TW202140555A

TW202140555A - 失智症之預防或治療劑

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Publication number: TW202140555A
Application number: TW110101615A
Authority: TW
Inventors: 山下俊英; 糸数秀; 宇野広樹; 石田裕一
Original assignee: 國立大學法人大阪大學; 日商田邊三菱製藥股份有限公司
Priority date: 2020-01-15
Filing date: 2021-01-15
Publication date: 2021-11-01
Also published as: MX2022008588A; JPWO2021145435A1; BR112022013944A2; CN114945385A; WO2021145435A1; CA3168209A1; AU2021207010A1; AR121065A1; US20230090965A1; EP4091633A4; KR20220113794A; IL294769A; EP4091633A1

Abstract

本發明提供一種選自糖尿病性失智症及血管性失智症之失智症之預防或治療劑，其係含有RGMa阻礙物質。

Description

失智症之預防或治療劑

本發明關於一種糖尿病性失智症及血管性失智症之預防或治療劑，其係含有RGMa阻礙物質。

隨著高齡化，糖尿病及失智症患者逐年增加，在糖尿病發病的情況，阿滋海默症或血管性失智症的發病風險會增加，並且已判明了兩疾病之間有密切的病態學關連性(非專利文獻1、非專利文獻2)。另外許多報告指出，沒有併發失智症的糖尿病患者，與非糖尿病患者相比，觀察到認知功能較為降低，關於這種糖尿病患者的認知功能障礙，有文獻報告出注意和集中力降低、視覺性記憶或語言性記憶降低、或簡短智能測驗(Mini-Mental State Examination；MMSE)得分低落等(非專利文獻3)。

近年來，伴隨糖尿病而發生的失智症的分類，除了阿滋海默症或血管性失智症以外，還有文獻提倡了糖代謝異常與失智症發病深刻關連的糖尿病性失智症這種臨床病型(非專利文獻4、非專利文獻5)。糖尿病性失智症在腦影像的觀察當中呈現阿滋海默症的特徵(海馬迴的萎縮等)的情形很少，然而觀察到較多和微小梗塞病變等的血管性病變的合併例(非專利文獻6)，臨床上稍高齡，並且因為糖尿病的控制不良，比起記憶障礙來說還更會有注意和集中力降低或執行功能的障礙明顯、行走稍緩慢這些特徵。

另一方面，血管性失智症是主要起因於腦血管障礙的失智症，尤其是以賓斯旺格病或多發小洞性梗塞等的腦部小血管病為主要原因，定義為(1)有失智症、(2)有腦血管障礙、(3)兩者有因果關係。依照臨床診斷基準NINDS-AIREN(National Institute of Neurological Disorders and Stroke-Association International pour la Recherche et 1' Enseignement en Neurosciences)所作的病型分類，列舉了(1)多發梗塞性、(2)單一病變性、(3)小血管病變性、(4)低灌流性、(5)腦出血性的這五種。然而，這些病型會有病因上、臨床上皆不一致的問題點，因此血管性失智症被認為是包含各種病狀的異質性疾病概念(非專利文獻7、非專利文獻8)。另外，血管性失智症的危險因子包括了糖尿病也已經廣為人知(非專利文獻8、非專利文獻9)。

RGM(repulsive guidance molecule)最初是被鑑定為視覺系統的軸突誘導分子的膜蛋白質(非專利文獻10)。RGM家族包括被稱為RGMa、RGMb及RGMc的三個成員(非專利文獻11)，已知至少RGMa與RGMb是用相同的訊號傳達機制來運作(非專利文獻12)。RGMc在鐵代謝之中發揮重要的功用。由後續的研究判明了RGM具有爪蟾及雞胚胎的軸突誘導及層狀組織形成、以及小鼠胚胎的頭部神經管關閉的控制等的功能(非專利文獻13)。專利文獻1揭示了含有抗RGM中和抗體作為有效成分的軸突再生促進劑。

除了神經發生階段的功能之外，還有在成人及大鼠的中樞神經系統損傷之後再表現、在大鼠身上發現RGMa阻礙會亢進脊髓損傷後的軸突成長，促進功能恢復(非專利文獻14)，因此RGMa被認為是中樞神經系統損傷後軸突再生的阻礙物質。將RGMa中和具體的抗體被記載於例如專利文獻2(例如5F9、8D1)、專利文獻3(例如AE12-1、AE12-1Y)及專利文獻4(例如r116A3、r70E4、r116A3C、rH116A3)。另外，專利文獻2還揭示了抗RGMa抗體在失智症治療的用途。雖然像這樣判明了RGMa在中樞神經系統損傷中的作用，然而在尤其是糖尿病性失智症及血管性失智症的治療中，RGMa的關連並未被鑑定，其治療藥仍為未知。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開WO2005/087268號 [專利文獻2]國際公開WO2009/106356號 [專利文獻3]國際公開WO2013/112922號 [專利文獻4]國際公開WO2016/175236號 [非專利文獻]

[非專利文獻1]Neurology, 45: 1161, 1995 [非專利文獻2]Am. J. Epidemiol. 1455: 301, 1997 [非專利文獻3]Diabetes Care, 20: 438, 1997 [非專利文獻4]Dement Geriatr Cogn Disord, 35: 280-290, 2013 [非專利文獻5]J. Neurol. Sci. 349: 45-51, 2015 [非專利文獻6]Nat Rev Neuro1 5: 305-306, 2009 [非專利文獻7]Neurology, 43: 250-260, 1993 [非專利文獻8]失智症疾病治療指導方針 2017 第14章血管性失智症 [非專利文獻9]Neuron 83: 844-866, 2013 [非專利文獻10]Neuron 5, 735-743 (1990) [非專利文獻11]Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 361: 1513-29, 2006 [非專利文獻12] Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 795-800 (2009) [非專利文獻13]Curr. Opin. Neurobiol. 17, 29-34 (2007) [非專利文獻14]J. Cell Biol. 173, 47-58 (2006)

[發明所欲解決的課題]

本發明課題為提供對糖尿病性失智症及血管性失智症有效的藥劑。 [用於解決課題的手段]

本發明人等為了解決上述課題鑽研檢討，結果發現RGMa阻礙物質，尤其是抗RGMa中和抗體會表現出對糖尿病性失智症及血管性失智症的改善效果，而完成本發明。亦即，本發明如以下所述。

[1]一種RGMa阻礙物質在製造失智症之預防劑或治療劑之用途，其中該失智症係選自糖尿病性失智症及血管性失智症。 [2]一種RGMa阻礙物質在製造糖尿病性失智症之預防劑或治療劑之用途。 [3]一種RGMa阻礙物質在製造血管性失智症之預防劑或治療劑之用途。 [4]如[1]~[3]中任一項之用途，其中RGMa阻礙物質為抗RGMa中和抗體。 [5]如[4]之用途，其中抗RGMa中和抗體為人源化抗體。 [6]如[4]或[5]之用途，其中抗RGMa中和抗體為辨識選自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:39的胺基酸序列的抗體。 [7]如[4]~[6]中任一項之用途，其中抗RGMa中和抗體為選自下述(a)~(l)的抗體： (a)含有包含含有SEQ ID NO:5所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:6所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:7所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:8所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:9所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:10所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (b)含有包含含有SEQ ID NO:11所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:12所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:13所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:14所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:15所記載的胺基酸序列的HCDR2及胺基酸序列中含有SFG的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (c)含有包含含有SEQ ID NO:17所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:18所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:19所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:20所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:21所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:22所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (d)含有包含含有SEQ ID NO:23所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:24所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:25所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:26所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:27所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:28所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (e)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:31所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (f)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:35所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (g)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:40所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (h)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:41所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (i)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:42所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (j)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:43所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (k)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:44所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體及 (l)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:45所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體。

[8]一種失智症之預防或治療方法，其係選自糖尿病性失智症及血管性失智症，包含對於需要治療的哺乳動物投予有效量的RGMa阻礙物質。 [9]如[8]之預防或治療方法，其中RGMa阻礙物質為抗RGMa中和抗體。 [發明之效果]

依據本發明，RGMa阻礙物質，尤其是抗RGMa中和抗體，作為例如選自糖尿病性失智症及血管性失智症的失智症之預防或治療劑是有用的。

以下說明本發明所使用的用語。 [中和] 在本發明中，中和是指結合於目標標的，且可阻礙該標的之任一功能的作用。例如RGMa阻礙物質是指結合於RGMa，結果表現出阻礙RGMa的生物活性的作用的物質。

[表位] 在本發明中的表位含有可特異性地結合於免疫球蛋白或T細胞受體的多肽決定基。在某個實施形態中，表位含有分子化學活性的表面基團(例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，在某個實施形態中可具有特定三維構造特性及/或特定電荷特性。表位是和抗體結合的抗原區域。

[分離] 在本發明中，被分離出來的RGMa阻礙物質(例如抗體等)等的「分離」，意指被鑑定且被分離出來，及/或由自然狀態下的成分來回收。自然狀態下的雜質是可能會妨礙該抗體在診斷或治療上的使用的物質，可列舉酵素、荷爾蒙及其他蛋白質性的或非蛋白質性的溶質。一般而言，為了分離出RGMa阻礙物質等，只要藉由至少一個純化步驟來純化即可，可將藉由至少一個純化步驟純化的RGMa阻礙物質稱為「被分離出來的RGMa阻礙物質」。

[抗體] 在本發明中的抗體，廣義來說，是指保持著免疫球蛋白(Ig)分子實質上結合於表位的特徵而且由兩條重鏈(H鏈)與兩條輕鏈(L鏈)共四條多肽鏈所形成的Ig分子。

[人抗體] 在本發明中，人抗體是指輕鏈、重鏈皆來自人的免疫球蛋白之抗體。人抗體，依照重鏈恆定區域的不同，包含具有γ重鏈的IgG(包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)、具有μ重鏈的IgM、具有α重鏈的IgA(包含IgA1、IgA2)、具有δ重鏈的IgD、或具有ε重鏈的IgE。另外，原則上輕鏈含有κ鏈與λ鏈之任一者。

[人源化抗體] 在本發明中的人源化抗體，是指由來自非人動物抗體的互補性決定區域與來自人抗體的框架區域所形成的可變區域及來自人抗體的恆定區域所形成之抗體。

[嵌合體抗體] 在本發明中的嵌合體抗體，是指輕鏈、重鏈或其兩者是由來自非人抗體的可變區域與來自人抗體的恆定區域所形成之抗體。

[單特異性抗體] 在本發明中單特異性抗體，是指具有單一的抗原特異性而且具有單一獨立的抗原辨識部位的抗體。在本說明書中，會有例如將辨識RGMa的單特異性抗體稱呼為RGMa單特異性抗體的情形。

[多特異性抗體] 在本發明中多特異性抗體，是指具有兩種以上不同的抗原特異性而且具有兩個以上獨立的抗原辨識部位的抗體，可列舉具有兩種抗原特異性的雙特異性抗體、具有三種抗原特異性的三特異性抗體等。

[互補性決定區域(CDR)] 互補性決定區域(CDR)是指免疫球蛋白分子的可變區域之中，形成抗原結合部位的區域，也被稱為超可變區域，是指各個免疫球蛋白分子中尤其胺基酸序列變化大的部分。就CDR來說，輕鏈及重鏈分別有三個CDR。也會有分別將輕鏈所含有的三個CDR稱呼為LCDR1、LCDR2及LCDR3，及以分別將重鏈所含有的三個CDR稱呼為HCDR1、HCDR2及HCDR3的情形。例如免疫球蛋白分子的CDR可依據卡巴(Kabat)的編號系統(Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA)來決定。

[有效量] 有效量，是指充足的預防或治療劑的量而能夠輕減或改善障礙或其一種以上的症狀的重症度及/或期間、預防障礙惡化、使障礙倒退、預防障礙所關連的一種以上的症狀復發、發生、發病或惡化、偵測障礙、強化或提升其他治療(例如預防藥或治療藥)的一種以上的預防或治療效果。

[胺基酸序列的一致性百分比(%)] 可變區域等的候選多肽序列的胺基酸序列對於參考多肽序列的胺基酸序列之「一致性百分比(%)」，被定義為將序列加以整理，為了得到最大的一致性百分比如果有必要的話導入間隙，各種保留型取代都不考慮進序列一致性的一部分之後，候選序列中的胺基酸殘基與特定參考多肽序列的胺基酸殘基相同者之百分比。為了進行一致性百分比的比對，在業界人士的技術範圍的各種方法，可藉由使用例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、或Megalign (DNASTAR)軟體般可公開取得的電腦軟體來達成。只要是業界人士即可決定用來比對序列的適當參數，包括讓被比較的序列全長達成最大的比對所必要的任意演算法。但是，為了達成此處的目的，一致性百分比值，在兩兩相互比對(pairwise alignment)之中，可藉由使用序列比較電腦程式BLAST來求得。在BLAST被使用於比較胺基酸序列的狀況，所提供的胺基酸序列A與所提供的胺基酸序列B的一致性百分比可如以下方式來計算：分率X/Y的100倍此處，X為藉由序列比對程式BLAST，A和B的程式比對結果為相同時，得分一致的胺基酸殘基的數目，Y為B的胺基酸殘基的總數。應該能夠理解在胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不同的情況，A對B的一致性百分比與B對A的一致性百分比是不同的。只要沒有特別註明，此處所有的一致性百分比值，如上段文章所示，可使用BLAST電腦程式求得。

[保留型取代] 保留型取代，意指以實質上不改變胜肽活性的方式將胺基酸殘基以其他化學上類似的胺基酸殘基取代。可列舉例如將某疏水性殘基以其他疏水性殘基取代的情形、將某極性殘基以具有相同電荷的其他極性殘基取代的情形等。可進行這種取代而且功能上類似的胺基酸的例子，非極性(疏水性)胺基酸，可列舉丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸等。極性(中性)胺基酸，可列舉甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺、半胱胺酸等。具有正電荷(鹼性)的胺基酸，可列舉精胺酸、組胺酸、離胺酸等。另外，具有負電荷(酸性)的胺基酸，可列舉天門冬胺酸、麩胺酸等。

以下針對本發明的實施形態詳細說明。本發明提供一種選自糖尿病性失智症及血管性失智症的失智症之預防或治療劑，為RGMa阻礙物質的新用途。另外，本發明提供一種選自糖尿病性失智症及血管性失智症的失智症之預防或治療方法，其係包含對於需要治療的哺乳動物投予含有有效量的RGMa阻礙物質的預防或治療劑的步驟。

＜RGMa阻礙物質＞本發明的RGMa阻礙物質只要是作用於RGMa本身，並阻礙或減弱RGMa的活性(以下在本說明書中會有簡稱為「RGMa活性」的情形)的物質即可，例如具有結合於RGMa，直接阻礙(減弱)RGMa活性的活性、或阻礙RGMa與受體的結合，間接阻礙(減弱)RGMa活性的活性的物質(例如後述化合物或抗體等)，將其稱為本發明的RGMa阻礙物質。另外，本發明的RGMa阻礙物質亦可為抑制RGMa的表現的物質，例如阻礙RGMa的表現，阻礙(減弱)RGMa活性的物質(例如後述核酸分子等)也被包括在本發明的RGMa阻礙物質。

RGMa被鑑定為阻礙中樞神經系統中的神經突成長的蛋白質，人RGMa蛋白質如SEQ ID NO:1所示般，是以由450個胺基酸所形成的前驅蛋白質的形式被生合成出來。存在於N末端的訊號胜肽Met1~Pro47(是指從N末端側算起，第1的甲硫胺酸殘基至第47的脯胺酸殘基為止的胜肽，以後也同樣地記載)會被除去，Asp168與Pro169之間的胜肽鍵會被切斷，而產生N末端結構域，進一步Pro169以後的C末端片段的C末端胜肽Ala425~Cys450會被除去，而且GPI錨定蛋白會被附加至成為C末端的Ala424的C末端羧基，而產生C末端結構域。人RGMa蛋白質，會以上述N末端結構域(Cys48~Asp168)與C末端結構域(Pro169~Ala424)藉由雙硫鍵連接的成熟蛋白質的形式，透過GPI錨定蛋白在細胞膜上表現出來。

在本發明中，RGMa可為來自任一動物的RGMa，宜為人的RGMa。人的RGMa的前驅蛋白質是由序列表的SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列所形成。小鼠的RGMa的前驅蛋白質是由序列表的SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列所形成，大鼠的RGMa的前驅蛋白質是由序列表的SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列所形成，然而C末端胜肽會被除去，因此就成熟蛋白質來說會是相同的胺基酸序列。 RGMa基因可列舉例如由SEQ ID NO:4所表示的鹼基序列所形成的人RGMa基因等，然而並不受其限定。來自各種生物的RGM基因的鹼基序列可由周知的資料庫(GenBank等)輕易獲得。

本發明的RGMa阻礙物質，具體而言，可列舉低分子化合物、抗RGMa中和抗體、其功能改變抗體、其結合抗體或其抗原結合片段等，另外還可列舉RGMa的核酸分子的siRNA(short interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)或反義寡核苷酸等。這些RGMa阻礙物質之中，宜為抗RGMa中和抗體、其功能改變抗體、其結合抗體及其抗原結合片段，較佳為抗RGMa中和抗體或其抗原結合片段，尤其以抗RGMa中和抗體為佳。

＜抗RGMa中和抗體＞在本發明中，抗RGMa中和抗體只要是結合於RGMa，將RGMa活性中和的抗體即可，可為多株抗體或單株抗體。在本發明中宜為單株抗體。另外，本發明的抗RGMa中和抗體，可為RGMa單特異性抗體，或可為多重辨識RGMa及其他抗原的多特異性抗體，宜為RGMa單特異性抗體。

另外，具體的表位，在人的RGMa之中，以SEQ ID NO:16(SEQ ID NO:1的胺基酸編號47-69)、 SEQ ID NO:36(SEQ ID NO:1的胺基酸編號298-311)、 SEQ ID NO:37(SEQ ID NO:1的胺基酸編號322-335)、 SEQ ID NO:38(SEQ ID NO:1的胺基酸編號349-359)、 SEQ ID NO:39(SEQ ID NO:1的胺基酸編號367-377)之中的一者以上為佳，SEQ ID NO:36及37的組合為較佳，SEQ ID NO:36、37及39的組合為特佳。

本發明的抗RGMa中和抗體，包含以RGMa蛋白質或其部分片段(例如上述表位片段)作為抗原，並且讓小鼠等的哺乳動物對該抗原免疫所得到的多株抗體及單株抗體、使用基因轉殖技術所製造出的嵌合體抗體及人源化抗體，以及使用可產生人抗體的基因轉殖動物等所製造出的人抗體等。在將本發明的抗體作為醫藥投予至人體的情況，從副作用的觀點看來，希望為人源化抗體或人抗體。

本發明的抗RGMa中和抗體，具體而言，可列舉下述(a)~(l)的抗體，各製造方法可使用專利文獻2~4所記載的方法。

可列舉選自下述的抗體： (a)含有包含含有SEQ ID NO:5所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:6所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:7所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:8所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:9所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:10所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體進一步還含有以SEQ ID NO:36、37及39為表位的抗體)、 (b)含有包含含有SEQ ID NO:11所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:12所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:13所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:14所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:15所記載的胺基酸序列的HCDR2及胺基酸序列中含有SFG的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體進一步還含有以SEQ ID NO:36、37及38為表位的抗體)、 (c)含有包含含有SEQ ID NO:17所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:18所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:19所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:20所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:21所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:22所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (d)含有包含含有SEQ ID NO:23所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:24所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:25所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:26所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:27所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:28所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (e)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:31所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體進一步還含有以SEQ ID NO:16為表位的抗體)、 (f)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:35所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體進一步還含有以SEQ ID NO:16為表位的抗體)、 (g)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:40所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體進一步還含有以SEQ ID NO:16為表位的抗體)、 (h)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:41所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體進一步還含有以SEQ ID NO:16為表位的抗體)、 (i)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:42所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體進一步還含有以SEQ ID NO:16為表位的抗體)、 (j)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:43所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體進一步還含有以SEQ ID NO:16為表位的抗體)、 (k)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:44所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體進一步還含有以SEQ ID NO:16為表位的抗體)及 (l)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:45所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體(該抗RGMa中和抗體進一步還含有以SEQ ID NO:16為表位的抗體)。這些之中，特別理想的可列舉(a)所記載的抗體。

本發明的抗RGMa中和抗體之製造方法可使用現今一般使用的製造方法。抗原可直接使用於免疫，或可以載體蛋白質的複合體的形式來使用。調製抗原與載體蛋白質的複合體時，可使用戊二醛、碳二亞胺、馬來醯亞胺活性酯等的縮合劑。載體蛋白質可例示牛血清蛋白素、甲狀腺球蛋白、血藍蛋白、KLH等。

免疫的哺乳動物，可列舉小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔子、貓、狗、豬、山羊、馬或牛等，接種方法可列舉皮下，肌肉或腹腔內的投予。投予時，可與完全佛朗氏佐劑或不完全佛朗氏佐劑混合投予，投予通常是每2~5週進行1次。由免疫動物的脾臟或淋巴節所得到的抗體生產細胞會與骨髓腫瘤(骨髓瘤)細胞發生細胞融合，並以融合瘤的形式被分離出來。骨髓腫瘤細胞可使用來自哺乳動物者，例如來自小鼠、大鼠、人等。

＜多株抗體＞多株抗體可例如將如前述般的抗原，因應必要與佛朗氏佐劑(Freund's Adjuvant)一起讓如上述般的哺乳動物免疫，並由從該免疫致敏動物得到的血清來取得。

＜單株抗體＞單株抗體，具體而言可如下述方式取得。亦即，以如前述般的抗原作為免疫原，將該免疫原因應必要與佛朗氏佐劑(Freund's Adjuvant)一起注射或移殖至如上述般的哺乳動物的皮下、肌肉內、靜脈內、腳掌內或腹腔內一次至數次，實施免疫致敏。通常，從初次免疫開始，每約1~14天進行免疫1~4次，最終免疫算起約1~5天後，可由經過免疫致敏的該哺乳動物獲得抗體生產細胞。

單株抗體可使用業界人士周知的方法來獲得(例如『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987))，Antibodies:A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。

分泌單株抗體的「融合瘤」的調製，可依據Kohler及Milstein等的方法(自然期刊(Nature), 256, 495, 1975)及以其為基準的改良方法來進行。亦即，藉由使由免疫致敏後的哺乳動物取得的脾臟等中所含有的抗體生產細胞與來自哺乳動物，宜為小鼠、大鼠或人的沒有自行生產抗體的能力的骨髓瘤細胞發生細胞融合來調製。

細胞融合所使用的骨髓瘤細胞，可使用例如來自小鼠的骨髓瘤P3/X63-AG8.653(653)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、P3/X63-Ag8.U1(P3U1)、SP2/0-Ag14(Sp2/0、Sp2)、PAI、F0或BW5147、來自大鼠的骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3.、來自人的骨髓瘤U-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11或CEM-T15等。

融合促進劑，可列舉聚乙二醇等，通常是使用20~50%左右的濃度的聚乙二醇(平均分子量1000~4000)，在20~40℃，宜為30~37℃的溫度下，產生抗體的細胞數與骨髓腫瘤細胞數之比通常定為1：1~10：1左右，藉由使其反應約1~10分鐘左右，可實施細胞融合。

產生單株抗體的融合瘤殖株的篩選，可藉由例如在微孔盤中培養融合瘤，藉由ELISA等的免疫化學方法來測定孔的培養上清液對免疫抗原的反應性來進行。

在產生抗體的融合瘤的篩選之中，除了RGMa蛋白質的結合測定之外，還進行了該抗體是否阻礙本發明的RGMa活性的評估。藉由這些篩選方法，可選擇本發明的抗RGMa中和抗體。

由含有產生目標抗體的融合瘤的孔進一步藉由極限稀釋法進行選殖，可得到殖株。融合瘤的挑選、育種，通常是以添加了HAT(次黃嘌呤、胺基蝶呤、胸苷)並含有10~20%牛胎兒血清的動物細胞用培養基來進行。

由融合瘤製造單株抗體，可藉由以體外的方式來培養融合瘤，或以小鼠、大鼠等的哺乳動物的腹水等當中的體內方式使融合瘤增殖所得到的培養上清液，或由哺乳動物的腹水分離來進行。

在以體外方式來培養的情況，可依照所培養的細胞種的特性及培養方法等的各種條件，使用適合於使融合瘤增殖、維持及保存，並且在培養上清液中產生單株抗體的營養培養基。營養培養基可列舉周知的營養培養基或由基本培養基所調製出的營養培養基等。

基本培養基，可列舉例如Ham' F12培養基、MCDB153培養基或低鈣MEM培養基等的低鈣培養基及MCDB104培養基、MEM培養基、D-MEM培養基、RPMI1640培養基、ASF104培養基或RD培養基等的高鈣培養基等，該基本培養基可依照目的含有例如血清、荷爾蒙、細胞介素及/或各種的無機或有機物質等。

單株抗體的分離、純化，可藉由將上述培養上清液或腹水提供於飽和硫酸銨、優球蛋白沉澱法、己酸法、辛酸法、離子交換層析(DEAE或DE52等)、抗免疫球蛋白管柱或蛋白質A管柱等的親和管柱層析等來進行。具體而言，單株抗體的純化只要使用已知作為免疫球蛋白純化法的方法即可，可藉由例如硫酸銨分劃法、PEG分劃法、乙醇分劃法、陰離子交換體的利用，甚至是使用RGMa蛋白質的親和層析等的手段輕易達成。

單株抗體亦可藉由噬菌體展示法來獲得。在噬菌體展示法中，使用目標免疫原，對由任意噬菌體抗體庫挑選出的噬菌體進行篩選，選擇對免疫原具有所希望的結合性的噬菌體。接下來，將噬菌體內所含有的抗體對應序列分離或定序，根據所分離出來的序列或所決定的序列資訊來構築含有編碼抗體或抗原結合結構域的核酸分子的表現載體。然後，藉由培養轉染了該表現載體的細胞株，可產生單株抗體。藉由採用人抗體庫作為噬菌體抗體庫，可產生具有所希望的結合性的人抗體。

＜核酸分子＞編碼本發明的抗RGMa中和抗體或其抗原結合片段的核酸分子，可藉由例如以下的方法來獲得。首先，使用市售的RNA萃取套件，由融合瘤等的細胞調製出全RNA，使用隨機引子等，藉由反轉錄酵素合成出cDNA。接下來，將在已知的人抗體重鏈基因、輕鏈基因的可變區域之中，分別被保存的序列的寡核苷酸使用於引子，藉由PCR法使編碼抗體的cDNA增幅。編碼恆定區域的序列，可藉由將已知的序列以PCR法增幅來獲得。DNA的鹼基序列可殖進定序用質體等，並藉由常法來定序。或者，藉由化學合成出可變區域或其一部分的序列，並結合於含有恆定區域的序列，也可得到編碼本發明的單株抗體的DNA。該核酸分子可編碼重鏈與輕鏈的恆定區域和可變區域全部，或可只編碼重鏈與輕鏈的可變區域。在編碼恆定區域與可變區域全部的情況，重鏈及輕鏈的恆定區域的鹼基序列以Nucleic Acids Research vol. 14, p1779, 1986、The Journal of Biological Chemistry vol. 257, p1516, 1982及Cell vol. 22, p197, 1980所記載的序列為佳。

＜功能改變抗體＞抗RGMa中和抗體的功能改變抗體可藉由如以下所述的方法來調製。例如若使用將α1,6-岩藻糖轉移酵素(FUT8)基因破壞掉的CHO細胞作為宿主細胞來製造本發明抗RGMa中和抗體，則糖鏈的岩藻糖含量會降低，可得到細胞殺傷功能高的抗體，若製造出導入了FUT8基因的CHO細胞作為宿主細胞，則可得到細胞殺傷功能低的抗體(國際公開第2005/035586號、國際公開第2002/31140號、國際公開第00/61739號)。另外，藉由改變Fc區域的胺基酸殘基，可調節補體活化功能(美國專利第6737056號、美國專利第7297775號、美國專利第7317091號)。此外，藉由使用提高了在其中一種Fc受體FcRn的結合能力的Fc區域的變異體，可謀求血中半衰期的延長(橋口周平等，生化學，2010, Vol.82(8), p710)。這些功能改變抗體可用基因工程的方式來製造。藉由使用提高了在其中一種Fc受體FcRn的結合能力的Fc區域的變異體，可謀求血中半衰期的延長(橋口周平等，生化學，2010, Vol.82(8), p710)。這些功能改變抗體可用基因工程的方式來製造。

＜結合抗體＞本發明的抗RGMa中和抗體的改變分子，可列舉結合抗體。結合抗體，可列舉在抗RGMa中和抗體上以化學或基因工程的方式結合了聚乙二醇(PEG)等的非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞介素、成長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophin等)、蛋白素、酵素、其他抗體等的本發明的抗RGMa中和抗體以外的機能分子而成的結合抗體。

在結合PEG作為機能分子的情況，PEG是非限定的，可使用分子量2000至100000Da，較佳為10000至50000Da的PEG，可為直鏈型或分支型PEG。PEG藉由使用例如NHS活性基，可結合於抗RGMa中和抗體的胺基酸的N末端胺基等。

在使用放射性物質作為機能分子的情況，可使用¹³¹ I、¹²⁵ I、⁹⁰ Y、⁶⁴ Cu、⁹⁹ Tc、⁷⁷ Lu或²¹¹ At等。放射性物質可藉由氯胺T法等方法直接結合於抗RGMa中和抗體。

在使用毒素作為機能分子的情況，可使用細菌毒素(例如白喉毒素)、植物毒素(例如離胺酸)、低分子毒素(例如格爾德黴素)、類美登素及卡奇黴素等。

在使用低分子化合物作為機能分子的情況，可列舉道諾黴素、阿黴素、胺甲喋呤、絲裂黴素、新抑癌素、長春地辛及FITC等的螢光色素等。

在使用酵素作為機能分子的情況，可使用螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶；美國專利第4737456號)、蘋果酸脫氫酶、脲酶、過氧化酶(例如辣根過氧化酶(HRPO))、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、醣類氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸酯脫氫酶)、雜環式氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶等)、乳過氧化酶、微過氧化酶等。

將毒素、低分子化合物或酵素化學結合時所使用的連接子，可列舉二價自由基(例如伸烷基、亞芳基、亞雜芳基)、由-(CR₂ )_n O(CR₂ )_n -(R為任意取代基，n為正整數)所表示的連接子或烷氧基的重複單元(例如聚環氧乙烷、PEG、聚甲醛等)及烷基胺基(例如聚乙烯胺基、Jeffamine(商標))，以及二酸酯及醯胺(可列舉琥珀酸酯、琥珀醯胺、二甘醇酸酯、丙二酸酯及己醯胺等)。使機能分子結合的化學修飾方法，在該領域中已經被確立(D.J. King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc；Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol 152:127；Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681)。

＜抗原結合片段＞本發明的實施形態中，抗體的「抗原結合片段」，意指如前述般的抗體之中具有抗原結合性的一部分區域，具體而言可列舉F(ab')₂ 、Fab'、Fab、Fv(variable fragment of antibody)、雙硫鍵Fv、單鏈抗體(scFv)及其聚合物等，此外，抗原結合片段還包含以化學或基因工程的方式結合了聚乙二醇(PEG)等的非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞介素、成長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophin等)、蛋白素、酵素、其他抗體等的本發明的抗RGMa中和抗體以外的機能分子的結合片段。

「F(ab')₂ 」及「Fab」，意指藉由將免疫球蛋白以蛋白質分解酵素的胃蛋白酶或木瓜酵素等作處理所製造出來，存在於鉸鏈區域中的兩條重鏈之間的雙硫鍵的前後被消化掉所產生的抗體片段。例如若將IgG以木瓜酵素處理，則存在於鉸鏈區域中的兩條重鏈之間的雙硫鍵的上游會被切斷，可製造出由VL(輕鏈可變區域)與CL(輕鏈恆定區域)所形成的輕鏈及由VH(重鏈可變區域)與CHγ1(重鏈恆定區域中的γ1區域)所形成的重鏈片段在C末端區域藉由雙硫鍵結合而成的兩個相同的抗體片段。將這兩個相同的抗體片段分別稱為Fab。另外，若將IgG以胃蛋白酶處理，則存在於鉸鏈區域中的兩條重鏈之間的雙硫鍵的下游會被切斷，可製造出比前述兩個Fab以鉸鏈區域連接成的抗體片段還稍大的抗體片段。將此抗體片段稱為F(ab')₂ 。

＜嵌合體抗體＞本發明的抗RGMa中和抗體的合適態樣，可列舉嵌合體抗體。「嵌合體抗體」可例示可變區域為來自非人動物(小鼠、大鼠、倉鼠、雞等)的免疫球蛋白的可變區域，恆定區域為來自人免疫球蛋白的恆定區域之嵌合體抗體。例如可讓小鼠對抗原免疫，由該小鼠單株抗體的基因將與抗原結合的可變區域切出，並與來自人骨髓的抗體恆定區域結合來製作。來自人免疫球蛋白的恆定區域，依照IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD及IgE等的同種型(isotype)，具有各固有的胺基酸序列，在本發明中的重組嵌合體抗體的恆定區域可為屬於任何同種型的人免疫球蛋白的恆定區域。宜為人IgG的恆定區域。使以這種方式所製作出出嵌合體抗體的基因用，可製作出表現載體。藉由以該表現載體將宿主細胞形質轉換，可得到生產嵌合體抗體的形質轉換細胞，藉由培養該形質轉換細胞，可由培養上清液中得到目標嵌合體化抗體。

＜人源化抗體＞本發明的抗RGMa中和抗體的其他合適態樣，可列舉人源化抗體。本發明中的「人源化抗體」，是僅將小鼠等非人動物抗體的抗原結合部位(CDR；互補性決定區域)的DNA序列移殖(CDR嫁接)至人抗體基因而成的抗體。可參考例如日本特表平4-506458號公報及日本特許2912618號說明書等所記載的方法來製作。具體而言，意指一種人源化抗體，特徵是該CDR的一部分或全部為來自非人哺乳動物(小鼠、大鼠、倉鼠等)的單株抗體的CDR，其可變區域的框架區域為來自人免疫球蛋白的可變區域的框架區域，且其恆定區域為來自人免疫球蛋白的恆定區域。

本發明中的人源化抗體可例如如以下所述方式來製造。然而，理所當然地不受這種製造方法限定。

例如來自小鼠單株抗體的重組人源化抗體，可參考日本特表平4-506458號公報及日本特開昭62-296890號公報等，用基因工程的方式來製作。亦即，由產生小鼠單株抗體的融合瘤，將小鼠重鏈CDR部分的DNA與小鼠輕鏈CDR部分的DNA分離出來，並由人免疫球蛋白基因將人重鏈CDR以外所有區域的人重鏈基因與人輕鏈CDR以外所有區域的人輕鏈基因分離出來。

將移殖了所分離出來的小鼠重鏈CDR部分的DNA的人重鏈基因以可表現出來的方式導入適當的表現載體，同樣地，將移殖了小鼠輕鏈CDR部分的DNA的人輕鏈基因以可表現出來的方式導入適當的另一個表現載體。或者，可將移殖了小鼠的CDR的人重鏈及輕鏈基因以可表現出來的方式導入相同的表現載體。藉由使用以這樣的方式所製作出的表現載體來使宿主細胞形質轉換，可得到產生人源化抗體的形質轉換細胞，藉由培養該形質轉換細胞，可由培養上清液中得到目標人源化抗體。

＜人抗體＞本發明的抗RGMa中和抗體的其他合適態樣，可列舉人抗體。人抗體，是指包含構成免疫球蛋白的重鏈可變區域和重鏈恆定區域以及輕鏈可變區域和輕鏈恆定區域的所有區域，是源自編碼人免疫球蛋白的基因的免疫球蛋白的抗體，並且可將人抗體基因導入小鼠來製作。具體而言，例如可藉由將至少人免疫球蛋白基因殖入小鼠等的人以外的哺乳動物的基因座中，並以抗原來使所製作出的基因轉殖動物免疫致敏，與前述多株抗體或單株抗體的製作法同樣地製造。

例如產生人抗體的基因轉殖小鼠，可依據Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994；Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997；日本特表平4-504365號公報；日本特表平7-509137號公報；國際公開WO94/25585號小冊子；Nature, Vol.368, p.856-859, 1994；及日本特表平6-500233號公報等所記載的方法來製作。較具體而言，可列舉HuMab(註冊商標)小鼠(Medarex, Princeton NJ)、KMTM小鼠(Kirin Pharma Company, Japan)、KM(FCγRIIb-KO)小鼠等。

本發明的抗RGMa中和抗體，具體而言，可列舉在重鏈可變區域具有含有特定胺基酸序列的CDR，輕鏈可變區域具有含有特定胺基酸序列的CDR者(宜為上述(a)~(l)之抗RGMa中和抗體)。此外，只要能夠維持本發明的抗體的特性，如具有RGMa的結合能力、阻礙(中和)RGMa活性，在此前提之下抗RGMa中和抗體(宜為上述(a)~(l)之抗RGMa中和抗體)的胺基酸序列之中，亦可發生一個或數個胺基酸(1~20個、1~10個或1~5個，宜為1至2個)的取代、缺損、附加或插入。這種取代、缺損、附加可導入CDR，然而以導入CDR以外的區域為佳。另外，該胺基酸取代，為了維持本發明的特性以保留型取代為佳。

在胺基酸序列之中，包含取代、缺損等的本發明的抗RGMa中和抗體(宜為上述(a)~(l)之抗RGMa中和抗體)的胺基酸序列，例如為胺基酸序列改變後的重鏈可變區域與改變前的胺基酸序列具有90%以上(較佳為95%、96%、97%、98%、99%以上)的一致性百分比的胺基酸序列，胺基酸序列改變後的輕鏈可變區域與改變前的胺基酸序列具有90%以上(較佳為95%、96%、97%、98%、99%以上)的一致性百分比的胺基酸序列。

在本發明中，siRNA是指可抑制標的基因(在本發明中為RGMa基因)的表現的兩條短RNA鏈。只要能作為本發明中阻礙RGMa活性的siRNA來發揮功能，則鹼基序列或長度(鹼基長)並未受到特別限定，宜為未達約30個鹼基，較佳為約19~27個鹼基，更佳為約21~25個鹼基。在本發明中，shRNA是指一條RNA鏈的一部分含有迴文狀鹼基序列，在分子內形成雙鏈構造，由3'末端具有突出部的短髮夾構造所形成的約有20個以上的鹼基對的分子。這種shRNA，在被導入細胞內之後，在細胞內會被分解成約20個鹼基的長度(代表性來說，例如21個鹼基、22個鹼基、23個鹼基)，與siRNA同樣地可抑制標的基因的表現。在本發明中，上述siRNA及shRNA只要可抑制RGMa基因的表現，則任何形態皆可。

在本發明中，siRNA或shRNA可用人工的方式化學合成。另外，例如使用T7RNA聚合酶及T7啟動子，可在體外由鑄型DNA合成出反義及正義的RNA。反義寡核苷酸只要是與RGMa基因的DNA序列中連續5至100個鹼基序列互補或雜交的核苷酸即可，可為DNA或RNA之任一者。另外，只要沒有對功能造成障礙，可經過修飾。反義寡核苷酸可藉由常法來合成，例如可藉由市售的DNA合成裝置輕易地合成。合適的序列可使用通常的選擇方法來選擇，本發明中的siRNA或shRNA，可藉由評估功能性RGMa的表現阻礙來確認。

＜糖尿病性失智症＞本發明中的糖尿病性失智症，是指因為糖代謝異常所引起的失智症，典型來說，可列舉伴隨糖尿病而發生的失智症。其發病機制，被推測除了腦梗塞或動脈硬化等的血管原因之外，還和糖毒性或氧化壓力、由AGE(advanced glycation end-product)等所造成的加齡變化的促進，甚至高胰島素血症、胰島素抵抗性、胰島素訊號傳達的障礙有關連(Lancet Neurol, 5:64-74, 2006)。糖尿病性失智症在臨床上顯示或暗示和糖代謝異常有密切關連，相對於此，沒有觀察到阿滋海默症的病理變化或血管性病變，或較輕微的失智症。另外，這種糖尿病性失智症也包括糖代謝障礙(包含高血糖等)造成的神經障礙所關連的失智症。本發明中的糖尿病性失智症，也包括還不到失智症的輕度認知功能障礙的糖尿病性認知功能障礙。

＜血管性失智症＞本發明中的血管性失智症，意指起因於腦血管障礙的失智症，腦血管障礙與失智症之間存在著因果關係。血管性失智症的原因，除了腦梗塞、腦出血、蜘蛛膜下出血之外，還包括腦循環不全、低灌流、白質病變等的病型。本發明中的血管性失智症，也包括還不到失智症的輕度認知功能障礙的血管性認知功能障礙。另外還可依據血管性失智症相關的診斷基準來特別指定本發明的血管性失智症(非專利文獻8)。本發明中的治療對象(宜為哺乳動物，尤其是人)是以糖尿病性失智症或血管性失智症發病的患者為對象，可將本發明的選自糖尿病性失智症及血管性失智症的失智症之預防或治療劑投予至這些患者。

此處，「治療」包含治療對象，宜為哺乳動物，尤其是人的疾病的任意治療，並且包含阻止疾病及症狀發展，消滅、治癒、減輕或緩和這樣的疾病及症狀。

另外，「預防」包含防止或抑制上述疾病在治療對象，宜為哺乳動物，尤其是人的發病。此外，本發明中的「預防」包括讓治療對象，宜為哺乳動物，尤其是人，防止上述疾病反覆地緩解和復發的「預防復發」。

＜醫藥組成物＞本發明中的選自糖尿病性失智症及血管性失智症的失智症之預防或治療劑，通常可在全身或局部，以口服或非口服的形式來投予。本發明中的選自糖尿病性失智症及血管性失智症的失智症之預防或治療劑，是以RGMa阻礙物質作為有效成分，可適當地摻合藥學所容許的擔體或添加劑來製劑化。可將以這樣的方式製劑化的成的醫藥組成物以口服或非口服的形式來投予。具體而言，可製成錠劑、被覆錠劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、液劑、懸浮劑、乳劑等的口服劑，另外還可製成注射劑、輸液、栓劑、軟膏、貼劑等的非口服劑。關於擔體或添加劑的摻合比例，只要根據在醫藥品領域通常可採用的範圍適當地設定即可。可摻合的擔體或添加劑並未受到特別限制，可列舉例如水、生理食鹽水、其他水性溶劑、水性或油性基劑等的各種擔體，例如賦形劑、結合劑、pH調整劑、崩壞劑、吸收促進劑、潤滑劑、著色劑、矯味劑、香料等的各種添加劑。

在RGMa阻礙物質為抗RGMa中和抗體、其功能改變抗體、其結合抗體或這些抗原結合片段的情況，以與藥學所容許的擔體一起製劑化成為注射劑或輸液的形式，由非口服投予路徑，例如靜脈內、肌肉內、皮膚內、腹腔內、皮下或局部來投予為佳。例如含有抗RGMa中和抗體的注射劑或輸液，能夠以溶液、懸浮液或乳濁液的形式來使用。其溶劑可使用例如注射用蒸餾水、生理食鹽水、葡萄糖浴液及等張液(例如氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇、山梨醇、硼酸、硼砂、丙二醇等的溶液)等。此外，這種含有抗RGMa中和抗體的注射劑或輸液，還可含有安定劑、溶解助劑、懸浮化劑、乳化劑、止痛劑、緩衝劑、保存劑、防腐劑、pH調整劑等。安定劑可使用例如蛋白素、球蛋白、明膠、甘露醇、葡萄糖、聚葡萄糖、乙二醇、丙二醇、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、EDTA鈉、檸檬酸鈉、二丁基羥基甲苯等。溶解輔助劑，可使用例如醇(例如乙醇等)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑例如Polysorbate 80(註冊商標)、HCO-50等)等。懸浮化劑，可使用例如單硬脂酸甘油、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、月桂基硫酸鈉等。乳化劑可使用例如阿拉伯膠、海藻酸鈉、黃蓍膠等。止痛劑可使用例如苄醇、氯丁醇、山梨醇等。緩衝劑可使用例如磷酸緩衝液、醋酸緩衝液、硼酸緩衝液、碳酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、TRIS緩衝液等。保存劑可使用例如對羥基安息香酸甲酯、對羥基安息香酸乙酯、對羥基安息香酸丙酯、對羥基安息香酸丁酯、氯丁醇、苄醇、苯扎氯銨、脫水醋酸鈉、依地酸鈉、硼酸、硼砂等。防腐劑可使用例如苯扎氯銨、對羥基安息香酸、氯丁醇等。 pH調整劑可使用例如鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、醋酸等。

在RGMa阻礙物質為核酸(siRNA、shRNA、反義寡核苷酸等)的情況，能夠以非病毒載體或病毒載體的形態來投予。在非病毒載體形態的情況，可利用使用核糖體來導入核酸分子的方法(核糖體法、HVJ-核糖體法、陽離子微脂體法、脂質體轉染法、Lipofectamine法等)、顯微注射法、藉由基因槍(Gene Gun)將核酸分子與載體(金屬粒子)一起移入細胞的方法等。例如在使用病毒載體將siRNA或shRNA投予至生物體的情況，可利用重組腺病毒、反轉錄病毒等的病毒載體。藉由在無毒化的反轉錄病毒、腺病毒、腺關連性病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、小兒麻痺病毒、辛德畢斯病毒、仙台病毒、SV40等的DNA病毒或RNA病毒中導入表現siRNA或shRNA的DNA，並使細胞或組織感染該重組病毒，可在細胞或組織內導入基因。

以這樣的方式得到的製劑，藉由例如對人或其他哺乳動物(例如大鼠、小鼠、兔子、綿羊、豬、牛、貓、狗、猴子等)投予其有效量，可預防或治療選自糖尿病性失智症及血管性失智症的失智症。投予量可考慮目的、疾病的嚴重度、患者的年齡、體重、性別、病歴、有效成分的種類等適當地設定。例如在有效成分為抗RGMa中和抗體，對象為體重約65~70kg的一般人的情況，以每天0.02mg~4000mg左右為佳，0.1mg~200mg左右為較佳。每天的總投予量可為單一投予量或分割投予量。

＜其他藥劑或治療的併用＞在本發明中，選自糖尿病性失智症及血管性失智症的失智症之預防或治療劑，可藉由與抗糖尿病藥併用的方式來投予。所併用的抗糖尿病藥之治療劑，可列舉例如胰島素抵抗性改善藥等。在本發明中，選自糖尿病性失智症及血管性失智症的失智症之預防或治療劑，可藉由與抗血栓療法或降壓劑併用的方式來投予。所併用的降壓劑，可列舉例如血管收縮素II受體拮抗藥(坎地沙坦等)、ACE阻礙藥(培哚普利等)等。

上述其他藥劑或治療，可在本發明的選自糖尿病性失智症及血管性失智症的失智症之預防或治療劑投予前或投予後投予或實施，此外還可同時投予或實施。 [實施例]

以下列舉實施例對本發明更具體地作說明，然而本發明不受其限定。此外在各實施例中，抗RGMa中和抗體是使用含有本說明書所記載的(a)的胺基酸序列(SEQ ID NO:5~10)的抗RGMa中和抗體。

[實施例1] 使用藥劑誘導性1型糖尿病模式小鼠，藉由新奇事物辨識測試來檢討抗RGMa中和抗體對認知功能障礙的治療效果。

＜糖尿病的誘導＞將7~8週齡的C57BL/6J雌性小鼠使用於實驗。對糖尿病誘導群，以10ml/kg的用量在腹腔內單次投予鏈脲佐菌素(STZ:Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, MO, USA) 20mg/ml，對非糖尿病誘導群以10ml/kg的用量來投予溶劑。參考前人研究(參考文獻1、2)，在糖尿病誘導1週後進行血糖值測定，排除血糖值未達300mg/dl的個體。

＜分群，抗體投予排程＞將購買到的小鼠分成「糖尿病-抗RGMa中和抗體投予群」或「糖尿病-同種型控制抗體(Palivizumab)投予群」兩群，兩群皆從糖尿病誘導3天後開始投予抗體。任一抗體皆在調整成6mg/ml的濃度之後，以30mg/kg的用量投予至尾靜脈內，各週1次，合計4次。「糖尿病-抗RGMa中和抗體投予群」為14隻、「糖尿病-同種型控制抗體(Palivizumab)投予群」為15隻，使用於物體辨識測試。將滿足物體辨識測試基準的「糖尿病-抗RGMa中和抗體投予群」10隻、「糖尿病-同種型控制抗體(Palivizumab)投予群」8隻使用於解析。另外，非糖尿病小鼠(健康小鼠)的DI值的計算使用了7隻。

＜新奇事物辨識記憶測試＞進行暖身(控管)3天，翌日讓各個體進入開放場地，使其自由探索15分鐘以進行場地的馴化(熟悉試驗1)。翌日進行記憶獲取試驗。在進行記憶獲取試驗之前，對各個體實施5分鐘的場地自由探索(熟悉試驗2)。實施熟悉試驗2之後，暫時讓各個體返回居住籠，將使用方塊所製作出的具有相同的形狀的物體(物體A)設置於場地的對角線上左上及右下兩處之後，讓各個體返回場地，使其自由探索(記憶獲取試驗)。記憶獲取試驗結束之後，隔12小時的記憶保存時距(retention interval)(由事先進行的條件檢討來決定)，實施測試試驗。在測試試驗時，配置裝入不透明珠子的瓶子(物體B)作為新奇事物來代替配置於場地的對角線上右下的物體A。另一方面，場地對角線上左上的物體A是和記憶獲取試驗同樣地配置。在測試試驗中，讓各個體返回配置了上述物體A及B的場地，使其自由探索10分鐘。此外，物體A及物體B是根據前人研究來製作(參考文獻3)。將所有的試驗以攝影機錄影，行動測試結束後分別計算出各試驗中各個體對兩個物體的探索時間。探索行動包含對各物體聞味道的行動及觸碰物體的行動，攀爬物體的行動除外。解析是使用參考前人研究所計算的測試試驗的Discrimination Index(DI)(參考文獻4)。DI定義為{(對物體B的探索時間)-(對物體A的探索時間)}/{(對物體B的探索時間)+(對物體A的探索時間)}。在測試試驗中對物體A及B的探索時間的合計未達30秒的個體並未使用於解析。此外，作為基準的健康小鼠的DI是以16週齡的非糖尿病小鼠實施本行動測試來計算。

＜結果＞將糖尿病病狀發病後經過4週的時間點分別由抗RGMa中和抗體投予群、同種型控制抗體投予群得到的DI值及健康小鼠的DI值表示於圖1。「糖尿病-同種型控制抗體投予群」，與健康小鼠相比，觀察到顯著的DI降低(p＜0.05，Tukey's multiple comparisons test)。另一方面，「糖尿病-抗RGMa中和抗體投予群」，與「糖尿病-同種型控制抗體投予群」相比，觀察到顯著的DI值上昇(p＜0.05，Tukey's multiple comparisons test)，與健康小鼠的比較中並未觀察到差異(p=0.8640，Tukey's multiple comparisons test)。由此結果可知，藉由投予抗RGMa中和抗體，可改善因為糖尿病而發生障礙的物體記憶障礙。以上的結果判明了，RGMa阻礙物質，尤其是抗RGMa中和抗體，會表現出對糖尿病性失智症的藥效。

[實施例2] 在糖尿病的動物模式中，海馬迴依存性認知功能障礙的原因，有文獻指出是海馬迴中的神經新生障礙(參考文獻6)。使用藥劑誘導性1型糖尿病模式小鼠，藉由免疫組織化學染色法來檢討抗RGMa中和抗體對由糖尿病所引起的海馬迴齒狀回神經新生的抑制的治療效果。

＜糖尿病的誘導＞將7~8週齡的(C57BL/6J雌性小鼠使用於實驗。對糖尿病誘導群以10ml/kg的用量在腹腔內單次投予鏈脲佐菌素(STZ:Sigma-Aldrich Co. LL.C, St, Louis, MO, USA) 20mg/ml，對非糖尿病誘導群以10ml/kg的用量投予溶劑。參考前人研究(參考文獻1、2)，糖尿病誘導1週後進行血糖值測定，排除血糖值未達300mg/dl的個體。

＜抗體投予＞將購買到的小鼠分成「非糖尿病-抗RGMa中和抗體投予群」、「非糖尿病-同種型控制抗體(Palivizumab)投予群」、「糖尿病-抗RGMa中和抗體投予群」及「糖尿病-同種型控制抗體(Palivizumab)投予群」這4群，對糖尿病群投予STZ溶液，並對非糖尿病誘導群，3天後開始投予抗RGMa中和抗體或同種型控制抗體。任一抗體皆調整成6mg/ml的濃度之後，以30mg/kg的用量投予至尾靜脈內，各週1次，合計6次。

＜組織採樣･免疫組織化學染色＞在糖尿病誘導6週後實施小鼠腦的採樣。充分麻醉之後，利用4%多聚甲醛(PFA)進行灌流固定，然後將腦摘出，在4%PFA中進行後固定。接下來將組織移至以PBS作為溶劑的30%蔗糖溶液中，在4℃下靜置2天至3天後，使用OCT compound(Sakura Finetek USA Inc., Torrance, CA, USA)來包埋。使用冷凍切片機，以厚度30μm將腦薄切，將所製作出的切片貼附於MAS塗層載玻片以供免疫染色。藉由含有3%Nomal Donkey Serum(NDS)、0.3%Triton X-100的PBS(阻斷溶液)在常溫下阻斷1小時，PBS洗淨之後，使用抗小鼠doublecortin抗體(1：100；abcam, Cambridge, UK，以阻斷溶液稀釋)作為一次抗體，在4℃下使其反應一晩。以PBST洗淨後，使用Alexa Fluor 568 donkey抗rabbit IgG(H+L)抗體(1：500；Invitrogen, Waltham, MA, USA，以阻斷溶液稀釋)作為二次抗體，在室溫下使其反應1小時。以PBST洗淨後，使用DAPI(1μg/ml)進行核染色，然後密封。使用共焦雷射顯微鏡FV3000(Olympus, Tokyo, Japan)，拍攝海馬迴齒狀回全體，並測量doublecortin陽性神經前驅細胞的細胞體數。各個體各製作6個切片，進行海馬迴齒狀回的測量。doublecortin陽性細胞數是使用Image J，以所測得的海馬迴齒狀回的面積來標準化。

＜結果＞將以海馬迴齒狀回面積標準化的doublecortin陽性細胞數表示於圖2。非糖尿病誘導群之間，無關於所投予的抗體種類，doublecortin陽性細胞數沒有變化(p＞0.9999，Tukey's multiple comparisons test)。另外，「糖尿病-同種型控制抗體投予群」，與「非糖尿病-抗RGMa中和抗體投予群」及「非糖尿病-同種型控制抗體投予群」相比，doublecortin陽性細胞數顯著減少(vs「非糖尿病-同種型控制抗體投予群」；p＜0.001，Tukey's multiple comparisons test，vs「非糖尿病-抗RGMa中和抗體投予群」；p＜0.001，Tukey's multiple comparisons test)。另一方面，「糖尿病-抗RGMa中和抗體投予群」，與「糖尿病-同種型控制抗體投予群」相比，doublecortin陽性細胞數顯著改善(p＜0.05，Tukey's multiple comparisons test)。「糖尿病-抗RGMa中和抗體投予群」，與「非糖尿病-同種型控制抗體投予群」及「非糖尿病-抗RGMa中和抗體投予群」相比，doublecortin陽性細胞數並未觀察到顯著的差異(vs非糖尿病-同種型控制抗體投予群；p=0.1071，Tukey's multiple comparisons test，vs非糖尿病-抗RGMa中和抗體投予群；p=0.1130，Tukey's multiple comparisons test)。由這些結果可知，藉由投予抗RGMa中和抗體，可改善起因於糖尿病所發生的海馬迴齒狀回中的doublecortin陽性神經前驅細胞的神經新生減少。由以上的結果判明了，RGMa阻礙物質，尤其是抗RGMa中和抗體，會表現出對其中一個糖尿病性失智症原因的海馬迴神經新生障礙的藥效。

[實施例3]使用抗RGMa中和抗體的治療介入對新奇事物辨識記憶的影響藉由新奇事物辨識測試來檢討抗RGMa中和抗體對藉由在兩側內頸動脈留置微線圈所誘導出的慢性腦低灌流模式小鼠(Bilateral conmon carotid artery stenosis model：BCAS model)的認知功能障礙的治療效果。

＜慢性腦低灌流模式的誘導＞將9週齡至10週齡的C57BL/6J雄性小鼠使用於實驗。在Isoflurane吸入麻醉(導入4%，維持1.5%)之下，以伏臥位將小鼠固定，以Laser speckle flowmetry來測量腦血流。測量中使用heatpad將直腸溫控管在35.0~36.5℃。然後以仰臥位來固定，將頸部切開，將頸動脈鞘(Carotid sheath)打開後，將微線圈留置於兩側內頸動脈(參考文獻5)。BCAS誘導1天後進行腦血流測定，排除腦血流與手術前相比並未降低至90%以下的個體。腦血流的測定使用了OZ-3(Omegawave, Tokyo, Japan)。

＜新奇事物辨識記憶測試＞讓各個體進入開放場地，使其自由探索15分鐘，進行對場地的馴化(熟悉試驗1)。翌日，在進行記憶獲取試驗之前，先對各個體實施5分鐘的場地自由探索(熟悉試驗2)。實施熟悉試驗2之後，暫時讓各個體返回居住籠，使用雙面膠帶在場地的對角線上左上及右下兩處離壁10cm的距離設置使用方塊所製作出的具有相同形狀的物體(物體A)，然後讓各個體返回場地，使其自由探索(記憶獲取試驗)。記憶獲取試驗結束之後，隔12小時的記憶保存時距，實施測試試驗。在測試試驗中，使用雙面膠帶在離壁10cm的位置配置裝入不透明珠子的瓶子(物體B)作為新奇事物來代替配置於場地的對角線上右下的物體A。另一方面，場地對角線上左上的物體A是和記憶獲取試驗同樣地配置。經過保存時距後，使各個體返回配置了上述物體A及B的場地，使其自由探索10分鐘(測試試驗)。使用於各試驗的物體A及物體B是根據前人研究來製作(參考文獻3)。在保存時距之中，各個體在居住籠中水、飼料皆自由攝取。將全部的試驗以攝影機錄影，行動測試結束後，計算各試驗之中的各個體對物體的探索時間。探索行動包括對各物體聞味道的行動及觸碰物體的行動，攀爬物體的行動除外。解析是使用測試試驗的Discrimination Index(DI)。DI定義為{(對物體B的探索時間)-(對物體A的探索時間)}/{(對物體B的探索時間)+(對物體A的探索時間)}。測試試驗中，對物體A及B的探索時間的合計未達30秒的個體並未使用於解析。

＜抗體投予＞將購買到的小鼠分成BCAS-抗RGMa中和抗體投予群、BCAS-同種型控制抗體(Palivizumab)投予群、Sham-同種型控制抗體(Palivizumab)投予群這3群，3群皆從BCAS手術或Sham手術3天後開始投予抗體。任一抗體皆調整成2mg/ml的濃度之後，依照體重，以10mg/kg的用量投予至腹腔內，各週2次、合計7次。各群的隻數如以下所述。 BCAS-抗RGMa中和抗體投予群13隻 BCAS-同種型控制抗體(Palivizumab)投予群9隻 Sham-同種型控制抗體(Palivizumab)投予群9隻

＜結果＞ BCAS-同種型控制抗體群，與Sham-同種型控制抗體(Palivizumab)投予群相比，觀察到顯著的DI降低(p＜0.001，Tukey's multiple comparisons test)。另一方面，BCAS-抗RGMa中和抗體投予群，與BCAS-同種型控制抗體群相比，DI顯著上昇(p＜0.001，Tukey's multiple comparisons test)。由此可知，利用抗RGMa中和抗體投予的治療介入，顯著改善了因為慢性缺血而發生障礙的物體辨識記憶障礙。(圖3) 由以上的結果，判明了RGMa阻礙物質，尤其抗RGMa中和抗體，會表現出對血管性失智症的藥效。

[參考文獻] 1. Deeds MC, Anderson JM, Armstrong AS, et al. Single dose streptozotocin-induced diabetes: Considerations for study design in islet transplantation models. Lab Anim 2011;45(3):131-140. doi:10.1258/la.2010.010090 2.O'brien PD, Sakowski SA, Feldman EL. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 2014;54(3):259-272. doi:10.1093/ilar/ilt052 3.Leger M, Quiedeville A, Bouet V, et al. Object recognition test in mice. Nat Protoc. 2013;8(12):2531-2537. doi:10.1038/nprot. 2013.155 4.Grinan-Ferre C, Puigoriol-Illamola D, Palomera-avalos V, et al. Environmental enrichment modified epigenetic mechanisms in SAMP8 mouse hippocampus by reducing oxidative stress and inflammaging and achieving neuroprotection. Front Aging Neurosci. 2016;8(OCT). doi:10.3389/fnagi.2016.00241 5.Hattori Y et al, Gradual Carotid Artery Stenosis in Mice Closely Replicates Hypoperfusive Vascular Dementia in Humans. Journal of the American Heart Association 2016 2 Feb.22;5(2): e002757. DOI:10.1161/JAHA.115.002757 6.Stranahan, A., Arumugam, T., Cutler, R. et al. Diabetes impairs hippocampal function through glucocorticoid-mediated effects on new and mature neurons. Nat Neurosci 11, 309-317(2008). https://doi.org/10.1038/nn2055

＜序列表的說明＞ SEQ ID NO:1：人RGMa前驅蛋白質的胺基酸序列 SEQ ID NO:2：小鼠RGMa前驅蛋白質的胺基酸序列 SEQ ID NO:3：大鼠RGMa前驅蛋白質的胺基酸序列 SEQ ID NO:4：人RGMa基因的DNA序列 SEQ ID NO:5：抗RGMa中和抗體r116A3之LCDR1的胺基酸序列 SEQ ID NO:6：抗RGMa中和抗體r116A3之LCDR2的胺基酸序列 SEQ ID NO:7：抗RGMa中和抗體r116A3之LCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:8：抗RGMa中和抗體r116A3之HCDR1的胺基酸序列 SEQ ID NO:9：抗RGMa中和抗體r116A3之HCDR2的胺基酸序列 SEQ ID NO:10：抗RGMa中和抗體r116A3之HCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:11：抗RGMa中和抗體r70E之LCDR1的胺基酸序列 SEQ ID NO:12：抗RGMa中和抗體r70E之LCDR2的胺基酸序列 SEQ ID NO:13：抗RGMa中和抗體r70E之LCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:14：抗RGMa中和抗體r70E之HCDR1的胺基酸序列 SEQ ID NO:15：抗RGMa中和抗體r70E之HCDR2的胺基酸序列 SEQ ID NO:16：人RGMa的表位的胺基酸序列 SEQ ID NO:17：抗RGMa中和抗體5F9之LCDR1的胺基酸序列 SEQ ID NO:18：抗RGMa中和抗體5F9之LCDR2的胺基酸序列 SEQ ID NO:19：抗RGMa中和抗體5F9之LCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:20；抗RGMa中和抗體5F9之HCDR1的胺基酸序列 SEQ ID NO:21：抗RGMa中和抗體5F9之HCDR2的胺基酸序列 SEQ ID NO:22：抗RGMa中和抗體5F9之HCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:23：抗RGMa中和抗體8D1之LCDR1的胺基酸序列 SEQ ID NO:24：抗RGMa中和抗體8D1之LCDR2的胺基酸序列 SEQ ID NO:25：抗RGMa中和抗體8D1之LCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:26：抗RGMa中和抗體8D1之HCDR1的胺基酸序列 SEQ ID NO:27：抗RGMa中和抗體8D1之HCDR2的胺基酸序列 SEQ ID NO:28：抗RGMa中和抗體8D1之HCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:29：抗RGMa中和抗體AE12-1之LCDR1的胺基酸序列 SEQ ID NO:30：抗RGMa中和抗體AE12-1之LCDR2的胺基酸序列 SEQ ID NO:31：抗RGMa中和抗體AE12-1之LCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:32：抗RGMa中和抗體AE12-1之HCDR1的胺基酸序列 SEQ ID NO:33：抗RGMa中和抗體AE12-1之HCDR2的胺基酸序列 SEQ ID NO:34；抗RGMa中和抗體AE12-1之HCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:35：抗RGMa中和抗體AE12-1Y之LCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:36：人RGMa的表位的胺基酸序列 SEQ ID NO:37：人RGMa的表位的胺基酸序列 SEQ ID NO:38：人RGMa的表位的胺基酸序列 SEQ ID NO:39：人RGMa的表位的胺基酸序列 SEQ ID NO:40：抗RGMa中和抗體AE12-1F之LCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:41：抗RGMa中和抗體AE12-1H之LCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:42：抗RGMa中和抗體AE12-1L之LCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:43：抗RGMa中和抗體AE12-1V之LCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:44：抗RGMa中和抗體AE12-1I之LCDR3的胺基酸序列 SEQ ID NO:45：抗RGMa中和抗體AE12-1K之LCDR3的胺基酸序列 [產業上的可利用性]

本發明中，RGMa阻礙物質對於糖尿病性失智症或血管性失智症之預防或治療是有用的，因此在醫藥品產業之中具有高利用價值。

[圖1]為表示糖尿病(DM)病狀發病後經過4週的時間點分別由抗RGMa中和抗體(會有簡記為抗RGMa抗體的情形)投予群、同種型控制抗體投予群得到的Discrimination Index(DI)值及健康小鼠的DI值之圖。 [圖2]為表示對非糖尿病(non-DM)小鼠或糖尿病(DM)小鼠投予抗RGMa中和抗體或同種型控制抗體時的doublecortin陽性細胞數之圖。doublecortin陽性細胞數是以海馬迴齒狀回面積來標準化。 [圖3]為表示在慢性腦低灌流模式下分別由抗RGMa中和抗體投予群、同種型控制抗體投予群得到的Discrimination Index(DI)值及由Sham小鼠的同種型控制抗體投予群得到的DI值之圖。

Claims

一種RGMa阻礙物質在製造失智症之預防劑或治療劑之用途，其中該失智症係選自糖尿病性失智症及血管性失智症。
一種RGMa阻礙物質在製造糖尿病性失智症之預防劑或治療劑之用途。
一種RGMa阻礙物質在製造血管性失智症之預防劑或治療劑之用途。
如請求項1之用途，其中RGMa阻礙物質為抗RGMa中和抗體。
如請求項4之用途，其中抗RGMa中和抗體為人源化抗體。
如請求項4之用途，其中抗RGMa中和抗體為辨識選自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:39的胺基酸序列的抗體。
如請求項4~6中任一項之用途，其中抗RGMa中和抗體為選自下述(a)~(l)的抗體： (a)含有包含含有SEQ ID NO:5所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:6所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:7所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:8所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:9所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:10所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (b)含有包含含有SEQ ID NO:11所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:12所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:13所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:14所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:15所記載的胺基酸序列的HCDR2及胺基酸序列中含有SFG的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (c)含有包含含有SEQ ID NO:17所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:18所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:19所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:20所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:21所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:22所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (d)含有包含含有SEQ ID NO:23所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:24所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:25所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:26所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:27所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:28所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (e)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:31所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (f)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:35所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (g)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:40所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (h)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:41所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (i)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:42所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (j)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:43所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體、 (k)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:44所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體及 (l)含有包含含有SEQ ID NO:29所記載的胺基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:30所記載的胺基酸序列的LCDR2及含有SEQ ID NO:45所記載的胺基酸序列的LCDR3之輕鏈可變區域，以及包含含有SEQ ID NO:32所記載的胺基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:33所記載的胺基酸序列的HCDR2及含有SEQ ID NO:34所記載的胺基酸序列的HCDR3之重鏈可變區域之抗RGMa中和抗體。