JP2020108386A

JP2020108386A - Ｃｄ３及びｃｄ３８に結合するヘテロ二量体抗体

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Publication number: JP2020108386A
Application number: JP2020039733A
Authority: JP
Inventors: ムーアグレゴリー; Moore Gregory; デジャルレジョン; Desjarlais John; バーネットマシュー; Bernett Matthew; チュースン; Seung Chu; ラシッドルマナ; Rumana Rashid; ムチャルウメシュ; Muchhal Umesh
Original assignee: Xencor Inc
Current assignee: Xencor Inc
Priority date: 2014-11-26
Filing date: 2020-03-09
Publication date: 2020-07-16
Anticipated expiration: 2035-11-25
Also published as: CA3006052A1; JP6956083B2; EP3223907A2; US20200199251A1; MX2018006382A; EP3380196B1; JP2017536830A; JP6982643B2; US10526417B2; US20160215063A1; EA037065B1; PE20171103A1; IL252467B; CN107406512A; MA43305A; AU2015353416C1; PH12017500982A1; AU2016359683A1; BR112017011166A2; WO2016086196A2

Abstract

【課題】ＣＤ３及びＣＤ３８に結合するヘテロ二量体抗体の提供。【解決手段】ＣＤ３及びＣＤ３８に結合するヘテロ二量体抗体であって、特定の配列を有する第１の単量体と、特定の配列を有する第２の単量体と、特定の配列を有する軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体。特定の配列をコードする第１の核酸と、特定の配列をコードする第２の核酸と、特定の配列をコードする第３の核酸と、を含む、核酸組成物。特定の配列をコードする核酸を含む第１の発現ベクターと、特定の配列をコードする核酸を含む第２の発現ベクターと、特定の配列をコードする核酸を含む第３の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１４年１１月２６日出願の米国仮特許出願第６２／０８５，１０６号、及び２０１５年１１月４日出願の米国仮特許出願第６２／２５０，９７１号に対する優先権を主張し、これらはすべて、全体が、参照によって、明確に本明細書に組み込まれ、特に、図、説明文、及び特許請求の範囲に関して組み込まれる。

抗体に基づく治療は、癌及び自己免疫疾患／炎症疾患を含む様々な病気の処置に、成功裏に使用されてきた。しかしながら、このクラスの薬物には、依然として改善が必要であり、特に、その臨床的有効性の増進に関して改良が必要である。探索されている１つの手段は、単一イムノグロブリン分子が、２つの異なる抗原を共捕捉するように、追加かつ新規の抗原結合部位を操作し、抗体に基づく薬物にすることである。２つの異なる抗原を捕捉するそのような非天然または代替の抗体形式は、二重特異性体と呼ばれることが多い。抗体可変領域（Ｆｖ）の相当な多様性によって、実質的にいかなる分子でもそれを認識するＦｖを産生することが可能であるため、二重特異性の生成に対する典型的な手法は、新しい可変領域を抗体へ導入することである。

多くの代替抗体形式が、二重特異性ターゲッティングに向けて探索されてきた（Ｃｈａｍｅｓ＆Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ１［６］：１−９；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３［９］：１１２６−１１３６；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ｍＡｂｓ４（２）：１８２（２０１２）、これらのすべてが、参照によって、本明細書に明確に組み込まれる）。初期には、二重特異性抗体は、それぞれが単一のモノクローナル抗体を産生する２つの細胞株を融合することによって作られた（Ｍｉｌｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ３０５：５３７−５４０）。得られたハイブリッドのハイブリドーマまたはクアドローマは、二重特異性抗体を確かに産生はしたが、少数集団にすぎず、所望の抗体の単離には、広範な精製が必要であった。これに対する操作的な解決策は、抗体断片を使用して、二重特異性体を作ることであった。そのような断片は、全長抗体の複雑な四次構造を欠いているため、可変軽鎖及び可変重鎖を、単一の遺伝子構築物において連結できる。ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、直列型ｓｃＦｖ、及びＦａｂ_２の二重特異性体を含む、多くの異なる形態の抗体断片が作成されてきた（Ｃｈａｍｅｓ＆Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ１［６］：１−９；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３［９］：１１２６−１１３６が、参照によって、本明細書に明確に組み込まれる）。こうした形式は、細菌において高水準で発現でき、サイズが小さいため、有利に浸透する利点を有し得るが、一方で、生体内において速やかに減失すると共に、生産及び安定性に関して、製造性上の障壁が存在し得る。こうした弱点の主要な原因は、抗体断片が、それに関連する機能特性を有する抗体の定常領域を通常は欠いていることにあり、当該関連機能特性には、サイズの大型化、高安定性、ならびに血清における長期半減期の維持（すなわち、新生児型Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎ）または精製のための結合部位として働く（すなわち、プロテインＡ及びプロテインＧ）様々なＦｃ受容体及びＦｃリガンドへの結合が含まれる。

より最新の研究では、二重である結合を全長抗体様形式へと操作することによって、断片に基づく二重特異性体が有する欠点に対処することが試みられている（Ｗｕｅｔａｌ．，２００７，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２５［１１］：１２９０−１２９７；ＵＳＳＮ１２／４７７，７１１；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎｅｔａｌ．，２００９，ｍＡｂｓ１［２］：１２８−１４１；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７４６９３；Ｚｕｏｅｔａｌ．，２０００，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１３［５］：３６１−３６７；ＵＳＳＮ０９／８６５，１９８；Ｓｈｅｎｅｔａｌ．，２００６，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８１［１６］：１０７０６−１０７１４；Ｌｕｅｔａｌ．，２００５，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８０［２０］：１９６６５−１９６７２；ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２５４７２、これらはすべて、参照によって、本明細書に明確に組み込まれる）。こうした形式は、抗体断片二重特異性体が有する障壁のいくつかを克服しており、これは、それらがＦｃ領域を含んでいることが主な理由である。こうした形式の１つの重大な弱点は、それらが、ホモ二量体定常鎖に追加で新しい抗原結合部位を構築するため、新しい抗原に対する結合が、常に二価であるということである。

治療用の二重特異性形式において、共標的（ｃｏ−ｔａｒｇｅｔ）として注目される抗原に向けた所望の結合の多くは、二価というよりもむしろ一価である。多くの免疫受容体では、細胞活性化は、一価の結合相互作用の架橋結合によって達成される。架橋結合の機構は、通常は、抗体／抗原免疫複合体によって媒介されるものであるか、またはエフェクター細胞が、標的細胞へと会合することを介するものである。例えば、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩａなどの低親和性Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、抗体Ｆｃ領域に一価で結合する。一価の結合は、こうしたＦｃγＲを発現している細胞を活性化しないが、免疫複合体形成または細胞対細胞接触の際は、受容体は、架橋結合され、細胞表面にクラスターを形成し、活性化を引き起こす。例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のＦｃγＲＩＩＩａのような、細胞殺傷の媒介を担う受容体では、エフェクター細胞が、非常に親和性が高い形式において標的細胞を捕捉するとき、受容体の架橋結合及び細胞の活性化が起こる（Ｂｏｗｌｅｓ＆Ｗｅｉｎｅｒ，２００５，ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ３０４：８８−９９が、参照によって、明確に組み込まれる）。同様に、Ｂ細胞上で、抑制性受容体であるＦｃγＲＩＩｂは、Ｂ細胞活性化の下方制御を行い、これは、ＦｃγＲＩＩｂが、細胞表面Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）との免疫複合体へと取り込まれるときのみに起こるものであり、ＢＣＲによって認識されるものと同一の抗原と、可溶性ＩｇＧのものとの免疫複合体形成によって媒介される機構である（Ｈｅｙｍａｎ
２００３，ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ８８［２］：１５７−１６１；ＳｍｉｔｈａｎｄＣｌａｔｗｏｒｔｈｙ，２０１０，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１０：３２８−３４３が、参照によって、本明細書に明確に組み込まれる）。別の例として、Ｔ細胞のＣＤ３活性化は、その関連するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が、非常に親和性が高い細胞対細胞シナプスにおいて、抗原提示細胞上の抗原負荷されたＭＨＣを捕捉するときのみに起こる（Ｋｕｈｎｓｅｔａｌ．，２００６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２４：１３３−１３９）。実際、抗ＣＤ３抗体を使用したＣＤ３の非特異的二価架橋結合は、サイトカインの急増及び毒性を誘発する（Ｐｅｒｒｕｃｈｅｅｔａｌ．，２００９，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１８３［２］：９５３−６１；Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ＆Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，２００７，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７：６２２−６３２が、参照によって、明確に組み込まれる）。したがって、実践的な臨床使用に向けた、標的細胞の再配向化殺傷（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄｋｉｌｌｉｎｇ）のためのＣＤ３共会合の好ましいモードは、共捕捉される標的との会合時にのみ活性化をもたらす一価の結合である。

サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼとしても知られるＣＤ３８は、長いＣ末端細胞外ドメイン、及び短いＮ末端細胞質ドメインを有する２型膜貫通糖タンパク質である。造血細胞の中で、ＣＤ３８が媒介するシグナル伝達に起因する機能性効果の種別には、リンパ球増殖、サイトカイン放出、Ｂ細胞及び骨髄細胞の発生と生存の制御、ならびに樹状細胞の成熟誘導が含まれる。多くの造血器悪性腫瘍、ならびに非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、Ｂ細胞性及びＴ細胞性急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む様々な造血器悪性腫瘍由来の細胞株において、ＣＤ３８は、制御されていない。一方で、造血系の原始的な多能性幹細胞のほとんどが、ＣＤ３８−である。抗癌物質の発見及び開発が、最近、進展しているにもかかわらず、ＣＤ３８−を発現している腫瘍が関与する癌の形態のほとんどで、依然として予後は、不良である。したがって、癌のそのような形態を処置するための方法の改善が必要である。
したがって、抗体断片から生成された二重特異性体は、生物物理学的及び薬物動態学的なハードルに直面している上に、全長抗体様形式で構築されたこれらの弱点は、一次標的抗原が存在しない状態において、共標的抗原を多価で捕捉し、非特異的な活性化及び潜在的毒性を引き起こすことである。本発明は、この問題を、ＣＤ３及びＣＤ３８を対象とする新規の二重特異抗体を導入することによって解決する。

Ｃｈａｍｅｓ＆Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ１［６］：１−９Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３［９］：１１２６−１１３６Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ｍＡｂｓ４（２）：１８２（２０１２）Ｍｉｌｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ３０５：５３７−５４０Ｗｕｅｔａｌ．，２００７，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２５［１１］：１２９０−１２９７Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎｅｔａｌ．，２００９，ｍＡｂｓ１［２］：１２８−１４１Ｚｕｏｅｔａｌ．，２０００，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１３［５］：３６１−３６７Ｓｈｅｎｅｔａｌ．，２００６，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８１［１６］：１０７０６−１０７１４Ｌｕｅｔａｌ．，２００５，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８０［２０］：１９６６５−１９６７２Ｂｏｗｌｅｓ＆Ｗｅｉｎｅｒ，２００５，ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ３０４：８８−９９Ｈｅｙｍａｎ２００３，ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ８８［２］：１５７−１６１ＳｍｉｔｈａｎｄＣｌａｔｗｏｒｔｈｙ，２０１０，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１０：３２８−３４３Ｋｕｈｎｓｅｔａｌ．，２００６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２４：１３３−１３９Ｐｅｒｒｕｃｈｅｅｔａｌ．，２００９，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１８３［２］：９５３−６１Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ＆Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，２００７，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７：６２２−６３２

したがって、本発明は、ＣＤ３及びＣＤ３８を標的とするヘテロ二量体抗体を提供する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列識別番号９１を有する第１の単量体、配列識別番号９２を有する第２の単量体、及び配列識別番号９３を有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列識別番号８８を有する第１の単量体、配列識別番号８９を有する第２の単量体、及び配列識別番号９０を有する軽鎖を含む。本発明は、上の配列をコードする第１、第２、及び第３の核酸を含む核酸組成物、及び核酸組成物を含む発現ベクター、核酸または発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞、ならびにヘテロ二量体抗体を作製し使用する方法をさらに提供する。

追加の態様では、本発明は、ｉ）第１のＦｃドメイン、ならびにｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して当該ＦｃドメインのＮ末端に共有結合で付加される、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、を含む、第１の単量体と、ｉ）重可変ドメイン、及びｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメイン、を含む重鎖を含む第２の単量体と、可変軽ドメイン及び可変軽定常ドメインを含む軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。いくつかの態様では、ｓｃＦｖ可変軽ドメインは、配列識別番号１５を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号１６を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号１７を有するｖｌＣＤＲ３を含み、当該ｓｃＦｖ可変重ドメインは、配列識別番号１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号１２を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列識別番号１３を有するｖｈＣＤＲ３を含み、当該重可変ドメイン及び当該可変軽ドメインは、ＣＤ３８に結合する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン、ならびにｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して当該ＦｃドメインのＮ末端に共有結合で付加される、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、を含む、第１の単量体と、ｂ）ｉ）重可変ドメイン、及びｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメイン、を含む重鎖を含む第２の単量体と、ｃ）可変軽ドメイン及び可変軽定常ドメインを含む軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。この態様では、ｓｃＦｖ可変軽ドメインは、配列識別番号２４を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号２６を有するｖｌＣＤＲ３を含み、当該ｓｃＦｖ可変重ドメインは、配列識別番号１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号１２を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列識別番号１３を有するｖｈＣＤＲ３を含み、当該重可変ドメイン及び当該可変軽ドメインは、ＣＤ３８に結合する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン、ならびにｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して当該ＦｃドメインのＮ末端に共有結合で付加される、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、を含む、第１の単量体と、ｂ）ｉ）重可変ドメイン、及びｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメイン、を含む重鎖を含む第２の単量体と、ｃ）可変軽ドメイン及び可変軽定常ドメインを含む軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。この態様では、ｓｃＦｖ可変軽ドメインは、配列識別番号３３を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号３４を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号３５を有するｖｌＣＤＲ３を含み、当該ｓｃＦｖ可変重ドメインは、配列識別番号２９を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号３０を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列識別番号３１を有するｖｈＣＤＲ３を含み、当該重可変ドメイン及び当該可変軽ドメインは、ＣＤ３８に結合する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン、ならびにｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して当該ＦｃドメインのＮ末端に共有結合で付加される、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、を含む、第１の単量体と、ｂ）ｉ）重可変ドメイン、及びｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメイン、を含む重鎖を含む第２の単量体と、ｃ）可変軽ドメイン及び可変軽定常ドメインを含む軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。この態様では、ｓｃＦｖ可変軽ドメインは、配列識別番号４２を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４３を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４４を有するｖｌＣＤＲ３を含み、当該ｓｃＦｖ可変重ドメインは、配列識別番号３８を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号３９を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列識別番号４０を有するｖｈＣＤＲ３を含み、当該重可変ドメイン及び当該可変軽ドメインは、ＣＤ３８に結合する。

追加の態様では、本発明の「ボトルオープナー」ヘテロ二量体抗体は、ＣＤ３ならびにｖｈ及びｖｌドメインに結合するｓｃＦｖを有し、可変軽ドメインは、配列ＲＡＳＱＮＶＤＴＷＶＡ（配列識別番号６９）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＳＡＳＹＲＹＳ（配列識別番号７０）を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列ＱＱＹＤＳＹＰＬＴ（配列識別番号７１）を有するｖｌＣＤＲ３を含み、当該可変重ドメインは、配列ＲＳＷＭＮ（配列識別番号６５）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＴＳＶＫＧ（配列識別番号６６）を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列ＹＧＮＷＦＰＹ（配列識別番号６７）を有するｖｈＣＤＲ３を含む。

追加の実施形態では、可変軽ドメインは、配列ＲＡＳＱＮＶＤＴＮＶＡ（配列識別番号７８）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＳＡＳＹＲＹＳ（配列識別番号７９）を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列ＱＱＹＤＳＹＰＬＴ（配列識別番号８０）を有するｖｌＣＤＲ３を含み、当該可変重ドメインは、配列ＲＳＷＭＮ（配列識別番号７４）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＴＳＶＫＧ（配列識別番号７５）を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列ＹＧＮＷＦＰＹ（配列識別番号７６）を有するｖｈＣＤＲ３を含む。

さらなる態様では、本発明は、ａ）ｉ）１）第１の可変重ドメインと、２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖と、３）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含むｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して当該ＦｃドメインのＣ末端に共有結合で付加される、ｓｃＦｖと、を含む第１の重鎖を含む第１の単量体と、ｂ）第２の可変重ドメインを含む第２の重鎖及び第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む第２の単量体と、ｃ）可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む共通の軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、当該第１及び当該第２のＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択される１セットのアミノ酸置換を有し、当該第１の可変重ドメイン及び当該可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３８（配列識別番号１３１）に結合し、当該第２の可変重ドメイン及び当該可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３８（配列識別番号１３１）に結合し、当該ｓｃＦｖが、ヒトＣＤ３（配列識別番号１２９）に結合する、ヘテロ二量体抗体を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）ｉ）１）第１の可変重ドメインと、２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重ドメインと、３）第１の可変軽ドメインであって、ドメインリンカーを使用して当該第１のＦｃドメインのＣ末端に共有結合で付加される、第１の可変軽ドメインと、を含む第１の重鎖を含む第１の単量体と、ｂ）ｉ）第２の可変重ドメインと、ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む第２の定常重ドメインと、ｉｉｉ）第３の可変重ドメインであって、当該第２の可変重ドメインが、ドメインリンカーを使用して当該第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合で付加される、第３の可変重ドメインと、を含む第２の単量体と、ｃ）可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む共通の軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、当該第１及び当該第２のＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択される１セットのアミノ酸置換を有し、当該第１の可変重ドメイン及び当該可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３８（配列識別番号１３１）に結合し、当該第２の可変重ドメイン及び当該可変軽ドメインが、当該ヒトＣＤ３８（配列識別番号１３１）に結合し、当該第２の可変軽ドメイン及び当該第３の可変重ドメインが、ヒトＣＤ３（配列識別番号１２９）に結合する、ヘテロ二量体抗体を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）ｉ）１）第１の可変重ドメインと、２）第１のＣＨ１ドメイン及び第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖と、３）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含むｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して当該ＣＨ１ドメインのＣ末端と当該第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合で付加される、ｓｃＦｖと、を含む第１の重鎖を含む第１の単量体と、ｂ）第２の可変重ドメインを含む第２の重鎖及び第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む第２の単量体と、ｃ）可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む共通の軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、当該第１及び当該第２のＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択される１セットのアミノ酸置換を有し、当該第１の可変重ドメイン及び当該可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３８（配列識別番号１３１）に結合し、当該第２の可変重ドメイン及び当該可変軽ドメインが、当該ヒトＣＤ３８（配列識別番号１３１）に結合し、当該ｓｃＦｖが、ヒトＣＤ３（配列識別番号１２９）に結合する、ヘテロ二量体抗体を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）ｉ）１）第１の可変重ドメインと、２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重ドメインと、３）第１の可変軽ドメインであって、ドメインリンカーを使用して当該第１の定常重ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と当該第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合で付加される、第１の可変軽ドメインと、を含む第１の重鎖を含む第１の単量体と、ｂ）ｉ）第２の可変重ドメインと、ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む第２の定常重ドメインと、ｉｉｉ）第３の可変重ドメインであって、当該第２の可変重ドメインが、ドメインリンカーを使用して当該第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合で付加される、第３の可変重ドメインと、を含む第２の単量体と、ｃ）可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む共通の軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、
当該第１及び当該第２のＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択される１セットのアミノ酸置換を有し、当該第１の可変重ドメイン及び当該可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３８（配列識別番号１３１）に結合し、当該第２の可変重ドメイン及び当該可変軽ドメインが、当該ヒトＣＤ３８（配列識別番号１３１）に結合し、当該第２の可変軽ドメイン及び当該第３の可変重ドメインが、ヒトＣＤ３（配列識別番号１２９）に結合する、ヘテロ二量体抗体を提供する。

追加の態様では、本発明は、ａ）ｉ）１）第１の可変重ドメインと、２）第１のＣＨ１ドメイン及び第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖と、３）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含むｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して当該ＣＨ１ドメインのＣ末端と当該第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合で付加される、ｓｃＦｖと、を含む第１の重鎖を含む第１の単量体と、ｂ
）第２のＦｃドメインを含む第２の単量体と、ｃ）可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、当該第１及び当該第２のＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択される１セットのアミノ酸置換を有し、当該第１の可変重ドメイン及び当該可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３８（配列識別番号１３１）に結合し、当該ｓｃＦｖが、ヒトＣＤ３（配列識別番号１２９）に結合する、ヘテロ二量体抗体を提供する。

追加の態様では、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択される１セットの変異体を含む第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインを含む。

さらなる態様では、ｓｃＦｖは、荷電リンカーであるｓｃＦｖリンカーを含む。

追加の態様では、本明細書に概要が記載されるヘテロ二量体抗体の重鎖定常ドメインは、アミノ酸置換Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含む。

さらなる態様では、本発明のヘテロ二量体抗体は、アミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む第１及び第２のＦｃドメインを有する。

追加の態様では、本発明は、本発明のヘテロ二量体抗体をコードする核酸組成物を提供し、当該組成物は、ａ）当該第１の単量体をコードする第１の核酸、ｂ）当該第２の単量体をコードする第２の核酸、及びｃ）当該軽鎖をコードする第３の核酸を含む。

さらなる態様では、本発明は、ａ）当該第１の単量体をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、ｂ）当該第２の単量体をコードする核酸を含む第２の発現ベクター、及びｃ）当該軽鎖をコードする核酸を含む第３の発現ベクターを含む発現ベクター組成物を提供する。本発明は、核酸組成物または発現ベクター組成物のいずれかを含む宿主細胞をさらに提供する。

本発明は、ヘテロ二量体抗体を作製する方法であって、当該抗体が発現される条件下で宿主細胞を培養することと、当該抗体を回収することとを含む、方法をさらに提供する。

本発明は、癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に本発明のヘテロ二量体抗体を投与することを含む、方法をさらに提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ａ）配列識別番号９１を有する第１の単量体と、
ｂ）配列識別番号９２を有する第２の単量体と、
ｃ）配列識別番号９３を有する軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体。
（項目２）
ａ）配列識別番号９１をコードする第１の核酸と、
ｂ）配列識別番号９２をコードする第２の核酸と、
ｃ）配列識別番号９３をコードする第３の核酸と、を含む、核酸組成物。
（項目３）
ａ）配列識別番号９１をコードする核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）配列識別番号９２をコードする核酸を含む第２の発現ベクターと、
ｃ）配列識別番号９３をコードする核酸を含む第３の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
（項目４）
項目２に記載の核酸組成物を含む、宿主細胞。
（項目５）
項目３に記載の発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
（項目６）
項目１に記載のヘテロ二量体抗体を作製する方法であって、前記抗体が発現される条件下で項目４または５に記載の宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することとを含む、方法。
（項目７）
癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に項目１に記載のヘテロ二量体抗体を投与することを含む、方法。
（項目８）
ａ）配列識別番号８９を有する第１の単量体と、
ｂ）配列識別番号８９を有する第２の単量体と、
ｃ）配列識別番号９０を有する軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体。
（項目９）
ａ）配列識別番号８８をコードする第１の核酸と、
ｂ）配列識別番号８９をコードする第２の核酸と、
ｃ）配列識別番号９０をコードする第３の核酸と、を含む、核酸組成物。
（項目１０）
ａ）配列識別番号８８をコードする核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）配列識別番号８９をコードする核酸を含む第２の発現ベクターと、
ｃ）配列識別番号９０をコードする核酸を含む第３の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
（項目１１）
項目９に記載の核酸組成物を含む、宿主細胞。
（項目１２）
項目１０に記載の発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
（項目１３）
項目８に記載のヘテロ二量体抗体を作製する方法であって、前記抗体が発現される条件下で項目１１または１２に記載の宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することとを含む、方法。
（項目１４）
癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に項目８に記載のヘテロ二量体抗体を投与することを含む、方法。
（項目１５）
ａ）
ｉ）第１のＦｃドメイン、ならびに
ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合で付加される、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、を含む、第１の単量体と、
ｂ）
ｉ）重可変ドメイン、及び
ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重定常ドメイン、を含む重鎖を含む第２の単量体と、
ｃ）可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、
前記ｓｃＦｖ可変軽ドメインが、配列識別番号１５を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号１６を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号１７を有するｖｌＣＤＲ３を含むＣＤ３
Ｌ１．４７のｖｌＣＤＲを含み、前記ｓｃＦｖ可変重ドメインが、配列識別番号１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号１２を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列識別番号１３を有するｖｈＣＤＲ３を含むＣＤ３Ｈ．３２のｖｌＣＤＲを含み、前記重可変ドメイン及び前記可変軽ドメインが、ＣＤ３８に結合する、ヘテロ二量体抗体。
（項目１６）
ａ）
ｉ）第１のＦｃドメイン、ならびに
ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合で付加される、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、を含む、第１の単量体と、
ｂ）
ｉ）重可変ドメイン、及び
ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重定常ドメイン、を含む重鎖を含む第２の単量体と、
ｃ）可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、
前記ｓｃＦｖ可変軽ドメインが、配列識別番号２４を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号２６を有するｖｌＣＤＲ３を含むＣＤ３
Ｌ１．４７のｖｌＣＤＲを含み、前記ｓｃＦｖ可変重ドメインが、配列識別番号２０を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号２１を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列識別番号２２を有するｖｈＣＤＲ３を含むＣＤ３Ｈ１．８９のｖｈＣＤＲを含み、前記重可変ドメイン及び前記可変軽ドメインが、ＣＤ３８に結合する、ヘテロ二量体抗体。
（項目１７）
ａ）
ｉ）第１のＦｃドメイン、ならびに
ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合で付加される、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、を含む、第１の単量体と、
ｂ）
ｉ）重可変ドメイン、及び
ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重定常ドメイン、を含む重鎖を含む第２の単量体と、
ｃ）可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、
前記ｓｃＦｖ可変軽ドメインが、配列識別番号３３を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号３４を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号３５を有するｖｌＣＤＲ３を含むＣＤ３
Ｌ１．４７のｖｌＣＤＲを含み、前記ｓｃＦｖ可変重ドメインが、配列識別番号２９を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号３０を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列識別番号３１を有するｖｈＣＤＲ３を含むＨ１．９０のｖｈＣＤＲを含み、前記重可変ドメイン及び前記可変軽ドメインが、ＣＤ３８に結合する、ヘテロ二量体抗体。
（項目１８）
ａ）
ｉ）第１のＦｃドメイン、ならびに
ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合で付加される、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、を含む、第１の単量体と、
ｂ）
ｉ）重可変ドメイン、及び
ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重定常ドメイン、を含む重鎖を含む第２の単量体と、
ｃ）可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、
前記ｓｃＦｖ可変軽ドメインが、配列識別番号４２を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４３を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４４を有するｖｌＣＤＲ３を含むＣＤ３
Ｌ１．４７のｖｌＣＤＲを含み、前記ｓｃＦｖ可変重ドメインが、配列識別番号３８を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号３９を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列識別番号４０を有するｖｈＣＤＲ３を含むＨ１．９０のｖｈＣＤＲを含み、前記重可変ドメイン及び前記可変軽ドメインが、ＣＤ３８に結合する、ヘテロ二量体抗体。
（項目１９）
前記可変軽ドメインが、配列ＲＡＳＱＮＶＤＴＷＶＡ（配列識別番号６９）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＳＡＳＹＲＹＳ（配列識別番号７０）を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列ＱＱＹＤＳＹＰＬＴ（配列識別番号７１）を有するｖｌＣＤＲ３を含み、前記可変重ドメインが、配列ＲＳＷＭＮ（配列識別番号６５）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＴＳＶＫＧ（配列識別番号６６）を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列ＹＧＮＷＦＰＹ（配列識別番号６７）を有するｖｈＣＤＲ３を含む、項目１５、１６、１７、または１８のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
（項目２０）
前記可変軽ドメインが、配列ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＮＶＤＴＷＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列識別番号６８）を有し、前記可変重ドメインが、配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＤＦＳＲＳＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＧＮＷＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列識別番号６４）を有する、項目１５、１６、１７、または１８に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目２１）
前記可変軽ドメインが、配列ＲＡＳＱＮＶＤＴＮＶＡ（配列識別番号７８）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＳＡＳＹＲＹＳ（配列識別番号７９）を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列ＱＱＹＤＳＹＰＬＴ（配列識別番号８０）を有するｖｌＣＤＲ３を含むＯＫＴ１０Ｌ１のｖｌＣＤＲを含み、前記可変重ドメインが、配列ＲＳＷＭＮ（配列識別番号７４）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＴＳＶＫＧ（配列識別番号７５）を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列ＹＧＮＷＦＰＹ（配列識別番号７６）を有するｖｈＣＤＲ３を含むＯＫＴ１０Ｈ１を含む、項目１５、１６、１７、または１８のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
（項目２２）
前記可変軽ドメインが、配列識別番号７７の配列を有し、前記可変重ドメインが、配列識別番号７３の配列を有する、項目１５、１６、１７、または１８のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
（項目２３）
前記可変軽ドメインが、配列ＲＡＳＱＮＶＤＴＷＶＡ（配列識別番号６０）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＳＡＳＹＲＹＳ（配列識別番号６１）を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列ＱＱＹＤＳＹＰＬＴ（配列識別番号６２）を有するｖｌＣＤＲ３を含むＯＫＴ１０Ｌ１．２４のｖｌＣＤＲを含み、前記可変重ドメインが、配列ＹＳＷＭＮ（配列識別番号５６）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＥＩＮＰＱＳＳＴＩＮＹＡＴＳＶＫＧ（配列識別番号５７）を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列ＹＧＮＷＦＰＹ（配列識別番号５８）を有するｖｈＣＤＲ３を含むＯＫＴ１０Ｈ１．７７のｖｌＣＤＲを含む、項目１５、１６、１７、または１８のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
（項目２４）
前記可変軽ドメインが、配列識別番号５９の配列を有し、前記可変重ドメインが、配列識別番号５５の配列を有する、項目１５、１６、１７、または１８のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
（項目２５）
前記第１のＦｃドメイン及び前記第２のＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択される１セットの変異体を含む、項目１５〜２４のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
（項目２６）
前記ｓｃＦｖリンカーが、荷電リンカーである、項目１５〜２５のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
（項目２７）
前記重鎖定常ドメインが、アミノ酸置換Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含む、項目１５〜２６のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
（項目２８）
前記第１及び第２のＦｃドメインが、アミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む、項目１５〜２７のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
（項目２９）
項目１５〜２８のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体をコードする核酸組成物であって、
ａ）前記第１の単量体をコードする第１の核酸と、
ｂ）前記第２の単量体をコードする第２の核酸と、
ｃ）前記軽鎖をコードする第３の核酸と、を含む、核酸組成物。
（項目３０）

ａ）前記第１の単量体をコードする核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）前記第２の単量体をコードする核酸を含む第２の発現ベクターと、
ｃ）前記軽鎖をコードする核酸を含む第３の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
（項目３１）
項目２９に記載の核酸組成物を含む、宿主細胞。
（項目３２）
項目３０に記載の発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
（項目３３）
項目１５〜２８のいずれかに従ってヘテロ二量体抗体を作製する方法であって、前記抗体が発現される条件下で項目３１または３２に記載の宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することとを含む、方法。
（項目３４）
癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に項目１５〜２８のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体を投与することを含む、方法。
（項目３５）
ａ）
ｉ）第１のＦｃドメイン、ならびに
ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合で付加される、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、を含む、第１の単量体と、
ｂ）
ｉ）重可変ドメイン、及び
ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメイン、を含む重鎖を含む第２の単量体と、
ｃ）可変軽ドメイン及び可変軽定常ドメインを含む軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、
前記可変軽ドメインが、配列ＲＡＳＱＮＶＤＴＷＶＡ（配列識別番号６０）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＳＡＳＹＲＹＳ（配列識別番号６１）を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列ＱＱＹＤＳＹＰＬＴ（配列識別番号６２）を有するｖｌＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３＿Ｌ１．４７からのｖｌＣＤＲを含み、前記可変重ドメインが、配列ＹＳＷＭＮ（配列識別番号５６を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＥＩＮＰＱＳＳＴＩＮＹＡＴＳＶＫＧ（配列識別番号５７）を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列ＹＧＮＷＦＰＹ（配列識別番号５８）を有するｖｈＣＤＲ３を含むＣＤ３Ｈ．１３０のｖｈＣＤＲを含む、ヘテロ二量体抗体。
（項目３６）
ａ）
ｉ）第１のＦｃドメイン、ならびに
ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合で付加される、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、を含む、第１の単量体と、
ｂ）
ｉ）重可変ドメイン、及び
ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメイン、を含む重鎖を含む第２の単量体と、
ｃ）可変軽ドメイン及び可変軽定常ドメインを含む軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、
前記可変軽ドメインが、配列ＲＡＳＱＮＶＤＴＷＶＡ（配列識別番号６９）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＳＡＳＹＲＹＳ（配列識別番号７０）を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列ＱＱＹＤＳＹＰＬＴ（配列識別番号７１）を有するｖｌＣＤＲ３を含み、前記可変重ドメインが、配列ＲＳＷＭＮ（配列識別番号６５）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＴＳＶＫＧ（配列識別番号６６）を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列ＹＧＮＷＦＰＹ（配列識別番号６７）を有するｖｈＣＤＲ３を含む、ヘテロ二量体抗体。
（項目３７）
前記可変軽ドメインが、配列ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＮＶＤＴＷＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列識別番号６８）を有し、前記可変重ドメインが、配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＤＦＳＲＳＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＴＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＧＮＷＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列識別番号６４）を有する、項目３６に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目３８）
ａ）
ｉ）第１のＦｃドメイン、ならびに
ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合で付加される、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、を含む、第１の単量体と、
ｂ）
ｉ）重可変ドメイン、及び
ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメイン、を含む重鎖を含む第２の単量体と、
ｃ）可変軽ドメイン及び可変軽定常ドメインを含む軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、
前記可変軽ドメインが、配列ＲＡＳＱＮＶＤＴＮＶＡ（配列識別番号７８）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＳＡＳＹＲＹＳ（配列識別番号７９）を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列ＱＱＹＤＳＹＰＬＴ（配列識別番号８０）を有するｖｌＣＤＲ３を含み、前記可変重ドメインが、配列ＲＳＷＭＮ（配列識別番号７４）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＴＳＶＫＧ（配列識別番号７５）を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列ＹＧＮＷＦＰＹ（配列識別番号７６）を有するｖｈＣＤＲ３を含む、ヘテロ二量体抗体。
（項目３９）
前記可変軽ドメインが、配列識別番号７７の配列を有し、前記可変重ドメインが、配列識別番号７３の配列を有する、項目３８に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目４０）
前記ｓｃＦｖが、配列識別番号１８の配列を有する、項目３５、３６、または３８に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目４１）
前記ｓｃＦｖが、配列識別番号２７の配列を有する、項目３５、３６、または３８に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目４２）
前記ｓｃＦｖが、配列識別番号３６の配列を有する、項目３５、３６、または３８に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目４３）
前記ｓｃＦｖが、配列識別番号４５の配列を有する、項目３５、３６、または３８に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目４４）
前記ｓｃＦｖが、配列識別番号５４の配列を有する、項目３５、３６、または３８に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目４５）
ａ）
ｉ）
１）第１の可変重ドメインと、
２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖と、
３）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含むｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して前記ＦｃドメインのＣ末端に共有結合で付加される、ｓｃＦｖと、を含む第１の重鎖を含む第１の単量体と、
ｂ）第２の可変重ドメインを含む第２の重鎖及び第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む第２の単量体と、
ｃ）可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む共通の軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、
前記第１及び前記第２のＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択される１セットのアミノ酸置換を有し、前記第１の可変重ドメイン及び前記可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３８（配列識別番号１３１）に結合し、前記第２の可変重ドメイン及び前記可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３８（配列識別番号１３１）に結合し、前記ｓｃＦｖが、ヒトＣＤ３（配列識別番号１２９）に結合する、ヘテロ二量体抗体。
（項目４６）
前記ｓｃＦｖが、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３５５１）、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１５４２６）、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３４２３）、及び配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１４７０２）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、項目４５に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目４７）
前記第１の可変重ドメイン及び前記可変軽ドメインが、配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１５３３１）、配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１５４２６）、配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１３２４３）、ならびに配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１４７０２）からなるドメインの対から選択される１対のドメインである、項目４５に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目４８）
ａ）
ｉ）
１）第１の可変重ドメインと、
２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重ドメインと、
３）第１の可変軽ドメインであって、ドメインリンカーを使用して前記第１のＦｃドメインのＣ末端に共有結合で付加される、第１の可変軽ドメインと、を含む第１の重鎖を含む第１の単量体と、
ｂ）
ｉ）第２の可変重ドメインと、
ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む第２の定常重ドメインと、
ｉｉｉ）第３の可変重ドメインであって、前記第２の可変重ドメインが、ドメインリンカーを使用して前記第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合で付加される、第３の可変重ドメインと、を含む第２の単量体と、
ｃ）可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む共通の軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、
前記第１及び前記第２のＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択される１セットのアミノ酸置換を有し、前記第１の可変重ドメイン及び前記可変軽ドメインが、第１の抗原に結合し、前記第２の可変重ドメイン及び前記可変軽ドメインが、前記第１の抗原に結合し、前記第２の可変軽ドメイン及び前記第３の可変重ドメインが、第２の抗原に結合する、ヘテロ二量体抗体。
（項目４９）
前記ｓｃＦｖが、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３５５１）、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１５４２６）、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３４２３）、及び配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１４７０２）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、項目４８に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目５０）
前記第１の可変重ドメイン及び前記可変軽ドメインが、配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１５３３１）、配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１５４２６）、配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１３２４３）、ならびに配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１４７０２）からなるドメインの対から選択される１対のドメインである、項目４８に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目５１）
ａ）
ｉ）
１）第１の可変重ドメインと、
２）第１のＣＨ１ドメイン及び第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖と、
３）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含むｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して前記ＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合で付加される、ｓｃＦｖと、を含む第１の重鎖とを含む第１の単量体と、
ｂ）第２の可変重ドメインを含む第２の重鎖及び第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む第２の単量体と、
ｃ）可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む共通の軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、
前記第１及び前記第２のＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択される１セットのアミノ酸置換を有し、前記第１の可変重ドメイン及び前記可変軽ドメインが、第１の抗原に結合し、前記第２の可変重ドメイン及び前記可変軽ドメインが、前記第１の抗原に結合し、前記ｓｃＦｖが、第２の抗原に結合する、ヘテロ二量体抗体。
（項目５２）
前記ｓｃＦｖが、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３５５１）、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１５４２６）、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３４２３）、及び配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１４７０２）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、項目５１に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目５３）
前記第１の可変重ドメイン及び前記可変軽ドメインが、配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１５３３１）、配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１５４２６）、配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１３２４３）、ならびに配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１４７０２）からなるドメインの対から選択される１対のドメインである、項目５１に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目５４）
ａ）
ｉ）
１）第１の可変重ドメインと、
２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重ドメインと、
３）第１の可変軽ドメインであって、前記第２の可変軽ドメインが、ドメインリンカーを使用して前記第１の定常重ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合で付加される、第１の可変軽ドメインと、を含む第１の重鎖とを含む第１の単量体と、
ｂ）
ｉ）第２の可変重ドメインと、
ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む第２の定常重ドメインと、
ｉｉｉ）第３の可変重ドメインであって、前記第２の可変重ドメインが、ドメインリンカーを使用して前記第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合で付加される、第３の可変重ドメインと、を含む第２の単量体と、
ｃ）可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む共通の軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、
前記第１及び前記第２のＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択される１セットのアミノ酸置換を有し、前記第１の可変重ドメイン及び前記可変軽ドメインが、第１の抗原に結合し、前記第２の可変重ドメイン及び前記可変軽ドメインが、前記第１の抗原に結合し、前記第２の可変軽ドメイン及び前記第３の可変重ドメインが、第２の抗原に結合する、ヘテロ二量体抗体。
（項目５５）
前記ｓｃＦｖが、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３５５１）、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１５４２６）、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３４２３）、及び配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１４７０２）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、項目５４に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目５６）
前記第１の可変重ドメイン及び前記可変軽ドメインが、配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１５３３１）、配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１５４２６）、配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１３２４３）、ならびに配列識別番号ＸＸ及び配列識別番号ＸＸ（ｖｈ及びｖｌ１４７０２）からなるドメインの対から選択される１対のドメインである、項目５４に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目５７）
ａ）
ｉ）
１）第１の可変重ドメインと、
２）第１のＣＨ１ドメイン及び第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖と、
３）ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含むｓｃＦｖであって、ドメインリンカーを使用して前記ＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合で付加される、ｓｃＦｖと、を含む第１の重鎖とを含む第１の単量体と、
ｂ）第２のＦｃドメインを含む第２の単量体と、
ｃ）可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む軽鎖と、を含む、ヘテロ二量体抗体であって、
前記第１及び前記第２のＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択される１セットのアミノ酸置換を有し、前記第１の可変重ドメイン及び前記可変軽ドメインが、第１の抗原に結合し、前記ｓｃＦｖが、第２の抗原に結合する、ヘテロ二量体抗体。
（項目５８）
前記ｓｃＦｖが、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３５５１）、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１５４２６）、配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３４２３）、及び配列識別番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１４７０２）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、項目５７に記載のヘテロ二量体抗体。

図１Ａ及び１Ｂは、本発明のいくつかの形式を示す。「ボトルオープナー」形式の２つの形態が示され、１つは、ｓｃＦｖを含む抗ＣＤ３抗原結合ドメイン、及びＦａｂを含む抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを有し、１つはこれらの逆を有する。ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中心ｓｃＦｖ、及び中心Ｆｖ形式がすべて示される。さらに、１つの単量体がＦｃドメインのみを含む「ワンアーム化（ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ）」形式であるワンアーム中心ｓｃＦｖ及びワンアーム中心Ｆｖの両方が示される。二重ｓｃＦｖ形式もまた示される。図１Ａ及び１Ｂは、本発明のいくつかの形式を示す。「ボトルオープナー」形式の２つの形態が示され、１つは、ｓｃＦｖを含む抗ＣＤ３抗原結合ドメイン、及びＦａｂを含む抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを有し、１つはこれらの逆を有する。ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中心ｓｃＦｖ、及び中心Ｆｖ形式がすべて示される。さらに、１つの単量体がＦｃドメインのみを含む「ワンアーム化（ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ）」形式であるワンアーム中心ｓｃＦｖ及びワンアーム中心Ｆｖの両方が示される。二重ｓｃＦｖ形式もまた示される。可変重及び軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌ及びｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む「高ＣＤ３」抗ＣＤ３＿Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７構築物の配列を示す。図に示す配列のすべてにあてはまるように、この荷電リンカーは、必要に応じて、非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーによって置き換えられ得る。可変重及び軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌ及びｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む「高中間（Ｈｉｇｈ−Ｉｎｔ）＃１」抗ＣＤ３＿Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７構築物の配列を示す。図に示す配列のすべてにあてはまるように、この荷電リンカーは、必要に応じて、非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーによって置き換えられ得る。可変重及び軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌ及びｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む「高中間＃２」抗ＣＤ３＿Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７構築物の配列を示す。図に示す配列のすべてにあてはまるように、この荷電リンカーは、必要に応じて、非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーによって置き換えられ得る。可変重及び軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌ及びｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む「高中間＃３」抗ＣＤ３＿Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７構築物の配列を示す。図に示す配列のすべてにあてはまるように、この荷電リンカーは、必要に応じて、非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーによって置き換えられ得る。可変重及び軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌ及びｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む「中間」抗ＣＤ３＿Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７構築物の配列を示す。図に示す配列のすべてにあてはまるように、この荷電リンカーは、必要に応じて、非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーによって置き換えられ得る。可変重及び軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌ及びｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む「低」抗ＣＤ３＿Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７構築物の配列を示す。図に示す配列のすべてにあてはまるように、この荷電リンカーは、必要に応じて、非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーによって置き換えられ得る。可変重及び軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌ及びｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む高ＣＤ３８：ＯＫＴ１０＿Ｈ１．７７＿Ｌ１．２４構築物の配列を示す。可変重及び軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌ及びｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む中間ＣＤ３８：ＯＫＴ１０＿Ｈ１Ｌ１．２４構築物の配列を示す。可変重及び軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌ及びｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む低ＣＤ３８：ＯＫＴ１０＿Ｈ１Ｌ１構築物の配列を示す。ＸＥＮＰ１５３３１の配列を示す。ＸＥＮＰ１３２４３の配列を示す。ＸＥＮＰ１４７０２の配列を示す。ＸＥＮＰ１５４２６の配列を示す。ＸＥＮＰ１４７０１の配列を示す。ＸＥＮＰ１４７０３の配列を示す。ＸＥＮＰ１３２４３の配列を示す。ＸＥＮＰ１８９６７の配列を示す。ＸＥＮＰ１８９７１の配列を示す。ＸＥＮＰ１８９６９の配列を示す。ＸＥＮＰ１８９７０の配列を示す。ＸＥＮＰ１８９７２の配列を示す。ＸＥＮＰ１８９７３の配列を示す。ＸＥＮＰ１５０５５の配列を示す。ＸＥＮＰ１３５４４の配列を示す。ＸＥＮＰ１３６９４の配列を示す。ヒトＣＤ３εの配列を示す。ヒトＣＤ３８タンパク質の全長（配列識別番号１３０）及び細胞外ドメイン（ＥＣＤ、配列識別番号１３１）を示す。図２９Ａ〜２９Ｅは、ヘテロ二量体化変異体のセットの有用な対（歪曲及びｐＩ変異体を含む）を示す。図２９Ａ〜２９Ｅは、ヘテロ二量体化変異体のセットの有用な対（歪曲及びｐＩ変異体を含む）を示す。図２９Ａ〜２９Ｅは、ヘテロ二量体化変異体のセットの有用な対（歪曲及びｐＩ変異体を含む）を示す。図２９Ａ〜２９Ｅは、ヘテロ二量体化変異体のセットの有用な対（歪曲及びｐＩ変異体を含む）を示す。図２９Ａ〜２９Ｅは、ヘテロ二量体化変異体のセットの有用な対（歪曲及びｐＩ変異体を含む）を示す。等比体積変異体抗体の定常領域、及びそのそれぞれの置換の一覧を示す。ｐＩ＿（−）は、より低いｐＩ変異体を示し、ｐＩ＿（＋）は、より高いｐＩ変異体を示す。これらは、本発明の他の二量体化変異体と、（かつ本明細書に概要が記載されるとおり、他の変異体の型と）任意選択かつ独立に組み合わせることができる。ＦｃγＲ結合を消去する有用な消去変異体（「ノックアウト」または「ＫＯ」変異体と呼ばれることがある）を示す。本発明の２つの特に有用な実施形態を示す。図３３は、１つ以上のｓｃＦｖを成分として利用するヘテロ二量体抗体のｐＩを増加または減少させることにおいて有用である多くの荷電ｓｃＦｖリンカーを示す。単一電荷を有する、単一の先行技術ｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ６（８）：９８９−９９５（１９９３）にちなんで、「Ｗｈｉｔｌｏｗ」と呼ばれる。このリンカーは、ｓｃＦｖにおいて、凝集の低減、及びタンパク質分解に対する安定性の増進に向けて使用されることに留意されたい。図３３は、１つ以上のｓｃＦｖを成分として利用するヘテロ二量体抗体のｐＩを増加または減少させることにおいて有用である多くの荷電ｓｃＦｖリンカーを示す。単一電荷を有する、単一の先行技術ｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ６（８）：９８９−９９５（１９９３）にちなんで、「Ｗｈｉｔｌｏｗ」と呼ばれる。このリンカーは、ｓｃＦｖにおいて、凝集の低減、及びタンパク質分解に対する安定性の増進に向けて使用されることに留意されたい。操作されたヘテロ二量体歪曲Ｆｃ変異体の一覧をヘテロ二量体の収率（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸにより決定）及び熱安定性（ＤＳＣにより決定）と共に示す。未決定の熱安定性は、「ｎ．ｄ．」と示される。タンパク質Ａの親和性精製後の二重特異性体の発現量である。陽イオン交換精製クロマトグラムである。再配向化Ｔ細胞細胞傷害性アッセイ、２４時間のインキュベーション、１０，０００個のＲＰＭＩ８２２６細胞、４００，０００個のＴ細胞である。試験物は、抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性体である。検出は、ＬＤＨが使用された。再配向化Ｔ細胞細胞傷害性アッセイ、２４時間のインキュベーション、１０，０００個のＲＰＭＩ８２２６細胞、５００，０００個のヒトＰＢＭＣである。試験物は、抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性体である。検出は、ＬＤＨが使用された。ＸＥＮＰ１４４１９の配列を示す。ＸＥＮＰ１４４２０の配列を示す。ＸＥＮＰ１４４２１の配列を示す。ＸＥＮＰ１４４２２の配列を示す。ＸＥＮＰ１４４２３の配列を示す。再配向化Ｔ細胞細胞傷害性アッセイ、９６時間のインキュベーション、４０，０００個のＲＰＭＩ８２２６細胞、４００，０００個のヒトＰＢＭＣである。試験物は、抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃｓである。検出は、フローサイトメトリー、特にＣＤ３８＋細胞の消失が使用された。図１において説明される再配向化Ｔ細胞細胞傷害性アッセイのさらなる分析である。第１の列は、フローサイトメトリーによって検出されるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上の活性化マーカーＣＤ６９の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。第２の列は、細胞増殖の尺度であるＫｉ−６７＋であるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。第３の列は、フローサイトメトリーによって検出されるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上のグランザイムＢ阻害剤ＰＩ−９の細胞内平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性体の抗腫瘍活性を調べるためのマウス研究の計画である。時間及び処置の関数としてＩＶＩＳ（登録商標）によって測定された腫瘍サイズであるＩＶＩＳ（登録商標）生物発光画像（１０日目）である示された試験物の単回投与後のカニクイザルにおけるＣＤ３８^＋細胞の欠乏であるカニクイザルにおいてＣＤ６９平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定されたＴ細胞活性化であり、色識別は図４９のとおりである。示された試験物の単回投与後のＩＬ−６の血清中レベルである。ＸＥＮＰ１５４２７の配列を示す。ＸＥＮＰ１５４２８の配列を示す。ＸＥＮＰ１５４２９の配列を示す。ＸＥＮＰ１５４３０の配列を示す。ＸＥＮＰ１５４３１の配列を示す。ＸＥＮＰ１５４３２の配列を示す。ＸＥＮＰ１５４３３の配列を示す。ＸＥＮＰ１５４３４の配列を示す。ＸＥＮＰ１５４３５の配列を示す。ＸＥＮＰ１５４３６の配列を示す。ＸＥＮＰ１５４３７の配列を示す。ＸＥＮＰ１５４３８の配列を示す。Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにおける結合親和性を示す。軽鎖、Ｆａｂ−Ｆｃ、及びｓｃＦｖ−Ｆｃの比を変更して使用し、安定プールを生成させた際のヘテロ二量体の純度を示す。ｈｕＰＢＭＣマウスモデルにおける抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体によるヒトＩｇＭ及びヒトＩｇＧ２の欠乏である。図６７は、安定性が最適化された、ヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖを示す。置換は、Ｈ１＿Ｌ１．４ｓｃＦｖ配列に対して与えられている。アミノ酸の番号付けは、Ｋａｂａｔの番号付けである。図６７は、安定性が最適化された、ヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖを示す。置換は、Ｈ１＿Ｌ１．４ｓｃＦｖ配列に対して与えられている。アミノ酸の番号付けは、Ｋａｂａｔの番号付けである。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。図６８。安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列、（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が記載される。再配向化Ｔ細胞細胞傷害性アッセイ、２４時間のインキュベーション、１０，０００個のＲＰＭＩ８２２６細胞、５００，０００個のＰＢＭＣである。試験物は、抗ＣＤ３８（ＯＫＴ１０＿Ｈ１Ｌ１、ＯＫＴ１０＿Ｈ１．７７＿Ｌ１．２４）×抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃｓである。検出は、ＬＤＨが使用された。ｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤＩｇ欠乏研究である。試験物は、０．０３、０．３、または３ｍｇ／ｋｇでＰＢＭＣ移植後の８日目に投与された。投与経路は腹腔内であった。血液試料は、ＰＢＭＣ移植後の１４日目に採取され、処理して血清とし、ヒトＩｇＭ及びＩｇＧ２をアッセイされた。ＸＥＮＰ１８９６７抗ＣＤ３８の配列を示す。ＸＥＮＰ１８９７１の配列を示す。ＸＥＮＰ１８９６９の配列を示すＸＥＮＰ１８９７０の配列を示す。ＸＥＮＰ１８９７２の配列を示す。ＸＥＮＰ１８９７３の配列を示す。本発明の実施形態の可能性のある組み合わせのマトリックスを示す。「Ａ」は、参照されるＣＤ３配列のＣＤＲが、左手側でＣＤ３８構築物のＣＤＲと組み合わせることができることを意味する。すなわち、例えば左上のセルについて、可変重鎖ＣＤ３Ｈ１．３０配列からのｖｈＣＤＲ及びＣＤ３Ｌ１．４７配列の可変軽鎖からのｖｌＣＤＲが、ＣＤ３８ＯＫＴ１０Ｈ１．７７配列からのｖｈＣＤＲ及びＯＫＴ１０Ｌ１．２４配列からのｖｌＣＤＲと組み合わせることができるということである。「Ｂ」は、ＣＤ３構築物からのＣＤＲが、ＣＤ３８構築物からの可変重及び軽ドメインと組み合わせることができることを意味する。すわなち、例えば左上のセルについて、可変重鎖ＣＤ３Ｈ１．３０配列からのｖｈＣＤＲ及びＣＤ３Ｌ１．４７配列の可変軽鎖からのｖｌＣＤＲが、可変重ドメインＣＤ３８ＯＫＴ１０Ｈ１．７７配列及びＯＫＴ１０Ｌ１．２４配列と組み合わせることができるということである。「Ｃ」は、ＣＤ３配列からの可変重ドメイン及び可変軽ドメインが、ＣＤ３８配列のＣＤＲと共に使用されるように逆にされる。「Ｄ」では、それぞれからの可変重及び可変軽鎖の両方が組み合わされる。「Ｅ」では、ＣＤ３のｓｃＦｖが、ＣＤ３８抗原結合ドメイン構築物のＣＤＲと共に使用され、「Ｆ」では、ＣＤ３のｓｃＦｖが、ＣＤ３８抗原結合ドメインの可変重及び可変軽ドメインと共に使用される。

Ｉ．定義
本出願をより完全に理解し得るために、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的に等価であるものを包含することを意図する。

本明細書では、「消去」は、活性の低減または除去を意味する。したがって、たとえば、「ＦｃγＲ結合の消去」は、特定の変異体を含まないＦｃ領域と比較して、Ｆｃ領域アミノ酸変異体が、出発結合の５０％未満を有することを意味し、活性を７０〜８０〜９０〜９５〜９８％喪失していることが好ましく、一般に、活性は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにおいて、検出可能な結合水準を下回る。ＦｃγＲ結合の消去において特に使用されるものは、図１６に示されるものである。

本明細書では、「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞傷害」は、細胞が媒介する反応であり、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性の細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の溶解を引き起こすことを意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合と相関しており、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合の増加は、ＡＤＣＣ活性の増加につながる。

本明細書では、「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞貪食は、細胞が媒介する反応であり、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性の細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の貪食を引き起こすことを意味する。

本明細書では、「改変」は、ポリペプチド配列における、アミノ酸の置換、挿入、及び／若しくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分に対する変更を意味する。例えば、改変は、糖質の変更またはタンパク質に付加されたＰＥＧ構造であってよい。本明細書では、「アミノ酸改変」は、ポリペプチド配列における、アミノ酸の置換、挿入、及び／または欠失を意味する。明確化に向けた説明として、別段の記載が無い限り、アミノ酸改変は、常に、ＤＮＡよってコードされるアミノ酸への改変であり、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡにおいてコドンを有する２０個のアミノ酸である。

本明細書では、「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列における特定位置で、アミノ酸を異なるアミノ酸と置き換えることを意味する。具体的には、いくつかの実施形態では、置換は、特定位置で自然発生しないアミノ酸に対するものであり、生物内において、または何らかの生物において、いずれでも自然発生しない。例えば、置換Ｅ２７２Ｙは、変異体ポリペプチドを指し、この場合、位置２７２で、グルタミン酸が、チロシンで置き換えられているＦｃ変異体である。明確化に向けた説明として、核酸がコードする配列が変わるように操作されているが、出発アミノ酸から変えていないタンパク質（例えば、ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（依然としてアルギニンをコードする）へと交換すると、宿主組織の発現水準は増加する）は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同一タンパク質をコードする新しい遺伝子が創出されているにもかかわらず、タンパク質が、出発時の特定位置に、同一のアミノ酸を有するのであれば、それは、アミノ酸置換ではない。

本明細書では、「アミノ酸挿入」または「挿入」は、親ポリペプチド配列における特定位置でのアミノ酸配列の追加を意味する。例えば、−２３３Ｅまたは２３３Ｅは、位置２３３の後かつ位置２３４の前でのグルタミン酸の挿入を指定する。さらに、−２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、位置２３３の後かつ位置２３４の前でのＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を指定する。

本明細書では、「アミノ酸欠失」または「欠失」は、親ポリペプチド配列における特定位置でのアミノ酸配列の除去を意味する。例えば、Ｅ２３３−またはＥ２３３＃またはＥ２３３（）は、位置２３３でグルタミン酸の欠失を指定する。さらに、ＥＤＡ２３３−またはＥＤＡ２３３＃は、位置２３３から始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を指定する。

本明細書では、「変異体タンパク質」または「タンパク質変異体」または「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸改変の理由によって、親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、またはそれをコードするアミノ配列を指してよい。好ましくは、タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を有し、例えば、親と比較して、約１〜約７０個のアミノ酸改変、好ましくは、約１〜約５個のアミノ酸改変を有する。以下に説明されるとおり、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えば、Ｆｃ親ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来のＦｃ領域などのヒト野生型配列であるが、変異体を有するヒト配列は、「親ポリペプチド」、例えば図１９のＩｇＧ１／２ハイブリッドとしても働くことができる。本明細書に記載されるタンパク質変異体配列は、好ましくは、親タンパク質配列との比較で、少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは、少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９５〜９８〜９９％の同一性を有する。変異体タンパク質は、変異体タンパク質自体、タンパク質変異体を含む組成物、またはそれをコードするＤＮＡ配列を指し得る。したがって、本明細書では、「抗体変異体」または「変異体抗体」は、少なくとも１つのアミノ酸改変の理由によって、親抗体と異なる抗体を意味し、本明細書では、「ＩｇＧ変異体」または「変異体ＩｇＧ」は、少なくとも１つのアミノ酸改変の理由によって、親ＩｇＧ（再度記載するが、多くの場合、ヒトＩｇＧ配列由来）と異なる抗体を意味し、本明細書では、「イムノグロブリン変異体」または「変異体イムノグロブリン」は、少なくとも１つのアミノ酸改変の理由によって親イムノグロブリン配列のそれと異なるイムノグロブリン配列を意味する。本明細書で使用される「Ｆｃ変異体」または「変異体Ｆｃ」は、Ｆｃドメインにおいてアミノ酸改変を含むタンパク質を意味する。本発明のＦｃ変異体は、それを構成するアミノ酸改変に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓまたは４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して、位置４３４で置換セリンを有するＦｃ変異体であり、番号付けは、ＥＵインデックスに従うものである。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して、置換Ｍ４２８Ｌ及び置換Ｎ４３４Ｓを有するＦｃ変異体を定義する。ＷＴアミノ酸の同一性が、特定されていなくてもよく、その場合、先に記載した変異体は、４２８Ｌ／４３４Ｓと呼ばれる。置換が提供される規則は任意であることに留意されたい。つまり、例えば、４２８Ｌ／４３４Ｓは、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同一のＦｃ変異体である等である。本発明において論じられ、抗体に関連する位置のすべてで、別段の記載が無い限り、アミノ酸位置の番号付けは、ＥＵインデックスに従うものである。ＥＵインデックス、またはＫａｂａｔ若しくはＥＵの番号付けスキームにあるようなＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の番号付けを指す（Ｅｄｅｌｍａｎｅｔａｌ．，１９６９，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ６３：７８−８５の全体が、これにより、参照によって、本明細書に組み込まれる。）。改変は、追加、欠失、または置換であり得る。置換は、自然発生するアミノ酸を含み得、場合によっては、合成アミノ酸を含み得る。例には、米国特許第６，５８６，２０７号、ＷＯ９８／４８０３２、ＷＯ０３／０７３２３８、ＵＳ２００４−０２１４９８８Ａ１、ＷＯ０５／３５７２７Ａ２、ＷＯ０５／７４５２４Ａ２、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎｅｔａｌ．，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ１２４：９０２６−９０２７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ１１：１１３５−１１３７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，ｅｔａｌ．，（２００２），ＰＩＣＡＳＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ９９：１１０２０−１１０２４、及びＬ．Ｗａｎｇ，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．１−１０が含まれ、これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる。

本明細書では、本明細書に記載される「タンパク質」は、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドが含まれる。ペプチジル基は、自然発生するアミノ酸及びペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造、すなわち、ペプトイドなどの「アナログ」を含んでよい（Ｓｉｍｏｎｅｔａｌ．，ＰＮＡＳＵＳＡ８９（２０）：９３６７（１９９２）参照。参照によって、全体が組み込まれる）。アミノ酸は、自然発生または合成（例えば、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸ではない）のいずれでもよく、当業者によって理解されるとおりである。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリン、オルニチン、及びノルロイシンは、本発明の目的に向けた合成アミノ酸であると考えられ、Ｄ及びＬ（ＲまたはＳ）で形成されたアミノ酸の両方を利用してよい。本発明の変異体は、例えば、Ｓｃｈｕｌｔｚらによって開発された技術を使用して組み込まれた合成アミノ酸の使用を含む改変を含んでよく、限定はされないが、Ｃｒｏｐｐ＆Ｓｈｕｌｔｚ，２００４，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．２０（１２）：６２５−３０、Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，２００４，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０１（２）：７５６６−７１、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２００３，３０３（５６５６）：３７１−３、及びＣｈｉｎｅｔａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１（５６３５）：９６４−７によって説明される方法が含まれ、これらはすべて、全体が、参照によって組み込まれる。さらに、ポリペプチドは、１つまたは複数の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、及びペプチドタグまたはペプチド標識の追加を含んでよい。

本明細書では、「残基」は、タンパク質における位置を意味し、アミノ酸同一性と関連する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７とも呼ばれる）は、ヒト抗体ＩｇＧ１における位置２９７の残基である。

本明細書では、「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」は、ＶＨイムノグロブリンドメイン、ＣＨ１イムノグロブリンドメイン、ＶＬイムノグロブリンドメイン、及びＣＬイムノグロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、この領域を単独で指してよく、または全長抗体、抗体断片、若しくはＦａｂ融合タンパク質の構成におけるこの領域を指してよい。本明細書では、「Ｆｖ」または「Ｆｖ断片」または「Ｆｖ領域」は、単一抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。当業者によって理解されるように、これらは一般に、２つの鎖で作り上げられている。

本明細書では、「ＩｇＧサブクラス改変」または「アイソタイプ改変」は、１つのＩｇＧアイソタイプの１つのアミノ酸を、異なる、位置合わせされたＩｇＧアイソタイプにおいて、対応するアミノ酸に変換するアミノ酸改変を意味する。例えば、ＥＵ位置２９６に、ＩｇＧ１は、チロシンを含み、ＩｇＧ２は、フェニルアラニンを含むため、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス改変であると考えられる。

本明細書では、「非自然発生改変」は、アイソタイプではないアミノ酸改変を意味する。例えば、ＩｇＧのいずれも位置４３４にセリンを含まないため、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４（またはそのハイブリッド）における置換４３４Ｓは、非自然発生改変であると考えられる。

本明細書では、「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」は、ＤＮＡ及びＲＮＡによってコードされる自然に発生する２０個のアミノ酸の１つを意味する。

本明細書では、「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域と、Ｆｃ受容体またはＦｃリガンドとの相互作用からもたらされる生化学的現象を意味する。エフェクター機能には、限定はされないが、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣが含まれる。

本明細書では、「ＩｇＧＦｃリガンド」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、何らかの生物由来の分子、好ましくは、ポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、限定はされないが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインＡ、ブドウ球菌プロテインＧ、及びウイルスＦｃγＲが含まれる。Ｆｃリガンドは、ＦｃγＲに相同性のＦｃ受容体のファミリーであるＦｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）（Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，２００２，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ１９０：１２３−１３６の全体が、参照によって、組み込まれる）も含む。Ｆｃリガンドには、Ｆｃに結合する未発見分子を含まれてよい。特定のＩｇＧＦｃリガンドは、ＦｃＲｎ及びＦｃガンマ受容体である。本明細書では、「Ｆｃリガンド」は、抗体のＦｃ領域に結合し、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、何らかの生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。

本明細書では、「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、または「ＦｃガンマＲ」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合するタンパク質ファミリーの何らかのメンバーを意味し、ＦｃγＲ遺伝子によってコードされる。ヒトにおいては、このファミリーには、限定はされないが、アイソフォームＦｃγＲＩａ、アイソフォームＦｃγＲＩｂ、及びアイソフォームＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びアロタイプＲ１３１を含む）、アイソフォームＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１及びＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びアロタイプＦ１５８を含む）、及びアイソフォームＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ１及びアロタイプＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓｅｔａｌ．，２００２，ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ８２：５７−６５の全体が、参照によって組み込まれる）、ならびに何らかの未発見のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォーム若しくはＦｃγＲアロタイプが含まれる。ＦｃγＲは、何らかの生物由来であってよく、限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルが含まれる。マウスＦｃγＲには、限定はされないが、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに何らかの未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォーム若しくはＦｃγＲアロタイプが含まれる。

本明細書では、「ＦｃＲｎ」または「新生児型Ｆｃ受容体」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合するタンパク質を意味し、少なくとも一部がＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。ＦｃＲｎは、何らかの生物由来であってよく、限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルが含まれる。当該技術分野で知られるように、機能性ＦｃＲｎタンパク質は、２つのポリペプチドを含み、重鎖及び軽鎖と呼ばれることが多い。軽鎖は、ベータ−２−ミクログロブリンであり、重鎖は、ＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。別段の記載が無い限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖のベータ−２−ミクログロブリンとの複合体を指す。ＦｃＲｎ受容体に対する結合の増加に使用され、場合によっては、血清半減期の増加に使用される様々なＦｃＲｎ変異体が、図８３の図の説明に示される。

本明細書では、「親ポリペプチド」は、後に改変されて変異体が生成する出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、自然発生するポリペプチド、または変異体、または自然発生するポリペプチドの操作された型であってよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。したがって、本明細書では、「親イムノグロブリン」は、改変されて変異体が生成する未改変イムノグロブリンポリペプチドを意味し、本明細書では、「親抗体」は、改変されて変異体抗体を生成する未改変抗体を意味する。「親抗体」は、以下に概要が記載される、既知であって、市販の、組換えで産生される抗体を含む。

本明細書では、「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、第１の定常領域イムノグロブリンドメイン、及び場合によっては、ヒンジ部分を除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域イムノグロブリンドメイン、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域イムノグロブリンドメイン、ならびにこうしたドメインに対する可動性のヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭ向けに、Ｆｃは、Ｊ鎖を含んでよい。ＩｇＧ向けに、Ｆｃドメインは、イムノグロブリンドメインＣγ２及びイムノグロブリンドメインＣγ３（Ｃγ２及びＣγ３）、ならびにＣγ１（Ｃγ１）及びＣγ２（Ｃγ２）の間の下位ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は、変わってよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、残基Ｃ２２６または残基Ｐ２３０をそのカルボキシ末端に含めると定義されることが通常であり、番号付けは、Ｋａｂａｔにあるように、ＥＵインデックスによるものである。いくつかの実施形態では、以下に、より完全に説明されるように、アミノ酸改変が、Ｆｃ領域に対してなされることで、例えば、１つまたは複数のＦｃγＲ受容体に対する結合、またはＦｃＲｎ受容体に対する結合が変わる。

本明細書では、「重定常領域」は、抗体のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分を意味する。

本明細書では、「Ｆｃ融合タンパク質」または「イムノアドヘシン」は、Ｆｃ領域を含むタンパク質を意味し、当該Ｆｃ領域は、一般に、本明細書で説明される、標的タンパク質に対する結合部分などの異なるタンパク質に、連結（任意選択で、本明細書で説明されるリンカー部分を介する）される。いくつかの場合では、ヘテロ二量体抗体の一方の単量体は、抗体重鎖（ｓｃＦｖを含むか、または軽鎖をさらに含むかのいずれか）を含み、もう一方の単量体はＦｃ融合であり、変異体Ｆｃドメイン及びリガンドを含む。いくつかの実施形態では、これらの「半抗体半融合タンパク質」は、「融合体」と呼ばれる。

本明細書では、「位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）」は、タンパク質の配列における場所（ｌｏｃａｔｉｏｎ）を意味する。位置は、連続して番号付けしてよく、または確立された形式に従ってよく、例えば、抗体の番号付けのためのＥＵインデックスに従ってよい。

本明細書では、「標的抗原」は、所与の抗体の可変領域によって特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、糖質、脂質、または他の化学化合物であってよい。幅広い数の適した標的抗原が以下に説明される。

本明細書に記載される、本発明のヘテロ二量体抗体の単量体の構成における「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は、「適合」するＤＮＡの２つの鎖（ｓｔｒａｎｄ）と同様に、ヘテロ二量体化変異体が、「適合」してヘテロ二量体を形成する能力を保つように、それぞれの単量体へと取り込まれることを意味する。例えば、いくつかのｐＩ変異体が、単量体Ａへと操作導入されている（例えば、ｐＩを高くする）のであれば、「電荷対」である立体変異体も利用することができ、ｐＩ変異体を妨害しない。例えば、ｐＩを高くする電荷変異体を、同一「鎖」または同一「単量体」に加えることにより、両機能性が保持される。同様に、以下により完全に概要が記載される組の対で起こる「歪曲」変異体については、当業者は、ｐＩ分離も歪曲のｐＩを使用して最大になるように、１セットの対を組み込む鎖または単量体のどれが機能するか決定するときにｐＩを考慮する。

本明細書では、「標的細胞」は、標的抗原を発現している細胞を意味する。

本明細書では、「可変領域」は、カッパイムノグロブリン、ラムダイムノグロブリン、及び重鎖イムノグロブリンの遺伝子座位をそれぞれ構成するＶ．カッパ遺伝子、Ｖ．ラムダ遺伝子、及び／またはＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つまたは複数のＩｇドメインを含むイムノグロブリンの領域を意味する。

本明細書では、「野生型またはＷＴ」は、天然においてみられるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味し、対立遺伝子変動を含む。ＷＴタンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。

本発明の抗体は、一般に、単離されているか、または組換え体である。「単離された」が、本明細書に開示される様々なポリペプチドについての説明に使用されるとき、それが発現される細胞または細胞培養から、同定され、分離され、及び／または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製段階によって調製されることになる。「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。「組換え体」は、抗体が、外来宿主細胞において組換え核酸技術を使用して生成されることを意味する。

「特異的結合（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｎｄｉｎｇ）」、または特定の抗原若しくはエピトープ「に特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｂｉｎｄｔｏ）」、または特定の抗原若しくはエピトープ「に向けて特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒ）」は、非特異的相互作用とは、測定可能な程に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に、結合活性を有さない類似構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定できる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子との競合によって決定できる。

特定の抗原またはエピトープに向けた特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに向けて、抗体が、少なくとも約１０〜４ＭのＫＤ、少なくとも約１０〜５ＭのＫＤ、少なくとも約１０〜６ＭのＫＤ、少なくとも約１０〜７ＭのＫＤ、少なくとも約１０〜８ＭのＫＤ、少なくとも約１０〜９ＭのＫＤ、あるいは、少なくとも約１０〜１０ＭのＫＤ、少なくとも約１０〜１１ＭのＫＤ、少なくとも約１０〜１２ＭのＫＤ、またはそれより高いＫＤを有することによって示すことができ、ＫＤは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体であれば、抗原またはエピトープに対して、対照分子が、２０倍〜、５０倍〜、１００倍〜、５００倍〜、１０００倍〜、５，０００倍〜、１０，０００倍〜、またはこれらを上回る倍数のＫＤを有することになる。

また、特定の抗原またはエピトープに向けた特異的結合は、例えば、対照に対して、抗体が、そのエピトープに向けて、少なくとも２０倍〜、５０倍〜、１００倍〜、５００倍〜、１０００倍〜、５，０００倍〜、１０，０００倍〜、またはこれらを上回る倍数の、抗原またはエピトープに向けたＫＡまたはＫａを有することによって示すことができ、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。
ＩＩ．概要

ＣＤ３及び腫瘍抗原標的を共捕捉する二重特異性抗体は、Ｔ細胞を再配向化して標的化腫瘍細胞を攻撃し溶解するために、設計され使用されてきた。例には、ＣＤ３及び腫瘍抗原を一価で捕捉するＢｉＴＥ及びＤＡＲＴ形式が含まれる。ＣＤ３ターゲティング手法が相当な見込みを示した一方、そのような治療の共通の副作用は、サイトカインの関連する産生であり、毒性サイトカイン放出症候群につながることが多い。二重特異性抗体の抗ＣＤ３結合ドメインが、すべてのＴ細胞に捕捉するため、高サイトカイン産生ＣＤ４Ｔ細胞サブセットが補充される。その上、ＣＤ４Ｔ細胞サブセットは、制御性Ｔ細胞を含み、その補充及び拡大は、免疫抑制に潜在的につながり、長期の腫瘍抑制に悪影響を有し得る。さらに、これらの形式は、Ｆｃドメインを含有せず、患者に非常に短い血清半減期を示す。

ＣＤ３ターゲティング手法が相当な見込みを示した一方、そのような治療の共通の副作用は、サイトカインの関連する産生であり、毒性サイトカイン放出症候群につながることが多い。二重特異性抗体の抗ＣＤ３結合ドメインが、すべてのＴ細胞に捕捉するため、高サイトカイン産生ＣＤ４Ｔ細胞サブセットが補充される。その上、ＣＤ４Ｔ細胞サブセットは、制御性Ｔ細胞を含み、その補充及び拡大は、免疫抑制に潜在的につながり、長期の腫瘍抑制に悪影響を有し得る。サイトカイン産生を低下させ、かつＣＤ４Ｔ細胞の活性化をおそらく低下させる１つのそのような可能性のある方法は、ＣＤ３に向けた抗ＣＤ３ドメインの親和性を低下させることによるものである。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対する「強」または「高親和性」結合体（例えば、１つの例は、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７として示される重可変ドメイン、及び軽可変ドメインである（必要に応じて任意選択で荷電リンカーを含む））であり、またＣＤ３８に結合する抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。他の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対する「軽（ｌｉｔｅ）」または「低親和性」結合体である抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。追加の実施形態は、ＣＤ３に対して中間または「中」親和性を有し、またＣＤ３８に結合する抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。

本発明の「高、中、低」抗ＣＤ３配列が、様々なヘテロ二量体化形式において使用され得ることを理解されるべきである。本明細書の開示の大部分が、ヘテロ二量体の「ボトルオープナー」形式を使用する一方で、これらの可変重及び軽配列、ならびにｓｃＦｖ配列（ならびにこれらの可変重及び軽配列を含むＦａｂ配列）は、ＷＯ公開第２０１４／１４５８０６号の図２に示されるもの、参照によって、明確に本明細書に組み込まれる図、形式、及び説明文などの他の形式で使用され得る。

したがって、本発明は、２つの異なる抗原に結合するヘテロ二量体抗体を提供し、例えば、その抗体は、本発明において２つの異なる標的抗原、例えば、ＣＤ３及びＣＤ３８に結合するという点で「二重特異性」である。これらのヘテロ二量体抗体は、一価（例えば、可変重及び可変軽ドメインの対などの単一抗原結合ドメインがある）または二価（それぞれが独立に抗原に結合する２つの抗原結合ドメインがある）のいずれかでこれらの標的抗原に結合し得る。本発明のヘテロ二量体抗体は、以下により詳細に要約されるように、ヘテロ二量体形成をホモ二量体形成より優先させるアミノ酸置換物を含有する様々な単量体と、以下に同様に概要が記載されるように、ホモ二量体を除去するヘテロ二量体の単純な精製を可能にする「ｐＩ変異体」と共に使用することに基づく。本発明のヘテロ二量体二重特異性抗体については、本発明は、一般に、ヘテロ二量体タンパク質を産生するために産生細胞内で自己組織化し得る操作されたＦｃドメインまたは変異体Ｆｃドメインの使用、及びそのようなヘテロ二量体タンパク質を生成し精製するための方法に依存する。
ＩＩＩ．抗体

本発明は、ＣＤ３及びＣＤ３８に結合する二重特異性抗体、一般には、治療用抗体の生成に関する。以下に論じられるように、「抗体」という用語が、一般に使用される。本発明において有用である抗体は、本明細書で説明される多くの形式で使用でき、伝統的な抗体、ならびに以下に説明される抗体の誘導体、断片、及び模倣体が含まれる。

伝統的な抗体構造単位は、典型的には、四量体を含む。それぞれの四量体は、典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一対からなり、それぞれの対が、１つの「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量を有する）、及び１つの「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖として分類される。本発明は、ＩｇＧクラスを対象とし、ＩｇＧクラスは、いくつかのサブクラスを有し、限定はされないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が含まれる。したがって、本明細書では、「アイソタイプ」は、その定常領域の化学的特性及び抗原特性によって定義されるイムノグロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。治療用抗体は、アイソタイプ及び／またはサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されるべきである。例えば、参照によって組み込まれる米国公開第２００９／０１６３６９９号に示されるように、本発明は、ＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドのｐＩ操作を含む。

それぞれの鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を第一に担う約１００〜１１０個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含み、可変領域は、一般に、当該技術分野及び本明細書で「Ｆｖドメイン」または「Ｆｖ領域」と呼ばれる。可変領域では、３つのループが、重鎖及び軽鎖のＶドメインのそれぞれに向けて集まり、抗原結合部位を形成する。ループのそれぞれは、相補性決定領域と呼ばれ（以下で「ＣＤＲ」と呼ばれる）、アミノ酸配列における変動が最も顕著である。「可変」は、可変領域のある一定のセグメントが、抗体間の配列において広く異なるという事実を指す。可変領域内の可変性は、均等に分布していない。その代わりに、Ｖ領域は、相対的に不変な区間からなり、当該区間は、それぞれの長さがアミノ酸で、９〜１５個か、またはそれより長い「超可変領域」と呼ばれる極度に可変性の、より短い領域によって分離されており、１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。

ＶＨ及びＶＬは、それぞれが３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）及び４つのＦＲからなり、次の順序で、アミノ末端からカルボキシ末端へと配置される。すなわち、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４である。

超可変領域は、軽鎖可変領域における、約アミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１；「Ｌ」は軽鎖を示す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）、重鎖可変領域における、およそ約３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１；「Ｈ」は、重鎖を示す）、約５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び約９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸残基；Ｋａｂａｔ
ｅｔａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳＯＦＰＲＯＴＥＩＮＳＯＦＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、ならびに／または超可変ループを形成するそうした残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域における２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、及び９６〜１０１（ＨＣＤＲ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ
ａｎｄＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、由来のアミノ酸残基を包含することが一般的である。本発明の特定のＣＤＲは、以下に説明される。

本明細書を通して、可変ドメイン（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７、及び重鎖可変領域の残基１〜１１３）における残基を指すときは、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、Ｆｃ領域についてはＥＵ番号付けシステムが一般に使用される（例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ（１９９１））。

本発明は、多数の異なるＣＤＲの組を提供する。この場合、「完全なＣＤＲのセット」は、３つの可変軽ＣＤＲ及び３つの可変重ＣＤＲ、例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む。これらは、それぞれより大きい可変軽または可変重ドメインの一部であり得る。さらに、より完全に本明細書に概要が記載されるとおり、可変重及び可変軽ドメインは、重及び軽鎖が使用される場合（例えば、Ｆａｂが使用される場合）別々のポリペプチド鎖上に、またはｓｃＦｖ配列の場合は単一ポリペプチド鎖上にあり得る。

ＣＤＲは、抗体結合の形成に寄与し、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとして知られる、抗体分子の可変領域における特定抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の分類であり、通常、特定の構造特性、及び特定の電荷特性を有する。単一抗原が複数のエピトープを有してよい。

エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる）、及び特異的な抗原結合ペプチドによって、効果的に遮断されるアミノ残基などの、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含んでよい。換言すれば、当該アミノ酸残基は、特異的な抗原結合ペプチドのフットプリントの範疇である。

エピトープは、立体構造的、または直線的のいずれでもよい。立体構造的エピトープは、空間的に並置されたアミノ酸によって、直線的ポリペプチド鎖の異なるセグメントから産生される。直線的エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接アミノ酸残基によって産生されるものである。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは、前者に対する結合であって、後者に対するものではない結合が、変性溶媒の存在下で消失するという点で区別されてよい。

エピトープは、特有の空間的立体構造において、典型的には少なくとも３個のアミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸を含む。同一エピトープを認識する抗体は、１つの抗体が、標的抗原に対する別の抗体の結合を遮断する能力を示す単純なイムノアッセイにおいて検証でき、例えば、「ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）」である。

それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を第一に担う定常領域を定義する。Ｋａｂａｔらは、重鎖及び軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列保存の程度に基づき、彼らは、個々の一次配列をＣＤＲ及びフレームワークへと分類し、その一覧を作った（ＳＥＱＵＥＮＣＥＳＯＦＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔｅｔａｌ．を参照のこと。参照によって、全体が組み込まれる）。

イムノグロブリンのＩｇＧサブクラスでは、重鎖において、いくつかのイムノグロブリンドメインが存在する。本明細書では、「イムノグロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、明確に異なる三次構造を有するイムノグロブリンの領域を意味する。本発明における対象は、定常重（ＣＨ）ドメイン及びヒンジドメインを含む重鎖ドメインにある。ＩｇＧ抗体の構成では、ＩｇＧアイソタイプは、それぞれが３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧの構成における「ＣＨ」ドメインは、次の通りである。「ＣＨ１」は、Ｋａｂａｔにあるように、ＥＵインデックスによる位置１１８〜２２０を指し、「ＣＨ２」は、Ｋａｂａｔにあるように、ＥＵインデックスによる位置２３７〜３４０を指し、及び「ＣＨ３」は、Ｋａｂａｔにあるように、ＥＵインデックスによる位置３４１〜４４７を指す。本明細書に示され、以下に説明されるように、ｐＩ変異体は、以下に論じられる１つまたは複数のＣＨ領域、及びヒンジ領域であり得る。

本明細書に示される配列は、位置１１８であるＣＨ１領域から始まり、別段の記載が無い限り、可変領域は含まれないことに留意されるべきである。例えば、配列識別番号２の第１のアミノ酸は、配列一覧表で、位置「１」であると指定されるが、ＥＵ番号付けによるＣＨ１領域の位置１１８に対応する。

重鎖のＩｇドメインの別の型は、ヒンジ領域である。本明細書では、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「イムノグロブリンヒンジ領域」は、抗体の第１の定常ドメイン及び第二定常ドメインの間にアミノ酸を含む可動性のポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置２２０で終了し、ＩｇＧ
ＣＨ２ドメインは、残基ＥＵ位置２３７から始まる。したがって、本明細書では、ＩｇＧに向けて、抗体ヒンジは、位置２２１（ＩｇＧ１におけるＤ２２１）〜位置２３６（ＩｇＧ１におけるＧ２３６）を含むと定義され、番号付けは、Ｋａｂａｔにあるように、ＥＵインデックスによるものである。いくつかの実施形態では、例えば、Ｆｃ領域の構成では、下位ヒンジ（ｌｏｗｅｒｈｉｎｇｅ）が含まれ、「下位ヒンジ」は、一般的に位置２２６または位置２３０を指す。本明細書に示されるとおり、ｐＩ変異体は、ヒンジ領域においても作ることができる。

軽鎖は、一般に、２つのドメイン、可変軽ドメイン（Ｆｖ領域を形成する可変重ドメインと共に軽鎖ＣＤＲを含む）、及び定常軽鎖領域（ＣＬまたはＣκと呼ばれることが多い）を含む。

以下に概要が記載される、追加の置換向けの別の関心領域は、Ｆｃ領域である。

したがって、本発明は、異なる抗体ドメインを提供する。本明細書で説明され、当該技術分野で知られるように、本発明のヘテロ二量体抗体は、重及び軽鎖内に異なるドメインを含み、そのドメインはまた、重複し得る。これらのドメインには、限定はされないが、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重定常ドメイン（ＣＨ１−ヒンジ−ＦｃドメインまたはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、軽定常ドメイン、ＦＡｂドメイン、及びｓｃＦｖドメインが含まれる。

したがって、「Ｆｃドメイン」は、−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、及び任意選択でヒンジドメインを含む。重鎖は、可変重ドメイン及び定常ドメインを含み、ＣＨ２−ＣＨ３を含むＣＨ１−任意選択のヒンジ−Ｆｃドメインを含む。軽鎖は、可変軽鎖及び軽定常ドメインを含む。

本発明のいくつかの実施形態は、自然に発生しないが、一般に、ｓｃＦｖリンカーによって一緒に連結される可変重ドメイン及び可変軽ドメインを含む少なくとも１つのｓｃＦｖドメインを含む。本明細書に示されるように、使用され得る多くの適したｓｃＦｖリンカーがあり、それらのリンカーは、組換え技術によって生成される伝統的なペプチド結合を含む。

リンカーペプチドは、次のアミノ酸残基を主に含んでよい。すなわち、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒである。リンカーペプチドは、２つの分子を連結するために適切な長さを有するべきであり、そのようにして、それらは、お互いに対して正しい立体構造をとり、その結果、それらは、所望の活性を保持する。１つの実施形態では、リンカーは、長さが、アミノ酸で約１〜５０個、好ましくは、長さが、アミノ酸で約１〜３０個である。１つの実施形態では、長さが、アミノ酸で１〜２０個であるリンカーを、いくつかの実施形態において有用である約５〜約１０個のアミノ酸と共に使用してよい。有用なリンカーには、グリシン−セリン重合体が含まれ、当該グリシン−セリン重合体には、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎ、ここで、ｎは、少なくとも１（かつ一般に３〜４）である整数であり、グリシン−アラニン重合体、アラニン−セリン重合体、ならびに他の可動性リンカーが含まれる。あるいは、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールの共重合体を含む様々な非タンパク質性の重合体が、リンカーとして有用であり得、すなわち、リンカーとして有用であり得る。

他のリンカー配列は、ＣＬ／ＣＨ１ドメインのすべての残基ではないが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの何らかの長さの何らかの配列を含んでよく、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２個のアミノ酸残基を含んでよい。リンカーは、イムノグロブリン軽鎖由来であり得、例えば、ＣκまたはＣλである。リンカーは、何らかのアイソタイプのイムノグロブリン重鎖由来であり得、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、及びＣμが含まれる。リンカー配列は、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来の配列、及び他のタンパク質由来の他の天然の配列などの他のタンパク質由来であってもよい。

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に一緒に概要が記載されるあらゆる２つのドメインを連結させるために使用される「ドメインリンカー」である。いずれの適したリンカーも使用され得る一方で、多くの実施形態は、グリシン−セリン重合体を利用し、当該グリシン−セリン重合体には、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎ、ここでｎは、少なくとも１（かつ一般に３〜４〜５）である整数であり、ならびに２つのドメインの組換え付加を可能にするいかなるペプチド配列も含まれ、当該２つのドメインは、各ドメインがその生物学的機能を保持することを可能にするのに十分な長さ及び柔軟性を有する。いくつかの場合では、以下に概要が記載されるように「鎖性」に注目すると、ｓｃＦｖリンカーのいくつかの実施形態において使用されるように、荷電ドメインリンカーは使用され得る。

いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、荷電ｓｃＦｖリンカーであり、その多くは、図３３に示される。したがって、本発明は、第１の単量体と第２の単量体との間でｐＩにおける分離を促進するために荷電ｓｃＦｖリンカーをさらに提供する。すなわち、荷電ｓｃＦｖリンカーを組み込むことによって、正であっても、負であっても（あるいは異なる単量体上でｓｃＦｖを使用する骨格の場合は両方）、これは、荷電リンカーを含む単量体が、Ｆｃドメインをさらに変更することなくｐＩを変えることを可能にする。これらの荷電リンカーは、標準リンカーを含有するあらゆるｓｃＦｖに置換されることができる。かさねて、当業者によって理解されるように、荷電ｓｃＦｖリンカーは、ｐＩにおける所望の変更に従って、正しい「鎖」または単量体上に使用される。例えば、本明細書で論じられるように、三重Ｆ形式のヘテロ二量体抗体を作製するために、所望の抗原結合ドメインのそれぞれについてのＦｖ領域の最初のｐＩは計算され、１つがｓｃＦｖを作製するために選択され、ｐＩによって、正または負のリンカーいずれかが選択される。

荷電ドメインリンカーはまた、本発明の単量体のｐＩ分離を増加するためにも使用することができ、したがって、図３３に含まれるものは、リンカーが利用される本明細書のいずれの実施形態においても使用され得る。

いくつかの実施形態では、抗体は、全長である。本明細書では、「全長抗体」は、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味し、特にホモ二量体を除去してヘテロ二量体化形成またはヘテロ二量体の精製のいずれかを可能にするためにＦｃドメインに、以下に概要が記載される１つまたは複数の改変を含む可変領域、及び定常領域を含む。全長抗体は、一般に、Ｆａｂ及びＦｃドメインを含み、図に一般に示されるように、ｓｃＦｖなどの余分な抗原結合ドメインをさらに含有し得る。

１つの実施形態では、抗体は、抗体断片であり、それが、ｐＩ操作などで、ヘテロ二量体を産生するように操作できる少なくとも１つの定常ドメインを含む場合に限られる。使用できる他の抗体断片には、ｐＩが操作される、本発明の１つまたは複数のＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、及びＣＬドメインを含む断片が含まれる。例えば、Ｆｃ融合体は、Ｆｃ領域（ＣＨ２及びＣＨ３、任意選択でヒンジ領域を有する）が別のタンパク質に融合した融合体である。多くのＦｃ融合体が、当該技術分野で知られており、本発明のヘテロ二量体化変異体の追加によって改良できる。この場合、抗体融合体を、ＣＨ１と、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３と、ＣＨ２と、ＣＨ３と、ＣＨ２及びＣＨ３と、ＣＨ１及びＣＨ３と、を含めて作ることができ、それらのいずれか、またはすべてを、本明細書において説明されるヘテロ二量体化変異体のいずれかの組み合わせを利用して、任意選択でヒンジ領域を含めて作ることができる。

具体的には、図１に示される形式は、通常「ヘテロ二量体抗体」と呼ばれる抗体であり、タンパク質が、ヘテロ二量体Ｆｃドメインに自己組織化される少なくとも２つの関連Ｆｃ配列を有することを意味する。

キメラ及びヒト化抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、異なる種由来の混合物であり得、例えば、キメラ抗体及び／またはヒト化抗体である。一般に、「キメラ抗体」及び「ヒト化抗体」の両方が、複数の種由来の領域を組み合わせる抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、伝統的に、マウス（または場合によってはラット）由来の可変領域、及びヒト由来の定常領域を含む。「ヒト化抗体」は、一般に、ヒト抗体においてみられる配列と交換された可変ドメインフレームワーク領域を有する非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体では、ＣＤＲを除き、抗体全体が、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされるか、またはそのＣＤＲ内は除いて、そのような抗体と同一である。ＣＤＲのいくつか、またはすべては、非ヒト生物起源の核酸によってコードされており、抗体を創出するためにヒト抗体可変領域のβシートフレームワークへ移植され、その特異性は、移植されたＣＤＲによって決定される。そのような抗体の創出は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６において説明されており、これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる。対応するドナー残基に対して選択されたアクセプターフレームワーク残基の「復帰突然変異（Ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎ）」が、初期移植構築物において消失した親和性を回復するために必要であることが多い（ＵＳ５５３０１０１、ＵＳ５５８５０８９、ＵＳ５６９３７６１、ＵＳ５６９３７６２、ＵＳ６１８０３７０、ＵＳ５８５９２０５、ＵＳ５８２１３３７、ＵＳ６０５４２９７、ＵＳ６４０７２１３、これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる）。ヒト化抗体は、イムノグロブリンの定常領域の少なくとも一部も最適に含むであろうし、これは、典型的には、ヒトイムノグロブリンのものであることから、したがって、典型的には、ヒトＦｃ領域を含むことになる。ヒト化抗体は、遺伝学的に操作された免疫系を有するマウスを使用して生成させることもできる。Ｒｏｑｕｅｅｔａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４の全体が、参照によって、組み込まれる。非ヒト抗体のヒト化及び再形成のための様々な技術及び方法が、当該技術分野でよく知られている（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ＆Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，ＨｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＢＣｅｌｌｓ，５３３−５４５，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）、及びそこでの引用文献参照のこと。これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる）。ヒト化の方法には、限定はされないが、Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，１９８８、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２９、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６、Ｑｕｅｅｎｅｔａｌ．，１９８９，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ，ＵＳＡ８６：１００２９−３３、Ｈｅｅｔａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５、Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，１９９２，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９：４２８５−９，Ｐｒｅｓｔａｅｔａｌ．，１９９７，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５７（２０）：４５９３−９、Ｇｏｒｍａｎｅｔａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４１８１−４１８５、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒｅｔ
ａｌ．，１９９８，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ１１：３２１−８において説明される方法が含まれ、これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低下させるヒト化または他の方法には、例えば、Ｒｏｇｕｓｋａｅｔａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：９６９−９７３において説明されるような表面再構成法（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）が含まれ、参照によって、全体が、組み込まれる。１つの実施形態では、親抗体は、親和性が成熟しており、当該技術分野で知られるとおりである。構造に基づく方法が、ヒト化及び親和性の成熟に用いられてよく、例えば、ＵＳＳＮ１１／００４，５９０において説明されるとおりである。ヒト化及び／または抗体可変領域の親和性成熟のために、選択に基づく方法が用いられてよく、限定はされないが、Ｗｕｅｔａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２、Ｂａｃａｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４、Ｒｏｓｏｋｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８、Ｒａｄｅｒｅｔａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９５：８９１０−８９１５、Ｋｒａｕｓｓｅｔａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１６（１０）：７５３−７５９において説明される方法が含まれ、これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる。他のヒト化方法は、ＣＤＲの一部のみの移植を伴うものでよく、限定はされないが、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０、Ｔａｎｅｔａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５、ＤｅＰａｓｃａｌｉｓｅｔａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４において説明される方法が含まれ、これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる。

ＩＶ．ヘテロ二量体抗体
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ヘテロ二量体抗体を形成するために自己組織化する２つの異なる重鎖変異体Ｆｃドメインの使用に依存するヘテロ二量体抗体を提供する。

本発明は、例えば、二重特異性結合を可能にするために、複数の抗原またはリガンドへの結合を可能にするヘテロ二量体抗体を提供するために新規構築物を対象とする。ヘテロ二量体抗体構築物は、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、例えば、「二量体」に組織化する２つの「単量体」の自己組織化の性質に基づく。ヘテロ二量体抗体は、以下により完全に論じられる各単量体のアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は、一般に、いくつかの方法で、抗原を共捕捉できるヘテロ二量体抗体の創出を対象とし、それぞれの鎖で異なる、定常領域のアミノ酸変異体に依存することで、ヘテロ二量体形成の促進、及び／またはホモ二量体に関してテロ二量体精製の容易化を可能にする。

したがって、本発明は、二重特異性抗体を提供する。抗体技術における継続問題は、２つの異なる抗原に同時に結合し、一般に、そのようにして、異なる抗原を近接させることを可能にし、新しい機能性及び新しい治療をもたらす「二重特異性」抗体が、切望されていることである。一般に、こうした抗体は、重鎖及び軽鎖それぞれの遺伝子を宿主細胞へと含めることによって作られる。これにより、一般に、所望のヘテロ二量体（Ａ−Ｂ）、ならびに２つのホモ二量体（Ａ−Ａ及びＢ−Ｂ（軽鎖ヘテロ二量体の問題を含まない））の形成がもたらされる。しかしながら、二重特異性抗体形成における主な障壁は、ヘテロ二量体抗体を精製してホモ二量体抗体を除去すること、及び／またはホモ二量体形成を上回るようにヘテロ二量体形成に偏らせることが困難であるということである。

本発明のヘテロ二量体を生成させるために使用できる機構は、数多く存在する。さらに、当業者によって理解されるように、こうした機構は、高いヘテロ二量体化を維持するために組み合わせることができる。したがって、ヘテロ二量体の産生につながるアミノ酸変異体は、「ヘテロ二量体化変異体」と呼ばれる。以下に論じられるように、ヘテロ二量体化変異体は、立体変異体（例えば、以下に説明される「ノブアンドホール」または「歪曲」変異体、及び以下に説明される「電荷対」変異体）、及びヘテロ二量体を除去してホモ二量体の精製を可能にする「ｐＩ変異体」を含み得る。これにより、その全体が、参照によって、組み込まれ、特に「ヘテロ二量体化変異体」の議論について以下のようにＷＯ２０１４／１４５８０６において一般に説明されるとおり、ヘテロ二量体化の有用な機構には、「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」、時に本明細書では「歪曲」変異体として（ＷＯ２０１４／１４５８０６の議論参照）、ＷＯ２０１４／１４５８０６において説明される「静電操縦」または「電荷対」、ＷＯ２０１４／１４５８０６において説明されるｐＩ変異体、及びＷＯ２０１４／１４５８０６及び以下に概要が記載される一般的な追加のＦｃ変異体が含まれる。

本発明には、ヘテロ二量体抗体の精製を容易化できるいくつかの基礎的な機構が存在する。すなわち、ｐＩ変異体の使用に依存し、その結果、単量体は、それぞれが異なるｐＩを有し、そうすることで、Ａ−Ａ二量体タンパク質、Ａ−Ｂ二量体タンパク質、及びＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電点精製を可能にするものである。あるいは、「三重Ｆ」形式などのいくつかの骨格形式は、サイズに基づく分離も可能にする。以下にさらに概要が記載されるとおり、ヘテロ二量体形成が、ホモ二量体を上回るようにする「歪曲」も可能である。したがって、立体二量体化変異体、及びｐＩ変異体または電荷対変異体の組み合わせは、本発明において、特定用途で有用である。

一般に、本発明において特に使用される実施形態は、歪曲変異体を含む変異体のセットに依存し、当該変異体は、２つの単量体の間でｐＩ差異を増加させるｐＩ変異体と共に使用するホモ二量体化形成より優先してヘテロ二量体化形成を促す。

さらに、以下に、より完全に概要が記載されるとおり、ヘテロ二量体抗体の形式に応じて、ｐＩ変異体は、単量体の定常及び／またはＦｃドメイン内のいずれかに含有され得るか、あるいはドメインリンカーまたはｓｃＦｖリンカーのいずれかである荷電リンカーが使用され得る。すなわち、三重Ｆ形式などのｓｃＦｖを利用する骨格は、精製目的に向けて、さらなるｐＩの増大を与える荷電ｓｃＦｖリンカー（正か負のいずれか）を含むことができる。当業者によって、理解されるとおり、三重Ｆ形式によっては、荷電ｓｃＦｖリンカーのみを有し、追加のｐＩ調整無しでも有用であるが、本発明は、単量体のうちの１つまたは両方にあるｐＩ変異体、及び／または荷電ドメインリンカーも提供する。さらに、代替機能性のために操作する追加のアミノ酸はまた、Ｆｃ、ＦｃＲｎ、及びＫＯ変異体などのｐＩの変更を与え得る。

ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にするための分離機構としてｐＩを利用する本発明においては、アミノ酸変異体を、単量体ポリペプチドの１つまたは両方に導入することができる。すなわち、単量体（本明細書では、単純化のため「単量体Ａ」と呼ぶ）の内の１つのｐＩが、単量体Ｂから遠ざかるように操作できるか、または単量体Ａ及び単量体Ｂの両方が変更され、単量体ＡのｐＩは増加し、単量体ＢのｐＩは減少する。以下に、より完全に概略が記載されるように、単量体のいずれか、または両方のｐＩの変更は、荷電残基を除去若しくは追加（例えば、中性アミノ酸は、正若しくは負に荷電したアミノ酸残基によって置き換えられ、例えば、グリシンからグルタミン酸への置き換えである）するか、荷電残基を正若しくは負から反対の電荷へと変更（アスパラギン酸からリジンへ）するか、または荷電残基を中性残基へと変更（例えば、リジンからセリンへであり、これにより荷電が消失する）することによって実施できる。多くのこうした変異体が、図に示される。

したがって、この実施形態では、本発明は、少なくとも１つの単量体において、ｐＩの十分な変更の創出を提供し、その結果、ヘテロ二量体は、ホモ二量体から分離できる。当業者によって、理解されるように、そして、以下にさらに論じられるように、これは、「野生型」重鎖定常領域と、そのｐＩが増加若しくは減少（ｗｔＡ−＋Ｂ若しくはｗｔＡ− −Ｂ）のいずれかとなるように操作された変異体領域と、を使用することによって実施できるか、または一方の領域を増加し、もう一方の領域を減少させること（Ａ＋ −Ｂ−若しくはＡ− Ｂ＋）によって実施できる。

したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、抗体の定常領域におけるアミノ酸変異体であり、当該アミノ酸変異体は、アミノ酸置換（「ｐＩ変異体」または「ｐＩ置換」）を単量体の１つまたは両方へ組み込むことによって、「ｐＩ抗体」）を形成するために、二量体タンパク質の単量体の両方か、もし両方でないなら少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を変えることに向けられる。本明細書で示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが、わずか０．１ｐＨ単位でも異なれば達成でき、０．２、０．３、０．４、及び０．５、またはそれより大きな差異は、すべて本発明において有用である。

当業者によって理解されるように、よい分離を得るために単量体のそれぞれまたは両方に含まれるｐＩ変異体の数は、構成要素の出発ｐＩ、例えば、三重Ｆ形式で、対象のｓｃＦｖ及びＦａｂの出発ｐＩに依存する部分があるであろう。すなわち、どの単量体を操作するか、またはどの「方向」（例えば、より正、若しくはより負）にするかを決定するために、２つの標的抗原のＦｖ配列が計算され、そこから決定がなされる。当該技術分野で知られるように、異なるＦｖであれば、本発明で活用される異なる出発ｐＩを有する。一般に、本明細書に概要が記載されるように、ｐＩが操作されることにより、それぞれの単量体で、少なくとも約０．１ｌｏｇの総ｐＩ差異がもたらされ、本明細書に概要が記載されるように当該総ｐＩ差異は、０．２〜０．５であることが好ましい。

さらに、当業者によって理解されると共に、本明細書に概要が記載されるように、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体は、サイズに基づいてホモ二量体から分離できる。例えば図１に示されるように、形式のいくつかは、サイズに基づくヘテロ二量体及びホモ二量体の分離を可能にする。

ｐＩ変異体が、重鎖の定常領域を使用することによって、二量体化を達成するために使用される場合は、抗体を含む二重特異性タンパク質の設計及び精製に対する、よりモジュール型の手法が提供される。したがって、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化変異体（歪曲ヘテロ二量体化変異体及び精製ヘテロ二量体化変異体を含む）は、可変領域に含まれておらず、その結果、個々の抗体は、それぞれ操作されなければならない。さらに、いくつかの実施形態では、ｐＩ変異体からもたらされる免疫原性の可能性は、異なるＩｇＧアイソタイプ由来のｐＩ変異体を移入することによって、著しく低減され、その結果、ｐＩは、著しい免疫原性を導入することなく変更される。したがって、解決すべき追加の問題は、ヒト配列含量が高い低ｐＩ定常ドメインの解明であり、例えば、何らかの特定位置における非ヒト残基の最小化または回避である。

このｐＩ操作で起こり得る付帯利点は、血清半減期の延長及びＦｃＲｎ結合の増加でもある。すなわち、ＵＳＳＮ１３／１９４，９０４において説明されるように（参照によって、その全体が組み込まれる）、抗体定常ドメイン（抗体及びＦｃ融合体においてみられるものを含む）のｐＩを下げることは、生体内において、血清での保持が長期化することにつながり得る。血清半減期の増加に向けた、こうしたｐＩ変異体によって、精製に向けたｐＩの変更も促進される。

さらに、ホモ二量体が存在する場合に、排除、最小化、及び区別するいずれかの能力が顕著であるため、ヘテロ二量体化変異体のｐＩ変異体が、二重特異性抗体の分析論及び品質管理工程のための追加の利点をもたらすことに留意されるべきである。同様に、ヘテロ二量体抗体産生の再現性を確実に試験する能力が重要である。

ヘテロ二量体化変異体
本発明は、ヘテロ二量体タンパク質を提供し、当該タンパク質は、ホモ二量体を除去してヘテロ二量体形成及び／または精製を可能にするためにヘテロ二量体変異体を利用する様々な形式でヘテロ二量体抗体を含む。

多くの適したヘテロ二量体化歪曲変異体のセットの対がある。これらの変異体は、「セット」の「対」で起こる。すなわち、対の一方のセットは、第１の単量体に組み込まれ、対のもう一方のセットは、第２の単量体に組み込まれる。これらのセットは、一方の単量体上の残基ともう一方の単量体上の残基との間の１対１の対応を有する「ノブインホール」変異体として必ずしも機能せず、すなわち、これらの対のセットは、ヘテロ二量体形成を促し、ホモ二量体形成を防止する２つの単量体の間で境界面を形成し、生物学的条件で自発的に形成するヘテロ二量体のパーセンテージが、予想された５０％よりもむしろ９０％を超えることを可能にする（２５％のホモ二量体Ａ／Ａ：５０％のヘテロ二量体Ａ／Ｂ：２５％のホモ二量体Ｂ／Ｂ）ことに留意されたい。

立体変異体
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体の形成は、立体変異体の追加によって促進され得る。すなわち、それぞれの重鎖におけるアミノ酸を変更することによって、同一Ｆｃアミノ酸配列を有するホモ二量体の形成と比較して、異なる重鎖が、会合してヘテロ二量体構造を形成する可能性が高くなる。適した立体変異体は、図２９に含まれる。

１つの機構は、当該技術分野において、「ノブアンドホール」と一般に呼ばれるものであり、立体的な影響を創出し、ヘテロ二量体形成に有利に働き、ホモ二量体形成を抑制するアミノ酸操作を指し、任意選択で使用することもできる。これは、「ノブアンドホール」と呼ばれることがあり、ＵＳＳＮ６１／５９６，８４６，Ｒｉｄｇｗａｙｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号において説明されるとおりであり、これらはすべて、全体が、参照によって、本明細書に組み込まれる。図によって多くの「ノブアンドホール」に依存する「単量体Ａ−単量体Ｂ」の対が特定されている。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）において説明されるとおり、こうした「ノブアンドホール」変異は、ジスルフィド結合と組み合わせて、形成をヘテロ二量体化へと歪曲することができる。

ヘテロ二量体の生成において有用である追加の機構は、「静電操縦」と呼ばれることがあり、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）において説明されるとおりである。当該文献は、参照によって、その全体が、本明細書に組み込まれる。これは、本明細書で「電荷対」と呼ばれることがある。この実施形態では、静電気が、形成をヘテロ二量体化へと歪曲するために使用される。当業者であれば、これらは、ｐＩに対しても効果を有し得、そうすることで、精製に対しても影響を有し得、したがって、場合によっては、ｐＩ変異体であり得るとも考えられることを理解されるであろう。しかしながら、これらは、ヘテロ二量体化を押し進めるために生成され、精製手段としては使用されなかったため、それらは、「立体変異体」として分類される。これらには、限定はされないが、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対であるＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは、「単量体が対応するセットである）及びＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対であるＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれる。

追加の単量体Ａ変異体、及び単量体Ｂ変異体を、本明細書に概要が記載されるｐＩ変異体または、ＵＳ２０１２／０１４９８７６の図３７に示される他の立体変異体などの他の変異体と、任意選択かつ独立して、何らかの量で、組み合わせることができる。当該特許文献の図及び説明文ならびに配列識別番号が、参照によって、本明細書に明確に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に概要が記載される立体変異体を、何らかのｐＩ変異体（またはＦｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体等の他の変異体）と共に１つまたは両方の単量体へ、任意選択かつ独立して、組み込むことができ、本発明のタンパク質を独立かつ任意選択で含む、または当該タンパク質から除外することができる。

適した歪曲変異体の一覧は、図２９にみられ、併せて図３４は、多くの実施形態における特定の有用性のいくつかの対を示す。特定用途の多くの実施形態は、限定はされないが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑが含まれるセットの組である。命名法の点から、対「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」は、一方の単量体が二重変異体セットＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを有し、もう一方が二重変異体セットＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを有することを意味する。

ヘテロ二量体のｐＩ（等電点）変異体
一般に、当業者によって理解されるように、ｐＩ変異体には２つの一般的なカテゴリーが存在する。タンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性の変更）、及びタンパク質のｐＩを減少させるもの（酸性の変更）である。本明細書に説明されるとおり、こうした変異体の組み合わせは、すべて実施することが可能である。すなわち、一方の単量体が、野生型、または野生型と顕著に異なるｐＩを示さない変異体であり得、もう一方は、より塩基性、またはより酸性であり得る。あるいは、それぞれの単量体が、１つは、より塩基性へ、１つは、より酸性へと変更される。

ｐＩ変異体の好ましい組み合わせは図３０に示される。本明細書に概要が記載され、図に示されるとおり、こうした変更は、ＩｇＧ１に対して示されるが、すべてのアイソタイプ及びアイソタイプハイブリッドを、このように変えることができる。重鎖定常ドメインが、ＩｇＧ２〜４由来である場合は、Ｒ１３３Ｅ及びＲ１３３Ｑも使用できる。

抗体ヘテロ二量体軽鎖変異体
抗体に基づくヘテロ二量体の場合で、例えば、単量体の少なくとも１つが、重鎖ドメインに加えて軽鎖を含む場合、ｐＩ変異体を軽鎖に作ることもできる。軽鎖のｐＩを低下させるためのアミノ酸置換には、限定はされないが、Ｋ１２６Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１４５Ｅ、Ｋ１４５Ｑ、Ｎ１５２Ｄ、Ｓ１５６Ｅ、Ｋ１６９Ｅ、Ｓ２０２Ｅ、Ｋ２０７Ｅ、及び軽鎖のＣ末端におけるペプチドＤＥＤＥの追加が含まれる。定常ラムダ軽鎖に基づくこのカテゴリーにおける変更には、Ｒ１０８Ｑ、Ｑ１２４Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｎ１３８Ｄ、Ｋ１４５Ｔ、及びＱ１９９Ｅでの１つまたは複数の置換が含まれる。さらに、軽鎖のｐＩの増加も可能である。

アイソタイプ変異体
さらに、本発明の多くの実施形態が、１つのＩｇＧアイソタイプから別のものへの、特定位置でのｐＩアミノ酸の「取り込み」に依存しており、したがって、変異体へ導入される不要な免疫原性の可能性を低下または除去している。これらの多くは、米国公開第２０１４／０３７００１３号の図２１に示され、これによって、参照によって、組み込まれる。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含めて、様々な理由で、治療用抗体のための共通のアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重定常領域は、ＩｇＧ２のそれと比較して、より高いｐＩを有している（８．１０対７．３１）。特定位置で、ＩｇＧ２残基を、ＩｇＧ１主鎖へ導入することによって、得られる単量体のｐＩは低下（または増加）し、付加的に血清半減期の長期化を示す。例えば、ＩｇＧ１は、位置１３７にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２は、グルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有している。つまり、グルタミン酸の取り込みは、得られるタンパク質のｐＩに影響を与えることになる。以下に説明されるとおり、多くのアミノ酸置換は、一般に、変異体抗体のｐＩに顕著な影響を与えることが必要とされている。しかしながら、以下に論じられるとおり、ＩｇＧ２分子における変更でさえ、血清半減期の増加を可能にすることに留意されるべきである。

他の実施形態では、非アイソタイプアミノ酸の変更がなされ、得られるタンパク質の全体の電荷状態が低下（例えば、より高いｐＩアミノ酸を、より低いｐＩアミノ酸へと変更することによって）するか、または安定に向けた構造の適応が可能になる等、以下にさらに説明されるとおりである。

さらに、重定常ドメイン及び軽定常ドメインの両方のｐＩ操作によって、ヘテロ二量体のそれぞれの単量体において、顕著な変化をみることができる。本明細書で論じられるように、２つの単量体のｐＩを少なくとも０．５異なるようにすることで、イオン交換クロマトグラフィー若しくは等電点電気泳動、または等電点感受性の他の方法によっての分離が可能になる。

ｐＩの計算
それぞれの単量体のｐＩは、変異体重鎖定常ドメイン及び融合相手を含めて、可変重鎖定常領域及び総単量体のｐＩに依存し得る。したがって、いくつかの実施形態では、米国公開第２０１４／０３７００１３号の図１９中のチャートを使用して、変異体重鎖定常ドメインに基づいて、ｐＩの変化が計算される。本明細書で論じられるように、どの単量体を操作するかは、一般に、Ｆｖ及び骨格領域の固有ｐＩによって決定される。あるいは、それぞれの単量体のｐＩを、比較することができる。

より良好なＦｃＲｎ生体内結合も与えるｐＩ変異体
ｐＩ変異体が、単量体のｐＩを低減する場合、生体内での血清における保持の改善という利点が追加され得る。

未だ試験中であるが、Ｆｃ領域は、生体内においてより長い半減期を有すると考えられ、これは、エンドソームにおける、ｐＨ６でのＦｃＲｎに対する結合が、Ｆｃを隔離するためである（ＧｈｅｔｉｅａｎｄＷａｒｄ，１９９７ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ．１８（１２）：５９２−５９８の全体が、参照によって組み込まれる）。その後、エンドソームの区画は、細胞表面へとＦｃを再循環させる。区画が、より高いｐＨである約７．４の細胞外空間へと一旦開くと、Ｆｃの放出が誘導され、血液へ戻る。マウスにおいて、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａらは、ｐＨ６及びｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合が増加したＦｃ変異型（Ｆｃｍｕｔａｎｔ）が、実際は、血清濃度が低下しており、野生型Ｆｃと同一の半減期を有することを示した（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａｅｔａｌ．２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１−５１８０の全体が、参照によって、組み込まれる）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに向けたＦｃの親和性の上昇は、Ｆｃが放出されて血流へ戻ることを妨げると考えられる。それ故に、生体内におけるＦｃの半減期を増加させるであろうＦｃ変異は、より高いｐＨでのＦｃの放出を、可能なままにしつつ、より低いｐＨでＦｃＲｎ結合を理想的に増加させることになる。アミノ酸であるヒスチジンは、６．０〜７．４のｐＨ範囲において、その電荷状態が変化する。したがって、ヒスチジン残基が、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体において、重要な位置を占めるという発見は、驚くべきことではない。

最近、より低い等電点を有する可変領域を有する抗体が、より長い血清半減期も有し得ることが示唆された（Ｉｇａｗａｅｔａｌ．，２０１０ＰＥＤＳ．２３（５）：３８５−３９２の全体が、参照によって、組み込まれる）。しかしながら、この機構の理解は、依然として不十分である。その上、可変領域は、抗体毎に異なる。ｐＩが低下、及び半減期が延長している定常領域変異体であれば、抗体の薬物動態特性の改善に対する、よりモジュール型の手法を提供するであろうことは、本明細書で説明されるとおりである。

追加の機能性のための追加のＦｃ変異体
ｐＩアミノ酸変異体に加えて、様々な理由から実施することのできる、有用なＦｃアミノ酸改変が多く存在し、限定はされないが、１つまたは複数のＦｃγＲ受容体に対する結合の変更、ＦｃＲｎ受容体に対する結合の変更等が含まれる。

したがって、本発明のタンパク質は、アミノ酸改変を含むことができ、アミノ酸改変には、ｐＩ変異体及び立体変異体を含めて、本明細書に概要が記載されるヘテロ二量体化変異体が含まれる。変異体の各セットは、任意の特定のヘテロ二量体タンパク質を独立かつ任意選択で含む、または当該タンパク質から除外することができる。

ＦｃγＲ変異体
したがって、１つまたは複数のＦｃγＲ受容体に対する結合を変えるために作ることのできる有用なＦｃ置換が多く存在する。結合の増加、及び結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃＲＩＩＩａに対する結合の増加は、一般に、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害。これは、細胞が媒介する反応であって、ＦｃγＲを発現している、非特異性である細胞傷害性の細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の溶解を引き起こす反応である）の増加をもたらすことが知られている。同様に、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）に対する結合の減少も、状況によっては、有益であり得る。本発明において有用であるアミノ酸置換には、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０（特に図４１）、ＵＳＳＮ１１／１７４，２８７、ＵＳＳＮ１１／３９６，４９５、ＵＳＳＮ１１／５３８，４０６において記載されるものが含まれ、これらはすべて、全体が、参照によって、明確に本明細書に組み込まれ、特に、そこで開示される変異体に向けて組み込まれる。有用な特定の変異体には、限定はされないが、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ、及び２９９Ｔが含まれる。

さらに、ＦｃＲｎ受容体に対する結合増加、及び血清半減期の増加において有用な追加のＦｃ置換が存在し、全体が、参照によって組み込まれるＵＳＳＮ１２／３４１，７６９において具体的に開示されるとおりであって、限定はされないが、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６Ｉ、またはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、及び２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌが含まれる。

消去変異体
同様に、機能性変異体の別のカテゴリーは、「Ｆｃγ消去変異体」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯ若しくはＫＯ）変異体である。こうした実施形態では、いくつかの治療用途に向け、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ等）の１つまたは複数またはすべてに対するＦｃドメインの通常の結合を低減または除去して、作用の付加的な機構を回避することが望ましい。すなわち、例えば、多くの実施形態では、特にＣＤ３に一価で結合する二重特異性抗体の使用において、ＦｃγＲＩＩＩａ結合を消去して、ＡＤＣＣ活性を排除、または著しく低下させることが一般に望ましい。Ｆｃドメインのうちの１つは、１つ以上のＦｃγ受容体消去変異体を含む。これらの消去変異体は、図３１に示され、それぞれは、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択される消去変異体を利用する好ましい態様と共に独立かつ任意選択で含める、または除外することができる。本明細書において参照される消去変異体が、一般に、ＦｃＲｎ結合ではなくＦｃγＲ結合を消去することに留意されたい。

ヘテロ二量体及びＦｃ変異体の組み合わせ
当業者によって理解されるように、その「鎖性」または「単量体区分（ｍｏｎｏｍｅｒ
ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）」が保持される限り、繰り返し記載されているヘテロ二量体化変異体（歪曲及び／またはｐＩ変異体を含む）はすべて、任意選択かつ独立に、何らかの方法で組み合わせることができる。さらに、こうした変異体はすべて、ヘテロ二量体化形式のいずれかに組み入れることができる。

ｐＩ変異体の場合、特定用途に有用な実施形態は、図に示されているが、精製の容易化のために２つの単量体間のｐＩ差異を変える基礎的な規則に従って、他の組み合わせを生成できる。

さらに、ヘテロ二量体化変異体、歪曲、及びｐＩのうちのいずれかはまた、一般的に本明細書に概要が記載されるとおり、Ｆｃ消去変異体、Ｆｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体と独立かつ任意選択で組み合わせられる。

本発明の有用な形式
当業者によって理解され、以下により完全に論じられるように、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は、一般に、図１に示されるように、幅広い種類の立体配置をとることができる。いくつかの図は、分子の一方の「アーム」上に１種類の特異性、及びもう一方の「アーム」上に異なる特異性がある「シングルエンド化（ｓｉｎｇｌｅｅｎｄｅｄ）」立体配置を示す。他の図は、分子の「上部」に少なくとも１種類の特異性、及び分子の「下部」に１つ以上の異なる特異性がある「二重エンド化（ｄｕａｌｅｎｄｅｄ）」立体配置を示す。したがって、本発明は、異なる第１の抗原及び第２の抗原を共捕捉する新規のイムノグロブリン組成物を対象とする。

当業者によって理解されるように、本発明のヘテロ二量体形式は、異なる結合価を有し、かつ二重特異性であることができる。すなわち、本発明のヘテロ二量体抗体は、二価かつ二重特異性であることができ、ＣＤ３が、１つの結合ドメインによって結合され、ＣＤ３８が、第２の結合ドメインによって結合される。ヘテロ二量体抗体はまた、三価かつ二重特異性であることができ、ＣＤ３８が、２つの結合ドメインによって結合され、ＣＤ３が、第２の結合ドメインによって結合される。本明細書に概要が記載されるとおり、潜在的な副作用を減少させるために、ＣＤ３が一価のみで結合されることが好ましい。

本発明は、抗ＣＤ３抗原結合ドメイン及び抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを利用する。当業者によって理解されるように、いずれの図（特に図２〜７、及び図６８参照）にも示される抗ＣＤ３ＣＤＲ、抗ＣＤ３可変軽及び可変重ドメイン、Ｆａｂ、及びｓｃＦｖのいずれの集合も使用されることができる。同様に、いずれの図（図８、９、及び１０参照）にも示される抗ＣＤ３８抗原結合ドメイン、抗ＣＤ３８ＣＤＲであっても、抗ＣＤ３８可変軽及び可変重ドメイン、Ｆａｂ、及びｓｃＦｖのいずれも使用され、任意の組み合わせで任意選択かつ独立に組み合わせることができる。

ボトルオープナー形式
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体骨格は、「三重Ｆ」または図１Ａ、Ａ、及びＢに示される「ボトルオープナー」骨格形式である。この実施形態では、抗体の一方の重鎖は、単鎖Ｆｖ（以下に定義される「ｓｃＦｖ」）を含み、もう一方の重鎖は、「定型的な（ｒｅｇｕｌａｒ）」ＦＡｂ形式であって、可変重鎖及び軽鎖を含む。この構造は、本明細書で「三重Ｆ」形式（ｓｃＦｖ−ＦＡｂ−Ｆｃ）、またはボトルオープナーにおおよそ視覚的に類似している（図１参照）ことから「ボトルオープナー」形式と呼ばれることがある。２つの鎖は、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（例えば、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、及び／またはヒンジ領域）において、アミノ酸変異体を使用することによって一緒にまとめられており、以下に、より完全に説明される。

本発明の「三重Ｆ」形式には、いくつかの明確に異なる利点が存在する。当該技術分野で知られるとおり、２つのｓｃＦｖ構築物に依存する抗体アナログは、安定性及び凝集の問題を有することが多いが、本発明においては、「定型的な」重鎖及び軽鎖の対を追加することによって、こうした問題を軽減できる。さらに、２つの重鎖及び２つの軽鎖に依存する形式とは対照的に、重鎖及び軽鎖が、不正確に対になる（例えば、重１が、軽２と対になる等）という問題は存在しない。

本明細書に概要が記載される実施形態の多くは、一般に、ｓｃＦｖを含む第１の単量体を含むボトルオープナー形式に依存し、当該ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖリンカー（多くの実施例において荷電）を使用して共有結合で付加される可変重及び可変軽ドメインを含み、ｓｃＦｖは、ドメインリンカー（本明細書に概要が記載されるとおり、非荷電または荷電であり得る）を通常介して、第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合で付加される。ボトルオープナー形式の第２の単量体は重鎖であり、組成物は、軽鎖をさらに含む。

一般に、多くの好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ３８に結合する重及び軽鎖のＦａｂを用いて、ＣＤ３に結合するドメインである。さらに、本発明のＦｃドメインは、一般に、歪曲変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択される特に有用な歪曲変異体を有する図２９及び図３４に示されるアミノ酸置換のセット）、任意選択で消去変異体を含み、重鎖は、ｐＩ変異体を含む。

本発明は、ボトルオープナー形式を提供し、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ配列が図２〜７、及び図６８に示されるとおりである。

本発明は、ボトルオープナー形式を提供し、抗ＣＤ３８配列は、図８〜１０に示されるとおりである。

ｍＡｂ−Ｆｖ形式
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体骨格は、図１に示されるｍＡｂ−Ｆｖ形式である。この実施形態では、形式は、一方の単量体に対する「余分な」可変重ドメインのＣ末端付加、及びもう一方の単量体に対する「余分な」可変軽ドメインのＣ末端付加の使用に依存し、したがって、第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、ＣＤ３８に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ３に結合する。

この実施形態では、第１の単量体は、第１の可変重ドメイン及び第１の定常重ドメインを含む第１の重鎖を含み、当該第１の定常重ドメインは、ドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＣ末端に共有結合で付加される第１の可変軽ドメインを有する第１のＦｃドメインを含む。第２の単量体は、第２のＦｃドメインを含む第２の定常重ドメインの第２の可変重ドメインと、ドメインリンカーを使用して第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合で付加される第３の可変重ドメインとを含む。２つのＣ末端に付加された可変ドメインは、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖを構成する。この実施形態は、可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用し、当該軽鎖は、ＣＤ３８に結合する２つの同一Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、追加のＦｃ変異体などが含まれる。

本発明は、ｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供し、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ配列は、図２〜７に示されるとおりである。

本発明は、ｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供し、抗ＣＤ３８配列は、図８〜１０に示されるとおりである。

本発明は、図３１に示される消去変異体を含むｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、図２９及び３４に示される歪曲変異体を含むｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

ｍＡｂ−ｓｃＦｖ
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体骨格は、図１に示されるｍＡｂ−Ｆｖ形式である。この実施形態では、形式は、単量体のうちの１つに対するｓｃＦｖのＣ末端付加の使用に依存し、したがって、第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、ＣＤ３８に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ３に結合する。したがって、第１の単量体は、ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含むＣ末端に共有結合で付加されるｓｃＦｖを有する第１の重鎖（可変重ドメイン及び定常ドメインを含む）を含む。この実施形態は、可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用し、当該軽鎖は、ＣＤ３８に結合する２つの同一Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、追加のＦｃ変異体などが含まれる。

本発明は、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式を提供し、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ配列は、図２〜７に示されるとおりである。

本発明は、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式を提供し、抗ＣＤ３８配列は、図８〜１０に示されるとおりである。

本発明は、図３１に示される消去変異体を含むｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、図２９及び３４に示される歪曲変異体を含むｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

中心ｓｃＦｖ
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体骨格は、図１に示される中心ｓｃＦｖ形式である。この実施形態では、形式は、挿入ｓｃＦｖドメインの使用に依存し、したがって、第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、ＣＤ３８に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ３に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体のうちの１つのＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入され、したがって、第３の抗原結合ドメインを提供する。

この実施形態では、１つの単量体は、ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含むｓｃＦｖを有する第１の可変重ドメイン、ＣＨ１ドメイン、及びＦｃドメインを含む第１の重鎖を含む。ｓｃＦｖは、ドメインリンカーを使用して重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合で付加される。この実施形態は、可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用し、当該軽鎖は、ＣＤ３８に結合する２つの同一Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、追加のＦｃ変異体などが含まれる。

本発明は、中心ｓｃＦｖ形式を提供し、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ配列は、図２〜７に示されるとおりである。

本発明は、中心ｓｃＦｖ形式を提供し、抗ＣＤ３８配列は、図８〜１０に示されるとおりである。

本発明は、図３１に示される消去変異体を含む中心ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、図２９及び３４に示される歪曲変異体を含む中心ｓｃＦｖ形式を提供する。

中心Ｆｖ形式
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体骨格は、図１に示される中心Ｆｖ形式である。この実施形態では、形式は、挿入ｓｃＦｖドメインの使用に依存し、したがって、第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、ＣＤ３８に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ３に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体のうちの１つのＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入され、したがって、第３の抗原結合ドメインを提供し、各単量体は、ｓｃＦｖの成分を含有する（例えば、一方の単量体は、可変重ドメインを含み、もう一方は、可変軽ドメインを含む）。

この実施形態では、一方の単量体は、第１の可変重ドメイン、ＣＨ１ドメイン、及びＦｃドメイン、ならびに追加の可変軽ドメインを含む第１の重鎖を含む。軽ドメインは、ドメインリンカーを使用して重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合で付加される。もう一方の単量体は、第１の可変重ドメイン、ＣＨ１ドメイン、及びＦｃドメイン、ならびに追加の可変重ドメインを含む第１の重鎖を含む。軽ドメインは、ドメインリンカーを使用して重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合で付加される。

この実施形態は、可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用し、当該軽鎖は、ＣＤ３８に結合する２つの同一Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、追加のＦｃ変異体などが含まれる。

ワンアーム化中心ｓｃＦｖ
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体骨格は、図１に示されるワンアーム化中心ｓｃＦｖ形式である。この実施形態では、一方の単量体は、Ｆｃドメインのみを含み、もう一方の単量体は、挿入ｓｃＦｖドメインを使用し、したがって、第２の抗原結合ドメインを形成する。この形式では、Ｆａｂ部分が、ＣＤ３８に結合し、ｓｃＦｖが、ＣＤ３に結合するか、またはその逆のいずれかである。ｓｃＦｖドメインは、単量体のうちの１つのＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入される。

この実施形態では、１つの単量体は、ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、及びｓｃＦｖ可変重ドメインを含むｓｃＦｖを有する第１の可変重ドメイン、ＣＨ１ドメイン、及びＦｃドメインを含む第１の重鎖を含む。ｓｃＦｖは、ドメインリンカーを使用して重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合で付加される。第２の単量体は、Ｆｃドメインを含む。この実施形態は、可変軽ドメイン及び定常軽ドメインを含む軽鎖をさらに利用し、当該軽鎖は、Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、追加のＦｃ変異体などが含まれる。

本発明は、ワンアーム化中心ｓｃＦｖ形式を提供し、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ配列は、図２〜７に示されるとおりである。

本発明は、ワンアーム化中心ｓｃＦｖ形式を提供し、抗ＣＤ３８配列は、図８〜１０に示されるとおりである。

本発明は、図３１に示される消去変異体を含むワンアーム化中心ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、図２９及び３４に示される歪曲変異体を含むワンアーム化中心ｓｃＦｖ形式を提供する。

二重ｓｃＦｖ形式
本発明はまた、当該技術分野で知られ、図１に示される二重ｓｃＦｖ形式を提供する。具体的には、本発明は、二重ｓｃＦｖ形式を提供し、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ配列は、図２〜７に示されるとおりである。

本発明は、二重ｓｃＦｖ形式を提供し、抗ＣＤ３８配列は、図８〜１０に示されるとおりである。

本発明の核酸
本発明は、本発明の二重特異性抗体をコードする核酸組成物をさらに提供する。当業者によって理解されるように、核酸組成物は、ヘテロ二量体タンパク質の形式及び骨格に依存する。したがって、例えば、形式が、三重Ｆ形式などのために３つのアミノ酸配列を必要とするとき（例えば、Ｆｃドメイン及びｓｃＦｖを含む第１のアミノ酸単量体、重鎖及び軽鎖を含む第２のアミノ酸単量体）、３つの核酸配列は、発現のための１つ以上の発現ベクターに組み込まれ得る。同様に、いくつかの形式（例えば、図１に開示されるものなどの二重ｓｃＦｖ形式）２つの核酸のみが必要とされ、再度それらは、１つまたは２つの発現ベクターに加えられ得る。

当該技術分野で知られるように、本発明の構成要素をコードする核酸は、本発明のヘテロ二量体抗体を産生するために使用される宿主細胞によって、当該技術分野で知られる発現ベクターに組み込まれ得る。一般に、核酸は、何らかの数の制御要素（プロモーター、複製の起源、選択可能なマーカー、リボソーム結合部位、誘導物質など）に操作可能に連結される。発現ベクターは、外部染色体または統合ベクターであってもよい。

本発明の核酸及び／または発現ベクターは、その後、哺乳類、細菌、酵母菌、昆虫、及び／または真菌細胞を含む当該技術分野でよく知られる何らかの数の異なる型の宿主細胞に変換され、哺乳細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、多くの実施形態において有用である。

いくつかの実施形態では、形式に応じて適用可能であるように、各単量体をコードする核酸及び軽鎖をコードする任意選択の核酸は、一般に、異なるまたは同一のプロモーター制御下で、単一の発現ベクター内でそれぞれ含有される。本発明の特定使用の実施形態では、これらの２つまたは３つの核酸のそれぞれは、異なる発現ベクター上に含有される。本明細書及びこれによって、参照によって、組み込まれる第６２／０２５，９３１号で示されるように、異なるベクターの比は、ヘテロ二量体形成を誘起するために使用され得る。すなわち、驚くべきことに、タンパク質が、１：１：２の比で第１の単量体：第２の単量体：軽鎖（ヘテロ二量体抗体を含む３つのポリペプチドを有する本明細書の実施形態の多くの場合）を含むが、これらは、最良の結果をもたらす比ではない。図６５参照。

本発明のヘテロ二量体抗体は、当該技術分野においてよく知られている発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによって作製される。一旦産生されると、イオン交換クロマトグラフィー段階を含む伝統的な抗体精製段階がなされる。本明細書で論じられるように、２つの単量体のｐＩを少なくとも０．５異なるようにすることで、イオン交換クロマトグラフィー若しくは等電点電気泳動、または等電点感受性の他の方法によっての分離が可能になる。すなわち、それぞれの単量体の等電点（ｐＩ）を変えるｐＩ置換を含め、その結果、それぞれの単量体が異なるｐＩを有し、ヘテロ二量体もまた、異なるｐＩを有し、したがって、「三重Ｆ」ヘテロ二量体の等電点精製を容易にする（例えば、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム）。こうした置換は、何らかの混入している二重ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体及びｍＡｂホモ二量体の、精製後の判定及び監視においても役に立つ（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ、及び分析ＩＥＸカラム）。

処置
一旦作製されると、本発明の組成物は、多くの応用において有用である。多くの造血器悪性腫瘍、ならびに非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、Ｂ細胞性及びＴ細胞性急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む様々な造血器悪性腫瘍由来の細胞株において、ＣＤ３８は、制御されていない。

したがって、本発明のヘテロ二量体組成物は、これらの癌の処置において有用である。

生体内投与用の抗体組成物
本発明に従って使用する抗体の製剤は、所望の純度を有し、任意選択で、医薬的に許容可能な担体、添加剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）と共に抗体を混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態において、貯蔵向けに調製される。許容可能な担体、添加剤、または安定剤は、用いられる投与量及び濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチルアルコール若しくはベンジルアルコール、メチルパラベン若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくはイムノグロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の糖質、ＥＤＴＡなどのキレート物質、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属複合体（例えば、亜鉛−タンパク質複合体）、ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。

本明細書に記載される製剤は、処置されている特定の徴候に向けて、必要に応じて複数の活性化合物を含んでもよく、好ましくは、お互いに有害な影響を及ぼすことのない相補的な活性を有するものである。例えば、他の特異性を有する抗体を提供することが望ましくあり得る。あるいは、またはさらに、組成物は、細胞傷害性物質、サイトカイン、成長阻害物質、及び／または小分子アンタゴニストを含んでよい。そのような分子は、意図する目的に向けて、有効な量の組み合わせで、適切に存在する。

活性成分は、調製するカプセルに封入されてもよく、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって封入されてよく、これらは、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリル酸）マイクロカプセルであり、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）、またはマイクロエマルジョンにおいて、封入されてよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）において開示される。

生体内投与に使用される製剤は、無菌、またはそれに近くあるべきである。これは、無菌ろ過膜を通過させるろ過によって容易に達成される。

持続放出調製物を調製してよい。持続放出調製物の適した例には、抗体を含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、当該マトリックスは、成形物品の形態であり、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルである。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及び．ガンマ．エチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸リュープロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブタン酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などの重合体は、１００日を超える期間の分子放出を可能にする一方で、ある一定のヒドロゲルでは、タンパク質の放出期間は、より短い。

カプセル化された抗体が、体内に長期間残存するとき、抗体は、３７℃での水分へ暴露の結果として変性または凝集し得、生物学的活性の消失と共に免疫原性が変化する可能性をもたらす。関与する機構に応じて、安定化に向けた合理的な方針を立てることができる。例えば、凝集機構が、チオジスルフィド相互交換を介した分子間Ｓ−−Ｓ結合形成であると見出されたのであれば、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量の制御、適した添加物の使用、及び特定の重合体マトリックス組成物の開発によって、安定化を達成してよい。

投与様式
本発明の抗体物質及び化学療法物質は、ボーラスとしての静脈投与、または期間にわたる継続注入による静脈投与などの既知の方法に従って、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）経路、皮下経路、関節内経路、関節滑液嚢内経路、くも膜下腔内経路、口腔経路、局所的経路、または吸入経路によって、対象に投与される。抗体の静脈内投与または皮下投与が好ましい。

処置様式
本発明の方法において、治療は、病気または状態に関する有益な治療応答を提供するために使用される。「有益な治療応答」は、病気若しくは状態における改善、及び／または病気若しくは状態と関連する症状における改善を意図する。例えば、有益な治療応答は、病気における下記の改善の１つまたは複数を指すことになる。（１）新生細胞数の減少、（２）新生細胞死の増加、（３）新生細胞の生存阻害、（５）腫瘍成長の阻害（例えば、ある程度の鈍化、好ましくは停止）、（６）患者生存率の増加、及び（７）病気または状態と関連する１つまたは複数の症状のいくらかの緩和。

何らかの所与の病気または状態における有益な治療応答は、病気または状態に特有の標準化された応答の診断基準によって決定できる。腫瘍応答は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、ｘ−線画像法、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン画像法、内視鏡検査、ならびに骨髄穿刺（ＢＭＡ）及び循環における腫瘍細胞の計数を含む腫瘍生検試料採取などの選別技術を使用して、腫瘍形態学（すなわち、全体的な腫瘍量、腫瘍サイズ、及び同様のもの）における変化で評価できる。

こうした有益な治療応答に加えて、治療が進行中の対象は、病気に関連する症状において、改善の有利な効果を経験し得る。

病気の改善は、完全奏効として特徴付けられてよい。「完全奏効」は、何らかの、以前には異常であったＸ線検査、骨髄、及び脳脊髄液（ＣＳＦ）の所見の正常化、または骨髄腫の場合は、異常なモノクローナルタンパク質の正常化を伴って、臨床的に検出可能な病気が存在しないことを意図する。

そのような応答は、本発明の方法による処置の後、少なくとも４〜８週間、または時には６〜８週間持続し得る。あるいは、病気の改善は、部分奏効であるとして分類されてよい。「部分奏効」は、新しい病変が存在せず、すべての測定可能な腫瘍量（すなわち、対象に存在する悪性細胞の数、または腫瘍質量の測定容積、または異常なモノクローナルタンパク質の量）が、少なくとも約５０％減少することを意図し、それが４〜８週間、または６〜８週間持続し得る。

本発明による処置は、使用する薬剤の「治療有効量」を含む。「治療有効量」は、必要な投与量及び期間で、所望の治療結果を達成するために有効である量を指す。

治療有効量は、個々の病気の状況、年齢、性別及び体重などの要因、ならびに個々における、薬剤の所望応答を引き出す能力に応じて変化してよい。治療有効量は、抗体または抗体部分の治療上有利な効果が、何らかの毒性作用または有害作用を凌ぐ量でもある。

腫瘍治療に向けた「治療有効量」は、病気の進行を安定化させる能力によって測定されてもよい。癌を抑制する化合物の能力を、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してよい。

あるいは、組成物のこの性質は、当業者に知られる試験管内アッセイによって、化合物が、細胞の成長を抑制する能力、またはアポトーシスを誘導する能力を試験することによって評価してよい。治療用化合物の治療有効量によって、対象の腫瘍サイズを減少させてよく、またはそうでなければ、対象の症状を回復させてよい。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、及び特定組成物、または選択する投与経路などの要因に基づいてそのような量を決定できるであろう。

投与レジメンは、最適な所望の応答を提供するように調整される（例えば、治療応答）。例えば、単回ボーラス投与をしてよく、いくつかに分割された用量を、長時間にわたって投与してよく、または治療状況の要件が示すように、比例的に用量を減少または増加してよい。非経口組成物を、投与の容易化、及び投与量の均一性担保に向けて、投与量単位形態において製剤化してよい。本明細書では、投与量単位形態は、処置される対象向けの単位投与量として適した、物理的に別々の単位を指す。それぞれの単位は、必要な医薬担体と関連して、所望の治療効果を提供するように計算され、予め決定された量の活性化合物を含む。

本発明の投与量単位形態のための規格は、（ａ）活性化合物特有の特性、及び達成される特定の治療効果、ならびに（ｂ）そのような活性化合物を、個々の感受性処置向けに配合する技術分野での固有の制限、によって決定されると共に、直接的にそれらに応じて、決定される。

本発明において使用される二重特異性抗体に向けた、効率的な投与量及び投与レジメンは、処置される病気または状態に依存し、当業者によって決定されてよい。

本発明において使用される二重特異性抗体の治療有効量のための、例示かつ非限定範囲は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇなどの約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇなどの約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．３ｍｇ／ｋｇなどの約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、抗体は、１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量などの１ｍｇ／ｋｇ以上の用量で投与され、例えば、５〜２０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

当該技術分野の医療従事者であれば、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方し得る。例えば、医者または獣医師であれば、医薬組成物において用いられる薬剤の投与を、所望の治療効果を達成するために必要となるよりも低い用量で開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができるであろう。

１つの実施形態では、二重特異性抗体は、注入によって、２００〜４００ｍｇ／ｋｇの投与量などの１０〜５００ｍｇ／ｋｇの投与量で毎週投与される。そのような投与は、例えば、３〜５回などの１〜８回繰り返されてよい。投与は、２〜１２時間の時間などの２〜２４時間の時間にわたる継続注入によって実施されてよい。

１つの実施形態では、毒性を含む副作用を減らす必要があれば、二重特異性抗体は、２４時間超などの長時間にわたる、緩徐な継続注入によって投与される。

１つの実施形態では、二重特異性抗体は、４〜６回などの最大８回の投与に向け、２５０ｍｇ〜２０００ｍｇの投与量が毎週投与され、例えば、３００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、または２０００ｍｇなどの投与量が毎週投与される。投与は、２〜１２時間などの２〜２４時間にわたる継続注入によって実施されてよい。そのようなレジメンは、必要に応じて１回または複数回繰り返されてよく、例えば、６ヶ月後または１２カ月後に繰り替えされてよい。投与量は、例えば、生物学的試料を採取し、二重特異性抗体の抗原結合領域を標的とする抗イディオタイプ抗体を使用することにより、投与の際に血液中に存在する本発明の化合物量を測定することによって、決定または調整してよい。

さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、毎週１回、２〜１２週間投与され、３〜１０週間など、４〜８週間などの期間投与される。

１つの実施形態では、二重特異性抗体は、維持療法によって投与され、例えば、６ヶ月またはそれより長い期間、１週間に１回などといった投与がなされる。

１つの実施形態では、二重特異性抗体は、二重特異性抗体の1回の注入を含むレジメン
によって投与される。レジメンは、繰り返されてよく、例えば、７〜９日後に繰り返されてよい。

非限定例として、本発明による処置は、１日の抗体投与量として提供されてよく、その量は、１日当たり、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇであって、１日当たり、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇ／ｋｇなどであり、処置の開始後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日目の内の少なくとも１日に提供されてよく、あるいは処置の開始後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０週間目の内の少なくとも１週に提供されてよく、またはそれらのいずれかの組み合わせで提供されてよく、単一または分割された用量を使用して、２４、１２、８、６、４、若しくは２時間毎に、またはそれらのいずれかの組み合わせで提供されてよい。

いくつかの実施形態では、その実施形態の二重特異性抗体分子は、例えば、化学療法物質といった、１つまたは複数の追加の治療用物質と組み合わせて使用される。ＤＮＡ損傷化学療法物質の非限定例には、トポイソメラーゼＩ阻害物質（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、及びそれらのアナログまたは代謝物、ならびにドキソルビシン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害物質（例えば、エトポシド、テニポシド、及びダウノルビシン）、アルキル化物質（例えば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、及びシクロホスファミド）、ＤＮＡインターカレーター（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチン）、ブレオマイシンなどのＤＮＡインターカレーター兼遊離ラジカル発生物質、ならびにヌクレオシド模倣物質（例えば、５−フルオロウラシル、カペシタビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、及びヒドロキシウレア）が含まれる。

細胞複製を攪乱する化学療法物質には、パクリタキセル、ドセタキセル、及び関連アナログと、ビンクリスチン、ビンブラスチン及び関連アナログと、サリドマイド、レナリドミド及び関連アナログ（例えば、ＣＣ−５０１３及びＣＣ−４０４７）と、タンパク質チロシンキナーゼ阻害物質（例えば、メシル酸イマチニブ及びゲフィチニブ）と、プロテアソーム阻害物質（例えば、ボルテゾミブ）と、ＩκＢキナーゼの阻害物質を含むＮＦ−κＢ阻害物質と、癌において過剰発現しているタンパク質に結合し、それによって細胞複製を下方制御する抗体（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、及びベバシズマブ）と、癌において上方制御、過剰発現、または活性化していることが知られており、それを阻害することにより、細胞複製が下方制御されるタンパク質または酵素の他の阻害物質と、が含まれる。

いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ベルケイド（登録商標）（ボルテゾミブ）での処置に先行して、処置と同時に、または処置の後に使用できる。

すべての引用文献は、それらの全体が、参照によって、明確に本明細書に組み込まれる。

例示目的に向けて、本発明の特定の実施形態を上に説明したが、添付の特許請求の範囲において説明される本発明から逸脱することなく、当業者によって、詳細の変更を数多く実施し得ることを理解されるであろう。

実施例
本発明を示すために、実施例を以下に提供する。こうした実施例は、本発明を何らかの特定の応用、または実施理論に限定しようと意図するものではない。本発明において論じられる定常領域の位置のすべてで、番号付けは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，１９９１，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ。参照によって、全体が組み込まれる）にあるように、ＥＵインデックスに従う。抗体技術分野の当業者であれば、この慣習が、イムノグロブリン配列の特定領域における、非連続的な番号付けからなっており、イムノグロブリンファミリーにおける保存位置への標準化された参照が可能になっていることを理解されるであろう。したがって、ＥＵインデックスによって定義される、何らかの所与のイムノグロブリンの位置は、その連続配列に必ずしも対応していないことになる。

一般的かつ特定の科学技術は、米国公開第２０１５／０３０７６２９号、同第２０１４／０２８８２７５号、及びＷＯ２０１４／１４５８０６に概要が記載され、これらはすべて、全体が、参照によって、明確に組み込まれ、特に、それらに概要が記載される技術に関して組み込まれる。

実施例１：代替形式
Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ産生

Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現−Ｆａｂ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、及びＬＣ−のために必要とされる３つの鎖をコードするＤＮＡを、遺伝子合成（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）によって生成し、発現ベクターｐＴＴ５に標準分子生物学的技術を使用してサブクローニングした。置換を、部位特異的な突然変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣｅｄａｒＣｒｅｅｋ，Ｔｅｘ．）または追加の遺伝子合成及びサブクローニングのいずれかを使用して導入した。ＤＮＡを、発現のためのＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトし、得られたタンパク質を、タンパク質Ａ親和性（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ製）及び陽イオン交換（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）クロマトグラフィーを使用して上清から精製した。Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性体についてのアミノ酸配列を、図３に記載する。

表面プラズモン共鳴親和性決定

表面プラズモン共鳴結合実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置（データ図示せず）を使用して実施した。親和性を調節するアミノ酸置換の後でさえ、抗ＣＤ３可変領域は、カニクイザルＣＤ３に対して交差反応性が残存する。

細胞表面結合

Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−ＦｃｓのＣＤ３への結合は、二次抗体を用いる検出を介してＴ細胞上で測定された。

再配向化Ｔ細胞細胞傷害性

抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性体は、ＣＤ２０^＋ラモスバーキットリンパ腫（ＢＬ）細胞株、ＣＤ２０^＋Ｊｅｋｏ−１マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞株、及びＣＤ３８^＋ＲＰＭＩ８２６６骨髄腫細胞株の再配向化Ｔ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）について試験管内で特徴づけた。ＲＴＣＣを測定し、ＲＴＣＣ中のＩＬ−６産生も特徴づけた（データ図示せず）。

ｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤイムノグロブリン欠乏マウス研究

ヒトＢ細胞または形質細胞の欠乏を介してヒトイムノグロブリンを欠乏させる抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性体の能力を、ヒトＰＢＭＣが移植されたＳＣＩＤマウスを使用して評価した。結果を図に示す。

実施例２：代替形式
二重特異性体産生
抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性体の模式図を、図１に示す。代替形式の抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性体のアミノ酸配列を、図３９〜図４３に記載する。二重特異性発現のために必要とされる３つの鎖をコードするＤＮＡを、遺伝子合成（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）によって生成し、発現ベクターｐＴＴ５に標準分子生物学的技術を使用してサブクローニングした。置換を、部位特異的な突然変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣｅｄａｒＣｒｅｅｋ，Ｔｅｘ．）または追加の遺伝子合成及びサブクローニングのいずれかを使用して導入した。ＤＮＡを、発現のためのＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトし、得られたタンパク質を、タンパク質Ａ親和性（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ製）及び陽イオン交換（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ製）クロマトグラフィーを使用して上清から精製した。タンパク質Ａ親和性精製後の収率を、図３５に示す。陽イオン交換クロマトグラフィー精製を、５０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．０の洗浄／平衡緩衝剤及び５０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．０＋１ＭＮａＣｌ直線勾配の溶離緩衝剤を用いるＨｉＴｒａｐＳＰＨＰカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ製）を使用して実施した（クロマトグラムについては図３６参照）。

再配向化Ｔ細胞細胞傷害性
抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性体は、ＣＤ３８^＋ＲＰＭＩ８２６６骨髄腫細胞株の再配向化Ｔ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）について試験管内で特徴づけた。１０，０００個のＲＰＭＩ８２６６細胞を、５００，０００個のヒトＰＢＭＣと共に、２４時間インキュベートした。ＲＴＣＣを、示されるようにＬＤＨ蛍光によって測定した（図３７参照）。

実施例３
再配向化Ｔ細胞細胞傷害性
抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性体は、ＣＤ３８＋ＲＰＭＩ８２６６骨髄腫細胞株の再配向化Ｔ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）について試験管内で特徴づけた。４０，０００個のＲＰＭＩ８２６６細胞を４００，０００個のヒトＰＢＭＣと共に、９６時間インキュベートした。ＲＴＣＣを、示されるようにフローサイトメトリーによって測定した（図４４参照）。ＣＤ６９、Ｋｉ−６７、及びＰＩ−９のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞発現もまた、フローサイトメトリーによって特徴づけ、図４５に示す。

抗腫瘍活性のマウスモデル
５匹のＮＯＤ重症複合免疫不全ガンマ（ＮＳＧ）マウスの４つの群のそれぞれに、−２３日目に静脈内尾静脈注射によって５×１０６ＲＰＭＩ８２２６ＴｒＳ腫瘍細胞（多発性骨髄腫、ルシフェラーゼ発現）を移植した。０日目に、マウスに、１０×１０６ヒトＰＢＭＣを腹腔内に移植した。０日目のＰＢＭＣ移植の後、試験物を、図４に示される用量レベルで腹腔内注射によって毎週（０、７日目）投与する。研究設計は、図４６にさらに概要を述べられる。腫瘍増殖を、生体内画像化システム（ＩＶＩＳ（登録商標））を使用してマウス当たりの全フラックスを測定することによって監視した。ＸｍＡｂ１３５５１及びＸｍＡｂ１５４２６の両方は、実質的な抗腫瘍効果を示した（図４７及び図４８参照）。

カニクイザルにおける研究
カニクイザルに、抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性体を単回投与した。抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性対照もまた含んだ。用量レベルは、２０μｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１３５５１（ｎ＝２）、０．５ｍｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１５４２６（ｎ＝３）、３ｍｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１４７０２（ｎ＝３）、または３ｍｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１３２４５（抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３対照、ｎ＝３）（３つの独立した研究において）であった。抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性体は、末梢血中のＣＤ３８＋細胞を速やかに欠乏させた（図４９参照）。抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性体は、ＣＤ６９発現によって測定されるＴ細胞活性化をもたらした（図５０参照）。ＩＬ−６の血清レベルもまた測定した（図５１参照）。ＸｍＡｂ１３５５１と比較して、ＸｍＡｂ１５４２６は、ＣＤ３８＋細胞欠乏の増加した期間ならびにより低いレベルのＴ細胞活性化及びＩＬ−６産生を有したこと留意されたい。

ＸｍＡｂ１５４２６及びＸｍＡｂ１４７０２を、それぞれ０．５ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの単回投与で試験した。両方の抗体は、これらのより高い用量で良好な忍容性を示し、処置されたサルからの血清中で観察された中程度のレベルのＩＬ６と一致した。その上、中間ＣＤ３親和性を有するＸｍＡｂ１５４２６は、２、５、または２０μｇ／ｋｇで投与された最初の高親和性ＸｍＡｂ１３５５１と比較して、０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ３８＋細胞をより効果的に欠乏させた。ＸｍＡｂ１５４２６による欠乏は、以前の研究においてＸｍＡｂ１３５５１の最高用量と比較してより持続性があった（７日目対２日目それぞれ）。注目すべきことに、標的細胞欠乏は、ＸｍＡｂ１５４２６についてより大きかったが、Ｔ細胞活性化（ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＰＤ１誘導）は、ＸｍＡｂ１５４２６を用いて処置され、２０μｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１３５５１の群よりも２５倍高い用量で投与されたサルにおいてさらにより低かった。非常に低いＣＤ３親和性を有するＸｍＡｂ１４７０２は、ＣＤ３８＋細胞及びＴ細胞活性化に対してほとんど効果を有しなかった。

これらの結果は、ＣＤ３親和性を減弱させることによってＴ細胞活性化を調節することが、Ｔ細胞結合二重特異性抗体の治療濃度域を改善するための有望な方法であることを実証する。この方針は、ＣＤ３８などの標的を用いて抗原シンククリアランスを克服するために、忍容性を改善し、より高い用量での投与を可能にすることによって、標的化Ｔ細胞免疫治療に適している抗原のセットを拡張するための潜在性を有する。ＣＤ３の親和性を低下させることによって、ＸｍＡｂ１５４２６がＣＤ３８＋細胞を効果的に欠乏し、一方でＣＲＳ効果を最小化することが、その高親和性対応物ＸｍＡｂ１３５５１を同等の用量で投与した場合にもみられることが示された。

Claims

明細書に記載の発明。