CN105637085A - 代谢优化的细胞培养物 - Google Patents

代谢优化的细胞培养物 Download PDF

Info

Publication number
CN105637085A
CN105637085A CN201480055499.4A CN201480055499A CN105637085A CN 105637085 A CN105637085 A CN 105637085A CN 201480055499 A CN201480055499 A CN 201480055499A CN 105637085 A CN105637085 A CN 105637085A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
culture
lactic acid
cell culture
metabolism
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480055499.4A
Other languages
English (en)
Inventor
S·劳伦斯
A·金
A·约翰逊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52813657&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN105637085(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority to CN202210497778.2A priority Critical patent/CN114717196A/zh
Publication of CN105637085A publication Critical patent/CN105637085A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2511/00—Cells for large scale production

Abstract

本发明提供了用于在细胞培养物中大规模生产蛋白质和/或多肽的改良方法。本发明提供该方法用于培养已经代谢转换的细胞。使用这样的方法或系统允许生产高水平的蛋白质或多肽并降低不想要的代谢废物(诸如乳酸)的积累。根据本发明表达的蛋白质和多肽可以被有利地用于制备药物组合物、免疫原性组合物或其他商售的生物组合物，诸如抗体。

Description

代谢优化的细胞培养物
【相关申请的交叉引用】
本申请根据35USC§119(e)要求2013年10月11日递交的美国临时专利申请号61/889,815的权益，将其全文通过引用并入本文中。
【发明领域】
本发明涉及细胞培养物中代谢转换(shift)成乳酸消耗的细胞。种子培养物中乳酸消耗代谢谱的切换(switch)对生产培养物具有有益的效果。一旦接种生产反应器，在补料分批的哺乳动物细胞培养物中，细胞显示出更有效的乳酸代谢，其具有低的乳酸生产速率、低的峰值乳酸水平、早转换成乳酸消耗以及随后增加的生产力。因此，本发明提供了一种用于在细胞培养物中大规模生产蛋白质和/或多肽的改良方法。
【发明背景】
生物学物质(特别是蛋白质和多肽)正被更常作为新的药物产品进行开发。生产非常高水平感兴趣的特定蛋白质的工程化细胞对于成功商业化生产这些药物干预变得极其重要。细胞培养物条件的控制和优化发生变化并对培养物中生产的治疗蛋白质的水平和治疗具有很大的影响。
通常经分批或补料分批过程形式的细胞培养来制备蛋白质。小瓶解冻之后早期接种物生长包括以种子培养物的形式培养细胞。通常，以指数生长速率生长细胞，诸如在种子培养生物反应器中，以逐渐增加细胞群体的大小和/或体积。通过几个生物反应器阶段使得细胞团(cellmass)成比例放大之后，则将细胞转移至生产生物反应器而细胞仍然在指数生长(对数期)(Gambhir,A.等人，2003,JBioscienceBioeng95(4):317-327)。一般认为不希望使得分批培养物(例如种子培养物)中的细胞通过对数期进入平台期。已经建议，当培养物处于对数期的同时、在细胞(例如贴壁细胞)由于接触抑制或废物的积累抑制细胞生长连同其他原因而达到汇合之前，应当将培养物进行传代(CellCultureBasics,Gibco/InvitrogenOnlineHandbook,www.invitrogen.com；AnimalCellCultureGuide,www.atcc.org)。
转移至补料分批培养之后，培养细胞一段时间，监测并控制培养基的组成以允许生产感兴趣的蛋白质或多肽。在达到特定的产率之后或者细胞活力、废物积累或营养耗尽决定应当终止培养，分离所生产的蛋白质或多肽。在过去的十年间试图提高重组蛋白质的产率已经发生许多显著的进步，所述产率目前达到每升许多克的效价。蛋白质制备方法中以及细胞系工程化和细胞培养基和进料发展中的进步已经对获得蛋白质产率做出了贡献。
补料分批生产涉及随着细胞生长和产品生产的进行加入小体积的进料以补充生物反应器中存在的营养物。应当理解的是，哺乳动物细胞通常倾向于连续代谢碳水化合物导致乳酸积累，因此需要碱的加入以中和乳酸。碱的加入升高细胞培养基中重量克分子渗透压浓度，其进而大大限制生物反应器所能获得的总细胞活力和/或生产力。培养基中乳酸的积累对于细胞生长是有害的并且是限制分批培养中所能获得的最大生产力的常见因素之一。在典型的分批细胞培养中，培养物中的乳酸浓度达到约30-50mM和/或氨浓度达到3-5mM之后，生长和生产力被抑制(Ozturk,S.S.,Riley,M.R.和Palsson,B.O.1992.Biotechnol.andBioeng.39:418–431)。迄今为止，广泛应用的方案包括补充营养和设计化学成分确定的、无血清培养基以支持细胞的连续生长和最佳产物分泌。
特别涉及降低细胞培养物中代谢废产物(诸如乳酸的积累)的输出的努力已经改善了最终蛋白质效价的总量。这些努力集中于受控葡萄糖或营养受限的补料分批方法(参见例如WO2004104186；US8192951B2)、改善的细胞培养基条件(例如US7390660；Zagari等人，2013,NewBiotechnol.,30(2):238-45)或细胞工程化，包括糖酵解途径中的靶向酶(例如Kim,S.H.和Lee,G.M.,2007,Appl.Microbiol.Biotechnol.74,152–159；Kim,S.H.andLee,G.M.,2007,Appl.Microbiol.Biotechnol.76,659–665；Wlaschin,K.F.和Hu,W-S.,2007,J.Biotechnol.131,168–176)。
利用细胞的受控的进料以努力达到更有效的代谢表型(Europa,A.F.等人，2000,Biotechnol.Bioeng.67:25–34；Cruz等人，1999,BiotechnolBioeng,66(2):104-113；Zhou等人，1997,Cytotechnology24,99–108；Xie和Wang,1994,BiotechnolBioeng,43:1174-89)。但是，这由于下列事实而被复杂化：在高细胞密度的补料分批培养中所看到的营养耗竭以及例如氨浓度的快速改变能够诱导凋亡(“细胞程序性死亡”)(Newland等人，1994,Biotechnol.Bioeng.43(5):434-8)。因此，常见优化方法是以补料分批的形式生长细胞至适当高的密度，然后有意通过例如温度或pH改变诱导延长的、生产的平台期(Quek等人，2010,MetabEng12(2):161-71.doi:10.1016/j.ymben.2009.09.002。2009年10月13日电子出版)。
优化技术(诸如同上所讨论的)已经集中于补料分批细胞培养，并且这种营养依赖的方法必须适用于被工程化以生产感兴趣的多肽的每种宿主细胞。使细胞适应培养物中的乳酸消费者的方法在制备生物治疗剂的方法中非常有希望。优化具有乳酸消耗的代谢表型的细胞系将证明有益于商业化生产多肽。
【发明概述】
本发明提供细胞和培养已经代谢转换成乳酸消耗的细胞的方法。代谢适应的细胞对于大规模蛋白质生产是理想的。
本发明的一个方面是培养细胞的方法，其包括在第一培养物中已经发生细胞中代谢转换成乳酸消耗之后将细胞从第一细胞培养物转移至第二细胞培养物。
本发明的另一个方面提供培养细胞的方法，其包括培养第一细胞培养物中的细胞，确定在第一细胞培养物中已经发生细胞中的代谢转换成乳酸消耗，并在已经发生细胞中的代谢转换成乳酸消耗之后将细胞转移至第二细胞培养物，其中在第二细胞培养物中的乳酸浓度表示第二培养过程中的净乳酸消耗。在一个实施方案中，该方法进一步提供与除了在第一细胞培养物中已经发生代谢转换之前将细胞转移至第二细胞培养物之外相同的条件下相同的细胞培养中所确定的乳酸的积累相比，在第二细胞培养物中乳酸的积累的下降。
本发明的第二个方面提供生产蛋白质的方法，其包括在已经发生细胞中的代谢转换成乳酸消耗之后将细胞从第一细胞培养物转移至第二细胞培养物，并且维持第二细胞培养物一段时间使得蛋白质在该细胞培养物中积累。在相关的方面，本发明提供生产蛋白质的方法，其包括培养第一细胞培养物中的细胞，确定在第一细胞培养物中已经发生细胞中的代谢转换成乳酸消耗，在已经发生细胞中的代谢转换成乳酸消耗之后将细胞从第一细胞培养物转移至第二细胞培养物，并且维持第二细胞培养物一段时间使得蛋白质在该细胞培养物中积累。在一个实施方案中，该方法进一步提供与除了在第一细胞培养物中已经发生代谢转换之前将细胞转移至第二细胞培养物之外相同的条件下相同的细胞培养中所确定的乳酸的积累相比，在第二细胞培养物中生产力的增加。
本发明的第三个方面提供培养细胞的改良方法，其中细胞包含编码感兴趣的多肽的基因，所述方法包括以下步骤：培养第一细胞培养物中的细胞，在允许细胞团扩增的条件下维持第一细胞培养物，在已经发生细胞中的代谢转换成乳酸消耗之后将细胞转移至第二细胞培养物，在允许感兴趣的多肽表达的条件下维持第二细胞培养物，以及从第二细胞培养物收获感兴趣的多肽。在一个实施方案中，该方法进一步包括确定在第一细胞培养物中已经发生细胞中的代谢转换成乳酸消耗。
本发明的第四个方面提供在细胞培养物中生产多肽的改良方法，其包括以下步骤：用编码感兴趣的多肽的DNA转染细胞，培养第一细胞培养物中的细胞，在已经发生细胞中的代谢转换成乳酸消耗之后将细胞转移至第二细胞培养物，其中在第二细胞培养物的条件下表达感兴趣的多肽，以及维持第二细胞培养物一段时间，使得多肽在细胞培养物中积累。在一个实施方案中，该方法进一步包括确定在第一细胞培养物中已经发生细胞中的代谢转换成乳酸消耗。
本发明的第五个方面提供生产代谢转换的细胞系的方法，其包括以下步骤：在允许细胞团扩增的条件下维持第一细胞培养物中的细胞群体，确定发生细胞中代谢转换成乳酸消耗，在已经发生细胞中的代谢转换成乳酸消耗之后将细胞群体的一部分从第一细胞培养物转移至第二细胞培养物，维持第二细胞培养物中的细胞群体一段时间，以及任选地收获细胞从而生产代谢转换的细胞系。
本发明的另一个方面提供由本文所公开的本发明的任何方法所生产的代谢转换的细胞系。
在一些实施方案中，代谢转换的细胞系包含稳定整合入细胞基因组的核酸序列，其中该核酸序列编码感兴趣的多肽或蛋白质。在其他实施方案中，代谢转换的细胞系包含编码感兴趣的多肽或蛋白质的表达载体。
在一个实施方案中，通过第一细胞培养物中pH、乳酸或碱的测量检测代谢转换成乳酸消耗。在其他实施方案中，当检测到乳酸消耗时将细胞转移至第二细胞培养物。在又一些其他实施方案中，在没有加入碱的情况下第一细胞培养物中pH升高之后检测代谢转换成乳酸消耗。在其他实施方案中，当第一细胞培养物中乳酸水平达到稳定状态检测代谢转换成乳酸消耗。在又一些其他实施方案中，该方法进一步包括确定代谢转换，其包括：测量第一细胞培养物中的pH，加入碱以维持pH高于预定的下限，确定pH在连续间隔高于预定的下限，以及停止加入碱，从而确定在第一细胞培养物中已经发生代谢转换成乳酸消耗。
在其他实施方案中，通过细胞代谢的指示物或产物检测代谢转换成乳酸消耗，包括但不限于氧消耗和代谢物，诸如甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、腺嘌呤、棕榈酸、谷氨酸、甲硫氨酸和天冬酰胺。在另一个实施方案中，通过代谢物组分析或蛋白质组分析检测代谢转换成乳酸消耗。
在一个实施方案中，当细胞在第一细胞培养物中离开对数(即指数生长)期时发生代谢转换。在另一个实施方案中，当细胞在第一细胞培养物中离开对数期之后将细胞进行转移。
在另一个实施方案中，当细胞在第一细胞培养物中已经达到平台生长期时发生代谢转换。在另一个实施方案中，当细胞在第一细胞培养物中已经达到平台生长期之后将细胞进行转移。
在一个实施方案中，在第一细胞培养物中细胞生长的第3天或3天之后，在第一细胞培养物中发生代谢转换。在另一个实施方案中，在第一细胞培养物中细胞生长的第3.5天或3.5天之后，在第一细胞培养物中发生代谢转换。
在一些实施方案中，第一细胞培养物是种子培养物。在一些实施方案中，第二细胞培养物是补料分批培养物。在其他实施方案中，第二细胞培养物是生产培养物。在其他实施方案中，第二细胞培养是在生产生物反应器中进行。
在又一些其他实施方案中，在起始细胞密度大于或等于大约0.5x106个细胞/mL时将细胞转移至第二细胞培养物。在一些实施方案中，在起始细胞密度在大约0.5-3.0x106个细胞/mL之间时将细胞转移至第二细胞培养物。
在一些实施方案中，第二细胞培养物中乳酸浓度表示净乳酸消耗，例如在第二细胞培养物中细胞生长的第2天或2天后、第3天或3天后、第4天或4天后或者第5天或5天后实现净乳酸消耗。在更多实施方案中，乳酸积累的降低是第二细胞培养物中峰值乳酸浓度减小。在其他实施方案中，在第二细胞培养物中细胞生长的第5天或5天之后，在第二细胞培养物中发生峰值乳酸浓度减小。在其他实施方案中，第二细胞培养物的峰值乳酸浓度小于大约6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L或小于大约1g/L。
在本发明的一些实施方案中，细胞选自CHO细胞、COS细胞、视网膜细胞、Vero细胞、CV1细胞、HEK293细胞、293EBNA细胞、MSR293细胞、MDCK细胞、HaK细胞、BHK21细胞、HeLa细胞、HepG2细胞、WI38细胞、MRC5细胞、Colo25细胞、HB8065细胞、HL-60细胞、Jurkat细胞、Daudi细胞、A431细胞、CV-1细胞、U937细胞、3T3细胞、L细胞、C127细胞、SP2/0细胞、NS-0细胞、MMT细胞、PER.C6细胞、鼠淋巴样细胞和鼠杂交瘤细胞。
【附图说明】
图1：生产融合蛋白的CHO细胞系种子容器被用于以三种不同的代谢状态(在线pH和离线乳酸)和活细胞计数(VCC)接种一式多份生产生物反应器(图1A)。还显示了针对种子容器归一化为1的碱的使用。针对每种细胞培养物(条件#1、#2和#3)(其中将细胞转移至生产生物反应器)的参数(时间、pH、乳酸、VCC和碱)以开口矩形(虚线)表示。以相同的操作条件运行所有生产生物反应器。显示了每种种子培养和其代谢状态对生产生物反应器中蛋白质效价(图1B)和乳酸(图1C)的影响。生产生物反应器的趋势线代表一式两份生物反应器的平均值，其误差棒代表±一个标准差。
图2：生产抗体的CHO细胞系种子容器被用于以四种不同的代谢状态(离线pH和乳酸)和活细胞计数在化学成分确定的方法中接种一式多份生产生物反应器(图2A)。针对每种细胞培养物(条件#1、#2、#3和#4)(其中将细胞转移至生产生物反应器)的参数(时间、pH、乳酸和VCC)以开口矩形(虚线)表示。以相同的操作条件运行所有生产生物反应器。在一周之后，条件#1丢失了。还显示了每种种子培养和其代谢状态对生产生物反应器的蛋白质效价(图2B)和乳酸积累(图2C)的影响。生产生物反应器的趋势线代表一式两份生物反应器的平均值，其误差棒代表±一个标准差。
【发明详述】
应当理解的是，本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为方法和条件可以发生变化。还应当理解的是，本文中所使用的术语仅用于描述特定实施方案，并且不旨在为限制性的，因为本发明的保护范围由权利要求书进行定义。
除非上下文另外明确指出，否则本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数引用。因此例如引用“一种方法”包括一种或多种方法，和/或本文所述类型的步骤和/或本领域技术人员一旦阅读该公开内容将对本领域技术人员变得明显的方法。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文中所述的那些相似或等价的任何方法和材料可以用于实践本发明，现在描述特定的方法和材料。本文中提到的所有出版物通过引用以其全文并入本文中。
细胞培养物
本文中使用的“分批培养”或“分批模式”是指被充满细胞和不进行交换的初始完全工作体积的培养基的单元(即培养容器)的短语。在这样的分批培养中，在培养过程的开始向培养容器供应用于细胞培养的所有成分。通常一直运行培养直到营养物被耗尽或者废产物到达毒性水平和细胞停止生长。
本文中使用的短语“种子培养(seedculture)”或“种子培养(seedtrain)”(也被称为接种物培养)包括允许以分批培养形式扩增的细胞群体的接种源，或者一系列分批培养物，直至准备好用于生产规模。种子培养扩增过程构成冷冻细胞解冻后的细胞初始生长期或接种物生长期。细胞解冻和细胞团的积累足以接种生产生物反应器之间的间隔构成种子培养扩增期。可以通过种子培养中的几个生物反应器阶段扩大细胞团，并且细胞在有利于细胞培养物的存活、生长和活力的条件下生长于细胞培养基中。应当理解的是，种子培养是旨在最大化指数生长期，或者实现特定被培养的细胞类型的最大生长速率。因此，从一个生物反应器或容器向另一个生物反应器或容器进行细胞传代可以是实现最大生长速率的一种方式。精确的条件将会基于细胞类型、细胞所来源的生物体和所表达的多肽或蛋白质的性质和特征而发生变化。转换成乳酸消耗的代谢可以发生或被检测于种子培养扩增的任一容器中。
当短语“补料分批细胞培养”或“补料分批培养”在本文中被使用时是指这样的分批培养，其中动物细胞和培养基最初被供应至培养容器中，额外的培养营养物在培养过程中被缓慢补料(连续或者以离散增量的形式)至培养物中，在结束培养之前有或者没有周期性细胞和/或产物收获。补料分批培养包括“半连续补料分批培养”，其中将整个培养物(其可以包括细胞和培养基)周期性取出并用新鲜培养基进行替换。补料分批培养不同于简单的“分批培养”，在分批培养形式的培养过程的开始时将用于细胞培养的所有成分(包括动物细胞和所有培养营养)供应至培养容器。补料分批培养可以进一步不同于灌注培养，在该过程中上清没有从培养容器取出，而在灌注培养中，通过例如过滤，细胞被限制在培养物中，并且培养基被连续地或者间歇地引入并从培养容器取出。但是，设想了在补料分批细胞培养过程中取出样品用于测试目的。补料分批过程一直继续直到确定达到了最大工作体积和/或蛋白质产量。
本文中使用的短语“连续细胞培养”涉及被用于连续生长细胞的技术，通常处于特定生长期。例如，如果需要细胞的恒定供应，或者需要生产感兴趣的特定多肽或蛋白质，细胞培养可能需要维持与特定的生长期。因此，必须连续监测条件并因此调整条件以将细胞维持在该特定期。
本文中使用的短语“对数期”是指典型特征为细胞倍增的细胞生长期。短语“指数生长期”或“指数期”与对数期可互换使用。在对数期中，每个单位时间出现的新细胞的数量与现存的细胞群体成比例，因此，将细胞数量的自然对数相对时间进行绘制得到直线。如果生长没有被限制，将以恒定速率继续倍增因而细胞的数量和群体的速率每个连续时间段增加两倍。
本文中使用的短语“平台期”是指其中细胞生长的速率等于细胞死亡的速率的点。当在图上进行绘制时，平台期被表示为曲线的达到稳定状态或者“平滑”、水平直线部分。
本文中使用的术语“细胞”包括任意细胞，其适用于表达重组核酸序列。细胞包括真核生物的那些，诸如非人动物细胞，哺乳动物细胞，人细胞或细胞融合例如杂交瘤或四源杂交瘤(quadroma)。在某些实施方案中，细胞是人细胞、猴细胞、猿细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞或小鼠细胞。在其他实施方案中，细胞选自以下细胞：CHO细胞(例如CHOK1细胞、DXB-11CHO细胞、Veggie-CHO细胞)、COS细胞(例如COS-7细胞)、视网膜细胞、Vero细胞、CV1细胞、肾细胞(例如HEK293细胞、293EBNA细胞、MSR293细胞、MDCK细胞、HaK细胞、BHK21细胞)、HeLa细胞、HepG2细胞、WI38细胞、MRC5细胞、Colo25细胞、HB8065细胞、HL-60细胞、Jurkat细胞、Daudi细胞、A431细胞(表皮细胞)、CV-1细胞、U937细胞、3T3细胞、L细胞、C127细胞、SP2/0细胞、NS-0细胞、MMT细胞、肿瘤细胞和来源于上述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.细胞)。在一些实施方案中，细胞是CHO细胞。在其他实施方案中，细胞是CHOK1细胞。
本文中使用的“细胞系”是指通过连续传代或细胞的继代培养来源于特定谱系的细胞。术语“细胞”与“细胞群体”可互换使用。
鉴于目前现有技术的补料策略，CHO细胞已经实现细胞数量诸如11×106个细胞/mL(在第8天)和例如2.3g/L人IgG的效价(在第14天收获)，其为CHO细胞补料分批培养的典型工业值的数量(Kim,BJ等人，BiotechnolBioeng.2012Jan；109(1):137-45.doi:10.1002/bit.23289。2011年10月3日电子出版)。已报道，已经被完全建立为重要的工业哺乳动物细胞系的CHO细胞为甚至大于10g/L的抗体产量(Omasa等人，CurrentPharmaceuticalBiotechnology,2010,11:233-240)。
术语“细胞培养基”和“培养基”是指用于生长哺乳动物细胞的营养液，其通常提供必要的营养以增强细胞的生长，诸如碳水化合物能源、必需氨基酸、微量元素，例如血清或蛋白胨(水解产物)，其供应支持细胞生长的原料。培养基可以含有酵母来源的提取物或大豆提取物，代替动物来源的提取物。化学成分确定的培养基是指其中所有的化学成分已知的细胞培养基。化学成分确定的培养基完全不含动物来源的成分，诸如血清来源的或动物来源的蛋白胨。
本发明的一个方面涉及生长期，其中修饰细胞培养的条件以增强重组真核细胞的生长。在该生长期中，将基础培养基和细胞供应至分批形式的培养容器。
将培养容器用细胞进行接种。初始细胞生长期的合适的接种密度基于起始细胞系而变化，例如在0.2-3x106个细胞/mL的范围内。培养容器包括、但不限于孔板、T型瓶、摇瓶、搅拌容器、旋转瓶、中空纤维、气升式生物反应器等。合适的细胞培养容器是生物反应器。生物反应器是指被制造成或被工程化为操纵或控制环境条件的任何培养容器。这样的培养容器是本领域众所周知的。
已经开发了生物反应器方法和系统以优化气体交换，以供应足以维持细胞生长和生产力的氧气，并去除CO2。维持气体交换的效率是确保成功扩大细胞培养物和蛋白质产量的重要准则。这样的系统是本领域技术人员众所周知的。
指数生长期或者种子培养(即第一细胞培养)通常接着不同的第二培养，已知为多肽生产期。在一个实施方案中，将经历第一细胞培养物中代谢转换成乳酸消耗的细胞转移至第二培养物。在一个实施方案，在不同于细胞生长期或种子培养的培养容器中进行第二细胞培养。在一些实施方案中，第二细胞培养是在生产生物反应器中进行。在该情形下，转移细胞是指从第一细胞培养容器提取一部分细胞群体并将该细胞群体部分置于第二细胞培养容器以启动第二细胞培养。
在其他方面，转移细胞是指将含有第一细胞培养物的细胞的一定体积细胞置于不同的容器并且接种物体积是第二细胞培养物的最终体积的一部分，例如最终体积的大约20％、30％、40％或50％或60％或70％或80％。在其他方面，转移细胞可以是指含有第一细胞培养物的细胞的一定体积细胞保持在起始容器中并且加入培养基使得初始体积(第一细胞培养物)是第二细胞培养物的最终体积的一部分。在该情形下，第一细胞培养物被稀释，由此将细胞转移至第二细胞培养物。
本文中使用的短语“离开(emergefrom或emergesfrom)”是指从一个阶段向另一阶段的改变，或者即将从一个阶段向另一阶段改变。离开特定的阶段(例如生长期)包括这样的时间段：其中测量表明第一阶段减慢或接近完全，而后续阶段正在开始。例如，离开对数期表示细胞正在结束对数期，和/或正在开始或已经达到平台期。通常通过活细胞浓度测量生长期。
短语“细胞密度”是指单位样品体积中细胞的数量，例如总(活的和死的)细胞数/mL。可以手动或自动对细胞的数量进行计数，诸如用流式细胞仪。已经适配自动细胞计数仪来使用例如标准台盼蓝摄取技术对活细胞的数量或死细胞的数量或活/死两种细胞的数量进行计数。短语“活细胞密度”或“活细胞浓度”是指每样品体积中活细胞的数量(也被称为“活细胞计数”)。任意数量的众所周知的手册或自动技术可以用于确定细胞密度。可以测量培养物的在线生物质的量，其中电容或光密度与每体积中细胞的数量相关。
第一细胞培养物中最终细胞密度(诸如种子培养密度)基于起始细胞系而变化，例如在大约1.0-10x106个细胞/mL的范围内。在一些实施方案中，在将细胞转移至第二细胞培养物之前最终种子培养密度达到1.0-10x106个细胞/mL。在其他实施方案中，在将细胞转移至第二细胞培养物之前最终种子培养密度达到5.0-10x106个细胞/mL。
在一些实施方案中将第一细胞培养物中细胞群体的一部分转移至第二细胞培养物。在其他实施方案中，将第一细胞培养物中的细胞群体转移至第二细胞培养物，使得第一细胞培养物是第二细胞培养物的一部分。可以由本领域普通技术人员选择第二培养物的起始细胞密度。在一个实施方案中，第二细胞培养物中的起始细胞密度在大约0.5x106个细胞/mL至大约3.0x106个细胞/mL之间。在其他实施方案中，第二细胞培养物中的起始细胞密度为大约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0x106个细胞/mL。
在某些实施方案中，在生产期之后收获细胞上清或细胞裂解物。在其他实施方案中，使用本领域众所周知的技术从培养基或细胞裂解物回收感兴趣的多肽或蛋白质。
细胞的属性和所生产的产物的位置决定了用于生长和生产的方法，以及随后选择合适类型的生物反应器或者培养容器。(Bleckwenn,NA和Shiloach,J.2004“Large-scalecellculture”CurrProtocImmunol.59:Appendix1U.1-Appendix1U.44。)
代谢转换
本文中使用的短语“代谢转换”是指细胞代谢或者碳营养源的使用从乳酸生产至净乳酸消耗的改变。不被任一理论束缚，无血清培养基中最常见的碳营养源是葡萄糖和谷氨酰胺，其支持细胞快速生长。葡萄糖可以被完全氧化为CO2和H2O，或者，基于氧的可用度诸如在有氧糖酵解中被转换成乳酸。迅速生长的细胞快速消耗葡萄糖和谷氨酰胺，导致不完全的氧化代谢并因此过量产生乳酸。碳水化合物代谢可以转换成乳酸消耗，并由此减少乳酸的积累。
本文中使用的短语“乳酸消耗”是指乳酸用作细胞代谢中的碳源。
本文中使用的短语“净乳酸消耗”是指这样的乳酸消耗，其中细胞正在同时消耗乳酸和产生乳酸为细胞代谢的副产物，并且总消耗速率大于或等于乳酸产生的速率。当净乳酸消耗增加时，细胞培养基中乳酸总的积累下降。
一旦启动补料分批培养，乳酸(以及可能的氨)的积累引起细胞活力快速下降。已报道，在没有代谢转换的补料分批培养物中，当细胞浓度已经达到其最大值时不能实现超过90％的存活(Xie和Wang,1994,Biotechnol.Bioeng.43(11):1175-1189)。尽管是最佳的方法性能所希望的，这样的代谢转换既非通用的也不容易进行控制(Zagari等人，2013,NewBiotechnol.30(2):238-245)。本发明人已经发现，将细胞从第一分批培养物(例如种子培养物)转移至第二分批培养物(例如补料分批培养物或生产培养物)的时间和条件对于最终蛋白质效价具有显著的影响。已经出乎意料地确定，在第一分批培养物中培养了更长时间段的细胞将转换成乳酸消耗并给乳酸消耗赋予代谢偏好或者代谢表型。本发明的一个目的是建立恒定的代谢转换状态的细胞，因此细胞具有乳酸消耗的代谢记忆。本发明的方法非常适合于预处理细胞进入代谢转换的状态，使得细胞可以被用于任何第二或后续细胞培养物，其中乳酸消耗是优选的。
在一个实施方案中，乳酸的总积累在第二细胞培养物中下降。在一些实施方案中，在第二细胞培养过程中实现净乳酸消耗，例如在第二细胞培养物中细胞生长的第2天或2天后、第3天或3天后、第4天或4天后或者第5天或5天后实现净乳酸消耗。在更多实施方案中，乳酸积累的降低是第二细胞培养物中峰值乳酸浓度减小。在其他实施方案中，在第二细胞培养物中细胞生长的第5天或5天之后，在第二细胞培养物中发生峰值乳酸浓度减小。在其他实施方案中，第二细胞培养物的峰值乳酸浓度小于大约6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L或小于大约1g/L。
在一些实施方案中，在第二细胞培养物中代谢转换的细胞产生至少2倍或3倍或4倍或5倍或高达10倍的更低的乳酸浓度值。在又一些实施方案中，将在第二细胞培养物中更低的乳酸浓度值或在第二细胞培养物中降低的乳酸总积累与除了在第一细胞培养物中已经发生代谢转换之前将细胞转移至第二细胞培养物之外相同的条件下相同的细胞培养中所确定的乳酸的积累进行比较。在又一些其他实施方案中，在第二细胞培养物中细胞生长的第5天或5天之后，第二细胞培养物中乳酸的总积累下降。
在另一个实施方案中，第二细胞培养物中产物总效价增加。在其他实施方案中，在第二细胞培养物中代谢转换的细胞产生至少2倍或2.5倍或3倍或4倍或5倍或高达10倍的更高的产物效价。在又一些其他实施方案中，将在第二细胞培养物中更高的蛋白质效价与除了在第一细胞培养物中已经发生代谢转换之前将细胞转移至第二细胞培养物之外相同的条件下相同的细胞培养中所确定的乳酸的积累进行比较。
在补料分批或者生产阶段之前优化培养物中细胞的代谢控制具有许多优点。可以通过多个参数确定第一培养物中的代谢转换成乳酸消耗。确定代谢转换包括本领域技术人员已知的许多用于确定生长的细胞的代谢状态的方法。
可以通过本领域技术人员众所周知的各种生物测定系统和试剂盒完成测量第一细胞培养物中的乳酸浓度值，诸如使用电化学的分析仪(例如Flex,NovaBiomedical,Waltham,MA)，或者拉曼光谱术，并且可以被用于离线或在线监测细胞培养物中的乳酸积累。
应当理解的是，乳酸积累对于细胞培养物具有有害的作用，并且随后对蛋白质产物产率具有负面效应。
在一个实施方案中，当乳酸的净积累减缓或者停止时在第一细胞培养物中确定代谢转换。
在一个实施方案中，通过第一细胞培养物中乳酸的测量检测代谢转换成乳酸消耗。在一些实施方案中，当在表示培养物中连续乳酸浓度值的测量的图上确定达到稳定状态或者基本上为水平直线时在第一细胞培养物中确定代谢转换。在其他实施方案中，乳酸浓度值在连续测量中保持低于容许上限。在又一些其他实施方案中，乳酸浓度的容许上限不大于4g/L。应当理解的是，当细胞经历净乳酸消耗时乳酸水平达到稳定状态。
在其他实施方案中，确定代谢转换包括间隔测量第一细胞培养物中的乳酸，并且确定乳酸在连续间隔均低于预定下限，由此确定已经发生细胞中代谢转换成乳酸消耗。
pH管理和控制是维持生物反应器培养物中的细胞的重要方面。大多数细胞的生长在窄的pH限内是最佳的。一般而言，将细胞培养物维持在7.0的中性pH，在上下设定点值的范围内。本领域技术人员基于培养的特定细胞系、培养基组成和该细胞生长的最佳条件确定设定点值。本文中使用的表述“中性pH”是指大约6.85至大约7.4的pH。表述“中性pH”包括大约6.85、6.9、6.95、7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35和7.4的pH值。
可以通过本领域技术人员众所周知的任意方法完成在线或“实时”pH监测和碱的加入。在一个在线系统中，通过直接连接至分析仪实时测量细胞培养物中的生物学和化学参数提供反馈以进行另外的动作，例如向培养基加入碱或者加入营养物。也可以进行周期性取样和手动操作者干预完成离线测量。连续测量pH允许细胞培养基被监测，并且例如倘若酸度达到容许限度外的下设定点值则加入碱。如果pH达到设定的容许上限(即变得太碱性了)，则可以加入CO2。
可以通过各种方法完成在线监测。电极(诸如流过电极(flow-throughelectrode))通常用于测量细胞培养基中的pH或其他参数诸如溶解O2(dO2)和温度。这样的流过电极直接插入用于连续记录的任何标准条形图表记录器或者可以被接口连接至任何标准实验室pH计或毫伏表。还可以通过使用安装在生物反应器中的荧光传感点的光学测量来测量pH。
任何这样的监测系统会整合设定的上下点值范围内的容许(或死区(dead-band))限。死区阻止定量给料系统的太快切换接通和断开。在pH控制过程中，如果pH偏离设定点在容许限范围内，则不会发生定量给料或滴定。如果pH测量值大于容许下限(酸性的)，那么会加入液体碱(例如KOH、NaOH、NaHCO3)或NH3气。如果pH测量值超过容许上限(碱性的)，则会加入酸或CO2气。pH设定点和控制测量(例如死区)与多个参数相关联，诸如溶解CO2、用于pH控制的碱消耗以及因此的重量克分子渗透压浓度。(参见例如Li,F.等人，2010,mAbs2(5):466-479.)
在一个实施方案中，当碱的加入(即滴定)停止时在第一细胞培养物中确定代谢转换。碱的趋势包括在线趋势，其中采用自动监测方法确定pH和碱的周期性加入。在本发明的方法中，pH设定点可以发生变化但是pH升高离开下死区表示第一细胞培养物中的代谢转换。测量碱趋势的在线和手动方法是本领域已知的，其包括监测容器的重量或泵的流速的方法以监测碱的加入或终止碱的加入。
在另一个实施方案中，当碱的加入对于将pH提高至超过容许下限不再是必须的时候，在第一细胞培养物中确定代谢转换。
在一些实施方案中，当在不加入碱的情况下pH值升高时在第一细胞培养物中确定代谢转换。在其他实施方案中，在连续测量下pH值升高超过的容许下限。
在其他实施方案中，确定代谢转换包括：(a)调节pH检测仪以检测第一细胞培养物中的噪音水平，(b)连续以规律性间隔测量第一细胞培养物中的pH，(c)根据需要加入碱以维持pH高于预定的下限，(d)确定pH在若干连续间隔均高于预定的下限，以及(e)停止加入碱，从而确定在细胞中已经发生代谢转换成乳酸消耗。
在一个实施方案中，容许下限是大约6.5、6.55、6.6、6.65、6.7、6.75、6.8、6.85、6.9、6.95、7.0、7.05或大约7.1的pH。
在一些实施方案中，通过第一细胞培养物中细胞代谢的指示物或产物检测代谢转换成乳酸消耗。细胞代谢的一个这样的指示物是氧消耗(Zagari等人，2013,NewBiotechnol.30(2):238-245)。精确测量细胞培养基中氧耗尽的速率可以被用于确定接种之后培养物中活细胞的存在以及培养物中细胞的生长速率(参见例如美国专利号6,165,741和美国专利号7,575,890)。氧消耗的测量是本领域众所周知的。
可以通过蛋白质组或代谢组技术(免疫阵列、核磁共振(NMR)或质谱)测量细胞代谢的其他指示物(诸如酶和代谢物)。已经将代谢物(诸如甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、腺嘌呤、棕榈酸、谷氨酸、甲硫氨酸和天冬酰胺)与细胞生物质的增加相关联(参见例如Jain,M.等人，Science.2012May25；336(6084):1040–1044.doi:10.1126/science.1218595；和DelaLuz-Hdez,K.,2012,MetabolomicsandMammalianCellCulture,Metabolomics,DrUteRoessner(Ed.),ISBN:978-953-51-0046-1,InTech，可获取自：http://www.intechopen.com/books/metabolomics/metabolomics-and-mammalian-cell-cultures)。与第一细胞培养物中代谢转换一致或直接导致第一细胞培养物中代谢转换的任意数量的分子改变可以被用于确定代谢转换已经发生。
蛋白质生产
本发明的方法在细胞培养物中生产感兴趣的蛋白质或多肽。为了能够在本发明的方法中生产蛋白质，细胞被工程化成重组表达感兴趣的多肽或蛋白质。
在细胞中已经发生代谢转换成乳酸消耗之后，将细胞转移至第二细胞培养物，例如生产培养物，并且将细胞在第二细胞培养物中维持一段时间，使得多肽或蛋白质在细胞培养物中积累。
本文中使用的“多肽”是在相邻氨基酸残基的羧基和氨基之间通过肽键键合在一起的氨基酸的单个直链聚合物链。术语“蛋白质”也可以用于描述具有特定折叠或空间结构的大的多肽(诸如七次跨膜蛋白)。因此，术语“蛋白质”是指包括由至少一个多肽组成的四级结构、三级结构和其他复合大分子。如果蛋白质包括物理上互相结合的超过一个多肽，那么此处所使用的术语“蛋白质”是指物理上偶联且作为离散单元一起发挥功能的多个多肽。术语“蛋白质”包括多肽。
由本发明的方法产生的多肽和蛋白质的实例包括抗体、融合蛋白、Fc-融合蛋白、受体、受体-Fc-融合蛋白等。
术语“免疫球蛋白”是指由两对多肽链(一对轻(L)链和一对重(H)链)组成的一类结构上相关的糖蛋白，其可以是所有的四条链通过二硫键互相连接。免疫球蛋白的结构已被充分表征。参见例如FundamentalImmunologyCh.7(Paul,W.,ed.,2nded.RavenPress,N.Y.(1989))。简而言之，每条重链通常包含重链可变区(本文中缩写为VH或VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区通常包含三个域：CH1、CH2和CH3。CH1和CH2域通过铰链连接。每条轻链通常包含轻链可变区(本文中缩写为VL或VL)和轻链恒定区。人和其他哺乳动物中有两种类型的轻链：kappa(κ)链和lambda(λ)链。轻链恒定区通常包含一个结构域(CL)。VH和VL区可以被进一步再分成超可变性的区域(或超可变区，其在序列和/或结构定义的环的形式中是超可变的)(也被称为互补决定区(CDR))，散布更保守的区域(被称为框架区(FR))。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成，从氨基端(N端)至羧基端(C端)按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(还可参见Chothia和LeskJ.MoI.Biol.196,901-917(1987))。通常，该区域中氨基酸残基的编号是根据IMGT,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991)或通过Kabat的EU编号系统(也被称为“EU编号”或“EU索引”)，例如如在Kabat,E.A.等人，SequencesofProteinsofImmunologicalinterest.5thed.USDepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版号91-3242(1991)中。
术语“Fc”是指重链恒定区的一部分，其至少包含CH2和CH3域，其通常与Fc受体(例如FcγR，即FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)或FcRn，即新生儿Fc受体)结合。应当理解的是，Fc-融合蛋白可以含有天然Fc域的一部分或全部或者含有缺失、取代和/或插入或其他修饰，其使得它不能结合任何Fc受体，因此使得该域就其作为通过Fc受体所实现的典型生物功能而言是非功能的或者“无效应子的”。
本文中使用的术语“抗体”(Ab)是指免疫球蛋白分子或其衍生物，其具有特异性结合抗原的能力。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有如上所述“免疫球蛋白”的概念所概括的与抗原相互作用的结合域。抗体也可以是双特异性抗体、双特异抗体(diabody)或类似分子(对于双特异抗体的描述，参见例如Holliger等人，1993,PNASUSA90(14),6444-8)。而且，已经显示，可以通过全长抗体的片段(即“抗原结合片段”或“抗原结合蛋白”)执行抗体的抗原结合功能如完整抗体分子所具有的，抗原结合蛋白可以是单特异性的或者多特异性的(例如双特异性的)。术语“抗体”所涵盖的结合分子或片段的实例包括、但不限于(i)Fab'或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段，或者如国际专利申请号WO2007059782中所述的单价抗体；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫键相连的两个Fab片段的双价片段；(iii)基本上由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)基本上由VL和VH域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，1989,Nature341,544-546)，其基本上由VH域组成并也被称为域抗体(Holt等人，2003,TrendsBiotechnol.21(11):484-90)；(vi)骆驼抗体或纳米抗体(Revets等人，2005,ExpertOpinBiolTher.5(1):111-24)和(vii)分离的互补决定簇(CDR)。
本文中使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体成分”是指单个分子成分的抗体分子的制剂。单克隆抗体成分展示了针对特定表达的结合特异性和亲和力。
本文中使用的术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或体外位点特异性诱变或者在基因重排过程中或通过体内体细胞突变引入的突变)。术语“小鼠或鼠单克隆抗体”是指展示单独结合特异性的抗体，其具有来源于鼠或小鼠种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。
本文中使用的术语“融合蛋白”包括Fc融合蛋白和受体-Fc融合蛋白。融合蛋白可以是通过表达嵌合基因所形成的任意多肽，所述嵌合基因通过合并具有不同起源的超过一种DNA序列而制得，通常通过将一种基因克隆入与第二种基因同框的表达载体使得两种基因编码一个连续的多肽。
在一个方面，本发明提供本文所述的用于生产重组感兴趣的多肽或蛋白质的方法。在一些实施方案中，感兴趣的重组多肽或蛋白质选自抗体、抗原结合蛋白、融合蛋白、Fc融合蛋白和受体-Fc融合蛋白。
细胞表达系统
使用细胞表达系统是在细胞培养物中高产这样的多肽或蛋白质的先决条件。
根据本发明的产物是多肽或蛋白质，其表达于细胞中并从培养系统(即细胞和/或细胞培养基)进行收获。它可以是任何感兴趣的多肽或蛋白质(同上)。
表达载体通常使用强基因启动子以驱动产物mRNA的转录。在又一个方面，本发明涉及编码感兴趣的多肽(例如抗体、抗原结合蛋白或融合蛋白)表达载体。这样的表达载体可以被用于本发明的方法用于经细胞培养重组生产感兴趣的多肽或蛋白质。
本发明的方法情形下的表达载体可以是任何合适的载体，包括染色体载体、非染色体载体和合成的核酸载体(包含一组合适的表达调控元件的核酸序列)。这样的载体的实例包括SV40、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒的衍生物，来源于质粒和噬菌体DNA的组合的载体，以及病毒核酸(RNA或DNA)载体。这样的核酸载体及其使用是本领域众所周知的(参见例如US5,589,466和US5,973,972)。
包含编码感兴趣的多肽或蛋白质的核酸分子的载体被提供于宿主细胞中，其中核酸分子可操作地连接至适用于在哺乳动物宿主细胞中表达的表达调控序列。
表达调控序列被工程化为调控并驱动编码感兴趣的基因的多肽的转录，以及在各种细胞系统中多肽或蛋白质的后续表达。质粒将可表达的感兴趣的基因与包含需要的元件(例如启动子、增强子、选择性标志、操纵基因等)表达调控序列(即表达盒)合并。在表达载体中，核酸分子可以包含或与以下结合：任何合适的启动子、增强子、选择性标志、操纵基因、阻遏物蛋白、polyA终止序列和其他表达辅助元件。
本文中使用的“启动子”表示足以直接转录与其可操作地连接的DNA序列的DNA序列，即以调控核苷酸序列的转录的方式连接。可以将核苷酸序列的表达置于本领域已知的任何启动子或增强子元件的调控之下。这样的元件的实例包括强表达启动子(例如人CMVIE启动子/增强子或CMV主要IE(CMV-MIE)启动子，以及RSV启动子、SV40晚期启动子、SL3-3启动子、MMTV启动子、泛素(Ubi)启动子、泛素C(UbC)启动子和HIVLTR启动子)。
在一些实施方案中，载体包含选自SV40、CMV、CMV-IE、CMV-MIE、RSV、SL3-3、MMTV、Ubi、UbC和HIVLTR的启动子。
编码感兴趣的多肽或蛋白质的核酸分子也可以可操作地连接至有效poly(A)终止序列、用于大肠杆菌的质粒产物的复制起点、作为选择性标志的抗生素抗性基因和/或方便的克隆位点(例如多位点人工接头)。核酸还可以包含与组成型启动子(诸如CMVIE)相反的可调节、可诱导启动子(可诱导、可抑制、发育调节的)(本领域技术人员将认识到这样的术语实际上是在某些条件下基因表达程度的描述信息(descriptor))。
选择性标志是本领域众所周知的元件。在选择性条件下，只有表达适当的选择性标志的细胞能够存活。常见的是，选择性标志基因表达蛋白质，通常是酶，其在细胞培养物中赋予对各种抗生素的抗性。在其他选择性条件下，表达荧光蛋白标志的细胞变成可见的，并因此是可选择的。实施方案包括β-内酰胺酶(bla)(β-内酰胺抗生素抗性或氨苄青霉素抗性基因或ampR)、bls(杀稻瘟菌素抗性乙酰转移酶基因)、bsd(杀稻瘟菌素-S脱氨酶抗性基因)、bsr(杀稻瘟菌素-S抗性基因)、Shble(抗性基因)、潮霉素磷酸转移酶(hpt)(潮霉素抗性基因)、tetM(四环素抗性基因或tetR)、新霉素磷酸转移酶II(npt)(新霉素抗性基因或neoR)、kanR(卡那霉素抗性基因)和pac(嘌呤霉素抗性基因)。选择性(或选择)标志通常被用于稳定细胞系的开发中。
在某些实施方案中，载体包含一种或多种选择性标志基因，其选自bla、bls、BSD、bsr、Shble、hpt、tetR、tetM、npt、kanR和pac。在其他实施方案中，载体包含一种或多种选择性标志基因，其编码绿色荧光蛋白(GFP)、增强绿色荧光蛋白(eGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、增强青色荧光蛋白(eCFP)、黄色荧光蛋白(YFP)等。
为了本发明的目的，可以使用强启动子紧密调节真核细胞中的基因表达，所述启动子由操纵基因调控，所述操纵基因进而由调节融合蛋白(RFP)调节。RFP基本上由转录封闭域和调节其活性的配体结合域组成。这样的表达系统的实例被描述于US20090162901A1中，将其全文通过引用并入本文中。
本文中使用的“操纵基因”表示DNA序列，其被引入感兴趣的基因中或附近，以这种方式使得可以通过将RFP与操纵基因结合调节基因，并且结果阻止或允许感兴趣的基因的转录。原核细胞和噬菌体中的许多操纵基因已经被充分表征(Neidhardt编辑的EscherichiacoliandSalmonella；CellularandMolecularBiology2d.Vol2ASMPress,WashingtonD.C.1996)。这些包括、但不限于大肠杆菌的LexA基因的操纵基因区(其结合LexA肽)以及乳糖和色氨酸操纵基因(其结合由大肠杆菌的LacI和trpR基因编码的阻遏物蛋白)。这些还包括来自λPR和噬菌体P22ant/mnt基因的噬菌体操纵基因，其结合由λcI和P22arc编码的阻遏物蛋白。在一些实施方案中，当RFP的转录封闭域是限制性酶(诸如NotI)时，操纵基因是该酶的识别序列。本领域技术人员将认识到的是，操纵基因必须位于邻近启动子或位于启动子3'，使得其能够通过启动子控制转录。例如美国专利号5,972,650(其通过引用并入本文中)指出tetO序列在特异性远离TATA盒的距离内。
在某些实施方案中，操纵基因选自tet操纵基因(tetO)、NotI识别序列、LexA操纵基因、乳糖操纵基因、色氨酸操纵基因和Arc操纵基因(AO)。在一些实施方案中，阻遏物蛋白选自TetR、LexA、LacI、TrpR、Arc、λC1和GAL4。在其他实施方案中，转录封闭域来源于真核阻遏物蛋白，例如来源于GAL4的阻遏物域。
在示例性细胞表达系统中，细胞被工程化为表达四环素阻遏物蛋白(TetR)，并且感兴趣的多肽被置于启动子的转录调控之下，所述启动子的活性由TetR进行调节。两个串联TetR操纵基因(tetO)紧接着载体的CMV-MIE启动子/增强子的下游进行放置。在这样的载体中由CMV-MIE启动子引导的编码感兴趣的蛋白质的转录可以在不存在四环素或其他一些合适的诱导物(例如强力霉素)的情况下由TetR进行阻断。在存在诱导物的情况下，TetR蛋白不能结合tetO，因此发生转录和因此感兴趣的多肽的翻译(表达)。(参见例如美国专利号7,435,553，将其全文通过引用并入本文中。)
这样的细胞表达细胞可以只用于“打开”生产培养过程中感兴趣的多肽的生产。因此，可以将抗生素(诸如四环素或其他合适的诱导物)加至生物反应器至第一细胞培养物中。
另一个示例性的细胞表达系统包括调节融合蛋白诸如TetR-ERLBDT2融合蛋白，其中融合蛋白的转录封闭域是TetR并且配体结合域是带有T2突变的雌激素受体配体结合域(ERLBD)(ERLBDT2；Feil等人，1997,Biochem.Biophys.Res.Commun.237:752-757)。当tetO序列被置于下游并接近强CMV-MIE启动子时，来自CMV-MIE/tetO启动子的感兴趣的核苷酸序列的转录在存在他莫昔芬的情况下被阻断，并通过去除他莫昔芬而解除阻断。在另一个实例中，融合蛋白Arc2-ERLBDT2(由单链二聚体组成，所述单链二聚体由两个Arc蛋白通过15个氨基酸的接头和ERLBDT2(同上)相连组成)的使用涉及Arc操纵基因(AO)，更具体地紧接着CMV-MIE启动子/增强子下游的两个串联arc操纵基因。可以通过Arc2-ERLBDT2调节细胞系，其中表达感兴趣的蛋白质的细胞被CMV-MIE/ArcO2启动子驱动，并是可诱导型的(去除他莫昔芬)。(参见例如US20090162901A1，将其通过引用并入本文。)在一些实施方案中，载体包含CMV-MIE/TetO或CMV-MIE/AO2杂合启动子。
用于本发明的方法的合适的载体也可以采用Cre-lox工具用于重组技术以有助于感兴趣的基因的复制。Cre-lox策略需要至少两种成分：1)Cre重组酶，催化两个loxP位点之间的重组；以及2)loxP位点(例如特异性的由8bp的核心序列(发生重组的地方)和侧翼的两个13bp反向重复组成的34碱基对bp序列)或突变lox位点。(参见例如Araki等人，1995,PNAS92:160-4；Nagy,A.等人，2000,Genesis26:99-109；Araki等人，2002,NucAcidsRes30(19):e103和US20100291626A1，将其全部通过引用并入本文)。在另一个重组策略中，可以利用具有共有序列FRT的酵母来源的FLP重组酶(还参见例如Dymecki,S.,1996,PNAS93(12):6191-6196)。
在另一个方面，将基因(即编码感兴趣的重组多肽的核苷酸序列)插入表达盒的表达增强序列内，并任选可操作地连接至启动子，其中启动子连接的基因5’侧接第一重组酶识别位点并且3’侧接第二重组酶识别位点。这样的重组酶识别位点允许表达系统的宿主细胞中Cre介导的重组。在一些情况下，第二启动子连接的基因在第一基因的下游(3’)并且3’侧接第二重组酶识别位点。在又一些其他情况下，第二启动子连接的基因5’侧接第二重组酶位点，并且3’侧接第三重组酶识别位点。在一些实施方案中，重组酶识别位点选自loxP位点、lox511位点、lox2272位点和FRT位点。在其他实施方案中，重组酶识别位点是不同的。在又一个实施方案中，宿主细胞包含能够表达Cre重组酶的基因。
在一个实施方案中，载体包含编码抗体的轻链或者感兴趣的抗体的重链的第一基因，以及编码抗体的轻链或感兴趣的抗体的重链的第二基因。
应当理解的是，在这样的表达系统中可以采用携带编码并表达感兴趣的蛋白质的一种或多种核酸序列的一种或多种载体。
本发明的细胞也可以被工程化为经蛋白质的共表达以增加产物表达，诸如伴侣蛋白、凋亡抑制剂、蛋白质降解抑制剂或可以增强产物的表达或稳定性的其他蛋白质。
在一些实施方案中，载体进一步包含X盒结合蛋白1(mXBP1)和/或EDEM2基因，其能够通过调控涉及蛋白质在内质网(ER)中的折叠的基因的表达增强蛋白质的生产/蛋白质的分泌。(参见例如RonD和WalterP.,2007,NatRevMolCellBiol.8:519–529；Olivari等人，2005,J.Biol.Chem.280(4):2424-2428，Vembar和Brodsky,Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.9(12):944-957,2008)。
也可以进行快速产生显著量的产物的瞬时转染细胞的使用以最佳化细胞培养过程，但是稳定转染通常被用于大体积的生产规模。
在本发明的情形下，代谢转换的细胞可以含有如本文中所述有效重组生产感兴趣的蛋白质所必需的细胞表达系统的任意或所有元件。
在再一个方面，本发明涉及代谢转换的重组真核宿主细胞，其生产感兴趣的蛋白质。宿主细胞的实例包括哺乳动物细胞，诸如CHO细胞系、PER.C6细胞系、鼠淋巴样细胞系和鼠杂交瘤细胞系(同上)。例如，在一个实施方案中，本发明提供代谢转换的细胞，其包含稳定整合入细胞基因组的核酸序列，其中该核酸序列编码感兴趣的蛋白质。在另一个实施方案中，本发明提供代谢转换的细胞，其包含非整合的(即游离型的)核酸序列，诸如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件，其包含编码感兴趣的蛋白质的序列。
“收获”或“细胞收获”发生于上游过程中生产批的结束时。通过许多方法从培养基分离细胞，诸如过滤、细胞包封(encapsulation)、细胞吸附至微载体、细胞沉降或离心。在另外的步骤中发生蛋白质的纯化以分离蛋白质产物。可以从细胞或细胞培养基收获多肽或蛋白质。
蛋白质纯化测量是本领域众所周知的。可溶形式的多肽(诸如抗体、抗体结合片段和含有Fc的蛋白质)可以经受商售可得的浓缩过滤器，并随后通过众所周知的方法进行亲和纯化，诸如亲和树脂、离子交换树脂、层析柱等。膜结合形式的多肽可以通过从表达细胞制备总膜级分并且用非离子去污剂(诸如X-100(EMDBiosciences,SanDiego,CA,USA))提取膜来进行纯化。可以通过裂解宿主细胞(经机械力、超声处理(sonication)、去污剂等)、通过离心去除细胞膜级分并保持上清来制备胞质蛋白质或细胞核蛋白质。
在又一个方面，本发明涉及用于生产抗体或抗原结合蛋白或感兴趣的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：a)根据本文上述的方法培养细胞，b)收获细胞，以及c)从细胞或细胞培养基纯化多肽或蛋白质，诸如抗体或抗原结合蛋白或融合蛋白。
提供以下实施例以向本领域技术人员描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，并且不旨在限制本发明人所认为的本发明的保护范围。已经努力确保所使用的数字(例如量、浓度、温度等)的准确性，但是应当考虑到一些实验误差和偏差的存在。
【实施例】
【实施例1-确定代谢转换参数：生产融合蛋白的细胞系】
用表达融合蛋白的DNA转染CHO细胞。在含有大豆的专有培养基中、在种子容器培养物中培养生产融合蛋白的CHO细胞系，并且测量并记录参数(诸如在线pH、离线乳酸和活细胞计数)以确定代谢状态(参见图1A的#1、#2或#3)。还监测碱的使用并针对该细胞系归一化为1(也参见图1A)。
当pH控制于控制范围的底端并且乳酸和VCC正升高时，使用条件#1和条件#2下的细胞接种一式多份的生产生物反应器。当pH开始升高离开控制范围的底部时(即碱的使用已经停止，表明乳酸重新代谢(即消耗))，接种条件#3下的细胞。条件#3中的细胞生长已经进入指数后生长期。以相同的操作条件运行所有的生产生物反应器。
使用已知方法测量每个生产生物反应器中的产品效价(参见图1B)和乳酸谱(参见图1C)以确定种子代谢状态#1、#2或#3的影响。生产生物反应器的趋势线代表一式两份生物反应器的平均值，其误差棒代表±一个标准差。
条件#3的细胞对第二细胞培养物的生产力和乳酸积累具有最显著的效果，导致生产反应器中产品效价大于两倍的升高(与条件#1和#2相比)(参见图1B)。条件#3的细胞还导致转移至第二细胞培养物之后降低的乳酸浓度(与条件#1和#2相比-参见图1C)。条件#3的细胞具有表示净乳酸消耗的乳酸谱(参见图1C的在8-12天的细胞培养物)。在条件#1下从第一培养物转移的细胞(即在第一培养物中代谢转换之前)没有实现生产生物反应器中的净乳酸消耗。
【实施例2-确定代谢转换参数：生产抗体的细胞系】
使用生产抗体的CHO细胞系种子容器来接种一式多份类似于实施例1的生产生物反应器，但是于化学成分确定培养基中。处理四种不同的代谢状态(监测离线pH、乳酸和活细胞计数-参见图2A的#1、#2、#3和#4)。当接种了生产生物反应器时，在种子容器持续培养过程中VCC继续升高。
当pH仍然在控制范围的顶端时和当乳酸低但正在升高时将条件#1非常早地接种于种子。当pH开始降低并且乳酸正升高并达到峰值水平时接种条件#2。当pH接近控制范围的底部并且乳酸水平已经达到稳定状态时接种条件#3。当pH开始升高离开控制范围底部时并在乳酸再代谢过程中(即乳酸消耗)接种条件#4。以相同的操作条件运行所有的生产生物反应器。在一周之后，条件#1丢失了。
确定了种子代谢状态对生产生物反应器效价(图2B)和乳酸(图2C)谱的影响。生产生物反应器的趋势线代表一式两份生物反应器的平均值，其误差棒代表±一个标准差。
在第二细胞培养物中条件#3和#4的细胞对生产力具有最显著的效果。条件#3和#4的细胞还导致生产生物反应器中降低的乳酸浓度(与条件#1和#2相比)，这表示乳酸消耗的代谢表型(参见图2B和图2C)。与实施例2类似，在条件#1下从第一培养物转移的细胞在生产期过程中没有实现净乳酸消耗。条件#2、#3和#4在生产期过程中实现净乳酸消耗，但是条件#4是最佳的，因为其净乳酸消耗的发生早于其他条件，并且峰值乳酸水平是最低的。

Claims (18)

1.用于培养细胞的方法，其包括：
(a)在第一细胞培养物中培养细胞，
(b)确定在所述第一细胞培养物中代谢转换成乳酸消耗已经发生，以及
(c)所述细胞中代谢转换成乳酸消耗已经发生之后，将所述细胞转移至第二细胞培养物，
其中所述第二细胞培养物中的乳酸浓度表示净乳酸消耗。
2.权利要求1所述的方法，其中培养第一细胞培养物中的细胞之前将所述细胞用编码感兴趣的多肽的DNA转染，并且包括在允许表达所述感兴趣的多肽的条件下维持所述第二细胞培养物，以及从所述第二细胞培养物收获所述感兴趣的多肽。
3.权利要求1或2所述的方法，其中通过测量所述第一细胞培养物中的pH、乳酸或碱检测代谢转换成乳酸消耗。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中在没有加入碱的情况下所述第一细胞培养物的培养基中pH升高之后检测代谢转换成乳酸消耗。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中当所述第一细胞培养物中的细胞离开对数期或已经达到平台期的时候代谢转换发生。
6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中当所述第一细胞培养物中的乳酸水平达到稳定状态时代谢转换发生。
7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中在所述第一细胞培养物中细胞生长的第3天或3天后代谢转换发生于所述第一细胞培养物中。
8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中在所述第二细胞培养物中，转移的细胞具有在大约0.5x106个细胞/mL至大约3.0x106个细胞/mL之间的接种细胞密度。
9.权利要求1-8任一项所述的方法，其中确定所述代谢转换的步骤包括：
a.测量所述第一细胞培养物中的pH，
b.加入碱以维持pH大于预定的下限，
c.确定所述pH在连续的间隔大于预定的下限，以及
d.停止加入碱，
从而确定在所述第一细胞培养物中代谢转换成乳酸消耗已经发生。
10.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述第一细胞培养物是种子培养物。
11.权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述第二细胞培养物是生产培养物。
12.权利要求1-11任一项所述的方法，其中将细胞转移至第二细胞培养物包括将细胞转移至生产生物反应器。
13.权利要求1-12任一项所述的方法，其中感兴趣的蛋白质选自抗体、抗原结合蛋白和融合蛋白。
14.由权利要求1-13任一项所述的方法生产的代谢转换的宿主细胞。
15.由权利要求1-13任一项所述的方法生产的代谢转换的宿主细胞，其包含稳定整合入细胞基因组的一种或多种核酸序列，其中所述核酸序列编码感兴趣的蛋白质。
16.由权利要求1-13任一项所述的方法生产的代谢转换的宿主细胞，其包含编码感兴趣的蛋白质的一种或多种表达载体。
17.权利要求15或权利要求16所述的宿主细胞，其中所述感兴趣的蛋白质选自抗体、抗原结合蛋白和融合蛋白。
18.权利要求14-17任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞选自CHO细胞、COS细胞、视网膜细胞、Vero细胞、CV1细胞、HEK293细胞、293EBNA细胞、MSR293细胞、MDCK细胞、HaK细胞、BHK21细胞、HeLa细胞、HepG2细胞、WI38细胞、MRC5细胞、Colo25细胞、HB8065细胞、HL-60细胞、Jurkat细胞、Daudi细胞、A431细胞、CV-1细胞、U937细胞、3T3细胞、L细胞、C127细胞、SP2/0细胞、NS-0细胞、MMT细胞、PER.C6细胞、鼠淋巴样细胞和鼠杂交瘤细胞。
CN201480055499.4A 2013-10-11 2014-10-10 代谢优化的细胞培养物 Pending CN105637085A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210497778.2A CN114717196A (zh) 2013-10-11 2014-10-10 代谢优化的细胞培养物

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361889815P 2013-10-11 2013-10-11
US61/889,815 2013-10-11
PCT/US2014/059993 WO2015054554A1 (en) 2013-10-11 2014-10-10 Metabolically optimized cell culture

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210497778.2A Division CN114717196A (zh) 2013-10-11 2014-10-10 代谢优化的细胞培养物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105637085A true CN105637085A (zh) 2016-06-01

Family

ID=52813657

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480055499.4A Pending CN105637085A (zh) 2013-10-11 2014-10-10 代谢优化的细胞培养物
CN202210497778.2A Pending CN114717196A (zh) 2013-10-11 2014-10-10 代谢优化的细胞培养物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210497778.2A Pending CN114717196A (zh) 2013-10-11 2014-10-10 代谢优化的细胞培养物

Country Status (18)

Country Link
US (2) US20160244725A1 (zh)
EP (3) EP3812453A1 (zh)
JP (3) JP6663854B2 (zh)
KR (4) KR102510238B1 (zh)
CN (2) CN105637085A (zh)
AU (2) AU2014331776B2 (zh)
CA (1) CA2926049C (zh)
DK (2) DK3351620T3 (zh)
EA (2) EA201991976A1 (zh)
ES (2) ES2678945T3 (zh)
HK (2) HK1223122A1 (zh)
HU (2) HUE039551T2 (zh)
IL (2) IL244511A0 (zh)
MX (2) MX2016004564A (zh)
PL (2) PL3055409T3 (zh)
SG (2) SG11201601681QA (zh)
WO (1) WO2015054554A1 (zh)
ZA (1) ZA201601550B (zh)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102510238B1 (ko) 2013-10-11 2023-03-16 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 대사적으로 최적화된 세포 배양
US20160244726A1 (en) * 2013-10-11 2016-08-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Metabolically optimized cell culture
US11390663B2 (en) 2013-10-11 2022-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Metabolically optimized cell culture
JP7260011B2 (ja) * 2017-03-31 2023-04-18 株式会社三洋物産 遊技機
JP7260020B2 (ja) * 2017-03-31 2023-04-18 株式会社三洋物産 遊技機
JP7260018B2 (ja) * 2017-03-31 2023-04-18 株式会社三洋物産 遊技機
JP7310947B2 (ja) * 2017-04-27 2023-07-19 株式会社三洋物産 遊技機
JP7272480B2 (ja) * 2017-04-27 2023-05-12 株式会社三洋物産 遊技機
JP7260021B2 (ja) * 2017-04-27 2023-04-18 株式会社三洋物産 遊技機
JP7310945B2 (ja) * 2017-04-27 2023-07-19 株式会社三洋物産 遊技機
JP7260012B2 (ja) * 2017-04-27 2023-04-18 株式会社三洋物産 遊技機
JP7310952B2 (ja) * 2017-04-27 2023-07-19 株式会社三洋物産 遊技機
JP7260009B2 (ja) * 2017-04-27 2023-04-18 株式会社三洋物産 遊技機
JP7260013B2 (ja) * 2017-04-27 2023-04-18 株式会社三洋物産 遊技機
CN111344558A (zh) 2017-10-06 2020-06-26 龙沙有限公司 使用拉曼光谱法自动控制细胞培养
EP4039786A1 (en) 2017-10-16 2022-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Perfusion bioreactor and related methods of use
US20200385673A1 (en) * 2017-11-30 2020-12-10 Hoffmann-La Roche Inc. Process for culturing mammalian cells
GB201810772D0 (en) * 2018-06-29 2018-08-15 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Method in bioprocess purification system
JP2020151559A (ja) * 2020-06-24 2020-09-24 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020151560A (ja) * 2020-06-24 2020-09-24 株式会社三洋物産 遊技機

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101300342A (zh) * 2005-11-02 2008-11-05 惠氏公司 用于使哺乳动物细胞具备适应性的方法
US20110104734A1 (en) * 2009-10-12 2011-05-05 Keck Graduate Institute Novel strategy to reduce lactic acid production and control ph in animal cell culture

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
US6165741A (en) 1997-05-30 2000-12-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for rapid detection of bacterial growth in cultures
US5972650A (en) 1997-06-26 1999-10-26 Brigham And Women's Hospital Tetracycline repressor regulated mammalian cell transcription and viral replication switch
DE60211329T2 (de) 2001-01-16 2007-05-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Isolierung von sezernierte proteine exprimierenden zellen
US6953692B2 (en) * 2001-12-18 2005-10-11 Bayer Pharmaceuticals Corporation Device and method for seed-train expansion of mammalian cells
US7039770B1 (en) 2002-03-05 2006-05-02 Juniper Networks, Inc. Low latency request dispatcher
CA2417689C (en) 2002-03-05 2006-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved methods for growing mammalian cells in vitro
US8673589B2 (en) 2002-05-29 2014-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Inducible eukaryotic expression system
ES2344789T5 (es) 2003-05-15 2017-06-14 Wyeth Llc Alimentación restringida de glucosa para el cultivo de células animales
US7531327B2 (en) * 2004-07-23 2009-05-12 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for increasing longevity and protein yield from a cell culture
US7335491B2 (en) 2004-08-27 2008-02-26 Wyeth Research Ireland Limited Production of anti-abeta
TWI364458B (en) * 2004-08-27 2012-05-21 Wyeth Res Ireland Ltd Production of tnfr-lg
WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
US7575890B2 (en) 2006-01-18 2009-08-18 Oxygen Enterprises, Ltd. Method for rapid detection and evaluation of cultured cell growth
MX2009004519A (es) 2006-11-03 2009-05-12 Wyeth Corp Sustancias que inhiben la glucolisis en un cultivo de celulas.
EP2150617B1 (en) 2007-06-04 2014-10-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Enhanced expression and stability regions
EP3327132A3 (en) 2007-08-09 2018-07-18 Wyeth LLC Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors
US20090325287A1 (en) * 2008-06-13 2009-12-31 Haimanti Dorai Methods for Obtaining High Viable Cell Density in Mammalian Cell Culture
SG185038A1 (en) * 2010-04-26 2012-11-29 Novartis Ag Improved cell culture medium
WO2011150241A2 (en) * 2010-05-28 2011-12-01 Genentech, Inc. Decreasing lactate level and increasing polypeptide production by downregulating the expression of lactate dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase kinase
TWI637057B (zh) 2012-11-09 2018-10-01 拜爾沙納有限公司 具交替生物反應器用途之不連續進料批次製程
KR102510238B1 (ko) 2013-10-11 2023-03-16 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 대사적으로 최적화된 세포 배양

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101300342A (zh) * 2005-11-02 2008-11-05 惠氏公司 用于使哺乳动物细胞具备适应性的方法
US20110104734A1 (en) * 2009-10-12 2011-05-05 Keck Graduate Institute Novel strategy to reduce lactic acid production and control ph in animal cell culture

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUONG LE等: "Multivariate analysis of cell culture bioprocess data—Lactate consumption as process indicator", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 *
孙祥明等: "乳酸对重组CHO细胞生长代谢及EPO表达的影响", 《化工学报》 *
王晓澍等: "CD147/HAb18G单克隆抗体对人脑胶质瘤细胞乳酸转运及细胞生长的影响", 《第三军医大学学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160062032A (ko) 2016-06-01
DK3351620T3 (da) 2020-10-26
ES2833471T3 (es) 2021-06-15
SG10201800772TA (en) 2018-03-28
EA201690600A1 (ru) 2016-09-30
ZA201601550B (en) 2023-05-31
AU2014331776B2 (en) 2020-10-22
CN114717196A (zh) 2022-07-08
JP7377243B2 (ja) 2023-11-09
KR20230038324A (ko) 2023-03-17
KR20220020415A (ko) 2022-02-18
EP3055409A4 (en) 2016-09-28
KR20210046835A (ko) 2021-04-28
JP2016532457A (ja) 2016-10-20
AU2021200193A1 (en) 2021-03-18
MX2016004564A (es) 2016-07-12
DK3055409T3 (en) 2018-07-30
HK1223122A1 (zh) 2017-07-21
US20210087535A1 (en) 2021-03-25
KR102243980B1 (ko) 2021-04-26
EP3055409B1 (en) 2018-04-25
KR102358807B1 (ko) 2022-02-08
IL262833A (en) 2018-12-31
ES2678945T3 (es) 2018-08-21
JP6663854B2 (ja) 2020-03-13
EP3812453A1 (en) 2021-04-28
PL3055409T3 (pl) 2018-10-31
EA033783B1 (ru) 2019-11-25
AU2014331776A1 (en) 2016-03-24
EP3351620A1 (en) 2018-07-25
KR102610425B1 (ko) 2023-12-06
CA2926049A1 (en) 2015-04-16
EA201991976A1 (ru) 2020-04-02
EP3351620B1 (en) 2020-09-02
US20160244725A1 (en) 2016-08-25
IL244511A0 (en) 2016-04-21
HUE051049T2 (hu) 2021-01-28
EP3055409A1 (en) 2016-08-17
CA2926049C (en) 2023-09-05
JP2022009453A (ja) 2022-01-14
AU2021200193B2 (en) 2023-08-24
JP2020072760A (ja) 2020-05-14
HK1253275A1 (zh) 2019-06-14
KR102510238B1 (ko) 2023-03-16
MX2020011334A (es) 2021-07-30
PL3351620T3 (pl) 2021-03-08
HUE039551T2 (hu) 2019-01-28
WO2015054554A1 (en) 2015-04-16
JP6967620B2 (ja) 2021-11-17
SG11201601681QA (en) 2016-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105637085A (zh) 代谢优化的细胞培养物
KR101591671B1 (ko) 항체의 이질성을 감소시키는 방법 및 그 항체의 제조방법
Stuible et al. Optimization of a high-cell-density polyethylenimine transfection method for rapid protein production in CHO-EBNA1 cells
CN105189735A (zh) 在培养期间减少乳酸累积的方法和生产多肽的方法
CN106687575A (zh) 用于收获哺乳动物细胞培养物的方法
CN115003787A (zh) 连续收获由培养的细胞生产的生物物质的设备和方法
Matanguihan et al. Upstream continuous processing: recent advances in production of biopharmaceuticals and challenges in manufacturing
CN108350415A (zh) 调节灌注模式中重组蛋白生产概况的方法
US20160244726A1 (en) Metabolically optimized cell culture
US20220315644A1 (en) Metabolically optimized cell culture
WO2023084427A1 (en) Mammalian cell culture process for recombinant protein production
EA040764B1 (ru) Метаболически оптимизированная клеточная культура
EA045030B1 (ru) Метаболически оптимизированная клеточная культура
WO2023242238A1 (en) Cell culture processes

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160601