KR20160127817A - 면역 반응을 변형시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20160127817A
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Abstract

본 발명은 면역 반응에 관여된 단백질을 조절하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 단백질의 발현 및 활성을 조절함으로써 자가면역 질환 및 암의 치료를 위한 방법 및 조성물을 추가로 제공한다.

Description

면역 반응을 변형시키기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING THE IMMUNE RESPONSE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2014년 3월 7일자로 출원된 미국 가출원 제61/949,927호(이의 내용은 모든 목적을 위해 본 명세서에서 그 전문이 명확히 참조로 포함됨)의 우선권의 이익을 주장한다.
면역 반응의 조율은 자가면역 질환 또는 암의 치료에서 사용될 수 있다. 염증성 반응의 추진제를 추진시킴으로써, 자가면역 질환의 증상은 경감되거나 완전히 가라앉을 수 있다. 면역 반응의 추진제의 조작은 암 세포를 공격하도록 신체 자체의 면역계를 유도함으로써 암을 치료하기 위해 또한 사용될 수 있다.
자가면역 질환 및 암 둘 다에 대한 치료제에 대한 표적을 확인하기 위해 면역 반응에서의 상이한 경로의 규명에 대한 수요가 존재한다.
따라서, 본 발명은 염증성 반응을 감소시키고 이로써 자가면역 질환을 치료하거나 암 세포를 공격하도록 신체 자체의 면역계를 유도하도록 면역 반응을 조절하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 암의 치료 방법을 제공하되, 상기 방법은 약제학적 유효량의 (ⅰ) 적어도 하나의 면역 관문 저해제(immune checkpoint inhibitor) 및 (ⅱ) Toso 활성의 저해제의 조합을 상기 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 적어도 하나의 면역 관문 저해제는 PD-1 저해제, CTLA-4 저해제, LAG3 저해제 및 TIM3 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이다.
추가의 실시형태에서 및 상기에 따라, Toso 활성의 저해제는 가용성 Toso 단백질 또는 Toso에 대한 항체이다.
훨씬 추가의 실시형태에서 및 임의의 상기에 따라, 암의 치료를 위한 병용 치료제는 PD-1 저해제, CTLA-4 저해제 및 가용성 Toso 단백질을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, PD-1 저해제는 항-PD-1 항체이고, CTLA-4 저해제는 항-CTLA-4 항체이다.
일 양상에서, 본 발명은 종양에서 침윤 림프구의 수준을 증가시키는 방법을 제공하되, 상기 방법은 가용성 Toso 단백질에 의해 종양을 치료하는 단계를 포함하고, 치료로부터 생긴 침윤 림프구의 수준이 치료가 없는 수준보다 크다. 일 실시형태에서, 침윤 림프구는 CD3+ 세포, CD8+ 세포 또는 CD3+ 세포와 CD8+ 세포의 조합을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 PD-1 저해제, CTLA-4 저해제 및 PDL-1 저해제로부터 선택된 하나 이상의 구성원에 의해 종양을 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 면역 반응을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 Toso의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 면역 반응을 감소시키는 방법은 IgM의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 PAMP 및/또는 DAMP의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계를 추가로 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 (a) Toso의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계; (b) IgM의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계; 및 (c) PAMP 및/또는 DAMP의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계 중 하나 이상을 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 Toso의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 IgM의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 PAMP 및/또는 DAMP의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 추가로 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 스크램블라제 단백질(scramblase protein)의 활성을 조절하는 단계를 추가로 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 (a) Toso의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계; (b) IgM의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계; (c) PAMP 및/또는 DAMP의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계; 및 (d) 스크램블라제 단백질의 활성을 조절하는 단계 중 하나 이상을 포함한다.
도 1은 본 명세서에 기재된 서열을 제공한다.
도 2는 Toso 단백질의 절두 돌연변이체의 예를 예시한다.
도 3은 본 발명의 가용성 Toso 단백질의 효과의 B 세포 증식 연구로부터의 데이터를 보여준다.
도 4는 본 발명의 가용성 및 전장 Toso 단백질의 효과의 B 세포 증식 연구로부터의 데이터를 보여준다.
도 5는 가용성 hToso의 절두된 형태에 의한 B 세포 증식 검정으로부터의 데이터를 보여준다.
도 6은 IgM 결합 검정으로부터의 데이터를 보여준다.
도 7은 IgM 결합 검정으로부터의 데이터를 보여준다.
도 8은 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia: CLL) 세포 증식의 실험실내 검정으로부터의 데이터를 보여준다.
도 9는 대조군과 비교하여 가용성 Toso 단백질에 의한 치료 시 종양 부위에서의 연구로부터의 데이터를 보여준다.
도 10은 가용성 Toso 단백질에 의해 치료된 마우스에서의 연구로부터의 생존 데이터를 보여준다.
도 11은 가용성 Toso 단백질에 의한 치료 후 종양에서의 림프구 침윤의 연구로부터의 데이터를 보여준다.
도 12는 가용성 Toso 단백질 및 항-PD-1 항체 둘 다를 포함하는 병용 치료제의 연구로부터의 데이터를 보여준다.
도 13은 가용성 Toso 단백질 및 항-PD-1 항체 둘 다를 포함하는 병용 치료제의 연구로부터의 데이터를 보여준다.
도 14는 가용성 Toso 단백질 및 항-CTLA-4 항체 둘 다를 포함하는 병용 치료제의 연구로부터의 데이터를 보여준다.
도 15는 가용성 Toso 단백질, 항-PD-1 항체 및 항-CTLA-4 항체를 포함하는 병용 치료제의 연구로부터의 데이터를 보여준다.
도 16은 가용성 Toso 단백질, 항-PD-1 항체 및 항-CTLA-4 항체를 포함하는 병용 치료제의 연구로부터의 데이터를 보여준다.
본 발명의 실행은, 달리 표시되지 않은 한, 종래의 기법 및 당해 분야의 기술 내에 있는 유기 화학, 중합체 기술, 분자 생물학(재조합 기법 포함), 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 설명을 이용할 수 있다. 이러한 종래의 기법은 중합체 어레이 합성, 하이브리드화, 결찰, 파지 디스플레이, 및 라벨을 사용한 하이브리드화의 검출을 포함한다. 적합한 기법의 특정한 예시는 하기 본 명세서에서 예에 참조로 될 수 있다. 그러나, 다른 동등한 종래의 절차가 물론 또한 사용될 수 있다. 이러한 종래의 기법 및 설명은 표준 실험 매뉴얼, 예컨대 [Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (모두 Cold Spring Harbor Laboratory Press로부터), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, New York, Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y. 및 Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.](모두 모든 목적을 위해 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함됨)에서 발견될 수 있다.
본 명세서 및 청구항에 사용되는 바대로, 단수 형태 "일", "하나" 및 "그"는 문맥이 명확히 달리 기술하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 것에 유의한다. 따라서, 예를 들어, "중합효소"에 대한 언급은 하나의 물질 또는 이러한 물질의 혼합물을 의미하고, "방법"에 대한 언급은 당해 분야의 당업자에게 공지된 동등한 단계 및 방법, 및 기타 등등에 대한 언급을 포함한다.
달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 언급된 모든 공보는 공보에 기재되고 이전에 기재된 발명과 연결되어 사용되는 장치, 조성물, 제제 및 방법론을 기술하고 개시할 목적으로 본 명세서에서 참조로 포함된다.
값의 범위가 제공될 때, 문맥이 명확히 달리 기술하지 않는 한, 이 범위의 상한 및 하한과 이 언급된 범위에서의 임의의 다른 설명된 또는 개재하는 값 사이의, 하한의 단위의 1/10으로의, 각각의 개재하는 값이 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이 더 적은 범위의 상한 및 하한은, 언급된 범위에서의 임의의 구체적으로 배제된 제한으로 처리된, 본 발명 내에 포함된 더 적은 범위에서 독립적으로 포함될 수 있다. 기재된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이들 포함된 제한의 둘 다를 배제한 범위가 본 발명에 또한 포함된다.
상기 설명에서, 다양한 상세한 세부사항이 본 발명의 더 완전한 이해를 제공하기 위해 기재되어 있다. 그러나, 하나 이상의 이들 특정한 세부사항 없이 본 발명이 실행될 수 있다는 것이 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다. 다른 경우에, 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 특징 및 널리 공지된 절차는 본 발명을 모호하게 하는 것을 피하기 위해 기재되어 있지 않다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 부재를 포함하지만 다른 것을 배제하지 않는다는 것을 의미하도록 의도된다. "본질적으로 이루어진"은, 조성물 및 방법을 한정하도록 사용될 때, 조성물 또는 방법에 대한 임의의 본질적인 중요물의 다른 구성성분을 배제하는 것을 의미해야 한다. "이루어진"은 청구된 조성물 및 실질적인 방법 단계에 대한 다른 성분의 미량 초과의 구성성분을 배제하는 것을 의미해야 한다. 이들 전환 용어의 각각에 의해 정의된 실시형태는 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 상기 방법 및 조성물이 추가적인 단계 및 성분을 포함할 수 있거나(포함하는), 대안적으로 중요하지 않은 단계 및 조성물(본질적으로 이루어진)을 포함하거나, 대안적으로, 언급된 방법 단계 또는 조성물만을 의도하는 것(이루어진)으로 의도된다.
범위를 포함하는 모든 숫자 지칭, 예를 들어, pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량은 0.1의 증분으로 (+) 또는 (-)로 변하는 근사치이다. 항상 명확히 설명되지 않지만, 용어 "약"이 모든 숫자 지칭에 선행하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "약"은 예컨대 "X + 0.1" 또는 "X - 0.1"의 "X"의 적은 증분 이외에 정확한 값 "X"를 또한 포함한다. 항상 명확히 설명되지 않지만, 본 명세서에 기재된 시약은 단지 예시적이고, 이의 균등물이 당해 분야에 공지된 것으로 또한 이해되어야 한다.
"조성물"은 물질 또는 화합물을 포함하는 임의의 물질을 포함할 수 있고, 물질 또는 화합물 및, 담체, 예를 들어, 화합물 또는 조성물, 불활성(예를 들어, 검출 가능한 물질 또는 라벨) 또는 활성, 예컨대 부형제, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친유성 용매, 보존제, 부형제 등을 포함하는 다른 물질의 임의의 조합을 포함하도록 또한 의도된다. 담체는 또한, 단독으로 또는 조합으로 1-99.99중량% 또는 용적%를 포함하는, 단독으로 또는 조합으로 존재할 수 있는, 약제학적 부형제 및 첨가제 단백질, 펩타이드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물(예를 들어, 당, 예컨대 모노사카라이드, 다이-, 트라이-, 테트라-, 및 올리고사카라이드; 유도체화 당, 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스터화 당 등; 및 폴리사카라이드 또는 당 중합체)을 포함한다. 예시적인 단백질 부형제는 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민(human serum albumin: HSA), 재조합 인간 알부민(recombinant human albumin: rHA), 젤라틴, 카제인 등을 포함한다. 완충 능력에서 또한 작용할 수 있는 대표적인 아미노산/항체 성분은 알라닌, 글라이신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 라이신, 류신, 아이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파라긴 등을 포함할 수 있다. 탄수화물 부형제는 또한 본 발명의 범위 내에 의도되고, 이의 예는 모노사카라이드, 예컨대 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 포도당, D-만노스, 소르보스 등; 다이사카라이드, 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 폴리사카라이드, 예컨대 라피노스, 말레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨(글루시톨) 및 마오이노시톨을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 생물학적 상용성 담체 또는 배지와 상호교환적으로 사용될 수 있는, 용어 약제학적으로 허용되는 담체(또는 배지)는 세포 및 치료학적으로 투여되는 다른 물질과 상용성일 뿐만 아니라, 충분한 의학 판단의 범위 내에 있고, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 부작용 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합당한 이익/위험 비율을 보상하는 시약, 세포, 화합물, 재료, 조성물 및/또는 제형을 의미한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 액체, 반고체(예를 들어, 겔) 및 고체 재료(예를 들어, 당해 분야에 공지된 바와 같고, 본 명세서에서 더 자세히 기재된, 세포 스캐폴드 및 매트릭스, 튜브 시트 및 다른 이러한 재료)를 포함한다. 이 반고체 및 고체 재료는 신체 내에 분해에 저항하도록 설계될 수 있거나(비생분해성), 이것은 신체 내 분해되도록 설계될 수 있다(생분해성, 생체부식성). 생분해성 재료는 추가로 생용해성 또는 생흡수성일 수 있고, 즉 이것은 체액(수용성 임플란트가 일 예임)으로 용해되거나 흡수되거나, 다른 재료로의 전환 또는 천연 경로를 통한 분해 및 제거에 의해 분해되고 궁극적으로 신체로부터 제거될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 동물, 포유류 또는 훨씬 추가로 인간 환자를 의도한다. 오직 예시의 목적을 위해, 포유류는 인간, 유인원, 쥣과, 소, 말, 돼지 또는 조류를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 또는 임의의 이들의 조합으로 이루어진 짧은 중합체를 의미한다. 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 적어도 약 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개 이상의 뉴클레오타이드의 길이이다. 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 및 합성 아미노산, 및 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화된 것, 및 차후에 변형된 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카복실기, 아미노기 및 R 기, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄에 결합된 α 탄소를 가지는 화합물을 의미한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 골격을 가지지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학 구조와 다르지만, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 구조를 가지는 화학 화합물을 의미한다.
용어 "단리된"은 본 명세서에 사용되는 바대로 다른 재료가 실질적으로 없는, 예를 들어, 70% 초과, 또는 80%, 또는 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98%인 분자 또는 생물학적 또는 세포 재료를 의미한다. 일 양상에서, 용어 "단리된"은, 천연 소스에 존재하고, 이의 네이티브 또는 천연 상태에 존재하는 경우 성취 가능하지 않은 결과를 성취하기 위한 재료의 조작, 예를 들어 돌연변이에 의한 재조합 복제 또는 조작을 허용하는, 각각 다른 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 장기로부터 분리된, 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 장기를 의미한다. 용어 "단리된"은 또한 재조합 DNA 기법에 의해 생성될 때 세포 재료, 바이러스 재료, 또는 배양 배지가 실질적으로 없는 핵산 또는 펩타이드, 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질을 의미한다. 더구나, "단리된 핵산"은 단편으로서 천연 발생이 아니고 천연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하도록 의도된다. 용어 "단리된"은 다른 세포 단백질로부터 단리된 폴리펩타이드를 의미하도록 본 명세서에서 또한 사용되고, 예를 들어 70% 초과, 또는 80%, 또는 85%, 또는 90%, 또는 95%, 98%, 또는 99%의 순도로 정제된 폴리펩타이드 및 재조합 폴리펩타이드 둘 다를 포함하도록 의도된다. 용어 "단리된"은 본 명세서에서 또한 다른 세포 또는 조직으로부터 단리된 세포 또는 조직을 의미하고, 배양된 및 조작된 세포 또는 조직 둘 다를 포함하도록 의도된다.
"재조합" 핵산은 보통 함께 발생하지 않는 2개 이상의 서열을 조합함으로써 생성된 인공 핵산을 의미한다. 일 실시형태에서, 이것은 특정한 목적을 위한 상이한 특질, 예컨대 항생제 내성을 암호화하거나 변경하도록 존재하는 유기체 DNA, 예컨대 박테리아의 플라스미드로의 관련 DNA의 도입을 통해 생성된다. "재조합" 폴리펩타이드는 재조합 핵산으로부터 유래한 폴리펩타이드이다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "프로모터"는 유전자의 전사를 지시하기에 충분한 핵산 서열을 의미한다. 프로모터 의존적 유전자 발현이 외부 신호 또는 물질에 의해 세포 유형 특이적, 조직 특이적 또는 유도성에 대해 조절 가능하게 만들기에 충분한 프로모터 구성요소가 본 발명에 또한 포함된다.
몇몇 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터 또는 별개의 프로모터이다. 유도성 프로모터는 온도 또는 광과 같은 화학적 또는 물리적 조건에 의해 조율될 수 있다. 화학 프로모터의 예는, 제한 없이, 알코올 조절, 테트라사이클린 조절, 스테로이드 조절, 금속 조절 및 병원균발생 조절 프로모터를 포함한다. 별개의 프로모터의 예는 예를 들어 문헌[Wolfe et al. Molecular Endocrinology 16(3): 435-49]에서 발견될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "조절 구성요소"는 유전자의 전사를 조절할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 조절 구성요소의 비제한적인 예는 프로모터, 인핸서, 사일런서, 폴리-아데닐화 신호, 전사 종결 서열을 포함한다. 조절 구성요소는 네이티브 유전자의 5' 또는 3' 영역에, 또는 인트론 내에 존재할 수 있다.
다양한 단백질은 이의 인간 단백질 및 암호화 서열에 대해 이의 유전자은행(GenBank) 수탁번호로 본 명세서에 또한 개시되어 있다. 그러나, 단백질은 개시된 유전자은행 수탁 번호에 의해 표시되는 아미노산 서열을 가지는 인간 유래 단백질로 제한되지 않고, 다른 동물, 특히 온혈 동물(예를 들어, 랫트, 기니아 피그, 마우스, 닭, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등)로부터 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "Toso", "FAIM3" 또는 "Fas 아폽토시스 저해 분자 3"은 유전자은행 수탁 번호 NP_001135945(인간 아이소폼 b), NP_001180267(인간 아이소폼 c), NP_005440(인간 아이소폼 a), NP_081252(마우스) 또는 NP_001014843(랫트)의 임의의 및 모든 버전을 포함하는 임의의 대표적인 Toso 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 단백질을 의미한다. Toso를 암호화하는 적합한 cDNA는 유전자은행 수탁 번호 NM_001142473, NM_001193338, NM_005449, NM_026976 및 NM_001014843으로 제공된다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "Toso의 생물학적 활성" 또는 "Toso 활성"은 전장 네이티브 Toso 단백질과 연관된 임의의 생물학적 활성을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, Toso의 생물학적 활성은 IgM 항체에 대한 결합을 의미한다. 추가의 실시형태에서, Toso의 생물학적 활성은 CD11b 또는 CD18 활성을 저해하는 것을 의미한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, Toso의 생물학적 활성은 과립구의 활성화 한계치를 증가시키는 것을 의미한다. 활성화 한계치는 골수로부터 활성화된 과립구의 수에 의해 측정될 수 있다. 추가의 실시형태에서, Toso의 생물학적 활성은 수지상 세포의 활성화 및 T 세포에 항원을 제시하는 이의 능력을 포함한다. 추가의 실시형태에서, Toso의 생물학적 활성은 아폽토시스의 저해 또는 TNF 신호전달의 증대를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, Toso 생물학적 활성은 유전자은행 수탁 번호 NP_001135945, NP_001180267, NP_005440, NP_081252 또는 NP_001014843(이들 수탁번호의 임의의 및 모든 버전 포함)에 의해 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질의 활성과 동등하다. 이해되는 것처럼, 본 명세서에 기재된 결실 돌연변이체 및 아미노산 변이체를 포함하는 Toso의 다른 형태는 Toso 생물학적 활성을 또한 나타낼 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "치료하는"은 질환 또는 장애의 적어도 하나의 부작용 또는 증상을 감소시키거나, 경감시키거나, 역전시키거나, 예방함으로써 환자의 증상을 개선할 목적을 위해 약제학적 조성물을 투여하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "예방하는"은 질환 또는 장애에 증가한 감수성을 가지지만 아직 질환 또는 장애의 증상을 나타내지 않는 대상체(즉, 환자)를 확인하고, 본 개시내용의 원칙에 따라 치료제를 투여하는 것을 의미한다. 예방 치료는 감수성인 대상체가 차후에 증상적이 되는 것의 가능성을 감소시키거나, 예방 치료의 부재 하에 있는 것보다 질환이 발병이 지연되거나 더 느리게 진행하도록 설계된다. 대상체는 임의의 적절한 방법에 의해, 예를 들어 질환/장애의 가족 병력을 확인하는 것에 의해 질환/장애를 발생시킬 증가한 가능성을 가지는 것, 또는 질환/장애 또는 질환/장애에 대한 감수성을 표시하는 하나 이상의 진단학적 마커를 가지는 것에 의해 확인될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "샘플" 또는 "시험 샘플"은 핵산을 함유하는 임의의 액체 또는 고체 재료를 의미한다. 적합한 실시형태에서, 시험 샘플은 생물학적 소스(즉, "생물학적 샘플"), 예컨대 배양물 중의 세포 또는 동물, 가장 바람직하게는, 인간으로부터의 조직 샘플로부터 얻어진다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "실질적으로 동일한"은, 단백질 또는 폴리펩타이드를 언급할 때, 기준 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 것을 의미한다. 비교의 길이는 바람직하게는 the 폴리펩타이드 또는 단백질의 전장이지만, 일반적으로 적어도 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개, 80개 또는 100개 이상의 인접한 아미노산이다. "실질적으로 동일한" 핵산은 기준 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 것이다. 비교의 길이는 바람직하게는 핵산의 전장이지만, 일반적으로 적어도 20개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드, 75개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드, 125개 이상의 뉴클레오타이드이다.
본 명세서에 사용되는 바대로, "아미노산 치환" 또는 "치환"은 또 다른 아미노산에 의한 시작 폴리펩타이드 서열에서의 특정한 위치에서의 아미노산의 대체를 의미한다. 예를 들어, 치환 M23Y는 23번 위치에서의 메티오닌이 타이로신에 의해 대체된 변이체 폴리펩타이드를 의미한다.
단백질 또는 핵산의 "생물학적으로 동등한"은 아미노산 또는 핵산 서열에 의해 단백질 또는 핵산과 실질적으로 동일하거나 동등한 생물학적 활성을 가지는 단백질 또는 핵산을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "유효량"은 환자에게 의학 이익을 제공하기 위해 충분한 빈도로 전달된 화합물(예를 들어, Toso 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편)의 분량을 의미한다. 일 실시형태에서, 단백질의 유효량은 질환의 증상을 치료하거나 경감시키기에 충분한 양이다.
세포의 집단은 표현형 및/또는 유전자형에서 동일하거나(클론성) 비동일한 하나 초과의 세포의 수집을 의도한다.
"실질적으로 균일한"은 세포의 약 50% 초과, 또는 대안적으로 약 60% 초과, 또는 대안적으로 70% 초과, 또는 대안적으로 75% 초과, 또는 대안적으로 80% 초과, 또는 대안적으로 85% 초과, 또는 대안적으로 90% 초과, 또는 대안적으로, 95% 초과가 동일한 또는 유사한 표현형인 세포의 집단을 의미한다. 표현형은 미리 선택된 세포 표면 마커 또는 다른 마커에 의해 결정될 수 있다.
용어 자가 이식한다, 자가 이식, 자가이식편 등은 세포 공여자가 또한 세포 대체 치료의 수혜자인 치료를 의미한다. 용어 동종이계 이식한다, 동종이계 이식, 동종이식편 등은 세포 공여자가 세포 대체 치료의 수혜자와 동일한 종이지만, 동일한 개체가 아닌 치료를 의미한다. 공여자의 세포가 수혜자와 조직적합성으로 일치하는 세포 이식은 때때로 동계 이식이라 불린다. 용어 이종 이식, 이종 이식한다, 이종이식편 등은 세포 공여자가 수혜자가 세포 대체 치료의 상이한 종인 치료를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, "항체"는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편 또는 이의 단일 사슬을 포함한다. 따라서, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 이것의 예는 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR) 또는 이의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크(framework: FR) 영역, 또는 이들의 임의의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 하나의 부분을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일반적으로, 용어 "항체"는 CH1, CH2, CH3 및 CL(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 적어도 하나의 불변 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명에서 용도가 발견된 항체는 전통적인 항체, 및 항체 유도체, 단편 및 모방체를 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다수의 포맷을 취할 수 있다.
항체는 다중클론 또는 단일클론일 수 있고, 임의의 적합한 생물학적 소스, 예를 들어 쥣과, 랫트, 양 및 개과로부터 단리될 수 있다.
단일클론 항체는 세포 또는 하이브리도마의 단일 클론에 의해 생성된 항체이고, 따라서 항체의 단일의 순수한 균일한 유형이다.
하이브리도마는 항체 생성 림프구 및 비항체 생성 암 세포, 보통 골수종 또는 림프종의 융합으로부터 실험실에서 생성된 세포이다. 하이브리도마는 증식하고 특이적 단일클론 항체의 연속 공급을 제공한다.
용어 "인간 항체"는, 본 명세서에 사용되는 바대로, 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 및 불변 영역을 가지는 항체를 포함하도록 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열(예를 들어, 실험실내 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 용어 "인간 항체"는, 본 명세서에 사용되는 바대로, 또 다른 포유류 종, 예컨대 마우스의 생식선으로부터 유래한 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 그래프팅된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "인간 항체"는 단백질의 실질적으로 모든 부분(예를 들어, CDR, 프레임워크, CL, CH 도메인(예를 들어, CH1, CH2, CH3), 힌지, (VL, VH))이 오직 약간의 서열 변화 또는 변경을 가지면서 인간에서 실질적으로 비면역원성인 항체를 의미한다. 유사하게, 항체는 영장류(원숭이, 개코원숭이, 침팬치 등), 설치류(마우스, 랫트, 토끼, 기니아 피그, 햄스터 등)를 지정하고, 다른 포유류는 이러한 종, 하위속, 속, 하위과, 과 특이적 항체를 지정한다. 추가로, 키메라 항체는 상기의 임의의 조합을 포함한다. 이러한 변화 또는 변경은 임의로 및 바람직하게는 비변형된 항체에 비해 인간 또는 다른 종에서의 면역원성을 보유하거나 감소시킨다. 따라서, 인간 항체는 키메라 또는 인간화 항체와 구별된다. 인간 항체가 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현할 수 있는 비인간 동물 또는 원핵생물 또는 진핵생물 세포에 의해 생성될 수 있다는 것이 지적된다. 추가로, 인간 항체가 단일 사슬 항체일 때, 이것은 네이티브 인간 항체에서 발견되지 않는 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 연결하는 링커 펩타이드, 예컨대 2개 내지 약 8개의 글라이신 또는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 링커 펩타이드는 인간 기원인 것으로 생각된다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 인간 항체는 예를 들어 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 형질전환 마우스를 면역화함으로써 또는 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝함으로써 인간 면역글로불린 서열을 사용하여 항체가 시스템으로부터 얻어지는 경우 특정한 생식선 서열로부터 "유도"된다. 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 "유도"된 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식선 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교함으로써 이렇게 확인될 수 있다. 선택된 인간 항체는 통상적으로 인간 생식선 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 90% 동일하고, 다른 종(예를 들어, 쥣과 생식선 서열)의 생식선 면역글로불린 아미노산 서열과 비교할 때 인간인 것으로 인간 항체를 확인하는 아미노산 잔기를 함유한다. 소정의 경우에, 인간 항체는 생식선 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 통상적으로, 특정한 인간 생식선 서열로부터 유도된 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 소정의 경우에, 인간 항체는 생식선 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4개 이하, 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산의 아미노산 차이를 나타낼 것이다.
용어 "재조합 인간 항체"는, 본 명세서에 사용되는 바대로, 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자에 형질전환 또는 트랜스염색체인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체 또는 이로부터 제조된 하이브리도마, 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 형질감염체로부터 단리된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 다른 DNA 서열에 대한 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 및 불변 영역을 가진다. 그러나, 소정의 실시형태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 실험실내 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대한 형질전환인 동물을 사용할 때, 생체내 체세포 돌연변이유발)로 처리될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래하고 이와 관련되지만, 생체내 인간 항체 생식선 레퍼토리 내에 천연으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 이 항체를 만드는 방법은 본 명세서에 기재되어 있다.
"아이소타입"은 본 명세서에 사용되는 바대로 불변 영역의 화학 및 항원 특징에 의해 한정된 면역글로불린의 임의의 하위종류를 의미한다. 치료학적 항체가 아이소타입 및/또는 하위종류의 하이브리드를 또한 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "다중클론 항체" 또는 "다중클론 항체 조성물"은 본 명세서에 사용되는 바대로 상이한 B 세포주로부터 유도된 항체의 제제를 의미한다. 이들은 각각 상이한 에피토프를 인식하는 특이적 항원에 대해 분비되는 면역글로불린 분자의 혼합물이다.
용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"은 본 명세서에 사용되는 바대로 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 의미한다. 단일클론 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "라벨"은 "표지된" 조성물을 생성하도록 검출되는 조성물에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 화합물 또는 조성물, 예를 들어 N 말단 히스티딘 태그(N-His), 자기 활성 동위원소, 예를 들어 115Sn, 117Sn 및 119Sn, 비방사성 동위원소, 예컨대 13C 및 15N, 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질, 예컨대 항체를 의미한다. 상기 용어는 녹색 형광성 단백질(green fluorescent protein: GFP) 등과 같은 삽입된 서열의 발현 시 신호를 제공하는 폴리뉴클레오타이드에 접합된 서열을 또한 포함한다. 라벨은 그 자체로 검출 가능할 수 있거나(예를 들어, 방사성 동위원소 라벨 또는 형광성 라벨), 효소 라벨의 경우에, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학 변경을 촉매화할 수 있다. 라벨은 소규모 검출에 적합하거나, 고속 스크리닝에 더 적합할 수 있다. 그러므로, 적합한 라벨은 자기 활성 동위원소, 비방사성 동위원소, 방사성 동위원소, 형광단, 화학발광성 화합물, 염료, 및 단백질, 예컨대 효소를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 라벨은 검출될 수 있거나, 이것은 정량화될 수 있다. 단순히 검출된 반응은 일반적으로 단지 존재가 확인된 반응을 포함하는 반면, 정량화된 반응은 일반적으로 정량 가능한(예를 들어, 숫자로 기록 가능한) 값, 예컨대 강도, 분극 및/또는 다른 특성을 가지는 반응을 포함한다. 발광 또는 형광 검정에서, 검출 가능한 반응은 결합에 실제로 관여하는 검정 성분과 연관된 발광단 또는 형광단을 사용하여, 또는 간접적으로 또 다른 성분과 연관된 발광단 또는 형광단(예를 들어, 리포터 또는 표시자)을 사용하여 생성될 수 있다.
신호를 생성하는 발광성 라벨의 예는 생물발광 및 화학발광을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 검출 가능한 발광 반응은 일반적으로 발광 신호의 변화 또는 발생을 포함한다. 검정 성분을 발광으로 표지하기 위한 적합한 방법 및 발광단은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Haugland, Richard P.(1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)]에 기재되어 있다. 발광성 프로브의 예는 아에쿠오린 및 루시퍼라제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
적합한 형광성 라벨의 예는 플루오르세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리쓰로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라사이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 엘로우, 케스케이드 블루(Cascade Blue)(상표명) 및 텍사스 레드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 적합한 광학 염료는 문헌[Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)]에 기재되어 있다.
또 다른 양상에서, 형광성 라벨은 세포 또는 조직, 예컨대 세포 표면 마커의 표면에서 또는 이것 위에 존재하는 세포 성분에 대한 공유 부착을 수월하게 하도록 작용기화된다. 적합한 작용기는 아이소티오사이아네이트기, 아미노기, 할로아세틸기, 말레이미드, 숙신이미딜 에스터, 및 설포닐 할라이드(이들 모두는 제2 분자에 형광성 라벨을 부착하도록 사용될 수 있음)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 형광성 라벨의 작용기의 선택은 링커, 물질, 마커, 또는 제2 라벨링제에 대한 부착의 부위에 따라 달라질 것이다.
본 발명이 특정한 실시형태와 관련하여 주로 기재되어 있지만, 다른 실시형태가 본 개시내용을 읽을 시 당해 분야의 당업자에게 명확해지는 것으로 또한 고안되고, 본 발명의 방법에 의해 이러한 실시형태가 함유되는 것으로 의도된다.
I. 본 발명의 개관
본 발명은 면역계 경로, 특히 Toso 단백질(또한 본 명세서에서 "Toso" 또는 "Toso 수용체" 또는 "Faim3" 또는 "FCMR"이라 상호교환적으로 칭해짐)을 포함하는 임의의 경로를 조절하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 용어 "면역계 경로" 및 "면역 경로"는 본 명세서에 사용되는 바대로 병원균, 불활성 물질에 의한 상해 및 암과 싸우는 조직 및 순환계의 네트워크에서 세포 및 가용성 성분에 의한 조직화된 작용을 의미한다. 면역계 경로의 조절은 경로의 하나 이상의 성분에서의 발현 또는 기능적 활성을 변경하여서 면역계에 의한 반응("면역 반응")을 조절하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 면역 반응을 감소시키거나 증가시키기 위해 이 면역계 경로 성분의 활성 또는 발현을 조율하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 소정의 예시적인 실시형태에서, 면역 반응을 감소시키는 것은 자가면역 질환의 증상을 치료하거나 경감시키도록 작용한다. 다른 예시적인 실시형태에서, 면역 반응을 증가시키는 것은 암을 치료하거나 경감시키거나 예방하도록 작용한다.
일 양상에서, 본 발명은 Toso 발현 및/또는 기능을 감소시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이 감소는, 제한 없이, Toso에 결합하는 항체의 투여, 하나 이상의 결합 파트너와 상호작용하는 Toso의 능력을 방해하는 가용성 Toso 단백질(또한 본 명세서에서 "sToso"라 칭함)의 투여, 및 단백질 발현을 저해하는 조성물, 예컨대 siRNA의 투여를 포함하는 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. Toso 발현 및/또는 기능은 다른 단백질, 특히 자체가 Toso에 직접적으로 결합하거나 달리 이와 상호작용하는 단백질의 발현 또는 기능을 조절함으로써 간접적으로 또한 감소할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바대로, "가용성 Toso 단백질" 및 모든 문법상 동일어는 일반적으로 막 결합하지 않은 단백질을 의미한다는 것에 유의한다.
몇몇 실시형태에서, Toso 발현 또는 활성의 감소는 Toso가 직접 결합 또는 다른 회합(물리적 및/또는 기능적)을 통해 상호작용하는 다른 단백질의 발현 또는 기능적 활성의 증가에 의해 달성된다. 활성 또는 발현 수준이 Toso 발현 또는 활성의 감소에 의해 영향을 받을 수 있는 예시적인 단백질은, 제한 없이, IgM, TSG6 및 B7H3을 포함한다.
소정의 양상에서, 본 발명은 Toso 활성, 및 면역 관문 저해제의 활성을 조절함으로써 면역 경로를 변경하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특정한 실시형태에서, 본 발명은 Toso 활성의 조절제 및 면역 관문 단백질의 저해제를 포함하는 병용 치료제의 사용을 통해 면역 반응을 증가시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 소정의 예에서, 병용 치료제는 면역 관문 저해제와 조합된 가용성 Toso 수용체의 용도를 포함한다. 추가의 예에서, 병용 치료제는 가용성 Toso 단백질 및 CTLA-4 저해제, PD-1 저해제, TIM3 저해제, LAG3 저해제, PD-1 리간드(예컨대, PDL-1), PD-1 리간드의 저해제, B7-H3 단백질, B7-H3 단백질의 저해제, B7-H4 단백질, 및 B7-H4 단백질의 저해제 중 하나 이상의 용도를 포함한다. 소정의 예에서, 병용 치료제는 가용성 Toso 단백질과 PD-1 저해제 또는 가용성 Toso 단백질과 PD-1 저해제과 CTLA-4 저해제를 포함한다. 추가의 예에서, 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 1-25 중 임의의 하나에 따른 아미노산 서열, 및 USSN 제13/831,031호(2013년 3월 14일자에 출원, 모든 목적을 위해 그리고 특히 가용성 Toso 단백질에 관한 모든 교시내용, 기재된 설명, 서열 및 도면에 대해 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 임의의 가용성 Toso 단백질을 포함한다. 훨씬 추가의 예에서, PD-1 저해제는 항-PD-1 항체, 예컨대 니볼루맙 또는 람브롤리주맙이고, CTLA-4 저해제는 항체, 예컨대 이필리무맙 또는 트레멜리무맙이다.
추가의 실시형태에서 및 임의의 상기에 따라, Toso 발현 또는 활성의 감소는 염증성 반응과 연관된 분자(또한 본 명세서에서 병원균 연관 분자 패턴 또는 "PAMP" 및 손상 연관 분자 패턴 또는 "DAMP"라 칭함)의 발현 또는 활성을 감소시킨다. 이러한 분자는 당해 분야에 공지되어 있고 본 명세서에 기재되어 있다. 이러한 PAMP 또는 DAMP의 감소는 직접적으로 또는 중재 단백질에서 대한 효과를 통해 Toso의 발현 또는 활성의 감소, 예컨대 IgM 및/또는 B7H3 발현 또는 활성의 증가로부터 생길 수 있다.
훨씬 추가의 실시형태에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명은 면역 반응을 감소시키고 이로써 경로에서의 하나 이상의 단백질의 발현 또는 기능을 변경함으로써 자가면역 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 예시적인 실시형태에서, Toso의 발현 또는 기능은 IgM 및/또는 B7H3의 발현 또는 기능을 증가시키도록 감소하고, 이후 PAMP 및/또는 DAMP의 발현 또는 기능을 감소시켜서 궁극적으로 면역 반응을 감소시키고 자가면역 질환의 증상을 치료하거나 경감시킨다. 추가의 예시적인 실시형태에서, Toso 발현은 변경되지 않지만, IgM 및/또는 B7H3 발현 또는 기능은 대안적인 방식으로 증가하여서 PAMP 및/또는 DAMP의 발현 또는 기능을 감소시킨다. 훨씬 추가의 예시적인 실시형태에서, PAMP 및/또는 DAMP는 다른 중재 단백질, 예컨대 IgM, TSG6 및/또는 B7H3의 발현을 변화시키지 않으면서 직접적으로 직접 작용을 통해 또는 Toso의 발현 또는 기능에 대한 작용을 통해 감소한다.
또 다른 양상에서, Toso 발현 및/또는 기능은 증가한다. 이 증가는, 제한 없이, 단백질 발현을 증가시키기 위한 Toso에 대한 효현제의 투여 및 조성물의 투여를 포함하는, 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 기재된, 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, Toso 발현 또는 활성의 증가는 Toso가 직접 결합 또는 다른 회합(물리적 및/또는 기능적)을 통해 상호작용하는 다른 단백질의 발현 또는 기능적 활성의 감소에 의해 달성된다. 활성 또는 발현 수준이 Toso 발현 또는 활성의 증가에 의해 영향을 받을 수 있는 예시적인 단백질은, 제한 없이, IgM, TSG6 및/또는 B7H3을 포함한다.
추가의 실시형태에서 및 임의의 상기에 따라, Toso 발현 및/또는 활성의 증가는 PAMP 및/또는 DAMP의 기능 또는 활성의 증가를 발생시키는 IgM의 발현 또는 기능적 활성의 감소에 의해 달성된다. 다른 실시형태에서, Toso 발현 및/또는 활성의 증가는 직접 작용을 통해 또는 간접적으로 또 다른 단백질을 통해 IgM의 관여 없이 PAMP 및/또는 DAMP의 기능 또는 활성을 증가시킨다.
훨씬 추가의 실시형태에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명은 경로에서의 하나 이상의 단백질의 발현 또는 기능을 변경함으로써 면역 반응을 증가시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이 증가는 이것이 하나 이상의 암 세포의 사멸을 발생시키도록 수행된다. 예시적인 실시형태에서, Toso의 발현 또는 기능은 IgM 및/또는 B7H3의 발현 또는 기능을 감소시키도록 증가하고, 이후 PAMP 및/또는 DAMP의 발현 또는 기능을 증가시켜서 궁극적으로 면역 반응을 증가시키고 암의 증상을 치료하거나 경감시킨다. 추가의 예시적인 실시형태에서, Toso 발현은 변경되지 않지만, IgM 및/또는 B7H3 발현 또는 기능은 대안적인 방식으로 감소하여서 PAMP 및/또는 DAMP의 발현 또는 기능을 증가시킨다. 훨씬 추가의 예시적인 실시형태에서, PAMP 및/또는 DAMP는 다른 단백질, 예컨대 IgM, TSG6 및/또는 B7H3의 발현을 변화시키지 않으면서 직접적으로 직접 작용을 통해 또는 Toso의 발현 또는 기능에 대한 작용을 통해 증가한다. 하나 이상의 이 단백질의 조작은 면역 반응을 증가시켜서, 종양 세포를 포함하는 암 연관 세포의 사멸을 발생시키도록 작용한다.
훨씬 추가의 양상에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명의 방법 및 조성물은 세포막의 지질 이중층의 2개의 단층 사이의 인지질의 수송을 담당하는 하나 이상의 스크램블라제 단백질을 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 직접적으로 또는 간접적으로 스크램블라제 활성을 조절하여서, 암 세포의 표적화된 아폽토시스를 발생시킨다.
소정의 양상에서, 면역 반응을 감소시키도록 사용될 수 있는 단백질은 하나 이상의 스크린을 통해 확인된다. 이러한 스크린에서 확인된 단백질은 몇몇 실시형태에서 하나 이상의 상기 확인된 단백질, 특히 Toso와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하여, 면역 반응에 영향을 미칠 수 있다.
II. 면역 반응 드라이버를 위한 활성 및 발현을 조절하기 위한 방법 및 조성물
본 명세서에서 추가로 자세히 기재된 것처럼, 본 발명은 Toso, B7H3, PAMP 및 DAMP, 스크램블라제 및 면역 관문 저해제, 예컨대 PD-1 및 CTLA-4를 포함하는 면역 반응에 관여하는 단백질의 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 소정의 실시형태에서 Toso 활성을 조절하는 물질을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은, 하기 추가로 자세히 기재된 것처럼, 제한 없이 Toso 단백질의 가용성 형태 또는 Toso에 대한 항체를 포함한다. Toso 활성을 조절하기 위한 조성물 및 방법은 제PCT/IB13/01179호(2013년 3월 14일자에 출원, 모든 목적을 위해 그리고 특히 임의의 기재된 설명, 실시예, 도면 및 도면 범례를 포함하여 Toso 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물에 관한 모든 교시내용을 위해 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함됨)에 또한 기재되어 있다.
이들 단백질의 임의의 조합의 활성 또는 발현의 조절은 제한 없이 항체, 압타머, 결합 파트너, 소 또는 대 분자 효현제, 소 또는 대 분자 저해제, 및 유전자 발현의 조작, 예컨대 저해 RNA(siRNA 포함) 또는 표적화된 단백질의 유전자 발현을 저해하거나 상향조절하기 위해 당해 분야에 공지된 임의의 다른 방법 또는 조성물의 용도를 포함할 수 있다.
본 명세서에 추가로 자세히 기재된 것처럼, 이들 단백질의 상이한 조합은 활성 및/또는 발현을 상이한 조합으로 증가시키거나 감소시키도록 조작될 수 있다. 예를 들어, Toso 활성 및/또는 발현을 감소시키기 위한 방법 및 조성물은 IgM 활성 및/또는 발현의 증가를 증가시키기 위한 방법 및 조성물과 조합될 수 있고, 이것은 또한 소정의 실시형태에서 PAMP/DAMP 활성 및/또는 발현을 감소시키기 위한 방법 및 조성물과 추가로 조합될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, Toso 활성 및/또는 발현을 감소시키기 위한 유일한 방법 및 조성물이 사용되고, 이 활성의 감소는, 제한 없이, IgM, B7H3, PAMP, DAMP, 스크램블라제 및 면역 관문 저해제, 예컨대 PD-1 및 CTLA-4 중 하나 이상을 포함하는 다른 단백질의 활성 및/또는 발현의 변화에 의해 달성된다.
IIA. 발현의 저해
본 발명의 소정의 양상에서, 면역 반응에 관여하는 하나 이상의 단백질의 발현은 저해된다. 이러한 단백질은, 제한 없이, Toso, IgM, B7H3, PAMP, DAMP, 스크램블라제 및 면역 관문 저해제, 예컨대 PD-1 및 CTLA-4를 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명은 표적 mRNA의 발현을 저해하여서 표적 mRNA 관련 장애를 가지는 환자에서 표적 mRNA 수준을 감소시키기 위해 간섭 RNA를 전달하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바대로 유전자 또는 mRNA와 관련하여 구절 "발현의 약화"는 mRNA 절단을 통해 또는 번역의 직접 저해를 통해 단백질로의 표적 mRNA의 번역을 감소시키기 위해 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)의 양을 투여하거나 발현시키는 것을 의미한다. 용어 "저해한다", "암호화" 및 "약화"는 본 명세서에 사용되는 바대로 본 발명의 간섭 RNA의 부재 하에 표적 mRNA 또는 상응하는 단백질의 발현과 비교하여 표적 mRNA 또는 상응하는 단백질의 발현의 측정 가능한 감소를 의미한다. 표적 mRNA 또는 상응하는 단백질의 발현의 감소는 흔히 "넉-다운(knock-down)"이라 불리고, 비표적화 대조 RNA(예를 들어, 비표적화 대조 siRNA)의 투여 또는 발현 후 존재하는 수준에 대해 보고된다. 50% 및 100%(사이)을 포함하는 양의 발현의 넉-다운은 본 명세서에 실시형태에 의해 고려된다. 그러나, 반드시 이러한 넉-다운 수준이 본 발명의 목적을 위해 성취되지는 않는다.
넉-다운은 흔히 정량적 중합효소 사슬 반응(qPCR) 증폭을 이용하여 mRNA 수준을 측정함으로써 또는 웨스턴 블롯 또는 효소 연결된 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 단백질 수준을 측정함으로써 평가된다. 단백질 수준을 분석하는 것은 mRNA 절단 및 번역 저해 둘 다의 평가를 제공한다. 넉-다운을 측정하기 위한 추가의 기법은 RNA 용액 하이브리드화, 뉴클레아제 보호, 노던 하이브리드화(northern hybridization), 마이크로어레이에 의한 유전자 발현 모니터링, 항체 결합, 라디오면역검정 및 형광 활성화 세포 분석을 포함한다.
본 발명의 간섭 RNA 분자에 의한 표적 유전자의 발현의 약화는 장애의 증상의 개선을 관찰함으로써 및/또는 특징의 변화(특징이 행동적이든 또는 생리학적이든(또 다른 단백질의 발현 수준의 변화를 포함))를 관찰함으로써 인간 또는 다른 포유류에 의해 추론될 수 있다.
일 실시형태에서, 단일 간섭 RNA는 표적 mRNA 수준을 감소시키기 위해 전달된다. 다른 실시형태에서, mRNA를 표적화하는 2개 이상의 간섭 RNA는 표적 mRNA 수준을 감소시키도록 투여된다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "간섭 RNA" 및 "간섭 RNA 분자"는 RISC와 상호작용하고 유전자 발현에서 RISC 매개 변화에 참여할 수 있는 모든 RNA 또는 RNA 유사 분자를 의미한다. RISC와 상호작용할 수 있는 다른 간섭 RNA 분자의 예는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 단일 가닥 siRNA, 마이크로RNA(miRNA), 피코RNA(piRNA) 및 다이서-기질(dicer-substrate) 27합체 듀플렉스를 포함한다. RISC와 상호작용할 수 있는 "RNA 유사" 분자의 예는, 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드, 하나 이상의 비뉴클레오타이드, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드, 및/또는 하나 이상의 비포스포다이에스터 연결을 함유하는, siRNA, 단일 가닥 siRNA, miRNA, piRNA 및 shRNA 분자를 포함한다. 따라서, siRNA, 단일 가닥 siRNA, shRNA, miRNA, piRNA 및 다이서-기질 27합체 듀플렉스는 "간섭 RNA" 또는 "간섭 RNA 분자"의 부분집합이다.
용어 "siRNA"는 본 명세서에 사용되는 바대로 달리 기재되지 않은 한 이중 가닥 간섭 RNA를 의미한다. 통상적으로, 본 발명의 방법에서 사용된 siRNA는 2개의 뉴클레오타이드 가닥을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자이고, 각각의 가닥은 약 19개 내지 약 28개의 뉴클레오타이드(즉, 약 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개 또는 28개의 뉴클레오타이드)를 가진다. 통상적으로, 본 발명의 방법에서 사용된 간섭 RNA는 약 19개 내지 49개의 뉴클레오타이드의 길이를 가진다. 구절 "19개 내지 49개의 뉴클레오타이드의 길이"는 이중 가닥 간섭 RNA을 언급할 때, 안티센스 및 센스 가닥이 독립적으로 간섭 RNA 분자(여기서, 센스 및 안티센스 가닥은 링커 분자에 의해 연결됨)를 포함하는, 약 19개 내지 약 49개의 뉴클레오타이드의 길이를 가진다는 것을 의미한다.
본 발명의 전달 시스템 및 방법에 사용된 간섭 RNA는 비변형될 수 있거나, 화학적으로 안정화될 수 있어서 식균작용 경로에서 리소좀 또는 다른 구획에서의 분해를 방지한다.
단일 가닥 간섭 RNA는 mRNA 침묵화를 발생시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 또한 단일 가닥 간섭 RNA의 투여를 제공한다. 단일 가닥 간섭 RNA는 상기 언급된 이중 가닥 간섭 RNA에 대해 약 19개 내지 약 49개의 뉴클레오타이드의 길이를 가진다. 단일 가닥 간섭 RNA는 5' 포스페이트를 가지거나 5' 위치에서 인시츄로 또는 생체내 인산화된다. 용어 "5' 인산화"는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에서 당(예를 들어, 리보스, 데옥시리보스, 또는 이들의 유사체)의 C5 하이드록실에 대한 에스터 연결을 통해 부착된 포스페이트기를 가지는, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 기술하기 위해 사용된다.
단일 가닥 간섭 RNA는 화학적으로 또는 실험실내 전사에 의해 합성되거나 이중 가닥 간섭 RNA와 관련하여 본 명세서에 기재된 바대로 벡터 또는 발현 카세트로부터 내인성으로 발현될 수 있다. 5' 포스페이트기는 키나제를 통해 첨가될 수 있거나, 5' 포스페이트는 RNA의 뉴클레아제 절단의 결과일 수 있다. 헤어핀 간섭 RNA는 줄기-루프 또는 헤어핀 구조(예를 들어, shRNA)에서 간섭 RNA의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다를 포함하는 단일 분자(예를 들어, 단일 올리고뉴클레오타이드 사슬)이다. 예를 들어, shRNA는 센스 간섭 RNA 가닥을 암호화하는 DNA 올리고뉴클레오타이드가 짧은 스페이서에 의해 리버스 상보성 안티센스 간섭 RNA 가닥을 암호화하는 DNA 올리고뉴클레오타이드에 연결된 DNA 벡터로부터 발현될 수 있다. 선택된 발현 벡터에 필요한 경우, 3' 말단 T' 및 뉴클레오타이드 형성 제한 부위가 첨가될 수 있다. 생성된 RNA 전사체는 그 자체로 뒤로 폴딩하여 줄기-루프 구조를 형성한다.
간섭 RNA는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실, 치환 또는 변형에 의해 천연 발생 RNA와 다를 수 있다. 비뉴클레오타이드 물질은 5' 말단, 3' 말단, 또는 내부에서 간섭 RNA에 결합할 수 있다. 이러한 변형은 흔히 간섭 RNA의 뉴클레아제 내성을 증가시키고, 세포 흡수를 개선하고, 세포 표적화를 증대시키고, 간섭 RNA의 추적을 도와서, 추가로 안정성을 개선하여서, 오프 표적 효과를 감소시키거나, 인터페론 경로의 활성화의 가능성을 감소시키도록 설계된다. 예를 들어, 간섭 RNA는 오버행(overhang)의 말단에서 퓨린 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 피롤리딘 링커에 의한 또한 siRNA 분자의 센스 가닥의 3' 말단에 대한 콜레스테롤의 접합은 siRNA에 대한 안정성을 제공한다.
추가의 변형은 예를 들어 바이오틴 분자, 펩티도미메틱, 형광성 염료 또는 덴드리머를 포함한다.
뉴클레오타이드는 본 발명의 실시형태에서 이의 염기 부분에서, 이의 당 부분에서, 또는 분자 및 기능의 포스페이트 부분에서 변형될 수 있다. 변형은 예를 들어 알킬, 알콕시, 아미노, 데아자, 할로, 하이드록실, 티올기, 또는 이들의 조합에 의한 치환을 포함한다. 뉴클레오타이드는, 데옥시리보뉴클레오타이드에 의한 리보뉴클레오타이드의 대체, 또는 당 변형, 예를 들어 2' 아미노기, 2' O-메틸기, 2' 메톡시에틸기, 또는 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지에 의해 대체된, 예컨대 2' OH기를 갖지는 것과 같은, 더 높은 안정성으로 유사체에 의해 치환될 수 있다. 뉴클레오타이드의 퓨린 또는 피리미딘 유사체의 예는 잔틴, 하이포잔틴, 아자퓨린, 메틸티오아데닌, 7-데아자-아데노신 및 O- 및 N-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 뉴클레오타이드의 포스페이트기는 질소 또는 황에 의한 포스페이트기의 하나 이상의 산소의 치환(포스포로티오에이트)에 의해 변형될 수 있다. 변형은 예를 들어 기능을 증대시키거나, 안정성 또는 투과성을 개선하거나, 오프 표적 효과를 감소시키거나, 국재화 또는 표적화를 지시하기에 유용하다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 간섭 분자는 상기 기재된 바대로 적어도 하나의 변형을 포함한다.
구절 "표적 서열" 및 "표적 mRNA"는 본 명세서에 사용되는 바대로 본 발명의 방법에서 사용된 간섭 RNA에 의해 인식될 수 있는 mRNA 또는 mRNA 서열의 일부를 의미하고, 이에 의해 간섭 RNA는 본 명세서에 기재된 바대로 유전자 발현을 침묵화시킬 수 있다. siRNA에 대한 표적 서열을 선택하는 기법은 예를 들어 록펠러 대학교(Rockefeller University) 웹사이트에서 이용 가능한 문헌[Tuschl, T. et al., "The siRNA User Guide", 2004년 5월 6일 개정]에 의해; 암비온(Ambion) 웹사이트에서의 암비온 인코포레이션(Ambion Inc.)의 기술 공보 506호, "siRNA Design Guidelines"에 의해; 및 예를 들어, 인비트로젠(Invitrogen), 다르마콘(Dharmacon), 인터그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies), 또는 진스크립트(Genscript) 웹사이트에서의 다른 웹 기반 설계에 의해 제공된다. 초기 조사 매개변수는 35% 내지 55%의 G/C 함량 및 19개 내지 27개의 뉴클레오타이드의 siRNA 길이를 포함할 수 있다. 표적 서열은 암호화 영역에 또는 mRNA의 5' 또는 3' 비번역 영역에 위치할 수 있다. 표적 서열은 간섭 RNA 분자, 예컨대 본 명세서에 기재된 것을 전달하도록 사용될 수 있다.
표적 mRNA 서열 내의 간섭 RNA 표적 서열(예를 들어, siRNA 표적 서열)은 상기 기재된 바대로 이용 가능한 설계 도구를 이용하여 선택될 수 있다. 표적 서열에 상응하는 간섭 RNA는 이후 표적 mRNA를 발현하는 세포의 형질감염, 이어서 본 명세서에 기재된 바대로 넉 다운의 평가에 의해 실험실내 시험된다. 간섭 RNA는 본 명세서에 기재된 바대로 동물 모델을 사용하여 생체내 추가로 평가될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 간섭 RNA 전달 시스템은, 제한 없이, Toso, IgM, B7H3, PAMP, DAMP, 스크램블라제 및 면역 관문 저해제, 예컨대 PD-1 및 CTLA-4를 포함하는 면역 반응과 연관된 유전자를 표적화하는 간섭 RNA 분자를 포함한다.
IIB. 항체
일 양상에서, 본 발명은, 제한 없이 Toso, IgM, B7H3, PAMP, DAMP, 스크램블라제 및 면역 관문 저해제, 예컨대 PD-1 및 CTLA-4를 포함하는 면역 반응에 관여하는 하나 이상의 단백질에 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 항체는 이들 단백질의 활성을 증가시킨다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 이의 활성을 감소시킨다.
항체를 제조하는 방법은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,727,350호는 Toso에 지향된 항체를 개시하고, 이것은 모든 목적을 위해 그리고 특히 본 명세서에 기재된 단백질에 지향된 항체에 관한 모든 교시내용을 위해 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함된다.
면역계 경로의 다른 성분에 대한 항체는 또한 당해 분야에 공지되어 있고, 단독으로 또는 본 명세서에 기재된 임의의 다른 분자와 조합되어 사용된다. 예를 들어, PD-1에 대한 항체는, 제한 없이, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, MK-3475(람브롤리주맙), 및 BMS-936558(예를 들어, 문헌[N Engl J Med 2012; 366:2443-2454]에 기재됨)을 포함한다. CTLA-4에 대한 항체는, 제한 없이, 이필리무맙 및 트레멜리무맙을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 항체는 하기 정의된 바와 같은 다중클론 항체, 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이의 유도체 또는 단편일 수 있다. 일 양상에서, 단편은 항체의 CDR을 포함하거나, 대안적으로 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 훨씬 추가로 이것으로 이루어진다. 일 양상에서, 본 발명의 항체는 검출 가능하게 표지되거나, 이것에 접합된 검출 가능한 라벨을 추가로 포함한다. 본 발명의 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주가 또한 제공된다. 하나 이상의 상기 실시형태를 포함하는 조성물이 본 명세서에 추가로 제공된다.
항체 및 운반체(carrier)를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 항체의 생물학적 활성 단편 또는 항체 단편을 포함하는 조성물이 추가로 제공된다. 적합한 운반체가 상기 정의되어 있다.
항체 및 항체에 특이적으로 결합한 폴리펩타이드를 포함하거나, 대안적으로 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 훨씬 추가로 이것으로 이루어진 항체-펩타이드 복합체가 추가로 제공된다. 일 양상에서, 폴리펩타이드는 항체가 길러진 키메라 폴리펩타이드이다.
본 발명은 또한 본 발명의 치료학적 방법에서 유용한 Toso와 복합체를 특이적으로 형성할 수 있는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 마우스, 랫트, 및 토끼 또는 인간 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 항체는 세포 배양에서, 파지에서, 또는 토끼, 염소, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그, 양, 개, 고양이, 원숭이, 침팬치, 유인원 등을 포함하는 다양한 동물(이들로 제한되지는 않음)에서 생성될 수 있다. 항체는 치료학적 폴리펩타이드를 확인하고 정제하기에 또한 유용하다.
본 발명은 또한 상기 기재된 항체 및 항체에 특이적으로 결합된 항원(또는 항원의 일부)를 포함하거나, 대안적으로 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 훨씬 추가로 이것으로 이루어진 항체-펩타이드 복합체를 제공한다. 항원은, 제한 없이, 폴리펩타이드(전장 및 전장 단백질의 일부 포함), 지질 항원 및 탄수화물 항원을 포함할 수 있다. 일 양상에서, 복합체는 단리된 복합체이다. 추가의 양상에서, 복합체의 항체는 본 명세서에 기재된 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체 또는 항체 유도체이지만, 이들로 제한되지는 않는다. 항체-항원 복합체의 항체 또는 항원 중 어느 하나 또는 둘 다는 검출 가능하게 표지화될 수 있거나, 이에 접합된 검출 가능한 라벨을 추가로 포함한다. 일 양상에서, 본 발명의 항체-항원 복합체는 진단학적 또는 스크리닝 검정에서 대조군 또는 기준 샘플로서 사용될 수 있다.
본 발명의 다중클론 항체는 당해 분야에 공지된 종래의 기법을 이용하여 생성될 수 있거나, 문헌에 널리 기재되어 있다. 다중클론 항체의 생성을 위한 몇몇 방법론이 존재한다. 예를 들어, 다중클론 항체는 통상적으로 닭, 염소, 기니아 피그, 햄스터, 말, 라마, 마우스, 랫트 및 토끼(이들로 제한되지는 않음)와 같은 적합한 척추 동물의 면역화에 의해 생성된다. 항원은 포유류로 주사되고, 이것은 B 림프구가 항원에 특이적인 IgG 면역글로불린을 생성하게 유도한다. 이 IgG는 포유류의 혈청으로부터 정제된다. 이 방법론의 변형은 부형제, 투여의 경로 및 부위, 부위마다의 주사 용적, 및 동물의 인간 치료 및 최적 생성을 위한 동물마다의 부위의 수의 변형을 포함한다. 예를 들어, 부형제는 통상적으로 항원에 대한 면역 반응을 개선하거나 증대시키도록 사용된다. 대부분의 부형제는 주사 부위 항원 데포를 제공하고, 이것은 방수하는 림프절로의 항원의 느린 방출을 허용한다. 다른 부형제는 넓은 표면적에 걸친 단백질 항원 분자의 농축을 촉진하는 계면활성제 및 면역자극 분자를 포함한다. 다중클론 항체 생성에 대한 부형제의 비제한적인 예는 프로인트 부형제(Freund's adjuvant), 리비(Ribi) 부형제 시스템 및 티테르맥스(Titermax)를 포함한다. 다중클론 항체는 미국 특허 제7,279,559호; 7,119,179호; 제7,060,800호; 제6,709,659호; 제6,656,746호; 제6,322,788호; 제5,686,073호; 및 제5,670,153호(모든 목적을 위해 그리고 특히 항체와 관련한 모든 교시내용을 위해 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
본 발명의 단일클론 항체는 당해 분야에 공지되고 문헌에 널리 기재된 종래의 하이브리도마 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마는 적합한 불활화 세포주(예를 들어, 골수종 세포주 예컨대, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U397, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, CHO, PerC.6, YB2/O) 등, 또는 이종골수종, 이의 융합 생성물, 또는 이로부터 유래한 임의의 세포 또는 융합 세포, 또는 당해 분야에 공지된 바와 같은 임의의 다른 적합한 세포주(이들로 제한되지는 않음)(예를 들어, www.atcc.org, www.lifetech.com.(2007년 11월 26일에 최근 접속) 등을 참조)를, 내인성 또는 비상동성 핵산으로서, 재조합 또는 내인성, 바이러스, 박테리아, 조류, 원핵생물, 양서류, 곤충, 파충류, 어류, 포유류, 설치류, 말, 양과, 염소, 양, 영장류, 진핵생물, 게놈 DNA, cDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록체 DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일, 이중 또는 삼중 가닥, 하이브리드화 등 또는 임의의 이들의 조합으로서, 항체 생성 세포, 예컨대 단리된 또는 클론화된 비장, 말초 혈액, 림프, 편도, 또는 다른 면역 또는 B 세포 함유 세포, 또는 중쇄 또는 경쇄 불변 또는 가변 또는 프레임워크 또는 CDR 서열을 발현하는 임의의 다른 세포(이들로 제한되지는 않음)와 융합함으로써 생성된다. 항체 생성 세포는 관심 있는 항원에 의해 면역화된 인간 또는 다른 적합한 동물의 말초 혈액 또는 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 또한 얻어질 수 있다. 임의의 다른 적합한 숙주 세포는 본 발명의 항체를 암호화하는 비상동성 또는 내인성 핵산, 이의 특정한 단편 또는 변이체를 발현하기 위해 또한 사용될 수 있다. 융합된 세포(하이브리도마) 또는 재조합 세포는 선택적 배양 조건 또는 다른 적합한 공지된 방법을 이용하여 단리되고, 제한 희석 또는 세포 분류 또는 다른 공지된 방법에 의해 클로닝될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 다중 항원 펩타이드(Multiple Antigenic Peptide: MAP) 시스템을 이용하여 생성될 수 있다. MAP 시스템은 관심 있는 항원 펩타이드가 표준 고상 화학을 이용하여 지어질 수 있는 3개 또는 7개의 방사상 분지된 라이신 잔기의 펩타이딜 코어를 이용한다. 라이신 코어는 일반적으로 전체 분자량의 10% 미만을 차지하는 내부 코어에 따라 펩타이드 에피토프의 약 4개 내지 8개의 카피를 보유하는 MAP를 생성시킨다. MAP 시스템은 접합에 운반 단백질을 요하지 않는다. MAP에서의 항원 에피토프의 복수의 카피의 치밀한 충전 및 높은 몰 비는 강한 면역원 반응을 생성시키는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 미국 특허 제5,229,490호에 기재되어 있고, 모든 목적을 위해 그리고 특히 MAP 시스템에 관련한 모든 교시내용을 위해 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함된다.
당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 펩타이드 또는 단백질 라이브러리(예를 들어, 다양한 상업 판매자, 예컨대 Cambridge Antibody Technologies(영국 케임브리지셔), MorphoSys(델라웨어주 마르틴스레이드/플라네그), Biovation(영국 스코틀랜드 애버딘) BioInvent(스웨덴 룬드) 등으로부터 구입 가능한, 박테리오파지, 리보솜, 올리고뉴클레오타이드, RNA, cDNA 등, 디스플레이 라이브러리(이들로 제한되지는 않음))로부터 재조합 항체를 선택하는 방법(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는, 필요한 특이성의 항체를 생성하거나 단리하는 다른 적합한 방법을 사용할 수 있다. 미국 특허 제4,704,692호; 제5,723,323호; 제5,763,192호; 제5,814,476호; 제5,817,483호; 제5,824,514호; 5,976,862호(모든 목적을 위해 그리고 특히 항체와 관련된 방법에 관련한 모든 교시내용을 위해 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함됨)를 참조한다. 대안적인 방법은 당해 분야에 공지된 바대로 및/또는 본 명세서에 기재된 바대로 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 형질전환 동물의 면역화에 따라 달라진다(예를 들어, SCID 마우스, Nguyen et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41:901-907; Sandhu et al. (1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118; Eren et al. (1998) Immunol. 93:154-161). 이러한 기법은 리보솜 디스플레이(Hanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937-4942; Hanes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14130-14135); 단일 세포 항체 생성 기술(예를 들어, 선택된 림프구 항체 방법("selected lymphocyte antibody method: SLAM")(미국 특허 제5,627,052호, Wen et al. (1987) J. Immunol. 17:887-892; Babcook et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848); 겔 미세액적 및 유세포분석법(Powell et al. (1990) Biotechnol. 8:333-337; One Cell Systems, (Cambridge, Mass); Gray et al. (1995) J. Imm. Meth. 182:155-163; 및 Kenny et al. (1995) Bio. Technol. 13:787-790); B 세포 선택(Steenbakkers et al. (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134)(모든 목적을 위해 그리고 특히 항체를 생성하는 방법에 관련한 모든 교시내용을 위해 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함됨)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체 유도체는 예컨대 젖 또는 혈청에서 이러한 항체를 생성하는 형질전환 동물 또는 포유류, 예컨대 설치류, 염소, 소, 말, 양 등을 제공하기 위해 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 적합한 숙주에 전달함으로써 또한 제조될 수 있다. 이 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,827,690호; 제5,849,992호; 제4,873,316호; 제5,849,992호; 제5,994,616호; 제5,565,362호; 및 제5,304,489호(모든 목적을 위해 그리고 특히 항체를 생성하는 것에 관련한 모든 교시내용을 위해 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
용어 "항체 유도체"는 항체 또는 단편의 선형 폴리펩타이드 서열에 대한 번역 후 변형을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,602,684호　B1(모든 목적을 위해 그리고 특히 항체의 변형에 관련한 모든 교시내용을 위해 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함됨)은, 증대된 Fc 매개된 세포 독성을 가지는 면역글로불린의 Fc 영역과 동등한 영역을 포함하는, 전체 항체 분자, 항체 단편 또는 융합 단백질을 포함하는, 항체의 변형된 글라이콜 형태, 및 이렇게 생성된 당단백질의 생성을 위한 방법을 기재한다.
식물 부분에서의 또는 이로부터 배양된 세포에서의 이러한 항체, 특정한 부분 또는 변이체를 생성하는, 형질전환 식물 및 배양된 식물 세포(예를 들어, 담배, 옥수수 및 좀개구리밥(이들로 제한되지는 않음))를 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 전달함으로써 항체 유도체를 또한 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cramer et al. (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118] 및 이에 인용된 문헌은 예를 들어 유도성 프로모터를 사용하여 다량의 재조합 단백질을 발현하는 형질전환 담배 잎의 생성을 기재한다. 형질전환 옥수수는 다른 재조합 시스템에서 생성되거나 천연 소스로부터 정제된 것과 동등한 생물학적 활성으로 상업 생성 수준에서 포유류 단백질을 발현하기 위해 사용된다. 예를 들어, 문헌[Hood et al. (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147] 및 이에 인용된 문헌을 참조한다. 항체 유도체는, 담배 종자 및 감자 괴경을 포함하는, 항체 단편, 예컨대 단일 사슬 항체(scFv)를 포함하는 형질전환 식물 종자로부터 또한 다량으로 생성된다. 예를 들어, 문헌[Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109] 및 이에 인용된 문헌을 참조한다. 따라서, 본 발명의 항체는 공지된 방법에 따라 형질전환 식물을 사용하여 또한 제조될 수 있다.
항체 유도체는 예를 들어 면역원성을 변형시키거나, 결합, 친화도, 결합 속도, 분해 속도, 결합도, 특이성, 반감기, 또는 임의의 다른 적합한 특징을 감소시키거나, 증대시키거나, 변형시키기 위해 외인성 서열을 첨가함으로써 또한 제조될 수 있다. 일반적으로 비인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부가 유지되는 반면에, 가변 및 불변 영역의 비인간 서열은 인간 또는 다른 아미노산에 의해 대체된다.
일반적으로, CDR 잔기(항체 단편의 예)는 직접적으로 및 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치는 것에 관여된다. 본 발명의 항체의 인간화 또는 조작은 임의의 공지된 방법, 예컨대 미국 특허 제5,723,323호; 제5,976,862호; 제5,824,514호; 제5,817,483호; 제5,814,476호; 제5,763,192호; 제5,723,323호; 제5,766,886호; 제5,714,352호; 제6,204,023호; 제6,180,370호; 제5,693,762호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,225,539호; 및 제4,816,567호(모든 목적을 위해 그리고 특히 항체의 인간화 또는 조작에 관련한 모든 교시내용을 위해 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 것(이들로 제한되지는 않음)을 이용하여 수행될 수 있다.
완전 인간 항체를 부분적으로 제조하는 기법은 당해 분야에 공지되어 있고, 임의의 이러한 기법을 이용할 수 있다. 일 실시형태에 따라, 완전 인간 항체 서열은 인간 중쇄 및 경쇄 항체 유전자를 발현하도록 조작된 형질전환 설치류, 예컨대 마우스에서 만들어진다. 상이한 종류의 항체를 생성할 수 있는 이러한 형질전환 마우스의 복수의 균주가 만들어진다. 원하는 항체를 생성하는 형질전환 마우스로부터의 B 세포는 원하는 항체의 연속 생성을 위해 하이브리도마 세포주를 만들도록 융합될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Russel et al. (2000) Infection and Immunity 68(4):1820-1826; Gallo et al. (2000) European J. of Immun. 30:534-540; Green (1999) J. of Immun. Methods 231:11-23; Yang et al. (1999A) J. of Leukocyte Biology 66:401-410; Yang (1999B) Cancer Research 59(6):1236-1243; Jakobovits (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42; Green & Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188(3):483-495; Jakobovits (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4):607-614; Tsuda et al. (1997) Genomics 42:413-421; Sherman-Gold (1997) Genetic Engineering News 17(14); Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Jakobovits (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System Vol. IV, 194.1-194.7; Jakobovits (1995) Current Opinion in Biotechnology 6:561-566; Mendez et al. (1995) Genomics 26:294-307; Jakobovits (1994) Current Biology 4(8):761-763; Arbones et al. (1994) Immunity 1(4):247-260; Jakobovits (1993) Nature 362(6417):255-258; Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(6):2551-2555; 및 미국 특허 제6,075,181호]을 참조.)
본 발명의 항체는 키메라 항체를 생성하도록 또한 변형될 수 있다. 키메라 항체는 항체의 중쇄 및 경쇄의 다양한 도메인이 하나 초과의 종으로부터의 DNA에 의해 암호화된 것이다. 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호를 참조한다.
대안적으로, 본 발명의 항체는 비니어드 항체(veneered antibody)를 생성하기 위해 또한 변형될 수 있다. 비니어드 항체는 일 종의 항체의 외부 아미노산 잔기가 제2 종의 것에 의해 사려 깊게 대체되거나 "비니어드"된 것이어서, 제1 종의 항체는 제2 종에서 면역원성이 아니어서 항체의 면역원성을 감소시킨다. 단백질의 항원성이 이의 표면의 성질에 따라 주로 달라지므로, 또 다른 포유류 종의 항체에서 보통 발견되는 것과 다른 노출된 잔기를 대체함으로써 항체의 면역원성은 감소한다. 외부 잔기의 이 사려 깊은 대체는 내부 도메인, 또는 내부도메인 접촉에 영향을 가지지 않거나 거의 가지지 않아야 한다. 따라서, 리간드 결합 특성은 가변 영역 프레임워크 잔기로 제한된 변경의 결과로서 영향을 받지 않아야 한다. 이 과정은 "비니어링(veneering)"이라 불리는데, 왜냐하면 항체의 외부 표면 또는 스킨만이 변경되어서, 분포되지 않고 남은 잔기를 지지하기 때문이다.
"비니어링"에 대한 절차는 문헌[Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., Bethesda, Md., National Institutes of Health], 이 데이터베이스의 업데이트, 및 다른 접근 가능한 미국 및 외국 데이터베이스에 의해 파일화된 인간 항체 가변 도메인(핵산 및 단백질 둘 다)에 대한 이용 가능한 서열 데이터를 사용한다. 비니어드 항체를 생성하기 위해 사용된 방법의 비제한적인 예는 EP 제519596호; 미국 특허 제6,797,492호; 및 문헌[Padlan et al. (1991) Mol. Immunol. 28(4-5):489-498]에 기재된 것을 포함한다.
용어 "항체 유도체"는 또한 2개의 항원 결합 부위를 가지는 작은 항체 단편인 "다이아바디"를 포함하고, 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. (예를 들어, EP 제404,097호; WO 제93/11161호; 및 문헌[Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448] 참조.) 동일한 사슬에서 2개의 도메인 사이의 쌍 지음을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 짓고 2개의 항원 결합 부위를 생성하도록 강요된다. (또한, 미국 특허 제6,632,926호(Chen 등)(모 항체의 초가변 영역으로 삽입된 하나 이상의 아미노산 및 항원에 대한 모 항체의 결합 친화도보다 적어도 약 2배 더 강한 표적 항원에 대한 결합 친화도를 가지는 항체 변이체를 개시함) 참조.)
용어 "항체 유도체"는 "선형 항체"를 추가로 포함한다. 선형 항체를 만드는 절차는 당해 분야에 공지되어 있고, 문헌[Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062]에 기재되어 있다. 간단히 말하면, 이 항체는 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 분절(VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
본 발명의 항체는 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수되거나 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")는 정제에 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 천연으로 정제된 생성물, 화학 합성 절차의 생성물, 및 예를 들어 효모, 고등의 식물, 곤충 및 포유류 세포를 포함하는 진핵생물 숙주로부터, 또는 대안적으로 상기 기재된 바와 같은 원핵생물 세포로부터 재조합 기법에 의해 생성된 생성물을 포함한다.
시험되는 단일클론 항체가 단백질 또는 폴리펩타이드와 결합할 때, 시험되는 항체 및 본 발명의 하이브리도마에 의해 제공된 항체는 동등하다. 단일클론 항체가 보통 반응성인 단백질 또는 폴리펩타이드에 본 발명의 단일클론 항체가 결합하는 것을 시험되는 항체가 방지하는지를 결정함으로써, 항체가 본 발명의 단일클론 항체와 동일한 특이성을 갖는지에 대해 부당한 실험 없이 또한 결정할 수 있다. 시험되는 항체가 본 발명의 단일클론 항체에 의한 결합의 감소로 나타나는 것처럼 본 발명의 단일클론 항체와 경쟁하는 경우, 2개의 항체가 동일한 또는 밀접히 관련된 에피토프에 결합할 것이다. 대안적으로, 본 발명의 단일클론 항체를 이것이 보통 반응성인 단백질과 예비 항온처리하고, 시험되는 단일클론 항체가 항원에 결합하는 능력이 저해되는지를 결정할 수 있다. 시험되는 단일클론 항체가 모든 가능성으로 이후 저해되면, 이것은 본 발명의 단일클론 항체와 동일한 또는 밀접히 관련된 에피토프 특이성을 가진다.
용어 "항체"는 또한 모든 아이소타입의 항체를 포함하도록 의도된다. 단일클론 항체의 특정한 아이소타입은 직접적으로 초기 융합으로부터 선택함으로써 제조될 수 있거나, 둘째로 문헌[Steplewski et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8653 또는 Spira et al. (1984) J. Immunol. Methods 74:307]에 기재된 절차를 이용하여 종류 변환 변이체(class switch variant)를 단리하기 위해 sib 선택 기법에 의해 상이한 아이소타입의 단일클론 항체를 분비하는 모 하이브리도마로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 단일클론 항체의 특이성을 가지는 단일클론 항체를 분비하는 다른 하이브리도마의 단리는 항-이디오타입 항체를 생성함으로써 당해 분야의 당업자에 의해 또한 달성될 수 있다. Herlyn et al. (1986) Science 232:100. 항-이디오타입 항체는 관심 있는 하이브리도마에 의해 생성된 단일클론 항체에 존재하는 독특한 결정부위를 인식하는 항체이다.
2개의 하이브리도마의 단일클론 항체 사이의 이디오타입 동일성은 2개의 단일클론 항체가 동일한 에피토프 결정부위의 이의 인식과 관련하여 동일하다는 것을 나타낸다. 따라서, 단일클론 항체 상의 에피토프 결정부위에 항체를 사용함으로써 동일한 에피토프 특이성의 단일클론 항체를 발현하는 다른 하이브리도마를 확인할 수 있다.
에피토프를 모방하는 단일클론 항체를 생성하는 항-이디오타입 기술을 또한 이용할 수 있다. 예를 들어, 제1 단일클론 항체에 만들어진 항-이디오타입 단일클론 항체는 제1 단일클론 항체에 의해 결합된 에피토프의 거울 상인 초가변 영역에서의 결합 도메인을 가질 것이다. 따라서, 이런 경우에, 항-이디오타입 단일클론 항체는 이 항체의 생성을 위한 면역화에 사용될 수 있다.
본 발명의 몇몇 양상에서, 검출가능하게 또는 치료학적으로 항체를 표지하는 것이 유용할 것이다. 이 물질에 항체를 접합하는 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 오직 예시 목적을 위해, 항체는 검출 가능한 모이어티, 예컨대 방사성 원자, 발색단, 형광단 등에 의해 표지될 수 있다. 이러한 표지된 항체는 생체내, 또는 단리된 시험 샘플에서 진단학적 기법을 위해 사용될 수 있다.
저분자량 합텐에 대한 항체의 커플링은 검정에서 항체의 감수성을 증가시킬 수 있다. 이후, 합텐은 제2 반응에 의해 특이적으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 합텐, 예컨대 아비딘과 반응하는 바이오틴, 또는 특이적 항-합텐 항체와 반응할 수 있는 다이나이트로페놀, 피리독살 및 플루오르세인을 사용하는 것이 통상적이다. 상기 문헌[Harlow & Lane (1988)]을 참조한다.
본 발명의 항체는 또한 많은 상이한 운반체에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 항체 및 또 다른 물질(활성 또는 불활성)을 함유하는 조성물을 제공한다. 널리 공지된 운반체의 예는 유리, 폴리스타이렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아마이드, 아가로스 및 자철석을 포함한다. 운반체의 성질은 본 발명의 목적을 위해 가용성 또는 불용성일 수 있다. 당해 분야의 당업자는 단일클론 항체에 결합하기 위한 다른 적합한 운반체를 알고 있거나, 일상적 실험을 이용하여 이를 확인할 수 있을 것이다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 항체는 이러한 돌연변이 없는 항체와 비교하여 항체의 약동학적 특성을 개선하는 불변 영역에서의 돌연변이를 포함한다. 이러한 항체는 소정의 실시형태에서 C 말단에서 인간 IgG1로부터 유도된 Fc 도메인을 포함할 것이고, 훨씬 추가의 실시형태에서 항체 의존적 및 보체 의존적 세포독성을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 이러한 돌연변이는 단독으로 또는 임의의 조합으로 E233P; L234V; L235A; ΔG236; A327G; A330S; P331S의 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, Fc 도메인은 도 10에 도시된 서열 번호 3에 따른 서열을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, Fc 도메인은 서열 번호 3과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 동일성의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 항체의 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 아미노산 변형을 만든다. 일반적으로, 오직 1개 또는 2개 또는 3개의 아미노산은 임의의 단일 CDR에서 치환되고, 일반적으로 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 변화가 일련의 CDR 내에 만들어진다. 그러나, 임의의 CDR에서의 무 치환, 1개, 2개 또는 3개의 치환의 임의의 조합이 독립적으로 및 임의로 임의의 다른 치환과 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
몇몇 경우에, CDR에서의 아미노산 변형은 "친화도 성숙"이라 칭해진다. "친화도 성숙된" 항체는 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도를 개선하는 하나 이상의 CDR에서의 하나 이상의 변경(들)을 가지는 것이다. 몇몇 경우에, 드물지만, 항원에 대한 항체의 친화도를 감소시키는 것이 바람직할 수 있지만, 이것은 일반적으로 바람직하지 않다.
친화도 성숙은 "부모" 항체와 비교하여 적어도 약 10% 내지 50-100-150% 이상, 또는 1배 내지 5배만큼 항원에 대한 항체의 결합 친화도를 증가시키도록 수행될 수 있다. 바람직한 친화도 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰을 가질 것이다. 친화도 성숙된 항체는 공지된 절차에 의해 생성된다. 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 기술하는 예를 들어 문헌[Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783]을 참조한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 랜덤 돌연변이유발은 예를 들어 문헌[Barbas, et al. 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; 및 Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol. 226:889-896]에 기재되어 있다.
대안적으로, 아미노산 변형은 "침묵"인, 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도를 상당히 변경하지 않는, 본 발명의 항체의 하나 이상의 CDR에서 이루어질 수 있다. (본 발명의 항체를 암호화하는 핵산에 대해 수행될 수 있는 것처럼) 발현의 최적화를 포함하는 다수의 이유로 이것이 만들어질 수 있다.
따라서, 본 발명의 CDR 및 항체의 정의 내에 변이체 CDR 및 항체가 포함되고, 즉 본 발명의 항체는 Ab79 및 Ab19의 CDR의 하나 이상에서의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 또한, 하기 기재된 바대로, 아미노산 변형은, 프레임워크 및 불변 영역을 포함하는, CDR 밖의 임의의 영역에서 또한 독립적으로 및 임의로 만들어질 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 항체는 약물과 접합되어 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate: ADC)를 형성한다. 일반적으로, ADC는 종양학 분야에서 사용되고, 여기서 세포독성제 또는 세포정지제의 국소 전달을 위한 항체-약물 접합체의 사용은 종양에 대한 약물 모이어티의 표적화된 전달을 허용하고, 이것은 더 높은 효율, 더 낮은 독성 등을 허용할 수 있다. 이 기술의 검토는 문헌[Ducry et al., Bioconjugate Chem., 21:5-13 (2010), Carter et al., Cancer J. 14(3):154 (2008) 및 Senter, Current Opin. Chem. Biol. 13:235-244 (2009)](이들 모두는 모든 목적을 위해 그리고 특히 항체 약물 접합체와 관련한 모든 교시내용을 위해 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함됨)에 제공된다.
따라서, 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 약물에 접합된 Toso 항체를 제공한다. 일반적으로, 접합은 항체에 대한 공유 부착에 의해 수행되고, 일반적으로 링커, 대개 펩타이드 연결(당해 분야에 공지된 바대로, 표적 부위에서의 프로테아제에 의한 절단에 민감하거나 민감하지 않도록 설계될 수 있음)에 따라 달라진다. 또한, 상기 기재된 바대로, 링커-약물 유닛(linker-drug unit: LU-D)의 연결은 항체 내의 시스테인에 대한 부착에 의해 수행될 수 있다. 당업자에 의해, 항체마다 약물 모이어티의 수가 반응의 조건에 따라 변할 수 있고, 1:1 내지 10:1의 약물:항체로 변할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 당업자에 의해, 실제 수가 평균인 것으로 이해될 것이다.
ADC의 약물은, 세포독성제, 예컨대 화학치료제, 성장 저해제, 독소(예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 접합체)(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는, 임의의 수의 물질일 수 있고, 이들이 제공된다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 ADC를 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명의 항체-약물 접합체에서 사용하기 위한 약물은 세포독성 약물, 특히 암 치료에 사용되는 것을 포함한다. 이러한 약물은 일반적으로 DNA 손상물질, 항대사물질, 천연 생성물 및 이들의 유사체를 포함한다. 예시적인 종류의 세포독성제는 효소 저해제, 예컨대 다이하이드로엽산 환원효소 저해제 및 티미딜레이트 신타제 저해제, DNA 치윤제, DNA 절단제, 토포아이소머라제 저해제, 약물의 안트라사이클린 패밀리, 빈카 약물, 미토마이신, 블레오마이신, 세포독성 뉴클레오사이드, 약물의 프테리딘 패밀리, 다이넨, 포도필로톡신, 돌라스타틴, 메이탄시노이드, 분화 유도제 및 탁솔을 포함한다.
이러한 종류의 구성원은 예를 들어 메토트렉세이트, 메토프테린, 다이클로로메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 6-머캅토퓨린, 사이토신 아라비노사이드, 멜팔란, 류로신, 류로시데인, 악티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 미토마이신 C, 미토마이신 A, 카미노마이신, 아미노프테린, 탈리소마이신, 포도필로톡신 및 포도필로톡신 유도체, 예컨대 에토포사이드 또는 에토포사이드 포스페이트, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 탄산, 예컨대 탁솔, 탁소테레 레티노산, 뷰티르산, N8-아세틸 스페르미딘, 캄프토테신, 칼리케아마이신, 에스페라마이신, 엔=다이인, 듀오카르마이신 A, 듀오카르마이신 SA, 칼리케아마이신, 캄프토테신, 메이탄시노이드(DM1 포함), 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF) 및 메이탄시노이드(DM4), 및 이들의 유사체를 포함한다.
독소는 항체-독소 접합체로서 사용될 수 있고, 박테리아 독소, 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소, 예컨대 라이신, 소분자 독소, 예컨대 겔다나마이신(Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), 메이탄시노이드(EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), 및 칼리케아마이신(Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 토포아이소머라제 저해를 포함하는 기전에 의해 이의 세포독성 및 세포정지 효과를 발휘할 수 있다.
Toso 항체 및 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴, 트리초테센, 칼리케아마이신, 및 CC1065의 접합체, 및 독소 활성을 가지는 이들 독소의 유도체가 고려된다.
임의의 상기에 따라, 본 발명의 항체에 이루어질 수 있는 또 다른 유형의 변형은 글라이코실화의 변경이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체는 하나 이상의 조작된 당형태를 포함하도록 변형될 수 있다. "조작된 당형태"는 본 명세서에 사용되는 바대로 항체에 공유로 부착된 탄수화물 조성물을 의미하고, 상기 탄수화물 조성물은 모 항체의 것과 화학적으로 다르다. 조작된 당형태는 이팩터 기능의 증대 또는 감소(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 다양한 목적에 유용할 수 있다. 예시적인 형태의 조작된 당형태는 비푸코실화이고, 이것은 아마도 FcγRIIIa 수용체에 대한 더 단단한 결합을 통해 ADCC 기능의 증가와 상관되는 것으로 나타났다. 이런 상황에서, "비푸코실화"는 숙주 세포에서 생성된 대부분의 항체가 실질적으로 푸코스가 없다는 것, 예를 들어 생성된 항체의 90-95-98%가 (일반적으로 Fc 영역에서 N297에서 부착된) 항체의 탄수화물 모이어티의 성분으로서 상당한 푸코스를 가지지 않는다는 것을 의미한다. 기능상 한정된, 비푸코실화 항체는 일반적으로 FcγRIIIa 수용체에 대한 적어도 50% 이상의 친화도를 나타낸다.
조작된 당형태는 당해 분야에 공지된 다양한 방법(Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; 미국 특허 제6,602,684호; 미국 출원번호 제10/277,370호; 미국 출원번호 제10/113,929호; PCT WO 제00/61739A1호; PCT WO 제01/29246A1호; PCT WO 제02/31140A1호; PCT WO 제02/30954A1호(모두 모든 목적을 위해 그리고 특히 조작된 당형태와 관련한 모든 교시내용을 위해 그 전문이 전체로 참조로 포함됨)에 의해 생성될 수 있다. 많은 이들 기법은, 예를 들어 조작된 또는 그 외 다양한 유기체 또는 세포주(예를 들어 Lec-13 CHO 세포 또는 랫트 하이브리도마 YB2/0 세포)에서 IgG를 발현시킴으로써, 글라이코실화 경로에 관여하는 효소(예를 들어, FUT8[1,6-푸코실트랜스퍼라제] 및/또는 β1-4-N-아세틸굴루코스아미닐트랜스퍼라제 III[GnTIII])를 조절함으로써, 또는 IgG가 발현된 후 탄수화물(들)을 변형시킴으로써, 푸코실화의 수준을 조절하는 것 및/또는 Fc 영역에 공유로 부착된 올리고사카라이드를 등분하는 것에 기초한다. 예를 들어, 시애틀 유전학(Seattle Genetics)의 "당 조작된 항체" 또는 "SEA 기술"은 생성 동안 푸코실화를 저해하는 변형된 사카라이드를 첨가함으로써 작용하고; 예를 들어 제20090317869호(본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함됨)를 참조한다. 조작된 당형태는 통상적으로 상이한 탄수화물 또는 올리고사카라이드라 불리고; 따라서 항체는 조작된 당형태를 포함할 수 있다.
대안적으로, 조작된 당형태는 상이한 탄수화물 또는 올리고사카라이드를 포함하는 변이체를 의미할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바대로, 글라이코실화 패턴은 단백질의 서열(예를 들어, 하기 기재된 특정한 글라이코실화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재), 또는 단백질이 생성된 숙주 세포 또는 유기체 둘 다에 따라 달라질 수 있다. 특정한 발현 시스템은 당해 분야에 공지되어 있고, 본 명세서에 기재되어 있다.
폴리펩타이드의 글라이코실화는 통상적으로 N 연결 또는 O 연결된다. N 연결은 아스파라긴 잔기의 부사슬에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 의미한다. 트라이-펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 부사슬에 대한 탄수화물 모이어티의 효소 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드에서의 이 트라이-펩타이드 서열의 존재는 가능한 글라이코실화 부위를 생성한다. O 연결된 글라이코실화는 하이드록시아미노산, 가장 흔히 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 또는 자일로스 중 하나의 부착을 의미하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신을 또한 사용할 수 있다.
항체(또는 임의의 다른 폴리펩타이드, 예컨대 상기 기재된 가용성 Toso 단백질)에 대한 글라이코실화 부위의 부가는 아미노산 서열을 변경함으로써 연속하여 달성되어서, 이것은 (N 연결 글라이코실화 부위에 대한) 하나 이상의 상기 기재된 트라이-펩타이드 서열을 함유한다. 변경은 (O 연결된 글라이코실화 부위에 대한) 시작 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 이에 의한 치환에 의해 또한 이루어질 수 있다. 용이함을 위해, 항체 아미노산 서열은 바람직하게는 특히 미리 선택된 염기에서 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변화를 통해 변경되어서, 원하는 아미노산으로 번역되는 코돈이 생성된다.
항체 또는 또 다른 단백질에 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또 다른 수단은 단백질에 대한 글라이코사이드의 화학 또는 효소 커플링에 의한다. 이 절차는 이것이 N 및 O 연결된 글라이코실화에 대한 글라이코실화 능력을 가지는 숙주 세포에서의 단백질의 생성을 필요로 하지 않는다는 점에서 유리하다. 사용된 커플링 모드에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카복실기, (c) 유리 설프하이드릴기, 예컨대 시스테인의 것, (d) 유리 하이드록실기, 예컨대 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 것, (e) 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판의 것, 또는 (f) 글루타민의 아마이드기에 부착될 수 있다. 이 방법은 WO 제87/05330호 및 문헌[Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306](둘 다 모든 목적을 위해 그리고 특히 단백질에 대해 탄수화물 모이어티를 커플링하는 것과 관련하여 모든 교시내용을 위해 본 명세서에 전체가 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
시작 항체(예를 들어 번역후)에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소로 달성될 수 있다. 화학 탈글라이코실화는 화합물 트라이플루오로메탄설폰산, 또는 동등한 화합물에 대한 단백질의 노출을 요한다. 이 처리는, 폴리펩타이드가 온전하게 두면서, 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외하고 대부분의 또는 모든 당을 절단시킨다. 화학 탈글라이코실화는 문헌[Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131](둘 다 전부가 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 폴리펩타이드에 대한 탄수화물 모이어티의 효소 절단은 문헌[Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350](전부가 참조로 포함됨)에 기재된 바대로 다양한 엔도- 및 엑소-글라이코시다제의 사용에 의해 성취될 수 있다. 가능한 글라이코실화 부위에서의 글라이코실화는 문헌[Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105](전부가 참조로 포함됨)에 기재된 바대로 화합물 투니카마이신의 사용에 의해 방지될 수 있다. 투니카마이신은 단백질-N-글라이코사이드 연결의 형성을 차단한다.
항체의 또 다른 유형의 공유 변형은 예를 들어 문헌[넥타르 쎄라퓨틱스(Nektar Therapeutics)로부터의 2005-2006 PEG 카탈로그(Nektar 웹사이트에서 이용 가능)], 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호(모두 모든 목적을 위해 그리고 특히 중합체에 항체를 연결하는 것과 관련하여 모든 교시내용을 위해 전체가 참조로 포함됨)에 기재된 방식으로 다양한 폴리올, 예컨대 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리프로필렌 글라이콜 또는 폴리옥시알킬렌(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 다양한 비단백질성 중합체에 항체를 연결하는 것을 포함한다. 또한, 당해 분야에 공지된 바대로, 중합체, 예컨대 PEG의 첨가를 수월하게 하도록 항체 내의 다양한 위치에서 아미노산 치환이 만들어질 수 있다. 예를 들어, 미국 공보 제2005/0114037A1호(전체가 참조로 포함됨)를 참조한다.
본 발명은 본 발명의 Toso 항체를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 둘 다가 항체에 포함된 경우에, 일반적으로 이들은 항체의 사합체 구조를 생성하기 위해, 표준 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포 등)로 조합된, 각각을 암호화하는 핵산을 이용하여 만들어진다. 오직 하나의 불변 도메인이 만들어지면, 오직 단일 핵산을 사용할 것이다.
본 발명에 따라 사용된 항체의 제제는 동결건조 제제 또는 수성 용액의 형태로 원하는 정도의 순도를 가지는 항체를 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 저장에 제조될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투약량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예컨대 포도당, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)(상표명), 플루로닉스(PLURONICS)(상표명) 또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)을 포함한다.
본 발명의 제제는 치료되는 특정한 적응증에 필요한 바대로 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부정적으로 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 가지는 것을 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 다른 특이성을 가지는 항체를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 또는 또한, 조성물은 세포독성제, 사이토카인, 성장 저해제 및/또는 소분자 길항제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도되는 목적에 효과적인 양으로 조합으로 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어 각각 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀션에 또한 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 무균이거나 거의 그래야 한다. 이는 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
서방출 제제를 제조할 수 있다. 서방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방출 매트릭스의 예는 폴리에스터, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글라이콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)(등록상표)(락트산-글라이콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주사용 미세구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시뷰티르산을 포함한다. 중합체, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글라이콜산이 100일 동안 분자의 방출을 허용하는 반면, 소정의 하이드로겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다.
캡슐화된 항체가 긴 시간 동안 신체에 있을 때, 이것은 37℃에서 습기에 대한 노출의 결과로서 변성되거나 응집될 수 있어서, 생물학적 활성이 소실되고 가능한 면역원성이 변경된다. 합당한 전략이 관여된 기전에 따라 안정화에 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-다이설파이드 상호변경을 통해 분자간 S--S 결합 형성인 것으로 밝혀질 때, 안정화는 설프하이드릴 잔기를 변형시키는 것, 산성 용액으로 동결건조하는 것, 적절한 첨가제를 사용하여 수분 함량을 조절하는 것, 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발하는 것에 의해 성취될 수 있다.
IIC. 가용성 Toso 단백질
본 발명의 가용성 Toso 단백질(또한 본 명세서에서 상호교환적으로 "가용성 Toso 수용체", "Toso-Fc" 및 "가용성 Toso 폴리펩타이드"라 칭함)은 Toso 수용체의 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 추가의 실시형태에서 신호 도메인 및/또는 Fc 도메인을 포함한다. 본 명세서에 추가로 자세히 기재된 것처럼, 가용성 Toso 단백질의 이 성분은 본 발명의 가용성 Toso 단백질을 제공하는 추가적인 성분 및/또는 변형과 함께 또는 이것 없이 임의의 방식으로 조합될 수 있다.
일 양상에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 Toso의 세포외 도메인을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 인간 Toso 아이소폼 a의 세포외 도메인을 포함한다. 인간 Toso의 세포외 도메인은 인간 Toso 아이소폼 a인 NP_005440.1의 아미노산 P21 내지 G251에 이르는 것으로 예상된다(문헌[Shima et al., Int. Immunol., 2010](모든 목적을 위해 그리고 특히 Toso의 세포외 도메인에 관련한 모든 교시내용을 위해 본 명세서에서 그 전문이 포함됨) 참조). 명확성을 위해, 본 명세서에서의 대부분의 토의는 인간 Toso 단백질의 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 가용성 Toso 단백질에 관한 것이다. 그러나, 임의의 종으로부터의 Toso 단백질의 세포외 도메인이 본 명세서에서의 설명에 따라 가용성 Toso 단백질을 생성하도록 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이고, 본 명세서에 기재된 인간 Toso 단백질의 영역에 상응하는 또 다른 종으로부터의 Toso 단백질의 영역을 확인하는 것은 바로 당해 분야의 당업자의 능력 내에 있을 것이다.
일 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 도 1에 도시된 서열 번호 1에 따른 세포외 도메인 서열을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 1과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 동일성의 서열 동일성을 가진다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 1에서 1-75개, 2-70개, 3-65개, 4-60개, 5-55개, 6-50개, 7-45개, 8-40개, 9-35개, 10-30개, 11-25개, 12-20개, 13-15개, 5-20개, 6-18개, 8-16개, 10-14개의 아미노산 치환을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 1에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개의 아미노산 치환을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 도 1에 도시된 서열 번호 8에 따른 세포외 도메인 서열을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 8과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 동일성의 서열 동일성을 가진다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 8에서 1-75개, 2-70개, 3-65개, 4-60개, 5-55개, 6-50개, 7-45개, 8-40개, 9-35개, 10-30개, 11-25개, 12-20개, 13-15개, 5-20개, 6-18개, 8-16개, 10-14개의 아미노산 치환을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 8에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개의 아미노산 치환을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다.
추가의 실시형태에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 7의 18번 내지 253번 아미노산을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 7의 21번 내지 253번 아미노산을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 7의 21번 내지 251번 아미노산을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 7로부터의 아미노산의 임의의 하기 범위를 포함한다: 1-255, 5-245, 10-235, 15-225, 20-215, 25-205, 30-195, 35-185, 40-175, 45-165, 50-155, 45-145, 40-135, 35-125, 30-115, 35-105, 40-95, 45-85, 50-75, 55-65. 훨씬 추가의 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 7의 18번 내지 253번 또는 21번 내지 253번 아미노산과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 동일성의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함한다.
훨씬 추가의 실시형태에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 도 1에 도시된 서열 번호 8의 전부 또는 일부를 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 8의 1-231번, 6-221번, 11-211번, 16-201번, 21-191번, 26-181번, 31-171번, 36-161번, 41-151번, 46-141번, 51-131번, 56-121번, 61-111번, 66-101번, 71-91번, 76-81번 아미노산을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 8의 1-231번, 6-221번, 11-211번, 16-201번, 21-191번, 26-181번, 31-171번, 36-161번, 41-151번, 46-141번, 51-131번, 56-121번, 61-111번, 66-101번, 71-91번, 76-81번 아미노산 영역과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다.
훨씬 추가의 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 8, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및 23 중 임의의 하나를 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 8, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 동일성의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 이 서열은 Toso 수용체의 세포외 도메인의 결실 변이체를 포함한다.
훨씬 추가의 실시형태에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 Toso 단백질의 완전 세포외 도메인의 결실 변이체를 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질의 성분인 결실 변이체는 하기 아미노산 중 하나 이상이 서열 번호 8로부터 결실된 폴리펩타이드를 포함한다: 1-21, 1-35, 1-87, 둘 다 영역 1-21 및 211-231, 211-231,154-231, 105-231, 및 93-231. 추가의 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질의 성분인 결실 변이체는 하기 아미노산 영역 중 하나 이상이 결실된 서열 번호 8에 따른 폴리펩타이드와 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다: 1-21, 1-35, 1-87, 1-21 및 211-231 영역 둘 다, 211-231,154-231, 105-231, 및 93-231.
추가의 실시형태에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 Toso 수용체의 리간드에 결합하는 영역을 포함하는 세포외 도메인 성분을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 IgM에 결합하는 세포외 도메인 성분을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 8의 35번 내지 87번 아미노산을 포함한다. 추가의 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 8의 25-100번, 29-95번, 33-90번, 37-85번, 41-80번, 45-75번, 49-70번, 53-65번, 또는 57-60번 아미노산을 포함한다.
추가의 양상에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 상기 기재된 바와 같은 세포외 도메인 성분을 포함하고, 신호 서열을 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 신호 서열은 숙주 세포로부터의 분비를 증대시킨다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 신호 서열은 제한 없이 IL-2 신호 서열, 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 α-일치 인자 프리-서열, 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger)로부터의 α-아밀라제 신호 서열, 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)로부터의 글루코아밀라제 신호 서열, 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터의 혈청 알부민 신호 서열, 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromcyes maxianus)로부터의 이눌리나제 신호 서열, 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 인버타제 신호 서열, 사카로마이세스 세레비시아에로부터의 살해 단백질 신호 서열, 갈루스 갈루스(Gallus gallus)로부터의 라이소좀 신호 서열로부터 선택된 구성원을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 신호 서열은 도 1에 도시된 서열 번호 2에 따른 서열을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 신호 서열은 서열 번호 2와 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 동일성의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은, 서열 번호 2 또는 서열 번호 2와 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 동일성의 동일성을 가지는 서열을 가지는 융합 단백질로서, 이 서열의 서열 번호 1, 8, 9, 11, 13, 15, 17, 21 및 23 중 임의의 하나 또는 변이체를 포함한다.
추가의 양상에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 Toso 수용체의 세포외 도메인 및 Fc 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 인간 Toso 단백질의 아이소폼 A의 세포외 도메인 및 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 추가의 실시형태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인이 없는 단백질과 비교하여 단백질의 반감기를 증대시키는 임의의 도메인을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인이 없는 단백질과 비교하여 단백질의 약동학적 프로필을 개선하는 임의의 도메인을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, Fc 도메인은 C 말단에서의 인간 IgG1로부터 유래하고, 이것은 훨씬 추가의 실시형태에서 항체 의존적 및 보체 의존적 세포독성을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 이러한 돌연변이는 단독으로 또는 임의의 조합으로 E233P; L234V; L235A; ΔG236; A327G; A330S; P331S의 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, Fc 도메인은 도 1에 도시된 서열 번호 3에 따른 서열을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, Fc 도메인은 서열 번호 3과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 동일성의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함한다.
추가의 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 세포외 도메인 성분 및 Fc 도메인 성분 둘 다를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 훨씬 추가의 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 1, 8, 9, 11, 13, 15, 17, 21 및 23, 또는 서열 번호 3 또는 서열 번호 3과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 동일성의 동일성을 가지는 서열을 가지는 융합 단백질로서, 이들 서열의 변이체를 포함한다.
일 양상에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 세포외 Toso 도메인, 신호 서열 및 Fc 도메인을 포함하고 - 이들 성분의 각각은 이들 성분의 임의의 상기 기재된 버전을 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 도 1에 도시된 서열 번호 5에 따른 서열을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 5와 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 동일성의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함한다.
추가의 실시형태에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 세포외 도메인 성분, 신호 서열 및 Fc 도메인을 포함하는 서열 번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24 중 임의의 하나에 따른 서열을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 서열 번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24 중 임의의 하나와 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함한다.
추가의 양상에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 Toso 세포외 도메인 성분과 Fc 도메인 사이, Toso 세포외 도메인 성분과 신호 서열 사이, 또는 Toso 세포외 도메인 성분과 Fc 도메인 및 Toso 세포외 도메인 성분과 신호 서열 사이 둘 다의 링커를 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 이러한 링커는 아미노산 링커, 중합체 링커, 또는 2개의 아미노산 서열을 함께 연결하기에 효과적인 당해 분야에 공지된 임의의 다른 링커일 수 있다. 추가의 예시적인 실시형태에서, 링커는 아미노산 링커이다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 링커는 아미노산 서열: ISAMVRS(서열 번호 25)이다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 링커는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산 치환을 함유하는 서열 번호 25의 변이체이다.
추가의 실시형태에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명의 가용성 Toso 단백질의 변이체는, 서열 번호 5, 6, 또는 8-24를 포함하는, 본 명세서에 기재된 임의의 가용성 Toso 단백질의 아미노산 서열의 변형을 통해 이루어질 수 있다. 이러한 변형은 당해 분야에 공지된 임의의 기법, 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발 또는 PCR 기반 돌연변이유발을 이용하여 성취될 수 있다. 이러한 기법은, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1989](이들의 각각은 모든 목적을 위해 그리고 특히 단백질 변이체를 형성하는 것에 관련한 모든 교시내용을 위해 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
훨씬 추가의 실시형태에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 단량체 또는 다합체 형태로 있을 수 있고, 다합체의 각각의 단량체는 단일 세포외 도메인 서열을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 단량체의 다합체로 있다. 특정한 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 6개의 단량체의 다합체이다. 추가의 실시형태에서, 육합체 Toso 다합체는 육합체화 태그를 포함하는 단량체로부터 형성된다. 추가의 실시형태에서, 육합체화 태그는 문헌[Hirano et al., Blood (2006)](모든 목적을 위해 그리고 특히 육합체화 또는 다른 다합체화 태그와 관련한 모든 교시내용을 위해 본 명세서에서 참조로 포함됨)에 기재된 바대로 인간 IgA 알파 중쇄 불변 영역으로부터 21개의 아미노산 꼬리 조각을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 본 발명의 육합체화 꼬리는 도 1에 도시된 서열 번호 4에 따른 서열을 포함한다.
추가의 실시형태에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 단백질의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하도록 변형된다. 예시적인 실시형태에서, 가용성 Toso 단백질은 화학적으로 변형된다. 예를 들어, 가용성 Toso 단백질은 생체내 이의 안정성을 개선하고/하거나 이의 약동학적 프로필을 변경하도록 하나 이상의 중합체에 의해 변형될 수 있다. 이러한 중합체는 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호; 또는 제4,179,337호(모든 목적을 위해 그리고 특히 중합체에 단백질을 연결하는 것에 관련한 모든 교시내용을 위해 모든 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 방식으로, 제한 없이, 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리프로필렌 글라이콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함된 Toso 가용성 단백질의 변형은 임의의 서열에 따른 Toso 폴리펩타이드의 표적화된 아미노산 잔기 및 상기 기재된 가용성 Toso 단백질을 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함하고, 유도체화제는 선택된 부사슬 또는 Toso 폴리펩타이드의 N 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있다. 보통 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(다이아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데하이드, N-하이드록시숙신이미드 에스터, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스터, 동종이작용성 이미도에스터, 예컨대 다이숙신이미딜 에스터, 예컨대 3,3'-다이티오비스(숙신이미딜프로피오네이트), 이작용성 말레이미드, 예컨대 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)다이티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.
다른 변형은 각각 상응하는 글루타르닐 및 아스파르틸 잔기에 대한 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 탈아마이드화, 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 부사슬의 "-아미노기의 메틸화[T. E. Creighton, Proteins; Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N 말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C 말단 카복실기의 아마이드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함된 가용성 Toso 단백질의 또 다른 유형의 변형은 폴리펩타이드의 네이티브 글라이코실화 패턴을 변경하는 것을 포함한다. "네이티브 글라이코실화 패턴을 변경하는 것"은 네이티브 서열 Toso 폴리펩타이드에 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키는 것, 및/또는 네이티브 서열 Toso 폴리펩타이드에 존재하지 않는 하나 이상의 글라이코실화 부위를 부가하는 것을 의미하도록 본 명세서에서 목적에 의도된다.
Toso 가용성 단백질에 대한 글라이코실화 부위의 부가는 이의 아미노산 서열을 변경함으로써 연속하여 달성될 수 있다. 변경은 (O 연결된 글라이코실화 부위에 대한) 가용성 Toso 단백질인 네이티브 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 이에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다. 가용성 Toso 단백질 아미노산 서열은 임의로 특히 미리 선택된 염기에서 Toso 가용성 단백질를 암호화하는 DNA를 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변화를 통해 변경되어서, 원하는 아미노산으로 번역되는 코돈이 생성된다.
Toso 가용성 단백질 상의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또 다른 수단은 폴리펩타이드에 대한 글라이코사이드의 화학 또는 효소 커플링에 의한다. 이러한 방법은 당해 분야에, 예를 들어 1987년 9월 11일에 공개된 WO 제87/05330호 및 문헌[Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)](모든 목적을 위해 그리고 특히 단백질 상의 탄수화물 모이어티를 변경하는 것에 관련한 모든 교시내용을 위해 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
가용성 Toso 단백질에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 또는 글라이코실화에 대한 표적으로서 작용하는 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈의 돌연변이 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학 탈글라이코실화 기법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) 및 Edge, et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩타이드 상의 탄수화물 모이어티의 효소 절단은 문헌[Thotakura, et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)](모든 목적을 위해 그리고 특히 단백질 상의 탄수화물 모이어티를 변경하는 것에 관련한 모든 교시내용을 위해 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함됨)에 의해 기재된 바대로 다양한 엔도- 및 엑소-글라이코시다제의 사용에 의해 성취될 수 있다.
본 발명의 가용성 Toso 단백질은 또 다른, 비상동성 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열에 융합된 단백질을 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 또한 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 키메라 분자는, 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는, 태그 폴리펩타이드에 의한 가용성 Toso 폴리펩타이드의 융합을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 Toso 폴리펩타이드의 아미노 또는 카복실 말단에 위치한다. Toso 폴리펩타이드의 이러한 에피토프 태그화 형태의 존재는 태그 폴리펩타이드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공은 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또 다른 유형의 친화도 매트릭스를 사용하여 Toso 폴리펩타이드가 친화도 정제에 의해 용이하게 정제되게 한다. 대안적인 실시형태에서, 키메라 분자는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정한 영역에 의한 Toso 폴리펩타이드의 융합을 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태의 경우, 이러한 융합은 IgG 분자 또는 GST 융합의 Fc 영역에 있을 수 있다.
다양한 태그 폴리펩타이드 및 이의 각각의 항체는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예는 폴리-히스티딘(폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글라이신(폴리-his-gly) 태그; 플루 HA 태그 폴리펩타이드 및 이의 항체 12CA5[Field, et al., Mol. Cell Biol., 8:2159-2165 (1988)]; c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체[Evan, et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; 및 단순 포진 바이러스 당단백질 D(gD) 태그 및 이의 항체[Paborsky, et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]를 포함한다. 다른 태그 폴리펩타이드는 플래그-펩타이드[Hopp, et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; KT3 에피토프 펩타이드[Martin, et al., Science, 255:192-194 (1992)]; 튜불린 에피토프 펩타이드[Skinner, et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; 및 T7 유전자 10 단백질 펩타이드 태그[Lutz-Freyermuth, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87;6393-6397 (1990)]를 포함한다.
추가의 실시형태에서 및 임의의 상기에 따라, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 세포 침투 펩타이드와 융합된다.
추가의 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 가용성 Toso 단백질을 암호화하는 핵산, 및 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용된 숙주 세포는, 제한 없이, HEK293F, HEK298T, Cos7, HeLa 및 CHO-DHFR 결핍 세포를 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 본 발명의 가용성 Toso 단백질은 혈청 비함유 현탁액에서 성장하도록 변형된 세포주에서 안정하게 발현된다.
추가의 양상에서, 본 발명의 조성물은 첨가제 및 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 본 명세서에 기재된 임의의 가용성 Toso 단백질을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바대로, "약제학적으로 허용되는 담체"는 접합체와 배합될 때 접합체의 활성을 보유하고 대상체의 면역계와 비반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예는 임의의 표준 약제학적 담체, 예컨대 포스페이트 완충 식염수 용액, 물, 에멀션, 예컨대 오일/물 에멀션, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 담체는 무균 용액, 코팅 정제를 포함하는 정제 및 캡슐을 또한 포함할 수 있다. 통상적으로 이러한 담체는 부형제, 예컨대 전분, 젖, 당, 소정의 유형의 점토, 젤라틴, 스테아르산 또는 이의 염, 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산칼슘, 탈크, 식물성 지방 또는 오일, 검, 글라이콜, 또는 다른 공지된 부형제를 함유한다. 이러한 담체는 향 및 색 첨가제 또는 다른 성분을 또한 포함할 수 있다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 종래의 널리 공지된 방법에 의해 제제화된다.
일 양상에서, 본 발명은 Toso 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, Toso 활성을 조절하는 방법은 Toso 활성을 저해하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, Toso 활성을 저해하는 방법은 Toso 활성을 증가시키는 것을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 Toso 활성을 직접적으로 조절하는 것을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 이러한 방법은 Toso에 결합하는 물질, 예컨대 항체를 적용하는 것을 포함한다.
다른 실시형태에서, Toso 활성은 간접적으로, 예를 들어 Toso의 동족 리간드를 결합시킴으로써 조절된다. 예시적인 실시형태에서, Toso 활성은 가용성 Toso 단백질을 투여함으로써 조절된다.
추가의 실시형태에서, Toso 활성은 기전의 조합에 의해, 예를 들어 Toso의 동족 리간드에 결합하는 물질을 포함하는 조성물과 조합하여 Toso에 결합하는 물질을 포함하는 조성물을 투여함으로써 조절된다. 예시적인 실시형태에서, 이러한 조합은, 제한 없이, Toso 항체 및 가용성 Toso 단백질을 포함할 수 있다.
이해되는 것처럼, Toso 활성을 조절하는 방법은 서열 번호 1-25 중 임의의 하나 이상, 및 본 명세서에 기재된 임의의 이의 변이체 또는 변형을 포함하는, 임의의 조합의, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물의 용도를 포함할 수 있다.
IID. 병용 치료제
임의의 상기에 따라, 본 발명의 방법은 면역계 경로의 성분을 조절하는 분자의 조합에 의해 치료를 필요로 하는 대상체를 치료함으로써 암 또는 자가면역 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 일반적으로, 이 병용 치료제는 면역계 경로의 하나 이상의 다른 조절제와 함께 가용성 Toso 단백질를 투여하는 것을 포함한다. 가용성 Toso 단백질은 면역계 경로의 하나 이상의 다른 조절제의 투여 전에, 이와 동시에 또는 이에 후속하여 투여될 수 있다. 소정의 양상에서, 면역계 경로의 하나 이상의 다른 조절제는, 제한 없이, IgM, B7H3, PAMP, DAMP, 스크램블라제 및 면역 관문 저해제를 포함한다.
추가의 양상에서, 병용 치료제는 하나 이상의 면역 관문 저해제와 함께 가용성 Toso 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 병용 치료제는 PD-1의 저해제, CTLA-4의 저해제, 또는 PD-1 및 CTLA-4 둘 다의 저해제와 Toso 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 병용 치료제는 항-PD-1 항체 또는 항-CTLA-4 항체와 Toso 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 병용 치료제는 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체 둘 다와 함께 Toso 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 병용 치료제를 서열 번호 1-25 중 임의의 하나를 포함하는 Toso 단백질을 하나 이상의 면역 관문 저해제와 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태가 본 명세서에 도시되어 있고 기재되어 있지만, 이러한 실시형태가 오직 예로서 제공된다는 것이 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다. 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형, 변화 및 치환이 당해 분야의 당업자에게 이제 일어날 것이다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실행하는 데 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 하기 청구항이 본 발명의 범위를 정의하고, 이 청구항의 범위 내의 방법 및 구조 및 이의 균등물이 이에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
실시예 1: 가용성 Toso 단백질에 의한 B 세포 증식의 저해
도 3은 B 세포 증식의 검정의 결과를 나타낸다. 표적 세포는 정제된 야생형 B 세포이다. 자극은 항-마우스 IgM에 의한 BCR 가교결합 또는 LPS에 의한 TLR 자극이다. 검정은 증식이 인간 또는 마우스 가용성 Toso 단백질에 의해 변형되는지를 결정하는 것이다. 도 3에 도시된 바대로, hToso-Fc 및 mToso-Fc 둘 다는 배양물에서의 마우스 B 세포의 증식을 저해한다. Fc 단백질 단독(대조군)은 증식에 영향을 미치지 않는다.
도 4는 전장 hToso의 저해 활성이 WT(야생형) 및 Toso KO(넉아웃) B 세포에서 동등하고, 따라서 내인성 mToso와의 sToso-Fc의 상호작용이 항-증식성 효과에 필요하지 않다는 것을 나타낸다. 전장 Toso로부터의 추정상 Ig 도메인의 제거는 이 모델에서 저해 활성을 무효화하여서, Ig 도메인이 이 모델에서 Toso의 이 특이적 활성에 중요하다는 것을 제안한다.
도 5는 Ig 도메인을 함유하는 가용성 hToso의 절두된 형태가 마우스 B 세포 증식을 변하는 정도로 저해한다는 것을 보여준다. 이 검정에서, 전장 hToso는 더 높은 효과를 나타냈다.
실시예 2: IgM 결합 검정
도 6은 IgM 결합 검정의 결과를 보여준다. 검정을 위해, 가용성 TOSO 단백질을 96웰 플레이트(Nunc Maxisorb)에 부동화하였다. 세척 및 차단 후, 마우스 IgM을 플레이트에서 항온처리하였다. 세척 후, 결합된 IgM을 항-마우스 IgM-HRP와의 항온처리에 의해 검출한 후, 세척하고 HRP 기질을 첨가하였다. 도 6에 도시된 바대로, 부동화 전장 hToso는 용량 의존적 방식으로 마우스 IgM에 결합한다.
도 7은 IgM에 결합하는 돌연변이체 hTOSO을 보여준다: hTOSO의 절두된/결실 돌연변이체는 상기 기재된 바대로 불활화되고 IgM 결합이 평가되었다. 돌연변이체 형태 M1, M3, M4 및 M7(M7은 마이너스 Ig 도메인임)은 IgM에 결합하지 않지만, 돌연변이체 M2(1-104)는 IgM에 더 강하게 결합하는 것으로 보인다.
실시예 3: CLL 세포 증식의 Toso 저해
도 8은 4개의 독립적인 환자 샘플로부터의 실험실내 CLL 활성화의 연구의 결과를 보여준다. 이 검정은 CLL 림프성 장기에서 발견되는 증식 중심의 실험실내 모델을 제공한다. 말초 혈액 CD19+ 세포를 CLL 환자로부터 정제하고, 혈청 비함유 시스템에서 레시퀴모드(R-848, TLR7/8 효현제) + IL-2에 의해 실험실내 활성화하였다. 이 세포를 "2S"라 칭한다. 증식에 대한 가용성 hTOSO 및 외인성 인간 IgM의 효과를 평가하였다. hTOSO, 및 더 약한 정도로 hIgM은, 3H Thy 혼입에 의해 예상된 것처럼, CLL 성장에 저해 효과를 가지는 것으로 보인다.
실시예 4: 가용성 Toso 단백질에 의한 치료는 종양생성을 약화시키고 생존을 증대시킨다
C57Bl/6 마우스를 잭슨 레버러토리즈(Jackson Laboratory)로부터 얻었다. B16F10 쥣과 흑색종 세포주를 10% FBS, 2mM L-글루타민, 및 항생제(50U/㎖ 페니실린 및 50㎍/㎖ 스트렙토마이신)가 보충된 이스코브(Iscove) 변형된 둘베코 배지에서 성장시켰다.
8 내지 14주령의 마우스(n = 5 내지 10)에 2 x 105개의 B16F10 흑색종 세포를 피하로 접종하였다. 완전 주사를 받지 않거나, 주사가 누수 없이 보이는 피하 물집을 생성시키지 않는 마우스를 실험에서 사용하지 않고 즉시 희생시켰다. 종양 측정을 디지털 캘리퍼스를 사용하여 격일마다 취했다.
C57Bl/6 마우스를 Toso-Fc 단독에 의해 치료하였다. B16F10 흑색종의 치료의 경우, 마우스는 B16F10 접종 후 10일에 시작하여 격일마다 50㎍의 Toso-Fc, 또는 대조군 Fc 단백질, 또는 PBS(비히클 대조군)의 복강내 주사(i.p.)를 받았다.
도 9는 가용성 Toso 단백질에 의한 마우스의 치료가 종양 면적이 상당한 감소하는 종양생성의 약화를 생성시킨다는 것을 보여준다. n = 10 Fc, 10 PBS, 및 15 Toso-Fc.
도 10은 Toso-Fc 치료된 마우스가 또한 연장된 생존을 나타낸다는 것을 보여준다.
실시예 5: 가용성 Toso 단백질에 의한 치료는 종양 침윤 림프구를 증가시킨다
도 11은 Toso-Fc 치료가 종양 침윤 림프구를 함유하는 종양의 백분율을 증가시킨다는 보여준다. 마우스를 상기 기재된 바대로 B16F10에 의해 접종하였다. B16F10 흑색종 접종 15일 후 마우스를 희생시키고, 종양 침윤 림프구(tumor infilitrating lymphocyte: TIL) 분석을 수행하였다. 피하 흑색종 종양을 수술로 제거하고 무게를 쟀다. 이후, 종양을 메스에 의해 1㎣ 조각으로 절단하고 분해 배지(10% FBS, 2mM L-글루타민, 항생제[50U/㎖ 페니실린 및 50㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 RPMI], 1㎎/㎖ 콜라게나제 IV, 및 20㎍/㎖ DNase I)에 위치시켰다. 분해 배지에서의 종양 샘플을 후속하여 37℃에서 30분 항온처리 동안 10분마다 와류시켰다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해, 종양을 이후 70㎛ 나일론 필터를 통해 통과시키고, 1% FBS가 보충된 RPMI에 의해 3회 세척하였다. 전체 종양 단일 세포 현탁액을 계수하고, 6x106개의 세포를 T 세포 마커(CD3, CD8, CD4)에 대한 MAb에 의해 염색하고, 유세포분석법에 의해 분석하였다.
실시예 6: 가용성 Toso 단백질 및 면역 관문 저해제에 의한 병용 치료제는 종양생성 약화 및 생존에 대해 증가한 효과를 나타낸다
C57Bl/6 마우스를 잭슨 레버러토리즈로부터 얻었다. B16F10 쥣과 흑색종 세포주를 10% FBS, 2mM L-글루타민, 및 항생제(50U/㎖ 페니실린 및 50㎍/㎖ 스트렙토마이신)가 보충된 이스코브 변형된 둘베코 배지에서 성장시켰다.
8 내지 14주령의 마우스(n = 5 내지 10)에 2 x 105개의 B16F10 흑색종 세포를 피하로 접종하였다. 완전 주사를 받지 않거나, 주사가 누수 없이 보이는 피하 물집을 생성시키지 않는 마우스를 실험에서 사용하지 않고 즉시 희생시켰다. 종양 측정을 디지털 캘리퍼스를 사용하여 격일마다 취했다.
C57Bl/6 마우스를 단독으로 또는 면역 관문 봉쇄 항체와 조합되어 Toso-Fc에 의해 치료하였다. B16F10 흑색종의 치료를 위해, 마우스는 B16F10 접종 후 10일에 시작하여 격일마다 50㎍의 Toso-Fc, 또는 대조군 Fc 단백질, 또는 PBS(비히클 대조군)의 복강내 주사(i.p.)를 받았다. 면역 관문 봉쇄 항체 αCTLA-4(9D9) 및 αPD-1(RPM1-14)을 Toso-Fc 치료와 조합하여 사용하였다. αCTLA-4(100㎍) 및 αPD-1(250㎍) 항체를 10일에 시작하여 또한 i.p. 투여하였다. 관문 봉쇄 항체의 3개의 치료가 제공되고, 치료를 3일마다(10일, 13일 및 16일) 투여하였다.
도 12는 Toso-Fc 및 항-PD-1 항체와의 병용 치료가 PD-1 항체 또는 Toso-Fc 단독보다 더 높은 정도로 종양생성을 약화시킨다는 것을 보여준다. 도 13은 이 병용 치료제가 개별 성분 단독의 적용에 비해 생존을 또한 증대시킨다는 것을 보여준다.
Toso-Fc 및 항-CTLA-4 항체의 조합이 생존을 증가시키는 것으로 보이지 않지만(도 14), 항-PD-1 및 항-CTLA-4과의 Toso-Fc의 3중 치료는 Toso 단독에 의한 치료 또는 오직 면역 관문 저해제(항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체)를 포함하는 이중 치료에 비해 종양생성(도 15)을 약화시키고 생존을 증대시켰다(도 16).
본 명세서는 현재 기재된 기술의 예 양상에서 방법론, 시스템 및/또는 구조 및 이의 용도의 완전한 설명을 제공한다. 소정의 정도의 특정사항으로, 또는 하나 이상의 개별 양상을 참조하여 이 기술의 다양한 양상이 상기 기재되어 있지만, 당해 분야의 당업자는 이의 기술의 정신 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 개시된 양상에 다양한 변경을 만들 수 있다. 많은 양상이 현재 기재된 기술의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있으므로, 적절한 범위는 이하 첨부된 본 명세서의 청구항에 있다. 다른 양상이 따라서 고려된다. 더구나, 임의의 조작이 달리 명확히 청구되지 않은 한 임의의 순서로 수행할 수 있거나, 특정한 순서가 본질적으로 청구 언어에 의해 필요하게 되는 것으로 이해되어야 한다. 상기 명세서에 함유되고 첨부 도면에 도시된 모든 대상이 오직 특정한 양상을 예시하는 것으로 해석되어야 하고, 기재된 실시형태에 제한이 아닌 것으로 의도된다. 상황으로부터 달리 명확하지 않거나 확실히 언급되지 않은 한, 본 명세서에 제공된 임의의 농도 값은 일반적으로 혼합물의 특정한 성분의 첨가 시 또는 첨가 후 생기는 임의의 전환과 관련 없이 혼합물 값 또는 백분율의 면으로 제공된다. 본 명세서에 이미 명확히 포함되지 않은 정도로, 본 명세서에 언급된 모든 공개 문헌 및 특허 문헌은 모든 목적을 위해 본 명세서에서 참조로 그 전문이 포함된다. 청구항에 정의된 바와 같은 본 기술의 기본적인 요소로부터 벗어나지 않으면서 세부사항 또는 구조의 변경이 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> University Health Network Mak, Tak W. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING THE IMMUNE RESPONSE <130> 011506-5005-WO <140> US 14/640,318 <141> 2015-03-06 <150> US 61/949,927 <151> 2014-03-07 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> soluble Toso protein <400> 1 Ile Ser Ala Met Val Arg Ser Arg Ile Leu Pro Glu Val Lys Val Glu 1 5 10 15 Gly Glu Leu Gly Gly Ser Val Thr Ile Lys Cys Pro Leu Pro Glu Met 20 25 30 His Val Arg Ile Tyr Leu Cys Arg Glu Met Ala Gly Ser Gly Thr Cys 35 40 45 Gly Thr Val Val Ser Thr Thr Asn Phe Ile Lys Ala Glu Tyr Lys Gly 50 55 60 Arg Val Thr Leu Lys Gln Tyr Pro Arg Lys Asn Leu Phe Leu Val Glu 65 70 75 80 Val Thr Gln Leu Thr Glu Ser Asp Ser Gly Val Tyr Ala Cys Gly Ala 85 90 95 Gly Met Asn Thr Asp Arg Gly Lys Thr Gln Lys Val Thr Leu Asn Val 100 105 110 His Ser Glu Tyr Glu Pro Ser Trp Glu Glu Gln Pro Met Pro Glu Thr 115 120 125 Pro Lys Trp Phe His Leu Pro Tyr Leu Phe Gln Met Pro 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Artificial Sequence <220> <223> soluble Toso protein <400> 21 Arg Ile Leu Pro Glu Val Lys Val Glu Gly Glu Leu Gly Gly Ser Val 1 5 10 15 Thr Ile Lys Cys Pro Leu Pro Glu Met His Val Arg Ile Tyr Leu Cys 20 25 30 Arg Glu Met Ala Gly Ser Gly Thr Cys Gly Thr Val Val Ser Thr Thr 35 40 45 Asn Phe Ile Lys Ala Glu Tyr Lys Gly Arg Val Thr Leu Lys Gln Tyr 50 55 60 Pro Arg Lys Asn Leu Phe Leu Val Glu Val Thr Gln Leu Thr Glu Ser 65 70 75 80 Asp Ser Gly Val Tyr Ala Cys Gly Ala Gly Met Asn Thr Asp Arg Gly 85 90 95 Lys Thr Gln Lys Val Ile Leu Asn Val His 100 105 <210> 22 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> soluble Toso protein <400> 22 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ile Ser Ala Met Val Arg Ser Arg Ile Leu Pro Glu 20 25 30 Val Lys Val Glu Gly Glu Leu Gly Gly Ser Val Thr Ile Lys Cys Pro 35 40 45 Leu Pro Glu Met His Val Arg Ile Tyr Leu Cys Arg Glu Met Ala Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Cys Gly Thr Val Val Ser Thr Thr Asn Phe Ile 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275 280 285 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 290 295 300 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 305 310 315 320 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 325 330 335 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 340 345 350 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 23 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> soluble Toso protein <400> 23 Arg Ile Leu Pro Glu Val Lys Val Glu Gly Glu Leu Gly Gly Ser Val 1 5 10 15 Thr Ile Lys Cys Pro Leu Pro Glu Met His Val Arg Ile Tyr Leu Cys 20 25 30 Arg Glu Met Ala Gly Ser Gly Thr Cys Gly Thr Val Val Ser Thr Thr 35 40 45 Asn Phe Ile Lys Ala Glu Tyr Lys Gly Arg Val Thr Leu Lys Gln Thr 50 55 60 Pro Arg Lys Asn Leu Phe Leu Val Glu Val Thr Gln Leu Thr Glu Ser 65 70 75 80 Asp Ser Gly Val Tyr Ala Cys Gly Ala Gly Met Asn Thr Asp 85 90 <210> 24 <211> 346 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> soluble Toso protein <400> 24 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ile Ser Ala Met Val Arg Ser Arg Ile Leu Pro Glu 20 25 30 Val Lys Val Glu Gly Glu Leu Gly Gly Ser Val Ile Ile Lys Cys Pro 35 40 45 Leu Pro Glu Met His Val Arg Ile Tyr Leu Cys Arg Glu Met Ala Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Cys Gly Thr Val Val Ser Thr Thr Asn Phe Ile Lys Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Lys Gly Arg Val Thr Leu Lys Gln Tyr Pro Arg Lys Asn Leu 85 90 95 Phe Leu Val Glu Val Thr Gln Leu Thr Glu Ser Asp Ser Gly Val Tyr 100 105 110 Ala Cys Gly Ala Gly Met Asn Thr Asp Arg Ser Val Glu Cys Pro Pro 115 120 125 Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 130 135 140 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 145 150 155 160 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 165 170 175 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 180 185 190 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 195 200 205 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 210 215 220 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 225 230 235 240 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 245 250 255 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 260 265 270 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 275 280 285 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 290 295 300 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 305 310 315 320 Val Pro Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 325 330 335 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> soluble Toso protein <400> 25 Ile Ser Ala Met Val Arg Ser 1 5 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligomer <400> 26 gtgaatacgt gagcttgggc tacc 24 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligomer <400> 27 caagtgatgg gggattacag tgaa 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tgtttaatat gatgtgtcag gctg 24 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 agggccagct cattcctccc actcat 26 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 aactctgccc ctgctccttc atttcc 26

Claims (18)

  1. 암을 치료하는 방법으로서, 약제학적 유효량의 (ⅰ) 적어도 하나의 면역 관문 저해제(immune checkpoint inhibitor) 및 (ⅱ) Toso 활성의 저해제의 조합을 상기 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 면역 관문 저해제는 PD-1 저해제, CTLA-4 저해제, LAG3 저해제 및 TIM3 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원인, 암을 치료하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Toso 활성의 저해제는 가용성 Toso 단백질인, 암을 치료하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Toso 활성의 저해제는 Toso에 대한 항체인, 암을 치료하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조합은 PD-1 저해제, CTLA-4 저해제 및 가용성 Toso 단백질을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 PD-1 저해제는 항-PD-1 항체이고, 상기 CTLA-4 저해제는 항-CTLA-4 항체인, 암을 치료하는 방법.
  7. 종양에서 침윤 림프구의 수준을 증가시키는 방법으로서, 가용성 Toso 단백질에 의해 상기 종양을 치료하는 단계를 포함하되, 상기 치료로부터 생긴 상기 침윤 림프구의 수준은 상기 치료가 없는 수준보다 큰, 종양에서 침윤 림프구의 수준을 증가시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 침윤 림프구는 CD3+ 세포, CD8+ 세포 또는 CD3+ 세포와 CD8+ 세포의 조합을 포함하는, 종양에서 침윤 림프구의 수준을 증가시키는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, PD-1 저해제, CTLA-4 저해제 및 PDL-1 저해제로부터 선택된 하나 이상의 구성원에 의해 상기 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 종양에서 침윤 림프구의 수준을 증가시키는 방법.
  10. Toso의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계를 포함하는, 면역 반응을 감소시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, IgM의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 추가로 포함하는, 면역 반응을 감소시키는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, PAMP 및/또는 DAMP의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계를 추가로 포함하는, 면역 반응을 감소시키는 방법.
  13. 하기 단계들 중 하나 이상을 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는 방법:
    (a) Toso의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계;
    (b) IgM의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계; 및
    (c) PAMP 및/또는 DAMP의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계.
  14. Toso의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 포함하는, 면역 반응을 유도하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, IgM의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계를 추가로 포함하는, 면역 반응을 유도하는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, PAMP 및/또는 DAMP의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 추가로 포함하는, 면역 반응을 유도하는 방법.
  17. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 스크램블라제 단백질(scramblase protein)의 활성을 조절하는 단계를 추가로 포함하는, 면역 반응을 유도하는 방법.
  18. 하기 단계들 중 하나 이상을 포함하는 암을 치료하는 방법:
    (a) Toso의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계;
    (b) IgM의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계;
    (c) PAMP 및/또는 DAMP의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계;
    (d) 스크램블라제 단백질의 활성을 조절하는 단계.
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