CN112912104A - 抗血管新生融合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种双功能融合蛋白，其为同时靶向血管内皮生长因子(VEGF)及血管生成素(ANG)的(AT)a‑Fc‑(VT)b，其中AT是ANG结合模体；VT是VEGF结合模体；Fc是IgG的N端；a及b的每一者是1至10的整数。该双功能融合蛋白含有两种或多种人类蛋白且全部为人类序列的结构域，因此预期其为非免疫原性的，并且可能用于治疗人类靶向血管新生相关疾病。

Description

抗血管新生融合蛋白及其用途
技术领域
本申请案主张在2018年8月17日提出申请之美国临时申请案第62/719,377号的权益及优先权，该临时申请案系以全文引用方式并入本文中。
本发明系与一种抗血管新生融合蛋白有关，该融合蛋白系双功能融合蛋白。
背景技术
血管新生，即通过从先前存在的血管出芽长成血管，对于固态肿瘤成长及肿瘤转移来说是不可或缺的。产生新的血管涉及多步骤过程，包含起始血管膜溶解、内皮细胞迁移及增生以及新血管形成。抑制任一这些步骤会抑制新血管形成，并因此影响肿瘤生长及转移产生。事实上，根据估计，消除单个内皮细胞可抑制肿瘤细胞生长。根据报导，抗血管新生疗法可为癌症治疗提供有希望的机制。
血管内皮生长因子(VEGF)在血管新生过程中扮演了重要的角色。在老年黄斑部退化(AMD)或肿瘤生长等疾病中，主要是通过此重要生长因子的过度表现引起新血管形成[Connolly等人(1989)J Clinic Invest 84(5):1470-8；Ferrara等人(1989)BiochemBiophys Res Commun 161(2):851-8；Ferrara等人(1989)Nat Med 4(3):336-40]。VEGF家族包含若干成员，例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及胎盘生长因子(PGF)。VEGF-A为VEGF家族的原型成员，也是最广为研究的成员。已显示VEGF-A会刺激内皮细胞行有丝分裂、促进细胞存活及增殖、诱导细胞迁移及增加微血管通透性。已证明通过利用抗体、VEGF陷阱(traps)或VEGF受体(VEGFR)激酶抑制剂阻断VEGF以靶向血管新生过程，在临床前及临床上能有效治疗癌症及AMD症[Major等人(1997)J Pharmacol Exp.Ther 283(1):402-10；Willett等人(2004)Nat Med 10(2):145-7；Papadopoulos等人(2012)Angiogenesis 15(2):171-85；Aiello等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(23):10457-61]。举例来说，在VEGF阻断剂中，Eylea(阿柏西普)为靶向VEGF-A、VEGF-B及PGF的改造嵌合Fc融合蛋白，其含有VEGFR1细胞外Ig结构域2(ECD，D2)、VEGFR2细胞外Ig结构域3(ECD，D3)及IgG1 Fc片段，目前已获FDA批准用于治疗AMD及转移性结肠直肠癌[Holash等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(17):11393-8]。
血管生成素(ANG)为血管生长因子的一家族，也显示在血管新生中扮演了重要的角色[Alves等人(2010)BMC Infect Dis 10:143-52]。其中，已证明ANG1及ANG2通过ANG-TIE信号传递路径在发育及肿瘤诱导的血管新生过程中参与了血管稳定性及退化的平衡[Augustin等人(2009)Nat Rev Mol Cell Biol 10(3):165-77]。ANG1及ANG2以类似的亲和力与TIE2结合[Suri等人(1996)Cell 87(7):1171-80；Maisonpierre等人(1997)Science277:55–60]。TIE2细胞外结构域(ECD)含有三个EGF样模块，其侧翼有两个免疫球蛋白(Ig)样结构域及第三免疫球蛋白样结构域，接着有三个第三型纤维黏连蛋白(FNIII)重复序列。结构及功能分析显示ANG结合位点位于Ig样子结构域的N端对，然而，与整个TIE2 ECD相比，其显示了较低的结合活性[Lin等人(1997)J Clin Invest 100:2072–2078]。最近的研究表明了ANG1为促效剂，通过将介于内皮细胞与其周围支持细胞及细胞外基质之间的相互作用最大化以促进血管稳定。另一方面，发现到ANG2是环境依赖拮抗剂，促进血管新生出芽或血管退化[Maisonpierre等人(1997)Science 277:55–60]。循环ANG2浓度已经确定为预测许多人类癌症(包含转移性黑色素瘤、结肠直肠癌(CRC)及慢性淋巴细胞性白血病)不良预后的因子[Eklund等人(2013)Exp Cell Res 319(9):1271-80]。据报导，升高的ANG2会引起内皮细胞不稳定，其导致血管退化、缺氧及ANG2、VEGF两者增加表现，这些共同诱导肿瘤中强烈的血管新生[Holash等人(1999)Science 284(5422):1994-8]。
然而，开发出一种在治疗血管新生相关疾病中抑制血管新生的新方法仍有其需要。
发明内容
因此，本发明提供一种融合蛋白，其抑制ANG-TIE信号传递路径及VEGF-VEGFR信号传递路径，其中该融合蛋白含有一ANG抑制结构域及一VEGF抑制结构域，从而通过阻断ANG、VEGF或其受体之间的相互作用以在抑制血管新生方面提供显著改善的功效。
在一方面，本发明提供一种双功能融合蛋白，其包含与一连接子融合的一或多个含有片段的ANG结合模体及一或多个含有片段的VEGF结合模体，从而通过阻断ANG、VEGF或其受体之间的相互作用以在抑制血管新生方面提供显著改善的功效。
在本发明的一具体实施例中，该双功能融合蛋白包含与一连接子融合的(1)一或多个含有ANG结合模体的片段及(2)一或多个含有VEGF结合模体的片段。
在本发明的一实例中，该含有ANG结合模体的片段是一片段抗原结合(Fab)片段，且含有VEGF结合模体的片段是一单链抗体(ScFv)。
在本发明的一具体实施例中，该双功能融合蛋白是同时靶向血管内皮生长因子(VEGF)及血管生成素(ANGs)的(AT)a-Fc-(VT)b，其提供了显著改善的抗血管新生功效，其中AT是一ANG结合模体，VT是一VEGF结合模体；Fc是一连接子；a及b的每一者是1至10的整数。
在本发明的一具体实施例中，ANG结合模体是由Tie2细胞外结构域(ECD)氨基酸23-448残基所组成的片段。
在本发明的一具体实施例中，该VEGF结合模体是VEGFR1 ECD D2、VEGFR2ECD D3或含有两者的嵌合结构域。在一较佳的具体实施例中，该VEGF结合模体是含有VEGFR1 ECD D2及VEGFR2 ECD D3的嵌合结构域。
在本发明的一具体实施例中，该连接子是IgG1 Fc片段、短弹性GS连接子或其组合。
在本发明的一具体实施例中，该双功能蛋白是融合蛋白(AT)-Fc-(VT)，其中AT是一含有Tie2 ECD氨基酸23-448残基的AT片段，Fc是一IgG Fc片段，且VT是一含有含VEGFR1D2及VEGFR2 D3的嵌合结构域的VT片段。
在本发明的一实例中，该AT片段与IgG Fc片段融合，接着在该AT-Fc片段的C端以一短弹性GS连接子与该VT连接。
在一特定的具体实施例中，该双功能融合蛋白是由一含有ANG抑制结构域的片段抗原结合(Fab)及一具有VEGF抑制结构域的单链抗体(ScFv)所构筑。较佳地，该Fab是抗-Ang2 Fab，且该ScFv是由Lucentis(兰尼单抗)Vh及Vk所组成的融合片段。
在一具体实施例中，该Fc片段是一野生型或一任何人类免疫球蛋白同型、亚型或同种异型的变体。
在另一方面，本发明提供一种医药组合物，其包含本文中揭示的该融合蛋白及医药上可接受的载体。
根据本发明，医药组合物是用于防止或治疗血管新生相关疾病，例如老年性黄斑部退化(AMD)症或原发癌或转移癌。
在又另一方面，本发明提供一种能够与血管生成素结合的融合蛋白，其含有与IgG1 Fc片段融合的Tie2 ECD氨基酸23至448残基。
在又另一方面，本发明提供一种针对VEGF的融合蛋白，其包含在其C端与IgG1 Fc片段融合的一含有VEGFR1 D2及VEGFR2 D3的嵌合模体。
应理解的是，前述一般性描述及下述实施方式两者为例示、说明且不限制本发明。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容及下述本发明的实施方式。出于说明本发明的目的，图式显示了目前较佳的具体实施例。
在图式中：
图1A及图1B分别显示了AT-Fc及Fc-VT蛋白的结构图，其中AT-Fc蛋白包含具有Tie2 ECD氨基酸23-448残基的合成核苷酸序列，其含有与IgG Fc的N端融合以构筑AT-Fc蛋白的表现载体的三个Ig样结构域及三个EGF样重复；且VT-Fc蛋白包含由VEGFR1 ECD D2及VEGFR2 ECD D3所组成的嵌合VEGF结合模体，其经合成并与IgG FC的C端融合，其之间有GS连接子以产生Fc-VT蛋白的表现载体。
图2A及图2B分别显示了AT-Fc蛋白及Fc-VT蛋白的PAGE分析，其中AT-Fc及Fc-VT表现载体分别用于转染HEK293细胞，其经表现，接着利用蛋白G层析自细胞培养上清液纯化。在还原或非还原的条件下对纯化的蛋白(3μg/lane)进行凝胶分析。图2A及图2B显示了AT-Fc及Fc-VT蛋白的结果，其适当地经二聚化并分别具有160kD及130kD的分子量，且通过单步蛋白G层析获得高于90％的纯度，以纯化两种融合蛋白。Lane 1：非还原；Lane 2：还原。
图3显示了提供改善抗血管新生活性的AT-Fc-VT及Tc350-253双功能融合蛋白的结构图。
图4显示了纯化的AT-Fc-VT双功能融合蛋白，其中AT-Fc-VT表现载体用以转染HEK293细胞。利用蛋白G层析由细胞培养上清液纯化经表现的可溶AT-Fc-VT融合蛋白。接着，在凝胶分析之前还原或非还原纯化的蛋白质(3μg/lane)。结果表明了融合蛋白经适当地二聚化并具有约250kD的分子量，且通过单步蛋白G层析可获得高于90％的纯度。Lane 1：非还原；Lane 2：还原。
图5显示了纯化的Tc350-253双功能融合蛋白。Tc350-253蛋白由HEK293细胞瞬时表现，并透过镍亲和力层析自转染的细胞培养上清液纯化。在还原或非还原的条件下对纯化的蛋白(5μg/lane)进行凝胶分析。Tc350-253双功能蛋白以约75kD的分子量经适当地表现，并获得高于90％的纯度。NR：非还原；R：还原。
图6显示了直接ELISA分析中AT-Fc蛋白对ANG1及ANG2的结合活性。首先，将配体预涂覆孔与各种浓度的纯化AT-Fc蛋白培养。接着，以HRP共轭山羊抗-人类IgG Fc特异性抗体检测结合蛋白并绘制OD450读数；结果表明了AT-Fc与ANG1及ANG2结合，EC50分别为4.26nM及2.01nM。
图7显示了Fc-VT蛋白对VEGF-A的结合活性。首先，将VEGF-A预涂覆孔与各种浓度的纯化Fc-VT蛋白培养。以HRP共轭山羊抗-人类IgG Fc特异性抗体检测洗涤后的结合蛋白并绘制OD450读数；结果表明了Fc-VT与VEGF-A结合，EC50为0.33nM。
图8及9分别显示了纯化的AT-Fc-VT融合蛋白对ANG2及VEGF-A的直接配体结合活性。首先，将配体预涂覆孔与各种浓度的纯化AT-Fc-VT蛋白培养。接着，以HRP共轭山羊抗-人类IgG Fc特异性抗体检测结合蛋白并绘制OD450读数。结果表明了AT-Fc-VT能与ANG2及VEGF-A结合，EC50分别为2.57nM及0.35nM，这与AT-Fc(0.28nM)或Fc-VT(0.46nM)的结合活性相当。
图10显示了融合蛋白对VEGF-依赖性HUVEC细胞生长分析的抑制功效。使用人类脐静脉内皮细胞，通过融合蛋白、Fc-VT及AT-Fc-VT与VEGF的结合来证明VEGF-依赖性细胞生长抑制。在实验中，将HUVEC维持在具有2％FBS的内皮细胞生长培养基(Lonza，Inc.)中。在37℃中，将96孔平底微量滴定盘的每一个孔涂覆胶原蛋白，接着与50μl 1nM的VEGF-A(R&Dsystems，Inc.)及各种浓度的融合蛋白(Fc-VT或AT-Fc-VT)培养1小时，然后将50μl(1x105cells/ml)在Medium-199(10％FBS，Hyclone，Inc.)中的HUVEC加入。于37℃、5％CO2中培养72小时后，通过加入10μl的MTS检测试剂(Promega Inc.)到每一个孔中来分析细胞增殖，接着测量在450/650nm处的OD吸收。结果表明了，Fc-VT及AT-Fc-VT两者对VEFG具有类似的抑制活性，其与Fc-VT相比(0.27nM对0.20nM)相当。在本研究中，还包括正控制组(VEGFR1 ECDD2及VEGFR2 ECD D3)，其在C端与IgG1 Fc片段融合，并显示IC50为0.19nM。
图11显示了可溶ANG2结合分析。纯化的融合蛋白(AT-Fc及AT-Fc-VT)用以检验本分析中的ANG2结合活性。在4℃中，将100μl的AT-Fc或AT-Fc-VT(1μg/ml)融合蛋白涂覆在96孔ELISA盘(Nunc)上整夜。经涂覆的孔以1％BSA的PBS在室温(RT)中阻隔1小时。将从100nM开始的三倍连续稀释的AT-Fc或AT-Fc-VT与等体积的500pM重组ANG2(PeproTech)在室温中培养2小时，接着转移至涂覆有蛋白的96孔。培养后，将样品转移至各孔并在室温中培养1小时。以洗涤缓冲液(Abcam)将盘洗涤三次，并与生物素化的抗-ANG2抗体(Abcam)在室温中培养1小时。洗涤后，将盘与链霉亲和素-HRP(Abcam)在室温中培养45分钟。最终洗涤后，加入四甲基联苯胺(TMB)，并利用读盘器测量在450nm处的吸收度。利用Prism(GraphPad)分析数据以计算抑制百分比。
图12显示了通过双功能融合蛋白抑制VEGF-诱导的内皮细胞迁移。
图13显示了通过双功能融合蛋白抑制VEGF-诱导的内皮细胞管形成。
图14显示了通过双功能蛋白Tc350-253抑制ANG2-诱导的内皮细胞管形成。
图15显示了通过双功能血管新生阻断剂抑制VEGF-诱导的内皮细胞侵入。
图16显示了通过双功能蛋白Tc350-253抑制VEGF/ANG2-诱导的内皮细胞管形成。
图17显示了通过双功能蛋白抑制小鼠中雷射诱导的脉络膜新生血管(CNV)。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文中使用的科学及技术术语具有与由所属技术领域中具有通常知识者通常理解的含义。
如本文所使用的，「抗体」乙词为由一或多种实质上由免疫球蛋白基因编码的多肽所组成的蛋白。典型的抗体为四聚物，其由两对相同的多肽链所构成，每一对具有一条「轻」链及一条「重」链。
本文中使用的「抗体可变区」乙词是指抗体可变链的N端区，其包含主要负责抗原识别的氨基酸残基。所属技术领域中具有通常知识者能容易地识别抗体可变区并决定赋予抗原识别所需的最小尺寸。抗体可变区可为单链抗体，例如单链Fv抗体(ScFv)，其中可变重链区及可变轻链区连接在一起(直接连接或通过肽连接子连接)以形成连续多肽。ScFv抗体可经化学合成或可从包括直接连接或通过肽编码连接子连接的VH-及VL-编码序列的核酸表现。
本发明提供了一种双功能融合蛋白，其抑制血管生成素(ANG)-TIE信号传递路径及血管内皮生长因子(VEGF)-血管内皮生长因子受体(VEGFR)信号传递路径。在本发明中，该融合蛋白含有ANG抑制结构域及VEGF抑制结构域，从而通过阻断ANG、VEGF或其受体之间的相互作用以在抑制血管新生方面提供显著改善的功效。
在本发明中，于血管新生过程中扮演重要角色的VEGF及ANG两者，用于构筑IgG Fc融合阻断剂。首先，产生分别具有ANG及VEGF结合活性的AT-Fc及Fc-VT蛋白，并因产生AT-Fc-VT双功能蛋白以提供双功能融合蛋白(具有ANG及VEGF结合活性)。这些AT-Fc及Fc-VT蛋白显示能以高亲和力与其各自的配体结合，且还分别在基于细胞的分析(cell-basedassay)中提供抗-ANG及抗-VEGF的功能。在本发明中，该Fc融合蛋白含有人类蛋白且全部为人类来源的结构域，并预期其为非免疫原性的，因此其具潜力进一步开发作为治疗血管新生相关疾病的治疗剂。
在本发明中，可使用任何具有阻断VEGF活性的模体、肽、蛋白或片段，例如抗-VEGF抗体、VEGF陷阱或VEGF受体(VEGFR)细胞外Ig结构域，诸如D1-D7，具体而言是VEGFR1细胞外Ig结构域2(ECD，D2)、VEGFR2细胞外Ig结构域3(ECD，D3)。
在本发明中，可使用任何与血管生成素(ANG)结合的模体、肽、蛋白或片段，例如与TIE2结合的ANG1及ANG2。TIE2 ECD含有三个EGF样模块，其侧翼有两个免疫球蛋白(Ig)样结构域及第三Ig样结构域，接着有三个第三型纤维黏连蛋白(FNIII)重复。ANG结合位点位于Ig样子结构域的N-末端对。
由于在各种各样的癌细胞类型中上调VEGF及ANG2，会阻断ANG-TIE相互作用(在有/无VEGF阻断剂的情况中)，因此本发明产生了针对ANG2及VEGF的双功能融合蛋白，以用于治疗癌症及老年性黄斑部退化(AMD)症。
在各种具体实施例中，血管新生相关疾病可为老年性黄斑部退化(AMD)症或原发癌及转移癌。
老年性黄斑部退化(AMD)症是一种疾病，其使得阅读、缝纫及驾驶等「直视(straight-ahead)」活动所需的敏锐中央视力模糊。一般来说，AMD会影响黄斑(眼睛的一部份)。
原发癌及转移性癌可能是乳癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰脏癌、肝癌、胆囊及胆管癌、小肠癌、泌尿道癌(包括肾、膀胱及泌尿道上皮)、女性生殖道癌(包括子宫颈癌、子宫癌及卵巢癌，以及绒毛膜癌及妊娠滋养细胞疾病)、男性生殖道癌(包括摄护腺癌、储精囊癌，睪丸癌及生殖细胞肿瘤)、内分泌腺癌(包括甲状腺癌、肾上腺癌、及脑下垂体腺癌)、及皮肤癌，以及血管瘤、黑色素瘤、肉瘤(包括由骨骼及软组织引起的那些及卡波西氏肉瘤)、脑、神经、眼及脑膜的肿瘤(包括星状细胞瘤、神经胶瘤、神经胶母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤、神经鞘瘤及脑膜瘤)、由造血恶性疾病引起的肿瘤、急性白血病、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B细胞淋巴瘤、勃氏(Burkitt's)淋巴瘤、慢性骨髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、发样细胞白血病、霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤、造血恶性疾病、卡波西氏肉瘤、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增生、恶性黑色素瘤、多发性骨髓瘤、肿瘤伴生症候群/恶性高血钙症或固态肿瘤。
在本发明的一具体实施例中，使用具有Tie2 ECD氨基酸23至448残基的片段(SEQID NO:1)在C端产生具有IgG1 Fc片段(SEQ ID NO:2)的AT-Fc蛋白，以改造AT-Fc蛋白。
在本发明的另一具体实施例中，含有VEGFR1 D2及VEGFR2 D3嵌合模体的片段(SEQID NO:3)在IgG1 Fc片段(SEQ ID NO:2)的C-末端融合，以构筑具有短柔性GS连接子(SEQID NO：4)在其之间的Fc-VT蛋白，该连接子确保正确的折迭并使空间位阻最小化。
在又一具体实施例中，通过融合改造AT-Fc-VT融合蛋白以获得在AT-Fc的C端含有VEGFR1 ECD D2及VEGFR2 ECD D3(SEQ ID NO:3)的结构域，也包括介于AT-FC及VT蛋白之间的GS连接子(SEQ ID NO:4)。
在一特定具体实施例中，该双功能蛋白Tc350-253经改造并表现为双硫键连接的Tc350-Tc253蛋白，其中通过以下构筑Tc350：在抗-Ang2-片段抗原结合(Fab)重链(HC)(SEQID NO:7)的C端融合Lucentis可变重链结构域(Vh)(SEQ ID NO:5)及可变κ结构域(Vk)(SEQID NO:6)，其之间有短弹性GS连接子(SEQ ID NO:4)，且Tc253经构筑以具有抗-Ang2-Fab轻链(LC)片段(SEQ ID NO:8)。
在进一步的具体实施例中，以一信号肽(SEQ ID NO:9)引导本发明描述的所有融合蛋白以用于表现蛋白的分泌。
AT-Fc、Fc-VT、AT-Fc-VT及Tc350的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13所示。
在本发明中，上述AT-Fc及/或Fc-VT蛋白由HEK29细胞瞬时表现，且透过蛋白G层析纯化自转染的细胞培养上清液。发现到在单步纯化过程中获得纯度高于90％的产物，且所有融合蛋白适当地形成及表现。
根据本发明，通过在ANG蛋白的C端融合VEGF结合模体，以产生同时靶向VEGF及ANGs的双功能融合蛋白AT-Fc-VT。如结果所示，根据本发明的AT-Fc-VT融合蛋白在抑制VEGF-依赖性HUVEC细胞增殖、细胞迁移、管形成及与ANG2蛋白结合方面提供了双功能功效，其分别与Fc-VT或AT-Fc蛋白相当。
根据本发明，该双功能蛋白Tc350-253对VEGF及/或ANG2诱导的血管新生相关表型提供了有利功效。具体而言，该双功能蛋白Tc350-253意外地改善了雷射诱导的脉络膜新生血管，已广泛用于老年性黄斑部退化(AMD)渗出型的研究。
选择术语定义如下，以便可更容易地理解本揭示。
如本文所用，「融合蛋白」乙词是指通过两种或多种结合蛋白或模体或编码不同基因的肽/氨基酸片段所产生的蛋白，其基因的转译产生了衍生自每种原始蛋白的多功能特性的单个或多个多肽。融合蛋白可包括与抗体共轭的蛋白、与不同抗体共轭的抗体或与Fab片段共轭的抗体。
AT或VT片段每一者为抗体，或者为体内半衰期长的抗体片段。
如本文所用，「连接子」乙词是指氨基酸残基或片段，或包含两个或多个通过肽键连接的氨基酸残基的多肽，其用于连接两个肽、多肽或蛋白。连接子可为Fc片段，其为野生型的免疫球蛋白Fc区或人类免疫球蛋白同型、亚型或其同种异型的变体。
「Fc区」乙词定义抗体的免疫球蛋白重链的C端区。Fc区可为天然序列Fc区或变体Fc区。
如本文所用，「医药组合物」乙词是指包含根据本发明融合蛋白的组合物或配方，其可通过将根据本发明融合蛋白与任选的医药可接受的载体(包括溶剂、分散介质、等渗剂及其类似物)混合来制备。载体可为液体、半固体或固体载体。在一些具体实施例中，载体可为水、盐溶液或其他缓冲液(诸如血清白蛋白及明胶)、碳水化合物(诸如单醣、双糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇或糊精)、凝胶、脂质、脂质体、树脂、多孔基质、黏合剂、填充剂、涂料、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂(包括抗坏血酸及甲硫胺酸)、螯合剂(诸如EDTA)、成盐抗衡离子(诸如钠)、非离子界面活性剂[诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)]或其组合。
在一些具体实施例中，医药组合物进一步包含一种额外的治疗剂，用以防止或治疗所述待治疗的疾病或病症。举例来说，额外药剂可为治疗剂、化学治疗剂；显像剂、细胞毒剂、血管新生抑制剂、激酶抑制剂、共刺激分子阻断剂(包括但不限于抗-B7.1、抗-B7.2、CTLA4-Ig、抗-CD20)、黏附分子阻断剂(包括但不限于抗-LFA-1抗体、抗-E/L选择蛋白抗体、小分子抑制剂)及抗-细胞激素抗体或其功能片段(包括但不限于抗-IL-18、抗TNF及抗IL-6/细胞激素受体抗体)。
通过以下实施例进一步说明本发明，不应将其理解为进一步的限制。
实施例
1.血管新生阻断剂的表现及纯化
TIE2 ECD氨基酸23至448残基用作ANG结合模体，且具有VEGFR1 D2和VEGFR2 D3的嵌合结构域用作VEGF结合陷阱。相应的DNA经合成并在C端与IgG1 Fc片段融合以用于ANG阻断剂(AT-Fc)(图1A)；或在N-末端与IgG1 Fc片段融合以用于VEGF阻断剂(Fc-VT)(图1B)，其之间有短弹性GS连接子。为了构筑双功能AT-Fc-VT表现载体，AT-Fc依序在C端与GS连接子及VEGF模体融合(图3)。在CMV启动子的控制下，将这些融合构筑体选殖至pCI-neo(Promega，Inc.)表现载体中介于EcoR I及Not I限制地址之间。载体含有新霉素抗性基因(Neomycin resistant gene)及胺芐青霉素抗性基因(Ampicillin resistant gene)，以用于哺乳动物细胞选择及大肠杆菌增殖。所有融合构筑体在N端含有信号肽，以用于分泌可溶融合蛋白。这些表现构筑体用以瞬时转染50ml的HEK293细胞(密度1x106 cell/ml)。转染96小时后收获培养基，并透过蛋白G层析来纯化融合蛋白。
如图2及图4中所示，每次转染得到了纯度高于90％的约3mg的融合蛋白。
为了构筑双功能蛋白Tc350-253表现载体(图3)，将抗-Ang2 Fab HC依序地与Lucentis Vh及Lucentis Vk融合，其两者通过GS连接子分开。Tc350-253蛋白在HEK293细胞瞬时表现，并透过镍亲和力层析自转染的细胞培养上清液中纯化。在还原或非还原的条件下对纯化的蛋白(5μg/lane)进行凝胶分析。Tc350-253双功能蛋白以约75kD的分子量适当地表现，并获得高于90％的纯度(图5)。
2.血管新生阻断剂的体外结合
以1x PBS将整夜配体预涂覆孔(100ng/well)洗涤3次，并以400ul在PBS的5％脱脂乳阻隔2小时。阻隔后，由30nM连续稀释3倍的100ul的纯化蛋白以一式两份加入每一个相应的孔，并在振荡器上于室温中培养1小时。结合后，以PBST(含有0.1％Tween-20的1x PBS)将孔洗涤3次，接着将100ul的1:2500稀释的山羊抗-人类IgG Fc HRP共轭物(JacksonImmunoResearch Inc.)加入每一个孔并在振荡器上再培养1小时。最终洗涤后，加入TMB试剂(Invitrogen,Inc.)，并测量在450nm处的OD吸收。使用Prism 4由S形曲线(sigmoidalcurve)拟合来分析数据。以类似分析来评估AT-Fc、Fc-VT及AT-Fc-VT与ANG或VEGF的结合。
如图6所示，计算出的AT-Fc对ANG1及ANG2的EC50分别为4.26nM及2.01nM。本文中收集的结果表明了可溶细胞外结构域(氨基酸残基23-448)在血管生成素结合方面具有功能活性，且可通过竞争血管生成素来调节膜结合形式的活性。
如图7所示，Fc-VT在VEGF-A结合评估中具有抗-VEGF功效。针对VEGF-A，计算的EC50为0.33nM。如收集的结果所示，C端定位的VEGFR1 D2及VEGFR2D3嵌合VEGF陷阱具有高亲和力的功能，且可中和VEGF的生物活性。
如图8及图9所示，评估了纯化的AT-Fc-VT双功能融合蛋白对ANG2及VEGF的结合活性，结果表明了AT-Fc-VT融合蛋白能与ANG2及VEGF-A结合，其EC50分别为2.57nM及0.35nM，且相较AT-Fc对ANG2及Fc-VT对VEGF，其提供显著改善的结合活性。
总言之，AT-Fc-VT融合蛋白经证实具有通过抑制配体结合及受体活化来调节ANG-TIE及VEGF-VEGFR传递路径的双功能。
3.通过血管新生阻断剂来抑制VEGF-依赖性HUVEC细胞增殖分析
Fc-VT及AT-Fc-VT用以抑制基于细胞的分析中的VEGF活性。人类脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞；Lonza，Inc.)用于证明VEGF-依赖性细胞增殖，其可为VEGF阻断剂所抑制。在实验中，将HUVEC细胞维持在具有2％FBS的内皮细胞生长培养基(Lonza，Inc.)中。在37℃中将50ml 1nM VEGF-A(R&D systems，Inc.)及各种浓度的Fc-VT或AT-Fc-VT加入胶原蛋白预涂覆孔的每一个孔并维持1小时，接着将50ml(1x 105cells/ml)在Medium-199(10％FBS，Hyclone，Inc.)中的HUVEC加入每一个孔中。于37℃、5％CO2中培养72小时后，通过加入10mlMTS检测试剂(Promega Inc.)到每一个孔中来分析细胞生长，接着测量在450/650nm处的OD吸收。
如图10所示，AT-Fc-VT对VEGF-依赖性HUVEC细胞增殖分析的50％抑制活性(IC50)为0.26nM，其类似于本实施例中Fc-VT(0.20nM)的抑制活性。
4.通过血管新生阻断剂来抑制内皮细胞管形成
AT-Fc及AT-Fc-VT用以决定管形成分析中的抗-ANG2活性。人类脐静脉内皮细胞用以证明Ang2-依赖性细胞管形成，其可通过AT-Fc或AT-Fc-VT与Ang2的结合来抑制。将HUVEC维持在具有2％FBS的内皮细胞生长培养基(Lonza，Inc.)中。在分析之前，将HUVEC细胞在不含血清的基础培养基中培养2小时，接着以胰蛋白酶消化并重新悬浮于1％的血清(105cells/ml)中。每一个基质胶预涂覆孔接种1.5x104个细胞及各种浓度的具有/不具有AT-Fc或AT-Fc-VT的200ng/ml Ang2。在37℃中培养18小时后，从每个孔取3个非重迭影像重复三次(9个影像/样品)来记录管形成。利用ImagePro软件(Media Cybernetics Inc.)来计算管长。
如图11所示，AT-Fc-VT对管形成的50％抑制活性(IC50)为2.45nM，小于本实施例中AT-Fc的抑制活性(3.68nM)。
5.双功能融合蛋白AT-Fc-VT显著地抑制VEGF-诱导的内皮细胞迁移
利用HUVEC在转孔平盘(transwell plate；8-μm孔径，Costar)上来评估双功能蛋白AT-Fc-VT对VEGF-诱导趋化性的抑制功效。将具有M199无血清培养基的HUVEC细胞(1x105)置于上孔。将配体人类VEGF(0.2μg/ml)与Eylea(2μg/ml)或AT-Fc-VT(2μg/ml)在10％FBS M199培养基中混合，并置于下孔。将转孔平盘在5％培养箱中培养24小时，以容许上孔的细胞转移至底部腔室。接着固定膜嵌入皿并以1％结晶紫染色。透过显微镜观察黏附到膜嵌入皿下表面的细胞，并利用ImageJ软件从一式三份嵌入皿上的五个代表性区域来计算平均迁移细胞数。
吾人检验了AT-Fc-VT蛋白对于内皮细胞对VEGF刺激的生理反应的影响。将HUVEC细胞加入上部腔室，并分别暴露于具有载体的VEGF、具有Eylea的VEGF、具有AT-Fc-VT的VEGF。24小时后，对迁移到膜的下部腔室细胞进行计数。VEGF显著地增加HUVEC细胞的迁移。然而，血管新生阻断剂AT-Fc-VT显著地抑制VEGF诱导的迁移(图12)。
6.双功能融合蛋白AT-Fc-VT抑制VEGF-诱导的HUVEC细胞管形成
为了研究双功能血管新生阻断剂AT-Fc-VT在血管新生的功能，在人类脐静脉内皮细胞中进行体外基质胶管形成分析。将HUVEC细胞在不含血清的基础培养基中培养2小时，接着以细胞分离试剂(accutase)进行胰蛋白酶消化。在37℃中，将4x103个HUVEC细胞接种4.5小时到含有包含AT-Fc-VT(100μg/ml)或Eylea(100μg/ml)的VEGF(1μg/ml)的基质胶预涂覆孔。通过Image J血管新生系统(5个影像/样品)对内皮网络形成定量。
在VEGF处理下，当HUVEC细胞培养在基质胶中4.5小时，其会展示原代血管网络。然而，双功能蛋白AT-Fc-VT显著地干扰管状结构的形成(图13)。
7.双功能蛋白Tc350-253抑制ANG2-诱导的HUVEC细胞管形成
将HUVEC细胞在不含血清的基础培养基中培养2小时。在37℃中，将4x103个HUVEC细胞接种到含有包含Tc350-253(50μg/ml)或Tc293-240(50μg/ml)的ANG2(0.5μg/ml)的基质胶预涂覆孔4.5小时。通过Image J血管新生系统(5个影像/样品)对内皮网络形成定量。
较高浓度的ANG2与人类湿性老年性黄斑部退化(AMD)及癌症进展(包括血管新生、转移及发炎)中的疾病严重程度相关。吾人生产一创新设计，以共同靶向VEGF及Ang2。为了解决双功能蛋白在血管新生的功能而进行体外基质胶管形成分析。结果表明了双功能蛋白Tc350-253或Tc293-240抑制ANG2-诱导的HUVEC细胞管在体外形成(图14)。
8.双功能蛋白AT-Fc-VT及Tc350-253抑制VEGF-诱导的HUVEC细胞侵入
根据制造商的说明，通过基质胶基底膜基质(Matrigel Basement MembraneMatrix；BD Biosciences，San Diego，CA，USA)预涂覆转孔嵌入皿来进行侵入分析。将具有Medium-199的HUVEC细胞(2x105)置于上孔。将配体人类VEGF(0.2μg/ml)分别与下部腔室的Eylea(2μg/ml)、AT-Fc-VT(2μg/ml)或Tc350-253(2μg/ml)混合。将转孔平盘在5％培养箱中培养24小时，以容许上孔的细胞转移至底部腔室。接着固定膜嵌入皿并以1％结晶紫染色。透过显微镜观察黏附到膜嵌入皿下表面的细胞，并利用ImageJ软件计算平均迁移细胞数。
利用博登细胞移形器(boyden chamber)侵入分析，AT-Fc-VT及Tc350-253的双功能蛋白用以决定抗-VEGF活性。与迁移研究结果类似，血管新生阻断剂AT-Fc-VT及Tc350-253抑制由VEGF诱导的侵入能力(图15)。
9.双功能蛋白Tc350-253抑制VEGF/ANG2-诱导的HUVEC细胞管形成
将HUVEC细胞在不含血清的基础培养基中培养2小时，接着以细胞分离试剂进行胰蛋白酶消化。在37℃中，将4x103个HUVEC细胞分别接种4.5小时到含有包含Eylea(50μg/ml)、Tc350-253(50μg/ml)或其他抗-Ang2抗体(50μg/ml)的VEGF(0.5μg/ml)/ANG2(0.5μg/ml)的基质胶预涂覆孔。通过Image J血管新生系统(5个影像/样品)对内皮网络形成定量。
为了研究双靶向蛋白Tc350-253在血管新生的功能，在人类脐静脉内皮细胞中进行体外基质胶管形成分析。双功能血管新生阻断剂Tc350-253显著地干扰管状结构的形成(图16)。在此分析中，双功能蛋白Tc350-253的生物活性较Eylea或抗-Ang2抗体(Nesvacumab及Tc252-253)佳。
10.双功能蛋白AT-Fc-VT及Tc350-253抑制雷射诱导的脉络膜新生血管(CNV)小鼠模型中的新生血管
雷射诱导CNV用于湿性AMD的动物模型，以评估血管新生阻断剂的活性。以盐酸氯胺酮麻醉小鼠(100mg/kg体重)以及以1％托平卡胺(tropicamide)扩张瞳孔后，在每一个视网膜以532nm二极管雷射光凝产生3处灼伤。在视网膜后极的9、12及3点钟位置产生灼伤。雷射时气泡产生(表明布鲁赫氏膜(Bruch’s membrane)破裂)是获得CNV的重要因素。
在雷射诱导的CNV模型中，第1天(n＝5/组)会在雄性C57BL/6小鼠的右眼玻璃体内注射载体对照组Eylea(40μg)、AT-Fc-VT(40μg)或Tc350-253(40μg)。在第0、7、14及21天，通过荧光素血管造影及光学同调断层摄影检验视网膜血管新生。对于荧光素血管造影，静脉注射10％的荧光素钠，且立即捕捉连续影像(每10秒一次，持续10分钟)。注射的荧光素钠在24小时后完全排出体外。利用Micron III视网膜成像显微镜(Phoenix ResearchLaboratories，San Ramon，CA，USA)捕捉影像，以决定CNV形成的程度。对于OCT分析，以公式V＝4/3πabc计算椭球体积，其中a(宽度)、b(深度)及c(长度)是椭球的水平面或垂直面的半径。
VEGF及ANG-2显示与病理性血管及血管通透性密切相关，其为眼部新生血管疾病的特点。吾人通过雷射诱导的脉络膜新生血管小鼠模型来测试双功能蛋白AT-Fc-VT或Tc350-253对血管新生的影响。利用基底荧光素血管造影(FFA)分析，其显示双功能蛋白AT-Fc-VT及Tc350-253在此模型中显著地抑制新生血管(图17)。通过光学同调断层摄影(OCT)对作为椭球的雷射-CNV损伤定量，也显示了在双功能蛋白AT-Fc-VT或Tc350-253处理后，损伤体积显著减小(图17)。
虽然已经以较佳具体实施例揭示本发明，然而其并不意欲限制本发明。在不脱离本发明精神及范围情况下，可允许任何所属技术领域中具有通常知识者对本发明进行修改与润饰。因此，本发明的保护范围应以后附申请专利范围所界定者为准。
序列表
<110> 三钰生物科技股份有限公司
<120> 抗血管新生融合蛋白及其用途
<130> TRB0003WO
<150> US 62/719,377
<151> 2018-08-17
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 426
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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<213> 智人
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Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ile Gly Gly Ile Val Gly Ala Ala Thr Leu Gly Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys
225
<210> 8
<211> 212
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Glu Leu Gly Glu Lys Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn
115 120 125
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val
130 135 140
Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu
145 150 155 160
Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser
180 185 190
Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro
195 200 205
Ala Glu Cys Ser
210
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 10
<211> 655
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu Pro Leu Val Ser Asp Ala
1 5 10 15
Glu Thr Ser Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly Trp Arg Pro His Glu Pro
20 25 30
Ile Thr Ile Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu Met Asn Gln His Gln Asp
35 40 45
Pro Leu Glu Val Thr Gln Asp Val Thr Arg Glu Trp Ala Lys Lys Val
50 55 60
Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile Asn Gly Ala Tyr Phe Cys
65 70 75 80
Glu Gly Arg Val Arg Gly Glu Ala Ile Arg Ile Arg Thr Met Lys Met
85 90 95
Arg Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr Leu Thr Met Thr Val Asp
100 105 110
Lys Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys Lys Val Leu Ile Lys Glu
115 120 125
Glu Asp Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser Phe Ile His Ser Val Pro
130 135 140
Arg His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val His Leu Pro His Ala Gln
145 150 155 160
Pro Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg Tyr Ile Gly Gly Asn Leu
165 170 175
Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val Arg Arg Cys Glu Ala Gln
180 185 190
Lys Trp Gly Pro Glu Cys Asn His Leu Cys Thr Ala Cys Met Asn Asn
195 200 205
Gly Val Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys Ile Cys Pro Pro Gly Phe
210 215 220
Met Gly Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu Leu His Thr Phe Gly Arg
225 230 235 240
Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Gln Glu Gly Cys Lys Ser Tyr Val
245 250 255
Phe Cys Leu Pro Asp Pro Tyr Gly Cys Ser Cys Ala Thr Gly Trp Lys
260 265 270
Gly Leu Gln Cys Asn Glu Ala Cys His Pro Gly Phe Tyr Gly Pro Asp
275 280 285
Cys Lys Leu Arg Cys Ser Cys Asn Asn Gly Glu Met Cys Asp Arg Phe
290 295 300
Gln Gly Cys Leu Cys Ser Pro Gly Trp Gln Gly Leu Gln Cys Glu Arg
305 310 315 320
Glu Gly Ile Gln Arg Met Thr Pro Lys Ile Val Asp Leu Pro Asp His
325 330 335
Ile Glu Val Asn Ser Gly Lys Phe Asn Pro Ile Cys Lys Ala Ser Gly
340 345 350
Trp Pro Leu Pro Thr Asn Glu Glu Met Thr Leu Val Lys Pro Asp Gly
355 360 365
Thr Val Leu His Pro Lys Asp Phe Asn His Thr Asp His Phe Ser Val
370 375 380
Ala Ile Phe Thr Ile His Arg Ile Leu Pro Pro Asp Ser Gly Val Trp
385 390 395 400
Val Cys Ser Val Asn Thr Val Ala Gly Met Val Glu Lys Pro Phe Asn
405 410 415
Ile Ser Val Lys Val Leu Pro Lys Pro Leu Ala Ser Asp Lys Thr His
420 425 430
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
435 440 445
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
450 455 460
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
465 470 475 480
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
485 490 495
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
500 505 510
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
515 520 525
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
530 535 540
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
545 550 555 560
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
565 570 575
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
580 585 590
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
595 600 605
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
610 615 620
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
625 630 635 640
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
645 650 655
<210> 11
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
100 105 110
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu
245 250 255
Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro
260 265 270
Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro
275 280 285
Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg
290 295 300
Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu
305 310 315 320
Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu
325 330 335
Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser
340 345 350
His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr
355 360 365
Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro
370 375 380
Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr
385 390 395 400
Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp
405 410 415
Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser
420 425 430
Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
435 440 445
<210> 12
<211> 874
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu Pro Leu Val Ser Asp Ala
1 5 10 15
Glu Thr Ser Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly Trp Arg Pro His Glu Pro
20 25 30
Ile Thr Ile Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu Met Asn Gln His Gln Asp
35 40 45
Pro Leu Glu Val Thr Gln Asp Val Thr Arg Glu Trp Ala Lys Lys Val
50 55 60
Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile Asn Gly Ala Tyr Phe Cys
65 70 75 80
Glu Gly Arg Val Arg Gly Glu Ala Ile Arg Ile Arg Thr Met Lys Met
85 90 95
Arg Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr Leu Thr Met Thr Val Asp
100 105 110
Lys Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys Lys Val Leu Ile Lys Glu
115 120 125
Glu Asp Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser Phe Ile His Ser Val Pro
130 135 140
Arg His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val His Leu Pro His Ala Gln
145 150 155 160
Pro Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg Tyr Ile Gly Gly Asn Leu
165 170 175
Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val Arg Arg Cys Glu Ala Gln
180 185 190
Lys Trp Gly Pro Glu Cys Asn His Leu Cys Thr Ala Cys Met Asn Asn
195 200 205
Gly Val Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys Ile Cys Pro Pro Gly Phe
210 215 220
Met Gly Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu Leu His Thr Phe Gly Arg
225 230 235 240
Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Gln Glu Gly Cys Lys Ser Tyr Val
245 250 255
Phe Cys Leu Pro Asp Pro Tyr Gly Cys Ser Cys Ala Thr Gly Trp Lys
260 265 270
Gly Leu Gln Cys Asn Glu Ala Cys His Pro Gly Phe Tyr Gly Pro Asp
275 280 285
Cys Lys Leu Arg Cys Ser Cys Asn Asn Gly Glu Met Cys Asp Arg Phe
290 295 300
Gln Gly Cys Leu Cys Ser Pro Gly Trp Gln Gly Leu Gln Cys Glu Arg
305 310 315 320
Glu Gly Ile Gln Arg Met Thr Pro Lys Ile Val Asp Leu Pro Asp His
325 330 335
Ile Glu Val Asn Ser Gly Lys Phe Asn Pro Ile Cys Lys Ala Ser Gly
340 345 350
Trp Pro Leu Pro Thr Asn Glu Glu Met Thr Leu Val Lys Pro Asp Gly
355 360 365
Thr Val Leu His Pro Lys Asp Phe Asn His Thr Asp His Phe Ser Val
370 375 380
Ala Ile Phe Thr Ile His Arg Ile Leu Pro Pro Asp Ser Gly Val Trp
385 390 395 400
Val Cys Ser Val Asn Thr Val Ala Gly Met Val Glu Lys Pro Phe Asn
405 410 415
Ile Ser Val Lys Val Leu Pro Lys Pro Leu Ala Ser Asp Lys Thr His
420 425 430
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
435 440 445
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
450 455 460
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
465 470 475 480
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
485 490 495
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
500 505 510
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
515 520 525
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
530 535 540
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
545 550 555 560
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
565 570 575
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
580 585 590
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
595 600 605
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
610 615 620
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
625 630 635 640
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
645 650 655
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Thr
660 665 670
Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His
675 680 685
Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro
690 695 700
Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro
705 710 715 720
Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser
725 730 735
Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val
740 745 750
Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn
755 760 765
Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser
770 775 780
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785 790 795 800
Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His
805 810 815
Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met
820 825 830
Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp
835 840 845
Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys
850 855 860
Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
865 870
<210> 13
<211> 496
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ile Gly Gly Ile Val Gly Ala Ala Thr Leu Gly Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
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Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
245 250 255
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
260 265 270
Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
275 280 285
Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr
290 295 300
Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser
305 310 315 320
Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
325 330 335
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His
340 345 350
Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
370 375 380
Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
385 390 395 400
Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu
405 410 415
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr
420 425 430
Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
435 440 445
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
450 455 460
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr
465 470 475 480
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys His His His His His His
485 490 495

Claims (26)

1.一种双功能融合蛋白，其抑制血管生成素(ANG)-TIE信号传递路径及血管内皮生长因子(VEGF)-血管内皮生长因子受体(VEGFR)信号传递路径，其中该融合蛋白含有ANG抑制结构域及VEGF抑制结构域，从而通过阻断ANG、VEGF或其受体之间的相互作用以在抑制血管新生方面提供显著改善的功效。
2.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其包含与连接子融合的(1)一或多个含有ANG结合模体的片段，及(2)一或多个含有VEGF结合模体的片段。
3.根据权利要求2所述的双功能融合蛋白，其中该含有ANG结合模体的片段系片段抗原结合(Fab)片段，且该含有VEGF结合模体的片段系单链抗体(ScFv)。
4.根据权利要求3所述的双功能融合蛋白，其中该Fab片段系抗-Ang2 Fab，且该ScFv系由Lucentis Vh及Vk所组成的融合片段。
5.根据权利要求4所述的双功能融合蛋白，其具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其系同时靶向血管内皮生长因子(VEGF)及血管生成素(ANGs)的(AT)a-Fc-(VT)b，提供了显著改善的抗血管新生功效，其中AT系一ANG结合模体，VT系一VEGF结合模体；Fc系一连接子；a及b的每一者系1至10的整数。
7.根据权利要求6所述的双功能融合蛋白，其中该ANG结合模体系由Tie2ECD氨基酸23-448残基所组成的片段。
8.根据权利要求7所述的双功能融合蛋白，其中该ANG Tie2 ECD氨基酸23-448残基具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求6所述的双功能融合蛋白，其中该VEGF结合模体系VEGFR1ECD D2、VEGFR2 ECD D3或含有VEGFR1 ECD D2及VEGFR2 ECD D3的嵌合结构域。
10.根据权利要求9所述的双功能融合蛋白，其中该VEGF结合模体系含有VEGFR1 ECDD2及VEGFR2 ECD D3的嵌合结构域。
11.根据权利要求10所述的双功能融合蛋白，其中该含有VEGFR1 ECD D2及VEGFR2 ECDD3的嵌合结构域具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求6所述的双功能融合蛋白，其中该连接子系一IgG1 Fc片段、一短弹性GS连接子或其组合。
13.根据权利要求12所述的双功能融合蛋白，其中该IgG1 Fc片段具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求12所述的双功能融合蛋白，其中该短弹性GS连接子具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求6所述的双功能融合蛋白，其中AT系一含有Tie2 ECD氨基酸23-448残基的AT片段，Fc系一IgG Fc片段，且VT系一含有含VEGFR1 D2及VEGFR2 D3的嵌合结构域的VT片段。
16.根据权利要求15所述的双功能融合蛋白，其中该AT片段与该IgG Fc片段融合，接着在该AT-Fc片段的C端以一短弹性GS连接子与该VT连接。
17.根据权利要求6所述的双功能融合蛋白，其中该连接子系一Fc片段，其系野生型的免疫球蛋白Fc区或人类免疫球蛋白同型、亚型或其同种异型的变体。
18.根据权利要求6所述的双功能融合蛋白，其中该AT或VT片段的每一者系抗体，或者系体内半衰期长的抗体片段。
19.根据权利要求6所述的双功能融合蛋白，其系具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的AT-Fc-VT。
20.一种能够与血管生成素结合的融合蛋白，其含有与IgG1 Fc片段融合的Tie2 ECD氨基酸23-448残基。
21.根据权利要求20所述的融合蛋白，其具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
22.一种针对VEGF的融合蛋白，其包含在其C端与一IgG1 Fc片段融合的一含有VEGFR1D2及VEGFR2 D3的嵌合模体。
23.根据权利要求22所述针对VEGF的融合蛋白，其具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
24.一种医药组合物，其包含权利要求1所述的双功能融合蛋白及医药可上接受的载体。
25.根据权利要求24所述的医药组合物，其系用于防止或治疗老年性黄斑部退化(AMD)症。
26.根据权利要求24所述的医药组合物，其系用于治疗原发癌或转移癌。
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