KR102358807B1

KR102358807B1 - 대사적으로 최적화된 세포 배양

Info

Publication number: KR102358807B1
Application number: KR1020217011547A
Authority: KR
Inventors: 숀 로렌스; 앤 킴; 에이미 죤슨
Original assignee: 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2013-10-11
Filing date: 2014-10-10
Publication date: 2022-02-08
Also published as: EA033783B1; KR102510238B1; KR20160062032A; JP6967620B2; HK1223122A1; CN114717196A; EA201991976A1; AU2014331776B2; IL244511A0; EP3055409A1; KR20230038324A; JP2022009453A; CA2926049C; JP2016532457A; AU2021200193B2; KR102243980B1; CA2926049A1; AU2014331776A1; HUE051049T2; WO2015054554A1

Abstract

세포 배양에서 단백질 및/또는 폴리펩타이드의 대규모 생산을 위한 개선된 방법이 제공된다. 본 발명에 따르면, 방법은 대사적으로 전환된 세포를 배양하는 단계를 제공한다. 이러한 방법 또는 시스템의 사용은 높은 수준의 단백질 또는 폴리펩타이드 생산을 허용하고 락테이트와 같이 원하지 않는 대사 폐기물의 축적을 감소시킨다. 본 발명에 따라 발현된 단백질 및 폴리펩타이드는 약학적, 면역원성, 또는 다른 상업적인 생물학적 조성물, 예를 들어, 항체의 제조에 유익하게 사용될 수도 있다.

Description

대사적으로 최적화된 세포 배양{METABOLICALLY OPTIMIZED CELL CULTURE}

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 35 USC § 119(e) 하에 2013년 10월 11일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/889,815의 이익을 주장하며, 그 출원은 특히 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본 발명의 분야

본 발명은 세포 배양에서 락테이트 소모로 대사적으로 전환되는 세포에 관한 것이다. 시드 트레인(seed train) 배양에서 락테이트 소모 대사 프로파일로의 전환은 생산 배양에 대하여 유익한 효과를 가지고 있다. 생산 반응기의 접종시, 세포는 유가(fed-batch) 포유동물 세포 배양에서 낮은 락테이트 생산 속도, 낮은 최대 락테이트 수준, 락테이트 소모로의 조기 전환, 및 이후 증가된 생산성으로 더 효율적인 락테이트 대사작용을 나타낸다. 따라서, 세포 배양에서 단백질 및/또는 폴리펩타이드의 대규모 생산을 위한 개선된 방법이 제공된다.

생물학적 작용제, 특히 단백질 및 폴리펩타이드는 새로운 의약품으로서 자주 개발되고 있다. 매우 높은 수준의 원하는 특정 단백질을 생산하는 조작된 세포들은 이 약학적 개입의 성공적인 상업적 생산을 위해 매우 중요해진다. 세포 배양 조건의 제어 및 최적화는 각기 다르며 배양에서 생산된 치료 단백질의 수준 및 품질에 큰 영향을 미친다.

배취(batch) 또는 유가 공정에서 세포 배양을 통해 단백질을 제조하는 것이 일반적이다. 바이알 해동 후 접종물 성장의 초기 스테이지는 시드 배양에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 세포는 세포 집단의 크기 및/또는 부피를 점진적으로 증가시키기 위해, 예를 들어, 시드 트레인 생물반응기에서 지수 성장 속도로 성장한다. 세포량이 여러 생물반응기 스테이지를 통해 증가된 후, 세포는 이어서 생산 생물반응기로 옮겨지는 한편 세포는 여전히 지수 성장 중에 있다 (로그 기(log phase)) (Gambhir, A. et al., 2003, J Bioscience Bioeng 95(4):317-327). 일반적으로 배취 배양, 예를 들어, 시드 배양에서 세포가 로그 기를 지나 정지 기(stationary phase)로 이동하게 하는 것은 바람직하지 않은 것으로 간주된다. 배양물은, 다른 이유들 중에서, 세포, 예를 들어, 부착 세포가 접촉 억제로 인해 밀집에 도달하거나 폐기물의 축적이 세포 성장을 억제하기 전에, 그것들이 로그 기에 있는 동안 계대배양되어야 한다고 추천되었다 (Cell Culture Basics, Gibco/Invitrogen Online Handbook, www.invitrogen.com; ATCC® Animal Cell Culture Guide, www.atcc.org).

유가 배양으로 옮긴 후, 세포는 일정 기간 동안 배양되는 반면에, 배지의 조성이 모니터링(monitor)되고 원하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 생산을 허용하도록 제어된다. 특정 수율에 도달되거나 세포 생존률, 폐기물 축적 또는 영양소 고갈이 배양이 종료되어야 한다는 것을 결정한 후에, 생산된 단백질 또는 폴리펩타이드가 분리된다. 지난 10년 동안 재조합 단백질 수율을 개선하려는 많은 큰 발전이 이루어졌는데, 이는 현재 리터 당 몇 그램의 역가에 도달한다. 단백질 제조 공정, 뿐만 아니라 세포주 조작에서의 발전, 및 세포 배양 배지 및 사료 개발이 단백질 수율의 증가에 기여하였다.

유가 생산은 세포 성장 및 생성물 생산이 진행함에 따라 생물반응기에 존재하는 영양소를 보충하기 위해 소량의 사료의 첨가를 수반한다. 일반적으로, 포유동물 세포는 탄수화물을 지속적으로 대사시켜서 락테이트 축적을 일으키는 성향이 있으며, 따라서 젖산을 중화시키기 위해 염기의 첨가가 필요하다고 생각된다. 염기 첨가는 세포 배지에서 삼투압을 증가시키는데 이는 결국 생물반응기에서 전체적으로 달성 가능한 세포 생존률 및/또는 생산성을 크게 제한한다. 배지에서 락테이트의 축적은 세포 성장에 해로우며 배취 배양에서 달성될 수 있는 최대 생산성을 제한하는 일반적인 인자 중 하나이다. 전형적인 배취 세포 배양에서, 성장 및 생산성은 배양에서 락테이트 농도가 대략 30-50 mM에 도달하고 및/또는 암모니아 농도가 3-5 mM에 도달한 후 억제된다 (Ozturk, S.S., Riley, M.R., and Palsson, B.O. 1992. Biotechnol. and Bioeng. 39: 418-431). 현재까지, 널리 이용된 전략은 지속적인 세포 성장 및 최적의 생성물 분비를 지지하기 위해 영양소 보충 및 화학적으로 한정된, 무혈청 배지의 설계를 포함한다.

세포 배양에서, 대사 폐기물의 생산량, 예를 들어, 락테이트의 축적의 감소와 특히 관련된 노력은 최종 단백질 역가의 전체적인 양을 개선하였다. 이 노력들은 제어된 글루코스 또는 영양소-제한된 유가 공정 (예를 들어, WO2004104186; US8192951B2 참조), 개선된 세포 배양 배지 조건 (예를 들어, US7390660; Zagari, et al., 2013, New Biotechnol., 30(2):238-45), 또는 해당 과정에서 효소의 표적화를 포함하는, 세포 조작 (예를 들어, Kim, S.H. and Lee, G.M., 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 152-159; Kim, S.H. and Lee, G.M., 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol. 76, 659-665; Wlaschin, K.F. and Hu, W-S., 2007, J. Biotechnol. 131,168-176)에 초점이 맞춰져 있다.

더 효율적인 대사 표현형에 도달하려는 노력으로 세포의 제어된 섭식이 이용된다 (Europa, A. F., et al., 2000, Biotechnol. Bioeng. 67:25-34; Cruz et al., 1999, Biotechnol Bioeng, 66(2):104-113; Zhou et al., 1997, Cytotechnology 24, 99-108; Xie and Wang, 1994, Biotechnol Bioeng, 43:1174-89). 하지만, 이는 영양소 결핍, 뿐만 아니라, 예를 들어, 높은 세포 밀도 유가 배양에서 보이는 암모니아 농도의 신속한 변화가 아폽토시스(apoptosis) ("예정된 세포 사멸")를 유발할 수 있다는 사실에 의해 복잡해진다 (Newland et al., 1994, Biotechnol. Bioeng. 43(5):434-8). 따라서, 일반적인 최적화 접근법은 유가에서 적당히 높은 밀도로 세포를 성장시키고, 예를 들어, 온도 또는 pH 변화에 의해 의도적으로 장기적, 생산적인 정지기를 유발하는 것이다 (Quek et al., 2010, Metab Eng 12(2):161-71. doi: 10.1016/j.ymben.2009.09.002. Epub 2009 Oct 13).

상기 논의된 것들과 같은 최적화 기술은 유가 세포 배양에 초점이 맞춰져 있으며 이 영양소-의존적 공정은 원하는 폴리펩타이드의 생산을 위해 조작된 각각의 숙주 세포에 적용되어야 한다. 배양에서 세포를 락테이트 소비자에 적용하는 방법이 생물학적 치료제를 제조하는 공정에 있어서 매우 바람직하다. 락테이트 소모에 대한 대사 표현형을 가진 세포주를 최적화하는 것이 폴리펩타이드의 상업적 생산에 유익한 것으로 입증될 것이다.

본 발명은 락테이트 소모로 대사적으로 전환된 세포 및 이 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 대사적으로 조정된 세포가 대규모 단백질 생산에 이상적이다.

본 발명의 한 양태는 세포에서 락테이트 소모로 대사적 전환이 제1 배양에서 일어난 후 세포를 제1 세포 배양에서 제2 세포 배양으로 옮기는 단계를 포함하는, 세포를 배양하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 양태는 제1 세포 배양에서 세포를 배양하는 단계, 세포에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 제1 세포 배양에서 일어났다는 것을 결정하는 단계, 및 세포에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어난 후 세포를 제2 세포 배양으로 옮기는 단계를 포함하는, 세포를 배양하는 방법을 제공하는데, 제2 세포 배양에서 락테이트 농도는 제2 배양 동안 순 락테이트 소모를 나타낸다. 한 구체예에서, 방법은 세포를 제2 세포 배양으로 옮기는 것이 제1 세포 배양에서 대사적 전환이 일어나기 전이라는 점을 제외하면 동일한 조건 하에 동일한 세포 배양에서 결정된 것과 비교하여 제2 세포 배양에서의 락테이트 축적의 감소를 더 제공한다.

본 발명의 두 번째 양태는 세포에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어난 후 세포를 제1 세포 배양에서 제2 세포 배양으로 옮기는 단계, 및 단백질이 세포 배양에서 축적되도록 일정한 기간 동안 제2 세포 배양을 유지하는 단계를 포함하는, 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 관련 양태에서, 본 발명은 제1 세포 배양에서 세포를 배양하는 단계, 세포에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 제1 세포 배양에서 일어났다는 것을 결정하는 단계, 세포에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어난 후 세포를 제2 세포 배양으로 옮기는 단계, 및 단백질이 세포 배양에 축적되도록 일정한 기간 동안 제2 세포 배양을 유지하는 단계를 포함하는, 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 방법은 세포를 제2 세포 배양으로 옮기는 것이 제1 세포 배양에서 대사적 전환이 일어나기 전이라는 점을 제외하면 동일한 조건 하에 동일한 세포 배양에서 결정된 것과 비교하여 제2 세포 배양에서의 생산성의 증가를 더 제공한다.

본 발명의 세 번째 양태는 제1 세포 배양에서 세포를 배양하는 단계, 세포량의 확장을 허용하는 조건 하에 제1 세포 배양을 유지하는 단계, 세포에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어난 후 세포를 제2 세포 배양으로 옮기는 단계, 원하는 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 하에 제2 세포 배양을 유지하는 단계, 및 제2 세포 배양으로부터 원하는 폴리펩타이드를 수득하는 단계를 포함하는, 개선된 세포 배양 방법을 제공하는데, 세포는 원하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 방법은 세포에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 제1 세포 배양에서 일어났다는 것을 결정하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 네 번째 양태는 세포 배양에서 개선된 폴리펩타이드 생산 방법을 제공하며, 세포를 원하는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션하는 단계, 제1 세포 배양에서 세포를 배양하는 단계, 세포에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어난 후 세포를 제2 세포 배양으로 옮기는 단계, 및 폴리펩타이드가 세포 배양에서 축적되도록 일정한 기간 동안 제2 세포 배양을 유지하는 단계를 포함하는데, 원하는 폴리펩타이드는 제2 세포 배양의 조건 하에 발현된다. 한 구체예에서, 방법은 세포에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 제1 세포 배양에서 일어났다는 것을 결정하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 다섯 번째 양태는 대사적으로 전환된 세포주를 생산하는 방법을 제공하며, 세포량의 확장을 허용하는 조건 하에 제1 세포 배양에서 세포 집단을 유지하는 단계, 세포에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어났을 때를 결정하는 단계, 세포에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어난 후 세포 집단의 일부를 제1 세포 배양에서 제2 세포 배양으로 옮기는 단계, 일정한 기간 동안 제2 세포 배양에서 세포 집단을 유지하는 단계, 및 임의로 세포를 수득하여 대사적으로 전환된 세포주를 생산하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 본원에서 개시된 본 발명의 방법 중 어느 것에 의해서도 생산되는, 대사적으로 전환된 세포주를 제공한다.

일부 구체예에서, 대사적으로 전환된 세포는 세포 게놈으로 안정하게 통합된 핵산 서열을 포함하는데 핵산 서열은 원하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화한다. 다른 구체예에서, 대사적으로 전환된 세포는 원하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 발현 벡터를 포함한다.

한 구체예에서, 락테이트 소모로의 대사적 전환은 제1 세포 배양에서 pH, 락테이트 또는 염기 측정에 의해 검출된다. 다른 구체예에서, 세포는 락테이트 소모가 검출될 때 제2 세포 배양으로 옮겨진다. 또 다른 구체예에서, 락테이트 소모로의 대사적 전환은 염기의 첨가 없이 제1 세포 배양 배지의 pH가 증가한 후 검출된다. 다른 구체예에서, 락테이트 소모로의 대사적 전환은 제1 세포 배양에서 락테이트 수준이 안정 상태일 때 검출된다. 또 다른 구체예에서, 방법은 제1 세포 배양에서 pH를 측정하는 단계, 염기를 첨가하여 미리 결정된 하한보다 높은 pH를 유지하는 단계, 연속적인 간격으로 pH가 미리 결정된 하한보다 높은지를 결정하는 단계, 및 염기의 첨가를 중단하고, 이로 인해 락테이트 소모로의 대사적 전환이 제1 세포 배양에서 일어난다는 것을 결정하는 단계를 포함하는, 대사적 전환을 결정하는 단계를 더 포함한다.

다른 구체예에서, 락테이트 소모로의 대사적 전환은 세포 대사작용의 지표 또는 생성물에 의해 검출되며, 산소 소모, 및 글리신, 트립토판, 페닐알라닌, 아데닌, 팔미트산, 글루탐산, 메티오닌 및 아스파라긴과 같은 대사산물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 락테이트 소모로의 대사적 전환은 대사체학적 분석 또는 단백질체학적 분석에 의해 검출된다.

한 구체예에서, 대사적 전환은 제1 세포 배양에서 세포가 로그 기 (즉, 지수 성장)에서 벗어날 때 일어난다. 또 다른 구체예에서, 제1 세포 배양에서 세포가 로그 기로부터 벗어난 후 세포가 옮겨진다.

또 다른 구체예에서, 대사적 전환은 제1 세포 배양에서 세포가 정지 성장 기에 도달했을 때 일어난다. 또 다른 구체예에서, 제1 세포 배양에서 세포가 정지 성장 기에 도달한 후 세포가 옮겨진다.

한 구체예에서, 대사적 전환은 제1 세포 배양에서 세포 성장 3일 또는 그 이후에 제1 세포 배양에서 일어난다. 또 다른 구체예에서, 대사적 전환은 제1 세포 배양에서 세포 성장 3.5일 또는 그 이후에 제1 세포 배양에서 일어난다.

일부 구체예에서, 제1 세포 배양은 시드 배양이다. 일부 구체예에서, 제2 세포 배양은 유가 배양이다. 다른 구체예에서, 제2 세포 배양은 생산 배양이다. 다른 구체예에서, 제2 세포 배양은 생산 생물반응기에서 수행된다.

또 다른 구체예에서, 세포는 약 0.5 x 10⁶ 세포/mL 이상의 시작 세포 밀도에서 제2 세포 배양으로 옮겨진다. 일부 구체예에서, 세포는 약 0.5-3.0 x 10⁶ 세포/mL의 시작 세포 밀도에서 제2 세포 배양으로 옮겨진다.

일부 구체예에서, 제2 세포 배양에서 락테이트 농도는 순 락테이트 소모를 나타내는데, 예를 들어, 순 락테이트 소모는 제2 세포 배양에서 세포 성장 2일, 3일, 4일, 또는 5일 또는 그 이후에 달성된다. 더 많은 구체예에서, 제2 세포 배양에서 락테이트 축적의 감소는 최대 락테이트 농도의 감소이다. 다른 구체예에서, 제2 세포 배양에서 최대 락테이트 농도의 감소는 제2 세포 배양에서 세포 성장 5일 또는 그 이후에 일어난다. 다른 구체예에서, 제2 세포 배양에서 최대 락테이트 농도는 약 6 g/L, 5 g/L, 4 g/L, 3 g/L, 2 g/L 미만, 또는 약 1 g/L 미만이다.

본 발명의 일부 구체예에서, 세포 또는 세포들은 CHO, COS, 망막 세포, Vero, CV1, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431, CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT, PER.C6, 쥐 림프구 세포, 및 쥐 하이브리도마(hybridoma) 세포로 구성되는 군으로부터 선택된다.

도 1: 융합 단백질-생산 CHO 세포주 시드 용기(seed vessel)는 (도. 1A) 세 가지 다른 대사 상태 (온라인 pH 및 오프라인 락테이트) 및 생균 수 (VCC)에서 복제 생산 생물반응기에 접종하는데 사용되었다. 시드 용기에 대하여 1로 표준화된 염기 사용이 또한 나타난다. 세포가 생산 생물반응기로 옮겨지는 각 세포 배양 (조건 #1, #2, 및 #3)에 대한 파라미터 (시간, pH, 락테이트, VCC, 및 염기)는 열린 직사각형 (점선)으로 나타난다. 모든 생산 생물반응기는 같은 작동 조건으로 작동되었다. 생산 생물반응기에서 단백질 역가 (도 1B) 및 락테이트 (도 1C)에 대한 각 시드 트레인 및 그것의 대사 상태의 영향이 나타난다. 생산 생물반응기 추세선은 ± 1 표준 편차를 나타내는 에러 바(error bar)와 함께 2배수 생물반응기의 평균을 나타낸다.
도 2: 항체-생산 CHO 세포주 시드 용기는 네 가지 다른 대사 상태 (오프라인 pH 및 락테이트) 및 생균 수에서 화학적으로 한정된 공정으로 복제 생산 생물반응기에 접종하는데 사용되었다. 세포가 생산 생물반응기로 옮겨지는 각 세포 배양 (조건 #1, #2, #3 및 #4)에 대한 파라미터 (시간, pH, 락테이트, 및 VCC)는 개방형 직사각형 (점선)으로 나타난다. 모든 생산 생물반응기는 같은 작동 조건으로 작동되었다. 조건 #1은 1주 후에 분실되었다. 생산 생물반응기 단백질 역가 (도 2B) 및 락테이트 축적 (도 2C)에 대한 각 시드 트레인 및 그것의 대사 상태의 영향이 또한 나타난다. 생산 생물 반응기 추세선은 ± 1 표준 편차를 나타내는 에러 바와 함께 2배수 생물반응기의 평균을 나타낸다.

본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 제한되지 않는 것으로 생각되어야 하며, 이와 같이 방법 및 조건은 달라질 수도 있다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술하려는 목적을 위한 것이며, 제한하려는 것이 아닌데, 본 발명의 범위는 청구범위에 의해 한정되기 때문이다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "한", "하나", 및 "그"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서 예를 들어, "방법"에 대한 지시대상은 하나 이상의 방법들, 및/또는 본원에서 기술되고 및/또는 본 개시물의 판독시 당업자에게 분명해지는 유형의 단계들을 포함한다.

달리 한정되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 업계의 당업자에 의해 보통 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본원에서 기술된 것과 유사하거나 동등한 어떤 방법 및 재료도 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 재료가 지금 기술된다. 본원에서 언급된 모든 간행물은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

세포 배양

본원에서 사용된 "배취 배양" 또는 "배취 방식"은 세포 및 교환된 적이 없는 초기 전체 작동 부피의 배지로 채워진 유닛 (예를 들어, 배양 용기)을 말하는 구절이다. 이러한 배취 배양에서, 세포 배양을 위한 모든 구성요소가 배양 공정의 시작시 배양 용기에 공급된다. 배양은 보통 영양소가 고갈되거나 폐기물이 독성 수준에 도달하여 세포가 성장을 멈출 때까지 실행된다.

본원에서 사용된 구절 "시드 배양" 또는 "시드 트레인" (접종물 트레인으로도 불림)은 생산 규모에 대하여 준비될 때까지, 배취 배양, 또는 일련의 배취 배양에서 확장하는 것이 허용된 세포 집단의 접종원을 포함한다. 시드 트레인 확장 공정은 냉동된 세포의 해동 후, 세포의 초기 성장기, 또는 접종물 성장기를 구성한다. 세포 해동과 생산 생물반응기에 접종하는데 충분한 세포량의 축적 사이의 간격은 시드 트레인 확장 기를 구성한다. 세포량은 시드 배양에서 여러 생물반응기 스테이지를 통해 확대될 수도 있고, 세포는 세포 배양물의 생존, 성장 및 생존률에 바람직한 조건 하에 세포 배양 배지에서 키워진다. 시드 트레인은 배양되고 있는 특정 세포 유형에 대하여 지수 성장기를 최대화하거나, 최대 성장 속도를 달성하기 위한 것이라고 생각된다. 그러므로, 한 생물반응기 또는 용기에서 또 다른 것으로 세포의 계대배양은 최대 성장 속도를 달성하기 위한 하나의 방법일 수도 있다. 정확한 조건은 세포 유형, 세포가 유래된 유기체, 및 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질의 성질 및 특징에 따라 다를 것이다. 락테이트 소모 대사작용으로의 전환은 시드 트레인 확장에서 용기 중 어느 하나에서 일어나거나 검출될 수도 있다.

구절 "유가 세포 배양" 또는 "유가 배양"은 본원에서 사용될 때 동물 세포 및 배양 배지가 처음 배양 용기에 공급되고, 배양의 종료 전에, 주기적으로 세포 및/또는 생성물을 수득하거나 또는 하지 않으면서, 배양 중에 추가적인 배양 영양소가 지속적으로 또는 불연속 증분적으로 천천히 배지에 공급되는 배취 배양을 말한다. 유가 배양은, 주기적으로 전체 배양물 (이것은 세포 및 배지를 포함할 수도 있음)이 제거되고 새로운 배지로 대체되는 "반연속적 유가 배양"을 포함한다. 유가 배양은 단순한 "배취 배양"과 구별되는 반면 배취 배양시 세포 배양을 위한 모든 구성요소 (동물 세포 및 모든 배양 영양소 포함)가 배양 공정의 시작시 배양 용기로 공급된다. 유가 배양은 공정 중에 상층액이 배양 용기로부터 제거되지 않는 한 관류 배양과 더 구별될 수 있는 반면, 관류 배양에서, 세포는 배양에서, 예를 들어, 여과에 의해 억제되고, 배양 배지가 지속적으로 또는 간헐적으로 도입되어 배양 용기로부터 제거된다. 하지만, 유가 세포 배양 중에 테스트 목적을 위해 샘플의 제거가 고려된다. 유가 공정은 최대 작동 부피 및/또는 단백질 생산량에 도달한 것으로 결정될 때까지 계속된다.

구절 "지속적 세포 배양"은 본원에서 사용될 때, 보통 특정 성장기에서, 지속적으로 세포를 키우는데 사용된 기술에 관한 것이다. 예를 들어, 세포의 일정한 공급이 필요하거나, 원하는 특정 폴리펩타이드 또는 단백질의 생산이 필요하면, 세포 배양은 성장의 특정 기에서의 유지가 필요할 수도 있다. 따라서, 조건은 상기 특정 기에서 세포를 유지하기 위해 지속적으로 모니터링되고 그에 따라 조정되어야 한다.

본원에서 사용된 구절 "로그 기"는 전형적으로 세포 더블링(doubling)을 특징으로 하는 세포 성장 주기를 의미한다. 구절 "지수 성장기" 또는 "지수 기"는 로그 기와 교체 가능하게 사용된다. 로그 기에서, 시간 단위 당 나타나는 새로운 세포의 수는 현재의 세포 집단에 비례하며, 이로 인해 시간에 대한 세포 수의 자연 로그의 플롯팅(plotting)은 직선을 생성한다. 성장이 제한되지 않으면, 더블링은 일정한 속도로 계속될 것이며 세포의 수 및 집단 증가의 속도는 각각의 연속적인 시간 간격으로 두 배로 증가한다.

본원에서 사용된 구절 "정지 기"는 세포 성장 속도와 세포 사멸 속도가 같은 시점을 말한다. 그래프 상에서 플롯팅될 때, 정지기는 안정 상태(plateau), 또는 곡선의 수평한 선 부분인, "스무드(smooth)"로 나타난다.

용어 "세포"는 본원에서 사용될 때 재조합 핵산 서열을 발현하는데 적합한 어떠한 세포도 포함한다. 세포는 진핵생물의 것, 예를 들어, 비-인간 동물 세포, 포유동물 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합체, 예를 들어, 하이브리도마 또는 콰드로마(quadroma)를 포함한다. 특정 구체예에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트 또는 마우스 세포이다. 다른 구체예에서, 세포는 다음 세포로부터 선택된다: CHO (예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장 (예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431 (표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 종양 세포, 및 상기 언급된 세포로부터 유래된 세포주. 일부 구체예에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자를 포함하는데, 예를 들어, 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포 (예를 들어, PER.C6® 세포)가 있다. 일부 구체예에서, 세포는 CHO 세포이다. 다른 구체예에서, 세포는 CHO K1 세포이다.

본원에서 사용된 "세포주"는 세포의 일련의 계대배양 또는 서브컬쳐(subculture)를 통해 특정 계통으로부터 유래된 세포 또는 세포들을 말한다. 용어 "세포"는 "세포 집단"과 교체 가능하게 사용된다.

현재 최첨단 섭식 전략을 고려해 볼 때, CHO 세포는 CHO 세포 유가 배양에 대하여 전형적인 산업 가치인 숫자인, 세포 수, 예를 들어, 11 x 10⁶ 세포/mL (제8 일) 및, 예를 들어, 2.3 g/L 인간 IgG의 역가 (제14 일에 수득됨)를 달성하였다 (Kim, BJ, et al. Biotechnol Bioeng. 2012 Jan;109(1):137-45. doi: 10.1002/bit.23289. Epub 2011 Oct 3). 중요한 산업용 포유동물 세포주로서 잘 확립된 CHO 세포로부터 10 g/L 이상의 항체 생산이 보고되었다 (Omasa et al, Current Pharmaceutical Biotechnology, 2010, 11: 233-240).

용어 "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 전형적으로 탄수화물 에너지원, 필수 아미노산, 미량 원소, 비타민, 등과 같이 세포의 성장을 향상시키기 위해 필요한 영양소를 공급하는, 포유동물 세포를 성장시키는데 사용된 배양액을 말한다. 세포 배양 배지는 추출물, 예를 들어, 혈청 또는 펩톤 (가수분해물)을 함유할 수도 있으며, 이것들은 세포 성장을 지지하는 원료를 공급한다. 배지는, 동물-유래 추출물 대신에, 효모-유래 또는 콩 추출물을 함유할 수도 있다. 화학적으로 한정된 배지는 모든 화학적 구성요소가 공지된 세포 배양 배지를 말한다. 화학적으로 한정된 배지는 동물-유래 구성요소, 예를 들어, 혈청- 또는 동물-유래 펩톤이 전혀 없다.

본 발명의 한 양태는 세포 배양 조건이 재조합 진핵생물 세포의 성장을 향상시키도록 변형되는 성장기에 관한 것이다. 성장기에서, 기본 배양 배지 및 세포가 배취의 배양 용기로 공급된다.

배양 용기에 세포가 접종된다. 초기 세포 성장기에 적합한 분주 밀도는, 예를 들어, 0.2 내지 3 x 10⁶ 세포/mL의 범위로, 시작 세포주에 따라 다르다. 배양 용기는 웰 플레이트, T-플라스크, 진탕 플라스크, 교반 용기, 스피너(spinner) 플라스크, 중공 섬유, 공기 부양식 생물반응기(air lift bioreactor), 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 세포 배양 용기는 생물반응기이다. 생물반응기는 환경적 조건을 조작하거나 제어하도록 제조되거나 조작되는 어떠한 배양 용기를 말한다. 이러한 배양 용기는 업계에 잘 공지되어 있다.

기체 교환을 최적화하고, 세포 성장 및 생산성을 유지하기에 충분한 산소를 공급하며, CO₂를 제거하기 위한 생물반응기 공정 및 시스템이 개발되었다. 기체 교환 효율의 유지는 세포 배양 및 단백질 생산의 성공적인 증가를 보장하기 위한 중요한 기준이다. 이러한 시스템은 당업자에게 잘 공지되어 있다.

지수 성장기 또는 시드 배양 (즉, 제1 세포 배양)은 전형적으로 폴리펩타이드 생산 기로 알려져 있는 별개의 제2 배양으로 이어진다. 한 구체예에서, 제1 세포 배양에서 락테이트 소모로의 대사적 전환을 거친 세포는 제2 세포 배양으로 옮겨진다. 한 구체예에서, 제2 세포 배양은 세포 성장기 또는 시드 배양과는 다른 배양 용기에서 수행된다. 일부 구체예에서, 제2 세포 배양은 생산 생물반응기에서 일어난다. 이 맥락에서, 세포의 이동은 제1 세포 배양 용기로부터 세포 집단의 분획의 추출 및 제2 세포 배양을 시작하기 위해 세포 집단 분획을 제2 세포 배양 용기에 배치하는 것을 말한다.

다른 양태에서, 세포의 이동은 제1 세포 배양의 세포를 함유하는 다량의 세포가 다른 용기에 배치되고 접종물 부피가 제2 세포 배양의 최종 부피의 일부, 예를 들어, 최종 부피의 약 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 또는 60%, 또는 70% 또는 80%인 것을 말할 수도 있다. 다른 양태에서, 세포의 이동은 제1 세포 배양의 세포를 함유하는 다량의 세포가 시작 용기에 남아있고 초기 부피 (제1 세포 배양)가 제2 세포 배양의 최종 부피의 분획이 되도록 배지가 추가되는 것을 말할 수도 있다. 이 맥락에서, 제1 세포 배양이 희석되며, 이로 인해 세포를 제2 세포 배양으로 옮긴다.

본원에서 사용된 구절 "~로부터 벗어나다" 또는 "~로부터 벗어나다"는 한 기에서 또 다른 기로의 변경, 또는 한 기에서 또 다른 기로의 변경하려는 것을 말한다. 특정 기, 예를 들어, 성장기로부터 벗어난다는 것은 측정값이 시간 주기를 포함하는데 척도는 첫 번째 기가 늦춰지고 있거나 거의 완료되어, 그 다음 기가 시작했음을 나타내는 기간을 포함한다. 예를 들어, 로그 기로부터 벗어난다는 것은 세포가 로그 기를 끝내고, 및/또는 정지 기를 시작하거나 이에 도달했음을 나타낸다. 성장기는 전형적으로 생존 세포 농도에 의해 측정된다.

구절 "세포 밀도"는, 예를 들어, mL 당 총 (생존 및 죽은) 세포의 수로서, 샘플 부피 당 세포의 수를 말한다. 세포의 수는 수동으로 또는 자동화에 의해, 예를 들어, 유동 세포 분석기로 계수될 수도 있다. 자동화된 세포 계수기는, 예를 들어, 표준 트립탄 블루 흡수 기술을 사용하여 생존 세포 또는 죽은 세포 또는 생존 세포/죽은 세포 둘 다의 수를 계수하도록 적용되었다. 구절 "생존 세포 밀도" 또는 "생존 세포 농도"는 샘플 부피 당 생존 세포의 수를 말한다 ("생존 세포 수"로도 불림). 많은 잘 공지된 수동 또는 자동화된 기술이 세포 밀도를 결정하는데 사용될 수도 있다. 배양의 온라인 바이오매스(biomass) 측정값이 측정될 수도 있으며, 정전 용량(capacitance) 또는 광학적 밀도는 부피 당 세포의 수와 연관성이 있다.

제1 세포 배양에서 최종 세포 밀도, 예를 들어, 시드 트레인 밀도는, 예를 들어, 약 1.0 내지 10 x 10⁶ 세포/mL의 범위로 시작 세포주에 따라 다르다. 일부 구체예에서, 최종 시드 트레인 밀도는 제2 세포 배양으로 세포 이동 전에 1.0 내지 10 x 10⁶ 세포/mL에 도달한다. 다른 구체예에서, 최종 시드 트레인 밀도는 제2 세포 배양으로 세포 이동 전에 5.0 내지 10 x 10⁶ 세포/mL에 도달한다.

일부 구체예에서, 제1 세포 배양의 세포 집단의 분획이 제2 세포 배양으로 옮겨진다. 다른 구체예에서, 제1 세포 배양의 세포 집단은 제1 세포 배양이 제 2세포 배양의 분획이 되도록 제2 세포 배양으로 옮겨진다. 제2 배양의 시작 세포 밀도는 당업자에 의해 선택될 수도 있다. 일부 구체예에서, 제2 세포 배양의 시작 세포 밀도는 약 0.5 x 10⁶ 세포/mL 내지 약 3.0 x 10⁶ 세포/mL이다. 다른 구체예에서, 제2 세포 배양의 시작 세포 밀도는 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 3.0 x 10⁶ 세포/mL이다.

특정 구체예에서, 세포 상층액 또는 세포 용해물이 생산 기 이후에 수득된다. 다른 구체예에서, 원하는 폴리펩타이드 또는 단백질이 업계에 공지된 기술을 사용하여 배양 배지 또는 세포 용해물로부터 회수된다.

세포의 속성 및 생산된 생성물의 위치는 성장 및 생산에 사용된 방법, 및 그 결과 적합한 유형의 생물반응기 또는 배양 용기의 선택을 나타낸다. (Bleckwenn, NA and Shiloach, J. 2004 "Large-scale cell culture" Curr Protoc Immunol. 59: Appendix 1U.1-Appendix 1U.44.)

대사적 전환

구절 "대사적 전환"은 본원에서 사용될 때 락테이트 생산에서 순 락테이트 소모로의 세포 대사작용의 변경, 또는 탄소 영양소 공급원의 사용을 말한다. 어느 한 이론에도 결부되지 않으면서, 무혈청 배지에서 가장 일반적인 탄소 영양소 공급원은 글루코스 및 글루타민이며, 이것들은 신속한 세포 성장을 지지한다. 글루코스는 CO₂ 및 H₂O로 완전히 산화될 수도 있거나, 또는 산소의 이용 가능성에 따라, 예를 들어, 호기성 해당 과정에서 락테이트로 전환될 수도 있다. 빨리 성장하는 세포들은 글루코스 및 글루타민을 빠르게 소모하며, 불완전 산화성 대사작용 및, 따라서, 과도한 락테이트 생산으로 이어진다. 탄수화물 대사작용은 락테이트 소모로 변환될 수도 있으며, 따라서 락테이트의 축적을 감소시킬 수도 있다.

구절 "락테이트 소모"는 본원에서 사용될 때 세포 대사작용에서 탄소 공급원으로서 락테이트의 사용을 말한다.

구절 "순 락테이트 소모"는 본원에서 사용될 때, 세포들이 동시에 락테이트를 소모하고 세포 대사작용의 부산물로서 락테이트를 생산하지만, 전체적인 소모 속도는 락테이트의 생산 속도보다 높거나 같은 락테이트 소모를 말한다. 순 락테이트 소모가 증가할 때, 세포 배양 배지에서 락테이트의 전체적인 축적은 감소한다.

유가 배양의 시작 시, 락테이트, 및 아마도 암모니아의 축적은 세포의 생존률을 빠르게 감소시킨다. 대사적으로 전환되지 않은 유가 배양에서는, 세포 농도가 최대에 도달했을 때 아무것도 90% 이상의 생존률에 도달할 수 없었다고 보고되었다. (Xie and Wang, 1994, Biotechnol. Bioeng. 43(11):1175-1189). 최적의 공정 수행에 바람직하지만, 이러한 대사적 전환은 일반적인 것이 아니며 쉽게 제어되지도 않는다 (Zagari, et al., 2013, New Biotechnol. 30(2):238-245). 발명자들은 제1 배취 배양 (예를 들어, 시드 배양)에서 제2 배취 배양 (예를 들어, 유가 배양 또는 생산 배양)으로의 세포 이동을 위한 시간 및 조건이 최종 단백질 역가에 큰 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 예상 외로 제1 배취 배양에서 장기간 동안 배양된 세포가 락테이트 소모로 변환되어 락테이트 소모에 대한 대사적 선호도, 또는 대사적 표현형을 부여하는 것으로 결정되었다. 일정한 대사적으로 전환된 상태의 세포, 따라서 락테이트 소모에 대한 대사 기억을 가진 세포를 생성하는 것이 본 발명의 목적이다. 본 발명의 방법은 세포가 락테이트 소모가 우선인 어떤 제2 또는 그 이후의 세포 배양에서도 사용될 수 있도록 세포를 대사적으로 전환된 상태로 사전 조정하는데 적합하다.

한 구체예에서, 전체적인 락테이트의 축적은 제2 세포 배양에서 감소한다. 일부 구체예에서, 순 락테이트 소모는 제2 세포 배양 중에 달성되는데, 예를 들어, 순 락테이트 소모는 제2 세포 배양에서 세포 성장의 2일, 3일, 4일, 또는 5일에 또는 그 이후에 달성된다. 더 많은 구체예에서, 락테이트 축적의 감소는 제2 세포 배양에서 최대 락테이트 농도의 감소이다. 다른 구체예에서, 최대 락테이트 농도의 감소는 제2 세포 배양에서 세포 성장의 5일에 또는 그 이후에 제 세포 배양에서 일어난다. 다른 구체예에서, 제2 세포 배양에서 최대 락테이트 농도는 약 6 g/L, 5 g/L, 4 g/L, 3 g/L, 2 g/L 미만, 또는 약 1 g/L 미만이다.

일부 구체예에서, 대사적으로 전환된 세포는 제2 세포 배양에서 적어도 2배, 또는 3배, 또는 4배, 또는 5배, 또는 최대 10배 더 낮은 락테이트 농도 값을 생산한다. 일부 추가의 구체예에서, 제2 세포 배양에서 더 낮은 락테이트 농도 값 또는 제2 세포 배양에서 전체적으로 감소된 락테이트 축적은 세포의 제2 세포 배양으로의 이동이 제1 세포 배양에서 대사적 전환이 일어나기 전이라는 점을 제외하면 동일한 조건 하에 동일한 세포 배양에서 결정된 것과 비교된다. 또 다른 구체예에서, 제2 세포 배양에서 전체적인 락테이트 축적은 제2 세포 배양에서 세포 성장의 5일에 또는 그 이후에 감소한다.

또 다른 구체예에서, 제2 세포 배양에서 전체적인 생성물 역가가 증가한다. 다른 구체예에서, 제2 세포 배양에서 대사적으로 전환된 세포는 적어도 2배, 또는 2.5배, 3배, 또는 4배, 또는 5배, 또는 최대 10배 더 높은 생성물 역가를 생산한다. 또 다른 구체예에서, 제2 세포 배양에서 더 높은 단백질 역가 값은 세포의 제2 세포 배양으로로의 이동이 제1 세포 배양에서 대사적 전환이 일어나기 전이라는 점을 제외하면 동일한 조건 하에 동일한 세포 배양에서 결정된 것과 비교된다.

유가 또는 생산 스테이지 전에 배양에서 세포의 대사 조절을 최적화하는 것은 많은 이점을 갖는다. 제1 배양에서 락테이트 소모로의 대사적 전환은 다수의 파라미터에 의해 결정될 수도 있다. 대사적 전환의 결정은 성장하는 세포의 대사 상태를 결정하기 위해 당업자에게 공지되어 있는 많은 방법들을 포함한다.

제1 세포 배양에서 락테이트 농도 값의 측정은 당업자에게 잘 공지되어 있는 생물학적 검정 시스템 및 키트, 예를 들어, 전기화학법을 사용하는 분석기 (예를 들어, Bioprofile® Flex, Nova Biomedical, Waltham, MA), 또는 라만 분광법(Raman spectroscopy)에 의해 실행될 수도 있고, 세포 배양에서 락테이트 축적의 오프라인 또는 온라인 모니터링에 사용될 수도 있다.

락테이트 축적은 세포 배양에 대하여 해로운 효과를 가지며, 그 결과로서 단백질 생산 수율에 대하여 부정적인 효과를 가지는 것으로 생각된다.

한 구체예에서, 대사적 전환은 락테이트의 순 축적이 둔화되거나 중단되는 제1 세포 배양에서 결정된다.

한 구체예에서, 락테이트 소모로의 대사적 전환은 제1 세포 배양에서 락테이트 측정에 의해 검출된다. 일부 구체예에서, 대사적 전환은 배양에서 연속적인 락테이트 농도 값의 측정값을 나타내는 그래프 상에서 안정 상태, 또는 근본적으로 수평한 선이 결정될 때 제1 세포 배양에서 결정된다. 다른 구체예에서, 락테이트 농도 값은 연속적인 측정값에 대한 허용 상한(상위 허용 한도)보다 낮게 유지된다. 또 다른 구체예에서, 락테이트 농도에 대한 허용 상한은 4 g/L 이하이다. 락테이트 수준은 세포가 순 락테이트 소모를 거칠 때 안정 상태인 것으로 생각된다.

다른 구체예에서, 대사적 전환의 결정은 간격을 두고 제1 세포 배양에서 락테이트를 측정하는 단계, 및 연속적인 간격으로 락테이트가 미리 결정된 상한보다 낮은 것을 결정하고, 이로 인해 세포에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어난 것을 결정하는 단계를 포함한다.

pH 관리 및 제어는 생물반응기 배양에서 세포 유지의 중요한 양태이다. 대부분의 세포의 성장은 좁은 pH 한도 내에서 최적이다. 일반적으로, 세포 배양은, 세트-포인트 상위 및 하위 세트-포인트 값의 범위 내에서, 7.0의 중성 pH에서 유지된다. 세트 포인트 값은 배양에서 특정 세포주, 배지 조성 및 상기 세포의 성장을 위한 최적의 조건에 따라 당업자에 의해 결정된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "중성 pH"는 약 6.85 내지 약 7.4의 pH를 의미한다. 표현 "중성 pH"는 약 6.85, 6.9, 6.95, 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, 및 7.4의 pH 값을 포함한다.

온라인, 또는 "실시간", pH 모니터링 및 염기의 첨가는 당업자에게 잘 공지되어 있는 많은 방법으로 달성될 수도 있다. 온라인 시스템에서, 세포 배양에서 분석기의 직접적인 연결에 의한 생물학적 및 화학적 파라미터의 실시간 측정은 추가적인 작업, 예를 들어, 배양 배지에 염기 첨가 또는 영양소 첨가를 수행하기 위한 피드백(feedback)을 제공한다. 오프라인 측정이 또한 실행될 수도 있는 반면 주기적인 샘플링 및 수동 오퍼레이터(operator) 개입이 일어난다. pH의 연속 측정은 세포 배지가 모니터링되게 하고, 예를 들어, 산성이 허용 한도를 벗어난 하한 세트 포인트 값에 도달하면, 염기가 첨가된다. pH가 세트 허용 상한에 도달하면 (즉, 너무 염기성이 되면), CO₂가 첨가될 수도 있다.

온라인 모니터링은 다양한 방법으로 실행될 수도 있다. 전극, 예를 들어, 관통 전극은 일반적으로 세포 배양 배지에서 pH, 또는 다른 파라미터, 예를 들어, 용존 O₂(dO₂) 및 온도를 측정하는데 사용된다. 이러한 관통 전극은 연속적인 기록을 위해 어떠한 표준 스트립 차트 레코더(strip chart recorder)에 연결되거나 또는 어떠한 표준 실험실 pH 또는 밀리볼트계에도 접속될 수 있다. pH는 또한 생물반응기에 설치된 형광 센서 스팟(spot)의 사용으로 최적의 측정의 수단에 의해 측정될 수도 있다.

어떤 이러한 모니터링 시스템은 세트 포인트 상위 및 하위 값 주위의 허용 한도 (또는 불감대(dead-band))를 통합시킬 것이다. 불감대는 신속한 켜짐 및 꺼짐으로부터 주입 시스템을 방지한다. pH 제어 중에, 세트 포인트의 pH 편차가 허용 한도 내에 있으면 주입 또는 적정이 일어나지 않을 것이다. pH 측정값이 허용 하한보다 더 크면 (산성), 액체 염기 (예를 들어, KOH, NaOH, NaHCO₃) 또는 NH₃ 기체가 첨가될 것이다. pH 측정값이 허용 상한 이상이면 (염기성), 산 또는 CO₂ 기체가 첨가될 것이다. pH 세트-포인트 및 제어 전략, 예를 들어, 불감대는 다수의 파라미터, 예를 들어, 용존 CO₂, pH 제어를 위한 염기 소모, 및 그러므로, 삼투압과 연관된다. (예를 들어, Li, F., et al., 2010, mAbs 2(5):466-479 참조).

한 구체예에서, 대사적 전환은 염기의 첨가 (즉, 적정)가 중단되는 제1 세포 배양에서 결정된다. 염기의 성향이 자동화된 모니터링 방법이 pH를 결정하는데 이용될 수도 있는 온라인 성향 및 염기의 주기적인 첨가을 포함한다. 본 방법에서, pH 세트 포인트는 달라질 수도 있지만 더 낮은 불감대의 pH 오프(off)의 증가는 제1 세포 배양에서 대사적 전환을 나타낸다. 염기 성향을 측정하는 온라인 및 수동 방법은 업계에 공지되어 있으며, 용기의 중량을 모니터링하는 방법, 또는 염기 첨가 또는 염기 첨가 중단을 검출하기 위한 펌프의 유속을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 대사적 전환은 허용 하한 이상으로 pH를 올리기 위해 염기 첨가가 더 이상 필요하지 않을 때 제1 세포 배양에서 결정된다.

일부 구체예에서, 대사적 전환은 염기를 첨가하지 않고 pH 값이 증가할 때 제1 배양에서 결정된다. 다른 구체예에서, pH 값은 연속적인 측정 동안 허용 하한 이상으로 증가한다.

다른 구체예에서, 대사적 전환의 결정은 (a) 제1 세포 배양에서 소음 수준을 검출하기 위한 pH 검출 기기의 조율, (b) 제1 세포 배양에서 규칙적인 간격으로 연속적으로 pH 측정, (c) 미리 결정된 하한 이상으로 pH를 유지하는데 필요한 만큼 염기 첨가, (d) 여러 번의 연속적인 간격으로 pH가 미리 결정된 하한 이상인지의 결정, 및 (e) 염기의 첨가를 중단하고, 이로 인해 세포에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어나는지의 결정을 포함한다.

한 구체예에서, 허용 하한은 약 6.5, 6.55, 6.6, 6.65, 6.7, 6.75, 6.8, 6.85, 6.9, 6.95, 7.0, 7.05 또는 약 7.1의 pH이다.

일부 구체예에서, 락테이트 소모로의 대사적 전환은 제1 세포 배양에서 세포 대사작용의 지표 또는 생성물에 의해 검출된다. 세포 대사작용의 하나의 이러한 지표는 산소 소모이다 (Zagari, et al., 2013, New Biotechnol. 30(2):238-245). 세포 배양 배지에서 산소 고갈 속도의 정확한 측정은 접종 후 배지에서 생존 세포의 존재, 뿐만 아니라 배양에서 세포의 성장 속도를 결정하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,165,741 및 미국 특허 번호 7,575,890 참조). 산소 소모의 측정은 업계에 잘 공지되어 있다.

세포 대사작용의 다른 지표, 예를 들어, 효소 및 대사산물은 단백질체학적 또는 대사체학적 기술, 예를 들어, 면역학적 어레이(array), 핵 자기 공명 (NMR) 또는 질량 분석법에 의해 측정될 수도 있다. 대사산물, 예를 들어, 글리신, 트립토판, 페닐알라닌, 아데닌, 팔미트산, 글루탐산, 메티오닌 및 아스파라긴은 세포의 바이오매스 증가와 연관성이 있었다 (예를 들어,Jain, M., et al, Science. 2012 May 25; 336(6084): 1040-1044. doi:10.1126/science.1218595; 및 De la Luz-Hdez, K., 2012, Metabolomics and Mammalian Cell Culture, Metabolomics, Dr Ute Roessner (Ed.), ISBN: 978-953-51-0046-1 참조, InTech, http://www.intechopen.com/books/metabolomics/metabolomics-and-mammalian-cell-cultures에서 이용 가능함). 제1 세포 배양에서 대사적 전환과 동시에 일어나거나 바로 대사적 전환으로 이어지는 많은 분자적 변화들은 대사적 전환이 일어났는지 결정하는데 이용될 수도 있다.

단백질 생산

본 발명의 방법은 세포 배양에서 원하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산한다. 본 발명의 방법에서 단백질 생산을 가능하게 하기 위해서, 세포는 원하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현하도록 재조합에 의해 조작된다.

세포는, 세포에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어난 후, 제2 세포 배양, 예를 들어, 생산 배양으로 옮겨지고 폴리펩타이드 또는 단백질이 세포 배양에 축적되도록 일정한 기간 동안 제2 세포 배양에서 유지될 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "폴리펩타이드"는 인접한 아미노산 잔기의 카르복실기 및 아미노기 사이에서 펩타이드 결합에 의해 함께 결합된 아미노산의 단일 선형 폴리머 사슬이다. 용어 "단백질"은 또한 특정 폴딩된(folded) 또는 공간 구조를 가진 큰 폴리펩타이드, 예를 들어, 7개의 막관통 스패닝 도메인(transmembrane spanning domain) 단백질을 기술하기 위해 사용될 수도 있다. 이와 같이, 용어 "단백질"은 4차 구조, 3원 구조 및 적어도 하나의 폴리펩타이드로 구성된 다른 복합 거대분자를 포함하는 것을 의미한다. 단백질이 서로 물리적으로 회합된 하나 이상의 폴리펩타이드로 구성되면, 본원에서 사용된 용어 "단백질"은 별개의 유닛으로서 물리적으로 커플링되어(coupled) 함께 작용하는 다수의 폴리펩타이드를 말한다. 용어 "단백질"은 폴리펩타이드를 포함한다.

본 발명의 방법에 의해 생산된 폴리펩타이드 및 단백질의 예는 항체, 융합 단백질, Fc-융합 단백질, 수용체, 수용체-Fc 융합 단백질, 등을 포함한다.

용어 "면역글로불린"은 두 쌍의 폴리펩타이드 사슬, 한 쌍의 경쇄 (L) 및 한 쌍의 중쇄 (H)로 구성되는 구조적 관련 당단백질의 종류를 말하며, 이것들은 네 개 모두 이황화 결합에 의해 서로 연결될 수도 있다. 면역글로불린의 구조는 잘 특성화되어 있다. 예를 들어, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989)) 참조. 간략히 말하면, 각 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역 (본원에서 V_H 또는 VH로 축약됨) 및 중쇄 불변 영역 (C_H)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 세 개의 도메인, C_H1, C_H2, 및 C_H3을 포함한다. C_H1 및 C_H2 도메인은 힌지(hinge)에 의해 결합된다. 각 경쇄는 전형적으로 경쇄 가변 영역 (본원에서 V_L 또는 VL로 축약됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 인간, 및 다른 포유동물에서 두 가지 유형의 경쇄, 카파 (κ) 사슬 및 람다 (λ) 사슬이 있다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 하나의 도메인 (C_L)을 포함한다. V_H 및 V_L 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 더 보존된 영역과 함께 배치된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 불리는, 초가변성 영역 (또는 구조적으로 한정된 루프의 서열 또는 형태에서 초가변적일 수도 있는 초가변적인 영역)으로 더 세분화될 수도 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 전형적으로 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성되며, 다음 순서로 아미노 말단 (N-말단)에서 카르복시-말단 (C-말단)으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (또한 Chothia and Lesk J. MoI. Biol. 196, 901-917 (1987) 참조). 전형적으로, 이 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링(numbering)은 IMGT, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)에 따르거나, 또는, 예를 들어, Kabat, E.A. et al. Sequences of Proteins of Immunological interest. 5^th ed. US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242 (1991)의 Kabat의 EU 넘버링 시스템 ("EU 넘버링" 또는 "EU 지수"로도 알려져 있음)에 의한 것이다.

용어 "Fc"는 전형적으로 Fc 수용체, 예를 들어, FcγR, 즉 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) 또는 FcRn, 즉, 신생아 Fc 수용체에 결합하는, 적어도 CH2 및 CH3을 포함하는 중쇄 불변 영역의 일부를 말한다. Fc-융합 단백질은 고유한 Fc 도메인 모두 또는 일부를 함유할 수도 있거나 또는 결실, 치환, 및/또는 삽입 또는 그것이 어떠한 Fc 수용체에도 결합할 수 없게 만들며, 그러므로 도메인이 Fc 수용체를 통해 달성되는 그것의 전형적인 생물학적 기능에 관하여 비-기능적 또는 "효과 없게" 만드는 다른 변형들을 함유하는 것으로 생각된다.

본원에서 사용된 용어 "항체" (Ab)는 면역글로불린 분자, 또는 이것의 유도체를 말하며, 이것은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖고 있다. 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 "면역글로불린"으로 상기 요약된 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체는 또한 이중 특이적 항체, 디아바디(diabody), 또는 유사한 분자일 수도 있다 (예를 들어, 디아바디의 기술을 위해서, Holliger, et al., 1993, PNAS USA 90(14), 6444-8 참조). 게다가, 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편, 즉, "항원-결합 단편" 또는 "항원-결합 단백질"에 의해 수행될 수도 있다고 나타났다. 전체 항체 분자와 같이, 항원-결합 단백질은 단일 특이적 또는 다중 특이적 (예를 들어, 이중 특이적)일 수도 있다. 용어 "항체" 내에 포함된 결합 분자 또는 단편의 예는 (i) Fab' 또는 Fab 단편, V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 구성되는 1가 단편, 또는 국제 특허 공개 번호 WO2007059782에서 기술된 1가 항체; (ii) F(ab')₂ 단편, 힌지 영역에서 이황화 브릿지(bridge)에 의해 결합된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) 근본적으로 V_H 및 C_H1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) V_L 및 V_H 도메인으로 구성되는 Fv 단편, (v) 근본적으로 V_H 도메인으로 이루어지며 도메인 항체로도 불리는 (Holt et al, 2003, Trends Biotechnol. 21(11):484-90) dAb 단편 (Ward et al., 1989, Nature 341, 544-546); (vi) 카멜리드(camelid) 또는 나노바디(nanobody) (Revets et al., 2005, Expert Opin Biol Ther. 5(1):111-24) 및 (vii) 분리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "단클론성 항체" 또는 "단클론성 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 조제물을 말한다. 단클론성 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

용어 "인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 가지는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내 또는 유전자 재배열 중에 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수도 있다. 용어 "마우스 또는 쥐 단클론성 항체"는 쥐 또는 마우스 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는, 단일 특이성을 나타내는 항체를 말한다.

본원에서 사용된 용어 "융합 단백질"은 Fc 융합 단백질 및 수용체-Fc 융합 단백질을 포함한다. 융합 단백질은 두 개의 유전자가 하나의 연속적인 폴리펩타이드를 암호화하도록 다른 기원의 하나 이상의 DNA 서열을 조합하여, 전형적으로는 제2 유전자가 있는 프레임 내에서(in frame) 하나의 유전자를 발현 벡터로 클로닝함으로써 만들어진 키메라 유전자의 발현에 의해 형성된 어떤 폴리펩타이드도 될 수 있다.

한 양태에서, 본 발명은 원하는 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질을 생산하기 위해 본원에서 기술된 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 원하는 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질은 항체, 항원-결합 단백질, 융합 단백질, Fc 융합 단백질, 및 수용체-Fc 융합 단백질로 구성되는 군으로부터 선택된다.

세포 발현 시스템

세포 발현 시스템의 사용은 세포 배양에서 이러한 폴리펩타이드 또는 단백질의 높은 생산량을 위한 전제조건이다.

본 발명의 생성물은 폴리펩타이드, 또는 단백질이며, 이것은 세포에서 발현되어 배양 시스템, 즉, 세포 및/또는 세포 배지로부터 수득된다. 그것은 어떠한 원하는 폴리펩타이드 또는 단백질도 될 수 있다 (상기).

발현 벡터는 전형적으로 강력한 유전자 프로모터를 사용하여 생성물 mRNA 전사를 구동한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 원하는 폴리펩타이드, 예를 들어, 항체, 항원-결합 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터에 관한 것이다. 이러한 발현 벡터는 세포 배양을 통해 원하는 폴리펩타이드 또는 단백질의 재조합 생산을 위해 본 발명의 방법에서 사용될 수도 있다.

본 발명의 방법의 맥락에서 발현 벡터는 어떠한 적합한 벡터도 될 수 있으며, 염색체, 비-염색체, 및 합성 핵산 벡터 (발현 제어 요소의 적합한 세트를 포함하는 핵산 서열)를 포함한다. 이러한 벡터의 예는 SV40의 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 바큘로바이러스(baculovirus), 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터, 및 바이러스 핵산 (RNA 또는 DNA) 벡터를 포함한다. 이러한 핵산 벡터 및 이것들의 용법은 업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, US 5,589,466 및 US 5,973,972 참조).

원하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터는 숙주 세포에서 제공되는데, 핵산 분자는 포유동물 숙주 세포에서 발현에 적합한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 결합된다.

발현 제어 서열은 다양한 세포 시스템에서 원하는 폴리펩타이드-암호화 유전자의 전사, 및 그 결과로서 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현을 제어하고 구동하도록 조작된다. 플라스미드는 원하는 발현 가능한 유전자를 바람직한 요소들, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 선택 가능 마커, 오퍼레이터, 등을 포함하는 발현 제어 서열 (즉, 발현 카세트)과 조합한다. 발현 벡터에서 핵산 분자는 어떠한 적합한 프로모터, 인핸서, 선택 가능 마커, 오퍼레이터, 억제 단백질, polyA 종결 서열 및 다른 발현을 용이하게 하는 요소를 포함하거나 이것들과 회합될 수도 있다.

본원에서 사용된 "프로모터"는 작동 가능하게 결합되는, 즉, 뉴클레오타이드 서열의 전사를 제어하는 방법으로 결합되는 DNA 서열의 전사를 지시하기에 충분한 DNA 서열을 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열의 발현은 업계에 공지되어 있는 어떠한 프로모터 또는 인핸서 요소의 제어 하에 둘 수도 있다. 이러한 요소의 예는 강한 발현 프로모터 (예를 들어, 인간 CMV IE 프로모터/인핸서 또는 CMV major IE (CMV-MIE) 프로모터, 뿐만 아니라 RSV, SV40 후기 프로모터, SL3-3, MMTV, 유비퀴틴 (Ubi), 유비퀴틴 C (UbC), 및 HIV LTR 프로모터)를 포함한다.

일부 구체예에서, 벡터는 SV40, CMV, CMV-IE, CMV-MIE, RSV, SL3-3, MMTV, Ubi, UbC 및 HIV LTR로 구성되는 군으로부터 선택된 프로모터를 포함한다.

원하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 또한 효과적인 poly (A) 종결 서열, 대장균(E. coli)에서 플라스미드 생성물에 대한 복제의 기원, 선택 가능 마커로서 항생제 저항 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위 (예를 들어, 폴리링커(polylinker))에 작동 가능하게 결합될 수도 있다. 핵산은 또한 구성 프로모터, 예를 들어, CMV IE와는 대조적으로 조절 가능한 유도성 프로모터 (유도성, 억제 가능, 발달상 조절됨)를 포함할 수도 있다 (당업자는 이러한 용어가 실제로 특정 조건 하에서 유전자 발현의 정도의 기술어인 것을 인식할 것이다).

선택 가능 마커는 업계에 잘 공지되어 있는 요소이다. 선택적 조건 하에서, 적절한 선택 가능 마커를 발현하는 세포만이 생존할 수 있다. 흔히, 선택 가능 마커 유전자는 세포 배양에서 다양한 항생제에 저항성을 부여하는 단백질, 보통 효소를 발현한다. 다른 선택적 조건 하에서, 형광 단백질 마커를 발현하는 세포는 가시화되고, 따라서 선택 가능하다. 구체예들은 베타-락타마제 (bla) (베타-락탐 항생제 저항성 또는 앰피실린 저항성 유전자 또는 ampR), bls (블라스티시딘 저항성 아세틸 트랜스퍼라제 유전자), bsd (블라스티시딘-S 데아미나제 저항성 유전자), bsr (블라스티시딘-S 저항성 유전자), Sh ble (Zeocin® 저항성 유전자), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hpt) (하이그로마이신 저항성 유전자), tetM (테트라사이클린 저항성 유전자 또는 tetR), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (npt) (네오마이신 저항성 유전자 또는 neoR), kanR (카나마이신 저항성 유전자), 및 pac (퓨로마이신 저항성 유전자)를 포함한다. 선택 가능 (또는 선택) 마커는 전형적으로 안정한 세포주 개발 내에서 이용된다.

특정 구체예에서, 벡터는 bla, bls, BSD, bsr, Sh ble, hpt, tetR, tetM, npt, kanR 및 pac로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 선택 가능 마커 유전자를 포함한다. 다른 구체예에서, 벡터는 녹색 형광 단백질 (GFP), 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP), 시아노 형광 단백질 (CFP), 향상된 시아노 형광 단백질 (eCFP), 노랑 형광 단백질 (YFP), 등을 암호화하는 하나 이상의 선택 가능 마커 유전자를 포함한다.

본 발명의 목적을 위해서, 진핵생물 세포에서의 유전자 발현은 조절 융합 단백질 (RFP)에 의해 차례로 조절되는 오퍼레이터에 의해 제어되는 강한 프로모터를 사용하여 엄격하게 조절될 수도 있다. RFP는 근본적으로 전사 차단 도메인, 및 그것의 활성을 조절하는 리간드-결합 도메인으로 구성되는다. 이러한 발현 시스템의 예는 US20090162901A1에서 기술되며, 이것은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이 "오퍼레이터"는 RFP의 오퍼레이터로의 결합에 의해 조절될 수도 있고, 결과로서, 원하는 유전자의 전사를 방지하거나 허용하는 방법으로 원하는 유전자에서 또는 그 주위에서 도입되는 DNA 서열을 지시한다. 원핵생물 세포 및 박테리오파지에서 많은 오퍼레이터들이 잘 특성화되어 있다 (Neidhardt, ed. Escherichia coli and Salmonella; Cellular and Molecular Biology 2d. Vol 2 ASM Press, Washington D.C. 1996). 이것들은 LexA 펩타이드에 결합하는, 대장균의 LexA 유전자의 오퍼레이터 영역, 및 대장균의 LacI 및 trpR 유전자에 의해 암호화되는 억제 단백질에 결합하는 락토스 및 트립토판을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이것들은 또한 람다 cI 및 P22 arc에 의해 암호화되는 억제 단백질에 결합하는 람다 P_R 및 파지 P22 ant/mnt 유전자의 박테리오파지 오퍼레이터를 포함한다. 일부 구체예에서, RFP의 전사 차단 도메인은 NotI과 같은 제한 효소이고, 오퍼레이터는 효소에 대한 인식 서열이다. 당업자는 오퍼레이터가 프로모터에 의해 전사를 제어할 수 있도록 프로모터에 인접하게, 또는 프로모터에 대하여 3'에 위치해야 한다고 인식할 것이다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 5,972,650는 tetO 서열이 TATA 박스로부터 특정 거리 내에 있다고 명시한다.

특정 구체예에서, 오퍼레이터는 tet 오퍼레이터 (tetO), NotI 인식 서열, LexA 오퍼레이터, 락토스 오퍼레이터, 트립토판 오퍼레이터 및 Arc 오퍼레이터 (AO)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 억제 단백질은 TetR, LexA, LacI, TrpR, Arc, 람다C1 및 GAL4로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 전사 차단 도메인은 진핵생물 억제 단백질로부터 유래되는데, 예를 들어, 억제 도메인은 GAL4로부터 유래된다.

예시적 세포 발현 시스템에서, 세포는 테트라사이클린 억제 단백질 (TetR)을 발현하도록 조작되고 원하는 폴리펩타이드가 TetR에 의해 활성이 제어되는 프로모터의 전사 제어 하에 배치된다. 두 개의 탠덤(tandem) TetR 오퍼레이터 (tetO)는 벡터에서 CMV-MIE 프로모터/인핸서의 바로 하류에 배치된다. 이러한 벡터에서 CMV-MIE 프로모터에 의해 지시된, 원하는 단백질을 암호화하는 유전자의 전사는 테트라사이클린 또는 일부 다른 적합한 유도물질 (예를 들어, 독시사이클린)의 부재 하에 TetR에 의해 차단될 수도 있다. 유도물질의 존재 하에, TetR 단백질은 tetO에 결합할 수 없으며, 따라서 원하는 폴리펩타이드의 전사 및 따라서 번역 (발현)이 일어난다. (예를 들어, 미국 특허 번호 7,435,553 참조, 이것은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨).

이러한 세포 발현 시스템은 단지 생산 배양 중에만 원하는 폴리펩타이드의 생산을 "작동시키는데(turn on)" 사용될 수도 있다. 따라서, 항생제, 예를 들어, 테트라사이클린 또는 다른 적합한 유도물질이 제1 세포 배양에 대한 생물반응기에 첨가될 수도 있다.

또 다른 예시적 세포 발현 시스템은 조절 융합 단백질, 예를 들어, TetR-ER_LBDT2 융합 단백질을 포함하며, 이것에서 융합 단백질의 전사 차단 도메인은 TetR이고 리간드-결합 도메인은 T2 돌연변이를 가진 에스트로겐 수용체 리간드-결합 도메인 (ER_LBD)이다 (ER_LBDT2; Feil et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:752-757). tetO 서열이 강한 CMV-MIE 프로모터의 하류에 및 근위에 배치되었을 때, CMV-MIE/tetO 프로모터로부터 원하는 뉴클레오타이드 서열의 전사는 타목시펜의 존재 하에 차단되었고 타목시펜의 제거에 의해 차단 해제되었다. 또 다른 예에서, 융합 단백질 Arc2-ER_LBDT2, 15개의 아미노산 링커에 의해 연결된 두 개의 Arc 단백질로 구성되는 단일 사슬 다이머 및 ER_LBDT2 (상기)로 구성되는 융합 단백질은 CMV-MIE 프로모터/인핸서의 바로 하류에서 Arc 오퍼레이터 (AO), 더 구체적으로는 두 개의 탠덤 arc 오퍼레이터를 수반한다. 세포주는 Arc2-ER_LBDT2에 의해 조절될 수도 있으며, 원하는 단백질을 발현하는 세포는 CMV-MIE/ArcO2 프로모터에 의해 구동되고 타목시펜의 제거와 함께 유도 가능하다. (예를 들어, US 20090162901A1 참조, 이것은 그 전문이 본원에 포함됨). 일부 구체예에서, 벡터는 CMV-MIE/TetO 또는 CMV-MIE/AO2 하이브리드 프로모터를 포함한다.

본 발명의 방법에 사용된 적합한 벡터는 또한 원하는 유전자의 복제를 용이하게 하기 위해서 재조합 기술을 위해 Cre-lox 도구를 활용할 수도 있다. Cre-lox 전략은 적어도 두 개의 구성 요소, 1) Cre 리콤비나제, 두 개의 loxP 부위 사이에서 재조합을 촉진하는 효소; 및 2) loxP 부위 (예를 들어, 재조합이 일어나는 8-bp 코어 서열, 및 두 개의 플랭킹된(flanking) 13-bp 역위 반복 서열로 구성되는 특이적 34-염기쌍 bp 서열) 또는 돌연변이 lox 부위를 필요로 한다 (예를 들어, Araki et al., 1995, PNAS 92:160-4; Nagy, A. et al., 2000, Genesis 26:99-109; Araki et al., 2002, Nuc Acids Res 30(19):e103; 및 US20100291626A1 참조, 이것의 전문은 본원에 참고로 포함됨). 또 다른 재조합 전략에서, 효모-유래 FLP 리콤비나제는 공통 서열 FRT 내에서 이용될 수도 있다 (또한, 예를 들어, Dymecki, S., 1996, PNAS 93(12): 6191-6196 참조).

또 다른 양태에서, 유전자 (즉, 원하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열)가 발현 카세트의 발현-향상 서열 내에 삽입되고, 임의로 프로모터에 작동 가능하게 결합되는데, 프로모터-결합된 유전자는 제1 리콤비나제 인식 부위에 의해 5'에 및 제2 리콤비나제 인식 부위에 의해 3'에 플랭킹된다. 이러한 리콤비나제 인식 부위는 발현 시스템의 숙주 세포에서 Cre-매개 재조합을 허용한다. 일부 예에서, 제2 프로모터-결합된 유전자는 제1 유전자의 하류 (3')에 있고 제2 리콤비나제 인식 부위에 의해 3'에 플랭킹된다. 또 다른 예에서, 제2 프로모터-결합된 유전자는 제2 리콤비나제 부위에 의해 5'에 플랭킹되고, 제3 리콤비나제 인식 부위에 의해 3'에 플랭킹된다. 일부 구체예에서, 리콤비나제 인식 부위는 loxP 부위, lox511 부위, lox2272 부위, 및 FRT 부위로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 리콤비나제 인식 부위는 다르다. 추가의 구체예에서, 숙주 세포는 Cre 리콤비나제를 발현할 수 있는 유전자를 포함한다.

한 구체예에서, 벡터는 항체의 경쇄 또는 원하는 항체의 중쇄를 암호화하는 제1 유전자, 및 항체의 경쇄 또는 원하는 항체의 중쇄를 암호화하는 제2 유전자를 포함한다.

원하는 단백질을 암호화하고 발현하는 하나 이상의 핵산 서열을 가지고 있는 하나 이상의 벡터가 이러한 발현 시스템에서 활용될 수도 있다고 생각된다.

본 발명의 세포들은 또한 단백질, 예를 들어, 샤페론, 아폽토시스 억제자, 단백질 분해 억제자, 또는 생성물의 발현 또는 안정성을 향상시킬 수도 있는 다른 단백질의 동시 발현을 통해 생성물 발현을 증가시키도록 조작될 수도 있다.

일부 구체예에서, 벡터는 소포체 (ER)에서 단백질 폴딩(folding)에 수반되는 유전자의 발현 제어를 통해 단백질 생산/단백질 분비를 향상시킬 수 있는 X-박스-결합-단백질 1 (mXBP1) 및/또는 EDEM2 유전자를 더 포함한다. (예를 들어, Ron D, and Walter P., 2007, Nat Rev MoL Cell Biol.8:519-529; Olivari et al., 2005, J. Biol. Chem. 280(4): 2424-2428, Vembar and Brodsky, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 9(12): 944-957, 2008 참조).

많은 양의 생성물을 신속하게 생산하는, 일시적으로 트랜스펙션된 세포의 사용이 또한 세포 배양 공정의 최적화를 위해 수행될 수도 있지만, 전형적으로 안정한 트랜스펙션이 대량의 생산 규모에 활용된다.

본 발명의 맥락에서, 대사적으로 전환된 세포는 원하는 단백질의 효율적인 재조합 생산에 필요한, 본원에서 기술된 세포 발현 시스템의 요소 중 일부 또는 모두를 함유할 수도 있다.

추가의 양태에서, 본 발명은 원하는 단백질을 생산하는, 대사적으로 전환된 재조합 진핵생물 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포의 예는 포유동물 세포, 예를 들어, CHO, PER.C6, 쥐 림프구 세포, 및 쥐 하이드리도마 세포주 (상기)를 포함한다. 예를 들어, 한 구체예에서, 본 발명은 원하는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 세포 게놈으로 안정하게 통합된 핵산 서열을 포함하는 대사적으로 전환된 세포를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 비-통합된 (즉, 에피솜) 핵산 서열, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 또는 선형 발현 요소를 포함하는 대사적으로 전환된 세포를 제공하는데, 이것은 원하는 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다.

"수득" 또는 "세포 수득"은 상류 공정에서 생산 배취의 끝에 일어난다. 세포는 많은 방법들, 예를 들어, 여과, 세포 캡슐화, 미립담체(mlicrocarrier)로의 세포 부착, 세포 침전 또는 원심분리에 의해 배지로부터 분리된다. 단백질의 정제는 단백질 생성물을 분리하기 위한 추가적인 단계에서 일어난다. 폴리펩타이드 또는 단백질은 세포 또는 세포 배양 배지로부터 수득될 수도 있다.

단백질 정제 전략은 업계에 잘 공지되어 있다. 가용성 형태의 폴리펩타이드, 예를 들어, 항체, 항체-결합 단편 및 Fc-함유 단백질은 상업적으로 이용 가능한 농축 필터를 거치고, 그 이후 잘 공지된 방법, 예를 들어, 친화성 수지, 이온 교환 수지, 크로마토그래피 컬럼, 등에 의해 친화성 정제될 수도 있다. 막-결합된 형태의 폴리펩타이드는 발현 세포로부터 전체 막 분획을 제조하고 비이온성 세제, 예를 들어, TRITON® X-100 (EMD Biosciences, San Diego, CA, USA)으로 막을 추출함으로써 정제될 수 있다. 세포질 또는 핵 단백질은 숙주 세포를 용해시키고 (기계적 힘, 초음파 처리(sonication), 세제, 등을 통해), 원심분리에 의해 세포막 분획을 제거하고, 상층액을 보유함으로써 제조될 수도 있다.

추가의 양태에서, 본 발명은 원하는 항체, 또는 항원-결합 단백질, 또는 융합 단백질을 생산하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 a) 상기 본원에서 기술된 방법에 따라 세포를 배양하는 단계, b) 세포를 수득하는 단계, 및 c) 세포 또는 세포 배양 배지로부터 폴리펩타이드 또는 단백질, 예를 들어, 항체, 또는 항원-결합 단백질, 또는 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.

다음 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 만들고 사용하는 법을 기술하기 위해 제공되며, 발명자가 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 사용된 수치 (예를 들어, 양, 농도, 온도, 등)에 관하여 정확도를 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험적 오차 및 편차에 대해서 설명되어야 한다.

실시예

실시예 1- 대사적 전환 파라미터의 결정: 융합 단백질-생산 세포주

CHO 세포에 융합 단백질을 발현하는 DNA를 트랜스펙션하였다. 융합 단백질-생산 CHO 세포주를 시드 용기 배양으로, 콩 함유 독점 배지에서 배양하였고, 파라미터, 예를 들어, 온라인 pH, 오프라인 락테이트 및 생존 세포 수를 측정하고 기록하여 대사 상태를 결정하였다 (도 1A의 #1, #2, 또는 #3 참조). 이 세포주에 대하여 염기 사용을 또한 모니터링하고 1로 표준화하였다 (또한 도 1A 참조).

pH가 제어 범위의 하단부에서 제어되고 락테이트 및 VCC가 증가할 때 조건 #1 및 조건 #2 하의 세포를 사용하여 복제 생산 생물반응기에 접종하였다. 락테이트 재대사화 (즉, 소모)를 지시하는, pH가 제어 범위의 하단부에서 증가하기 시작했을 때, 즉, 염기 사용이 중단되었을 때, 조건 #3 하에서 세포들을 접종하였다. 조건 #3에서 세포 성장은 후 지수 성장기에 들어섰다. 모든 생산 생물반응기를 같은 작동 조건으로 실행하였다.

생성물 역가 (도 1B 참조) 및 락테이트 프로파일 (도 1C 참조)을 각 생산 생물반응기에서 시드 트레인 대사 상태 #1, #2 또는 #3의 영향을 결정하기 위해 공지된 방법을 사용하여 측정하였다. 생산 생물반응기 추세선은 ± 1 표준 편차를 나타내는 에러 바와 함께 2배수 생물반응기의 평균을 나타낸다.

조건 #3 세포들은 제2 세포 배양에서 생산성 및 락테이트 축적에 대하여 가장 큰 영향을 받았으며, 생산 생물반응기에서, 2배 이상의 생성물 역가의 성장을 초래한다 (조건 #1 및 #2와 비교) (도 1B 참조). 조건 #3 세포는 순 락테이트 소모를 나타내는 락테이트 프로파일을 가진다 (세포 배양의 8-12일에 도 1C 참조). 조건 #1 (즉, 제1 배양에서 대사적 전환 전) 하에 제1 배양으로부터 트랜스펙션된 세포는 생산 생물반응기에서 순 락테이트 소모를 달성하지 못한다.

실시예 2- 대사적 전환 파라미터 결정: 항체-생산 세포주

항체-생산 CHO 세포주 시드 용기를 사용하여 실시예 1과 유사하지만, 화학적으로 한정된 배지에서 복제 생산 생물반응기에 접종하였다. 네 개의 다른 대사 상태를 측정하였다 (모니터링 오프라인 pH, 락테이트 및 생균 수- 도 2A의 #1, #2, #3, 및 #4 참조). VCC는 생산 생물반응기에 접종될 때 시드 용기 배양 기간 동안 계속해서 증가하였다.

pH가 여전히 제어 범위의 상단부에 있을 때 및 락테이트가 매우 낮지만 증가할 때 조건 #1을 시드 트레인에서 매우 초기에 접종하였다. pH가 감소하기 시작하고 락테이트가 증가하여 최대 수준에 접근했을 때 조건 #2를 접종하였다. pH가 제어 범위의 하단부 근처에 있고 락테이트 수준이 안정 상태에 있을 때 조건 #3을 접종하였다. pH가 제어 범위의 하단부에서 증가하기 시작했을 때 및 락테이트 재대사화 (즉, 락테이트 소모) 중에 조건 #4를 접종하였다. 모든 생산 생물반응기를 같은 작동 조건으로 실행시켰다. 조건 #1은 일주일 후 분실되었다.

생산 생물반응기 역가 (도 2B) 및 락테이트 (도 2C) 프로파일에 대한 시드 트레인 대사 상태의 영향을 결정하였다. 생산 생물반응기 추세선은 ± 1 표준 편차를 나타내는 에러 바와 함께 2배수 생물반응기의 평균을 나타낸다.

조건 #3 및 #4 세포가 제2 세포 배양에서 생산성에 대하여 가장 큰 효과를 갖는다. 조건 #3 및 #4 세포들은 또한 생산 생물반응기에서 감소된 락테이트 농도를 초래하였는데 (조건 #1 및 #2와 비교), 이는 락테이트 소모에 대한 대사 표현형을 나타낸다 (도 2B 및 2C 참조). 실시예 2와 유사하게, 조건 #1 하에서 제1 세포로부터 옮겨진 세포들은 생산 기 동안 순 락테이트 소모를 달성하지 않는다. 조건 #2, #3 및 #4는 생산 기 동안 순 락테이트 소모를 달성하지만, 조건 #4가 최적인데, 순 락테이트 소모가 다른 조건들보다 더 일찍 일어나고, 최대 락테이트 수준이 가장 낮기 때문이다.

Claims

원하는 단백질을 생산하는 방법으로서,
(a) 제1 세포 배양에서 상기 원하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 배양하는 단계;
(b) 락테이트 소모로의 대사적 전환이 상기 제1 세포 배양에서 일어났는지 결정하는 단계;
(c) 상기 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어난 후 세포를 상기 제1 세포 배양으로부터 제2 세포 배양으로 옮기는 단계;
(d) 상기 원하는 단백질이 상기 제2 세포 배양에서 축적되도록 일정 기간 동안 상기 제2 세포 배양을 유지하는 단계;
(e) 상기 제2 세포 배양으로부터 상기 원하는 단백질을 수득하는 단계; 및
(f) 상기 원하는 단백질을 정제하는 단계
를 포함하는, 원하는 단백질을 생산하는 방법.
제1 항에 있어서, 제2 세포 배양에서 락테이트 소모는 순 락테이트 소모를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항에 있어서, 상기 세포는 CHO, COS, 망막 세포, Vero, CV1, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431, CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT, PER.C6, 쥐 림프구 세포, 및 쥐 하이브리도마(hybridoma) 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3 항에 있어서, 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항에 있어서, 원하는 단백질은 항체, 항원-결합 단백질, 융합 단백질, Fc 융합 단백질, 수용체-Fc 융합 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항에 있어서, 원하는 단백질은 항체 또는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항에 있어서, 상기 세포를 제2 세포 배양으로 옮기는 단계가 제1 세포 배양에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어나기 전이라는 점을 제외하고는 동일한 조건으로 동일한 세포 배양에서 생산된 역가보다 더 큰 역가로 원하는 단백질을 상기 제2 세포 배양에서 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7 항에 있어서, 상기 세포를 제2 세포 배양으로 옮기는 단계가 제1 세포 배양에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어나기 전이라는 점을 제외하고는 동일한 조건으로 동일한 세포 배양에서 생산된 역가보다 적어도 2배 더 큰 역가로 원하는 단백질을 상기 제2 세포 배양에서 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7 항에 있어서, 상기 세포를 제2 세포 배양으로 옮기는 단계가 제1 세포 배양에서 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어나기 전이라는 점을 제외하고는 동일한 조건으로 동일한 세포 배양에서 생산된 역가보다 적어도 2배, 또는 2.5배, 또는 3배, 또는 4배, 또는 5배, 또는 10배 이하로 더 큰 역가로 원하는 단백질을 상기 제2 세포 배양에서 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 락테이트 소모로의 대사적 전환은 제1 세포 배양에서 pH, 락테이트 또는 염기 측정에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 락테이트 소모로의 대사적 전환은 염기의 첨가없이 제1 세포 배양 배지에서 pH가 증가된 후에 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 락테이트 소모로의 대사적 전환은 제1 세포 배양에서 락테이트 수준이 안정 상태일 때 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 대사적 전환을 결정하는 단계는
(a) 제1 세포 배양에서 pH를 측정하는 단계,
(b) 미리 결정된 하한보다 높은 pH를 유지하도록 염기를 첨가하는 단계,
(c) 연속적인 간격으로 pH가 미리 결정된 하한보다 높은지를 결정하는 단계, 및
(d) 염기의 첨가를 중단하고 그로써 락테이트 소모로의 대사적 전환이 제1 세포 배양에서 일어났음을 결정하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 대사적 전환은 제1 세포 배양에서 세포 성장 3일 또는 그 이후에 제1 세포 배양에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 배양에서 세포가 로그 기(log phase)에서 벗어난 후 또는 제1 세포 배양에서 세포가 정지 성장 기(stationary growth phase)에 도달한 후에 세포가 옮겨지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 0.5×10⁶ 세포/mL 이상의 시작 세포 밀도 또는 0.5×10⁶ 세포/mL 내지 3.0×10⁶ 세포/mL의 시작 세포 밀도로 제2 세포 배양으로 옮겨지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 배양은 시드 트레인 배양인 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포 배양은 생산 배양인 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 배양은 시드 트레인 배양이고, 제2 세포 배양은 생산 배양이고, 제2 세포 배양은 제1 세포 배양과는 상이한 배양 용기에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포 배양은 생산 생물반응기에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 배양에서 세포 집단은 제2 세포 배양으로 옮겨져서 제1 세포 배양이 제2 세포 배양의 분획인 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 세포의 세포 게놈으로 안정하게 통합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 원하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
원하는 단백질을 생산하는 방법으로서,
(a) 제1 세포 배양에서 상기 원하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 CHO 세포를 배양하는 단계;
(b) 락테이트 소모로의 대사적 전환이 상기 제1 세포 배양에서 일어났는지 결정하는 단계;
(c) 상기 락테이트 소모로의 대사적 전환이 일어난 후 세포를 상기 제1 세포 배양으로부터 제2 세포 배양으로 옮기는 단계;
(d) 상기 원하는 단백질이 상기 제2 세포 배양에서 축적되도록 일정 기간 동안 상기 제2 세포 배양을 유지하는 단계;
(e) 상기 제2 세포 배양으로부터 상기 원하는 단백질을 수득하는 단계; 및
(f) 상기 원하는 단백질을 정제하는 단계
를 포함하며,
상기 대사적 전환은 상기 제1 세포 배양에서 락테이트 수준이 안정 상태(plateau)일 때 일어나고,
상기 제1 세포 배양은 시드 트레인(seed train) 배양이고,
상기 제2 세포 배양은 생산 배양이고,
상기 제2 세포 배양으로 세포를 옮기는 단계는 세포를 생산 생물반응기로 옮기는 단계를 포함하는,
원하는 단백질을 생산하는 방법.
제24 항에 있어서, 상기 락테이트 소모로의 대사적 전환은 상기 제1 세포 배양에서 pH, 락테이트 또는 염기 측정에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제24 항에 있어서, 상기 락테이트 소모로의 대사적 전환은 염기의 첨가 없이 상기 제1 세포 배양 배지에서 pH가 증가한 후 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제24 항에 있어서, 상기 락테이트 소모로의 대사적 전환은 상기 제1 세포 배양에서 락테이트 수준이 안정 상태일 때 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제24 항에 있어서, 상기 대사적 전환을 결정하는 단계는
(a) 상기 제1 세포 배양에서 pH를 측정하는 단계,
(b) 미리 결정된 하한보다 높은 pH를 유지하기 위해 염기를 첨가하는 단계,
(c) 연속적인 간격 동안 pH가 미리 결정된 하한보다 높은지를 결정하는 단계, 및
(d) 염기의 첨가를 중단함으로써 상기 락테이트 소모로의 대사적 전환이 상기 제1 세포 배양에서 일어났는지 결정하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제24 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원하는 단백질은 Fc 융합 단백질 또는 수용체-Fc 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제24 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대사적 전환은 상기 제1 세포 배양에서 세포 성장 3일 또는 그 이후에 제1 세포 배양에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
제24 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 배양에서 세포가 로그 기(log phase)에서 벗어난 후 또는 제1 세포 배양에서 세포가 정지 성장기(staionary growth phase)에 도달한 후에 옮겨지는 것을 특징으로 하는 방법.
제24 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 0.5×10⁶ 세포/mL 이상의 시작 세포 밀도 또는 0.5×10⁶ 세포/mL 내지 3.0×10⁶ 세포/mL의 시작 세포 밀도로 제2 세포 배양으로 옮겨지는 것을 특징으로 하는 방법.
제24 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 세포의 세포 게놈으로 안정하게 통합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제24 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 원하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.