ES2344789T5

ES2344789T5 - Alimentación restringida de glucosa para el cultivo de células animales

Info

Publication number: ES2344789T5
Application number: ES04752591.0T
Authority: ES
Inventors: Denis Drapeau; Terry Cardoza Stanek; Yen-Tung Luan
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2003-05-15
Filing date: 2004-05-17
Publication date: 2017-06-14
Anticipated expiration: 2024-05-17
Also published as: EP1623019A1; PL1623019T3; ES2344789T3; DK1623019T4; DE602004027905D1; SI1623019T1; WO2004104186A1; PT1623019E; PL1623019T5; EP1623019B2; EP1623019B1; ATE472597T2; US7429491B2; US20050070013A1; DK1623019T3

Description

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DESCRIPCION

Alimentacion restringida de glucosa para el cultivo de celulas animales Solicitudes anteriores relacionas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos n.° de serie 60/470.937, presentada el 15 de mayo de 2003, la cual se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad.

Antecedentes de la invencion

Campo de la invencion

La invencion se refiere a un procedimiento para mejorar la produccion de protemas mediante celulas animales en cultivo. De forma mas concreta, la invencion se refiere a un procedimiento para controlar la produccion de acido lactico por parte de celulas animales en cultivo (preferentemente celulas de mairnfero) a niveles bajos en un cultivo celular semicontinuo. En algunas realizaciones, la invencion proporciona procedimientos para mantener la produccion de lactato por parte de celulas en cultivo a niveles bajos a traves del uso de sistemas de suministro de glucosa que no dependen del muestreo de los cultivos a intervalos regulares. En particular, la invencion se refiere al cultivo de celulas animales en condiciones en las que se alimenta glucosa a, o en el cultivo, de una manera restringida, por ejemplo a una tasa que es una funcion de una tasa esperada o premodelada de consumo de glucosa por parte de las celulas animales al exponerlas a un medio que contiene un nivel elevado de glucosa. Asociado a esta alimentacion restringida, se controla la produccion de acido lactico por parte de celulas en cultivo a un nivel bajo durante el cultivo. Como resultado final, se aumenta la produccion de protemas recombinantes a partir de las celulas en cultivo, por ejemplo para facilitar la produccion a escala comercial.

Tecnica anterior relacionada

Una gran proporcion de productos biotecnologicos, ya sea esten disponibles de forma comercial o solo en desarrollo, son protemas terapeuticas. Adicionalmente, en general es necesaria la maquinaria celular de una celula animal (frente a una celula bacteriana) para producir muchas formas de protemas terapeuticas (tales como protemas glucosiladas o anticuerpos monoclonales (Acm) producidos por hibridoma). En consecuencia, existe una demanda creciente de produccion de estas protemas en cultivos de celulas animales.

Sin embargo, en comparacion con los cultivos de celulas bacterianas, los cultivos de celulas animales presentan tasas de produccion mas bajas y normalmente generan rendimientos de produccion mas bajos. El mantenimiento de las concentraciones de glucosa en el medio de cultivo celular a concentraciones bajas (por ejemplo, entre 0,02 y 1,0 g/l (por ejemplo, entre 0,11 y 5,5 mM)) y el cultivo de celulas en una fase de produccion a una osmolalidad de aproximadamente 400 a 600 mOsm, se ha encontrado que aumenta la produccion de protemas recombinantes por parte de cultivos de celulas animales, en particular tras un cultivo inicial a una osmolalidad de aproximadamente 280 a 330 mOsm (patente de Estados Unidos n. ° 5.856.179; cada patente de Estados Unidos citada en el presente documento se incorpora como referencia en su totalidad) y en el que el cultivo en todas las fases tambien es a una concentracion de glutamina seleccionada (preferentemente entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 2 mM; patente de Estados Unidos n. ° 6.180.401).

Parte de este incremento de la produccion de protemas recombinantes puede ser el resultado de una reduccion de la produccion de lactato que se produce cuando se mantienen bajas las concentraciones de glucosa en el medio de cultivo. Es conocido que el lactato es un fuerte inhibidor del crecimiento celular y de la produccion de protemas, y que mantener bajas las concentraciones de glucosa en el medio de cultivo puede dar como resultado niveles bajos de la produccion de lactato (Glacken y col. (1986) Biotechnol. Bioeng. 28:1376-89; Kurokawa y col. (1984) Biotechnol. Bioeng. 44:95-103; patente de Estados Unidos n. ° 6.156.570). En consecuencia, dependiendo de otras condiciones de cultivo, el mantenimiento de las concentraciones de glucosa a niveles bajos respecto a la concentracion celular es un factor que puede contribuir a niveles mas bajos de produccion de lactato y, por lo tanto, a concentraciones celulares mas altas y a una produccion aumentada de protemas recombinantes en cultivos de celulas animales.

Cuando se exponen las celulas a una concentracion baja de glucosa en el medio, su metabolismo se altera de forma que tanto la tasa de captacion de glucosa como la tasa de produccion de lactato son mas bajas en comparacion con celulas mantenidas en procedimientos semicontinuos que tienen medios con niveles altos de glucosa al inicio del procedimiento (patente de Estados Unidos n. ° 6.156.570). Adicionalmente, la duracion del cultivo semicontinuo puede extenderse. En consecuencia, tanto la tasa de crecimiento celular como la tasa de produccion de protemas pueden mantenerse durante un periodo mas prolongado en comparacion con los cultivos semicontinuos, en los que las celulas se cultivan en medios que conducen a niveles altos de produccion de lactato (por ejemplo, medios que contienen niveles altos de glucosa al inicio del periodo de cultivo).

Una manera de controlar la produccion de lactato por parte de las celulas en cultivo es a traves de una alimentacion invariante, de tasa constante, de glucosa en un procedimiento semicontinuo (Ljunggren y Haggstrom (1994) Biotechnol. Bioeng. 44:808-18; Haggstrom y col. (1996) Annals N.Y. Acad. Sci. 782:40-52). Aunque esta

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alimentacion de glucosa invariante, de tasa constante, en un procedimiento semicontinuo, puede ayudar a controlar la produccion de acido lactico por parte de celulas en cultivo en niveles bajos, no se consigue un maximo de concentraciones celulares, tasas de crecimiento, niveles de viabilidad celular y tasas de produccion de protemas maximas, debido a que este procedimiento de proporcionar glucosa normalmente de como resultado la privacion de glucosa a medida que aumentan las concentraciones celulares.

Otra manera de controlar la produccion de lactato por parte de las celulas en cultivo a niveles bajos es a traves del uso de sistemas de suministro de glucosa que dependen del muestreo de los cultivos a intervalos regulares. Se toman muestras de un cultivo a intervalos regulares y, tras determinar la concentracion de glucosa en las muestras (por ejemplo, a traves del analisis de inyeccion en flujo, como en Male y col. (1997) Biotechnol. Bioeng. 55:497-504 o en Siegwarty col. (1999) Biotechnol. Prog. 15:608-16), o a traves de cromatograffa lfquida de alta presion, como en Kurokaway col. (1994) Biotechnol. Bioeng. 44:95-103), se anaden cantidades medidas de glucosa a los cultivos para mantener en el medio las concentraciones de glucosa a un nivel bajo sostenido con respecto a la concentracion celular. Sin embargo, las celulas pueden adaptarse a una concentracion baja de glucosa mediante, por ejemplo, el aumento de su capacidad de incorporar glucosa y, de esta manera, producir cantidades excesivas de acido lactico a pesar de la baja concentracion de la glucosa.

El documento WO 2004/048556 A1, que es tecnica anterior segun el art. 54(3) de la EPC, desvela un procedimiento para el control de la produccion de acido lactico a niveles reducidos en un cultivo celular semicontinuo mediante la alimentacion de glucosa al cultivo celular de una manera restringida.

Ademas, el riesgo de contaminacion por microorganismos a traves de dichos procedimientos de control por retroalimentacion basado en muestreo es significativo. En consecuencia, no resulta sorprendente que el uso de tales procedimientos para la produccion comercial de protemas recombinantes en cultivos de celulas animales no haya resultado factible. Los procedimientos de control por retroalimentacion basado en muestreo para el mantenimiento de bajos niveles de concentracion de glucosa en el medio de cultivo celular se han limitado a los usos en investigacion desde que se publico el primer artmulo sobre tales procedimientos (Glacken y col., citado anteriormente); el artmulo informa que las concentraciones de glucosa en el medio de cultivo se determinaban utilizando un autoanalizador en lmea, en el que se mezclaba una muestra que contema glucosa con o-toluidina, y un colonmetro, a traves del cual se media la absorbancia a 660 nm de la mezcla para determinar la concentracion de glucosa.

Por los motivos anteriores, existe una necesidad de procedimientos alternativos para controlar la produccion de lactato por parte de celulas en cultivo a niveles bajos en el medio de cultivo.

Sumario de la invencion

La invencion se refiere a la realizacion caracterizada por las reivindicaciones.

La presente invencion proporciona un procedimiento para la alimentacion restringida de glucosa a o en cultivos de celulas animales en procedimientos semicontinuos. En asociacion con esta alimentacion restringida, puede controlarse la produccion de lactato por parte de las celulas en cultivo a niveles bajos sin requerir una tasa constante de alimentacion de glucosa. En algunas realizaciones, puede controlarse la produccion de lactato por parte de las celulas en cultivo en niveles bajos, sin requerir el muestreo de los cultivos a intervalos regulares para la determinacion de la concentracion de glucosa en un procedimiento de control por retroalimentacion. En particular, la presente invencion proporciona una solucion a una antigua necesidad de un procedimiento para controlar de forma flexible la produccion de lactato por parte de celulas en cultivo a niveles bajos, para estimular la produccion aumentada de protemas recombinantes en cultivos de celulas animales, en especial para la produccion a escala comercial.

La presente invencion se refiere a un procedimiento de cultivo de celulas animales en condiciones en las que se alimenta glucosa a los cultivos celulares de una manera restringida (es decir, alimentacion restringida), lo que da como resultado niveles bajos del lactato que producen las celulas en cultivo. Esta alimentacion restringida o lenta se lleva a cabo a traves de la alimentacion continua o intermitente de glucosa en el cultivo celular a tasas que son menores que (es decir, una funcion de) las tasas de consumo de glucosa esperadas o premodeladas por parte de las celulas animales expuestas a un medio que contiene un nivel alto de glucosa. En particular, la invencion se refiere a un procedimiento para aumentar la produccion de protemas en cultivos de celulas animales mediante el control de la produccion de lactato a niveles bajos a traves de la alimentacion restringida de glucosa.

A pesar de que algunas realizaciones de la invencion pueden emplear un control por retroalimentacion basado en muestreo, otras realizaciones de la invencion no requieren el control por retroalimentacion basado en muestreo. Por ejemplo, las estimaciones de las capacidades esperadas para las tasas de consumo de glucosa por parte de las celulas animales en cultivo pueden incrementarse por las mediciones de concentracion celular, las cuales en algunas realizaciones se realizan sin muestreo (por ejemplo, se realizan fotometricamente). Basandose en las mediciones de concentracion celular, pueden calcularse las tasas de suministro de glucosa a los cultivos celulares (si se desea en tiempo real) para la alimentacion restringida de glucosa a los cultivos celulares, es decir a una tasa de no mas del 45 % de una tasa de consumo de glucosa esperada o premodelada por parte de celulas animales en

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un cultivo que corresponde con condiciones de cultivo muy similares, pero en el que la concentracion de glucosa, en lugar de estar en un nivel restringido, es tal que cualquier aumento de la concentracion del mismo no afectara a la tasa de consumo de glucosa por parte de las celulas. Como se demuestra en las realizaciones de la invencion, la alimentacion restringida de glucosa permite controlar la produccion de acido lactico por parte de las celulas en cultivo en niveles bajos.

Se incluye la supervision del pH como procedimiento complementario para estimar el consumo de lactato y para la proteccion frente a la privacion de glucosa de las celulas en cultivo. La supervision del pH aprovecha el hecho de que las celulas consumiran lactato del cultivo si no hay glucosa disponible. A medida que las celulas consumen lactato se produce un incremento del pH del cultivo, por lo tanto un incremento del pH puede senalar que no hay disponible glucosa en el cultivo celular (es decir, que las celulas se encuentran privadas de glucosa). En consecuencia, en algunas realizaciones de la invencion, una estrategia de alimentacion que proporcione un bolo de alimentacion de glucosa y/o aumente la tasa de alimentacion restringida por glucosa a un cultivo celular, al producirse un incremento del pH, puede proteger a las celulas de la privacion por falta de glucosa. En algunas realizaciones, las mediciones de pH se obtienen sin “muestreo” (por ejemplo, las mediciones de pH se realizan a traves del uso in situ de un sensor de pH para el que no se extraen del cultivo alfcuotas que contienen celulas para medir el pH).

En particular, la invencion proporciona un procedimiento de cultivo celular para controlar la produccion del acido lactico en niveles bajos en un cultivo celular semicontinuo, que comprende: mezclar celulas animales y un medio para formar un cultivo celular y alimentar glucosa en el cultivo celular de una manera restringida. La alimentacion restringida de glucosa se produce cuando se proporciona glucosa a una tasa que es una funcion de una tasa esperada de consumo de glucosa por parte de las celulas animales cuando se las expone a un medio que contiene un nivel alto de glucosa. La funcion es la multiplicacion por un porcentaje de no mas del 45 %, incluyendo, pero sin limitacion, porcentajes tales como al menos el 33 %, de una tasa esperada. En realizaciones relacionadas adicionales, la alimentacion restringida de glucosa en el cultivo celular se logra sin muestreo de control por retroalimentacion durante el cultivo.

En algunas realizaciones de la invencion, se utiliza un sensor de concentracion celular para supervisar la concentracion celular en el cultivo celular, y se utiliza adicionalmente una medicion obtenida de un sensor de la concentracion celular para el calculo de la tasa a la que se alimentara glucosa de una manera restringida en el cultivo celular. Se utiliza un sensor de pH para supervisar el pH del cultivo celular y, en respuesta a un incremento del pH por encima de un valor predeterminado (por ejemplo de aproximadamente 7), se anade glucosa al cultivo celular (por ejemplo, en un bolo de alimentacion de glucosa y/o a una nueva tasa de alimentacion de glucosa de una manera restringida que es mayor que una tasa de adicion de glucosa inmediatamente anterior; en algunas realizaciones, una nueva tasa puede ser al menos del 15 % o no mas del 50 %, mayor que una tasa inmediatamente anterior, a condicion de que tal nueva tasa no alcance o exceda el 45 % de la tasa esperada de consumo de glucosa por parte de celulas de control expuestas a un nivel alto de glucosa). En otras realizaciones, en la determinacion de la tasa de alimentacion de glucosa de manera restringida en el cultivo celular puede utilizarse un sistema basado en un sensor de concentracion celular junto con un sistema basado en un sensor de pH. Puede utilizarse el sistema basado en un sensor de concentracion celular o el sistema basado en un sensor de pH, o ambos, sin “muestreo” del cultivo celular.

Otra realizacion del procedimiento de la invencion proporciona un procedimiento de cultivo celular para el control de la produccion de acido lactico a niveles bajos en un cultivo semicontinuo, que comprende: (a) mezclar celulas animales y un medio que contiene un nivel alto de glucosa para formar un primer cultivo celular, (b) determinar una tasa de consumo de glucosa (es decir, una tasa premodelada) para las celulas animales en cultivo en el primer cultivo celular, (c) mezclar celulas animales y un medio para formar un segundo cultivo celular, y (d) alimentar glucosa de una manera restringida al segundo cultivo celular a una tasa que es una funcion de la tasa de consumo de glucosa determinada de la etapa (b) (es decir, una funcion de la tasa premodelada de consumo de glucosa). La funcion es la multiplicacion por un porcentaje de no mas del 45 %, tal como al menos el 33 %, de la tasa de consumo de glucosa determinada (es decir, la tasa premodelada). En realizaciones relacionadas adicionales, la alimentacion restringida de glucosa en el segundo cultivo celular se lleva a cabo sin muestreo de control por retroalimentacion del segundo cultivo celular.

En algunas realizaciones de la invencion, se utiliza un sensor de concentracion celular para supervisar la concentracion celular en el segundo cultivo celular, en el que, para el calculo de la tasa de alimentacion de glucosa de una manera restringida en el segundo cultivo celular, se utiliza adicionalmente una medicion obtenida de un sensor de concentracion celular. Se utiliza un sensor de pH para la supervision del pH del segundo cultivo celular y, en respuesta a un incremento del pH por encima de un valor predeterminado (por ejemplo, de aproximadamente 7), se anade glucosa al segundo cultivo celular (por ejemplo, en un bolo de alimentacion de glucosa y/o a una nueva tasa de alimentacion de glucosa de una manera restringida que es mayor que una tasa inmediatamente anterior de adicion de glucosa; en algunas realizaciones, una nueva tasa puede ser al menos del 15%, o no mas del 50%, mayor que una tasa inmediatamente anterior). En otras realizaciones, para la determinacion de la tasa de alimentacion de glucosa de una manera restringida al segundo cultivo celular puede utilizarse un sistema basado en un sensor de concentracion celular junto con un sistema basado en un sensor de pH. Puede utilizarse el sistema basado en un sensor de concentracion celular o el sistema basado en un sensor de pH, o ambos, sin “muestreo” del

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segundo cultivo celular.

En el procedimiento de la invencion, las celulas se adaptan al crecimiento en condiciones de cultivo en las que se anade glucosa para probar cultivos celulares a tasas que son restringidas en comparacion con las tasas de consumo de glucosa en condiciones de cultivo de control (por ejemplo, en las que la concentracion de glucosa es tal que cualquier aumento de la concentracion no afectara a la tasa de consumo de glucosa por parte de las celulas animales). En particular, las celulas procedentes de dos cultivos celulares alimentados de forma restringida ejemplificados (que difieren en las tasas a las que se alimentaba glucosa de una manera restringida en los cultivos) produjeron niveles mas bajos de lactato que los producidos por los cultivos celulares de control. Tambien presentaron tasas de crecimiento y tasas de produccion de protema recombinante distintas. Los cultivos de alimentacion restringida de “rampa baja” presentaron niveles mas bajos de produccion de lactato que los cultivos de alimentacion restringida de “rampa alta”. Los cultivos de alimentacion restringida de “rampa baja” tambien presentaron tasas de crecimiento mas altas y tasas mas altas de produccion de protema recombinante que los cultivos de alimentacion restringida de “rampa alta”. En general, los cultivos de alimentacion restringida tanto de rampa baja como los cultivos de alimentacion restringida de rampa alta presentaron tasas de produccion de lactato mas bajas, tasas de crecimiento mas altas y tasas mas altas de produccion de protema recombinante que los cultivos de control.

Otras caractensticas y ventajas de la invencion resultaran evidentes a partir de la siguiente descripcion de realizaciones preferentes de la misma, y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripcion de los dibujos

FIG. 1. Control frente a alimentaciones restringidas de glucosa: curva de mejor ajuste.

FIG. 2. Glucosa acumulada: control frente a alimentacion de aumento esperado.

FIG. 3. Glucosa acumulada: control frente a alimentaciones premodeladas.

FIG. 4. Concentracion celular: control frente a alimentacion de aumento esperado.

FIG. 5. Tftulo de BMP-2 (normalizado): control frente a alimentacion de aumento esperado.

FIG. 6. Concentraciones de glucosa y de lactato: control frente a alimentacion de aumento esperado.

FIG. 7. Concentracion celular: control frente a alimentaciones premodeladas.

FIG. 8. Tftulo de BMP-2 (normalizado): control frente a alimentaciones premodeladas.

FIG. 9. Concentraciones de glucosa y de lactato: control frente a alimentaciones premodeladas.

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones: la expresion “celulas animales” abarca celulas de invertebrado, de vertebrado no mairftfero (por ejemplo de ave, de reptil y de anfibio) y celulas de mamfero. Los ejemplos no limitativos de celulas de invertebrado incluyen las siguientes celulas de insecto: celulas de Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori (gusano de seda/polilla de la seda). Las celulas de mairftfero preferentes incluyen celulas de rinon de hamster lactante (BHK), celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas de rinon humanas (293), diploides fetales normales de mono rhesus (FRhL-2) y de mieloma murino (por ejemplo, SP2/0 y NS0).

La expresion “medio de inoculacion base” se refiere a una solucion o sustancia que contiene nutrientes, pero no glucosa, en la que se inicia un cultivo celular. El “medio de alimentacion base” contiene los mismos nutrientes que el medio de inoculacion base, pero es una solucion o sustancia con la que se alimenta el cultivo celular tras el inicio del mismo.

Un “cultivo discontinuo” se refiere a un cultivo celular por el cual las celulas reciben medio de inoculacion base que contiene glucosa al inicio del cultivo y por el cual el cultivo celular suministra producto, por ejemplo protema recombinante, solo al finalizar el cultivo. De manera similar, un “cultivo semicontinuo” de celulas suministra producto solo en su punto de finalizacion. Sin embargo, las celulas en un cultivo semicontinuo reciben medio de inoculacion base que contiene glucosa al inicio del cultivo y se las alimenta con medio de alimentacion base que contiene glucosa en uno o mas puntos tras el inicio, pero antes de la finalizacion.

“Nivel alto de glucosa” significa una concentracion de glucosa en cultivos de celulas animales por la cual cualquier aumento de la concentracion de glucosa no afectara a la tasa de consumo de glucosa de las celulas.

Una “tasa de consumo de glucosa” refleja el consumo de glucosa de las celulas animales en cultivo en un punto del tiempo. Las tasas de consumo de glucosa pueden representarse de forma grafica (como en la curva de “mejor ajuste” en la parte superior de la FIG. 1) o a traves de una funcion matematica (como en la leyenda de la FIG. 1).

“Alimentacion de glucosa de una manera restringida” y/o “alimentacion restringida de glucosa” y/o “se alimenta glucosa de una manera restringida” y/o expresiones similares, se refieren a proporcionar una cantidad restringida de glucosa a un cultivo, de manera que la cantidad restringida proporcionada se determina o se calcula mediante una funcion, y es de no mas del 45 % de la cantidad de glucosa esperada o determinada que consumira un cultivo de control. Un “cultivo de control” significa un cultivo de las mismas celulas animales en condiciones de cultivo similares (por ejemplo, un cultivo de las mismas celulas en un medio de inoculacion base y de alimentacion similares, a la

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misma temperatura, comenzando con la misma concentracion celular inicial, etc.), excepto en que el cultivo tiene un nivel alto de glucosa. Por lo tanto, la funcion mediante la cual puede determinate o calcularse la cantidad restringida de glucosa proporcionada puede ser una funcion de una tasa esperada de consumo de glucosa, o una funcion de una tasa de consumo de glucosa determinada, por parte de las celulas en un cultivo de control. Puede producirse la alimentacion de glucosa de una manera restringida, mediante lo cual la glucosa se proporciona a una concentracion o concentraciones determinadas durante un periodo de tiempo, es decir, a una tasa o tasas determinadas, y/o mediante lo cual la glucosa se proporciona mediante uno o mas bolos de alimentacion de glucosa.

Las expresiones “funcion de una tasa esperada de consumo de glucosa” o “funcion de una tasa de consumo de glucosa determinada” (en donde la tasa de consumo de glucosa determinada es una tasa premodelada) pueden incluir varias relaciones matematicas entre una tasa esperada o premodelada de consumo de glucosa y una tasa de alimentacion restringida de glucosa (o una tasa restringida de adicion de glucosa), incluyendo relaciones en las que la tasa de alimentacion de glucosa es el producto de (es decir, el resultado de la multiplicacion de) (1) una tasa esperada o premodelada de consumo de glucosa en un punto del tiempo durante la duracion del cultivo celular y (2) un valor porcentual de no mas del 45 %. Las funciones cuadraticas, cubicas y exponenciales tambien se encuentran entre las muchas relaciones matematicas abarcadas por la invencion. Sin embargo, las funciones aplicables dentro del ambito de la invencion no incluyen aquellas en las que la tasa de alimentacion restringida de glucosa es una adicion invariante de tasa constante durante la duracion del cultivo celular.

“Nivel bajo de acido lactico” (o “nivel bajo de lactato”) en un cultivo celular se refiere a una concentracion de acido lactico (o de lactato) que es mas baja que las concentraciones de acido lactico (o de lactato) encontradas en celulas cultivadas con un nivel alto de glucosa.

“Muestreo” incluye la extraccion de muestras que contienen celulas de cultivos de celulas animales (por ejemplo, en un biorreactor) con el fin de medir caractensticas del medio de cultivo. “Muestreo” no incluye mediciones de la concentracion celular en las que no se retiran o se separan del cultivo muestras o alfcuotas que contienen celulas con el fin de medir la concentracion celular. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo estimaciones de la concentracion celular de tipo fotometrico sin “muestro” de un cultivo mantenido en un recipiente transparente o translucido. Ademas, “muestreo” no incluye la utilizacion in situ de un sensor de pH para medir el pH de un medio en el que se cultivan celulas animales, en el que no se retiran del cultivo muestras o alfcuotas que contienen celulas con el fin de medir el pH. La utilizacion de una sonda para medir el pH de un medio de cultivo celular no es “muestreo” como se define en el presente documento, si no se retiran o se separan del cultivo muestras o alfcuotas que contienen celulas.

Siguiendo una antigua convencion, los terminos “un” y “una” significan “uno o mas” o “una o mas” cuando se utilizan en la presente solicitud, incluyendo las reivindicaciones. Aunque la invencion se ha descrito con un determinado grado de particularidad, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones resultaran evidentes para los expertos en la materia a la luz de la divulgacion. Por consiguiente, se pretende que la totalidad de tales alternativas, modificaciones y variaciones, que estan incluidas dentro del esprntu y alcance de la invencion, esten abarcadas en las reivindicaciones definidas.

La presente invencion se refiere a un procedimiento de cultivo de celulas animales, de manera que los cultivos que mantienen niveles bajos de acido lactico tienen como resultado una viabilidad celular aumentada durante un periodo de tiempo mas largo, y producen niveles aumentados de protema recombinante. El experto en la materia reconocera que el procedimiento desvelado en el presente documento puede utilizarse para cultivar muchas de las bien conocidas celulas animales utilizadas y cultivadas de forma rutinaria en la tecnica, es decir, el procedimiento desvelado en el presente documento no se limita al uso solo con las celulas animales enumeradas dentro de la definicion de celulas animales.

Los procedimientos de la invencion se refieren a la alimentacion de glucosa de una manera restringida a un cultivo de celulas animales. Como se detalla adicionalmente en el Ejemplo 2, la alimentacion de glucosa de una manera restringida puede producirse proporcionando glucosa a una tasa que es una funcion de una tasa de consumo de glucosa esperada o determinada (por ejemplo, una tasa premodelada de consumo de glucosa) por parte de celulas animales en un cultivo de control, por ejemplo celulas cultivadas con un nivel alto de glucosa. La alimentacion de glucosa de una manera restringida tambien puede incluir proporcionar uno o mas bolos de glucosa.

El experto en la materia puede determinar las condiciones del cultivo de control sin necesidad de excesiva experimentacion. Por ejemplo, el experto en la materia entendera que las celulas animales normalmente se cultivan en un “medio”, el cual en general se refiere a una solucion que comprende nutrientes, incluyendo glucosa. Como tal, el experto en la materia conocera que la glucosa debena anadirse al medio de inoculacion base y de alimentacion antes de la inoculacion y alimentacion de las celulas animales, respectivamente. Se reconocera que la cantidad de glucosa anadida al medio de inoculacion base y al medio de alimentacion base puede diferir. De forma adicional, el experto en la materia reconocera que medio es apropiado para el cultivo de una celula animal particular (por ejemplo, celulas CHO) y la cantidad de glucosa que el medio debena contener para generar cultivos de celulas animales, de forma que exista un nivel alto de glucosa (ver, por ejemplo, Mather, J.P. y col. (1999), “Culture media, animal cells, large scale production”, Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation vol. 2:777-785,). En otras palabras, el experto en la materia reconocera la concentracion de glucosa a

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la que debe cultivarse una celula particular de forma que cualquier aumento de la concentracion de glucosa del cultivo no afecte a la tasa de consumo de glucosa de la celula. Debe distinguirse un nivel alto de glucosa en un cultivo celular de un nivel alto de glucosa anadida al medio de inoculacion base y de alimentacion; la concentracion de glucosa en este ultimo (por ejemplo, a 44, 200 o 280 g/l) normalmente se diluye durante la adicion al cultivo celular.

Un experto en la materia reconocera adicionalmente que la concentracion optima de otros nutrientes (por ejemplo, glutamina, hierro, oligoelementos D) o de agentes concebidos para el control de otras variables del cultivo (por ejemplo, la cantidad del espumado y la osmolalidad), variara dependiendo de la celula animal. Como tal, el ajuste de las concentraciones de tales nutrientes o agentes en los medios de inoculacion base y de alimentacion es rutinario en la tecnica. Ademas, el experto en la materia reconocera a que temperatura y concentracion debe cultivarse una celula particular.

En algunas realizaciones de la invencion, se verifica la concentracion celular y/o del pH del cultivo, y se utilizan para calcular la tasa de alimentacion restringida de glucosa. Los procedimientos para la medicion de la concentracion celular y/o el pH de un cultivo son bien conocidos de la tecnica; tales procedimientos se incluyen, pero sin limitacion, el uso de un Cedex (Innovatis GmbH, Bielefeld, Alemania) y/o un instrumento CASY (Scharfe system GmbH, Reutlingen, Alemania) para determinar la concentracion celular y/o un sensor de pH. Son particularmente utiles para la invencion reivindicada los procedimientos para la determinacion de la concentracion celular y el pH que no requieran muestreo, es decir, la extraccion de muestras que contienen celulas del cultivo animal, incluyendo, pero sin limitacion, el uso de una sonda de capacitancia, una sonda de densidad optica y/o una sonda de turbidez para medir la concentracion celular, y/o una sonda potenciometrica o colorantes sensibles al pH para medir el pH.

En algunas realizaciones de la invencion, una medicion obtenida de la concentracion celular y/o una medicion obtenida de un sensor de pH, determina que la alimentacion de glucosa de manera restringida debe continuar posteriormente a una nueva tasa que es mayor que a una tasa inmediatamente anterior. La nueva tasa a la cual se alimenta glucosa de una manera restringida es de no mas del 45 % de una tasa de consumo de glucosa esperada o determinada. En otras realizaciones, la nueva tasa se aumenta en el 1-15 % de la tasa inmediatamente anterior. En algunas realizaciones de la invencion, la nueva tasa se aumenta en al menos el 15 % de la tasa inmediatamente anterior. En otras realizaciones de la invencion, la nueva tasa se aumenta en no mas del 50 % de la tasa inmediatamente anterior.

Ejemplos

Ejemplo 1

Medios

Ejemplo 1.1: Medios de inoculacion

Se formulo un medio de inoculacion base para que incluyese los mismos componentes que el medio DMEM/F12, pero anadiendose los siguientes componentes: sulfato de dextrano 200 mg/l (la patente de Estados Unidos n.° 5.318.898 describe el uso del sulfato de dextrano en medios de cultivo), Nucellin 10 mg/l (un analogo de la insulina humana de origen de ADN recombinante; Ell Lilly (Indianapolis, IN)) y alcohol polivimlico (PVA) 2,4 g/l. El medio de inoculacion base fabricado para estos experimentos caredan de glucosa. Para el medio de inoculacion de control, se anadieron aproximadamente 10 g/l de glucosa al medio de inoculacion base antes de la inoculacion. Para el medio de inoculacion utilizado en los cultivos de alimentacion restringida de glucosa, se anadieron al medio de inoculacion base glucosa 0,8 g/l y NaCl 1,3 g/l; se anadio NaCl de manera que la osmolalidad inicial del medio de inoculacion utilizado en los cultivos de alimentacion restringida de glucosa fuese similar a la osmolalidad inicial del medio de inoculacion de control.

Ejemplo 1.2; Medios de alimentacion

Se formulo el medio de alimentacion base para que consistiese en los mismos componentes que el medio DMEM/ F12-medio de inoculacion base; el medio de alimentacion base formulado para estos experimentos caredan de glucosa. Para el medio de alimentacion de control, se anadieron aproximadamente 44 g/l de glucosa al medio de alimentacion base.

Ejemplo 2: Fijacion de las tasas de adicion de glucosa

Un enfoque para la fijacion de tasas de adicion de glucosa para los cultivos de alimentacion de glucosa restringida implico examinar las tasas de consumo de glucosa por parte de celulas CHO durante todo un cultivo discontinuo de control tfpico. La concentracion de glucosa en un cultivo de control tfpico se inicio a un nivel alto (por ejemplo, de aproximadamente 10 g/l) y se redujo de forma sostenida durante el crecimiento exponencial normal; se realizaron adiciones de glucosa tras el dfa 3. Para estos cultivos de control, es necesaria la complementacion de glucosa para evitar el agotamiento de la glucosa (por ejemplo, vease el perfil de concentracion de glucosa para el cultivo de control en la FIG. 9).

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Se determinaron las concentraciones de glucosa para cultivos de control utilizando procedimientos basado en muestreo, en los que se tomaron muestras en diversos puntos de tiempo tras la inoculacion, y se determinaron las concentraciones de glucosa de las muestras. Se tomaron muestras de forma diaria y se analizaron utilizando el analizador Bioprofile 100 (Nova Biomedical Corp., Waltham, MA), el cual mide las concentraciones de glucosa, lactato, glutamina, glutamato y amonio. Tambien se estimaron las concentraciones de glucosa de algunas muestras utilizando un kit Glucose HK (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, n.° de cat. GAHK-20).

En este enfoque basado en muestreo, se represento la tasa de glucosa consumida durante la fase de crecimiento exponencial del medio de cultivos de control frente al tiempo en incrementos de horas y dfas. Despues, se genero una curva de mejor ajuste exponencial (es decir, y = aebx) utilizando estos puntos de datos (para la curva de mejor ajuste de la FIG. 1, por ejemplo, a = 2,058 y b = 0,0064). A partir de esta curva, se extrapolaron las tasas de consumo de glucosa (g/l/h) para proporcionar cantidades de alimentacion restringida de glucosa de rampa baja y de rampa alta en cualquier punto de tiempo dado. Para los cultivos de alimentacion restringida de rampa baja, los valores de la representacion de la curva de mejor ajuste de control se multiplicaron por 33 % para estimar las tasas a las que se proporcionana glucosa a los cultivos de alimentacion restringida de rampa baja (veanse los triangulos negros de “rampa baja” de la FIG. 1). De manera similar, se multiplicaron los valores de la representacion de la curva de mejor ajuste de control por 45 % para estimar las tasas a las que se proporcionana glucosa a los cultivos de alimentacion restringida de rampa alta (veanse los cuadrados negros de “rampa alta” de la FIG. 1). Los multiplicadores 33% y 45% se eligieron de forma arbitraria. Todos los multiplicadores que teman porcentajes inferiores a 100%, o funciones que relacionaban la tasa de alimentacion restringida de glucosa con una tasa esperada o premodelada de consumo de glucosa en las que una tasa de alimentacion restringida de glucosa calculada es inferior a una tasa esperada o premodelada de consumo de glucosa, estan dentro del ambito de la invencion (excepto que las funciones admisibles no incluyan las relaciones en las que la tasa resultante de adicion de glucosa es una adicion invariante, de tasa constante, durante la duracion del cultivo celular).

Otro enfoque para la alimentacion de glucosa de una manera restringida implica utilizar un sistema de respuesta controlado por el pH en un sistema programado de cultivo de alimentacion de glucosa restringida. Cuando un cultivo de celulas de mairnfero (tales como celulas CHO) ha agotado la glucosa, las celulas del cultivo inician el consumo de lactato como una fuente de energfa de carbohidrato alternativa. La disminucion de la concentracion de lactato en el cultivo celular da como resultado un incremento del pH (al que reacciona el sistema de respuesta controlado por el pH).

Durante la implementacion de este enfoque, se programa una bomba de jeringa de una solucion de glucosa para que suministre glucosa a una tasa restringida (por ejemplo, 0,032 g/l/h; vease la tasa de adicion “de rampa baja” inicial de la Tabla 2), excepto que, cuando el pH del medio de cultivo asciende en 0,02 unidades de pH por encima de un valor predeterminado de 7,00, se activa el suministro de un bolo de alimentacion de glucosa (0,05 a 0,2 g de glucosa suministrados a partir del medio de alimentacion por litro de cultivo) y, ademas, posteriormente se aumenta la tasa de suministro restringido por parte de la bomba de jeringa a un nivel del 15 % al 50 % superior que la tasa de suministro restringido previa. Por ejemplo, el suministro de un bolo de 0,25 y 1,0 ml de medio de alimentacion que contiene 0,2 g/ml de glucosa proporciona a un cultivo celular de 1 l aproximadamente 0,05 a 0,2 g de glucosa.

En otro enfoque, se mide la concentracion celular de un cultivo celular sin muestreo para ayudar en el calculo de tasas para la alimentacion restringida de glucosa. Al iniciar los ensayos de este enfoque, se alimento glucosa en el cultivo de manera que la concentracion de glucosa permaneciese a un nivel considerado como adecuado para la concentracion celular del cultivo. Se utilizo un espectrofotometro Wedgewood (653 Absorbance Monitor con sensor de insercion modelo BT65 Series, Wedgewood Technology Inc., San Carlos, CA) para estimar la concentracion celular en cultivos en tiempo real. Para estimar la concentracion celular puede utilizarse de forma alternativa una sonda laser de turbidez (por ejemplo, modelo LA-300LT, ASR Co., Ltd., Tokio). Se emitio un haz de laser desde la sonda laser de turbidez a traves del cultivo celular desde la fuente de luz de la sonda, y se utilizo una curva de calibracion para convertir los valores de densidad optica en concentraciones celulares. Aunque las propiedades de absorcion lummica de las celulas no son constantes y la distribucion de tamanos de las celulas cambia durante el cultivo Zhou y Hu ((1994), Biotechnol. Bioeng. 44:170-77) han encontrado que la concentracion celular total de una lmea celular de hibridoma de raton-raton, MAK, se correlaciona de forma lineal con la senal procedente de una sonda laser de turbidez a concentraciones celular por debajo de 3,0x109 celulas/litro. En consecuencia, para ayudar en el calculo de las tasas para la alimentacion restringida de glucosa pueden llevarse a cabo mediciones espectrofotometricas de la concentracion celular (sin muestreo).

Otro enfoque combina un sistema de respuesta basado en un sensor de pH y un sistema obtenido de la concentracion celular con el uso de un programa de arranque de la alimentacion (configurado para aproximarse a las demandas esperadas de glucosa de un cultivo celular durante el tiempo). Puede utilizarse el sistema de respuesta basado en un sensor de pH o el sistema obtenido de la concentracion celular, o ambos, sin muestreo del cultivo celular.

No es necesaria paro la practica de la invencion el uso de una sonda sensora de glucosa para medir la concentracion de glucosa directamente (y no simplemente segun reflejan las mediciones de pH o de concentracion celular) en tiempo real (y de una manera que no requiera el muestreo de un cultivo), en particular debido a que la invencion proporciona tasas restringidas de suministro de glucosa a cultivos de celulas animales, en lugar de

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simplemente mantener una concentracion de glucosa baja en el cultivo, para superar la capacidad de las celulas de adaptarse a una concentracion de glucosa baja. Sin embargo, el uso de un sensor de glucosa en la practica de los procedimientos desvelado puede estar dentro del ambito de la presente invencion.

Ejemplo 3; Produccion de BMP-2 en celulas CHO

El fin de estos experimented fue implementar estrategias de alimentacion restringida de glucosa para controlar la produccion de lactato a niveles bajos en cultivos celulares semicontinuos (de forma concreta en cultivos de un litro (1 l)) que utilizaban celulas CHO (de forma concreta celulas EMCG5) para la produccion de protema morfogenetica osea 2 (BMP-2, siglas del ingles bone morphogenetic protein-2) recombinante (patente de Estados Unidos n.° 5.318.898; patente de Estados Unidos n.° 5.618.924 y patente de Estados Unidos n.° 5.631.142, describen adicionalmente las protemas BMP-2 y su produccion). Se supervisaron los efectos de las estrategias de alimentacion restringida de glucosa sobre la concentracion y viabilidad celulares, la produccion de lactato, la productividad de protema y la duracion extendida del lote.

Se alimento en un biorreactor solucion esteril de glucosa de una manera restringida, utilizando una bomba de jeringa programada para aumentar la glucosa proporcionada a traves de todo el cultivo celular semicontinuo. En un conjunto de ensayos se anadio glucosa al cultivo como funcion de (por ejemplo, como porcentaje de) una tasa previamente determinada de consumo de glucosa por parte de las celulas animales expuestas a un nivel alto de glucosa (es decir, como funcion de una tasa premodelada).

Ademas se supervisaron los episodios de privacion de glucosa utilizando un sensor de pH (Bradley-James Corp.) que no requirio muestreo. Por consiguiente, un incremento de 0,02 unidades de pH por encima de un valor predeterminado de 7,00 se considero que indicaba que se habfa agotado por completo la glucosa del medio de cultivo y que las celulas habfan comenzado a consumir acido lactico. La disminucion de los niveles de acido lactico en los cultivos provoca un aumento del pH del medio de cultivo celular; esta relacion permite que un sistema basado en un sensor de pH anticipe los episodios de privacion de glucosa.

Para evaluar la eficacia de un sistema basado en un sensor de pH para la prevencion de la privacion de glucosa en experimentos de alimentacion restringida de glucosa, se programo una bomba de jeringa para suministrar un bolo de alimentacion de glucosa en el biorreactor si el pH ascendfa por encima de un valor predeterminado de 7,00. Un incremento de 0,02 unidades de pH por encima de 7,00 activaba el suministro de un bolo de alimentacion de glucosa, aumentando la tasa restringida posterior de suministro continuo de glucosa en el 15 % en algunos ensayos, en el 50 % en otros.

En estos experimentos, se utilizaron biorreactores Applikon® de 2 l con un volumen de trabajo de 1 l (Applikon Biotechnology, Foster City, CA). Se proporciono aire por chorro a demanda para mantener el oxfgeno disuelto al 23 % de saturacion de aire y se utilizo emulsion C antiespumante de calidad medica (Dow Coming Corporation, Midland, MI) para evitar el espumado. Durante todo el cultivo semicontinuo se mantuvo la temperatura a 37 °C. Se llenaron de forma aseptica jeringas Becton Dickinson® (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) con solucion de glucosa de control o experimental para suministrar glucosa a los cultivos de control o de alimentacion restringida, respectivamente, en los biorreactores.

En un primer experimento (es decir, un experimento de aumento esperado de la alimentacion), un cultivo de control representativo utilizo cantidades crecientes de glucosa cada dfa, y se utilizo una curva de mejor ajuste exponencial para aproximar la cantidad de glucosa consumida por el cultivo de control cada dfa. Utilizando la curva de mejor ajuste como base, se configuro una bomba de jeringa (Yale Apparatus, Wantagh, NY) para alimentar glucosa al cultivo experimental a una tasa de alimentacion restringida, es decir, aproximadamente al 50-70 % de la cantidad consumida por el cultivo de control. La tasa de alimentacion restringida se cambio cada dfa para responder a la concentracion celular creciente. La concentracion de la alimentacion de glucosa era de 200 g/l.

La concentracion inicial de glucosa en el cultivo de control (1 l) era de 10,38 g/l. Despues de poco mas de tres dfas se anadio glucosa (2,2 g) al cultivo de control a intervalos de 24 h (es decir, a las 75,5, 99,5 y 123,5 h de cultivo) (Tabla 1, FIG. 2 y FIG. 6). La concentracion inicial de glucosa en el cultivo de alimentacion restringida (1 l) era de 1,1 g/l. Se aumento en cuatro veces la tasa de alimentacion restringida continua de glucosa en el cultivo de alimentacion restringida (tras 27,5, 51,5, 75,5 y 99,5 h de cultivo) a partir de una tasa de alimentacion restringida continua inicial de 0,046 g/l/h (la cual se mantuvo en el periodo de cultivo de de 20 a 27,5 horas) (Tabla 1).

Tabla 1. Experimento de alimentacion de aumento esperado: adicion de glucosa

Adicion de glucosa al cult (concentracion inicial de c: vo de control de 1 l lucosa: 10,38 g/l) Tasas de adicion al cultivo de alimentacion restringida (concentracion inicial de glucosa: 1,1 g/l)

Punto (h): Cantidad (g) Periodo (h) Tasa (g/l/h)

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--: o CM O 0

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--: 20 -27,5 0,046

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(continuacion)

Punto (h): Cantidad (g) Periodo (h) Tasa (g/l/h)

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--: 27,5 -51,5 0,068

75,5: 2,2 51,5 -75,5 0,088

99,5: 2,2 75,5 -99,5 0,104

123,5: 2,2 99,5 - 147,5 0,12

La tasa de consumo de glucosa en el cultivo de alimentacion restringida se aproximaba a la tasa restringida de suministro de glucosa a lo largo de toda la duracion de la alimentacion restringida continua de glucosa en el cultivo de alimentacion restringida. Esto se pone de manifiesto en que la concentracion de glucosa en el cultivo de alimentacion restringida permanece proxima a cero tras comenzar la alimentacion continua de glucosa de una manera restringida tras 20 h de cultivo (FIG. 6). Por otro lado, las tasas de consumo de glucosa en los cultivos de control no estaban limitadas por una tasa restringida de suministro de glucosa. En consecuencia, las tasas de consumo de glucosa en los cultivos de control continuaron durante varios dfas a niveles mas altos que en los cultivos de alimentacion restringida (Tabla 6). Las concentraciones de lactato (FIG. 6) y las tasas de produccion de lactato (Tabla 7) tambien permanecieron mas bajas para los cultivos de alimentacion restringida que para los cultivos de control a lo largo de todo este experimento de alimentacion de aumento esperado.

En un segundo experimento (es decir, un experimento de alimentaciones premodeladas), se utilizo la programacion de arranque de la alimentacion de una bomba de jeringa doble (KD Scientific, Holliston, MA). Para este experimento de alimentaciones premodeladas, la concentracion de glucosa era de 0,28 g/ml para la alimentacion de glucosa de rampa alta y de 0,20 g/ml para la alimentacion de glucosa de rampa baja. En contraste con el experimento de alimentacion de aumento esperado, por el cual la bomba de jeringa suministro glucosa de forma continua a una tasa prefijada de alimentacion restringida durante un periodo de tiempo, por ejemplo 0,046 g/h entre las 20-20,7 horas y 0,068 g/h entre 27,5 y 51,5 las horas, etc., la programacion de arranque de la bomba de jeringa en el experimento de alimentaciones premodeladas permitio que la tasa de alimentacion restringida de glucosa aumentase de forma gradual hasta asemejarse al 33 % y el 45 % de la curva de mejor ajuste exponencial de glucosa consumida por el cultivo de control cada dfa. La programacion de arranque permitio programar las tasas restringidas inicial y final para cada periodo de tiempo, por ejemplo 12 h, y la bomba cambiana la tasa de forma continua de modo lineal durante ese periodo de tiempo. La Tabla 2 proporciona datos representativos sobre la adicion de glucosa para este experimento de alimentaciones premodeladas.

Tabla 2. Experimento de alimentaciones premodeladas: adicion de glucosa

Adicion de glucosa al cultivo de control de 1 l (concentracion inicial de glucosa: 8,4 g/l)

Punto (h): Cantidad (g)

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--

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--

67,5: 2,2

94,75: 2,2

119,75: 2,2

143,75: 2,2

167,75: 2,2

191: 2,2

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(continuacion)

Alimentacion restringida

: Tasas de adicion a cultivos de alimentacion restringida (concentracion inicial de glucosa: 0,88 g/l)

Periodo (h): Tasa de la jeringa (ml/h) Rampa baja (alimentacion de 0,2 g/ml) g/hora anadidos a 1 l Rampa alta (alimentacion de 0,28 g/ml) g/hora anadidos a 1 l

0 -19,75: 0 0 0

19,75 -43,75: 0,160 -0,184 0,0320 -0,0368 0,0448 -0,0515

43,75 -67,75: 0,184 -0,224 0,0368 - 0,0448 0,0515 -0,0627

67,75 -91,75: 0,224 - 0,264 0,0448 - 0,0528 0,0627 -0,0739

91,75 -115,75: 0,264 - 0,304 0,0528 -0,0608 0,0739 -0,0851

115,75 - 139,75: 0,304 -0,344 0,0608 -0,0688 0,0851 -0,0963

139,75 - 140,25: 0,344 - 0,346 0,0688 -0,0692 0,0963 -0,0969

140,25 - 164,25: 0,400 -0,450 0,0800 -0,0900 0,1120 -0,1260

164,25 - 191: 0,450 0,0900 0,1260

La FIG. 2 representa la cantidad acumulada de glucosa suministrada a lo largo del tiempo para el experimento de alimentacion de incremento esperada, y la FIG. 3 representa la cantidad acumulada de glucosa suministrada a lo largo del tiempo para el experimento de alimentaciones premodeladas. Las FIG. 2 y 3 incluyen, cada una, las cantidades iniciales de glucosa proporcionadas en los reactores tanto de control como de alimentacion restringida (y no simplemente las cantidades de glucosa total suministrada por jeringa). En ambos experimentos, un lote de control tema un nivel inicialmente alto de glucosa, y se anadio glucosa (2,2 g) de forma diaria tras aproximadamente 72 h. Para los cultivos de alimentacion restringida, los biorreactores teman en el dfa 0 aproximadamente 1 g/l de glucosa, y el suministro de glucosa por jeringa comenzo tras aproximadamente despues de 20 horas.

El experimento de alimentacion de aumento esperado demostro que el crecimiento celular en el cultivo de alimentacion restringida inicialmente se encontraba retardado en comparacion con el crecimiento celular en el cultivo de control, pero que el crecimiento celular en el cultivo de alimentacion restringida finalmente alcanzo en el dfa 6 una concentracion celular final mas alta (FIG. 4). En el cultivo de control, la concentracion celular alcanzo un maximo mucho antes y la viabilidad comenzo a descender rapidamente tras el dfa 4 (FIG. 4). En contraste con el cultivo de control, la tasa de crecimiento celular en el cultivo de alimentacion restringida permanecio positiva hasta el dfa 6 (Tabla 3).

Aunque el cultivo de alimentacion restringida alcanzo una concentracion celular final mas alta en comparacion con el cultivo de control en el dfa 6, el dfa 5 los cultivos teman concentraciones similares (figura 4). Estos datos demuestran que la viabilidad disminuida de las celulas en el cultivo de control en comparacion con la viabilidad de las celulas en el cultivo de alimentacion restringida no era una funcion de las celulas que alcanzan la capacidad maxima del biorreactor. En cambio, los datos de la Figura 4 en combinacion con la demostracion de un nivel bajo de lactato en los cultivos de alimentacion restringida en comparacion con el nivel de lactato en los cultivos de control (Figura 6) sugieren que la viabilidad aumentada de las celulas cultivadas en los cultivos de alimentacion restringida era una funcion del nivel bajo de lactato alcanzado mediante la alimentacion de glucosa de una manera restringida a las celulas.

Tabla 3. Experimento de alimentacion de aumento esperado: tasas de crecimiento celular (valores p de Cedex por h; valores p de Cedex = concentracion celular en unidades de 105 celulas por ml)

Dfa: Tasas de crecimiento de control (p(h'1)) Tasas de crecimiento de alimentacion restringida (p(h'1))

1: 0,027 0,027

2: 0,032 0,026

4: 0,016 0,017

5: 0,001 0,007

6: -0,014 0,005

La FIG. 5 presenta graficos de los tftulos de BMP-2 normalizados. Los valores de los tftulos de BMP-2 se normalizaron como una fraccion del valor del tftulo de BMP-2 en el dfa 6 del experimento de alimentacion de aumento esperado. La Tabla 4 presenta los valores para las tasas de produccion de BMP-2 correspondientes. Las tasas de produccion de BMP- 2 se normalizan como una fraccion de la tasa de produccion de BMP-2 del cultivo de control en el dfa 1. Tras el dfa 4, los tftulos de BMP-2 se estabilizaron en el cultivo de control, pero continuaron

aumentando en el cultivo de alimentacion restringida (FIG. 5). En contraste con el cultivo de control, las tasas de produccion de BMP-2 del cultivo de alimentacion restringida permanecieron positivos hasta el d^a 6 (Tabla 4). Debe indicarse que, aunque la FIG. 5 sugiere que los cultivos de control demostraron el dfa 5 un tftulo ligeramente disminuido de BMP-2, es probable que las pequenas disminuciones observadas sean un reflejo de la variabilidad 5 experimental y no una disminucion real del tftulo de BMP-2 del cultivo.

Tabla 4. Experimento de alimentacion de aumento esperado: tasa de produccion de BMP-2 (normalizada)

Dfa: Tasa de produccion de control Tasa de produccion en alimentacion restringida

1: 1,00 0,84

2: 0,71 0,77

4: 0,40 0,65

5: -0,07 0,21

6: 0,08 0,40

El mantenimiento de un nivel bajo de acido lactico utilizando una estrategia de alimentacion de glucosa de una manera restringida potencio el crecimiento celular y la productividad de protema. El tftulo final de BMP2 era 10 aproximadamente el 70 % mas alto en el cultivo de alimentacion restringida (FIG. 5) y la tasa de produccion de BMP-2 no se hizo negativa como lo hizo en el cultivo de control (Tabla 4).

La FIG. 6 presenta perfiles de concentracion de glucosa (g/l) y de concentracion de lactato (g/l) del experimento de alimentacion de aumento esperado, y la Tabla 5 presenta los datos representativos correspondientes de concentracion de glucosa (g/l) y de concentracion de lactato (g/l) de este experimento. La Tabla 6 presenta valores 15 para las tasas de consumo de glucosa correspondientes, y la Tabla 7 presenta valores para las tasas de produccion de lactato correspondientes.

Tabla 5. Experimento de alimentacion de aumento esperado: concentraciones de glucosa y de lactato

: Concentracion de glucosa (g/l)

Hora: Control Alimentacion restringida

0: 10,38 1,10

20,75: 8,96 0,22

51,25: 5,20 0,06

75,5: 7,40 --

92,5: 0,78 0,07

99,5: 2,98 --

115,25: 0,10 0,08

123,5: 2,30 --

142,5: 0,10 0,07

: Concentracion de lactato (g/l)

Horas: Control Alimentacion restringida

0: 0,12 0,16

20,75: 1,40 1,14

51,25: 3,40 2,26

75,5: -- --

92,5: 5,78 3,82

99,5: -- --

115,25: 6,50 4,20

123,5: -- --

142,5: 6,96 4,60

Dfa: Qglucosa de control (mg/106 celulas/dfa) Qglucosa de alimentacion restringida (mg/106 celulas/dfa)

1: 1,90 1,32

2: 1,54 1,02

4: 0,90 0,66

5: 0,51 0,53

6: 0,39 0,48

Tabla 7. Experimento de alimentacion de aumento esperado: tasa de produccion de lactato

Dfa: Qlactato de control (mg/106 celulas/dfa) Qlactato de alimentacion restringida (mg/106 celulas/dfa)

1: 1,71 1,41

2: 0,82 0,55

4: 0,32 0,26

5: 0,13 0,08

6: 0,08 0,06

5 Para el cultivo de alimentacion restringida en el experimento de alimentacion de aumento esperado, las tasas de consumo de glucosa eran mas bajas en el cultivo de alimentacion restringida que en el cultivo de control del dfa 1 al dfa 3 (Tabla 6), y las tasas de produccion de lactato durante todo el periodo de cultivo eran mas bajas en el cultivo de alimentacion restringida que en el cultivo de control (Tabla 7), lo que dio como resultado concentraciones de lactato mas bajas para el cultivo de alimentacion restringida, durante todo el periodo de cultivo (FIG. 6).

10 Tambien se midieron los perfiles de osmolalidad y la cantidad de titulador (una mezcla de carbonato sodico y bicarbonato sodico) utilizado por dfa en cada uno de los biorreactores. La Tabla 8 presenta los perfiles de osmolalidad, y la Tabla 9 presenta la cantidad de titulador utilizado por dfa (por cada 1 l de volumen de trabajo) en cada una de las dos condiciones de cultivo.

Tabla 8. Experimento de alimentacion de aumento esperado: osmolalidad

Dfa: Osmolalidad de control (mOsm/l) Osmolalidad de glucosa restringida (mOsm/l)

0: 286 289

1: 295 312

2: 340 324

4: 382 371

5: 394 362

6: 413 375

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Tabla 9. Experimento de alimentacion de aumento esperado: uso de titulador

Dfa: Uso de titulador de control (ml/dfa) Uso de titulador en glucosa restringida (ml/dfa)

0-1: 3 1

1-2: 16 3

2-4: 25 20

4-5: 10 1

5-6: 6 9

El nivel de osmolalidad en general mas bajo (Tabla 8) y el uso mas bajo de titulador (Tabla 9) en el cultivo de alimentacion restringida (frente al cultivo de control) pueden atribuirse a las cantidades mas bajas de lactato 20 producidas (que requieren menor neutralizacion con titulador).

En el experimento de alimentaciones premodeladas, se establecio como control un biorreactor; se mantuvo en el un cultivo semicontinuo convencional. Ademas, se prepararon dos biorreactores de ensayo con cultivos de alimentacion restringida - uno para el suministro restringido de glucosa de “rampa baja” y otro para el suministro restringido de glucosa de “rampa alta”. Para cada biorreactor de ensayo se utilizo una bomba de jeringa para aumentar de forma

continua la tasa de alimentacion restringida de glucosa. La concentracion de la solucion de glucosa administrada en el biorreactor de rampa baja era de 0,2 g/ml; la concentracion en el biorreactor de rampa alta era de 0,28 g/ml.

La FIG. 7 presenta de forma grafica los datos de concentracion celular (lmeas continuas) y de viabilidad celular (lmeas discontinuas) a lo largo de los periodos de cultivo en biorreactores de control y de ensayo; la Tabla 10 5 presenta los datos de tasas de crecimiento celular para los biorreactores de control y de ensayo.

Tabla 10. Experimento de alimentaciones premodeladas: tasas de crecimiento celular (valores p de Cedex por h; valores p de Cedex = concentracion celular en unidades de 105 celulas por ml)

Dfa: Tasas de control (p(h'1)) Tasas de rampa baja (p(h'1)) Tasas de rampa alta (p (h'1))

1: 0,030 0,026 0,024

2: 0,035 0,029 0,030

3: 0,029 0,026 0,025

4: 0,009 0,016 0,017

5: 0,005 0,011 0,010

6: -0,004 0,012 0,009

7: -0,013 0,006 0,005

8: -0,012 0,002 0,003

En ambos cultivos de alimentacion restringida, la concentracion celular continuo aumentando hasta el dfa 8 (192 h);

10 ademas, la viabilidad celular se mantuvo en niveles altos a lo largo de este mismo periodo (FIG. 7). Por el contrario, aproximadamente el dfa 5 (120 horas) la concentracion celular en el cultivo de control alcanzo un maximo, seguido de una bajada brusca de la concentracion celular, y una bajada todavfa mas brusca de la viabilidad celular (FIG. 7). El cultivo de rampa baja alcanzo una concentracion celular de mas de 12x106 celulas/ml el dfa 8, y la viabilidad celular se mantuvo superior al 90 % (FIG. 7).

15 Los niveles del tftulo de BMP-2 observados en los cultivos de alimentacion restringida respaldan la utilidad de los procedimientos de la invencion para mejorar la produccion de protemas a partir de celulas animales en cultivo (en particular para el cultivo en rampa baja). La FIG. 8 presenta los niveles del tftulo de BMP-2 para los biorreactores de control y de ensayo normalizados como una fraccion del tftulo de BMP-2 maximo (dfa 5) para el cultivo de control. La Tabla 11 presenta las tasas de produccion de BMP-2 para los biorreactores de control y de ensayo normalizados

20 como una fraccion de la tasa de produccion de BMP-2 del cultivo de control el dfa 1 (como tambien se ha normalizado en la Tabla 4).

Tabla 11. Experimento de alimentaciones premodeladas: tasa de produccion de BMP-2 (normalizada)

Dfa: Tasa de produccion de control Tasa de produccion de rampa baja Tasa de produccion de rampa alta

1: 1,00 1,19 1,17

2: 1,01 0,75 0,77

3: 0,94 0,94 1,02

4: 0,67 0,86 1,02

5: 0,16 1,06 0,56

6: -0,19 1,15 0,59

7: -0,39 0,52 -0,02

8: -0,02 0,43 -0,03

El tftulo final mas alto se consiguio en el cultivo de alimentacion restringida de rampa baja; este nivel del tftulo es 25 mas de tres veces mas alto que el tftulo maximo de BMP-2 alcanzado en el cultivo de control (FIG. 8). La tasa de produccion de BMP-2 se mantuvo alta durante seis dfas en el cultivo de rampa baja (Tabla 11). La tasa de produccion de BMP-2 en el cultivo de alimentacion restringida de rampa alta descendio mas rapidamente que la tasa de produccion de BMP-2 en el cultivo de alimentacion restringida de rampa baja (Tabla 11). Este descenso mas rapido de la tasa de produccion de BMP-2 se debe con probabilidad a la presencia de un nivel mas alto de 30 inhibidores, tales como el lactato, en el cultivo de rampa alta que en el cultivo de rampa baja.

La FIG. 9 presenta perfiles de concentraciones (g/l) de glucosa (lmeas continuas) y de lactato (lmeas discontinuas) del experimento de las alimentaciones premodeladas para los biorreactores de control y de ensayo, y la Tabla 12 presenta los datos representativos correspondientes para las concentraciones (g/l) de glucosa y de lactato

procedentes de este experimento. La Tabla 13 presenta datos de la tasa de consumo de glucosa, y la Tabla 14 presenta datos de la tasa de produccion de lactato, para los biorreactores de control y de ensayo.

Tabla 12. Experimento de alimentaciones premodeladas: concentraciones de glucosa y de lactato

: Concentracion de glucosa (g/l)


: Alimentacion restringida

Horas: Control Rampa baja Rampa alta

0: 10,46 1,09 1,09

18,75: 8,68 0,01 0,00

42,75: 6,38 0,12 0,08

66,25: 3,07 0,05 0,05

67,75: 5,82 -- --

92,25: 1,61 0,16 0,11

94,75: 4,36 -- --

115,75: 0,44 0,06 0,05

119,75: 3,19 -- --

139,75: 0 0 0

143,75: 2,75 -- --

164,5: 0,54 0,07 0,22

167,75: 3,29 -- --

187,25: 0,87 0,06 0,39

191: 3,62 -- --

: Concentracion de lactato (g/l)

Hora: Control Alimentacion restringida

Rampa baja: Rampa alta

0: 0,01 0,02 0,01

18,75: 1,20 1,06 1,08

42,75: 2,90 1,58 1,88

66,25: 4,68 2,06 2,77

67,75: -- -- --

92,25: 5,92 2,20 3,43

94,75: -- -- --

115,75: 7,76 1,86 3,68

119,75: -- -- --

139,75: 8,04 1,24 4,08

143,75: -- -- --

164,5: 7,60 1,18 4,36

167,75: -- -- --

187,25: 7,72 1,09 4,76

191: -- -- --

Dfa: Qglucosa de control (mg/106 celulas/dfa) Qglucosa de rampa baja (mg/106 celulas/dfa) Qglucosa de rampa alta (mg/106 celulas/dfa)

1: 2,90 1,67 1,69

2: 1,43 0,45 0,68

3: 0,99 0,36 0,48

4: 0,73 0,22 0,33

5: 0,63 0,22 0,29

6: 0,49 0,18 0,26

7: 0,40 0,18 0,27

8: 0,65 0,18 0,26

Tabla 14. Experimento de alimentaciones premodeladas: tasa de produccion de lactato

Dfa: Qlactato de control (mg/106 celulas/dfa) Qlactato de rampa baja (mg/106 celulas/dfa) Qlactato de rampa alta (mg/106 celulas/dfa)

1: 1, 94 1,61 1,66

2: 1, 06 0,35 0,53

3: 0,53 0,17 0,31

4: 0,22 0,03 0,13

5: 0,30 -0,05 0,04

6: 0,04 -0,07 0,05

7: -0,08 -0,01 0,03

8: 0,03 -0,01 0,04

5 Los perfiles de lmeas discontinuas de la FIG. 9 ponen de manifiesto las diferencias de produccion de lactato entre los tres cultivos. La comparacion de estos perfiles de la FIG. 9 revela que los niveles de lactato mas bajos aparecen cuando la alimentacion de glucosa restringida se establecio a una tasa de “gradiente bajo”. La muy baja tasa de produccion de lactato en el cultivo con alimentacion restringida de glucosa de rampa baja (FIG. 9 y Tabla 14) probablemente es responsable de la capacidad de las celulas en ese cultivo de mantener tal productividad alta. La 10 tasa de consumo de glucosa se estabilizo en aproximadamente 0,2 mg/106 celulas/dfa en el cultivo de rampa baja (Tabla 13).

La Tabla 15 presenta los perfiles de osmolalidad para los cultivos de control y de alimentacion restringida, y la Tabla 16 presenta los datos de uso de titulador para estos cultivos (nuevamente, por volumen de trabajo de 1 l).

Tabla 15. Experimento de alimentaciones premodeladas: osmolalidad

Dfa: Osmo. de control (mOsm/l) Osmo. de rampa baja (mOsm/l) Osmo. de rampa alta (mOsm/l)

0: 290 288 271

1: 299 290 293

2: 320 298 304

3: 349 306 324

4: n.e. n.e. n.e.

5: 408 296 334

6: 427 287 353

7: 437 221 308

8: 413 237 366

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Dfa: Titulador de control (ml/dfa) Titulador de rampa baja (ml/dfa) Gradiente alto de titulador (ml/dfa)

1
1: 0 5

2: 8 2 3

3: 10 2 4

4: 13 2 6

5: 10 1 4

6: 8 3 8

7: 5 1 2

8: 5 0 7

La osmolalidad en el cultivo de alimentacion restringida de rampa baja aumento de forma ligera desde un nivel de partida de 288 mOsm/l hasta solo 306 mOsm/l el d^a 3, antes de estabilizarse en un nivel de 237 mOsm/l el dfa 8 (Tabla 15). El cultivo de rampa baja tambien requirio relativamente poco titulador del dfa 1 al dfa 8 (Tabla 16). Por otra parte, la osmolalidad en el cultivo de control aumento en casi el 50 % hasta el dfa 7 (Tabla 15), y el uso de titulador para el cultivo de control en todo momento sobrepaso el uso de titulador para el cultivo de rampa baja (Tabla 16). De manera similar, excepto en el dfa 1 y el dfa 8, el uso de titulador para el cultivo de control tambien sobrepaso el uso de titulador para el cultivo de alimentacion restringida de rampa alta (Tabla 16). Como en el experimento de alimentacion de aumento esperado, el nivel mas bajo de osmolalidad (Tabla 15) y el uso en general mas bajo de titulador (Tabla 9) en los cultivos de alimentacion restringida (cultivos de alimentacion restringida tanto de rampa baja como alta) frente al cultivo de control, se pueden atribuir a las menores cantidades de lactato producidas (que requieren menos neutralizacion con titulador) en el experimento de alimentacion premodelada.

La alimentacion de glucosa de una manera restringida en los medios de cultivo celular (y de esta manera el mantenimiento de la produccion de lactato baja en el medio) tema varios efectos positivos en estos experimentos (en particular sobre la productividad de protema; FIG. 5 y Tabla 4, y FIG. 8 y Tabla 11). Estos efectos positivos se obtuvieron programando los suministros de glucosa para que aumentasen en todos estos cultivos semicontinuos, para anticipar las necesidades de glucosa estimadas para los aumentos esperados o premodelados de las necesidades de glucosa (por ejemplo, como resultado de los aumentos de la concentracion celular), aunque en todo momento alimentando la glucosa de una manera restringida.

Esta estrategia de alimentacion restringida dio como resultado reducciones significativas de las tasas de produccion de lactato (en todo el experimento de alimentacion de aumento esperado - Tabla 7; vease tambien la FIG. 6 - y en la mayor parte del experimento de alimentaciones premodeladas - Tabla 14; vease tambien la FIG. 9) en comparacion con los cultivos de control, en los cuales el medio de cultivo celular inicialmente contema un nivel elevado de glucosa (por ejemplo, de aproximadamente 10 g/l). La concentracion celular (ver las Tablas 3 y 10) y los niveles de produccion de protema (veanse las Tablas 4 y 11) en los cultivos de ensayo de alimentacion restringida continuaron aumentando despues de que estos determinantes alcanzaran un maximo en los cultivos de control. En particular, en el experimento de alimentaciones premodeladas, el cultivo de alimentacion restringida de rampa baja logro un tttulo final de protema recombinante que era mas de tres veces mas alto que el tftulo maximo del cultivo de control (FIG. 8).

En vista de los niveles de tftulos de BMP2 normalizados logrados (FIG. 8), puede observarse que una ventaja clave de la alimentacion restringida de glucosa para el control de la produccion del acido lactico a niveles bajos es la mejora de la productividad del procedimiento (en particular cuando se mide en terminos de tasas de produccion de protema). La alimentacion de glucosa de una manera restringida para el control de la produccion del acido lactico en niveles bajos tambien puede facilitar la productividad del procedimiento al medir esta ultima en terminos de concentracion celular (FIG. 7).

Resulta importante que los beneficios de la invencion se logran mediante tasas restringidas de suministro de glucosa a los cultivos de ensayo, en lugar de simplemente mediante el mantenimiento de las concentraciones de glucosa bajas en los cultivos de ensayo. Por ejemplo, los perfiles de concentracion de glucosa en los cultivos tanto de rampa baja como de rampa alta del experimento de alimentaciones premodeladas eran, de manera similar, bajos, pero el perfil de produccion de lactato del cultivo de rampa baja permanecio claramente por debajo del perfil de produccion de lactato del cultivo de rampa alta (FIG. 9 y Tabla 12). Por consiguiente, los perfiles metabolicos beneficiosos son el resultado de la adaptacion de las celulas animales en cultivo para crecer en condiciones de cultivo en las que la disponibilidad de glucosa esta limitada por el suministro restringido de glucosa al cultivo, en particular cuando el suministro restringido se basa en tasas esperadas o premodeladas de las capacidades de consumo de glucosa por parte de las celulas animales en cultivo. Con independencia de cuantos transportadores de glucosa expresan las celulas en cultivo, las celulas tienen la capacidad de obtener suficiente glucosa para producir solo niveles bajos de acido lactico al alimentar la glucosa a los cultivos solo a una tasa restringida.

5

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25

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35

Ejemplo 4;

Sistema basado en un sensor de concentracion celular

Para facilitar el suministro de glucosa a tasas restringidas en tiempo real puede utilizarse un sensor de la concentracion celular que no se basa en muestreo. Un sistema de verificacion por ordenador mediante el cual pueden determinarse las concentraciones celulares sin muestreo (por ejemplo, a traves del uso de un sistema en el que la concentracion celular de un cultivo de celulas animales se estima a traves de mediciones fotometricas de la turbidez del cultivo) se programa para que registre las concentraciones celulares cada cinco minutos, y para enviar esos datos a un sistema informatico conectado que controla el suministro de glucosa al cultivo de celulas animales. Este sistema informatico conectado esta programado, a su vez, tanto para calcular una tasa de suministro restringido de glucosa como para suministrar glucosa al cultivo de celulas animales a esa tasa restringida. Esta tasa restringida de suministro de glucosa es una funcion de una tasa esperada o premodelada de consumo de glucosa para las celulas a la concentracion celular estimada.

Se prepara un sistema de suministro de glucosa basado en una jeringa al igual que para el cultivo de alimentacion restringida de glucosa de rampa baja (es decir, con una solucion de alimentacion de glucosa 0,2 g/ml) del ejemplo anterior. Para las concentraciones celulares entre 1,4x106 celulas/ml y 1,6x106 celulas/ml en un sistema de cultivo de celulas animales de 1 l, se determina que una tasa restringida de suministro de glucosa a un cultivo es (como funcion de una tasa esperada o premodelada de consumo de glucosa) de 8,4 mg de glucosa/h, mientras que para concentraciones celulares entre 1,9x106 celulas/ml y 2,1x106 celulas/ml en un sistema de cultivo de celulas animales de 1 l, se determina que una tasa restringida de suministro de glucosa a un cultivo es (nuevamente como funcion de una tasa esperada o premodelada de consumo de glucosa) de 11 mg de glucosa/hora. Por consiguiente, cuando el sistema informatico de verificacion mide que la concentracion celular es aproximadamente de 1,5x106 celulas/ml, el sistema informatico conectado que controla el suministro de glucosa al cultivo de celulas animales ajusta en tiempo real la tasa de suministro de glucosa al cultivo, de manera que la jeringa suministra 0,042 ml/h de la solucion de alimentacion de glucosa 0,2 g/ml (es decir, se suministra glucosa al sistema de cultivo celular a una tasa de 8,4 mg/h). Mas tarde, cuando el que el sistema informatico de verificacion mide que la concentracion celular es aproximadamente de 2,0x106 celulas/ml, el sistema informatico conectado que controla el suministro de glucosa al cultivo de celulas animales ajusta en tiempo real la tasa de suministro de glucosa al cultivo, de manera que la jeringa suministra 0,055 ml/h de la solucion de alimentacion de glucosa 0,2 g/ml (es decir, se suministra glucosa al sistema de cultivo celular a una tasa de 11 mg/h).

La invencion anteriormente descrita para la alimentacion restringida de glucosa en cultivos celulares proporciona un procedimiento practico para mejorar el rendimiento del cultivo de celulas animales. Este procedimiento practico proporciona una opcion sencilla para la mejora del cultivo celular a escala industrial.

La descripcion y ejemplos detallados anteriores se han proporcionado solo para ofrecer una mejor comprension. No deben interpretarse limitaciones innecesarias de los mismos. La invencion no se limita a los detalles exactos mostrados y descritos, debido a que las variaciones que puede determinar un experto en la materia se encuentran comprendidas dentro de la invencion definida en las reivindicaciones.

Claims

5

10

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50

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de cultivo celular para controlar la produccion de acido lactico a niveles bajos en un cultivo celular semicontinuo que comprende:

mezclar celulas animales y un medio para formar un cultivo celular; y alimentar glucosa de una manera restringida al cultivo celular,

en el que la alimentacion de glucosa de una manera restringida comprende proporcionar glucosa al cultivo celular a una tasa que es una funcion de una tasa esperada o una premodelada de consumo de glucosa por parte de las celulas animales cultivadas en medio que contiene un alto nivel de glucosa,

en el que la funcion es la multiplicacion de la tasa esperada o la tasa premodelada por un porcentaje menor del 100 %, y,

en el que el porcentaje no es mas del 45 %, y

en el que se utiliza un sensor de pH para supervisar el pH del cultivo celular, y, en respuesta a un incremento por encima de un valor de pH predeterminado, se alimenta glucosa adicional de una manera restringida al cultivo celular.
2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el porcentaje es al menos del 33 %.
3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la alimentacion de glucosa de una manera restringida comprende la adicion de uno o mas bolos de alimentacion de glucosa.
4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la alimentacion de glucosa de una manera restringida se lleva a cabo sin muestreo de control por retroalimentacion durante el cultivo.
5. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que se utiliza un sensor para supervisar la concentracion celular en el cultivo celular, y se utiliza de forma adicional una medicion obtenida del sensor de concentracion celular en el calculo de la tasa de alimentacion de glucosa de una manera restringida al cultivo celular.
6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la glucosa adicional alimentada de una manera restringida comprende uno o mas bolos de alimentacion de glucosa.
7. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el valor de pH predeterminado es aproximadamente de 7.
8. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que se utiliza un sensor de pH para supervisar el pH del cultivo celular, y, en respuesta a un incremento por encima de un valor de pH predeterminado, la alimentacion de glucosa de una manera restringida continua posteriormente a una tasa nueva que es mayor que una tasa inmediatamente anterior.
9. El procedimiento de la reivindicacion 8, en el que la tasa nueva es mayor en al menos el 15 % superior a la tasa inmediatamente anterior.
10. El procedimiento de la reivindicacion 8, en el que la tasa nueva es mayor en no mas del 50 % superior a la tasa inmediatamente anterior.
11. El procedimiento de la reivindicacion 8, en el que la respuesta a un incremento por encima de un valor de pH predeterminado comprende adicionalmente la adicion de uno o mas bolos de alimentacion de glucosa al cultivo celular.
12. El procedimiento de la reivindicacion 8, en el que el valor de pH predeterminado es aproximadamente de 7.
13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que

(i) se utiliza un sensor de concentracion celular para supervisar la concentracion celular en el cultivo celular sin muestreo, y se utiliza de forma adicional una medicion obtenida del sensor de concentracion celular en el calculo de la tasa de alimentacion de glucosa de una manera restringida al cultivo celular;

(ii) se utiliza un sensor de pH para supervisar el pH del cultivo celular sin muestreo, y, en respuesta a un incremento por encima de un valor de pH predeterminado, la alimentacion de glucosa de una manera restringida continua posteriormente a una tasa nueva que es mayor que una tasa inmediatamente anterior; o

(iii) se utilizan tanto el sensor de concentracion celular como el sensor de pH, como se describe en (i) y (ii), respectivamente.
14. El procedimiento de la reivindicacion 13, en el que la respuesta a un incremento por encima de un valor de pH predeterminado en (ii) y/o (iii) comprende adicionalmente la adicion de uno o mas bolos de alimentacion de glucosa al cultivo celular.
15. El procedimiento de la reivindicacion 13, en el que el valor de pH predeterminado es aproximadamente de 7.
16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la tasa premodelada se determina mezclando

5

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30

celulas animales y un medio que contiene un alto nivel de glucosa para formar un primer cultivo celular; y determinando una tasa de consumo de glucosa para las celulas animales cultivadas en el primer cultivo celular.
17. El procedimiento de la reivindicacion 16, en el que se utiliza un sensor de pH para supervisar el pH del segundo cultivo celular, y, en respuesta a un incremento por encima de un valor de pH predeterminado, la alimentacion de glucosa de una manera restringida comprende adicionalmente la adicion de uno o mas bolos de aporte de glucosa al segundo cultivo celular.
18. El procedimiento de la reivindicacion 17, en el que la alimentacion de glucosa de una manera restringida al segundo cultivo celular comprende adicionalmente continuar posteriormente la alimentacion a una tasa nueva que es mayor que una tasa inmediatamente anterior.
19. El procedimiento de la reivindicacion 17, en el que el valor de pH predeterminado es aproximadamente de 7.
20. El procedimiento de la reivindicacion 18, en el que la tasa nueva es mayor en al menos el 15 % superior a la tasa inmediatamente anterior.
21. El procedimiento de la reivindicacion 18, en el que la tasa nueva es mayor en no mas del 50 % superior a la tasa inmediatamente anterior.
22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la tasa premodelada se determina mezclando celulas animales y un medio que contiene un alto nivel de glucosa para formar un primer cultivo celular; determinando una tasa de consumo de glucosa para las celulas animales cultivadas en el primer cultivo celular; mezclando celulas animales y un medio para formar un segundo cultivo celular; y alimentando glucosa de una manera restringida al segundo cultivo celular a una tasa que es una funcion de la tasa de consumo de glucosa determinada; en el que

(i) se utiliza un sensor de concentracion celular para supervisar la concentracion celular en el segundo cultivo celular sin muestreo, y se utiliza adicionalmente una medicion obtenida del sensor de concentracion celular en el calculo de la tasa de alimentacion de glucosa de una manera restringida al segundo cultivo celular;

(ii) se utiliza un sensor de pH para supervisar el pH del segundo cultivo celular sin muestreo, y, en respuesta a un incremento por encima de un valor predeterminado de pH, la alimentacion de glucosa de una manera restringida continua posteriormente a una tasa nueva que es mayor que una tasa inmediatamente anterior; o

(iii) se utilizan tanto el sensor de concentraciones celulares como el sensor de pH, como se describe en (i) y (ii), respectivamente.
23. El procedimiento de la reivindicacion 22, en el que la respuesta a un incremento por encima de un valor de pH predeterminado en (ii) y/o (iii) comprende adicionalmente la adicion de uno o mas bolos de alimentacion de glucosa al segundo cultivo celular.