EA037065B1 - Гетеродимерные антитела, связывающие cd3 и cd38 - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к гетеродимерным антителам, которые связывают CD3 и CD38.

Description

(54) ГЕТЕРОДИМЕРНЫЕ АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕ CD3 И CD38 (31) 62/085,106; 62/250,971 (32) 2014.11.26; 2015.11.04 (33) US (43) 2017.12.29 (86) PCT/US2015/062786 (87) WO 2016/086196 2016.06.02 (71)(73) Заявитель и патентовладелец:

КСЕНКОР, ИНК. (US) (72) Изобретатель:

Мур Грегори, Дежарле Джон, Бернетт Мэттью, Чу Сеунг, Рашид Румана, Му чхал Умеш (US) (74) Представитель:

Медведев В.Н. (RU) (56) US-A1-2014294833

WO-A1-2014110601

US-A1-2014302064

BORTOLETTO NICOLA ET AL.: Optimizing anti-CD3 affinity for effective T cell targeting against tumor cells, EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, WILEY - VCH VERLAG GMBH & CO. KGAA, DE, vol. 32, no. 11, 1 November 2002 (2002-11-01), pages 3102-3107, XP002436763, ISSN: 0014-2980, DOL 10. 1002/1521-4141 (2002 11)32:11 <3 102 :: AI D-I MMU3 102>3.0. CO; 2-C, page 3105

WO-A1-2015149077

Gregory Moore: Tuning T Cell Affinity Improves Efficacy and Safety of Anti-CD38 x AntiCD3 Bispecific Antibodies in Monkeys - a Potential Therapy for Multiple Myeloma, 5 December 2015 (2015-12-05), XP055258267, Retrieved from the Internet: URL: https://a.sh.confex.com/ash/2015/web program/Paper78382.html [retrieved on 2016-03-15] the whole document

037065 В1 (57) Изобретение относится к гетеродимерным антителам, которые связывают CD3 и CD38.

037065 Bl

Перекрестные ссылки на родственные заявки

В настоящей заявке заявляется приоритет согласно статье 35 Свода федеральных законов США 119(e) по предварительной заявке на патент США № 62/085106, поданной 26 ноября 2014 г., и по предварительной заявке на патент США 62/250971, поданной 4 ноября 2015 г., полное содержание которых явно включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме, с отдельными ссылками на чертежи, условные обозначения и формулы, приведенные в них.

Уровень техники

Лекарственные средства на основе антител успешно применяются для лечения различных заболеваний, включая рак и аутоиммунные/воспалительные нарушения. Тем не менее, данный класс лекарственных веществ все же требует усовершенствований, в частности это касается повышения клинической эффективности. Один из основных исследуемых подходов заключается в конструировании дополнительных и новых антигенсвязывающих сайтов в лекарственных веществах на основе антител, так чтобы одна иммуноглобулиновая молекула одновременно захватывает два разных антигена. Такие ненативные или альтернативные формы антител, которые захватывают два разных антигена, часто называются биспецифическими. Поскольку значительное разнообразие вариабельного участка антител (Fv) дает возможность получать Fv, который распознает практически любую молекулу, типичным подходом для получения биспецифических антител является введение в антитело новых вариабельных участков.

Был исследован ряд альтернативных форм антител на биспецифический таргетинг (Chames & Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9; Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136; Kontermann, MAbs 4(2):182 (2012), все явным образом полностью включены в данный документ посредством ссылки). Первоначально биспецифические антитела получали слиянием двух клеточных линий, каждая из которых продуцировала одно моноклональное антитело (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-540). Хотя полученная гибридная гибридома или квадрома действительно продуцировала биспецифические антитела, они получались только в незначительной популяции и требовалась длительная очистка для выделения требуемого антитела. Техническим решением этой проблемы было применение фрагментов антител для получения биспецифических антител. Поскольку у таких фрагментов отсутствует сложная четвертичная структура полноразмерного антитела, вариабельные легкие и тяжелые цепи можно соединять в одних генетических конструкциях. Было получено множество различных форм фрагментов антител, включая диатела, одноцепочечные диатела, тандемные scFv и Fab₂-биспeцифичeскиe антитела (Chames & Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9; Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136; явным образом включены в данный документ посредством ссылки). Поскольку эти формы могут с высокими уровнями экспрессироваться в бактериях и благодаря малому размеру могут обладать преимуществами, обусловленными удобной проникающей способностью, то они быстро выводятся in vivo и могут представлять сложности для производства, связанные с их продукцией и стабильностью. Основная причина этих недостатков заключается в том, что у фрагментов антител обычно отсутствует константный участок антитела со связанными с ним функциональными свойствами, включающими больший размер, высокую стабильность и связывание с различными рецепторами и лигандами Fc, которые обеспечивают длительный период полувыведения из сыворотки (т.е. неонатальный Fc-рецептор FcRn) или служат в качестве сайтов связывания для очистки (т.е. для белка А и белка G).

В более поздней работе предпринята попытка, направленная на преодоление недостатков биспецифических антител на основе фрагментов путем конструирования двойного связывания в формах, подобных полноразмерному антителу (Wu et al., 2007, Nature Biotechnology 25[11]:1290-1297; USSN12/477711; Michaelson et al., 2009, mAbs 1 [2]:128-141; PCT/US2008/074693; Zuo et al., 2000, Protein Engineering 13 [5]:361-367; USSN09/865198; Shen et al., 2006, J Biol Chem 281 [16]: 10706-10714; Lu et al., 2005, J Biol Chem 280 [20]:19665-19672; PCT/US2005/025472, явным образом включены в данный документ посредством ссылки). Этими формами преодолеваются некоторые затруднения, присущие биспецифическим антителам на основе фрагментов антител, главным образом потому, что они содержат Fc-участок. Один существенный недостаток этих форм заключается в том, что они создают новые антигенсвязывающие сайты наверху гомодимерных константных цепей, и связывание с новым антигеном всегда является бивалентным.

Для многих антигенов, которые являются перспективными в качестве сопутствующих мишеней в терапевтической биспецифической форме, скорее требуется моновалентное связывание, чем бивалентное. Для многих иммунных рецепторов клеточная активация осуществляется перекрестным связыванием взаимодействия с моновалентным связыванием. Механизм перекрестного связывания обычно опосредован иммунными комплексами антитело/антиген или осуществляется путем взаимодействие эффекторной клетки с клеткой-мишенью. Например, рецепторы Fc-гамма с низкой аффинностью (FcyR), такие как FcYRIIa, FcYRIIb и FcYRIIIa, моновалентно связываются с Fc-участком антител. Моновалентное связывание не активирует клетки, экспрессирующие эти FcyR; однако при образовании иммунных комплексов или при контакте клетка-клетка рецепторы оказываются перекрестно связанными и собранными в кластеры на поверхности клетки, что приводит к активации. Для рецепторов, отвечающих за опосредование клеточной гибели, например FcYRIIIa на клетках естественных киллеров (NK), происходит перекрестное

- 1 037065 связывание рецепторов и клеточная активация, когда эффекторная клетка взаимодействует с клеткоймишенью в высокоавидной форме (Bowles & Weiner, 2005, J Immunol Methods 304:88-99, явным образом включена посредством ссылки). Аналогичным образом, ингибирующий рецептор FcYRIIb на В-клетках снижает активацию В-клеток, только когда он захватывается в иммунный комплекс с В-клеточным рецептором поверхности клеток (BCR), механизм, который опосредован образованием иммунных комплексов растворимых IgG с таким же антигеном, который распознается BCR (Heyman 2003, Immunol Lett 88 [2]:157-161; Smith & Clatworthy, 2010, Nature Reviews Immunology 10:328-343; явным образом включены посредством ссылки). В качестве другого примера CD3-активация Т-клеток происходит, только когда связанный с ней Т-клеточный рецептор (TCR) захватывает нагруженный антигеном МНС на антигенпрезентирующих клетках в высокоавидном синапсе клетка-клетка (Kuhns et al., 2006, Immunity 24:133-139). В действительности неспецифическое бивалентное перекрестное связывание CD3 с использованием анти-CD3 антитела вызывает цитокиновую бурю и токсичность (Perruche et al., 2009, J Immunol 183[2]:953-61; Chatenoud & Bluestone, 2007, Nature Reviews Immunology 7:622-632; явным образом включены посредством ссылки). Поэтому для практического клинического применения предпочтительным режимом совместного захвата CD3 для перенаправленной гибели клеток-мишеней является моновалентное связывание, которое приводит к активации только при взаимодействии в сопутствующее захваченной мишенью.

CD38, также известный как гидролаза циклической АДФ-рибозы, представляет собой трансмембранный гликопротеин II типа с длинным С-концевым внеклеточным доменом и коротким N-концевым цитоплазматическим доменом. Среди гемопоэтических клеток набор функциональных влияний был приписан CD38-опосредованному сигналингу, включающему обеспечение пролиферации лимфоцитов, высвобождение цитокинов, регуляцию развития и выживания В- и миелоидных клеток и индукцию созревания дендритных клеток. CD38 не регулируется при многих гемопоэтических злокачественных новообразованиях и в клеточных линиях, происходящих из различных гемопоэтических злокачественных новообразований, включающих неходжкинскую лимфому (NHL), лимфому Беркитта (BL), множественную миелому (ММ), В-клеточную хроническую лимфоцитарную лейкемию (B-CLL), В- и Т-клеточную острую лимфоцитарную лейкемию (ALL), Т-клеточную лимфому (TCL), острую миелоидную лейкемию (AML), волосатоклеточную лейкемию (HCL), лимфому Ходжкина (HL) и хроническую миелоидную лейкемию (CML). С другой стороны, наиболее примитивные плюрипотентные клетки гемопоэтической системы содержат CD38-. Несмотря на современный прогресс в открытии и разработке противораковых средств, многие формы рака, вовлекающие образование CD38-экспрессирующих опухолей, все еще обладают неблагоприятным прогнозом лечения. Таким образом, существует потребность в усовершенствованных способах лечения таких форм рака.

Поскольку биспецифические антитела, полученные из фрагментов антител, обладают биофизическими и фармакокинетическими ограничениями, то недостаток таких антител, построенных из форм, подобных полноразмерным антителам, заключается в том, что они мультивалентно захватывают сопутствующие антигены-мишени в отсутствие первичного антигена-мишени, приводя к неспецифической активации и потенциальной токсичности. Настоящее изобретение решает эту проблему путем предоставления новых биспецифических антител, направленных на CD3 и CD38.

Краткое описание сущности изобретения

Соответственно в настоящем изобретении предложены гетеродимерные антитела, направленные против CD3 и CD38. В некоторых вариантах реализации изобретения, гетеродимерные антитела содержат первый мономер, содержащий SEQ ID NO:91; второй мономер, содержащий SEQ ID NO:92; и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO:93. В некоторых вариантах реализации изобретения, гетеродимерные антитела содержат первый мономер, содержащий SEQ ID NO:88; второй мономер, содержащий SEQ ID NO:89; и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO:90. В изобретении дополнительно предложены композиции нуклеиновых кислот, содержащие первую, вторую и третью нуклеиновые кислоты, которые кодируют последовательности, приведенные выше, а также векторы экспрессии, содержащие композиции нуклеиновых кислот, клетки-хозяева, содержащие или нуклеиновые кислоты, или векторы экспрессии, а также способы изготовления и применения гетеродимерных антител.

В дополнительном аспекте изобретение относится к гетеродимерным антителам, содержащим первый мономер, содержащий: i) первый домен Fc; ii) анти-CD3 scFv, содержащий вариабельный легкий домен scFv, линкер scFv и вариабельный тяжелый домен scFv; причем указанный scFv ковалентно присоединен к N-концу указанного домена Fc с применением домена-линкера; второй мономер, содержащий тяжелую цепь, содержащую: i) вариабельный тяжелый домен; и ii) константный домен тяжелой цепи, содержащий второй домен Fc; и легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен. В некоторых аспектах вариабельный легкий домен scFv содержит vlCDR1, имеющий SEQ ID NO:15, vlCDR2, имеющий SEQ ID NO:16, и vlCDR3, имеющий SEQ ID NO:17, указанный вариабельный тяжелый домен scFv содержит vhCDR1, имеющий SEQ ID NO:11, vhCDR2, имеющий SEQ ID NO:12, и vhCDR3, имеющий SEQ ID NO:13, и при этом указанный вариабельный тяжелый домен и указанный вариабельный легкий домен связывают CD38.

В дополнительном аспекте изобретение относится к гетеродимерным антителам, содержащим: а)

- 2 037065 первый мономер, содержащий: i) первый домен Fc; ii) aHTu-CD3 scFv, содержащий вариабельный легкий домен scFv, линкер scFv и вариабельный тяжелый домен scFv; причем указанный scFv ковалентно присоединен к N-концу указанного домена Fc с применением домена-линкера; б) второй мономер, содержащий тяжелую цепь, содержащую: i) вариабельный тяжелый домен; и ii) константный домен тяжелой цепи, содержащий второй домен Fc; и в) легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен. В данном аспекте, вариабельный легкий домен scFv содержит vlCDR1, имеющий SEQ ID NO:24, vlCDR2, имеющий SEQ ID NO:25, и vlCDR3, имеющий SEQ ID NO:26, указанный вариабельный тяжелый домен scFv содержит vhCDR1, имеющий SEQ ID NO: 11, vhCDR2, имеющий SEQ ID NO:12, и vhCDR3, имеющий SEQ ID NO:13, и при этом указанный вариабельный тяжелый домен и указанный вариабельный легкий домен связывают CD38.

В дополнительном аспекте изобретение относится к гетеродимерным антителам, содержащим: а) первый мономер, содержащий: i) первый домен Fc; ii) aнти-CD3 scFv, содержащий вариабельный легкий домен scFv, линкер scFv и вариабельный тяжелый домен scFv; причем указанный scFv ковалентно присоединен к N-концу указанного домена Fc с применением домена-линкера; б) второй мономер, содержащий тяжелую цепь, содержащую: i) вариабельный тяжелый домен; и ii) константный домен тяжелой цепи, содержащий второй домен Fc; и в) легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен. В данном аспекте, вариабельный легкий домен scFv содержит vlCDR1, имеющий SEQ ID NO:33, vlCDR2, имеющий SEQ ID NO:34, и vlCDR3, имеющий SEQ ID NO:35, указанный вариабельный тяжелый домен scFv содержит vhCDR1, имеющий SEQ ID NO:29, vhCDR2, имеющий SEQ ID NO:30, и vhCDR3, имеющий SEQ ID NO:31, и причем указанный вариабельный тяжелый домен и указанный вариабельный легкий домен связывают CD38.

В дополнительном аспекте изобретение относится к гетеродимерным антителам, содержащим: а) первый мономер, содержащий: i) первый домен Fc; ii) aнти-CD3 scFv, содержащий вариабельный легкий домен scFv, линкер scFv и вариабельный тяжелый домен scFv; причем указанный scFv ковалентно присоединен к N-концу указанного домена Fc с применением домена-линкера; б) второй мономер, содержащий тяжелую цепь, содержащую: i) вариабельный тяжелый домен; и ii) константный домен тяжелой цепи, содержащий второй домен Fc; и в) легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен. В данном аспекте, вариабельный легкий домен scFv содержит vlCDR1, имеющий SEQ ID NO:42, vlCDR2, имеющий SEQ ID NO:43, и vlCDR3, имеющий SEQ ID NO:44, указанный вариабельный тяжелый домен scFv содержит vhCDR1, имеющий SEQ ID NO:38, vhCDR2, имеющий SEQ ID NO:39, и vhCDR3, имеющий SEQ ID NO:40, и причем указанный вариабельный тяжелый домен и указанный вариабельный легкий домен связывают CD38.

В дополнительном аспекте, гетеродимерные антитела в форме бутилкооткрывателя (bottle opener) по данному изобретению имеют scFv, который связывает CD3 и домены vh и vl, причем вариабельный легкий домен содержит vlCDR1, имеющий последовательность RASQNVDTWVA (SEQ ID NO:69), vlCDR2, имеющий последовательность SASYRYS (SEQ ID NO:70) и vlCDR3, имеющий последовательность QQYDSYPLT (SEQ ID NO:71), указанный вариабельный тяжелый домен содержит vhCDR1, имеющий последовательность RSWMN (SEQ ID NO:65), vhCDR2, имеющий последовательность EINPDSSTINYATSVKG (SEQ ID NO:66) и vhCDR3, имеющий последовательность YGNWFPY (SEQ ID NO:67).

В дополнительных вариантах реализации изобретения вариабельный легкий домен содержит vlCDR1, имеющий последовательность RASQNVDTNVA (SEQ ID NO:78), vlCDR2, имеющий последовательность SASYRYS (SEQ ID NO:79) и vlCDR3, имеющий QQYDSYPLT последовательность (SEQ ID NO:80), причем вариабельный тяжелый домен содержит vhCDR1, имеющий последовательность RSWMN (SEQ ID NO:74), vhCDR2, имеющий последовательность EINPDSSTINYATSVKG (SEQ ID NO:75) и vhCDR3, имеющий последовательность YGNWFPY (SEQ ID NO:76).

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к гетеродимерным антителам, содержащим: а) первый мономер, содержащий: i) первую тяжелую цепь, содержащую: 1) первый вариабельный тяжелый домен; 2) первую константную тяжелую цепь, содержащую первый домен Fc; 3) scFv содержащий вариабельный легкий домен scFv, линкер scFv и вариабельный тяжелый домен scFv; причем указанный scFv ковалентно присоединен к С-концу указанного домена Fc с применением доменалинкера; б) второй мономер, содержащий вторую тяжелую цепь, содержащую второй вариабельный тяжелый домен и вторую константную тяжелую цепь, содержащую второй домен Fc; и в) общую легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен; причем указанные первый и второй домены Fc имеют набор аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L и K370S: S364K/E357Q, и при этом указанный первый вариабельный тяжелый домен и указанный вариабельный легкий домен связывают CD38 человека (SEQ ID NO:131), указанный второй вариабельный тяжелый домен и указанный вариабельный легкий домен связывают CD38 человека (SEQ ID NO:131), и указанный scFv связывает CD3 человека (SEQ ID NO: 129).

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к гетеродимерным антителам, содержащим: а) первый мономер, содержащий: i) первую тяжелую цепь, содержащую: 1) первый вариабель

- 3 037065 ный тяжелый домен; 2) первый константный тяжелый домен, содержащий первый домен Fc; 3) первый вариабельный легкий домен, причем указанный первый вариабельный легкий домен является ковалентно прикрепленным к С-концу указанного первого домена Fc с применением домена-линкера; б) второй мономер, содержащий: i) второй вариабельный тяжелый домен; ii) второй константный тяжелый домен, содержащий второй домен Fc; и iii) третий вариабельный тяжелый домен, причем указанный второй вариабельный тяжелый домен является ковалентно прикрепленным к С-концу указанного второго домена Fc с применением домена-линкера; и в) общую легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен; причем указанные первый и второй домены Fc имеют набор аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L и K370S: S364K/E357Q, и при этом указанный первый вариабельный тяжелый домен и указанный вариабельный легкий домен связывают CD38 человека (SEQ ID NO:131), указанный второй вариабельный тяжелый домен и указанный вариабельный легкий домен связывают указанный CD38 человека (SEQ ID NO:131), и указанный второй вариабельный легкий домен и указанный третий вариабельный тяжелый домен связывают CD3 человека (SEQ ID NO:129).

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к гетеродимерным антителам, содержащим: а) первый мономер, содержащий: i) первую тяжелую цепь, содержащую: 1) первый вариабельный тяжелый домен; 2) первую константную тяжелую цепь, содержащую первый домен СН1 и первый домен Fc; 3) scFv содержащий вариабельный легкий домен scFv, линкер scFv и вариабельный тяжелый домен scFv; причем указанный scFv ковалентно присоединен между С-концом указанного домена СН1 и N-концом указанного первого домена Fc с применением домена-линкера; б) второй мономер, содержащий вторую тяжелую цепь, содержащую второй вариабельный тяжелый домен, и вторую константную тяжелую цепь, содержащую второй домен Fc; и в) общую легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен; причем указанные первый и второй домены Fc имеют набор аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L и K370S: S364K/E357Q, при этом указанный первый вариабельный тяжелый домен и указанный вариабельный легкий домен связывают CD38 человека (SEQ ID NO:131), указанный второй вариабельный тяжелый домен и указанный вариабельный легкий домен связывают указанный CD38 человека (SEQ ID NO:131), и указанный scFv связывает CD3 человека (SEQ ID NO:129).

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к гетеродимерным антителам, содержащим: а) первый мономер, содержащий: i) первую тяжелую цепь, содержащую: 1) первый вариабельный тяжелый домен; 2) первый константный тяжелый домен, содержащий первый домен Fc; и 3) первый вариабельный легкий домен, причем указанный второй вариабельный легкий домен является ковалентно прикрепленным между С-концом домена СН1 указанного первого константного тяжелого домена и Nконцом указанного первого домена Fc с применением домена-линкера; б) второй мономер, содержащий: i) второй вариабельный тяжелый домен; ii) второй константный тяжелый домен, содержащий второй домен Fc; и iii) третий вариабельный тяжелый домен, причем указанный второй вариабельный тяжелый домен является ковалентно прикрепленным к С-концу указанного второго домена Fc с применением домена-линкера; и в) общую легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен; причем указанные первый и второй домены Fc имеют набор аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L и K370S: S364K/E357Q, при этом указанный первый вариабельный тяжелый домен и указанный вариабельный легкий домен связывают CD38 человека (SEQ ID NO:131), указанный второй вариабельный тяжелый домен и указанный вариабельный легкий домен связывают указанный CD38 человека (SEQ ID NO:131), и указанный второй вариабельный легкий домен и указанный третий вариабельный тяжелый домен связывают CD3 человека (SEQ ID NO:129).

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к гетеродимерным антителам, содержащим: а) первый мономер, содержащий: i) первую тяжелую цепь, содержащую: 1) первый вариабельный тяжелый домен; 2) первую константную тяжелую цепь, содержащую первый домен СН1 и первый домен Fc; 3) scFv содержащий вариабельный легкий домен scFv, линкер scFv и вариабельный тяжелый домен scFv; причем указанный scFv является ковалентно прикрепленным между С-концом указанного домена СН1 и N-концом указанного первого домена Fc с применением домена-линкера; б) второй мономер, содержащий второй домен Fc; и в) легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен; причем указанные первый и второй домены Fc имеют набор аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L и K370S: S364K/E357Q, при этом указанный первый вариабельный тяжелый домен и указанный вариабельный легкий домен связывают CD38 человека (SEQ ID NO:131), и указанный scFv связывает CD3 человека (SEQ ID NO:129).

В дополнительном аспекте в некоторых вариантах реализации изобретения гетеродимерные антитела содержат первый домен Fc и второй домен Fc, которые содержат набор вариантов, выбранных из группы, состоящей из S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K;

- 4 037065

T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L и K370S: S364K/E357Q.

В дополнительных аспектах scFv содержит линкеры scFv, которые представляют собой заряженные линкеры.

В дополнительных аспектах константный домен тяжелой цепи гетеродимерных антител, описанных в настоящем документе, содержит аминокислотные замены N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D.

В дополнительном аспекте гетеродимерные антитела по изобретению имеют первый и второй домены Fc, которые содержат аминокислотные замены E233P/L234V/L235A/G236del/S267K.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к композиции нуклеиновых кислот, кодирующих гетеродимерные антитела по изобретению, которая содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный первый мономер; б) вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный второй мономер; и в) третью нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную легкую цепь.

В дополнительном аспекте изобретение относится к композиции векторов экспрессии, содержащей: а) первый вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный первый мономер; б) второй вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный второй мономер; и в) третий вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную легкую цепь. В изобретении дополнительно предложены клетки-хозяева, содержащие или композиции нуклеиновых кислот или композиции векторов экспрессии.

В изобретении дополнительно предложены способы создания гетеродимерных антител, включающие культивирование клетов-хозяев в условиях, в которых указанное антитело экспрессируется, и получение указанного антитела.

В изобретении дополнительно предложены способы лечения рака, включающие введение гетеродимерного антитела по изобретению пациенту, нуждающемуся в этом.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1А и 1В иллюстрируют несколько форм (антител) по настоящему изобретению. Изображены два варианта бутилкооткрывающей формы, один с антигенсвязывающим доменом анти-CD3, содержащим scFv, и антигенсвязывающим доменом-CD38, содержащим Fab, и другой с этими же, но переставленными доменами. Изображены формы mAb-Fv, mAb-scFv, Central-scFv и Central-Fv. Дополнительно, изображены одноплечевые формы, в которых один мономер содержит только домен Fc, -как одноплечевой Central-scFv, так и одноплечевой Central-Fv. Также показана форма с двойным scFv.

Фиг. 2 иллюстрирует последовательности конструкции High CD3 анти-CD3_H1.30_L1.47, в том числе вариабельные тяжелые и легкие домены (подчеркнуты CDR), а также отдельные vl и vhCDR, a также конструкцию scFv с заряженным линкером (дважды подчеркнут). Как и в случае всех последовательностей, изображенных на чертежах, этот заряженный линкер может быть заменен незаряженным линкером или другим заряженным линкером, по мере необходимости.

Фиг. 3 иллюстрирует последовательности конструкции High-Int #1 αнти-CD3_Н1.32_L1.47, включая вариабельные тяжелые и легкие домены (подчеркнуты CDR), а также отдельные vl и vhCDR, a также конструкцию scFv с заряженным линкером (дважды подчеркнут). Как и в случае всех последовательностей, изображенных на чертежах, этот заряженный линкер может быть заменен незаряженным линкером или другим заряженным линкером, по мере необходимости.

Фиг. 4 иллюстрирует последовательности конструкции High-Int #2 aнти-CD3_H1.89_L1.47, включая вариабельные тяжелые и легкие домены (подчеркнуты CDR), а также отдельные vl и vhCDR, а также конструкцию scFv с заряженным линкером (дважды подчеркнут). Как и в случае всех последовательностей, изображенных на чертежах, этот заряженный линкер может быть заменен незаряженным линкером или другим заряженным линкером, по мере необходимости.

Фиг. 5 иллюстрирует последовательности конструкции High-Int #3 aнти-CD3_Н1.90_L1.47, включая вариабельные тяжелые и легкие домены (подчеркнуты CDR), а также отдельные vl и vhCDR, а также конструкцию scFv с заряженным линкером (дважды подчеркнут). Как и в случае всех последовательностей, изображенных на чертежах, этот заряженный линкер может быть заменен незаряженным линкером или другим заряженным линкером, по мере необходимости.

Фиг. 6 иллюстрирует последовательности конструкции Int анти-CD3_Н1.90_L1.47, включая вариабельные тяжелые и легкие домены (подчеркнуты CDR), а также отдельные vl и vhCDR, а также конструкцию scFv с заряженным линкером (дважды подчеркнут). Как и в случае всех последовательностей, изображенных на чертежах, этот заряженный линкер может быть заменен незаряженным линкером или другим заряженным линкером, по мере необходимости.

Фиг. 7 иллюстрирует последовательности конструкции Low Anti-CD3_H1.31_L1.47, включая вариабельные тяжелые и легкие домены (подчеркнуты CDR), а также отдельные vl и vhCDR, а также конструкцию scFv с заряженным линкером (дважды подчеркнут). Как и в случае всех последовательностей, изображенных на чертежах, этот заряженный линкер может быть заменен незаряженным линкером или другим заряженным линкером, по мере необходимости.

Фиг. 8 иллюстрирует последовательности конструкции High CD38: OKT10_Н1.77_L1.24, в том числе вариабельные тяжелые и легкие домены (подчеркнуты CDR), а также отдельные vl и vhCDR, a также конструкцию scFv с заряженным линкером (дважды подчеркнут).

- 5 037065

Фиг. 9 иллюстрирует последовательности конструкции Intermediate CD38: OKT10_H1L1.24, включая вариабельные тяжелые и легкие домены (подчеркнуты CDR), а также отдельные vl и vhCDR, a также конструкцию scFv с заряженным линкером (дважды подчеркнут).

Фиг. 10 иллюстрирует последовательности конструкции Low CD38: OKT10_H1L1, включая вариабельные тяжелые и легкие домены (подчеркнуты CDR), а также отдельные vl и vhCDR, а также конструкцию scFv с заряженным линкером (дважды подчеркнут).

Фиг. 11 иллюстрирует последовательности XENP15331.

Фиг. 12 иллюстрирует последовательности XENP13243.

Фиг. 13 иллюстрирует последовательности XENP14702.

Фиг. 14 иллюстрирует последовательности XENP1542 6.

Фиг. 15 иллюстрирует последовательности XENP14701.

Фиг. 16 иллюстрирует последовательность XENP14703.

Фиг. 17 иллюстрирует последовательность XENP13243.

Фиг. 18 иллюстрирует последовательности XENP18967.

Фиг. 19 иллюстрирует последовательности XENP18971.

Фиг. 20 иллюстрирует последовательности XENP18969.

Фиг. 21 иллюстрирует последовательности XENP18970.

Фиг. 22 иллюстрирует последовательности XENP18972.

Фиг. 23 иллюстрирует последовательности XENP18973.

Фиг. 24 иллюстрирует последовательности XENP15055.

Фиг. 25 иллюстрирует последовательности XENP13544.

Фиг. 26 иллюстрирует последовательности XENP13694.

Фиг. 27 иллюстрирует последовательность CD3 ε человека.

Фиг. 28 иллюстрирует полную последовательность (SEQ ID NO:130) и внеклеточный домен (ECD; SEQ ID NO:131) белка CD38 человека.

Фиг. 29А-29Е иллюстрируют полезные пары наборов вариантов гетеродимеризации (включая ассиметричные и pI варианты).

Фиг. 30 иллюстрирует список изостерических вариантов константных областей вариантного антитела и их соответствующих замены. pI_(-) обозначает более низкие варианты pI, в то время как pI_(+) обозначает более высокие варианты pI. Они могут быть необязательно и независимо скомбинированы с другими вариантами гетеродимеризации по изобретению (а также другими типами вариантов, как описано в настоящем документе).

Фиг. 31 иллюстрирует полезные варианты абляций, которые аблируют связывание FcyR (иногда упоминаются как нокаутные или КО варианты).

Фиг. 32 иллюстрирует два особенно полезных варианта реализации настоящего изобретения.

Фиг. 33 иллюстрирует ряд заряженных линкеров scFv, которые находят применение в увеличении или уменьшении pI гетеродимерных антител, которые используют один или более scFv в качестве компонента. Один линкер scFv известного уровня техники с одиночным зарядом упоминается как Whitlow, в Whitlow et al., Protein Engineering 6(8):989-995 (1993). Следует отметить, что данный линкер применяли для снижения агрегации и усиления протеолитической стабильности scFv.

Фиг. 34 иллюстрирует список сконструированных вариантов гетеродимерных ассиметричных Fc с процентом гетеродимера (определяется с помощью катионообменной ВЭЖХ) и термостабильностью (определена по ДСК). Термическая стабильность, которая не была определена, обозначается как н.о..

Фиг. 35 - выход экспрессии биспецификов после аффинной очистки с помощью белка А.

Фиг. 36 - хроматограммы катионообменной очистки.

Фиг. 37 - анализ перенаправленной цитотоксичности Т-клеток, 24 ч инкубации, 10 тыс. клеток RPMI8226, 400 тыс. Т-клеток. Тестовые образцы представляют собой биспецифические антитела антиCD38 х анти-CD3. Обнаружение проводили с помощью ЛДГ.

Фиг. 38 - анализ перенаправленной цитотоксичности Т-клеток, 24 ч инкубации, 10 тыс. клеток RPMI8226, 500 тыс. человеческих МКПК (Мононуклеарные Клетки Периферической Крови). Тестовые образцы представляют собой биспецифические антитела анти-CD38 х анти-CD3. Определение проводили с помощью ЛДГ.

Фиг. 39 - иллюстрирует последовательности XENP14419.

Фиг. 40 - иллюстрирует последовательности XENP14420.

Фиг. 41 - иллюстрирует последовательности XENP14421.

Фиг. 42 - иллюстрирует последовательности XENP14422.

Фиг. 43 - иллюстрирует последовательности XENP14423.

Фиг. 44 - анализ перенаправленной цитотоксичности Т-клеток, 96 ч инкубации, 40 тыс. клеток RPMI8226, 400 тыс. МКПК (Мононуклеарные Клетки Периферической Крови) человека. Тестовые образцы представляют собой αнти-CD38 х анти-CD3 Fab-scFv-Fcs. Обнаружение проводилось методом проточной цитометрии, в частности по исчезновению CD38+ клеток.

- 6 037065

Фиг. 45 - дополнительный анализ перенаправленной цитотоксичности Т-клеток, проиллюстрирован на фиг. 1. Первый ряд показывает Среднюю Интенсивность Флуоресценции (СИФ) маркера активации CD69 на Т-клетках CD4+ и CD8+, как обнаружено с помощью проточной цитометрии. Второй ряд показывает процент Т-клеток CD4+ и CD8+, которые представляют собой Ki-67+, меру пролиферации клеток. Третий ряд показывает внутриклеточную Среднюю Интенсивность Флуоресценции (СИФ) PI-9 - ингибитора гранзима В на Т-клетках CD4+ и CD8+, как обнаружено с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 46 - план исследования на мышах для изучения противоопухолевой активности анти-CD38 х анти-CD3-Fab-scFv-Fc биспецификов.

Фиг. 47 - размер опухоли, измеренный с помощью IVIS®, как функция времени и лечения.

Фиг. 48 - биолюминесцентные изображения IVIS® (день 10).

Фиг. 49 - истощение CD38+ клеток у яванских макак после введения однократной дозы указанных тестовых образцов.

Фиг. 50 - активация Т-клеток, измеренная с помощью Средней Интенсивности Флуоресценции (СИФ) CD69 у яванских макак, цветовые обозначения как на фиг. 49.

Фиг. 51 - сывороточные уровни ИЛ-6 после введения однократной дозы указанных тестовых образцов.

Фиг. 52 - иллюстрирует последовательности XENP15427.

Фиг. 53 - иллюстрирует последовательности XENP15428.

Фиг. 54 - иллюстрирует последовательности XENP15429.

Фиг. 55 - иллюстрирует последовательности XENP15430.

Фиг. 56 - иллюстрирует последовательности XENP15431.

Фиг. 57 - иллюстрирует последовательности XENP15432.

Фиг. 58 - иллюстрирует последовательности XENP15433.

Фиг. 59 - иллюстрирует последовательности XENP15434.

Фиг. 60 - иллюстрирует последовательности XENP15435.

Фиг. 61 - иллюстрирует последовательности XENP15436.

Фиг. 62 - иллюстрирует последовательности XENP15437.

Фиг. 63 - иллюстрирует последовательности XENP15438.

Фиг. 64 - иллюстрирует значения аффинности связывания в анализе Biacore.

Фиг. 65 - иллюстрирует чистоту гетеродимера во время образования стабильного пула с применением изменяемых соотношений легкой цепи, Fab-Fc и scFv-Fc.

Фиг. 66 - истощение IgM и IgG2 человека под действием анти-CD38 х анти-CD3 биспецифических антител в мышиной модели с МКПК человека.

Фиг. 67 - иллюстрирует оптимизированные по стабильности, гуманизированные вариантные антиCD3 scFv. Замены приведены по отношению к последовательности scFv H1_L1.4. Аминокислотная нумерация представляет собой нумерацию Кабата.

Фиг. 68 - аминокислотные последовательности оптимизированных по стабильности, гуманизированных вариантных анти-CD3 scFv. CDR подчеркнуты. Для каждой комбинации тяжелой цепи/легкой цепи, перечислены четыре последовательности: (i) scFv с С-концевой 6xHis частью, (ii) только scFv, (ii) только VH, (iv) только VL.

Фиг. 69 - анализ перенаправленной цитотоксичности Т-клеток, 24 ч инкубации, 10 тыс. клеток RPMI8226, 500 тыс. МКПК. Тестовые образцы представляют собой анти-CD38 (OKT10_H1L1, OKT10_Н1.77_L1.24) х анти-CD3 Fab-scFv-Fcs. Определение проводили с помощью ЛДГ.

Фиг. 70 - истощение Ig в исследовании на huPBL-SCID (модель, предполагающая введение лимфоцитов периферической крови человека мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом). Тестовые образцы вводили через 8 дней после приживления МКПК в дозах 0,03, 0,3 или 3 мг/кг. Путь введения был внутрибрюшинный. Образцы крови брали через 14 дней после приживления РВМС, обрабатывали сывороткой и анализировали на человеческие IgM и IgG2.

Фиг. 71 - иллюстрирует последовательности XENP18967 Anti-CD38.

Фиг. 72 - иллюстрирует последовательности XENP18971.

Фиг. 73 - иллюстрирует последовательности XENP18969.

Фиг. 74 - иллюстрирует последовательности XENP18970.

Фиг. 75 - иллюстрирует последовательности XENP18972.

Фиг. 76 - иллюстрирует последовательности XEN18973.

Фиг. 77 - иллюстрирует матрицу возможных комбинаций для вариантов реализации настоящего изобретения. А означает, что CDR, упоминаемых последовательностей CD3, могут быть объединены с CDR конструкции CD38 по левой стороне. То есть, например, для верхней левой ячейки, vhCDR из последовательности H1.30 вариабельной тяжелой цепи CD3 и vlCDR из последовательности L1.47 вариабельной легкой цепи CD3 могут быть скомбинированы с vhCDR из последовательности OKT10 H1.77 CD38 и с vlCDR из последовательности OKT10L1.24. В означает, что CDR из конструкций CD3 могут быть скомбинированы с вариабельными тяжелыми и легкими доменами из конструкции CD38. То есть,

- 7 037065 например, для верхней левой ячейки, vhCDR из последовательности H1.30 вариабельной тяжелой цепи CD3 и vlCDR из последовательности L1.47 вариабельной легкой цепи CD3 могут быть скомбинированы с последовательностью OKT10 H1.77 вариабельного тяжелого домена CD38 и последовательностью OKT10L1.24. А С перевернута, таким образом, что вариабельный тяжелый домен и вариабельный легкий домен из последовательностей CD3 применяют с CDR, из последовательностей CD38. A D - это где комбинируют как вариабельная тяжелая, так и вариабельная легкая цепь из каждого. Е - это где scFv из CD3 применяют с CDR конструкции антиген-связывающего домена CD38 и F - это где scFv CD3 применяют с вариабельными тяжелыми и вариабельными легкими доменами антиген-связывающего домена CD38.

Описание сущности изобретения

Определения.

Для того чтобы можно было в более полной мере понять данную заявку, ниже изложены несколько определений. Такие определения охватывают грамматические эквиваленты.

Абляция в данном документе означает снижение или исключение активности. Так, например, абляция связывания FcyR означает, что аминокислотный вариант Fc-участка имеет менее 50% исходного связывания по сравнению с Fc-участком, не содержащим специфический вариант, предпочтительно с менее чем 70-80-90-95-98% потерей активности, и в целом с активностью ниже уровня выявляемого связывания при анализе Biacore. Особенно полезными в абляции связывания FcyR являются те, что указаны на фиг. 16.

АЗКЦ, или антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность, в данном документе означает клеточноопосредованную реакцию, при которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcyR, распознают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают лизис клетки-мишени. АЗКЦ коррелирует со связыванием с FcYRIIIa; a повышенное связывание с FcYRIIIa приводит к повышению активности АЗКЦ.

АЗКФ, или антителозависимый клеточноопосредованный фагоцитоз, в данном документе означает клеточноопосредованную реакцию, при которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcyR, распознают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают фагоцитоз клетки-мишени.

Модификация в данном документе означает аминокислотную замену, инсерцию и/или делецию в полипептидной последовательности или изменение фрагмента, химически связанного с белком. Например, модификация может быть проведена изменением углевода или ПЭГ -структуры, присоединенной к белку.

Аминокислотная модификация в данном документе означает аминокислотную замену, инсерцию и/или делецию в полипептидной последовательности. Для ясности, если не указано иное, аминокислотная модификация всегда относится к аминокислоте, кодированной ДНК, например 20 аминокислот, которые имеют кодоны в ДНК и РНК.

Аминокислотная замена или замена в данном документе означает замену аминокислоты в конкретном положении в первичной полипептидной последовательности другой аминокислотой. В частности, в некоторых вариантах реализации изобретения замена представляет собой аминокислоту, которая не встречается в природе в конкретном положении, не встречается в природе ни в данном организме, ни в каком-либо организме. Например, замена E272Y относится к вариантному полипептиду, в случае которой Fc-вариант, в котором глутаминовая кислота находится в положении 272, заменяется тирозином. Для ясности, белок, который сконструирован для изменения кодирующей нуклеотидной последовательности, но без изменения исходной аминокислоты (например, изменение CGG (кодирующий аргинин) на CGA (также кодирующий аргинин) для увеличения уровней экспрессии в организме-хозяине), не является белком с аминокислотной заменой; а именно, несмотря на создание нового гена, кодирующего такой же белок, если белок имеет такую же аминокислоту в конкретном положении, с которого он начинается, то это не аминокислотная замена.

Аминокислотная инсерция или инсерция в данном документе означает добавление к аминокислотной последовательности в конкретном положении в первичной полипептидной последовательности. Например, -233Е или 233Е обозначает инсерцию глутаминовой кислоты после положения 233 и перед положением 234. Кроме того, -233ADE или A233ADE обозначает вставку AlaAspGlu после позиции 233 и 234 до положения.

Аминокислотная делеция или делеция в данном документе означает удаление из аминокислотной последовательности в конкретном положении в первичной полипептидной последовательности. Например, Е233- или Е233# или Е233() обозначает удаление глутаминовой кислоты в положении 233. Кроме того, EDA233- или EDA233# обозначает удаление последовательности GluAspAla, которая начинается в позиции 233.

Вариантный белок, или вариант белка, или вариант в данном документе означает белок, который отличается от первичного белка благодаря одной аминокислотной модификации. Вариант белка может относиться к самому белку, композиции, содержащей белок, или аминокислотной последовательно

- 8 037065 сти, которая его кодирует. Предпочтительно, чтобы вариант белка имел по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по сравнению с первичным белком, например от около одной до около семидесяти аминокислотных модификаций, и предпочтительно от около одной до около пяти аминокислотных модификаций по сравнению с начальным. Как описано ниже, в некоторых вариантах реализации изобретения первичный полипептид, например первичный Fc-полипептид, представляет собой последовательность человека дикого типа, такую как Fc-участок из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, хотя последовательности человека с вариантами также могут служить в качестве первичных полипептидов, например IgG1/2 гибрид фиг. 19. Последовательность варианта белка в данном документе предпочтительно будет обладать по меньшей мере около 80% идентичности с последовательностью первичного белка, и предпочтительнее всего по меньшей мере около 90% идентичности, предпочтительнее по меньшей мере около 95-98-99% идентичности. Вариантный белок может относиться к самому вариантному белку, композициям, содержащим вариант белка, или последовательности ДНК, которая его кодирует. Соответственно вариант антитела или вариантное антитело в данном документе означает антитело, которое отличается от первичного антитела благодаря по меньшей мере одной аминокислотной модификации, вариант IgG или вариантный IgG в данном документе означает антитело, которое отличается от первичного IgG (снова, во многих случаях, от последовательности IgG человека) благодаря по меньшей мере одной аминокислотной модификации, и вариант иммуноглобулина или вариантный иммуноглобулин в данном документе означает иммуноглобулиновую последовательность, которая отличается от такой последовательности первичного иммуноглобулина благодаря по меньшей мере одной аминокислотной модификации. Fc-вариант или вариантный Fc в данном документе означает белок, содержащий аминокислотную модификацию в Fc-домене. Fc-варианты по настоящему изобретению определяют в соответствии с аминокислотными модификациями, которые их составляют. Таким образом, например, N434S или 434S представляет собой Fc-вариант с замененным серином в положении 434 относительно первичного Fc-полипептида, в котором используется нумерация в соответствии с индексом EU. Аналогичным образом, M428L/N434S определяет Fc-вариант с заменами M428L и N434S относительно первичного Fcполипептида. WT Идентичность аминокислоты ДТ может быть неустановленной, в таком случае вышеуказанный вариант называется 428L/434S. Следует отметить, что порядок, в котором предлагается введение замен, является произвольным, а именно для подтверждения этого, например 428L/434S представляет собой такой же Fc-вариант, что и M428L/N434S, и т.д. Для всех положений, обсуждаемых в настоящем изобретении, которое относится к антителам, если не указано иное, нумерация положения аминокислот производится в соответствии с индексом EU. Индекс EU, или EU-индекс, как в схеме нумерации Кабата, или EU, относится к нумерации антитела EU (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:7885, в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки). Модификация может быть добавлением, делецией или заменой. Замены могут включать встречающиеся в природе аминокислоты и, в некоторых случаях, синтетические аминокислоты. Примеры включают патенты США № 6586207; WO 98/48032; WO 03/073238; US 2004-0214988A1; WO05/35727А2; WO 05/74524A2; J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J.W. Chin и Р.G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J.W. Chin, et al., (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024 и L. Wang и P.G. Schultz, (2002), Chem. 1-10, все включены в полном объеме посредством ссылки.

В данном документе белок означает по меньшей мере две ковалентно присоединенные аминокислоты, которые включают белки, полипептиды, олигопептиды и пептиды. Пептидильная группа может содержать встречающиеся в природе аминокислоты и пептидные связи, или синтетические пептидомиметические структуры, т.е. аналоги, такие как пептидоиды (см. Simon et al., PNAS USA 89(20):9367 (1992), в полном объеме включена посредством ссылки). Аминокислоты могут быть как встречающиеся в природе, так и синтетические (например, могут не являться аминокислотой, которая кодируется ДНК); как ясно специалистам в данной области. Например, для целей данного изобретения гомофенилаланин, цитруллин, орнитин и норлейцин считаются синтетическими аминокислотами и могут использоваться обе D- и L-(R или S) конфигурации аминокислот. Варианты по настоящему изобретению могут содержать модификации, которые включают применение синтетических аминокислот, включенных с использованием, к примеру, технологий, разработанных Schultz и коллегами, включая, но не ограничиваясь этим, способы, описанные Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 (2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3 и Chin et al., 2003, Science 301(5635):964-7, все включены в полном объеме посредством ссылки. В дополнение к этому, полипептиды могут включать синтетическую дериватизацию одной или более боковых цепей или концов, гликозилирование, ПЭГилирование, кольцевую пермутацию, циклизацию, использование линкеров с другими молекулами, слияние с белками или белковыми доменами и добавление пептидных маркеров или меток.

Остаток в данном документе означает положение в белке и связанную с ним аминокислотную идентичность. Например, аспарагин 297 (также называемый Asn297 или N297) представляет собой остаток в положении 297 в антителе человека IgG1.

Fab или Fab-участок в данном документе означает полипептид, который содержит иммуноглобулиновые домены VH, CH1, VL и CL. Fab может относиться к этому участку в отдельности, или этот участок понимается в контексте полноразмерного антитела, фрагмента антитела или Fab-белка слияния.

- 9 037065

Fv, или Fv-фрагмент, или Fv-участок в данном документе означает полипептид, который содержит VL- и VH-домены одного антитела. Как будет понятно специалистам в данной области, они обычно состоят из двух цепей.

Модификация подкласса IgG или изотипная модификация в данном документе означает аминокислотную модификацию, которая превращает одну аминокислоту одного изотипа IgG в соответствующую аминокислоту другого выровненного изотипа IgG. Например, поскольку IgG1 содержит тирозин, a IgG2 - фенилаланин в положении EU 296, то замена F296Y в IgG2 считается модификацией подкласса IgG.

Не встречающаяся в природе модификация в данном документе означает аминокислотную модификацию, которая не является изотипической. Например, поскольку ни один из IgG не содержит серин в положении 434, то замена 434S в IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 (или их гибриды) считается не встречающейся в природе модификацией.

Аминокислота или аминокислотная идентичность в данном документе означает одну из 20 встречающихся в природе аминокислот, которые кодируются ДНК или РНК.

Эффекторная функция в данном документе означает биохимическое событие, которое происходит в результате взаимодействия Fc-участка антитела с рецептором или лигандом Fc. Эффекторные функции включают, но не ограничиваются ими, АЗКЦ, АЗКФ и КЗЦ.

Fc-лиганд IgG в данном документе означает молекулу, предпочтительно полипептид, полученную из любого организма, которая связывается с Fc-участком IgG-антитела с образованием Fc/Fc-лигандного комплекса. Fc-лиганды включают, но не ограничиваются ими, FcyRIs, FcyRIIs, FcyRIIIs, FcRn, C1q, C3, маннансвязывающий лектин, рецептор маннозы, стафилококковый белок А, стрептококковый белок G и вирусный FcyR. Fc-лиганды также включают гомологи рецепторов Fc (FcRH), представляющие собой семейство рецепторов Fc, которые гомологичны FcyR (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123136, включена в полном объеме посредством ссылки). Fc-лиганды могут включать неоткрытые молекулы, которые связывают Fc. В частности, Fc-лиганды IgG представляют собой рецептори FcRn и Fc гамма. Fc-лиганд в данном документе означает молекулу, предпочтительно полипептид, полученную из любого организма, которая связывается с Fc-участком антитела с образованием Fc/Fc-лигандного комплекса.

Fc-гамма рецептор, FcyR или Fc-гамма-R в данном документе означает любого представителя семейства белков, которые связывают Fc-участок IgG-антитела и кодируются геном FcyR. Для человека это семейство включает, но не ограничивается FcyRI (CD64), включая изоформы FcYRIa, FcYRIb и FcyRIc; FcRII (CD32), включая изоформы FcRIIa (включая аллотипы Н131 и R131), FcYRIIb (включая FcYRIIb-1 и FcYRIIb-2) и FcyRIIc; и FcyRIII (CD16), включая изоформы FcYRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcYRIIIb (включая аллотипы FcYRIIb-NA1 и FcYRIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, полностью включенные в качестве ссылки), а также любые неоткрытые человеческие FcyRs или FcyR изоформы или аллотипы. FcyR может быть получен из любого организма, включая, но не ограничиваясь, людьми, мышами, крысами, кроликами и обезьянами. Мышиные FcyR включают, но не ограничиваются лишь этими: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) и FcyRIII-2 (CD16-2), а также любые неоткрытые мышиные FcyRs или FcYR-изоформы или аллотипы.

FcRn или неонатальный рецептор Fc в данном документе означает белок, который связывает Fcучасток IgG-антитела и кодируется, по меньшей мере, частично геном FcRn. FcRn могут быть получены из любого организма, включая, но не ограничиваясь лишь этими: людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян. Как известно в данной области техники, функциональный белок FcRn содержит два полипептида, часто называемые тяжелой цепью и легкой цепью. Легкая цепь представляет собой бета-2 микроглобулин, а тяжелая цепь кодируется геном FcRn. Если в данном документе не указано иное, белок FcRn или FcRn относится к комплексу тяжелой цепи FcRn с бета-2 микроглобулином. Для увеличения связывания с рецептором FcRn и в некоторых случаях для увеличения периода полувыведения из сыворотки применяется множество вариантов FcRn, которые показаны в условных обозначениях к фиг. 83.

Первичный полипептид в данном документе означает исходный полипептид, который впоследствии модифицируется для получения варианта. Первичный полипептид может быть встречающимся в природе полипептидом, или вариантом, или сконструированной версией встречающегося в природе полипептида. Первичный полипептид может относиться к самому полипептиду, композициям, которые содержат первичный полипептид, или аминокислотной последовательности, которая его кодирует. Соответственно первичный иммуноглобулин в данном документе означает немодифицированный иммуноглобулиновый полипептид, который модифицируется для получения варианта, а первичное антитело в данном документе означает немодифицированное антитело, которое модифицируется для получения вариантного антитела. Следует отметить, что первичное антитело включает известные коммерческие, полученные рекомбинантным способом антитела, как описано ниже.

Fc, или Fc-участок, или Fc-домен в данном документе означает полипептид, содержащий константный участок антитела, за исключением первого домена константного участка иммуноглобулина, и, в некоторых случаях, часть шарнира. Таким образом, Fc относится к последним двум доменам константных участков иммуноглобулинов IgA, IgD и IgG, последним трем доменам константных участков имму

- 10 037065 ноглобулинов IgE и IgM, и к гибкому шарниру N-конца у этих доменов. Для IgA и IgM, Fc может включать J-цепь. Для IgG домен Fc включает иммуноглобулиновые домены Сγ2 и Cy3 (Cy2 и Сγ3) и нижнюю шарнирную область между Cy1 (Cy1) и Сγ2 (Су2). Хотя границы Fc-участка могут изменяться, Fc-участок тяжелой цепи IgG человека обычно определяется как включающий остатки С226 или Р230 на своем карбоксильном конце, причем нумерация проводится в соответствии с индексом EU, как и по Кабату. В некоторых вариантах реализации изобретения, как более полно описано ниже, аминокислотные модификации осуществлены в Fc-участке, например, для изменения связывания с одним или более рецепторами FcyR или с рецептором FcRn.

Термин тяжелая константная область здесь означает СН1-шарнир-СН2-CH3-часть антитела.

Fc-белок слияния или иммуноадгезин в данном документе означает белок, содержащий Fcучасток, обычно связанный (необязательно через линкерный фрагмент, как описано в данном документе) с другим белком, таким как фрагмент связывания с белком-мишенью, как описано в данном документе. В некоторых случаях, один мономер гетеродимерного антитела содержит тяжелую цепь антитела (или содержащий scFv или дополнительно содеражщий легкую цепь), а другой мономер представляет собой Fc-гибрид, содержащий вариант Fc-домена и лиганд. В некоторых вариантах реализации изобретения, эти наполовину антитело - наполовину гибридные белки называются гибридотелами.

Положение в данном документе означает локализацию в последовательности белка. Положения могут нумероваться последовательно или в соответствии с установленной формой, например, индексом EU для нумерации антител.

Антиген-мишень в данном документе означает молекулу, которая специфически связывается вариабельным участком данного антитела. Антиген-мишень может быть белком, углеводом, липидом или другим химическим соединением. Широкий ряд подходящих антигенов-мишеней описан ниже.

Цепочечность в контексте мономеров гетеродимерных антител по настоящему изобретению в данном документе означает, что аналогично двум цепям ДНК, которые совместимы, гетеро димеризационные варианты включаются в каждый мономер так, что сохраняется способность совмещаться для образования гетеродимеров. Например, если несколько pI-вариантов сконструированы в мономере А (например, создание более высокой pI), то стерические варианты, которые представляют собой заряженные пары, что могут использоваться, а также не влиять на pI-варианты, например заряженные варианты, которые делают pI более высокой, помещают на ту же цепь или мономер для сохранения обеих функций. Аналогичным образом, для ассиметричных вариантов, которые входят в пары набора, как более полно описано ниже, квалифицированный специалист рассмотрит pI при принятии решения о том, в какую цепочку или мономер, который включает один набор пары войдет эта пара, так что разделение pI максимизируется с применением также pI ассиметричностей.

Клетка-мишень в данном документе означает клетку, которая экспрессирует антиген-мишень.

Вариабельный участок в данном документе означает участок иммуноглобулина, который содержит один или более Ig-доменов, в основном кодированных любым из V.каппа., V.лямбда, и/или VHгенами, которые создают каппа, лямбда и тяжелую цепь иммуноглобулиновых генетических локусов соответственно.

Дикий тип или ДТ в данном документе означает аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая обнаружена в природе, включая аллельные вариации. Белок ДТ имеет аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая не была намеренно модифицирована.

Антитела по настоящему изобретению обычно являются выделенными или рекомбинантными. Выделенный, когда используется для описания различных полипептидов, описанных в данном документе, обозначает полипептид, который идентифицирован и отделен и/или выделен из клетки или клеточной культуры, в которой он был экспрессирован. Как правило, выделенный полипептид будет получен с использованием по меньшей мере одной стадии очистки. Выделенное антитело относится к антителу, которое практически свободно от других антител, имеющих разные антигенные специфичности. Рекомбинантный означает, что антитела генерируются с использованием методов рекомбинантной нуклеиновой кислоты в экзогенных клетках-хозяевах.

Специфическое связывание, или специфически связывается с, или является специфическим к конкретному антигену или эпитопу, означает связывание, которое измеряемо отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание может измеряться, к примеру, определением связывания молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы, которая обычно представляет собой молекулу со сходной структурой, которая не имеет активности связывания. Например, специфическое связывание может определяться конкуренцией с контрольной молекулой, которая сходна с мишенью.

Специфическое связывание может проявляться для конкретного антигена или эпитопа, например, тем, что антитело имеет значение KD для антигена или эпитопа по меньшей мере около 10-4 М, по меньшей мере около 10-5 М, по меньшей мере около 10-6 М, по меньшей мере около 10-7 М, по меньшей мере около 10-8 М, по меньшей мере 10-9 М, в альтернативном варианте по меньшей мере около 10-10

- 11 037065

М, по меньшей мере около 10-11 М, по меньшей мере около 10-12 М, или больше, если KD относится к степени диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Как правило, антитело, которое специфически связывает антиген, будет иметь значение KD, которое в 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5000-, 10000- или больше раз больше для контрольной молекулы относительно антигена или эпитопа.

Также может проявляться специфическое связывание конкретного антигена или эпитопа, например, антителом, имеющим KA или Ka для антигена или эпитопа по меньшей мере в 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5000-, 10000- или еще больше раз для эпитопа относительно контроля, где KA или Ka относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.

II. Обзор.

Биспецифические антитела, которые одновременно взаимодействуют с CD3 и опухолевым антигеном-мишенью, были сконструированы и применены для перенаправления Т-клеток на опухолевые клетки-мишени для атаки и лизиса. Примеры включают формы BiTE и DART, которые моновалентно взаимодействуют с CD3 и опухолевым антигеном. Несмотря на то, что CD3-нацеливающий подход продемонстрировал значительные перспективы, общим побочным эффектом таких методов лечения является сопутствующая продукция цитокинов, что часто приводит к синдрому токсического высвобождения цитокинов. Поскольку анти-CD3-связывающий домен биспецифического антитела взаимодействует со всеми Т-клетками, привлекается подгруппа CD4 Т-клеток, продуцирующих большие количества цитокинов. Более того, подкласс CD4 Т-клеток включает регуляторные Т-клетки, привлечение и размножение которых потенциально может привести к подавлению иммунитета и иметь негативное влияние на длительное подавление опухоли. Кроме того, эти формы не содержат доменов Fc и показывают очень короткие сывороточные периоды полувыведения у пациентов.

Несмотря на то что CD3-нацеливающий подход продемонстрировал значительные перспективы, общий побочный эффект таких методов лечения связан с производством цитокинов, что часто приводит к синдрому токсического цитокинового высвобождения. Поскольку анти-CD3-связывающий домен биспецифического антитела взаимодействует со всеми Т-клетками, привлекается подгруппа CD4 Т-клеток, продуцирующих высокие количества цитокинов. Более того, подкласс CD4 Т-клеток включает регуляторные Т-клетки, привлечение и размножение которых потенциально может привести к подавлению иммунитета и иметь негативное влияние на долгосрочное подавление опухоли. Одним из таких возможных способов снижения продуцирования цитокинов и, возможно, снижения активации CD4 Т-клеток является снижение сродства анти-CD3 домена к CD3.

Соответственно в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предлагаются конструкции антител, содержащие анти-CD3 антигенсвязывающие домены, которые являются сильными или высокоаффинными связующими CD3 (например, в одном примере описаны тяжелый и легкий вариабельные домены как H1.30_L1.47 (необязательно включающие при необходимости заряженный линкер)) и также которые связываются с CD38. В других вариантах реализации настоящего изобретения предлагаются конструкции антител, содержащие анти-CD3 антигенсвязывающие домены, которые являются слабыми или низкоаффинными связующими CD3. Дополнительные варианты реализации изобретения относятся к конструкциям антител, содержащим анти- CD3 антигенсвязывающие домены, что имеют промежуточную или среднюю аффинность к CD3, что также связываются с CD38.

Следует понимать, что высокие, средние, низкие последовательности анти-CD3 по настоящему изобретению могут применяться во множестве разновидностей гетеродимеризационных форм. Хотя большая часть раскрытия в данном документе использует для гетеродимеров форму бутылкооткрыватель, эти последовательности вариабельных тяжелых и легких цепей, а также последовательности scFv (и последовательности Fab, содержащие эти последовательности вариабельных тяжелых и легких цепей) могут быть применены в других формах, таких как показано на фиг. 2 публикации WO № 2014/145806, чертежи, формы и пояснения условных обозначений которой явно включены в данный документ посредством ссылки.

Соответственно настоящее изобретение относится к гетеродимерным антителам, которые связываются с двумя различными антигенами, например антитела являются биспецифичными, поскольку они связывают два разных антигена-мишени, например CD3 и CD38 в настоящем изобретении. Эти гетеродимерные антитела могут связывать данные антигены-мишени или моновалентно (например, имеется единственный антигенсвязывающий домен, такой как паравариабельный тяжелый домен и вариабельный легкий домен), или бивалентно (имеются два антигенсвязывающих домена, каждый из которых независимо связывает антиген). Гетеродимерные антитела по изобретению основаны на применении различных мономеров, которые содержат аминокислотные замены, что делают ассиметричной конструкцию гетеродимеров по отношению к гомодимерам, как это более подробно описано ниже, в сочетании с вариантами pI, которые позволяют легко очищать гетеродимеры от гомодимеров, как схожим образом описано ниже. Для гетеродимерных биспецифических антител по настоящему изобретению, настоящее изобретение в целом, как правило, основано на применении сконструированных или вариантных доменов Fc, которые могут самособираться в продуцирующих клетках, для получения гетеродимерных белков, и способов получения и очистки таких гетеродимерных белков.

- 12 037065

III. Антитела.

Настоящее изобретение относится к получению биспецифичных антител, которые связываться с CD3 и CD38, в целом, как правило, к получению терапевтических антител. Как обсуждается ниже, термин антитело применяется обычным образом. Антитела, которые находят применение в настоящем изобретении, могут принимать ряд форм, как описано в данном документе, включая традиционные антитела, а также производные антител, фрагменты и миметики, описанные в данном документе.

Структурные единицы традиционного антитела, как правило, содержат тетрамер. Каждый тетрамер, как правило, состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну легкую (обычно имеющую молекулярную массу около 25 кДа) и одну тяжелую цепь (обычно имеющую молекулярную массу около 50-70 кДа). Легкие цепи человека классифицируют как легкие цепи каппа и лямбда. Настоящее изобретение направлено на класс IgG, который имеет несколько подклассов, включающих, но не ограниченных лишь этими: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Таким образом, изотип в данном документе означает любой из подклассов иммуноглобулинов, определенных химическими и антигенными свойствами их константных участков. Следует понимать, что терапевтические антитела также могут содержать гибриды изотипов и/или подклассов. Например, как показано в публикации США 2009/0163699, включенной посредством ссылки, настоящее изобретение охватывает pi-конструирование IgG1/G2гибридов.

Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельный участок от около 100 до 110 или более аминокислот, главным образом ответственный за распознавание антигена, обычно называемый в данной области техники и в данном документе Fv-доменом или Fv-участком. В вариабельном участке для каждого из V-доменов тяжелой цепи и легкой цепи собраны три петли для того, чтобы сформировать антигенсвязывающий сайт. Каждая из петель называется определяющим комплементарность участком (в дальнейшем называемая CDR), в котором вариация в аминокислотной последовательности является наиболее важной. Вариабельный относится к тому факту, что среди антител определенные сегменты вариабельного участка значительно отличаются по последовательностям. Вариабельность в пределах вариабельного участка распределяется неравномерно. На самом деле, V-участки состоят из относительно инвариантных промежутков, называемых каркасными участками (FR), из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими участками с чрезвычайной вариабельностью, называемыми гипервариабельными участками, которые составляют в длину 9-15 аминокислот каждый или длиннее.

Каждый VH и VL состоит из трех гипервариабельных участков (определяющие комплементарность участки, CDR) и четырех FR, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

Гипервариабельный участок обычно охватывает аминокислотные остатки от около аминокислотных остатков 24-34 (LCDR1; L обозначает легкую цепь), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) на вариабельном участке легкой цепи и приблизительно около 31-35В (HCDR1; Н обозначает тяжелую цепь), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) на вариабельном участке тяжелой цепи; Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), и/или такие участки, образующие гипервариабельную петлю (например, остатки 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3) на вариабельном участке легкой цепи и 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) и 96-101 (HCDR3) на вариабельном участке тяжелой цепи; Chothia и Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917. Конкретные CDR согласно изобретению описаны ниже.

В настоящем описании, как правило, используется система нумерации Кабата, если относится к остатку в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 вариабельного участка легкой цепи и остатки 1-113 вариабельного участка тяжелой цепи), и система нумерации ЕС для Fc-областей (например, Kabat et al., см. выше (1991)).

В настоящем изобретении предлагается большое количество различных наборов CDR. В данном случае полный набор CDR содержит три вариабельных легких и три вариабельных тяжелых CDR, например vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 и vhCDR3. Эти могут быть частью более крупного вариабельного легкого домена и вариабельного тяжелого домена соответственно. Кроме того, как более подробно описано в данном документе, вариабельные тяжелые и вариабельные легкие домены могут находится в отдельных полипептидных цепях, когда используется тяжелая и легкая цепи (например, когда применяются Fab), или в одной полипептидной цепи в случае последовательностей scFv.

CDR вносят вклад в формирование антигенсвязывающего или, более конкретно, эпитопсвязывающего сайта антител. Эпитоп относится к детерминанте, которая взаимодействует со специфическим антигенсвязывающим сайтом в вариабельном участке молекулы антитела, известном как паратоп. Эпитопы группируются из молекул, таких как аминокислоты или сахаридные боковые цепи, и обычно имеют специфические структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Один антиген может иметь более чем один эпитоп.

Эпитоп может содержать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании (также названные иммунодоминантным компонентом эпитопа), и другие аминокислотные остатки, которые непосредственно не участвуют в связывании, такие как аминокислотные остатки, которые эффективно блокируются специфическим антигенсвязывающим пептидом; другими словами, аминокислотный

- 13 037065 остаток находится в пределах зоны узнавания специфического антигенсвязывающего пептида.

Эпитопы могут быть как конформационными, так и линейными. Конформационный эпитоп создается пространственно совмещенными аминокислотами из разных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, созданный соседними аминокислотными остатками в полипептидной цепи. Конформационные и неконформационные эпитопы могут различаться в том отношении, что в присутствии денатурирующих растворителей теряется связывание с первыми, но не с последними эпитопами.

Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3, а более обычно по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Антитела, которые распознают одинаковый эпитоп, могут быть проверены простым иммуноанализом, например сортировкой, показывающим способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью.

Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константную область, главным образом отвечающую за эффекторную функцию. Kabat et al. собрали множество первичных последовательностей вариабельных участков тяжелых цепей и легких цепей. На основании степени консервативности последовательностей они классифицировали отдельные первичные последовательности в CDR и каркас, и составили их перечень (см. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al., включена в полном объеме посредством ссылки).

В подклассе IgG иммуноглобулинов существует несколько иммуноглобулиновых доменов в тяжелой цепи. В данном документе иммуноглобулиновый (Ig) домен означает участок иммуноглобулина, имеющий четкую четвертичную структуру. Для настоящего изобретения представляют интерес домены тяжелой цепи, включающие константные тяжелые (СН) домены и шарнирные домены. В контексте IgGантител каждый из изотипов IgG имеет три СН-участка. Соответственно СН-домены в контексте IgG являются следующими: СШ относится к положениям 118-220 в соответствии с индексом в соответствии с индексом EU, как и по Кабату. СН2 относится к положениям 237-340 в соответствии с индексом EU, как и по Кабату, а CH3 относится к положениям 341-447 в соответствии с индексом EU, как и по Кабату. Как показано в данном документе и описано ниже, pI-варианты могут находиться в одном или более СН-участках так же, как шарнирном участке, как обсуждается ниже.

Следует отметить, что последовательности, изображенные в данном документе, начинаются с CH1участка, положение 118; вариабельные участки не включаются, за исключением оговоренных случаев. Например, первая аминокислота SEQ ID NO: 2, когда обозначена положением 1 в перечне последовательностей, соответствует положению 118 CH1-участка в соответствии с нумерацией EU.

Другой тип Ig-домена тяжелой цепи представляет собой шарнирный участок. Шарнир, или шарнирный участок, или шарнирный участок антитела, или шарнирный участок иммуноглобулина в данном документе означает гибкий полипептид, содержащий аминокислоты между первым и вторым константными доменами антитела. Структурно CHI-домен IgG заканчивается на положении EU 220, а СН2-домен IgG начинается с остатка на положении EU 237. Таким образом, шарнир антитела для IgG в данном документе определяется как включающий положения от 221 (D221 в IgG1) до 236 (G236 в IgG1), причем нумерация соответствует индексу EU, как и по Кабату. В некоторых вариантах реализации изобретения, например, в контексте Fc-участка, включен более низкий шарнир, более низкий шарнир в целом относится к положениям 226 или 230. Как отмечается в данном документе, pI-варианты также могут быть осуществлены в шарнирном участке.

Легкая цепь, как правило, содержит два домена, вариабельный легкий домен (содержащий CDR легкой цепи и вместе с вариабельными тяжелыми доменами образующий Fv-участок) и константный участок легкой цепи (часто называемый как CL или Ск).

Другой областью интереса для дополнительных замен, описанных ниже, является область Fc.

Таким образом, в настоящем изобретении предложены различные домены антител. Как описано в данном документе и известно в данной области техники, гетеродимерные антитела по изобретению содержат различные домены в пределах тяжелых и легких цепей, которые также могут перекрываться. Эти домены включают, но не ограничиваются ими, Fc-домен, CH1-домен, СН2-домен, CH3-домен, шарнирный домен, тяжелый константный домен (СН1-шарнир-Fc-домен или СН1-шарнир-СН2-CH3), вариабельный тяжелый домен, вариабельный легкий домен, константный легкий домен, FAb домены и scFv домены.

Таким образом, Fc-домен содержит домен -СН2-СНЗ, и необязательно шарнирный домен. Тяжелая цепь содержит вариабельный тяжелый домен и константный домен, который включает CHIнеобязательный шарнир-домен Fc, содержащий СН2-СЫ3. Легкая цепь содержит вариабельную легкую цепь и константный легкий домен.

Некоторые варианты реализации изобретения включают по меньшей мере один домен scFv, который, хотя и не встречается в природе, в целом, как правило, содержит вариабельный тяжелый домен и вариабельный легкий домен, соединенные вместе scFv-линкером. Как показано в данном документе, существует ряд подходящих scFv-линкеров, которые могут быть использованы, включая традиционные пептидные связи, полученные рекомбинантными методами.

Линкерный пептид преимущественно может содержать следующие аминокислотные остатки: Gly,

- 14 037065

Ser, Ala или Thr. Линкерный пептид должен иметь длину, которая является достаточной для связывания двух молекул таким образом, чтобы они приняли правильную конформацию относительно друг друга так, чтобы они сохраняли требуемую активность. В одном варианте реализации изобретения, линкер составляет от около 1 до 50 аминокислот в длину, предпочтительно - от около 1 до 30 аминокислот в длину. В одном варианте реализации изобретения, линкер составляет от около 1 до 20 аминокислот в длину, предпочтительно - от около 5 до 10 аминокислот в длину. Пригодные линкеры включают полимеры глицина-серина, включающие, например, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n и (GGGS)n, где n представляет собой целое число, по меньшей мере единицу (и в целом, как правило, от 3 до 4), полимеры глицина-аланина, полимеры аланина-серина и другие гибкие линкеры. В альтернативном варианте могут находить применение как линкеры множества небелковых полимеров, включающих, но не ограниченных этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиалкилены или сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, которые могут находить применение в качестве линкеров.

Другие линкерные последовательности могут включать любую последовательность любой длины CL/CH1-домена, но не все остатки CL/CH1-домена; например, первые 5-12 аминокислотных остатков CL/CH1-домена. Линкеры могут быть получены из легкой цепи иммуноглобулина, например Ск или Cλ. Линкеры могут быть получены из тяжелых цепей иммуноглобулина любого изотипа, включая, например, Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, Ca1, Ca2, Cδ, Cε и Cμ. Линкерные последовательности также могут происходить из других белков, таких как Ig-подобные белки (например, TCR, FcR, KIR), происходящие из последовательностей шарнирных участков и других природных последовательностей других белков.

В некоторых вариантах реализации изобретения линкер представляет собой домен-линкер, применяемый для соединения любых двух доменов, как изложено в данном документе. В то время как может быть применен любой подходящий линкер, в многочисленных вариантах реализации изобретения применяют, например, полимер глицина-серина, включающий, например, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n и (GGGS)n, где n представляет собой целое число, по меньшей мере единицу (и в целом, как правило, от 3 до 4 до 5), а также любую пептидную последовательность, которая делает возможным рекомбинантное соединение двух областей, с достаточной длиной и гибкостью, что позволяют каждому домену сохранить свою биологическую функцию. В некоторых случаях и с уделением особого внимания цепочечности, как указано ниже, могут использоваться заряженные линкерные домены, как используется в некоторых вариантах реализации scFv-линкеров.

В некоторых вариантах реализации изобретения, scFv-линкер представляет собой заряженный scFvлинкер, некоторое количество которых показано на фиг. 33. Соответственно настоящее изобретение дополнительно относится к заряженным scFv-линкерам, чтобы облегчить разделение в pI между первым и вторым мономерами. То есть путем включения заряженного scFv-линкера, как положительного, так и отрицательного (или обоих, в случае каркасов, которые используют scFvs на разных мономерах), это позволяет мономеру, содержащему заряженный линкер, изменять pI без внесения дополнительных изменений в Fc домены. Данные заряженные линкеры могут быть заменены на любые scFv, содержащие стандартные линкеры. Опять же, как будет понятно специалистам в данной области техники, заряженные scFv-линкеры применяются на правильной цепи или мономере в соответствии с желаемыми изменениями в pI. Например, как описано в данном документе, для получения гетеродимерного антитела в форме тройного F, рассчитывают исходный pI участка Fv для каждого из желаемых антигенсвязывающих доменов, и выбирают один для получения scFv, и выбирают в зависимости от pI или положительные, или отрицательные линкеры.

Заряженные домены-линкеры также могут использоваться для увеличения разделения мономеров по pI по изобретению, и таким образом те, которые включены на фиг. 33, могут быть применены в любом варианте реализации настоящего изобретения, где используется линкер.

В некоторых вариантах реализации изобретения антитела являются полноразмерными. Полноразмерное антитело в данном документе означает структуру, которая составляет природную биологическую форму антитела, включающую вариабельные и константные участки, включающие одну или более модификаций, как описано в данном документе, в частности в доменах Fc, что делают возможным или гетеродимеризационное формирование, или очистку гетеродимеров от гомодимеров. Полноразмерные антитела в целом, как правило, содержат домены Fab и Fc, и могут дополнительно содержать дополнительные антигенсвязывающие домены, такие как scFv, как это в целом проиллюстрировано на чертежах.

В одном варианте реализации изобретения, антитело представляет собой фрагмент антитела, поскольку оно содержит по меньшей мере один константный домен, который может быть сконструирован для получения гетеродимеров таким способом, как конструирование pI. Другие фрагменты антител, которые могут применяться, включают фрагменты, содержащие один или более СН1, СН2, CH3, шарнирных и CL-доменов по данному изобретению, которые подвергли конструированию pI. Например, Fcгибриды представляют собой гибриды по Fc-участку (СН2 и CH3, необязательно с шарнирным участком), присоединенному к другому белку. Ряд Fc-гибридов известен в данной области техники и может быть усовершенствован добавлением гетеродимеризационных вариантов по данному изобретению. В данном случае, могут быть получены гибриды антител, содержащие CH1; CH1, CH2 и CH3; СН2; CH3;

- 15 037065

СН2 и CH3; СН1 и CH3, любой из которых или все необязательно могут быть получены с шарнирным участком, используя любую комбинацию гетеродимеризационных вариантов, описанную в данном документе.

В частности, формы, изображенные на фиг. 1, представляют собой антитела, как правило, называемые гетеродимерными антителами, а это означает, что белок имеет по меньшей мере две соответствующие Fc-последовательности, самособранные в гетеродимерный домен Fc.

Химерные и гуманизированные антитела.

В некоторых вариантах реализации изобретения, антитела могут быть смесью из разных видов, например химерного антитела и/или гуманизированного антитела. В целом, как химерные антитела, так и гуманизированные антитела относятся к антителам, в которых комбинируются участки из более чем одного вида. Например, химерные антитела традиционно содержат вариабельный(е) участок(ки) из организма мыши (или, в некоторых случаях, крысы) и константный(е) участок(ки) из организма человека. Гуманизированное антитело, как правило, относится к нечеловеческим антителам, которые имеют каркасные участки вариабельного домена, замененные на последовательности, обнаруженные в антителах человека. Как правило, в гуманизированном антителе целое антитело, за исключением CDR, кодируется полинуклеотидом человеческого происхождения или является идентичным такому антителу, за исключением внутренней части его CDR. CDR, некоторые из которых или все кодируются нуклеиновыми кислотами, происходящими из нечеловеческого организма, прививают на каркас бета-листа вариабельного участка антитела человека для создания антитела, специфичность которого определяется привитыми CDR. Создание таких антител описано, например, в WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536, все включены в полном объеме посредством ссылки. Обратная мутация выбранных остатков акцепторного каркаса на соответствующие донорские остатки часто требуется для восстановления аффинности, которая потеряна в начальной привитой конструкции (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213, все включены в полном объеме посредством ссылки). Гуманизированное антитело также оптимально будет содержать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина, обычно из иммуноглобулина человека, и поэтому будет, как правило, содержать Fc-участок человека.

Гуманизированные антитела могут быть также получены с использованием мышей с генетически модифицированной иммунной системой. Роке и др., 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639-654, включено в полном объеме посредством ссылки. Множество техник и способов гуманизации и реконструирования нечеловеческих антител хорошо известны в данной области техники (см. Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of В Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), и ссылки, цитируемые здесь, все включены в полном объеме посредством ссылки). Способы гуманизации включают, но не ограничиваются лишь этими: способы, описанные в Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8, все включены в полном объеме посредством ссылки. Гуманизация или другие способы снижения иммуногенности вариабельных участков нечеловеческих антител могут включать способы реконструирования, как описано, например, в Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973, включена в полном объеме посредством ссылки. В одном варианте реализации изобретения, первичное антитело было аффинно созревшим, как известно в данной области техники. Для гуманизации и аффинного созревания могут применяться способы, основанные на изменении структуры, например, как описано в USSN 11/004590. Для гуманизации и/или аффинного созревания вариабельных участков антител могут применяться способы, основанные на отборе, включающие, но не ограниченные ими, способы, описанные в Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759, все включены в полном объеме посредством ссылки. Другие способы гуманизации могут вовлекать прививание лишь частей CDR, включая, но не ограничиваясь лишь этими: способы, описанные в USSN 09/810510; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084, все включены в полном объеме посредством ссылки.

IV. Гетеродимерные антитела.

Соответственно в некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к гетеродимерным антителам, что основаны на применении двух различных вариантов Fc-доменов тяжелой цепи, которые будут самособираться с формированием гетеродимерных антител.

Настоящее изобретение относится к новым конструкциям для получения гетеродимерных антител, которые делают возможным связывание с более чем одним антигеном или лигандом, например делают возможным биспецифическое связывание. Конструкции гетеродимерных антител основаны на их способности самосборки двух Fc-доменов тяжелых цепей антител, например двух мономеров, которые собираются в димер. Гетеродимерные антитела получают путем изменения аминокислотной последовательности каждого мономера, как более подробно описано ниже. Так, настоящее изобретение в целом

- 16 037065 направлено на создание гетеродимерных антител, которые могут совместно захватывать антигены несколькими путями, основанными на аминокислотных вариантах в константных участках, которые различаются на каждой цепи для облегчения гетеродимерного образования, и/или позволяют облегчить очистку гетеродимеров от гомодимеров.

Таким образом, в настоящем изобретении предложены биспецифические антитела. Существующая проблема в технологиях получения антител заключается в требовании получения биспецифических (и/или мультиспецифических) антител, которые связываются с двумя (или более) разными антигенами одновременно, как правило, позволяя, таким образом, разным антигенам сближаться и приводя к получению нового функционирования и новым видам терапии. Как правило, эти антитела получают посредством введения генов каждой тяжелой и легкой цепи в клетки-хозяева. В целом, как правило, это приводит к образованию требуемого гетеродимера (А-В), а также двух гомодимеров (А-А и В-В (не включая гетеродимерные ограничения легкой цепи)). Однако основное препятствие для образования биспецифических антител заключается в трудности очистки гетеродимерных антител от гомодимерных антител и/или смещения образования димеров в направлении преобладания гетеродимеров над гомодимерами.

Существует ряд механизмов, которые могут применяться для получения гетеродимеров по настоящему изобретению. В дополнение к этому, как ясно специалистам в данной области техники, эти механизмы могут комбинироваться для обеспечения высокой гетеродимеризации. Таким образом, аминокислотные варианты, которые приводят к получению гетеродимеров, упоминаются как гетеродимеризационные варианты. Как описано ниже, гетеродимеризационные варианты могут включать в себя стерические варианты (например, выпуклости и углубление (knobs and holes) или ассиметричные варианты, описанные ниже, и варианты заряженные пары (charge pairs) описаны ниже), а также pIварианты, что делают возможной очистку гомодимеров от гетеродимеров. Как в целом описано в WO 2014/145806, включенном в данный документ посредством ссылки в полном объеме, и как, в частности, описано ниже для обсуждения гетеродимеризационных вариантов, полезные способы для гетеродимеризации включают: выпуклости и углубление (ВИВ (KIH), иногда в данном документе ассиметричные варианты, (см. обсуждение в WO 2014/145806), электростатическое ориентирование или заряженные пары, как описано в WO 2014/45806, pI-варианты, как описано в WO 2014/145806, и общие дополнительные Fc-варианты, как описано в WO 2014/145806 и ниже.

В настоящем изобретении существует несколько основных механизмов, которые приводят к облегчению очистки гетеродимерных антител; один основан на применении pI-вариантов, так что каждый мономер имеет отличающуюся pI, таким образом позволяя проводить изоэлектрическую очистку димерных белков А-А, А-В и В-В. В альтернативном варианте, некоторые формы каркасных структур, такие как тройная F форма, позволяют проводить разделение на основании размера. Как дополнительно отмечено ниже, также можно сделать ассиметричным образование гетеродимеров относительно гомодимеров. Таким образом, комбинация стерических гетеродимеризационных вариантов и pI-вариантов или вариантов заряженных пар находит конкретное применение в данном изобретении.

В целом, как правило, разновидности реализации изобретения для конкретного применения в настоящем изобретении основаны на наборах вариантов, которые включают в себя ассиметричные варианты, что стимулируют гетеродимеризационное формирование относительно гетеродимеризационного формирования в сочетании с вариантами pI, которые увеличивают разность pI между двумя мономерами.

Кроме того, как более подробно описано ниже, в зависимости от формы гетеродимерного антитела, pI-варианты могут быть таковыми что, или содержатся в константных и/или Fc доменах мономера, или в заряженных линкерах, или могут быть использованы линкеры-домены или scFv-линкеры. То есть каркасы, которые используют scFv, такие как форма тройная F, могут содержать заряженные scFv-линкеры (или положительные, или отрицательные), которые дают дополнительное изменение pI для целей очистки.

Специалистам в данной области ясно, что некоторые тройные F-формы являются подходящими только с заряженными scFv-линкерами и без дополнительных корректировок pI, тем не менее, в данном изобретении также предложены pI-варианты, которые присутствуют на одном или обоих мономерах, и\или также заряженных доменах-линкерах. К тому же, дополнительное аминокислотное конструирование для предоставления альтернативных функциональных возможностей может также обеспечивать изменения pI, таких как варианты Fc, FcRn и KO.

В настоящем изобретении, в котором применяется pI в качестве механизма, что позволяет очищать гетеродимерные белки, могут вводиться аминокислотные варианты в один или оба мономерных полипептида; а именно pI одного из мономеров (названного в данном документе для простоты мономер А) может быть сконструировано отдельно от мономера В, или может быть изменен заряд обоих мономеров А и В с увеличением pI мономера А и уменьшением pI мономера В. Как полнее описано ниже, изменить pI как одного, так и обоих мономеров можно путем удаления или добавления заряженного остатка (например, нейтральная аминокислота заменяется положительно или отрицательно заряженным аминокислотным остатком, например глицин на глутаминовую кислоту), изменения заряженного остатка с положительного или отрицательного на остаток с противоположным зарядом (аспарагиновая кислота на лизин) или изменения заряженного остатка на нейтральный остаток (например, потеря заряда; лизин на

- 17 037065 серии). Ряд этих вариантов показан на чертежах.

Соответственно в этом варианте реализации настоящего изобретения предложено создание достаточного изменения pI по меньшей мере в одном из мономеров так, чтобы гетеродимеры можно было отделять от гомодимеров. Как ясно специалистам в данной области и как дополнительно обсуждается ниже, это можно осуществить применением дикого типа константного участка тяжелой цепи и вариантного участка, который был сконструирован как с увеличением, так и с уменьшением его pI (дт А-+В или дт А - -В), либо увеличением для одного участка или уменьшением для другого участка (А+ -В- или АВ+).

Таким образом, в целом, компонент некоторых вариантов реализации изобретения по настоящему изобретению представлен аминокислотными вариантами в константных участках антител, которые направлены на изменение изоэлектрической точки (pI) по меньшей мере одного, если не обоих, мономеров димерного белка для образования pI-антител введением аминокислотных замен (pI-варианты или pIзамены) в один или оба мономера. Как показано в данном документе, отделение гетеродимеров от двух гомодимеров может осуществляться, если pI двух мономеров отличаются всего лишь на 0,1 единицу рН, все данные со значениями 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 или больше используются в настоящем изобретении.

Специалистам в данной области ясно, что количество pI-вариантов, включаемых в каждый или оба мономера для достижения надлежащего разделения, будет зависеть, в частности, от исходной pI компонентов, например в форме тройного F, исходного pI представляющих интерес scFv и Fab. Иными словами, для определения того, какой мономер следует конструировать или в каком направлении изменять (например, делать более положительным или более отрицательным), рассчитывают последовательности Fv двух антигенов-мишеней и на основе этого принимают решение. Как известно в данной области техники, разные Fv будут иметь разные исходные pI, которые используются в настоящем изобретении. В целом, как отмечается в данном документе, pI конструируют для получения общей разности pI каждого мономера по меньшей мере около 0,1 log с предпочтением от 0,2 до 0,5, как описано в данном документе.

Кроме того, как ясно специалистам в данной области техники и как описано в данном документе, в некоторых вариантах реализации изобретения, гетеродимеры могут быть отделены от гомодимеров на основе размера. Как показано, например, на фиг. 1, некоторые из форм позволяют разделять гетеродимеры и гомодимеры на основе размера.

В случае, когда для достижения гетеродимеризации применяются pI-варианты, предложен более модульный подход для разработки и очистки биспецифических белков, включая антитела, путем использования константного участка(ов) тяжелой цепи(ей). Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения, гетеродимеризационные варианты (включая ассиметричные варианты и гетеродимеризационные варианты для очистки) не включают в вариабельные участки, так что должно конструироваться каждое отдельное антитело. В дополнение к этому, в некоторых вариантах реализации изобретения возможность иммуногенности, возникающая вследствие pI-вариантов, значительно снижается импортированием pI-вариантов из разных изотипов IgG, так что pI изменяется без возникновения значительной иммуногенности. Таким образом, дополнительная проблема, требующая разрешения, заключается в установлении константных доменов с низкой pI и с высоким содержанием последовательностей человека, например минимизацией или избеганием в любом конкретном положении остатков нечеловеческой последовательности.

Побочное преимущество, возможное при данном конструировании pI, также заключается в продлении периода полувыведения из сыворотки и увеличении связывания FcRn. Иными словами, как описано в USSN 13/194904 (включен в полном объеме посредством ссылки), снижение pI константных доменов антител (включая обнаруженные в антителах и Fc-гибридах) может привести к продлению удержания в сыворотке in vivo. Эти pI-варианты для увеличения периода полувыведения из сыворотки также облегчают введение изменений pI для очистки.

Кроме того, следует отметить, что варианты pI-варианты гетеродимеризационных вариантов дают дополнительное преимущество для аналитики и процесса контроля качества биспецифических антител, поскольку возможность или устранять, минимизировать и различать присутствие гомодимеров, является значительным преимуществом. Точно так же важна возможность надежно тестировать воспроизводимость продуцирования гетеродимерных антител.

Гетеродимеризационные варианты.

В настоящем изобретении предложены гетеродимерные белки, включая гетеродимерные антитела во множестве форм, которые используют гетеродимерные варианты, позволяющие формирование и/или очистку гетеродимеров от гомодимеров.

Существует несколько подходящих пар наборов ассиметричных вариантов гетеродимеризации. Эти варианты предложены в виде пар наборов. То есть один набор пары помещают в первый мономер, а другой набор пары помещают во второй мономер. Следует отметить, что эти наборы не обязательно взаимодействуют как варианты выпуклость и впуклость, с соответствием один-к-одному между остатком на одном мономере и остатком на другом; то есть эти пары наборов образуют интерфейс между двумя мономерами, что способствует образованию гетеродимера и препятствует образованию гомодимера, позволяя проценту гетеродимеров, которые самопроизвольно образуют в биологических условиях, превы

- 18 037065 шать 90%, нежели составлять ожидаемые 50% (25% гомодимер А/А:50% гетеродимер А/В:25% гомодимер В/В).

Стерические варианты.

В некоторых вариантах реализации изобретения образование гетеродимеров может облегчаться добавлением стерических вариантов. Иными словами, путем изменения аминокислот в каждой тяжелой цепи, разные тяжелые цепи с большей вероятностью ассоциируют с образованием гетеродимерной структуры, чем с образованием гомодимеров с одинаковыми аминокислотными Fcпоследовательностями. Подходящие стерические варианты приведены на фиг. 29.

Один механизм, обычно называемый в данной области техники как выпуклости и углубления, относится к аминокислотному конструированию, которое создает стерические факторы для благоприятствования гетеродимерному образованию, а также необязательно может использоваться для препятствования гомодимерному образованию; эти факторы иногда называются как выпуклости и углубления, как описано в UsSn 61/596846, Ridgway et al., Protein Engineering 9(7):617 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol. 1997 270:26; патент США № 8216805, все они включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Чертежи идентифицируют ряд пар мономер А - мономер В, которые основаны на механизме выпуклости и углубления. В дополнение к этому, как описано в Merchant et al., Biotech. 16:677 (1998), эти мутации выпуклости и углубления могут комбинироваться с дисульфидными связями для смещения образования в направлении гетеродимеризации.

Дополнительный механизм, который находит применение для получения гетеродимеров, иногда называется электростатическое ориентирование, как описано в Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010), включенной в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Этот механизм иногда называется в данном документе заряженные пары. В этом варианте реализации изобретения, электростатические взаимодействия применяются для смещения образования в сторону гетеродимеризации. Специалистам в данной области техники ясно, что эти взаимодействия могут влиять на pI и, таким образом, на очистку, и поэтому в некоторых случаях также могут считаться pI-вариантами. Но поскольку эти пары создавались для принудительной гетеродимеризации и не использовались как средства для очистки, то они классифицируются как стерические варианты. Они включают, но не ограничиваются лишь этими: D221E/P228E/L368E спаренные с D221R/P228R/K409R (например, они являются соответствующими наборами мономеров), и С220Е/Р228Е/368Е спаренные с C220R/E224R/P228R/K409R.

Дополнительные варианты мономера А и мономера В могут комбинироваться с другими вариантами необязательно и независимо в любом количестве, такие как pI-варианты, отмеченные в данном документе, или другие стерические варианты, как показано на фиг. 37 заявки США 2012/0149876, чертеж и условные обозначения и SEQ ID NO которой включены в данный документ явным образом посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации изобретения, стерические варианты, описанные в данном документе, могут необязательно и независимо включаться с любым pI вариантом (или другими вариантами, такими как Fc-варианты, FcRn-варианты, и т.д.) в один или оба мономера, и могут быть независимо и необязательно включенными или исключенными из белков по изобретению.

Перечень подходящих ассиметричных вариантов может быть найден на фиг. 29, с фиг. 34, что иллюстрируют некоторые пары особенно полезных вариантов во многих вариантах реализации изобретения. Особо полезными во многих вариантах реализации изобретения являются пары наборов, включающие, но не ограниченные лишь этими: S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L и K370S: S364K/E357Q. С точки зрения номенклатуры, пара S364K/E357Q: L368D/K370S означает, что один из мономеров имеет двойной вариант набора S364K/E357Q, а другой имеет двойной вариант набора L368D/K370S.

Варианты по pI (изоэлектрическая точка) для гетеродимеров.

В целом, как ясно специалистам в данной области техники, существует две общие категории pIвариантов: те, которые увеличивают pI белка (основные изменения), и те, которые снижают pI белка (кислотные изменения). Как описано в данном документе, все комбинации этих вариантов могут быть произведены одним мономером, который может быть диким типом, или вариантом, который не проявляет значительно отличающуюся от дикого типа pI, и другим, который может быть более основным или более кислотным. В альтернативном варианте, изменяется каждый мономер, один - в сторону большей основности, а другой - в сторону большей кислотности.

Предпочтительные комбинации pI-вариантов показаны на фиг. 30. Как описано в данном документе и показано на чертежах, эти изменения показаны относительно IgG1, но таким образом могут изменяться все изотипы, а также изотипные гибриды. В случае, когда константный домен тяжелой цепи получен из IgG2-4, могут также использоваться замены R133E и R133Q.

Варианты легкой цепи гетеродимеров антител.

В случае антитела на основе гетеродимеров, например, когда по меньшей мере один из мономеров содержит легкую цепь в дополнение к домену тяжелой цепи, то в легкой цепи также могут быть созданы pI-варианты. Аминокислотные замены для снижения pI легкой цепи включают, но не ограничиваются

- 19 037065 лишь этими: К126Е, K126Q, К145Е, K145Q, N152D, S156E, К169Е, S202E, К207Е и добавление пептида DEDE на с-конце легкой цепи. Изменения в этой категории, основанные на константной легкой цепи лямбда, включают одну или более замен R108Q, Q124E, K126Q, N138D, К145Т и Q199E. В дополнение к этому также может быть осуществлено увеличение pI легких цепей.

Изотипические варианты.

В дополнение к этому, многие варианты реализации изобретения по данному изобретению основываются на импортировании pI-аминокислот в конкретные положения из одного изотипа IgG в другой, тем самым снижая или устраняя возможность нежелательной иммуногенности, вводимой в варианты. Некоторое их количество показано на фиг. 21 публикации США 2014/0370013, включенной в данный документ посредством ссылки. Иными словами, IgG1 является обычным изотипом для терапевтических антител по множеству причин, включающих высокую эффекторную функцию. Однако тяжелый константный участок IgG1 имеет более высокую pI, чем такой участок IgG2 (8,10 против 7,31). Вследствие введения остатков IgG2 в конкретные положения в скелете IgG1, pI результирующего мономера снижается (или увеличивается) и дополнительно демонстрирует более длительный период полувыведения из сыворотки. Например, IgG1 содержит глицин (pI 5,97) в положении 137, a IgG2 содержит глутаминовую кислоту (pI 3,22); импортирование глутаминовой кислоты будет влиять на pI результирующего белка. Как описано ниже, некоторое количество аминокислотных замен обычно требуется для значительного влияния на pI вариантного антитела. Однако следует отметить, что, как обсуждается ниже, для увеличенного периода полувыведения из сыворотки допустимы даже изменения в молекулах IgG2.

В других вариантах реализации изобретения создаются неизотипические аминокислотные замены как для снижения общего уровня заряда результирующего белка (например, путем изменения аминокислоты с большей pI на аминокислоту с меньшей pI), так и для обеспечения стабильности согласованиями в структуре и т.п., как подробнее описано ниже.

В дополнение к этому, с помощью конструирования pI как тяжелых, так и легких константных доменов могут быть обнаружены значительные изменения в каждом мономере гетеродимера. Как обсуждается в данном документе, изменение pI двух мономеров по меньшей мере на 0,5 может обеспечить разделение ионообменной хроматографией или изоэлектрическим фокусированием, или другими методами, чувствительными к изоэлектрической точке.

Расчет pI.

Значение pI каждого мономера может зависеть от pI константного домена вариантной тяжелой цепи и pI всего мономера, включающего константный домен вариантной тяжелой цепи и партнера слияния. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения изменение pI рассчитывается на основе константного домена вариантной тяжелой цепи с использованием схемы на фиг. 19 публикации США 2014/0370013. Как обсуждалось в данном документе, выбор подлежащего конструированию мономера в целом, как правило, определяется изначальным pI участков Fv и каркаса. В альтернативном варианте может сравниваться pI каждого мономера.

pI-варианты, которые также придают лучшее связывание FcRn in vivo.

В случае, когда pI-варианты снижают pI мономера, они могут обладать дополнительным преимуществом улучшенного удержания в сыворотке in vivo.

Хотя это явление еще изучается, считается, что Fc-участки обладают более длительными периодами полувыведения in vivo, Fc секвестируется по причине связывания с FcRn при рН 6 в эндосоме (Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598, включена в полном объеме посредством ссылки). Затем эндосомальный компартмент осуществляет рециклинг Fc на поверхность клетки. Как только компартмент открывается во внеклеточное пространство, более высокое рН ~7,4, индуцирует высвобождение Fc обратно в кровь. На мышах Dall' Acqua et al. показали, что Fc-мутанты с увеличенным связыванием FcRn при рН 6 и рН 7,4 действительно имели пониженные концентрации в сыворотке и такой же период полувыведения, как и Fc дикого типа (Dall' Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180, включена в полном объеме посредством ссылки). Предполагается, что увеличенная аффинность Fc для FcRn при рН 7,4 препятствует высвобождению Fc обратно в кровь. Следовательно, Fc-мутации, которые будут увеличивать период полувыведения Fc in vivo, теоретически будут увеличивать связывание FcRn при более низком рН, в то же время еще обеспечивая высвобождение Fc при более высокой рН. Аминокислота гистидин изменяет состояние заряда в диапазоне рН от 6,0 до 7,4. Следовательно, неудивительно, что остатки His обнаруживаются в комплексе Fc/FcRn в важных положениях.

Недавно предположили, что антитела с вариабельными участками, которые имеют более низкие изоэлектрические точки, также могут обладать более длительными периодами выведения из сыворотки (Igawa et al., 2010 PEDS. 23 (5):385-392, полностью включены в качестве ссылки). Тем не менее, механизм этого явления все еще остается малопонятным. Более того, вариабельные участки отличаются от антитела к антителу. Варианты с константными участками с пониженной pI и расширенным периодом полувыведения могли бы обеспечивать более модульный подход для улучшения фармакокинетических свойств антител, как описано в данном документе.

Дополнительные Fc-варианты для получения дополнительной функциональности.

В дополнение к аминокислотным pI-вариантам существует ряд полезных аминокислотных Fc

- 20 037065 модификаций, которые могут осуществляться по множеству причин, включая, но не ограничиваясь этим, изменение связывания с одним или более рецепторами FcyR, измененное связывание с рецепторами FcRn и т.п.

Соответственно белки по данному изобретению могут включать аминокислотные модификации, включающие гетеродимеризационные варианты, описанные в данном документе, которые включают pIварианты и стерические варианты. Каждый набор вариантов может быть независимо и необязательно включен или исключен из какого-либо конкретного гетеродимерного белка.

Варианты FcyR.

Соответственно существует ряд полезных Fc-замен, которые могут осуществляться для изменения связывания с одним или более рецепторами FcyR. Могут быть полезными замены, которые приводят к увеличенному связыванию, а также к уменьшенному связыванию. Например, известно, что увеличенное связывание с FcYRIIIa, как правило, приводит к уменьшенной АЗКЦ (антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности; клеточноопосредованной реакции, при которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcyR, распознают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают лизис клетки-мишени). Аналогичным образом, при некоторых обстоятельствах также может быть выгодным уменьшенное связывание с FcYRIIb (ингибирующий рецептор). Аминокислотные замены, которые находят применение в настоящем изобретении, включают перечисленные в USSN 11/124620 (особенно фиг. 41), 11/174287, 11/396495, 11/538406, все они явным образом включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки и исключительно для описанных здесь вариантов. Конкретные варианты, которые находят применение, включают, но не ограничиваются лишь этими: 236А, 239D, 239Е, 332Е, 332D, 239D/332E, 267D, 267Е, 328F, 267E/328F, 236А/332Е, 239D/332E/330Y, 239D, 332E/330L, 243А, 243L, 264А, 264V и 299Т.

В дополнение к этому, существуют дополнительные Fc-замены, которые находят применение для увеличения связывания с рецептором FcR и уменьшения периода полувыведения из сыворотки, как конкретно описано в USSN 12/341769, включенном в данный документ в полном объеме посредством ссылки, включая, но не ограничиваясь лишь этими: 434S, 434А, 428L, 308F, 259I, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 436I или V/434S, 436V/428L и 259I/308F/428L.

Абляционные Fc-варианты.

Аналогичным образом, другая категория функциональных вариантов представлена FcyRабляционными вариантами или Fc-нокаут (FcHO или НО) вариантами. В этих вариантах реализации изобретения для некоторых терапевтических применений требуется снижать или исключать нормальное связывание Fc-домена с одним или всеми рецепторами Fcy (например, FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa и т.п.) для избегания дополнительных механизмов действия. То есть, например, во многих вариантах реализации данного изобретения, в частности, в применении биспецифических антител, которые связываются моновалентно с CD3, в целом, как правило, желательно аблировать связывание FcYRIIIa, чтобы устранить или значительно уменьшить АЗКЦ активность, причем один из доменов Fc содержит один или более абляционных вариантов рецептора Fcy. Эти абляционные варианты изображены на фиг. 31, и каждый из них может быть независимо и необязательно включен или исключен, причем предпочтительные аспекты используют варианты абляции, выбранные из группы, состоящей из

G236R/L328R, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K,

E233P/L234V/L235A/G236del/S267K,

E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G,

E2 33P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G и

E233P/L234V/L235A/G236del.

Следует отметить, что абляционные варианты, упоминаемые в данном документе, аблируют связывание FcyR, но в целом, как правило, не связывание FcRn.

Комбинация гетеродимерных вариантов и Fc-вариантов.

Специалистам в данной области техники ясно, что все перечисленные гетеродимеризационные варианты (включая ассиметричные и/или pI-варианты) могут необязательно и независимо комбинироваться любым путем, поскольку они могут сохранять свою цепочечность или мономерную часть. В дополнение к этому, все эти варианты могут комбинироваться в любую гетеродимеризационную форму.

В случае pI-вариантов, в то время как варианты реализации изобретения находят конкретное применение, показанное на чертежах, могут быть получены другие комбинации, следуя основному правилу изменения разницы pI между двумя мономерами для облегчения очистки.

Кроме того, любой из гетеродимеризационных вариантов, ассиметричных и pI, также независимо и необязательно комбинируются с абляционными Fc-вариантами, Fc-вариантами, FcRn-вариантами, как в целом описано в настоящем документе.

Полезные формы по изобретению

Как ясно специалистам в данной области техники и обсуждается полнее ниже, гетеродимерные гибридные белки по настоящему изобретению принимают ряд многочисленных конфигураций как показано на фиг. 1. Некоторые чертежи иллюстрируют одноконцевые конфигурации, причем в наличии один

- 21 037065 тип специфичности на одном плече молекулы и другой тип специфичности на другом плече. Другие чертежи иллюстрируют двоконцевые конфигурации, причем в наличии по меньшей мере один тип специфичности в верхней части молекулы, и одна или больше различных специфичностей в нижней части молекулы. Таким образом, настоящее изобретение относится к новым иммуноглобулиновым композициям, которые совместно захватывают разные первый и второй антиген.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, гетеродимерные формы по изобретению могут иметь различные валентности, а также быть биспецифичными. То есть гетеродимерные антитела по изобретению могут быть бивалентными и биспецифическими, причем CD3 связывается одним связывающим доменом и CD38 связывается вторым связывающим доменом. Гетеродимерные антитела также могут быть тривалентными и биспецифическими, причем CD38 связывается двумя связывающим доменом и CD3 связывается вторым связывающим доменом. Как указано в данном документе, предпочтительно, чтобы CD3 связывался только моновалентно, чтобы уменьшить возможные побочные эффекты.

В настоящем изобретении применяют анти-CD3 антиген-связывающие домены и анти-CD38 антиген-связывающие домены. Как будет понятно специалистам в данной области техники, может быть использована любая совокупность CDR анти-CD3, анти-CD3 вариабельных легких доменов и анти-CD3 вариабельных тяжелых доменов, Fabs и scFvs, как показано на любом чертеже (см., в частности, фиг. 2-7 и фиг. 68). Аналогично, может быть использован любой из антиген-связывающих доменов анти-CD38, будь то CDR анти-CD38, анти-CD38 вариабельных легких доменов и анти-CD38 вариабельных тяжелых доменов, Fabs и scFvs, как показано на любой из фиг. (см., фиг. 8, 9 и 10), необязательно и независимо скомбинированы в любую комбинацию.

Форма бутылкооткрыватель.

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в настоящем изобретении, представляет собой форму тройная F, или бутылкооткрыватель, как показано на фиг. 1А и 1В. В этом варианте реализации данного изобретения одна тяжелая цепь антитела содержит одну цепь Fv (scFv, как определено ниже), а другая тяжелая цепь, представляет собой обычную FAb-форму, содержащую вариабельную тяжелую и легкую цепи. Эта структура в данном документе иногда называется формой тройная F (scFv-FAb-Fc) или формой бутылкооткрыватель из-за некоторого визуального сходства с бутылкооткрывателем (см. фиг. 1). Две цепи являются сведенными вместе благодаря применению аминокислотных вариантов в константных участках (например, Fc-домене, СН1 домене и/или шарнирном домене), что облегчает образование гетеродимерных антител, как полнее описано ниже.

Существует несколько различных преимуществ данной формы тройная F. Как известно в данной области техники, аналоги антител, основанные на двух scFv-конструкциях, часто имеют сложности со стабильностью и агрегацией, которые могут быть уменьшены в настоящем изобретении путем добавления обычного подбора пар тяжелых и легких цепей. В дополнение к этому, в противоположность формам, которые основаны на двух тяжелых цепях и двух легких цепях, здесь не возникает проблемы с неправильным спариванием тяжелых и легких цепей (например, тяжелая 1 спаривается с легкой 2 и т.д.).

Многие из вариантов реализации изобретения, описанные в данном документе, полагаются в целом, как правило, на форму бутылкооткрыватель, что содержит первый мономер, содержащий scFv, содержащий вариабельный тяжелый и вариабельный легкий домен, ковалентно прикрепленный с применением линкера scFv (заряженный, во многих случаях), причем scFv ковалентно присоединен к N-концу первого домена Fc, как правило, через домен-линкер (который, как указано в данном документе, может быть или незаряженным или заряженным). Второй мономер формы бутылкооткрыватель является тяжелой цепью, и композиция дополнительно содержит легкую цепь.

В целом, как правило, во многих предпочтительных вариантах реализации изобретения scFv является доменом, который связывается с CD3, с Fab тяжелых и легких цепей, связывающийся с CD38. В дополнение к этому, домены Fc по настоящему изобретению в целом, как правило, содержат ассиметричные варианты (например, набор аминокислотных замен, как показано на фиг. 29 и 34, в частности, особенно полезны ассиметричные варианты, выбранные из группы, состоящей из S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L и K370S: S364K/E357Q), необязательно абляционные варианты, а также тяжелую цепь, содержащую pI варианты.

В настоящем изобретении предложены формы по типу бутылкооткрывателя, где последовательности анти-CD3 scFv являются такими, как показанные на фиг. 2-7 и фиг. 68.

В настоящем изобретении предложены формы по типу бутылкооткрывателя, причем последовательности анти-CD38 являются такими, как показанные на фиг. 8-10.

Форма mAb-Fv.

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в настоящем изобретении, представляет собой форму mAb-Fv, показанную на фиг. 1. В этом варианте реализации данного изобретения форма основана на применении С-концевого присоединения добавочного вариабельного тяжелого домена к одному мономеру, и С-концевого присоединения добавочного вариабельного легкого домена к другому мономеру, таким образом формируя третий антиген-связывающий домен, причем части

- 22 037065

Fab двух мономеров связывают CD38 и добавочный домен scFv связывает CD3.

В данном варианте реализации изобретения первый мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный тяжелый домен и первый константный тяжелый домен, содержащий первый домен Fc, с первым вариабельным легким доменом, ковалентно присоединенным к С-концу первого домена Fc с применением домена-линкера. Второй мономер содержит второй вариабельный тяжелый домен второго константного тяжелого домена, содержащего второй домен Fc, и третий вариабельный тяжелый домен, ковалентно присоединенный к С-концу второго домена Fc с применением доменалинкера. Два С-терминальных прикрепленных вариабельных домена формируют scFv, который связывает CD3. Данный вариант реализация изобретения дополнительно использует общую легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен, которая объединяется с тяжелыми цепями с образованием двух идентичных Fab, которые связывают CD38. Что же касается многих вариантов реализации изобретения в данном документе, эти конструкции включают в себя ассиметричные варианты, pI-варианты, абляционные варианты, дополнительные варианты Fc, и т.д., как желаемо и описано в данном документе.

В настоящем изобретении предложены формы mAb-Fv, в которых последовательности анти-CD3 scFv представляют собой те, что показаны на фиг. 2-7.

В настоящем изобретении предложены формы mAb-Fv, причем последовательности анти-CD38 представляют собой те, что показаны на фиг. 8-10.

В настоящем изобретении предложены формы mAb-Fv, содержащие абляционные варианты, как показано на фиг. 31.

В настоящем изобретении предложены формы mAb-Fv, содержащие ассиметричные варианты, как показано на фиг. 29 и 34.

mAb-scFv.

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в настоящем изобретении, представляет собой форму mAb-Fv, показанную на фиг. 1. В этом варианте реализации данного изобретения, форма основана на применении С-концевого присоединения scFv к одному мономеру, таким образом формируя третий антиген-связывающий домен, причем части Fab двух мономеров связывают CD38 и добавочный домен scFv связывает CD3. Таким образом, первый мономер содержит первую тяжелую цепь (содержащую вариабельный тяжелый домен и константный домен) с С-терминально ковалентно присоединенным scFv, содержащим вариабельный легкий домен scFv, линкер scFv и вариабельный тяжелый домен scFv. Данный вариант реализация изобретения дополнительно использует общую легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен, которая объединяется с тяжелыми цепями с образованием двух идентичных Fab, которые связывают CD38. Что же касается многих вариантов реализации изобретения в данном документе, эти конструкции включают в себя ассиметричные варианты, pI-варианты, абляционные варианты, дополнительные варианты Fc, и т.д., как желаемо и описано в данном документе.

В настоящем изобретении предложены формы mAb-scFv, в которых последовательности анти-CD3 scFv представляют собой те, что показаны на фиг. 2-7.

В настоящем изобретении предложены формы mAb-scFv, причем последовательности анти-CD38 представляют собой те, что показаны на фиг. 8-10.

В настоящем изобретении предложены формы mAb-scFv, содержащие абляционные варианты, как показано на фиг. 31.

В настоящем изобретении предложены формы mAb-scFv, содержащие ассиметричные варианты, как показано на фиг. 29 и 34.

Central scFv.

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в настоящем изобретении, представляет собой форму Central-scFv, показанную на фиг. 1. В этом варианте реализации данного изобретения, форма основана на применении вставленного домена scFv, таким образом формируя третий антиген-связывающий домен, причем части Fab двух мономеров связывают CD38 и добавочный домен scFv связывает CD3. Домен scFv вставляют между доменом Fc и участком CH1-Fv одного из мономеров, таким образом получая третий антиген-связывающий домен.

В этом варианте реализации данного изобретения первый мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный тяжелый домен, домен СН1 и Fc, с scFv, содержащим вариабельный легкий домен scFv, линкер scFv и вариабельный тяжелый домен scFv. scFv ковалентно присоединен между С-концом домена СН1 тяжелого константного домена и N-концом первого домена Fc с использованием доменов-линкеров. Данный вариант реализация изобретения дополнительно использует общую легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен, которая объединяется с тяжелыми цепями с образованием двух идентичных Fab, которые связывают CD38. Что же касается многих вариантов реализации изобретения в данном документе, эти конструкции включают в себя ассиметричные варианты, pI-варианты, абляционные варианты, дополнительные варианты Fc, и т.д., как желаемо и описано в данном документе.

В настоящем изобретении предложены формы Central-scFv, в которых последовательности анти- 23 037065

CD3 scFv представляют собой те, что показаны на фиг. 2-7.

В настоящем изобретении предложены формы Central-scFv, причем последовательности анти-CD38 представляют собой те, что показаны на фиг. 8-10.

В настоящем изобретении предложены формы Central-scFv, содержащие абляционные варианты, как показано на фиг. 31.

В настоящем изобретении предложены формы Central-scFv, содержащие ассиметричные варианты, как показано на фиг. 29 и 34.

Форма Central-Fv.

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в настоящем изобретении, представляет собой форму Central-Fv, показанную на фиг. 1. В этом варианте реализации данного изобретения, форма основана на применении вставленного домена scFv, таким образом формируя третий антиген-связывающий домен, причем части Fab двух мономеров связывают CD38 и добавочный домен scFv связывает CD3. Домен scFv вставляют между доменом Fc и участком CH1-Fv одного из мономеров, таким образом получая третий антиген-связывающий домен, причем каждый мономер содержит компонент scFv (например, один мономер содержит вариабельный тяжелый домен и другой вариабельный легкий домен).

В этом варианте реализации данного изобретения, один мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный тяжелый домен, домен СН1 и домен Fc, и дополнительный вариабельный легкий домен. Легкий домен ковалентно присоединен между С-концом домена СН1 тяжелого константного домена и N-концом первого домена Fc с использованием доменов-линкеров. Другой мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный тяжелый домен, домен СН1 и домен Fc, и дополнительный вариабельный тяжелый домен. Легкий домен ковалентно присоединен между С-концом домена СН1 тяжелого константного домена и N-концом первого домена Fc с использованием доменов-линкеров.

Данный вариант реализация изобретения дополнительно использует общую легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен, которая объединяется с тяжелыми цепями с образованием двух идентичных Fab, которые связывают CD38. Что же касается многих вариантов реализации изобретения в данном документе, эти конструкции включают в себя ассиметричные варианты, pI-варианты, абляционные варианты, дополнительные варианты Fc, и т.д., как желаемо и описано в данном документе.

В настоящем изобретении предложены формы Central-scFv, в которых последовательности антиCD3 scFv представляют собой те, что показаны на фиг. 2-7.

В настоящем изобретении предложены формы Central-scFv, причем последовательности анти-CD38 представляют собой те, что показаны на фиг. 8-10.

В настоящем изобретении предложены формы Central-scFv, содержащие абляционные варианты, как показано на фиг. 31.

В настоящем изобретении предложены формы Central-scFv, содержащие ассиметричные варианты, как показано на фиг. 29 и 34.

Одноплечевой central-scFv.

Один гетеродимерный каркас, который находит конкретное применение в настоящем изобретении, представляет собой одноплечевую форму central-scFv, показанную на фиг. 1. В этом варианте реализации данного изобретения, один мономер содержит только домен Fc, в то время как другой мономер использует вставленный домен scFv, таким образом, формируя второй антигенсвязывающий домен. В данной форме или часть Fab связывает CD38, a scFv связывает CD3, или наоборот. Домен scFv вставляют между доменом Fc и участком CH1-Fv одного из мономеров.

В этом варианте реализации данного изобретения, первый мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный тяжелый домен, домен СН1 и Fc, с scFv, содержащим вариабельный легкий домен scFv, линкер scFv и вариабельный тяжелый домен scFv. scFv ковалентно присоединен между С-концом домена СН1 тяжелого константного домена и N-концом первого домена Fc с использованием доменов-линкеров. Второй мономер содержит домен Fc. Данный вариант реализация изобретения дополнительно использует легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен, которая объединяется с тяжелой цепью с образованием Fab. Что же касается многих вариантов реализации изобретения в данном документе, эти конструкции включают в себя ассиметричные варианты, pI-варианты, абляционные варианты, дополнительные варианты Fc, и т.д., как желаемо и описано в данном документе.

В настоящем изобретении предложены одноплечевые формы Central-scFv, в которых последовательности анти-CD3 scFv представляют собой те, что показаны на фиг. 2-7.

В настоящем изобретении предложены одноплечевые формы Central-scFv, причем последовательности анти-CD38 представляют собой те, что показаны на фиг. 8-10.

В настоящем изобретении предложены одноплечевые формы Central-scFv, содержащие абляционные варианты, как показано на фиг. 31.

В настоящем изобретении предложены одноплечевые формы Cenral-scFv, содержащие ассиметрич

- 24 037065 ные варианты, как показано на фиг. 29 и 34.

Формы с двойным scFv.

В настоящем изобретении также предложены формы с двойным scFv, которые известны в данной области техники и показаны на фиг. 1. В настоящем изобретении предложены формы с двойным scFv, в которых последовательности анти-CD3 scFv представляют собой те, что показаны на фиг. 2-7.

В настоящем изобретении предложены формы с двойным scFv, причем последовательности антиCD38 представляют собой те, что показаны на фиг. 8-10.

Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению.

Изобретение дополнительно относится к композициям нуклеиновых кислот, кодирующим биспецифические антитела по изобретению. Как будет понятно специалистам в данной области техники, композиции нуклеиновых кислот будут зависеть от формы и каркаса гетеродимерного белка. Так, например, когда форма требует три аминокислотные последовательности, такие, как для формы тройная F (например, первый аминокислотный мономер, содержащий домен Fc и scFv, второй аминокислотный мономер, содержащий тяжелую цепь и легкую цепь), три нуклеотидных последовательности могут быть включены в один или более экспрессионных векторов для экспрессии. Аналогичным образом, некоторые формы (например, формы с двойным scFv, такие как те, что описаны на фиг. 1), требуют лишь двух нуклеиновых кислот; опять же, они могут быть помещены в один или два экспрессирующих вектора.

Как известно специалистам в данной области техники, нуклеиновые кислоты, кодирующие компоненты по изобретению могут быть вставлены в векторы экспрессии, как известно в данной области техники, и в зависимости от клетки-хозяева, применятся для получения гетеродимерных антитела по изобретению. В целом, как правило, нуклеиновые кислоты, функционально связаны с любым количеством регуляторных элементов (промоторы, ориджин репликации, селективные маркеры, сайты связывания рибосом, индукторы и т.д.). Векторы экспрессии могут быть экстрахромосомными или интегрирующими векторами.

Нуклеиновыми кислотами и/или векторами экспрессии по данному изобретению, затем трансформируют любое число различных типов клеток-хозяев, которые хорошо известны в данной области техники, в том числе млекопитающих, бактерий, дрожжей, насекомых и/или грибковых клеток, с клетками млекопитающих (например, клетки СНО), находящие применение во многих вариантах реализации изобретения.

В некоторых вариантах реализации изобретения, нуклеиновые кислоты, кодирующие каждый мономер и необязательная нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь, как это применимо в зависимости от формы, каждая содержится в одном векторе экспрессии, в целом, как правило, под контролем различных или одинаковых промоторов. В вариантах реализации изобретения конкретного применения в настоящем изобретении, каждая из этих двух или трех нуклеиновых кислот содержится в разном векторе экспрессии. Как показано в данном документе и 62/025,931, включенном в данный документ посредством ссылки, различные соотношения вектора(ов) могут быть применены для направления формирования гетеродимеров. То есть, как ни удивительно, в то время как белки содержат первый мономер:второй мономер:легкие цепи (в случае многих из вариантов реализации изобретения в данном документе, что имеют три полипептида, составляющие гетеродимерное антитело) в соотношении 1:1:2, эти соотношения не являются соотношениями, которые дают лучшие результаты; смотрите фиг. 65.

Г етеродимерные антитела по изобретению получают путем культивирования клеток-хозяев, содержащих вектор(ы) экспрессии, как хорошо известно в данной области техники. После получения, выполняют традиционные стадии очистки антитела, включающие стадию очистки ионообменной хроматографией. Как обсуждается в данном документе, изменение pI двух мономеров по меньшей мере на 0,5 может обеспечить разделение ионообменной хроматографией или изоэлектрическим фокусированием, или другими методами, чувствительными к изоэлектрической точке. То есть, включение pI-замен, которые изменяют изоэлектрическую точку (pI) каждого мономера позволяют сделать так, что каждый мономер имеет различный pI и каждый гетеродимер также имеет различный pI, таким образом облегчая изоэлектрическую очистку гетеродимира с формой тройная F (например, применяя анионо-обменные колонки, катионо-обменные колонки). Данные замены также помогают при определении и мониторинге любых контаминирующих двойных scFv-Fc и mAb-гомодимеров после очистки (например, в гелях ИЭФ, в гелях кИЭФ, и аналитических ИО-колонках).

Лечение.

После получения, композиции по настоящему изобретению находят применение в ряде прикладных областей. CD38 не регулируется при многих гемопоэтических злокачественных новообразованиях и в клеточных линиях, происходящих из различных гемопоэтических злокачественных новообразований, включающих неходжкинскую лимфому (NHL), лимфому Беркитта (BL), множественную миелому (ММ), В-клеточную хроническую лимфоцитарную лейкемию (B-CLL), В- и Т-клеточную острую лимфоцитарную лейкемию (ALL), Т-клеточную лимфому (TCL), острую миелоидную лейкемию (AML), волосатоклеточную лейкемию (HCL), лимфому Ходжкина (HL), хроническую лимфоцитарную лейкимию (CLL) и хроническую миелоидную лейкемию (CML).

Соответственно гетеродимерные композиции по настоящему изобретению находят применение в

- 25 037065 лечении этих видов рака.

Композиции антител для введения in vivo.

Лекарственные формы антител, применяемые в соответствии с настоящим изобретением, получают с целью хранения путем смешивания антитела, обладающего требуемой степенью чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]), в форме лиофилизированных лекарственных форм или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксическими для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях и включают буферные вещества, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид, бензэтония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (менее чем около 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Лекарственная форма, описанная в данном документе, также может содержать более одного активного соединения, требуемого при конкретном подлежащем лечению показании, предпочтительно с дополняющими видами активности, которые не оказывают негативного влияния друг на друга. Например, может потребоваться наделить антитела другими видами специфичности. В альтернативном варианте или в дополнение, композиция может содержать цитотоксический агент, цитокин, ингибирующий рост агент и/или малую молекулу-антагонист. Такие молекулы надлежащим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для предполагаемого назначения.

Активные ингредиенты также можно заключить в микрокапсулы, полученные, например, с помощью методик коацервации или межфазовой полимеризации, например микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы полиметилметакрилата соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных веществ (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Лекарственные формы, применяемые для введения in vivo, должны быть стерильными или практически стерильными. Это легко осуществить путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

Могут быть приготовлены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем матрицы находятся в форме формованных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма. этил-Ь-глутамат, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида) и поли-Э-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. В то время как полимеры, такие как этиленвинилацетат и молочная кислота-гликолевая кислота, обеспечивают возможность высвобождения молекул дольше 100 суток, определенные гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени.

Если инкапсулированные антитела остаются в организме в течение длительного времени, то они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия влаги при 37°C, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям иммуногенности. Для стабилизации могут быть разработаны рациональные стратегии, зависящие от задействованного механизма. Например, если обнаружено, что механизм агрегации вызывает образование межмолекулярной связи S--S посредством тиодисульфидного обмена, то стабилизация может достигаться модификацией сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислотных растворов, регулированием содержания влаги, использованием подходящих добавок и разработкой специальных композиций с полимерными матрицами.

Способы введения.

Антитела и химиотерапевтические агенты по данному изобретению вводятся субъекту в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение в виде болюсной или непрерывной инфузии в течение некоторого периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрицереброспинальным, подкожным, интраартикулярным, внутрисуставным, интратекальным, пероральным, мест

- 26 037065 ным или ингаляционным путями. Предпочтительным является внутривенное или подкожное введение. Способы лечения.

В способах по данному изобретению используется терапия для обеспечения положительного терапевтического ответа применительно к заболеванию или патологическому состоянию. Положительный терапевтический ответ предназначен для улучшения течения заболевания или состояния и/или улучшения симптомов, связанных с заболеванием или состоянием. Например, положительный терапевтический ответ может относиться к одному или более из следующих видов облегчения заболевания: (1) уменьшение количества неопластических клеток; (2) увеличение гибели неопластических клеток; (3) ингибирование выживаемости неопластических клеток; (5) ингибирование (т.е. до некоторой степени замедление, предпочтительно остановка) роста опухоли; (6) увеличенный коэффициент выживаемости пациентов и (7) некоторое облегчение одного или более симптомов, связанных с данным заболеванием или патологическим состоянием.

Положительные терапевтические ответы при любом данном заболевании или патологическом состоянии могут определяться по стандартизированному критерию ответа, специфическому для данного заболевания или патологического состояния. Ответ опухоли может оцениваться по изменениям морфологии опухоли (т.е. общей опухолевой нагрузки, размеру опухолей и т. п.) с использованием методик скрининга, таких как сканирование магнитно-резонансной томографией (МРТ), рентгенорадиографической визуализацией, компьютерным томографическим (КТ) сканированием, сканированием костей скелета, эндоскопией и отбором опухолевых биоптатов, включая аспирацию костного мозга (АКМ) и подсчет опухолевых клеток в кровотоке.

В дополнение к этим положительным терапевтическим ответам субъект, проходящий терапию, может ощущать благоприятный эффект улучшения симптомов, связанных с данным заболеванием.

Облегчение заболевания может характеризоваться как полный ответ. Под полным ответом подразумевается отсутствие клинически выявляемого заболевания с нормализацией результатов любых проведенных раннее радиографических исследований на выявление аномалий костного мозга и спинномозговой жидкости (СМЖ) или, в случае миеломы, аномального моноклонального белка.

Такой ответ может сохраняться в течение по меньшей мере от 4 до 8 недель, или иногда от 6 до 8 недель, после лечения в соответствии со способами по данному изобретению. В альтернативном варианте облегчение заболевания может быть отнесено к категории, представляющей собой частичный ответ. Под частичным ответом подразумевается по меньшей мере около 50% уменьшение всей измеряемой опухолевой нагрузки (т.е. количество злокачественных клеток, присутствующих у субъекта, или измеряемого объема опухолевых масс или количества аномального моноклонального белка) при отсутствии новых очагов, который может сохраняться в течение от 4 до 8 недель или от 6 до 8 недель.

Лечение в соответствии с настоящим изобретением включает терапевтически эффективное количество используемых лекарственных средств. Терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического результата.

Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания, возраст, пол и вес индивида, а также способности лекарственных средств вызывать у индивида требуемый ответ. Терапевтически эффективное количество также является таким, при котором терапевтически благоприятное воздействие превосходит любое токсическое или пагубное воздействие антитела или части антитела.

Терапевтически эффективное количество для противоопухолевой терапии также может измеряться по его способности стабилизировать прогрессирование заболевания. Способность соединения ингибировать рак может оцениваться в системе животной модели, прогнозирующей эффективность при лечении опухолей человека.

В альтернативном варианте это свойство композиции может оцениваться путем изучения способности соединения ингибировать рост клеток или индуцировать апоптоз анализами in vitro, известными квалифицированному практику. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшать размер опухоли или иным образом облегчать симптомы у субъекта. Любой средний специалист в данной области техники смог бы определить такие количества на основании таких факторов, как рост субъекта, тяжесть симптомов у субъекта, и конкретной композиции или выбранного пути введения.

Режимы дозировок корректируются для обеспечения оптимального требуемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, может вводиться однократная болюсная доза, несколько раздельных доз могут вводиться в течение периода времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как того требует терапевтическая ситуация. Для облегчения введения и однородности дозировки могут составляться парентеральные композиции в одноразовой дозированной форме. Одноразовая дозированная форма в данном документе относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве однократных доз для подлежащих лечению субъектов; каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения требуемого терапевтического действия, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем.

- 27 037065

Описание одноразовых дозированных форм по настоящему изобретению обусловлено и напрямую зависит от: (а) уникальных свойств активного соединения и конкретного достигаемого терапевтического воздействия и (b) ограничений, существующих в области составления рецептур такого активного соединения для лечения у индивидов чувствительности.

Эффективные дозировки и режимы дозировок для биспецифических антител, применяемых в настоящем изобретении, зависят от подлежащего лечению заболевания или патологического состояния и могут определяться специалистами в данной области техники.

Типичный неограничивающий диапазон терапевтически эффективного количества биспецифического антитела, применяемого в настоящем изобретении, составляет около 0,1-100 мг/кг, такой как около 0,1-50 мг/кг, например около 0,1-20 мг/кг, как около 0,1-10 мг/кг, например около 0,5, такой как около 0,3, около 1 или около 3 мг/кг. В другом варианте реализации изобретения, антитело вводится в дозе 1 мг/кг или больше, такой как доза от 1 до 20 мг/кг, например в дозе от 5 до 20 мг/кг, например в дозе 8 мг/кг.

Медицинский специалист, обладающий обычными навыками в данной области техники, может легко определить и назначить эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать с доз используемого в фармацевтической композиции лекарственного средства на более низких уровнях, чем требуется для достижения требуемого терапевтического воздействия, и постепенно увеличивать дозировку до достижения требуемого воздействия.

В одном варианте реализации изобретения, биспецифическое антитело вводят путем инфузии в еженедельной дозировке от 10 до 500 мг/кг, например от 200 до 400 мг/кг. Такое введение может быть повторено, например, от 1 до 8 раз, например от 3 до 5 раз. Введение может проводиться непрерывной инфузией в течение периода времени от 2 до 24 ч, такого как от 2 до 12 ч.

В одном варианте реализации изобретения, биспецифическое антитело вводится путем медленной непрерывной инфузии в течение длительного периода времени, например более 24 ч, если это необходимо для снижения побочных эффектов, включающих токсичность.

В одном варианте реализации изобретения биспецифическое антитело вводится в еженедельной дозировке от 250 до 2000 мг, такой как, например, 300, 500, 700, 1000, 1500 или 2000 мг, вплоть до 8 раз, например, от 4 до 6 раз. Введение может проводиться непрерывной инфузией в течение периода времени от 2 до 24 ч, такого как от 2 до 12 ч. Такие режимы могут повторяться один или более раз, при необходимости, например, через 6 или 12 месяцев. Дозировка может определяться или корректироваться при помощи измерения количества соединения по настоящему изобретению в крови при введении, например, отбором биологического образца и использованием анти-идиотипических антител, которые таргетируют антигенсвязывающий участок биспецифического антитела.

В дополнительном варианте реализации изобретения биспецифическое антитело вводится раз в неделю в течение от 2 до 12 недель, например от 3 до 10 недель, например от 4 до 8 недель.

В одном варианте реализации изобретения, биспецифическое антитело вводится поддерживающей терапией, такой как, например, раз в неделю в течение периода 6 месяцев или более.

В одном варианте реализации изобретения, биспецифическое антитело вводится в режиме, включающем одну инфузию биспецифического антитела с последующей инфузией биспецифического антитела, конъюгированного с радиоизотопом. Режим может повторяться, например, через 7-9 суток.

В качестве неограничивающих примеров лечение в соответствии с настоящим изобретением может предоставляться в виде ежедневной дозировки антитела в количестве около 0,1-100 мг/кг, например 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мкг/кг в сутки, по меньшей мере в одни из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 суток, или, в альтернативном варианте, по меньшей мере раз в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 недель после начала лечения, или в любой их комбинации с использованием однократной или раздельных доз каждые 24, 12, 8, 6, 4 или 2 ч, или в любой их комбинации.

В некоторых вариантах реализации изобретения молекула биспецифического антитела применяется в комбинации с одним или более дополнительных терапевтических агентов, например химиотерапевтическим агентом. Неограничивающие примеры повреждающих ДНК химиотерапевтических агентов включают ингибиторы топоизомеразы I (например, иринотекан, топотекан, камптотецин и аналоги их метаболитов, и доксорубицин); ингибиторы топоизомеразы II (например, этопозид, тенипозид и даунорубицин); алкилирующие агенты (например, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, тиотепа, ифосфамид, кармустин, ломустин, семустин, стрептозоцин, декарбазин, метотрексат, митомицин С и циклофосфамид); интеркаляторы ДНК (например, цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин); интеркаляторы ДНК и генераторы свободных радикалов, такие как блеомицин; и нуклеозидные миметики (например, 5фторурацил, капецитибин, гемцитабин, флударабин, цитарабин, меркаптопурин, тиогуанин, пентостатин и гидроксимочевина).

Химиотерапевтические агенты, которые разрушают репликацию клеток, включают паклитаксел, доцетаксел и родственные аналоги; винкристин, винбластин и родственные аналоги; талидомид, леналидомид и родственные аналоги (например, СС-5013 и СС-4047); ингибиторы протеинтирозинкиназы (на

- 28 037065 пример, иматиниба мезилат и гефитиниб); ингибиторы протеасомы (например, бортезомиб); ингибиторы NF-кВ, включающие ингибиторы киназы 1кВ; антитела, которые связываются со сверхэкспрессируемыми при раковых заболеваниях белками и тем самым снижают репликацию клеток (например, трастузумаб, ритуксимаб, цетуксимаб и бевацизумаб); и другие ингибиторы белков или ферментов, известных как находящиеся на повышенном уровне, сверхэкспрессированные или активированные при раковых заболеваниях, ингибирование которых снижает репликацию клеток.

В некоторых вариантах реализации изобретения антитела по данному изобретению могут применяться до, одновременно или после лечения Velcade® (бортезомибом).

Все публикации, процитированные в данном документе, явным образом включены в полном объеме посредством ссылки.

Принимая во внимание то, что конкретные варианты реализации изобретения были описаны выше с целью иллюстрации, специалистам в данной области техники ясно, что могут быть осуществлены многочисленные изменения деталей без выхода за рамки объема данного изобретения, как описано в приложенной формуле изобретения.

Примеры

Примеры ниже представлены для иллюстрации настоящего изобретения. Эти примеры не подразумевают ограничение настоящего изобретения до любого конкретного применения или методики использования. Для всех положений констатного участка, обсуждаемых в настоящем изобретении, нумерация приведена в соответствии с индексом EU, как по Кабату (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, включена в полном объеме посредством ссылки). Специалистам в области техники, относящейся к антителам, ясно, что это правило состоит из непоследовательной нумерации специфических участков иммуноглобулиновой последовательности, дающей возможность унифицировать ссылки на консервативные положения в семействах иммуноглобулинов. Соответственно положения в любом данном иммуноглобулине, определенные индексом EU, не обязательно будет соответствовать последовательной последовательности.

Общие и конкретные научные методы изложены в публикациях США 2015/0307629, 2014/0288275 и WO 2014/145806, все из которых специально включены посредством ссылки во всей их полноте и, в частности, для раскрытия методов, изложенных в них.

Примеры.

Пример 1. Альтернативные формы.

Получение Fab-scFv-Fc.

Молекулы ДНК, кодирующие три цепи, необходимые для экспрессии Fab-scFv-Fc - Fab-Fc, scFv-Fc, и LC, были получены путем генного синтеза (Blue Heron Biotechnology, Bothell, штат Вашингтон), и были субклонированы в вектор экспрессии рТТ5 с применением стандартных методов молекулярной биологии. Замены были введены с применением или сайт-направленного мутагенеза (QuikChange, Stratagene, Cedar Creek, штат Техас), или дополнительного генного синтеза и субклонирования. ДНК трансфицировали в клетки НЕК293Е для экспрессии, и полученные белки очищали от надосадочной жидкости с применением аффинной хроматографии с белком A (GE Healthcare) и катион-обменной хроматографии (GE Healthcare). Аминокислотные последовательности для биспецифических антител Fab-scFv-Fc приведены на фиг. 3.

Определения аффинности с помощью поверхностного плазмонного резонанса.

Эксперименты по поверхностному плазмонному резонансу связывания были проведены с применением инструмента Biacore 3000 (данные не показаны). Даже после замещения аминокислоты (аминокислот) для изменения аффинности, вариабельный участок анmи-CD3 остается перекрестно-реактивным с CD3 яванского макака.

Связывание с клеточной поверхностью.

Связывание Fab-scFv-Fcs с CD3 измеряли на Т-клетках с помощью обнаружения вторичным антителом.

Перенаправленная цитотоксичность Т-клеток.

Анти-CD38 х анти-CD3 Fab-scFv-Fc биспецифические антитела были охарактеризованы in vitro по свойству перенаправленной цитотоксичности Т-клеток (ПЦТК) клеточной линии CD20' лимфомы Рамоса Беркитта, клеточной лини Jeko-1 CD20+ лимфомы клеток мантии (MCL), и клеточной линии RPMI 8266 CD38+ миеломы. Было измерено ПЦТК, и также было охарактеризовано продуцирование ИЛ-6 в течение ПЦТК (данные не показаны).

Исследования иммуноглобулинового истощения на мышах huPBL-SCID.

Свойство анти-CD38 х анти-CD3-Fab-scFv-Fc биспецифических антител уменьшать количество иммуноглобулинов человека путем уменьшения количества человеческих В клеток или плазматических клеток оценивали с применением человеческого МКПК (мононуклеарные клетки периферической крови), привитых мышам SCID. Результаты показаны на чертежах.

- 29 037065

Пример 2. Альтернативные формы.

Получение биспецифических антител.

Схематические рисунки биспецифических антител анти-CD38 х анти-CD3 представлены на фиг. 1. Аминокислотные последовательности для альтернативной формы биспецифических антител анти-CD38 х анти-CD3 приведены на фиг. 39-43. Молекулы ДНК, кодирующие три цепи, необходимые для экспрессии биспецифических антител, были получены путем генного синтеза (Blue Heron Biotechnology, Bothell, штат Вашингтон), и были субклонированы в вектор экспрессии рТТ5 с применением стандартных методов молекулярной биологии. Замены были введены с применением или сайт-направленного мутагенеза (QuikChange, Stratagene, Cedar Creek, штат Техас), или дополнительного генного синтеза и субклонирования. ДНК трансфицировали в клетки НЕК293Е для экспрессии, и полученные белки очищали от надосадочной жидкости с помощью аффинной хроматографии с белком A (GE Healthcare) и катион-обменной хроматографии (GE Healthcare). Количество продукта после очистки аффинной хроматографией с белком А показано на фиг. 35. Очистку катион-обменной хроматографией проводили с применением колонки HiTrap SP HP (GE Healthcare) с промывным/уравновешивающим буфером 50 мМ MES, рН 6,0 и буфером элюции 50 мМ MES, рН 6,0 + 1 М NaCl линейного градиента (см. фиг. 36 для хроматограмм).

Перенаправленная цитотоксичность Т-клеток.

Анти-CD38 х анти-CD3 биспецифические антитела были охарактеризованы in vitro по свойству перенаправленной цитотоксичности Т-клеток (ПЦТК) клеточной линии RPMI8266 CD38+ миеломы. 10 тыс. клеток RPMI8266 инкубировали в течение 24 ч с 500 тыс. человеческих МКПК. ПЦТК измеряли с помощью ЛДГ флуоресценции, как указано (см. фиг. 37).

Пример 3. Перенаправленная цитотоксичность Т-клеток.

Анти-CD38 х анти-CD3 Fab-scFv-Fc биспецифические антитела были охарактеризованы in vitro по свойству перенаправленной цитотоксичности Т-клеток (ПЦТК) клеточной линии RPMI8266 CD38+ миеломы. 40 тыс. клеток RPMI8266 инкубировали в течение 96 ч с 400 тис человеческих МКПК. ПЦТК измеряли проточной цитометрией, как указано (см. фиг. 44). Экспрессия CD69, Ki-67 и PI-9 Т-клетками CD4+ и CD8+ также была охарактеризована проточной цитометрией и показана на фиг. 45.

Мышиная модель противоопухолевой активности.

Четырем группам мышей NOD SCID гамма (NSG) по пять мышей в каждой были привиты 5x106 опухолевых клеток RPMI8226TrS (множественная миелома, люциферазо-экспрессирующие клетки) путем внутривенной инъекции в вену хвоста в День -23. В День 0 мышам внутрибрюшинно прививали 10x106 человеческих МКПК. После приживления МКПК в День 0 тестовые изделия дозировали еженедельно (Дни 0, 7) путем внутрибрюшинной инъекции в дозах, указанных на фиг. 4. Дизайн исследования дополнительно резюмирован на фиг. 46. Рост опухоли наблюдали, измеряя общий поток на мышь, используя in vivo систему визуализации (IVIS®). Оба, XmAb13551 и XmAb15426, показали существенные противоопухолевые эффекты (см. фиг. 47 и 48).

Исследования, проведенные на яванских макаках.

Яванским макакам вводили одну дозу биспецифических антител анти-CD38 х анти-CD3. Также был включен биспецифический контроль анти-RSV х анти-CD3. Величины доз составляли: 20 мкг/кг XmAb13551 (n=2), 0,5 мкг/кг XmAb15426 (n=3), 3 мкг/кг XmAb14702 (n=3), или 3 мкг/кг XmAb13245 (контроль анти-RSV х анти-CD3, n=3) (в трех независимых исследованиях). Биспецифические антитела анти-CD38 х анти-CD3 быстро уменьшали количество клеток CD38+ в периферической крови (см. фиг. 49). Биспецифические антитела анти-CD38 х анти-CD3 вызывали активацию Т-клеток, как было измерено с помощью экспрессии CD69 (см. фиг. 50). Также измеряли уровни ИЛ-6 в сыворотке (см. фиг. 51). Следует отметить, что, по сравнению с XmAb13551, XmAb15426 имел повышенную продолжительность уменьшения количества клеток CD38+ и более низкие уровни активации Т-клеток и продукции ИЛ-6.

XmAb15426 и XmAb14702 были испытаны в одиночных дозах 0,5 и 3 мг/кг соответственно. Оба антитела были хорошо переносимыми при этих более высоких дозах, в соответствии с умеренным уровнем ИЛ-6, наблюдаемым в сыворотке, полученной из обработанных обезьян. Кроме того, XmAb15426, с промежуточной аффинностю к CD3, более эффективно уменьшал количество клеток CD38+ при дозе 0,5 мг/кг по сравнению с первоначальной высокой аффинностю XmAb13551, введенного в дозах 2, 5 или 20 мкг/кг. Уменьшение количества антителом XmAb15426 было более замедленным по сравнению с наиболее высокой дозой XmAb13551 в предыдущем исследовании (7 против 2 дней соответственно). Следует отметить, что хотя уменьшение количества клеток-мишеней было больше для XmAb15426, активация Тклеток (индукция CD69, CD25 и PD1) была значительно ниже у обезьян, обработанных XmAb15426 в дозе, что была выше в 25 раз, чем доза 20 мкг/кг группы XmAb13551. XmAb14702 с очень низкой аффинностю к CD3 обладал небольшим эффектом на клетки CD38+ и активацию Т-клеток.

Эти результаты показывают, что модулирование активации Т-клеток путем ослабления CD3сродства является перспективным способом для улучшения терапевтического окна вовлечения Т-клеток биспецифическими антителами. Данная стратегия имеет потенциал для расширения набора антигенов, поддающихся целевой Т-клеточной иммунотерапии, путем улучшения переносимости и обеспечения возможности более высокого дозирования для преодоления снижения клиренса антигеном с такими це

Claims (18)

1. Гетеродимерное антитело для связывания CD3 и CD38, содержащее:

a) первый мономер, содержащий:

i) первый домен Fc;

ii) анти-CD3 scFv, содержащий вариабельный легкий домен scFv, scFv-линкер и вариабельный тяжелый домен scFv; причем указанный scFv ковалентно присоединен к N-концу указанного домена Fc, используя домен-линкер; и указанный вариабельный легкий домен scFv содержит vlCDR1, имеющий SEQ ID NO:15, vlCDR2, имеющий SEQ ID NO:16, и vlCDR3, имеющий SEQ ID NO:17, и указанный вариабельный тяжелый домен scFv содержит vhCDR1, имеющий SEQ ID NO:11, vhCDR2, имеющий SEQ ID NO:12, и vhCDR3, имеющий SEQ ID NO:13;

b) второй мономер, содержащий тяжелую цепь, содержащую:

i) вариабельный тяжелый домен; и ii) константный тяжелый домен, содержащий второй домен Fc; и

c) легкую цепь, содержащую вариабельный легкий домен и константный легкий домен;

причем указанный вариабельный тяжелый домен и указанный вариабельный легкий домен связывают CD38 и указанный вариабельный легкий домен содержит vlCDR1, имеющий последовательность RASQNVDTWVA (SEQ ID NO:69), vlCDR2, имеющий последовательность SASYRYS (SEQ ID NO:70), и vlCDR3, имеющий последовательность QQYDSYPLT (SEQ ID NO:71), и указанный вариабельный тяжелый домен содержит vhCDR1, имеющий последовательность RSWMN (SEQ ID NO:65), vhCDR2, имеющий последовательность EINPDSSTINYATSVKG (SEQ ID NO:66), и vhCDR3, имеющий последовательность YGNWFPY (SEQ ID NO:67).

2. Гетеродимерное антитело по п.1, отличающееся тем, что указанный вариабельный легкий домен содержит последовательность

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVDTWVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTG

SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDSYPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:68), и указанный вариабельный тяжелый домен содержит последовательность

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRSWMNWVRQAPGKGLEWVSEINPDSSTINYATSV

KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGNWFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:64) .

3. Гетеродимерное антитело по п.1 или 2, в котором указанный вариабельный легкий домен scFv имеет последовательность SEQ ID NO:14 и указанный вариабельный тяжелый домен scFv имеет последовательность SEQ ID NO:10.

4. Гетеродимерное антитело по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что указанный scFv имеет последовательность SEQ ID NO:18.

5. Гетеродимерное антитело по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что указанный первый домен Fc и указанный второй домен Fc содержат набор вариантов, выбранных из группы, состоящей из S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L и K370S: S364K/E357Q.

6. Гетеродимерное антитело по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что указанный scFv-линкер представляет собой заряженный линкер.

7. Гетеродимерное антитело по любому из пп.1-6, отличающееся тем, что указанный константный домен тяжелой цепи содержит аминокислотные замены N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D.

8. Гетеродимерное антитело по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что указанный первый и второй домены Fc содержат аминокислотные замены E233P/L234V/L235A/G236del/S267K.

9. Гетеродимерное антитело по п.1, в котором первый мономер содержит SEQ ID NO:104; второй мономер содержит SEQ ID NO:109 и легкая цепь содержит SEQ ID NO: 111.

10. Композиция нуклеиновых кислот для продукции гетеродимерного антитела по любому из пп.19, которая содержит:

a) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный первый мономер по любому из пп.1-9;

b) вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный второй мономер по любому из пп.1-9; и

с) третью нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную легкую цепь по любому из пп.1-9.

11. Композиция векторов экспрессии для продукции гетеродимерного антитела по любому из пп. 1 9, содержащая:

a) первый вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный первый мономер по любому из пп.1-9;

- 31 037065

b) второй вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный второй мономер по любому из пп.1-9; и

c) третий вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную легкую цепь по любому из пп.1-9.

12. Клетка-хозяин, содержащая композицию нуклеиновых кислот по п.10.

13. Клетка-хозяин, содержащая композицию векторов экспрессии по п.11.

14. Способ получения гетеродимерного антитела по любому из пп.1-9, включающий культивирование клетки-хозяина по п.12 или 13 в условиях, в которых экспрессируется указанное антитело, и сбор указанного антитела.

15. Композиция для продукции гетеродимерного антитела по любому из пп.1-9, содержащая: а) первый вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный первый мономер гетеродимерного антитела по любому из пп.1-9, и b) второй вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный второй мономер гетеродимерного антитела по любому из пп.1-9, и нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную легкую цепь гетеродимерного антитела по любому из пп.1-9.

16. Клетка-хозяин, содержащая композицию по п.15.

17. Способ получения гетеродимерного антитела по любому из пп.1-9, включающий культивирование клетки-хозяина по п.15 в условиях, в которых указанное антитело экспрессируется, и сбор указанного антитела.

18. Способ лечения гемопоэтического рака, включающий введение гетеродимерного антитела по любому из пп.1-9 пациенту.