JP2018516079A - 連続培養における細胞コントロール灌流 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2015年5月29日に出願された米国仮出願第62/168,297号;2015年7月31日に出願された第62/199,388号、及び2015年10月27日に出願された第62/246,774号の優先権の利益を主張する。前記出願の各々の内容全体は参照により、本願明細書にすべて示すかのように援用したものとする。
本発明は、バイオリアクタ中で連続灌流細胞培養を用いる、培養動物細胞、好ましくは哺乳類細胞におけるタンパク質生成の方法に関する。
本発明技術は、pH変化を介してバイオリアクタへの灌流培地の添加の速度を細胞に自己レギュレーションさせることによる、連続灌流培養のための方法であって、灌流培地は、グルコース、L−ラクタート(及び/又は炭酸水素ナトリウム)並びにグルコースに対して特定比のアミノ酸を含む方法に関する。本技術の利点は、より少量の液体培地の使用など、プロセス条件を至適化してタンパク質生成を増加させることを含む。
「約」の用語は一般的に、測定におけるわずかな誤差をいい、多くの場合特定の信頼レベル内の真の値を含む値の範囲(68%信頼区間(C.I.)に対して通常、±1σ)として提示される。「約」の用語は、整数及びその整数の±20%の値として記載されることもある。
哺乳類細胞の連続灌流培養の間、細胞マスは細胞保持デバイスによりバイオリアクタ内に含まれたままで、培地は培養液により灌流される(図1)。懸濁液培養系において、細胞保持デバイスは通常、何らかのタイプのフィルターであるが、完全に「無細胞」にならないかもしれないいくつかのデバイスを含め、多くの他の方法が採用され得る(音波分離、傾斜板沈降、外装遠心分離、回転又は振動などの内装フィルター、外装ハイドロサイクロンなど)。細胞マスが成長し続けて数と重量が増加するにつれ灌流の速度は増加し、代謝副生成物を除去して必要な栄養素を供給する。灌流速度は通常、段階的に増加され、多くの場合に算出に基づき決定されて、細胞数に対する時間あたり灌流培地の特定の比が維持される(CSPR、すなわち細胞固有の灌流速度(多くの場合ナノリットル/細胞/日)、通例0.05〜0.5nL/細胞/日の範囲)。Ozturk, Cytotechnology, 1996; 2: 3-16 and Konstantinov et al., Adv. Biochem. Eng/Biotechnol., 2006; 101: 75-98参照。いくつかの例では、灌流速度はグルコース又はL−ラクタートの濃度をコントロールするように設定されるか(Konstantinov et al., Biotechnol. Prog, 1996; Jan-Feb; 12(1): 100-9 and Ozturk et al., Biotechnol. Bioeng., 1997; Feb 20; 53(4): 372-8)、又は酸素取り込み率(uptake rate)測定に基づく。Feng et al., J. Biotechnol., 2006; April 20; 122(4): 422-430参照。
1〜2リットルスケールでのHIPCOP技術の適用
70リットルスケールでのHIPCOP技術の適用
ハイブリッド灌流/流加プロセスにおける、さらなる細胞系へのHIPCOP技術の適用
連続灌流プロセスへのHIPCOP技術の適用
約130kDaのリコンビナントタンパク質を発現しているDG44由来のCHO細胞系及び灌流培地中で高炭酸水素ナトリウムを用いたHIPCOP技術の使用
リコンビナント免疫グロブリンGを発現しているグルタミン−シンテターゼCHO細胞系及び灌流培地中で高炭酸水素ナトリウムを用いたHIPCOP技術の使用
リコンビナント免疫グロブリンGを発現しているグルタミン−シンテターゼCHO細胞系及び炭酸ナトリウム流加でのHIPCOP技術の使用
本願明細書に開示されるデバイス及び方法は、灌流バイオ製造に有用であり、したがって、リコンビナント、治療的タンパク質を製造するための工業的方法を改善するのに有用である。
Claims (67)
- 連続灌流培養プロセスであって、
(a)pHセンサで細胞培養液におけるpHをモニターすること、
(b)pHが所定の値を超えると新鮮培地を送達し、透過物を除去すること、並びに
(c)pHが所定の値を下回ると培地の送達及び透過物の除去を不活性化すること
を含むプロセス。 - 新鮮培地が、L−ラクタートを含む請求項1記載のプロセス。
- L−ラクタートが、新鮮培地中約0.1g/L〜7.0g/Lの量で存在する請求項2記載のプロセス。
- L−ラクタートが、新鮮培地中約1〜4g/Lの量で存在する請求項3記載のプロセス。
- L−ラクタートが、新鮮培地中約1〜3g/Lの量で存在する請求項4記載のプロセス。
- L−ラクタートが、新鮮培地中約1〜2.5g/Lの量で存在する請求項5記載のプロセス。
- L−ラクタートが、L−乳酸ナトリウム又はL−乳酸カリウムである請求項2記載のプロセス。
- 新鮮培地が、
(a)グルコース、
(b)L−ラクタート、及び
(c)アミノ酸
を含む請求項1記載のプロセス。 - 新鮮培地が、
(a)約0.5〜40g/L グルコース、
(b)約0.1〜7g/L L−ラクタート、及び
(c)アミノ酸1モルに対して約0.25〜1.0モル グルコースの比のアミノ酸
を含む請求項1記載のプロセス。 - アミノ酸及びグルコースが、70mM アミノ酸及び培地1リットルあたりグルコース 5.3グラムに等しい量で、又は60:4.2、90:8、100:12、120:13、240:42及び380:70mM アミノ酸:グラム/L グルコース(培地1リットルあたり)からなる群より選択される比で供給される請求項8記載のプロセス。
- 所定の値が、約pH7である請求項1記載のプロセス。
- 細胞培養液中のグルコース濃度の測定、又はグルコースポンプによる細胞培養液へのグルコースの添加が必要とされない請求項1記載のプロセス。
- 連続灌流培養プロセスにおいて迅速な細胞成長を成し遂げるための方法であって、
(a)pHセンサで細胞培養液におけるpHをモニターすること、
(b)pHが所定の値を超えると新鮮培地を送達し、透過物を除去すること、及び
(c)pHが所定の値を下回ると培地の送達及び透過物の除去を不活性化することを含む方法。 - 新鮮培地が、
(a)約0.5〜40g/L グルコース、
(b)約0.1〜7.0g/L L−ラクタート、及び
(c)アミノ酸1モルに対して約0.25〜1.0モルのグルコースの比のアミノ酸
を含む請求項13記載の方法。 - 迅速な細胞成長が4日以内に成し遂げられる請求項13記載の方法。
- 細胞培養液中のグルコース濃度の測定又はグルコースポンプによる細胞培養液へのグルコースの添加が必要とされない請求項13記載の方法。
- 請求項1記載の連続灌流培養プロセスを第一培養プロセスとして含むハイブリッド培養プロセス。
- 連続灌流培養プロセスの後に流加プロセスが続く請求項17記載のハイブリッド培養プロセス。
- 連続灌流培養プロセスの後に第二連続灌流培養プロセスが続く請求項17記載のハイブリッド培養プロセス。
- 第二連続灌流培養プロセスが、
(a)濃縮培地を添加する工程、及び
(b)希釈剤を添加する工程
を含む請求項19記載のハイブリッド培養プロセス。 - 濃縮培地が、600ミリモル濃度 アミノ酸、90グラム/リットル グルコース、0g/L L−乳酸ナトリウムを含む請求項20記載のハイブリッド培養プロセス。
- 希釈剤が、生理食塩水及び水からなる群より選択される請求項20記載のハイブリッド培養プロセス。
- 生理食塩水又は水が、培地の浸透圧強度を約0〜250及び/又は250〜350mOsm/kgに正常化する請求項22記載のハイブリッド培養プロセス。
- 生理食塩水が、2.0g/L 炭酸水素ナトリウム、2.4g/L ポリビニルアルコール、20mM 塩化カリウム、及び80mM 塩化ナトリウムを含む請求項22記載のハイブリッド培養プロセス。
- ハイブリッド培養プロセスが、1グラム細胞/L/日を超える容量当たり生産性をもたらす請求項17〜24のいずれか一項記載のハイブリッド培養プロセス。
- ハイブリッド培養プロセスが、約50及び約150Lの培養容量にて実施される請求項17〜24のいずれか一項記載のハイブリッド培養プロセス。
- 培養容量が約70Lである請求項26記載のハイブリッド培養プロセス。
- 連続灌流培養プロセスを行うためのバイオリアクタであって、連続灌流培養プロセスは、
(a)pHセンサで細胞培養液におけるpHをモニターする工程、
(b)pHが所定の値を超えると新鮮培地を送達し、透過物を除去する工程、及び
(c)pHが所定の値を下回ると培地の送達及び透過物の除去を不活性化する工程
を含むバイオリアクタ。 - 新鮮培地が、
(a)グルコース、
(b)約0.1〜7.0g/L L−ラクタート、及び
(c)アミノ酸
を含む請求項28記載のバイオリアクタ。 - グルコースが、約0.5〜40g/L供給される請求項29記載のバイオリアクタ。
- アミノ酸及びグルコースが、70mM アミノ酸及び培地1リットルあたりグルコース 5.3グラムに等しい量で、又は60:4.2、90:8、100:12、120:13、240:42及び380:70mM アミノ酸:グラム/L グルコース(培地1リットルあたり)からなる群より選択される比で供給される請求項29記載のバイオリアクタ。
- 約60×106/mLの生細胞密度が、4日以内に成し遂げられる請求項28記載のバイオリアクタ。
- 細胞培養液中のグルコース濃度の測定又はグルコースポンプによる細胞培養液へのグルコースの添加が必要とされない請求項28記載のバイオリアクタ。
- 所定のpH値が6.8〜7.4である請求項28記載のバイオリアクタ。
- 灌流培養プロセスであって、
(d)pHセンサで灌流バイオリアクタ中の細胞培養液におけるpHをモニターすること、
(e)pHが所定の値を超えると新鮮培地を灌流バイオリアクタに送達し、透過物を除去すること、及び
(f)pHが所定の値を下回ると培地の送達及び透過物の除去を不活性化すること
を含む灌流培養プロセス。 - 新鮮培地が、L−ラクタートを含む請求項35記載の灌流培養プロセス。
- L−ラクタートが、新鮮培地中約0.1g/L〜7.0g/Lの量で存在する請求項36記載の灌流培養プロセス。
- pHが所定の値を超えると、L−ラクタートに代えて又はそれに加えて、炭酸ナトリウムが灌流バイオリアクタに添加される請求項36記載の灌流培養プロセス。
- 利用される灌流培地1リットルあたり8.7mLの割合で1モル濃度 カーボナートが灌流バイオリアクタに入るように、炭酸ナトリウムが灌流バイオリアクタに添加される請求項38記載の灌流培養プロセス。
- L−ラクタートに代えて又はそれに加えて、生理的に許容できる塩基が灌流バイオリアクタに添加され、乳酸として灌流培地からラクタートの消費によって起こるであろうと同様にpHへ上昇影響を与える請求項36記載の灌流培養プロセス。
- L−ラクタートが、L−乳酸ナトリウム又はL−乳酸カリウムである請求項36記載の灌流培養プロセス。
- 新鮮培地が、
(d)グルコース、
(e)L−ラクタート、及び
(f)アミノ酸
を含む請求項36記載の灌流培養プロセス。 - 新鮮培地が、
(d)約0.5〜約40g/L グルコース、
(e)約0.1〜約7g/L L−ラクタート、及び
(f)約0.25〜約1.0の、グルコースのモル対アミノ酸のモル比のアミノ酸
を含む請求項42記載の灌流培養プロセス。 - 新鮮培地が、グルコースを、約70mM アミノ酸及び培地1リットルあたりグルコース約5.3グラムに等しい量で含むか、又は新鮮培地が、培地1リットルあたり約60〜約4.2、約90〜約8、約100〜約12、約120〜約13、約240〜約42及び約380〜約70からなる群より選択されるアミノ酸(mM)対グルコース(g/L)比でグルコースを含む請求項35記載の灌流培養プロセス。
- 所定の値が、約pH7である請求項35記載の灌流培養プロセス。
- 細胞培養液中のグルコース濃度の測定、又はグルコースポンプによる細胞培養液へのグルコースの添加が必要とされない請求項35記載の灌流培養プロセス。
- 灌流培養プロセスにおいて迅速な細胞成長を成し遂げるための方法であって、
(d)pHセンサで灌流バイオリアクタ中の細胞培養液におけるpHをモニターすること、
(e)pHが所定の値を超えると新鮮培地を灌流バイオリアクタに送達し、透過物を除去すること、及び
(f)pHが所定の値を下回ると培地の送達及び透過物の除去を不活性化すること
を含む方法。 - 新鮮培地が、約0.1g/L〜7.0g/Lの量でL−ラクタートを含む請求項47記載の方法。
- 新鮮培地が、
(d)約0.5〜約40g/L グルコース、
(e)約0.1〜約7.0g/L L−ラクタート、及び
(f)グルコースのモル対アミノ酸のモル比 約0.25〜約1.0のアミノ酸
を含む請求項48記載の方法。 - pHが所定の値を超えると、L−ラクタートに代えて又はそれに加えて、炭酸ナトリウムが灌流バイオリアクタに添加される請求項49記載の方法。
- 利用される灌流培地1リットルあたり8.7mLの割合で1モル濃度 カーボナートが灌流バイオリアクタに入るように、炭酸ナトリウムが灌流バイオリアクタに添加される請求項50記載の方法。
- 迅速な細胞成長が、4日以内に成し遂げられる請求項46記載の方法。
- 細胞培養液中のグルコース濃度の測定、又はグルコースポンプによる細胞培養液へのグルコースの添加が必要とされない請求項46記載の方法。20.約60×106/mLの生細胞密度が4日以内に成し遂げられる請求項46〜53のいずれか一項記載の方法。
- 連続灌流培養プロセスを行うためのバイオリアクタであって、連続灌流培養プロセスは、
(d)pHセンサで灌流バイオリアクタ中の細胞培養液におけるpHをモニターする工程、
(e)pHが所定の値を超えると新鮮培地を灌流バイオリアクタに送達し、透過物を除去する工程、及び
(f)pHが所定の値を下回ると培地の送達及び透過物の除去を不活性化する工程
を含むバイオリアクタ。 - 新鮮培地が、
(d)グルコース、
(e)L−ラクタート、及び
(f)アミノ酸
を含む請求項54記載のバイオリアクタ。 - L−ラクタート量が、約0.1g/L〜7.0g/Lである請求項54記載のバイオリアクタ。
- pHが所定の値を超えると、L−ラクタートに代えて又はそれに加えて、炭酸ナトリウムが灌流バイオリアクタに添加される請求項55記載のバイオリアクタ。
- 利用される灌流培地1リットルあたり8.7mLの割合で1モル濃度 カーボナートが灌流バイオリアクタに入るように、炭酸ナトリウムが灌流バイオリアクタに添加される請求項57記載の方法。
- 細胞培養液中のグルコース濃度の測定、又はグルコースポンプによる細胞培養液へのグルコースの添加が必要とされない請求項54記載のバイオリアクタ。
- 所定のpH値が6.8〜7.4である請求項54記載のバイオリアクタ。
- 関心対象のタンパク質であって、
(a)関心対象のタンパク質をエンコードする遺伝子を含む細胞を、灌流細胞培養バイオリアクタにおいて関心対象のタンパク質を生成させる条件下に、
i.pHセンサで細胞培養バイオリアクタにおけるpHをモニターすること、
ii.pHが所定の値を超えると新鮮培地を送達し、透過物を除去すること、及び
iii.pHが所定の値を下回ると培地の送達及び透過物の除去を不活性化すること
を含めて培養することと、
(b)細胞培養バイオリアクタから関心対象のタンパク質を回収することと
を含む方法によって生成される関心対象のタンパク質。 - 新鮮培地が、
(g)グルコース、
(h)L−ラクタート、及び
(i)アミノ酸
を含む請求項61記載の関心対象のタンパク質。 - L−ラクタートの量が、約0.1g/L〜7.0g/Lである請求項62記載の関心対象のタンパク質。
- 細胞培養液中のグルコース濃度の測定、又はグルコースポンプによる細胞培養液へのグルコースの添加が必要とされない請求項61記載の関心対象のタンパク質。
- 所定のpH値が6.8〜7.4である請求項61記載の関心対象のタンパク質。
- pHが所定の値を超えると、L−ラクタートに代えて又はそれに加えて、炭酸ナトリウムが灌流バイオリアクタに添加される請求項62記載の関心対象のタンパク質。
- 利用される灌流培地1リットルあたり8.7mLの割合で1モル濃度 カーボナートが灌流バイオリアクタに入るように、炭酸ナトリウムが灌流バイオリアクタに添加される請求項66記載の関心対象のタンパク質。
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