидермальные клетки), CV-1, U937, 3Т3, клетка L, клетка С127, SP2/0, NS-0, клетка ММТ, опухолевая клетка и клеточная линия, полученная из вышеупомянутой клетки. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка содержит один или несколько вирусных генов, например, ретинальная клетка, которая экспрессирует вирусный ген (например, клетка PER.C6®). Согласно некоторым вариантам осуществления клетка представляет собой клетку СНО. Согласно другим вариантам осуществления клетка представляет собой клетку СНО K1.
Используемый в настоящем документе термин клеточная линия относится к клетке или клеткам, полученным из конкретной линии дифференцировки через серийное пассирование или субкультивирование клеток. Термин клетки используется взаимозаменяемо с термином клеточная популяция.
Принимая во внимание современные стратегии подпитки, соответствующие последним достижениям, клетки СНО достигают такого количества клеток, как 11x106 клеток/мл (на 8 день) и титров, составляющих, например, 2,3 г/л IgG человека (собранного на 14 день), количества, которые представляют собой типичные промышленные значения для периодических культур клеток СНО с подпиткой (Kim, BJ, et al. Biotechnol Bioeng. 2012 Jan;109(1): 137-45. doi: 10,1002/bit,23289. Epub 2011 Oct 3). Сообщалось о производстве антитела, составляющем даже больше чем 10 г/л, из клеток СНО, которые стали общепризнанными в качестве важной промышленной клеточной линией млекопитающего (Omasa et al., Current Pharmaceutical Biotechnology, 2010, 11:233-240).
Термины среда для культивирования клеток и культуральная среда относятся к питательному раствору, используемому для выращивания клеток млекопитающего, который, как правило, обеспечивает необходимые питательные вещества для усиления роста клеток, такие как углеводный источник энергии, незаменимые аминокислоты, микроэлементы, витамины и т.д. Среда для культивирования клеток может содержать экстракты, например, сыворотку или пептоны (гидролизаты), которые обеспечивают сырьевые материалы, поддерживающие рост клеток. Среды могут содержать дрожжевые или соевые экстракты вместо экстрактов животного происхождения. Среда с установленным химическим составом относится к среде для культивирования клеток, в которой все химические компоненты являются известными. Среда с установленным химическим составом абсолютно не содержит компонентов животного происхождения, таких как пептоны из сыворотки или пептоны животного происхождения.
Один аспект настоящего изобретения относится к фазе роста, на которой условия культивирования клеток модифицируют для усиления роста рекомбинантных эукариотических клеток. На фазе роста основную культуральную среду и клетки подают в сосуд для культивирования периодически.
Сосуд для культивирования инокулируют клетками. Подходящая плотность посева для начальной фазы роста клеток варьирует в зависимости от исходной клеточной линии, например, в диапазоне, составляющем 0,2-3x106 клеток/мл. Сосуды для культивирования включают в себя без ограничения луночные планшеты, Т-колбы, встряхиваемые колбы, сосуды с мешалкой, роллерные колбы, половолоконные биореакторы, биореакторы с воздушным подъемом и подобное. Подходящий сосуд для культивирования клеток представляет собой биореактор. Биореактор относится к любому сосуду для культивирования, который произведен или сконструирован для управления окружающими условиями или их контроля. Такие сосуды для культивирования хорошо известны в настоящей области техники.
Процессы и системы биореакторов были разработаны для оптимизации газообмена, для подачи достаточного количества кислорода для поддержания роста и продуктивности клеток и для удаления СО2. Поддержание эффективности газообмена является важным критерием для обеспечения успешного пропорционального увеличения клеточной культуры и производства белка. Такие системы хорошо известны специалисту в настоящей области техники.
За фазой экспотенциального роста или затравочной культурой (т.е. первой клеточной культурой), как правило, следует отдельная вторая культура, известная как фаза производства полипептида. Согласно одному варианту осуществления клетки, подвергающиеся метаболическому сдвигу на потребление лактата в первой клеточной культуре, переносят во вторую клеточную культуру. Согласно одному вари- 6 045030 анту осуществления культивирование второй клеточной культуры проводят в другом сосуде для культивирования, чем фазу роста клеток или затравочную культуру. Согласно некоторым вариантам осуществления культивирование второй клеточной культуры происходит в производственному биореакторе. В этом контексте перенос клеток относится к экстракции фракции клеточной популяции из сосуда с первой клеточной культурой и помещение фракции клеточной популяции в сосуд для второй клеточной культуры для закладки второй клеточной культуры.
Согласно другим аспектам перенос клеток может относиться к объему клеток, содержащему клетки первой клеточной культуры, который помещают в другой сосуд, и объем инокулята представляет собой фракцию конечного объема второй клеточной культуры, например, приблизительно 20%, 30%, 40%, или 50%, или 60%, или 70%, или 80% конечного объема. Согласно другим аспектам перенос клеток может относиться к объему клеток, содержащему клетки первой клеточной культуры, который остался в исходном сосуде, и среду добавляют так, чтобы исходный объем (первая клеточная культура) представлял собой фракцию конечного объема второй клеточной культуры. В этом контексте, первую клеточную культуру разводят, тем самым осуществляя перенос клеток во вторую клеточную культуру.
Используемая в настоящем документе фраза выходят из или выходит из относится к переключению с одной фазы на другую фазу, или событиям, относящимся к переключению с одной фазы на другую фазу. Выход из конкретной фазы, например, фазы роста, включает в себя период времени, когда измерения указывают на то, что первая фаза замедляется или почти завершена, и начинается следующая фаза. Выход из фазы логарифмического роста, например, указывает на то, что клетки заканчивают фазу логарифмического роста, и/или начинают или достигли стационарной фазы. Фазы роста, как правило, измеряют по концентрации жизнеспособных клеток.
Фраза плотность клеток относится к количеству клеток на объем образца, например, в виде количества общих (жизнеспособных и мертвых) клеток на мл. Количество клеток можно подсчитать вручную или автоматически, например, с помощью проточного цитометра. Автоматизированные счетчики клеток были адаптированы к подсчету количества жизнеспособных или мертвых клеток или как жизнеспособных, так мертвых клеток с использованием, например, стандартной техники поглощения трипанового синего. Фраза плотность жизнеспособных клеток или концентрация жизнеспособных клеток относится к количеству жизнеспособных клеток на объем образца (которое также называется число жизнеспособных клеток). Любое количество хорошо известных неавтоматизированных или автоматизированных техник можно использовать для определения плотности клеток. Можно проводить измерения биомассы культуры в режиме реального времени, где емкость или оптическая плотность коррелируют с количеством клеток на единицу объема.
Конечная плотность клеток в первой клеточной культуре, такая как плотность в системе посевных ферментеров, варьирует в зависимости от исходной клеточной линии, например, в диапазоне, составляющем приблизительно 1,0-10x106 клеток/мл. Согласно некоторым вариантам осуществления конечная плотность в системе посевных ферментеров достигает 1,0-10x106 клеток/мл перед переносом клеток во вторую клеточную культуру. Согласно другим вариантам осуществления конечная плотность в системе посевных ферментеров достигает 5,0-10x106 клеток/мл переносом клеток во вторую клеточную культуру.
Согласно некоторым вариантам осуществления фракцию клеточной популяции в первой клеточной культуре переносят во вторую клеточную культуру. Согласно другим вариантам осуществления клеточную популяцию в первой клеточной культуре переносят во вторую клеточную культуру так, что первая клеточная культура представляет собой фракцию второй клеточной культуры. Начальная плотность клеток второй культуры может быть выбрана специалистом в настоящей области техники. Согласно некоторым вариантам осуществления начальная плотность клеток во второй клеточной культуре составляет приблизительно 0,5x106 клеток/мл - приблизительно 3,0x106 клеток/мл. Согласно другим вариантам осуществления начальная плотность клеток во второй клеточной культуре составляет приблизительно 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0x106 клеток/мл.
Согласно определенным вариантам осуществления клеточный супернатант или клеточный лизат собирают после фазы образования продукта. Согласно другим вариантам осуществления представляющий интерес полипептид или белок извлекают из культуральной среды или клеточного лизата с использованием техник, хорошо известных в настоящей области техники.
Свойства клеток и локализация производимого продукта диктуют способ, используемый для выращивания и производства и, следовательно, определяют выбор подходящего типа биореактора или сосуда для культивирования. (Bleckwenn, NA and Shiloach, J. 2004 Large-scale cell culture Curr Protoc Immunol. 59: Appendix 1U.1-Appendix 1U.44.)
Метаболический сдвиг.
Используемая в настоящем документе фраза метаболический сдвиг относится к изменению в клеточном метаболизме, или использованию углеродных источников питательных веществ, от производства лактата на чистое потребление лактата. Не связываясь с какой-либо теорией, наиболее распространенные углеродные источники питательных веществ в бессывороточных средах представляют собой глюкозу и
- 7 045030 глутамин, которые поддерживают быстрый рост клеток. Глюкоза может полностью окисляться до СО2 и
H2O, или, исходя из доступности кислорода, может превращаться в лактат, например, в аэробном гликолизе. Быстрорастущие клетки быстро потребляют глюкозу и глутамин, что приводит к неполному окислительному метаболизму и, следовательно, к избытку производства лактата. Метаболизм углеводов может переходить на потребление лактата и, таким образом, снижать накопление лактата.
Используемая в настоящем документе фраза потребление лактата относится к использованию лактата в качестве источника углерода в клеточном метаболизме.
Используемая в настоящем документе фраза чистое потребление лактата относится к потреблению лактата, при котором клетки одновременно потребляют лактат и производят лактат в качестве побочного продукта клеточного метаболизма, и общая скорость потребления больше или равна скорости производства лактата. Если чистое потребление лактата увеличивается, общее накопление лактата в среде для культивирования клеток уменьшается.
При закладке периодической культуры с подпиткой накопление лактата и, возможно, аммиака, вызывает быстрое снижение жизнеспособности клеток. Сообщалось, что в периодических культурах с подпиткой, которые не характеризовались метаболическим сдвигом, невозможно достичь выше 90% жизнеспособности, когда концентрация клеток достигла своего максимума. (Xie and Wang, 1994, Biotechnol. Bioeng. 43(11): 1175-1189). Такой метаболический сдвиг, несмотря на то, что он является желательным для оптимального осуществления процесса, не является типичным, кроме того, его нелегко контролировать (Zagari, et al., 2013, New Biotechnol. 30(2):238-245). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что время и условия переноса клеток из первой периодической культуры (например, затравочной культуры) во вторую периодическую культуру (например, периодическую культуру с подпиткой или производственную культуру) оказывают существенное воздействие на конечный титр белка. Неожиданно определили, что клетки, культивируемые в течение более длительного периода времени в первой периодической культуре, будут переходить на потребление лактата и обеспечивать метаболическое предпочтение, или метаболический фенотип, характеризующийся потреблением лактата. Целью настоящего изобретения является создание клеток в состоянии постоянного метаболического сдвига, а значит, клеток с метаболической памятью на потребление лактата. Способ согласно настоящему изобретению хорошо подходит для предварительного приведения клеток в состояние метаболического сдвига так, чтобы клетки можно было использовать в любой второй или последующей клеточной культуре, где потребление лактата является предпочтительным.
Согласно одному варианту осуществления общее накопление лактата уменьшается во второй клеточной культуре. Согласно некоторым вариантам осуществления чистое потребление лактата достигается во время второй клеточной культуры, например, чистое потребление лактата достигается на 2, 3, 4 или 5 день или через 2 дня, 3 дня, 4 дня или 5 дней роста клеток во второй клеточной культуре. В других вариантах осуществления уменьшение накопления лактата представляет собой снижение максимальной концентрации лактата во второй клеточной культуре. Согласно другим вариантам осуществления снижение максимальной концентрации лактата происходит во второй клеточной культуре на 5 день ил через 5 дней роста клеток во второй клеточной культуре. Согласно другим вариантам осуществления максимальная концентрация лактата во второй клеточной культуре составляет меньше чем приблизительно 6 г/л, 5 г/л, 4 г/л, 3 г/л, 2 г/л или меньше чем приблизительно 1 г/л.
Согласно некоторым вариантам осуществления характеризующиеся метаболическим сдвигом клетки производят по меньшей мере в 2 раза, или в 3 раза, или в 4 раза, или в 5 раз, или вплоть до в 10 раз более низкие значения концентрации лактата во второй клеточной культуре. Согласно некоторым дополнительным вариантам осуществления пониженные значения концентрации лактата во второй клеточной культуре или общее уменьшенное накопление лактата во второй клеточной культуре сравнивают с указанным параметром, определенным в идентичной в других отношениях клеточной культуре при идентичных в других отношениях условиях за исключением того, что перенос клеток во вторую клеточную культуру происходит до того, как в первой клеточной культуре произошел метаболический сдвиг. Согласно другим вариантам осуществления общее накопление лактата уменьшается во второй клеточной культуре на 5 день ил через 5 дней роста клеток во второй клеточной культуре.
Согласно другому варианту осуществления общий титр продукта увеличивается во второй клеточной культуре. Согласно другим вариантам осуществления характеризующиеся метаболическим сдвигом клетки производят по меньшей мере в 2 раза, или в 2,5 раза, в 3 раза, или в 4 раза, или в 5 раз, или вплоть до в 10 раз более высокий титр продукта во второй клеточной культуре. Согласно другим вариантам осуществления повышенные значения титра белка во второй клеточной культуре сравнивают с указанным параметром, определенным в идентичной в других отношениях клеточной культуре при идентичных в других отношениях условиях за исключением того, что перенос клеток во вторую клеточную культуру происходит до того, как в первой клеточной культуре произошел метаболический сдвиг.
Оптимизация метаболического контроля за клетками в культуре до периодической культуры с подпиткой или стадии образования продукта обладает множеством преимуществ. Метаболический сдвиг на потребление лактата в первой культуре можно определить по многочисленным параметрам. Определение метаболического сдвига предусматривает ряд способов, известных специалисту в настоящей области
- 8 045030 техники для определения метаболического статуса растущих клеток.
Измерение значений концентрации лактата в первой клеточной культуре можно осуществить с помощью разнообразных биоаналитических систем и наборов, хорошо известных специалисту в настоящей области техники, таких как анализаторы с применением электрохимии (например, Bioprofile® Flex, Nova Biomedical, Waltham, MA), или спектроскопии комбинационного рассеяния, и их можно использовать для автономного мониторинга или мониторинга в режиме реального времени накопления лактата в клеточной культуре.
Следует понимать, что накопление лактата оказывает неблагоприятное действие на клеточную культуру и, следовательно, оказывает отрицательное действие на выход белкового продукта.
Согласно одному варианту осуществления метаболический сдвиг определяют в первой клеточной культуре, когда чистое накопление лактата замедляется или прекращается.
Согласно одному варианту осуществления метаболический сдвиг на потребление лактата обнаруживают с помощью измерений лактата в первой клеточной культуре. Согласно некоторым вариантам осуществления метаболический сдвиг определяют в первой клеточной культуре, когда определяют плато или по существу горизонтальную линию на графике, представляющем измерение следующих подряд значений концентрации лактата в культуре. Согласно другим вариантам осуществления значение концентрации лактата остается ниже верхнего предела допустимых значений для следующих подряд измерений. Согласно другим вариантам осуществления верхний предел допустимых значений для концентрации лактата не превышает 4 г/л. Следует понимать, что содержания лактата достигают плато, когда клетки испытывают чистое потребление лактата.
Согласно другим вариантам осуществления определение метаболического сдвига предусматривает измерение лактата в первой клеточной культуре с интервалами, и определение того, что содержание лактата находится ниже заданного верхнего предела в течение последовательных временных интервалов, тем самым, определяя, что произошел метаболический сдвиг на потребление лактата в клетках.
Управление и контроль рН представляет собой важный аспект содержания клеток в культуре биореактора. Рост большинства клеток является оптимальным в пределах узких границ рН. Как правило, клеточную культуру содержат при нейтральном значении рН, составляющем 7,0, в пределах диапазона верхних и нижних установленных значений. Установленные значения определяются специалистом в настоящей области техники в зависимости от конкретной клеточной линии в культуре, состава среды и оптимальных условий роста для данной клетки. Используемое в настоящем документе выражение нейтральное значение рН означает значение рН, составляющее приблизительно 6,85 - приблизительно 7,4. Выражение нейтральное значение рН включает в себя значения рН, составляющие приблизительно 6,85, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 и 7,4.
Мониторинг рН и добавление основания в режиме онлайн, или в режиме реального времени, можно осуществить с помощью любого количества способов, хорошо известных специалисту в настоящей области техники. В онлайн системе, измерения биологических и химических параметров в клеточной культуре в режиме реального времени путем прямого соединения с анализатором обеспечивает обратную связь для проведения дополнительных действий, например, добавления основания или добавления питательных веществ в культуральную среду. Также можно проводить автономные измерения, при которых имеет место периодический забор образцов и неавтоматизированные манипуляции оператора. Непрерывное измерение рН обеспечивает мониторинг клеточной среды и добавление основания, например, если кислотность достигает нижнего установленного значения за пределами допустимых значений. Если рН достигает установленных верхних пределов допустимых значений (т.е. становится слишком основной), можно добавить СО2.
Мониторинг в режиме реального времени можно осуществить с помощью разнообразных способов. Электроды, такие как проточные электроды, широко используют для измерения значения рН или других параметров, таких как содержание растворенного О2 (dO2) и температура, в среде для культивирования клеток. Такие проточные электроды подключают напрямую в любой стандартный ленточный самописец для непрерывной записи или можно соединить с любым стандартным лабораторным рН-метром или милливольтметром. рН также можно измерять с помощью оптического измерения с использованием зоны флуоресцентного сенсора, установленной в биореакторе.
Любая такая система мониторинга будет интегрировать предел допустимых значений (или зону нечувствительности датчика) вблизи установленных верхних и нижних значений. Зона нечувствительности датчика предохраняет систему дозирования от слишком быстрого включения и выключения. Во время контроля за значением рН не будет происходить дозирование или титрование, если отклонение значения рН от установленного значения находится в пределах допустимых значений. Если измеренные значения рН превышают нижний предел допустимых значений (кислотный), тогда добавят жидкое основание (например, КОН, NaOH, NaHCO3) или газообразный NH3. Если измеренные значения рН превышают верхний предел допустимых значений (основный), тогда добавят кислоту или газ СО2. Установленное значение рН и стратегия контроля, например, зона нечувствительности датчика, связаны с многочисленными параметрами, таким как содержание растворенного CO2, потребление основания для контроля за значением рН, и, следовательно, осмолярностью. (См., например, Li, F., et al., 2010, mAbs 2(5):466-479.)
- 9 045030
Согласно одному варианту осуществления метаболический сдвиг определяют в первой клеточной культуре, когда прекращают добавление (т.е. титрование) основания. Тенденция изменения содержания основания включает в себя тенденцию изменения в режиме реального времени, причем автоматизированный способ мониторинга можно использовать для определения значения рН и периодического добавления основания. Согласно настоящему способу установленные значения рН могут варьировать, но повышение значения рН за пределы нижней границы зоны нечувствительности указывает на метаболический сдвиг в первой клеточной культуре. Способы в режиме реального времени и неавтоматизированные способы измерения тенденции изменения содержания основания известны в настоящей области техники, включая в себя способы мониторинга массы сосуда, или объемной скорости потока насоса для обнаружения добавления основания или остановки добавления основания.
Согласно другому варианту осуществления метаболический сдвиг определяют в первой клеточной культуре, если добавление основания больше не требуется для повышения значения рН выше нижнего предела допустимых значений.
Согласно некоторым вариантам осуществления метаболический сдвиг определяют в первой культуре, если значение рН увеличивается без добавления основания. Согласно другим вариантам осуществления значение рН увеличивается выше нижнего предела допустимых значений для последовательных измерений.
Согласно другим вариантам осуществления определение метаболического сдвига предусматривает следующее: (а) настройка показывающего рН прибора на обнаружение уровня шума в первой клеточной культуре, (b) непрерывное измерение рН в первой клеточной культуре с регулярными интервалами, (с) добавление основания при необходимости для поддержания рН выше заданного нижнего предела, (d) определение того, что значение рН находится выше заданного нижнего предела в течение нескольких последовательных временных интервалов, и (е) прекращение добавления основания, тем самым, определяя, что произошел метаболический сдвиг на потребление лактата в клетках.
Согласно одному варианту осуществления нижний предел допустимых значений представляет собой значение рН, составляющее приблизительно 6,5, 6,55, 6,6, 6,65, 6,7, 6,75, 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05 или приблизительно 7,1.
Согласно некоторым вариантам осуществления метаболический сдвиг на потребление лактата обнаруживают с помощью индикаторов или продуктов клеточного метаболизма в первой клеточной культуре. Один такой индикатор клеточного метаболизма представляет собой потребление кислорода (Zagari, et al., 2013, New Biotechnol. 30(2):238-245). Точное измерение скорости истощения кислорода в среде для культивирования клеток можно использовать для определения присутствия жизнеспособных клеток в культуре после инокуляции, а также скорости роста клеток в культуре (см., например, патенты США №№ 6165741 и 7575890). Измерение потребления кислорода хорошо известно в настоящей области техники.
Другие индикаторы клеточного метаболизма, такие как ферменты и метаболиты, можно измерить с помощью протеомных или метаболомных техник, таких как иммунологические чипы, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) или масс-спектрометрия. Отмечали корреляцию содержания таких метаболитов, как глицин, триптофан, фенилаланин, аденин, пальмитиновая кислота, глутаминовая кислота, метионин и аспарагин, с увеличением клеточной биомассы (см., например, Jain, M., et al., Science. 2012 May 25; 336(6084): 1040-1044. doi: 10.1126/science. 1218595; и De la Luz-Hdez, K., 2012, Metabolomics and Mammalian Cell Culture, Metabolomics, Dr Ute Roessner (Ed.), ISBN: 978-953-51-0046-1, InTech, Available from: http://www.intechopen.com/books/metabolomics/ metabolomics-and-mammalian-cell-cultures). Любое количество молекулярных изменений, которые совпадают или напрямую ведут к метаболическому сдвигу в первой клеточной культуре, можно использовать для определения того, что метаболический сдвиг произошел.
Получение белка.
Способы согласно настоящему изобретению предусматривают производство представляющего интерес белка или полипептида в клеточной культуры. Для обеспечения получения белка в способах согласно настоящему изобретению, клетки конструируют для того, чтобы они рекомбинантно экспрессировали представляющий интерес полипептид или белок.
Клетки переносят во вторую клеточную культуру, например, производственную культуру, после того, как произошел метаболический сдвиг на потребление лактата в клетках, и будут содержать во второй клеточной культуре в течение некоторого периода времени так, чтобы полипептид или белок накапливался в клеточной культуре.
Используемый в настоящем документе термин полипептид представляет собой отдельную неразветвленную полимерную цепь аминокислот, соединенную вместе с помощью пептидных связей между карбоксильными и аминогруппами смежных аминокислотных остатков. Термин белок также можно использовать для описания большого полипептида, такого как белок из семи трансмембранных доменов, с конкретной укладкой или пространственной структурой. Таким образом, подразумевается, что термин белок включает в себя четвертичные структуры, третичные структуры и другие сложные макромолекулы, состоящие по меньшей мере из одного полипептида. Если белок состоит из более чем одного поли- 10 045030 пептида, которые физически связаны друг с другом, то используемый в настоящем документе термин белок относится к множественным полипептидам, которые физически соединены и функционируют вместе как отдельная структурная единица. Термин белок включает в себя полипептид.
Примеры полипептидов и белков, полученных с помощью способов согласно настоящему изобретению, включают в себя антитела, слитые белки, содержащие Fc слитые белки, рецепторы, содержащие рецептор Fc слитые белки и подобное.
Термин иммуноглобулин относится к классу структурно родственных гликопротеинов, состоящих из двух пар полипептидных цепей, одной пары легких (L) цепей и одной пары тяжелых (Н) цепей, причем все четверо из них могут быть взаимосвязаны с помощью дисульфидных связей. Структура иммуноглобулинов была всесторонне охарактеризована. См., например, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989)). Кратко, каждая тяжелая цепь, как правило, содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно представленную в настоящем документе как VH или VH) и константную область тяжелой цепи (CH). Константная область тяжелой цепи, как правило, содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Домены CH1 и CH2 соединены с помощью шарнира. Каждая легкая цепь, как правило, содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно представленную в настоящем документе как VL или VL) и константную область легкой цепи. Существуют два типа легких цепей у людей и других млекопитающих: каппа (к) цепь и лямбда (λ) цепь. Константная область легкой цепи, как правило, содержит один домен (CL). Области VH и VL можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности (или гипервариабельные области, которые могут являться гипервариабельными в последовательности и/или могут образовывать структурно определяемые петли), которые также называются определяющие комплементарность области (CDR), чередующиеся с областями, которые являются более консервативными, которые называются каркасные области (FR). Каждая VH и VL, как правило, состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца (N-конца) к карбокси-концу (С-концу) в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (см. также Chothia and Lesk J. MoI. Biol. 196, 901-917 (1987)). Как правило, нумерация аминокислотных остатков в этой области осуществляется согласно IMGT, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) или по системе нумерации EU согласно Kabat (также известной как нумерация EU или индекс EU), например, как в Kabat, E.A. et al. Sequences of Proteins of Immunological interest. 5th ed. US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242 (1991).
Термин Fc относится к части константной области тяжелой цепи, которая содержит по меньшей мере домены СН2 и СН3, которые, как правило, связываются с рецептором Fc, например, FcyR, а именно FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) или FcRn, т.е. неонатальным рецептором Fc. Следует понимать, что содержащий Fc слитый белок может содержать весь нативный домен Fc или его часть или содержать делеции, замены и/или вставки или другие модификации, которые делают его неспособным связываться с любым рецептором Fc, следовательно, делая домен нефункциональным или лишенным функций эффектора в отношении его типичной биологической функции, которая достигается посредством рецептора Fc.
Используемый в настоящем документе термин антитело (Ab) относится к молекуле иммуноглобулина или ее производному, которое обладает способностью специфически связываться с антигеном. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей молекулы иммуноглобулина содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном, как изложено выше при описании термина иммуноглобулин. Антитело также может представлять собой биспецифическое антитело, диатело или сходную молекулу (см., например, Holliger, et al., 1993, PNAS USA 90(14), 6444-8, в отношении описания диател). Кроме того, было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела, т.е. антигенсвязывающими фрагментами или антигенсвязывающими белками. Как и полноразмерные молекулы антитела, антигенсвязывающие белки могут являться моноспецифическими или мультиспецифическими (например, биспецифическими). Примеры связывающих молекул или фрагментов, предусмотренных в пределах термин антитело, включают в себя без ограничения следующее: (i) фрагмент Fab' или Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1, или моновалентное антитело, описанное в международной патентной публикации № WO2007059782; (ii) фрагменты F(ab')2, бивалентные фрагменты, содержащие два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком на шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий по существу из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий по существу из доменов VL и VH, (v) фрагмент dAb (Ward et al., 1989, Nature 341, 544-546), который состоит по существу из домена Vh и также имеет название доменные антитела (Holt et al., 2003, Trends Biotechnol. 21(11):484-90); (vi) верблюжьи антитела или нанотела (Revets et al., 2005, Expert Opin Biol Ther. 5(1): 111-24) и (vii) выделенная определяющая комплементарность область (CDR).
Используемые в настоящем документе термины моноклональное антитело или композиция моноклональных антител относятся к препарату молекул антитела единого молекулярного состава. Композиция моноклональных антител проявляет единую специфичность и аффинность связывания в отношении конкретного эпитопа.
- 11 045030
Предусмотрено, что используемый в настоящем документе термин антитело человека включает в себя антитела, содержащие вариабельную и константную области, происходящие из зародышевых последовательностей иммуноглобулина человека. Антитела человека могут включать в себя аминокислотные остатки, не кодируемые зародышевыми последовательностями иммуноглобулина человека (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или во время генной реаранжировки или путем соматической мутации in vivo). Термин моноклональное антитело мыши, или мышиное моноклональное антитело относится к антителам, проявляющим единую специфичность связывания, которые содержат вариабельную и константную области, происходящие из мышиных зародышевых последовательностей иммуноглобулина.
Используемый в настоящем документе термин слитый белок включает в себя содержащий Fc слитый белок и содержащий рецептор Fc слитый белок. Слитый белок может представлять собой любой полипептид, образованный путем экспрессии химерного гена, образованного путем комбинации более чем одной последовательности ДНК различного происхождения, как правило, путем клонирования одного гена в экспрессионный вектор в рамке считывания со вторым геном так, чтобы два гена кодировали один непрерывный полипептид.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предусмотрен описанный в настоящем документе способ получения рекомбинантного представляющего интерес полипептида или белка. Согласно некоторым вариантам осуществления рекомбинантный представляющий интерес полипептид или белок выбран из группы, состоящей из антитела, антигенсвязывающего белка, слитого белка, содержащего Fc слитого белка и содержащего рецептор Fc слитого белка.
Системы экспрессии клеток.
Применение системы экспрессии клеток представляет собой необходимое предварительное условие для крупномасштабного получения таких полипептидов или белков в клеточной культуре.
Продукт согласно настоящему изобретению представляет собой полипептид или белок, который экспрессируют в клетках и собирают из системы культивирования, т.е. клеток и/или клеточной среды. Он может представлять собой любой представляющий интерес полипептид или белок (ранее).
В экспрессионных векторах, как правило, используются сильные генные промоторы для управления транскрипцией и РНК продукта. Согласно дополнительному аспекту настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, кодирующему представляющий интерес полипептид, например, антитело, антигенсвязывающий белок или слитый белок. Такие экспрессионные векторы можно использовать в способах согласно настоящему изобретению для рекомбинантного получения представляющих интерес полипептидов или белков с помощью клеточной культуры.
Экспрессионный вектор в контексте способов согласно настоящему изобретению может представлять собой любой подходящий вектор, включая в себя хромосомные, нехромосомные и синтетические нуклеиновокислотные векторы (последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая подходящий набор элементов контроля экспрессии). Примеры таких векторов включают в себя производные SV40, бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирус, дрожжевые плазмиды, векторы, полученые из комбинаций плазмид и фаговой ДНК, и векторы из вирусной нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК). Такие нуклеиновокислотные векторы и их применение хорошо известны в настоящей области техники (см., например, патенты США №№ 5589466 и 5973972).
Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес полипептид или белок, поставляют в клетку-хозяин, причем молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с контролирующей экспрессию последовательностью, подходящей для экспрессии в клеткехозяине млекопитающего.
Контролирующие экспрессию последовательности конструируют для контроля и управления транскрипцией кодирующих полипептид генов, представляющих интерес, и последующей экспрессией полипептидов или белков в различных клеточных системах. Плазмиды комбинируют экспрессируемый ген, представляющий интерес, с контролирующими экспрессию последовательностями (т.е. экспрессионными кассетами), которые содержат необходимые элементы, такие как, например, промоторы, энхансеры, селектируемые маркеры, операторы и т.д. В экспрессионном векторе молекулы нуклеиновой кислоты могут содержать или могут быть связаны с любым подходящим промотором, энхансером, селектируемым маркером, оператором, репрессорным белком, терминирующими последовательностями полиаденилирования и другими облегчающими экспрессию элементами.
Используемый в настоящем документе термин промотор относится к последовательности ДНК, достаточной для направления транскрипции последовательности ДНК, с которой он функционально связан, т.е. связан таким образом, чтобы контролировать транскрипцию нуклеотидной последовательности. Экспрессию нуклеотидной последовательности можно разместить под контроль любого промоторного или энхансерного элемента, известного в настоящей области техники. Примеры таких элементов включают в себя сильные промоторы экспрессии (например, промотор/энхансер IE CMV человек или главный промотор IE CMV (CMV-MIE), а также RSV, поздний промотор SV40, промоторы SL3-3, MMTV, убиквитина (Ubi), убиквитина С (UbC) и HIV LTR).
Согласно некоторым вариантам осуществления вектор содержит промотор, выбранный из группы,
- 12 045030 состоящей из SV40, CMV, CMV-IE, CMV-MIE, RSV, SL3-3, MMTV, Ubi, UbC и HIV LTR.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие представляющий интерес полипептид или белок, также могут быть функционально связаны с эффективной терминирующей последовательностью полиаденилирования, точкой начала репликации для плазмидного продукта в Е. coli, геном устойчивости к действию антибиотика в качестве селектируемого маркера и/или подходящим сайтом клонирования (например, полилинкером). Нуклеиновые кислоты также могут содержать регулируемый индуцируемый промотор (индуцируемый, репресируемый, регулируемый условиями окружающей среды) в отличие от конститутивного промотора, такого как IE CMV (специалисту в настоящей области техники будет понятно, что такие термины фактически являются дескрипторами степени генной экспрессии при определенных условиях).
Селектируемые маркеры представляют собой элементы, хорошо известные в настоящей области техники. При селективных условиях могут выжить только клетки, экспрессирующие соответственный селектируемый маркер. Как правило, гены селектируемых маркеров экспрессируют белки, как правило, ферменты, которые обеспечивают устойчивость к различным антибиотикам в клеточной культуре. В других селективных условиях клетки, которые экспрессируют флуоресцентный белковый маркер, визуализируются, и их, таким образом, отбирают. Варианты осуществления включают в себя следующее: бета-лактамаза (bla) (ген устойчивости к антибиотику бета-лактаму или устойчивости к ампициллину, или ampR), bls (ген ацетилтрансферазы, обеспечивающий устойчивость к бластицидина), bsd (ген деаминазы, обеспечивающий устойчивость к бластицидина-S), bsr (ген устойчивости к бластицидину-S), Sh ble (ген устойчивости к Zeocin®), гигромицинфосфотрансфераза (hpt) (ген устойчивости к гигромицину), tetM (ген устойчивости к тетрациклину, или tetR), неомицинфосфотрансфераза II (npt) (ген устойчивости к неомицину, или neoR), kanR (ген устойчивости к канамицину), и рас (ген устойчивости к пуромицину). Селектируемые (или селективные) маркеры, как правило, используют в разработке стабильных клеточных линий.
Согласно определенным вариантам осуществления вектор содержит один или несколько генов селектируемых маркеров, выбранных из группы, состоящей из bla, bls, BSD, bsr, Sh ble, hpt, tetR, tetM, npt, kanR и рас. Согласно другим вариантам осуществления вектор содержит один или несколько генов селектируемых маркеров, кодирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), синий флуоресцентный белок (CFP), усиленный синий флуоресцентный белок (eCFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) или подобное.
Для целей настоящего изобретения экспрессию генов в эукариотических клетках можно точно регулировать с использованием сильного промотора, который контролируется оператором, который, в свою очередь, регулируется регуляторным слитым белком (RFP). RFP состоит по существу из блокирующего транскрипцию домена и лигандсвязывающего домена, который регулирует его активность. Примеры таких экспрессионных систем описаны в US20090162901A1, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Используемый в настоящем документе термин оператор относится к последовательности ДНК, которую вводят в ген или рядом с геном, представляющим интерес, таким образом, чтобы ген мог регулироваться путем связывания RFP с оператором и в результате предотвращать или разрешать транскрипцию представляющего интерес гена. Ряд операторов в прокариотических клетках и бактериофагах был хорошо охарактеризован (Neidhardt, ed. Escherichia coli and Salmonella; Cellular and Molecular Biology 2d. Vol 2 ASM Press, Washington D.C. 1996). Они включают в себя без ограничения операторную область гена LexA E. coli, которая связывает пептид LexA, и операторы лактозы и триптофана, которые связывают репрессорные белки, кодируемые генами LacI и trpR E. coli. Также они включают в себя операторы бактериофагов из лямбда PR и генов ant/mnt фага Р22, которые связывают репрессорные белки, кодируемые лямбда cI и Р22 arc. Согласно некоторым вариантам осуществления, в которых блокирующий транскрипцию домен RFP представляет собой рестрикционный фермент, такой как NotI, оператор представляет собой последовательность распознавания для этого фермента. Специалисту в настоящей области техники понятно, что оператор должен быть расположен рядом, или 3' относительно промотора так, чтобы он был способен контролировать транскрипцию с помощью промотора. Например, в патенте США № 5972650, который включен в настоящий документ посредством ссылки, раскрыто, что последовательности tetO находятся в пределах конкретного расстояния от ТАТА - бокса.
Согласно определенным вариантам осуществления оператор выбран из группы, состоящей из следующего: оператор tet (tetO), последовательность распознавания NotI, оператор LexA, оператор лактозы, оператор триптофана и оператор Arc (АО). Согласно некоторым вариантам осуществления репрессорный белок выбран из группы, состоящей из TetR, LexA, LacI, TrpR, Arc, LambdaC1 и GAL4. Согласно другим вариантам осуществления блокирующий транскрипцию домен происходит из эукариотического репрессорного белка, например, репрессорного домена, происходящего из GAL4.
В иллюстративной системе экспрессии клеток клетки конструируют для экспрессии репрессорного белка тетрациклина (TetR) и представляющий интерес полипептид помещают под транскрипционный контроль промотора, чья активность регулируется TetR. Два тандемных оператора TetR (tetO) располагают непосредственно ниже по ходу транскрипции промотора/энхансера CMV-MIE в векторе. Транс
- 13 045030 крипция гена, кодирующего представляющий интерес белок, направляемая промотором CMV-MIE, в таком векторе может блокироваться с помощью TetR при отсутствии тетрациклина или другого определенного подходящего индуктора (например, доксициклина). В присутствии индуктора белок TetR не способен связываться с tetO, следовательно, происходит транскрипция и, таким образом, трансляция (экспрессия) представляющего интерес полипептида. (См., например, патент США № 7435553, который полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.)
Такие системы экспрессии клеток можно использовать для запуска производства представляющего интерес полипептида только во время культивирования производственной культуры. Таким образом, антибиотики, такие тетрациклин или другие подходящие индукторы, можно добавлять в биореактор к первой клеточной культуре.
Другая иллюстративная система экспрессии клеток включает в себя регуляторные слитые белки, такие как слитый белок TetR-ERLBDT2, в котором блокирующий транскрипцию домен слитого белка представляет собой TetR, и лигандсвязывающий домен представляет собой лигандсвязывающий домен рецептора эстрогена (ERLBD) с мутациями Т2 (ERLBDT2; Feil et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:752-757). Если последовательности tetO расположены ниже по ходу транскрипции и рядом с сильным промотором CMV-MTE, транскрипция представляющей интерес нуклеотидной последовательности из промотора CMV-MIE/tetO блокировалась в присутствии тамоксифена, и это блокирование отменялось при удалении тамоксифена. В другом примере применение слитого белка Arc2-ERLBDT2, слитого белка, состоящего из одноцепочечного димера, состоящего из двух белков Arc, соединенных линкером из 15 аминокислотных остатков и ERLBDT2 (ранее), предусматривает оператор Arc (АО), более конкретно двух тандемные операторы а, непосредственно ниже по ходу транскрипции относительно промотора/энхансера CMV-MIE. Клеточные линии могут регулироваться с помощью Arc2-ERLBDT2, причем клетки, экспрессирующие представляющий интерес белок, управляются промотором CMV-MIE/ArcO2 и индуцируются удалением тамоксифена. (См., например, US 20090162901А1, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.) Согласно некоторым вариантам осуществления вектор содержит гибридный промотор CMV-MIE/TetO или CMV-MIE/AO2.
Подходящие векторы, используемые в способах согласно настоящему изобретению, также могут использовать инструменты Cre-lox для технологии рекомбинации для облегчения репликации представляющего интерес гена. Стратегия Cre-lox требует наличия по меньшей мере двух компонентов: 1) рекомбиназа Cre, фермент, который катализирует рекомбинацию между двумя сайтами loxP; и 2) сайты loxP (например, специфическая последовательность из 34 п.н., состоящая из 8 п.н. сердцевинной последовательности, где происходит рекомбинация, и двух фланкирующих по 13 п.н. инвертированных повторов) или мутантных сайтов lox. (Смотрите, например, Araki et al., 1995, PNAS 92:160-4; Nagy, A. et al., 2000, Genesis 26:99-109; Araki et al., 2002, Nuc Acids Res 30(19):e103; и US20100291626A1, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки). Согласно другой стратегии рекомбинации дрожжевая рекомбиназа FLP может быть использована с консенсусной последовательностью FRT (см. также, например, Dymecki, S., 1996, PNAS 93(12): 6191-6196).
Согласно другому аспекту ген (т.е. нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес рекомбинантный полипептид) введен в усиливающую экспрессию последовательность экспрессионной кассеты и необязательно функционально связан с промотором, причем связанный с промотором ген фланкирован 5' первым сайтом распознавания рекомбиназой и 3' вторым сайтом распознавания рекомбиназой. Такие сайты распознавания рекомбиназой обеспечивают опосредованную Cre рекомбинацию в клетке-хозяине экспрессионной системы. В некоторых случаях второй связанный с промотором ген расположен по ходу транскрипции (3') относительно первого гена и фланкирован 3' вторым сайтом распознавания рекомбиназой. В других случаях второй связанный с промотором ген фланкирован 5' вторым сайтом распознавания рекомбиназой и фланкирован 3'третьим вторым сайтом распознавания рекомбиназой. Согласно некоторым вариантам осуществления сайты распознавания рекомбиназой выбраны из сайта loxP, сайта lox511, сайта lox2272 и сайта FRT. Согласно другим вариантам осуществления сайты распознавания рекомбиназой являются различными. Согласно дополнительному варианту осуществления клетка-хозяин содержит ген, способный экспрессировать рекомбиназу Cre.
Согласно одному варианту осуществления вектор содержит первый ген, кодирующий легкую цепь антитела или тяжелую цепь антитела, представляющего интерес, и второй ген, кодирующий легкую цепь антитела или тяжелую цепь антитела, представляющего интерес.
Следует понимать, что один или несколько векторов, несущих одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих и экспрессирующих представляющий интерес белок, можно использовать в такой экспрессионной системе.
Клетки согласно настоящему изобретению также можно сконструировать для увеличения экспрессии продукта посредством коэкспрессии таких белков, как шапероны, ингибиторы апоптоза, ингибиторы распада белка или другой белок, который может усиливать экспрессию или стабильность продукта.
Согласно некоторым вариантам осуществления вектор дополнительно содержит ген связывающегося с Х-боксом белка 1 (mXBP1) и/или EDEM2, способный усиливать производство белка/секрецию белка посредством контроля за экспрессией генов, вовлеченных в укладку белка в эндоплазматическом рети- 14 045030 кулуме (ER). (См., например, Ron D, and Walter P., 2007, Nat Rev Mol Cell Biol.8:519-529; Olivari et al.,
2005, J. Biol. Chem. 280(4): 2424-2428, Vembar and Brodsky, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 9(12): 944-957, 2008).
Применение временно трансфицированных клеток, которые быстро производят значительные количества продукта, также можно осуществить для оптимизации процесса культивирования клеток, хотя стабильную трансфекцию, как правило, используют для промышленных масштабов производства большого объема.
В контексте настоящего изобретения характеризующаяся метаболическим сдвигом клетка может содержать любой или все элементы системы экспрессии клеток, описанные в настоящем документе, необходимые для эффективного рекомбинантного производства представляющего интерес белка.
Согласно дополнительному аспекту настоящее изобретение относится к характеризующейся метаболическим сдвигом рекомбинантной эукариотической клетке - хозяину, которая производит представляющий интерес белок. Примеры клеток-хозяев включают в себя клетки млекопитающего, такие как СНО, PER.C6, мышиные лимфоидные и мышиные гибридомные клеточные линии (ранее). Например, согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение предусматривает характеризующуюся метаболическим сдвигом клетку, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, стабильно интегрированную в клеточный геном, которая содержит последовательность, кодирующую представляющий интерес белок. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение предусматривает характеризующуюся метаболическим сдвигом клетку, содержащую неинтегрированную (т.е. эписомальную) последовательность нуклеиновой кислоты, такую как плазмида, космида, фагемида или линейный экспрессионный элемент, который содержит последовательность, кодирующую представляющий интерес белок.
Сбор или сбор клеток происходит в конце производственной серии в процессе накопления клеточной массы. Клетки отделяют от среды с помощью ряда способов, таких как фильтрация, инкапсулирование клеток, прилипание клеток на микрочипы, седиментация клеток или центрифугирование клеток. Очищение белка происходит в дополнительных стадиях для выделения белкового продукта. Полипептиды или белки можно собирать или из клеток, или из сред для культивирования клеток.
Стратегии очищения белков хорошо известны в настоящей области техники. Растворимые формы полипептида, такие как антитела, антителосвязывающие фрагменты и Fc-содержащие белки, могут быть подвергнуты действию коммерчески доступным концентрационным фильтрам и впоследствии могут быть аффинно очищены с помощью хорошо известных способов, таких как аффинные смолы, ионообменные смолы, хроматографические колонки и подобное. Связанные с мембранами формы полипептида могут быть очищены путем получения общей мембранной фракции из экспрессирующей клетки и экстракции мембран с помощью неионного детергента, такого как TRITON® Х-100 (EMD Biosciences, San Diego, СА, USA). Цитозольные или ядерные белки можно получить путем лизиса клеток-хозяев (посредством механического воздействия, обработки ультразвуком, детергентом и т.д.), удаления фракции клеточных мембран путем центрифугирования и сохранения супернатанта.
Согласно дополнительному аспекту настоящее изобретение относится к способу получения представляющего интерес антитела, или антигенсвязывающего белка, или слитого белка, причем указанный способ предусматривает следующие стадии: а) культивирование клеток согласно способу, описанному в настоящем документе выше, b) сбор клеток и с) очищение полипептида или белка, такого как антитело, или антигенсвязывающий белок, или слитый белок, от клеток или сред для культивирования клеток.
Следующие примеры представлены для описания специалистам в настоящей области техники, как осуществить и применить способы и композиции согласно настоящему изобретению, и не предусмотрено, что они ограничивают объем того, что авторы настоящего изобретения рассматривают как свое изобретение. Были предприняты попытки обеспечить точность используемых числовых выражений (например, количеств, концентраций, температуры и т.д.), однако следует принимать во внимание некоторые экспериментальные погрешности и отклонения.
Примеры
Пример 1. Определение параметров метаболического сдвига: производящая слитый белок клеточная линия.
Клетки СНО трансфектировали ДНК, экспрессирующей слитый белок. Производящую слитый белок клеточную линию СНО инкубировали в культуре посевного сосуда, в патентованных средах, содержащий сою, и такие параметры, как значение рН в режиме реального времени, содержание лактата и количество жизнеспособных клеток в автономном режиме, измеряли и регистрировали для определения метаболического статуса (см. № 1, № 2 или № 3 на фиг. 1А). Использование основания также подвергали мониторингу и нормировали к 1 для указанной клеточной линии (также смотрите фиг. 1А).
Клетки при условии № 1 и условии № 2 использовали для инокуляции производственных биореакторов в параллелях, когда значение рН контролировалось на нижнем пределе контрольного диапазона и содержание лактата и VCC увеличивались. Клетки при условии № 3 инокулировали, когда значение рН начинало увеличиваться выше нижнего предела контрольного диапазона, т.е. прекращали использование основания, что указывало на реметаболизацию лактата (т.е. потребление). Рост клеток при условии № 3 выходил из фазы, следующей за фазой экспотенциального роста. Все производственные биореакторы
-
Claims (14)
- функционировали при одинаковых эксплуатационных условиях.Титр продукта (см. фиг. 1В) и профили лактата (см. фиг. 1С) измеряли в каждом производственном биореакторе с использованием известных способов для определения воздействия метаболического статуса № 1, № 2 или № 3 в системе посевных ферментеров. Линии, отражающие основную тенденцию производственного биореактора, представляли среднее от биореакторов в двух параллелях с планками погрешностей, представляющих ± одно стандартное отклонение.Клетки при условии № 3 характеризовались наиболее значительным эффектом на продуктивность и накопление лактата во второй клеточной культуре, давая в результате больше чем в 2 раза увеличение титра продукта (по сравнению с условиями № 1 и № 2), в производственном биореакторе (см. фиг. 1В). Клетки при условии № 3 также давали в результате сниженную концентрацию лактата после переноса во вторую клеточную культуру (по сравнению с условиями № 1 и № 2 - см. фиг. 1С). Клетки при условии № 3 характеризовались профилем лактата, указывающим на чистое потребление лактата (см. фиг. 1С на 8-12 дни культивирования клеточной культуры). Клетки, перенесенные из первой культуры при условии № 1 (т.е. перед метаболическим сдвигом в первой культуре) не достигают чистого потребления лактата в производственном биореакторе.Пример 2. Определение параметров метаболического сдвига: производящая антитело клеточная линия.Сосуд для посева производящей антитело клеточной линии СНО использовали для инокуляции производственных биореакторов в параллелях аналогично примеру 1, но в среде с установленным химическим составом. Измеряли четыре различных метаболических статуса (мониторинг в автономном режиме значения рН, содержания лактата и количества жизнеспособных клеток - см. № 1, № 2, № 3 и № 4 на фиг. 2А). Значение VCC продолжало увеличиваться в течение всей инкубации в посевном сосуде, если инокулировали производственные биореакторы.Условие № 1 инокулировали очень рано в системе посевных ферментеров, когда значение рН оставалось на верхнем пределе контрольного диапазона и когда содержание лактата было низким, но увеличивалось. Условие № 2 инокулировали, когда значение рН начинало снижаться и содержание лактата увеличивалось и достигало максимальных уровней. Условие № 3 инокулировали, когда значение рН было близко нижнему пределу контрольного диапазона, и содержание лактата вышло на плато. Условие № 4 инокулировали, когда значение рН начало уменьшаться ниже нижнего предела контрольного диапазона и во время реметаболизации лактата (т.е. потребления лактата). Все производственные биореакторы функционировали при одинаковых эксплуатационных условиях. Условие № 1 утрачивалось через одну неделю.Определяли воздействие метаболического статуса в системе посевных ферментеров на титр в производственном биореакторе (фиг. 2В) и профили лактата (фиг. 2С). Линии, отражающие основную тенденцию производственного биореактора, представляли среднее от биореакторов в двух параллелях с планками погрешностей, представляющих ± одно стандартное отклонение.Клетки при условии № 3 и № 4 характеризовались наиболее значительным эффектом на продуктивность во второй клеточной культуре. Клетки при условии № 3 и № 4 также давали в результате сниженную концентрацию лактата в производственном биореакторе (по сравнению с условиями № 1 и № 2), что указывает на метаболический фенотип, направленный на потребления лактата (см. фиг. 2В и 2С). Аналогично примеру 2, клетки, перенесенные из первой культуры при условии № 1, не достигают чистого потребления лактата в течение фазы образования продукта. Условия № 2, № 3 и № 4 достигают чистого потребления лактата в течение фазы образования продукта, тем не менее условие № 4 является наиболее оптимальным, поскольку чистое потребление лактата происходит раньше, чем при других условиях, и максимальное содержание лактата является наименьшим.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ культивирования клеток, предусматривающий:(a) культивирование клеток в первой клеточной культуре, (b) измерение концентрации лактата в указанной первой клеточной культуре, (c) определение того, что в первой клеточной культуре произошел метаболический сдвиг на потребление лактата, и (d) перенос клеток первой клеточной культуры во вторую клеточную культуру после того, как произошел метаболический сдвиг на потребление лактата в первой клеточной культуре, при этом метаболический сдвиг происходит, когда уровни содержания лактата выходят на плато в первой клеточной культуре; и при этом культивирование второй клеточной культуры проводят в другом сосуде для культивирования, чем первой клеточной культуры.
- 2. Способ по п.1, при котором клетки трансфицируют ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, перед культивированием клеток в первой клеточной культуре, и дополнительно предусматривающий поддержание второй клеточной культуры в условиях, которые обеспечивают экспрессию представляющего интерес полипептида, и сбор представляющего интерес полипептида из второй кле-- 16 045030 точной культуры.
- 3. Способ по п.1 или п.2, при котором метаболический сдвиг на потребление лактата обнаруживают путем измерений значения рН, содержания лактата или основания в первой клеточной культуре.
- 4. Способ по любому из пп.1-3, при котором метаболический сдвиг на потребление лактата обнаруживают по увеличению значения рН в первой среде для культивирования клеток без добавления основания.
- 5. Способ по любому из пп.1-3, при котором метаболический сдвиг определяют в первой клеточной культуре, когда чистое накопление лактата замедляется или прекращается.
- 6. Способ по любому из пп.1-5, при котором метаболический сдвиг происходит, когда клетки выходят из фазы логарифмического роста или достигли стационарной фазы в первой клеточной культуре.
- 7. Способ по любому из пп.1-6, при котором:(i) метаболический сдвиг происходит в первой клеточной культуре на 3 день или через 3 дня роста клеток в первой клеточной культуре;(ii) перенесенные клетки характеризуются инокуляционной плотностью клеток, составляющей от приблизительно 0,5x106 клеток/мл до приблизительно 3,0x106 клеток/мл во второй клеточной культуре; и/или (iii) стадия определения метаболического сдвига предусматривает:a) измерение рН в первой клеточной культуре,b) добавление основания для поддержания рН выше заданного нижнего предела,c) обнаружение того, что значение рН превышает заданный нижний предел в течение последовательных временных интервалов, иd) прекращение добавления основания, тем самым, определяя, что произошел метаболический сдвиг на потребление лактата в первой клеточной культуре.
- 8. Способ по любому из пп.1-7, при котором первая клеточная культура представляет собой культуру в системе посевных ферментеров.
- 9. Способ по любому из пп.1-8, при котором вторая клеточная культура представляет собой производственную культуру.
- 10. Способ по любому из пп.1-9, при котором перенос клеток во вторую клеточную культуру предусматривает перенос клеток в производственный биореактор.
- 11. Способ по любому из пп.1-10, при котором популяцию клеток из первой клеточной культуры переносят во вторую клеточную культуру так что первая клеточная культура представляет собой фракцию второй клеточной культуры.
- 12. Способ по любому из пп.1-11, при котором:(i) одна или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты стабильно интегрированы в клеточный геном клеток, и причем последовательности нуклеиновой кислоты кодируют представляющий интерес полипептид; или (ii) клетки содержат один или несколько экспрессионных векторов, кодирующих представляющий интерес полипептид.
- 13. Способ по любому из пп.2-12, при котором представляющий интерес полипептид выбран из группы, состоящей из антитела, антигенсвязывающего белка и слитого белка.
- 14. Способ по любому из пп.1-13, причем клетки выбраны из группы, состоящей из клеток СНО, COS, ретинальных клеток, клеток Vera, CV1, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431, CV-1, U937, 3Т3, клетки L, клетки С127, клеток SP2/0, NS-0, ММТ, PER.C6, лимфоидных и мышиных гибридомных клеток.-
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61/889,815 | 2013-10-11 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA045030B1 true EA045030B1 (ru) | 2023-10-26 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2021200193B2 (en) | Metabolically optimized cell culture | |
US9670519B2 (en) | Methods for reducing accumulation of lactate during culturing and method for producing polypeptide | |
US20160244726A1 (en) | Metabolically optimized cell culture | |
US20220315644A1 (en) | Metabolically optimized cell culture | |
EA045030B1 (ru) | Метаболически оптимизированная клеточная культура | |
EA040764B1 (ru) | Метаболически оптимизированная клеточная культура | |
US20150252385A1 (en) | Methods for Producing Recombinant Proteins |