CN111228509A - 双特异性抗-半抗原/抗-血脑屏障受体的抗体、其复合物及其作为血脑屏障穿梭物的应用 - Google Patents

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Abstract

本文报道了一种双特异性抗体，其包含特异性结合半抗原化有效负载物的第一结合特异性和特异性结合血脑屏障受体的第二结合特异性。

Description

双特异性抗-半抗原/抗-血脑屏障受体的抗体、其复合物及其 作为血脑屏障穿梭物的应用
本申请是申请日为2014年12月19日、发明名称为“双特异性抗- 半抗原/抗-血脑屏障受体的抗体、其复合物及它们作为血脑屏障穿梭物的 应用”的中国专利申请No.201480070147.6的分案申请。
本文报道了双特异性抗-半抗原/抗-血脑屏障受体的抗体、其与半抗原 化的有效负载物(haptenylated payloads)的非共价的以及共价的复合物和 所述抗体及它们的复合物作为血脑屏障穿梭物(blood brain barrier shuttles)的应用。
发明背景
多肽治疗应用的主要瓶颈在于其有限的溶解性、体内稳定性、短的血 清半衰期和从血流中的快速清除。
报道了解决这一问题的不同方法。一种改善治疗性多肽的PK/稳定性 和生物物理行为的方法是将其融合到使所述多肽稳定的实体上，将其保持 在溶液中并且延长其半衰期。此类实体的实例是人血清白蛋白或人免疫球 蛋白Fc-区。另一种改善治疗性多肽的PK/稳定性和生物物理行为的方法 是例如通过PEG化或HES化而化学或酶学缀合到聚合物上。
US 5,804,371报道了半抗原-标记的肽及其在免疫学检测方法中的应 用。Decarie A.等(Peptides 15(1994)511-518)报道了洋地黄毒苷-标记的肽 (缓激肽)及其在发炎组织中缓激肽的化学发光酶免疫测定中的应用。
WO 2004/065569中报道了多功能性抗体。
WO 2011/003780中报道了双特异性洋地黄毒苷结合抗体。
WO 2012/093068中报道了抗-DIG抗体与缀合到肽上的洋地黄毒苷的 复合物的药物组合物。
WO 2014/006124中报道了抗-半抗原抗体和半抗原化的有效负载物(haptenylated payload)的共价复合物。
单克隆抗体具有巨大的治疗神经学或中枢神经系统(CNS)疾病的治 疗潜力，但是其进入脑受到血脑屏障(BBB)的限制。之前的研究已经表明， 在血流中循环的IgG有非常少的百分数量(约0.1％)穿过BBB进入CNS (Felgenhauer，K.，Klin.Wschr.52(1974)1158-1164)，在其中抗体的CNS 浓度可能不足以允许强健的作用。
WO 2014/033074中已经报道，通过将与血脑屏障受体(BBBR)特异性 结合的抗体或抗体片段的结合模式限定为单价的，可以获得具有BBB胞 转特性的BBB-穿梭模块。
WO 2012/075037中已经报道，通过使用以中等亲和力特异性结合 BBBR的抗体或抗体片段，可以获得具有BBB胞转特性的BBB-穿梭模块。
WO 2012/143379中已经报道，通过使用具有在不同pH值确定的特 定EC50值比例的抗体或抗体片段，可以获得具有BBB胞转特性的BBB- 穿梭模块。
Pardridge，W.M.报道了用分子特洛伊木马(Trojan horses)进行的递送 至脑的生物药剂的再造(Bioconjug.Chem.19(2008)1327-1338)。Feng Ji-Ming等报道了受体介导的药物穿过BBB的运输(Neurometh.45(2010) 15-34)。Zhou，Q-H.等报道了用IgG-抗生物素蛋白融合蛋白将肽放射性药 物递送至脑(Bioconjug.Chem.22(2011)1611-1618)。Manich，G.等报道了 具有Fab'货物的抗-转铁蛋白受体抗体在小鼠血脑屏障中的胞转作用的研 究(Eur.J.Pharm.Sci.49(2013)556-564)。
发明概述
本发明报道了一种血脑屏障-穿梭模块(BBB-穿梭模块)，其是一种 具有针对半抗原的第一结合特异性和针对血脑屏障受体(BBBR)的第二结 合特异性的双特异性抗体。所述BBB-穿梭模块识别血脑屏障上可胞转的 细胞表面靶标(诸如TfR、LRPs或其他靶标，BBBR)，并且同时结合半 抗原化的有效负载物。
已经发现，不必须满足关于结合价态、抗体形式、BBBR结合亲和力 的其他要求。
还已经发现，不要求本文报道的基于双特异性抗体的穿梭模块从血脑 屏障的内皮细胞释放来调节半抗原化的有效负载物的胞转作用。相反，在 与BBBR结合时与基于双特异性抗体的穿梭模块复合/结合的半抗原化的 有效负载物在BBB细胞内从所述基于双特异性抗体的穿梭模块释放，即， 在细胞内囊状系统中，与所述穿梭模块分开，随后从BBB细胞胞吐进入 脑，将所述双特异性抗体留在BBB细胞中。当使用共价复合物时，这也 是适用的。
本文报道的基于双特异性抗体的穿梭模块在结合特异性价态和 BBBR结合特异性的亲和性方面是非常多变的。同时，其能够允许从穿梭 模块释放有效负载物。
本文报道的一方面是双特异性抗体，其包含特异性结合半抗原化的有 效负载物的第一结合特异性和特异性结合血脑屏障受体的第二结合特异 性。
本文报道的一方面是包含双特异性抗体的非共价复合物和半抗原化 的有效负载物，所述双特异性抗体具有特异性结合半抗原化的有效负载物 的第一结合特异性和特异性结合血脑屏障受体的第二结合特异性，其中所 述半抗原化的有效负载物被所述第一结合特异性特异性结合。
本文报道的一方面是共价缀合物，其包含：i)双特异性抗体，其具 有特异性结合半抗原化的有效负载物的第一结合特异性和特异性结合血 脑屏障受体的第二结合特异性，和ii)半抗原化的有效负载物，其中所述 半抗原化的有效负载物被所述第一结合特异性特异性结合，并且其具有在 所述半抗原化的有效负载物与特异性结合半抗原化的有效负载物的第一 结合特异性之间的共价键。
在一个实施方案中，所述半抗原化的有效负载物选自包括下述的组： 生物素化的有效负载物(biotinylated payloads)，茶碱化的有效负载物 (theophyllinylatedpayloads)，洋地黄毒苷化的有效负载物(digoxigenylated payloads)，碳硼烷化的有效负载物(carboranylated payloads)，荧光素化的 有效负载物(fluoresceinylatedpayloads)，helicarylated有效负载物 (helicarylated payloads)和溴脱氧尿苷化的有效负载物 (bromodeoxyuridinylated payloads)。
本文报道的一方面是共价缀合物，其包含：
i)双特异性抗体，其具有特异性结合半抗原化的有效负载物的第一 结合特异性和特异性结合血脑屏障受体的第二结合特异性，和
ii)半抗原化的有效负载物，
其中所述半抗原化的有效负载物被所述第一结合特异性特异性结合，
其中所述共价缀合物在所述半抗原化的有效负载物与特异性结合半 抗原化的有效负载物的第一结合特异性之间具有共价键，和
其中所述半抗原化的有效负载物选自由下述组成的组：生物素化的有 效负载物，茶碱化的有效负载物，洋地黄毒苷化的有效负载物，碳硼烷化 的有效负载物，荧光素化的有效负载物，helicarylated有效负载物和溴脱 氧尿苷化的有效负载物。
在所有方面的一个实施方案中，共价缀合物是非持久性的共价缀合 物。在一个实施方案中，所述共价缀合物是细胞内可裂解的共价缀合物。
在一个实施方案中，血脑屏障受体选自由下述组成的组：转铁蛋白受 体(TfR)，胰岛素受体，胰岛素样生长因子受体(IGF受体)，低密度脂蛋 白受体相关蛋白8(LRP8)，低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)和肝素- 结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体没有效应子功能。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含：
a)一个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和一个针对血脑屏障 受体的结合位点，或
b)两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和一个针对血脑屏障 受体的结合位点，或
c)一个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对血脑屏障 受体的结合位点，或
d)两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对血脑屏障 受体的结合位点。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体在抗体CDR2中的氨基酸残基 处包含半胱氨酸残基，其中所述CDR2按照Kabat确定。
在一个实施方案中，共价键位于抗体CDR2中的半胱氨酸残基与半抗 原化的有效负载物中的巯基之间。
本文报道的一方面是共价缀合物，其包含：
i)双特异性抗体，其具有特异性结合半抗原化的有效负载物的第一 结合特异性和特异性结合转铁蛋白受体的第二结合特异性，和
ii)半抗原化的有效负载物，
其中所述半抗原化的有效负载物被所述第一结合特异性特异性结合，
其中所述共价缀合物具有在半抗原化的有效负载物与第一结合特异 性的重链CDR2中位置52b或53处的半胱氨酸残基之间的二硫键，其中 所述编号按照Kabat进行，
其中所述半抗原化的有效负载物选自由下述组成的组：生物素化的有 效负载物，茶碱化的有效负载物，洋地黄毒苷化的有效负载物，碳硼烷化 的有效负载物，荧光素化的有效负载物，helicarylated有效负载物和溴脱 氧尿苷化的有效负载物，和
其中所述双特异性抗体包含：
a)一个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和一个针对转铁蛋白 受体的结合位点，或
b)两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和一个针对转铁蛋白 受体的结合位点，或
c)一个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对转铁蛋白 受体的结合位点，或
d)两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对转铁蛋白 受体的结合位点。
在一个实施方案中，半抗原是核苷酸或核苷的衍生物或类似物。在一 个实施方案中，半抗原是氨基酸的衍生物或类似物。
在一个实施方案中，血脑屏障受体选自由下述组成的组：转铁蛋白受 体(TfR)，胰岛素受体，胰岛素样生长因子受体(IGF受体)，低密度脂蛋 白受体相关蛋白8(LRP8)，低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)和肝素- 结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体是包含两个结合位点的全长抗 体。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体是已经融合了一个或两个scFvs或scFabs并且包含三个或四个结合位点的全长抗体。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体是抗体片段。在一个实施方案 中，所述抗体片段选自F(ab’)2和双抗体。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体是人源化的或人抗体。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体没有效应子功能。在一个实施 方案中，所述双特异性抗体不具有功能性Fc-区。在一个实施方案中，所 述双特异性抗体没有Fc-区。在一个实施方案中，所述双特异性抗体具有 包含突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的Fc-区，其中所述位 置按照Kabat的Fc-区编号确定(Kabat EU索引)。在一个实施方案中，所 述双特异性抗体具有包含突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类的 Fc-区，其中所述位置按照Kabat的Fc-区编号确定(Kabat EU索引)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含：
a)一个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和一个针对血脑屏障 受体的结合位点，或
b)两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和一个针对血脑屏障 受体的结合位点，或
c)一个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对血脑屏障 受体的结合位点，或
d)两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对血脑屏障 受体的结合位点。
在前述实施方案的b)和c)情形中，双特异性抗体的一条重链包含孔 洞突变，而相应的另一条链包含凸起突变。
在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含两个针对半抗原化 的有效负载物的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点。
在一个实施方案中，所述半抗原化的有效负载物在半抗原与有效负载 物之间包含接头。在一个实施方案中，所述接头是肽接头。在一个实施方 案中，所述接头是化学接头(非肽接头)。
已经发现，通过将半抗原化的有效负载物与抗-半抗原抗体共价偶联， 可以实现有效负载物的稳定和PK-特性改善。
本文报道的一方面是共价缀合物用于靶向递送半抗原化的有效负载 物穿过血脑屏障的应用，所述共价缀合物包含：
i)双特异性抗体，其具有特异性结合半抗原化的有效负载物的第一 结合特异性和特异性结合血脑屏障受体的第二结合特异性，和
ii)半抗原化的有效负载物，
其中所述半抗原化的有效负载物被所述第一结合特异性特异性结合，
其中所述共价缀合物具有在半抗原化的有效负载物与特异性结合半 抗原化的有效负载物的第一结合特异性之间的共价键，和
其中所述半抗原化的有效负载物选自由下述组成的组：生物素化的有 效负载物，茶碱化的有效负载物，洋地黄毒苷化的有效负载物，碳硼烷化 的有效负载物，荧光素化的有效负载物，helicarylated有效负载物和溴脱 氧尿苷化的有效负载物。
在一个实施方案中，所述应用是用于将游离的(即，分离的)半抗原 化的有效负载物靶向递送穿过血脑屏障。
在一个实施方案中，所述血脑屏障受体选自由下述组成的组：转铁蛋 白受体(TfR)，胰岛素受体，胰岛素样生长因子受体(IGF受体)，低密度 脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)，低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)和肝 素-结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。
在一个实施方案中，所述血脑屏障受体是转铁蛋白受体或低密度脂蛋 白受体相关蛋白8。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体没有效应子功能。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含：
a)一个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和一个针对血脑屏障 受体的结合位点，或
b)两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和一个针对血脑屏障 受体的结合位点，或
c)一个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对血脑屏障 受体的结合位点，或
d)两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对血脑屏障 受体的结合位点。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含在抗体CDR2中氨基酸残 基处的半胱氨酸残基，其中所述CDR2按照Kabat确定。
在一个实施方案中，共价键位于抗体CDR2中的半胱氨酸残基与半抗 原化的有效负载物中的巯基之间。
在所有方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体和所述半抗原化的 有效负载物分别包含官能团，由此当所述双特异性抗体结合所述半抗原化 的有效负载物时，在所述半抗原化的有效负载物与所述双特异性抗体之间 形成共价键。
在所有方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含在所述抗体 CDR2中氨基酸残基处的官能团，其中所述CDR2按照Kabat确定。在一 个实施方案中，所述在抗体CDR2中氨基酸残基处的官能团是巯基。在 一个实施方案中，所述双特异性抗体在所述抗体的CDR2中包含半胱氨 酸氨基酸残基。
在所有方面的一个实施方案中，所述半抗原化的有效负载物在半抗原 中包含官能团，或者如果存在，在半抗原与有效负载物之间的接头中包含 官能团。在一个实施方案中，所述官能团是巯基或马来酰亚胺或卤代乙酰 基。在一个实施方案中，半抗原或接头(如果存在接头的话)中的官能团 是巯基。
在所有方面的一个实施方案中，共价键位于抗体CDR2中的半胱氨酸 残基与半抗原化的有效负载物的巯基之间。在一个实施方案中，共价键是 二硫键。在一个实施方案中，共价键是二硫键，并且其无需添加氧化还原 活性剂而形成。
在所有方面的一个实施方案中，在选自由生物素化的有效负载物、茶 碱化的有效负载物、洋地黄毒苷化的有效负载物和荧光素化的有效负载物 组成的组的半抗原化的有效负载物的情形中，CDR2是重链CDR2。在一 个实施方案中，抗体重链CDR2中的半胱氨酸残基位于位置52，或位置 52a，或位置52b，或位置52c，或位置52d，或位置53(按照Kabat重链可变结构域编号)。在一个实施方案中，抗体重链CDR2中的半胱氨酸残 基位于位置52a，或位置52b，或位置52c，或位置53(按照Kabat重链 可变结构域编号)。在一个优选的实施方案中，抗体重链CDR2中的半胱 氨酸残基位于位置52b或位于位置53(按照Kabat重链可变结构域编号)。
已经发现，当用包含用于形成半抗原化的有效负载物与抗体重链 CDR2中的氨基酸残基之间的共价键的官能团的通用接头衍生化时，在所 述半抗原化的有效负载物中可以使用任意的有效负载物。在通用接头中放 置官能团具有这样的优点：如果有效负载物改变，不必要再造合成和抗体 重链CDR2中官能团的位置。
在所有方面的一个实施方案中，在helicarylated有效负载物的情形中， CDR2是轻链CDR2。在一个实施方案中，抗体轻链CDR2中的半胱氨酸 残基位于位置51或位于位置55(按照Kabat轻链可变结构域编号)。在 一个优选的实施方案中，抗体轻链CDR2中的半胱氨酸残基位于位置55 (按照Kabat轻链可变结构域编号)。
已经发现，当用包含用于形成helicarylated有效负载物与抗体轻链 CDR2中的半胱氨酸残基之间的共价二硫键的官能团的半胱氨酸衍生 helicar氨基酸序列(helicaramino acid sequence)时，在helicarylated有效 负载物中可以使用任意有效负载物。在helicar氨基酸序列中放置半胱氨 酸残基(巯基官能团)具有这样的优点：如果有效负载物改变时，不必要 再造合成和抗体轻链CDR2中半胱氨酸残基的位置。
在所有方面的一个实施方案中，每个CDR2准确形成一个共价键。
在所有方面的一个实施方案中，有效负载物选自结合结构部分、标记 结构部分和生物活性结构部分。
在所有方面的一个实施方案中，所述生物活性结构部分选自包括下述 的组：抗体，多肽，一种或多种CNS靶标的天然配体，一种或多种CNS 靶标的天然配体的修饰版本，适体，抑制性核酸(即，小的抑制性RNAs (siRNA)和短发夹RNAs(shRNA))，锁定的核酸(LNAs)，核酶，和小分 子，或前述任一种的活性片段。
在所有方面的一个实施方案中，所述有效负载物是核酸或核酸衍生 物。在一个实施方案中，所述核酸是iRNA或LNA。
在所有方面的一个实施方案中，所述有效负载物是多肽。
在所有方面的一个实施方案中，所述有效负载物是全长抗体或抗体片 段。
在所有方面的一个实施方案中，所述半抗原化的有效负载物是半抗原 化的全长抗-α突触核蛋白抗体。
在所有方面的一个实施方案中，所述半抗原化的有效负载物是特异性 结合α-突触核蛋白的半抗原化的抗-α突触核蛋白抗体片段。
在所有方面的一个实施方案中，所述半抗原是生物素。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体在重链可变结构域中包含 SEQ ID NO:243-245的HVRs，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO: 246-248的HVRs。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体在重链可变结构域中包含 SEQ ID NO:249、250和245的HVRs，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:251-253的HVRs。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体包含由SEQ ID NO:254组 成的重链可变结构域和由SEQ ID NO:255组成的轻链可变结构域。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体已经通过将包含由SEQ ID NO:254组成的重链可变结构域和由SEQ ID NO:255组成的轻链可变结 构域的抗体人源化而获得。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体是人源化的抗体，并且在重 链可变结构域中包含SEQ ID NO:243-245的HVRs和在轻链可变结构域 中包含SEQ ID NO:246-248的HVRs，其中在每个HVR中，多至3个氨 基酸残基可以被改变。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体是人源化的抗体，并且在重 链可变结构域中包含SEQ ID NO:249、250和245的HVRs和在轻链可变 结构域中包含SEQ ID NO:251-253的HVRs，其中在每个HVR中，多至 3个氨基酸残基可以被改变。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体是人源化的抗体，并且重链 可变结构域来源于由SEQ ID NO:254组成的重链可变结构域，轻链可变 结构域来源于由SEQ ID NO:255组成的轻链可变结构域。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体与在重链中包含SEQ ID NO: 256-258的HVRs和在轻链中包含SEQ ID NO:259-261的HVRs的抗体结 合相同的表位。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体与在重链中包含SEQ ID NO: 262、263和258的HVRs和在轻链中包含SEQ ID NO:264-266的HVRs 的抗体结合相同的表位。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体包含由SEQ ID NO:267组 成的重链可变结构域和由SEQ ID NO:268组成的轻链可变结构域。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体已经通过将包含由SEQ ID NO:267组成的重链可变结构域和由SEQ ID NO:268组成的轻链可变结 构域的抗体人源化而获得。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体是人源化的抗体，并且在重 链可变结构域中包含SEQ ID NO:256-258的HVRs和在轻链可变结构域 中包含SEQ ID NO:259-261的HVRs，其中在每个HVR中，多至3个氨 基酸残基可以被改变。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体是人源化的抗体，并且在重 链可变结构域中包含SEQ ID NO:262、263和258的HVRs和在轻链可变 结构域中包含SEQ ID NO:264-266的HVRs，其中在每个HVR中，多至 3个氨基酸残基可以被改变。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体是人源化的抗体，并且重链 可变结构域来源于由SEQ ID NO:267组成的重链可变结构域，且轻链可 变结构域来源于由SEQ ID NO:268组成的轻链可变结构域。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体与在重链中包含SEQ ID NO: 269-271的HVRs并且在轻链中包含SEQ ID NO:272-274的HVRs的抗体 结合相同的表位。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体与在重链中包含SEQ ID NO: 269、275和271的HVRs并且在轻链中包含SEQ ID NO:276-278的HVRs 的抗体结合相同的表位。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体包含由SEQ ID NO:279组 成的重链可变结构域和由SEQ ID NO:280组成的轻链可变结构域。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体已经通过将包含由SEQ ID NO:279组成的重链可变结构域和由SEQ ID NO:280组成的轻链可变结 构域的抗体人源化而获得。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体是人源化的抗体，并且在重 链可变结构域中包含SEQ ID NO:269-271的HVRs，且在轻链可变结构域 中包含SEQ ID NO:272-274的HVRs，其中在每个HVR中，多至3个氨 基酸残基可以被改变。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体是人源化的抗体，并且在重 链可变结构域中包含SEQ ID NO:269、275和271的HVRs，且在轻链可 变结构域中包含SEQ ID NO:276-278的HVRs，其中在每个HVR中，多 至3个氨基酸残基可以被改变。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体是人源化的抗体，并且重链 可变结构域来源于由SEQ ID NO:279组成的重链可变结构，且轻链可变 结构域来源于由SEQ ID NO:280组成的轻链可变结构域。
在所有方面的一个实施方案中，所述半抗原化的有效负载物是半抗原 化的全长抗-人Tau(pS422)抗体。
在所有方面的一个实施方案中，所述半抗原化的有效负载物是特异性 结合在位置422的丝氨酸处磷酸化的人Tau的半抗原化的抗-人Tau(pS422) 抗体片段。
在所有方面的一个实施方案中，所述半抗原是生物素。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗-人Tau(pS422)抗体包含：
a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:230、239和232的HVRs， 或
b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:230、231和232的HVRs。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体还包含：
a)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:234、235和236的HVRs， 或
b)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:233、229和236的HVRs。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体包含：
a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:230、239和232的HVRs， 且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:234、235和236的 HVRs，或
b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:230、231和232的HVRs， 且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:233、229和236的HVRs，或
c)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:230、231和232的HVRs， 且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:234、235和236的HVRs。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体包含：
a)SEQ ID NO:241的重链可变结构域和SEQ ID NO:238的轻链可变 结构域，或
b)SEQ ID NO:240的重链可变结构域和SEQ ID NO:237的轻链可变 结构域，或
c)SEQ ID NO:240的重链可变结构域和SEQ ID NO:238的轻链可变 结构域，或
d)SEQ ID NO:242的重链可变结构域和SEQ ID NO:238的轻链可变 结构域。
在所有方面的一个实施方案中，所述半抗原化的有效负载物是半抗原 化的全长抗-Aβ抗体。
在所有方面的一个实施方案中，所述半抗原化的有效负载物是特异性 结合人Aβ的半抗原化的抗-Aβ抗体片段。
在所有方面的一个实施方案中，所述半抗原是生物素。
在所有方面的一个实施方案中，抗-Aβ抗体在重链可变结构域中包含 SEQ ID NO:281、282和283的HVRs。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体还在轻链可变结构域中包含 SEQ IDNO:284、285和286的HVRs。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体在重链可变结构域中包含 SEQ ID NO:281、282和283的HVRs，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:284、285和286的HVRs。
在所有方面的一个实施方案中，所述抗体包含：
a)SEQ ID NO:287的重链可变结构域和SEQ ID NO:290的轻链可变 结构域，或
b)SEQ ID NO:288的重链可变结构域和SEQ ID NO:291的轻链可变 结构域，或
c)SEQ ID NO:289的重链可变结构域和SEQ ID NO:292的轻链可变 结构域。
在所有方面的一个实施方案中，所述有效负载物是小分子(非-多肽生 物活性结构部分)。
在所有方面的一个实施方案中，所述生物活性结构部分是多肽。在一 个实施方案中，所述多肽由5-500个氨基酸残基组成。在一个实施方案中， 所述多肽包含10-450个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述多肽包含 15-400个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述多肽包含18-350个氨基 酸残基。
在所有方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合洋 地黄毒苷化的有效负载物的第一结合特异性(抗-洋地黄毒苷结合特异性； 抗-DIG结合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受 体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗 -低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8结合特异性)的第二 结合特异性。
在所有方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体具有两种特异性结 合洋地黄毒苷化的有效负载物的结合特异性(两种抗-洋地黄毒苷结合特 异性)和两种特异性结合(人)转铁蛋白受体(两种抗-(人)转铁蛋白受体结合 特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白 8结合特异性)的结合特异性。
在所有方面的一个实施方案中，特异性结合洋地黄毒苷化的有效负载 物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包 含：(a)包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:02的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQID NO:03的氨基酸序 列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:05的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:06的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:07的氨基酸序列的轻链CDR3。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合洋地黄毒苷化的有效 负载物的结合特异性是人源化的结合特异性。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合洋地黄毒苷化的有效 负载物的结合特异性包含上述任一个实施方案中的CDRs和接受体人构 架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合洋地黄毒苷化的有效 负载物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域， 其包含：(a)包含SEQ IDNO:09或25的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包 含SEQ ID NO:10或26的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO: 11或27的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:13或29的氨 基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:14或30的氨基酸序列的轻 链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:15或31的氨基酸序列的轻链CDR3。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合洋地黄毒苷化的有效 负载物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域， 其包含与SEQ ID NO:04或12或20或28的氨基酸序列具有至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的 序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参 比序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失， 但是包含所述序列的抗-洋地黄毒苷抗体保留与洋地黄毒苷结合的能力。 在某些实施方案中，在SEQ ID NO:01或09或17或25中共有1-10个氨 基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发 生在CDRs之外的区域(即FRs)中。任选地，所述抗-洋地黄毒苷抗体 包含SEQ ID NO:01或09或17或25中的VH序列，包括所述序列的翻 译后修饰。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合洋地黄毒苷化的有效 负载物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域， 其进一步包含与SEQ IDNO:08或16或24或32的氨基酸序列具有至少 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或 100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对于参 比序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失， 但是包含所述序列的抗-洋地黄毒苷抗体保留与洋地黄毒苷结合的能力。 在某些实施方案中，在SEQ ID NO:08或16或24或32中共有1-10个氨 基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发 生在CDRs之外的区域(即FRs)中。任选地，所述抗-洋地黄毒苷抗体 包含SEQ ID NO:08或16或24或32中的VL序列，包括所述序列的翻 译后修饰。
在所有方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合生 物素化的有效负载物的第一结合特异性(抗-生物素结合特异性；抗-BI结 合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受体结合特异 性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂 蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8结合特异性)的第二结合特异 性。
在所有方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体具有两种特异性结 合生物素化的有效负载物的结合特异性(两种抗-生物素结合特异性)和两 种特异性结合(人)转铁蛋白受体(两种抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或 低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异 性)的结合特异性。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合生物素化的有效负载 物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包 含(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQID NO:35的氨基酸序 列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链CDR3。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合生物素化的有效负载 物的结合特异性是人源化的结合特异性。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合生物素化的有效负载 物的结合特异性包含上述任一个实施方案中的CDRs和接受体人构架(例 如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合生物素化的有效负载 物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包 含：(a)包含SEQ ID NO:41或57的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:42或58的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:43 或59的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:45或61的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:46或62的氨基酸序列的轻链 CDR2，和(f)包含SEQID NO:47或63的氨基酸序列的轻链CDR3。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合生物素化的有效负载 物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包 含与SEQ ID NO:36或44或52或60的氨基酸序列具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一 性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参比序列， 具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％ 或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但 是包含所述序列的抗-生物素抗体保留与生物素结合的能力。在某些实施 方案中，在SEQ ID NO:36或44或52或60中共有1-10个氨基酸被置换、 插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDRs之 外的区域(即FRs)中。任选地，所述抗-生物素抗体包含SEQ ID NO:36 或44或52或60中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合生物素化的有效负载 物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其进 一步包含与SEQ ID NO:40或48或56或64的氨基酸序列具有至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序 列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对参比序列， 具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％ 或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但 是包含所述序列的抗-生物素抗体保留与生物素结合的能力。在某些实施 方案中，在SEQ ID NO:40或48或56或64中共有1-10个氨基酸被置换、 插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDRs之 外的区域(即FRs)中。任选地，所述抗-生物素抗体包含SEQ ID NO:40 或48或56或64中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在所有方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合茶 碱化的有效负载物的第一结合特异性(抗-茶碱结合特异性；抗-THEO结 合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受体结合特异 性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂 蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8结合特异性)的第二结合特异 性。
在所有方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体具有两种特异性结 合茶碱化的有效负载物的结合特异性(两种抗-茶碱结合特异性)和两种特 异性结合(人)转铁蛋白受体(两种抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密 度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性) 的结合特异性。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合茶碱化的有效负载物 的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含 (a)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ IDNO:67的氨基酸序列的 重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:71 的氨基酸序列的轻链CDR3。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合茶碱化的有效负载物 的结合特异性是人源化的结合特异性。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合茶碱化的有效负载物 的结合特异性包含上述任一个实施方案中的CDRs和接受体人构架(例 如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合茶碱化的有效负载物 的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含 (a)包含SEQ ID NO:73或89的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:74或90的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:75或 91的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:77或93的氨基酸 序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:78或94的氨基酸序列的轻链 CDR2，和(f)包含SEQ IDNO:79或95的氨基酸序列的轻链CDR3。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合茶碱化的有效负载物 的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含 与SEQ ID NO:68或76或84或92的氨基酸序列具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一 性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对参比序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或 99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是 包含所述序列的抗-茶碱抗体保留与茶碱结合的能力。在某些实施方案中， 在SEQ ID NO:68或76或84或92中共有1-10个氨基酸被置换、插入和 /或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区 域(即FRs)中。任选地，所述抗-茶碱抗体包含SEQ ID NO:68或76或 84或92中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合茶碱化的有效负载物 的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其进一 步包含与SEQ ID NO:72或80或88或96的氨基酸序列具有至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序 列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对参比序列， 具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％ 或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但 是包含所述序列的抗-茶碱抗体保留与茶碱结合的能力。在某些实施方案 中，SEQ ID NO:72或80或88或96中共有1-10个氨基酸被置换、插入 和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDRs之外的 区域(即FRs)中。任选地，所述抗-茶碱抗体包含SEQ ID NO:72或80 或88或96中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在所有方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合荧 光素化的有效负载物的第一结合特异性(抗-荧光素结合特异性；抗-FLUO 结合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受体结合特 异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度 脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8结合特异性)的第二结合特 异性。
在所有方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体具有两种特异性结 合荧光素化的有效负载物的结合特异性(两种抗-荧光素结合特异性)和两 种特异性结合(人)转铁蛋白受体(两种抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或 低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特 异性)的结合特异性。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合荧光素化的有效负载 物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包 含(a)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQID NO:99的氨基酸序 列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的轻链CDR3。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合荧光素化的有效负载 物的结合特异性是人源化的结合特异性。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合荧光素化的有效负载 物的结合特异性包含上述任一个实施方案中的CDRs和接受体人构架(例 如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合荧光素化的有效负载 物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包 含(a)SEQ ID NO:105或113的氨基酸序列的重链CDR1，(b)SEQ ID NO: 106或114的氨基酸序列的重链CDR2，(c)SEQID NO:107或115的氨 基酸序列的重链CDR3，(d)SEQ ID NO:109或117的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)SEQ ID NO:110或118的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)SEQ ID NO:111或119的氨基酸序列的轻链CDR3。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合荧光素化的有效负载 物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包 含与SEQ ID NO:108或116的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重 链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对参比序列，具有至少 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同 一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所 述序列的抗-荧光素抗体保留与荧光素结合的能力。在某些实施方案中， 在SEQ ID NO:108或116中共有1-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。 在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即FRs) 中。任选地，所述抗-荧光素抗体包含SEQ ID NO:108或116中的VH序 列，包括所述序列的翻译后修饰。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合荧光素化的有效负载 物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还 包含与SEQ ID NO:112或120的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻 链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对参比序列，具有至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的 VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列 的抗-荧光素抗体保留与荧光素结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:112或120中共有1-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些 实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即FRs)中。 任选地，所述抗-荧光素抗体包含SEQ ID NO:112或120中的VL序列， 包括所述序列的翻译后修饰。
在所有方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合溴 脱氧尿苷化的有效负载物的第一结合特异性(抗-溴脱氧尿苷结合特异性； 抗-BrdU结合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受 体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8 (抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8结合特异性)的第 二结合特异性。
在所有方面的一个实施方案中，所述双特异性抗体具有两种特异性结 合溴脱氧尿苷化的有效负载物的结合特异性(两种抗-溴脱氧尿苷结合特 异性)和两种特异性结合(人)转铁蛋白受体(两种抗-(人)转铁蛋白受体结合 特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8 结合特异性)的结合特异性。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合溴脱氧尿苷化的有效 负载物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域， 其包含(a)包含SEQ IDNO:214的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:218 的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包 含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的轻链CDR3。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合溴脱氧尿苷化的有效 负载物的结合特异性是人源化的结合特异性。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合溴脱氧尿苷化的有效 负载物的结合特异性包含上述任一个实施方案中的CDRs和接受体人构 架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合溴脱氧尿苷化的有效 负载物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域， 其包含(a)包含SEQ IDNO:214或215的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包 含SEQ ID NO:216或217的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:219的氨基酸 序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列的轻链 CDR2，和(f)包含SEQ IDNO:221的氨基酸序列的轻链CDR3。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合溴脱氧尿苷化的有效 负载物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域， 其包含与SEQ ID NO:222或224的氨基酸序列具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一 性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对参比序列，具 有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或 99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是 包含所述序列的抗-溴脱氧尿苷抗体保留与溴脱氧尿苷结合的能力。在某 些实施方案中，在SEQ ID NO:222或224共有1-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDRs之外 的区域(即FRs)中。任选地，所述抗-溴脱氧尿苷抗体包含SEQ ID NO: 222或224中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在所有方面的一个实施方案中，所述特异性结合溴脱氧尿苷化的有效 负载物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域， 其还包含与SEQ ID NO:223或225的氨基酸序列具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一 性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对参比序列，具有至 少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％ 同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含 所述序列的抗-溴脱氧尿苷抗体保留与溴脱氧尿苷结合的能力。在某些实 施方案中，在SEQ ID NO:223或225中共有1-10个氨基酸被置换、插入 和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDRs之外的 区域(即FRs)中。任选地，所述抗-溴脱氧尿苷抗体包含SEQ ID NO:223 或225中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
本文报道的一方面是包含本文报道的双特异性抗体和药用载体的药 物制剂。
本文报道的一方面是包含本文报道的非共价复合物和药用载体的药 物制剂。
本文报道的一方面是包含本文报道的共价缀合物和药用载体的药物 制剂。
本文报道的一方面是本文报道的双特异性抗体，其用作药物。
本文报道的一方面是本文报道的非共价复合物，其用作药物。
本文报道的一方面是本文报道的共价缀合物，其用作药物。
本文报道的一方面是本文报道的双特异性抗体，其用于治疗癌症或神 经学病症。
本文报道的一方面是本文报道的非共价复合物，其用于治疗癌症或神 经学病症。
本文报道的一方面是本文报道的共价缀合物，其用于治疗癌症或神经 学病症。
本文报道的一方面是本文报道的双特异性抗体在制备药物中的应用。
本文报道的一方面是本文报道的非共价复合物在制备药物中的应用。
本文报道的一方面是本文报道的共价缀合物制备药物中的应用。
在一个实施方案中，所述药物用于治疗癌症。
在一个实施方案中，所述药物用于治疗神经学病症。
在一个实施方案中，所述神经学病症选自阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)(包括，但不限于，轻度认知损害(mild cognitive impairment) 和前驱性AD(prodromal AD))，卒中(stroke)，痴呆(dementia)，肌营 养不良症(muscular dystrophy，MD)，多发性硬化(multiple sclerosis， MS)，肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis，ALS)，囊性纤维化 (cystic fibrosis)，安格尔曼综合征(Angelman’ssyndrome)，李德尔综合 征(Liddle syndrome)，帕金森病(Parkinson’s disease)，皮克病(Pick’s disease)，佩吉特病(Paget’s disease)，癌症(例如，影响CNS或脑的癌症)， 和外伤性脑损伤(traumatic brain injury)。
本文报道的一方面是本文报道的双特异性抗体作为诊断剂的应用。
本文报道的一方面是本文报道的非共价复合物作为诊断剂的应用。
本文报道的一方面本文报道的共价缀合物作为诊断剂的应用。
本文报道的一方面是本文报道的非共价复合物提高有效负载物的稳 定性的应用。
本文报道的一方面是本文报道的共价缀合物提高有效负载物的稳定 性的应用。
本文报道的一方面是本文报道的非共价复合物提高有效负载物的活 性的应用。
本文报道的一方面是本文报道的共价缀合物提高有效负载物的活性 的应用。
本文报道的一方面是本文报道的非共价复合物增加有效负载物的体 内半衰期的应用。
本文报道的一方面是本文报道的共价缀合物增加有效负载物的体内 半衰期的应用。
本文报道的一方面是本文报道的双特异性抗体在治疗疾病中的应用。
本文报道的一方面是本文报道的非共价复合物在治疗疾病中的应用。
本文报道的一方面是本文报道的共价缀合物在治疗疾病中的应用。
本文报道的一方面是治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括向所 述个体施用有效量的本文报道的非共价复合物。
本文报道的一方面是治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括向所 述个体施用有效量的本文报道的共价缀合物。
本文报道的一方面是治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述 个体施用有效量的本文报道的非共价复合物。
本文报道的一方面是治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述 个体施用有效量的本文报道的共价缀合物。
在一个实施方案中，所述疾病是癌症。
在一个实施方案中，所述疾病是神经学病症。
在一个实施方案中，所述神经病病症选自阿尔茨海默病(AD)(包括， 但不限于，轻度认知损害和前驱性AD)，卒中，痴呆，肌营养不良症(MD)， 多发性硬化(MS)，肌萎缩侧索硬化(ALS)，囊性纤维化，安格尔曼综合征， 李德尔综合征，帕金森病，皮克病，佩吉特病，癌症(例如，影响CNS或 脑的癌症)，和外伤性脑损伤。
本文报道的一方面是本文报道的双特异性抗体用于靶向递送半抗原 化的有效负载物穿过血脑屏障的应用。
本文报道的一方面是本文报道的非共价复合物用于靶向递送半抗原 化的有效负载物穿过血脑屏障的应用。
本文报道的一方面是本文报道的共价复合物用于靶向递送半抗原化 的有效负载物穿过血脑屏障的应用。
本文报道的一方面是本文报道的双特异性抗体用于靶向递送半抗原 化的有效负载物穿过血脑屏障并且在血脑屏障内或在脑内释放所述半抗 原化的有效负载物的应用。
本文报道的一方面是本文报道的非共价复合物用于靶向递送半抗原 化的有效负载物穿过血脑屏障并且在血脑屏障内或在脑内释放所述半抗 原化的有效负载物的应用。
在一个实施方案中，与不存在所述双特异性抗体的递送相比，所述半 抗原化的有效负载物的递送更高。在一个实施方案中，所述递送是两倍更 高。在一个实施方案中，所述递送是10倍更高。
在一个实施方案中，与存在本文报道的双特异性抗体的条件相比，半 抗原化的有效负载物在不存在本文报道的双特异性抗体的条件下具有更 高的生物学活性。在一个实施方案中，在不存在所述双特异性抗体的条件 下，所述生物学活性两倍更高。在一个实施方案中，在不存在所述双特异 性抗体的条件下，所述生物学活性十倍更高。
附图描述
图1:用于肽的洋地黄毒苷化(将洋地黄毒苷缀合到肽上)的方 法(图1A)。洋地黄毒苷化标记的实例(荧光团Dig-Cy5；图1B)和洋地黄毒苷化的多肽的实例(PYY-衍生物(DIG-PYY)； 图1C)。
图2:单特异性二价抗-洋地黄毒苷抗体和洋地黄毒苷-Cy5缀合 物的复合物(图2A)和单特异性二价抗-洋地黄毒苷抗体和洋 地黄毒苷-多肽缀合物的复合物的示意图(图2B)。双特异性 四价抗-洋地黄毒苷抗体和洋地黄毒苷-多肽缀合物的复合 物的示意图(图2C)。
图3:包含抗-洋地黄毒苷抗体和缀合到肽(DIG-PYY)上的洋地黄 毒苷的复合物的大小排阻层析(在280nm记录)，其表现 出确定大小的复合物单峰。
图4:A:抗-洋地黄毒苷Fab的结构模型(左)，显示洋地黄毒苷 (圈出的)被捕获在由VH和VL区的CDRs形成的深口袋中。 B:抗-生物素Fab的结构模型(右)，显示biocytinamid(圈 出的)被捕获在由VH和VL区的CDRs形成的深口袋中。
图5:比较具有和不具有引入的VH53C突变的重组人源化的抗- 生物素抗体的结合。结合特性使用BIAcore T100或BIAcore 3000仪器通过表面等离子体共振(SPR)技术进行分析。a)人 源化的抗-生物素抗体。生物素化的siRNA与人源化的抗- 生物素抗体的结合，KD＝624pM；b)人源化的Cys53突 变的抗-生物素抗体。生物素化的siRNA的结合，KD＝643 pM；siRNA浓度:0.14，0.41，1.23，3.70，11.1，33.3，和 100nM；抗-生物素抗体浓度:2nM；传感器芯片CM3；抗 体经由抗-人IgG Fc抗体的结合。
Figure BDA0002341415350000271
图6:在半抗原和在抗体的适当位置引入SH官能性允许所述抗 体和所述半抗原形成共价键，从而产生缀合物。
图7:SDS-PAGE自荧光带型示意图(没有将SDS-PAGE凝胶进一 步染色):
A:如果在还原或非还原两种条件下在抗体与半抗原-荧光 团缀合物之间没有形成共价键，则可以检测到在游离的半 抗原-荧光团缀合物的分子量处的一条自荧光带。
B:如果在非还原条件下在抗体与半抗原-荧光团缀合物之 间形成共价键，则可以检测到在所述抗体与所述半抗原-荧 光团的缀合物的组合分子量处的一条自荧光带。在还原条 件下，抗体与半抗原-荧光团缀合物的缀合物(半抗原化的 化合物)中的二硫键裂解，并且可以检测到在游离的半抗 原-荧光团缀合物的分子量处的一条自荧光带。
图8:在氧化还原活性剂(谷胱甘肽二硫化物，GSSG)和还原剂(二 硫赤藓糖醇，DTE)的存在下，半抗原标记的Cys-突变抗体 与半抗原-Cys-荧光素标记缀合物(半抗原化的化合物)的缀 合物形成：在SDS PAGE分析中通过荧光信号检测抗体的 复合和后续在确定位置的共价连接。如实施例11所述进行 非还原(上部图片)和还原(下部图片)SDS-PAGE分析。 在非还原条件下，作为在适当位置的较大尺寸的蛋白结合 信号，共价连接半抗原的抗体是可检测的。这些信号在还 原时与蛋白脱离，并且在还原条件下显现为小的实体。
左:荧光图片
右:考马斯蓝染色
系列1:具有52bC突变的抗-洋地黄毒苷抗体
系列2:在位置52b具有野生型残基的抗-洋地黄毒苷抗体
(A)使用3mM DTE和10mM GSSG的共价偶联；
(B)使用0.3mM DTE和1mM GSSG的共价偶联；
(C)使用0.03mM DTE和0.1mM GSSG的共价偶联。
图9:在仅存在氧化剂(谷胱甘肽二硫化物，GSSG)而不存在还 原剂的条件下或在不存在二者的条件下，半抗原-结合的 Cys突变抗体与半抗原-Cys-荧光标记缀合物的复合物形成： 在SDS PAGE分析中通过荧光信号检测抗体的复合和后续 在确定位置的共价连接。如实施例12所述进行非还原(上 部图片)和还原(下部图片)SDS-PAGE分析。在非还原条件下，作为在适当位置的较大尺寸的蛋白结合信号，共 价连接半抗原的抗体是可检测的。这些信号在还原时与蛋 白脱离，并且在还原条件下显现为小的实体。
左:荧光图片
右:考马斯蓝染色
系列1:具有52bC突变的抗-洋地黄毒苷抗体
系列2:在位置52b具有野生型残基的抗-洋地黄毒苷抗体
(A)没有添加剂
(B)使用1mM GSSG的共价偶联；
(C)使用0.1mM GSSG的共价偶联。
图10:Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)的结构。
图11:DIG-3-cme-eda-Cy5的结构。
图12:DIG-马来酰亚胺-Cy5的结构。
图13:DIG-eda-Cys-Cy5的结构。
图14:DIG-Ahx-Cys-Cy5的结构。
图15:DIG-Cys-MR121的结构。
图16:Ac-PYY(PEG3-Dig)的结构。
图17:Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)的结构。
图18:PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)的结构。
图19:Dy636-eda-Btn的结构。
图20:Dy636-Ser-Btn的结构。
图21:Dy636-Cys-Btn的结构。
图22:Cy5-Cys-Btn的结构。
图23:Cy5-Ser-Btn的结构。
图24:Ac-PYY(PEG2-Btn)的结构。
图25:Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Btn)的结构。
图26:Ac-PYY-PEG3-Ser-PEG2-Btn)的结构。
图27:Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Btn的结构。
图28:Ac-PYY(PEG3-Cys-4-Abu-5-Fluo)的结构。
图29:Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)的结构。
图30:用于产生Ac-PYY(PEG2-Btn)的方案。
图31:用于产生Ac-PYY(PEG3-Cys-β-Ala-Btn)的方案。
图32:用于产生Ac-PYY(PEG3-Cys-4-Abu-Dig)的方案。
图33:与biocytinamid复合的鼠抗-生物素抗体的X-射线结构。与 biocytinamid相互作用的氨基酸残基以棍状物显示。
图34:与未复合的抗原/半抗原相比较，使用共价缀合物和非共价 复合物的体内血液PK研究的结果；显示了生物素-Cy5非 共价复合物(图34A)和共价(二硫键)缀合物(图34B)以及未 复合的生物素-Ser-Cy5(星号)的Cy5-介导的荧光的相对残 留的荧光强度(％，实心符号)；将在时间点t＝0.08h的荧光 信号设为100％；另外，显示了小鼠血清样品中人IgG的相 对残留量(空心符号)；将t＝0.08h的IgG血清浓度设为 100％。
图35:确定小鼠血清中洋地黄毒苷化的PYY多肽的量的蛋白质印 迹。
图36:亲和力驱动的半抗原化的化合物与抗-半抗原抗体的复合的 分析。
在如实施例20所述进行的SDS PAGE分析中通过荧光信号 检测抗体复合和后续在确定位置的共价连接。
左：使用非还原的(凝胶左侧)和还原的(凝胶右侧)样 品的荧光图片。
右：考马斯蓝染色。
1:人源化的抗-洋地黄毒苷抗体+生物素-Cys-Cy5
2:人源化的抗-洋地黄毒苷抗体VH52bC+生物素 -Cys-Cy5
3:人源化的抗-生物素抗体+生物素-Cys-Cy5
4:人源化的抗-生物素抗体VH53C+生物素-Cys-Cy5
白色箭头标记过量的(未偶联的)生物素-Cys-Cy5，当使用抗 -洋地黄毒苷抗体VH52bC时，由于在这种情形中缀合反 应不是亲和力驱动的，其显著更高。
图37:Fab区内形成在位置52b具有另外的半胱氨酸(用于半抗原 介导的定点共价有效负载物偶联)的Dig-结合抗体所需要 的半胱氨酸和二硫键模式。
(A)VH和CH1结构域中，以及VL和CL结构域中，形成 功能性Fab片段所需要的半胱氨酸和二硫键模式。(B)VH 和CH1结构域中，以及VL和CL结构域中，形成在位置 52b具有另外的半胱氨酸(用于半抗原-介导的定点共价有 效负载物偶联)的功能性Fab片段所需要的半胱氨酸和二 硫键模式。(C&D)在VH52b变体的VH结构域内形成错误 的二硫键的可能性，所述错误的二硫键将导致错误折叠的 非功能性抗体。E)在VH52b变体的Fv区内潜在的错误结 构域间二硫键的实例，所错误的结构域间二硫键将导致错 误折叠的非功能性抗体。
图38:形成在位置52b具有另外的半胱氨酸(用于半抗原-介导的 定点共价有效负载物偶联)的Dig-结合二硫化物-稳定的单 链Fv所需要的半胱氨酸位置和二硫键模式。(A)VH和VL 结构域中形成功能性scFvs、dsscFvs和52b突变的dsscFvs 所需要的半胱氨酸。(B)产生功能性scFvs、dsscFvs和52b 突变的dsscFvs必须形成的二硫键的正确模式。(C)形成将 导致错误折叠的非功能性scFvs的错误的二硫键的可能性。 (D)形成将导致错误折叠的非功能性dsscFvs的错误的二硫 键的可能性。(E)形成将导致错误折叠的非功能性52b突变的dsscFvs的错误的二硫键的可能性。
图39:作为共价偶联的有效负载物的递送载体(delivery vehicle) 的LeY-Dig双特异性抗体衍生物的组成。
图40:用于靶向递送共价偶联的有效负载物的双特异性抗-半抗原 抗体衍生物的表达和纯化。
(A)为了进行蛋白质印迹分析，将细胞培养物上清进行SDS PAGE(NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(1.0mm x 12个孔) (Invitrogen；Cat.No.NP0322)，并且随后将蛋白转移到稳定 素转移膜(Immobilon Transfer Membranes)(稳定素-P) (Millipore；Cat.No.IPVH07850)PVDF(孔尺寸为0.45μm) 上。通过1:1000稀释的在山羊中产生的抗-人κ轻链-碱性 磷酸酶抗体(亲和纯化)(Sigma(Cat.No.A3813))和1:1000 稀释的在山羊中产生的抗-人IgG(Fc特异性)-碱性磷酸酶 抗体(Sigma(Cat.No.A9544))检测抗体衍生物。使用底物 BCIP/NBT-Blue液体底物(Sigma Cat.No.B3804)进行蛋白 质印迹显色。泳道1–分子量标记；泳道2&3–具有未修 饰的重链的对照抗体；泳道4–具有延长的H链的 LeY-Dig(52bC)双特异性抗体。
(B)SDS-PAGE分析(NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶 [Invitrogen])和后续用考马斯亮蓝染色证明蛋白制备物的纯 度，并且显现具有与其计算的分子量相对应的表观分子大小的与IgG相关的多肽链。
泳道1–分子量标记；泳道2-具有还原的延长的H链的 LeY-Dig(52bC)双特异性抗体，泳道3-具有没有还原的延 长的重链的LeY-Dig(52bC)双特异性抗体；
(C)大小排阻层析(Superdex 200)证明LeY-Dig(52bC)双特 异性抗体衍生物的蛋白制备物在蛋白质A纯化后的同质性 和缺少聚集物。
图41:与非复合的半抗原化合物Dig-Cy5相比，使用共价缀合物 和非共价复合物的体内血液药物代谢动力学研究的结果； 显示了Dig-Cy5非共价复合物(上图)、Dig-Cys-Cy5共价(二 硫键)缀合物(下图)以及非复合的Dig-Cy5(灰色三角形)的 相对残留的荧光强度(％)；将在时间点t＝0.08h的荧光信号 设为100％；另外，显示了小鼠血清样品中人IgG的相对残 留量；将在t＝0.08h的IgG血清浓度(mg/ml)设为100％。
图42:在注射非共价复合物或分别包含生物素-Cy5或生物素 -Cys-Cy5的共价(二硫键)缀合物或非复合的生物素-Cy5 后，通过非侵入性眼睛成像确定Cy5荧光的体内药物代谢 动力学；实心菱形：生物素-Cy5；实心方形：生物素-Cy5抗 -生物素抗体复合物；三角形：生物素-Cy5抗-生物素抗体缀 合物。
图43:a)茶碱-Cys-Cy5的组成、结构和分子量；b)大小排阻层析 证明了纯化的茶碱-结合性抗体变体的纯度和同质性；#2 峰显示纯化的产物，缺少#1峰表示所述制备物不含聚集物； c)通过非还原(左侧泳道)和还原(右侧泳道)SDS PAGE 证明在茶碱-结合性抗体与茶碱-Cys-Cy5之间形成共价复合 物；在非还原条件下，仅在包含茶碱-Cys-Cy5和Cys-突变 的抗体的样品中，Cy5似乎偶联到H链上，这些共价缀合 物在被还原时分解(右侧泳道)；泳道1:分子量标记；2-4 非还原-2:抗-茶碱抗体(没有Cys-突变)+茶碱-Cys-Cy5 (复合物)；3:抗-茶碱抗体-cys_55+茶碱-Cys-Cy5(缀合 物)；4:抗-茶碱抗体-cys_54+茶碱-Cys-Cy5(缀合物)；5-7 还原-5:抗-茶碱抗体(没有Cys-突变)+茶碱-Cys-Cy5(复 合物)；6:抗-茶碱抗体-cys_55+茶碱-Cys-Cy5(缀合物)； 7:抗-茶碱抗体-cys_54+茶碱-Cys-Cy5(缀合物)。
图44:通过非还原和还原SDS PAGE证明在生物素-结合性抗体与 生物素-Cys-Cy5之间形成共价复合物；在鼠血清中在37℃ 进行偶联反应1小时。在非还原条件下，仅在包含生物素 -Cys-Cy5和Cys-突变的抗体的样品中，Cy5似乎偶联到H 链上；这些共价缀合物在被还原时分解(右侧泳道)；泳 道1:分子量标记；2-3非还原-2:抗-生物素抗体(没有Cys-突变)+生物素-Cys-Cy5(复合物)；3:抗-生物素抗体-Cys+ 生物素-Cys-Cy5(缀合物)；4-5还原-5:抗-生物素抗体(没 有Cys-突变)+生物素-Cys-Cy5(复合物)；6:抗-生物素抗 体-Cys+生物素-Cys-Cy5(缀合物)。
图45:在注射非共价复合物-形成抗体或共价(二硫键)缀合物- 形成抗体后，接着注射生物素-Cy5后，通过非侵入性眼睛 成像确定Cy5荧光的体内药物代谢动力学；实心菱形:仅 施用生物素-Cy5，实心圆形:在施用抗-生物素抗体后24小 时施用的生物素-Cy5(体内复合物形成)；实心方形:在施用 抗-生物素抗体-Cys后24小时施用的生物素-Cys-Cy5(体内 缀合物形成)。
图46:在具有biocytinamid的复合物中确定鼠抗-生物素抗体-Fab- 片段的蛋白结构：复合的半抗原的位置紧密邻近带负电荷 的氨基酸簇；由于在该位置没有电荷排斥(由于缺少COOH 基团)，衍生用于在其羧基进行有效负载物偶联的生物素 (作为半抗原)以良好的功效结合；相反，游离的(正常 的)生物素不能有效结合抗体，原因在于其羧基紧密邻近 这一负电荷簇，并且因此变得排斥。
图47:血脑屏障-穿梭模块组合物的示意图。
图48:在实施例27中产生的血脑屏障-穿梭模块的SEC模式和 SDS PAGE。
图49:FACS分析的结果，所述分析使用hCMEC/D3细胞作为表 达TfR的BBB-来源的细胞系和使用Dig-Cy5作为荧光有 效负载物。
图50:半抗原-结合性双特异性抗体血脑屏障-穿梭模块由内皮细 胞的胞转和释放；A:抗-CD33-dig抗体transwell测定，huFc ELISA；B:抗-TfR1抗体transwell测定，huFcELISA；C:抗 -TfR1抗体-Dig transwell测定，huFc ELISA；D:抗-TfR2 抗体transwell测定，huFc ELISA；E:抗-TfR2-抗体Dig transwell测定，huFc ELISA。
图51:A:双特异性抗体-半抗原化的有效负载物非共价复合物的 组成和定量；B:使用具有减小的针对TfR的亲和力的双特 异性抗体由内皮细胞胞转和释放半抗原化的有效负载物(A: 抗-CD33-Dig+Dig-DNA transwell测定，qPCR；B:抗 -CD33-Bio+Bio-DNAtranswell测定，qPCR，C:抗 -TfR2-Dig+Dig-DNA transwell测定，qPCR，D:抗 -TfR2-Bio+Bio-DNA transwell测定，qPCR)。
图52:使用具有高的针对TfR的亲和力的非释放性血脑屏障-穿梭 模块由内皮细胞胞转和释放半抗原化的有效负载物；A:抗 -TrF1-Dig+Dig-DNA transwell测定，qPCR，B:抗-TfR1 抗体-Bio+Bio-DNA transwell测定，qPCR)。
图53:半抗原化的有效负载物由具有高的针对TfR的亲和力的非 释放性血脑屏障-穿梭模块的结合、摄入和细胞内分离；显 示的是在37℃温育三小时后，在hCMEC/D3细胞中双特 异性抗体-复合的半抗原化的荧光有效负载物的亚细胞分 离。DIG-DNA-CY5或Bio-DNA-Cy5(深灰色)出现在截然不 同的细胞内囊泡中，不与内在化的抗-洋地黄毒苷-或抗-生 物素-结合性双特异性抗体(中等灰色)重叠。
图54:SDS PAGE凝胶：使用2.5摩尔过量的包含helicar基序氨 基酸序列的化合物，抗体0155与helicar基序氨基酸序列 半胱氨酸变体2的偶联形成共价复合物0156；1＝helicar 基序氨基酸序列半胱氨酸变体2；2＝抗体0019；3＝抗体 0155。
图55:抗体0157与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的偶 联的SDS PAGE凝胶；1＝helicar基序氨基酸序列半胱氨酸 变体1(氧化的)；2＝对照偶联(氧化的)；3＝共价缀合物 (氧化的)；4＝分子量标记；5＝共价缀合物(还原的)；6＝ 对照偶联(还原的)；7＝helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变 体1(还原的)。
图56:抗体0155、SEQ ID NO:28缺失C端赖氨酸残基包含假单 胞菌属(Pseudomonas)外毒素分子LR8M的helicar基序氨 基酸序列半胱氨酸变体1及它们的共价缀合物的SEC层析 图。
图57:通过SDS-CE、测径器(Caliper)分析未还原样品的缀合效 率。
图58:A:进行SEC-MALLS分析以鉴定和表征抗-TfR/BRDU双 特异性抗体与BRDU-标记的DNA的复合物以及游离的双 特异性抗体和游离的BRDU-DNA。复合物在244.9kDa的 MW处从柱上洗脱下来，游离的双特异性抗体在215.4kDa 的MW处检测到，并且游离的BRDU-DNA在16.4kDa的 MW处检测到。
B:进行SEC-MALLS分析以鉴定和表征抗-TfR/BRDU双特 异性抗体与BRDU-标记的DNA的复合物以及游离的双特 异性抗体和游离的BRDU-DNA。复合物展现出6.8nm的水 力学半径(hydrodynamic radius)，而游离的双特异性抗体 展现出6.2nm的水力学半径。
图59:A:进行SEC-MALLS分析以鉴定和表征抗-TfR/生物素双 特异性抗体与生物素-标记的抗-pTau抗体的复合物以及游 离的双特异性抗体和游离的生物素-标记的抗-pTau抗体。 复合物展现出8.0nm的水力学半径，而游离的双特异性抗 体展现出6.2nm的水力学半径，并且游离的生物素-标记的 抗-pTau抗体展现出5.5nm的水力学半径。
B:进行SEC-MALLS分析以鉴定和表征抗-TfR/生物素双 特异性抗体与生物素-标记的抗-pTau抗体的复合物以及游 离的双特异性抗体和游离的生物素-标记的抗-pTau抗体。 复合物在501kDa的MW处从柱上洗脱下来，游离的双特 异性抗体在205kDa的MW处检测到，并且游离的生物素- 标记的抗-pTau抗体在150kDa的MW处检测到。
C:如果使用错误的半抗原和抗-半抗原抗体组合，则不形成 复合物。
图60:生物素-标记的抗-pTau抗体与抗-CD33/生物素双特异性抗 体的复合物(左上图)和游离的生物素-标记的抗-pTau抗体 (右上图)不被有效地胞吞(细胞裂解物，线条)，并且不被转 运到底外侧(左侧柱，浅灰色)或顶部(右侧柱，黑色)区室中 (上样3.8μg/ml)。
生物素-标记的抗-pTau抗体与抗-TfR/生物素双特异性抗体 1(左下图)或抗-TfR/生物素双特异性抗体2(右下图)的复合 调控有效的胞吞作用(细胞裂解物，线条)以及后续将生物 素-标记的抗-pTau抗体转运到底外侧(左侧柱，浅灰色)以 及转运回顶部(右侧柱，黑色)区室中(上样3.8μg/ml)。
图61:由内皮细胞胞转并释放半抗原化的有效负载物和半抗原-结 合性双特异性抗体血脑屏障-穿梭模块的Transwell测定；使 用具有减小的针对TfR(TfR2)的亲和力的双特异性抗体和 非结合性双特异性抗体(抗-CD33)，并且使用34mer寡核 苷酸有效负载物(寡核苷酸S1)
A，B，C，D: DNA有效负载物的qPCR定量
E，F，G，H: 血脑屏障-穿梭模块(双特异性抗体)的 ELISA定量
A，E: 抗-TfR2-Bio+Bio-DNA寡核苷酸S1
B，F: 抗-CD33-Bio+Bio-DNA寡核苷酸S1
C，G: 抗-TfR2-Dig+Dig-DNA寡核苷酸S1
D，H: 抗-CD33-Dig+Dig-DNA寡核苷酸S1。
图62:由内皮细胞胞转并释放半抗原化的有效负载物和半抗原-结 合性双特异性抗体血脑屏障-穿梭模块的Transwell测定；使 用具有减小的针对TfR(TfR2)的亲和力的双特异性抗体和 非结合性双特异性抗体(抗-CD33)，并且使用28mer寡核苷 酸有效负载物(寡核苷酸S2)
A，B，C，D，H:寡核苷酸有效负载物的qPCR定量
E，F，G: 血脑屏障-穿梭模块(双特异性抗体)的 ELISA定量
A，E: 抗-TfR2-Bio+Bio-DNA寡核苷酸S2
B，F: 抗-CD33-Bio+Bio-DNA寡核苷酸S2
C，G: 抗-TfR2-Dig+Dig-DNA寡核苷酸S2
D: 抗-CD33-Dig+Dig-DNA寡核苷酸S2
H: 仅Dig-DNA寡核苷酸S2有效负载物。
图63:由内皮细胞胞转并释放半抗原化的有效负载物和半抗原-结 合性双特异性抗体血脑屏障-穿梭模块的Transwell测定；使 用具有高的针对TfR(TfR1)的亲和力的双特异性抗体，并且 使用34mer寡核苷酸有效负载物(寡核苷酸S1)或28mer寡 核苷酸有效负载物(寡核苷酸S2)
A，B，C，D: DNA有效负载物的qPCR定量
E，F，G，H: 血脑屏障-穿梭模块(双特异性抗体)的 ELISA定量
A，E: 抗-TfR1-Bio+Bio-DNA寡核苷酸S1
B，F: 抗-TfR1-Dig+Dig-DNA寡核苷酸S1
C，G: 抗-TfR1-Bio+Bio-DNA寡核苷酸S2
D，H: 抗-TfR1-Dig+Dig-DNA寡核苷酸S2。
发明详述
I.定义
用在本文中时，重链和轻链的所有的恒定区和结构域的氨基酸位置按 照Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴 趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中所述的Kabat编号系统进行编号，并且在 本文中称为“按照Kabat编号”。具体地，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的Kabat 编号系统(参见第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL， 并且Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域 (CH1，铰链，CH2和CH3)。
用于本文目的的“接受体人构架”是包含来源于人免疫球蛋白构架或 人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的 氨基酸序列的构架。“来源于”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接受体 人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含氨基酸序列的变 化。在一些实施方案中，所述氨基酸变化为10个以下、9个以下、8个以 下、7个以下、6个以下、5个以下、4个以下、3个以下或2个以下。在一 些实施方案中，VL接受体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列 或人共有构架序列相同。
术语“氨基酸”表示天然存在或非天然存在的羧基α-氨基酸的组，天然 存在的即所述氨基酸直接或以前体形式可以由核酸编码。单个天然存在的 氨基酸由三个核苷酸组成的核酸(所谓的密码子或碱基-三联体)编码。 每个氨基酸由至少一种密码子编码。这称为“遗传密码的简并性”。术语“氨 基酸”用在本申请中表示天然存在的羧基α-氨基酸，包括丙氨酸(三字母密 码:ala，单字母密码:A)，精氨酸(Arg，R)，天冬酰胺(Asn，N)，天冬氨 酸(Asp，D)，半胱氨酸(Cys，C)，谷氨酰胺(Gln，Q)，谷氨酸(Glu， E)，甘氨酸(Gly，G)，组氨酸(His，H)，异亮氨酸(Ile，I)，亮氨酸(Leu， L)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，苯丙氨酸(Phe，F)，脯氨酸 (Pro，P)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸 (Tyr，Y)，和缬氨酸(Val，V)。非天然存在的氨基酸的实例包括，但不限 于，Aad(α-氨基己二酸)，Abu(氨基丁酸)，Ach(α-氨基环己烷-羧酸)， Acp(α-氨基环戊烷-羧酸)，Acpc(1-氨基环丙烷-1-羧酸)，Aib(α-氨基异 丁酸)，Aic(2-氨基茚满-2-羧酸；所谓的2-2-Aic)，1-1-Aic(1-氨基茚满-1- 羧酸)，(2-氨基茚满-2-羧酸)，烯丙甘氨酸(烯丙基Gly)，别异亮氨酸(别 -Ile)，Asu(α-氨基辛二酸，2-氨基辛二酸(octanedioc acid))，Bip(4-苯基 -苯丙氨酸-羧酸)，BnHP((2S,4R)-4-羟基脯氨酸)，Cha(β-环己基丙氨 酸)，Cit(瓜氨酸)，环己基甘氨酸(Chg)，环戊基丙氨酸，β-环丙基丙氨 酸，Dab(1,4-二氨基丁酸)，Dap(1,3-二氨基丙酸)，对(3,3-二苯基丙氨酸- 羧酸)，3,3-二苯基丙氨酸，二-正丙基甘氨酸(Dpg)，2-呋喃基丙氨酸， 高环己基丙氨酸(HoCha)，高瓜氨酸(HoCit)，高环亮氨酸，高亮氨酸 (HoLeu)，高精氨酸(HoArg)，高丝氨酸(HoSer)，羟基脯氨酸， Lys(Ac)，(1)Nal(1-萘基(Naphtyl)丙氨酸)，(2)Nal(2-萘基丙氨酸)， 4-MeO-Apc(1-氨基-4-(4-甲氧基苯基)-环己烷-1-羧酸)，正亮氨酸(Nle)， Nva(正缬氨酸)，Omathine，3-Pal(α-氨基-3-吡啶基丙氨酸-羧酸)，4-Pal (α-氨基-4-吡啶基丙氨酸-羧酸)，3,4,5,F3-Phe(3,4,5-三氟-苯丙氨酸)， 2,3,4,5,6,F5-Phe(2,3,4,5,6-五氟-苯丙氨酸)，Pqa(4-氧-6-(1-哌嗪基)-3(4H)- 喹唑啉-乙酸(CAS889958-08-1))，吡啶基丙氨酸，喹啉基丙氨酸，肌氨 酸(Sar)，噻唑基丙氨酸，噻吩基丙氨酸，Tic(α-氨基-1,2,3,4,四氢异喹啉 -3-羧酸)，Tic(OH)，Tle(叔丁基甘氨酸)和Tyr(Me)。
术语“氨基酸序列变体”是指具有在某种程度上与天然/母本/野生型 氨基酸序列不同的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列变体与所述天然 /母本/野生型氨基酸序列具有至少约70％的序列同一性。在一个实施方案 中，所述变体与天然/母本/野生型氨基酸序列具有约80％以上的序列同一 性。在一个实施方案中，所述变体与天然/母本/野生型氨基酸序列具有约 90％以上的序列同一性。在一个实施方案中，所述变体与天然/母本/野生型氨基酸序列具有约95％以上的序列同一性。在一个实施方案中，所述 变体与天然/母本/野生型氨基酸序列具有约98％以上的序列同一性。所述 氨基酸序列变体在天然/母本/野生型氨基酸序列的氨基酸序列内的某些位 置上具有置换、缺失和/或插入。氨基酸可以由常规名称，即单字母和三 字母密码命名。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用，并且包括不同的抗体结构， 包括，但不限于，单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特 异性抗体)和抗体片段，只要它们显示所需的抗原结合活性和特异性即 可。
术语“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部 分，所述部分特异性结合完整抗体也特异性结合的抗原。抗体片段的实 例包括但不限于Fv，Fab，Fab'，Fab’-SH，F(ab')2，双抗体，线性抗体， 单链抗体分子(例如scFv)，单链Fab片段(scFab)，单重链抗体(VHH)，和 由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜酶消化产生两个相同的抗原-结合片段(称为“Fab”片段， 每个具有单一抗原-结合位点)和残留的“Fc”片段，其名称反应其易于结 晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原-结合位点，并 且仍然能够交联抗原。
Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。 Fab'片段不同于Fab片段，区别在于在重链CH1结构域的羧基端添加一些残 基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸，Fab'-SH在本文中是命 名恒定结构域的半胱氨酸残基携带至少一个有利的巯基的Fab'。F(ab')2抗 体片段最初作为一对在它们之间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段而产生。抗 体片段的其他化学偶联也是已知的。
“Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区 域由紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。 正是以这种构型，每个可变结构域的三个高变区相互作用，以在VH-VL 二聚体表面上限定抗原结合位点。笼统地，六个高变区赋予抗体的抗原- 结合特异性。然而，甚至单可变结构域(或仅包含三个对抗原特异性的高 变区的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管是以比完整的结合位 点低的亲和力。
术语“生物素”，缩写“BI”表示5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧六氢-1H-噻吩并 [3,4-d]咪唑-4-基]戊酸。生物素也称为维生素H或辅酶R。
术语“生物素化的有效负载物”表示包含生物素结构部分、任选地接 头和有效负载物的缀合的实体。所述接头可以是任意的接头，诸如例如， 肽接头或化学接头。
术语“双特异性抗体”表示具有两种不同的(抗原/半抗原)结合特 异性的抗体。在一个实施方案中，本文报道的双特异性抗体特异性针对两 种不同的抗原，即，半抗原和非半抗原的抗原。
术语“溴脱氧尿苷”，缩写“BrdU”，表示5-溴-2’-脱氧尿苷。溴脱氧 尿苷还称为溴甙(broxuridine)、BudR、BrdUrd。
术语“溴脱氧尿苷化的有效负载物”表示包含溴脱氧尿苷结构部分、 任选地接头和有效负载物的缀合实体。所述接头可以是任意的接头，诸如 例如，肽接头或化学接头。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中一部分重链和/或轻链来源 于特定的来源或物种，而其余的重链和/或轻链来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五 个主要类别的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中有几个类 别可以进一步被划分为亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3， IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分 别被称为α，δ，ε，γ和μ。
术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细 胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂是特异性的有效负载物。细胞毒性剂包 括但不限于：放射性同位素(例如，At211，I131，I125，Y90，Re186， Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药 物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱 (vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托 泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)， 丝裂霉素C(mitomycin C)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素 (daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，如核酸水解 酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌 剂。
术语“洋地黄毒苷”，缩写“DIG”，表示 3-[(3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S,17R)-3,12,14-三羟基-10,13-二甲基 -1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-十四氢-环戊基[a]-菲-17-基]-2H-呋喃-5- 酮(CAS号1672-46-4)。洋地黄毒苷(DIG)是一种专属在植物紫花毛地黄 (Digitalis purpurea)、东方毛地黄(Digitalis orientalis)和狭叶毛地黄(Digitalis lanata)(指顶花(foxgloves))的花和叶中发现的类固醇(Polya， G.，Biochemical targets of plant bioactive compounds(植物生物活性化合物 的生化靶标)，CRC Press，New York(2003)p.847)。
术语“洋地黄毒苷化的有效负载物”表示包含洋地黄毒苷结构部分、 任选地接头和有效负载物的缀合实体。所述接头可以是任意的接头，诸如 例如，肽接头或化学接头。
“效应子功能”表示那些可归于抗体Fc区且随抗体类别而变化的生物 学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性 (CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作 用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。没有效应子功 能的Fc区(＝缺少效应子的Fc区)在氨基酸序列中包含消除Fc区与C1q或Fcγ-受体结合的突变。
试剂例如药物制剂的“有效量”是指在需要的剂量和时间阶段有效获 得所需的治疗或预防结果的量。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区 域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在 一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧 基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除 非本文另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号 系统，其也被称为EU索引，如在Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中所述。
术语“荧光素”，缩写“FLUO”，表示6-羟基-9-(2-羧基苯基)-(3H)-呫 吨-3-酮，备选地，2-(6-羟基-3-氧-(3H)-呫吨-9-基)-苯甲酸。荧光素还称 为间苯二酚酞，C.I.45350，溶剂黄94，7号D&C黄，angiofluor，日本 黄201(Japan yellow 201)或皂黄(soap yellow)。
术语“荧光素化的有效负载物”表示包含荧光素结构部分、任选地接 头和有效负载物的缀合实体。所述接头可以是任意的接头，诸如例如，肽 接头或化学接头。
术语“构架”，缩写“FR”，表示指除高变区(HVR)残基之外的重 链和轻链可变结构域氨基酸残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域 组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下述顺序出 现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“人工半胱氨酸残基”表示已经改造到(母本)抗体或(母本) 多肽中的半胱氨酸氨基酸残基，其具有巯基官能团(SH)，并且其不配对成 分子内二硫键。然而，人工半胱氨酸残基可以配对成分子间二硫键，例如， 与谷胱甘肽配对。
术语表示具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有包含如本文所 定义的Fc区的重链的抗体。天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚 体糖蛋白，由二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链构成。从 N-到C-端，每条重链具有可变区(VH)(其也称为可变重链结构域或重链 可变结构域)，接着是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N-到C-端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可 变结构域)，接着是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定区的氨基酸序列， 可以将抗体的轻链指定为称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种类型中的一 种。
“全长抗体”是这样的抗体，其包含VL和VH结构域以及轻链恒定 结构域(CL)和重链恒定结构域CH1，CH2和CH3。恒定结构域可以是天然 序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。全长 抗体可以具有一种或多种“效应子功能”，所述效应子功能是指可归于抗 体的Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。 抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结 合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；以及细胞表 面受体(诸如B细胞受体和BCR)下调。
术语“半抗原”表示仅当连接到大的载体(诸如蛋白)上时才能引发 免疫应答的小分子。示例性的半抗原是苯胺，邻-、间-和对-氨基苯甲酸， 苯醌，组氨酸-琥珀酰-甘氨酸(HSG)，肼苯哒嗪，氟烷(halothane)，铟-DTPA，荧光素，生物素，洋地黄毒苷，茶碱，溴脱氧尿苷和二硝基苯 酚。在一个实施方案中，所述半抗原是生物素或洋地黄毒苷或茶碱或荧 光素或溴脱氧尿苷。
术语“半抗原化的有效负载物”表示(共价)缀合到有效负载物上的 半抗原。活化的半抗原衍生物可以用作形成所述缀合物的起始原料。在一 个实施方案中，半抗原通过接头缀合到(在一个实施方案中，通过其3- 羟基)有效负载物上。在一个实施方案中，接头包括：a)一个或多个(在 一个实施方案中，3-6个)亚甲基-羧基-甲基基团(-CH2-C(O)-)，和/或b) 1-10个(在一个实施方案中，1-5个)氨基酸残基(在一个实施方案中，选 自甘氨酸，丝氨酸，谷氨酸，β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，ε-氨基己酸或赖氨 酸)，和/或c)一种或多种(在一个实施方案中，一种或两种)具有结构式 NH2-[(CH2)nO]xCH2-CH2-COOH的化合物，其中n是2或3，x是1-10，在一 个实施方案中是1-7。最后的元件导致(至少部分)式 -NH-[(CH2)nO]xCH2-CH2-C(O)-的接头(部分)。所述化合物的一种实例是， 例如，12-氨基-4,7,10-三氧杂十二酸(产生TEG(三乙二醇)接头)。在一个 实施方案中，所述接头还包含马来酰亚胺基团。由于接头包含电荷或/和 可以形成氢键，接头具有稳定和增溶作用。另外，其能够在空间上促进抗 -半抗原抗体与半抗原化的有效负载物的结合。在一个实施方案中，接头 缀合到有效负载物(在一个实施方案中，多肽)的氨基酸的侧链上(例如， 通过氨基或巯基缀合到赖氨酸或半胱氨酸侧链上)。在一个实施方案中， 接头缀合到有效负载物(在一个实施方案中，多肽)的氨基端或羧基端。 接头与有效负载物的缀合位置典型地选择在与所述接头的缀合不影响有 效负载物的生物学活性的区域中。因此，接头的连接位置取决于有效负载物的性质和负责有效负载物的生物学活性的相关结构元件。半抗原连接的 有效负载物的生物学活性可以在缀合之前和之后在体外测定中进行测试。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换地使用并 且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转 化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和来源于其的后代，而不 考虑传代的次数。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可 以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功 能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于 这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于利用人抗 体库或其它人抗体编码序列的非人来源。人抗体的这种定义明确排除包 含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVRs的氨基酸残基和来自人FRs的 氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上 所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVRs (例如，CDRs)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FRs对 应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗 体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人 源化的抗体。
术语“高变区”或“HVR”当在本文中使用时，是指抗体可变结构域的 每个区域，其序列高可变(“互补性决定区”或“CDRs”)和/或形成结构上 限定的环(“高变环”)，和/或包含抗原-接触残基(“抗原接触”)。通常， 抗体包含六个HVRs；三个在VH(H1，H2，H3)中，三个在VL(L1，L2， L3)中。
本文中的HVRs包括：
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、 53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia，C.和Lesk，A.M.， J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、 50-65(H2)和95-102(H3)处的CDRs(Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)， 第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health， Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242)；
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b (H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触(MacCallum等J. Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)，(b)，和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56 (L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、 93-102(H3)和94-102(H3).。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动 物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动 物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案 中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在 一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％的纯度，如通过例如电 泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子 交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参 见，例如，Flatman，S.等，J.Chrom.B 848(2007)79-87。
“分离的”核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分 离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但 是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位 置处。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得 的抗体，即除了可能的变体抗体(该变体抗体例如含有天然存在的突变或 在产生单克隆抗体制剂的过程中出现，此类变体通常少量存在)外，构成 群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决 定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每个 单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来产 生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包 括但不限于杂交瘤法，重组DNA法，噬菌体展示法，和利用包含所有或 部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这样的方法和用于制备 单克隆抗体的其他示例性方法描述于本文中。
术语“单特异性抗体”表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结 合位点具有相同的结合特异性，即，结合相同的抗原或半抗原。
“裸抗体”是指没有缀合异源结构部分(如细胞毒性结构部分)或放射性 标记的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
术语“包装说明书(package insert)”用于指通常包括在治疗产品的商品 包装中的使用说明，其包含关于适应证、用法、剂量、给药、组合疗法、 禁忌症的信息和/或关于使用这样的治疗产品的警告。
术语“有效负载物”表示可以缀合到半抗原上的任意分子或分子组合。 术语“有效负载物”还表示这样的结构部分，其生物学活性需要递送到(入) 和/或定位在细胞或组织中。有效负载物包括，但不限于，标记、化疗剂、 抗-血管生成剂、细胞毒素(例如，假单胞菌属外毒素、蓖麻蛋白、相思 豆毒蛋白、白喉毒素(Diphtheria toxin)等)、细胞因子、前药、酶、生长 因子、转录因子、药物、放射性核素、配体、抗体或其片段、脂质体、纳 米颗粒、病毒粒子、细胞因子等。
“化疗剂”是有效用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂 类(alkylating agents)，如塞替哌(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯(alkyl sulfonates)，如白消安(busulfan)，英丙 舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶类(aziridines)，如苯佐替 派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌 (uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamylamines)，包 括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺 (trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)，如苯丁酸氮 芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(chlorophosphamide)、 雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、 盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新 氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、 曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类(nitroureas)， 如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、 洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生 素类，如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素 (authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素 C(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、carabicin、洋红霉素 (carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌 素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6- 重氮基-5-氧-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、多柔比星 (doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星 (idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、麦考 酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、 培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素 (quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨喋呤(methotrexate) 和5-氟尿嘧啶(methotrexate)(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、 甲氨喋呤、喋罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如 氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤 (thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、 阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞 苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、 依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素类，诸如卡鲁 睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药 (anti-adrenals)，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛 司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯 (aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；5-氨基酮戊酸 (aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)； 依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌 (diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁 (etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖 (lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；尼曲吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸 (podophyllinicacid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼 (procarbazine)；
Figure BDA0002341415350000481
雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌 (triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺(2,2',2"-trichlorotriethylamine)；乌拉坦 (urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀 (mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊 溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(arabinoside)("Ara-C")；环磷 酰胺；塞替哌(thiotepa)；紫杉烷类(taxanes)，例如，紫杉酚(paclitaxel) (
Figure BDA0002341415350000491
Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西紫杉醇 (docetaxel)(
Figure BDA0002341415350000492
Rh6ne-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯 丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤 (6-thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤；铂类似物，如顺铂 (cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷 (etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C(mitomycin C)； 米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)； 诺维本(navelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素 (daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐 (ibandronate)；CPT-II；35拓扑异构酶抑制剂RFS 2000(35topoisomerase inhibitor RFS 2000)；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine)(DMFO)； 视黄酸(retinoic acid)；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)； 以及上述任一种的药用盐、酸或衍生物。该定义中还包括抗-激素试剂， 其起作用调控或抑制激素对肿瘤的作用，如抗雌激素，例如，包括他莫昔 芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制性4(5)-咪唑，4-羟 基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene， LY117018，奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)； 个抗-雄激素药，诸如氟他胺(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，比卡 鲁胺(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以 及上述任一种的药用盐、酸或衍生物。
“抗血管生成剂”是指在某种程度上阻断或妨碍血管发育的化合物。 例如，抗血管生成剂可以是小分子或与参与血管生成的生长因子或生长因 子受体结合的抗体。在一个实施方案中，抗血管生成剂是与血管表皮生长 因子(VEGF)结合的抗体。
术语“细胞因子”是一般性术语，指由一个细胞群释放的对另一个 细胞群起细胞间调节剂作用的蛋白。此种细胞因子的实例是淋巴细胞因 子(lymphokines)、单核细胞因子(monokines)和传统的多肽激素。细胞因 子中包括的是生长激素如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生 长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素(proinsulin)；松弛 素；前松弛素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)和促黄体生成素(LH)；肝生长因子(hepatic growth factor)；成纤维细胞生长 因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-a和-P；苗勒氏管抑制物质 (mullerian-inhibitingsubstance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素 (inhibin)；活化素(activin)；血管内皮生长因子；整联蛋白(integrin)；血 小板生成素(thrombopoietin)(TPO)；神经生长因子如NGF-p；血小板生 长因子；转化生长因子(TGFs)如TGF-a和TGF-p；胰岛素样生长因子-I 和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干扰 素，如干扰素-a，-P和-y；集落刺激因子(CSFs)，如巨噬细胞-CSF (M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(GCSF)；白 细胞介素(ILs)，如IL-I，IL-1a，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-IO，IL-II，IL-12；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-P； 和其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。当用于本文时，术语细胞因 子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白，以及天然序列细胞 因子的生物活性等价物。
术语“fMLP”表示由N-甲酰甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸组成的三 肽。在一个实施方案中，效应子结构部分是fMLP或其衍生物。
术语“前药”是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其较亲本药物 对肿瘤细胞的细胞毒性更小并且能够被酶活化或转化为更具活性的亲本 形式。参见，例如，Wilman，"Prodrugs in Cancer Chemotherapy"(癌症化 疗中的前药)"Biochemical SocietyTransactions，Vol.14，615th Meeting Belfast(1986)pp.375-382和Stella，等,"Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery"(前药：靶向药物递送的化学方法)，Directed Drug Delivery，Borchardt，等，(编)，pp.247-267，Humana Press(1985)。可以 用作效应子结构部分的前药包括，但不限于，含磷酸盐的前药，含硫代磷 酸盐的前药，含硫酸盐的前药，含肽的前药，D-氨基酸修饰的前药，糖 基化前药，含b-内酰胺的前药，含任选取代的苯氧基乙酰胺的前药或含 任选取代的苯基乙酰胺的前药，可以被转化为更具活性的无细胞毒性的药 物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前药。可以被衍生成用于本发明的前 药形式的细胞毒性药物的实例包括，但不限于，上述那些化疗剂。
术语“细胞毒素”是指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破 坏的物质。细胞毒素包括，但不限于，放射性同位素(例如，At211，I131， I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)； 化疗试剂或药物(例如，甲氨蝶呤，阿霉素，长春花生物碱(长春新碱， 长春碱，依托泊苷)，多柔比星，美法仑，丝裂霉素C，苯丁酸氮芥，柔 红霉素或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，如核酸水解酶；抗生 素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素， 包括其片段和/或变体；以及本文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所 述序列进行比对并在必要时引入空位以获取最大百分比序列同一性，且不 将任何保守置换视为序列同一性的一部分之后，候选序列中的氨基酸残基 与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域技术人员已 知的多种方法实现用于测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对，例如， 使用公众可得到的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的适宜参数， 包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为此目 的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。 ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech，Inc，并且源代码已经 随用户文档提交至美国版权局(Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可从Genentech，Inc.(South San Francisco， California)得到ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序 应当为在UNIX操作系统、包括数字UNIX V4.0D上使用而进行编译。 ALIGN-2程序设定了所有序列比较参数并且不变。
在应用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情形中，给定氨基酸序列A 相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列 同一性(或者可以这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针 对给定氨基酸序列B的特定％氨基酸序列同一性)如下计算：
100乘以X/Y比值
其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为 相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理 解，当氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于 B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除 非另外具体说明，在本文用的所有％氨基酸序列同一性的值都是用 ALIGN-2计算机程序如前段所描述的那样得到的。
术语“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生 物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可 接受的毒性的另外的成分。
“药用载体”是指药物制剂中活性成分之外的成分，其对受试者是无毒 的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
“多肽”是由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，不管是天然产生 的还是合成的。少于20个氨基酸残基的多肽可以称为“肽”，而由两个以 上多肽组成或包含一个大于100个氨基酸残基的多肽的分子可以称为 “蛋白”。多肽也可以包含非氨基酸成分，诸如碳水化合物基团、金属离 子或羧酸酯。非氨基酸成分可以是由表达所述多肽的细胞所加入的，并且 可以随细胞类型而不同。多肽在本文中关于其氨基酸骨架结构或编码其的 核酸而限定。诸如碳水化合物基团的添加通常没有规定，但是，是可以存 在的。
所有的多肽序列按照通常接受的惯例书写，其中α-N-端氨基酸残基 在左侧，且α-C-端氨基酸残基在右侧。当用于本文时，术语“N-端”是 指多肽中氨基酸的游离的α-氨基基团，术语“C-端”是指多肽中氨基酸 的游离的a-羧酸端。在N-端以某基团结束的多肽是指在N-端氨基酸残基 的α-氨基氮上携带基团的多肽。在N-端以某基团结束的氨基酸是指在α-氨基氮上携带基团的氨基酸。
除非通过"D"前缀(例如，D-Ala或N-Me-D-Ile)或以小写字母形式 书写(例如，a，i，1，(Ala、Ile、Leu的D版本))另外指明，本说明书 和附上的权利要求书中所述的多肽中的氨基酸和氨酰基残基的α-碳的立 体化学是天然的或"L"构型。Cahn-Ingold-Prelog"R"和"S"命名用来指明多 肽N-端的特定酰基取代基中手性中心的立体化学。命名"R,S"意欲表示两 种对映体形式的外消旋混合物。这种命名法按照Cahn，R.S.，等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.5(1966)385-415中所述的命名法。
术语“单链Fv”，缩写“scFv”，表示包含抗体的VH和VL结构域的 抗体片段，其中这些结构域存在于单多肽链中。在一个实施方案中，Fv 多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，所述接头使scFv形成对 于抗原结合需要的结构。关于scFv的综述，参见Plueckthun于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学),卷113,Rosenburg和Moore(编)，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
术语“茶碱”，缩写“THEO”，表示1,3-二甲基-7H-嘌呤-2,6-二酮。茶 碱也称为二甲基黄嘌呤。
术语“茶碱化的有效负载物”表示包含茶碱结构部分、任选地接头和有 效负载物的缀合的实体。所述接头可以是任意的接头，诸如例如，肽接头 或化学接头。
术语“治疗(treatment)”(及其语法变化如“治疗(treat)”或“治疗 (treating)”)指在尝试改变被治疗的个体的天然进程中的临床干预，并且 可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括但不限 于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后 果，防止转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和减退或改善 的预后。在一些实施方案中，将本发明的抗体用于延缓疾病的发生或减缓 疾病的进展。
术语“x-价”，例如，“单价”或“二价”或“三价”或“四价”，表 示在抗体分子中存在特定数目的结合位点，即，“x”个。因此，术语“二 价”、“四价”和“六价”分别表示在抗体分子中存在两个结合位点、四个 结合位点和六个结合位点。本文报道的双特异性抗体至少是“二价的”， 并且可以是“三价的”或“多价的”(例如，“四价的”或“六价的”)。在 一个实施方案中，本文报道的双特异性抗体是二价的、三价的或四价的。 在一个实施方案中，所述双特异性抗体是二价的。在一个实施方案中，所 述双特异性抗体是三价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价 的。
在特定的方面和实施方案中，本文报道的抗体具有两个以上的结合微 单并且是双特异性的。即，甚至在存在多于两个结合位点的情形中(即， 所述抗体是三价的或多价的)，所述抗体可以是双特异性的。术语双特异 性抗体包括，例如，多价单链抗体、双抗体和三抗体，以及具有全长抗体 的恒定结构域结构的抗体，所述全长抗体上通过一个或多个肽接头连接其 他的抗原结合位点(例如，单链Fv，VH结构域和/或VL结构域，Fab， 或(Fab)2)。抗体可以是来自单一物种的全长的，或是嵌合的或人源化的。 对于具有多于两个抗原结合位点的抗体，一些结合位点可以是相同的，只 要蛋白具有针对两个不同抗原的结合位点即可。即，尽管第一结合位点是 特异性针对半抗原的，第二结合位点特异性针对非半抗原抗原，反之亦然。
术语“可变区”是指参与抗体与其抗原结合的抗体重或轻链的结构域。 天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的 结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FRs)和三个高变区(HVRs)。 (参见，例如，Kindt，T.J.等KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，N.Y.(2007)，第91页)。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结 合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构 域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。 参见，例如，Portolano，S.等，J.Immunol.(免疫学杂志)150(1993)880-887； Clackson，T.等，Nature(自然)352(1991)624-628)。
术语“载体”是指能够使与其相连的另一种核酸增殖的核酸分子。该术 语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞 的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这 样的载体在本文中被称为“表达载体”。
II.本文报道的缀合物
本文报道的是血脑屏障-穿梭模块(BBB-穿梭模块)，其是一种具有针 对半抗原的第一结合特异性和针对血脑屏障受体(BBBR)的第二结合特 异性的双特异性抗体。所述BBB-穿梭模块识别血脑屏障上的可胞转的细 胞表面靶标(诸如TfR、LRPs或其他靶标，BBBR)并且同时结合半抗原 化的有效负载物。
已经发现，不必须满足关于结合价态、抗体形式、BBBR结合亲和力 的其他要求。
还已经发现，不要求本文报道的基于双特异性抗体的穿梭模块从血脑 屏障的内皮细胞释放来调节半抗原化的有效负载物的胞转作用。相反，在 与BBBR结合时与基于双特异性抗体的穿梭模块复合/结合的半抗原化的 有效负载物在BBB细胞内从所述基于双特异性抗体的穿梭模块释放，即， 在细胞内囊状系统中，与所述穿梭模块分开，随后从BBB细胞胞吐进入 脑，将所述双特异性抗体留在BBB细胞中。
本文报道的基于双特异性抗体的穿梭模块在结合特异性价态和 BBBR结合特异性的亲和性方面是非常多变的。同时，其能够允许从穿梭 模块释放有效负载物。
非共价复合物
本文报道的双特异性抗体用作用于治疗性或诊断性有效负载物的半 抗原化的有效负载物递送载体(delivery vehicle)。所述治疗性或诊断性有 效负载物与半抗原缀合，由此通过本文报道的双特异性抗体的半抗原-结 合位点二复合。该复合物是确定的且稳定的，并且特异性地将半抗原化的 有效负载物递送至靶细胞或组织。由于半抗原化的治疗性或诊断性有效负 载物以非共价形式与双特异性抗体复合，因此，一方面，半抗原化的有效负载物在其在循环中的时间内结合在其递送载体(＝双特异性抗体)上，但 是，另一方面，在内在化或胞转后，还可以有效地释放。可以实现与半抗 原的缀合而不干扰治疗性或诊断性有效负载物的活性。双特异性抗体不包 含罕见的共价加成，并且因此避免了任意的免疫原性危险。因此，这种简 单的复合方法可以用于与仅一种抗-半抗原抗体组合的任意有效负载物； 例如，肽、蛋白、小分子、成像试剂盒核酸。半抗原化的治疗性或诊断性 有效负载物与本文报道的包含半抗原-特异性结合位点的双特异性抗体的 复合赋予所述治疗性或诊断性有效负载物(例如，诊断性或治疗性多肽或 小分子)良好的生物物理行为和改善的PK参数。此外，所述复合物能够 使递送负荷靶向展示由所述双特异性抗体的第二结合特异性识别的抗原 的细胞或组织。
使核酸特异性靶向并递送至且进入靶组织和靶细胞是主要的任务。对 于治疗性应用，需要同质限定的实体。在一些实例中已经证明了抗体或抗 体-片段-介导的核酸递送(例如，Lieberman等，Nat.Biotechnol.(自然生 物技术)23(2005)709)。特别感兴趣的是使双链RNA分子(dsRNA)特异 性靶向并递送至和进入靶组织和靶细胞。已经证明双链核糖核酸(dsRNA) 分子以称为RNA干扰(RNAi)的高度保守调节机制阻断基因表达。 DsRNAs可以与具有良好的稳定性的抗体缀合，以确保特异性的靶向并避 免系统非特异性释放。另一方面，dsRNA必须在靶细胞处或在靶细胞内 释放，以能够进入所述细胞中。
本文报道的双特异性抗体可以用作核酸(DNA或RNA)的递送载体。 因此，本发明提供用于靶向的基因治疗、靶向的RNAi和靶向的LNA递 送的特异性递送平台。
在一个实施方案中，半抗原化的核酸与本文报道的双特异性抗体的复 合物用于将核酸特异性靶向递送至细胞或组织。尽管被半抗原化，以及尽 管与抗体复合，所述核酸保留其功能性。另外，在复合的半抗原化的核酸 的存在性，双特异性抗体的血脑屏障受体结合位点保留其结合特异性和亲 和性。半抗原化的核酸与本文报道的双特异性抗体的复合物可以用于使核 酸特异性靶向表达血脑屏障受体的细胞。由此，被血脑屏障受体识别的细 胞或脑在胞转后被所述核酸选择性地到达(addressed)，由所述核酸引起 的活性(例如，RNAi或核酸介导的细胞毒性)因此在血脑屏障受体表达 细胞或脑中得以提高。在一个实施方案中，通过另外应用靶向的内体调节 试剂，进一步提高这些活性。核酸不仅被特异性递送至抗原表达细胞，而 且在所述靶细胞中内在化。由于半抗原化的核酸以非共价形式偶联在本文 报道的双特异性抗体上，因此，在内在化或胞转后，有效负载物(即核酸) 可以被释放。
在一个优选的实施方案中，所述核酸是DNA。在一个优选的实施方 案中，所述核酸是dsRNA。在一个优选的实施方案中，所述核酸是LNA。
为了调节它们的活性(例如，由siRNAs特异性破坏mRNAs)，治疗 性或诊断性核酸必须进入其靶细胞的细胞质。特异性核酸活性的递送的一 个重要因素是不仅将所述分子递送至细胞，而且必须将充分量的核酸转移 到这些细胞的细胞质中。对此，这些分子必须至少一次穿透生物膜。由于 生物制品不容易通过膜，因此，该过程是核酸活性有效递送必须克服的瓶 颈。克服该瓶颈的方式可以是膜穿透、蛋白易位通过膜或可能涉及膜破裂 过程的内体逃逸或囊泡逃逸机制。
在一个实施方案中，本文报道的双特异性抗体或本文报道的双特异性 抗体与半抗原化的核酸的非共价复合物用作连接内体功能性的调节剂或 内体逃逸/破裂模块的核酸递送模块。在一个实施方案中，内体逃逸模块 包含肽。
在一个实施方案中，内体逃逸模块包含动态聚缀合物(Dynamic PolyConjugates，DPCs)。DPCs是在细胞结合和内在化时引起siRNAs内体逃 逸的化学实体(Rozema，D.B.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104(2007) 12982-12987)。所述DPCs由PBAVE(丁基-氨基乙烯醚的聚合物)支架构 成，在所述支架上用双官能性马来酰胺(maleamate)连接可逆地连接PEG 分子。对于后者，可以使用羧基化的二甲基马来酸(CDM)。使用PEG单位来掩蔽PBAVE的内体裂解的正电荷。siRNA货物也连接在PBAVE上 (例如，通过可逆的二硫键)。由于siRNA、掩蔽基团(和另外的靶向配 体)以可逆形式缀合到聚合物上，因此，得到的递送载体称为siRNA动态 聚缀合物。所述DPCs引起siRNA的细胞质递送的内体裂解特性由其化 学环境诱导：成熟的内体内的pH降低，诱导CDM-PEG的释放，这使 PBAVE的正电荷暴露，其又调节内体裂解。
因此，在一个实施方案中，DPCs的内体裂解特征与双特异性半抗原 化的有效负载物递送系统的特异性靶向特性组合。
在一个实施方案中，本文报道的双特异性抗体与半抗原化的核酸的非 共价复合物用于成像分析。在该实施方案中，核酸同时缀合到半抗原和可 检测的标记上。由此，可能通过显微镜检或其他成像技术显现靶向血脑屏 障受体表达细胞的核酸的定位。在一个实施方案中，所述可检测的标记是 荧光标记。在一个实施方案中，核酸的定位在细胞中显现，即，体外显现。 在另一个实施方案中，核酸的定位在体内显现。
由于其化学和物理特性，诸如分子量和结构域体系结构，包括二级修 饰，抗体的下游加工是非常复杂的。例如，不仅对于配制的药物，而且对 于下游加工(DSP)中的中间体，需要浓缩的溶液来实现用于经济化处理和 应用存储的低体积。
但是，随着抗体浓度增加，可以观察到形成聚集物的趋势。与分离的 抗体相比，这些聚集的抗体具有削弱的特征。可以通过在与单特异性二价 亲本抗体的单链抗体的重链与轻链可变结构域之间引入二硫键而减少本 文报道的抗体的聚集。这种改善的稳定性不仅在生产过程中而且在抗体的 存储中是有用的。在一个实施方案中，包含在本文报道的双特异性抗体中 的单链抗体的可变结构域之间的二硫键对于每个单链抗体独立地选自：
i)重链可变结构域位置44-轻链可变结构域位置100，
ii)重链可变结构域位置105-轻链可变结构域位置43，或
iii)重链可变结构域位置101-轻链可变结构域位置100。
在一个实施方案中，包含在本文报道的双特异性抗体中的单链抗体 的可变结构域之间的二硫键是在重链可变结构域位置44与轻链可变结构 域位置100之间。
在一个实施方案中，包含在本文报道的双特异性抗体中的单链抗体 的可变结构域之间的二硫键是在重链可变结构域位置105与轻链可变结 构域位置43之间。
共价缀合物
已经发现，通过将半抗原化的有效负载物与抗-半抗原抗体共价偶联， 可以实现有效负载物的稳定和PK-特性改善。
半抗原化的有效负载物与抗-半抗原抗体的共价缀合物可以赋予多肽 良好的生物物理行为和改善的PK特性。此外，在使用双特异性抗体的情 形中，所述缀合物可以用来将使多肽靶向展示由双特异性抗体的第二结合 特异性识别的抗原的细胞。所述缀合物由一个抗-半抗原结合特异性和一 个(非-半抗原)抗原结合特异性构成。抗体与半抗原化的有效负载物的 化学计量比率取决于双特异性抗体的形式，并且可以是1:1，1:2，2:1，2:2，2:4和4:2(抗体：半抗原-多肽)。
理想地，尽管被缀合到半抗原上，以及被缀合到抗体上，有效负载 物保留良好的生物学活性。还需要(在双特异性靶向分子的情形中)，在 共价缀合的半抗原化的有效负载物的存在下，双特异性抗体的细胞表面靶 标结合位点保留其结合特异性和亲和性。
半抗原化的有效负载物中的活性基团可以是任意的活性基团，诸如， 例如，马来酰亚胺，例如，N-乙基马来酰亚胺(NEM)，碘乙酰胺，吡啶基 二硫化物，或其他反应性缀合配偶体(例如，参见，Haugland，2003， Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probesand Research Chemicals (荧光探针和研究化学品的分子探针手册)，Molecular Probes，Inc.； Brinkley，1992，Bioconjugate Chem.3:2；Garman，1997，Non-RadioactiveLabeling:A Practical Approach(非放射性标记：一种实用方法)，Academic Press，London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2；Hermanson，G.在 BioconjugateTechniques(缀合物技术)中(1996)Academic Press，San Diego，第40-55和643-671页)。
抗体的活性基团限于那些可以选择性(即，位置特异性)产生的基 团。因此，限于下述氨基酸残基的侧链基团：半胱氨酸，丝氨酸，天冬酰 胺，谷氨酰胺，酪氨酸，赖氨酸，精氨酸，天冬氨酸和谷氨酸。
为了形成抗体与半抗原化的有效负载物之间的共价缀合物，两种化 合物必须通过引入活性基团进行修饰。当半抗原化的有效负载物与抗体结 合时，使两个活性基团紧密邻近，允许形成共价键。在一个实施方案中， 修饰是在每个化合物中引入巯基官能性。在一个实施方案中，所述巯基化 合物是半胱氨酸残基。
包含官能团的位置必须同时满足两个要求：(i)偶联位置应该邻近抗 体的抗-半抗原结合特异性的结合区，以利用半抗原的位置效应用于定向 偶联，和(ii)突变和偶联位置必须以不影响半抗原结合本身的方式放置。 这些关于发现适当的位置的要求实际上是彼此‘抵触的’，原因在于，要 求(i)最好由接近结合位点的位置实现，而要求(ii)最安全地由远离结合位 点的位置实现。
除了这些实际上排除的要求，鉴定可能被突变而不影响半抗原放置 并且同时允许定向的共价偶联的位置。
按照重链可变结构域的Kabat编号，第一位置分别位于位置VH52b 或位置VH53。如果抗体具有短的VH CDR2，其不具有间断的残基，如 52a，52c，52c和52d，所述位置是53(编号和比对是按照Kabat关于抗 体重链可变结构域的编号方案和法则)。如果抗体具有包含残基52a和52b 且任选地包含52c和52d等的其他残基的长的VH CDR2，所述位置是52b (编号和比对是按照Kabat关于抗体重链可变结构域的编号方案和法 则)。
已经发现，当用包含用于形成半抗原化的有效负载物与抗体重链 CDR2中的氨基酸残基之间的共价键的官能团的通用接头衍生化时，在所 述半抗原化的有效负载物中可以使用任意的有效负载物(在选自由下述组 成的组的半抗原化的有效负载物的情形中：生物素化的有效负载物，茶碱 化的有效负载物，洋地黄毒苷化的有效负载物和荧光素化的有效负载物)。 在通用接头中放置官能团具有这样的优点：如果有效负载物改变，不必要 再造合成和抗体重链CDR2中官能团的位置。
已经发现，当用包含用于形成helicarylated有效负载物与抗体轻链 CDR2中的半胱氨酸残基之间的共价二硫键的官能团的半胱氨酸衍生 helicar氨基酸序列时，在helicarylated有效负载物中可以使用任意有效负 载物。在helicar氨基酸序列中放置半胱氨酸残基(巯基官能团)具有这 样的优点：如果有效负载物改变时，不必要再造合成和抗体轻链CDR2 中半胱氨酸残基的位置。
第二位置位于按照Kabat编号的位置VH28。
例如，在抗-洋地黄毒苷抗体结构中，半抗原结合在由疏水残基形成 的深口袋中。在该结晶学研究中使用荧光洋地黄毒苷-Cy5缀合物，其中， 由于高度的灵活性和产生的晶体无序性，荧光团和在洋地黄毒苷与Cy5 之间的接头在结构中是不可见的。然而，接头和Cy5连接在洋地黄毒苷 的O32上，其指向重链CDR2的方向。洋地黄毒苷的O32与按照Kabat的位置52b中的氨基酸残基的Cα之间的距离约为
Figure BDA0002341415350000601
已经发现，所述位置是“通用的”位置，即，所述位置分别适用于 任意(抗-半抗原)抗体或任意helicarylated有效负载物，并且，因此，每当 必须产生新的共价复合物时，不需要从头起始，例如，通过提供晶体结构， 并且确定允许半抗原定位的共价偶联的适当位置进行。
本文报道的修饰的抗体保留其亲本(即野生型)抗体对应体的半抗 原(抗原)结合能力。因此，改造的抗体能够结合。在一个实施方案中， 其能够特异性结合半抗原(抗原)。
术语“特异性结合……的结合位点”或“特异性结合……的抗体” 表示包含所述结合位点的分子或可以以特异性方式与其他分子形成复合 物的抗体。结合可以在体外测定中检测，诸如在等离子体共振测定 (BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，Sweden)中检测。复合物形成的亲和力 由术语ka(形成复合物的化合物缔合的速率常数)、kD(解离常数，复合物的解离)和KD(kD/ka)限定。结合或特异性结合意指约10-7M以下的结合 亲和力(KD)。
已经发现，当抗体与半抗原化的有效负载物结合时，发生在半胱氨 酸-修饰的抗体与半胱氨酸-修饰的半抗原化的有效负载物(所述半胱氨酸 -修饰的半抗原化的有效负载物在半抗原与有效负载物之间的接头中或在 半抗原之内或在有效负载物之内携带半胱氨酸残基)之间的共价键的形 成，如果所形成的键是二硫键，则无需加入还原剂和/或氧化剂。因此， 当形成非共价复合物时，这两种化合物之前的二硫键是自发形成的。因此， 用于形成本文报道的共价复合物的方法仅需要将两种混合物混合。形成二 硫键的唯一前提条件是两种化合物关于彼此的取向。
将在位置VH52b和VH53(按照Kabat编号方案)的氨基酸残基分 别替换为Cys残基导致具有下述重链可变区序列的抗体衍生物：关于抗- 洋地黄毒苷抗体-VH52bC，在SEQ IDNO:20和28中列出的，关于抗- 茶碱抗体-VH53C，在SEQ ID NO:84和92中列出的，关于抗-生物素抗 体-VH53C，在SEQ ID NO:52和60中列出的，关于抗-荧光素抗体 -VH52bC，在SEQ IDNO:108中列出的，和关于抗-溴脱氧尿苷抗体 -VH53C，在SEQ ID NO:226中列出的。
将在位置VH28(按照Kabat编号方案)的重链可变结构域氨基酸残 基替换为Cys残基导致分别具有SEQ ID NO:116，124，132，140，148， 156和164中列出的重链可变区序列的抗体衍生物。
鉴定为修饰点的另一个位置是按照Kabat编号的位置VH28。
用Cys替换按照Kabat的位置VH28的氨基酸产生具有下述重链可变 区序列的抗体衍生物：关于抗-洋地黄毒苷抗体-VH28C，在SEQ ID NO: 124和132中列出的，关于抗-茶碱抗体-VH28C，在SEQ ID NO:156和 164中列出的，关于抗-生物素抗体-VH28C，在SEQ ID NO:140和148 中列出的，关于抗-荧光素抗体-VH28C，在SEQ ID NO:116中列出的， 和关于抗-溴脱氧尿苷抗体-VH28C，在SEQ ID NO:227中列出的。
ESI-MS分析表明半抗原化的有效负载物(有效负载物＝治疗性肽) 的共价抗体缀合导致确定尺寸的缀合物，其大于未复合的抗体或未复合的 肽。
Figure BDA0002341415350000631
Figure BDA0002341415350000641
Figure BDA0002341415350000651
体内实验的结果显示，半抗原-和TfR-结合性双特异性BBB-穿梭载 体结合半抗原化的有效负载物抗体，并且能够将有效负载物转运穿过 BBB。这些实验的结果表明，有效负载物可以从穿梭载体上释放下来，随 后结合其在脑中的靶标并且在其脑中靶标上积聚。
抗体亲和力
在某些实施方案中，本文报道的抗体本身或本文报道的复合物中的 抗体具有的解离常数(Kd)≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM或≤0.001 nM(例如，约10-8M以下，例如约10-8M至约10-13M，例如，约10-9M 至约10-13M)。
在一个实施方案中，Kd通过用目的抗体的Fab形式及其抗原进行的 放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量，如由以下测定所述的。Fab对 抗原的溶液结合亲合力通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况下，用最 小浓度的(125I)-标记的抗原平衡Fab，接着用抗-Fab抗体-包被的板捕获结 合的抗原来测量(参见，例如，Chen，Y.等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂 志)293(1999)865-881)。为了确定测定的条件，将
Figure BDA0002341415350000661
多孔 板(Thermo Scientific)用5μg/ml的在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的捕获抗 -Fab抗体(CappelLabs)包被过夜，并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白 蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100 pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的系列稀释物混合(例如，与在Presta， L.G.等，Cancer Res.(癌症研究)57(1997)4593-4599中的抗-VEGF抗体， Fab-12的评估一致)。接着，将目的Fab温育过夜；然而，温育可以持续 更长的阶段(例如，约65小时)从而确保达到平衡。随后，将混合物转移 到捕获板中以在室温进行温育(例如1小时)。接着，去除溶液，并将所述 板用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20
Figure BDA0002341415350000662
洗涤8次。当所述板 已经干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并将所述板在TOPCOUNT TMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择提供少 于或等于20％的最大结合的每种Fab的浓度用在竞争性结合测定中。
根据另一个实施方案，Kd是通过表面等离子体共振测定法使用
Figure BDA0002341415350000664
-2000或
Figure BDA0002341415350000663
-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片以～10个应答单位(RU)测量的。简而言之， 依照供应商的说明书，用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺 (EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片 (CM5，BIACORE Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(约 0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入，以获得约10个应答单位(RU)的偶 联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了进 行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨醇酯 20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释的Fab (0.78 nM至500 nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型 (
Figure BDA0002341415350000671
Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合缔合和解离传 感图计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率 koff/kon计算。参见例如Chen，Y.等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293 (1999)865-881。如果通过上文表面等离子体共振测定法，缔合速率超过 106M-1 s-1，那么缔合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列 SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯(stirred cuvette)的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7.2中 的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发 射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的或在本文报道的缀合物中的抗体是 抗体片段。抗体片段包括但不限于，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv， 和scFv片段及其缀合物，以及以下描述的其他片段，只要所述片段是二 价的且是双特异性的，或者组合形成二价双特异性抗体片段融合多肽即 可。对于特定抗体片段的综述，请参见Hudson，P.J.等，Nat.Med.(自然医学)9(2003)129-134。对于scFv片段的综述，参见，例如，Plueckthun， A.，在ThePharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学) 中，卷113，Rosenburg和Moore(编)，Springer-Verlag，New York(1994)， 第269-315页；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。 对于包含拯救受体(salvage receptor)结合表位残基并具有提高的体内半衰 期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见US 5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特 异性的。参见，例如，EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson，P.J.等， Nat.Med.(自然医学)9(2003)129-134；和Holliger，P.等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(美国国家科学院学报)90(1993)6444-6448。三抗体和四抗体 也描述于Hudson，P.J.等，Nat.Med.(自然医学)9(20039 129-134)中。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部 分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单 结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，US 6,248,516)。
抗体片段可以通过多种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水 解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生， 如本文所述。
嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体或在本文报道的缀合物中 的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体于例如US 4,816,567；及Morrison， S.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)81(1984) 6851-6855中描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如源自 小鼠、大鼠、仓鼠、兔或例如猴的非人类灵长类动物的可变区)及人恒定 区。在另一实例中，嵌合抗体是种类或亚类已经自亲本抗体的种类或亚类 发生变化的“种类转变”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体经人 源化以降低对人类的免疫原性，同时保持亲本非人抗体的特异性和亲和 力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVRs，例 如CDRs(或其部分)源自非人抗体，且FRs(或其部分)是源自人抗体序列。 人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中， 人源化抗体中的一些FR残基经来自非人抗体(例如HVR残基所源自的 抗体)的相应残基置换，例如以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法于例如Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633中评述，且进一步于例如Riechmann，I.等， Nature(自然)332(1988)323-329；Queen，C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA (美国国家科学院学报)86(1989)10029-10033；美国专利号5,821,337， 7,527,791，6,982,321和7,087,409；Kashmiri，S.V.等，Methods(方法)36 (2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan，E.A.，Mol.Immunol.(分 子免疫学)28(1991)489-498(描述“表面重整”)；Dall’Acqua，W.F.等， Methods(方法)36(2005)43-60(描述“FR重组(shuffling)”)；及36(2005) 43-60(方法)36(2005)61-68和Klimka，A.等，Br.J.Cancer(英国癌症杂 志)83(2000)252-260(描述FR重组(shuffling)的“导向选择”方法)中描述。
可用于人源化的人构架区包括，但不限于：使用“最佳拟合”法选择的 构架区(参见例如Sims，M.J.等，J.Immunol.(免疫学杂志)151(1993) 2296-2308；源自特定亚型的轻链或重链可变区的人抗体共有序列的构架 区(参见例如Carter，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学 报)89(1992)4285-4289；及Presta，L.G.等，J.Immunol.(免疫学杂志)151 (1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变)构架区或人生殖系构架区(参见例 如Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；及源自筛选FR文库的构架区(参见例如Baca，M.等，J.Biol.Chem.(生物化 学杂志)272(1997)10678-10684及Rosok，M.J.等，J.Biol.Chem.(生物化 学杂志)271(19969 22611-22618)。
人抗体
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体或在本文报道的缀合物中 的抗体是人抗体。可使用本领域中已知的多种技术来制备人抗体。人抗体 一般描述于van Dijk，M.A.和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Pharmacol. (当前药学观点)5(2001)368-374以及Lonberg，N.，Curr.Opin.Immunol. (当前免疫学观点)20(2008)450-459。
可通过向已经经过修饰因而响应抗原攻击刺激产生完整人抗体或具 有人可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原，来制备人抗体。这些动 物通常含有全部或一部分人免疫球蛋白基因座，其替代了内源免疫球蛋白 基因座，或存在于染色体外或随机整合于动物染色体内。在这样的转基因 小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已经失活。关于从转基因动物获得人 抗体的方法的综述，参见Lonberg，N.，Nat.Biotech.(自然生物技术)23(2005)1117-1125。也参见例如描述XENOMOUSETM技术的US 6,075,181 和US 6,150,584；描述
Figure BDA0002341415350000701
技术的US 5,770,429；描述K-M
Figure BDA0002341415350000702
技术的US 7,041,870，及描述
Figure BDA0002341415350000703
技术的US 2007/0061900。这些动物产生的完整抗体的人可变区可进一步修饰，例如 通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可通过基于杂交瘤的方法制得。已经描述了用于产生人单 克隆抗体的人骨髓瘤及小鼠-人融合骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor， D.，J.Immunol.(免疫学杂志)133(1984)3001-3005；Brodeur，B.R.等， Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications(单克隆抗体 产生技术及应用)，Marcel Dekker，Inc.，New York(1987)，第51-63页； 和Boerner，P.等，J.Immunol.(免疫学杂志)147(1991)86-95)。通过人B 细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在Li，J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103 (2006)3557-3562中描述。其他方法包括例如美国专利号7,189,826(描述 由杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)及Ni，J.，Xiandai Mianyixue 26 (2006)265-268(描述人-人杂交瘤)中所述的那些方法。人杂交瘤技术 (Trioma技术)也于Vollmers，H.P.和Brandlein，S.，Histology and Histopathology(组织学和组织病理学)20(2005)927-937，及Vollmers，H.P. 和Brandlein，S.，Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology(实验和临床药学方法和发现)27(2005)185-191中描述。
也可通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列产 生人抗体。随后可将这些可变结构域序列与所需人恒定结构域组合。下文 描述自抗体文库选择人抗体的技术。
源自文库的抗体
可通过在组合文库中筛选具有一种或多种所需活性的抗体来分离本 发明的抗体或本文报道的缀合物中的抗体。例如，本领域中已知多种用于 产生噬菌体展示文库并且在这些文库中筛选具有所需结合特征的抗体的 方法。这些方法于例如Hoogenboom，H.R.等，Methods in Molecular Biology (分子生物学方法)178(2001)1-37中评述，并且进一步于例如McCafferty， J.等，Nature(自然)348(1990)552-554；Clackson，T.等，Nature(自然)352 (1991)624-628；Marks，J.D.等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222(1992) 581-597；Marks，J.D.和Bradbury，A.，Methods in Molecular Biology(分 子生物学方法)248(2003)161-175；Sidhu，S.S.等，J.Mol.Biol.(分子生 物学杂志)338(2004)299-310；Lee，C.V.等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂 志)340(2004)1073-1093；Fellouse，F.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101 (2004)12467-12472；和Lee，C.V.等，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂 志)284(2004)119-132中描述。
在某些噬菌体展示方法中，VH及VL基因库(repertoire)是通过聚合 酶链式反应(PCR)分别克隆并且随机重组于噬菌体文库中，随后可如 Winter，G.等，Ann.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)12(1994)433-455中 所述在其中筛选抗原-结合噬菌体。噬菌体通常展示抗体片段，如单链 Fv(scFv)片段或Fab片段。来自被免疫来源的文库无需构建杂交瘤即可提 供针对免疫原的高亲和力抗体。或者，天然库可经克隆(例如，来自人)以 在无任何免疫的情况下提供针对多种非自体抗原以及自体抗原的抗体单 一来源，如Griffiths，A.D.等，EMBO J.12(1993)725-734所述。最后， 还可以通过从干细胞克隆未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列 的PCR引物来编码高度可变的CDR3区，并且实现体外重排来合成制备 天然文库，如Hoogenboom，H.R.和Winter，G.，J.Mol.Biol.(分子生物 学杂志)227(1992)381-388所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开物包 括例如：美国专利号5,750,373，及美国专利公开号2005/0079574， 2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764， 2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为本文的人抗体或人抗体 片段。
抗体片段
上文列出的抗体和抗体片段可以以多种方式组合，以产生不同的抗 体形式。
例如，一个或多个scFv抗体片段可以融合在完整抗体的一条或多条 多肽链的C-端。特别地，scFv抗体片段可以融合到每个重链C-端或每个 轻链C-端。
例如，一个或多个抗体Fab片段可以融合到完整抗体一条或多条多 肽链的C-端。特别地，抗体Fab片段可以融合到每个重链C-端或每个轻 链C-端。
例如，一个scFv和一个抗体Fab片段可以融合到抗体Fc区的N-端。
例如，一个scFv或抗体Fab片段可以融合到抗体Fc区的N-端，并 且一个scFv或抗体Fab片段可以融合到抗体Fc区另一条链的C-端。
多特异性抗体
已经开发了宽泛种类的重组抗体形式，例如，融合例如双特异性抗 体形式与单链结构域的四价双特异性抗体(参见，例如，Coloma，M.J.， 等，Nature Biotech 15(1997)159-163；WO 2001/077342；和Morrison， S.L.，Nature Biotech 25(2007)1233-1234)。
还已经开发了一些其他的形式，其中不再保留抗体核心结构e(IgA， IgD，IgE，IgG或IgM)，诸如双抗体、三抗体或四抗体、迷你抗体、一 些单链形式(scFv，Bis-scFv)，它们能够结合两种以上的抗原(Holliger， P.，等，Nature Biotech(自然生物技术)23(2005)1126-1136；Fischer， N.，Léger，O.，Pathobiology(病理生理学)74(2007)3-14；Shen，J.，等，Journal of Immunological Methods(免疫学方法杂志)318(2007) 65-74；Wu，C.，等，Nature Biotech.(自然生物技术)25(2007)1290-1297)。
所有这样的形式都使用接头，以使抗体核心(IgA，IgD，IgE，IgG或 IgM)融合到另一个结合蛋白(例如scFv)或以融合例如两个Fab片段或 scFvs(Fischer，N.和Léger，O.，Pathobiology(病理生理学)74(2007)3-14)。 必须记住的是，一种方式想要保留效应子功能，诸如例如，补体-依赖性 细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，其经由Fc受体结合通过 维持与天然存在的抗体的高度相似性而调节。
WO 2007/024715中报道了作为改造的多价多特异性结合蛋白的双重 可变结构域免疫球蛋白。US 6,897,044中报道了用于制备生物学活性抗体 二聚体的方法。US 7,129,330中报道了具有至少四个彼此通过肽接头连接 的可变结构域的多价FV抗体构建体。US2005/0079170报道了二聚体和 多聚体抗原结合结构。US 6,511,663中报道了三价或四价单特异性抗原结 合蛋白，其包含三个或四个彼此通过连接结构共价结合的Fab片段，所述蛋白不是天然免疫球蛋白。WO 2006/020258中报道了四价双特异性抗体， 其可以在原核细胞和真核细胞中有效地表达，并且可用于治疗和诊断方 法。从包含两种类型的多肽二聚体的混合物中与不通过至少一个链间二硫 键连接的二聚体分离或优先合成通过至少一个链间二硫键连接的二聚体 的方法报道在US 2005/0163782中。US 5,959,083中报道了双特异性四价 受体。WO 2001/077342中报道了改造的具有三个以上功能性抗原结合位 点的抗体。
WO 1997/001580中报道了多特异性和多价的抗原-结合多肽。 WO 1992/004053报道了同型缀合物，典型的由结合相同抗原决定簇的IgG 种类的单克隆抗体制备，其通过合成的交联共价连接。WO 1991/06305 中报道了具有高的针对抗原的抗体亲抗原性(avidity)的寡聚体单克隆抗 体，其中分泌具有两个以上缔合在一起的免疫球蛋白单体的寡聚体(典型 地IgG种类的)，以形成四价或六价IgG分子。US 6,350,860中报道了绵 羊来源的抗体和改造的抗体构建体，其可以用于治疗其中干扰素γ是致病 性的疾病。在US2005/0100543中报道了可靶向的构建体，其为双特异性 抗体的多价载体，即，可靶向构建体的每个分子可以作为两种以上的双特 异性抗体的载体。WO 1995/009917中报道了遗传改造的双特异性四价抗 体。在WO 2007/109254中，报道了由稳定的scFv组成或包含scFv的稳 定的结合分子。
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体或本文报道的缀合物中的 抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不 同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一种结合特异 性是针对半抗原而另一种是针对任何其他(非半抗原)抗原。双特异性抗 体还可以用于将细胞毒性剂定位在细胞中。双特异性抗体可制成全长抗体 或抗体片段形式。
制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两个 免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein，C.和Cuello，A.C.， Nature(自然)305(1983)537-540，WO 93/08829，及Traunecker，A.等， EMBO J.10(1991)3655-3659)，及“凸起-入-孔洞(knob-in-hole)”工程改造 (参见例如美国专利号5,731,168)。也可通过以下方法制得多特异性抗体： 工程改造用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电导引作用 (WO 2009/089004)；将两种以上抗体或片段交联(参见例如美国专利号 4,676,980，及Brennan，M.等，Science(科学)229(1985)81-83)；使用亮 氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见，例如Kostelny，S.A.等，J.Immunol. (免疫学杂志)148(1992)1547-1553)；使用“双抗体”技术来制得双特异性 抗体片段(参见，例如Holliger，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；及使用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如Gruber，M等， J.Immunol.(免疫学杂志)152(1994)5368-5374)；及如例如Tutt，A.等， J.Immunol.(免疫学杂志)147(1991)60-69中所述制备三特异性抗体。
在一个实施方案中，通过“凸起-进入-孔洞”技术改变双特异性抗体 重链的CH3结构域，所述技术以一些实例详细记述在例如WO 96/027011， WO 98/050431，Ridgway J.B.，等，Protein Eng.9(1996)617–621，Merchant， A.M.，等，Nat Biotechnol 16(1998)677-681中。以这种方法，两个CH3 结构域的相互作用表面被改变，从而增加包含这两个CH3结构域的两条 重链的异源二聚体化。(两条重链的)两个CH3结构域中的任一个可以是 “凸起”，而另一个是“孔洞”。二硫键的引入稳定所述异型二聚体 (Merchant，A.M，等，NatureBiotech 16(1998)677-681，Atwell，S.，等J. Mol.Biol.270(1997)26–35)并且增加产量。
在所有方面的一个实施方案中，双特异性抗体特征在于：
-一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域分别在包括抗 体CH3结构域之间的初始界面的界面处相接，
其中改变所述界面以促进双特异性抗体的形成，其中所述改变的特征 在于：
a)改变一条重链的CH3结构域，
由此，在与双特异性抗体内的另一条重链的CH3结构域的初始界面 相接的一条重链的CH3结构域的初始界面内，
氨基酸残基被替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在一条重 链的CH3结构域的界面内生成突起，该突起可以定位在另一条重链的 CH3结构域的界面内的凹洞中；
并且
b)改变另一条重链的CH3结构域，
由此，在与双特异性抗体内的第一CH3结构域的初始界面相接的第 二CH3结构域的初始界面内，
氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在第二 CH3结构域的界面内生成凹洞，第一CH3结构域的界面内的突起可以定 位在该凹洞中。
因此，在一个实施方案中，本文报道的抗体特征在于：
-全长抗体的第一重链的CH3结构域和全长抗体的第二重链的CH3 结构域分别在包括抗体CH3结构域之间的初始界面中的改变的界 面处相接，
其中i)在第一重链的CH3结构域中
氨基酸残基被替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在一条重 链的CH3结构域的界面内生成突起，该突起可以定位在另一条重链的 CH3结构域的界面内的凹洞中，
并且其中ii)在第二重链的CH3结构域中
氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在第二 CH3结构域的界面内生成凹洞，第一CH3结构域的界面内的突起可以定 位在该凹洞中。
在一个实施方案中，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨 酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)组成的组。
在一个实施方案中，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨 酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)组成的组。
在一个实施方案中，通过引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域相应 位置处的氨基酸，进一步改变这两个CH3结构域，从而可以形成两个CH3 结构域之间的二硫键。
在一个优选的实施方案中，所述多特异性抗体包含在“凸起链”第一 CH3结构域中的氨基酸T366W突变和在“孔洞链”第二CH3结构域中 的氨基酸T366S、L368A、Y407V突变。还可以使用在CH3结构域之间 的另外的链间二硫键(Merchant,A.M,等,Nature Biotech.(自然生物技术) 16(1998)677-681)，例如，通过向“孔洞链”CH3结构域中引入氨基酸 Y349C突变和向“凸起链”CH3结构域中引入氨基酸E356C突变或氨基 酸S354C突变。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个 中包含Y349C、T366W突变，在这两个CH3结构域中的另一个中包含 E356C、T366S、L368A、Y407V突变。在一个实施方案中，所述双特异 性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C、T366W突变和在这 两个CH3结构域中的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变(在 一个CH3结构域中的另外的Y349C突变与在另一个CH3结构域中的另 外的E356C或S354C突变形成链间二硫键)(按照Kabat的EU索引编号； (Kabat，E.A.，等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫 学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)))。也可以备选或者另外地使用EP 1 870 459 A1所述的其它凸起-入-孔洞技术。因此，所述双特异性抗体的另一个实例是在“凸起链”CH3结构域中的R409D、K370E突变和在“孔洞链” CH3结构域中的D399K、E357K突变(按照Kabat的EU索引编号；(Kabat， E.A.，等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学感兴趣 的蛋白的序列)，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health， Bethesda，MD(1991)))。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含在“凸起链”CH3结构域 中的T366W突变和在“孔洞链”CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V 突变，并且额外地，包含在“凸起链”CH3结构域中的R409D、K370E 突变和在“孔洞链”CH3结构域中的D399K、E357K突变。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的 一个中的Y349C、T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的 S354C、T366S、L368A、Y407V突变，或者所述双特异性抗体包含在两 个CH3结构域中的一个中的Y349C、T366W突变和在这两个CH3结构 域中的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变，并且额外地， 包含在“凸起链”CH3结构域中的R409D、K370E突变和在“孔洞链” CH3结构域中的D399K、E357K突变。CH3结构域中的所述凸起和孔洞 突变典型地用在SEQ ID NO:169，SEQ ID NO:170，SEQ ID NO:171，或 SEQ ID NO:172(人IgG1亚类同种异型(高加索人和美国黑人或突变体 L234A/L235A，和L234A/L235A/P329G)，SEQ ID NO:173，SEQ ID NO: 174，或SEQ ID NO:175(人IgG4亚类或突变体S228P，L235E，和 S228P/L235E/P329G)的人重链恒定区(编号按照Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版， Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的EU索引)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:169，SEQ ID NO:170，SEQID NO:171，或SEQ ID NO:172，SEQ ID NO:173，SEQ ID NO:174，或SEQ ID NO:175的人重链恒定区，还包括在CH3结构域中 的此类“凸起”和“孔洞”突变(例如，在两个CH3结构域中中的Y349C、 T366W突变和在这两个CH3结构域的另一个中的S354C、T366S、L368A、 Y407V突变)(编号按照Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service， National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的EU索引)。
本文还包括改造的具有三个以上功能性抗原结合位点的抗体，包括 “章鱼属(Octopus)抗体”(例如，参见US 2006/0025576)。
本文的抗体或片段还包括“双重作用Fab”或“DAF”，其包含一个 与半抗原和另一个不同的抗原结合的抗原结合位点(例如，参见 US 2008/0069820)。
本文的抗体或片段还包括WO 2009/080251，WO 2009/080252， WO 2009/080253，WO 2009/080254，WO 2010/112193，WO 2010/115589， WO 2010/136172，WO 2010/145792，和WO 2010/145793中所述的多特 异抗体。
在一个优选的实施方案中，所述多特异性抗体(其在每条重链中包含CH3结构域)在两个CH3结构域中的一个中包含氨基酸S354C、T366W 突变和在这两个CH3结构域中的另一个中包含氨基酸Y349C、T366S、 L368A、Y407V突变(在一个CH3结构域中的另外的氨基酸S354C突变 与在另一个CH3结构域中的另外的氨基酸Y349C突变形成链间二硫键) (按照Kabat编号)。
包括其他用于CH3-修饰以加强异型二聚体化的技术作为备选方案， 并且例如记述在WO 96/27011，WO 98/050431，EP 1870459，WO 2007/110205，WO 2007/147901，WO2009/089004，WO 2010/129304， WO 2011/90754，WO 2011/143545，WO 2012/058768，WO2013/157954， WO 2013/096291中。
在一个实施方案中，使用记述在EP 1 870 459A1中的异型二聚体化 方法。该方法是基于在两条重链之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨 基酸位置引入具有相反电荷的带电氨基酸的置换/突变。在一个优选的实 施方案中，所述多特异性抗体在(多特异性抗体的)第一重链的CH3结 构域中包含氨基酸R409D、K370E突变且在(多特异性抗体的)第二重链的第二CH3结构域中包含氨基酸D399K、E357K突变(按照Kabat编 号)。
在另一个实施方案中，所述多特异性抗体包含在“凸起链”CH3结构 域中的氨基酸T366W突变和在“孔洞链”CH3结构域中的氨基酸T366S、 L368A、Y407V突变，并且另外地，包含在“凸起链”CH3结构域中的 氨基酸R409D、K370E突变和在“孔洞链”CH3结构域中的氨基酸D399K、 E357K突变。
在另一个实施方案中，所述多特异性抗体在两个CH3结构域中的一 个中包含氨基酸S354C、T366W突变，且在这两个CH3结构域中的另一 个中包含氨基酸Y349C、T366S、L368A、Y407V突变，或者所述多特异 性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含氨基酸Y349C、T366W突变， 且在这两个CH3结构域中的另一个中包含氨基酸S354C、T366S、L368A、Y407V突变，并且，另外地，包含在“凸起链”CH3结构域中的氨基酸 R409D、K370E突变和在“孔洞链”CH3结构域中的氨基酸D399K、E357K 突变。
在一个实施方案中，使用WO2013/157953中所述的异型二聚体化方 法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366K突变，并且 第二CH3结构域包含氨基酸L351D突变。在另一个实施方案中，第一 CH3结构域还包含氨基酸L351K突变。在另一个实施方案中，第二CH3 结构域还包含选自Y349E、Y349D和L368E的氨基酸突变(优选L368E)。
在一个实施方案中，使用WO2012/058768中所述的异型二聚体化方 法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸L351Y、Y407A 突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸T366A、K409F突变。在另一个 实施方案中，第二CH3结构域在位置T411、D399、S400、F405、N390 或K392包含例如选自下述的另一个氨基酸突变：a)T411N，T411R， T411Q，T411K，T411D，T411E或T411W，b)D399R，D399W，D399Y 或D399K，c)S400E，S400D，S400R或S400K，F405I，F405M，F405T， F405S，F405V或F405W，N390R，N390K或N390D，K392V，K392M， K392R，K392L，K392F或K392E、在另一个实施方案中，第一CH3结 构域包含氨基酸L351Y、Y407A突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸 T366V、K409F突变。在另一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基 酸Y407A突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸T366A、K409F突变。 在另一个实施方案中，第二CH3结构域还包含氨基酸K392E、T411E、 D399R和S400R突变。
在一个实施方案中，使用WO2011/143545中所述的异型二聚体化方 法，例如，在选自由368和409组成的组的位置具有氨基酸修饰。
在一个实施方案中，使用WO2011/090762中所述的异型二聚体化方 法，其还使用上文所述的凸起-进入-孔洞技术。在一个实施方案中，第一 CH3结构域包含氨基酸T366W突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸 Y407A突变。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366Y突 变，并且第二CH3结构域包含氨基酸Y407T突变。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体是IgG2同种型，并且使用 WO2010/129304中所述的异型二聚体化方法。
在一个实施方案中，使用WO2009/089004中所述的异型二聚体化方 法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸残基K392或N392 被带负电荷的氨基酸(例如，谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)，优选K392D 或N392D)置换，并且第二CH3结构域包含氨基酸残基D399、E356、 D356或E357被带正电荷的氨基酸(例如，赖氨酸(K)或精氨酸(R)，优选 D399K，E356K，D356K或E357K，并且更优选D399K和E356K)置换。 在另一个实施方案中，第一CH3结构域还包含氨基酸残基K409或R409 被带负电荷的氨基酸(例如，谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)，优选K409D 或R409D)置换。在另一个实施方案中，第一CH3结构域还或备选地包 含氨基酸残基K439和/或K370被带负电荷的氨基酸(例如，谷氨酸(E)， 或天冬氨酸(D))置换。
在一个实施方案中，使用WO2007/147901中所述的异型二聚体化方 法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸K253E、D282K 和K322D突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸D239K、E240K和K292D 突变。
在一个实施方案中，使用WO2007/110205中所述的异型二聚体化方 法。
在一个实施方案中，双特异性抗体的第一结合特异性是针对半抗原， 并且第二结合特异性是针对非半抗原的抗原。在一个实施方案中，所述非 半抗原的抗原选自：白细胞标记，CD2，CD3，CD4，CD5，CD6，CD7， CD8，CD11a,b,c，CD13，CD14，CD18，CD19，CD22，CD23，CD27 及其配体，CD28及其配体B7.1，B7.2，B7.3，CD29及其配体，CD30 及其配体，CD40及其配体gp39，CD44，CD45和异构体，CD56，CD58， CD69，CD72，CTLA-4，LFA-1和TCR；组织相容性抗原，I或II类MHC， Lewis Y抗原，SLex，SLey，SLea，和SLeb；整联蛋白，VLA-1，VLA-2， VLA-3，VLA-4，VLA-5，VLA-6，αVβ3，和LFA-1，Mac-1，和pl50,95， αVβ1，gpIIbIIIa，αRβ3，α6β4，αVβ5，αVβ6，和αV 62 7；选择蛋白， L-选择蛋白，P-选择蛋白，和E-选择蛋白以及它们的反受体VCAM-1， ICAM-1，ICAM-2，和LFA-3；白介素，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5， IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，和IL-15； 白介素受体选自由下述组成的组：IL-1R，IL-2R，IL-3R，IL-4R，IL-5R， IL-6R，IL-7R，IL-8R，IL-9R，IL-10R，IL-11R，IL-12R，IL-13R，IL-14R， 和IL-15R；趋化因子选自由下述组成的组：PF4，RANTES，MIP1α，MCP1，NAP-2，Groα，Groβ，和IL-8；生长因子选自由下述组成的组：TNFα， TGFβ，TSH，VEGF/VPF，VEGFA，VEGFB，VEGF111，VEGF121， VEGF165，VEGF189，VEGF206，PTHrP，EGF家族，PDGF家族，内 皮缩血管肽，Fibrosin(FSF-1)，人层粘连蛋白，和胃泌素释放肽(GRP)， PLGF，HGH，HGHR；生长因子受体选自由下述组成的组：TNFαR， RGFβR，TSHR，VEGFR/VPFR，EGFR，PTHrPR，PDGFR家族，EPO-R， GCSF-R和其他造血受体；干扰素受体选自由下述组成的组：IFNCαR，IFNβR，和IFNλR；Ig及其受体选自由下述组成的组：IgE，FcγRI，和 FcγRII；肿瘤抗原选自由下述组成的组：her2-neu，粘蛋白，CEA和内 皮唾酸蛋白；变应原选自由下述组成的组：房尘螨抗原，lol p1(草)抗原， 和漆酚；并且多肽选自由下述组成的组：CMV糖蛋白B，H，和gCIII， HIV-1包膜糖蛋白，RSV包膜糖蛋白，HSV包膜糖蛋白，HPV包膜糖蛋 白，肝炎(Hepatitis)家族表面抗原；毒素选自由下述组成的组：假单胞 杆菌属内毒素和骨桥蛋白/尿桥蛋白，蛇毒，蜘蛛毒，和蜜蜂毒芋螺毒素 (conotoxin)；血液因子选自由下述组成的组：补体C3b，补体C4a，补 体C4b-9，Rh因子，纤维蛋白原，纤维蛋白，和髓磷脂相关的生长抑制剂(myelin associated growth inhibitor)；以及酶选自由下述组成的组胆固 醇酯转移多肽，结合膜的基质金属蛋白酶，和谷氨酸脱羧酶(GAD)。
抗体变体
在某些实施方案中，预期本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例 如，可能需要提高抗体的结合亲合力和/或其它生物学性质。通过将合适 的修饰引入编码抗体的核酸序列中，或通过肽合成来制备抗体的氨基酸 序列变体。所述修饰包括，例如，在抗体的氨基酸序列中缺失残基和/或 插入残基，和/或置换残基。进行缺失、插入和置换的任何组合从而得到 最终的构建体，条件是最终的构建体具有需要的特征，例如，抗原结合。
a)置换、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供据具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。 用于置换诱变的感兴趣的位点包括HVRs和FRs。可以向目的抗体中引入 氨基酸置换，并且筛选产物的需要的活性，例如，保留的/改善的抗原结 合，减少的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
表2.
Figure BDA0002341415350000821
氨基酸可以按照常见侧链的性质进行分组：
(1)疏水性:正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水性:Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性:Asp，Glu；
(4)碱性:His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基:Gly，Pro；
(6)芳族的:Trp，Tyr，Phe。
非保守性置换需要将这些类别中之一的成员交换为另一类。
一种类型的置换变体包括置换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一 个或多个高变区残基。一般地，关于进一步研究所选择的得到的一种或多 种变体相对于亲本抗体具有某些生物学特性的改进(例如，改善)(例如， 增加的亲和力、减少的免疫原性)，和/或将具有亲本抗体基本上保留的特 定生物学特性。一种示例性的置换变体是亲和力成熟的抗体，其可以便利 地产生，例如，使用基于噬菌体的亲和力成熟技术，诸如本文所述的那些 技术。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并且将变体抗体展示在噬 菌体上，并针对特定的生物学活性(例如，结合亲和力)进行筛选。
可以在HVRs中产生变化(例如置换)，例如，以改善抗体亲和性。 此类改变可以在HVR“热点”和/或SDRs(a-CDRs)中产生，“热点”即在 体成熟过程中以高频率进行突变的密码子所编码的残基(例如，参见 Chowdhury，P.S.，Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)，检测所得到的 变体VH或VL的结合亲和力。已经描述了通过构建和从二级文库再选 择的亲和力成熟，例如，在Hoogenboom，H.R.等，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)178(2002)1-37中。在亲和力成熟的一些实施 方案中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸定向的诱 变)中的任一种向选择进行成熟的可变基因中引入多样性。然后产生二级 文库。然后，筛选该文库，以鉴定具有所需要的亲和性的任何抗体变体。 另一种引入多样性的方法涉及HVR-定向方法，其中一些HVR残基(例 如，一次4-6个残基)被随机化。参与抗原结合的HVR残基可以被特异 性地鉴定出来，例如，使用丙氨酸扫面诱变或建模。特别地，通常靶向重 链CDR3和轻链CDR3。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以发生在一个或多个HVRs 内，只要所述变化基本上不减小抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在 HVRs中进行基本上不减小结合亲和力的保守变化(例如，本文提供的保 守置换)。此类变化可以在HVR“热点”或SDRs之外。在上文提供的变 体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR没有改变，或者包含不 超过一个、两个或三个氨基酸置换。
可用于鉴定抗体可以被靶向诱变的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫 描诱变”，如Cunningham，B.C.和Wells，J.A.，Science 244(1989)1081-1085 所述。在该方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电荷的残基，如 Arg，Asp，His，Lys，和Glu)，并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如， 丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。可以 在氨基酸位置引入其他的置换，来证明针对初始置换的功能敏感性。备选 地，或另外地，抗原-抗体的晶体结构鉴定抗体与抗原之间的接触点。此 类接触残基和相邻的残基可以被靶向或消除，作为置换的候选物。可以筛 选变体，以确定它们是否包含需要的特性。
氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端融合，长度范围在1个残基 到包含一百个以上残基的多肽，以及单一氨基酸残基或多个氨基酸残基 的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-端甲硫氨酰残基的抗体。抗 体分子的其它插入变体包括抗体的N-端或C-端与增加抗体的血清半衰期 的酶(例如，关于ADEPT)或多肽的融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，本文提供的抗体或包含在本文报道的缀合物中的 抗体被改变，以增加或减少抗体被糖基化的程度。通过改变氨基酸序列， 以产生或去除一个或多个糖基化位点，可以便利地实现向抗体中添加或删 除糖基化位点。
当抗体包含Fc区时，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物 细胞产生的天然抗体典型地包含分支的、双触角型(biantennary)的寡糖， 其通常通过N-连接与Fc区的CH2结构域的Asn297连接。例如，参见， Wright，A.和Morrison，S.L.，TIBTECH 15(1997)26-32。所述寡糖可以 包括多种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳 糖和唾液酸，以及连接到在双触角型寡糖结构的“干”中的GlcNAc上的 岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本发明的抗体中的寡糖的修饰，以 产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有缺少与Fc区连接(直接地或间接地连 接)的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，此类抗体中岩藻糖的 量可以为1％-80％、1％-65％、5％-65％或20％-40％。岩藻糖的量通过 相对于连接到Asn 297上的所有的糖结构的总和(例如，复合型、杂合型 和高甘露糖型结构)(通过MALDI-TOF质谱测量)，计算糖链中在Asn297 的所述岩藻糖的平均量，例如，如在WO 2008/077546中所述。Asn297 是指在Fc区域中位于约位置297的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)； 然而，由于抗体中的次要序列变化，Asn297也可以在定位在位置297上 游或下游的约±3个氨基酸处，即在位置294-300之间。此类岩藻糖基化 的变体可以具有改善的ADCC功能。例如，参见，US 2003/0157108；US2004/0093621。关于“去岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏型”抗体变体的 公布的生理包括：US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246； US 2003/0115614；US 2002/0164328；US2004/0093621；US 2004/0132140； US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119； WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742； WO 2002/031140；Okazaki，A.等，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249； Yamane-Ohnuki，N.等，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去 岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括蛋白岩藻糖基化缺陷型Lec13 CHO细胞(Ripka，J.等，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，特别是实施例11)，和敲除的细胞系， 诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除的CHO细胞(例如，参见 Yamane-Ohnuki，N.等，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO 2003/085107)。
进一步提供具有平分型寡糖的抗体变体，例如，其中，连接在抗体 Fc区的双触角型寡糖被GlcNAc平分。此类抗体变体可以具有减少的岩 藻糖基化和/或改善的ADCC功能。例如，此类抗体变体的实例记述在 WO 2003/011878；美国专利号6,602,684；和US 2005/0123546中。还提 供在连接到Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。所述抗体变体可以具有改善的CDC功能。例如，所述抗体变体记述在WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764中。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗 体的Fc区，由此产生Fc区变体。所述Fc区变体可以包含这样的人Fc 区序列(例如人IgG1,IgG2,IgG3或IgG4 Fc区)，所述Fc区序列在一个或 多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如置换)。
在某些实施方案中，本发明包括具有一些而非全部效应子功能的抗体 变体，这使其成为这样的应用的候选物：在所述应用中，抗体体内半衰期 是重要的，而某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害 的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定来证实CDC和/或ADCC活性 的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺少FcγR结合(由此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。调节 ADCC的主要的细胞，即NK细胞，仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc γRI，FcγRII和FcγRIII。Ravetch，J.V.和Kinet，J.P.，Annu.Rev.Immunol. 9(1991)457-492第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。评估目的 分子的ADCC活性的体外测定的非限制性的实例记述在美国专利号 5,500,362(例如，参见Hellstrom，I.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986) 7059-7063；和Hellstrom，I.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985) 1499-1502)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann，M.等，J.Exp.Med. 166(1987)1351-1361)中。备选地，可以使用非放射性测定(例如，参见 用于流式细胞计数的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc. Mountain View，CA)；和CytoTox
Figure BDA0002341415350000861
非放射性细胞毒性测定(Promega， Madison，WI))。可用于所述测定的效应子细胞包括外周血单核细胞 (PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或另外地，可以在体内评估目的 分子的ADCC活性，例如，在动物模型中评估，诸如Clynes，R.等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中公开的。也可以进行C1q结合测 定来证实抗体不能结合C1q，由此缺少CDC活性。例如，参见 WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了 评估补体激活，可以进行CDC测定(例如，参见Gazzano-Santoro，H. 等，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)202(1996)163-171；Cragg，M.S.等，Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg，M.S.和M.J.Glennie， Blood 103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法进行FcRn结 合和体内清除/半衰期确定(例如，参见Petkova，S.B.等，Int.Immunol.18 (2006:1759-1769))。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有一个或多个Fc区残基238， 265，269，270，297，327和329的置换的那些抗体(美国专利号6,737,056)。 此类Fc突变体包括在两个以上氨基酸位置265，269，270，297和327 具有置换的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和 297置换为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
记述了具有改善的或减少的与FcRs的结合的特定抗体变体。(例如， 参见，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，和Shields，R.L.等，J.Biol. Chem.276(2001)6591-6604)。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨 基酸置换的Fc区，例如，在Fc区位置298，333，和/或334的置换(残 基的EU编号)。
在一些实施方案中，可以在Fc区中进行改变，产生改变的(即，改 善的或减少的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如在美 国专利号6,194,551，WO 99/51642，和Idusogie，E.E.等，J.Immunol.164 (2000)4178-4184中所述。
在US 2005/0014934中描述了具有增加的半衰期并且对于新生儿Fc 受体(FcRn)具有改善的结合的抗体，所述新生儿Fc受体(FcRn)负责将母 体IgGs转移给胎儿(Guyer，R.L.等，J.Immunol.(免疫学杂志)117(1976) 587-593，和Kim，J.K.等，J.Immunol.(免疫学杂志)24(1994)2429-2434)。 这些抗体包含在其中具有一个或多个置换的Fc区，所述置换提高Fc区与 FcRn的结合。此类Fc变体包括在下述一个或多个Fc区残基处具有置换 的那些变体：238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317， 340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，例如， Fc区残基434的置换(美国专利号7,371,826)。
还参见Duncan，A.R.和Winter，G.，Nature 322(1988)738-740； US 5,648,260；US5,624,821；以及WO 94/29351，涉及Fc区变体的其他 实例。
在一个优选的实施方案中，抗体在两条重链中包含突变L234A， L235A和P329G(按照EU索引编号)。
d)半胱氨酸改造的抗体变体
在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸改造的抗体，例如，“硫 代MAbs”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在具体的 实施方案中，被置换的残基存在于抗体的可接近的位点。用半胱氨酸置换 这些残基，活性巯基基团因此被放置在抗体可接近的位点，并且可以用来 使所述抗体与其他结构部分缀合，如药物结构部分或接头-药物结构部分， 以产生免疫缀合物，如本文进一步所述。在某些实施方案中，下述残基中 的任意一个或多个可以被半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重 链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸改造的 抗体可以如例如美国专利号7,521,541所述产生。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以对本文提供的抗体进一步修饰以包含本领 域已知并且容易获得的另外的非蛋白质性的结构部分。适合抗体的衍生 作用的结构部分包括，但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制 性实例包括，但不限于：聚乙二醇(PEG),乙二醇/丙二醇的共聚物，羧 甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环,聚-1,3,6-三噁烷,乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(同聚物或随机共聚 物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇同聚物，聚环 氧丙烷/氧化乙烯共聚物，聚氧乙基化的多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇， 及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛可以在生产中具有 优势。聚合物可以是任意分子量的，并且可以是分支或不分支的。与抗 体连接的聚合物的数目可以变化，并且如果连接多于一个聚合物，它们 可以是相同或不同的分子。一般地，用于衍生化的聚合物的数目和/或类 型可以基于这样的考虑来确定，所述考虑包括，但不限于，待改善的抗 体的具体性质或功能，抗体衍生物是否将在限定的条件下用于治疗中 等。
在另一个实施方案中，提供抗体与可以通过暴露于射线选择性加热的 非蛋白样结构部分的缀合物。在一个实施方案中，所述非蛋白样结构部分 是碳纳米管(Kam，N.W.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005) 11600-11605)。射线可以是任意波长的，并且包括，但不限于，不伤害普 通学报的波长，但是其将所述非蛋白样结构部分加热至杀死邻近抗体-非 蛋白样结构部分的细胞的温度。
半抗原化的化合物
如果本身不是分子中的一种，本文报道的缀合物中的半抗原可以缀合 到治疗剂(药物)，细胞毒性剂(例如，毒素，如多柔比星或百日咳毒素)， 荧光团，如荧光染料，如荧光素或罗丹明，用于成像的螯合剂或放疗金属， 肽基或非肽基标记或检测标签，或改变清除的试剂，诸如聚乙二醇的多种 异构体，与第三成分结合的肽，或另一种碳水化合物或亲脂剂。所述缀合 物表示为半抗原化的化合物。缀合可以直接地或通过插入的接头进行。
a)治疗性结构部分
半抗原-药物缀合物(ADC，半抗原化的药物)的药物结构部分(D)可以 是具有细胞毒性或细胞生长抑制性作用的任意化合物、结构部分或基团。 药物结构部分包括：(i)化疗剂，其可以作用为微管抑制剂、有丝分裂抑 制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂；(ii)蛋白毒素，其可以酶促作 用；和(iii)放射性同位素。
示例性的药物结构部分包括，但不限于，美坦生(maytansinoid)， auristatin，多拉司他汀(dolastatin)，单端孢菌素(trichothecene)，CC1065， 加利车霉素(calicheamicin)和其他enediyne抗生素，紫杉烷(taxane)， 蒽环类抗生素(anthracycline)，和它们的立体异构体、isosters、类似物或 衍生物。
蛋白毒素包括白喉-A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链 (来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、(Vitetta等(1987)Science，238:1098)、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根 毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(α-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、 香石竹毒蛋白(dianthin proteins)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白 (PAPI，PAPII，和PAP-5)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树 毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis) 抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素 (restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢 菌素(tricothecenes)(WO 93/21232)。
治疗性的放射性同位素包括32P，33P，90Y，125I，131I，131In， 153Sm，186Re，188Re，211At，212B，212Pb，和Lu的放射性同位素。
放射性同位素或其他标记可以以已知的方式结合(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57；"Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy(免疫闪烁成像中的单克隆抗体)"Chatal，CRC Press 1989)。碳-14-标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合到复合物上的示例性的螯合剂(WO 94/11026)。
b)标记
半抗原化的化合物可以是半抗原化的标记。可以使用任何能够共价连 接到半抗原上的标记结构部分(例如，参见Singh等(2002)Anal.Biochem. 304:147-15；Harlow E.和Lane，D.(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册)，ColdSprings Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，N.Y.；Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification(用于蛋白修饰的化学试剂)，第2版.CRCPress，Boca Raton，Fla.)。所述标记可以起作用，以：(i)提供可检测的信号；(ii)与 第二标记相互作用，以改变由第一或第二标记提供的可检测信号，例如， 以产生FRET(荧光共振能量转移)；(iii)影响移动性，例如，电泳移动 性或细胞渗透性，电荷，疏水性，形状或气体物理参数，或(iv)提供捕获 结构部分，例如，以调节离子复合。
包含本文报道的半抗原化的标记的缀合物可以用于诊断测定，例如， 用于检测特定细胞、组织或血清中目的抗原的表达。对于诊断应用，将使 用这样的双特异性抗体：其中第一结合特异性结合靶标，第二结合特异性 结合半抗原化的标记。半抗原典型地用可检测的结构部分标记。多种标记 是多用的，其通常可以分成下述种类：
(a)放射性同位素(放射性核素)，诸如3H，11C，14C，18F，32P， 35S，64Cu，68Gn，86Y，89Zr，99TC，111In，123I，124I，125I，131I， 133Xe，177Lu，211At，或131Bi。放射性同位素标记的缀合物可用于靶 向受体的成像实验。可以使用Current Protocols inImmunology(现代免疫 学方法)，(1991)卷1和2，Coligen等，Ed.Wiley-Interscience，NewYork， N.Y.，Pubs所述的技术，用配体试剂标记抗原(半抗原)，所述配体试剂 结合、螯合或另外复合放射性同位素金属。可以复合金属离子的螯合配体 包括DOTA，DOTP，DOTMA，DTPA和TETA(Macrocyclics，Dallas， Tex.)。放射性核素可以通过与本文报道的复合物复合而被靶向(Wu等， Nature Biotechnology 23(9)(2005)1137-1146)。通过检测并定量复合物或 相对应的治疗性抗体在肿瘤组织中的进展性积聚，使用放射性核素标记的 复合物的受体靶向成像能够提供途径激活的标记(Albert等(1998)Bioorg. Med.Chem.Lett.8:1207-1210)。
适合用作成像实验的标记的金属螯合复合物(US 2010/0111856；US 5,342,606；US 5,428,155；US 5,316,757；US 5,480,990；US 5,462,725； US 5,428,139；US 5,385,893；US 5,739,294；US 5,750,660；US 5,834,456； Hnatowich等，J.Immunol.Methods 65(1983)147-157；Meares等，Anal. Biochem.142(1984)68-78；Mirzadeh等，BioconjugateChem.1(1990) 59-65；Meares等，J.Cancer(1990)，Suppl.10:21-26；Izard等，Bioconjugate Chem.3(1992)346-350；Nikula等，Nucl.Med.Biol.22(1995)387-90；Camera等，Nucl.Med.Biol.20(1993)955-62；Kukis等，J.Nucl.Med.39 (1998)2105-2110；Verel等，J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670；Camera 等，J.Nucl.Med.21(1994)640-646；Ruegg等，Cancer Res.50(1990) 4221-4226；Verel等，J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670；Lee等，Cancer Res. 61(2001)4474-4482；Mitchell，等，J.Nucl.Med.44(2003)1105-1112；Kobayashi等Bioconjugate Chem.10(1999)103-111；Miederer等，J.Nucl. Med.45(2004)129-137；DeNardo等，Clinical Cancer Research 4(1998) 2483-90；Blend等，CancerBiotherapy&Radiopharmaceuticals 18(2003) 355-363；Nikula等J.Nucl.Med.40(1999)166-76；Kobayashi等，J.Nucl. Med.39(1998)829-36；Mardirossian等，Nucl.Med.Biol.20(1993)65-74； Roselli等，Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals，14(1999)209-20)。
(b)荧光标记，诸如稀土螯合剂(铕螯合剂)，荧光素类型，包括FITC， 5-羧基荧光素，6-羧基荧光素；罗丹明类型，包括TAMRA；单酰；丽丝 胺(Lissamine)；cyanines；藻红蛋白(phycoerythrins)；Texas Red；和它 们的类似物。例如，荧光标记可以使用CurrentProtocols in Immunology (现代免疫学方法)(同前所述)中公开的技术缀合到抗原(半抗原)上。 荧光染料和荧光标记试剂包括可从Invitrogen/Molecular Probes(Eugene，Oregon，USA)和Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，Ill.)商购获得的那 些。
检测标记，诸如荧光染料和化学发光染料(Briggs等"Synthesis ofFunctionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids(功能性荧光染料的合成以及它们与胺和氨基酸的偶联),"J.Chem. Soc.，Perkin-Trans.1(1997)1051-1058)提供可检测的信号，并且通常适 用于标记，特别是具有下述特性：(i)标记的缀合物应该产生非常高的具 有低背景的信号，从而可以在不含细胞的和基于细胞的测定中灵敏地检测 少量的缀合物；和(ii)标记的缀合物应该是光稳定的，从而可以观察、监 测和记录荧光信号，而没有显著的照片漂白(photo bleaching)。对于涉及 标记的缀合物与膜或细胞表面、尤其是活细胞的细胞表面结合的应用，所 述标记应该(iii)具有良好的水溶性，从而获得有效的缀合物浓度和检测灵 敏性，并且(iv)对活细胞无毒，从而不破坏细胞的正常代谢过程或引起不 成熟的细胞的死亡。
(c)多种酶-底物标记是可获得的或公开的(例如，参见 US 4,275,149)。酶通常催化可以使用多种技术测量的产色底物的化学变 化。例如，酶可以催化底物的颜色变化，其可以通过分光光度计测量。备 选地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。化学发光底物经过化学反应变 成电子激发的，然后可以发射能够检测的光(例如，使用化学发光计)或 向荧光接受体提供能量。酶标记的实例包括荧光素酶(例如，萤火虫荧光 素酶和细菌荧光素酶；US 4,737,456)，荧光素，2,3-二氢酞嗪二酮，苹果 酸脱氢酶，脲酶，过氧化物酶，如辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)， (3-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶， 半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化物(诸如尿酸酶和黄嘌 呤氧化酶)，乳过氧化物酶，微过氧化物酶等。使酶缀合到多肽上的棘手 记述在O'Sullivan等"Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for usein Enzyme Immunoassay(制备用于酶免疫测定的酶-抗 体缀合物的方法)"，在Methods inEnzym.(酶学方法)(J.Langone&IT Van Vunakis编)，Academic Press，New York，73(1981)147-166中。
例如，酶-底物组合的实例(US 4,275,149；US 4,318,980)包括：
(i)辣根过氧化物酶(HRP)与作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢 酶氧化染料前体(例如，原次苯基二胺(orthophenylene diamine)(OPD) 或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为产色底物的对-硝基苯基磷酸；和
(iii)(3-D-半乳糖苷酶((3-D-Gal)与产色底物(例如，对-硝基苯基-(3-D- 半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-(3-D-半乳糖苷酶。
本文报道的标记的缀合物可以用在任何已知的测定方法中，诸如 ELISA，竞争性结合测定，直接或间接的夹心测定，和免疫沉淀测定(Zola， Monoclonal Antibodies:AManual of Techniques(单克隆抗体：技术手册) (1987)第147-158页，CRC Press，Inc.)。
本文报道的标记的缀合物可通过多种生物医学和分子成像方法和技 术用作成像生物标记和探针，诸如：(i)MRI(磁共振成像)；(ii)MicroCT(计 算机断层扫描)；(iii)SPECT(单光子发射计算体层摄影)；(iv)PET(正电 子成象术)Tinianow，J.等NuclearMedicine and Biology(核医学和生物 学)，37(3)(2010)289-297；Chen等，BioconjugateChem.15(2004)41-49； US 2010/0111856(v)生物发光；(vi)荧光；和(vii)超声。免疫闪烁成像 是一种成像方法，其中将用放射活性的物质标记的缀合物施用给动物或人 患者，并且拍摄所述聚合物定位的身体部位的图像(US 6,528,624)。成像 生物标记可以客观性地测量，并且作为生产生物学过程、致病性过程或针 对治疗性干预的药理学反应的指示剂进行评价。生物标记可以是几种类型 的：0型标记是天然的疾病历史标记，并且在纵向上与已知的临床指标相 关，例如，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)中滑膜炎(synovialinflammation)的MRI评估；I型标记捕获与作用机制相关的干预的作用， 即使所述机制可能与临床结果不相关；II型标记作用为替代终点，其中生 物标记中的变化、来自生物标记的信号预测临床益处，从而“验证”靶向 反应，诸如通过CT测量的类风湿性关节炎中的骨质侵蚀。成像生物标记 由此可以提供关于下述的药效(PD)治疗信息：(i)靶蛋白的表达，(ii)治 疗剂与靶蛋白的结合，即，选择性地结合，和(iii)清除和半衰期药物代谢 动力学数据。相对于基于实验室的生物标记，体内成像生物标记的优点包 括：非侵入性治疗，可量化，整个身体评估，重复给药和评估，即，多个 时间点，和从临床前(小动物)到临床(人)结果的潜在可转移的作用。 对于一些应用，生物成像替代了临床前研究中的动物实验或者使临床前研 究中的动物实验次数最少化。
肽标记方法是公知的。参见Haugland(2003)Molecular Probes Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals(荧光探针和研究 化学试剂的分子探针手册)，Molecular Probes，Inc.；Brinkley(1992) Bioconjugate Chem.3:2；Garman，(1997)Non-Radioactive Labeling:A Practical Approach(非放射性标记：实用方法)，AcademicPress，London； Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2；Glazer等Chemical Modificationof Proteins(蛋白的化学修饰).Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology(生物化学和分子生物学实验室技术)(T.S.Work和E. Work编)American Elsevier Publishing Co.，New York；Lundblad，R.L.和 Noyes，C.M.(1984)Chemical Reagents for Protein Modification(用于蛋白 修饰的化学试剂)，卷I和II，CRC Press，New York；Pfleiderer，G.(1985) "Chemical Modification of Proteins(蛋白的化学修饰)"，Modern Methods in Protein Chemistry，H.Tschesche编，WalterDeGruyter，Berlin and New York；和Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugationand Cross-linking (蛋白缀合和交联的化学)，CRC Press，Boca Raton，Fla.)； DeLeon-Rodriguez等，Chem.Eur.J.10(2004)1149-1155；Lewis等，Bioconjugate Chem.12(2001)320-324；Li等，Bioconjugate Chem.13(2002) 110-115；Mier等Bioconjugate Chem.16(2005)240-237。
抗体缀合物
如果本身不是分子中的一种，本文报道的缀合物中的抗体可以进一步 缀合到治疗剂(药物)，细胞毒性剂(例如，毒素，如多柔比星或百日咳 毒素)，荧光团，如荧光染料，如荧光素或罗丹明，用于成像的螯合剂或 放疗金属，肽基或非肽基标记或检测标签，或改变清除的试剂，诸如聚乙 二醇的多种异构体，与第三成分结合的肽，或另一种碳水化合物或亲脂剂。
免疫缀合物
本发明还提供包含本文报道的抗体的或本文报道的缀合物的免疫缀 合物，本文报道的抗体的或本文报道的缀合物缀合到一种或多种细胞毒性 剂，诸如化疗剂或药物，生长抑制剂，毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真 菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素。
在一个实施方案中，免疫缀合物是一种抗体-药物缀合物(ADC)，其 中抗体缀合到一种或多种药物上，包括但不限于，美坦生(参见 US 5,208,020，US 5,416,064和EP 0 425235B1)；auristatin，诸如单甲基 auristatin(monomethyl auristatin)药物结构部分DE和DF(MMAE和 MMAF)(参见US 5,635,483，US 5,780,588和US 7,498,298)；多拉司他汀； 加利车霉素或它们的衍生物(参见US 5,712,374，US 5,714,586， US 5,739,116，US 5,767,285，US 5,770,701，US 5,770,710，US 5,773,001， 和US 5,877,296；Hinman，L.M.等，Cancer Res.53(1993)3336-3342；以 及Lode，H.N.等，Cancer Res.58(1998)2925-2928)；蒽环类抗生素，诸 如道诺霉素或多柔比星(参见Kratz，F.等，Curr.Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey，S.C.等，Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358-362； Torgov，M.Y.等，Bioconjug.Chem.16(2005)717-721；Nagy，A.等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834；Dubowchik，G.M.等，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12(2002)1529-1532；King，H.D.等，J.Med.Chem.45 (2002)4336-4343；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷，如多西紫杉醇(docetaxel)，紫杉酚，larotaxel，tesetaxel，和ortataxel； 单端孢菌素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含缀合到酶活性毒素或其片段上 的本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括，但不限于，白喉-A 链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖 麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、 油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)、苦 瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒蛋白、丝 林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含缀合到放射性原子上形成放射 性缀合物的本文所述的抗体或本文报道的复合物。多种放射性同位素可用 于制备放射性缀合物。实例包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153， Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时， 体可以包含用于闪烁研究的放射性原子，例如，TC99m或I123，或用于核 磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，同样如碘-123， 碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
抗体与细胞毒性剂的缀合物可以使用多种双官能蛋白偶联剂制备，诸 如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基 -4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷 (iminothiolane)(IT)，亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如二甲基己二亚酰胺 盐酸化物(dimethyl adipimidate HCl))，活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰 亚胺基酯)，醛类(诸如戊二醛)，双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基) 己二胺)，双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)，二异氰酸酯(诸 如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。 例如，可如Vitetta，E.S.等，Science(科学)238(1987)1098-1104中所述 制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙 基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯 合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞毒性剂在细胞内释放的“可 裂解的接头”。例如，可以使用酸敏感性结构、肽酶敏感性结构、光敏感 性接头、二甲基接头或包含二硫化物的接头(Chari，R.V.等，Cancer Res. (癌症研究)52(1992)127-131；美国专利号5,208,020)。
本文明确包括的免疫缀合物或ADCs，不限于此类使用交联剂制备的 缀合物，所述交联剂包括，但不限于，可商购获得的(例如，购自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)BMPS，EMCS，GMBS，HBVS， LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，磺基-EMCS，磺基-GMBS，磺基-KMUS，磺基-MBS，磺基-SIAB，磺基 -SMCC，和磺基-SMPB，和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
接头
术语“接头”表示可以用于使抗原(例如半抗原)与其他结构部分(如 可检测的标记或药物)缀合(连接)的双官能或多官能结构部分。使用具 有结合药物、抗原(半抗原)和抗-半抗原抗体的反应性官能性的接头， 可以便利地制备抗原(半抗原)缀合物。
在一个实施方案中，接头具有活性位点，其具有与抗-半抗原抗体上 存在的亲核基团反应的亲电子基团。例如，抗体上的半胱氨酸巯基与接头 上的亲电子基团反应，并且与接头形成共价键。可用的亲电子基团包括， 但不限于，另一个巯基、马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团(例如，参见 Klussman等，Bioconjugate Chemistry(生物缀合物化学)15(4)(2004) 765-773中第766页的缀合方法)。
巯基反应官能团的实例包括，但不限于，硫醇，马来酰亚胺，α-卤 代乙酰基，活性酯，如琥珀酰亚胺酯，4-硝基苯基酯，五氟苯基酯，四氟 苯基酯，酸酐，酰基氯，磺酰氯，异氰酸酯和异硫氰酸酯。
接头可以包含连接抗原(半抗原)与有效负载物的氨基酸残基。所述 氨基酸残基可以形成二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、 十肽、十一肽或十二肽单位。氨基酸残基包括天然存在的那些，以及非天 然存在的氨基酸类似物，诸如例如，瓜氨酸或β-氨基酸，诸如例如，β- 丙氨酸，或ω-氨基酸，诸如4-氨基-丁酸。
在另一个实施方案中，接头具有活性官能团，所述活性官能团具有与 抗原(半抗原)或抗体(抗-半抗原抗体)上存在的亲电子基团反应的亲核 基团。可用的亲核基团包括，但不限于，醛和酮羰基。接头的亲核基团的 杂原子可以与半抗原或抗体上的亲电子基团反应，并且形成针对抗原(半 抗原)或抗体的共价键。接头上可用的亲核基团包括，但不限于，酰肼、 肟、氨基、肼、缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯和芳基酰肼基 团。抗原(半抗原)上的亲电子基团提供用于连接接头的便利位点。
典型地，可以通过形成两个以上氨基酸和/或肽片段之间的肽键而制 备肽型接头。例如，按照肽化学领域公知的液相合成方法(E.Schroder和 K.Lubke"The Peptides(肽)"，卷1(1965)76-136，Academic Press)，可 以制备所述肽键。
在另一个实施方案中，接头可以被调节溶解性或反应性的基团置换。 例如，带电荷的取代基，如磺酸基(SO3 -)或铵，或聚合物，如PEG，可以 增加试剂的水溶性，并且促进接头试剂与抗原(半抗原)或药物结构部分的 偶联反应，或者取决于所用的合成途径而促进偶联反应。
本文报道的包含药物或标记的缀合物明确包括，但不限于，用下述接 头试剂制备的复合物：BMPEO，BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC， MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，磺基-EMCS， 磺基-GMBS，磺基-KMUS，磺基-MBS，磺基-SIAB，磺基-SMCC和磺基 -SMPB，和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，并且包括二- 马来酰亚胺试剂:DTME，BMB，BMDB，BMH，BMOE，BM(PEO)3， 和BM(PEO)4，其可从Pierce Biotechnology，Inc.商购获得。二-马来酰亚 胺试剂允许例如巯基基团按先后或同时的方式连接到包含巯基的药物结构部分、标记或接头中间体上。除马来酰亚胺之外，可与例如巯基基团反 应的其他官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯吡啶、二硫化物、吡啶基 二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
示例性的接头包括具有马来酰亚胺框架和对-氨基苯甲基氨甲酰 (PAB)自动切除的间隔体(self-immolative spacer)的缬氨酸-瓜氨酸(val-cit 或vc)二肽接头试剂，和具有马来酰亚胺框架单位和对-氨基苯甲基自动切 除的间隔体的phe-lys(Mtr)二肽接头试剂。
半胱氨酸巯基基团是亲核性的，并且能够与接头试剂和半抗原化的化 合物上的亲电子基团形成共价键，所述接头试剂和半抗原化的化合物包 括：(i)活性酯，如NHS酯，HOBt酯，卤代甲酸酯，和酰基卤；(ii)烷 基和苄基卤，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛，酮，羧基，和马来酰亚胺基团； 和(iv)二硫化物，包括吡啶基二硫化物，通过硫化物交换。半抗原化的化 合物上的亲核基团包括，但不限于：胺，巯基，羟基，酰肼，肟，肼，缩 氨基硫脲，肼羧酸酯和芳基酰肼基团，它们能够与接头结构部分和接头试 剂上的亲电子基团反应形成共价键。
III.核酸
编码本文报道的或包含在本文报道的缀合物中的抗体的氨基酸序列 变体的DNA可以通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括，但不 限于，通过定点(或寡核苷酸-介导的)诱变、PCR诱变和早期制备的编 码多肽的DNA的盒诱变而制备。重组抗体的变体也可以通过限制性片段 化操作或通过使用合成的寡核苷酸的重叠延伸PCR而构建。诱变引物编 码一个或多个半胱氨酸密码子替代物。可以使用标准的诱变技术产生编码 所述修饰改造的抗体的DNA。通用的指导可见于Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989；和Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学方法)，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，N.Y.，1993。
IV.表达和纯化
抗体可以使用例如在美国专利号4,816,567中描述的重组方法和组合 物产生。在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗体的分离的核酸。 该核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序 列(例如抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含该核酸 的一个或多个载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含该 核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，用下述 各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸 序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述 核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核 酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真 核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20 细胞)。在一个实施方案中，提供了制备本文报道的抗体的方法，其中所 述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的 宿主细胞(如上文所提供的)，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养 基)回收所述抗体。
为了重组产生本文报道的抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗 体)的核酸，并插入到一个或多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆 和/或表达。此类核酸可以使用常规方法容易地分离和测序(例如通过使用 能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。
用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原 核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc 效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，US 5,648,237，5,789,199和US 5,840,523 。(还参见Charlton，K.A.，在:Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)中，卷248，Lo，B.K.C.(编)， Humana Press，Totowa，NJ(2003)，第245-254页，描述抗体片段在大肠 杆菌(E.coli)中的表达)。在表达后，抗体可以以可溶级分与细菌细胞糊 状物分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物以外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母，也是用于 编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基 化途径已经进行“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗 体。参见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech.(自然生物技术)22(2004) 1409-1414；和Li，H.等，Nat.Biotech.(自然生物技术)24(2006)210-215。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物 和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了 许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)细胞。
还可利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如，美国专利号5,959,177， 6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(其描述了在转基因植物中 产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于 悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用 SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如 Graham，F.L.等，J.Gen Virol.(遗传病毒学杂志)36(1977)59-74中所描述 的)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如在 Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的)；猴肾细胞(CV1)； 非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)； 布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞 (Hep G2)；小鼠乳瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather，J.P.等， Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所描述的；MRC5细胞；和FS4 细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包 括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家 科学院学报)77(1980)4216-4220)；并且骨髓瘤细胞系，如Y0，NS0和 Sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如 Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)， 卷248，Lo，B.K.C.(编)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，第255-268 页)。
V.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文报道的任何抗体，尤其是双特异性抗体和 缀合物，可以用于检测一种或多种靶分子在生物样品中的存在。术语“检 测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在一个实施方案中，生物样品 包含细胞或组织。
在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的本文报道的抗体或 缀合物。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文报道的抗 体或缀合物在允许所述抗体或缀合物与靶标结合的条件下接触，并检测在 所述抗体或缀合物与靶标之间是否形成复合物。该方法可以是体外或体内 方法。
在某些实施方案中，提供标记的抗体或缀合物。标记包括但不限于， 被直接检测的标记或结构部分(如荧光标记，发色团标记，电子致密标记， 化学发光标记，和放射性标记)，以及被间接检测的结构部分，如酶或配 体，例如，通过酶促反应或分子相互作用来间接检测。示例性标记包括但 不限于，放射性同位素32P，14C，125I，3H，和131I，荧光团如稀土螯合物 或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮 (umbelliferone)，荧光素酶，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(US 4,737,456)，荧光素(luciferin)，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)， 碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，例如， 葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如 尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，加上利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HRP， 乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/抗生物素蛋白， 自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。
VI.药物制剂
本文报道的抗体或缀合物的药物制剂通过将具有所需纯度的所述抗 体或缀合物与一种或多种任选的药用载体(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编)(1980))混合来制备，制成冻干制剂或水 溶液的形式。药用载体通常在所用剂量及浓度对接受者无毒，并且包括但 不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗 坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄铵；氯化六羟季铵； 氯苄烷铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基 苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇； 及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、 明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸，如 甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和 其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，例如 蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子，如钠；金属复合体(例 如Zn-蛋白质复合体)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文 中的示例性药用载体还包括间质药物分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如 rhuPH20(
Figure BDA0002341415350001021
Baxter International，Inc.)。某些示例性sHASEGPs 及使用方法，包括rhuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186及2006/0104968中。在一方面中，sHASEGP与一种或多种其他葡糖胺聚糖 酶例如软骨素酶组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于US 6,267,958。水性抗体制剂包括US 6,171,586和WO 2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙 酸盐缓冲剂。
本文的制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗 的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活 性成分。所述活性成分以对于想要的目的有效的量合适地组合存在。
可以将活性成分截留于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的 微胶囊中，例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚-(甲基丙烯酸甲 酯)微胶囊中、胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、 纳米颗粒及纳米胶囊)中或粗滴乳状液中。这些技术披露于Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编)(1980)中。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体或缀合物的固 体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微胶囊的 形式。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以通过例如经由无菌滤膜过 滤容易地实现无菌。
VII.治疗方法和组合物
本文报道的任何抗体或缀合物都可以用于治疗方法。
在一方面中，提供用作药物的本文报道的抗体或缀合物。在另一些 方面中，提供用于治疗疾病的本文报道的抗体或缀合物。在某些实施方 案中，提供用于治疗方法的本文报道的抗体或缀合物。在某些实施方案 中，本发明提供本文报道的抗体或缀合物，所述抗体或缀合物用于治疗 个体的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文报道的抗体 或缀合物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有 效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。根据任何以上实施方 案的“个体”可以是人。
在其他方面中，本发明提供本文报道的抗体或缀合物在生产或制备 药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗疾病。在另一个 实施方案中，所述药物用于治疗疾病的方法，所述方法包括向患有疾病 的个体施用有效量的所述药物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包 括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。 根据任何以上实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面中，本发明提供一种用于治疗疾病的方法。在一个实施方 案中，所述方法包括向患有所述疾病的个体施用有效量的本文报道的抗体 或缀合物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有 效量的至少一种另外的治疗剂，如下文所述。根据任何以上实施方案的“个 体”可以是人。
在另一方面中，本发明提供药物制剂，所述药物制剂包含本文报道 的任何抗体或缀合物，例如，用于任何以上的治疗方法。在一个实施方 案中，所述药物制剂包含本文报道的任何抗体或缀合物和药用载体。在 另一个实施方案中，药物制剂包含本文报道的任何抗体或缀合物和至少 一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。
在治疗中，本文报道的抗体和缀合物可以单独使用或与其他试剂组 合使用。例如，本文报道的抗体或缀合物可以与至少一种另外的治疗剂 一起共同给药。
这样的上文所述的组合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包 含在相同或分开的制剂中)和分别给药，其中，本发明的抗体的给药可以 发生在另外的治疗剂和/或辅药的给药之前、同时和/或之后。本文报道的 抗体和缀合物还可以与射线疗法组合使用。
本文报道的抗体或缀合物(以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合 适的方法给药，包括肠胃外给药、肺内给药和鼻内给药，并且，如果需要 局部治疗，进行病变内给药。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉 内、腹膜内或皮下给药。部分根据用药是短期还是长期性而定，可通过 任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵 盖各种用药时间方案，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次 给药、推注给药及脉冲输注。
本文报道的抗体或缀合物将以与良好医疗实践相一致的方式配制、 给药和施用。在该背景下考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的 具体哺乳动物、个体患者的临床状态、病症的原因、递送试剂的位点、 施药方法、施药时间安排、和医疗从业者已知的其他因素。所述抗体或 缀合物不需要，但任选地，与目前用于预防或治疗所讨论的病症的一种或多种试剂一起配制。所述其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体 或缀合物的量、病症或治疗的类型和以上讨论的其他因素。这些一般以 相同剂量，并使用如本文中所述的施药途径，或以本文中所述的剂量的 约1-99％，或以通过经验/临床确定合适的任意剂量和任何途径来使用。
为了预防或治疗疾病，本文报道的抗体或缀合物的合适剂量(当单独 或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类 型、抗体或缀合物的类型、疾病的严重性和进程、所述抗体或缀合物是 以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和 对所述抗体或缀合物的应答，和主治医师的判断力。所述抗体或缀合物 以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。根据疾病的类型和严 重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)的抗体或缀合物可 以是用于向患者施用的最初候选剂量，无论，例如，通过一次或多次分 别施药，或通过连续输注。一个典型的每日剂量可以在约1μg/kg-100 mg/kg或更多的范围内，其取决于上文提及的因素。为了重复施用数日或 更长时间，根据病症，通常将持续治疗直至出现疾病症状的理想抑制。 所述抗体或缀合物的一个示范性剂量应该在约0.05mg/kg-约10mg/kg范 围内。因此，约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组 合)的一个或多个剂量可以施用于患者。这样的剂量可以间隔地，例如每 周或每三周施用(例如以使得患者接受约2-约20或例如约6剂量的所述抗 体)。可以施用最初较高的负荷剂量，随后是一个或多个较低的剂量。然 而，其他的给药方案也可以是有用的。该治疗的进展易于通过常规技术和 测定来监测。
应该理解，任意上述制剂或治疗方法可以使用本发明的免疫缀合物替 代本文报道的抗体或缀合物或与本文报道的抗体或缀合物一起进行。
VIII.制品
在本发明的另一方面中，提供一种制品，所述制品包含可用于治 疗、预防和/或诊断上述病症的材料。该制品包括容器和在容器上或与容 器一起的标签或包装说明书(package insert)。适合的容器包括，例如，瓶 子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或 塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于治 疗、预防和/或诊断所述病症的另一种组合物结合，并且可以具有无菌的 存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内 溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本文报道的抗体或复合 物。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗选择的病症。此外，所 述制品可以包含：(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本 文报道的抗体或复合物；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组 合物包含另一种细胞毒性剂或其他的治疗剂。本发明的该实施方案中的 制品还可以包括包装说明书，所述包装说明书指明所述组合物可以用于 治疗特定病症。备选地，或另外地，所述制品还可以包括第二(或第三) 容器，所述第二(或第三)容器包含药用缓冲剂，如抑菌注射用水 (BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户立 场，它还可以包括所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、 针头和注射器。
应该理解，任意上述制品可以包括本发明的免疫缀合物以替代本文报 道的抗体或缀合物或与本文报道的抗体或缀合物一起。
IX.具体的实施方案
1.一种共价缀合物，其包含：
i)双特异性抗体，其具有特异性结合半抗原化的有效负载物的第一 结合特异性，和特异性结合血脑屏障受体的第二结合特异性，和
ii)半抗原化的有效负载物，
其中所述半抗原化的有效负载物通过所述第一结合特异性特异性结 合，
其中所述共价缀合物具有在所述半抗原化的有效负载物与特异性结 合所述半抗原化的有效负载物的第一结合特异性之间的共价键，并且
其中所述半抗原化的有效负载物选自由下述组成的组：生物素化的有 效负载物，茶碱化的有效负载物，洋地黄毒苷化的有效负载物，碳硼烷化 的有效负载物，荧光素化的有效负载物，helicarylated有效负载物和溴脱 氧尿苷化的有效负载物。
2.一种非共价复合物，其包含双特异性抗体，所述双特异性抗体具 有特异性结合半抗原化的有效负载物的第一结合特异性，和特异性结合血 脑屏障受体和半抗原化的有效负载物的第二结合特异性，其中所述半抗原 化的有效负载物通过所述第一结合特异性特异性结合。
3.一种共价缀合物，其包含双特异性抗体，所述双特异性抗体具有 特异性结合半抗原化的有效负载物的第一结合特异性，和特异性结合血脑 屏障受体和半抗原化的有效负载物的第二结合特异性，其中所述半抗原化 的有效负载物通过所述第一结合特异性特异性结合，并且其具有在半抗原 化的有效负载物与特异性结合所述半抗原化的有效负载物的第一结合特 异性之间的共价键。
4.根据第1-3项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述半抗原 化的有效负载物选自包括下述的组：生物素化的有效负载物，茶碱化的有 效负载物，洋地黄毒苷化的有效负载物，碳硼烷化的有效负载物，荧光素 化的有效负载物，helicarylated有效负载物和溴脱氧尿苷化的有效负载物。
5.根据第1-4项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述半抗原是 核苷酸或核苷的衍生物或类似物。在一个实施方案中，所述半抗原是氨基 酸的衍生物或类似物。
6.根据第1-5项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述血脑屏障 受体选自由下述组成的组：转铁蛋白受体(TfR)，胰岛素受体，胰岛素样 生长因子受体(IGF受体)，低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)，低密度 脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)，和肝素-结合性表皮生长因子样生长因子 (HB-EGF)。
7.根据第1-6项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特异性 抗体是包含两个结合位点的全长抗体。
8.根据第1-7项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特异性 抗体是已经融合了一个或两个scFvs或scFabs并且包含三个或四个结合位 点的全长抗体。
9.根据第1-8项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特异性 抗体是抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体片段选自F(ab’)2和双抗 体。
10.根据第1-9项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特异 性抗体是人源化的或人抗体。
11.根据第1-10项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特异 性抗体没有效应子功能。
12.根据第1-11项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特异 性抗体没有功能性Fc区。
13.根据第1-12项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特 异性抗体没有Fc区。
14.根据第1-13项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特 异性抗体具有带有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的Fc区， 其中位置按照Kabat Fc区编号(Kabat EU索引)确定。
15.根据第1-14项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特 异性抗体具有带有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类的Fc区， 其中位置按照Kabat Fc区编号(Kabat EU索引)确定。
16.根据第1-15项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特 异性抗体包含：
a)一个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和一个针对血脑屏 障受体的结合位点，或
b)两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和一个针对血脑屏 障受体的结合位点，或
c)一个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对血脑屏 障受体的结合位点，或
d)两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对血脑屏 障受体的结合位点。
17.根据第1-16项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特 异性抗体包含两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对血 脑屏障受体的结合位点。
18.根据第1-17项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述半抗 原化的有效负载物在所述半抗原与所示有效负载物之间包含接头。
19.根据第18项所述的复合物或缀合物，其中所述接头是肽接头。
20.根据第18项所述的复合物或缀合物，其中所述接头是化学接头 (非肽接头)。
21.根据第1-20项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特 异性抗体和所述半抗原化的有效负载物分别包含官能团，由此当所述双特 异性抗体结合所述半抗原化的有效负载物时，在所述半抗原化的有效负载 物与所述双特异性抗体之间形成共价键。
22.根据第1-21项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特 异性抗体在抗体CDR2中的氨基酸残基处包含官能团，其中CDR2按照 Kabat确定。
23.根据第22项所述的复合物或缀合物，其中所述在抗体CDR2中 的氨基酸残基处的官能团是巯基基团。
24.根据第1-23项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特 异性抗体包含在抗体CDR2中的氨基酸残基处的半胱氨酸。
25.根据第1-24项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述半抗 原化的有效负载物在所述半抗原中包含官能团，或者如果存在，在所述半 抗原与所述有效负载物之间的接头中包含官能团。
26.根据第25项所述的复合物或缀合物，其中所述官能团是巯基或 马来酰亚胺或卤代乙酰基。
27.根据第25-26项中任一项所述的复合物或缀合物，其中半抗原或 接头(如果存在接头的话)中的所述官能团是巯基基团。
28.根据第1-27项中任一项所述的复合物或缀合物，其中共价键位 于抗体CDR2中的半胱氨酸残基与半抗原化的有效负载物的巯基基团之 间。
29.根据第28项所述的复合物或缀合物，其中所述共价键是二硫键。
30.根据第28-29项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述共价 键是二硫键，并且其无需添加氧化还原活性剂而形成。
31.根据第1-30项中任一项所述的复合物或缀合物，其中在选自由 生物素化的有效负载物、茶碱化的有效负载物、洋地黄毒苷化的有效负载 物和荧光素化的有效负载物组成的组的半抗原化的有效负载物的情形中， 所述CDR2是重链CDR2。
32.根据第31项所述的复合物或缀合物，其中抗体重链CDR2中的 半胱氨酸残基位于位置52，或位置52a，或位置52b，或位置52c，或位 置52d，或位置53(按照Kabat重链可变结构域编号)。
33.根据第31-32项中任一项所述的复合物或缀合物，其中抗体重链 CDR2中的半胱氨酸残基位于位置52a，或位置52b，或位置52c，或位置 53(按照Kabat重链可变结构域编号)。
34.根据第31-33项中任一项所述的复合物或缀合物，其中抗体重链 CDR2中的半胱氨酸残基位于位置52b或位于位置53(按照Kabat重链可 变结构域编号)。
35.根据第1-30项中任一项所述的复合物或缀合物，其中在 helicarylated有效负载物的情形中，CDR2是轻链CDR2。
36.根据第35项所述的复合物或缀合物，其中抗体轻链CDR2中的 半胱氨酸残基位于位置51或位于位置55(按照Kabat轻链可变结构域编 号)。
37.根据第35-36项中任一项所述的复合物或缀合物，其中抗体轻链 CDR2中的半胱氨酸残基位于位置55(按照Kabat轻链可变结构域编号)。
38.根据第1-37项中任一项所述的复合物或缀合物，其中每个CDR2 准确形成一个共价键。
39.根据第1-38项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述有效 负载物选自结合结构部分、标记结构部分和生物活性结构部分。
40.根据第1-39项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述生物 活性结构部分选自包括下述的组：抗体，抗体片段，抗体缀合物多肽，一 种或多种CNS靶标的天然配体，一种或多种CNS靶标的天然配体的修饰 版本，适体，抑制性核酸(即，小的抑制性(siRNA)和短发夹RNAs (shRNA))，锁定的核酸(LNAs)，核酶，和小分子，或前述任一种的活性 片段。
41.根据第1-40项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述有效 负载物是核酸或核酸衍生物。
42.根据第1-41项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述核酸 是iRNA或LNA。
43.根据第1-42项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述有效 负载物是多肽。
44.根据第1-43项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述有效 负载物是小分子(非-多肽生物学活性结构部分)。
45.根据第1-44项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述生物 学活性结构部分是多肽。
46.根据第45项所述的复合物或缀合物，其中所述多肽由5-500个 氨基酸残基组成。
47.根据第45-46项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述多肽 包含10-450个氨基酸残基。
48.根据第45-47项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述多肽 包含15-400个氨基酸残基。
49.根据第45-48项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述多肽 包含18-350个氨基酸残基。
50.根据第1-49项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特 异性抗体包含特异性结合洋地黄毒苷化的有效负载物的第一结合特异性 (抗-洋地黄毒苷结合特异性；抗-DIG结合特异性)和特异性结合(人)转铁 蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低 密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异 性；抗-LRP8结合特异性)的第二结合特异性。
51.根据第1-50项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特 异性抗体具有两种特异性结合洋地黄毒苷化的有效负载物的结合特异性 (两种抗-洋地黄毒苷结合特异性)和两种特异性结合(人)转铁蛋白受体(两 种抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗- 低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
52.根据第1-51项中任一项所述的复合物或缀合物，其中特异性结 合洋地黄毒苷化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链可变结构域 和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列 的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:02的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包 含SEQ ID NO:03的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:05 的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:06的氨基酸序列的轻 链CDR2，和(f)包含SEQID NO:07的氨基酸序列的轻链CDR3。
53.根据第1-52项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述特异 性结合洋地黄毒苷化的有效负载物的结合特异性是人源化的结合特异性。
54.根据第1-53项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述特异 性结合洋地黄毒苷化的有效负载物的结合特异性包含上述任一个实施方 案中的CDRs和接受体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架)。
55.根据第1-54项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述特异 性结合洋地黄毒苷化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链可变结 构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO:09或25的 氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:10或26的氨基酸序列的 重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:11或27的氨基酸序列的重链CDR3， (d)包含SEQ ID NO:13或29的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:14或30的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:15 或31的氨基酸序列的轻链CDR3。
56.根据第1-55项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述特异 性结合洋地黄毒苷化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链可变结 构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:04或12或20或28 的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
57.根据第1-56项中任一项所述的复合物或缀合物，其中相对于参 比序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失， 但是包含所述序列的抗-洋地黄毒苷抗体保留与洋地黄毒苷结合的能力。
58.根据第1-57项中任一项所述的复合物或缀合物，其中在SEQ ID NO:01或09或17或25中共有1-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。
59.根据第1-58项中任一项所述的复合物或缀合物，其中置换、插 入或缺失发生在CDRs之外的区域(即FRs)中。
60.根据第1-59项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述抗-洋 地黄毒苷抗体包含SEQ ID NO:01或09或17或25中的VH序列，包括 所述序列的翻译后修饰。
61.根据第1-60项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述特异 性结合洋地黄毒苷化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链可变结 构域和抗体轻链可变结构域，其进一步包含与SEQ ID NO:08或16或24 或32的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
62.根据第1-61项中任一项所述的复合物或缀合物，其中相对于参 比序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失， 但是包含所述序列的抗-洋地黄毒苷抗体保留与洋地黄毒苷结合的能力。
63.根据第1-62项中任一项所述的复合物或缀合物，其中在SEQ ID NO:08或16或24或32中共有1-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失， 任选地，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即FRs)中。
64.根据第1-63项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述抗-洋 地黄毒苷抗体包含SEQ ID NO:08或16或24或32中的VL序列，包括 所述序列的翻译后修饰。
65.根据第1-49项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特 异性抗体包含特异性结合生物素化的有效负载物的第一结合特异性(抗- 生物素结合特异性；抗-BI结合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体 (抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋 白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8 结合特异性)的第二结合特异性。
66.根据第1-49项和65项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所 述双特异性抗体具有两种特异性结合生物素化的有效负载物的结合特异 性(两种抗-生物素结合特异性)和两种特异性结合(人)转铁蛋白受体(两种 抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低 密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
67.根据第1-49项和65-66项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述特异性结合生物素化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链可 变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含(a)包含SEQ ID NO:33的氨基 酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链 CDR2，(c)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:38的氨基酸 序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链 CDR3。
68.根据第1-49项和65-67项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述特异性结合生物素化的有效负载物的结合特异性是人源化的结合特 异性。
69.根据第1-49项和65-68项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述特异性结合生物素化的有效负载物的结合特异性包含上述任一个实 施方案中的CDRs和接受体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构 架)。
70.根据第1-49项和65-69项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述特异性结合生物素化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链可 变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含：(a)包含SEQ ID NO:41或57 的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:42或58的氨基酸序列 的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:43或59的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:45或61的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:46或62的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:47 或64的氨基酸序列的轻链CDR3。
71.根据第1-49项和65-70项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述特异性结合生物素化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链可 变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:36或44或52 或60的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
72.根据第1-49项和65-71项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 相对于参比序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入 或缺失，但是包含所述序列的抗-生物素抗体保留与生物素结合的能力。
73.根据第1-49项和65-72项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 在SEQ IDNO:36或44或52或60中共有1-10个氨基酸被置换、插入和 /或缺失，任选地，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即 FRs)中。
74.根据第1-49项和65-73项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述抗-生物素抗体包含SEQ ID NO:36或44或52或60中的VH序列， 包括所述序列的翻译后修饰。
75.根据第1-49项和65-74项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述特异性结合生物素化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链可 变结构域和抗体轻链可变结构域，其进一步包含与SEQ ID NO:40或48 或56或64的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
76.根据第1-49项和65-75项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 相对参比序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入 或缺失，但是包含所述序列的抗-生物素抗体保留与生物素结合的能力。
77.根据第1-49项和65-76项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 在SEQ IDNO:40或48或56或64中共有1-10个氨基酸被置换、插入和 /或缺失，任选地，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即 FRs)中。
78.根据第1-49项和65-77项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述抗-生物素抗体包含SEQ ID NO:40或48或56或64中的VL序列， 包括所述序列的翻译后修饰。
79.根据第1-49项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特 异性抗体包含特异性结合茶碱化的有效负载物的第一结合特异性(抗-茶 碱结合特异性；抗-THEO结合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受体(抗 -(人)转铁蛋白受体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂蛋白受 体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗-LRP8结 合特异性)的第二结合特异性。
80.根据第1-49项和79项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所 述双特异性抗体具有两种特异性结合茶碱化的有效负载物的结合特异性 (两种抗-茶碱结合特异性)和两种特异性结合(人)转铁蛋白受体(两种抗 -(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密 度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
81.根据第1-49项和79-80项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述特异性结合茶碱化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链可变 结构域和抗体轻链可变结构域，其包含(a)包含SEQ ID NO:65的氨基酸 序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR2， (c)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的 轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
82.根据第1-49项和79-81项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述特异性结合茶碱化的有效负载物的结合特异性是人源化的结合特异 性。
83.根据第1-49项和79-82项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述特异性结合茶碱化的有效负载物的结合特异性包含上述任一个实施 方案中的CDRs和接受体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有构 架)。
84.根据第1-49项和79-83项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述特异性结合茶碱化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链可变 结构域和抗体轻链可变结构域，其包含(a)包含SEQ ID NO:73或89的 氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:74或90的氨基酸序列的 重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:75或91的氨基酸序列的重链CDR3， (d)包含SEQ ID NO:77或93的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:78或94的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:79 或95的氨基酸序列的轻链CDR3。
85.根据第1-49项和79-84项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述特异性结合茶碱化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链可变 结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:68或76或84或 92的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
86.根据第1-49项和79-85项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 相对参比序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入 或缺失，但是包含所述序列的抗-茶碱抗体保留与茶碱结合的能力。
87.根据第1-49项和79-86项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 在SEQ IDNO:68或76或84或92中共有1-10个氨基酸被置换、插入和 /或缺失，任选地，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即 FRs)中。
88.根据第1-49项和79-87项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述抗-茶碱抗体包含SEQ ID NO:68或76或84或92中的VH序列，包 括所述序列的翻译后修饰。
89.根据第1-49项和79-88项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述特异性结合茶碱化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链可变 结构域和抗体轻链可变结构域，其进一步包含与SEQ ID NO:72或80或 88或96的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
90.根据第1-49项和79-89项中任一项所述的复合物或缀合物，其 中相对参比序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入 或缺失，但是包含所述序列的抗-茶碱抗体保留与茶碱结合的能力。
91.根据第1-49项和79-90项中任一项所述的复合物或缀合物，其 中SEQ ID NO:72或80或88或96中共有1-10个氨基酸被置换、插入和 /或缺失，任选地，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即 FRs)中。
92.根据第1-49项和79-91项中任一项所述的复合物或缀合物，其 中所述抗-茶碱抗体包含SEQ ID NO:72或80或88或96中的VL序列， 包括所述序列的翻译后修饰。
93.根据第1-49项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双特 异性抗体包含特异性结合荧光素化的有效负载物的第一结合特异性(抗- 荧光素结合特异性；抗-FLUO结合特异性)和特异性结合(人)转铁蛋白受 体(抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性)或低密度脂 蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性；抗 -LRP8结合特异性)的第二结合特异性。
94.根据第1-49项和93项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述双特异性抗体具有两种特异性结合荧光素化的有效负载物的结合特 异性(两种抗-荧光素结合特异性)和两种特异性结合(人)转铁蛋白受体(两 种抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗- 低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
95.根据第1-49项和93-94项中任一项所述的复合物或缀合物，其 中所述特异性结合荧光素化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链 可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含(a)包含SEQ ID NO:97的 氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的重链 CDR2，(c)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ IDNO:101的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:102的氨基 酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的轻链 CDR3。
96.根据第1-49项和93-95项中任一项所述的复合物或缀合物，其 中所述特异性结合荧光素化的有效负载物的结合特异性是人源化的结合 特异性。
97.根据第1-49项和93-96项中任一项所述的复合物或缀合物，其 中所述特异性结合荧光素化的有效负载物的结合特异性包含上述任一个 实施方案中的CDRs和接受体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或人共有 构架)。
98.根据第1-49项和93-97项中任一项所述的复合物或缀合物，其 中所述特异性结合荧光素化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链 可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含(a)SEQ ID NO:105或113 的氨基酸序列的重链CDR1，(b)SEQ ID NO:106或114的氨基酸序列的 重链CDR2，(c)SEQ ID NO:107或115的氨基酸序列的重链CDR3，(d) SEQID NO:109或117的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)SEQ ID NO:110 或118的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)SEQ ID NO:111或119的氨基 酸序列的轻链CDR3。
99.根据第1-49项和93-98项中任一项所述的复合物或缀合物，其 中所述特异性结合荧光素化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重链 可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:108或116的 氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
100.根据第1-49项和93-99项中任一项所述的复合物或缀合物，其 中相对参比序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入 或缺失，但是包含所述序列的抗-荧光素抗体保留与荧光素结合的能力。
101.根据第1-49项和93-100项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中在SEQ IDNO:108或116中共有1-10个氨基酸被置换、插入和/或缺 失，任选地，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即FRs) 中。
102.根据第1-49项和93-101项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中所述抗-荧光素抗体包含SEQ ID NO:108或116中的VH序列，包括 所述序列的翻译后修饰。
103.根据第1-49项和93-102项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中所述特异性结合荧光素化的有效负载物的结合特异性是一对抗体重 链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还包含与SEQ ID NO:112或120 的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
104.根据第1-49项和93-103项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中相对参比序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、 插入或缺失，但是包含所述序列的抗-荧光素抗体保留与荧光素结合的能 力。
105.根据第1-49项和93-104项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中在SEQ IDNO:112或120中共有1-10个氨基酸被置换、插入和/或缺 失，任选地，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即FRs) 中。
106.根据第1-49项和93-105项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中所述抗-荧光素抗体包含SEQ ID NO:112或120中的VL序列，包括 所述序列的翻译后修饰。
107.根据第1-49项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述双 特异性抗体包含特异性结合溴脱氧尿苷化的有效负载物的第一结合特异 性(抗-溴脱氧尿苷结合特异性；抗-BrdU结合特异性)和特异性结合(人) 转铁蛋白受体(抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性；抗-(h)TfR结合特异性) 或低密度脂蛋白受体相关蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特 异性；抗-LRP8结合特异性)的第二结合特异性。
108.根据第1-49项和107项中任一项所述的复合物或缀合物，其中 所述双特异性抗体具有两种特异性结合溴脱氧尿苷化的有效负载物的结 合特异性(两种抗-溴脱氧尿苷结合特异性)和两种特异性结合(人)转铁蛋 白受体(两种抗-(人)转铁蛋白受体结合特异性)或低密度脂蛋白受体相关 蛋白8(抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白8结合特异性)的结合特异性。
109.根据第1-49项和107-108项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的有效负载物的结合特异性是一对抗 体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含(a)包含SEQ ID NO: 214的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ IDNO:216的氨基酸序列 的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO: 220的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:221的氨基酸序 列的轻链CDR3。
110.根据第1-49项和107-109项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的有效负载物的结合特异性是人源化 的结合特异性。
111.根据第1-49项和107-110项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的有效负载物的结合特异性包含上述 任一个实施方案中的CDRs和接受体人构架(例如，人免疫球蛋白构架或 人共有构架)。
112.根据第1-49项和107-111项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的有效负载物的结合特异性是一对抗 体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含(a)包含SEQ ID NO: 214或215的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQID NO:216或217 的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列的重 链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包 含SEQ ID NO:220的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO: 221的氨基酸序列的轻链CDR3。
113.根据第1-49项和107-112项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的有效负载物的结合特异性是一对抗 体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:222或 224的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
114.根据第1-49项和107-113项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中相对参比序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、 插入或缺失，但是包含所述序列的抗-溴脱氧尿苷抗体保留与溴脱氧尿苷 结合的能力。
115.根据第1-49项和107-114项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中在SEQ IDNO:222或224共有1-10个氨基酸被置换、插入和/或缺 失，任选地，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即FRs) 中。
116.根据第1-49项和107-115项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中所述抗-溴脱氧尿苷抗体包含SEQ ID NO:223或225中的VH序列， 包括所述序列的翻译后修饰。
117.根据第1-49项和107-116项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中所述特异性结合溴脱氧尿苷化的有效负载物的结合特异性是一对抗 体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其还包含与SEQ ID NO:223 或225的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
118.根据第1-49项和107-117项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中相对参比序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、 插入或缺失，但是包含所述序列的抗-溴脱氧尿苷抗体保留与溴脱氧尿苷 结合的能力。
119.根据第1-49项和107-118项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中在SEQ IDNO:223或225中共有1-10个氨基酸被置换、插入和/或 缺失，任选地，所述置换、插入或缺失发生在CDRs之外的区域(即FRs) 中。
120.根据第1-49项和107-119项中任一项所述的复合物或缀合物， 其中所述抗-溴脱氧尿苷抗体包含SEQ ID NO:223或225中的VL序列， 包括所述序列的翻译后修饰。
121.根据第1-38、40、43和45-120项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述有效负载物是半抗原化的全长抗体或半抗原化的抗体片 段。
122.根据第1-38、40、43和45-121项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述半抗原化的有效负载物是半抗原化的全长抗-α突触核蛋 白抗体。
123.根据第1-38、40、43和45-121项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述半抗原化的有效负载物是特异性结合α-突触核蛋白的半 抗原化的抗-α突触核蛋白抗体片段。
124.根据第121-123项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述 半抗原是生物素。
125.根据第1-38、40、43和45-124项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:243-245的 HVRs，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:246-248的HVRs。
126.根据第1-38、40、43和45-125项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:249、250和 245的HVRs，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:251-253的 HVRs。
127.根据第1-38、40、43和45-126项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体包含由SEQ ID NO:254组成的重链可变结构域和由 SEQ ID NO:255组成的轻链可变结构域。
128.根据第1-38、40、43和45-127项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体已经通过将包含由SEQ ID NO:254组成的重链可变 结构域和由SEQ ID NO:255组成的轻链可变结构域的抗体人源化而获 得。
129.根据第1-38、40、43和45-128项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体是人源化的抗体，并且在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:243-245的HVRs且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:246-248 的HVRs，其中在每个HVR中，多至3个氨基酸残基可以被改变。
130.根据第1-38、40、43和45-129项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体是人源化的抗体，并且在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:249、250和245的HVRs且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO: 251-253的HVRs，其中在每个HVR中，多至3个氨基酸残基可以被改变。
131.根据第1-38、40、43和45-130项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体是人源化的抗体，并且重链可变结构域来源于由SEQ ID NO:254组成的重链可变结构域，轻链可变结构域来源于由SEQ ID NO: 255组成的轻链可变结构域。
132.根据第1-38、40、43和45-131项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体与在重链中包含SEQ ID NO:256-258的HVRs和在 轻链中包含SEQ ID NO:259-261的HVRs的抗体结合相同的表位。
133.根据第1-38、40、43和45-132项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体与在重链中包含SEQ ID NO:262、263和258的HVRs 和在轻链中包含SEQ ID NO:264-266的HVRs的抗体结合相同的表位。
134.根据第1-38、40、43和45-133项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体包含由SEQ ID NO:267组成的重链可变结构域和由 SEQ ID NO:268组成的轻链可变结构域。
135.根据第1-38、40、43和45-134项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体已经通过将包含由SEQ ID NO:267组成的重链可变 结构域和由SEQ ID NO:268组成的轻链可变结构域的抗体人源化而获 得。
136.根据第1-38、40、43和45-135项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体是人源化的抗体，并且在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:256-258的HVRs且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:259-261 的HVRs，其中在每个HVR中，多至3个氨基酸残基可以被改变。
137.根据第1-38、40、43和45-136项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体是人源化的抗体，并且在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:262、263和258的HVRs且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO: 264-266的HVRs，其中在每个HVR中，多至3个氨基酸残基可以被改 变。
138.根据第1-38、40、43和45-137项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体是人源化的抗体，并且重链可变结构域来源于由SEQ ID NO:267组成的重链可变结构域，且轻链可变结构域来源于由SEQ ID NO:268组成的轻链可变结构域。
139.根据第1-38、40、43和45-138项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体与在重链中包含SEQ ID NO:269-271的HVRs并且 在轻链中包含SEQ ID NO:272-274的HVRs的抗体结合相同的表位。
140.根据第1-38、40、43和45-139项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体与在重链中包含SEQ ID NO:269、275和271的HVRs 并且在轻链中包含SEQ ID NO:276-278的HVRs的抗体结合相同的表位。
141.根据第1-38、40、43和45-140项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体包含由SEQ ID NO:279组成的重链可变结构域和由 SEQ ID NO:280组成的轻链可变结构域。
142.根据第1-38、40、43和45-141项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体已经通过将包含由SEQ ID NO:279组成的重链可变 结构域和由SEQ ID NO:280组成的轻链可变结构域的抗体人源化而获 得。
143.根据第1-38、40、43和45-142项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体是人源化的抗体，并且在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:269-271的HVRs，且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO: 272-274的HVRs，其中在每个HVR中，多至3个氨基酸残基可以被改变。
144.根据第1-38、40、43和45-143项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体是人源化的抗体，并且在重链可变结构域中包含 SEQ ID NO:269、275和271的HVRs，且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:276-278的HVRs，其中在每个HVR中，多至3个氨基酸残基可 以被改变。
145.根据第1-38、40、43和45-144项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述抗体是人源化的抗体，并且重链可变结构域来源于由SEQ ID NO:279组成的重链可变结构，且轻链可变结构域来源于由SEQ ID NO: 280组成的轻链可变结构域。
146.根据第1-38、40、43和45-121项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述半抗原化的有效负载物是半抗原化的全长抗-人Tau(pS422) 抗体。
147.根据第1-38、40、43和45-121以及146项中任一项所述的复 合物或缀合物，其中所述半抗原化的有效负载物是特异性结合在位置422 的丝氨酸处磷酸化的人Tau的半抗原化的抗-人Tau(pS422)抗体片段。
148.根据第146-147中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述半 抗原是生物素。
149.根据第1-38、40、43和45-121以及146-148项中任一项所述 的复合物或缀合物，其中所述抗-人Tau(pS422)抗体包含：
a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:230、239和232的HVRs， 或
b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:230、231和232的HVRs。
150.根据第1-38、40、43和45-121以及146-149项中任一项所述 的复合物或缀合物，其中所述抗体还包含：
a)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:234、235和236的HVRs， 或
b)在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:233、229和236的HVRs。
151.根据第1-38、40、43和45-121以及146-150项中任一项所述 的复合物或缀合物，其中所述抗体包含：
a)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:230、239和232的HVRs， 且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:234、235和236的 HVRs，或
b)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:230、231和232的HVRs， 且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:233、229和236的 HVRs，或
c)在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:230、231和232的HVRs， 且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:234、235和236的HVRs。
152.根据第1-38、40、43和45-121以及146-151项中任一项所述 的复合物或缀合物，其中所述抗体包含：
a)SEQ ID NO:241的重链可变结构域和SEQ ID NO:238的轻链可变 结构域，或
b)SEQ ID NO:240的重链可变结构域和SEQ ID NO:237的轻链可变 结构域，或
c)SEQ ID NO:240的重链可变结构域和SEQ ID NO:238的轻链可变 结构域，或
d)SEQ ID NO:242的重链可变结构域和SEQ ID NO:238的轻链可变 结构域。
153.根据第1-38、40、43和45-121项中任一项所述的复合物或缀 合物，其中所述半抗原化的有效负载物是半抗原化的全长抗-Aβ抗体。
154.根据第1-38、40、43和45-121和154项中任一项所述的复合 物或缀合物，其中所述半抗原化的有效负载物是特异性结合人Aβ的半抗 原化的抗-Aβ抗体片段。
155.根据第153-154项中任一项所述的复合物或缀合物，其中所述 半抗原是生物素。
156.根据第1-38、40、43和45-121和153-155项中任一项所述的 复合物或缀合物，其中抗-Aβ抗体在重链可变结构域中包含SEQ ID NO: 281、282和283的HVRs。
157.根据第1-38、40、43和45-121和153-156项中任一项所述的 复合物或缀合物，其中所述抗体还在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO: 284、285和286的HVRs。
158.根据第1-38、40、43和45-121和153-157项中任一项所述的 复合物或缀合物，所述抗体在重链可变结构域中包含SEQ ID NO:281、 282和283的HVRs，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO:284、285 和286的HVRs。
159.根据第1-38、40、43和45-121和153-158项中任一项所述的 复合物或缀合物，其中所述抗体包含：
a)SEQ ID NO:287的重链可变结构域和SEQ ID NO:290的轻链可变 结构域，或
b)SEQ ID NO:288的重链可变结构域和SEQ ID NO:291的轻链可变 结构域，或
c)SEQ ID NO:289的重链可变结构域和SEQ ID NO:292的轻链可变 结构域。
160.一种药物制剂，其包含第1-159项中任一项所述的复合物或缀 合物以及药用载体。
161.根据第1-159项中任一项所述的复合物或缀合物，其用作药物。
162.根据第1-159项中任一项所述的复合物或缀合物，其用于治疗 癌症或神经学病症。
163.第1-159项中任一项所述的复合物或缀合物在制备药物中的应 用。
164.根据第163项所述的应用，其中所述药物用于治疗癌症。
165.根据第163项所述的应用，其中所述药物用于治疗神经学病症。
166.根据第165项所述的应用，其中所述神经学病症选自阿尔茨海 默病(AD)(包括，但不限于，轻度认知损害和前驱性AD)，卒中，痴呆， 肌营养不良症(MD)，多发性硬化(MS)，肌萎缩侧索硬化(ALS)，囊性纤维 化，安格尔曼综合征，李德尔综合征，帕金森病，皮克病，佩吉特病，癌 症(例如，影响CNS或脑的癌症)，和外伤性脑损伤。
167.第1-159项中任一项所述的复合物或缀合物作为诊断剂的应 用。
168.第1-159项中任一项所述的复合物或缀合物提高有效负载物的 稳定性的应用。
169.第1-159项中任一项所述的复合物或缀合物提高有效负载物的 活性的应用。
170.第1-159项中任一项所述的复合物或缀合物增加有效负载物的 体内半衰期的应用。
171.第1-159项中任一项所述的复合物或缀合物在治疗疾病中的应 用。
172.一种治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施 用有效量的第1-159项中任一项所述的复合物或缀合物。
173.一种治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用 有效量的第1-159项中任一项所述的复合物或缀合物。
174.根据第171-173项中任一项所述的应用或方法，其中所述疾病 是癌症。
175.根据第171-173项中任一项所述的应用或方法，其中所述疾病 是神经学病症。
176.根据第175项所述的应用或方法，其中所述神经病病症选自阿 尔茨海默病(AD)(包括，但不限于，轻度认知损害和前驱性AD)，卒中， 痴呆，肌营养不良症(MD)，多发性硬化(MS)，肌萎缩侧索硬化(ALS)，囊 性纤维化，安格尔曼综合征，李德尔综合征，帕金森病，皮克病，佩吉特 病，癌症(例如，影响CNS或脑的癌症)，和外伤性脑损伤。
177.第1-159项中任一项所述的复合物或缀合物用于靶向递送半抗 原化的有效负载物穿过血脑屏障的应用。
178.根据第177项所述的应用，其中所述应用是用于将游离的(即， 分离的)半抗原化的有效负载物靶向递送穿过血脑屏障。
179.第1-2和4-159项中任一项所述的复合物用于靶向递送半抗原 化的有效负载物穿过血脑屏障并且在所述血脑屏障或脑中释放所述半抗 原化的有效负载物的应用。
180.根据第179项所述的应用，其中，与不存在所述双特异性抗体 或复合物的递送相比，所述半抗原化的有效负载物的递送更高。
181.根据第180项所述的应用，其中所述递送是两倍更高。
182.根据第180-181项中任一项所述的应用，其中所述递送是10倍 更高。
183.根据第179-182项中任一项所述的应用，其中，与存在所述双 特异性抗体或复合物的条件相比，半抗原化的有效负载物在不存在所述双 特异性抗体或复合物的条件下具有更高的生物学活性。
184.根据第183项所述的应用，其中在不存在所述双特异性抗体或 复合物的条件下，所述生物学活性两倍更高。
185.根据第183-184项中任一项所述的应用，其中在不存在所述双 特异性抗体或复合物的条件下，所述生物学活性十倍更高。
本文引用的所有参考文献的公开内容通过引用结合在本文中。
提供下述实施例、附图和序列以辅助对本发明的理解，其真正的范围 在附上的权利要求书中描述。应该理解，可以在不背离本发明的精神的条 件下，在所描述的方法中进行改进。
实施例
实施例1
由小鼠杂交瘤分离并表征编码具有κ轻链的IgG1种类的鼠抗-洋地黄毒 苷抗体和鼠抗-生物素抗体的VH和VL结构域的cDNAs
编码抗-洋地黄毒苷抗体的VH和VL结构域的cDNAs的分离和表征、 RNA制备、产生DNA片段、将所述DNA片段克隆到质粒中并且确定 DNA-和氨基酸序列分别记述在WO 2011/003557和WO 2011/003780中。
鼠半抗原-结合抗体的VH和VL结构域的蛋白和(DNA)序列信息直接 从杂交瘤克隆获得。随后进行的实验步骤为：(i)从产生抗体的杂交瘤细 胞分离RNA，(ii)将该RNA转化为cDNA，转移到携带VH和VL的PCR 片段中，并且(iii)将这些PCR片段整合到质粒载体中，用于在大肠杆菌 中繁殖，并且确定它们的DNA(和推定的蛋白)序列。
从杂交瘤细胞制备RNA：
使用RNAeasy-试剂盒(Qiagen)从5x106个表达抗体的杂交瘤细胞制备 RNA。简言之，将沉淀的细胞在PBS中洗涤一次并沉淀，然后重悬，在 500μl RLT-缓冲液(+β-ME)中裂解。通过流过Qiashredder(Qiagen)而将细 胞完全裂解，然后按照供应商手册所述进行基质介导的纯化步骤(ETOH， RNAeasy柱)。最后的洗涤步骤后，将RNA从柱上回收到50μL不含RNA 酶的水中。通过定量1:20稀释的样品的A260和A280，确定回收的RNA 的浓度。通过在甲酰胺-琼脂糖凝胶上的变性RNA凝胶电泳(参见Maniatis 手册(Maniatis Manual))分析分离的RNA样品的完整性(质量、降解程 度)。获得表示完整的18s和28s核糖体RNAs的离散条带，并且这些条 带的完整性(以及约2:1的强度比率)表示RNA制剂的良好的质量。将 由杂交瘤分离的RNAs冷冻，并以整分试样保存在-80℃。
通过RACE PCR产生编码VH和VH的DNA片段，将这些DNA片段克隆到质粒中，并且确 定它们的DNA-和氨基酸序列
通过使用国际专利申请WO 2012/093068中所述的技术，从RNA制 剂制备用于后续(RACE-)PCR反应的cDNA。然后，通过琼脂糖凝胶提取 分离VH和VL-编码PCR片段，然后通过标准分子生物学技术纯化。使 用pCR bluntII topo试剂盒(Invitrogen)，严格按照供应商的使用说明，将 PWO-产生的纯化的PCR片段插入到载体pCR bluntII topo中。将Topo- 连接反应物转化到大肠杆菌Topo10-一次性感受态细胞中。然后，将包含 具有包含VL-或VH的插入物的载体的大肠杆菌克隆鉴定为在LB-卡那霉 素琼脂板上的菌落。从这些菌落制备质粒，并且通过用EcoRI限制性消 化证实在所述载体中存在所需要的插入物。由于载体骨架包含侧连在插入 物的每侧的EcoRI限制性识别位点，因此，携带插入物的质粒定义为具 有约800bp(关于VL)或600bp(关于VH)的EcoRI-释放性插入物。通过对 关于VH和VL的多个克隆的自动化DNA测序，确定VL和VH的DNA 序列和推定的蛋白序列。
抗-生物素抗体的鼠VL序列显示在SEQ ID NO:40中。抗-生物素抗 体的鼠VH序列显示在SEQ ID NO:36中。
抗-洋地黄毒苷抗体的鼠VL序列显示在SEQ ID NO:08中。抗-洋地 黄毒苷抗体的鼠VH序列显示在SEQ ID NO:04中。
实施例2
从小鼠杂交瘤分离并表征编码具有κ轻链的IgG1种类的鼠抗-茶碱抗体 的VH和VL结构域的cDNAs
如实施例1所述获得抗-茶碱抗体的序列。
抗-茶碱抗体的鼠VL序列显示在SEQ ID NO:72中。抗-茶碱抗体的 鼠VH序列显示在SEQ ID NO:68中。
实施例3
鼠抗-洋地黄毒苷抗体和抗-生物素抗体的VH和VL结构域的人源化
WO 2011/003557和WO 2011/003780中详细记载了洋地黄毒苷-结合 性抗体的人源化变体的产生。鼠生物素-结合性抗体muM33以相似的方式 人源化，如下所述：
从小鼠杂交瘤产生并表征包含具有κ轻链的IgG1种类的鼠抗-生物素 抗体的VH和VL结构域的编码序列和氨基酸序列记载在 WO 2011/003557和WO 2011/003780中。基于这一信息，基于人种系构 架IGHV1-69-02和IGKV1-27-01组合，产生相对应的人源化的抗-生物素 抗体(huM33)。对于VL，不必在人IGKV1-27-01和IGKJ2-01种系的人J 元件的构架中整合任何回复突变。人源化的VH是基于人IGHV1-69-02 种系和IGHJ4-01-3种系的人J元件。在构架区1的位置24(A24S)和在构 架区3的位置73(K73T)引入两个回复突变。人源化的VH的氨基酸序列 显示在SEQ ID NO:44中，并且人源化的VL的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:48中。
实施例4
鼠抗-茶碱抗体的VH和VL结构域的人源化
将鼠茶碱-结合性抗体人源化如下：基于人种系构架IGHV4-31-02和 IGKV2-30-01组合产生人源化的抗-茶碱抗体。人源化的VH是基于人 IGHV4-31-02种系和IGHJ4-01-3种系的人J元件。在构架区3的位置71 (V71R)引入一个回复突变。人源化的VL是基于人IGHV2-30-01种系和 IGKJ2-01种系的人J元件。在构架区2的位置46(R46L)引入一个回复 突变。人源化的VH的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:76中，并且人源化 的VL的氨基酸序列显示在SEQID NO:80中。
实施例5
在存在洋地黄毒苷的条件下，鼠抗-洋地黄毒苷Fv区的结合区的结晶和 X射线结构确定，以及在存在生物素的条件下，鼠抗-生物素Fv区的结 合区的结晶和X射线结构确定
洋地黄毒苷-结合性抗体的Fab片段的结构的确定详细记载在 WO 2011/003557和WO 2011/003780中，还公布(3RA7)在Metz，S.等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)8194-8199中。
确定鼠抗-生物素抗体的结构。因此，使用本领域公知的方法(木瓜 蛋白酶消化)，通过用蛋白酶消化纯化的IgGs产生Fab片段，然后纯化。
对于apo Fab片段(纯化的Fabs)的结晶，将apo Fab片段(纯化的 Fabs)在20mMHis-HCl，140mM NaCl，pH 6.0中浓缩至13mg/ml。在 汽相扩散法坐滴实验(vapordiffusion sitting drop experiments)中，通过 将0.2μl蛋白溶液与0.2μL储液混合，在21℃建立结晶小滴。在5天内， 从0.1M Tris pH 8.5，0.01M氯化钴，20％聚乙烯吡咯烷酮K15中出现晶 体，并且在8天内长成0.3mm x 0.06mm x 0.03mm的最终尺寸。
用15％甘油作为冷冻保护剂，收集晶体，然后在液氮(liquid N2) 中快速冷冻。在Swiss光源的光束线X10SA，在100K的温度，用Pilatus 6M检测器收集衍射图像，并用程序XDS处理(Kabsch，W.，J.Appl.Cryst. 26(1993)795-800)，用SCALA(从BRUKER AXS获得)定比例，产生
Figure BDA0002341415350001331
分辨率的数据。该Fab片段晶体属于单斜相空间群P21，具有
Figure BDA0002341415350001332
和β＝117.53°的晶胞尺寸，并且每个晶体学 不对称单位包含四个Fab分子(见表3)。
使用CCP4软件套件的标准晶体学程序，通过用PDB entry 3PQP分 子替代作为搜索模型，来解析结构，计算电子密度，并且精修x-射线结 构(CCP4，CollaborativeComputational Project，Acta Crystallogr.D， 760-763(1994))。使用COOT将结构模型重建为电子密度(Emsley，P.，等 Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.60(2010)486-501)。坐标用REFMAC5 (Murshudov，G.N.，等.Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.53(1997)240-55) 和autoBUSTER(Global Phasing Ltd.)精修。
表3:关于单斜相muM33 Fab片段apo-晶体(apo-crystal)的数据收集和 结构精修统计学
Figure BDA0002341415350001341
1括号里的值是指最高分辨率组(highest resolution bins)。
2 Rmerge＝Σ|I-<I>|/ΣI，其中I是强度。
3 Rcryst＝Σ|Fo-<Fc>|/ΣFo，其中Fo是观察到的，并且Fc是计算的结构因子 幅度(structure factor amplitude)。
4在精修过程中，基于5％的总数据计算Rfree。
5用PROCHECK [Laskowski，R.A.，等，J.Appl.Crystallogr.26，283-291 (1993)]计算的。
关于与生物素-衍生物复合的Fab片段的结晶，在筛选后3天内，将 用于浸没实验的Fab片段的apo晶体从0.8M琥珀酸中取出，并且在5天 内生长至0.25mm x 0.04mm x0.04mm的终尺寸。将Biocytinamid以 100mM溶解在水中。然后，将化合物在结晶液中稀释为10mM的工作 浓度，并且涂抹上结晶小滴中的晶体上。将晶体用2μl的10mM化合物 溶液洗涤三次，最后在21℃与biocytinamid温育16小时。
使用15％甘油作为冷冻保护剂收集晶体，然后在液氮(liquid N2)中 快速冷冻。在Swiss光源的光束线X10SA，在100K的温度，用Pilatus 6M 检测器收集衍射图像，并用程序XDS处理(Kabsch，W.，J.Appl.Cryst.26 (1993)795-800)，用SCALA(从BRUKER AXS获得)定比例，产生
Figure BDA0002341415350001351
Figure BDA0002341415350001352
分辨率的数据。该Fab片段晶体属于单斜相空间群P21，具有
Figure BDA0002341415350001353
Figure BDA0002341415350001354
和β＝117.15°的晶胞尺寸，并且每个晶体学不对称单 位包含四个Fab分子(见表4)。
使用CCP4软件套件的标准晶体学程序，通过用apo Fab片段的坐标 分子替代作为搜索模型，来解析结构，计算电子密度，并且精修x-射线 结构至
Figure BDA0002341415350001355
的分辨率(CCP4)。使用COOT(Emsley，P.，Lohkamp，B.， Scott，W.G.&Cowtan，K.Features and development ofCOOT(COOT的 特征和开发).Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.60，486-501(2010))将 结构模型重建为电子密度。坐标用REFMAC5(Murshudov，G.N.，等.Acta Crystallogr.DBiol.Crystallogr.53，240-255(1997))和autoBUSTER(Global Phasing Ltd.)精修。
表4:关于单斜相muM33 Fab片段biocytinamid复合物晶体的数据收集和 结构精修统计学
Figure BDA0002341415350001361
1括号里的值是指最高分辨率组(highest resolution bins)。
2 Rmerge＝Σ|I-<I>|/ΣI，其中I是强度。
3 Rcryst＝Σ|Fo-<Fc>|/ΣFo，其中Fo是观察到的，并且Fc是计算的结构因子 幅度(structure factor amplitude)。
4在精修过程中，基于5％的总数据计算Rfree。
5用PROCHECK [Laskowski，R.A.，MacArthur，M.W.，Moss，D.S. & Thornton，J.M.PROCHECK:a program to check the stereochemical quality of proteinstructure(PROCHECK:检验蛋白结构的立体化学质量的程序). J.Appl.Crystallogr.26，283-291(1993)]计算的。
实验结构确定的结果显示在图33中。复合物的晶体形式在不对称单 位中包含四个独立的biocytinamid:抗-生物素Fab复合物，其中 biocytinamid被所有Fab分子相似地结合。Biocytinamid结合在由重链的 CDRs 1和3以及全部3个轻链CDRs形成的口袋中。配体的结合口袋由 重链的残基ASN29、ASP31、THR32、PHE33、GLN35、TRP99和TRP106 和轻链的ASN31、TYR32、LEU33、SER34、TYR49、SER50、PHE91 和TYR96限定。生物素的首基与在所述口袋一个末端的CDR2和CDR1 的残基形成氢键：biocytinamid的N3与Ser50的羟基-氧相互作用，而O22 与同一残基的主链-酰胺氮接触。另外，biocytinamid的O22也与Ser34 的羟基氧氢键结合。除了这个之外，在biocytinamid与结合口袋内里的芳 香侧链之间观察到疏水相互作用。生物素的(CH2)4脂族尾末端的酰胺键堆 叠到重链CDR1的PHE33上，并且通过与PHE33的主链酰胺氮和Asp31 的另外的氢键而稳定。这以使氮后的原子从结合口袋指向溶剂的方式放置 酰胺氮，所述酰胺氮是与活性实体连接的位点。
分辨率为
Figure BDA0002341415350001371
的结合区实验确定结果允许表征配体与其抗体的结 合模式，这是详细建模并且通过蛋白改造重组生物素结合模块进行进一步 改善的前提条件。
实施例6
具有引入的用于共价缀合的官能性的抗-半抗原抗体的定义和产生
进行上文所述的抗-半抗原抗体的人源化的VH和VL序列的衍生， 以产生允许在确定的位置使抗原/半抗原与抗体共价偶联的化合物。
使用实验确定的与洋地黄毒苷(3RA7)结合的抗-洋地黄毒苷Fab-片 段的结构)(Metz，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)8194-8199) 来鉴定这样的位置：在所述位置的改变允许在抗体与其复合的抗原/半抗 原之间发生定向偶联反应。使用与biocytinamid结合的抗-生物素Fab-片 段的结构(见实施例5)来证实对生物素-结合性抗体片段引入的半胱氨 酸残基的正确位置，并且提供一个或多个鉴定的位置的广泛适用性的证 据。
待突变的位置必须同时满足两个要求：(i)偶联位置应该邻近结合区， 以利用抗原/半抗原的位置效应进行定向偶联，和(ii)突变和偶联位置必须 以抗原/半抗原结合本身不受影响的方式放置。这些关于发现适当的位置 的要求实际上是彼此‘抵触的’，原因在于，要求(i)最好由接近结合位点 的位置实现，而要求(ii)最安全地由远离结合位点的位置实现。
除了这些实际上排除的要求，我们能够鉴定可能被突变而不影响半 抗原放置并且同时允许半抗原化的化合物的定向的共价偶联的位置。
取决于各个抗体的CDR2的实际长度，第一个位置位于Kabat编号的 位置VH52b或VH53。在抗-洋地黄毒苷抗体结构中，半抗原结合在由疏 水残基形成的深口袋中。在该晶体学研究中使用荧光洋地黄毒苷-Cy5缀 合物，其中，由于高度的灵活性和产生的晶体无序性，荧光团和在洋地黄 毒苷与Cy5之间的接头在结构中是不可见的。然而，接头和Cy5连接在 洋地黄毒苷的O32上，其指向重链CDR2的方向。洋地黄毒苷的O32(见 上文)与按照Kabat的位置52b中的氨基酸残基的Cα之间的距离约为
Figure BDA0002341415350001381
Figure BDA0002341415350001382
用Cys替换位置VH52b/VH53的氨基酸产生具有下述重链可变区序 列的抗体衍生物：关于抗-洋地黄毒苷抗体-VH52bC，在SEQ ID NO:20 和28中列出的，关于抗-茶碱抗体-VH53C，在SEQ ID NO:84和92中列 出的，关于抗-生物素抗体-VH53C，在SEQ ID NO:52和60中列出的， 关于抗-荧光素抗体-VH52bC，在SEQ ID NO:108中列出的。
鉴定为修饰点的另一个位置是按照Kabat编号的位置VH28。
结果，我们在Kabat位置VH28引入半胱氨酸。用Cys替代位置VH28 的氨基酸产生具有下述重链可变区序列的抗体衍生物：关于抗-洋地黄毒 苷抗体-VH28C，在SEQ ID NO:124和132中列出的，关于抗-茶碱抗体 -VH28C，在SEQ ID NO:156和164中列出的，关于抗-生物素抗体 -VH28C，在SEQ ID NO:140和148中列出的，和关于抗-荧光素抗体 -VH28C，在SEQID NO:116中列出的。
已经发现，这些位置中的一个是“通用的”位置，即，该位置适用 于任意的抗体，并且，因此，每当必须修饰新的抗体时，不需要从头起始： 通过提供晶体结构，并且确定允许半抗原定位的共价偶联的适当位置进 行。
按照Kabat重链可变区编号的突变VH52bC或VH53C分别可以用于 每种半抗原-结合抗体(抗-半抗原抗体)。即使抗体和它们的结合口袋的结 构非常多样，也已经表明VH52bC/VH53C突变能够用于将抗原/半抗原共 价连接到结合了洋地黄毒苷、生物素、荧光素以及茶碱的抗体上。
可以表达由这些序列构成的结合实体，并且用标准的蛋白质A-和大 小排阻层析法纯化(见实施例7)。得到的分子完全有功能，并且以与其 未修饰的亲本分子相同的方式保留针对其同源半抗原的亲和性。这通过表 面等离子体共振(SPR)实验得到证明(见实施例9)。
实施例7
重组抗-半抗原抗体的组成、表达和纯化
将鼠和人源化的抗-半抗原抗体可变区与人来源的恒定区组合，形成 单特异性或双特异性的嵌合抗体或人源化的抗体。
产生单特异性的人源化的抗-半抗原抗体和特异性结合半抗原以及不 同的非-半抗原靶标(例如，受体酪氨酸激酶或IGF-1R)的双特异性人源 化的抗-半抗原抗体需要：(i)设计和定义关于所述分子的氨基酸和核苷酸 序列，(ii)在转染的培养的哺乳动物细胞中表达这些分子，和(iii)从转染 的细胞的上清纯化这些分子。这些步骤如之前在WO 2012/093068中所述 进行。
通常，为了产生具有(初始)鼠抗-半抗原抗体的结合特异性的IgG 种类的人源化抗体，将人源化的VH序列符合读框地融合在亚类IgG1的 人Fc区CH1-铰链-CH2-CH3的N端。类似地，将人源化的VL序列符合 读框地融合在人CLκ恒定区的N端。
为了产生包含半抗原-结合特异性以及针对其他靶标的特异性的双特 异性抗体衍生物，将抗-半抗原抗体、scFv或Fab片段符合读框地融合到 前述抗体重量的C端。在多种情形中，通过引入VH44-VL100二硫键进 一步稳定所用的抗-半抗原scFv，这之前已经描述过(例如，Reiter，Y.， 等，Nature biotechnology(自然生物技术)14(1996)1239-1245)。
表达质粒
将包含用于表达重链和轻链的表达盒的表达质粒分别组装在哺乳动 物细胞表达载体中。
由此，如上文所述连接编码个体元件的基因区段。
关于可以推导密码子应用的人轻链和重链核苷酸序列的通用信息提 供在：Kabat，E.A.，等，Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication No 91-3242中。
κ-轻链的转录单位由下述元件构成：
-来自人巨细胞病毒(hCMV)的即时早期增强子和启动子，
-合成的包含Kozak序列的5'-UT，
-包含信号序列内含子的鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-克隆的可变轻链cDNA，其在5'端排列特有的BsmI限制性位点， 并且在3'端排列剪接供体位点和特有的NotI限制性位点，
-基因组人κ-基因恒定区，其包含内含子2小鼠Ig-κ增强子(Picard， D.，和Schaffner，W.Nature 307(1984)80-82)，和
-人免疫球蛋白κ-聚腺苷酸化("聚A")信号序列。
γl-重链的转录单位由下述元件构成：
-来自人巨细胞病毒(hCMV)的即时早期增强子和启动子，
-合成的包含Kozak序列的5'-UT，
-包含信号序列内含子的修饰的鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-克隆的单特异性可变重链cDNA或克隆的双特异性融合scFv-可变 重链cDNA，其在5'端排列特有的BsmI限制性位点，并且在3'端 排列剪接供体位点和特有的NotI限制性位点，
-基因组人γl-重链基因恒定区，其包含小鼠Igμ-增强子(Neuberger， M.S.，EMBOJ.2(1983)1373-1378)，和
-人γl-免疫球蛋白聚腺苷酸化("聚A")信号序列。
除了κ-轻链或γ1-重链表达盒之外，这些质粒包含：
-潮霉素抗性基因，
-埃巴病毒(Epstein-Barr virus，EBV)的复制起点，oriP，
-来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制， 和
-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌氨苄青霉素抗性。
重组DNA技术
使用Sambrook等，1999(同前所述)中所述的标准克隆技术进行克隆。 所有的分子生物学试剂可商购(如果没有另外指明)，并且按照供应商的 使用说明使用。
由Geneart AG，Regensburg合成包含编码序列、突变或其他基因元 件的DNA。
DNA序列通过在SequiServe(SequiServe GmbH，Germany)进行的双 链测序而确定。
DNA和DNA序列分析和序列数据管理
使用载体NTI高级套件(Vector NTI Advance suite)版本9.0进行序 列创建、绘图、分析、注释和例证。
抗-半抗原抗体和衍生物的表达
抗-半抗原抗体通过瞬时转染悬浮的人胚肾293(HEK293)细胞进行表 达。对此，如上文所述，将对应的单特异性抗体或双特异性抗体的轻链和 重链构建到携带原核和真核选择标记的表达载体中。将这些质粒在大肠杆 菌中增殖，纯化，然后用于瞬时转染。使用标准细胞培养技术处理细胞， 如在Current Protocols in Cell Biology(现代细胞生物学方法)(2000)， Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.和Yamada，K.M.(编)，John Wiley&Sons，Inc.中所述。
将细胞在适当的表达培养基中在37℃/8％CO2培育。在转染那天， 将细胞以1-2x106个活细胞/ml的密度接种在新鲜培养基中。在Opti-MEM I培养基(Invitrogen，USA)中制备DNA-复合物与转染试剂，其在250ml 最终转染体积中包含250μg摩尔比例为1:1的重链和轻链质粒DNA。转 染后7天，通过以14,000g离心30分钟，并通过无菌滤器(0.22μm)过滤，而将包含单特异性抗体或双特异性抗体的细胞培养物上清澄清化处理。在 纯化之前将上清保存在-20℃。
为了确定细胞培养物上清中抗体和衍生物的浓度，使用亲和性HPLC 层析。为此，将包含结合在蛋白-A上的单特异性抗体或双特异性抗体或 其衍生物的细胞培养物上清应用到处在包含200mM KH2PO4，100mM柠 檬酸钠，pH 7.4的溶液中的Applied BiosystemsPoros A/20柱上。通过应 用包含200mM NaCl，100mM柠檬酸，pH 2.5的溶液，进行从层析材料 的洗脱。使用UltiMate 3000HPLC系统(Dionex)。洗脱下来的蛋白通过 UV吸光度和峰面积的整合进行量化。纯化的IgG1抗体作为标准物。
结合洋地黄毒苷、荧光素、茶碱或生物素的抗-半抗原抗体的纯化
转染后七天，收集HEK 293细胞上清。使用蛋白A--SepharoseTM亲 和层析(GEHealthcare，Sweden)通过亲和层析和Superdex200大小排除层 析，以两个步骤从上清中纯化其中包含的重组抗体(或-衍生物)。简言之， 将包含抗体的澄清化处理的培养物上清应用到用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl and 2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe蛋白A(5-50ml)柱上。未结合的蛋白用平衡缓冲液洗掉。 抗体(或-衍生物)用50mM柠檬酸盐缓冲液，pH 3.2洗脱。将包含蛋白 的级分用0.1ml 2M Tris缓冲液，pH 9.0中和。然后，汇集洗脱下来的蛋 白级分，用Amicon Ultra浓缩过滤装置(MWCO:30K，Millipore)浓缩， 并且上样到用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex200HiLoad 26/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，Sweden)上。通过使用基于Pace 等，ProteinScience(蛋白质科学)4(1995)2411-2423所述的氨基酸序列 计算的摩尔消光系数，以320nm的OD作为背景校正，确定280nm的光 学密度(OD)，而确定纯化的抗体和衍生物的蛋白浓度。汇集单体抗体级 分，速冻，并且保存在-80℃。提供部分样品用于后续的蛋白分析和标准。
通过在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)的条件下的 SDS-PAGE并且用考马斯亮蓝染色，来证实抗体的同质性。
Figure BDA0002341415350001421
Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen，USA)按照供应商的使用说明使用(4-20％ Tris-甘氨酸凝胶)。
在还原条件下，在SDS-PAGE后，与IgG相关的多肽链在与计算的 分子量相似的表观分子大小处鉴定。通过蛋白A分析所有构建体的表达 水平。在所述未优化的瞬时表达实验中，平均蛋白产量为6mg-35mg 纯化的蛋白/升细胞上清。
实施例8
半抗原化的化合物的产生
为了产生用于非共价复合和用于缀合(共价复合)的化合物，需要： (i)将半抗原经由适当的接头偶联到化合物(＝有效负载物)上，和(ii)确 保所述偶联以允许所述化合物保留其功能性的方式发生。
a)半抗原-多肽缀合物：
可以通过携带半抗原的接头在N-端或C-端或在侧链位置衍生任意的 多肽，只要可以在多肽与半抗原之间的接头中引入活性残基，如半胱氨酸 残基即可。特别地，多肽可以包含非天然的氨基酸残基。
下表5中列出了示例性的半抗原化的化合物。
表5.
Figure BDA0002341415350001431
Figure BDA0002341415350001441
Figure BDA0002341415350001451
缩写:4Abu＝4-氨基-丁酸
Ahx＝氨基己酸
Btn＝生物素基
cme＝羧甲基
Cy5＝吲哚二碳花菁(Indodicarbocyanine)，Cyanin-5
Dadoo＝1,8-二氨基-3,6-二氧-辛烷
DCM＝二氯甲烷
Dig(OSu)＝洋地黄毒苷-3-羧甲基-N-羟基琥珀酰亚胺
Dy636＝荧光团
eda＝乙二胺
Fluo＝5-羧基-荧光素
HATU＝0-(7-Aza-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯
HFIP＝1,1,1,3,3,3,-六氟-2-丙醇
Mmt＝4-甲氧基三苯甲基
MR121＝噁嗪荧光团
MTBE＝叔丁基-甲基-醚
NMM＝N-甲基-吗啉
NMP＝N-甲基-2-吡咯酮
PEG2＝8-氨基-3,6-二氧-辛酸
PEG3＝12-氨基-4,7,10-三氧十二酸
O2Oc＝8-氨基-3,6-二氧-十二酸
Pip＝哌啶
Pqa＝4-氧-6-哌嗪-1-基-4H-喹唑啉-3-基)-乙酸
TBTU＝2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯
TCEP＝三(2-氯乙基)磷酸酯
TFE＝2,2,2,三氟乙醇
TIS＝三异丙基硅烷
偶联方法和所用的试剂的方案显示在图30、31和32中。
已经用在本文中的示例性的多肽是神经肽-2受体激动剂衍生物。该 多肽是肽酪氨酸酪氨酸(Peptide Tyrosine Tyrosine)或胰腺肽短PYY(3-36) 类似物，如WO 2007/065808所报道的。其通过在位置2的氨基酸残基赖 氨酸被洋地黄毒苷化。该洋地黄毒苷化的PYY多肽在下文中称为 DIG-PYY，而不考虑将多肽连接到洋地黄毒苷残基上的侧链。
其他示例性的化合物是非肽荧光染料Cy5、Dy636和MR121。这些 化合物可以通过NHS-酯化学偶联到包含洋地黄毒苷或生物素的接头系统 中。
i)用于产生PYY(3-36)-衍生的多肽缀合前体的通用方法
在自动化多频合成仪上，用于PYY衍生物的标准方法：
合成仪:具有涡旋搅拌系统的多频合成仪SYRO I(MultiSynTech GmbH，Witten)
树脂:200mg TentaGel S RAM(0.25mmol/g)，RAPP Polymere, Tubingen，具有Teflon釉料的10ml塑料注射器(作为反 应容器)
储液:
Figure BDA0002341415350001461
偶联:
Figure BDA0002341415350001462
Fmoc-去封闭:
去封闭剂: 1200μl
反应时间: 5min+12min
洗涤:
溶剂: 1200μl
体积: 1300μl
反应时间: 5×1min
最后的切割:
切割剂: 8ml TFA/硫代苯甲醚/硫代甲酚/TIS(95:2,5:2,5:3)
反应时间: 4h
Work-up: 将切割溶液过滤，并浓缩至1-2ml，并通过加入MTBE 沉淀肽。通过离心收集白色固体，用MTBE洗涤2次， 并干燥。
Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg (Mtr)-Y(tBu)-TentaGel S RAM树脂(SEQ ID NO:176)
通过树脂结合的肽序列 Ac-IK(Mmt)-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(tBu)R(Pbf)Q(Trt)- MeArg(Mtr)-Y(tBu)-TentaGel-RAM树脂的自动化固相合成获得 PYY(3-36)-多肽衍生物(称为PYY)。利用Fmoc化学在具有涡旋搅拌系 统的多频合成仪SYRO I(MultiSynTech GmbH，Witten)中进行肽合成。使 用TentaGel RAM树脂(上样:0.25mmol/g；Rapp Polymers，Germany)，通 过顺序偶联相对应的Fmoc-氨基酸(规格:0.05mmol)以重复的循环组装肽 序列。在每个偶联步骤中，通过用在二甲基甲酰胺(DMF)中的30％哌啶处 理树脂(5min+12min)而去除N-端Fmoc-基团。使用用TBTU(0.25mmol) 在位置1、13、14和15活化的Fmoc-保护的氨基酸(0.25mmol)和在NMP 中的NMM 50％进行偶联(双重偶联，2x 30min涡旋)。在所有其他的 位置，使用HATU(0.25mmol)和在NMP中的NMM 50％作为活化剂。在 每个偶联步骤之间，将树脂用DMF洗涤5次，每次1min。合成线性前 体后，通过与DMF/DIPEA/Ac2O反应15min进行乙酰化，并且用DMF 洗涤，产生 Ac-IK(Mmt)-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf)Q(Trt)- MeArg(Mtr)-Y(tBu)-TentaGel S RAM树脂。
为了去除Mmt基团，用DCM/HFIP/TFE/TIS(6.5:2:1:0.5)处理肽， 2x 1h，在用DMF洗涤后，产生部分去保护的前体 Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg (Mtr)-Y(tBu)-TentaGel S RAM树脂。
Ac-PYY(PEG3-Dig)/Ac-IK(PEG3-Dig)-Pqa-RHYLNWVTRQ-MeArg-Y-NH2(SEQ ID NO:177)
合成也参见WO 2012/093068。
向肽Ac-IK(H2N-TEG)-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-methyl)RY(100mg， 40.6μmol)在水(5mL)中的溶液中加入溶解在NMP(1mL)中的洋地黄毒 苷-3-羧基-甲基-N-羟基琥珀酰亚胺(26.6mg，48.8μmol)。加入三乙胺 (13.6L，97.6μmol)，并且将混合物在室温翻转2小时。然后，加入另外 的溶解在NMP(0.5mL)中的洋地黄毒苷-3-羧基-甲基-N-羟基琥珀酰亚胺(13.3mg，24.4μmol)，和三乙胺(6.8μL，48.8μmol)，并且将溶液翻转15 小时。通过制备级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化粗产物，从而提供作为无色 固体的Dig-PYY肽(29mg，10.0μmol，25％)。为了肽衍生物的分析表征， 我们应用下述条件并且收到下述数据：分析级HPLC:tR＝11.3min(MerckChromolith Performance RP-18e，100x 4.6mm，水+0.1％TFA→乙腈/ 水+0.1％TFA 80:20，25min)；ESI-MS(阳离子模式):m/z:为 C140H207N35O32计算的:2892.4；实测的:964.9[M+2H]2+，计算的:965.1。 到与抗体复合的时间点时，我们将洋地黄毒苷化的肽在4℃保存为冻干 物。图2C显示了DIG-moPYY的结构。
ii)产生具有包含半胱氨酸的接头的洋地黄毒苷化的PYY(3-36)-衍生的多肽
Ac-IK(PEG3-Cys-4Abu-NH2)-Pqa-RHYLNWVTRQ-MeArg-Y-NH2(SEQ ID NO:178)
从前体Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf) Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-TentaGel S RAM树脂(SEQ ID NO:176)起始， 用下述步骤继续肽合成：
使用66.5mg(3当量)Fmoc-12-氨基-4,7,10-三氧十二酸(PEG3-间隔 臂)，57.0mg(3当量)HATU和在1.2ml DMF中的16.7μl(3当量)NMM 进行人工双重偶联，2x 30min。用DMF(5x 1min)洗涤后，用30％ Pip/DMF切割Fmoc-基团，并且用标准方法用DMF洗涤树脂。
利用如用于PYY衍生物的在自动化多频合成仪上的标准方法所述的 方法，在SYRO1合成仪中自动进行下述Fmoc-Cys(Trt)-OH和 Fmoc-4-Abu-OH的双重偶联。最后，将树脂用DMF，EtOH，MTBE洗涤， 并干燥。
使用8ml TFA/硫代苯甲醚/硫代甲酚/TIS(95:2.5:2.5:3)进行与树脂的 切割4小时。将切割溶液过滤并浓缩至1-2ml，并通过加入MTBE沉淀 肽。通过离心收集白色固体，用MTBE洗涤2次，并干燥。
通过制备级反相HPLC纯化粗产物，产生无色固体。产量：28.0mg。
纯化方法
Figure BDA0002341415350001491
分析数据:
Figure BDA0002341415350001492
Figure BDA0002341415350001501
m/z:为C122H185N37O28S计算的＝2650.13；实测的:2650.3
Ac-IK(PEG3-Cys-4Abu-Dig)-Pqa-RHYLNWVTRQ-MeArg-Y-NH2(SEQ ID NO:179)
向在50μl DMSO中的15mg肽 Ac-IK(PEG3-Cys-4Abu-NH2)-Pqa-RHYLNWVTRQ-MeArg-Y-酰胺(SEQ ID NO:180)溶液中加入250μl PBS缓冲液pH 7.4，并且将溶液搅拌过夜。 通过HPLC控制二聚体形成。18小时后，形成约90％的二聚体。
向该溶液中加入7.3mg溶解在100μl DMF中的洋地黄毒苷-3-羧基- 甲基-N-羟基琥珀酰亚胺(Dig-OSu)，并且在室温搅拌5小时。然后，加入 另外的16.9mg溶解在100μl DMF中的Dig-OSu，并且搅拌2小时。进一 步加入在100μl DMF中的6.9mg，并且搅拌18小时。对于二聚体的还 原，加入TCEP，搅拌3小时，并且将溶液直接用于利用制备级反相HPLC 的纯化。
分析数据:
条件与关于SEQ ID NO:178所述的相同
用于制备级HPLC的梯度:38-58％B，在30min内。
产量:5.3mg
m/z:为C147H219N37O34S计算的＝3080.7；实测的:3079.8
PEG3-IK(PEG3-Cys-4Abu-Dig)-Pqa-RHYLNWVTRQ-MeArg-Y-NH2(SEQ ID NO:180)
自动化固相合成树脂结合的PYY序列：
PEG2-IK(ivDde)-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(tBu)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-TentaGel-RAM树脂(SEQ ID NO:181)
按照确定的方法(FastMoc 0.25mmol)在自动化Applied Biosystems ABI 433A肽合成仪中利用Fmoc化学进行肽合成。使用TentaGel RAM树脂 (上样:0.18mmol/g；RappPolymers，Germany)，通过顺序偶联相对应的 Fmoc-氨基酸(规格:0.25mmol)以重复的循环组装肽序列。在每个偶联步 骤中，通过用在N-甲基吡咯酮(NMP)中的20％哌啶处理树脂(3×2.5min) 而去除N-端Fmoc-基团。使用由在DMF中的HBTU/HOBt(分别为1mmol) 和DIPEA(2mmol)活化的Fmoc-保护的氨基酸(1mmol)进行偶联(45-60 min涡旋)。分别在位置2、3和14，氨基酸衍生物Fmoc-Lys(ivDde)-OH、 Fmoc-Pqa-OH和Fmoc-N-Me-Arg(Mtr)-OH结合到合成序列中。每个偶联步 骤后，通过用在NMP中的Ac2O(0.5M)、DIPEA(0.125M)和HOBt(0.015M) 混合物处理(10min涡旋)而将未反应的氨基基团封端。在每个步骤之间， 将树脂用N-甲基吡咯酮和DMF彻底洗涤。在自动化的双重偶联中，实现 空间位阻氨基酸的掺入。为了这一目的，将树脂用1mmol活化的结构单元 处理两次，在偶联循环之间没有封端步骤。靶序列完成后，用在NMP中 的20％哌啶去除N-端Fmoc-基团，并且在用HBTU/HOBt(分别为2mmol) 和DIPEA(4mmol)活化后，偶联2-[2-(甲氧基乙氧基)-乙氧基]乙酸(4 mmol)。然后，将树脂转移到涂釉的固相反应器中进行进一步的操作。
PEG2-IK(PEG3-Cys-Abu-NH2)-Pqa-RHYLNWVTRQ-MeArg-Y-NH2(SEQ ID NO:182)
为了去除ivDde基团，将肽树脂 (PEG2-IK(ivDde)-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(tBu)R(Pbf)Q( Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-TentaGel-RAM树脂；SEQ ID NO:181)用DMF溶胀 30分钟，然后用在DMF(60mL)中的2％水合肼溶液处理2小时。用异丙醇 和DMF彻底洗涤树脂后，加入在DMF(3mL)中的Fmoc-12-氨基-4,7,10-三 氧十二酸(PEG3-spacer)(887mg，2mmol)、HBTU(2mmol)、HOBt (2mmol)和2M二异丙基乙基胺(2mL，4mmol)溶液，并且将混合物摇动 3小时。将树脂用DMF洗涤，并且用在DMF中的20％吡啶混合物切割Fmoc- 基团。然后，将树脂用Fmoc-Cys(Trt)-OH(1.2g；2mmol)、HBTU/HOBt(分 别为2mmol)和DIPEA(4mmol)的混合物处理2小时。将树脂用DMF洗涤， 并且用DMF中的20％吡啶混合物切割Fmoc-基团，并偶联用HBTU/HOBt (分别为2mmol)和DIPEA(4mmol)活化的Fmoc-4-氨基丁酸(0.65g，2mmol) (2h)。N-端Fmoc-基团用在NMP中的20％吡啶去除，并且将树脂用DMF反复洗涤。然后，将树脂用三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(19mL:0.5mL: 0.5mL)的混合物处理2.5小时。将切割溶液过滤，并且加入冷(0℃)二异丙 醚(300mL)沉淀肽，提供无色固体，将其用二异丙醚反复洗涤。将粗产物 再次溶解在乙酸/水的混合物中，并冻干，通过制备级反相HPLC使用包含 0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)进行纯化。
分析级HPLC:tR＝8.6min(Merck Chromolith Performance RP-18e，100 x4.6mm，水+0.1％TFA→乙腈/水+0.1％TFA 80:20，25min)；ESI-MS(阳 离子模式):m/z:为C127H195N37O31S计算的:2768.3；实测的:1385.0 [M+2H]2+，计算的:1385.1；923.7[M+3H]3+，计算的:923.8；693.1[M+4H]4+， 计算的:693.1。
PEG2-IK(PEG3-Cys-4Abu-Dig)-Pqa-RHYLNWVTRQ-MeArg-Y-NH2(PEG2-PYY(PEG3- Cys-4Abu-Dig)(SEQ ID NO:183)
向肽PEG2-IK(PEG3-Cys-Abu-NH2)-Pqa-RHYLNWVTRQ- MeArg-Y-NH2(SEQ ID NO:182，4.1mg，1.48μmol)在DMF(3mL)中的溶 液中加入溶解在NMP(1mL)中的洋地黄毒苷-3-羧基-甲基-N-羟基琥珀酰 亚胺(0.81mg，1.48μmol)。加入在DMF中的三乙胺(0.41μl，97.6μmol)， 并且将混合物在室温翻转2小时。通过制备级反相HPLC使用包含0.1％ TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化粗 产物，以提供作为无色固体的PEG3-Cys-4Abu-Dig肽(1.2mg，0.375μmol， 25％)。
分析级HPLC:tR＝10.2min(Merck Chromolith Performance RP-18e， 100x4.6mm，水+0.1％TFA→乙腈/水+0.1％TFA 80:20，25min)； ESI-MS(阳离子模式):m/z:为C152H229N37O37S计算的:3198.8；实测的: 1067.3[M+3H]3+，计算的:1067.3。
iii)产生具有生物素或具有生物素和包含半胱氨酸的接头的PYY(3-36)-衍 生的多肽
Ac-IK(PEG2-生物素)-Pqa-RHYLNWVTRQ-MeArg-Y-酰胺/Ac-PYY(PEG2-Biot)(SEQ ID NO:184)
从常见的前体肽树脂(SEQ ID NO:176)起始，将肽用在1.2ml DMF中 的57.8mg(3当量)Fmoc-8-氨基-二氧辛酸(PEG2间隔体)、48.2mg(3当量) TBTU和33.3μl(6当量)NMM人工偶联2次，每次30分钟，并用DMF洗涤。 使用关于SEQ ID NO:176所述的标准方法，用30％Pip/DMF切割Fmoc-基 团，将树脂用DMF洗涤，并用在NMP中的生物素-OBt溶液(在1.2ml NMP中的48.9mg生物素(4当量.)、64.2mg TBTU(4当量)和44.4μl NMM(8 当量)，预先活化3min)处理2小时。用DMF、EtOH和MTBE洗涤后，将肽 树脂干燥。
如上文所述进行最后的切割。通过制备级反相HPLC使用30min内 22-52％B的梯度纯化粗产物，产生固体。产量：42mg。
纯化方法
Figure BDA0002341415350001531
分析数据:
Figure BDA0002341415350001532
m/z:为C122H181N37O27S计算的＝2630.10；实测的:2631.5
Ac-IK(PEG3-Cys-β-Ala-生物素)-Pqa-RHYLNWVTRQ-MeArg-Y-NH2/Ac-PYY(PEG3- Cys-β-Ala-Biot)(SEQ ID NO:185)
用前体Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But) R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-TentaGel S RAM树脂(SEQ ID NO:176) 起始，将所述肽与在1.2mlDMF中的66.5mg(3当量)Fmoc-12-氨基 -4,7,10-三氧十二酸(PEG3-间隔体)、57.0mg(3当量)HATU和16.7μl(3 当量)NMM人工偶联2次。在用DMF洗涤后，用30％Pip/DMF切割Fmoc- 基团，并且用DMF使用标准方法洗涤树脂。
在SYRO 1合成仪中通过标准方法自动化进行Fmoc-Cys(Trt)-OH和 Fmoc-β-Ala-OH的双重偶联后，人工加入在NMP中的生物素-OBt溶液(由 在1.2ml NMP中的48.9mg生物素(4当量)，64.2mg TBTU(4当量)和 44.4μl NMM(8当量)制备，预先活化3min)，并且在室温搅拌。2小时 后，将树脂用DMF、EtOH、MTBE洗涤，并干燥。
如上文所述进行最后的切割。如关于SEQ ID NO:184所述，通过制 备级反相HPLC纯化粗产物，产生无色固体。产量：41.4mg。
分析数据:
用于制备级HPLC的梯度:在30min内28-58％B。
m/z:为C131H197N39O30S2计算的＝2862.4；实测的:2862.4
Ac-IK(PEG3-Cys-PEG2-生物素)-Pqa-RHYLNWVTRQ-MeArg-Y-NH2/Ac-PYY(PEG3- Cys-PEG2-Biot)(SEQ ID NO:186)
用前体Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf) Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-TentaGel S RAM resin(SEQ ID NO:176)起始， 以下述步骤继续肽合成：
与Fmoc-PEG3-OH双重偶联(通过标准方法)，
Fmoc Cys(Trt)-OH的双重偶联(通过标准方法)，
Fmoc-PEG2-OH与在1.2ml DMF中的57.8mg(3当量)Fmoc-8-氨基- 二氧辛酸(PEG2间隔体)、48.2mg(3当量)TBTU和33.3μl(6当量)NMM 的双重偶联，2x 30min，以及用在1.2mlNMP中的48.9mg生物素(4 当量)、64.2mg TBTU(4当量)和44.4μl NMM(8当量)溶液生物素化，单 次偶联2小时。
从树脂上切割下来，如关于SEQ ID NO:184所述进行纯化和分析。 产量：47.7mg。
分析数据:
条件与用于SEQ ID NO:184的相同。
用于制备级HPLC的梯度:在30min内25-45％B。
m/z:为C134H203N39O32S2计算的＝2936.5；实测的:2937.8
iv)产生具有荧光素或具有荧光素和包含半胱氨酸的接头的PYY(3-36)-衍 生的多肽
Ac-IK(PEG3-Cys-4-Abu-5-Fluo)-Pqa-RHYLNWVTRQ-MeArg-Y-NH2/Ac-PYY(PEG3- Cys-4-Abu-5-Fluo)(SEQ ID NO:187)
从前体Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf) Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-TentaGel S RAM树脂(SEQ ID NO:176)起始， 与SEQ ID NO:179类似地继续肽合成。为了标记，加入在DMF中的54.2 mg 5-羧基荧光素、33.1mg HOBt和35.6μlDIC的溶液，并且在室温搅拌 18小时。
从树脂上切割下来，如关于SEQ ID NO:179所述进行纯化和分析。 产量：41.6mg。
分析数据:
用于制备级HPLC的梯度:在30min内29-49％B。
m/z:为C143H195N37O34S计算的＝3008.44；实测的:3007.2
Ac-IK(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)-Pqa-RHYLNWVTRQ-MeArg-Y-NH2/Ac-PYY(PEG3- Cys-PEG2-5-Fluo)(SEQ ID NO:188)
用前体Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf) Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-TentaGel S RAM树脂(SEQ ID NO:176)起始， 以下述步骤继续肽合成：
与Fmoc-PEG3-OH双重偶联(通过标准方法)，
Fmoc Cys(Trt)-OH的双重偶联(通过标准方法)，
双重偶联Fmoc-PEG2-OH(see SEQ ID NO:186)。
为了标记，将肽树脂用在DMF中的56.7mg 5-羧基荧光素、34.6mg HOBt和37.3μlDIC的溶液搅拌18小时。从树脂上切割下来，如关于SEQ ID NO:185所述进行纯化和分析。产量：41.7mg。
分析数据:
用于制备级HPLC的梯度:在30min内34-64％B。
m/z:为C145H199N37O36S1计算的＝3068.5；实测的:3069.2
b)半抗原-标记的荧光染料:
i)产生洋地黄毒苷化的Cy5
合成参见WO 2012/093068。
ii)产生Dig-Cys-MR121
在Erlenmeyer烧瓶中，将1,2-二氨基-丙烷三苯甲基树脂(250mg， 0.225mmol，上样0.9mmol/g)用DMF(5mL)溶胀30分钟。然后，向树脂 中加入在DMF(2mL)中的Fmoc-Cys(Trt)-OH(395mg，0.675mmol)溶液 和在DMF(8mL)中的HATU(433mg，1.2375mmol)与HOAt(164mg， 1.2375mmol)的溶液。向该混悬液中加入DIPEA(385μL，2.25mmol)，并 将混合物在环境温度搅拌16小时，过滤，并且用DMF反复洗涤。偶联 步骤后，通过用在DMF中的Ac2O(20％)混合物处理，将未反应的氨基 基团封端，然后是用DMF的洗涤步骤。N-端Fmoc基团的去除通过用在 DMF中的哌啶(20％)处理2小时而实现。之后，将树脂用DMF和异丙醇 彻底洗涤，并再次用DMF洗涤，然后用在DMF(10mL)中的1％DIPEA 中的MR121(25mg，0.05mmol)溶液处理16小时。过滤并用DMF洗涤 后，将树脂用三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(9mL:9mL:1mL)的混合物 处理3小时。将切割溶液过滤，在减压下浓缩，并且将得到的固体通过制 备级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化，并冻干。分析级HPLC:tR＝7.7min (Merck Chromolith Performance RP-18e，100x4.6mm，水+0.1％TFA→ 乙腈/水+0.1％TFA 80:20，25min。然后，将该中间体的一部分(10.0mg， 17.6μmol)溶解在DMF(1mL)中，并且加入在DMF(1mL)中的洋地黄毒 苷-3-羧基-甲基-N-羟基琥珀酰亚胺(9.6mg，17.6μmol)溶液和在DMF(2 mL)中的1％三乙胺，将混合物翻转16小时。之后将溶液浓缩，并且通 过制备级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化靶标化合物。产量：1.0mg。 分析级HPLC:tR＝10.1min(Merck Chromolith Performance RP-18e，100x4.6mm，水+0.1％TFA→乙腈/水+0.1％TFA 80:20，25min)。ESI-MS (阳离子模式):m/z:关于[M]计算的:996.3；实测的:995.8[M]1+。
iii)产生DIG-Cys-Ahx-Cy5
在Erlenmeyer烧瓶中，将1,2-二氨基-丙烷三苯甲基树脂(250mg， 0.225mmol，上样0.9mmol/g)用DMF(5mL)溶胀30分钟。然后，向树脂 中加入在DMF(2mL)中的Fmoc-Cys(Trt)-OH(395mg，0.675mmol)溶液 和在DMF(8mL)中的HATU(433mg，1.2375mmol)与HOAt(164mg， 1.2375mmol)溶液，向该混悬液中加入DIPEA(385μL，2.25mmol)，并将 混合物在环境温度搅拌16小时，过滤，并且用DMF反复洗涤。偶联步 骤后，通过用在DMF中的Ac2O(20％)混合物处理，将未反应的氨基基 团封端，然后是用DMF的洗涤步骤。N-端Fmoc基团的去除通过用在DMF 中的哌啶(20％)处理而实现。之后，将树脂用DMF和异丙醇彻底洗涤， 并再次用DMF洗涤，然后用在DMF(10mL)中的1％DIPEA中的 Cy5-Mono NHS-酯(25mg，0.0316mmol)溶液处理16小时。过滤并用DMF 洗涤后，将树脂用三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(9mL:9mL:1mL)的混 合物处理3小时。将切割溶液过滤，在减压下浓缩，并且将得到的固体重 新溶解在水中并冻干。中间体的纯化通过制备级反相HPLC使用包含 0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm) 实现，冻干之后产生蓝色固体。分析级HPLC:tR＝6.2min(Merck Chromolith Performance RP-18e，100x 4.6mm，水+0.1％TFA→乙腈/ 水+0.1％TFA 80:20，25min)。然后，将该中间体的一部分(6.5mg，7.9μmol) 溶解在DMF(1mL)中，并且加入在DMF(1mL)中的Dig-Amcap-OSu(5.2 mg，7.9μmol)和在DMF(2mL)中的1％三乙胺，将混合物翻转16小时。 之后将溶液浓缩，并且通过制备级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈 /水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化靶标化合物。 产量：3mg。分析级HPLC:tR＝8.7min(Merck Chromolith Performance RP-18e，100x4.6mm，水+0.1％TFA→乙腈/水+0.1％TFA 80:20，25 min)。ESI-MS(阳离子模式):m/z:关于[M]计算的:1360.0；实测的:1360.7 [M+H]1+。
iv)产生生物素-eda-Dy636
向在0.1M K3PO4缓冲液(pH 8.0，500μL)中的生物素-乙二胺氢溴酸 酯(2.14mg，5.83μmol)溶液中国加入在0.1M K3PO4缓冲液(pH 8.0， 500μL)中的Dy636-OSu(5mg，5.83μmol)溶液，并且将得到的混合物在 环境温度翻转2小时，过滤，并且通过制备级反相HPLC使用包含0.1％ TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)分离靶标化合物。冻干后，获得作为无色固体(2.8mg，48％％)的Dy636-乙二胺 -Bi缀合物。分析级HPLC:tR＝8.5min(Merck Chromolith Performance RP-18e，100x 4.6mm，水+0.1％TFA→乙腈/水+0.1％TFA 80:20，25 min)；ESI-MS(阳离子模式):m/z:为C50H65N6O10S3计算的:1006.3；实测 的:1007.3[M+H]+。
v)产生生物素-Ser-Dy636
步骤1:生物素-O2Oc-Ser-O2Oc-DADOO-NH2
在O-二-(氨基乙基)乙二醇三苯甲基树脂(176mg，0.125mmol，上样 0.71mmol/g，Novabiochem)上，连续偶联Fmoc-O2Oc-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-O2Oc-OH(全部来自Iris Biotech)和DMTr-D-生 物素(Roche)。按照确定的方法(FastMoc 0.25mmol)在自动化Applied Biosystems ABI 433A肽合成仪中利用Fmoc化学进行肽合成(如关于SEQ ID NO:180所述)。
合成后，将树脂用DMF、甲醇、二氯甲烷彻底洗涤，并且真空干燥。 然后，将树脂置于Erlenmeyer烧瓶中，并用三氟乙酸、水和三异丙基硅 烷(9.5mL:250μL:250μL)的混合物在室温处理2小时。将切割溶液过 滤，并且通过加入冷(0℃)二异丙醚(80mL)沉淀肽，提供无色固体，将其 用二异丙醚反复洗涤。将粗产物再次溶解在水中，冻干，然后通过制备级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生无色固体。产量:56mg(60％)。 分析级HPLC:tR＝4.5min(MerckChromolith Performance RP-18e，100x 3mm，水+0.1％TFA→乙腈/水+0.1％TFA 80:20，25min)。ESI-MS(阳 离子模式):m/z:关于[M]计算的:751.9；实测的:752.4[M+H]+；376.9[M+2H]2+。
步骤2:生物素-O2Oc-Ser-O2Oc-DADOO-Dy-636(Bi-Ser-Dy-636)
将肽(5.3mg，7.0μmol)溶解在200mM磷酸钾缓冲液pH 7.5(583μL) 中。将Dy-636NHS-酯(4mg，4.7μmol，Dyomics)溶解在水(583μL)中， 并且加入到肽溶液中。将反应溶液在室温搅拌2小时，然后通过制备级反 相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度(MerckChromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生蓝色固体。产量:3.9mg(55％)。分析级HPLC:tR＝8.3min(Merck Chromolith Performance RP-18e，100x 3mm，水+0.025％TFA→乙腈/水+0.023％TFA 80:20，25min)。 ESI-MS(阳离子模式):m/z:为[M]计算的:1472.8；实测的:1472.8 [M+H]+；737.0[M+2H]2+。
vi)产生生物素-Cys-Dy636
步骤1:生物素-O2Oc-Cys-O2Oc-DADOO-NH2
在O-二-(氨基乙基)乙二醇三苯甲基树脂(352mg，0.25mmol，上样 0.71mmol/g，Novabiochem)上，连续偶联Fmoc-O2Oc-OH、 Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-O2Oc-OH(全部来自Iris Biotech)和DMTr-D-生 物素(Roche)。按照确定的方法(FastMoc 0.25mmol)在自动化Applied Biosystems ABI 433A肽合成仪中利用Fmoc化学进行肽合成(如关于SEQ ID NO:180所述)。
合成后，将树脂用DMF、甲醇、二氯甲烷彻底洗涤，并且真空干燥。 然后，将树脂置于Erlenmeyer烧瓶中，并用三氟乙酸、水和三异丙基硅 烷(9.5mL:250μL:250μL)的混合物在室温处理2小时。将切割溶液过 滤，并且通过加入冷(0℃)二异丙醚(100mL)沉淀肽，提供无色固体，将 其用二异丙醚反复洗涤。将粗产物再次溶解在水中，冻干，然后通过制备 级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生无色固体。产量:79mg(41％)。 分析级HPLC:tR＝5.3min(MerckChromolith Performance RP-18e，100x 3mm，水+0.1％TFA→乙腈/水+0.1％TFA 80:20，25min)。ESI-MS(阳 离子模式):m/z:关于[M]计算的:767.9；实测的:768.4[M+H]+；384.8[M+2H]2+。
步骤2:生物素-O2Oc-Cys(TNB)-O2Oc-DADOO-NH2
将肽(30mg，39μmol)溶解在100mM磷酸钾缓冲液pH 7.5(4mL)中， 并且加入5,5′-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(77mg，195μmol)。将混合物在室 温搅拌30分钟，然后通过制备级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/ 水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生 黄色固体。产量:31mg(83％)。分析级HPLC:tR＝5.4min(MerckChromolith Performance RP-18e，100x 3mm，水+0.025％TFA→乙腈/ 水+0.023％TFA 80:20，25min)。ESI-MS(阳离子模式):m/z:关于[M]计 算的:965.1；实测的:965.4[M+H]+；483.3[M+2H]2+。
步骤3:生物素-O2Oc-Cys(TNB)-O2Oc-DADOO-Dy-636
将TNB保护的肽(1.35mg，1.4μmol)溶解在200mM磷酸钾缓冲液 pH 7.5(291μL)中。将Dy-636 NHS-酯(1mg，1.2μmol，Dyomics)溶解在 水(291μL)中，并且加入到肽溶液中。将反应溶液在室温搅拌1小时，然 后通过制备级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生蓝色固体。产 量:1mg(50％)。分析级HPLC:tR＝9.0min(Merck Chromolith Performance RP-18e，100x 3mm，水+0.025％TFA→乙腈/水+0.023％TFA 80:20， 25min)。ESI-MS(阳离子模式):m/z:关于[M]计算的:1686.0；实测的: 1686.7[M+H]+；844.2[M+2H]2+。
步骤4:生物素-O2Oc-Cys-O2Oc-DADOO-Dy-636(Bi-Cys-Dy-636)
将用TNB保护的且用染料标记的肽(1mg，0.6μmol)溶解在200mM 磷酸钾缓冲液pH7.5(250μL)和水(192μL)的混合物中。加入100mM三 (2-羧乙基)膦盐酸盐溶液(58μL)，将反应混合物在室温搅拌30分钟。通 过制备级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)进行纯化，冻干后产生蓝色固体。 产量：0.7mg(79％)。分析级HPLC:tR＝8.6min(Merck Chromolith Performance RP-18e，100x3mm，水+0.025％TFA→乙腈/水+0.023％ TFA 80:20，25min)。ESI-MS(阳离子模式):m/z:关于[M]计算的:1488.9； 实测的:1488.6[M+H]+；745.1[M+2H]2+。
vii)产生生物素-Cys-Cy5
步骤1:生物素-O2Oc-Cys-O2Oc-DADOO-NH2
在O-二-(氨基乙基)乙二醇三苯甲基树脂(352mg，0.25mmol，上样 0.71mmol/g，Novabiochem)上，连续偶联Fmoc-O2Oc-OH、 Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-O2Oc-OH(全部来自Iris Biotech)和DMTr-D-生 物素(Roche)。按照确定的方法(FastMoc 0.25mmol)在自动化Applied Biosystems ABI 433A肽合成仪中利用Fmoc化学进行肽合成(如关于SEQ ID NO:180所述)。
合成后，将树脂用DMF、甲醇、二氯甲烷彻底洗涤，并且真空干燥。 然后，将树脂置于Erlenmeyer烧瓶中，并用三氟乙酸、水和三异丙基硅 烷(9.5mL:250μL:250μL)的混合物在室温处理2小时。将切割溶液过 滤，并且通过加入冷(0℃)二异丙醚(100mL)沉淀肽，提供无色固体，将 其用二异丙醚反复洗涤。将粗产物再次溶解在水中，冻干，然后通过制备 级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生无色固体。产量：79mg(41％)。 分析级HPLC:tR＝5.3min(MerckChromolith Performance RP-18e，100x 3mm，水+0.1％TFA→乙腈/水+0.1％TFA 80:20，25min)。ESI-MS(阳 离子模式):m/z:关于[M]计算的:767.9；实测的:768.4[M+H]+；384.8[M+2H]2+。
步骤2:生物素-O2Oc-Cys(TNB)-O2Oc-DADOO-NH2
将肽(30mg，39μmol)溶解在100mM磷酸钾缓冲液pH 7.5(4mL)中， 并且加入5,5′-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(77mg，195μmol)。将混合物在室 温搅拌30分钟，然后通过制备级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/ 水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生 黄色固体。产量:31mg(83％)。分析级HPLC:tR＝5.4min(MerckChromolith Performance RP-18e，100x 3mm，水+0.025％TFA→乙腈/ 水+0.023％TFA 80:20，25min)。ESI-MS(阳离子模式):m/z:关于[M]计 算的:965.1；实测的:965.4[M+H]+；483.3[M+2H]2+。
步骤3:生物素-O2Oc-Cys(TNB)-O2Oc-DADOO-Cy5
将TNB保护的肽(9.9mg，10.3μmol)溶解在200mM磷酸钾缓冲液 pH 7.5(1026μL)中。将Cy5-Mono NHS-酯(6.5mg，8.2μmol，GE Healthcare) 溶解在水(1026μL)中，并且加入到肽溶液中。将反应溶液在室温搅拌2 小时，然后通过制备级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度 (Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生蓝色固体。产量:10mg(80％)。分析级HPLC:tR＝7.2min(Merck Chromolith Performance RP-18e，100x 3mm，水+0.025％TFA→乙腈/水+0.023％ TFA 80:20，25min)。ESI-MS(阳离子模式):m/z:关于[M]计算的:1603.9； 实测的:1604.9[M+H]+；803.1[M+2H]2+。
步骤4:生物素-O2Oc-Cys-O2Oc-DADOO-Cy5(Bi-Cys-Cy5)
将用TNB保护的且用染料标记的肽(10mg，6.1μmol)溶解在200mM 磷酸钾缓冲液pH7.5(1522μL)和水(1218μL)的混合物中。加入100mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液(304μL)，将反应混合物在室温搅拌30分钟。 通过制备级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)进行纯化，冻干后产生蓝色固体。 产量:7.6mg(86％)。分析级HPLC:tR＝6.4min(Merck Chromolith Performance RP-18e，100x3mm，水+0.025％TFA→乙腈/水+0.023％ TFA 80:20，25min)。ESI-MS(阳离子模式):m/z:关于[M]计算的:1406.8； 实测的:1406.8[M+H]+；704.0[M+2H]2+。
viii)产生生物素-Ser-Cy5
步骤1:生物素-O2Oc-Ser-O2Oc-DADOO-NH2
在O-二-(氨基乙基)乙二醇三苯甲基树脂(176mg，0.125mmol，上样 0.71mmol/g，Novabiochem)上，连续偶联Fmoc-O2Oc-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-O2Oc-OH(全部来自Iris Biotech)和DMTr-D-生 物素(Roche)。按照确定的方法(FastMoc 0.25mmol)在自动化Applied Biosystems ABI 433A肽合成仪中利用Fmoc化学进行肽合成(如关于SEQ ID NO:180所述)。
合成后，将树脂用DMF、甲醇、二氯甲烷彻底洗涤，并且真空干燥。 然后，将树脂置于Erlenmeyer烧瓶中，并用三氟乙酸、水和三异丙基硅 烷(9.5mL:250μL:250μL)的混合物在室温处理2小时。将切割溶液过 滤，并且通过加入冷(0℃)二异丙醚(80mL)沉淀肽，提供无色固体，将其 用二异丙醚反复洗涤。将粗产物再次溶解在水中，冻干，然后通过制备级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生无色固体。产量:56mg(60％)。 分析级HPLC:tR＝4.5min(MerckChromolith Performance RP-18e，100x 3mm，水+0.1％TFA→乙腈/水+0.1％TFA 80:20，25min)。ESI-MS(阳 离子模式):m/z:关于[M]计算的:751.9；实测的:752.4[M+H]+；376.9[M+2H]2+。
步骤2:生物素-O2Oc-Ser-O2Oc-DADOO-Cy5(Bi-Ser-Cy5)
将肽(5.7mg，7.6μmol)溶解在200mM磷酸钾缓冲液pH 7.5(789μL) 中。将Cy5-MonoNHS-酯(5mg，6.3μmol，GE Healthcare)溶解在水 (789μL)中，并且加入到肽溶液中。将反应溶液在室温搅拌2小时，然后 通过制备级反相HPLC使用包含0.1％TFA的乙腈/水梯度(Merck Chromolith prep RP-18e柱，100x25mm)纯化，冻干后产生蓝色固体。产 量:6mg(58％)。分析级HPLC:tR＝6.1min(Merck Chromolith Performance RP-18e，100x 3mm，水+0.025％TFA→乙腈/水+0.023％TFA80:20， 25min)。ESI-MS(阳离子模式):m/z:关于[M]计算的:1390.72；实测的: 1391.2[M+H]+。
实施例9
重组人源化的抗-生物素抗体与生物素-标记的化合物(半抗原化的化合物) 的结合
为了确定人源化方法和后续引入半胱氨酸释放产生保留完全的结合 活性的衍生物，进行下述实验。
使用Octet QK仪器(Fortebio Inc.)通过生物层干涉测量(BLI)技术分 析重组抗-生物素抗体衍生物的结合特性。充分建立该系统用于分子相互 作用的研究。BLi-技术是基于测量从生物传感器尖端表面和内部参比反射 的白光的干扰模式。分子与生物传感器尖端的结合导致可以测量的干扰模 式的转换。为了分析上述人源化方法是否消除抗-生物素抗体结合生物素 的能力，直接比较抗体的嵌合版本和人源化版本在它们结合生物素化的蛋 白的能力方面的特性。通过在抗-huIgG Fc抗体捕获(anti-huIgG Fc antibodyCapture(AHC))生物传感器(Fortebio Inc.)捕获抗-生物素抗体而 进行结合研究。首先，将生物传感器在抗体溶液中温育1分钟，所述抗体 溶液在20mM组氨酸、140mM NaCl、pH 6.0中，浓度为0.5mg/ml。然 后，将生物传感器在1x PBS pH 7.4中温育1分钟，以达到稳定的基线。 通过将抗体-包被的生物传感器在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0 中包含浓度为0.06mg/ml的生物素化的蛋白的溶液中温育5分钟而测量 结合。在1x PBS pH 7.4中监测解离5分钟。直接比较关于嵌合的和人源 化的抗-生物素抗体得到的结合曲线。
所述抗体的人源化版本显示出与嵌合抗体相等的或甚至比其更好的 与生物素化的抗原的结合。对于在Kabat位置VH53具有Cys突变的人源 化体也是这样。生物素化的蛋白表现出针对所述生物传感器的残留的非特 异性结合，当用不结合生物素的赫赛汀(Herceptin)包被生物传感器时， 所述残留的非特异性结合减少。因此，在其人源化的变体(其由SEQ ID NO:44和48，SEQ ID NO:60和64中所述的序列定义)中保留抗-生物素 抗体的功能性。
表面等离子体共振
表面等离子体共振测量在
Figure BDA0002341415350001651
T200仪器(GE Healthcare BiosciencesAB，Sweden)上在25℃进行。通过使用GE Healthcare (BR-1000-50)提供的标准胺偶联试剂盒，在pH 5.0在CM3芯片(GE Healthcare，BR-1005-36)上偶联约4300个共振单位(RU)的捕获系统(来 自人抗体捕获试剂盒的10μg/ml抗-人捕获(IgG Fc)，BR-1008-39，GEHealthcare Biosciences AB，Sweden)。用于胺偶联的运行缓冲液是HBS-N (10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，GE Healthcare，BR-1006-70)。 用于之后的结合研究的运行和稀释缓冲液是PBS-T(包含0.05％吐温20 的10mM磷酸盐缓冲盐水)pH 7.4。通过以5μl/min的流速注入2nM溶 液60秒而捕获人源化的抗-生物素抗体。将生物素化的siRNA用PBS-T 稀释为0.14-100nM的浓度(1:3连续稀释)。通过以30μl/min的流速注 入每个浓度180秒而测量结合，解离时间为600秒。通过以μl/min的流 速用3M MgCl2溶液洗涤30秒而使表面再生。利用BIAevaluation软件(GE Healthcare Biosciences AB，Sweden)来评价数据。通过减去从抗-人IgG Fc 表面获得的反应而校正本体折射率差异。还减去空白注射(＝双重参比)。 为了计算KD和动力学参数，使用朗格缪尔1:1模型(Langmuir 1:1model)。
对人源化的抗-生物素抗体SEQ ID NO:44和48与人源化的抗-生物 素抗体VH53CSEQ ID NO:60和64通过表面等离子体共振(SPR)进行动 力学结合分析。浓度为2nM的抗-生物素抗体由结合在CM3传感器芯片 上的抗-人IgG Fc抗体捕获。在浓度0.41，1.23，3.7，11.1，33.3，100和 300nM记录生物素化的siRNA(Mw:13868Da)的结合。测量一式两份进 行。关于人源化的抗-生物素抗体和人源化的抗-生物素抗体VH53C计算 的KD分别为0.633nM和0.654nM。
实施例10
产生半抗原化的化合物与抗-半抗原抗体的非共价复合物
通用方法：
抗-半抗原抗体与半抗原化的化合物(＝缀合有效负载物的半抗原)的 复合物的产生将导致确定的复合物，并且应该确保在这些复合物中的化合 物(＝有效负载物)保留其活性。为了产生半抗原化的化合物与各自的抗-半 抗原抗体的复合物，将所述半抗原化的化合物溶解在H2O中至1mg/ml 的终浓度。将抗体在20mM组氨酸缓冲液，140mM NaCl，pH＝6.0中浓 缩至1mg/ml(4.85μM)。半抗原化的有效负载物和抗体以2:1的摩尔比例 (化合物比抗体)通过吸上吸下而混合，并且在室温(RT)温育15分钟。
备选地，将半抗原化的化合物溶解在100％DMF至10mg/ml的终浓 度。将抗体在50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH＝8.2中浓缩至10mg/ml 的终浓度。将半抗原化的化合物和抗体以2.5:1的摩尔比例(化合物比抗 体)通过吸上吸下而混合，并且在室温(RT)和350rpm温育60分钟。
用于形成半抗原化的荧光染料与抗-半抗原抗体的复合物–非共价洋地黄毒苷- Cy5复合物–的示例性方法
使用人源化的和鼠抗-洋地黄毒苷抗体或双特异性抗-洋地黄毒苷抗 体衍生物作为抗体成分。为了产生洋地黄毒苷化的Cy5与抗-洋地黄毒苷 抗体的复合物，将Cy5-洋地黄毒苷缀合物溶解在PBS中至终浓度为 0.5mg/ml。抗体以在由20mM组氨酸和140mM NaCl构成的pH 6的缓 冲液中1mg/ml(约5μM)的浓度使用。将洋地黄毒苷化的Cy5和抗体以 2:1的摩尔比例(洋地黄毒苷化的Cy5比抗体)混合。该方法产生确定组 成的复合物的同质性制备物。
可以通过在大小排阻柱上确定抗体-缔合的荧光团的荧光(650/667nm) 而监测复合反应。这些实验的结果证明复合仅在抗体包含针对洋地黄毒苷 的结合特异性时发生。不具有针对洋地黄毒苷的结合特异性的抗体不结合 洋地黄毒苷-Cy5缀合物。对于二价抗-洋地黄毒苷抗体，直到2:1的洋地 黄毒苷-Cy5缀合物比抗体的比例，可以观察到增加的信号。然后，组合 物依赖性的荧光信号达到平台。
用于形成半抗原化的荧光染料与抗-半抗原抗体的复合物–生物素-Cy5/嵌合的 抗-生物素抗体(人IgG亚类)复合物–的示例性方法
为了形成包含半胱氨酰化的接头的生物素-衍生的-Cy5(生物素 -Cys-Cy5)的复合物，将0.16mg生物素-Cys-Cy5溶解在100％DMF中至 终浓度为10mg/ml。1mg所述抗体以在由50mM Tris-HCl、1mM EDTA 构成的pH 8.2的缓冲液中10.1mg/ml(约69μM)的浓度使用。将生物素 -Cys-Cy5和抗体以2.5:1的摩尔比例(生物素-Cys-Cy5比抗体)混合，并在 室温(RT)以350rpm摇动温育60分钟。如实施例11a所述，通过 SDS-PAGE分析得到的缀合物。荧光的检测如实施例11a所述进行。
用于形成生物素化的荧光染料与抗-生物素抗体的缀合物–生物素-Ser-Cy5/人源 化的抗-生物素抗体–的示例性方法：
为了产生在接头内包含丝氨酸残基的生物素-衍生的-Cy5(生物素 -Ser-Cy5)的复合物，将0.61mg生物素-Ser-Cy5溶解在20mM组氨酸， 140mM NaCl，pH 6.0中至终浓度为10mg/ml。18.5mg人源化的抗-生物 素抗体以在由Tris-HCl、1mM EDTA构成的pH 8.2的缓冲液中10mg/ml (约69μM)的浓度使用。将生物素-Ser-Cy5和抗体以2.5:1的摩尔比例(生 物素-Ser-Cy5比抗体)混合，并且在室温(RT)以350rpm摇动温育60分 钟。然后，使用Superdex200 16/60高负载制备级柱(GE Healthcare)，以 1.5ml/min的流速，和以20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0作为移动 相，将样品进行大小排阻层析。收集峰级分，并且通过SDS-PAGE分析 纯度。染料与抗体的比例通过下述计算：(1)测量样品在波长280nm(蛋 白)和650nm(Cy5)的吸光度；(2)使用式：标记的蛋白的A650/ε(Cy5)* 蛋白浓度(M)＝摩尔/摩尔蛋白，其中ε(Cy5)＝250000M-1cm-1，复合物的 A650＝47.0，蛋白浓度为86.67μM。得到的染料比抗体分子的比率为2.17， 其表示所有的抗体互补位被生物素-Cy5分子饱和。
用于形成半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的复合物–洋地黄毒苷-PYY(3-36)/ 抗-洋地黄毒苷抗体复合物–的示例性方法
为了产生洋地黄毒苷化的多肽与抗-洋地黄毒苷抗体的非共价复合 物，还将鼠杂交瘤来源的抗体(从10mM KPO4，70mM NaCl；pH 7.5冻 干)溶解在12ml水中，并且针对包含20mM组氨酸、140mM NaCl pH 6.0 的溶液偷袭，产生在11ml缓冲液中的300mg(2x 10-6mol)(c＝27.3 mg/ml)。在1小时内以4部分2.85mg加入洋地黄毒苷-PYY(3-36)缀合物(11.57mg，4x 10-6mol，2当量)，并在室温再温育一小时。复合反应结束 后，经由Superdex200 26/60GL柱(320ml)，在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中，以2.5ml/min的流速，通过大小排阻层析纯化复合物。 洗脱下来的复合物收集在4ml级分中，汇合，并且针对0.2μm滤器除菌， 产生浓度为14.3mg/ml的234mg复合物。以相似的方式，为了产生人源 化的抗-洋地黄毒苷抗体的复合物，将抗体调整至在20mM组氨酸，140 mM NaCl，pH 6.0中10.6mg/ml(9.81mg，6.5x10-8mol，0.93ml)的浓度。 向所述抗体溶液中加入作为冻干物的0.57mg＝1.97x10-7mol＝3.03当量 的洋地黄毒苷化的多肽(DIG-PYY)。将多肽和抗体在室温温育1.5小时。 经由Superose 6 10/300GL柱，在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0 中，以0.5ml/min的流速，通过大小排阻层析去除过量的多肽。洗脱下来 的复合物收集在0.5ml级分中，汇集，并且用0.2μm滤器除菌，产生浓 度为1.86mg/ml的4.7mg复合物。
由于在大小排阻层析中存在单个峰，将得到的半抗原化的多肽-抗-半 抗原抗体复合物定义为单体IgG样分子。得到的复合物定义为每个抗体 分子携带两个洋地黄毒苷-PYY衍生物的单体IgG样分子。通过大小排阻 层析验证这些肽复合物的确定组成，这还表明不存在蛋白聚集物。这些双 特异性肽的确定的组成(和2:1的多肽与蛋白的比例)还通过SEC-MALLS (大小排阻层析-多角度光散射)得以证实。对于SEC-MALLS分析，使 用1x PBSpH 7.4作为移动相，将100-500μg各种样品以0.25-0.5ml/min 的流速应用到Superdex 20010/300 GL大小排阻柱上。使用Wyatt MiniDawn TREOS/QELS检测器检测光散射，用WyattOptilab rEX-检测器 测量折射率。用软件ASTRA(版本5.3.4.14)分析得到的数据。SEC-MALLS 分析的结构提供关于复合物的质量、半径和大小的信息。然后，将这些数 据与对应的未复合的抗体的那些数据进行比较。这些实验的结果证明，将 洋地黄毒苷化的-PYY暴露于抗-洋地黄毒苷抗体产生每个抗体分子包含 两个洋地黄毒苷-PYY衍生物的复合物。因此，洋地黄毒苷化的PYY可 以在确定的位点(结合区)和以确定的化学计量与抗-洋地黄毒苷抗体复 合。
通过表面等离子体共振研究表征复合物提供了关于复合反应产生确 定的且完全复合的分子的另外的证据。抗-洋地黄毒苷抗体可以结合到 SPR芯片上，这导致信号增加。后续加入洋地黄毒苷-PYY缀合物导致进 一步的信号增加，直到所有的结合位点都完全被占据。在这些条件，加入 更多的洋地黄毒苷-PYY不使信号进一步增加。这表明复合反应是特异性 的，并且信号不是由洋地黄毒苷化的多肽的非特异性粘性(non-specificstickiness)引起的。
用于形成半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的复合物-Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala- Biot/嵌合的抗-生物素抗体复合物-的示例性的方法
为了产生包含半胱氨酰化的接头的生物素化的-PYY-多肽的非共价 复合物，将0.19mg Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot溶解在100％DMF至 10mg/ml的浓度。抗体以在由50mM Tris-HCl、1mM EDTA构成的pH 8.2 的缓冲液中10.7mg/ml(约73μM)的浓度使用。 Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot和抗体以2.5:1的摩尔比例 (Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot比抗体)混合，并且在室温(RT)和350rpm 温育60分钟。由于在大小排阻层析中存在单一峰，将得到的复合物定义 为单体IgG样分子(95％的单体)。得到的复合物进一步通过SDS-PAGE和后续的蛋白质印迹分析进行分析。将10μg的复合物与4x LDS样品缓 冲液(Invitrogen)混合，并且在95℃温育5分钟。将样品用于4-12％Bis-Tris 聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE，Invitrogen)，其以200V和120mA运行35分 钟。将在聚丙烯酰胺凝胶上分离的分子以25V和160mA转移到PVDF 膜(0.2μm孔尺寸，Invitrogen)40分钟。将膜在1x PBST(1x PBS+0.1％吐温20)中的1％(w/v)脱脂乳中在室温(RT)封闭1小时。将膜在1x PBST 中洗涤3次持续5分钟，然后用以1:2000稀释液使用的链霉抗生物素蛋 白-POD-缀合物(2900U/ml，Roche)温育。使用Lumi-Light蛋白质印迹底 物(Roche)进行与膜上的生物素结合的链霉抗生物素蛋白-POD的检测。
用于产生半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的复合物-Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2- Biot)/嵌合的抗-生物素抗体复合物-的示例性方法
为了产生包含半胱氨酰化的接头的生物素化的-PYY-多肽的非共价 复合物，将0.16mg Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot溶解在100％DMF中至 10mg/ml的浓度。抗体以在由50mM Tris-HCl、1mM EDTA构成的pH 8.2 的缓冲液中10.7mg/ml(约73μM)的浓度使用。 Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot和抗体以2.5:1的摩尔比例 (Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot比抗体)混合，并且在室温(RT)和350rpm 温育60分钟。通过大小排阻层析，将得到的复合物定义为63％的单体IgG 样分子和37％的二聚体可溶性聚集物。得到的复合物进一步通过 SDS-PAGE和后续的蛋白质印迹分析进行分析。将10μg的复合物与4x LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合，并且在95℃温育5分钟。将样品用于 4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE，Invitrogen)，其以200V和120 mA运行35分钟。将在聚丙烯酰胺凝胶上分离的分子以25V和160mA 转移到PVDF膜(0.2μm孔尺寸，Invitrogen)40分钟。将膜在1x PBST(1x PBS+0.1％吐温20)中的1％(w/v)脱脂乳中在室温(RT)封闭1小时。 将膜在1x PBST中洗涤3次持续5分钟，然后用以1:2000稀释液使用的 链霉抗生物素蛋白-POD-缀合物(2900U/ml，Roche)温育。使用Lumi-Light 蛋白质印迹底物(Roche)进行与膜上的生物素结合的链霉抗生物素蛋白- POD的检测。
用于形成半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的复合物-Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5- Fluo)/嵌合的抗-荧光素抗体复合物-的示例性方法
为了产生包含半胱氨酰化接头的荧光素-缀合的-PYY-多肽的非共价 复合物，将0.33mg Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo溶解在100％DMF 中至10mg/ml的浓度。抗体以在由50mM Tris-HCl、1mM EDTA构成的 pH 8.2的缓冲液中9.99mg/ml(约68μM)的浓度使用。 Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo和抗体以2.5:1的摩尔比例 (Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)比抗体)混合，并且在室温(RT)和350 rpm温育60分钟。通过大小排阻层析，将得到的复合物定义为76％的单 体IgG样分子和24％的二聚体可溶性聚集物。得到的复合物进一步通过SDS-PAGE和后续检测聚丙烯酰胺凝胶中荧光素相关的荧光进行分析。将 8μg的复合物与4xLDS样品缓冲液(Invitrogen)混合，并且在95℃温育5 分钟。使用LumiImager F1装置(Roche)以645nm的激发波长记录荧光素 相关的荧光。
实施例11
在存在氧化还原剂的条件下，产生半抗原化的染料或多肽与抗-半抗原抗 体VH52bC/VH53C的确定的共价缀合物
用于形成半抗原化的荧光染料与抗-半抗原抗体的缀合物-Dig-Cys-Ahx-Cy5/抗- 洋地黄毒苷抗体VH52bC-的示例性方法
产生抗-半抗原抗体与包含半胱氨酸-接头的半抗原化的荧光染料的 共价缀合物导致确定的缀合物，其中在抗-半抗原抗体CDR2中的VH52bC 与半抗原同荧光染料间的接头中的半胱氨酸之间的特定位置形成二硫键。 缀合反应在存在氧化还原剂的条件下进行。将Dig-Cys-Ahx-Cy5溶解在 20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中。通过逐滴加入10％(v/v)的乙 酸促进溶解。将终浓度调整为0.4mg/ml。使抗-洋地黄毒苷抗体VH52bC 在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中达到10mg/ml的浓度。使用 抗-洋地黄毒苷抗体作为对照，并且用与抗-洋地黄毒苷抗体VH52bC相同 的方式处理。将4.7nmol的每种抗体与2.5摩尔当量的Dig-Cys-Ahx-Cy5 混合。这通过以4部分(每部分2.9nmol)每15分钟加入11.7nmol的该物 质而实现。在这些加入之间，将样品在25℃温育，同时轻轻摇动。加入 最后一部分后，将0.64nmol的每种抗体-Dig-Cys-Ahx-Cy5复合物转移到 包含下述氧化还原剂的缓冲液中：3mM DTE(二硫赤藓糖醇)+10mM GSSG(氧化谷胱甘肽)，0.3mM DTE+1mM GSSG和0.03mM DTE+0.1 mM GSSG。将所有样品在这些条件下温育15分钟。温育后，将样品分成 两部分(每部分0.34nmol)，并且准备用于SDS凝胶电泳。为此，加入 4x LDS样品缓冲液(Invitrogen)。对于每种样品，还通过加入10x NuPAGE 样品还原剂(Invitrogen)制备还原版本。在使用1xMOPS缓冲液 (Invitrogen)在4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE，Invitrogen)上电泳之前，将所有样品在70℃温育5分钟。使用LumiImager F1装置(Roche) 以645nm的激发波长记录凝胶中Cy5-相关的荧光。荧光检测后，将凝胶 用SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)染色。凝胶显示在图8中。
对抗-洋地黄毒苷抗体VH52bC显示出位点特异性的二硫键形成(图 8，上部凝胶，泳道1A-C)，背景荧光信号低(此时使用在CDR2中没有 半胱氨酸的抗-洋地黄毒苷抗体(泳道2A-C))。对照反应中的背景信号可 以由Dig-Cys-Ahx-Cy5与通常参与形成抗体-链间二硫键的半胱氨酸的偶 联来解释。增加量的氧化还原剂基本上还原连接抗体重链和轻链的二硫 键，主要产生3/4抗体(-1x LC)、HC-二聚体(-2x LC)和1/2抗体(1x HC+1x LC)。在凝胶底部，可以检测到没有与抗体共价偶联的Dig-Cys-Ahx-Cy5 的荧光。图8底部的凝胶显示，当将样品还原时，在抗体重链和轻链附近 没有检测到Cy5-相关的荧光，这表明共价连接确实是由二硫键形成的。 每块凝胶的考马斯染色显示每条泳道中蛋白总量是相等的。
用于形成半抗原化的荧光染料与抗-半抗原抗体的缀合物–Dig-Cys-Cy5/抗-洋地 黄毒苷抗体VH52bC–的示例性方法
将Dig-Cys-Cy5溶解在8.3mM HCl，10％(v/v)DMF中至3.25mg/ml 的终浓度。使在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中的抗-洋地黄毒 苷抗体VH52bC抗体达到15mg/ml的浓度。使用抗-洋地黄毒苷抗体作为 对照，并且以与抗-洋地黄毒苷抗体VH52bC相同的方式处理。在存在1 mM GSH(还原的谷胱甘肽)和5mM GSSG(氧化的谷胱甘肽)的条件下， 将13.3nmol的每种抗体以10mg/ml的终抗体浓度与2摩尔当量的Dig-Cys-Cy5混合。这通过以2部分每5分钟加入26.6nmol的该物质而 实现。在这些加入之间，将样品在室温(RT)温育，同时轻轻搅拌。加 入最后一部分后，将样品在室温(RT)温育1小时。通过SDS-PAGE以 及后续记录Cy5-相关的荧光信号而评价偶联反应的效率。准备5，10和 20μg的每种样品用于SDS-PAGE。为此，加入4x LDS样品缓冲液 (Invitrogen)。在使用1x MOPS缓冲液(Invitrogen)在4-12％Bis-Tris聚丙 烯酰胺凝胶(NuPAGE，Invitrogen)上电泳之前，将所有样品在70℃温育5 分钟。使用LumiImager F1装置(Roche)以645nm的激发波长记录凝胶中 Cy5-相关的荧光。荧光检测后，将凝胶用SimplyBlue SafeStain(Invitrogen) 染色。
用于形成半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的缀合物–PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu- Dig)/人源化的抗-洋地黄毒苷抗体VH52bC–的示例性方法
为了产生包含半胱氨酰化的接头的洋地黄毒苷-衍生的-PYY-多肽的 缀合物，将1.4mg PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)溶解在100％DMF中 至10mg/ml的浓度。1mg的抗体以在由5mM Tris-HCl、1mM EDTA、 1mM GSH、5mM GSSG构成的pH 8.2的缓冲液中10mg/ml(约68μM) 的浓度使用。PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)与抗体以2:1的摩尔比例 (PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)比抗体)混合，并且在室温(RT)以 100rpm搅拌温育60分钟。通过质谱法分析得到的缀合物。检测到的种 类中有43％鉴定为偶联到2个多肽分子上的抗体，46％是偶联到1个多肽 分子上的抗体，并且有11％鉴定为未偶联的抗体。
实施例12
在不存在氧化还原剂的条件下，产生半抗原化的染料和多肽与抗-半抗原 抗体VH52bC/VH53C的确定的共价缀合物
为了产生共价的抗-半抗原抗体/半抗原化的多肽或半抗原化的染料 二硫键连接的缀合物，需要：(i)将半抗原(例如，洋地黄毒苷，荧光素， 生物素或茶碱)经由适当的包含活性基团(诸如，例如，半胱氨酸，马来 酰亚胺)的接头偶联到多肽或染料上，所述多肽或染料允许多肽暴露在抗 体表面上，并且因此保留其活性，和(ii)产生半抗原化的多肽与具有半胱 氨酸突变的抗-半抗原抗体(＝抗体VH52bC/VH53C)的共价的位点特异性 缀合物，其中所述多肽的生物学活性保留，并且(iii)在不存在还原剂的条 件下进行反应，以避免还原抗体的链间二硫键。
通用方法：
产生抗-半抗原抗体与半抗原化的化合物的缀合物将导致具有确定的 化学计量的缀合物，并且应该确保在这些缀合物中的化合物保留其活性。 为了产生半抗原化的化合物与各自的抗-半抗原抗体的缀合物，将所述半 抗原化的化合物溶解在100％DMF中至10mg/ml的终浓度。使抗-半抗原 抗体VH52bC/VH53C在50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH＝8.2中达到 10mg/ml的浓度。半抗原化的有效负载物和抗-半抗原抗体以 VH52bC/VH53C以2.5:1的摩尔比例(化合物比抗体)通过吸上吸下而混 合，并且在室温(RT)和350rpm温育60分钟。
通过包含半胱氨酸的接头与半抗原缀合的多肽在下文中称为半抗原 -Cys-多肽或多肽-Cys-半抗原。多肽可以具有游离的N-端或封端的N-端， 例如用乙酰基团(Ac-多肽-Cys-半抗原)或PEG-残基(PEG-多肽-Cys-半抗 原)封端。
经由包含半胱氨酸的接头缀合到半抗原上的荧光染料在下文中称为 染料-Cys-半抗原或半抗原-Cys-染料。
用于形成半抗原化的荧光染料与抗-半抗原抗体的缀合物–Dig-Cys-Ahx-Cy5/抗- 洋地黄毒苷抗体VH52bC–的示例性方法
样品准确按照实施例11a所述制备，不同之处在于将抗体 -Dig-Cys-Ahx-Cy5转移到不包含氧化还原化合物、包含0.1mM GSSG(氧 化谷胱甘肽)或1mM GSSG的缓冲液中。得到的荧光-扫描的和考马斯 染色的聚丙烯酰胺凝胶显示在图9中。所有三种条件表现出相似的关于位 点特异性二硫键形成的特异性(图9，上部凝胶，泳道1A-C)，具有低水 平的背景反应(图9，泳道2A-C)。由于与实施例11相比，仅检测到残 余量的3/4抗体(-1x LC)、HC-二聚体(-2x LC)和1/2抗体(1x HC+1x LC)，这证实了二硫键的形成可以无需还原剂而实现。这显著稳定了抗体 /减少抗体的分裂。
用于形成半抗原化的荧光染料与抗-半抗原抗体的缀合物–Dig-Cys-Cy5/抗-洋地 黄毒苷抗体VH52bC–的示例性方法
样品准确按照实施例11b所述制备，不同之处在于，在不存在氧化还 原剂的条件下，将13.3nmol抗体以10mg/ml的最终抗体浓度与2摩尔当 量的Dig-Cys-Cy5混合。
用于形成半抗原化的荧光染料与抗-半抗原抗体的缀合物–生物素-Cys-Cy5/嵌合 的抗-生物素抗体VH53C–的示例性方法
为了产生包含半胱氨酰化的接头的生物素-衍生的-Cy5的缀合物，将 0.16mg生物素-Cys-Cy5溶解在100％DMF至10mg/ml的浓度。1mg的 抗-生物素抗体VH53C以在由50mMTris-HCl、1mM EDTA构成的pH 8.2的缓冲液中9.7mg/ml(约68μM)的浓度使用。生物素-Cys-Cy5和抗体 以2.5:1的摩尔比例(Ac-生物素-Cys-Cy5比抗体)混合，并且在室温(RT) 以350rpm摇动温育60分钟。得到的缀合物通过SDS-PAGE进行分析， 如实施例11a所述。如实施例11a所述，进行荧光的检测。
用于形成半抗原化的荧光染料与抗-半抗原抗体的缀合物–生物素-Cys-Cy5/人源 化的抗-生物素抗体VH53C–的示例性方法
为了产生包含半胱氨酰化的接头的生物素-衍生的-Cy5的缀合物，将 0.16mg生物素-Cys-Cy5溶解在100％DMF中至10mg/ml的浓度。1mg 的人源化的抗-生物素抗体VH53C以在由50mM Tris-HCl、1mM EDTA 构成的pH 8.2的缓冲液中7.4mg/ml(约51μM)的浓度使用。生物素 -Cys-Cy5和抗体以2.5:1的摩尔比例(Ac-生物素-Cys-Cy5比抗体)混合，并 且在室温(RT)以350rpm摇动温育60分钟。得到的缀合物通过SDS-PAGE 进行分析，如实施例11a所述。如实施例11a所述，进行荧光的检测。
用于形成半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的缀合物–Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu- Dig)/人源化的抗-洋地黄毒苷抗体VH52bC–的示例性方法
为了产生包含半胱氨酰化的接头的洋地黄毒苷-衍生的-PYY-多肽的 缀合物，将2.4mg Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)溶解在20％乙酸酯中至 5mg/ml的浓度。10mg的人源化的抗-洋地黄毒苷抗体VH52bC(68.4nmol) 以在由20mM组氨酸、140mM NaCl构成的pH 6.0的缓冲液中19.5mg/ml (约133μM)的浓度使用。Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)和抗体以2:1的摩 尔比例(Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)比抗体)混合，并且在室温(RT)以 100rpm搅拌温育60分钟。得到的缀合物通过质谱法进行分析。检测的 种类中有7.4％鉴定为偶联到2个肽分子上的抗体，40％是偶联到1个肽 分子上的抗体，并且有52％鉴定为未偶联的抗体。
用于形成半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的缀合物–Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla- Biot)/嵌合的抗-生物素抗体VH53C–的示例性的方法
为了产生包含半胱氨酰化的接头的生物素-衍生的-PYY-多肽的缀合 物，将0.19mg Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biot)溶解在100％DMF中至10 mg/ml的浓度。1mg嵌合的抗-生物素抗体VH53C以在由50mM Tris-HCl、 1mM EDTA构成的pH 8.2的缓冲液中9.7mg/ml(约67μM)的浓度使用。 Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot和抗体以2.5:1的摩尔比例 (Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot]比抗体)混合，并且在室温(RT)以350rpm 摇动温育60分钟。得到的缀合物通过质谱法进行分析。检测到的种类中 有87.7％鉴定为偶联到2个肽分子上的抗体，有12.3％鉴定为偶联到1 个肽分子上的抗体。
用于形成半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的缀合物–Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2- Biot)/嵌合的抗-生物素抗体VH53C–的示例性的方法
为了产生包含半胱氨酰化的接头的生物素-衍生的-PYY-多肽的缀合 物，将0.16mg Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot)溶解在100％DMF至 10mg/ml的浓度。1mg的嵌合的抗-生物素抗体VH53C以在由50mM Tris-HCl、1mM EDTA构成的pH 8.2的缓冲液中9.9mg/ml(约68μM)的 浓度使用。Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot与抗体以2.5:1的摩尔比例 (Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot]比抗体)混合，并且在室温(RT)以350rpm 摇动温育60分钟。得到的缀合物通过质谱法进行分析。检测的种类100％ 鉴定为偶联到2个肽分子上的抗体。
用于形成半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的缀合物–Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla- Biot)/人源化的抗-生物素抗体VH53C–的示例性的方法
为了产生包含半胱氨酰化的接头的生物素-衍生的-PYY-多肽的缀合 物，将0.06mg Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biot)溶解在100％DMF中至10 mg/ml的浓度。0.8mg的人源化的抗-生物素抗体VH53C以在由50mM Tris-HCl、1mM EDTA构成的pH 8.2的缓冲液中9mg/ml(约62μM)的浓 度使用。Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot和抗体以2.5:1的摩尔比例 (Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot]比抗体)混合，并且在室温(RT)以350rpm 摇动温育60分钟。得到的缀合物通过质谱法进行分析。检测到的种类中 有62.2％鉴定为偶联到2个肽分子上的抗体，有33.9％鉴定为偶联到1 个肽分子上的抗体，有3.9％鉴定为未偶联的抗体。
用于形成半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的缀合物–Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2- Biot)/人源化的抗-生物素抗体VH53C–的示例性方法
为了产生包含半胱氨酰化的接头的生物素-衍生的-PYY-多肽的缀合 物，将0.08mg Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot)溶解在100％DMF至 10mg/ml的浓度。0.8mg的人源化的抗-生物素抗体VH53C以在由50mM Tris-HCl、1mM EDTA构成的pH 8.2的缓冲液中9mg/ml(约62μM)的浓 度使用。Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot与抗体2.5:1的摩尔比例 (Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot]比抗体)混合，并且在室温(RT)以350rpm 摇动温育60分钟。得到的缀合物通过质谱法进行分析。检测到的种类中 有71.4％鉴定为偶联到2个肽分子上的抗体，有26％鉴定为偶联到1个 肽分子上的抗体，有2.5％鉴定为未偶联的抗体。
用于形成半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的缀合物–Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2- Fluo)/抗-荧光素抗体VH52bC–的示例性方法
为了产生包含半胱氨酰化的接头的生物素-衍生的-PYY-多肽的缀合 物，将0.33mg Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo溶解在100％DMF至10 mg/ml的浓度。1mg的抗-荧光素抗体VH52bC以在由50mM Tris-HCl、 1mM EDTA构成的pH 8.2的缓冲液中9.3mg/ml(约63μM)的浓度使用。 Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo与抗体以2.5:1的摩尔比例 (Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo]比抗体)混合，并且在室温(RT)以350rpm 摇动温育60分钟。得到的缀合物通过质谱法进行分析。检测的种类中有 95％鉴定为偶联到2个肽分子上的抗体，有5％鉴定为偶联到1个肽分子 上的抗体。
用于形成半抗原化的多肽与抗-半抗原抗体的缀合物–Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2- Fluo)/抗-荧光素抗体VH28C–的示例性方法
为了产生包含半胱氨酰化的接头的生物素-衍生的-PYY-多肽的缀合 物，将0.33mg Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo溶解在100％DMF中至10 mg/ml的浓度。将1mg的抗-荧光素抗体VH28C以在由50mM Tris-HCl、 1mM EDTA构成的pH 8.2的缓冲液中9.5mg/ml(约63μM)的浓度使用。 Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo与抗体以2.5:1的摩尔比例 (Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo]比抗体)混合，并且在室温(RT)以350rpm 摇动温育60分钟。得到的缀合物通过质谱法进行分析。检测到的种类 100％鉴定为偶联到2个肽分子上的抗体。
实施例13
产生共价的茶碱-抗-茶碱抗体复合物
为了评价利用茶碱和茶碱-结合性抗体作为半抗原识别系统的共价抗 体复合物的形成，产生茶碱-Cys-Cy5作为荧光有效负载物，通常应用记 载用于洋地黄毒苷-Cys-Cy5或生物素-Cys-Cy5的合成和纯化技术进行， 不同之处在于，所述半抗原更换为茶碱(见实施例8和图13、14和22)。 已经合成的茶碱-Cys-Cy5衍生物的组成显示在图43a中。为了证明共价 二硫化物的形成，产生茶碱-结合性抗体，其包含设计的在重链可变区的 位置54或55的Cys(抗-茶碱抗体-Cys)。这些抗体的纯度示例性地关于 Y54C变体显示在图43b中。这些抗体衍生物与茶碱-Cys-Cy5复合，然后 在非还原条件和还原条件下进行SDS-PAGE，如实施例12所述。在非还 原条件下，二硫键连接的抗-茶碱-抗体复合的Cy5通过如实施例12所述相同的方式以凝胶内其H-链相关的荧光而检测到。这显示在图43c中， 其证明了由于以如使用洋地黄毒苷、荧光素或生物素作为半抗原时观察到 的二硫化物的相同方式的简单负载反应，已经形成了抗体间的共价复合 物。这些复合物如预期的在还原时解离，即，仅当二硫化物被还原时，从 H链释放有效负载物(图43c)。
实施例14
在类似体内的条件下产生共价的半抗原-抗体复合物，和体内定向的二硫 化物形成的证据
为了评价在类似体内的条件下共价的半抗原-抗体复合物的形成，将 抗-生物素抗体-Cys在鼠血清中在37℃用生物素-Cys-Cy5温育60分钟。 然后，用蛋白-A从鼠血清捕获所述抗体。然后，将捕获的抗体在如实施 例12所述的非还原条件和还原条件下进行SDS-PAGE。二硫键连接的抗 体-复合的Cy5以如实施例12所述相同的方式以凝胶内其H链相关的荧 光来检测。图44证明了在血清中在37℃(即，在与体内条件相似的条 件下)形成抗体间的共价复合物。这些复合物与预期的在还原时解离，即， 仅当二硫化物被还原时，从H链释放有效负载物(图44)。当放置半抗原 时，甚至在存在血清的条件下，也可以形成抗体与有效负载物之间的定向 二硫键的观察是出乎意料的，原因在于血清包含大量的蛋白、肽和其他化 合物(其可能干扰二硫化物形成反应)。当放置半抗原时，在血清中在37℃ 可以形成抗体与有效负载物之间的定向二硫键的观察也创造了以预先靶 向设置使用该PK-调节系统的可能性：分开使用抗体和半抗原-有效负载 物，然后体内组装抗体复合物，以及后续的二硫化物形成。
为了进一步评价体内‘预先靶向’应用的可能性，如实施例19所述， 在预先靶向条件下，通过动物眼睛非侵入性光学成像技术确定生物素-Cy5 的药物代谢动力学。在这些实验中，通过动物眼睛光学成像非侵入性地确 定Cy5的存在，所述光学成像显示毛细管中的Cy5荧光。将在注射生物 素-Cy5后10分钟我们在小鼠眼睛中检测到的Cy5-介导的荧光值设为 100％的值，并且相对于其表示在后续时间点测量的荧光值。在该实验中， 在注射生物素-Cy5并开始眼睛成像前24小时，应用1mg抗体(抗-生物 素抗体或抗-生物素抗体-Cys(＝抗-生物素抗体的Cys-突变体))。对照组没 有预先注射抗-生物素抗体。
这些实验的结果显示在图45中：向没有接受预先注射的抗体的动物 中注射生物素-Cy5被清除，具有低的血清半衰期和低的暴露水平(菱形)。 注射到具有24小时预先注射抗-生物素抗体(无Cys突变)的动物中的生 物素-Cy5的血清水平和半衰期极大地提高。这表明，所示抗体捕获其在 循环中的抗原(具有有效负载物)，并且延长抗原(以及类似地缀合的有 效负载物)的血清半衰期。注射到24小时预先注射抗-生物素抗体-Cys (即，包含本文报道的Cys突变的抗体，其用于共价有效负载物偶联) 的动物中的生物素-Cys-Cy5的相对血清水平和半衰期甚至进一步提高。 在这些样品中，相对Cy5水平不仅高于未复合的化合物的水平，而且高 于复合的(但不是二硫化物键合的)Cy5的水平。因此，半抗原-复合的二硫化键-连接的有效负载物(其在预先靶向条件下在体内形成)在循环 中更稳定，并且可以达到比非共价复合的有效负载物更高的暴露水平。
实施例15
在具有抗-半抗原抗体的缀合物和复合物中的多肽保留功能性
我们之前已经表明作为非共价半抗原-多肽缀合物的一部分并且在与 抗-半抗原抗体的复合物中的多肽保留功能性(WO2011/003557，WO 2011/003780和WO 2012/093068)。为了证明偶联的肽在共价二硫化物-偶 联时也保留功能性，比较抗-洋地黄毒苷抗体复合的多肽与其与抗-洋地黄 毒苷抗体VH52bC的二硫化物-缀合物的生物学活性。
PYY-衍生的肽的需要的治疗性功能性是与其同种受体NPY2结合并 干扰其同种受体NPY2的信号传导。通过NPY2受体的信号传导参与和/ 或调节代谢过程。
为了评价多肽Dig-PYY与抗-洋地黄毒苷抗体的复合或SS-缀合或多 肽Dig-Cys-PYY与抗-洋地黄毒苷抗体VH52bC的缀合是否分别影响其活 性，我们在表达NPY2受体的HEK293细胞中评价了其抑制福司柯林 (Forskolin)刺激的cAMP积聚的能力(cAMP测定)。
下表6显示cAMP-测定的结果，进行该测定来评估PYY(3-36)、其 Y2受体特异性修饰的类似物moPYY、其抗体-复合的Dig-变体及其二硫 化物-缀合的Dig-Cys-衍生物的生物学活性。
表6.
Figure BDA0002341415350001811
对于cAMP激动剂测定，使用下述材料：384-孔平板；Tropix cAMP- 筛选试剂盒；cAMP ELISA系统(Applied Biosystems，cat.#T1505；CS 20000)；福司柯林(Calbiochemcat.#344270)；细胞:HEK293/hNPY2R； 生长培养基：Dulbecco’s改良的eagle培养基(D-MEM，Gibco)；10％胎牛 血清(FBS，Gibco)，热灭活的；1％青霉素/链霉抗生物素蛋白(Pen10000单 位/mL:Strep 10000mg/mL，Gibco)；500μg/mL G418(遗传霉素 (Geneticin)，Gibco cat.#11811-031)；和涂板培养基：DMEM/F12 w/o 酚红(Gibco)；10％FBS(Gibco，cat.#10082-147)，热灭活的；1％青霉 素/链霉抗生物素蛋白(Gibco，cat.#15140-122)；500μg/mL G418(遗传霉 素，Gibco，cat.#11811-031)。
为了进行测定，在第一天，倒掉培养基，并每个烧瓶(T225)用10mL PBS冲洗单层细胞。倾倒掉PBS后，使用5mL VERSENE(Gibco， cat#1504006)移去细胞(5min@37℃)。轻敲烧瓶，并且汇集细胞混悬液。 每个烧瓶用10mL涂板培养基润洗，并且以1000rpm离心5分钟。汇集 混悬液并计数。将混悬液以2.0x 105个细胞/mL的HEK293/hNPY2R密度 重悬在涂板培养基中。使用多滴分配器，将50微升的细胞 (HEK293/hNPY2R–10,000个细胞/孔)转移到384-孔平板中。将所述平板 在37℃温育过夜。第二天，检查细胞75-85％的汇合。允许培养基和试 剂恢复到室温。在制备稀释液之前，允许刺激二甲亚砜(DMSO，Sigma， cat#D2650)中的化合物的储液温热至32℃5-10分钟。在具有0.5mM 3- 异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，Calbiochem，cat#410957)和0.5mg/mL BSA 的DMEM/F12中制备稀释液。刺激培养基中的最终DMSO浓度为1.1％， 其中福司柯林的浓度为5μM。将细胞平板轻轻倒置在纸巾上而使细胞培 养基流出。每个孔放置50μL刺激培养基(每个浓度以一式两份进行)。 将平板在室温温育30分钟，在显微镜下检查细胞的毒性。处理30分钟后， 倒掉刺激培养基，并且加入50μL/孔测定裂解缓冲液(Assay Lysis Buffer) (Tropix试剂盒中提供)。将平板在(@)37℃温育45分钟。将20μL裂 解物从刺激平板转移到Tropix试剂盒的预先包被有抗体的平板(384-孔)。 加入10μL AP缀合物和20μL抗-cAMP抗体。将平板在室温摇动下温育 1小时。然后，将板用洗涤缓冲液洗涤5次，每次洗涤70μL/孔。将平板 排干。加入30μL/孔的CSPD/Sapphire-II RTU底物/增强剂溶液，并且在 室温(@RT)(摇动)温育45分钟。在发光计(VICTOR-V)中测量1sec/ 孔的信号。
这些测定的结果(表6)表明，与野生型PYY相比，修饰的肽衍生 物moPYY具有可忽略的较低的活性。cAMP测定的IC50值对于野生型 PYY为0.09nM，对于修饰的类似物是0.14nM。共价的二硫化物-缀合导 致生物学活性略微降低。对于缀合物，IC50值是5-36nM。令人惊讶地， 共价的二硫化物-缀合物的活性比非共价复合物高2倍，IC50值为10.91 nM。
实施例16
与生物素化的Cy5与人源化的抗-生物素抗体VH53C的共价缀合物比 较，生物素化的Cy5与人源化的抗-生物素抗体的复合物的血清稳定性
所述肽修饰技术的目的是改善肽的治疗性应用性。目前，肽的治疗 性应用的主要瓶颈是有限的体内稳定性和/或短的血清半衰期和快速清 除。在体内确定荧光团的抗体缀合物的PK参数，并且与非共价抗体-荧 光团复合物的PK进行比较。因此，(i)抗-生物素抗体VH53C共价缀合 到生物素化的荧光团Biot-Cys-Cy5，(ii)产生抗-生物素抗体与生物素化的 荧光团Biot-Cy5的非共价复合物，(iii)将共价缀合的和非共价复合的化 合物施用给动物，并且(iv)通过特异性检测人源化抗体的ELISA方法确 定Cy5(A650)的荧光和相对应的抗体的荧光，测量在这些动物中化合物 随时间变化的血清浓度。
实验方法
为了分析小荧光底物对抗体-复合或抗体-缀合的PK参数的影响，关 于每种物质，给六只雌性小鼠(品系NMRI)施用在20mM组氨酸/140 mM NaCl，pH 6.0中的13nmol Cy5-生物素/人源化的抗-生物素抗体 VH53C-缀合物或相应的抗体非共价复合的化合物。在下述时间点采集约 0.1ml血液样品：对第一组的小鼠1、2和3在0.08h，4h和48h，对第 二组的小鼠1、2和3在0.08h，24h和72h。在室温(RT)离心(9300x g，3min，4℃)1小时后得到约50μl血清样品。将血清样品保存在-80℃。
为了确定在给定时间点血清中化合物(荧光团)的量，利用Cy5的 荧光特性：使用Cary Eclipse荧光光度分光计(Varian)，在室温在120μl 石英杯中测量血清样品中的Cy5荧光。激发波长是640nm，发射是在667 nm测量的。将血清样品在1x PBS中稀释，达到适当的发射强度范围。 在1x PBS中同样稀释的未处理的小鼠的血液血清作为各种样品用作空 白探针，并且没有显示任何荧光信号。
为了确定在给定时间点血清中人IgG抗体的量，使用下述测定原理： 血清样品中的人IgG1抗体捕获在包被有抗-人κ-链单克隆IgG抗体的固 相(
Figure BDA0002341415350001841
微量滴定平板，NUNC-ImmunoTM)上。血清样品以1:105和1:106稀释，并且将100μl这些稀释液加入到孔中。温育后，将孔每次 用300μl PBS/0.05％吐温20洗涤，洗涤三次。首先通过加入100μl浓度 为0.25μg/ml的在C-端洋地黄毒苷化的抗-人CH1-结构域IgG而进行人 IgG抗体的检测。每次用300μl 1x PBS/0.05％吐温20洗涤三次后，加入 100μl浓度为25mU/ml的缀合到辣根过氧化物酶(HRP)的抗-洋地黄毒 苷抗体Fab-片段。最后，加入100μl
Figure BDA0002341415350001842
/孔。在环境温度温育30分 钟后。在商购的微量滴定平板ELISA读数仪(例如，Tecan Sunrise)上在405nm和492nm测量消光(OD)[405/492]。
图34显示在用抗体-生物素-Cy5-复合物和-缀合物处理的小鼠中的 Bio-Cy5血清水平和人IgG的血清水平。数据显示为针对注射后5分钟的 (峰值)血清水平标准化的相对(％)人IgG或荧光水平。抗体-半抗原-复 合物和-缀合物二者的相对人IgG血清水平与关于抗体-半抗原缀合物测量 的相对荧光一致。因此，生物素-Cys-Cy5化合物表现出与其所缀合的抗 体相似的体内稳定性，这意指，抗体-半抗原缀合物在体内完好无损。对 于抗体-半抗原复合物的情形，明显不是这样的，对于该复合物，相对Cy5- 介导的荧光比相对人IgG血清水平减少得更快。这意指复合物在体内随 时间释放有效负载物。
总之，当结合抗-半抗原抗体时，半抗原化的化合物的体内稳定性显 著提高。然而，由于半抗原-Cy5血清水平的减少比抗体血清水平的减少 更快，因此，抗体-半抗原复合物在体内不是十分稳定。对于抗体-半抗原 -Cy5缀合物的情形，不是这样的，所述缀合物表现出与正常IgG抗体相 似的体内行为。
实施例17
洋地黄毒苷-Cy5与人源化的抗-洋地黄毒苷抗体的复合物和洋地黄毒苷 -Cys-Cy5与源化的抗-洋地黄毒苷抗体的共价缀合物相比较的血清稳定性
为了分析不同的半抗原对抗体复合物或抗体缀合物的药物代谢动力 学的影响，在体内确定与洋地黄毒苷-Cy5复合的或与洋地黄毒苷 -Cys-Cy5共价缀合的抗-洋地黄毒苷抗体的PK参数。以关于生物素-Cy5 或生物素-Cys-Cy5所述相同的方式(见实施例16)，给雌性NMRI小鼠施 用洋地黄毒苷-Cy5或抗体-复合的或抗体-Cys-连接的洋地黄毒苷 -(Cys)-Cy5，然后在0.08h，2h，4h和24h采集血液。通过测量其荧光 而确定洋地黄毒苷-(Cys)-Cy5水平，并且通过ELISA确定相对应的抗体 的浓度，如实施例16所述。数据在图41中显示为针对注射后5分钟的(峰 值)血清水平标准化的相对(％)人IgG或荧光水平。
这些实验的结果证明，对于洋地黄毒苷-Cy5，在注射后2小时，可 检测到少于应用的(5min的值)10％的荧光。在以后的时间点，即，分 别为注射后4小时和24小时，没有检测到未复合的洋地黄毒苷-Cy5信号 (见图41，两幅图表中的灰色三角形)。与未复合的化合物相反，抗体- 复合的化合物以高得多的水平并且在更靠后的时间点检测到(图41，上部 图表)。这表明，抗体复合显著增加小化合物洋地黄毒苷-Cy5的血清半衰 期。此外，与非共价连接的复合物相比，共价连接的有效负载物表现出更 高的血清稳定性。直接比较洋地黄毒苷-Cy5水平和抗体水平表明复合的 有效负载物从所述抗体随时间释放(loss)，Cy5水平比抗体水平减少更快。 相反，共价连接的洋地黄毒苷-缀合物表现出几乎相同的Cy5和IgG血清 半衰期(图41，下图)。这表明二硫化物连接的有效负载物保持与抗体稳定 连接，而非共价复合物随时间解离。
实施例18
与人源化的抗-洋地黄毒苷抗体复合的洋地黄毒苷化多肽的血清稳定性
为了分析洋地黄毒苷化的多肽对抗体-复合的PK参数的影响，给2 只雌性小鼠(品系NMRI)分别施用在20mM组氨酸/140mM NaCl pH 6.0中的32.1nmol多肽或32.1nmol洋地黄毒苷化的多肽与相对应的抗- 洋地黄毒苷抗体之间的非共价复合物。在下述时间点采集约0.1ml血液 样品：对小鼠1，在0.08h，2h和24h，对小鼠2，在0.08h，4h和24h。 在室温(RT)离心(9300x g，3min，4℃)1小时后得到约50μl血清样 品。将血清样品保存在-80℃。
由于没有直接的检测血清样品中的多肽的方法可用，与Dig-Cy5的 检测相比，确定在给定时间点血清中洋地黄毒苷化的肽的量难以与Dig-Cy5是困难的。因此，建立蛋白质印迹相关的测量来检测血清中的洋 地黄毒苷化的肽。第一步，将血清样品在还原SDS-PAGE上分离。由于 样品分离包括将血清暴露于高浓度的SDS和还原剂，因此，复合的Dig- 多肽缀合物可以从(完全变性的/展开的)抗-洋地黄毒苷抗体上释放，而 共价缀合物保持结合。为了调节多肽从非共价抗体复合物上的释放并且通 过SDS-PAGE分离个体成分，将2μl每种血清样品稀释在18μl 20mM组 氨酸/140mM NaCl pH 6.0中，与6.7μl 4x LDS样品缓冲液和3μl 10x 样品还原剂(NuPAGE，Invitrogen)在95℃混合5分钟。作为对照，使用 相同品系的未处理的小鼠的2μl血清。将样品应用到4-12％Bis-Tris凝胶 (NuPAGE，Invitrogen)上，凝胶用1xMES(Invitrogen)组为运行缓冲液以 200V/120mA运行20分钟。然后，使用XCellSure
Figure BDA0002341415350001861
Mini-Cell系 统(Invitrogen)将分离的多肽以25V/130mA印迹到PVDF膜(0.22μm孔 尺寸，Invitrogen)上40分钟。将膜在1x PBS+1％吐温20(PBST)中的1％ 脱脂乳中在室温(RT)封闭1小时。然后，使用抗-洋地黄毒苷抗体，检 测膜上的洋地黄毒苷化的多肽。对此，抗-洋地黄毒苷抗体以在10ml 1％ 脱脂乳/PBST中13μg/ml的浓度在室温(RT)应用到膜上2小时。将膜 在1x PBST中洗涤3x 5min。在室温(RT)应用在10ml 1％脱脂乳/PBST 中1:25稀释的来自LumiLightPLUS蛋白质印迹试剂盒(Roche)的与POD偶 联的抗-小鼠IgG Fab-片段。将膜用1x PBST洗涤3x 5min。通过将膜在 4ml LumiLight蛋白质印迹底物中在室温(RT)温育5分钟进行检测。使 用LumiImager F1(Roche)检测化学发光，曝光时间为20分钟。
这些分析的结果显示在图35中。已经确定了在不同时间点鼠血清中 洋地黄毒苷多肽的存在/量。接受抗体复合的肽的小鼠(图35左侧)在最 早的时间点(施用后5分钟)表现出强信号。这些信号是清楚可归属为对 照印迹上的尺寸和位置。在用抗体-复合的多肽处理的小鼠的血清中，多 肽相关的信号在早期时间点最强，并且随时间减弱。然而，多肽仍然是可 检测的，在所有时间点，甚至在施用后24小时，具有良好的信号。
在接受未复合的多肽的小鼠中，甚至在最早的时间点，几乎没有检 测到任何与小的多肽相关信号。图35在右侧显示在正常的曝光条件下， 在印迹上没有显现游离的多肽。印迹的反差增强揭示一些多肽在施用后5 分钟存在，但是仅以痕量存在。在靠后的时间点，没有检测到确定的多肽 条带。
可以看出，与未复合的半抗原-Cy5相似，未复合的多肽在小鼠血清 中具有非常短的半衰期。接受相同的多肽但是以抗体复合的形式的小鼠表 现出这些多肽在血清中存在增加的时间期间。注射后24小时，在这些小 鼠的血清中仍然能够测定多肽。
实施例19
体内实时测量共价连接的半抗原-抗体缀合物和非共价复合物的血清半衰 期和暴露水平
与共价连接的半抗原化合物相比，为了进一步分析非共价复合的半 抗原化合物的药物代谢动力学特征，通过非侵入性光学成像技术确定注射 的生物素-Cy5或生物素-Cys-Cy5与相对应的抗-生物素抗体之间的复合物 或缀合物的体内动力学，所述光学成像技术显示在动物眼睛毛细管中的 Cy5荧光。将值针对10分钟的值(设为100％)标准化。这些实验的结 果显示在图42中：未复合的生物素-Cy5本身具有短的血清半衰期和低的 暴露水平。不是共价连接的抗体-复合的生物素-Cy5以高得多的水平检测 到，并且具有延长的半衰期。与非共价连接的复合物相比，共价连接的有 效负载物表现出甚至更高的血清稳定性，这是由更高的血清水平证明的。 这些实验证实，与非共价复合的有效负载物相比，共价二硫化物-连接的 有效负载物在循环中更稳定，并且可以达到更高的暴露水平。
实施例20
与结合不同半抗原的抗体的肽-复合和共价缀合
应用半抗原结合分子将半抗原化的化合物(＝有效负载物)偶联到靶向 载体上是一种技术可能性，通过其可以实现半抗原介导的递送。该观念可 以扩展到另外的半抗原或捕获化合物并将其连接到靶分子的其他实体。例 如，对于多肽递送或稳定化，可以使用结合洋地黄毒苷或其他半抗原的单 特异性-或双特异性抗体来稳定并且PK-优化治疗性多肽。
使用多肽作为捕获模块的前提条件是：(i)化合物与半抗原的偶联没 有严重干扰多肽的活性，和(ii)抗体与半抗原化的化合物的有效结合/复合 的可能性。
半抗原-定向的结合是半抗原化的染料或多肽与抗-半抗原半胱氨酰 化的抗体有效共价偶联的前提条件。
为了证明半抗原化的化合物与抗-半抗原抗体的亲和力驱动的复合是 有效的二硫键形成的前提条件，将生物素-Cys-Cy5与人源化的抗-洋地黄 毒苷抗体和人源化的抗-洋地黄毒苷抗体VH53C一起温育。进行生物素 -Cys-Cy5与人源化的抗-生物素抗体和人源化的抗-生物素抗体VH53C的 温育作为对照反应。
将0.13mg生物素-Cys-Cy5溶解在100％DMF中至10mg/ml的浓度。 0.7mg每种抗体以在由50mM Tris-HCl、1mM EDTA构成的pH 8.2的缓 冲液中6.7mg/ml(约46μM)的浓度使用。生物素-Cys-Cy5和抗体以2.5:1 的摩尔比例(Ac-生物素-Cys-Cy5比抗体)混合，并在室温(RT)以350rpm 摇动温育60分钟。得到的复合物/缀合物通过SDS-PAGE和后续在聚丙烯酰胺凝胶中检测Cy5-相关的荧光进行进一步的分析。将15μg复合物/缀 合物与4x LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合并且在95℃温育5分钟。使 用LumiImager F1装置(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany) 以645nm的激发波长记录Cy5-相关的荧光。
对于人源化的抗-生物素抗体VH53C，未还原的样品表现出共价位点 特异性二硫键形成(图36，泳道4)，具有非常低的背景荧光信号(此时 使用在CDR2中没有半胱氨酸的人源化的抗-生物素抗体)(图36，泳道 3)。生物素-Cys-Cy5也与人源化的抗-洋地黄毒苷抗体VH52bC共价偶联 (图36，泳道2)，具有低的背景信号(此时使用人源化的抗-洋地黄毒苷抗体)(图36，泳道1)，但是具有显著更低的效率。这可以由在凝胶底部(箭 头)检测到的过量的生物素-Cys-Cy5推导出。在人源化的抗-洋地黄毒苷 抗体VH52bC的情形中，可以检测到比人源化的抗-生物素抗体VH53C (泳道4)显著更多的未偶联的生物素-Cys-Cy5(泳道2)。当将样品还原时， 接近抗体重链和轻链，没有检测到Cy5-相关的荧光，这表明共价连接确实是通过二硫键形成的。每块凝胶的考马斯染色显示每个泳道中蛋白总量 是相等的。
实施例21
半抗原-定向的结合是半抗原化的染料或多肽与抗-半抗原半胱氨酰化的 抗体的有效共价偶联的前提条件
为了证明半抗原化的化合物与抗-半抗原抗体的亲和力驱动的复合是 有效的二硫键形成的前提条件，经未半抗原化的肽 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)(Biosynthan1763.1，SEQ ID NO:178)与人 源化的抗-洋地黄毒苷抗体VH52bC和人源化的抗-洋地黄毒苷抗体一起 温育。将1.4mg Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)溶解在100％DMF至10 mg/ml的浓度。2mg每种抗体以在由50mM Tris-HCl、1mM EDTA构成 的pH 8.2的缓冲液中11-13mg/ml(约75-89μM)的浓度使用。 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)和抗体以2.1:1的摩尔比例 (Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2比抗体)混合。将肽以3部分加入，同时将 溶液用搅拌棒以500rpm搅拌。在每次加入之间，将样品以200rpm温育 5分钟。加入最后一部分后，将样品在室温(RT)和200rpm温育1小时。
通过大小排阻层析法，对于Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)：人源化 的抗-洋地黄毒苷抗体VH52bC缀合物，得到的复合物/缀合物确定为97％ 单体IgG样分子和3％二聚体可溶性聚集物：并且对于 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)：人源化的抗-洋地黄毒苷抗体复合物，确 定为100％单体。此外，通过质谱法分析得到的复合物/缀合物。对于 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)：人源化的抗-洋地黄毒苷抗体VH52bC缀 合物，检测的种类中有17％鉴定为与2个肽分子偶联的抗体，有51％鉴 定为与1个肽分子偶联的抗体，有32％鉴定为没有偶联的肽的抗体。对 于Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)：人源化的抗-洋地黄毒苷抗体复合物，100％的抗体是未偶联的。
实施例22
形成正确折叠的功能性具有用于共价有效负载物偶联的半胱氨酸突变的 半抗原-结合抗体所需要的二硫化物模式
用于共价复合物/有效负载物偶联的半抗原-结合模块以由‘标准’抗 体构成，诸如IgGs，其包含能够允许共价连接半抗原化的化合物/有效负 载物的额外的半胱氨酸。本文报道的方法在折叠结构域内引入需要的官能 性(半胱氨酸)，所述折叠的结构域的结构和序列为抗体官能性提供基础。 在抗体的结构域之内以及在抗体的结构域之间正确形成确定的二硫键对 于形成和维持正确的结构和官能性是重要的。图37(A)显示形成未修饰的抗体的功能性结合臂(如Fabs)所需要的二硫化物模式，图37(B)显示维 持VH52cB/VH53C突变的抗体衍生物的结构和官能性所需要的二硫化物 模式。为了维持正确的二硫化物模式，在VH结构域中引入的另外的半胱 氨酸必需是未被占据的，并且必须不干扰或与相邻的半胱氨酸反应。图 37(C)和37(D)显示，添加额外的半胱氨酸产生在所述分子的生物合成过程中形成错误的二硫化物的可能性。VH52bC/VH53C的位置位于VH结构 域内(并且非常接近其他的半胱氨酸)的事实加重了在重链的生物合成过 程中可能形成错误的二硫化物的危险。另一个潜在的问题是VH和VL结 构域在分泌途径内组装成一个Fv片段。分泌途径涉及氧化还原-该组条件 和二硫化物形成和-该组酶。因此，通过添加VH52bC/VH53C突变引入错 误的二硫化物的潜在性也可能“扩展到”轻链的二硫化物(示例性显示在 图37(E)中)。这的确进一步增加获得/产生错误折叠的无功能性分子的危 险。因此，尽管有这些危险，非常令人惊讶的是，可以表达和获得适量的 包含VH52bC/VH53C突变的同质功能性抗体衍生物，并且所述衍生物能 够共价连接半抗原化的化合物/有效负载物。
实施例23
抗-半抗原二硫化物-稳定的具有用于共价偶联的半胱氨酸突变的单链Fv 片段的组成和产生
用于共价化合物/有效负载物偶联的半抗原-结合性模块可以由‘标 准’抗体组成，诸如IgGs。备选地，它们可以是修饰的实体，诸如重组 Fv或Fab片段，或它们的衍生物。单链Fv片段通常用作全长抗体的备选 方案，特别是在需要小模块的应用中或需要另外的结合模块来产生双特异 性或多特异性抗体衍生物的应用中。已经产生的抗-半抗原Fv-衍生的实 体的一个实例是结合并共价连接洋地黄毒苷化的化合物/有效负载物的二 硫键稳定的单链Fv。具有Dig-结合特异性的二硫键稳定的单链Fv通过由 灵活的富含Gly和Ser的接头彼此连接抗-洋地黄毒苷抗体VH和VL结构 域而产生。这些VH和VL结构域在VH的位置44和VL的位置100(按 照Kabat等的位置)携带另外的半胱氨酸突变。这些另外的半胱氨酸形成 VH和VL之间的稳定的分子间二硫键。这稳定scFv，如之前所述(例如， Reiter，Y.等，Nature Biotechnology(自然生物技术)14(1996)1239-1245)。
除此之外，分别在按照Kabat编号的位置52b或53向VH中引入另 一个半胱氨酸，以辅助与Fv片段共价连接的官能性。
然而，向二硫键稳定的Fv片段中引入所述突变要比将它们放置在全 长抗体中更加有挑战性。单链Fv片段稳定性固有地比全长IgGs或Fab 片段差，原因在于它们缺少作为稳定和异型二聚体化强制性实体的恒定结 构域。可以通过在Fvs中放置另外的半胱氨酸突变，如VH44-VL100二 硫化物，而富于稳定性。然而，这种稳定原理仅在正确的半胱氨酸之间在 正确位置形成二硫化物时起作用。因此，除了确定的结构域内二硫键(一 个在VH中，一个在VL中)，需要形成一个单一的确定的正确的结构域 间二硫键。不匹配的半胱氨酸之间的二硫键连接将产生错误折叠的不稳定 的且没有功能的实体。考虑到二硫化物-稳定的Fv片段包含6个半胱氨酸， 理论上可以形成21种不同的二硫键连接–但是，仅有3个确定的二硫键 的正确组合形成功能性稳定的dsscFv。当向VH结构域中添加另一个游离 的半胱氨酸时，将加剧这种挑战。需要的稳定的dsscFv包含两个确定的 结构域内二硫键(在VH和VL中各一个)，一个确定的结构域间二硫键 (在VH与VL之间)，此外还有一个游离的半胱氨酸，以用于半抗原化 的化合物/有效负载物偶联(在VH中的位置52b/53)。考虑到具有用于共价偶联的额外的半胱氨酸突变的二硫键稳定的Fv片段包含7个半胱氨酸， 理论上可以形成多个不同的二硫键连接，但是仅有3个确定的二硫键的正 确组合以及在VH52b/VH53的额外的游离的半胱氨酸位置将形成功能性 稳定的共价偶联的活性dsscFv。另一个挑战是这样的事实：另外的游离 的半胱氨酸(VH52b/VH53)位置紧密接近VH44半胱氨酸，其不是天然存在的半胱氨酸，而是为二硫键稳定引入的突变。VH44C是形成正确的结 构域间二硫键所需要的，并且该二硫化物在独立折叠和VH和VL组装后 更可能不被该理论形式结合。VH44C与VH52bC/VH53C的邻近加剧结构 域内二硫键不以正确形式形成的危险。但是，已经发现，可以产生结合洋 地黄毒苷并且同时能够共价连接洋地黄毒苷化的有效负载物的功能性二硫键稳定的单链Fv模块。图38显示了二硫键稳定的单链Fv分子的组成， 其包含正确的二硫键和在正确的位置的游离的半胱氨酸，并且显示了其与 不理想的错误折叠的分子的比较。编码具有VH52bC突变Fv抗体衍生物 的这一Dig-结合性dsscFv的轻量可变区和修饰的重链可变区的序列在 SEQ ID NO:190(VH)中列出，相对应的VL在SEQ ID NO:189中列出。 成功产生作为用于产生双特异性抗体衍生物的模块的所述dsscFv记载在 实施例24(下文)以及图40(A)、图40(B)和图40(C)中。
实施例24
用于靶向递送偶联的化合物/有效负载物的双特异性抗-半抗原抗体的组 成、表达和纯化
产生包含用于共价化合物/有效负载物偶联的半抗原-结合性抗体模 块的双特异性抗体。这些抗体另外包含能够允许靶向其他抗原的结合模 块。此类双特异性抗体的应用包括将半抗原化的化合物/有效负载物特异 性靶向携带所述靶向抗原的细胞或组织。产生的所述分子的一个实例是一 种双特异性抗体，其具有识别肿瘤相关的碳水化合物抗原LeY的结合区， 同时具有结合并共价连接洋地黄毒苷化的化合物/有效负载物的二硫键稳 定的Fvs。因此，二硫键稳定的单链Fvs通过灵活的富含Gly和Ser的连 接子肽连接到LeY抗体CH3结构域的C-端，形成具有两个LeY结合臂 和另外两个洋地黄毒苷结合实体的四价分子。洋地黄毒苷-结合实体携带 VH44-VL100二硫键，所述二硫键已经描述过(例如，Reiter，Y.，等，Nature Biotechnology 14(1996)1239-1245)。洋地黄毒苷结合实体另外包含用于共价偶联的VH52bC突变。编码所述LeY-Dig抗体衍生物的轻链和修饰的 重链的序列在SEQ IDNO:191和SEQ ID NO:192中列出。作为共价偶联 的化合物/有效负载物的递送载体的LeY-Dig双特异性抗体衍生物的组成 示意性地显示在图39中。
双特异性分子通过分子生物学技术产生，通过培养的细胞分泌表达， 然后以上述相同的方式从培养物上清中纯化。图40(A)显示在细胞培养上 清中存在该LeY-Dig(52bC)双特异性抗体的修饰的H-链和L-链，这是在 检测抗体L-链和H链的蛋白质印迹分析中显现的。图40(B)证明在存在还 原剂的条件下，通过SDS-PAGE纯化后，这些抗体的同质性。用考马斯 亮蓝染色SDS-PAGE显现与IgG相关的多肽链，其具有与其计算的分子 量相近的表观分子量。图40(C)显示在蛋白A纯化后LeY-Dig(52bC)双特 异性抗体的SEC模式，证明了同质性，蛋白制备物中缺少聚集物。因此， 可以产生包含靶向模块和用于共价偶联半抗原化的化合物/有效负载物的 模块的双特异性抗体，并且纯化至同质性。
实施例25
与biocytinamid复合的鼠抗-生物素抗体-Fab-片段的X射线结构确定
确定鼠抗-生物素抗体Fab-片段的蛋白结构与biocytinamid复合。因 此，在0.8M琥珀酸中生长Fab-片段的晶体，然后用Biocytinamid填装该 抗体晶体(在结晶溶液中稀释至10mM工作浓度，应用到结晶小滴中的 晶体)。将晶体用2μl 10mM Biocytinamid溶液洗涤三次，并且最后用 Biocytinamid在21℃温育16小时，用作为冷冻保护剂的15％甘油收集，并且在液氮中快速冷冻。处理的衍射图像产生
Figure BDA0002341415350001931
分辨率的蛋白结构。 图46显示了生物素-结合性可变区的结构和电荷位置：生物素结合在表面 口袋中，所述表面口袋侧连由来自CDR区的氨基酸构成的带电荷区域。 复合的半抗原位置紧密邻近带负电荷的氨基酸簇。由于在该位置没有电荷 排斥(由于缺少COOH基团)，作为半抗原，在其羧基端衍生用于有效负 载物偶联的生物素以良好的功效结合。相反，游离的(正常的)生物素不 能有效地结合抗体，原因在于其羧基端紧密邻近该带负电荷的簇，并且因 此是排斥性的。
实施例26
改造血脑屏障-穿梭模块
通过将二硫键稳定的半抗原-结合性单链Fvs融合到抗-TfR抗体CH3 结构域的C-端，而产生半抗原-结合性双特异性血脑屏障-穿梭模块。相似 的设计和技术按之前所述使用(例如，参见PCT/EP2013/064100)。这些血 脑屏障-穿梭模块的组成的实例显示在图47中。
血脑屏障-穿梭模块识别在血脑屏障的内皮细胞上的可胞转的细胞表 面靶标(血脑屏障受体)。示例性地，我们使用两种不同的抗体，其以不同 的亲和力结合转铁蛋白受体。抗体TfR1以高亲和力结合转铁蛋白受体， 抗体TfR2以减少的亲和力结合转铁蛋白受体(例如，参见WO 2012/075037)。将来源于这些抗-TfR抗体的TfR-结合位点作为未改变的Fab臂设到双特异性抗体中，以获得二价全长IgG模块。二硫键稳定的半 抗原-结合性单链Fvs通过短的GS-接头融合到所述产生的双特异性抗体 CH3结构域的C-端。示例性地，使用之前所述的结合洋地黄毒苷(Dig)或 生物素(Bio)的衍生物的实体作为抗-半抗原结合位点(序列见上文)。
这些穿梭载体的序列组成的实例列出如下：SEQ ID NO:193(LC抗 -TfR1抗体)，SEQ ID NO:194(缀合到scFv抗-洋地黄毒苷抗体片段的HC 抗-TfR1抗体)，SEQ ID NO:195(缀合到scFv抗-生物素抗体片段的HC 抗-TfR1抗体)，SEQ ID NO:196(LC抗-TfR2抗体)，SEQ ID NO:197(缀 合到scFv抗-洋地黄毒苷抗体片段的HC抗-TfR2抗体)，SEQ ID NO:198(缀合到scFv抗-生物素抗体片段的HC抗-TfR2抗体)。
实施例27
双特异性抗体(血脑屏障-穿梭模块)的表达和纯化
如前所述(见上文)，在确定的不含血清的培养基中在哺乳动物细胞 中产生血脑屏障-穿梭模块双特异性抗体。将HEK293悬浮细胞瞬时转染 编码L-链和H-链的表达质粒，以产生表达所述血脑屏障-穿梭模块双特异 性抗体的簇。
为了产生以高亲和力结合TfR的洋地黄毒苷化的有效负载物结合性 血脑屏障-穿梭模块，将包含SEQ ID NO:193编码核酸/表达盒的表达质 粒与包含SEQ ID NO:194编码核酸/表达盒的表达质粒共同转染。
为了产生以高亲和力结合TfR的生物素化的有效负载物结合性血脑 屏障-穿梭模块，将包含SEQ ID NO:193编码核酸/表达盒的表达质粒与 包含SEQ ID NO:195编码核酸/表达盒的表达质粒共同转染。
为了产生以减少的亲和力结合TfR的洋地黄毒苷化的有效负载物结 合性血脑屏障-穿梭模块，将包含SEQ ID NO:196编码核酸/表达盒的表 达质粒与包含SEQ ID NO:197编码核酸/表达盒的表达质粒共同转染。
为了产生以减少的亲和力结合TfR的生物素化的有效负载物结合性 血脑屏障-穿梭模块，将包含SEQ ID NO:196编码核酸/表达盒的表达质 粒与包含SEQ ID NO:198编码核酸/表达盒的表达质粒共同转染。
通过蛋白A层析(见上文)从瞬时转染编码L-链和H-链的表达质粒 的HEK293悬浮细胞上清中纯化双特异性抗体。然后，使用大小排阻层 析(SEC)获得没有聚集物或污染物的双特异性抗体。关于纯化的血脑屏障- 穿梭模块的纯度和组成的实例以SEC模式和SDSPAGE显示在图48中。
实施例28
双特异性半抗原-结合性血脑屏障-穿梭模块同时结合半抗原化的有效负 载物和血脑屏障受体
为了保证双特异性抗体的血脑屏障-穿梭功能性，它们必须同时结合 血脑屏障内皮细胞上的血脑屏障受体和要被穿梭的半抗原化的有效负载 物。为了评价本文报道的半抗原-结合性双特异性抗体的功能性，通过 FACS分析解决同时的细胞表面和有效负载物结合。对于这些分析，通过 植物赤藓素(phytoerythrin)-标记的IgG识别二级抗体检测血脑屏障-穿 梭模块(＝双特异性抗体)的细胞结合。同时的有效负载物结合通过使用半 抗原化的荧光有效负载物(洋地黄毒苷化的Cy5；DIG-Cy5(见上文))检 测。图49显示了FACS分析的结果，所述分析使用hCMEC/D3细胞作为 表达TfR的BBB-来源的细胞系，和Dig-Cy5作为荧光有效负载物：两种 转铁蛋白受体结合性双特异性抗体都结合hCMEC/D3，如通过抗-IgG-PE 相关的信号所显示的。类似地，两种双特异性抗体还同时结合Dig-Cy5， 如通过归因于细胞相连的Cy5的信号所显示的。(高亲和力)TfR1双特异 性抗体和(减少的亲和力)TfR2双特异性抗体之间的信号强度的比较表明， (如预期地)，与中等亲和力双特异性抗体相比，在具有高亲和力的细胞 上的信号强度更高。识别hCMEC/D3上不以可检测的量存在的抗原(CD33-Dig)的对照双特异性抗体(如预期地)不产生与抗-IgG抗体相关 的信号，也不产生与Dig-Cy5相关的信号。
这些结果表明双特异性半抗原-结合性血脑屏障-穿梭模块特异性结 合它们在内皮细胞表面上的靶标。此外，这些双特异性抗体同时结合半抗 原化的有效负载物，由此可以将它们导向血脑屏障的内皮细胞。
实施例29
血脑屏障-穿梭模块的受体结合模式影响从脑内皮细胞的释放
我们使用脑内皮细胞(hCMEC/D3)来研究本文报道的穿梭模块的细 胞结合和胞转作用。之前的研究(Crepin等，2010；Lesley等，1989，WO 2012/075037，WO 2014/033074)报道了TfR结合性抗体的价态和亲和力影 响与血脑屏障的内皮细胞结合、通过其胞转和从其释放的功效。为了研究 在hCMEC/D3中的细胞结合和胞转作用，将在滤纸插入物上培养的hCMEC/D3细胞在顶部用双特异性抗体或亲本抗体(没有半抗原-结合性 scFvs，作为对照)在37℃温育1小时。细胞单层在室温(RT)在不含 血清的培养基中在顶部(400μl)和底外侧(1600μl)洗涤三次，每次3-5min。 收集所有的洗涤体积，以监测未结合的配体或抗体的去除效率。向顶部室 中加入预先加温的培养基，并且将滤纸转移到包含1600μl预先温热的培养基的新鲜的12孔平板(用包含1％BSA的PBS封闭过夜)。在该点， 将在一些滤纸上的细胞在500μl RIPA缓冲液(Sigma，Munich，Germany， #R0278)中裂解，以确定特定的摄入。将得到的滤纸在37℃温育，并且 在不同的时间点收集细胞样品和底外侧和顶部培养基样品，以确定顶部和 /或底外侧释放。样品中抗体的含量使用高灵敏性IgG ELISA定量。这些 分析的结果显示在图50中：高亲和力的二价抗-TfR抗体(TfR1)有效地结 合细胞，但是不释放到顶部或底外侧区室中。以相同的方式，包含高亲和 力TfR结合位点的双特异性抗体(TfR1-Dig，TfR1-Bio)有效地结合细胞， 但是不释放到顶部或底外侧区室中。相反，具有减少的亲和力(TfR2)的二 价抗-TfR抗体有效地结合细胞，并且随后随时间释放到顶部或底外侧区室中。包含减少的亲和力的二价TfR结合位点的双特异性抗体(TfR2-Dig， TfR2-Bio)也有效地结合细胞，并且以与亲本抗体相同的程度释放到顶部 或底外侧区室中。与不存在于hCMEC/D3上的抗原结合的对照双特异性 抗体(CD33-Dig，CD33-Bio)不结合这些细胞，并且因此也不随时间释放 到顶部或底外侧区室中。
实施例30
具有减少的针对TfR的亲和力的血脑屏障-穿梭模块穿梭穿过内皮细胞并 且支持半抗原化的有效负载物的胞转和释放
使用脑内皮细胞(hCMEC/D3)来研究与半抗原-结合性血脑屏障-穿梭 模块形成非共价复合物的半抗原化的有效负载物的细胞结合和胞转作用。 为了评价是否可以通过本文报道的半抗原-结合性血脑屏障-穿梭模块(双 特异性抗体)实现非共价复合的有效负载物的有效负载物胞转，将在 trans-well系统中的hCMEC/D3细胞暴露于由本文报道的双特异性抗体复 合的半抗原化的有效负载物(关于示例性的构建体，参见之前的实施例) 1小时，以允许TfR结合。通过洗涤去除穿梭物和有效负载物后(见实施 例28)，以与实施例28关于穿梭模块所述相同的方式，随时间(实验开 始＝洗涤步骤后0-5小时)监测有效负载物的结合的分子、内在化、细胞 内分选、胞转和释放。用在本实施例中的有效负载物是单-半抗原化的 DNA，其在用本文报道的双特异性抗体温育时，以2:1的(摩尔)比例非共 价复合，如图51A所示。可以通过qPCR检测有效负载物在细胞提取物、 顶部和底外侧区室中的存在。示例性地，图51A显示在Roche LightCycler 上使用两种PCR引物PrFor(SEQ ID NO:200)和PrRev(SEQ ID NO:201) 定量作为有效负载物的末端单-生物素化的或单-洋地黄毒苷化的单链 DNA 50mer(SEQ ID NO:199)。这些分析的结果(图51B)证明非共价连接 的半抗原化的有效负载物结合细胞，内在化，然后被释放到顶部和底外侧 区室。结合和随后的释放由TfR-结合性血脑屏障-穿梭模块介导，原因在 于，如果使用CD33-结合性对照双特异性抗体，没有检测到与细胞的结合， 也没有检测到释放。此外，在使用没有双特异性抗体的半抗原化的有效负 载物的情形中，没有检测到与细胞的结合，也没有检测到释放。对于包含 双特异性抗体和相对应的半抗原化的有效负载物的洋地黄毒苷结合位点 和生物结合位点，观察到非共价复合的有效负载物的胞转作用。这表明， 可以使用不同的半抗原来设计非共价的双特异性抗体血脑屏障-穿梭模 块。因此，可以使用半抗原-结合性双特异性抗体实现非共价复合的半抗 原化的有效负载物的有效负载物穿过血脑屏障的胞转。
实施例31
具有针对TfR的高亲和力的结合位点的血脑屏障-穿梭模块结合内皮细胞 但不从内皮细胞释放，但是仍然支持半抗原化的有效负载物的胞转和释 放
以与前述实施例30所述相同的方式，使用脑内皮细胞(hCMEC/D3) 来研究可以与半抗原-结合性血脑屏障-穿梭模块形成非共价复合物的半 抗原化的有效负载物的细胞结合和胞转作用。将在trans-well系统中的 HCMEC/D3细胞暴露于与血脑屏障-穿梭模块(双特异性抗体)复合的半抗 原化的有效负载物1小时，以允许TfR结合、内在化和细胞内分选以及 胞转。有效负载物是单-半抗原化的DNA，其在用所述双特异性抗体温育 时，以2:1的(摩尔)比例非共价复合，如图51A所示。如前述实施例30 所述，可以通过qPCR定量单-生物素化的或单-洋地黄毒苷化的单链DNA 50mer有效负载物(SEQ ID NO:199)在细胞提取物、顶部和底外侧区室中 的存在。
这些分析的结果(图52)证明非共价复合的半抗原化的有效负载物结 合细胞，内在化，然后被释放到顶部和底外侧区室。由于二价高亲和力穿 梭模块本身不从细胞释放，因此这是令人惊讶的发现。结合和随后的有效 负载物释放由TfR-结合性双特异性抗体血脑屏障-穿梭模块介导，原因在 于，如果使用CD33-结合性对照双特异性抗体，没有检测到与细胞的结合， 也没有检测到释放。此外，在使用没有双特异性抗体血脑屏障-穿梭模块的半抗原化的有效负载物的情形中，没有检测到与细胞的结合，也没有检 测到释放。对于包含双特异性抗体和相对应的半抗原化的有效负载物的洋 地黄毒苷结合位点和生物结合位点，观察到非共价复合的有效负载物的胞 转和释放。这表明，可以使用不同的半抗原来设计半抗原化的有效负载物 与双特异性抗体血脑屏障-穿梭模块的非共价复合物。可以通过与血脑屏 障-穿梭模块(双特异性抗体)非共价复合的半抗原化的有效负载物实现穿 过包含血脑屏障的细胞的有效负载物胞转。令人惊讶地，由于甚至当使用 不释放的穿梭模块时，有效负载物也被释放，因此，胞转不依赖于穿梭载 体本身的释放。
实施例32
在囊泡区室内，半抗原化的有效负载物与血脑屏障-穿梭模块分离
使用包含与内皮细胞结合但是本身不从这些细胞释放的血脑屏障-穿 梭模块的高亲和力TfR结合位点(TfR1)的胞转测定显示了令人惊讶的结 果：尽管穿梭模块本身保持连接在细胞上/保留在细胞中，半抗原化的有 效负载物穿梭穿过细胞，并且释放到顶部和底外侧区室。双特异性抗体介 导的有效负载物的细胞结合、摄入和分布通过共聚焦显微镜检进行分析。 因此，将脑内皮细胞(hCMEC/D3)暴露于双特异性抗体-复合的半抗原化的 荧光有效负载物(半抗原-Cy5或半抗原-DNA-Cy5)，并且通过共聚焦荧光 显微镜检进行分析。因此，将hCMEC/D3细胞接种在显微镜级别的玻璃 盖玻片上，并且用50nM双特异性抗体-复合的半抗原化的荧光有效负载 物在细胞培养基中在37℃温育三小时。然后，洗涤细胞，固定(4％低 聚甲醛)，并通过用抗-κ轻链特异性抗体接着用缀合到ALEXA Fluor 488 上的二级抗体复染而检测穿梭模块的IgG部分。在LEICASP5x共聚焦显 微镜上使用100x/1.46NA物镜，使用用于ALEXAFluor488(IgG)和CY5(半 抗原-DNA-CY5有效负载物)的适当的带通滤波器设置，拍摄图像。这些 分析的结果显示在图53中。高亲和力双特异性抗体与荧光标记的半抗原 化的有效负载物(DNA-Cy5)的复合物结合TfR，并且初始位于细胞表面 上。然后，它们与其同种受体共同内在化，并且出现在细胞内囊泡区室中， 即，内体和溶酶体中。内在化后很快(三小时)我们观察到归因于穿梭模 块的荧光信号与归因于半抗原化的有效负载物的荧光信号的实质性分离。 因此，本文报道的血脑屏障-穿梭模块与半抗原化的有效负载物的非共价 复合物可以在细胞内解离到不同的囊泡区室中。由此，有效负载物从穿梭 模块上释放，并且甚至在穿梭模块保持与细胞结合/保留在细胞中时，可 以通过胞转作用离开内皮细胞。对于洋地黄毒苷结合性以及生物素-结合 性血脑屏障-穿梭模块(双特异性抗体)和相对应的半抗原化的有效负载物， 观察到非共价复合的半抗原化的有效负载物的细胞内分离。因此，可以使 用不同的半抗原来设计半抗原化的有效负载物与血脑屏障-穿梭模块的非 共价复合物，所述非共价复合物能够允许有效负载物胞转。
实施例33
包含肽YY的Helicar基序氨基酸序列
肽YY是一种由回肠和结肠中的细胞响应喂食而释放的一种短肽(36- 氨基酸)。在人中，其似乎是降低食欲。最常见形式的循环的PYY是 PYY3-36，其与Y受体家族的Y2受体(Y2R)结合。PYY存在于胃肠道(尤 其是回肠和结肠)粘膜中的L细胞中。此外，在食道、胃、十二指肠和 空肠中发现少量的PYY，约1-10％。在循环中，PYY浓度在食物摄入后 增加，并且在禁食过程中下降。PYY通过NPY受体发挥其作用；其抑制 胃蠕动，并且增加结肠中的水和电解质吸收。PYY和PYY模拟物已经用 于解决肥胖。
修饰PYY，以包含helicar基序氨基酸序列，并且被抗-helicar基序氨 基酸序列抗体复合，以利用抗体的药物代谢动力学特性并且避免PYY固 有的不稳定性。
非共价复合物形成
PYY3-36肽的结构研究(Nygaard，R.，等，Biochem.45(2006) 8350–8357；SEQ IDNO:211)揭示用于中心氨基酸的螺旋基序(helicar-样 基序氨基酸序列)。由于已经记载N-端异亮氨酸和修饰的C-端对于肽的功 能性活性是重要的，因此，修饰中心螺旋，以使所述氨基酸反映在helicar 基序氨基酸序列中。
Figure BDA0002341415350002001
Figure BDA0002341415350002011
通过转染两个包含分别插入到包含恒定人IgG1和恒定人λ结构域的 载体中的重链和轻链可变区的质粒而在HEK293细胞中产生完整的IgG1 抗-helicar基序氨基酸序列抗体。使用蛋白A层析，通过标准方法纯化抗 -helicar基序氨基酸序列抗体(0019)。质谱实验证实了抗体0019的性质。
通过向抗体溶液中应用少量过量的肽而在体外获得抗体0019与修饰 的PYY肽PYY_helicar之间的复合物。形成了复合物0052。通过 SEC-MALLS分析实验确定所述复合物的化学计量为1.6个肽复合到1个 二价抗体上。
检测抗体0019、PYY(3-36)野生型、PYY_helicar和复合物0052对 Y2受体家族的作用。
Figure BDA0002341415350002012
Figure BDA0002341415350002021
如证实的(Hoffmann，E.，等，J.Cont.Rel.171(2013)48-56.)，与抗 体复合的肽具有延长的体内半衰期。并且，令人惊讶地，与未复合的肽相 比，所述复合物表现出略好的针对NPY2R受体的亲和性；所述抗体使所 述多肽稳定，并且使所述肽以其固定的生物学活性构象呈现。
共价复合物形成(共价二硫键)
为了提高抗-helicar基序氨基酸序列抗体与包含helicar基序氨基酸序 列的化合物之间的复合物的体外和体内稳定性，已经使用了在结合时形成 二硫键。
第一步是特异性识别步骤(高亲和力相互作用)，即，形成包含helicar 基序氨基酸序列的化合物-抗-helicar基序氨基酸序列抗体复合物。在第二 步中，这之后是二硫键自发改组，以形成稳定性改善的共价复合物。
由于12-mer肽(helicar基序氨基酸序列)是相对刚性的实体(至少当 被特异性的抗-helicar基序氨基酸序列抗体复合时)，因此，已经发现必须 使用用于二硫键的结构特异性设计。由于复合物形成和之后引起的共价偶 联是在两个重组产生的实体之间，引入用于形成共价二硫键的人工半胱氨 酸残基不必作为游离的半胱氨酸残基产生，但是以还原形式表达，即，缀 合到游离的半胱氨酸或同型半胱氨酸的氨基酸上。
抗-helicar基序氨基酸序列抗体可变结构域的氨基酸序列中引入人工 游离的半胱氨酸残基的位置是至关重要的。抗体可变结构域氨基酸序列中 未暴露的半胱氨酸具有更大的作为游离的半胱氨酸(没有缀合的)表达的 可能性，而由于由半胱氨酸构型引入的空间位阻，暴露的邻近结合口袋的 胱氨酸残基可以消除12-mer肽(helicar基序氨基酸序列)与另外的结构部 分(如游离的半胱氨酸)的结合
a)与包含helicar基序氨基酸序列的荧光化合物的复合物
为了鉴定具有最低空间位阻危险和强亲和性减少的适当的位置，已 经检测了用于在helicar基序氨基酸序列中引入人工半胱氨酸残基的不同 位置。半胱氨酸残基已被引入在12mer(helicar基序氨基酸序列)的C-端， 从而使得大部分的互补位不变。已经合成了所述肽，并且融合到荧光基序 上。
Figure BDA0002341415350002031
关于所述抗体，已经进行了结构设计，以允许在不同的3D环境中关 于两种设计的分别包含半胱氨酸的肽形成二硫键。
将12-mer螺旋肽AHLENEVARLKK(helicar基序氨基酸序列)建模成 VH和VH结构域。在肽的C-端，残基L10和K11被鉴定为可能的位置， 并且在轻链可变结构域中，鉴定了按照Kabat轻链编号的位置N55和G51。
抗-helicar基序氨基酸序列抗体(0019)的重链可变结构域具有下述氨 基酸序列：
Figure BDA0002341415350002032
(SEQ ID NO:205)。
抗-helicar基序氨基酸序列抗体(0019)的轻链可变结构域具有下述氨 基酸序列：
Figure BDA0002341415350002033
(SEQ ID NO:206)。
抗-helicar基序氨基酸序列抗体(0155)的轻链可变结构域N55C变体 具有下述氨基酸序列：
Figure BDA0002341415350002041
(SEQ ID NO:207)。
抗-helicar基序氨基酸序列抗体(0157)的轻链可变结构域N51C变体 具有下述氨基酸序列：
Figure BDA0002341415350002042
(SEQ ID NO:208)。
i)包含helicar基序氨基酸序列的化合物与抗体0155的共价缀合物
二价抗体0155与其没有游离的半胱氨酸的亲本分子Y2R(bck)-0019 类似地在HEK293细胞中表达。使用用于抗体0019的相同的方法纯化修 饰的抗体。质谱分析表明实验确定的去糖基化的抗体的质量为142,001 Da。这超过了计算质量259Da。还原的链具有下述实验确定的质量：48,167 Da(完整的重链，计算为48,168Da，Cys＝SH，C-Term＝-K)和22,720Da (完整的轻链，N55C，计算为22,720Da，Cys＝SH)。链的序列在还原 后验证。
在100％DMF中使用2.5摩尔过量的包含helicar基序氨基酸序列的 化合物，将抗体0155偶联到helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体2上， 形成共价复合物0156。
在SDS page(变性条件，见图54)上，仅对抗体0155观察到荧光； 在还原条件下，仅有小肽是可见的。
结果：
包含helicar基序氨基酸序列的荧光化合物与抗-helicar基序氨基酸序 列抗体的共价缀合是成功的。共有约43％的抗-helicar基序氨基酸序列抗 体共价缀合到两个helicar基序氨基酸序列上，约40％的抗-helicar基序氨 基酸序列抗体共价缀合到一个helicar基序氨基酸序列上，约17％的抗 -helicar基序氨基酸序列没有缀合。
包含两个helicar基序氨基酸序列的缀合物被修饰至50％。该种类没 有考虑进行定量。如对于起始材料已经确定的，没有helicar基序氨基酸 序列的抗体包含两个约128Da的修饰。缀合到一个helicar基序氨基酸序 列上的抗体仅具有一个约128Da的修饰。
ii)包含helicar基序氨基酸序列的化合物与抗体0157的共价缀合物
与抗体0155类似，抗体0157主要以半胱氨酰化的形式表达。质谱 分析显示去糖基化的抗体的实验确定的质量为141,863Da。这超过了计算 质量3Da。所述抗体主要作为单一或双同型半胱氨酰化形式存在。还原 的链具有下述实验确定的质量：48,168Da(完整的重链，计算为48,168 Da，Cys＝SH，C-Term＝-K)和22,777Da(完整的轻链，N51C，计算为22,777Da，Cys＝SH)。链的序列在还原后验证。
抗体0157与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的偶联没有形成 预期的共价复合物。在预期的泳道中没有观察到荧光，但是在本实验中应 该是阴性的参比泳道中观察到荧光(见图55)。
抗体0157与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1一起温育。抗体 0019与同样的helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1一起温育作为对照。
结果：
包含helicar基序氨基酸序列的荧光化合物与抗-helicar基序氨基酸序 列抗体的共价缀合没有成功。不受该理论的限制，假设在该情形中，抗体 半胱氨酰化在结合口袋中太深而不允许包含helicar基序氨基酸序列的荧 光化合物有效地结合在适当的位置的亲核巯基基团并递送在适当的位置 的亲核巯基基团区攻击C51。
b)与包含helicar基序氨基酸序列的重组多肽的复合物
当考虑到与重组产生的包含helicar基序氨基酸序列的多肽形成共价 复合物时，基于helicar的方法变得特别有吸引性。
由于包含VL-N55C突变的抗体0155与helicar基序氨基酸序列半胱 氨酸变体1(AHLENEVARLCK；SEQ ID NO:203)的缀合较备选方案(在VL上的G51C与helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体2 (AHLENEVARCKK；SEQ ID NO:204))更好进行，进一步研究0155与包 含helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1的多肽的缀合。所述多肽包含 融合到N-端的helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1 (AHLENEVARLCK；SEQ ID NO:203)。
已经在大肠杆菌中产生了包含假单胞菌属外毒素分子LR8M、C-端赖 氨酸残基缺失的helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1(0236；SEQ ID NO:213)，并且使用阴离子交换层析和SEC的组合进行纯化(例如，参见 WO 2011/032022)。
抗体0155共价缀合到SEQ ID NO:213的包含假单胞菌属外毒素分子 LR8M、C-端赖氨酸残基缺失的helicar基序氨基酸序列半胱氨酸变体1 上。SEC层析图谱显示在图56中。对于未还原的样品，通过SDS-CE、 测径器分析缀合效率(见图57)。
共有约4％的抗-helicar基序氨基酸序列抗体共价缀合到两个SEQ ID NO:213的多肽上，约41％的抗-helicar基序氨基酸序列抗体共价缀合到 一个SEQ ID NO:213的多肽上，并且约55％的抗-helicar基序氨基酸序 列没有缀合。
总之，抗-helicar基序氨基酸序列单克隆抗体可以用于通过12-mer helicar基序氨基酸序列的高亲和性识别而复合肽、具有肽接头的小分子和 重组蛋白。可以修饰具有折叠成螺旋的倾向性的肽，以模拟初始的12-mer helicar基序氨基酸序列AHLENEVARLKK(SEQID NO:202)，然后可与 抗-helicar基序氨基酸序列单克隆抗体复合。除了高亲和力复合，还允许 SEQ ID NO:202的包含半胱氨酸的半胱氨酸变体与在CDRs中包含半胱 氨酸的修饰的抗-helicar基序氨基酸序列抗体通过形成稳定的二硫键的共 价缀合。由不同系统表达的重组蛋白可以在体外在以后缀合，无需特定的 反应条件，而是通过自发的二硫键改组进行。
实施例34
来自具有包含BrdU的有效负载物的复合物的BrdU-结合性双特异性抗 体
利用SEC-MALLS分析来评价转铁蛋白受体(TfR)-和溴代脱氧尿苷 (BRDU)-结合性双特异性抗体(bsAb)是否能够结合包含BRDU的有效负 载物和结合至何种程度。因此，将BRDU-DNA以2:1的化学计量比例(350 μg；2.5mg/ml)添加到TfR-BRDU bsAb中，并且在室温温育30分钟，以 形成bsAb/有效负载物-复合物。作为对照试剂，我们制备游离的双特异性抗体(2.5mg/ml)和游离的BRDU-DNA(3.2mg/ml)。BRDU-DNA (BRDU-ACC AAG CCT AGA GAGGAG CAA TAC AAC AGT ACA TAT CGC GTG GTAAGC GT；SEQ ID NO:228)在DNA的5’端包含1个 BRDU/DNA分子。将复合物和对照试剂保存在-80℃，直到进行分析时。
将由此产生的复合物和对照试剂进行SEC-MALLS分析以鉴定并表 征游离的双特异性抗体、游离的有效负载物和二者的复合物。在装配了 Wyatt miniDawnTREOS/QELS和Optilab rEX检测器的Dionex Ultimate 3000 HPLC上进行SEC-MALLS分析。将分析物以1mg/ml溶解在PBS 缓冲液pH 7.4中，以0.5ml/min的流速应用到Superdex200 10/300GL柱上，并用PBS缓冲液pH 7.4洗涤60分钟。
这些分析的结果(显示在图58中)表明，包含BRDU的DNA与双 特异性抗体形成确定的复合物。这些复合物以244.9kDa的MW从柱上洗 脱下来(图58A)并且展现出6.8nm的水力学半径(图58B)，这允许计算约 2(1.8)个DNA分子/双特异性抗体分子的化学计量比例。与此相比较，游 离的双特异性抗体在215.4kDa的MW检测到，并且其水力学半径确定为6.2nm。游离的BRDU-DNA在16.4kDa的MW检测到。
因此，表明包含BRDU的DNA被抗-TfR/BRDU双特异性抗体有效 且化学计量地结合，形成2:1摩尔比例的复合物。
实施例35
生物素-结合性双特异性抗体与包含生物素的IgGs结合
为了分析TfR/生物素双特异性抗体是否能够结合单-生物素化的全长 IgG以及结合至何种程度，将特异性结合pTau(生物素-标记的抗-pTau抗 体，BIO-pTau)的IgG同种型的单-生物素化的抗体以2:1的化学计量比例 (300μg，1.3mg/ml)添加到抗-TfR/生物素双特异性抗体中，并且将混合物 在室温温育30分钟(形成双特异性抗体-有效负载物复合物)。通过产生 在IgG同种型的凸起-进入-孔洞异型二聚体抗体的一条链的C-端具有Avi-标签的IgG-衍生物，而产生单-生物素化的IgG。所述Avi-标签以限定的 方式酶促缀合到一个生物素上。
作为复合物形成的特异性的对照，将抗-TfR/洋地黄毒苷双特异性抗 体与BIO-pTau混合。制备游离的双特异性抗体和游离的BIO-pTau二者 作为其他的对照试剂。复合物和对照试剂保存在-80℃，直到用于分析时。
将产生的复合物进行SEC-MALLS分析，以鉴定并表征游离的双特 异性抗体、游离的BIO-pTau以及它们的复合物。在装配了Wyatt miniDawnTREOS/QELS和Optilab rEX检测器的Dionex Ultimate 3000 HPLC上进行SEC-MALLS分析。将分析物以1-2mg/ml溶解在PBS缓冲 液pH 7.4中，以0.5ml/min的流速应用到Superose 6 10/300GL柱上，并 且用PBS缓冲液pH 7.4洗脱60分钟。
这些分析的结果(显示在图59中)表明，BIO-pTau与双特异性抗体 形成确定的复合物。这些复合物以501kDa的MW从柱上洗脱下来(图59A)，并且展现出8.0nm的水力学半径(图59B)。与此相比较，游离的双 特异性抗体在205kDa的MW检测到，并且其水力学半径确定为6.2nm。 游离的BIO-pTau在150kDa的MW检测到，并且其水力学半径测量为 5.5nm。
由于洋地黄毒苷-结合性双特异性抗体不与BIO-pTau形成复合物(图 59C)，因此，通过生物素与双特异性抗体的生物素-结合性结构部分之间 的相互作用特异性地形成复合物。
实施例36
生物素-标记的抗-pTau抗体的胞转
为了分析抗-TfR/生物素双特异性抗体是否促进全长抗体有效负载物 的胞转以及到何种程度，按照实施例35所述形成抗-TfR/生物素双特异性 抗体(抗-TfR/生物素bsAb-1和抗-TfR/生物素bsAb-2)与BIO-pTau的复 合物，并且如上文所述进行胞转测定，例如，如实施例31所述。作为非 特异性胞转的对照，平行检测抗-CD33/生物素双特异性抗体与BIO-pTau 的复合物以及游离的BIO-pTau。在负载细胞后0，1，2，3，4和5小时 采集顶部和底外侧区室的样品和细胞裂解物的样品。负载浓度总是3.8 μg/ml。
通过ELISA测量生物素-标记的抗-pTau抗体的量。因此，将pTau蛋 白以500ng/ml包被到NUNC Maxisorb White 384-孔平板上，在2-8℃过 夜或在室温一小时。将平板用包含2％BSA和0.05％吐温20的PBS封 闭至少一小时。将在包含0.5％BSA和0.05％吐温20的PBS中1/729稀 释的样品稀释液上样1.5-2小时，然后上样聚-HRP40-链霉抗生物素蛋白(Fitzgerald)30分钟和超级信号ELISA Pico底物(Thermo Scientific)10分 钟，都在室温下进行。在同一平板上测定BIO-pTau抗体的标准稀释液(100 ng/ml–0.5pg/ml)。在连续的温育步骤之间，将平板用包含0.1％吐温20 的PBS洗涤。
这些胞转测定的结果(图60)表明，将BIO-pTau与抗-TfR/生物素 bsAb-1复合或与抗-TfR/生物素bsAb-2复合调节有效的内吞并随后转运 BIO-pTau进入底外侧以及回到顶部区室。相反，BIO-pTau与抗-CD33/生 物素双特异性抗体的复合物和游离的BIO-pTau都没有被有效地内吞或胞 转，这表明观察到的胞转是由抗-TfR/生物素双特异性抗体与细胞表面上 的TfR特异性结合引起的。
实施例37
半抗原-结合性血脑屏障-穿梭剂能够允许短寡核苷酸的胞转和释放
在本实施例中，证明对小的核酸，诸如反义寡核苷酸，或修饰的核 酸衍生物，如“锁定的”核酸，可以实现核酸穿过形成血脑屏障的内皮细 胞的胞转。已经产生了比实施例30和31中描述的DNA片段小的单链核 酸有效负载物。这些以半抗原-偶联的形式产生的有效负载物与治疗性反 义寡核苷酸或锁定的核酸非常相似，并且因此可以作为所述实体的替代 物。与实施例30所述的测定类似地，通过qPCR测定实现半抗原化的(例 如，单-生物素化的或单-洋地黄毒苷化的)单链34mer或28mer寡核苷酸 (分别为序列S1或S2)的精确检测。使用PCR引物PrFor(SEQ ID NO:200) 和PrRev(SEQ ID NO:201)，通过分析hCMEC/D3培养基和细胞提取物中S1和S2 DNAs的连续稀释液，验证特异性的检测。用于检测寡核苷酸S1或S2在顶部或底外侧细胞上清区室中或在细胞提取物中的存在的qPCR 测定的条件如下：在95℃变性10min.；95℃10sec.，54℃15sec.，72℃ 10sec.，共45个循环；然后使高分辨率的解链和冷却。测定在Roche光 循环仪480II(Roche Light Cycler 480II)上进行。
以与实施例30和31所述相同的方式，使用脑内皮细胞(hCMEC/D3) 来研究可以与半抗原-结合性血脑屏障-穿梭模块形成非共价复合物的半 抗原化的有效负载物的细胞结合和胞转。将在trans-well系统中的 HCMEC/D3细胞暴露于与血脑屏障-穿梭模块(双特异性抗体)复合的半抗 原化的有效负载物1小时，以允许TfR结合、内在化和细胞内分选以及胞转。有效负载物是单-半抗原化的寡核苷酸S1或S2，其在与双特异性 抗体一起温育时以2:1的(摩尔)比例非共价复合，如图51A所示。如之 前实施例30和31所述，通过qPCR定量单-生物素化的或单-洋地黄毒苷 化的寡核苷酸S1或S2在细胞提取物、顶部和底外侧区室中的存在。如 实施例29所述，通过特异性针对人IgG的ELISA量化血脑屏障-穿梭模 块(双特异性抗体)在相同的提取物、顶部和底外侧区室中的存在。
这些分析的结果(图61-63)证明，非共价连接的半抗原化有效负载物 S1和S2与细胞结合，内在化，并且随后释放到顶部和底外侧区室中。如 同实施例31中的50mer DNA有效负载物的情形，观察到本身不从细胞释 放的二价高亲和性穿梭模块仍然促进两种有效负载物S1和S2的胞转。 结合和随后的释放由TfR-结合性血脑屏障-穿梭模块调节，原因在于，如 果使用CD33-结合性对照双特异性抗体，没有检测到与细胞的结合，也没 有检测到释放。对于包含双特异性抗体和相对应的半抗原化的有效负载物 的洋地黄毒苷结合性穿梭剂以及生物素结合性穿梭剂，观察到非共价复合 的有效负载物S1和S2的胞转。相反，在使用没有双特异性抗体的半抗 原化的有效负载物的情形中，或者当半抗原化的有效负载物与识别不相关 的半抗原的双特异性抗体一起使用时，没有检测到显著的与细胞的特异性结合，也没有检测到显著的释放。这表明，短的寡核苷酸-衍生的有效负 载物由非共价的双特异性抗体血脑屏障-穿梭模块递送穿过脑内皮细胞。 因此，通过与血脑屏障-穿梭模块(双特异性抗体)非共价复合的半抗原化的 有效负载物可以实现短的核酸(如反义-寡核苷酸或“锁定的”核酸)穿 过形成血脑屏障的细胞的胞转。以与实施例31所述相同的方式，短的核 酸衍生物的胞转不依赖于穿梭载体本身的释放，原因在于甚至当使用不释 放的穿梭模块时，有效负载物也从穿梭实体释放。
实施例38
评价半抗原-和转铁蛋白-受体结合性穿梭载体递送有效负载物穿过血脑 屏障的体内功能
利用动物实验评价双特异性半抗原-和转铁蛋白-受体结合性穿梭载 体在体内能够允许有效负载物递送穿过血脑屏障(BBB)到何种程度。在脑 中被转运和检测到的有效负载物是单-生物素化的磷酸-tau结合性抗体衍 生物。该抗体的靶标(tau蛋白)位于脑中。由于这个原因，所述抗体需 要通过血脑屏障接近其靶标。因此，该抗体用作有效负载物用于体内实验。 与有效负载物组合的穿梭载体以与上文所述的实施例中所述和用于体外 实验的那些相同或相似的方式构成，但是具有结合鼠转铁蛋白受体而不结 合人对应体的结合区。转换特异性的原因是培养的BBB-胞转分析系统 ((transwell测定，见上文)应用具有人TfR的细胞，却在BBB上具有鼠 TfR的小鼠中进行动物实验。
识别鼠TfR的半抗原(例如，生物素)-结合性穿梭载体与生物素化的 pTau-结合性抗体复合，然后应用给TauPS2APP小鼠。备选地，还可以将 识别鼠TfR的半抗原(例如，生物素)-结合性穿梭载体注射到TauPS2APP 小鼠中，然后在稍后的时间点注射生物素化的pTau-结合性抗体(＝预先 靶向设置)。
在第-1天，将各组小鼠用单剂量的抗-CD4处理，以诱导免疫耐受性， 然后每周静脉内注射测试物质，持续10-12周：
A组:没有处理
B组:仅用(生物素化的)p-Tau结合性抗体
C组:与双特异性抗-TfR/生物素抗体(穿梭载体)复合的生物素 化的p-Tau结合性抗体
D组:与抗-TfR抗体共价连接的p-Tau结合性抗体
在第0天将A组小鼠处死，以提供基线组。其余的组每周接受静脉 内施用各自化合物，共持续12周，并且在最后施用后一周处死。
为了确定将有效负载物抗体转运穿过BBB，将每只小鼠的脑矢状切 成两个半球，并且按下述使用：
(1)右半球:包含pTau的聚集物的免疫组织化学，
(2)左半球:制备脑匀浆物，用于通过特异性αLISAs (AlphaLISAs)测量磷酸-tau蛋白和总tau蛋白。
Figure IDA0002341415420000011
Figure IDA0002341415420000021
Figure IDA0002341415420000031
Figure IDA0002341415420000041
Figure IDA0002341415420000051
Figure IDA0002341415420000061
Figure IDA0002341415420000071
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Claims (20)

1.共价缀合物用于靶向递送半抗原化的有效负载物穿过血脑屏障的应用，所述共价缀合物包含：
i)双特异性抗体，其具有特异性结合半抗原化的有效负载物的第一结合特异性，和特异性结合血脑屏障受体的第二结合特异性，和
ii)半抗原化的有效负载物，
其中所述半抗原化的有效负载物通过所述第一结合特异性特异性结合，
其中所述共价缀合物具有在所述半抗原化的有效负载物与特异性结合所述半抗原化的有效负载物的第一结合特异性之间的共价键，并且
其中所述半抗原化的有效负载物选自由下述组成的组：生物素化的有效负载物，茶碱化的有效负载物，洋地黄毒苷化的有效负载物，碳硼烷化的有效负载物，荧光素化的有效负载物，helicarylated有效负载物和溴脱氧尿苷化的有效负载物。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述应用是靶向递送游离的(即，分离的)半抗原化的有效负载物穿过血脑屏障。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的应用，其中血脑屏障受体选自由下述组成的组：转铁蛋白受体(TfR)，胰岛素受体，胰岛素样生长因子受体(IGF受体)，低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)，低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)，和肝素-结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其中所述血脑屏障受体是转铁蛋白受体或低密度脂蛋白受体相关蛋白8。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其中所述双特异性抗体没有效应子功能。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其中所述双特异性抗体包含：
a)一个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和一个针对血脑屏障受体的结合位点，或
b)两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和一个针对血脑屏障受体的结合位点，或
c)一个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点，或
d)两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的应用，其中所述双特异性抗体包含在所述抗体CDR2中的氨基酸残基处的半胱氨酸残基，其中所述CDR2按照Kabat确定。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的应用，其中所述共价键是在所述抗体的CDR2中的半胱氨酸残基与所述半抗原化的有效负载物中的巯基基团之间。
9.一种共价缀合物，所述共价缀合物包含：
i)双特异性抗体，其具有特异性结合半抗原化的有效负载物的第一结合特异性，和特异性结合血脑屏障受体的第二结合特异性，和
ii)半抗原化的有效负载物，
其中所述半抗原化的有效负载物通过所述第一结合特异性特异性结合，
其中所述共价缀合物具有在所述半抗原化的有效负载物与特异性结合所述半抗原化的有效负载物的第一结合特异性之间的共价键，并且
其中所述半抗原化的有效负载物选自由下述组成的组：生物素化的有效负载物，茶碱化的有效负载物，洋地黄毒苷化的有效负载物，碳硼烷化的有效负载物，荧光素化的有效负载物，helicarylated有效负载物和溴脱氧尿苷化的有效负载物。
10.根据权利要求9所述的缀合物，其中所述血脑屏障受体选自由下述组成的组：转铁蛋白受体(TfR)，胰岛素受体，胰岛素样生长因子受体(IGF受体)，低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)，低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)，和肝素-结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。
11.根据权利要求9-10中任一项所述的缀合物，其中血脑屏障受体是转铁蛋白受体或低密度脂蛋白受体相关蛋白8。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的缀合物，其中所述双特异性抗体没有效应子功能。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的缀合物，其中所述双特异性抗体包含：
a)一个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和一个针对血脑屏障受体的结合位点，或
b)两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和一个针对血脑屏障受体的结合位点，或
c)一个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点，或
d)两个针对半抗原化的有效负载物的结合位点和两个针对血脑屏障受体的结合位点。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的缀合物，其中所述双特异性抗体包含在所述抗体CDR2中的氨基酸残基处的半胱氨酸残基，其中所述CDR2按照Kabat确定。
15.根据权利要求9-14中任一项所述的缀合物，其中所述共价键是在所述抗体的CDR2中的半胱氨酸残基与所述半抗原化的有效负载物中的巯基基团之间。
16.根据权利要求14-15中任一项所述的缀合物，其中所述CDR2是重链CDR2，并且所述半胱氨酸位于按照Kabat编号的位置52b或53。
17.根据权利要求14-15中任一项所述的缀合物，其中所述CDR2是轻链CDR2，并且所述半胱氨酸位于按照Kabat编号的位置55或51。
18.包含权利要求9-17中任一项所述的缀合物和药用载体的药物制剂。
19.根据权利要求9-17中任一项所述的缀合物，其用作药物。
20.根据权利要求9-17中任一项所述的缀合物，其用于治疗癌症或神经学病症。
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