KR20230084163A - 항체-약물 접합체와 parp1 선택적 억제제의 조합 - Google Patents

항체-약물 접합체와 parp1 선택적 억제제의 조합 Download PDF

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2세 제롬 토마스 메테탈
아자데 체라그치 바쉬 아스타네
엘리사베타 레오
얀 발레
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아스트라제네카 유케이 리미티드
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
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Abstract

PARP1 선택적 억제제와 조합된 항-HER2 항체-약물 접합체의 투여를 위한 제약 제품이 제공된다. 상기 항-HER2 항체-약물 접합체는 하기 화학식 (여기서, A는 항체에 대한 연결 위치를 나타냄)으로 표시되는 약물-링커가 티오에테르 결합을 통해 항-HER2 항체에 접합된 항체-약물 접합체이다. 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제가 대상체에 조합 투여되는 치료적 용도 및 방법이 또한 제공된다:
[화학식 I]
Figure pct00102
.

Description

항체-약물 접합체와 PARP1 선택적 억제제의 조합
본 발명은 항종양 약물이 링커 구조체를 통해 항-HER2 항체에 접합된 특이적 항체-약물 접합체를 PARP1 선택적 억제제와 조합하여 투여하기 위한 제약 제품, 및 특이적 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 대상체에 조합 투여하는 치료적 용도 및 방법에 관한 것이다.
폴리(ADP-리보스) 폴리머라아제(PARP) 패밀리의 효소는 복제, 재조합, 염색질 리모델링 및 DNA 손상 복구와 같은 다수의 세포 과정에서 중요한 역할을 한다(문헌[O’Connor MJ, Mol Cell (2015) 60(4):547-60]). PARP 억제제 및 그의 작용 메커니즘의 예는 예를 들어 WO2004/080976에 교시되어 있다.
PARP1 및 PARP2는 DNA 손상 복구에서의 역할에 대해 가장 광범위하게 연구된 PARP이다. PARP1은 DNA 손상 파괴에 의해 활성화되고 표적 단백질에 대한 폴리(ADP-리보스)(PAR) 사슬의 부가를 촉매하는 기능을 한다. PAR화(PARylation)로 알려진 이 번역 후 변형은 DNA 병변으로의 추가 DNA 복구 인자의 모집을 매개한다. 이러한 모집 역할의 완료 후 PARP 자가-PAR화는 DNA로부터의 결합 PARP의 방출을 촉발하여 다른 DNA 복구 단백질에 대한 접근을 허용하여 복구를 완료한다. 따라서 손상된 부위에 대한 PARP의 결합, 그의 촉매 활성, 및 DNA로부터의 그의 최종 방출은 모두 암세포가 화학요법제 및 방사선 요법에 의해 야기되는 DNA 손상에 반응하는 중요한 단계이다(문헌[Bai P. Biology of poly(ADP-ribose) polymerases: the factotums of cell maintenance. Mol Cell 2015;58:947-58]).
PARP 패밀리 효소의 억제는 상보적인 DNA 복구 경로를 불활성화하여 암세포를 선택적으로 사멸시키는 전략으로 활용되었다. 다수의 전임상 및 임상 연구에서 상동 재조합(HR)에 의한 이중 가닥 DNA 파괴(DSB) 복구에 관여하는 주요 종양 억제 단백질인 BRCA1 또는 BRCA2의 유해한 변경을 포함하는 종양 세포가 PARP 패밀리의 DNA 복구 효소의 소분자 억제제에 선택적으로 민감하다는 것이 입증되었다. 이러한 종양은 결함성 상동 재조합 복구(homologous recombination repair; HRR) 경로를 가지며, 생존을 위해 PARP 효소 기능에 의존한다. PARP 억제제 요법은 주로 BRCA-돌연변이 암을 표적으로 했지만 PARP 억제제는 상동 재조합 결함(homologous recombination deficiency; HRD)을 나타내는 비-BRCA 돌연변이 종양에서 임상적으로 테스트되었다(문헌[(Turner N, Tutt A, Ashworth A. Hallmarks of 'BRCAness' in sporadic cancers. Nat Rev Cancer 2004;4: 814-9]).
PARP1에 대한 개선된 선택성을 갖는 PARP 억제제는 비-선택적 PARP 억제제와 비교하여 개선된 효능 및 감소된 독성을 가질 수 있는 것으로 여겨진다. 또한 PARP1을 선택적으로 강력하게 억제하면 DNA 상에 PARP1이 포획되어, S-기의 복제 분기점의 붕괴를 통한 DNA 이중 가닥 파괴(DSB)로 이어진다고 여겨진다. 또한 PARP1-DNA 포획은 HRD를 갖는 종양 세포를 선택적으로 사멸시키는 효과적인 메커니즘인 것으로 여겨진다.
항체에 접합된 세포독성 약물로 구성된 항체-약물 접합체(ADC)는 암 세포에 선택적으로 약물을 전달할 수 있으며, 따라서 암 세포 내의 약물을 축적하여 암 세포를 사멸시킬 것으로 기대된다(문헌[Ducry, L., et al., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13; Alley, S. C., et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537]; 문헌[Damle N. K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452]; 문헌[Senter P. D., et al., Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637]; 문헌[Burris HA., et al., J. Clin. Oncol. (2011) 29(4): 398-405]).
한 가지 이러한 항체-약물 접합체는 HER2-표적 항체와 엑사테칸의 유도체로 구성된 트라스투주맙 데룩스테칸이다(문헌[Ogitani Y. et al., Clinical Cancer Research (2016) 22(20), 5097-5108]; 문헌[Ogitani Y. et al., Cancer Science (2016) 107, 1039-1046]).
트라스투주맙 데룩스테칸(Enhertu®, DS-8201)은 유방암, 위암, 결장직장암 및 비소세포 폐암을 포함하는 HER2-발현 고형 종양에서 유의미한 임상적 효능을 나타내었다. 유의미하게, DS-8201은 상기 적응증에서 HER2 저 종양에서 유망한 활성을 입증하였다. 효능 향상, 치료 반응 지속성 증가, 환자의 내약성 개선 및/또는 용량-의존적 독성 감소를 위해 DS-8201의 조합 파트너를 확인할 필요가 있다.
트라스투주맙 데룩스테칸과 같은 항체-약물 접합체와 PARP1 억제제의 치료 가능성에도 불구하고, 항체-약물 접합체와 PARP1 선택적 억제제의 조합 사용의 우수한 효과를 입증하는 테스트 결과를 기술한 문헌은 공개되지 않았다.
따라서, 기존 암 치료제의 효능을 향상시키고/시키거나, 치료 반응의 지속성을 증가시키고/시키거나, 환자의 내약성을 개선하고/하거나 용량-의존적 독성을 감소시킬 수 있는 개선된 치료 조성물 및 방법에 대한 요구가 남아 있다.
본 발명에 사용되는 항체-약물 접합체 (국소이성질화효소 I 억제제 엑사테칸의 유도체를 성분으로서 포함하는 항-HER2 항체-약물 접합체)는 단독으로 투여될 때 유방암 및 위암과 같은 특정 암의 치료에서 탁월한 항종양 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, PARP1 억제제는 특정 암의 치료에서 항종양 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 그러나, 암 치료에 있어서 효능 향상, 치료 반응의 지속성 증가 및/또는 용량 의존적 독성 감소와 같은 우수한 항종양 효과를 얻을 수 있는 약제 및 치료법을 제공하는 것이 요구된다.
본 발명은 PARP1 선택적 억제제와 조합된 항-HER2 항체-약물 접합체의 투여를 통해, 암 치료에서 탁월한 항종양 효과를 나타낼 수 있는 제약 제품을 제공한다. 본 발명은 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제가 대상체에 조합 투여되는 치료적 용도 및 방법을 또한 제공한다:
구체적으로, 본 발명 은 하기 [1] 내지 [54]에 관한 것이다:
[1] 조합 투여를 위한 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 포함하는 제약 제품으로서, 항-HER2 항체-약물 접합체는 하기 화학식:
Figure pct00001
(여기서, A는 항체에 대한 연결 위치를 나타냄)으로 표시되는 약물-링커가 티오에테르 결합을 통해 항-HER2 항체에 접합된 항체-약물 접합체인, 제약 제품;
[2] [1]에 있어서, PARP1 선택적 억제제는 하기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염인, 제약 제품:
[화학식 I]
Figure pct00002
(상기 식에서,
X1 및 X2는 N 및 C(H)로부터 각각 독립적으로 선택되며,
X3은 N 및 C(R4)로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, R4는 H 또는 플루오로이며,
R1은 C1-4 알킬 또는 C1-4 플루오로알킬이며,
R2는 H, 할로, C1-4 알킬, 및 C1-4 플루오로알킬로부터 독립적으로 선택되며;
R3은 H 또는 C1-4 알킬이되,
단,
X1이 N이면, X2는 C(H)이고, X3은 C(R4)이며,
X2가 N이면, X1은 C(H)이고, X3은 C(R4)이며,
X3이 N이면, X1 및 X2 둘 다가 C(H)임);
[3] [2]에 있어서, 화학식 I에서, R3은 C1-4 알킬인, 제약 제품;
[4] [3]에 있어서, 화학식 I에서, R3은 메틸인, 제약 제품;
[5] [2] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 화학식 I에서, R1은 에틸인, 제약 제품;
[6] [1]에 있어서, PARP1 선택적 억제제는 하기 화학식 Ia로 표시되는 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염인, 제약 제품:
[화학식 Ia]
Figure pct00003
(상기 식에서,
R1은 C1-4 알킬이며,
R2는 H, 할로, C1-4 알킬, 및 C1-4 플루오로알킬로부터 선택되며,
R3은 H 또는 C1-4 알킬이며,
R4는 H임);
[7] [6]에 있어서, 화학식 Ia에서, R2는 H 또는 할로인, 제약 제품.
[8] [6]에 있어서, 화학식 Ia에서, R1은 에틸이며, R2는 H, 클로로 및 플루오로로부터 선택되며, R3은 메틸인, 제약 제품.
[9] [1]에 있어서, PARP1 선택적 억제제는 하기 화학식으로 표시되는, AZ14170049로도 알려진, AZD5305 또는 이의 제약상 허용가능한 염인, 제약 제품:
Figure pct00004
[10] [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 항-HER2 항체는 서열 번호 3 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 26 내지 33]으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH1, 서열 번호 4 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 51 내지 58]로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH2 및 서열 번호 5 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 97 내지 109]로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH3을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 6 [= 서열 번호 2의 아미노산 잔기 27 내지 32]으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRL1, 서열 번호 7 [= 서열 번호 2의 아미노산 잔기 50 내지 52]의 아미노산 잔기 1 내지 3으로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 CDRL2 및 서열 번호 8 [= 서열 번호 2의 아미노산 잔기 89 내지 97]로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRL3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체인, 제약 제품;
[11] [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 항-HER2 항체는 서열 번호 9 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 1 내지 120]로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 10 [= 서열 번호 2의 아미노산 잔기 1 내지 107]으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체인, 제약 제품;
[12] [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 항-HER2 항체는 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체인, 제약 제품;
[13] [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 항-HER2 항체는 서열 번호 11 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 1 내지 449]로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체인, 제약 제품;
[14] [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 항-HER2 항체-약물 접합체는 하기 화학식으로 표시되는, 제약 제품:
Figure pct00005
(여기서, '항체'는 티오에테르 결합을 통해 약물-링커에 접합된 항-HER2 항체를 나타내며, n은 항체-약물 접합체에서 항체 분자당 접합된 약물-링커의 평균 단위 수를 나타내고, n은 7 내지 8의 범위임);
[15] [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 있어서, 항-HER2 항체-약물 접합체는 트라스투주맙 데룩스테칸 (DS-8201)인, 제약 제품;
[16] [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 있어서, 제품은 동시 투여를 위한, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 포함하는 조성물인, 제약 제품;
[17] [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 있어서, 제품은 순차 또는 동시 투여를 위한, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 포함하는 조합 제제인, 제약 제품;
[18] [1] 내지 [17] 중 어느 하나에 있어서, 제품은 암 치료용인, 제약 제품;
[19] [18]에 있어서, 암은 유방암, 위암, 결장직장암, 폐암, 식도암, 두경부암, 식도위 접합부 선암종, 담도암, 파제트병, 췌장암, 난소암, 자궁 암육종, 요로상피암, 전립선암, 방광암, 위장관 기질 종양, 소화관 기질 종양, 자궁경부암, 편평세포 암종, 복막암, 간암, 간세포암, 자궁체 암종, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 음경암, 백혈병, 악성 림프종, 형질세포종, 골수종, 교모세포종 다형체, 골육종, 육종, 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 제약 제품;
[20] [19]에 있어서, 암은 유방암인, 제약 제품;
[21] [20]에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 3+인, 제약 제품;
[22] [20]에 있어서, 유방암은 HER2 저발현 유방암인, 제약 제품;
[23] [20]에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 2+인, 제약 제품;
[24] [20]에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 1+인, 제약 제품;
[25] [20]에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC >0 및 <1+인, 제약 제품;
[26] [20]에 있어서, 유방암은 삼중 음성 유방암인, 제약 제품;
[27] [18]에 있어서, 암은 위암인, 제약 제품;
[28] [18]에 있어서, 암은 결장직장암인, 제약 제품;
[29] [18]에 있어서, 암은 폐암인, 제약 제품;
[30] [29]에 있어서, 폐암은 비소세포 폐암인, 제약 제품;
[31] [18]에 있어서, 암은 췌장암인, 제약 제품;
[32] [18]에 있어서, 암은 난소암인, 제약 제품;
[33] [18]에 있어서, 암은 전립선암인, 제약 제품;
[34] [18]에 있어서, 암은 신장암인, 제약 제품;
[35] 암 치료에 사용하기 위한, [1] 내지 [17] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 제약 제품;
[36] [25]에 있어서, 암은 [19] 내지 [34] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 것인, 사용하기 위한 제약 제품;
[37] 암을 치료하기 위한, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제의 조합 투여를 위한 의약의 제조에 있어서 항-HER2 항체-약물 접합체 또는 PARP1 선택적 억제제의 용도로서, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제는 [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 것인, 용도;
[38] [37]에 있어서, 암은 [19] 내지 [34] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 것인, 용도;
[39] [37] 또는 [38]에 있어서, 의약은 동시 투여를 위한, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 포함하는 조성물인, 용도;
[40] [37] 또는 [38]에 있어서, 의약은 순차 또는 동시 투여를 위한, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 포함하는 조합 제제인, 용도;
[41] PARP1 선택적 억제제와 조합하여, 암 치료에 사용하기 위한 항-HER2 항체-약물 접합체로서, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제는 [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 것인, 사용하기 위한 항-HER2 항체-약물 접합체;
[42] [41]에 있어서, 암은 [19] 내지 [34] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 것인, 사용하기 위한 항-HER2 항체-약물 접합체;
[43] [41] 또는 [42]에 있어서, 사용은 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제의 순차 투여를 포함하는, 사용하기 위한 항-HER2 항체-약물 접합체;
[44] [41] 또는 [42]에 있어서, 사용은 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제의 동시 투여를 포함하는, 사용하기 위한 항-HER2 항체-약물 접합체;
[45] 대상체에서 암의 치료에 사용하기 위한 항-HER2 항체-약물 접합체로서, 상기 치료는 i) 상기 항-HER2 항체-약물 접합체, 및 ii) PARP1 선택적 억제제를 상기 대상체에 개별, 순차 또는 동시 투여하는 것을 포함하고, 상기 항-HER2 항체-약물 접합체 및 상기 PARP1 선택적 억제제는 [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 것인, 사용하기 위한 항-HER2 항체-약물 접합체;
[46] 항-HER2 항체-약물 접합체와 조합하여 암 치료에 사용하기 위한 PARP1 선택적 억제제로서, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제는 [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 것인, 사용하기 위한 PARP1 선택적 억제제;
[47] [46]에 있어서, 암은 [19] 내지 [34] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 것인, 사용하기 위한 PARP1 선택적 억제제;
[48] [46] 또는 [47]에 있어서, 사용은 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제의 순차 투여를 포함하는, 사용하기 위한 PARP1 선택적 억제제;
[49] [46] 또는 [47]에 있어서, 사용은 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제의 동시 투여를 포함하는, 사용하기 위한 PARP1 선택적 억제제;
[50] 대상체에서 암의 치료에 사용하기 위한 PARP1 선택적 억제제로서, 상기 치료는 i) 상기 PARP1 선택적 억제제, 및 ii) 항-HER2 항체-약물 접합체를 상기 대상체에 개별, 순차 또는 동시 투여하는 것을 포함하고, 상기 PARP1 선택적 억제제 및 상기 항-HER2 항체-약물 접합체는 [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 것인, 사용하기 위한 PARP1 선택적 억제제;
[51] [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에 조합 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법;
[52] [51]에 있어서, 암은 [19] 내지 [34] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 것인, 방법;
[53] [51] 또는 [52]에 있어서, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 순차 투여하는 단계를 포함하는, 방법; 및
[54] [51] 또는 [52]에 있어서, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 동시 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
[발명의 유리한 효과]
본 발명은 항종양 약물이 링커 구조체를 통해 항-HER2 항체에 접합된 항-HER2 항체-약물 접합체, 및 PARP1 선택적 억제제를 조합 투여하는 제약 제품, 및 특이적 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 대상체에 조합 투여하는 치료적 용도 및 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 암 치료에서 우수한 항종양 효과를 얻을 수 있는 약제 및 치료법을 제공할 수 있다.
[도 1] 도 1은 항-HER2 항체의 중쇄의 아미노산 서열을 나타내는 도이다 (서열 번호 1).
[도 2] 도 2는 항-HER2 항체의 경쇄의 아미노산 서열을 나타내는 도이다 (서열 번호 2).
[도 3] 도 3은 중쇄 CDRH1의 아미노산 서열을 나타내는 도이다 (서열 번호 3 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 26 내지 33]).
[도 4] 도 4는 중쇄 CDRH2의 아미노산 서열을 나타내는 도이다 (서열 번호 4 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 51 내지 58]).
[도 5] 도 5는 중쇄 CDRH3의 아미노산 서열을 나타내는 도이다 (서열 번호 5 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 97 내지 109]).
[도 6] 도 6은 경쇄 CDRL1의 아미노산 서열을 나타내는 도이다 (서열 번호 6 [= 서열 번호 2의 아미노산 잔기 27 내지 32]).
[도 7] 도 7은 경쇄 CDRL2 (SAS)의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 나타내는 도이다 (서열 번호 7 [= 서열 번호 2의 아미노산 잔기 50 내지 56]).
[도 8] 도 8은 경쇄 CDRL3의 아미노산 서열을 나타내는 도이다 (서열 번호 8 [= 서열 번호 2의 아미노산 잔기 89 내지 97]).
[도 9] 도 9는 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타내는 도이다 (서열 번호 9 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 1 내지 120]).
[도 10] 도 10은 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타내는 도이다 (서열 번호 10 [= 서열 번호 2의 아미노산 잔기 1 내지 107]).
[도 11] 도 11은 중쇄의 아미노산 서열을 나타내는 도이다 (서열 번호 11 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 1 내지 449]).
[도 12a 및 12b] 도 12a 및 12b는 고 HER2 발현을 갖는 세포주에서 DS-8201을 AZD5305 (AZ14170049; PARP1 선택적 억제제)와 조합하는 고처리량 스크린으로 얻어지는 조합 매트릭스를 나타내는 도이다.
[도 13a 및 13b] 도 13a 및 13b는 저 HER2 발현을 갖는 세포주에서 DS-8201을 AZD5305와 조합하는 고처리량 스크린으로 얻어지는 조합 매트릭스를 나타내는 도이다.
[도 14] 도 14는 AZD5305와 조합된 DS-8201로 치료된 세포주에서 조합 Emax 및 Loewe 시너지 점수를 나타내는 도이다.
[도 15a 및 15b] 도 15a 및 15b는 저 또는 고 HER2 발현을 갖는 세포주에서 DS-8201을 AZD5305와 조합하기 위한 조합 매트릭스를 나타내는 도이다.
[도 16a 및 16b] 도 16a 및 16b는 각각 합성예 4 형태 A의 X-선 회절 패턴 및 대표적인 DSC 트레이스를 나타낸다.
[도 17] 도 17은 DS-8201 또는 AZD5305를 단독으로 사용하거나, AZD5305와 조합된 DS-8201을 사용한 생체 내 치료에 대한 종양 부피를 나타내는 그래프이다. 점선은 AZD5305 투약 기간의 종료를 나타낸다.
[도 18a, 18b 및 18c] 도 18a, 18b 및 18c는 저 또는 고 HER2 발현을 갖는 NSCLC 세포주에서 DS-8201을 AZD5305와 조합하는 고처리량 스크린으로 얻어지는 조합 매트릭스를 나타내는 도이다.
[도 19a, 19b 및 19c] 도 19a, 19b 및 19c는 HER2-돌연변이 발현을 갖는 요로암 세포주에서 DS-8201을 AZD5305와 조합하는 고처리량 스크린으로 얻어지는 조합 매트릭스를 나타내는 도이다.
본 발명이 더욱 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위하여, 먼저 특정 용어를 정의한다. 추가적인 정의는 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 전반에 걸쳐 제시된다.
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명은 특정 조성물 또는 방법 단계로 제한되지 않으며, 변화될 수 있음을 이해한다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용되는 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 용어 "하나"(또는 "한")뿐 만 아니라 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.
또한, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 2개의 특정된 특징 또는 성분 각각이 나머지 하나와 함께 또는 나머지 하나 없이 구체적으로 개시된 것으로서 해석되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 이용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하려는 것이다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 이용되는 용어 "및/또는"은 각각의 다음 양태: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독)를 포괄하려는 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명과 관련된 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 개시내용에 사용되는 여러 용어의 일반 사전을 당업자에게 제공한다.
단위, 접두어, 및 기호는 이의 국제 단위 체계(SI) 허용 형태로 표시된다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수치의 경계를 포함한다.
본원에 "포함하는"이라는 어구와 함께 양태가 기술되어 있는 경우에, "~으로 이루어진" 및/또는 "~으로 본질적으로 이루어진"에 관해 기술된 다른 유사한 양태도 제공된다는 것이 이해된다.
용어 "억제한다", "차단한다" 및 "저해한다"는 본원에 상호교환 가능하게 사용되며, 활성의 완전한 차단을 포함하는 생물학적 활성의 임의의 통계적으로 유의미한 감소를 지칭한다. 예를 들어, "억제"는 생물학적 활성의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 감소를 지칭할 수 있다. 세포 증식은 세포 분열의 속도, 및/또는 세포 분열을 거치는 세포 집단 내의 세포의 비율, 및/또는 말기 분화 또는 세포 사망(예컨대, 티미딘 도입)으로 인한 세포 집단으로부터의 세포 소실 속도를 측정하는 당해 분야에서 인정된 기법을 이용하여 분석할 수 있다.
용어 "대상체"는 특정 치료의 수신체가 되는, 비제한적으로 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 포함하는 임의의 동물(예, 포유류)을 나타낸다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체에 대해 본원에서 상호교환가능하게 이용된다.
용어 "제약 제품"은, (동시 투여를 위한) 모든 활성 성분을 함유하는 조성물로서, 또는 (순차 또는 동시 투여를 위한) 활성 성분 중 전부는 아니지만 적어도 하나를 각각 포함하는 별도의 조성물들의 조합(조합 제제)으로서, 활성 성분의 생물학적 활성을 허용하는 형태이며, 제품을 투여할 대상체에게 허용 불가능한 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제품은 살균 제품일 수 있다. "동시 투여"는 활성 성분들이 동시에 투여됨을 의미한다. "순차 투여"는 활성 성분들이 개별 투여 사이에 시간 간격을 두고 어느 순서로든 차례로 투여됨을 의미한다. 시간 간격은 예를 들어 24시간 미만, 바람직하게는 6시간 미만, 더 바람직하게는 2시간 미만일 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "완화하는" 또는 "완화하기 위한"과 같은 용어는 (1) 진단받은 병리적 병태 또는 장애를 치유하고/하거나, 둔화시키고/시키거나, 이의 증상을 경감시키고/시키거나 이의 진행을 중지시키는 치료적 조치 및 (2) 표적화된 병리적 병태 또는 장애를 예방하고/하거나 이의 발생을 둔화시키는 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 대상체에는 이미 장애를 갖고 있는 대상체; 장애를 갖기 쉬운 대상체; 및 장애가 방지되어야 하는 대상체가 포함된다. 특정 양태에서, 대상체는 환자가 예를 들어 특정 유형의 암의 완전한, 부분적인 또는 일시적인 관해를 나타내는 경우, 본 발명의 방법에 따라 암에 대해 성공적으로 "치료된" 것이다.
용어 "암", "종양", "암성" 및 "악성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리적 질환을 나타내거나 설명한다. 암의 예에는 유방암, 위암, 결장직장암, 폐암, 식도암, 두경부암, 식도위 접합부 선암종, 담도암, 파제트병, 췌장암, 난소암, 자궁 암육종, 요로상피암, 전립선암, 방광암, 위장관 기질 종양, 소화관 기질 종양, 자궁경부암, 편평세포 암종, 복막암, 간암, 간세포암, 자궁체 암종, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 음경암, 백혈병, 악성 림프종, 형질세포종, 골수종, 교모세포종 다형체, 골육종, 육종, 및 흑색종이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 암에는 혈액 악성종양, 예컨대 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병, 광범위 큰 B 세포 림프종, 버키트 림프종, 소포 림프종 및 고형 종양, 예컨대 유방암, 폐암, 신경모세포종 및 결장암이 포함된다.
본 설명에 사용된 용어 “세포독성제”는 광범위하게 정의되고, 세포의 기능을 억제하거나 방해하고/하거나, 세포의 파괴(세포 사멸)를 야기하고/하거나, 항-신생물/항-증식 효과를 발휘하는 물질을 지칭한다. 예를 들어, 세포독성제는 신생 종양 세포의 발생, 성숙 또는 확산을 직접적으로 또는 간접적으로 방지한다. 용어에는 세포정지 효과만을 유도하며 단순한 세포독성 효과를 유도하지 않은 제제도 포함된다. 이러한 용어는 아래에 명시된 화학요법제들뿐만 아니라 기타 HER2 길항제, 항-혈관신생제, 티로신 키나제 억제제, 단백질 키나제 A 억제제, 사이토카인 패밀리의 구성원, 방사성 동위원소 및 독소, 예컨대, 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소 활성 독소도 포함한다.
용어 "화학치료제"는 천연 또는 합성 화학 화합물을 포함하는 용어 "세포독성제"의 하위세트이다.
본 발명의 방법 또는 용도에 따라, 본 발명의 화합물을 환자에게 투여하여 암에 대한 긍정적 치료 반응을 촉진할 수 있다. 암 치료에 대한 용어 "긍정적 치료 반응"은 질환과 연관된 증상에서의 개선을 나타낸다. 예를 들어, 질환의 개선은 완전 반응으로 특징지어질 수 있다. 용어 "완전 반응"은 임의의 이전의 검사 결과의 정상화와 함께 임상적으로 검출 가능한 질환의 부재를 지칭한다. 대안적으로, 질환의 개선은 부분적 반응으로서 범주화될 수 있다. "긍정적 치료 반응"은 본 발명의 화합물의 투여로 생성되는 암의 진행 및/또는 지속기간의 감소 또는 억제, 암 중증도의 감소 또는 완화 및/또는 이의 하나 이상의 증상의 완화를 포괄한다. 구체적인 양태에서, 이러한 용어는 본 발명의 화합물의 투여 후 1개, 2개 또는 3개 이상의 결과를 나타낸다:
(1) 암 세포 집단의 안정화, 감소 또는 제거;
(2) 암 성장의 안정화 또는 감소;
(3) 암 형성의 손상;
(4) 일차적, 지역적 및/또는 전이성 암의 박멸, 제거 또는 제어;
(5) 사망률의 감소;
(6) 무-질환, 무-재발, 무-진행 및/또는 전반적 생존, 기간 또는 비율의 증가;
(7) 반응률, 반응 연속성 또는 반응하거나 차도가 있는 환자의 수의 증가;
(8) 입원율의 감소,
(9) 입원 기간의 감소,
(10) 암의 크기가 유지되고 증가하지 않거나 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 바람직하게는 4% 미만, 바람직하게는 2% 미만으로 증가함, 및
(11) 차도가 있는 환자 수의 증가.
(12) 다른 경우 암을 치료하기 위해 요구될 보조 치료법(예, 화학치료법 또는 호르몬 치료법)의 수 감소.
임상적 반응은 스크리닝 기법, 예컨대 PET, 자기 공명 조영(MRI) 스캔, x-방사측정 조영, 컴퓨터연산 단층촬영(CT) 스캔, 유세포 측정 또는 형광-활성화 세포 정렬장치(FACS) 분석, 조직학, 거시 병리학 및 비제한적으로 ELISA, RIA, 크로마토그래피에 의해 검출 가능한 변화를 포함하는 혈액 화학 등을 이용해서 평가될 수 있다. 이러한 긍정적 치료 반응에 부가하여, 치료법을 받고 있는 대상체는 질환과 연관된 증상에서 유익한 개선 효과를 경험할 수 있다.
알킬 기 및 모이어티는 직쇄 또는 분지쇄, 예를 들어 C1-8 알킬, C1-6 알킬, C1-4 알킬 또는 C5-6 알킬이다. 알킬 기의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, t-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸, 예컨대 메틸 또는 n-헥실이 있다.
플루오로알킬 기는 하나 이상의 H 원자가 하나 이상의 플루오로 원자로 대체된 알킬 기, 예를 들어 C1-8 플루오로알킬, C1-6 플루오로알킬, C1-4 플루오로알킬 또는 C5-6 플루오로알킬이다. 예는 플루오로메틸(CH2F-), 디플루로메틸(CHF2-), 트리플루오로메틸(CF3-), 2,2,2-트리플루오로에틸(CF3CH2-), 1,1-디플루오로에틸(CH3CHF2-), 2,2-디플루오로에틸(CHF2CH2-), 및 2-플루오로에틸(CH2FCH2-)을 포함한다.
할로는 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도를 의미한다. 일 실시 형태에서, 할로는 플루오로 또는 클로로이다.
본원에서 이용되는 어구 "유효량"이란 치료할 증상 및/또는 질환을 유의미하게 그리고 긍정적으로 변경하기에(예를 들어, 긍정적 임상 반응을 제공하기에) 충분한 화합물 또는 조성물의 양을 의미한다. 제약 제품에 사용되는 활성 성분의 유효량은 치료될 특정 병태, 병태의 중증도, 치료 지속기간, 동시 요법의 특성, 이용되는 특정 활성 성분(들), 이용된 특정한 제약상 허용가능한 부형제(들)/담체(들), 및 주치의의 지식과 전문 지식 내에 있는 유사 요인에 따라 달라질 것이다. 특히, 항체-약물 접합체와 조합하여 암 치료에 사용하기 위한 화합물의 유효량은, 이러한 조합이 인간과 같은 온혈 동물에서 증상을 완화하거나 암의 진행을 늦추거나 암 증상이 있는 환자의 악화 위험을 줄이기에 충분한 양이다.
본 명세서에서, 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제약상 허용가능한"은, 타당한 의학적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉되어 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
화학식 I의 화합물은 안정한 제약상 허용가능한 산 또는 염기 염을 형성할 수 있으며, 이러한 경우 염으로서의 화합물의 투여가 적절할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 산 부가염의 예는 아세테이트, 아디페이트, 아스코르베이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 바이카르보네이트, 바이술페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 콜린, 시트레이트, 시클로헥실 술파메이트, 디에틸렌디아민, 에탄술포네이트, 푸마레이트, 글루타메이트, 글리콜레이트, 헤미술페이트, 2-히드록시에틸술포네이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 히드록시말레에이트, 락테이트, 말레이트, 말레에이트, 메탄술포네이트, 메글루민, 2-나프탈렌술포네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 파모에이트, 퍼술페이트, 페닐아세테이트, 포스페이트, 디포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 퀴네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 술파메이트, 술파닐레이트, 술페이트, 타르트레이트, 토실레이트(p-톨루엔술포네이트), 트리플루오로아세테이트 및 운데카노에이트를 포함한다. 비-독성 생리적으로-허용되는 염이 바람직하지만, 예를 들면, 생성물을 단리하거나 정제하는데 있어서 다른 염이 유용할 수 있다.
염은 통상적인 수단에 의해, 예를 들면, 생성물의 유리 염기 형태를 염이 불용성인 용매 또는 매질 중에서, 또는 진공에서 제거되거나 동결 건조에 의해 제거되거나 적합한 이온-교환 수지 상에서 기존 염의 음이온을 또 다른 음이온으로 교환함으로써 제거되는 물과 같은 용매 중에서 1 당량 이상의 적절한 산과 반응시켜 형성될 수 있다.
화학식 I의 화합물은 하나 초과의 키랄 중심을 가질 수 있고, 본 출원은 모든 개별 입체이성질체, 거울상이성질체 및 부분입체이성질체 및 이들의 혼합물을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 화학식 I의 화합물이 하나 이상의 비대칭 탄소 원자에 의해 광학적 활성 형태 또는 라세미 형태로 존재할 수 있는 한에 있어서는, 본 출원은 상기 언급된 활성을 갖는 임의의 이러한 광학적 활성 형태 또는 라세미 형태를 이의 정의에 포함함이 이해되어야 한다. 본 출원은 본원에 정의된 바와 같은 활성을 갖는 이러한 모든 입체이성질체를 포괄한다.
따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐, 화학식 I의 화합물이 언급되는 경우, 용어 '화합물'은 PARP1 억제제인 부분입체이성질체, 부분입체이성질체의 혼합물, 및 거울상이성질체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
화학식 I의 특정 화합물 및 이의 제약적 염은 용매화된 형태 및 비용매화된 형태, 예를 들어 수화된 형태 및 무수 형태로 존재할 수 있음이 또한 이해되어야 한다. 본원의 화합물은 이러한 모든 용매화된 형태를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 명확하게 하기 위해, 이것은 유리 형태의 화합물의 용매화된(예를 들어, 수화된) 형태와, 화합물의 염의 용매화된(예를 들어, 수화된) 형태 둘 다를 포함한다.
일부 화학식 I의 화합물은 결정질일 수 있고, 하나 초과의 결정질 형태를 가질 수 있다. 본 발명은 PARP1 선택적 억제 활성을 갖는, 임의의 결정질 또는 비정질 형태, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 결정질 물질이 통상적인 기술, 예를 들어, 예컨대, X-선 분말 회절(하기에서, XRPD) 분석 및 시차 주사 열량측정법(DSC)을 이용하여 분석될 수 있다는 것은 일반적으로 공지되어 있다.
본원에 기술된 화학식 I은 그의 구성 원자의 모든 동위 원소를 포괄하는 것으로 의도된다. 예를 들면, H(또는 수소)는 1H, 2H(D) 및 3H(T)를 포함하는 수소의 임의의 동위 원소 형태를 포함하고; C는 12C, 13C 및 14C를 포함하는 탄소의 임의의 동위 원소 형태를 포함하고; O는 16O, 17O 및 18O를 포함하는 산소의 임의의 동위 원소 형태를 포함하고; N은 13N, 14N 및 15N을 포함하는 질소의 임의의 동위 원소 형태를 포함하고; F는 19F 및 18F를 포함하는 불소의 임의의 동위 원소 형태를 포함하고; 기타 유사한 경우도 마찬가지이다. 일 양태에서, 화학식 I의 화합물은 천연 발생 존재비에 상응하는 양으로 그 안에 커버된 원자의 동위 원소를 포함한다. 그러나, 특정 경우에, 통상적으로 더 낮은 존재비로 존재할 특정 동위 원소에서의 하나 이상의 원자의 풍부화가 바람직할 수 있다. 예를 들어, 1H는 통상적으로 99.98%가 넘는 존재비로 존재할 것이지만; 일 양태에서, 본원에 주어진 임의의 화학식의 화합물은 H가 존재하는 하나 이상의 위치에서 2H 또는 3H가 풍부할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본원에 주어진 임의의 화학식의 화합물이 방사성 동위 원소, 예를 들어 3H 및 14C가 풍부한 경우, 화합물은 약물 및/또는 기질 조직 분포 분석법(substrate tissue distribution assay)에 유용할 수 있다. 본 출원은 이러한 모든 동위 원소 형태를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 형태에 대하여 기술한다. 후술하는 실시 형태들은 본 발명의 전형적인 실시 형태의 일례를 예시하기 위해 제공되는 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다.
1. 항체-약물 접합체
본 발명에 사용되는 항체-약물 접합체는 하기 화학식:
Figure pct00006
(여기서, A는 항체에 대한 연결 위치를 나타냄)
으로 표시되는 약물-링커가 티오에테르 결합을 통해 항-HER2 항체에 접합된 항체-약물 접합체이다.
본 발명에서, 항체-약물 접합체에서 약물 및 링커로 이루어진 부분 구조는 "약물-링커"로 지칭된다. 약물-링커는 항체에서 사슬간 디술피드 결합 부위 (중쇄들 사이의 2개의 부위, 및 중쇄와 경쇄 사이의 2개의 부위)에 형성된 티올 기 (다시 말해, 시스테인 잔기의 황 원자)에 연결된다.
본 발명의 약물-링커는 성분으로서 국소이성질화효소 I 억제제인 엑사테칸 (IUPAC 명: (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-1,2,3,9,12,15-헥사히드로-9-히드록시-4-메틸-10H,13H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13-디온, (화학명: (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-히드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온)으로도 표시됨)을 포함한다. 엑사테칸은 하기 화학식으로 표시되는, 항종양 효과를 갖는 캄프토테신 유도체이다:
Figure pct00007
본 발명에 사용되는 항-HER2 항체-약물 접합체는 하기 화학식으로 또한 표시될 수 있다:
Figure pct00008
여기서, 약물-링커는 티오에테르 결합을 통해 항-HER2 항체 ('항체-')에 접합된다. n의 의미는 소위 접합된 약물 분자의 평균 수(DAR; 약물-대-항체 비)와 동일하며, 항체 분자당 접합된 약물-링커의 평균 단위 수를 나타낸다.
암 세포 내로 이동한 후에, 본 발명에 사용되는 항-HER2 항체-약물 접합체는 링커 부분에서 절단되어 하기 화학식으로 표시되는 화합물을 방출한다:
Figure pct00009
이 화합물은 본 발명에 사용되는 항체-약물 접합체의 항종양 활성의 원천인 것으로 추정되며, 국소이성질화효소 I 억제 효과를 갖는 것으로 확인되었다 (문헌[Ogitani Y. et al., Clinical Cancer Research, 2016, Oct 15;22(20):5097-5108, Epub 2016 Mar 29]).
본 발명에 사용되는 항-HER2 항체-약물 접합체는 방관자 효과(bystander effect)를 갖는 것으로 알려져 있다 (문헌[Ogitani Y. et al., Cancer Science (2016) 107, 1039-1046]). 방관자 효과는 표적을 발현하는 암 세포에 본 발명에서 사용되는 항체-약물 접합체가 내재화되며, 주변에 존재하고 표적을 발현하지 않는 암 세포에도 방출된 화합물이 항종양 효과를 발휘하는 과정을 통해 발휘된다. 이러한 방관자 효과는 항-HER2 항체-약물 접합체를 본 발명에 따른 PARP1 선택적 억제제와 함께 사용하는 경우에도 탁월한 항종양 효과로서 발휘된다.
2. 항체-약물 접합체 내의 항체
본 발명에서 사용되는 항체-약물 접합체 내의 항-HER2 항체는 임의의 종으로부터 유래될 수 있으며, 바람직하게는 인간, 래트, 마우스, 또는 토끼로부터 유래된 항-HER2 항체이다. 항체가 인간 종 이외의 종으로부터 유래되는 경우, 이는 바람직하게는 잘 알려진 기술을 사용하여 키메라화 또는 인간화된다. 항-HER2 항체는 다클론성 항체 또는 단클론성 항체이며 바람직하게는 단클론성 항체이다.
본 발명에 사용되는 항체-약물 접합체 내의 항체는, 바람직하게는 암 세포를 표적화할 수 있는 특징을 갖는 항-HER2 항체이고, 바람직하게는 예를 들어 암 세포를 인식하는 특성, 암 세포에 결합하는 특성, 암 세포에 내재화하는 특성 및/또는 암 세포에 대한 살세포 활성을 갖는 항체이다.
암 세포에 대한 항-HER2 항체의 결합 활성은 유세포 측정을 사용하여 확인될 수 있다. 암 세포 내로의 항체의 내재화는 (1) 치료 항체에 결합하는 2차 항체(형광 표지됨)를 사용하여 형광 현미경 하에서 세포에 통합된 항체를 시각화하는 분석 (문헌[Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761]), (2) 치료 항체에 결합하는 2차 항체(형광 표지됨)를 사용하여 세포에 통합된 형광 강도를 측정하는 분석 (문헌[Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, December 2004]), 또는 (3) 치료 항체에 결합하는 면역독소(세포 내에 통합될 때 독소를 방출하여 세포 성장을 억제함)를 사용하는 Mab-ZAP 분석 (문헌[Bio Techniques 28: 162-165, January 2000])을 사용하여 확인될 수 있다. 면역독소로서는 디프테리아 독소 촉매 도메인과 단백질 G의 재조합 복합 단백질이 사용될 수 있다.
항-HER2 항체의 항종양 활성은 세포 성장에 대한 억제 활성을 결정함으로써 시험관 내에서 확인될 수 있다. 예를 들어, 항체에 대한 표적 단백질로서 HER2를 과발현하는 암 세포주를 배양하고, 항체를 다양한 농도로 배양 시스템에 첨가하여 병소 형성, 콜로니 형성 및 스페로이드 성장에 대한 억제 활성을 결정한다. 항종양 활성은 예를 들어 표적 단백질을 고발현하는 암 세포주를 이식한 누드 마우스에 항체를 투여하고 암 세포의 변화를 결정함으로써 생체 내에서 확인될 수 있다.
항-HER2 항체-약물 접합체에 접합된 화합물이 항종양 효과를 발휘하므로, 항-HER2 항체 자체가 항종양 효과를 갖는 것은 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 암 세포에 대한 항종양 화합물의 세포독성 활성을 특이적이고 선택적으로 발휘하기 위해서는 항-HER2 항체가 암 세포로 이동하도록 내재화하는 성질을 갖는 것이 중요하고 또한 바람직하다.
본 발명에 사용되는 항체-약물 접합체 내의 항-HER2 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 항원 폴리펩티드로 동물을 면역화하고 생체 내에서 생성된 항체를 수집 및 정제하는 것을 포함하는, 당업계에서 통상적으로 수행되는 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 항원의 기원은 인간에 한정되지 않으며, 동물은 마우스, 래트 등과 같은 비-인간 동물로부터 유래된 항원으로 면역화될 수 있다. 이 경우, 수득된 이종 항원에 결합하는 항체와 인간 항원의 교차-반응성을 테스트하여 인간 질환에 적용가능한 항체를 스크리닝할 수 있다.
대안적으로, 항원에 대한 항체를 생성하는 항체-생성 세포는 당업계에 공지된 방법 (예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; and Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)])에 따라 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마를 확립하며, 이로부터 단클론성 항체를 수득할 수 있다.
항원은 숙주 세포를 유전공학적으로 조작하여 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 생성함으로써 수득할 수 있다. 구체적으로, 항원 유전자의 발현을 허용하는 벡터를 준비하고 숙주 세포로 옮겨 유전자가 발현되도록 한다. 이렇게 발현된 항원은 정제될 수 있다. 항체는 또한 전술한 유전공학적으로 조작된 항원-발현 세포 또는 항원을 발현하는 세포주로 동물을 면역화하는 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에 사용되는 항체-약물 접합체 내의 항-HER2 항체는 바람직하게는 키메라 항체 또는 인간화 항체와 같이 인간에 대한 이종 항원성을 감소시킬 목적으로 인공 변형에 의해 수득된 재조합 항체이거나, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 항체의 유전자 서열만을 갖는 항체, 즉 인간 항체이다. 이들 항체는 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
키메라 항체로서는, 항체 가변 및 불변 영역이 상이한 종으로부터 유래된 항체, 예를 들어, 마우스- 또는 래트-유래 항체 가변 영역이 인간-유래 항체 불변 영역에 연결된 키메라 항체가 예시될 수 있다 (문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984)]).
인간화 항체로서는, 인간-유래 항체에 이종 항체의 상보성 결정 영역(CDR)만을 통합하여 수득된 항체 (문헌[(Nature (1986) 321, pp. 522-525]), 및 인간 항체에 이종 항체의 프레임워크의 아미노산 잔기의 일부뿐만 아니라 이종 항체의 CDR 서열을 CDR-그래프팅 방법에 의해 이식하여 수득된 항체 (WO 90/07861), 및 유전자 전환 돌연변이유발 전략을 사용하여 인간화된 항체 (미국 특허 제5821337호)가 예시될 수 있다.
인간 항체로서는, 인간 항체의 중쇄 및 경쇄의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체-생성 마우스를 사용하여 생성된 항체 (문헌[Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143; 문헌[Kuroiwa, Y. et. al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448]; 문헌[Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects vol.10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999]; 문헌[Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727] 등 참조)가 예시될 수 있다. 대안으로는, 파지 디스플레이에 의해 수득된 항체 (인간 항체 라이브러리로부터 선택되는 항체) (문헌[Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002)43 (7), p.2301-2308]; 문헌[Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1(2), p.189-203]; 문헌[Siriwardena, D. et. al., Ophthalmology (2002) 109(3), p.427-431] 등 참조)가 예시될 수 있다.
본 발명에서, 본 발명에 사용되는 항체-약물 접합체 내의 항-HER2 항체의 변형된 변이체가 또한 포함된다. 변형된 변이체는 본 발명에 따른 항체를 화학적 또는 생물학적으로 변형시켜 수득되는 변이체를 의미한다. 화학적으로 변형된 변이체의 예에는 아미노산 골격에 대한 화학 모이어티의 연결을 포함하는 변이체, N-연결 또는 O-연결 탄수화물 사슬에 대한 화학 모이어티의 연결을 포함하는 변이체 등이 포함된다. 생물학적으로 변형된 변이체의 예에는 번역 후 변형 (예를 들어 N-연결 또는 O-연결 글리코실화, N- 또는 C-말단 처리, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질체화, 또는 메티오닌의 산화)에 의해 수득되는 변이체, 및 메티오닌 잔기가 원핵 숙주 세포에서 발현됨으로써 N 말단에 부가된 변이체가 포함된다. 또한, 본 발명에 따른 항체 또는 항원을 검출 또는 단리할 수 있도록 표지된 항체, 예를 들어 효소-표지 항체, 형광-표지 항체, 및 친화성-표지 항체가 또한 변형된 변이체의 의미 내에 포함된다. 본 발명에 따른 항체의 이러한 변이체 항체는 항체의 안정성 및 혈중 체류성 향상, 항원성 감소, 항체 또는 항원의 검출 또는 단리 등에 유용하다.
또한, 본 발명에 따른 항체에 연결된 글리칸의 변형(글리코실화, 탈푸코실화 등)을 조절함으로써, 항체-의존성 세포독성 활성을 향상시킬 수 있다. 항체의 글리칸의 변형을 조절하는 기술로서는, WO99/54342, WO00/61739, WO02/31140, WO2007/133855, WO2013/120066 등에 개시된 것들이 공지되어 있다. 그러나, 기술은 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 항-HER2 항체에서, 글리칸의 변형이 조절된 항체가 또한 포함된다.
배양된 포유류 세포에서 생성된 항체의 중쇄의 카르복실 말단에서 라이신 잔기는 결실된 것으로 알려져 있으며 (문헌[Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)]), 또한, 배양된 포유류 세포에서 생성된 항체의 중쇄의 카르복실 말단에서 2개의 아미노산 잔기 (글리신 및 라이신)는 결실되고 카르복실 말단에 새로 위치한 프롤린 잔기는 아미드화된 것으로 알려져 있다 (문헌[Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)]). 그러나, 이러한 중쇄 서열의 결실 및 변형은 항체의 항원-결합 친화성 및 이펙터 기능 (보체의 활성화, 항체-의존적 세포독성 등)에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 항-HER2 항체에서, 이러한 변형을 거친 항체 및 항체의 기능적 단편이 또한 포함되며, 중쇄의 카르복실 말단에서 1개 또는 2개의 아미노산이 결실된 결실 변이체, 결실 변이체의 아미드화에 의해 수득되는 변이체(예를 들어, 카르복실 말단 프롤린 잔기가 아미드화된 중쇄) 등이 또한 포함된다. 본 발명에 따른 항-HER2 항체의 중쇄의 카르복실 말단에 결실을 갖는 결실 변이체의 유형은 항원-결합 친화성 및 이펙터 기능이 보존되는 한 상기 변이체에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 항체를 구성하는 2개의 중쇄는 전장 중쇄 및 전술한 결실 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 유형일 수 있거나, 이들로부터 선택된 2가지 유형의 조합일 수 있다. 각각의 결실 변이체 양의 비율은 본 발명에 따른 항-HER2 항체를 생성하는 배양된 포유류 세포의 유형 및 배양 조건에 의해 영향을 받을 수 있으나; 본 발명에 따른 항체에서 2개의 중쇄 모두에서 카르복실 말단의 1개의 아미노산 잔기가 결실된 항체가 바람직한 것으로 예시될 수 있다.
본 발명에 따른 항-HER2 항체의 아이소타입으로서는, 예를 들어, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)가 예시될 수 있으며, IgG1 또는 IgG2가 바람직한 것으로 예시될 수 있다.
본 개시내용에서, 용어 "항-HER2 항체"는, HER2 (인간 표피 성장 인자 수용체 유형 2; ErbB-2)에 특이적으로 결합하며 바람직하게는 HER2에 결합함으로써 HER2-발현 세포에서 내재화 활성을 갖는 항체를 지칭한다.
항-HER2 항체의 예에는 트라스투주맙 (미국 특허 제5821337호) 및 페르투주맙 (WO01/00245)가 포함되며, 트라스투주맙이 바람직한 것으로 예시된다.
3. 항체-약물 접합체의 제조
본 발명에 따른 항-HER2 항체-약물 접합체의 생성에 사용하기 위한 약물-링커 중간체는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00010
약물-링커 중간체는 화학명 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드로 표시될 수 있으며, WO2014/057687, WO2015/098099, WO2015/115091, WO2015/155998, WO2019/044947 등의 설명을 참조하여 생성될 수 있다.
본 발명에 사용되는 항-HER2 항체-약물 접합체는 전술한 약물-링커 중간체와 티올 기(술프히드릴 기로도 지칭됨)를 갖는 항-HER2 항체를 반응시켜 생성될 수 있다.
술프히드릴 기를 갖는 항-HER2 항체는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수득될 수 있다 (문헌[Hermanson, G. T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)]). 예를 들어, 항체 내 사슬간 디술피드당 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드(TCEP)와 같은 환원제를 0.3 내지 3몰 당량으로 사용하고 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이팅제를 함유하는 완충 용액에서 항체와 반응시킴으로써, 항체 내에 부분적으로 또는 완전히 환원된 사슬간 디술피드를 갖는 술프히드릴 기를 갖는 항-HER2 항체를 수득할 수 있다.
또한, 술프히드릴 기를 갖는 항-HER2 항체당 2 내지 20몰 당량의 약물-링커 중간체를 사용함으로써, 항체 분자당 2 내지 8개의 약물 분자가 접합된 항-HER2 항체-약물 접합체를 생성할 수 있다.
예를 들어, 280 nm 및 370 nm의 2개의 파장에서 항체-약물 접합체 및 그의 접합 전구체에 대한 UV 흡광도를 측정하는 것에 기초한 계산 방법(UV 방법), 또는 항체-약물 접합체를 환원제로 처리하여 수득된 단편에 대해 HPLC 측정을 통한 정량화에 기초한 계산 방법(HPLC법)에 의해, 생성된 항체-약물 접합체의 항-HER2 항체 분자당 접합된 약물 분자의 평균 수를 결정할 수 있다.
항-HER2 항체와 약물-링커 중간체 사이의 접합 및 항체-약물 접합체의 항체 분자당 접합된 약물 분자의 평균 수의 계산은 WO2014/057687, WO2015/098099, WO2015/115091, WO2015/155998, WO2017/002776, WO2018/212136 등의 설명을 참조하여 수행될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "항-HER2 항체-약물 접합체"는 본 발명에 따른 항체-약물 접합체 내의 항체가 항-HER2 항체인 항체-약물 접합체를 지칭한다.
항-HER2 항체는 바람직하게는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 26 내지 33으로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 CDRH1, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 51 내지 58로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 CDRH2 및 서열 번호 1의 아미노산 잔기 97 내지 109로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 CDRH3을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 2의 아미노산 잔기 27 내지 32로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 CDRL1, 서열 번호 2의 아미노산 잔기 50 내지 52로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 CDRL2 및 서열 번호 2의 아미노산 잔기 89 내지 97로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 CDRL3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체이고, 더 바람직하게는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 1 내지 120으로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 2의 아미노산 잔기 1 내지 107로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체, 및 더욱 더 바람직하게는 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체, 또는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 1 내지 449로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 2의 모든 아미노산 잔기 1 내지 214로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체이다.
항-HER2 항체-약물 접합체 내의 항체 분자당 접합된 약물-링커의 평균 단위 수는 바람직하게는 2 내지 8, 더 바람직하게는 3 내지 8, 더욱 더 바람직하게는 7 내지 8, 더욱 더 바람직하게는 7.5 내지 8, 더욱 더 바람직하게는 약 8이다.
본 발명에 사용되는 항-HER2 항체-약물 접합체는 WO2015/115091 등의 설명을 참조하여 생성될 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 항-HER2 항체-약물 접합체는 트라스투주맙 데룩스테칸 (DS-8201)이다.
4. PARP1 선택적 억제제
본 발명에서, 용어 "PARP1 선택적 억제제"는 PARP2, PARP3, PARP5a, 및 PARP6과 같은 다른 PARP 패밀리 구성원에 비해 PARP1에 대한 선택성, 유리하게는 PARP2에 비해 PARP1에 대한 선택성, 바람직하게는 PARP2에 비해 PARP1에 대한 적어도 10배의 선택성, 더 바람직하게는 PARP2에 비해 PARP1에 대한 적어도 100배의 선택성을 나타내는 PARP 억제제를 지칭한다. PARP1 선택적 억제제의 바람직한 예는 본원에 개시된 것들을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 PARP1 선택적 억제제의 예는 화학식 I의 아자퀴놀론 화합물을 포함한다. 본원에 기술된 화학식 I의 아자퀴놀론 화합물은 PARP2, PARP3, PARP5a 및 PARP6과 같은 다른 PARP 패밀리 구성원에 비해 PARP1에 대해 놀랍도록 높은 선택성을 갖는다. 유리하게는, 본원에 기술된 화학식 I의 화합물은 낮은 hERG 활성을 갖는다. 인간 에테르-
Figure pct00011
-gogo 관련 유전자(hERG)에 의해 암호화된 심장 이온 채널의 차단이 신약 발견 및 개발의 위험 요인이며 hERG의 차단은 심장 부정맥과 같은 안전 문제를 일으킬 수 있다는 것은 잘 알려져 있다.
따라서, 본 발명에서 사용되는 PARP1 선택적 억제제의 바람직한 실시 형태에서, PARP1 선택적 억제제는 하기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염이다:
[화학식 I]
Figure pct00012
(상기 식에서,
X1 및 X2는 N 및 C(H)로부터 각각 독립적으로 선택되며,
X3은 N 및 C(R4)로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, R4는 H 또는 플루오로이며,
R1은 C1-4 알킬 또는 C1-4 플루오로알킬이며 (바람직하게는 에틸이며),
R2는 H, 할로, C1-4 알킬, 및 C1-4 플루오로알킬로부터 독립적으로 선택되며,
R3은 H 또는 C1-4 알킬이되 (바람직하게는 C1-4 알킬, 더 바람직하게는 메틸이되),
단,
X1이 N이면, X2는 C(H)이고, X3은 C(R4)이며,
X2가 N이면, X1은 C(H)이고, X3은 C(R4)이며,
X3이 N이면, X1 및 X2 둘 다가 C(H)임).
일 실시 형태에서 본 발명에 사용되는 PARP1 선택적 억제제는 화학식 Ia의 화합물이다:
[화학식 Ia]
Figure pct00013
(상기 식에서,
R1은 C1-4 알킬이고, R2는 H, 할로, C1-4 알킬, 및 C1-4 플루오로알킬로부터 선택되고 (바람직하게는 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 및 메틸로부터 선택되거나, H 또는 할로임), R3은 H 또는 C1-4 알킬이고, R4는 H임). 화학식 Ia의 화합물에서, 바람직하게는 R1은 에틸이고, R2는 H, 클로로 및 플루오로로부터 선택되고, R3은 메틸이고, R4는 H이다.
또 다른 실시 형태에서 본 발명에 사용되는 PARP1 선택적 억제제는 화학식 Ib의 화합물이다:
[화학식 Ib]
Figure pct00014
(상기 식에서,
R1은 C1-4 알킬이고, R2는 H 또는 할로이고, R3은 H 또는 C1-4 알킬임). 화학식 Ib의 화합물에서, 바람직하게는 R1은 에틸이고, R2는 H, 클로로 및 플루오로로부터 선택되고, R3은 메틸이다.
또 다른 실시 형태에서 본 발명에 사용되는 PARP1 선택적 억제제는 화학식 Ic의 화합물이다:
[화학식 Ic]
Figure pct00015
(상기 식에서,
R1은 C1-4 알킬 또는 C1-4 플루오로알킬이고, R2는 H, 할로, C1-4 알킬, 및 C1-4 플루오로알킬로부터 독립적으로 선택되고,
R3은 H 또는 C1-4 알킬이고, R4는 H 또는 플루오로임).
또 다른 실시 형태에서 PARP1 선택적 억제제는, R1이 에틸, n-프로필, 트리플루오로메틸, 1,1-디플루오로에틸, 2,2-디플루오로에틸, 2-플루오로에틸, 및 2,2,2-트리플루오로에틸로부터 독립적으로 선택되고; R2가 H, 메틸, 에틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 플루오로메틸, 플루오로, 및 클로로로부터 독립적으로 선택되고; R3이 H 또는 메틸이고, R4가 H인, 화학식 Ic의 화합물이다.
또 다른 실시 형태에서 PARP1 선택적 억제제는 PARP2에 비해 PARP1에 대한 선택성, 바람직하게는 PARP2에 비해 PARP1에 대한 적어도 10배의 선택성, 더 바람직하게는 PARP2에 비해 PARP1에 대한 적어도 100배의 선택성을 갖는, 화학식 I의 화합물, 또는 화학식 Ia, Ib 또는 Ic의 화합물이다.
다른 실시 형태에서 본 발명에 사용되는 PARP1 선택적 억제제는 다음으로부터 선택되는 화합물이다:
5-[4-[(3-에틸-2-옥소-1H-1,6-나프티리딘-7-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[(3-에틸-2-옥소-1H-1,6-나프티리딘-7-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
6-클로로-5-[4-[(3-에틸-2-옥소-1H-1,6-나프티리딘-7-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
6-클로로-5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드
6-에틸-5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드,
6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
6-클로로-5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
N-메틸-5-[4-[[3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드,
6-클로로-N-메틸-5-[4-[[3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드,
6-플루오로-N-메틸-5-[4-[[3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드,
N-메틸-5-[4-[(3-옥소-2-프로필-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드,
6-클로로-N-메틸-5-[4-[(3-옥소-2-프로필-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드,
6-플루오로-N-메틸-5-[4-[(3-옥소-2-프로필-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[(2-에틸-7-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[[2-(1,1-디플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[[2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[[2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[[2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
6-플루오로-5-[4-[[2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
N-메틸-5-[4-[[3-옥소-2-(2,2,2-트리플루오로에틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드, 및
6-플루오로-N-메틸-5-(4-((3-옥소-2-(2,2,2-트리플루오로에틸)-3,4-디히드로퀴녹살린-6-일)메틸)피페라진-1-일)피콜린아미드,
또는 이들의 제약상 허용 가능한 염.
또 다른 실시 형태에서 본 발명에 사용되는 PARP1 선택적 억제제는 다음으로부터 선택되는 화합물이다:
6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-6 (트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드,
5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드, 및
N-에틸-5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드,
또는 이들의 제약상 허용가능한 염.
바람직한 실시 형태에서 본 발명에 사용되는 PARP1 선택적 억제제는 하기 화학식으로 표시되는 화합물 AZD5305 (5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드) 또는 이의 제약상 허용가능한 염이다:
Figure pct00016
5. 항체-약물 접합체와 PARP1 선택적 억제제의 조합
본 발명의 제1 조합 실시 형태에서, PARP1 선택적 억제제와 조합되는 항-HER2 항체-약물 접합체는 하기 화학식:
Figure pct00017
(여기서, A는 항체에 대한 연결 위치를 나타냄)으로 표시되는 약물-링커가 티오에테르 결합을 통해 항-HER2 항체에 접합된 항체-약물 접합체이다.
또 다른 조합 실시 형태에서, 제1 조합 실시 형태에 대해 상기에 정의된 바와 같은 항-HER2 항체-약물 접합체는 하기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염인 PARP1 선택적 억제제와 조합된다:
[화학식 I]
Figure pct00018
(상기 식에서,
X1 및 X2는 N 및 C(H)로부터 각각 독립적으로 선택되며,
X3은 N 및 C(R4)로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, R4는 H 또는 플루오로이며,
R1은 C1-4 알킬 또는 C1-4 플루오로알킬이며,
R2는 H, 할로, C1-4 알킬, 및 C1-4 플루오로알킬로부터 독립적으로 선택되며;
R3은 H 또는 C1-4 알킬이되,
단,
X1이 N이면, X2는 C(H)이고, X3은 C(R4)이며,
X2가 N이면, X1은 C(H)이고, X3은 C(R4)이며,
X3이 N이면, X1 및 X2 둘 다가 C(H)임).
또 다른 조합 실시 형태에서, 상기에 정의된 바와 같은 항-HER2 항체-약물 접합체는, 화학식 I에서, R3이 C1-4 알킬인 상기에 정의된 바와 같은 PARP1 선택적 억제제와 조합된다.
또 다른 조합 실시 형태에서, 상기에 정의된 바와 같은 항-HER2 항체-약물 접합체는, 화학식 I에서, R3이 메틸인 상기에 정의된 바와 같은 PARP1 선택적 억제제와 조합된다.
또 다른 조합 실시 형태에서, 상기에 정의된 바와 같은 항-HER2 항체-약물 접합체는, 화학식 I에서, R1이 에틸인 상기에 정의된 바와 같은 PARP1 선택적 억제제와 조합된다.
또 다른 조합 실시 형태에서, 상기에 정의된 바와 같은 항-HER2 항체-약물 접합체는 하기 화학식 Ia로 표시되는 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염인 PARP1 선택적 억제제와 조합된다:
[화학식 Ia]
Figure pct00019
(상기 식에서,
R1은 C1-4 알킬이며,
R2는 H, 할로, C1-4 알킬, 및 C1-4 플루오로알킬로부터 선택되며,
R3은 H 또는 C1-4 알킬이며,
R4는 H임);
또 다른 조합 실시 형태에서, 상기에 정의된 바와 같은 항-HER2 항체-약물 접합체는, 화학식 Ia에서, R2가 에틸인 상기에 정의된 바와 같은 PARP1 선택적 억제제와 조합된다.
또 다른 조합 실시 형태에서, 상기에 정의된 바와 같은 항-HER2 항체-약물 접합체는, 화학식 Ia에서, R1이 에틸이고, R2가 H, 클로로 및 플루오로로부터 선택되고, R3이 메틸인 상기에 정의된 바와 같은 PARP1 선택적 억제제와 조합된다.
또 다른 조합 실시 형태에서, 상기에 정의된 바와 같은 항-HER2 항체-약물 접합체는 하기 화학식으로 표시되는 AZD5305 또는 이의 제약상 허용가능한 염인 PARP1 선택적 억제제와 조합된다:
Figure pct00020
전술한 조합 실시 형태 각각의 실시 형태에서, 항-HER2 항체는 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH1, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH2 및 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH3을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRL1, 서열 번호 7의 아미노산 잔기 1 내지 3으로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 CDRL2 및 서열 번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRL3을 포함하는 경쇄를 포함한다. 전술한 조합 실시 형태 각각의 또 다른 실시 형태에서, 항-HER2 항체는 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 전술한 조합 실시 형태 각각의 또 다른 실시 형태에서, 항-HER2 항체는 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다. 전술한 조합 실시 형태 각각의 또 다른 실시 형태에서, 항-HER2 항체는 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 조합 실시 형태에서, 항-HER2 항체-약물 접합체는 트라스투주맙 데룩스테칸 (DS-8201)이고 PARP1 선택적 억제제는 하기 화학식으로 표시되는 화합물이다:
Figure pct00021
(AZD5305로서 또한 확인됨).
6. 치료적 조합 용도 및 방법
본 발명에 따른 항-HER2 항체-약물 접합체와 PARP1 선택적 억제제를 조합 투여하는 제약 제품 및 치료적 용도 및 방법이 하기에 기술된다.
본 발명의 제약 제품 및 치료적 용도 및 방법은 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제가 상이한 제형에 활성 성분으로서 개별적으로 함유되고, 동시에 또는 상이한 시점에 투여되는 것을 특징으로 할 수 있거나, 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제가 단일 제제에 활성 성분으로서 함유되고 투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제약 제품 및 치료적 방법에서, 본 발명에 사용되는 단일 PARP1 선택적 억제제가 항-HER2 항체-약물 접합체와 함께 투여될 수 있거나, 둘 이상의 상이한 PARP1 선택적 억제제가 항체-약물 접합체와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 제품 및 치료적 방법은 암 치료에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 유방암 (삼중 음성 유방암 및 내강형 유방암을 포함함), 위암 (위 선암종이라고도 함), 결장직장암 (결장 및 직강 암이라고도 하며, 결장암 및 직장암을 포함함), 폐암 (소세포 폐암 및 비소세포 폐암을 포함함), 식도암, 두경부암 (침샘암 및 인두암을 포함함), 식도위 접합부 선암종, 담도암 (담관암을 포함함), 파제트병, 췌장암, 난소암, 자궁 암육종, 요로상피암, 전립선암, 방광암, 위장관 기질 종양, 자궁경부암, 편평세포 암종, 복막암, 간암, 간세포암, 자궁체 암종, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 음경암, 백혈병, 악성 림프종, 형질세포종, 골수종, 교모세포종 다형체, 골육종, 육종, 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 암을 치료하는 데 사용될 수 있고, 더 바람직하게는 유방암, 위암, 결장직장암, 폐암 (바람직하게는 비소세포 폐암), 췌장암, 난소암, 전립선암, 및 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 암을 치료하는 데 사용될 수 있다.
HER2 종양 마커의 존재 여부는, 예를 들어 암 환자로부터 종양 조직을 수집하여 포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 검체를 준비하고, 예를 들어, 검체를 면역조직화학적(IHC) 방법, 유세포 분석기 또는 웨스턴 블롯팅(Western blotting)으로 유전자 산물(단백질)에 대해 테스트하거나, 또는 예를 들어, 인 시튜 하이브리드화(in situ hybridization, ISH) 방법, 정량적 PCR 방법(q-PCR), 또는 마이크로어레이 분석으로 유전자 전사에 대해 테스트함으로써, 또는 암 환자로부터 무세포 순환 종양 DNA(ctDNA)를 수집하고 ctDNA를 차세대 서열분석(NGS)과 같은 방법으로 테스트함으로써 결정될 수 있다.
본 발명의 제약 제품 및 치료적 방법은 HER2-과발현암 (고 또는 중)일 수 있거나 HER2 저-발현 암일 수 있는 HER2-발현 암에 사용될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "HER2-과발현 암"은 당업자에 의해 HER2-과발현 암으로 인식되는 한 특별히 제한되지 않는다. HER2-과발현 암의 바람직한 예는 IHC 방법에서 HER2의 발현에 대해 3+의 점수를 받은 암, 및 IHC 방법에서 HER2의 발현에 대해 2+의 점수를 받고 인 시튜 하이브리드화 방법(ISH)에서 HER2의 발현에 대해 양성으로 결정된 암을 포함할 수 있다. 본 발명의 인 시튜 하이브리드화 방법은 형광 인 시튜 하이브리드화 방법(FISH) 및 듀얼 컬러 인 시튜 하이브리드화 방법(DISH)을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "HER2 저-발현 암"은 당업자에 의해 HER2 저-발현 암으로 인지되는 한 특별히 제한되지 않는다. HER2 저-발현 암의 바람직한 예는 IHC 방법에서 HER2의 발현에 대해 2+의 점수를 받고 인 시튜 하이브리드화 방법에서 HER2의 발현에 대해 음성으로 결정된 암, 및 IHC 방법에서 HER2의 발현에 대해 1+의 점수를 받은 암을 포함할 수 있다.
IHC 방법에 의해 HER2 발현 정도의 점수를 매기는 방법, 또는 인 시튜 하이브리드화 방법에 의해 HER2 발현에 대해 양성 또는 음성을 결정하는 방법은 당업자에 의해 인식되는 한 특별히 제한되지 않는다. 방법의 예는 유방암에 대한 HER2 테스트에 대한 가이드라인의 제4판에 기술된 방법(유방암에 대한 HER2의 최적 사용을 위해 일본 병리학 위원회에 의해 개발됨)을 포함할 수 있다.
암은, 특히 유방암 치료와 관련하여, HER2-과발현(고 또는 중) 또는 저-발현 유방암, 또는 삼중 음성 유방암일 수 있고/있거나 HER2 상태 점수가 IHC 3+, IHC 2+, IHC 1+ 또는 IHC >0 및 <1+일 수 있다.
본 발명의 제약 제품 및 치료적 방법은 바람직하게는 포유 동물에 사용될 수 있지만, 더 바람직하게는 인간에 사용될 수 있다.
테스트 대상체 동물에 암 세포를 이식하여 모델을 제조하고 본 발명의 제약 제품 및 치료적 방법의 적용에 의한 종양 부피 감소 또는 수명 연장 효과를 측정함으로써, 본 발명의 제약 제품 및 치료적 방법의 항종양 효과를 확인할 수 있다. 그리고 이어서, 본 발명에 사용된 항체-약물 접합체의 단일 투여 및 PARP1 선택적 억제제의 단일 투여에 따른 항종양 효과를 비교함으로써, 본 발명에 사용된 항체-약물 접합체와 PARP1 선택적 억제제의 조합 사용의 효과를 확인할 수 있다.
본 발명의 제약 제품 및 치료적 방법의 항종양 효과는 고형암 반응 평가 기준(RECIST)을 사용한 평가 방법, WHO 평가 방법, Macdonald 평가 방법, 체중 측정 및 기타 접근법 중 임의의 것을 사용하는 임상 시험에서 확인할 수 있으며, 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 진행성 질환(PD), 객관적 반응률(ORR), 반응 지속기간(DoR), 무진행 생존율(PFS), 전체 생존율(OS) 등의 지표를 기준으로 결정될 수 있다.
상기 방법을 사용함으로써, 본 발명의 제약 제품 및 치료적 방법이 기존의 암 치료용 제약 제품 및 치료적 방법에 비해 항종양 효과가 우수함을 확인할 수 있다.
본 발명의 제약 제품 및 치료적 방법은 암세포의 발달을 지연시키고, 성장을 억제하며, 나아가 암 세포를 사멸시킬 수 있다. 이러한 효과는 암 환자가 암으로 인한 증상으로부터 자유로워지게 하거나 암 환자의 삶의 질(QOL) 개선을 달성할 수 있고, 암 환자의 생명을 유지함으로써 치료 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 제약 제품 및 치료적 방법은 암 세포를 사멸하지 못하더라도, 암 세포의 성장을 억제하거나 제어함으로써 장기 생존을 달성하면서 암 환자의 더 높은 QOL을 달성할 수 있다.
본 발명의 제약 제품은 환자에 대한 전신 요법으로서의 적용에 의해, 그리고 추가로 암 조직에 대한 국소 적용에 의해 치료 효과를 발휘할 것으로 예상할 수 있다.
본 발명의 제약 제품 및 치료적 방법은, 또 다른 양태에서, 이온화 방사선 또는 다른 화학치료제를 사용한 암 요법에서 보조제로서 사용하기 위해 제공된다. 예를 들어, 암 치료에서, 치료는 이온화 방사선 또는 다른 화학요법제와 동시에 또는 순차적으로, 치료적 유효량의 제약 제품을, 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 제품 및 치료적 방법은 외과 수술과 결합된 보조 화학 요법으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 제약 제품은 외과 수술 전에 종양 크기를 감소시키기 위한 목적으로 투여될 수 있거나 (수술 전 보조 화학요법 또는 신보조 요법으로 지칭됨), 외과 수술 후 종양의 재발 방지를 목적으로 투여될 수 있다 (수술 후 보조 화학 요법 또는 보조 요법으로 지칭됨).
추가의 양태에서, 본 발명의 제약 제품은 상동 재조합(HR) 의존적 DNA DSB 복구 활성이 결핍된 암의 치료에 사용될 수 있다. HR 의존성 DNA DSB 복구 경로는 상동 메커니즘을 통해 DNA의 이중 가닥 파괴(DSB)를 복구하여 연속적인 DNA 나선을 재형성한다(문헌[K.K. Khanna and S.P. Jackson, Nat. Genet. 27(3): 247-254 (2001)]). HR 의존성 DNA DSB 복구 경로의 구성 요소는 ATM(NM_000051), RAD51(NM_002875), RAD51L1(NM_002877), RAD51C(NM_002876), RAD51L3(NM_002878), DMC1(NM_007068), XRCC2(NM_005431), XRCC3(NM_005432), RAD52(NM_002879), RAD54L(NM_003579), RAD54B(NM_012415), BRCA1(NM_007295), BRCA2(NM_000059), RAD50(NM_005732), MRE11A(NM_005590) 및 NBS1(NM_002485)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. HR 의존성 DNA DSB 복구 경로에 관련된 다른 단백질은 EMSY와 같은 조절 인자를 포함한다(문헌[Hughes-Davies, et al., Cell, 115, pp523-535]). HR 구성 요소는 또한 문헌[Wood, et al., Science, 291, 1284-1289 (2001)]에 기술되어 있다. HR 의존성 DNA DSB 복구 결함성인 암은 정상 세포에 비해 그 경로를 통한 DNA DSB 복구 능력이 감소되거나 없어진 하나 이상의 암세포를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 즉, HR 의존성 DNA DSB 복구 경로의 활성이 상기 하나 이상의 암세포에서 감소되거나 무효화될 수 있다. HR 의존성 DNA DSB 복구 경로의 하나 이상의 구성 요소의 활성은 HR 의존성 DNA DSB 복구 결함성인 암을 갖는 개체의 상기 하나 이상의 암세포에서 무효화될 수 있다. HR 의존성 DNA DSB 복구 경로의 구성 요소는 당업계에서 잘 특성화되어 있으며(예를 들어, 문헌[Wood, et al., Science, 291, 1284-1289 (2001)] 참조), 상기 열거된 구성 요소를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 암세포는 BRCA1 및/또는 BRCA2 결함성 표현형을 가질 수 있으며, 즉, BRCA1 및/또는 BRCA2 활성이 암세포에서 감소되거나 무효화된다. 이 표현형을 갖는 암세포는 BRCA1 및/또는 BRCA2 결함성일 수 있다. 즉, BRCA1 및/또는 BRCA2의 발현 및/또는 활성은 예를 들어 암호화 핵산의 돌연변이 또는 다형성에 의해, 또는 조절 인자를 암호화하는 유전자, 예를 들어 BRCA2 조절 인자를 암호화하는 EMSY 유전자의 증폭, 돌연변이 또는 다형성에 의해 암세포에서 감소되거나 무효화될 수 있다(문헌[Hughes-Davies, et al., Cell, 115, 523-535]). BRCA1 및 BRCA2는 이형접합 보인자의 종양에서 야생형 대립유전자가 빈번하게 손실되는 알려진 종양 억제자이다(문헌[Jasin M., Oncogene, 21(58), 8981-93 (2002)]; 문헌[Tutt, et al., Trends Mol Med., 8 (12), 571-6, (2002)]). BRCA1 및/또는 BRCA2 돌연변이와 유방암의 연관성은 당업계에 잘 특성화되어 있다(문헌[Radice, P.J., Exp Clin Cancer Res., 21(3 Suppl), 9-12 (2002)]). BRCA2 결합 인자를 암호화하는 EMSY 유전자의 증폭은 유방암 및 난소암과 관련이 있는 것으로도 알려져 있다. 또한 BRCA1 및/또는 BRCA2의 돌연변이 보인자는 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 혈액암, 위장암 및 폐암을 포함한 특정 암의 위험도가 상승된다. 일부 실시 형태에서, 개체는 BRCA1 및/또는 BRCA2 또는 이의 조절자의 돌연변이 및 다형성과 같은 하나 이상의 변이에 대해 이형접합성이다. BRCA1 및 BRCA2의 변이의 검출은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 EP 699 754, EP 705 903, 문헌[Neuhausen, S.L. and Ostrander, E.A., Genet. Test, 1, 75-83 (1992)]; 문헌[Chappnis, P.O. and Foulkes, W.O., Cancer Treat Res, 107, 29-59 (2002)]; 문헌[Janatova M., et al., Neoplasma, 50(4), 246-505 (2003)]; 문헌[Jancarkova, N., Ceska Gynekol., 68{1), 11-6 (2003)]에 기술되어 있다. BRCA2 결합 인자 EMSY의 증폭의 결정은 문헌[Hughes-Davies, et al., Cell, 115, 523-535]에 기술되어 있다.
암과 관련된 돌연변이 및 다형성은 변이형 핵산 서열의 존재를 검출함으로써 핵산 수준에서, 또는 변이형(즉, 돌연변이형 또는 대립유전자 변이형) 폴리펩티드의 존재를 검출함으로써 단백질 수준에서 검출될 수 있다.
본 발명의 제약 제품은 적어도 하나의 제약상 적합한 성분을 함유하여 투여될 수 있다. 제약상 적합한 성분은 본 발명에서 사용되는 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제의 투여량, 투여 농도 등에 따라 당업계에서 일반적으로 사용되는 제형 첨가제 등으로부터 적합하게 선택되고 적용될 수 있다. 본 발명에 사용되는 항-HER2 항체-약물 접합체는, 예를 들어, 히스티딘 완충액과 같은 완충액, 수크로스 및 트레할로스와 같은 비히클, 및 폴리소르베이트 80 및 20과 같은 계면활성제를 함유하는 제약 제품으로서 투여될 수 있다. 본 발명에 사용되는 항체-약물 접합체를 함유하는 제약 제품은 바람직하게는 주사제로 사용될 수 있으며, 더 바람직하게는 수성 주사제 또는 동결건조 주사제로 사용될 수 있고, 더욱 더 바람직하게는 동결건조 주사제로 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항-HER2 항체-약물 접합체를 함유하는 제약 제품이 수성 주사제인 경우, 수성 주사제는 바람직하게는 적합한 희석제로 희석된 다음 정맥내 주입으로 투여될 수 있다. 희석제의 예에는 덱스트로스 용액 및 생리 식염수가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 덱스트로스 용액이 예시될 수 있고, 더 바람직하게는 5% 덱스트로스 용액이 예시될 수 있다. 본 발명의 제약 제품이 동결건조 주사제인 경우, 바람직하게는, 필요량의 동결건조 주사제를 주사용수에 미리 용해시킨 것을 적합한 희석제로 희석하여 정맥내 주입으로 투여한다. 희석제의 예에는 덱스트로스 용액 및 생리 식염수가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 덱스트로스 용액이 예시될 수 있고, 더 바람직하게는 5% 덱스트로스 용액이 예시될 수 있다.
본 발명의 제약 제품의 투여에 적용가능한 투여 경로의 예에는 정맥내, 피내, 피하, 근육내, 및 복강내 경로가 포함될 수 있으며, 정맥내 경로가 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 항-HER2 항체-약물 접합체는 인간에게 1 내지 180일의 간격으로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 1주, 2주, 3주 또는 4주의 간격으로 투여될 수 있고, 더 바람직하게는 3주의 간격으로 투여될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항-HER2 항체-약물 접합체는 투여당 약 0.001 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 투여당 0.8 내지 12.4 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-HER2 항체-약물 접합체는 0.8 mg/kg, 1.6 mg/kg, 3.2 mg/kg, 5.4 mg/kg, 6.4 mg/kg, 7.4 mg/kg, 또는 8 mg/kg의 용량으로 3주마다 1회 투여될 수 있으며, 바람직하게는 5.4 mg/kg 또는 6.4 mg/kg의 용량으로 3주마다 1회 투여될 수 있다.
PARP1 선택적 억제제는 임의의 적합한 투여 경로에 의해 적합한 용량으로 투여될 수 있다. 특정 질환 상태의 치료적 처치를 위해 요구되는 용량의 크기는 반드시 치료받는 대상체, 투여 경로 및 치료되는 병의 중증도에 따라 변화될 것이다. 투여 경로 및 투약 요법에 대한 추가 정보에 대해서는, 문헌[Chapter 25.3 in Volume 5 of Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990]을 참조할 수 있다.
화학식 I의 화합물, 또는 이의 제약상 허용가능한 염은 보통 제약상 허용가능한 투여 형태로, 활성 성분 또는 이의 제약상 허용가능한 염 또는 용매화물, 또는 이러한 염의 용매화물을 포함하는 제약 제제의 형태로, 경구 경로를 통해 투여될 것이다. 치료할 장애 및 환자에 따라, 조성물은 다양한 용량으로 투여될 수 있다.
상기에 기술된 화학식 I의 화합물의 제약 제형은 특히 정제 또는 캡슐의 형태로, 그리고 특히 결장-표적화 약물 방출을 제공하는 것을 목표로 하는 기술을 포함하는 경구 투여용으로 제조될 수 있다(문헌[Patel, M. M. Expert Opin. Drug Deliv. 2011, 8 (10), 1247-1258]).
상기에 기술된 화학식 I의 화합물의 제약 제형은 단위 투여 형태로 편리하게 투여될 수 있으며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985)]에 기술된 바와 같은, 제약 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
경구 투여에 적합한 화학식 I의 화합물의 제약 제형은 하나 이상의 생리학적으로 상용성인 담체들 및/또는 부형제들을 포함할 수 있고 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 정제 및 캡슐은 결합제, 충전제, 활택제, 및/또는 계면활성제, 예컨대 소듐 라우릴 술페이트를 이용하여 제조될 수 있다. 액체 조성물은 현탁제, 유화제 및/또는 방부제와 같은 통상적인 첨가제를 함유할 수 있다. 액체 조성물은 단위 투여 형태를 제공하기 위해 예를 들어 젤라틴에 캡슐화될 수 있다. 고체 경구 투여 형태는 정제, 투-피스(two-piece) 경질 쉘 캡슐 및 연질 탄성 젤라틴(SEG) 캡슐을 포함한다. 투-피스 경질 쉘 캡슐은 예를 들어 화학식 I의 화합물을 젤라틴 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC) 쉘에 충전함으로써 제조될 수 있다.
화학식 I의 화합물의 건식 쉘 제형은 전형적으로 약 40% 내지 60%(w/w) 농도의 젤라틴, 약 20% 내지 30% 농도의 가소제(예컨대 글리세린, 소르비톨 또는 프로필렌 글리콜) 및 약 30% 내지 40% 농도의 물을 포함한다. 방부제, 염료, 유백제 및 착향제와 같은 다른 재료도 존재할 수 있다. 액체 충전 재료는 (밀랍, 수소화 피마자유 또는 폴리에틸렌 글리콜 4000과 같은 현탁제를 사용하여) 용해, 가용화 또는 분산된 고체 약물 또는 광유, 식물유, 트리글리세리드, 글리콜, 폴리올 및 표면 활성제와 같은 비히클들의 조합 또는 비히클 중 액체 약물을 포함한다.
인간의 치료적 처치에서 화학식 I의 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염의 적합한 1일 용량은 체중 1 kg당 약 0.0001 내지 100 mg이다. 경구 제형, 특히 0.1 mg 내지 1000 mg의 범위의 활성 화합물의 용량을 제공하도록 당업자에게 공지된 방법에 의해 제형화될 수 있는 정제 또는 캡슐이 바람직하다.
[실시예]
본 발명은 하기에 나타낸 실시예를 고려하여 구체적으로 기술된다. 그러나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 또한, 제한적으로 해석되어서는 안 된다.
PARP1 선택적 억제제의 합성예
PARP1 선택적 억제제의 후술되는 합성예 1 내지 32는 WO2021/013735의 실시예 1 내지 32에 기술된 것과 같다.
일반적인 실험 조건
달리 나타내지 않는 한 27℃에서 Bruker 300 MHz, 400 MHz 또는 500 MHz 분광계를 사용하여 1H NMR 스펙트럼을 얻었으며; 화학적 이동은 백만분율(ppm, δ 단위)로 표시되고 용매의 잔존 모노-1H 동위 원소를 참조한다(CHCl3: 7.24 ppm; CHDCl2: 5.32 ppm; CD3S(=O)CD2H: 2.49 ppm). 커플링 상수는 헤르츠(Hz) 단위로 주어진다. 분할 패턴은 명백한 다중성을 설명하고, s(단일선), d(이중선), t(삼중선), q(사중선), m(다중선) 및 br s(브로드 단일선)로 표기된다. Waters SQD 질량 분석기가 장착된 Waters UPLC 또는 Shimadzu 2020 질량 분석기가 장착된 Shimadzu LC-20AD LC-20XR LC-30AD를 사용하여 LC-MS를 수행하였다. 달리 나타내지 않는 한, 보고된 분자 이온은 [M+H]+에 상응하고; 다수의 동위 원소 패턴을 갖는 분자의 경우(Br, Cl 등) 달리 명시되지 않는 한 보고된 값은 가장 낮은 동위 원소 질량에 대해 얻어진 것이다.
플래시 크로마토그래피는, 표준 플래시 크로마토그래피 또는 C18-플래시 컬럼을 이용하는, Agela로부터의 Flash Column 실리카-CS 컬럼, 순상 실리카 FLASH+TM(40M, 25M 또는 12 M) 또는 SNAPTM KP-Sil 카트리지(340, 100, 50 또는 10)를 사용하는 Thermo Fisher로부터의 Gilson 시스템에서 또는 ISCO로부터의 CombiFlash®Rf, BiotageTM로부터의 SP1TM 정제 시스템에서, 직선상 플래시 크로마토그래피를 사용하여 수행되었다. 일반적으로, 사용된 모든 용매는 구매가능하고 분석 등급이었다. 무수 용매를 일상적으로 반응에 사용하였다. 실시예에 사용된 상 분리기(Phase Separator)는 ISOLUTE® 상 분리 컬럼이다. 하기에 명명된 중간체 및 실시예는 Advanced Chemistry Development, Inc.(ACD/Labs)의 ACD/Name 12.01을 사용하여 명명되었다. 출발 물질을 상업적 공급처로부터 획득하거나 문헌의 경로를 통해 제조하였다.
X선 분말 회절(XRPD) 분석
Bruker AXS Inc™(미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터 구매가능한 Bruker D8 회절계를 사용하여 XRPD 분석을 수행하였다. 분석용 재료의 샘플(대략 10 mg)을 단결정 규소 웨이퍼 마운트(single silicon crystal wafer mount; 예를 들어, Bruker 실리콘 제로 배경 X선 회절 샘플 홀더) 상에 장착하고, 현미경 슬라이드를 이용하여 샘플을 박층 내로 확산시킴으로써 XRPD 스펙트럼을 얻었다. 샘플을 (계수 통계를 개선하기 위해) 분당 30회전으로 스핀하고, 1.5406 옹스트롬(즉, 약 1.54 옹스트롬)의 파장으로 40 kV 및 40 mA에서 작동되는 구리 장미세 초점 튜브에 의해 생성되는 X선을 조사하였다. 샘플을 세타-세타 모드(theta-theta mode)로 5도 내지 40도 2-세타의 범위에 걸쳐 0.02도 2-세타 증분(연속 스캔 모드)당 1초 동안 노출시켰다. 실행 시간은 D8에 있어서 대략 15분이었다.
XRPD 2θ 값은 합리적인 범위, 예를 들어 ±0.2°의 범위 내에서 달라질 수 있으며, 예를 들어 우선 배향(preferred orientation)을 포함한 다양한 이유로 인해 본질적으로 동일한 결정 형태에 대해 측정할 때 그러한 XRPD 강도가 달라질 수 있다. XRPD의 원리는 간행물, 예를 들어, 문헌[Giacovazzo, C. et al. (1995), Fundamentals of Crystallography, Oxford University Press]; 문헌[Jenkins, R. and Snyder, R. L. (1996), Introduction to X-Ray Powder Diffractometry, John Wiley & Sons, New York]; 및 문헌[Klug, H. P. & Alexander, L. E. (1974), X-ray Diffraction Procedures, John Wiley and Sons, New York]에 기술되어 있다.
DSC 분석
DSC 분석은 TA INSTRUMENTS®(미국 델라웨어주 뉴 캐슬 소재)로부터 입수가능한 Q SERIES™ Q1000 DSC 열량측정계를 사용하여 표준 방법에 따라 제조된 샘플에서 수행되었다. 샘플(대략 2 mg)을 알루미늄 샘플 팬(sample pan) 내에 칭량하여 넣고, DSC로 옮겼다. 기기를 50 mL/분으로 질소로 퍼징하였고 데이터를 10℃/분의 동적 가열 속도를 이용하여 22℃ 내지 300℃에서 수집하였다. 표준 소프트웨어, 예를 들어 TA INSTRUMENTS®로부터의 Universal v.4.5A를 사용하여 열 데이터를 분석하였다.
하기 약어를 사용하였다: AcOH = 아세트산; aq = 수성; BAST = 비스(2-메톡시에틸)아미노설퍼 트리플루오라이드 ; Boc2O = 디-tert-부틸 데카르보네이트; Boc = t-부틸옥시카르보닐; CDCl3 = 중수소화 클로로포름; CD3OD = 중수소화 메탄올; CH3NO2 = 니트로메탄; DCE = 1,2-디클로로에탄; DCM = 디클로로메탄; DEA = 디에틸아민; DEAD = 디에틸 아조디카르복실레이트; 데스-마틴(Dess-martin) 퍼요오디난 = 1,1,1-트리스(아세틸옥시)-1,1-디히드로-1,2-벤즈요오독솔-3-(1H)-온; DIPEA = N,N-디이소프로필에틸아민; DMAP = 2,6-디메틸아미노피리딘; DMF = N,N-디메틸포름아미드; DMSO = 디메틸술폭시드; DMSO-d6 = 중수소화 디메틸술폭시드; DPPA = 디페닐 포스포르아지데이트; dppf = 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센; DIAD = 디-이소프로필 (E)-디아젠-1,2-디카르복실레이트; DSC = 시차 주사 열량 측정법; DTAD = 디-tert-부틸 (E)-디아젠-1,2-디카르복실레이트; ee = 거울상 이성질체 과잉률; eq. = 당량; ESI = 전자분무 이온화; Et2O = 디에틸 에테르; EtOAc 또는 EA =에틸아세테이트; EtOH = 에탄올; FA = 포름산; 그럽스 촉매(Grubbs catalyst)(1,3-디메시틸이미다졸린-2-일리덴)(트리시클로헥실포스핀)루테늄 디클로라이드; h = 시간; HATU = (디메틸아미노)-N,N-디메틸(3-옥시도-1H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리디닐)메탄이미늄 헥사플루오로포스페이트; HCl = 염산; H2O2 = 과산화수소; HP = 고압; IPA = 이소프로필알코올; LC = 액체 크로마토그래피; LiClO4 = 과염소산리튬; mmol = 밀리몰; mCPBA = 메타-클로로퍼옥시벤조산; MeOH = 메탄올; min = 분; MeCN 또는 CH3CN = 아세토니트릴; MeNO2 = 니트로메탄; MS = 질량 분석법; NMP = N-메틸-2-피롤리돈; NMR = 핵 자기 공명; Pd/C = 탄소상 팔라듐; Pd2dba3 = 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐 (0); PdCl2(dppf) = 1,1'-비스(디-tert-부틸포스피노)페로센 팔라듐 디클로라이드; PE = 석유 에테르; PPh3 = 트리페닐포스핀; rt = 실온; Rt 또는 RT = 체류 시간; Ruphos Pd G3 = (2-디시클로헥실포스피노-2',6'-디이소프로폭시-1,1'-바이페닐)[2-(2'-아미노-1,1'바이페닐)]팔라듐(II) 메탄술포네이트; sat = 포화; SFC = 초임계 유체 크로마토그래피; T3P = 2,4,6-트리프로필-1,3,5,2,4,6-트리옥사트리포스피난 2,4,6-트리옥시드; TBTU = 2-(1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸이소우로늄 테트라플루오로보레이트; TFA = 트리플루오로아세트산; THF = 테트라히드로푸란; TLC = 박층 크로마토그래피; TMS = 트리메틸실릴; Xantphos = 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸잔텐; CBr4 = 사브롬화탄소; HCl = 염산; HBr = 브롬화수소산; Cs2CO3 = 탄산세슘; MgSO4 = 황산마그네슘; NaHCO3 = 중탄산나트륨; DDQ = 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논; SOCl2 = 티오닐 클로라이드; DIBAL-H = 디이소부틸알루미늄 히드라이드; NH4HCO3 = 중탄산암모늄; BINAP = 2,2'-비스(디페닐포스피노)-1,1'-바이나프틸.
출발 물질 및 중간체의 합성
Figure pct00022
중간체 2: 7-브로모-3-에틸-1H-1,6-나프티리딘-2-온
부티릴 클로라이드 (0.143 mL, 1.37 mmol)를 0℃의 CH2Cl2 (5 mL) 중 4-아미노-6-브로모-피리딘-3-카르브알데히드 (중간체 1 250 mg, 1.24 mmol), DIPEA (1.086 mL, 6.22 mmol) 및 DMAP (30.4 mg, 0.25 mmol)의 교반 용액에 적가하였다. 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반시켰다. 추가의 2 당량의 부티릴 클로라이드를 첨가하고, 반응을 추가 24시간 동안 계속하였다. 반응물을 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 농축시켜 조 생성물을 제공하였다. 1.5 mL의 MeOH를 첨가하고, 고체 (생성물)를 여과 제거하고, 1 mL의 MeOH로 세척하여 7-브로모-3-에틸-1H-1,6-나프티리딘-2-온 (중간체 2, 167 mg, 53.1%)을 백색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d6) 1.17 (3H, t), 2.45 - 2.50 (2H, m, 용매 DMSO 피크와 겹칩), 7.35 (1H, s), 7.82 (1H, s), 8.63 (1H, s), 12.09 (1H, br s) ; m/z (ES+) [M+H]+ = 252.
중간체 3: 3-에틸-7-비닐-1H-1,6-나프티리딘-2-온
PdCl2(dppf) (37.6 mg, 0.05 mmol)를 1,4-디옥산 (4 mL)/ 물 (1.333 mL) 중 7-브로모-3-에틸-1H-1,6-나프티리딘-2-온 (중간체 2, 130 mg, 0.51 mmol), 4,4,5,5-테트라메틸-2-비닐-1,3,2-디옥사보롤란 (0.105 mL, 0.62 mmol) 및 K2CO3 (213 mg, 1.54 mmol)의 교반 혼합물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 90℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 농축시켜 조 생성물을 제공하였다. 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, DCM 중 0~20% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 건조상태까지 농축시켜 3-에틸-7-비닐-1H-1,6-나프티리딘-2-온 (중간체 3, 93 mg, 90%)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6) 1.18 (3H, t), 2.53 (2H, m, 용매 DMSO 피크와 겹침), 5.49 (1H, dd), 6.27 (1H, dd), 6.84 (1H, dd), 7.15 (1H, s), 7.81 (1H, s), 8.78 (1H, s), 12.00 (1H, br s) ; m/z (ES+) [M+H]+ = 201.
중간체 4 : 3-에틸-2-옥소-1H-1,6-나프티리딘-7-카르브알데히드
H2O 중 사산화오스뮴 (0.024 mL, 3.00 μmol)을 THF (1 mL)/물 (0.200 mL) 중 3-에틸-7-비닐-1H-1,6-나프티리딘-2-온 (중간체 3, 30 mg, 0.15 mmol), 2,6-루티딘 (0.035 mL, 0.30 mmol) 및 과요오드산나트륨 (128 mg, 0.60 mmol)의 용액에 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응물을 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 여과액을 건조상태까지 농축시켰다. 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, DCM 중 0 내지 15% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 농축시켜 3-에틸-2-옥소-1H-1,6-나프티리딘-7-카르브알데히드 (중간체 4, 24.00 mg, 79%)를 연한 황색 폼으로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6) 1.20 (3H, t), 2.55 - 2.62 (2H, m, 용매 DMSO 피크와 겹침), 7.73 (1H, s), 7.95 (1H, s), 9.03 (1H, s), 10.00 (1H, s), 12.32 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 203.
중간체 5: 3-에틸-7-(히드록시메틸)-1H-1,6-나프티리딘-2-온
소듐 보로히드라이드 (61.4 mg, 1.62 mmol)를 0℃의 메탄올 (2 mL) 중 3-에틸-2-옥소-1H-1,6-나프티리딘-7-카르브알데히드 (중간체 4, 82 mg, 0.41 mmol)의 교반 용액에 서서히 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 메탄올을 진공 하에 제거하고, 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, DCM 중 0~35% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 농축시켜 3-에틸-7-(히드록시메틸)-1H-1,6-나프티리딘-2-온 (중간체 5, 68.0 mg, 82%)을 담황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (500MHz, DMSO-d6) 1.18 (3H, t), 2.52 - 2.55 (2H, m, 용매 DMSO 피크와 겹침), 4.59 (2H, br s), 5.52 (1H, br s), 7.33 (1H, s), 7.80 (1H, s), 8.71 (1H, s), 12.01 (1H, br s) ; m/z (ES+) [M+H]+ = 205.
중간체 6 : 7-(브로모메틸)-3-에틸-1H-1,6-나프티리딘-2-온
CBr4 (928 mg, 2.80 mmol)를 0℃의 CH2Cl2 (18.656 ml) 중 3-에틸-7-(히드록시메틸)-1H-1,6-나프티리딘-2-온 (중간체 5, 381 mg, 1.87 mmol) 및 트리페닐포스핀 (734 mg, 2.80 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 생성된 용액을 0℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응물을 농축시키고, 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, DCM 중 0~15% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 농축시켜 7-(브로모메틸)-3-에틸-1H-1,6-나프티리딘-2-온 (중간체 6, 386 mg, 77%)을 백색 고체로서 제공하였다 (트리페닐 포스핀 옥시드를 함유함, 분리하기 어려움). 이 화합물을 추가 정제 없이 다음 단계에 적용하였다.
m/z (ES+) [M]+ = 267.
합성예 1 : 5-[4-[(3-에틸-2-옥소-1H-1,6-나프티리딘-7-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00023
DIPEA (0.059 mL, 0.34 mmol)를 20℃의 아세토니트릴 (1 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-에틸-1H-1,6-나프티리딘-2-온 (중간체 6, 30 mg, 0.11 mmol) 및 N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 13, 42.8 mg, 0.15 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 70℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하고, 생성된 조 물질을 추가로 역상 크로마토그래피 (RediSep Rf Gold® C18, 물 (첨가제로서 0.1% NH4OH) 중 0~90% 아세토니트릴)로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 건조상태까지 농축시켜 5-[4-[(3-에틸-2-옥소-1H-1,6-나프티리딘-7-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 1, 23.60 mg, 51.7%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (500MHz, DMSO-d6) 1.18 (3H, br t), 2.54 (2H, m, 용매 DMSO 피크와 겹침), 2.67 (4H, br s), 2.79 (3H, br d), 3.38 (4H, br s), 3.75 (2H, br s), 7.34 (1H, s), 7.42 (1H, br dd), 7.77 - 7.88 (2H, m), 8.29 (1H, br d), 8.40 (1H, br d), 8.75 (1H, s), 11.60 - 12.11 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 407.
합성예 2: 5-[4-[(3-에틸-2-옥소-1H-1,6-나프티리딘-7-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00024
DIPEA (0.082 mL, 0.47 mmol)를 20℃의 아세토니트릴 (2 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-에틸-1H-1,6-나프티리딘-2-온 (중간체 6, 25 mg, 0.09 mmol) 및 6-플루오로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, HCl (중간체 23, 28.3 mg, 0.10 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 70℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, DCM 중 0~20% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 농축시켜 5-[4-[(3-에틸-2-옥소-1H-1,6-나프티리딘-7-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 2, 17.00 mg, 42.8%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (500MHz, DMSO-d6) 1.18 (3H, t), 2.52 - 2.55 (2H, m, 용매 DMSO 피크와 겹침), 2.64 (4H, br s), 2.77 (3H, d), 3.20 (4H, br s), 3.70 (2H, s), 7.32 (1H, s), 7.59 (1H, dd), 7.80 (1H, s), 7.86 (1H, d), 8.31 - 8.49 (1H, m), 8.73 (1H, s), 11.93 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 425.
합성예 3 : 6-클로로-5-[4-[(3-에틸-2-옥소-1H-1,6-나프티리딘-7-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00025
DIPEA (0.082 mL, 0.47 mmol)를 20℃의 아세토니트릴 (2 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-에틸-1H-1,6-나프티리딘-2-온 (중간체 6, 25 mg, 0.09 mmol) 및 6-클로로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 47, 33.7 mg, 0.10 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 생성된 용액을 70℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, DCM 중 0~20% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 농축시켜 6-클로로-5-[4-[(3-에틸-2-옥소-1H-1,6-나프티리딘-7-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 3, 19.20 mg, 46.5%)를 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (500MHz, DMSO-d6) 1.18 (3H, t), 2.53 (2H, m, 용매 DMSO 피크와 겹침), 2.66 (4H, br s), 2.80 (3H, d), 3.15 (4H, br s), 3.72 (2H, s), 7.33 (1H, s), 7.68 (1H, d), 7.81 (1H, s), 7.95 (1H, d), 8.43 (1H, br d), 8.74 (1H, s), 11.93 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 441.
Figure pct00026
중간체 8 : 에틸 6-포르밀-5-니트로-피리딘-3-카르복실레이트
1,4-디옥산 (50 mL) 중 에틸 6-메틸-5-니트로-피리딘-3-카르복실레이트 (중간체 7, 10 g, 47.58 mmol) 및 이산화셀레늄 (7.92 g, 71.36 mmol)의 혼합물을 110℃에서 20시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 셀라이트 패드를 통해 여과시키고, 셀라이트를 에틸 아세테이트로 세척하였다. 합한 여과액을 농축시키고, 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, 헥산 중 0~70% 에틸 아세테이트 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 농축시켜 에틸 6-포르밀-5-니트로-피리딘-3-카르복실레이트 (중간체 8, 9.70 g, 91%)를 갈색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.48 (3H, t), 4.54 (2H, q), 8.81 (1H, d), 9.51 (1H, d), 10.32 (1H, s); m/z (ES+) [M]+ = 224.
중간체 9 : 에틸 6-[(E)-2-에톡시카르보닐부트-1-에닐]-5-니트로-피리딘-3-카르복실레이트 (E/Z 이성질체 혼합물)
무수 THF (100 mL) 중 수소화나트륨 (9.63 g, 240.89 mmol) (광유 중 60%)의 교반 용액에 에틸 2-(디에톡시포스포릴)부타노에이트 (60.8 g, 240.89 mmol)를 0℃에서 첨가 깔때기로 적가하여 회색 혼합물을 제공하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반시키고, 10분에 걸쳐 실온까지 가온하고, 40℃에서 5분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 -78℃까지 냉각시키고, 그 후 이 냉각된 반응 혼합물에 THF 100 ml 중 에틸 6-포르밀-5-니트로-피리딘-3-카르복실레이트 (중간체 8, 22.5 g, 100.37 mmol)의 용액을 서서히 첨가하였다. 상기 혼합물을 포화 NH4Cl 용액으로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 소듐 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 조 생성물을 제공하였다. 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, 헥산 중 0~50% 에틸 아세테이트 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 농축시켜 에틸 6-[(E)-2-에톡시카르보닐부트-1-에닐]-5-니트로-피리딘-3-카르복실레이트 (중간체 9, 24.30 g, 75%)를 황색 오일로서 수득하였다 (1:1의, E/Z 이성질체 혼합물). 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.13 (3H, t), 1.18 (3H, t), 1.23 (3H, t), 1.37 (3H, t), 1.45 (6H, q), 2.57 (2H, qd), 2.66 (2H, q), 4.11 - 4.24 (2H, m), 4.32 (2H, q), 4.45 - 4.56 (4H, m), 7.08 (1H, s), 7.85 (1H, s), 8.86 (2H, dd), 9.26 (1H, d), 9.43 (1H, d); m/z (ES+) [M]+ = 322.
중간체 10 : 에틸 7-에틸-6-옥소-7,8-디히드로-5H-1,5-나프티리딘-3-카르복실레이트
에탄올 (30 mL) 중 에틸 6-[(E)-2-에톡시카르보닐부트-1-에닐]-5-니트로-피리딘-3-카르복실레이트 (1:1 E/Z 이성질체 혼합물) (중간체 9, 3.75 g, 11.63 mmol), Pd/C (1.857g, 1.75 mmol) (10%)의 혼합물을 탈기시키고, H2 (벌룬)를 충전시키고, 반응물을 H2 분위기 하에 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 상기 혼합물을 셀라이트층을 통해 여과시키고, 셀라이트층을 에탄올로 세척하였다. 농축 후, 디옥산 중 4 M HCl (15 ml)을 생성된 잔사에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 에테르로 희석시키고, 고체를 여과 제거하고, 디에틸 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 에틸 7-에틸-6-옥소-7,8-디히드로-5H-1,5-나프티리딘-3-카르복실레이트 (중간체 10, 2.260 g, 78%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 0.94 (3H, t), 1.33 (3H, t), 1.41 - 1.51 (1H, m), 1.69 - 1.81 (1H, m), 2.41 - 2.48 (1H, m), 2.94 (1H, dd), 3.20 (1H, dd), 4.35 (2H, t), 7.67 (1H, d), 8.61 (1H, d), 10.32 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 249.
중간체 11 : 에틸 7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-카르복실레이트
에틸 7-에틸-6-옥소-7,8-디히드로-5H-1,5-나프티리딘-3-카르복실레이트 (중간체 10, 2.26 g, 9.10 mmol)를 1,4-디옥산 (40 mL)에 용해시키고, DDQ (2.273 g, 10.01 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 환류에서 3시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고, 포화 NaHCO3 용액을 첨가하고, 잔사를 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 고체를 여과 제거하고, 물, 이어서 10 ml의 디에틸 에테르로 세척하였다. 생성된 고체를 진공 하에 건조시켜 에틸 7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-카르복실레이트 (중간체 11, 1.738 g, 78%)를 연한 갈색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.14 - 1.28 (3H, m), 1.35 (3H, t), 2.58 (2H, q), 4.38 (2H, q), 7.83 (1H, s), 8.17 (1H, s), 8.90 (1H, s), 12.05 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 247.
중간체 12 : 3-에틸-7-(히드록시메틸)-1H-1,5-나프티리딘-2-온
THF 중 2 M 수소화알루미늄리튬 (29.2 mL, 58.47 mmol)을 질소 하에 0℃에서 45분의 기간에 걸쳐 테트라히드로푸란 (150 mL) 중 에틸 7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-카르복실레이트 (중간체 11, 7.2 g, 29.24 mmol)에 적가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 1.5시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 1 M 수성 HCl (29 mL)의 적가에 의해 켄칭하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 고체를 물 (대략 150 ml)로 희석시키고, 29 ml의 1 M HCl 용액에 의해 황색 현탁물을 제공하였다. 고체를 여과로 수집하고, 물, 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켜 조 생성물을 황색 고체로서 수득하였다 (일부 무기 염에 의해 오염됨). 이 고체를 메탄올과 DCM (2:1)의 혼합물 (400 ml)에 현탁시키고, 가열 환류시켰다. 고체를 여과 제거하였다. 이 고체를 메탄올/DCM 혼합물에 재현탁시키고, 이 절차를 5회 반복하여 이 혼합물로부터 대부분의 생성물을 얻었다. 그 후, 합한 여과액을 약 100 ml이 될 때까지 농축시키고, 고체를 여과로 수집하고, 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 3-에틸-7-(히드록시메틸)-1H-1,5-나프티리딘-2-온 (중간체 12, 4.35 g, 72.8%)을 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.18 (3H, t), 2.52 - 2.56 (2H, m), 4.61 (2H, d), 5.44 (1H, t), 7.61 (1H, s), 7.74 (1H, s), 8.37 (1H, s), 11.87 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 205.3.
합성예 4 : 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00027
티오닐 클로라이드 (6.41 mL, 88.14 mmol)를 0℃의 CH2Cl2 (60 mL) 중 3-에틸-7-(히드록시메틸)-1,5-나프티리딘-2(1H)-온 (중간체 12, 3 g, 14.69 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 (0.114 mL, 1.47 mmol)의 현탁물에 적가하고, 생성된 용액을 실온에서 6시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 건조상태까지 농축시켜 조 7-(클로로메틸)-3-에틸-1H-1,5-나프티리딘-2-온 (중간체 17)을 제공하였다.
DIPEA (12.83 mL, 73.45 mmol)를 20℃의 아세토니트릴 (50.00 mL) 중 7-(클로로메틸)-3-에틸-1H-1,5-나프티리딘-2-온 (중간체 17, 상기로부터의 조 물질), 요오드화칼륨 (0.488 g, 2.94 mmol) 및 N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 13, 4.31 g, 14.69 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 80℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 물질을 물로 희석시키고, NaHCO3 수용액으로 염기성화하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 농축시켜 조 생성물을 제공하였다. 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, DCM 중 0 내지 15% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 농축시켜 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 4, 3.93 g, 65.8%)를 황백색(off white) 부분 결정성 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500MHz, DMSO-d6) 1.19 (3H, t), 2.53 - 2.59 (6H, m), 2.79 (3H, d), 3.33 - 3.39 (4H, m), 3.66 (2H, s), 7.39 (1H, dd), 7.64 (1H, s), 7.76 (1H, s), 7.83 (1H, d), 8.27 (1H, d), 8.36 - 8.40 (1H, m), 8.41 (1H, d), 11.85 (1H, s); m/z (ES+) [M]+ = 406.
Figure pct00028
중간체 14 : 7-(브로모메틸)-3-에틸-1H-1,5-나프티리딘-2-온
CBr4 (219 mg, 0.66 mmol)를 0℃의 CH2Cl2 (4 mL) 중 3-에틸-7-(히드록시메틸)-1H-1,5-나프티리딘-2-온 (중간체 12, 90 mg, 0.44 mmol) 및 트리페닐포스핀 (173 mg, 0.66 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 0℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응물을 진공 하에 농축시키고, 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, DCM 중 0~15% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 농축시켜 7-(브로모메틸)-3-에틸-1H-1,5-나프티리딘-2-온 (중간체 14, 84 mg, 71.4%) (트리페닐 포스핀 옥시드를 함유함, 분리하기 어려움)을 수득하였다. 이 화합물을 추가 정제 없이 다음 단계에 적용하였다.
m/z (ES+) [M]+ = 267.
합성예 5 : 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00029
DIPEA (0.082 mL, 0.47 mmol)를 20℃의 아세토니트릴 (2 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-에틸-1H-1,5-나프티리딘-2-온 (중간체 14, 25 mg, 0.09 mmol) 및 6-플루오로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 23, 32.0 mg, 0.10 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 70℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, DCM 중 0~20% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 농축시켜 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 5, 13.00 mg, 33%) (담황색 고체)를 수득하였다. 1H NMR (500MHz, DMSO-d6) 1.19 (3H, t), 2.55 (2H, m, 용매 DMSO 피크와 겹침), 2.58 (4H, br d), 2.77 (3H, d), 3.19 (4H, br s), 3.67 (2H, s), 7.57 (1H, dd), 7.63 (1H, s), 7.76 (1H, s), 7.85 (1H, d), 8.32 - 8.49 (2H, m), 11.85 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 425.
합성예 6 : 6-클로로-5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00030
DIPEA (0.082 mL, 0.47 mmol)를 20℃의 아세토니트릴 (2 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-에틸-1H-1,5-나프티리딘-2-온 (중간체 14, 25 mg, 0.09 mmol) 및 6-클로로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 48, 26.2 mg, 0.10 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 70℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, DCM 중 0~20% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 농축시켜 6-클로로-5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 6, 19.80 mg, 48.0%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500MHz, DMSO-d6) 1.19 (3H, t), 2.55 (2H, m, 용매 DMSO 피크와 겹침), 2.58 - 2.65 (4H, m), 2.79 (3H, d), 3.13 (4H, br s), 3.68 (2H, s), 7.63 (1H, d), 7.67 (1H, d), 7.76 (1H, s), 7.94 (1H, d), 8.34 - 8.50 (2H, m), 11.85 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 441.
Figure pct00031
중간체 16 : 메틸 5-피페라진-1-일피리딘-2-카르복실레이트
디옥산 중 HCl (4.67 mL, 18.67 mmol)을 MeOH (1 mL) 중 tert-부틸 4-(6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 15, 600 mg, 1.87 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하여 메틸 5-피페라진-1-일피리딘-2-카르복실레이트, 2HCl (중간체 16, 543 mg, 99%)을 연한 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 3.20 (4H, br s), 3.71 (4H, br s), 3.85 (3H, s), 7.58 (1H, br d), 7.99 (1H, br d), 8.43 (1H, br s), 9.73 (2H, br), 11.29 - 11.75 (1H, br) ; m/z (ES+) [M+H]+ = 222.
중간체 18: 메틸 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복실레이트
DIPEA (944 μl, 5.40 mmol)를 20℃의 아세토니트릴 (6774 μl) 중 7-(클로로메틸)-3-에틸-1H-1,5-나프티리딘-2-온, HCl (중간체 17, 200 mg, 0.77 mmol), 요오드화나트륨 (11.57 mg, 0.08 mmol) 및 메틸 5-피페라진-1-일피리딘-2-카르복실레이트, 2HCl (중간체 16, 250 mg, 0.85 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 80℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하고, 0.4 mL의 포화 중탄산나트륨 용액 및 1.5 mL의 아세토니트릴을 첨가하고, 반응물을 10분 동안 교반시켰다. 고체를 여과 제거하고, 2 mL의 물, 이어서 1 mL의 아세토니트릴로 세척하여 메틸 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 18, 158 mg, 50.2%)를 황백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500MHz, DMSO-d6) 1.19 (3H, br t), 2.54 - 2.61 (6H, m), 3.40 (4H, br s), 3.66 (2H, s), 3.81 (3H, s), 7.35 (1H, br dd), 7.62 (1H, s), 7.75 (1H, s), 7.88 (1H, br d), 8.28 - 8.47 (2H, m), 12.03 (1H, br); m/z (ES+) [M+H]+ = 408.
합성예 7 : 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00032
메탄올 중 암모니아 (4 mL, 28.00 mmol)를 메틸 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 18, 60 mg, 0.15 mmol)에 첨가하고, 생성된 용액을 50℃까지 24시간 동안 가열하였다 (밀봉 튜브). 반응물을 실온까지 냉각시키고, 고체를 여과 제거하고, 2 mL의 메탄올로 세척하여 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 7, 88 mg, 90%)를 연한 갈색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500MHz, DMSO-d6) 1.19 (3H, t), 2.56 (6H, m, 용매 DMSO 피크와 겹침), 3.35 (4H, br d), 3.66 (2H, s), 7.30 (1H, br s), 7.40 (1H, dd), 7.64 (1H, s), 7.76 (2H, s), 7.85 (1H, d), 8.28 (1H, d), 8.41 (1H, d), 11.61 - 11.98 (1H, m) ; m/z (ES+) [M+H]+ = 393.
Figure pct00033
중간체 20: 메틸 5-브로모-6-플루오로-피리딘-2-카르복실레이트
오븐 건조 플라스크를 아세토니트릴 (60 mL) 중 메틸 5-브로모피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 19, 6 g, 27.77 mmol)로 충전시켰다. 플루오르화은 (II) (14.18 g, 97.21 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과지를 통해 여과시키고, DCM으로 세척하였다. 여과액을 농축시켜 연한 갈색 고체를 제공하였다. 잔사를 DCM과 포화 NH4Cl 용액의 혼합물에 현탁시키고, 백색 현탁물을 여과 제거하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM (100 ml x 2)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, 헥산 중 0~25% EtOAc 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 건조상태까지 농축시켜 메틸 5-브로모-6-플루오로-피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 20, 5.98 g, 수율: 90%)를 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 4.01 (3H, s), 7.93 (1H, d), 8.15 (1H, t); m/z (ES+) [M]+ = 234.
중간체 21: tert-부틸 4-(2-플루오로-6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트
1,4-디옥산 (200 mL) 중 tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트 (13.11 g, 70.41 mmol), 메틸 5-브로모-6-플루오로-피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 20,10.985 g, 46.94 mmol), RuphosPd-G3 (2.5 g, 2.99 mmol) 및 Cs2CO3 (38 g, 116.63 mmol)의 혼합물을 N2 하에 80℃에서 하룻밤 교반시켰다. 상기 혼합물을 물 및 에틸 아세테이트로 희석시키고, 층들을 분리하였다. 수성 층을 DCM (100 ml x 2)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, 헥산 중 0~100% EtOAc 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 건조상태까지 농축시켜 tert-부틸 4-(2-플루오로-6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 21,14.00 g, 88%)를 황색 고체로서 수득하였다; 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.51 (9H, s), 3.16 - 3.32 (4H, m), 3.58 - 3.72 (4H, m), 3.98 (3H, s), 7.29 - 7.34 (1H, m), 8.00 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 340.
중간체 22: tert-부틸 4-[2-플루오로-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트
메틸아민 (120 mL, 36.80 mmol, 에탄올 중 33 중량%) 중 tert-부틸 4-(2-플루오로-6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 21, 12.49 g, 36.80 mmol)를 실온에서 24시간 동안 교반시켰다 (밀봉 튜브). 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔사를 DCM에 용해시키고, 실리카 겔 베드를 통해 여과시키고, 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여과액을 농축시키고, 진공 하에 건조시켜 tert-부틸 4-[2-플루오로-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 22,12.45 g, 100%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.42 (9H, s), 2.77 (3H, d), 3.04 - 3.16 (4H, m), 3.43 - 3.56 (4H, m), 7.59 (1H, dd), 7.80 - 7.93 (1H, m), 8.41 (1H, q); m/z (ES+) [M+H]+ = 340.
중간체 23: 6-플루오로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드
HCl (디옥산 중 4 M, 100 ml, 400.00 mmol)을 0℃의 1,4-디옥산 (50 mL) 중 tert-부틸 4-[2-플루오로-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 22, 12.5 g, 36.94 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 5시간 동안 교반시키고, 그 동안 온도를 실온까지 가온시켜 황색 현탁물을 제공하였다. 상기 현탁물을 에테르로 희석시키고, 고체를 여과 제거하고, 에테르로 세척하였다. 이 고체를 진공 하에 건조시켜 6-플루오로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 23, 11.42 g, 99%)을 연한 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.8 (d, J=4.6 Hz, 3 H) 3.3 (br s, 4 H) 3.4 (br d, J=4.4 Hz, 4 H) 7.6 - 7.7 (m, 1 H) 7.9 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 8.4 (br d, J=4.4 Hz, 1 H) 9.0 - 9.3 (m, 2 H); m/z (ES+) [M+H]+ = 239
Figure pct00034
중간체 15: tert-부틸 4-(6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트
Ruphos Pd G3 (4.07 g, 4.86 mmol)를 1,4-디옥산 (200 mL) 중 메틸 5-브로모피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 19, 30 g, 138.87 mmol), tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트 (27.2 g, 145.81 mmol), Cs2CO3 (90 g, 277.73 mmol)의 탈기 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 N2 분위기 하에 110℃에서 6시간 동안 교반시켰다. 그 후 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트 (150 ml x 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시켰다. 이 여과액에 3-(디에틸렌트리아미노)프로필-작용화 실리카 겔 (12 g, 1.3 mmol/g의 로딩)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 여과시키고, 여과액을 대략 100 ml까지 농축시켰다. 결정성 황색 고체를 여과 제거하고, 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 tert-부틸 4-(6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 15, 26.36 g, 82 mmol, 59.1%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.50 (9H, s), 3.31 - 3.42 (4H, m), 3.56 - 3.68 (4H, m), 3.98 (3H, s), 8.04 (1H, d), 8.37 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 322.
중간체 24: tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트
메틸아민 (100 ml, 1155.26 mmol, 물 중 40%)을 MeOH (100 mL) 중 tert-부틸 4-(6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 15, 36 g, 112.02 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반시켜 백색 현탁물을 제공하였다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 포화 NH4Cl 용액과 DCM 사이에 분배하고, 층들을 분리하였다. 수성 층을 DCM으로 추출하고, 유기 층을 합하고, 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 24, 35.9 g, 100%)를 황색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.49 (9H, s), 3.02 (3H, d), 3.26 - 3.35 (4H, m), 3.58 - 3.67 (4H, m), 7.23 (1H, dd), 7.81 (1H, br d), 8.07 (1H, d), 8.16 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 321.
중간체 13: 카르복실레이트 N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드
HCl (디옥산 중 4 M, 150 ml, 600.00 mmol)을 MeOH (50 mL) 중 tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 24, 35.9 g, 112.05 mmol)의 현탁물에 첨가하고, 생성된 주황색 현탁물을 실온에서 4시간 동안 교반시켰다. 약 80 ml의 용매를 감압 하에 제거하고, 혼합물을 에테르 및 헥산 (200 ml, 1/1)으로 희석시켰다. 고체를 여과로 수집하고, 헥산으로 세척하고, 건조시키고, 진공 하에 건조시켜 N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl 염 (중간체 13, 37.0 g, 100%)을 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.79 (3H, d), 3.22 (4H, br s), 3.53 - 3.67 (4H, m), 7.51 (1H, dd), 7.91 (1H, d), 8.33 (1H, d), 8.50 (1H, br s), 9.19 - 9.49 (2H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 221
Figure pct00035
중간체 26: 메틸 4-(1-메톡시카르보닐프로필아미노)-3-니트로-벤조에이트
탄산수소나트륨 (27.0 g, 321.39 mmol)을 THF (100 mL) 중 메틸 4-플루오로-3-니트로벤조에이트 (중간체 25, 16 g, 80.35 mmol), 및 메틸 2-아미노부타노에이트, HCl (14.81 g, 96.42 mmol)의 교반 혼합물에 일부씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응물을 물의 첨가에 의해 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 포화 NaHCO3 수용액으로 세척하고, 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 건조상태까지 농축시켜 메틸 4-(1-메톡시카르보닐프로필아미노)-3-니트로-벤조에이트 (중간체 26, 22.86 g, 96%)를 밝은 황색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500MHz, DMSO-d6) 0.91 (3H, t), 1.75 - 2.12 (2H, m), 3.75 (3H, s), 3.85 (3H, s), 4.63 - 4.82 (1H, m), 7.15 (1H, d), 8.00 (1H, dd), 8.52 - 8.76 (2H, m).
중간체 27: 메틸 2-에틸-3-옥소-2,4-디히드로-1H-퀴녹살린-6-카르복실레이트
Pd/C (4.15 g, 3.90 mmol)를 MeOH (300 mL) 중 메틸 4-(1-메톡시카르보닐프로필아미노)-3-니트로-벤조에이트 (중간체 26, 23.1 g, 77.97 mmol)의 교반 용액에 일부씩 첨가하고, 생성된 슬러리를 H2 분위기 하에 실온에서 30시간 동안 교반시켰다. 메탄올을 진공 하에 제거하고, 150 mL의 DMF를 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 교반시켰다. 팔라듐 촉매를 셀라이트에서 여과 제거하고, 50 mL의 DMF로 세척하였다 (물질은 유기 용매, 예컨대 MeOH/DCM/EtOAc에서 매우 낮은 용해도를 갖는다). 여과액을 Genevac에서 농축시켜 메틸 2-에틸-3-옥소-2,4-디히드로-1H-퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 27, 15.80 g, 87%)를 회색 고체로서 제공하였다. 물질을 NMR로 분석하고, 정제 없이 다음 단계에 적용하였다. 1H NMR (500MHz, DMSO-d6) 0.91 (3H, t), 1.63 - 1.73 (2H, m), 3.75 (3H, s), 3.90 (1H, td), 6.71 (1H, d), 6.84 (1H, s), 7.33 (1H, d), 7.41 (1H, dd), 10.39 (1H, s); m/z (ES+) [M]+ = 235.
중간체 28: 메틸 2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르복실레이트
DDQ (15.87 g, 69.92 mmol)를 1,4-디옥산 (150 mL) 중 메틸 2-에틸-3-옥소-2,4-디히드로-1H-퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 27, 15.6 g, 66.59 mmol)의 현탁물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 상기 혼합물을 포화 NaHCO3 수용액 (대략 500 ml)에 서서히 첨가하고, 실온에서 20분 동안 교반시켰다. 침전물을 여과시키고, 물 (100 ml)로 세척하고, 건조시켜 메틸 2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르복실레이트를 황백색 고체로서 수득하였다 (중간체 28, 11.40 g, 73.7%). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.23 (3H, t), 2.83 (2H, q), 3.89 (3H, s), 7.73 - 7.86 (2H, m), 7.89 (1H, d), 12.45 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 233.
중간체 29: 3-에틸-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온
THF 중 2 M 수소화알루미늄리튬 (49.1 mL, 98.17 mmol)을 질소 분위기 하에 0℃에서 50분의 기간에 걸쳐 테트라히드로푸란 (350 mL) 중 메틸 2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 28, 11.4 g, 49.09 mmol)의 슬러리에 적가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 1.5시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 0℃에서 1 M 수성 HCl (300 mL)에 서서히 부었다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (대략 300 ml X 2)로 추출하고, 이어서 DCM/메탄올 (5:1) (150 ml x 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 300 ml까지 농축시키고, 에테르 (200 ml)로 희석시켜 현탁물을 제공하였다. 고체를 여과로 수집하고, 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 3-에틸-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 29, 8.00 g, 80%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.22 (3H, t), 2.80 (2H, q), 4.59 (2H, s), 5.19 - 5.61 (1H, m), 7.19 (1H, dd), 7.28 (1H, s), 7.66 (1H, d), 12.28 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 205.
중간체 30: 7-(브로모메틸)-3-에틸-1H-퀴녹살린-2-온
브롬화수소 (60 ml, 물 중 48 중량%)를 3-에틸-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 29, 7.8 g, 38.19 mmol)에 첨가하고 (투명 갈색 용액을 생성하고), 혼합물을 80℃에서 8시간 동안 교반시키고, 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 150 mL의 얼음물에 부어 황백색 침전물을 제공하였다. 고체를 진공 하에 여과시키고, 물, 이어서 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켜 7-(브로모메틸)-3-에틸-1H-퀴녹살린-2-온을 베이지색 고체 (중간체 30, 11.10 g, 84%)로서 80% 순도로 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.20 (3H, t), 2.79 (2H, q), 4.79 (2H, s), 7.27 - 7.38 (2H, m), 7.69 (1H, d), 12.34 (1H, br s); m/z (ES+) [M]+ = 267.0.
Figure pct00036
중간체 32: tert-부틸 4-(2-브로모-6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트
DMF (20 mL) 중 tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 31, 2.57 g, 13.80 mmol), 메틸 6-브로모-5-플루오로-피리딘-2-카르복실레이트 (1.9 g, 8.12 mmol) 및 탄산칼륨 (1.459 g, 10.55 mmol)의 혼합물을 110℃에서 5시간 동안 교반시켰으며, LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, DCM 및 물로 희석시키고, 층들을 분리하였다. 수층을 DCM으로 2회 추출하고, 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, 헥산 중 0~50% EtOAc 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 건조상태까지 농축시켜 tert-부틸 4-(2-브로모-6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 32, 2.200 g, 67.7%)를 연한 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.50 (9H, s), 3.05 - 3.20 (4H, m), 3.58 - 3.72 (4H, m), 3.98 (3H, s), 7.31 (1H, d), 8.06 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 400.
중간체 33: tert-부틸 4-[2-브로모-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트
밀봉 압력 용기를 tert-부틸 4-(2-브로모-6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 32, 2.2 g, 5.50 mmol) 및 메틸아민 (22 ml, 176.72 mmol) (에탄올 중 33 중량%)으로 충전시키고, 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 가열하고, LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 농축시키고, 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, 헥산 중 0~80% EtOAc 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 건조상태까지 농축시켜 tert-부틸 4-[2-브로모-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 33, 2.200 g, 100%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.50 (9H, s), 3.02 (3H, d), 3.05 - 3.14 (4H, m), 3.56 - 3.74 (4H, m), 7.36 (1H, d), 7.68 (1H, br d), 8.11 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 399.
중간체 34: tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-2-비닐-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트
1,4-디옥산 (5 ml) 중 tert-부틸 4-[2-브로모-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 33, 200 mg, 0.50 mmol), 트리부틸(비닐)스탄난 (0.161 ml, 0.55 mmol) 및 2세대 XPhos Pd 사이클 (19.71 mg, 0.03 mmol)의 혼합물을 N2 하에 100℃에서 2.5시간 동안 교반시켰으며, LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 DCM으로 희석시키고, 포화 NH4Cl로 세척하고, 유기 층을 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시켰다. 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, 헥산 중 0~80% EtOAc 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 건조상태까지 농축시켜 tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-2-비닐-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 34, 174 mg, 100%)를 백색 고체로서 수득하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 347
중간체 35: tert-부틸 4-[2-에틸-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트
Pd/C (53.5 mg, 0.05 mmol) (10 중량% 건조 기준, 습윤 로드)를 MeOH (6 mL) 중 tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-2-비닐-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 34, 174 mg, 0.50 mmol)의 용액에 첨가하였다. 플라스크를 탈기시키고, H2 (벌룬)로 재충전시켰다. 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. LCMS는 반응이 완료되지 않았음을 나타냈다. 추가의 Pd/C (53.5 mg, 0.05 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 H2 분위기 하에 실온에서 5시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과시키고, 메탄올로 세척하고, 여과액을 건조상태까지 농축시켜 tert-부틸 4-[2-에틸-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 35, 172 mg, 98%)를 무색 잔사로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.37 (3H, t), 1.51 (9H, s), 2.82 - 2.95 (6H, m), 3.05 (3H, d), 3.57 - 3.73 (4H, m), 7.39 (1H, d), 7.93 - 8.13 (2H, m); m/z (ES+) [M]+ = 348.
중간체 36: 6-에틸-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드
HCl (디옥산 중 4 M, 8 ml, 32.00 mmol) 중 tert-부틸 4-[2-에틸-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 35, 172 mg, 0.49 mmol)의 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켜 백색 현탁물을 제공하였다. 상기 혼합물을 에테르로 희석시키고, 고체를 여과 제거하고, 진공 하에 건조시켜 6-에틸-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 36, 159 mg, 100%)을 연한 황색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.31 (3H, t), 2.74 - 2.86 (5H, m), 3.00 - 3.14 (4H, m), 3.24 (4H, br s), 7.57 (1H, d), 7.82 (1H, d), 8.43 (1H, br d), 9.20 (2H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 249.
합성예 8: 6-에틸-5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00037
DIPEA (0.203 mL, 1.17 mmol)를 아세토니트릴 (3 mL) 중 6-에틸-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 36, 75 mg, 0.23 mmol) 및 7-(브로모메틸)-3-에틸-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 30, 69.3 mg, 0.23 mmol)의 현탁물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 3시간 동안 교반시켰으며, LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 농축시키고, 잔사를 Gilson 역상 컬럼 (0~95% ACN/물/0.1%TFA로 용출, 15분 실행, 5~9분에서 수집)에서 정제하였다. 생성물 함유 분획을 농축시키고, 그 후 잔사를 메탄올 및 DCM에 용해시켰다. 300 mg의 테트라알킬암모늄 카르보나이트, 중합체-결합된 것 (40~90 메쉬, 2.5~3.5 mmol/g), 및 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반시켰다. 그 후 상기 혼합물을 여과시키고, 메탄올로 세척하였다. 여과액을 농축시키고, 물/CAN의 혼합물에 재용해시키고, 이 혼합물을 건조상태까지 동결건조시켜 6-에틸-5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 8, 60.0 mg, 59.1%)를 연한 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.22 (3H, t), 1.30 (3H, t), 2.54 - 2.69 (2H, m), 2.72 - 2.86 (7H, m), 2.93 (4H, br s), 3.26 (2H, s), 3.64 (2H, s), 7.17 - 7.33 (2H, m), 7.52 (1H, d), 7.69 (1H, br d), 7.80 (1H, d), 8.40 (1H, br d), 12.25 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 435.
Figure pct00038
중간체 37: tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-2-(트리플루오로메틸)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트
DMF (2 mL) 중 플루오르화은(I) (176 mg, 1.39 mmol)의 잘 교반된 혼합물에, 트리메틸(트리플루오로메틸)실란 (0.247 mL, 1.67 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 상기 혼합물을 20분 동안 교반시키고, 이어서 구리 분말 (133 mg, 2.09 mmol)을 첨가하였다. 4시간 동안 교반시킨 후 반응 혼합물이 청색으로 변하였다 (CuCF3의 형성의 지표). tert-부틸 4-(2-브로모-6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 33, 150 mg, 0.38 mmol)를 상기 혼합물에 첨가하고, 생성된 짙은 혼합물을 90℃에서 18시간 동안 교반시켜 갈색 현탁물을 제공하였다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 고체를 여과 제거하였다. 여과액을 물로 세척하고, 이어서 염수로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, 헥산 중 0~70% EtOAc 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 건조상태까지 농축시켜 tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-2-(트리플루오로메틸)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 37, 146 mg, 100%)를 황색 잔사로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.50 (9H, s), 2.93 - 3.03 (4H, m), 3.05 (3H, d), 3.55 - 3.69 (4H, m), 7.71 (1H, d), 7.81 (1H, br d), 8.33 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 389.
중간체 38: N-메틸-5-피페라진-1-일-6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드
HCl (디옥산 중 4 M, 8 ml, 32.00 mmol) 중 tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-2-(트리플루오로메틸)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 37, 146 mg, 0.38 mmol)의 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 용매를 2 ml의 부피까지 농축시키고, 혼합물을 에테르/헥산 (15 ml, 5/1)으로 희석시켰다. 고체를 여과 제거하고, 진공 하에 건조시켜 N-메틸-5-피페라진-1-일-6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 38, 127 mg, 94%)을 분홍색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.83 (3H, d), 3.21 (8H, br s), 8.09 (1H, d), 8.23 (1H, d), 8.46 (1H, br d), 9.08 (2H, br d); m/z (ES+) [M+H]+ = 289.
합성예 9: 5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00039
DIPEA (0.121 mL, 0.69 mmol)를 아세토니트릴 (3 mL) 중 N-메틸-5-피페라진-1-일-6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 38, 50 mg, 0.14 mmol) 및 7-(브로모메틸)-3-에틸퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 30, 46.2 mg, 0.14 mmol)의 현탁물에 첨가하고, 상기 혼합물을 60℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 농축시키고, 잔사를 Gilson 역상 컬럼 (0~95% ACN/물/0.1%TFA로 용출)에서 정제하였다. 생성물 함유 분획을 실온에서 농축시켰다. 그 후 잔사를 메탄올 및 DCM에 용해시키고, 이어서 250 mg의 테트라알킬암모늄 카르보나이트 중합체-결합된 것 (40~90 메쉬, 2.5~3.5 mmol/g)을 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반시켰다. 그 후 고체를 여과 제거하고, 메탄올로 세척하고, 여과액을 농축시켜 고체를 제공하였다. 그 후 이 고체를 물/CH3CN의 혼합물에 재용해시키고, 건조상태까지 동결건조시켜 5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 9, 40.0 mg, 60.9%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.40 (3H, t), 2.70 (4H, br s), 2.98 - 3.08 (5H, m), 3.12 (4H, br s), 3.72 (2H, br s), 7.29 - 7.32 (1H, m), 7.37 (1H, dd), 7.74 (1H, d), 7.79 - 7.88 (2H, m), 8.33 (1H, d), 11.06 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 475.
Figure pct00040
중간체 39: tert-부틸 4-[2-포르밀-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트
H2O 중 사산화오스뮴 (0.050 mL, 6.35 μmol)을 THF (5 mL)/물 (1 mL)/ tert-부탄올 (0.304 mL, 3.18 mmol) 중 tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-2-비닐-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 34, 110 mg, 0.32 mmol), 2,6-루티딘 (0.074 mL, 0.64 mmol) 및 과요오드산나트륨 (272 mg, 1.27 mmol)의 용액에 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켜 황색 현탁물을 제공하였다. LCMS 및 TLC는 완전한 전환을 나타냈다. 반응물을 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 농축 후, 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, 헥산 중 0~100% EtOAc 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 건조상태까지 농축시켜 tert-부틸 4-[2-포르밀-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 39, 100 mg, 90%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.50 (9H, s), 3.07 (3H, d), 3.14 - 3.29 (4H, m), 3.66 - 3.79 (4H, m), 7.49 (1H, d), 7.86 (1H, br d), 8.28 (1H, d), 10.10 (1H, s). m/z (ES+) [M+H]+ = 349.
중간체 40: tert-부틸 4-[2-(디플루오로메틸)-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트
CH2Cl2 (2 mL) 중 tert-부틸 4-[2-포르밀-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 39, 99 mg, 0.28 mmol)를 0℃까지 냉각시키고, DAST (0.710 mL, 0.71 mmol) (DCM 중 1 M)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. TLC 및 LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 반응물을 포화 NaHCO3 용액의 적가에 의해 켄칭하고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기물을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 조 생성물을 제공하였다. 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, 헥산 중 0~100% EtOAc 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 건조상태까지 농축시켜 tert-부틸 4-[2-(디플루오로메틸)-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 40, 94 mg, 89%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.51 (9H, s), 2.89 - 3.03 (4H, m), 3.06 (3H, d), 3.54 - 3.73 (4H, m), 6.82 - 7.16 (1H, m), 7.64 (1H, d), 7.94 (1H, br d), 8.29 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 371.
중간체 41: 6-(디플루오로메틸)-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드
1,4-디옥산 중 4 M HCl (6 ml, 24.00 mmol) 중 tert-부틸 4-[2-(디플루오로메틸)-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 40, 92 mg, 0.25 mmol)의 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반시켜 주황색 현탁물을 제공하고, 상기 혼합물을 에테르로 희석시키고, 여과시키고, 고체를 메탄올에 재용해시키고, 건조상태까지 농축시켜 6-(디플루오로메틸)-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 41, 56.0 mg, 65.7%)을 주황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.83 (3H, d), 3.03 - 3.23 (5H, m), 3.30 (4H, br s), 7.06 - 7.49 (1H, m), 7.92 (1H, d), 8.13 (1H, d), 8.43 (1H, br d), 9.00 (2H, br d); m/z (ES+) [M+H]+ = 271.
합성예 10: 6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00041
DIPEA (0.127 mL, 0.73 mmol)를 아세토니트릴 (3 mL) 중 6-(디플루오로메틸)-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 41, 50 mg, 0.15 mmol) 및 7-(브로모메틸)-3-에틸퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 30, 48.6 mg, 0.15 mmol)의 현탁물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 3시간 동안 교반시켰으며, LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 Gilson 역상 컬럼 (0~95% ACN/물/0.1%TFA로 용출)에서 정제하였다. 생성물 함유 분획을 실온에서 농축시켰다. 그 후 잔사를 메탄올 및 DCM에 용해시키고, 이어서 250 mg의 테트라알킬암모늄 카르보나이트 중합체-결합된 것 (40~90 메쉬, 2.5~3.5 mmol/g)을 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반시켰다. 그 후 고체를 여과 제거하고, 메탄올로 세척하고, 여과액을 농축시켜 고체를 제공하였다. 그 후 이 고체를 물/CH3CN의 혼합물에 재용해시키고, 건조상태까지 동결건조시켜 6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 10, 50.0 mg, 75%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.40 (3H, t), 2.72 (4H, br s), 2.97 - 3.17 (9H, m), 3.73 (2H, s), 6.84 - 7.15 (1H, m), 7.32 (1H, s), 7.37 (1H, d), 7.64 (1H, d), 7.83 (1H, d), 7.95 (1H, br d), 8.29 (1H, d), 11.32 - 11.62 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 457.
Figure pct00042
합성예 11 : 5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00043
20 mL 바이알 내에 7-(브로모메틸)-3-에틸퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 30, 0.147 g, 0.55 mmol) 및 N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 13, 0.161 g, 0.55 mmol)을 첨가하였다. 바이알을 밀봉하고, 배기시키고, N2로 재충전시켰다. 아세토니트릴 (3 mL) 및 DIPEA (0.481 mL, 2.75 mmol)를 바이알에 첨가하고, 70℃로 예열된 가열 블록에 넣었다. 반응 혼합물을 상기 온도에서 2시간 동안 교반시키고, 실온까지 냉각시켰다. 반응물의 부피를 진공 하에 초기 부피의 1/3까지 감소시키고, NaHCO3 수용액 (2 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 교반시키고, 여과시키고, 고체를 물 (50 mL)로 세척하였다. 조 생성물을 DCM 중 0~30% MeOH를 사용하여 플래시 실리카 크로마토그래피로 정제하여 5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 11, 93.0 mg, 41.6%)를 연한 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.22 (3H, t), 2.52 - 2.60 (4H, m), 2.73 - 2.85 (5H, m), 3.30 (4H, m, 물 피크와 겹침), 3.62 (2H, s), 7.22 - 7.31 (2H, m), 7.39 (1H, dd), 7.69 (1H, d), 7.83 (1H, d), 8.23 - 8.31 (1H, m), 8.39 (1H, br d), 12.13 - 12.36 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 407.
Figure pct00044
합성예 12 : 5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00045
7-(브로모메틸)-3-에틸퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 30, 150 mg, 0.56 mmol)을 NMP (2 mL) 중 6-플루오로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드(중간체 23, 60 mg, 0.25 mmol) 및 DIPEA (0.270 mL, 1.55 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 5 um, 19x150 mm; 이동상 A: 물 (10 MMOL/L NH4HCO3, 0.1% NH3.H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 20 mL/분; 구배: 8분 내에 28% B에서 38% B까지; 254; 220 nm; RT: 8.02분). 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 12, 9 mg, 42.9%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 1.33 (3H, t), 2.65 - 2.72 (4H, m), 2.87 - 2.95 (5H, m), 3.26 - 3.30 (4H, m), 3.71 (2H, s), 7.33 - 7.41 (2H, m), 7.52 (1H, dd), 7.76 (1H, d), 7.90 (1H, dd); 19F NMR (376 MHz, CD3OD) δ -73.40; m/z (ES+) [M+H]+ = 425.
Figure pct00046
중간체 43 : 5-브로모-N,6-디메틸피콜린아미드
THF 중 2 M 메틸아민 용액 (20 mL, 40.00 mmol)을 메틸 5-브로모-6-메틸피콜리네이트 (중간체 42, 2.0 g, 8.69 mmol)에 첨가하고, 생성된 혼합물을 80℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (0.1% NH4HCO3) 중 5~80% MeOH). 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-브로모-N,6-디메틸피콜린아미드 (중간체 43, 1.5 g, 75%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.65 (3H, s), 2.82 (3H, d), 7.75 (1H, d), 8.17 (1H, d), 8.57 - 8.76 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 229.
중간체 44 : tert-부틸 4-(2-메틸-6-(메틸카르바모일)피리딘-3-일)피페라진-1-카르복실레이트
5-브로모-N,6-디메틸피콜린아미드 (중간체 43, 1.0 g, 4.37 mmol)를 질소 하에 톨루엔 (20 mL) 중 tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트 (0.894 g, 4.80 mmol), BINAP (0.272 g, 0.44 mmol), Pd(OAc)2 (0.098 g, 0.44 mmol) 및 Cs2CO3 (3.56 g, 10.91 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 16시간 동안 80℃에서 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (0.4% HCO2H) 중 5~30% MeOH). 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 tert-부틸 4-(2-메틸-6-(메틸카르바모일)피리딘-3-일)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 44, 1.2 g, 82%)를 갈색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 1.50 (9H, s), 2.58 (3H, s), 2.92 - 3.00 (7H, m), 3.62 (4H, m), 7.50 (1H, d), 7.88 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 335.
중간체 45 : N,6-디메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드
tert-부틸 4-(2-메틸-6-(메틸카르바모일)피리딘-3-일)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 44, 1.18 g, 3.53 mmol)를 1,4-디옥산 중 4 M HCl 용액 (10 mL, 329.15 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 침전물을 여과로 수집하고, 석유 에테르 (5 mL x 2), Et2O (5 mL x 2)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 N,6-디메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 45, 0.77 g, 81%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 2.86 (3H, s), 3.02 (3H, s), 3.42 - 3.54 (8H, m), 8.29 (2H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 235.
합성예 13 : 5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00047
7-(브로모메틸)-3-에틸퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 30, 100 mg, 0.37 mmol)을 NMP (2 mL) 중 N,6-디메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 45, 90 mg, 0.33 mmol) 및 DIPEA (0.36 mL, 2.05 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼 30 x 150 mm, 5 um; 이동상 A: 물 (10 MMOL/L NH4HCO3), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 30% B에서 40% B까지; 254; 220 nm; RT: 6.43분). 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 13, 68.7 mg, 43.6%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 1.33 (3H, t), 2.55 (3H, s), 2.71 (4H, s), 2.87 - 2.99 (5H, m), 3.05 (4H, t), 3.73 (2H, s), 7.35 (1H, s), 7.38 (1H, d), 7.49 (1H, d), 7.77 (1H, d), 7.87 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 421.
Figure pct00048
중간체 47 : 메틸 6-클로로-5-(피페라진-1-일)피콜리네이트
피페라진 (1.0 g, 11.61 mmol)을 MeCN (30 mL) 중 메틸 6-클로로-5-플루오로피콜리네이트 (중간체 46, 1.0 g, 5.28 mmol)에 첨가하였다. 그에 따른 혼합물을 18시간 동안 80℃에서 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (0.1% NH4HCO3) 중 5~60% MeCN). 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 메틸 6-클로로-5-(피페라진-1-일)피콜리네이트 (중간체 47, 1.28 g, 95%)를 적색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.81 - 2.91 (4H, m), 3.04 - 3.08 (4H, m), 3.85 (3H, s), 7.61 (1H, d), 8.00 (1H, d) (NH 양성자는 표시되지 않음); m/z (ES+) [M+H]+ = 256.
중간체 48 : 6-클로로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드
THF 중 2 M 메틸아민 용액 (40 mL, 80.00 mmol)을 메틸 6-클로로-5-(피페라진-1-일)피콜리네이트 (중간체 47, 1.26 g, 4.93 mmol)에 첨가하였다. 그에 따른 혼합물을 18시간 동안 80℃에서 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (0.1% NH4HCO3) 중 5~60% MeCN). 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-클로로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 48, 1.12 g, 89%)를 담황색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 2.79 (3H, d), 2.85 - 2.89 (4H, m), 2.97 - 3.02 (4H, m), 7.63 (1H, d), 7.94 (1H, d), 8.45 (1H, q) (피페라진-NH 양성자는 표시되지 않음); m/z (ES+) [M+H]+ = 255.
합성예 14: 6-클로로-5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00049
7-(브로모메틸)-3-에틸퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 30, 200 mg, 0.75 mmol)을 NMP (2 mL) 중 6-클로로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 48, 100 mg, 0.39 mmol) 및 DIPEA (0.358 mL, 2.05 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼 30x150 mm 5 um; 이동상 A: 물 (10 MMOL/L NH4HCO3), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 8분 내에 30% B에서 40% B까지; 254; 220 nm; RT: 7.3분). 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-클로로-5-[4-[(2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 14, 52.6 mg, 30.4%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1HNMR (400 MHz, CD3OD) δ 1.33 (3H, t), 2.71 (4H, s), 2.87 - 2.96 (5H, m), 3.23 (4H, s), 3.73 (2H, s), 7.33 - 7.41 (2H, m), 7.62 (1H, d), 7.77 (1H, d), 8.00 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 441.
Figure pct00050
중간체 50 : 7-브로모-3-(트리플루오로메틸)퀴녹살린-2(1H)-온
4-브로모벤젠-1,2-디아민 (중간체 49, 0.9 g, 4.81 mmol)을 톨루엔 (10 mL) 중 메틸 3,3,3-트리플루오로-2-옥소프로파노에이트 (0.9 g, 5.77 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 100℃에서 60분 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 크로마토그래피, 석유 에테르 중 0~50% EtOAc 용출 구배로 정제하였다. 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 7-브로모-3-(트리플루오로메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 및 6-브로모-3-(트리플루오로메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 50 + 중간체 51, 1.28 g, 45.4%)의 위치이성질체 혼합물을 황백색 고체로서 수득하였다. 위치이성질체들의 혼합물을 단리하였으며, 1H NMR 스펙트럼은 해석되지 않았다; m/z (ES+) [M+H]+ = 295.
중간체 52 : 7-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)퀴녹살린-2(1H)-온
Pd(Ph3P)4 (0.3 g, 0.26 mmol)를 1,4-디옥산 (40 mL) 중 7-브로모-3-(트리플루오로메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 및 6-브로모-3-(트리플루오로메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 50 + 중간체 51, 1.2 g, 2.05 mmol) 및 (트리부틸스탄닐)메탄올 (1.2 g, 3.74 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 질소 하에 100℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피, 물 (0.1% HCO2H) 중 5~50% MeCN 용출 구배로 정제하였다. 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 7-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 52, 0.32 g, 64.0%)을 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6,) δ 4.63 (2H, d), 5.52 (1H, t), 7.30 (1H, dd), 7.38 (1H, d), 7.83 (1H, d), 13.05 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 245.
합성예 15 : N-메틸-5-[4-[[3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00051
AcOH 중 33% HBr 용액 (3 mL, 18.23 mmol)을 7-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 52, 111 mg, 0.45 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. DIEA (0.5 mL, 2.86 mmol) 및 N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 13, 100 mg, 0.45 mmol)를 NMP (3 mL) 중 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼, 30x150 mm 5 um; 이동상 A: 물 (10 MMOL/L NH4HCO3), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 22 B에서 32 B까지; 254; 220 nm; RT: 5.77. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 N-메틸-5-[4-[[3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 15, 44.0 mg, 21.71%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.55 - 2.62 (m, 4H), 2.78 (d, 3H), 3.34 - 3.38 (t, 4H), 3.69 (s, 2H), 7.34 - 7.44 (m, 3H), 7.80 - 7.91 (m, 2H), 8.27 (d, 1H), 8.36 - 8.41 (m, 1H), 12.97 (s, 1H); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -68.36; m/z (ES+) [M+H]+ = 447.
Figure pct00052
합성예 16 : 6-클로로-N-메틸-5-[4-[[3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00053
AcOH 중 33% HBr (3 mL, 18.23 mmol)을 7-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 52, 43.1 mg, 0.18 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. DIPEA (0.5 mL, 2.86 mmol) 및 6-클로로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 48, 45 mg, 0.18 mmol)를 NMP (5 mL) 중 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼, 30x150 mm 5 um; 이동상 A: 물 (10 MMOL/L NH4HCO3), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 10 B에서 50 B까지; 254; 220 nm; RT: 6.75. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-클로로-N-메틸-5-[4-[[3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 16, 22.00 mg, 25.9%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.56 - 2.64 (s, 4H), 2.79 (d, 3H), 3.09 - 3.17 (m, 4H), 3.71 (s, 2H), 7.36 - 7.42 (m, 2H), 7.67 (d, 1H), 7.88 (d, 1H), 7.94 (d, 1H), 8.39 - 8.44 (m, 1H), 12.89 (s, 1H); 19F NMR (376 MHz, DMSO) δ -68.41; m/z (ES+) [M+H]+ = 481.
Figure pct00054
합성예 17 : 6-플루오로-N-메틸-5-[4-[[3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00055
AcOH 중 33% HBr (3 mL, 55.25 mmol)을 7-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 52, 102 mg, 0.42 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 23, 100 mg, 0.42 mmol) 및 DIPEA (0.5 mL, 2.86 mmol)를 NMP (5 mL) 중 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼, 30x150 mm 5 um; 이동상 A: 물 (10 MMOL/L NH4HCO3), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 8분 내에 15 B에서 40 B까지; 254; 220 nm; RT: 7.2. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-플루오로-N-메틸-5-[4-[[3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 17, 66.0 mg, 33.9%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.55 - 2.69 (m, 4H), 2.77 (d, 3H), 3.15 - 3.23 (m, 4H), 3.69 (s, 2H), 7.33 - 7.46 (m, 2H), 7.58 (dd, 1H), 7.78 - 7.93 (m, 2H), 8.37 - 8.42 (m, 1H), 12.99 (s, 1H); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -68.36,-72.52; m/z (ES+) [M+H]+ = 465.
Figure pct00056
중간체 54 : 메틸 2-아미노펜타노에이트 히드로클로라이드
SOCl2 (17 mL, 232.94 mmol)를 0℃의 MeOH (200 mL) 중 2-아미노펜탄산 (중간체 53, 10.0 g, 85.36 mmol)에 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하여 메틸 2-아미노펜타노에이트 히드로클로라이드 (중간체 54, 15.78 g, 110%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 0.88 (3H, t), 1.19 - 1.51 (2H, m), 1.67 - 1.83 (2H, m), 3.74 (3H, s), 3.89 - 3.93 (1H, m), 8.64 (3H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 132.
중간체 55 : 메틸 4-(1-메톡시-1-옥소펜탄-2-일아미노)-3-니트로벤조에이트
중탄산나트륨 (20.0 g, 238.08 mmol)을 THF (160 mL) 중 메틸 2-아미노펜타노에이트 히드로클로라이드 (중간체 54, 15.57 g, 92.88 mmol) 및 메틸 4-플루오로-3-니트로벤조에이트 (9.0 g, 45.19 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (150 mL)로 희석시키고, 순차적으로 물 (100 mL x 1), 포화 NaHCO3 (100 mL x 1) 및 포화 염수 (100 mL x 1)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켜 메틸 4-(1-메톡시-1-옥소펜탄-2-일아미노)-3-니트로벤조에이트 (중간체 55, 14.09 g, 100%)를 황색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.89 (3H, t), 1.26 - 1.41 (2H, m), 1.84 - 1.94 (2H, m), 3.73 (3H, s), 3.83 (3H, s), 4.68 - 4.75 (1H, m), 7.12 (1H, d), 8.00 (1H, d), 8.60 (1H, d), 8.63 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 311.
중간체 56 : 메틸 3-옥소-2-프로필-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트
Pd(OH)2/C (20 중량%, 1.58 g, 2.25 mmol)를 MeOH (300 mL) 중 메틸 4-((1-메톡시-1-옥소펜탄-2-일)아미노)-3-니트로벤조에이트 (중간체 55, 14.05 g, 45.28 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 H2 하에 실온에서 30시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과시켰다. 침전물을 DMF (100 mL)로 세척하고, 여과액을 건조상태까지 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 DCM (10 mL)으로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 메틸 3-옥소-2-프로필-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 56, 9.12 g, 81%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.87 (3H, t), 1.32 - 1.46 (2H, m), 1.57 - 1.64 (2H, m), 3.74 (3H, s), 3.88 - 3.93 (1H, m), 6.70 (1H, d), 6.83 (1H, d), 7.32 (1H, d), 7.40 (1H, dd), 10.38 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 249.
중간체 57 : 메틸 3-옥소-2-프로필-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트
DDQ (9.42 g, 41.50 mmol)를 1,4-디옥산 (200 mL) 중 메틸 3-옥소-2-프로필-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 56, 9.12 g, 36.73 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 (200 mL)으로 희석시켰다. 생성된 혼합물을 실온에서 0.5시간 동안 교반시켰다. 침전물을 여과로 수집하고, 물 (1000 mL)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 메틸 3-옥소-2-프로필-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 57, 7.86 g, 87%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.98 (3H, t), 1.68 - 1.80 (2H, m), 2.75 - 2.83 (2H, m), 3.89 (3H, s), 7.73 - 7.85 (2H, m), 7.88 (1H, d), 12.45 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 247.
중간체 58 : 7-(히드록시메틸)-3-프로필퀴녹살린-2(1H)-온
THF 중 1 M DIBAL-H 용액 (100 mL, 100.00 mmol)을 0℃의 THF (200 mL) 중 메틸 3-옥소-2-프로필-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 57, 7.81 g, 31.71 mmol)에 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 MeOH (5 mL) 및 포화 모노포타슘 모노소듐 타르트레이트 4수화물 수용액 (20 mL)으로 켄칭하고, 유기 층을 증발시켜 7-(히드록시메틸)-3-프로필퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 58, 1.2 g, 17.34%)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.97 (3H, t), 1.36 - 1.77 (2H, m), 2.71 - 2.79 (2H, m), 4.59 (2H, s), 5.39 (1H, s), 7.18 (1H, dd), 7.27 (1H, d), 7.65 (1H, d), 12.30 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 219.
중간체 59 : 7-(브로모메틸)-3-프로필퀴녹살린-2(1H)-온
AcOH 중 33% HBr (74.6 μl, 1.37 mmol)을 7-(히드록시메틸)-3-프로필퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 58, 300 mg, 1.37 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하여 7-(브로모메틸)-3-프로필퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 59, 600 mg, 155%)을 갈색 고체로서 수득하였다 (조 생성물은 순수하지 않았고 AcOH 및 기타 불순물을 함유함). 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 1H NMR 스펙트럼은 깔끔하지 않았으며, 해석되지 않았다; m/z (ES+) [M+H]+ = 282.
합성예 18 : N-메틸-5-[4-[(3-옥소-2-프로필-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00057
DIPEA (200 μL, 1.15 mmol)를 NMP (3 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-프로필퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 59, 200 mg, 0.71 mmol) 및 N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 13, 80 mg, 0.36 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 19 x 250 mm, 10 um; 이동상 A: 물 (10 MMOL/L NH4HCO3, 0.1% NH3.H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 20 mL/분; 구배: 7분 내에 38 B에서 50 B까지; 254/ 220 nm; RT: 6.20. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 N-메틸-5-[4-[(3-옥소-2-프로필-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 18, 71.0 mg, 46.5%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 0.97 (3H, t), 1.66 - 1.80 (2H, m), 2.55 - 2.61 (4H, m), 2.73 - 2.85 (5H, m), 3.33 - 3.40 (4H, m), 3.62 (2H, s), 7.19 - 7.31 (2H, m), 7.40 (1H, dd), 7.68 (1H, d), 7.83 (1H, d), 8.27 (1H, d), 8.35 - 8.45 (1H, m), 12.26 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 421.
Figure pct00058
합성예 19: 6-클로로-N-메틸-5-[4-[(3-옥소-2-프로필-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00059
DIPEA (200 μL, 1.15 mmol)를 NMP (3 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-프로필퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 59, 200 mg, 0.71 mmol) 및 6-클로로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 48, 80 mg, 0.31 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 19 x 250 mm, 10 um; 이동상 A: 물 (0.1% HCO2H), 이동상 B: ACN; 유량: 20 mL/분; 구배: 7분 내에 18 B에서 30 B까지; 254/ 220 nm; RT: 5.93. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-클로로-N-메틸-5-[4-[(3-옥소-2-프로필-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 19, 52.0 mg, 36.4%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.97 (3H, t), 1.66 - 1.79 (2H, m), 2.55 - 2.65 (4H, m), 2.71 - 2.85 (5H, m), 3.06 - 3.12 (4H, m), 3.64 (2H, s), 7.20 - 7.32 (2H, m), 7.64 - 7.72 (2H, m), 7.94 (1H, d), 8.40 - 8.50 (1H, m), 12.27 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 455.
Figure pct00060
합성예 20: 6-플루오로-N-메틸-5-[4-[(3-옥소-2-프로필-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00061
DIPEA (500 μl, 2.86 mmol)를 NMP (3 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-프로필퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 59, 200 mg, 0.71 mmol) 및 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2 HCl (중간체 23, 100 mg, 0.32 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: SunFire C18 OBD Prep 컬럼, 100 Å, 5 μm, 19 mm x 250 mm; 이동상 A: 물 (0.1% HCO2H), 이동상 B: ACN; 유량: 25 mL/분; 구배:13분 내에 10 B에서 20 B까지; 254/ 220 nm; RT: 12.13. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-플루오로-N-메틸-5-[4-[(3-옥소-2-프로필-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 20, 71.0 mg, 50.4%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.97 (3H, t), 1.66 - 1.78 (2H, m), 2.54 - 2.60 (4H, m), 2.71 - 2.83 (5H, m), 3.14 - 3.25 (4H, m), 3.62 (2H, s), 7.19 - 7.33 (2H, m), 7.57 (1H, dd), 7.68 (1H, d), 7.85 (1H, dd), 8.37 - 5.43 (1H, m), 12.27 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -72.51; m/z (ES+) [M+H]+ = 439.
Figure pct00062
중간체 61 : 메틸 2-아미노부타노에이트 히드로클로라이드
SOCl2 (17 mL, 232.94 mmol)를 0℃의 MeOH (100 mL) 중 2-아미노부탄산 (중간체 60, 10.0 g, 96.97 mmol)에 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하여 메틸 2-아미노부타노에이트 히드로클로라이드 (중간체 61, 14.84 g, 100%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.91 (3H, t), 1.75 - 1.95 (2H, m), 3.73 (3H, s), 3.93 (1H, t), 8.72 (3H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 118.
중간체 62 : 메틸 2-플루오로-4-(1-메톡시-1-옥소부탄-2-일아미노)-5-니트로벤조에이트
DIPEA (4.02 mL, 23.03 mmol)를 NMP (10 mL) 중 메틸 2,4-디플루오로-5-니트로벤조에이트 (1.0 g, 4.61 mmol) 및 메틸 2-아미노부타노에이트 히드로클로라이드 (중간체 61, 0.707 g, 4.61 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피, 물 (0.1% NH4HCO3) 중 5~80% MeCN 용출 구배로 정제하였다. 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 메틸 2-플루오로-4-(1-메톡시-1-옥소부탄-2-일아미노)-5-니트로벤조에이트 (중간체 62, 1.2 g, 83%)를 흑색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.88 (3H, t), 1.78 - 2.03 (2H, m), 3.75 (3H, s), 3.83 (3H, s), 4.73 - 4.80 (1H, m), 7.06 (1H, d), 8.66 - 8.72 (2H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 315.
중간체 63 : 메틸 2-에틸-7-플루오로-3-옥소-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트
메틸 2-플루오로-4-((1-메톡시-1-옥소부탄-2-일)아미노)-5-니트로벤조에이트 (중간체 62, 1.15 g, 3.66 mmol)를 수소 하에 MeOH (300 mL) 및 에틸 아세테이트 (50 mL) 중 20 중량% Pd(OH)2 (500 mg, 0.71 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반시켰다. 반응은 완료되지 않았다. 반응 혼합물을 여과시켰다. 유기 층을 증발시켜 조 생성물, 메틸 2-에틸-7-플루오로-3-옥소-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 63, 0.780 g, 85%)를 갈색 검으로서 수득하였다. 조 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 직접적으로 사용하였다. 조 생성물은 깔끔하지 않았으며, 1HNMR 스펙트럼은 해석되지 않았다; m/z (ES+) [M+H]+ = 253.
중간체 64 : 메틸 2-에틸-7-플루오로-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트
메틸 2-에틸-7-플루오로-3-옥소-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 63, 760 mg, 3.01 mmol)를 DCM (20 mL) 중 DDQ (821 mg, 3.62 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응은 완료되었다. 생성된 혼합물을 감압 하에 농축시켜 갈색 고체를 얻었다. NaHCO3 포화 수용액 (10 mL)을 상기 고체에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 침전물을 여과시키고, 추가의 NaHCO3 수용액 (10 mL x 5)으로 헹구었다. 고체를 진공 하에 건조시켜 메틸 2-에틸-7-플루오로-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 64, 750 mg, 99%)를 갈색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 1.20 (3 H, t), 2.82 (2 H, q), 3.87 (3 H, s), 7.65 (1 H, d), 7.76 (1 H, d), 12.42 (1 H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 251.
중간체 65 : 3-에틸-6-플루오로-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온
THF 중 1 M 디이소부틸알루미늄 히드라이드 용액 (15.35 mL, 15.35 mmol)을 THF (300 mL) 중 메틸 2-에틸-7-플루오로-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 64, 640 mg, 2.56 mmol)에 일부씩 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응은 완료되었다. 반응 혼합물을 0℃의 포화 포타슘 소듐 타르트레이트 수용액 (20 mL) 및 MeOH (10 mL)로 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과시키고, THF (50 mL x 3)로 세척하였다. 유기 층을 건조상태까지 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피, 물 (0.4% HCO2H) 중 5~60% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 3-에틸-6-플루오로-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 65, 110 mg, 19.37%)을 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 1.21 (3H, t), 2.80 (2H, q), 4.63 (2H, d), 5.49 (1H, t), 7.41 (1H, d), 7.49 (1H, d), 12.36 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 223.
합성예 21: 5-[4-[(2-에틸-7-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00063
3-에틸-6-플루오로-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 65, 50 mg, 0.23 mmol)을 AcOH 중 33% HBr (2 mL, 12.15 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 증발시켜 7-(브로모메틸)-3-에틸-6-플루오로퀴녹살린-2(1H)-온 (조 생성물)을 수득하였다. 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 직접적으로 사용하였다. DIPEA (0.196 mL, 1.13 mmol)를 NMP (2 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-에틸-6-플루오로퀴녹살린-2(1H)-온 및 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 23, 70 mg, 0.29 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: Sunfire prep C18 컬럼, 30 x 150 mm, 5 um; 이동상 A: 물 (0.1% HCO2H), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 8분 내에 10 B에서 35 B까지; 254/ 220 nm; RT: 7.37. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(2-에틸-7-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 21, 55.0 mg, 53.7%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 1.21 (3H, t), 2.61 (4H, m), 2.73 - 2.85 (5H, m), 3.18 (4H, m), 3.68 (2H, s), 7.38 (1H, d), 7.51 - 7.61 (2H, m), 7.84 (1H, dd), 8.13 (0.29H, s), 8.38 (1H, m), 12.29 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -72.53, -124.31; m/z (ES+) [M+H]+ = 443.
Figure pct00064
중간체 67 : 메틸 4-(3-히드록시-1-메톡시-1-옥소부탄-2-일아미노)-3-니트로벤조에이트
DIPEA (8.77 mL, 50.22 mmol)를 DMF (20 mL) 중 메틸 4-플루오로-3-니트로벤조에이트 (2.0 g, 10.04 mmol) 및 메틸 2-아미노-3-히드록시부타노에이트 히드로클로라이드 (중간체 66, 2.04 g, 12.05 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 EtOAc (100 mL)로 희석시키고, 순차적으로 포화 NH4Cl 수용액 (100 mL x 1), 및 염수 (100 mL x 4)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켜 원하는 생성물, 메틸 4-((3-히드록시-1-메톡시-1-옥소부탄-2-일)아미노)-3-니트로벤조에이트 (중간체 67, 2.9 g, 92%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.15 - 1.27 (3H, m), 3.64 - 3.74 (3H, m), 3.83 (3H, s), 4.08 - 4.44 (1H, m), 4.61 - 4.72 (1H, m), 5.39 - 5.60 (1H, m), 7.03 - 7.15 (1H, m), 7.90 - 8.03 (1H, m), 8.62 - 8.69 (1H, m), 8.73 - 8.89 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 313.
중간체 68 : 메틸 2-(1-히드록시에틸)-3-옥소-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트
20% Pd(OH)2/C (0.648 g, 0.92 mmol)를 수소 하에 MeOH (300 mL) 중 메틸 4-((3-히드록시-1-메톡시-1-옥소부탄-2-일)아미노)-3-니트로벤조에이트 (중간체 67, 2.88 g, 9.22 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응은 완료되었다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시켰다. 유기 층을 증발시켜 메틸 2-(1-히드록시에틸)-3-옥소-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 68, 2.290 g, 99%)를 회색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.07 (3H, m), 2.81 (1H, d), 3.72 (1H, m), 3.74 (3H, s), 4.78 (1H, d), 6.70 - 6.86 (2H, m), 7.27 (1H, d), 7.37 (1H, dd), 10.38 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 251.
중간체 69 : 메틸 2-(1-히드록시에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트
DDQ (2.265 g, 9.98 mmol)를 DCM (100 mL) 중 메틸 2-(1-히드록시에틸)-3-옥소-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 68, 2.27 g, 9.07 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응은 완료되었다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 갈색 고체를 얻었다. NaHCO3 포화 수용액 (100 mL)을 상기 고체에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 침전물을 여과시키고, 추가의 NaHCO3 수용액 (30 mL x 3)으로 헹구었다. 고체를 진공 하에 건조시켜 메틸 2-(1-히드록시에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 69, 2.24 g, 99%)를 회색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.40 (3H, d), 3.88 (3H, s), 4.94 (1H, q), 7.69 (1H, dd), 7.77 (1H, d), 7.90 (1H, d) (2개의 양성자는 표시되지 않음); m/z (ES+) [M+H]+ = 249.
중간체 70: 메틸 2-아세틸-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트
데스-마틴 퍼요오디난 (2.56 g, 6.04 mmol)을 DCM (30 mL) 중 메틸 2-(1-히드록시에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 69, 1.0 g, 4.03 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피, 물 (0.4% HCO2H) 중 5~30% MeCN 용출 구배로 정제하였다. 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 메틸 2-아세틸-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 70, 0.62 g, 62.5%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.58 (3H, s), 3.91 (3H, s), 7.84 (1H, dd), 7.91 - 8.03 (2H, m), 12.86 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 247.
중간체 71 : 메틸 2-(1,1-디플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트
BAST (1.35 mL, 7.31 mmol)를 DCM (20 mL) 중 메틸 2-아세틸-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 70, 600 mg, 2.44 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피, 물 (0.4% HCO2H) 중 5~30% MeCN 용출 구배로 정제하였다. 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 메틸 2-(1,1-디플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 71, 174 mg, 26.6%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.07 (3H, t), 3.91 (3H, s), 7.84 (1H, dd), 7.92 - 7.99 (2H, m), 12.90 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -93.26; m/z (ES+) [M+H]+ = 269.
중간체 72 : 3-(1,1-디플루오로에틸)-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온
THF 중 1 M 디이소부틸알루미늄 히드라이드 용액 (2.39 mL, 2.39 mmol)을 0℃의 THF (50 mL) 중 메틸 2-(1,1-디플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 71, 160 mg, 0.60 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 0℃의 포화 포타슘 소듐 타르트레이트 수용액 (3 mL) 및 MeOH (1 mL)로 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과시키고, THF (10 mL x 3)로 세척하였다. 유기 층을 증발시켜 조 생성물, 3-(1,1-디플루오로에틸)-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 72, 120 mg, 84%)을 수득하였다. 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 직접적으로 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.06 (3H, t), 4.63 (2H, s), 5.47 (1H, s), 7.26 (1H, dd), 7.35 (1H, d), 7.78 (1H, d), 12.75 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 241.
합성예 22 : 5-[4-[[2-(1,1-디플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00065
3-(1,1-디플루오로에틸)-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 72, 60 mg, 0.25 mmol)을 아세트산 중 33% HBr (2 mL, 12.15 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 증발시켜 7-(브로모메틸)-3-(1,1-디플루오로에틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (조 생성물)을 수득하였다. 생성물을 추가 정제 없이 직접적으로 다음 단계에서 사용하였다. DIPEA (0.218 mL, 1.25 mmol)를 NMP (3 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-(1,1-디플루오로에틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (조 생성물) 및 N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 13, 60 mg, 0.27 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 농축시키고, 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 30 x 150 mm, 5 um; 이동상 A: 물 (0.05% NH3H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 13 B에서 33 B까지; 254; 220 nm; RT: 5.70. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[[2-(1,1-디플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 22, 47.8 mg, 43.2%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.06 (3H, t), 2.52 - 2.62 (4H, m), 2.78 (3H, d), 3.30 - 3.40 (4H, m), 3.67 (2H, s), 7.32 - 7.42 (3H, m), 7.80 - 7.86 (2H, m), 8.27 (1H, d), 8.34 - 8.42 (1H, m), 12.70 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -92.74; m/z (ES+) [M+H]+ = 443.
Figure pct00066
중간체 74 : 메틸 4-(4,4-디플루오로-1-메톡시-1-옥소부탄-2-일아미노)-3-니트로벤조에이트
DIPEA (8.77 mL, 50.22 mmol)를 DMF (20 mL) 중 메틸 4-플루오로-3-니트로벤조에이트 (2.0 g, 10.04 mmol) 및 메틸 2-아미노-4,4-디플루오로부타노에이트 히드로클로라이드 (중간체 73, 2.0 g, 10.55 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 40℃에서 8시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 EtOAc (100 mL)로 희석시키고, 순차적으로 포화 NH4Cl (100 mL x 1), 및 염수 (100 mL x 4)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켜 원하는 생성물, 메틸 4-((4,4-디플루오로-1-메톡시-1-옥소부탄-2-일)아미노)-3-니트로벤조에이트 (중간체 74, 2.5 g, 74.9%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 2.50 - 2.76 (2H, m), 3.71 (3H, s), 3.82 (3H, s), 4.95 (1H, q), 6.22 (1H, tt), 7.18 (1H, d), 7.99 (1H, dd), 8.63 (1H, d), 8.66 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 333.
중간체 75 : 메틸 2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트
20% Pd(OH)2/C (0.465 g, 0.66 mmol)를 수소 하에 MeOH (300 mL) 중 메틸 4-((4,4-디플루오로-1-메톡시-1-옥소부탄-2-일)아미노)-3-니트로벤조에이트 (중간체 74, 2.2 g, 6.62 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시켰다. 여과액을 증발시켜 메틸 2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 75, 1.64 g, 92%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.24 - 2.32 (2H, m), 3.76 (3H, s), 4.10 - 4.18 (1H, m), 6.27 (1H, tt), 6.73 (1H, d), 6.89 (1H, s), 7.37 (1H, d), 7.44 (1H, dd), 10.58 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 271.
중간체 76 : 메틸 2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트
DDQ (1.478 g, 6.51 mmol)를 DCM (100 mL) 중 메틸 2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 75, 1.6 g, 5.92 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 생성된 혼합물을 감압 하에 제거하여 갈색 고체를 얻었다. NaHCO3 포화 수용액 (100 mL)을 상기 고체에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 침전물을 여과시키고, 추가의 NaHCO3 수용액 (30 mL x 3)으로 헹구었다. 고체를 진공 하에 건조시켜 메틸 2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 76, 1.58 g, 99%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.46 (2H, td), 3.90 (3H, s), 6.57 (1H, t), 7.79 - 7.92 (3H, m), 12.68 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 269.
중간체 77 : 3-(2,2-디플루오로에틸)-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온
THF 중 1 M 디이소부틸알루미늄 히드라이드 용액 (22.37 mL, 22.37 mmol)을 0℃의 THF (100 mL) 중 메틸 2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 76, 1.0 g, 3.73 mmol)에 일부씩 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 0℃의 포화 포타슘 소듐 타르트레이트 수용액 (20 mL) 및 MeOH (10 mL)로 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과시키고, THF (30 mL x 3)로 세척하였다. 유기 층을 증발시켜 3-(2,2-디플루오로에틸)-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (0.72 g, 80%)을 적색 고체로서 수득하였다 (조 생성물). 조 생성물을 역상 크로마토그래피, 물 (0.4% HCO2H) 중 5~60% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 3-(2,2-디플루오로에틸)-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 77, 500 mg, 69.4%)을 적색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 3.42 (2H, td), 4.61 (2H, s), 5.42 (1H, brs), 6.56 (1H, tt), 7.23 (1H, dd), 7.32 (1H, d), 7.71 (1H, d), 12.55 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 241.
중간체 78 : 2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르브알데히드
데스-마틴 퍼요오디난 (530 mg, 1.25 mmol)을 DCM (5 mL) 중 3-(2,2-디플루오로에틸)-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 77, 200 mg, 0.83 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피, 물 (0.4% HCO2H) 중 5~30% MeCN 용출 구배로 정제하였다. 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르브알데히드 (중간체 78, 160 mg, 81%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.47 (2H, td), 6.58 (1H, tt), 7.77 - 7.85 (2H, m), 7.90 - 7.98 (1H, m), 10.09 (1H, s), 12.79 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 239.
합성예 23 : 5-[4-[[2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00067
티타늄 이소프로폭시드 (65.6 mg, 0.23 mmol)를 THF (2 mL) 중 2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르브알데히드 (중간체 78, 55 mg, 0.23 mmol) 및 N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 13, 60 mg, 0.23 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2분 동안 교반시켰다. 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (196 mg, 0.92 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 MeOH (0.1 mL)로 켄칭하였다. 반응 혼합물을 증발시켜 조 생성물을 수득하고, 이를 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 30 x 150 mm, 5 um; 이동상 A: 물 (0.05% NH3H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 13 B에서 33 B까지; 254; 220 nm; RT: 5.70. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[[2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 23, 8.76 mg, 8.57%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.56 (4H, m), 2.78 (3H, d), 3.32 - 3.48 (6H, m), 3.64 (2H, s), 6.55 (1H, tt), 7.27 - 7.33 (2H, m), 7.39 (1H, dd), 7.73 (1H, d), 7.83 (1H, d), 8.26 (1H, d), 8.37 (1H, m), 12.49 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -114.29; m/z (ES+) [M+H]+ = 443.
Figure pct00068
합성예 24 : 5-[4-[[2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00069
티타늄 이소프로폭시드 (59.7 mg, 0.21 mmol)를 THF (2 mL) 중 2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르브알데히드 (중간체 78, 50 mg, 0.21 mmol) 및 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 23, 50.0 mg, 0.21 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2분 동안 교반시켰다. 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (178 mg, 0.84 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응은 완료되었다. 반응 혼합물을 MeOH (0.1 mL)로 켄칭하였다. 반응 혼합물을 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: Sunfire prep C18 컬럼, 30 x 150, 5 um; 이동상 A: 물 (0.1% HCO2H), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 2 B에서 27 B까지; 254/ 220 nm; RT: 6.78. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[[2-(2,2-디플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 24, 21.72 mg, 22.13%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.54 - 2.61 (4H, m), 2.76 (3H, d), 3.14 - 3.22 (4H, m), 3.41 (2H, td), 3.64 (2H, s), 6.39 - 6.71 (1H, m), 7.26 - 7.33 (2H, m), 7.57 (1H, dd), 7.73 (1H, d), 7.82 - 7.86 (1H, m), 8.13 (0.16H, s), 8.37 (1H, m), 12.49 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -72.52, -114.29; m/z (ES+) [M+H]+ = 461.
Figure pct00070
중간체 80 : 메틸 4-(4-플루오로-1-메톡시-1-옥소부탄-2-일아미노)-3-니트로벤조에이트
DIPEA (8.77 mL, 50.22 mmol)를 DMF (20 mL) 중 메틸 4-플루오로-3-니트로벤조에이트 (2.0 g, 10.04 mmol) 및 메틸 2-아미노-4-플루오로부타노에이트 히드로클로라이드 (중간체 79, 1.81 g, 10.55 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 40℃에서 8시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 EtOAc (100 mL)로 희석시키고, 순차적으로 포화 NH4Cl (100 mL x 1), 및 염수 (100 mL x 4)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켜 원하는 생성물, 메틸 4-((4-플루오로-1-메톡시-1-옥소부탄-2-일)아미노)-3-니트로벤조에이트 (중간체 80, 2.5 g, 79%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 2.25 - 2.35 (1H, m), 2.35 - 2.45 (1H, m), 3.71 (3H, s), 3.82 (3H, s), 4.36 - 4.58 (1H, m), 4.56 - 4.74 (1H, m), 4.84 (1H, q), 7.14 (1H, d), 7.99 (1H, dd), 8.63 (1H, d), 8.67 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 315.
중간체 81 : 메틸 2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트
20% Pd(OH)2/C (0.547 g, 0.78 mmol)를 수소 하에 MeOH (300 mL) 중 메틸 4-((4-플루오로-1-메톡시-1-옥소부탄-2-일)아미노)-3-니트로벤조에이트 (중간체 80, 2.45 g, 7.80 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응은 완료되었다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시켰다. 여과액을 증발시켜 메틸 2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 81, 1.9 g, 97%)를 회색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ1.91 - 2.19 (2H, m), 3.75 (3H, s), 4.03 (1H, m), 4.49 - 4.73 (2H, m), 6.73 (1H, d), 6.91 (1H, d), 7.35 (1H, d), 7.42 (1H, dd), 10.46 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 253.
중간체 82 : 메틸 2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트
DDQ (1.83 g, 8.07 mmol)를 DCM (100 mL) 중 메틸 2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 81, 1.85 g, 7.33 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 생성된 혼합물을 감압 하에 제거하여 갈색 고체를 얻었다. NaHCO3 포화 수용액 (100 mL)을 상기 고체에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 침전물을 여과시키고, 추가의 NaHCO3 수용액 (30 mL x 3)으로 헹구었다. 고체를 진공 하에 건조시켜 메틸 2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 82, 1.8 g, 98%)를 회색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.23 (2H, dt), 3.89 (3H, s), 4.90 (2H, dt), 7.76 - 7.85 (2H, m), 7.88 (1H, d), 12.55 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 251.
중간체 83 : 3-(2-플루오로에틸)-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온
THF 중 1 M 디이소부틸알루미늄 히드라이드 용액 (15.99 mL, 15.99 mmol)을 0℃의 THF (100 mL) 중 메틸 2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 82, 1.0 g, 4.00 mmol)에 일부씩 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 0℃의 포화 포타슘 소듐 타르트레이트 수용액 (20 mL) 및 MeOH (10 mL)로 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과시키고, THF (30 mL x 3)로 세척하였다. 유기 층을 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피, 물 (0.4% HCO2H) 중 5~60% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 3-(2-플루오로에틸)-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 83, 0.49 g, 55.2%)을 갈색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 3.20 (2H, dt), 4.60 (2H, d), 4.90 (2H, dt), 5.41 (1H, t), 7.21 (1H, dd), 7.30 (1H, d), 7.68 (1H, d), 12.42 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 223.
중간체 84 : 2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르브알데히드
데스-마틴 퍼요오디난 (229 mg, 0.54 mmol)을 DCM (3 mL) 중 3-(2-플루오로에틸)-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 83, 100 mg, 0.45 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피, 물 (0.4% HCO2H) 중 5~30% MeCN 용출 구배로 정제하였다. 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르브알데히드 (중간체 84, 93 mg, 94%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 3.20 - 3.28 (2H, m), 4.90 (2H, dt), 7.74 - 7.80 (2H, m), 7.91 (1H, d), 10.06 (1H, s), 12.66 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 221.
합성예 25 : 5-[4-[[2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00071
티타늄 이소프로폭시드 (64.5 mg, 0.23 mmol)를 THF (3 mL) 중 2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르브알데히드 (중간체 84, 50 mg, 0.23 mmol) 및 N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 13, 50.0 mg, 0.23 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2분 동안 교반시켰다. 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (192 mg, 0.91 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이것을 또 다른 배치에서 반복하고, 정제를 위해 2개의 배치를 합하였다. 합한 반응 혼합물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼, 30x150 mm 5 um; 이동상 A: 물 (10 MMOL/L NH4HCO3), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 20 B에서 35 B까지; 254/ 210 nm; RT: 6.38. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[[2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 25, 4.83 mg, 2.54%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.53 - 2.59 (4H, m), 2.78 (3H, d), 3.17 (1H, t), 3.23 (1H, t), 3.32 - 3.38 (4H, m), 3.63 (2H, s), 4.83 (1H, t), 4.95 (1H, t), 7.25 - 7.32 (2H, m), 7.39 (1H, dd), 7.71 (1H, d), 7.83 (1H, d), 8.26 (1H, d), 8.37 (1H, d), 12.36 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -217.70; m/z (ES+) [M+H]+ = 425.
Figure pct00072
합성예 26 : 6-플루오로-5-[4-[[2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00073
티타늄 이소프로폭시드 (90 mg, 0.32 mmol)를 THF (3 mL) 중 2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르브알데히드 (중간체 84, 70 mg, 0.32 mmol) 및 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 23, 76 mg, 0.32 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2분 동안 교반시켰다. 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (269 mg, 1.27 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 MeOH (0.1 mL)로 켄칭하였다. 반응 혼합물을 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼, 30x150 mm 5 um; 이동상 A: 물 (10 MMOL/L NH4HCO3), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 8분 내에 28 B에서 35 B까지; 254/ 210 nm; RT: 7. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 추가로 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: Xselect CSH OBD 컬럼 30*150 mm 5 um, n; 이동상 A: 물 (0.1% HCO2H), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 5 B에서 20 B까지; 254; 220 nm; RT: 6.83. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-플루오로-5-[4-[[2-(2-플루오로에틸)-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 26, 3.79 mg, 2.65%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.55 - 2.60 (4H, m), 2.76 (3H, d), 3.14 - 3.25 (6H, m), 3.63 (2H, s), 4.89 (2H, dt), 7.24 - 7.31 (2H, m), 7.57 (1H, dd), 7.70 (1H, d), 7.84 (1H, d), 8.24 (0.174H, s), 8.38 (1H, d), 12.37 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -72.51, -217.71; (ES+) [M+H]+ = 443.
Figure pct00074
중간체 86 : 메틸 3-니트로-4-(4,4,4-트리플루오로-1-메톡시-1-옥소부탄-2-일아미노)벤조에이트
DIPEA (8.77 mL, 50.22 mmol)를 DMF (20 mL) 중 메틸 4-플루오로-3-니트로벤조에이트 (2.0 g, 10.04 mmol) 및 메틸 2-아미노-4,4,4-트리플루오로부타노에이트 히드로클로라이드 (중간체 85, 2.2 g, 10.55 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 50℃에서 10시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 EtOAc (100 mL)로 희석시키고, 순차적으로 포화 수성 NH4Cl (100 mL x 1), 및 염수 (100 mL x 4)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켜 원하는 생성물, 메틸 3-니트로-4-((4,4,4-트리플루오로-1-메톡시-1-옥소부탄-2-일)아미노)벤조에이트 (중간체 86, 3.0 g, 85%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.99 - 3.28 (2H, m), 3.73 (3H, s), 3.84 (3H, s), 5.18 (1H, td), 7.28 (1H, d), 8.01 (1H, dd), 8.65 (1H, d), 8.71 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 351.
중간체 87 : 메틸 3-옥소-2-(2,2,2-트리플루오로에틸)-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트
20% Pd(OH)2/C (0.601 g, 0.86 mmol)를 수소 하에 MeOH (300 mL) 중 메틸 3-니트로-4-((4,4,4-트리플루오로-1-메톡시-1-옥소부탄-2-일)아미노)벤조에이트 (중간체 86, 3.0 g, 8.57 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시켰다. 여과액을 건조상태까지 증발시켜 메틸 3-옥소-2-(2,2,2-트리플루오로에틸)-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 87, 2.3 g, 93%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.64 - 2.83 (2H, m), 3.76 (3H, s), 4.32 - 4.37 (1H, m), 6.78 (1H, d), 6.90 (1H, d), 7.37 (1H, d), 7.43 (1H, dd), 10.64 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 289.
중간체 88 : 메틸 3-옥소-2-(2,2,2-트리플루오로에틸)-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트
DDQ (1.975 g, 8.70 mmol)를 DCM (100 mL) 중 메틸 3-옥소-2-(2,2,2-트리플루오로에틸)-1,2,3,4-테트라히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 87, 2.28 g, 7.91 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 생성된 혼합물을 감압 하에 제거하여 갈색 고체를 얻었다. NaHCO3 포화 수용액 (100 mL)을 상기 고체에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 침전물을 여과시키고, 추가의 NaHCO3 수용액 (30 mL x 3)으로 헹구었다. 고체를 진공 하에 건조시켜 메틸 3-옥소-2-(2,2,2-트리플루오로에틸)-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 88, 2.2 g, 97%)를 갈색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.88 - 3.98 (5H, m), 7.81 (1H, dd), 7.86 - 7.94 (2H, m), 12.75 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 287.
중간체 89 : 7-(히드록시메틸)-3-(2,2,2-트리플루오로에틸)퀴녹살린-2(1H)-온
THF 중 1 M 디이소부틸알루미늄 히드라이드 용액 (20.96 mL, 20.96 mmol)을 0℃의 THF (100 mL) 중 메틸 3-옥소-2-(2,2,2-트리플루오로에틸)-3,4-디히드로퀴녹살린-6-카르복실레이트 (중간체 88, 1.0 g, 3.49 mmol)에 일부씩 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 0℃의 포화 포타슘 소듐 타르트레이트 수용액 (20 mL) 및 MeOH (10 mL)로 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과시키고, THF (30 mL x 3)로 세척하였다. 유기 층을 증발시켜 황백색 고체를 수득하고, 이를 플래시 실리카 크로마토그래피, 물 (0.4% HCO2H) 중 5~55% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 7-(히드록시메틸)-3-(2,2,2-트리플루오로에틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 89, 650 mg, 72.2%)을 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 3.88 (2 H, q), 4.62 (2H, d), 5.45 (1H, t), 7.24 (1H, dd), 7.33 (1H, d), 7.73 (1H, d), 12.62 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 259.
합성예 27 : N-메틸-5-[4-[[3-옥소-2-(2,2,2-트리플루오로에틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00075
7-(히드록시메틸)-3-(2,2,2-트리플루오로에틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 89, 50 mg, 0.19 mmol)을 AcOH 중 33% HBr (2 mL, 12.15 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 증발시켜 7-(브로모메틸)-3-(2,2,2-트리플루오로에틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (조 생성물)을 수득하였다. 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 직접적으로 사용하였다. DIPEA (0.169 mL, 0.97 mmol)를 NMP (2 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-(2,2,2-트리플루오로에틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (조 생성물) 및 N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 13, 50 mg, 0.23 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 농축시키고, 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: Sunfire prep C18 컬럼, 30 x 150, 5 um; 이동상 A: 물 (0.1% HCO2H), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 10 B에서 25 B까지; 254/ 220 nm; RT: 6.57. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 N-메틸-5-[4-[[3-옥소-2-(2,2,2-트리플루오로에틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 27, 41.5 mg, 46.6%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.56 (4H, m), 2.78 (3H, d), 3.35 (4H, m), 3.65 (2H, s), 3.88 (2H, q), 7.29 - 7.42 (3H, m), 7.79 (2H, m), 8.25 - 8.30 (1H, m), 8.38 (1H, m),12.60 (1H, br s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -61.53; m/z (ES+) [M+H]+ = 461.
Figure pct00076
합성예 28 : 6-플루오로-N-메틸-5-[4-[[3-옥소-2-(2,2,2-트리플루오로에틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00077
7-(히드록시메틸)-3-(2,2,2-트리플루오로에틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 89, 60 mg, 0.23 mmol)을 AcOH 중 33% HBr (2 mL, 12.15 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 증발시켜 7-(브로모메틸)-3-(2,2,2-트리플루오로에틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (조 생성물)을 수득하였다. 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 직접적으로 사용하였다. DIPEA (0.203 mL, 1.16 mmol)를 NMP (2 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-(2,2,2-트리플루오로에틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (조 생성물) 및 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 23, 60 mg, 0.25 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: Sunfire prep C18 컬럼, 30 x 150, 5 um; 이동상 A: 물 (0.1% HCO2H), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 12 B에서 30 B까지; 254/ 220 nm; RT: 6.25. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-플루오로-N-메틸-5-[4-[[3-옥소-2-(2,2,2-트리플루오로에틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 28, 49.0 mg, 43.3%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.53 - 2.63 (4H, m), 2.76 (3H, d), 3.15 - 3.22 (4H, m), 3.65 (2H, s), 3.88 (2H, q), 7.28 - 7.35 (2H, m), 7.57 (1H, dd), 7.76 (1H, d), 7.84 (1H, dd), 8.17 (0.185H, s), 8.38 (1H, m), 12.57 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -61.54, -72.52; m/z (ES+) [M+H]+ = 479.
합성예 29 : 6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00078
DIPEA (330 μl, 1.89 mmol)를 20℃의 아세토니트릴 (2.4 mL) 중 7-(클로로메틸)-3-에틸-1,5-나프티리딘-2(1H)-온, HCl (중간체 17, 70 mg, 0.27 mmol), 요오드화나트륨 (4.05 mg, 0.03 mmol) 및 6-(디플루오로메틸)-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 41,102 mg, 0.30 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 생성된 용액을 50℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하고, 50 mL의 물, 이어서 3 mL의 포화 NaHCO3을 첨가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 농축 후, 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, DCM 중 0~30% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 건조상태까지 농축시켜 6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 29, 52.0 mg, 42%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500MHz, DMSO-d6) 1.19 (3H, t), 2.54 - 2.58 (2H, m), 2.63 (4H, br s), 2.84 (3H, d), 3.03 (4H, br t), 3.68 (2H, s), 7.14 (1H, t), 7.62 (1H, d), 7.76 (1H, s), 7.86 (1H, d), 8.10 (1H, d), 8.32 - 8.45 (2H, m), 11.86 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 457.
합성예 30 : 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-6 (트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00079
DIPEA (330 μl, 1.89 mmol)를 20℃의 아세토니트릴 (2.4 mL) 중 7-(클로로메틸)-3-에틸-1,5-나프티리딘-2(1H)-온, HCl (중간체 17, 70 mg, 0.27 mmol), 요오드화나트륨 (4.05 mg, 0.03 mmol) 및 N-메틸-5-피페라진-1-일-6-(트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 38,107 mg, 0.30 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 생성된 용액을 50℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하고, 50 mL의 물, 이어서 3 mL의 포화 NaHCO3을 첨가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 농축 후, 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, DCM 중 0~30% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 건조상태까지 농축시켜 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-6 (트리플루오로메틸)피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 30, 58.0 mg, 45%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500MHz, DMSO-d6) 1.19 (3H, t), 2.54 - 2.62 (6H, m), 2.83 (3H, d), 3.04 (4H, br t), 3.67 (2H, s), 7.62 (1H, d), 7.75 (1H, s), 8.04 (1H, d), 8.19 (1H, d), 8.31 - 8.48 (2H, m), 11.85 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 475.
합성예 31 : 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00080
DIPEA (0.366 mL, 2.10 mmol)를 20℃의 아세토니트릴 (2 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-에틸-1,5-나프티리딘-2(1H)-온 (중간체 14, 80 mg, 0.30 mmol) 및 N,6-디메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 45, 101 mg, 0.33 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 생성된 용액을 70℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하고, 50 mL의 물, 이어서 3 mL의 포화 NaHCO3을 첨가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 농축 후, 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피, DCM 중 0~30% MeOH 용출 구배로 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 건조상태까지 농축시켜 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 31, 36.0 mg, 29%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.19 (3H, t), 2.50 (3H, s), 2.54 - 2.57 (2H, m), 2.57 - 2.64 (4H, m), 2.81 (3H, d), 2.96 (4H, br s), 3.68 (2H, s), 7.49 (1H, d), 7.63 (1H, d), 7.76 (1H, s), 7.80 (1H, d), 8.35 - 8.47 (2H, m), 11.85 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 421.
Figure pct00081
중간체 90 : tert-부틸 4-[6-(에틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트
메탄올 중 에탄아민 (7M, 7.78 mL, 15.56 mmol)을 tert-부틸 4-(6-(메톡시카르보닐)피리딘-3-일)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 15, 500 mg, 1.56 mmol)의 용액에 첨가하고, 생성된 용액을 50℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하고, 샘플을 추가로 건조시켜 tert-부틸 4-[6-(에틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 90, 0.495 g, 95%)를 수득하였다. 1H NMR (500MHz, DMSO-d6) 1.11 (3H, t), 1.43 (9H, s), 3.27 - 3.32 (6H, m), 3.44 - 3.52 (4H, m), 7.42 (1H, dd), 7.85 (1H, d), 8.28 (1H, d), 8.44 (1H, br t).
중간체 91 : N-에틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드
디옥산 중 HCl (0.473 mL, 15.58 mmol)을 메탄올 (10 mL) 중 tert-부틸 4-(6-(에틸카르바모일)피리딘-3-일)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 90, 521 mg, 1.56 mmol)의 교반 용액에 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 17시간 동안 교반시켰다. 반응물을 농축시키고, 고체를 건조시켜 N-에틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 91, 421 mg, 88%)을 제공하였다; m/z (ES+) [M+H]+ = 235.
합성예 32 : N-에틸-5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드
Figure pct00082
DIPEA (0.320 mL, 1.83 mmol)를 20℃의 아세토니트릴 (2 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-에틸-1,5-나프티리딘-2(1H)-온 (중간체 14, 70 mg, 0.26 mmol), 및 N-에틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 91, 89 mg, 0.29 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 생성된 용액을 70℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하고, 50 mL의 물, 이어서 3 mL의 포화 NaHCO3을 첨가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 농축 후, 조 생성물을 역상 크로마토그래피 (컬럼: XbridC18), 물 (+ 0.2%NH4OH) 중 20~50% MeCN 용출 구배로 정제하였다. 순수 분획을 건조상태까지 증발시켜 N-에틸-5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드 (합성예 32, 28.0 mg, 25%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.10 (3H, t), 1.19 (3H, t), 2.52 - 2.55 (2H, m), 2.55 - 2.59 (4H, m), 3.26 - 3.30 (2H, m), 3.34 (4H, br d), 3.66 (2H, s), 7.40 (1H, dd), 7.63 (1H, s), 7.76 (1H, s), 7.83 (1H, d), 8.27 (1H, d), 8.36 - 8.46 (2H, m), 11.74 - 11.94 (1H, m); m/z (ES+) [M]+ = 420.
합성예 4 - 형태 A
합성예 4에서, 감압 하에 메탄올/디클로로메탄 용액을 증발시킴으로써 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드를 부분 결정성 고체로서 얻었다. 이렇게 얻은 결정성 물질은 결정 형태 A로 특성화되었다.
불량한 결정도의 경우, 20 mg의 조 샘플을 주위 온도 또는 50℃에서 1일 동안 0.20 ml의 물, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란, 에틸 아세테이트 또는 기타 용매에 현탁시켜 결정 형태 A를 수득할 수 있었다.
형태 A를 XRPD에 의해 분석하였고 그 결과가 도 16a에 나타나 있으며 하기에 표로 정리되어 있다:
형태 A에 대한 XRPD 피크
Figure pct00083
형태 A는 CuKα 방사선을 사용하여 측정된 하기 2θ 값들 중 적어도 하나를 제공하는 것을 특징으로 한다: 8.3, 12.4, 및 19.4°.
형태 A를 열적 기술로 분석하였다. DSC 분석에 의하면 형태 A는 융점이 254℃에서 시작되고 피크가 255℃인 것으로 나타났다. 형태 A의 대표적인 DSC 트레이스가 도 16b에 도시되어 있다.
생물학적 분석 (PARP1 선택적 억제제)
하기 테스트 절차를 이용하여 본원에 기술된 PARP1 선택적 억제제의 억제 특성을 결정할 수 있다.
PARP 형광 이방성 결합 분석
재조합 전장 6HIS 태깅 PARP1 단백질을 50 mM 트리스(Tris) pH 8, 0.001% 트리톤(Triton) X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl을 사용하여 6 nM까지 희석시키고, 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl로 희석된 당량 부피의 2 nM 형광 프로브와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 프로브의 최종 DMSO 농도를 1%(v/v) 미만으로 유지하였다.
재조합 전장 PARP2 단백질을 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl을 사용하여 6 nM까지 희석시키고, 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl로 희석된 당량 부피의 2 nM 형광 프로브와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 프로브의 최종 DMSO 농도를 1%(v/v) 미만으로 유지하였다.
재조합 전장 PARP3 단백질을 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl을 사용하여 100 nM까지 희석시키고, 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl로 희석된 당량 부피의 6 nM 형광 프로브와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 프로브의 최종 DMSO 농도를 1%(v/v) 미만으로 유지하였다.
재조합 PARP5a 결합 도메인을 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl을 사용하여 160 nM까지 희석시키고, 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl로 희석된 당량 부피의 6 nM 형광 프로브와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 프로브의 최종 DMSO 농도를 1%(v/v) 미만으로 유지하였다.
재조합 전장 GST 태깅 PARP6 단백질을 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl을 사용하여 160 nM까지 희석시키고, 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl로 희석된 당량 부피의 6 nM 형광 프로브와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 프로브의 최종 DMSO 농도를 1%(v/v) 미만으로 유지하였다.
단백질에 결합되는 경우 프로브의 형광 이방성을 테스트 화합물 또는 용매 대조군의 존재 하에 BMG Pherastar FSⓒ를 사용하여 측정하고, 이방성에 대한 영향을 결정하였다. IC50 값을 결정하기 위해 상이한 테스트 화합물 농도에 대한 억제율(%) 값을 계산하고, 4개 파라미터 로지스틱 플롯에 피팅시켰다. 필요한 경우, 화합물의 K i는 문헌[Anal. Biochem. 1980 Sep 1;107(1):220-39]에 정의된 Munson Rodbard 방정식을 사용하여 IC50 값으로부터 결정될 수 있으며, 관련 PARP 단백질에 결합하는 프로브의 공지된 K D를 기반으로 한다.
hERG의 전기생리학적 분석
안정적으로 형질감염된 CHO hKv11.1 세포로부터의 전기생리학적 기록(모두 RT에서 수행됨)을 Nanion Syncropatch 768PE를 사용하여 얻었다. 세포 상에 누적 투약을 허용하기 위해 6개의 화합물 플레이트 각각을 상이한 농도로 하여 테스트 화합물, 비히클 또는 양성 대조군을 첨가하였다(10 mM, 3.167 mM, 1 mM, 0.3167 mM, 0.1 mM, 0.03167 mM). 600 μl의 화합물을, 39.6 μM, 13.2 μM, 4.4 μM, 1.46 μM, 0.48 μM, 0.16 μM의 최종 화합물 농도를 위하여 90 μl의 기준 완충액(mM 단위로, NaCl 80, KCL 4, CaCl 5, MgCl 1, NMDG Cl 60, D-글루코스 1수화물 5, HEPES 10(pH7.4 HCL, 298 mOsm))에 재현탁한다. 각각의 Nanion Syncropatch 768PE 실행에 있어서, 세포외 용액 (mM 단위로, NaCl 80, KCL 4, CaCl 5, MgCl 1, NMDG Cl 60, D-글루코스 1수화물 5, HEPES 10 (pH7.4 HCL, 298 mOsm))의 존재 하에서의 각각의 세포에서의 전류 진폭을, Syncropatch 액체 처리 시스템을 사용하여 수행된 모든 액체 추가에 의해 측정한다. 40 μL의 외부 용액 (mM 단위로, HBPS, CaCl2 2, MgCl2 1(pH7.4, NaOH))을 384웰 멀티홀 매체 저항 기록 칩에 첨가하고, 내부 완충액 (mM 단위로, KF 130, KCl 20, MgCl2 1, EGTA 10, HEPES 10, Escin 25 (모두 Sigma-Aldrich; 10 M KOH를 사용하여 pH 7.2~7.30, 320 mOsm))을 플레이트의 하면에 관류한다. 대략 9℃에서 유지되는 1e6개의 세포/ml의 밀도로 세포 20 μL, 이어서 시일(seal) 향상제 20 μL(mM 단위로, NaCl 80, KCl 3, CaCl 10, HEPES 10, MgCl 1 (pH7.4 NaOH))를 칩의 각각의 웰에 분배한다. 40 μL의 잔존 부피를 남기고 세척 단계를 수행한다. 40 μL의 기준 완충액을 분배하여 안정적인 기준선을 확립한 후 테스트 화합물을 첨가하며, 이때 3분 후 40 μL의 제거 단계가 있고, 이 단계를 반복한다. 40 μL의 화합물 농도 1 (0.16 μM)을 분배하고, 3분 노출 동안 '실시간' 기록을 한 후 40 μL를 제거한다. 이 단계를 5개의 후속 화합물 플레이트에 대해 반복하여 누적 곡선 분석을 생성한다. 모든 데이터는 누출 차감되며, -80 mV 100 ms까지 2개 펄스는 100 ms의 지연이 있다. 그 후 외향성 K+ 전류는 -90 mV의 유지 전위로부터 +60 mV까지 전압 스텝에 의해 유발되며, 각각의 펄스는 15s 펄스 간격으로 2 Hz의 주파수로 전달된다.
PARP 증식 분석(4일 화합물 투약)
DLD1 및 BRCA2 (-/-) DLD1 세포를 완전 배지 중에 각각 1.875E4개의 세포/ml 및 6.25E4개의 세포/ml의 밀도까지 수확하고, Multidrop Combi를 사용하여 40 μL/웰을 384웰 플레이트(Greiner, 오스트리아 크렘스문스테르 소재; 781090) 내에 시딩하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음 날(제1일) Multidrop Combi를 사용하여 sytox green(5 ul, 2 uM) 및 사포닌(10 ul, 0.25% 스톡)을 제0일 플레이트에 첨가하고, 흑색 접착 뚜껑을 사용하여 플레이트를 밀봉하고, 실온에서 >3시간 동안 인큐베이션하였다. 4x 대물렌즈가 장착된 Cell Insight(Thermo Fisher)를 사용하여 세포를 이미지화하였다. Echo 555를 사용하여 테스트 화합물을 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 유지되는 인큐베이터에 넣고, 4일 동안 인큐베이션하였다. 제5일에 sytox green(5 ul, 2 uM) 및 그 후 사포닌(10 ul, 0.25% 스톡)을 플레이트에 첨가하고, 흑색 접착 뚜껑을 사용하여 플레이트를 밀봉하고, 실온에서 >3시간 동안 인큐베이션하였다. 4x 대물렌즈가 장착된 Cell Insight에서 모든 세포를 판독하였다. 제0일 및 제5일 플레이트에 대한 Cell Insight로부터의 총 세포 수 출력을 평가하여 Genedata에서 증식 속도를 결정한다.
Figure pct00084
Figure pct00085
실시예 1: 항체-약물 접합체의 제조
WO2015/115091에 기술된 생성 방법에 따라 그리고 항-HER2 항체 (서열 번호 11 (서열 번호 1의 아미노산 잔기 1 내지 449)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 2의 모든 아미노산 잔기 1 내지 214로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체)를 사용하여, 하기 화학식:
Figure pct00086
(여기서, A는 항체에 대한 연결 위치를 나타냄)
으로 표시되는 약물-링커가 티오에테르 결합을 통해 항-HER2 항체에 접합된 항-HER2 항체-약물 접합체를 생성하였다 (DS-8201: 트라스투주맙 데룩스테칸). 항체-약물 접합체의 DAR은 7.7 또는 7.8이다.
실시예 2: PARP1 선택적 억제제의 생성
본원에 기술된 제조 방법에 따라, 화학식 I의 PARP1 선택적 억제제가 제조된다. 구체적으로, 5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드:
Figure pct00087
는 본원의 합성예 4 (WO2021/013735의 실시예 4)에 따라 제조될 수 있다.
실시예 3: 항종양 테스트
항체-약물 접합체 DS-8201 (트라스투주맙 데룩스테칸 (Enhertu®))과 PARP1 선택적 억제제 AZD5305 (5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드)의 조합
방법:
고처리량 조합 스크린을 진행하였으며, 다양한 HER2 발현을 갖는 27개의 유방암 세포주 및 고 HER2 발현을 갖는 1개의 위 세포주 (표 1)를 DS-8201과 AZD5305 (PARP1 선택적 억제제)의 조합으로 처리하였다.
[표 1]
Figure pct00088
스크린의 판독값은 6 x 6 용량 반응 매트릭스 (DS-8201에 대해 5점 로그 연속 희석 및 AZD5305에 대해 하프 로그 연속 희석)로서 수행된, 7일 CellTiter-Glo 세포 생존능 분석이었다. 최대 농도는 AZD5305의 경우 3 μM이고 DS-8201의 경우 10 μg/ml이었다. 또한, 효과적인 조합의 작용 메커니즘을 해독하는 데 도움을 주기 위해, 트라스투주맙 및 엑사테칸 (DNA 국소이성질화효소 I 억제제)을 AZD5305와 병행하여 또한 스크리닝하였다. ΔEmax 및 Loewe 시너지 점수의 조합에 기초하여 조합 활성을 평가하였다.
결과:
HER2 고 세포주 (KPL4, NCI-N87, SKBR3, HCC1954, HCC1569, AU565)에 대해 도 12a 및 12b 및 표 2에, 그리고 HER2 저 세포주 (MDA-MB-468, MDA-MB-157, HCC1187, T47D, HCC38)에 대해 도 13a 및 13b 및 표 3에 결과가 나타나 있다.
도 12a 및 13a는 측정된 세포 생존능 신호의 매트릭스를 나타낸다. X 축은 약물 A (DS-8201)를 나타내고, Y 축은 약물 B (AZD5305)를 나타낸다. 상자 안의 값은 7일차에 DMSO 대조군과 비교하여 약물 A + B로 처리된 세포의 비를 나타낸다. 모든 값은 0일차의 세포 생존능 값에 대해 정규화된다. 0 내지 100의 값은 % 성장 억제율을 나타내고 100을 초과하는 값은 세포 사멸을 나타낸다.
도 12b 및 13b는 Loewe 초과 매트릭스(excess matrix)를 나타낸다. 상자 안의 값은 Loewe 가산성 모델에 의해 계산된 초과 값을 나타낸다.
표 2 및 3은 HSA 시너지 및 Loewe 가산성 점수를 나타낸다:
[표 2]
Figure pct00089
[표 3]
Figure pct00090
도 14는 AZD5305와 조합된 DS-8201로 치료된 다양한 세포주에서 조합 Emax 및 Loewe 시너지 점수를 나타낸다.
도 12a 및 12b, 및 표 2에 나타난 바와 같이, AZD5305는 DS-8201과 시너지로 상호작용하고 또한 HER2+ 유방 및 위 세포주에서 세포 사멸을 증가시켰다. 도 13a 및 13b, 및 표 3에 나타난 바와 같이, AZD5305는 DS-8201과 시너지로 상호작용하고 또한 Emax (3 μM AZD5305 및 10 μg/ml DS-8201)에서 HER2 저 유방암 세포주에서 세포 사멸을 증가시켰다. 도 14에 나타난 바와 같이, HER2 저 유방암 세포주를 포함하는 11개의 세포주에서, AZD5305와 조합된 DS-8201을 사용한 치료는 높은 조합 Emax (>100) 및 높은 Loewe 시너지 점수 (>5)를 초래하였다.
실시예 4: 항종양 테스트
항체-약물 접합체 DS-8201 (트라스투주맙 데룩스테칸 (Enhertu®))과 PARP1 선택적 억제제 AZD5305 (5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드)의 조합
방법:
각각의 조건에서 성장한 세포를 분석 기간(4 내지 8일) 동안 선형 증식이 가능하도록 최적의 밀도로 96웰 플레이트에 도말하였다. 도말 직후에, 지시된 화합물을 세포에 총 부피 200 μL/웰로 투여하고 인큐베이터에 넣었다. 조합을 각 조합에 대해 6 x 8 농도 반응 매트릭스로서 수행하였다. 종점에서, 세포를 실온에서 20분 동안 2% PFA에 고정시켰다. 처리 시작 시 세포 수를 구하기 위해, 각 실험에 대해 하나의 추가 플레이트를 사용하여 세포 부착 후 고정하였다. 이어서 세포를 PBS 중 0.5% 트리톤-X100에서 10분 동안 투과성화하였다. PBS 세척 후에, 세포를 RT에서 1시간 동안 PBS 중 5% FBS에서 블로킹하고 5% FBS + 0.05% 트리톤 중에서 일차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 인큐베이션하였다. PBS에서 3회 세척 후, 세포를 실온에서 1시간 동안 Hoechst33258과 함께 5% FBS + 0.05% 트리톤에서 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. PBS에서 3회 세척 후, 세포를 9 필드/웰 및 10x 대물렌즈를 갖는 Cellinsight 기기로 스캔하였다. 핵 Hoechst 염색에 기초한 세포 카운트에 대해 Columbus를 사용하여 이미지를 분석하였다. 총 세포 카운트/웰을 사용하여 용매 대조군과 비교하여 각 웰에서 상대적 성장을 계산하였다. 시너지 점수를 계산하기 위해, Combenefit 소프트웨어를 사용하여 성장 억제 데이터를 분석하였다 (문헌[Di Veroli, G.Y., et al., Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations. Bioinformatics, 2016, 32(18): p. 2866-8]).
결과:
HER2 고 세포주 (KPL4) 및 2개의 HER2 저 세포주 (JIMT1, MDA-MB-468)에 대한 결과가 도 15a 및 15b에 나타나 있다.
도 15a는, Y 축이 약물 A (DS-8201)를 나타내고 X 축이 약물 B (AZD5305)를 나타내는 세포 카운트 매트릭스를 나타낸다. 상자 안의 값은 상대적 총 셀(핵) 카운트를 DMSO 비히클 대조군에 대한 백분율로서 나타낸다.
도 15b는, Y 축이 약물 A (DS-8201)를 나타내고 X 축이 약물 B (AZD5305)를 나타내는 매트릭스를 나타내며, 상자 안의 값은 계산된 Loewe 시너지 점수를 나타낸다.
실시예 3 및 4의 결과는 AZD5305를 사용한 선택적 PARP1 억제가 시험관 내에서 고 및 저 HER2-발현 세포주 둘 모두에서 DS-8201의 항종양 효능을 향상시킨다는 것을 입증한다. 실시예 3에서, DS-8201과 조합된 AZD5305는 5개의 HER2+ 유방암 세포주, 1개의 HER2+ 위암 세포주 (도 12a, 12b, 14 및 표 2) 및 5개의 HER2 저 유방암 세포주 (도 13a, 13b 및 14, 표 3)에서 조합 이점을 나타내었다. 실시예 4에서, DS-8201과 조합된 AZD5305는 HER2-고 (KPL4) 및 HER2-저 (JIMT-1, MDA-MB-468) 세포주에서 시너지 활성을 나타내었다 (도 15a 및 15b).
실시예 5: 항종양 테스트 - 생체 내
항체-약물 접합체 DS-8201 (트라스투주맙 데룩스테칸 (Enhertu®))과 PARP1 선택적 억제제 AZD5305 (5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드)의 조합
방법:
5 내지 8주령 암컷 누드 마우스 (Charles River)를 연구에 들어가기 전 7일간 적응시킨 후에 사용하였다. 1x107 NCI-N87 종양 세포 (마트리겔 중 1:1)를 암컷 누드 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 종양이 대략 150 mm3에 도달했을 때, 비슷한 크기의 종양을 표 4에 나타낸 바와 같은 치료군에 무작위로 할당하였다:
[표 4]
Figure pct00091
각 동물에 대한 화합물의 용량은 투약 당일 개별 체중을 기준으로 계산되었다. DS-8201 및 AZD5305는 같은 날에 투약되었으며, DS-8201은 AZD5305의 PO 투약 약 1시간 후에 투여되었다. DS-8201은 1일차에 1 mg/kg 또는 3 mg/kg의 단일 용량으로 투여되었고 AZD5305는 28일 동안 1 mg/kg QD로 투여되었다. 투약 기간은 28일이었다.
3 mg/kg 및 1 mg/kg의 DS-8201의 제형화
투약 당일에 DS-8201 스톡 (20.1 mg/ml)을 각각 3 mg/kg 및 1 mg/kg 투약 용액에 대해 0.6 mg/ml 및 0.2 mg/ml로 25 mM 히스티딘 완충액, 9% 수크로스 (pH5.5)에 희석하여 DS-8201의 투약 용액을 제조하였다. 각 투약 용액을 5 ml/kg의 투약 부피로 IV 주사를 통해 투여하기 전에 피펫을 사용하여 잘 혼합하였다.
1 mg/kg의 AZD5305의 제형화
1 mg/kg 투약 용액을 제형화하기 위해, PO 투약을 위한 10 ml/kg의 투약 부피를 초래하는 0.1 mg/ml 농도의 AZD5305를 준비하였다. 총 49 ml의 비히클이 필요하였다. 15 μl 부피의 1M HCl을 화합물에 첨가하고 볼텍싱에 의해 잘 혼합하였다. 1 ml 부피의 멸균수를 Eppendorf 튜브에 첨가하고 펠릿 막자를 사용하여 화합물과 잘 혼합하였다. 화합물을 약 5분 동안 초음파 처리한 다음, 내용물을 유리병으로 옮겼다. 1 ml 부피의 멸균수를 사용하여 Eppendorf 튜브에서 임의의 나머지 화합물을 헹구고 유리병으로 옮겼다. 나머지 부피의 멸균수(37.2 ml; 총 비히클 부피의 총 80%)를 유리병에 첨가하고 자석 교반기를 사용하여 잘 혼합하였다. 투약 용액의 pH를 pH 3.74로 조정한 다음, 나머지 비히클(9.772 ml의 멸균수)을 유리병에 첨가하고 자석 교반기를 사용하여 잘 혼합하였다. 투약 용액을 빛으로부터 보호하고 투약을 위해 매일 소량을 분취량을 취하였다. 모든 나머지 투약 용액은 냉장고에서 최대 7일 동안 보관되었다. 1 mg/kg AZD5305에 대한 최종 투약 매트릭스는 투명 용액이었다.
측정
종양 성장 억제율 (TGI)을 다음과 같이 계산하였다:
TGI% = {1-(MTV 치료/MTV 대조군)}*100
여기서, MTV = 평균 종양 부피임.
비히클 대조군과 비교하여, 최종 측정일에 (log(상대적 종양 부피) = log(최종 부피 / 시작 부피))의 단측 t-검정을 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다.
결과
DS-8201 또는 AZD5305 단독 치료 또는 AZD5305와 조합된 DS-8201 치료에 대한 종양 부피가 도 17에 나타나 있다. 데이터는 치료군에 대한 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 나타낸다. 도 17의 점선은 투약 기간의 종료를 나타낸다. 전체 용량 및 일정 정보에 대해서는 상기 표 4를 참조한다. 표시된 값은 평균 ±SEM이고; 비히클-처리된 마우스에 대해 초기에 n=10이고 모든 다른 치료군에 대해 n=8이다.
NCI-N87 이종이식편에서, DS-8201 또는 AZD5305 단독 치료 또는 AZD5305와 조합된 DS-8201 치료 후 TGI 반응 (41일차 TGI%)이 표 5에 나타나 있다:
[표 5]
Figure pct00092
3 mg/kg에서 DS-8201을 사용한 단독요법은 치료 후 41일차에 62%의 TGI 값을 나타내었다. 1 mg/kg에서 DS-8201은 치료 후 41일차에 25%의 TGI를 나타내었다. AZD5305 단독요법은 치료 후 41일차에 40%의 TGI를 달성하였다. 1 mg/kg에서, AZD5305와 DS-8201의 조합 치료는 치료 후 41일차에 55%의 TGI를 초래하였다. 더 높은 DS-8201 3 mg/kg 용량을 AZD5305와 함께 사용한 조합 요법은 치료 후 41일차에 90%의 상당한 TGI를 달성하였으며 각각의 단독요법보다 더 우수한 반응을 나타내었다.
치료군은 일반적으로 내약성이 양호하였고 (15% 초과의 체중 감소로 인해 2마리의 이상치 동물이 연구에서 제외됨), 모든 치료군의 평균 체중은 연구 동안 안정적으로 유지되었다.
실시예 6:
시험관 내에서 HER2 고, HER2 저, 및 HER2 돌연변이-발현 세포주에서 항체-약물 접합체 DS-8201 (트라스투주맙 데룩스테칸 (Enhertu®))과 PARP1 선택적 억제제 AZD5305 (5-[4-[(7-에틸-6-옥소-5H-1,5-나프티리딘-3-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드)의 조합 투여
방법:
다양한 HER2 발현을 갖는 4개의 폐암 세포주 (표 6) 및 HER2 돌연변이 암 세포주 (표 7)를 DS-8201과 AZD5305의 조합으로 스크리닝하는 고-처리량 조합 스크리닝을 진행하였다.
[표 6]
Figure pct00093
[표 7]
Figure pct00094
스크린의 판독값은 6 x 6 용량 반응 매트릭스 (각 조합에 대해 각각 하프-로그 연속 희석의 DS-8201 및 AZD5305)로서 수행된, 7일 CellTiter-Glo 세포 생존능 분석이었다. 최대 농도는 AZD5305의 경우 3.33 또는 10 μM이고 DS-8201의 경우 100 μg/ml이었다. ΔEmax 및 Loewe 시너지 점수의 조합에 기초하여 조합 활성을 평가하였다.
결과:
HER2+, HER2 저, HER2 저/널 NSCLC 세포주 (HCC1171, NCIH1573, NCIH2170, Calu6)에 대해 도 18a, 18b 및 18c, 및 표 8에, 그리고 HER2 돌연변이 세포주 (5637)에 대해 도 19a, 19b 및 19c, 및 표 9에 결과가 나타나 있다.
도 18a 및 19a는 측정된 세포 생존능 신호의 매트릭스를 나타낸다. X 축은 약물 A (DS-8201)를 나타내고, Y 축은 약물 B (AZD5305)를 나타낸다. 상자 안의 값은 7일차에 DMSO 대조군과 비교하여 약물 A + B로 처리된 세포의 비를 나타낸다. 모든 값은 0일차의 세포 생존능 값에 대해 정규화된다. 0 내지 100의 값은 % 성장 억제율을 나타내고 100을 초과하는 값은 세포 사멸을 나타낸다.
도 18b 및 18b는 Loewe 초과 매트릭스를 나타낸다. 상자 안의 값은 Loewe 가산성 모델에 의해 계산된 초과 값을 나타낸다.
도 18c 및 19c는 HSA 초과 매트릭스를 나타낸다. 상자 안의 값은 HSA (최고 단일 제제) 모델에 의해 계산된 초과 값을 나타낸다.
표 8 및 9은 HSA 시너지 및 Loewe 가산성 점수를 나타낸다:
[표 8]
Figure pct00095
[표 9]
Figure pct00096
도 18a, 18b 및 18c, 및 표 8에 나타난 바와 같이, AZD5305는 DS-8201과 시너지로 상호작용하며 또한 HER2+ 세포주 NCIH2170에서 Emax (0.125 μM AZD5305 및 100 μg/ml DS-8201)에서, HER2 저 세포주 HCC1171에서 Emax (0.125 μM AZD5305 및 100 μg/ml DS-8201)에서 그리고 HER2 저/널 세포주 Calu6에서 Emax (1.25 μM AZD5305 및 100 μg/ml DS-8201)에서 세포 사멸을 증가시켰다. 단일 제제 활성이 없거나 낮은 경우에도 조합 활성이 관찰되었다. 세포주 NCIH1573에서는 시너지가 관찰되었지만, 세포 사멸은 없었다.
도 19a, 19b 및 19c, 및 표 9에 나타난 바와 같이, AZD5305는 DS-8201과 시너지로 상호작용하고 또한 HER2 돌연변이 세포주 5637에서 Emax (1.25 μM AZD5305 및 100 μg/ml DS-8201)에서 세포 사멸을 증가시켰다. 조합 활성은 단일 제제로서의 AZD5305가 활성이 아닌 경우에도 관찰되었다.
상기 기재된 명세서는 당업자가 실시 형태를 실시할 수 있기에 충분한 것으로 여겨진다. 전술한 설명 및 실시예는 특정 실시 형태를 상세히 설명하며, 발명자들이 고안한 최적의 방식을 기술하고 있다. 그러나 전술된 내용이 문헌에서 얼마나 상세히 기술되었는지에 관계없이, 이러한 실시 형태들은 다양한 방식으로 실행될 수 있고, 청구범위는 이의 임의의 등가물을 포함한다는 점이 이해될 것이다.
서열 목록의 프리 텍스트
서열 번호 1 - 항-HER2 항체의 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 2 - 항-HER2 항체의 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 3 - 중쇄 CDRH1의 아미노산 서열 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 26 내지 33]
서열 번호 4 - 중쇄 CDRH2의 아미노산 서열 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 51 내지 58]
서열 번호 5 - 중쇄 CDRH3의 아미노산 서열 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 97 내지 109]
서열 번호 6 - 경쇄 CDRL1의 아미노산 서열 [= 서열 번호 2의 아미노산 잔기 27 내지 32]
서열 번호 7 - 경쇄 CDRL2 (SAS)의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열 [= 서열 번호 2의 아미노산 잔기 50 내지 56]
서열 번호 8 - 경쇄 CDRL3의 아미노산 서열 [= 서열 번호 2의 아미노산 잔기 89 내지 97]
서열 번호 9 - 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 1 내지 120]
서열 번호 10 - 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 [= 서열 번호 2의 아미노산 잔기 1 내지 107]
서열 번호 11 - 중쇄의 아미노산 서열 [= 서열 번호 1의 아미노산 잔기 1 내지 449]
<110> AstraZeneca UK Limited and DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> COMBINATION OF ANTIBODY-DRUG CONJUGATE AND PARP1 SELECTIVE INHIBITOR <130> PN838961WO <150> US63-089859 <151> 2020-10-09 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of humanized anti-HER2 antibody <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of humanized anti-HER2 antibody <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of heavy chain of humanized anti-HER2 antibody <400> 3 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of heavy chain of humanized anti-HER2 antibody <400> 4 Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr 1 5 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of heavy chain of humanized anti-HER2 antibody <400> 5 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of light chain of humanized anti-HER2 antibody <400> 6 Gln Asp Val Asn Thr Ala 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence comprising CDRL2 of light chain of humanized anti-HER2 antibody <400> 7 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of light chain of humanized anti-HER2 antibody <400> 8 Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 9 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of heavy chain of humanized anti-HER2 antibody <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of light chain of humanized anti-HER2 antibody <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of humanized anti-HER2 antibody <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly

Claims (89)

  1. 조합 투여를 위한 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 포함하는 제약 제품으로서, 항-HER2 항체-약물 접합체는 하기 화학식:
    Figure pct00097

    (여기서, A는 항체에 대한 연결 위치를 나타냄)으로 표시되는 약물-링커가 티오에테르 결합을 통해 항-HER2 항체에 접합된 항체-약물 접합체인, 제약 제품.
  2. 제1항에 있어서, PARP1 선택적 억제제는 하기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염인, 제약 제품:
    [화학식 I]
    Figure pct00098

    (상기 식에서,
    X1 및 X2는 N 및 C(H)로부터 각각 독립적으로 선택되며,
    X3은 N 및 C(R4)로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, R4는 H 또는 플루오로이며,
    R1은 C1-4 알킬 또는 C1-4 플루오로알킬이며,
    R2는 H, 할로, C1-4 알킬, 및 C1-4 플루오로알킬로부터 독립적으로 선택되며;
    R3은 H 또는 C1-4 알킬이되,
    단,
    X1이 N이면, X2는 C(H)이고, X3은 C(R4)이며,
    X2가 N이면, X1은 C(H)이고, X3은 C(R4)이며,
    X3이 N이면, X1 및 X2 둘 다가 C(H)임).
  3. 제2항에 있어서,
    화학식 I에서, R3은 C1-4 알킬인, 제약 제품.
  4. 제2항에 있어서, 화학식 I에서, R3은 메틸인, 제약 제품.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I에서, R1은 에틸인, 제약 제품.
  6. 제1항에 있어서, PARP1 선택적 억제제는 하기 화학식 Ia로 표시되는 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염인, 제약 제품:
    [화학식 Ia]
    Figure pct00099

    (상기 식에서,
    R1은 C1-4 알킬이며,
    R2는 H, 할로, C1-4 알킬, 및 C1-4 플루오로알킬로부터 선택되며,
    R3은 H 또는 C1-4 알킬이며,
    R4는 H임).
  7. 제6항에 있어서, 화학식 Ia에서, R2는 H 또는 할로인, 제약 제품.
  8. 제6항에 있어서, 화학식 Ia에서, R1은 에틸이며, R2는 H, 클로로 및 플루오로로부터 선택되며, R3은 메틸인, 제약 제품.
  9. 제1항에 있어서, PARP1 선택적 억제제는 하기 화학식으로 표시되는 AZD5305 또는 이의 제약상 허용가능한 염인, 제약 제품:
    Figure pct00100
    .
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항-HER2 항체는 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH1, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH2 및 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH3을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRL1, 서열 번호 7의 아미노산 잔기 1 내지 3으로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 CDRL2 및 서열 번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDRL3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체인, 제약 제품.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항-HER2 항체는 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체인, 제약 제품.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항-HER2 항체는 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체인, 제약 제품.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항-HER2 항체는 서열 번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체인, 제약 제품.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항-HER2 항체-약물 접합체는 하기 화학식으로 표시되는, 제약 제품:
    Figure pct00101

    (여기서, '항체'는 티오에테르 결합을 통해 약물-링커에 접합된 항-HER2 항체를 나타내며, n은 항체-약물 접합체에서 항체 분자당 접합된 약물-링커의 평균 단위 수를 나타내고, n은 7 내지 8의 범위임).
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항-HER2 항체-약물 접합체는 트라스투주맙 데룩스테칸 (DS-8201)인, 제약 제품.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제품은 동시 투여를 위한, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 포함하는 조성물인, 제약 제품.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제품은 순차 또는 동시 투여를 위한, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 포함하는 조합 제제인, 제약 제품.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제품은 암 치료용인, 제약 제품.
  19. 제18항에 있어서, 암은 유방암, 위암, 결장직장암, 폐암, 식도암, 두경부암, 식도위 접합부 선암종, 담도암, 파제트병, 췌장암, 난소암, 자궁 암육종, 요로상피암, 전립선암, 방광암, 위장관 기질 종양, 소화관 기질 종양, 자궁경부암, 편평세포 암종, 복막암, 간암, 간세포암, 자궁체 암종, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 음경암, 백혈병, 악성 림프종, 형질세포종, 골수종, 교모세포종 다형체, 골육종, 육종, 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 제약 제품.
  20. 제19항에 있어서, 암은 유방암인, 제약 제품.
  21. 제20항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 3+인, 제약 제품.
  22. 제20항에 있어서, 유방암은 HER2 저발현 유방암인, 제약 제품.
  23. 제20항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 2+인, 제약 제품.
  24. 제20항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 1+인, 제약 제품.
  25. 제20항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC >0 및 <1+인, 제약 제품.
  26. 제20항에 있어서, 유방암은 삼중 음성 유방암인, 제약 제품.
  27. 제18항에 있어서, 암은 위암인, 제약 제품.
  28. 제18항에 있어서, 암은 결장직장암인, 제약 제품.
  29. 제18항에 있어서, 암은 폐암인, 제약 제품.
  30. 제29항에 있어서, 폐암은 비소세포 폐암인, 제약 제품.
  31. 제18항에 있어서, 암은 췌장암인, 제약 제품.
  32. 제18항에 있어서, 암은 난소암인, 제약 제품.
  33. 제18항에 있어서, 암은 전립선암인, 제약 제품.
  34. 제18항에 있어서, 암은 신장암인, 제약 제품.
  35. 암 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제약 제품.
  36. 제35항에 있어서, 암은 유방암, 위암, 결장직장암, 폐암, 식도암, 두경부암, 식도위 접합부 선암종, 담도암, 파제트병, 췌장암, 난소암, 자궁 암육종, 요로상피암, 전립선암, 방광암, 위장관 기질 종양, 소화관 기질 종양, 자궁경부암, 편평세포 암종, 복막암, 간암, 간세포암, 자궁체 암종, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 음경암, 백혈병, 악성 림프종, 형질세포종, 골수종, 교모세포종 다형체, 골육종, 육종, 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 사용하기 위한 제약 제품.
  37. 제35항에 있어서, 암은 유방암인, 사용하기 위한 제약 제품.
  38. 제37항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 3+인, 사용하기 위한 제약 제품.
  39. 제37항에 있어서, 유방암은 HER2 저발현 유방암인, 사용하기 위한 제약 제품.
  40. 제37항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 2+인, 사용하기 위한 제약 제품.
  41. 제37항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 1+인, 사용하기 위한 제약 제품.
  42. 제37항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC >0 및 <1+인, 사용하기 위한 제약 제품.
  43. 제37항에 있어서, 유방암은 삼중 음성 유방암인, 사용하기 위한 제약 제품.
  44. 제35항에 있어서, 암은 위암인, 사용하기 위한 제약 제품.
  45. 제35항에 있어서, 암은 결장직장암인, 사용하기 위한 제약 제품.
  46. 제35항에 있어서, 암은 폐암인, 사용하기 위한 제약 제품.
  47. 제46항에 있어서, 폐암은 비소세포 폐암인, 사용하기 위한 제약 제품.
  48. 제35항에 있어서, 암은 췌장암인, 사용하기 위한 제약 제품.
  49. 제35항에 있어서, 암은 난소암인, 사용하기 위한 제약 제품.
  50. 제35항에 있어서, 암은 전립선암인, 사용하기 위한 제약 제품.
  51. 제35항에 있어서, 암은 신장암인, 사용하기 위한 제약 제품.
  52. 암을 치료하기 위한, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제의 조합 투여를 위한 의약의 제조에 있어서 항-HER2 항체-약물 접합체 또는 PARP1 선택적 억제제의 용도로서, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인, 용도.
  53. 제52항에 있어서, 암은 유방암, 위암, 결장직장암, 폐암, 식도암, 두경부암, 식도위 접합부 선암종, 담도암, 파제트병, 췌장암, 난소암, 자궁 암육종, 요로상피암, 전립선암, 방광암, 위장관 기질 종양, 소화관 기질 종양, 자궁경부암, 편평세포 암종, 복막암, 간암, 간세포암, 자궁체 암종, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 음경암, 백혈병, 악성 림프종, 형질세포종, 골수종, 교모세포종 다형체, 골육종, 육종, 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 용도.
  54. 제52항에 있어서, 암은 유방암인, 용도.
  55. 제54항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 3+인, 용도.
  56. 제54항에 있어서, 유방암은 HER2 저발현 유방암인, 용도.
  57. 제54항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 2+인, 용도.
  58. 제54항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 1+인, 용도.
  59. 제54항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC >0 및 <1+인, 용도.
  60. 제54항에 있어서, 유방암은 삼중 음성 유방암인, 용도.
  61. 제52항에 있어서, 암은 위암인, 용도.
  62. 제52항에 있어서, 암은 결장직장암인, 용도.
  63. 제52항에 있어서, 암은 폐암인, 용도.
  64. 제63항에 있어서, 폐암은 비소세포 폐암인, 용도.
  65. 제52항에 있어서, 암은 췌장암인, 용도.
  66. 제52항에 있어서, 암은 난소암인, 용도.
  67. 제52항에 있어서, 암은 췌장암인, 용도.
  68. 제52항에 있어서, 암은 신장암인, 용도.
  69. 제52항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 의약은 동시 투여를 위한, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 포함하는 조성물인, 용도.
  70. 제52항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 의약은 순차 또는 동시 투여를 위한, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 포함하는 조합 제제인, 용도.
  71. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에 조합 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
  72. 제71항에 있어서, 암은 유방암, 위암, 결장직장암, 폐암, 식도암, 두경부암, 식도위 접합부 선암종, 담도암, 파제트병, 췌장암, 난소암, 자궁 암육종, 요로상피암, 전립선암, 방광암, 위장관 기질 종양, 소화관 기질 종양, 자궁경부암, 편평세포 암종, 복막암, 간암, 간세포암, 자궁체 암종, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 음경암, 백혈병, 악성 림프종, 형질세포종, 골수종, 교모세포종 다형체, 골육종, 육종, 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 방법.
  73. 제71항에 있어서, 암은 유방암인, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 3+인, 방법.
  75. 제73항에 있어서, 유방암은 HER2 저발현 유방암인, 방법.
  76. 제73항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 2+인, 방법.
  77. 제73항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC 1+인, 방법.
  78. 제73항에 있어서, 유방암은 HER2 상태 점수가 IHC >0 및 <1+인, 방법.
  79. 제73항에 있어서, 유방암은 삼중 음성 유방암인, 방법.
  80. 제71항에 있어서, 암은 위암인, 방법.
  81. 제71항에 있어서, 암은 결장직장암인, 방법.
  82. 제71항에 있어서, 암은 폐암인, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 폐암은 비소세포 폐암인, 방법.
  84. 제71항에 있어서, 암은 췌장암인, 방법.
  85. 제71항에 있어서, 암은 난소암인, 방법.
  86. 제71항에 있어서, 암은 전립선암인, 방법.
  87. 제71항에 있어서, 암은 신장암인, 방법.
  88. 제71항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 순차 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  89. 제71항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 항-HER2 항체-약물 접합체 및 PARP1 선택적 억제제를 동시 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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