CN115932273A - 鉴定包含结合多肽的细菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供鉴定包含结合多肽的细菌的方法。本发明还提供鉴定具有结合多肽的改善的表达的细菌的方法。本发明还提供鉴定具有改善的表达的结合多肽的方法。本发明还提供适用于本发明方法的工程化细菌。本发明还提供可以使用本发明的方法获得的组合物，例如具有改善的表达和/或稳定性的抗白介素‑13(IL‑13)抗体。本发明还提供包含结合多肽(例如，抗体)变体的文库。

Description

鉴定包含结合多肽的细菌的方法
本申请为申请日为2016年4月22日，发明名称为“鉴定包含结合多肽的细菌的方法”的申请201680036688.6的分案申请。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并通过整体引用并入本文。所述ASCII副本创建于2016年4月20日，名称为50474-102WO2_Sequence_Listing_4.20.16_ST25，大小为26,384字节。
技术领域
本发明涉及鉴定包含结合多肽的细菌的方法、鉴定具有改善的表达的结合多肽的方法、鉴定具有结合多肽的改善的表达的细菌的方法、适用于该方法的工程化细菌、使用该方法获得的组合物例如具有改善的表达和/或稳定性的抗体(例如，具有改善的表达和/或稳定性的抗白介素-13(IL-13)抗体和抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体)和包含结合多肽(例如，抗体)变体的文库。
背景技术
在噬菌体或细胞(例如细菌、酵母或哺乳动物细胞)表面上展示结合多肽(例如抗体或其片段)是广泛使用的蛋白质工程化方法。虽然与其它细胞展示技术相比，细菌的快速复制时间为细菌展示提供加速的一轮一轮(round-to-round)的进展，但是这些优点通常被保留候选结合多肽在细胞中并维持抗原可及性所需的折衷抵消。作为细菌外膜蛋白的融合体展示大分子是困难的，限制了这些系统应用在肽或小蛋白中。另一种方法是在周质中展示较大的蛋白。然而，在大多数情况下，外膜是不可通透的不能将分子量大于约600道尔顿的亲水性分子扩散到周质中(参见例如Decad等人J.Bacteriology 128(1)：325-336，1976)。目前较大配体的结合多肽的周质展示方法包括去除外膜，这需要将结合多肽拴系到内膜的外侧(例如通过使用融合蛋白或其它拴系)以维持结合多肽与细菌内膜的结合。此外，外膜的破坏导致细胞死亡，这在细菌展示的各轮之间需要耗时的分子操纵。
因此，仍然需要与全长结合多肽(例如抗体)和靶分子(例如，抗原)相兼容的活细胞细菌展示的改善方法，其可用于鉴定例如具有期望特征(例如，改善的表达、稳定性和/或亲和力)的蛋白变体，以及鉴定具有改善的结合多肽表达的细菌。
发明内容
本发明涉及鉴定携带期望的结合多肽的细菌的方法、鉴定具有改善的表达的结合多肽的方法、鉴定具有结合多肽的改善的表达的细菌的方法、适用于本发明方法的工程化细菌、使用所述方法获得的组合物，例如具有改善的表达和/或稳定性的抗体(例如抗IL-13和抗VEGF抗体)、以及包含结合多肽(例如，抗体)变体的文库。
一方面，本发明的特征在于一种用于鉴定包含特异性结合靶分子的结合多肽的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供对具有大于10kDa的分子量的分子具有可通透的外膜的细菌，所述细菌表达编码候选结合多肽的核酸，其中所述候选结合多肽存在于所述细菌的周质中；(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和(c)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为包含结合多肽，其中在步骤(c)之后细菌保持存活。在一些实施方案中，靶分子具有小于250kDa的分子量。在一些实施方案中，靶分子具有小于150kDa的分子量。
另一方面，本发明的特征在于一种用于鉴定具有特异性结合靶分子的结合多肽的改善的表达的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供对具有大于10kDa的分子量的分子具有可通透的外膜的细菌，所述细菌表达编码结合多肽的核酸，其中所述结合多肽存在于所述细菌的周质中；(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和(c)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为具有结合多肽的改善的表达，其中在步骤(c)之后细菌保持存活。在一些实施方案中，靶分子具有小于250kDa的分子量。在一些实施方案中，靶分子具有小于150kDa的分子量。
另一方面，本发明的特征在于一种用于鉴定包含特异性结合靶分子的结合多肽的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含突变的细菌，所述突变允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中，所述细菌表达编码候选结合多肽的核酸，其中候选结合多肽存在于细菌周质中；(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和(c)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为包含结合多肽，其中在步骤(c)之后细菌保持存活。
另一方面，本发明的特征在于一种用于鉴定具有特异性结合靶分子的结合多肽的改善的表达的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含突变的细菌，所述突变允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中，所述细菌表达编码结合多肽的核酸，其中结合多肽存在于细菌周质中；(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和(c)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为具有改善的结合多肽的表达，其中在步骤(c)之后细菌保持存活。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述方法还包括使细菌在步骤(b)之前经历透化细菌外膜的条件。在一些实施方案中，所述方法还包括在使细菌与可检测地标记的靶分子接触后重新密封细菌外膜。
另一方面，本发明的特征在于一种用于鉴定包含特异性结合靶分子的结合多肽的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供表达编码候选结合多肽的核酸的细菌，其中所述候选结合多肽存在于细菌周质中；(b)使细菌经历透化细菌外膜的条件；(c)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；(d)在步骤(c)之后重新密封细菌外膜；和(e)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为包含结合多肽。另一方面，本发明的特征在于一种用于鉴定具有特异性结合靶分子的结合多肽的改善的表达的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供表达编码结合多肽的核酸的细菌，其中所述结合多肽存在于所述细菌的周质中；(b)使细菌经历透化细菌外膜的条件；(c)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；(d)在步骤(c)之后重新密封细菌外膜；和(e)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为具有结合多肽的改善的表达。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述方法还包括至少一次重复所述方法的步骤，而没有分离核酸的中间步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在重复所述方法之前在生长培养基中孵育细菌。
在任何前述方面的一些实施方案中，细菌包含允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中的突变。在一些实施方案中，突变在编码外膜蛋白或影响脂多糖(LPS)组成的蛋白的基因中。在一些实施方案中，外膜蛋白是主要外膜脂蛋白Lpp(Lpp)、孔蛋白或TolC。在一些实施方案中，影响LPS组成的蛋白选自RfaD、RfaE、RfaH、RfaRd、TolA、TolB和TolD。
在任何前述方面的一些实施方案中，使细菌经历透化细菌外膜的条件包括用透化剂处理细菌。在一些实施方案中，透化剂选自二价阳离子螯合剂、NaCl、蔗糖、抗生素、洗涤剂、溶菌酶、Tris、Tris-EDTA、抗坏血酸盐、聚赖氨酸、苯扎氯铵、鱼精蛋白、杀菌/通透性增加蛋白(BPI)、血清、补体和Ca2+。在一些实施方案中，二价阳离子螯合剂是EDTA。在一些实施方案中，抗生素选自氨基糖苷、多粘菌素B、脱酰基多粘菌素、八肽霉素和苄基青霉素。
在任何前述方面的一些实施方案中，重新密封细菌外膜包括使细菌与选自Mg2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Na+或K+的阳离子盐接触。在一些实施方案中，阳离子是Mg2+。在一些实施方案中，Mg2+的盐是MgCl2。
在任何前述方面的一些实施方案中，接触步骤还包括使细菌与核酸染料接触。在一些实施方案中，核酸染料选自
Figure BDA0003890634210000041
9、
Figure BDA0003890634210000042
41、
Figure BDA0003890634210000043
43、
Figure BDA0003890634210000051
42、
Figure BDA0003890634210000052
44、
Figure BDA0003890634210000053
40和
Figure BDA0003890634210000054
45。在一些实施方案中，核酸染料是
Figure BDA0003890634210000055
9或
Figure BDA0003890634210000056
41。
在任何前述方面的一些实施方案中，可检测地标记的靶分子包含荧光标记。在一些实施方案中，荧光标记包含荧光染料或荧光多肽。在一些实施方案中，荧光染料选自
Figure BDA0003890634210000057
染料或
Figure BDA0003890634210000058
染料。在一些实施方案中，
Figure BDA0003890634210000059
染料是
Figure BDA00038906342100000510
488或
Figure BDA00038906342100000511
647。在一些实施方案中，
Figure BDA00038906342100000512
染料是
Figure BDA00038906342100000513
649。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述方法还包括至少一个洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在细菌与可检测地标记的靶分子接触后将细菌重悬在洗涤缓冲液中。
在任何前述方面的一些实施方案中，鉴定步骤包括流式细胞术。在一些实施方案中，流式细胞术包括分选单个细胞和基于可检测地标记的靶分子的信号进行分选。在一些实施方案中，该方法还包括基于核酸染料的信号进行分选。在一些实施方案中，流式细胞术依次包括(i)基于核酸染料的信号进行分选；(ii)分选单个细胞；和(iii)基于可检测地标记的靶分子的信号进行分选。
在任何前述方面的一些实施方案中，细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，革兰氏阴性细菌是大肠杆菌细菌。
在任何前述方面的一些实施方案中，结合多肽在细菌的周质中以可溶形式表达。
在任何前述方面的一些实施方案中，结合多肽是抗体。在一些实施方案中，抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体是半抗体。在一些实施方案中，抗体是抗体片段。在一些实施方案中，抗体片段选自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段。
在任何前述方面的一些实施方案中，步骤(a)包括提供多种细菌，其中所述多种细菌包含核酸的文库，各核酸编码候选结合多肽。在一些实施方案中，文库包含编码候选抗体变体的多种核酸，其中各候选抗体变体与参照抗体相比在VH或VL的FR中包含氨基酸残基改变，其中氨基酸残基改变：(a)在与参照抗体具有相同亚型的天然存在的抗体中鉴定，和(b)在预测被隐藏的氨基酸残基中。在一些实施方案中，天然存在的抗体中氨基酸残基改变由体细胞超突变引起。在一些实施方案中，基于周质中标记的靶分子的量鉴定候选结合多肽为具有增加的表达水平的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括基于周质中标记的靶分子的量鉴定候选结合多肽为具有增加的稳定性的步骤。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述方法还包括在鉴定步骤之后分离核酸。
在任何前述方面的一些实施方案中，细菌包含影响转录调节基因的突变。在一些实施方案中，步骤(a)包括提供多种细菌，其中所述多种细菌包含核酸的文库，各核酸编码转录调节基因的突变体。在一些实施方案中，转录调节基因选自转录起始因子、抗σ因子、RNA聚合酶亚基或转录因子。在一些实施方案中，转录起始因子是σ因子。在一些实施方案中，σ因子选自RpoD(σ70)、RpoE(σ24)、RpoH(σ32)、RpoS(σ38)、RpoN(σ54)、RpoF(σ28)和FecI(σ19)。在一些实施方案中，σ因子是RpoD(σ70)。在一些实施方案中，影响转录调节基因的突变存在于合成的质粒上。在一些实施方案中，影响转录调节基因的突变存在于内源细菌基因组中。在一些实施方案中，影响转录调节基因的突变由易错PCR诱变、化学诱变、置换(transpositional)诱变或靶向诱变引起。在一些实施方案中，影响转录调节基因的突变由易错PCR诱变引起。在一些实施方案中，该方法鉴定具有结合多肽的改善的表达的细菌。
另一方面，本发明的特征在于一种细菌，其包含(i)在编码Lpp的基因中丧失功能的突变；和(ii)编码抗体的表达构建体。在一些实施方案中，抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体是半抗体。在一些实施方案中，抗体是抗体片段。在一些实施方案中，抗体片段选自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段。在一些实施方案中，细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，革兰氏阴性细菌是大肠杆菌细菌。在一些实施方案中，抗体在细菌的周质中以可溶形式表达。在一些实施方案中，丧失功能的突变是点突变、插入突变或缺失突变。在一些实施方案中，丧失功能的突变是缺失突变。在一些实施方案中，表达构建体包含与编码抗体的基因可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，表达构建体包含合成的质粒。在一些实施方案中，细菌还包含影响转录调节基因的突变。在一些实施方案中，转录调节基因选自转录起始因子、抗σ因子、RNA聚合酶亚基或转录因子。在一些实施方案中，转录起始因子是σ因子。在一些实施方案中，σ因子选自RpoD(σ70)、RpoE(σ24)、RpoH(σ32)、RpoS(σ38)、RpoN(σ54)、RpoF(σ28)和FecI(σ19)。在一些实施方案中，σ因子是RpoD(σ70)。在一些实施方案中，影响转录调节基因的突变存在于合成的质粒上。在一些实施方案中，影响转录调节基因的突变存在于内源细菌基因组中。在一些实施方案中，影响转录调节基因的突变由易错PCR诱变、化学诱变、置换诱变或靶向诱变引起。在一些实施方案中，影响转录调节基因的突变由易错PCR诱变引起。
另一方面，本发明的特征在于一种细菌，其包含(i)允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中的突变；(ii)编码结合多肽的表达构建体；和(iii)影响转录调节基因的突变。在一些实施方案中，转录调节基因选自转录起始因子、抗σ因子、RNA聚合酶亚基或转录因子。在一些实施方案中，转录起始因子是σ因子。在一些实施方案中，σ因子选自RpoD(σ70)、RpoE(σ24)、RpoH(σ32)、RpoS(σ38)、RpoN(σ54)、RpoF(σ28)和FecI(σ19)。在一些实施方案中，σ因子是RpoD(σ70)。在一些实施方案中，影响转录调节基因的突变存在于合成的质粒上。在一些实施方案中，影响转录调节基因的突变存在于内源细菌基因组中。在一些实施方案中，影响转录调节基因的突变由易错PCR诱变、化学诱变、置换诱变或靶向诱变引起。在一些实施方案中，影响转录调节基因的突变由易错PCR诱变引起。在一些实施方案中，结合多肽是抗体。在一些实施方案中，抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体是半抗体。在一些实施方案中，抗体是抗体片段。在一些实施方案中，抗体片段选自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段。在一些实施方案中，细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，革兰氏阴性细菌是大肠杆菌细菌。在一些实施方案中，抗体在细菌的周质中以可溶形式表达。在一些实施方案中，允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中的突变是在编码外膜蛋白或影响LPS组成的蛋白的基因中。在一些实施方案中，外膜蛋白是主要外膜脂蛋白Lpp(Lpp)、孔蛋白或TolC。在一些实施方案中，外膜蛋白是Lpp。在一些实施方案中，影响LPS组成的蛋白选自EnvA、RfaD、RfaE、RfaH、RfaRd、TolA、TolB和TolD。
另一方面，本发明的特征在于特异性结合白介素-13(IL-13)的分离的抗体，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链可变区，和(b)包含氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少95％同一性。
另一方面，本发明的特征在于特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区和(b)包含氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少95％同一性。
另一方面，本发明的特征在于特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区和(b)包含氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少95％同一性。
另一方面，本发明的特征在于特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和(b)包含氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少95％同一性。
另一方面，本发明的特征在于特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链可变区。
另一方面，本发明的特征在于特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区。
另一方面，本发明的特征在于特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区。
另一方面，本发明的特征在于特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区。
另一方面，本发明的特征在于特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区。
在任何前述方面的一些实施方案中，所述抗体还包含以下六种HVR：(a)包含AYSVN(SEQ ID NO：7)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含MIWGDGKIVYNSALKS(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含DGYYPYAMDN(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASKSVDSYGNSFMH(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含LASNLES(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含QQNNEDPRT(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，前述抗体中的任何一种以约1nM或更低的KD特异性结合人IL-13。在一些实施方案中，抗体以约1pM至约50pM的KD特异性结合人IL-13。在一些实施方案中，抗体以约29pM至约40pM的KD特异性结合人IL-13。
在一些实施方案中，前述抗体中的任一种是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体是半抗体。在一些实施方案中，抗体是结合IL-13的抗体片段。在一些实施方案中，抗体片段选自Fab、Fab'-SH、Fv，scFv和(Fab')2片段。在一些实施方案中，抗体是单特异性抗体。在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。
另一方面，本发明的特征在于编码本文所述的任何抗体的分离的核酸。在另一方面，本发明的特征在于包含用于表达抗体的分离的核酸的载体(例如，表达载体)。在另一方面，本发明的特征在于包含前述核酸和/或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞。
在另一方面，本发明的特征在于生产本文所述的任何抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养包含任何前述载体(例如表达载体)的宿主细胞。在一些实施方案中，该方法还包括从宿主细胞或培养基中回收抗体。
在另一方面，本发明的特征在于包含前述抗体中的任一种的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。
在一些方面，前述抗体中的任一种可以用作药物。
在一些方面，前述抗体中的任一种可用于治疗IL-13介导的疾患。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗患有哮喘症状的患者的方法，所述方法包括向患者施用有效量的前述抗体中的任一种以减少哮喘症状。
在另一方面，本发明的特征在于一种用于抑制患者中IgE抗体产生的方法，所述方法包括向患者施用有效量的前述抗体中的任一种。在一些实施方案中，抑制IgE抗体产生旨在治疗支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎、荨麻疹、过敏反应(anaphylaxis)或特应性皮炎。
另一方面，本发明的特征在于一种治疗患者中IL-13介导的疾患的方法，所述方法包括向患者施用有效量的前述抗体中的任一种。在一些实施方案中，疾患是过敏性哮喘、非过敏性(内在性)哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、过敏性结膜炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏、慢性阻塞性肺病、溃疡性结肠炎、RSV感染、葡萄膜炎、硬皮病或骨质疏松症。
另一方面，本发明的特征在于一种治疗患者中IgE介导的疾患的方法，所述方法包括向患者施用有效量的前述抗体中的任一种。在一些实施方案中，IgE介导的疾患是支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、荨麻疹、过敏反应或特应性皮炎。
在前述治疗方法的一些实施方案中，抗体抑制IL-13与其受体结合并抑制一种或多种与IL-13与其受体结合相关的功能。
在前述治疗方法的一些实施方案中，通过一种或多种途径施用抗体，所述一种或多种途径选自静脉内、腹膜内、吸入、肌内、皮下和口服。在一些实施方案中，途径是皮下。
在前述治疗方法的一些实施方案中，患者是人。
另一方面，本发明的特征在于包含编码候选抗体变体的多种核酸的文库，其中各候选结合多肽变体与参照抗体相比在VH或VL的FR中包含氨基酸残基改变，其中氨基酸残基改变是：(a)在与参照抗体具有相同亚型的天然存在的抗体中鉴定，和(b)在预测被隐藏的氨基酸残基中。在一些实施方案中，天然存在的抗体中氨基酸残基改变由体细胞超突变引起。
附图说明
图1A是一组荧光显微照片，其显示用IL-13抗原特异性染色表达抗体的细菌细胞。将表达抗IL-13抗体或空载体对照(pBR322)的细胞用
Figure BDA0003890634210000111
41(核酸染料)、
Figure BDA0003890634210000112
488-标记的IL-13或
Figure BDA0003890634210000113
649标记的抗人Fc F(ab’)2抗体染色。只有表达抗体的细胞用IL-13抗原和抗人Fc抗体染色阳性。
图1B显示在乙二胺四乙酸(EDTA)处理、抗原染色和MgCl2添加之前(“染色前”)和之后(“染色后”)，用表达不同抗IL-13抗体形式或空对照载体(pBR322)的细胞系列稀释液点样的细菌培养板的图像。在未染色和染色的细胞之间没有观察到存活力的实质差异。
图1C是显示用荧光标记的IL-13染色后表达不同形式的抗IL-13抗体(IgG、半抗体(Half-Ab)和Fab)的细胞或对照细胞的流式细胞术分析的图，所述对照细胞用空对照载体pBR322转化(黑线，阴影)。所有形式都显示IL-13信号在pBR322对照上位移。
图1D是本发明的示例性方法的示意图。细胞通过EDTA处理透化，与荧光标记的抗原孵育，并通过添加MgCl2恢复外膜的完整性。通过流式细胞术分选≤前1％抗原阳性的细胞，或者再生长后进展到下一轮以进一步富集、或者收集用于分析。SSC，侧散射。
图2A显示用细菌系列稀释液点样的细菌培养板的图像，携带赋予羧苄西林(Carb)和四环素(Tet)抗性的编码抗IL-13抗体的质粒的细菌，以1：105或1：106掺入赋予羧苄西林抗性的用编码抗VEGF抗体的质粒转化的细菌中。通过将系列稀释液铺板到含有羧苄西林(总细菌计数)和四环素(仅携带抗IL-13质粒的细菌)的板上观察稀少的表达抗IL-13的细菌的存在，证实预期的比例。
图2B是显示1或2轮(Rd)细菌抗体展示(BAD)后抗原阳性细胞百分比的图。掺入的培养物是用
Figure BDA0003890634210000121
647标记的抗原进行分选的BAD。以1:106的比率掺入展示非结合抗体细胞池的展示抗IL-13(环)或抗-VEGF-抗体(正方形)的细胞在两轮BAD分选的过程中迅速富集。
图2C是显示图2B所示的抗VEGF掺入实验的流式细胞术分析的一系列图。在两轮分选后，显著部分的细胞群与VEGF抗原结合。
图3A是显示通过Western印迹测定的抗VEGF.2变体表达水平的图。用抗人Fc抗体检测非还原的可溶性样品，并使用LI-COR
Figure BDA0003890634210000122
仪器定量。针对抗VEGF.2WT(野生型)的半抗体条带对信号进行标准化。n＝3次实验。与WT相比，所有变体具有增加的表达水平。
图3B是显示个体抗VEGF.2变体的流式细胞术分析的图。抗VEGF.2WT具有比未染色细胞更高的位移(黑色，阴影)。所有变体具有比WT更高的位移，并与由Western印迹测定的表达分级相关(参见图3A)。显示了抗VEGF.2WT、L4M.E6Q.M34I、F71Y.E6Q.M34I和S24R.E6Q.M34I。
图3C是显示最佳表达的变体的富集的一系列图，该变体来自通过BAD的抗VEGF.2WB和三种变体池。经过两轮对前1％VEGF结合细胞的分选，池的流式细胞术信号以更正向的方向位移。在每轮中分析并显示了最低表达的抗VEGF.2WA和最佳表达的变体S24R.E6Q.M34I，用于比较。
图3D是显示经过两轮分选的抗VEGF.2变体富集的一系列饼图。对96个克隆进行测序，在两轮后富集最高表达的抗VEGF.2变体、F71Y.E6Q.M34I和S24R.E6Q.M34I，而耗尽两个最低表达的变体(抗VEGF.2WT和L4M.E6Q.M34I)。
图4A是显示抗IL-13框架变体的轮富集的一系列图。叠加FACSTM点图显示抗IL-13框架(FR)变体经过每一轮与抗IL-13WT相比位移更正向。
图4B是显示抗IL-13文库轮富集的一系列饼图。第1轮和第2轮显示的数据分别来自测序186和226个克隆。M4L和E6Q是两轮BAD后最富集的变体。
图4C是显示哺乳动物(HEK293T)和大肠杆菌细胞中抗IL-13变体及其组合的表达的相关性的图。在两个宿主系统中都可以看到表达的改善。对于大肠杆菌表达，用抗人Fc抗体检测非还原的可溶半抗体样品，并使用LI-COR
Figure BDA0003890634210000131
仪器定量。对于HEK293T表达，定量蛋白A纯化的IgG产量。针对抗IL-13WT对表达进行标准化。n＝3次实验。
图4D是显示通过差示扫描荧光测定法(DSF)测量的抗IL-13变体及其组合的热稳定性的图。包含M4L突变的所有变体显示不依赖于宿主表达系统的5℃的热稳定性增加。为了测量热稳定性，分别从大肠杆菌和CHO细胞纯化Fab和IgG。该图示出了Fab转换(温度)(一半Fab熔解时的温度)的结果，其等于熔解温度Tm。Fab与IgG抗体形式中Fab熔体的Tm值相当。
图5A是显示每轮FACSTM后抗VEGF.3框架文库富集的流式细胞术分析的一系列图。这些数据表明，在第1轮后抗VEGF.3框架(FR)文库变体比抗VEGF.3WT或未染色的细胞(黑线，阴影)更好地位移，并且通过第2轮位移进一步明显。
图5B是显示在大肠杆菌中具有改善的表达的抗VEGF框架变体及其组合的亚组显示在哺乳动物(HEK293T)表达(画框)中相关增加的图。针对抗VEGF WT对表达进行标准化，并通过半抗体(大肠杆菌)或蛋白A纯化IgG(HEK 293T)的抗Fc Western印迹测定。n＝3次实验。
图5C是显示抗VEGF.3框架变体具有增加的热稳定性以及组合框架变体具有加和效应的图。差示扫描荧光测定法显示，单框架变体E6Q、V37I、V48L或V48I(左框)增加热稳定性。双变体(中间框)进一步增加热稳定性，三变体(右框)具有最大的加和增加。显示IgG的Fab转换(温度)值，n＝3次实验。
图5D是抗VEGF G6与VEGF复合的晶体结构的表现(RCSB蛋白数据库(PDB)登录号：2FJG)。在抗VEGF G6与VEGF复合(PDB：2FJG)的X线晶体结构上显示鉴定的增加表达和热稳定性的框架残基。做V37I和V48I突变的模型，而Q6存在于天然抗体结构中。三个残基位于重链可变(VH)结构域核心的平面内。E6和V48I位于VH结构域的β桶状结构核心中分开的链上，而V37I在VH和轻链可变(VL)结构域之间的隐藏界面中。重链恒定结构域(CH)、轻链恒定结构域(CL)。
图6显示了来自抗IL-13抗体的轻链和重链抗IL-13可变结构域的氨基酸序列。抗体可变结构域由位于四个框架区(FR)之间的三个高变区(HVR；上划线)组成。体细胞超突变可以向FR和HVR中引入变化。整理来自Kabat数据库的数据，汇编由体细胞超突变在可变κ4(Vκ4)和重链2(VH2)亚型的框架内引起的所有氨基酸变化，然后将其缩窄至非溶剂暴露的残基(由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的序列下定位的氨基酸残基表示)。制备抗IL-13半抗体的单框架变体，轻链中5个和重链中28个，并组合以通过BAD筛选。
图7是抗VEGF G6抗体的可变结构域的主链抗体骨架的带状结构图(Fuh等人，JBiol Chem.281(10):6625-31,2006)。轻链和重链可变区被标记。与使用抗IL-13抗体的方法(参见图6)类似，扫描Kabat数据库以鉴定由体细胞超突变在可变κ1和重3(分别为Vκ1和VH3)亚型的FR中引入的残基。排除HVR以保持亲和力，同时还选择隐藏的残基(球)以降低免疫原性的风险。通过这些标准，产生抗VEGF半抗体的单一框架变体，轻链中47个，重链中36个，并组合这些变体以通过BAD筛选。
图8显示用抗VEGF.2抗体表达后的所示细菌菌株点样的细菌培养板的图像。将1OD/mL细胞系列稀释并铺板在LB/羧苄西林板上以观察细胞存活力。在抗VEGF抗体表达后各种野生型表达菌株显示不同程度的存活力(左图)。与菌株64B4相比，62A7菌株显示存活力增加1-log。在64B4菌株背景中删除lpp导致存活力下降3-log。在表达抗VEGF或抗组织因子(TF)抗体的细胞中与64B4Δlpp菌株相比，62A7Δlpp菌株显示增加的存活力(右图)。
图9是显示用所示蓝色荧光核酸染料染色的表达抗VEGF.V48L的大肠杆菌细胞的流式细胞术分析的一系列图。观察到范围为20-90％的细胞阳性染色。MFI，平均荧光强度。
图10是显示在BAD筛选期间细胞浓度可影响流式细胞术期间的细胞双联体的存在的一系列图。两个抗VEGF变体V48L和A97T分开地在菌株62A7Δlpp中表达，细胞用分别与ALEXA
Figure BDA0003890634210000151
488和ALEXA
Figure BDA0003890634210000152
647荧光缀合的VEGF抗原进行标记。然后将这些标记的细胞相等地组合并进行流式细胞术分析。当分析浓度为1×108细胞/mL时，存在两种
Figure BDA0003890634210000153
染料双阳性的细胞(上图)。然而，将细胞浓度降低至1×106细胞/mL时，消除了双联体，仅观察到单一阳性的细胞(下图)。
图11是显示细菌抗体展示的示例性流式细胞术分选策略的示意图。抗体在62A7Δlpp大肠杆菌表达菌株中表达。首先基于与未染色的对照相比的核酸染料阳性来选择细胞。接下来，使用前和侧散射来选择细胞。接下来，使用细胞复杂性(侧散射的宽度和高度，SSC)和小细胞尺寸(前散射的宽度和高度，FSC)实施选择双联体消除的两个标准门控。最后，使用设置在表达非结合抗体和未染色细胞和/或空载体的细胞中看到的位移之上的门控选择抗原阳性细胞。
图12A是显示使用实施例4中描述的策略可成功分选差异标记的抗原阳性细胞的图。两个抗VEGF变体(V48L和A97T)分开地在菌株62A7Δlpp中表达，细胞用分别与ALEXA
Figure BDA0003890634210000161
488和ALEXA
Figure BDA0003890634210000162
647荧光缀合的VEGF抗原标记。然后将这些标记的细胞一对一组合，分选单一抗原阳性(
Figure BDA0003890634210000163
488或
Figure BDA0003890634210000164
647)、与两种抗原(双阳性)结合或与两种抗原均不结合(双阴性)。绿框表示预期表达V48L变体的细胞，而红框表示预期表达A97T变体的细胞。对分选输入和输出进行铺板，并对96个菌落进行测序。右组是显示分选事件的数量和分析后阳性事件的百分比的表格，如通过将分选的样品在流式细胞仪上运行来检测与抗原结合的阳性百分比(％阳性)。
图12B是显示图12A所示实验的测序分析结果的表。其中两种抗VEGF变体(V48L和A97T)1：1输入，每轮分选后各变体可分开地富集至约95％。可分选的双阳性细胞非常低的数量不产生用于测序的任何菌落，而不结合任一标记抗原的双阴性细胞由两种抗体变体的相等组合组成，表明没有选择偏差。
图13是基于抗IL-13可变结构域的亚型的主链抗体骨架的带状结构图。体细胞超突变可以将变化引入框架区和高变区。整理来自Kabat数据库的数据，汇编由体细胞超突变在可变κ4(Vκ4)和重2(VH2)亚型的框架内引起的所有氨基酸变化，然后将选择的变体缩窄为非溶剂暴露的残基(球)。制备抗IL-13半抗体的单一框架变体，轻链中5个，重链中28个，组合以通过BAD筛选。
图14是大肠杆菌σ因子RpoD(σ70)的结构域结构的示意图。
图15A和15B是显示通过易错聚合酶链反应(PCR)构建突变体rpoD文库的示例性策略的示意图。通过易错PCR诱变pACYCrpoD质粒(6006bp)，产生约106个突变质粒的文库大小(图15A)。在转化到大肠杆菌中时，各突变体表达独特的表型(在图15B中由每个细胞中存在的不同箭头表示)。
图16A和16B是显示制备用于BAD筛选的突变体rpoD质粒文库的示例性策略的示意图。用编码抗IL-13抗体的MD169质粒转化菌株66C4(Δlpp)(图16A)。得到的转化体进一步用突变体rpoD质粒文库转化，产生具有约106个成员的多样性的66C4细菌文库池(图16A和16B)。
图17A和17B是显示用突变体rpoD质粒文库转化的细菌池的BAD筛选的示例性策略的示意图。将66C4细菌文库池在30℃下在CRAP培养基中以225rpm摇动生长24小时。收获1OD单位，通过用EDTA处理透化，与荧光标记的抗原(ALEXA
Figure BDA0003890634210000171
647标记的人IL-13(“
Figure BDA0003890634210000173
647-huIL-13”))和核酸染色剂(
Figure BDA0003890634210000172
9)孵育，并通过添加MgCl2恢复外膜的完整性。使用
Figure BDA0003890634210000174
设备、使用所示的门控策略对细胞进行流式细胞术(图17B)。基于
Figure BDA0003890634210000175
647-hulL-13信号强度分选前1-3％的细胞，生长用于下一轮的BAD。
图18是显示所示样品的流式细胞术分析结果的图，所述样品来自用突变体rpoD质粒文库转化的66C4细菌文库池的BAD筛选。插入的表显示样品和平均荧光强度(“平均值”)。
图19是显示通过BAD筛选用突变体rpoD质粒文库转化的66C4细菌文库池鉴定的三个rpoD突变体的示意图。突变体1和2是包括相对于野生型RpoD的所示点突变的截短突变体。图底部的饼图显示在96个测序菌落中观察到的所示突变体的数目。
图20是显示所示样品(表达所示rpoD突变体、野生型RpoD或空载体对照的大肠杆菌)的流式细胞术分析结果的图。插入的表显示样品和平均荧光强度(“平均值”)。
图21A是免疫印迹，表明与表达天然野生型RpoD的细胞相比，所示rpoD突变体的表达导致66C4宿主大肠杆菌细胞中全长抗IL-13的表达增加。
图21B是免疫印迹，表明与表达天然野生型RpoD的细胞相比，所示rpoD突变体的表达导致67A6宿主大肠杆菌细胞中全长抗IL-13的表达增加。
具体实施方式
I定义
本文所用的术语“约”是指本技术领域中的技术人员熟知的相应值的通常误差范围。文中引用“约”某值或参数包括(和描述)针对该值或参数本身的实施方案。
本文所用的“细菌”是指包括内膜(即细胞质膜)、周质和外膜的细菌细胞。外膜不同于内膜，可以包含例如脂多糖(LPS)和孔蛋白。在一些实施方案中，细菌是革兰氏阴性细菌。示例性细菌物种包括埃希氏杆菌属(Escherichia species)(例如大肠杆菌)、沙门氏菌属(Salmonella species)(例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和肠道沙门氏菌(S.enterica))以及本领域已知的其它物种。
术语“结合多肽”是指特异性结合靶分子的多肽。在一些实施方案中，结合多肽是抗体。在其它实施方案中，结合多肽是例如抗体模拟物、细胞表面受体、细胞因子或生长因子。术语“靶分子”是指结合多肽的特异性结合靶。靶分子通常是小分子、多肽或多肽片段。如果结合多肽是抗体，则靶分子例如可以是抗原。
关于结合多肽(例如，抗体)与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合”或“特异于”特定多肽或特定靶分子上的表位是指与非特异性相互作用明显不同的结合。可以例如通过测定与对照分子的结合相比的分子的结合来测量特异性结合。例如，可以通过与靶相似的对照分子(例如过量的未标记的靶)的竞争来确定特异性结合。在这种情况下，如果标记的靶与探针的结合被过量的未标记的靶竞争性地抑制，则指示特异性结合。本文使用的术语“特异性结合”或“特异性结合”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位可以例如由以下分子显示：所述分子针对靶具有10-4M或更低、或者10-5M或更低、或者10-6M或更低、或者10-7M或更低、或者10-8M或更低、或者10-9M或更低、或者10-10M或更低、或者10-11M或更低、或者10-12M或更低的KD，或者所述分子针对靶具有10-4M至10-6M或10-6M至10-10M或10-7M至10-9M范围的KD。如本领域技术人员将理解的，亲和力和KD值是负相关的。通过低KD值测得对抗原的高亲和力。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指分子结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位的结合。
如本文所用，“文库”是指多种结合多肽(例如抗体或抗体片段)序列或编码这些序列的核酸。示例性文库可以具有约2个结合多肽至约1014个结合多肽的大小(例如，约2至约10、约2至约20、约2至约30、约2至约40、约2至约50、约2至约60、约2至约70、约2至约70、约2至约80、约2至约100、约2至约1014、约2至约1013、约2至约1012、约2约1011、约2至约1010、约2至约109、约2至约108、约20至约108、约30至约108、约40至约108、约50至约108、约60至约108、约70至约108、约80至约108、约90至约108、约100至约108、约200至约108结合、约400至约108、约600至约108、约800至约108、约103至约108、约104至约108、约105至约108、约106至约108、或约107至约108个结合多肽)。
起始或参照结合多肽(例如，参照抗体)的“变体”或“突变体”是(1)具有不同于起始或参照多肽的氨基酸序列并且(2)是通过天然或人工(人造)诱变来源于起始或参照多肽的结合多肽。这样的变体包括例如从感兴趣结合多肽的氨基酸序列中的残基的缺失、插入和/或取代，文中称为“氨基酸残基改变”。因此，变体HVR是指相对于起始或参照多肽序列(如源抗体或抗原结合片段的序列)包含变体序列的HVR。在上下文中，氨基酸残基改变是指与起始或参照多肽序列(如参照抗体或其片段)中相应位置上的氨基酸不同的氨基酸。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的变体或突变体构建体，只要最终构建体具有期望的功能特征(例如亲和力、稳定性和/或表达)。
“野生型”或“参照”序列或“野生型”或“参照”蛋白/多肽的序列，如参照抗体的HVR、FR或可变结构域的序列可以是通过引入突变而从其得到变体多肽的参照序列。通常，给定蛋白的“野生型”序列是在自然界中最常见的序列。类似地，“野生型”基因序列是在自然界中最常见的基因的序列。可以通过自然方法或通过人为诱导方法将突变引入“野生型”基因(并因此引入其编码的蛋白)。这些方法的产品是原始“野生型”蛋白或基因的“变体”或“突变体”形式。
“突变”是相对于参照核苷酸序列(如野生型序列)的核苷酸的缺失、插入或取代。
术语“膜不可通透的”是指分子(例如，多肽)不能跨过生物膜(例如，细菌的内膜和/或外膜)或通道孔(例如孔蛋白)扩散。相比之下，“膜可通透的”分子能够跨过生物膜扩散。应当理解，在一些条件下，例如，通过本发明的方法，通常是膜不可通透的分子(例如，多肽)可以扩散到细菌的周质中，例如，如果外膜的完整性永久或短暂地受损。
本文所用的术语“通透性”是指分子跨过生物膜的扩散速率。如果给定分子基本上能够跨过膜扩散，则生物膜对于该分子是“可通透的”。如果给定分子基本上不能跨过膜扩散，则生物膜对于该分子是“不可通透的”。分子的电荷、极性和大小可影响生物膜对该分子是可通透的或不可通透的。通常，疏水性分子和小的不带电极性分子是跨过生物膜可通透的，而大多数水溶性(亲水性)分子是不可通透的。通常细菌外膜对于具有大于约600道尔顿的分子量的亲水性分子的扩散是不可通透的(参见例如Decad等人，J.Bacteriology 128(1):325-336,1976)。
本文所用的“主要外膜脂蛋白Lpp”在本领域中也称为“Lpp”、“Braun脂蛋白”和“murein脂蛋白”，除了另有说明，其是指来自任何细菌来源(包括来自大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌(也称为lkyD))的任何天然Lpp。该术语包括“全长”、未处理的Lpp，以及由细胞内加工产生的任何形式的Lpp。Lpp与肽聚糖相互作用，有助于维持细胞包膜的结构和功能完整性。示例性大肠杆菌(菌株K12)Lpp的氨基酸序列可以在例如UniProtKB登录号P69776中找到。
“周质”是由两个选择性可通透屏障(例如生物膜)界定的空间。在许多细菌物种(包括大肠杆菌)中，周质是由内膜和外膜界定的空间。
本文所用的“透化剂”是指能够增加例如针对通常是膜不可通透的分子(例如多肽)的细菌外膜通透性的化学品。示例性的透化剂包括例如螯合剂，包括二价阳离子螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA；也称为依地酸(edetic acid)或2-[2-[双(羧甲基)氨基]乙基-(羧甲基)氨基]乙酸)、2-[2-[2-[2-[双(羧甲基)氨基]苯氧基]乙氧基]-N-(羧甲基)苯胺基]乙酸(BAPTA)和2-[2-[2-[2-[双(羧甲基)氨基]乙氧基]乙氧基]乙基-(羧甲基)氨基]乙酸(EGTA)),NaCl(Chen等人Nat.Biotech.19:537-542,2001)、蔗糖、抗生素(例如氨基糖苷类(例如链霉素和庆大霉素)、多粘菌素B、脱酰多粘菌素、八肽霉素和苄基青霉素)、洗涤剂、溶菌酶、Tris、Tris-EDTA、抗坏血酸、聚赖氨酸、苯扎氯铵、鱼精蛋白、杀菌/通透性增加蛋白(BPI)、血清和/或补体、Ca2+或其组合。参见，例如，Hancock,Ann.Rev.Microbiol.38:237-264,1984。在一些实施方案中，透化剂是EDTA。
文中使用的“透化”是指增加分子跨过生物膜的扩散速率，例如增加通常是膜不可通透的分子(例如，多肽)跨过细菌外膜的扩散速率。
“多肽”是指含有通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的肽或蛋白，包括肽、寡聚体、蛋白等。多肽可以含有天然的、修饰的或合成的氨基酸。多肽也可以被天然修饰(如通过翻译后加工)或化学修饰(如酰胺化酰化、交联等)。
如本文所用的“多种”物质，如本发明的多肽或多核苷酸，通常是指两种或更多种类型或种类的物质的集合。如果两种或更多种物质在特定特征(如在特定氨基酸位置处发现的变体氨基酸)方面彼此不同，则存在两种或更多种类型或种类的物质。例如，如果存在两种或更多种本发明的多肽，其在除了变体框架区(FR)的序列外、或者除了在特定的非溶剂暴露的氨基酸位置上的变体氨基酸外，在序列上基本上相同、优选地相同，则存在本发明的多种多肽。在另一个实例中，如果存在两种或更多种本发明的多核苷酸，其在除了编码变体FR的序列外、或者除了编码特定的非溶剂暴露的氨基酸位置的变体氨基酸的序列外，在序列上基本上相同、优选地相同，则存在本发明的多种多核苷酸。
本文所用的术语“重新密封”是指基本上恢复细菌外膜的膜通透性屏障。在一些实施方案中，重新密封反转之前的细菌外膜的透化。
本文所用的术语“转录调节基因”是指影响编码结合多肽(例如抗体)的基因的转录或表达的其它方面(例如翻译、转运或稳定性)的任何基因，例如，全局地(例如，影响多个基因的转录)或单独地(例如，影响一个或几个基因的转录)。示例性的非限制性转录调节基因包括转录起始因子(例如，σ因子)、抗σ因子、RNA聚合酶亚基和转录因子。在一些实施方案中，σ因子选自RpoD(σ70)、RpoE(σ24)、RpoH(σ32)、RpoS(σ38)、RpoN(σ54)、RpoF(σ28)和FecI(σ19)。在一些实施方案中，σ因子是RpoD(σ70)。
“影响转录调节基因的突变”是指影响转录调节基因的功能、表达水平、稳定性或活性的任何突变。突变可以是例如位于转录调节基因本身。在其它实施方案中，突变可以位于调节性核酸序列，例如转录调节基因的启动子或增强子中。突变可以是本领域已知的任何类型，例如点突变、插入突变、缺失突变、框架位移突变等。
“表达构建体”是指能够在细菌中赋予基因(例如，结合多肽(例如抗体)或转录调节基因)表达的任何核酸元件。表达构建体可以指转化到细菌中的合成的质粒、整合到内源细菌基因组中的合成的核酸序列或任何其它合适的核酸元件。在一些实施方案中，表达构建体是合成的质粒。
如本文所用，在结合多肽的表达和/或稳定性方面，术语“改善的”和“增加的”是指相对于结合多肽的参照表达水平和/或结合多肽的参照稳定性的增加或增强。在一些实施方案中，参照表达水平可以是野生型结合多肽的表达水平。在其它实施方案中，参照表达水平可以是变体结合多肽的表达水平。在一些实施方案中，参照表达水平可以是野生型细菌中结合多肽的表达水平。在一些实施方案中，参照表达水平可以是突变细菌中结合多肽的表达水平。在一些实施方案中，参照稳定性可以是野生型结合多肽的稳定性。在其它实施方案中，参照稳定性可以是变体结合多肽的稳定性。
“合成的质粒”是指可以用于基因表达(例如编码结合多肽的基因或转录调节基因的表达)目的的任何非天然存在的质粒(例如，线性质粒或环状质粒)。合成的质粒可以包括例如可操作地连接到感兴趣基因的启动子、抗生素抗性标记物、多克隆位点、复制起点或本领域已知的任何其它元件。
用于本文目的的“受体人框架”是包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如下所定义。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者其可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如抗体和抗原)成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些。以下描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
“亲和力成熟”抗体是在一个或多个HVR和/或框架区中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这些改变的亲本抗体相比，所述改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。优选的亲和力成熟抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的方法产生。例如，Marks等人Bio/Technology 10：779-783，1992描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。HVR和/或框架残基的随机诱变描述于：Barbas等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3809-3813,1994；Schier等人Gene169:147-155,1995；Yelton等人J.Immunol.155:1994-2004,1995；Jackson等人J.Immunol.154(7):3310-3319,1995；和Hawkins等人J.Mol.Biol.226:889-896,1992。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所期望的抗原结合活性。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定法中50％或更多地阻断参照抗体与其抗原结合的抗体，反之，参照抗体在竞争测定法中50％或更多地阻断该抗体与其抗原的结合。本文提供了示例性的竞争测定法。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体；线性抗体(参见美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人Protein Eng.8(10):1057-1062,1995)；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，以及残留的“Fc”片段，该名称反映了容易结晶的能力。Fab片段由整个轻(L)链与重(H)链的VH结构域、以及一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。胃蛋白酶处理抗体产生单个大的F(ab')2片段，其大致对应具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段不同，在CH1结构域的羧基末端具有额外的少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在文中是这样的Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。F(ab')2抗体片段最初作为成对的Fab'片段产生，在其之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
本文中的术语“Fc区”用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可能存在或不存在。除非另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991所述。
“Fv”由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠出现六个高变环(每3个环来自H和L链)，其提供抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含特异性针对抗原的三个Hs的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常亲和力低于整个结合位点。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接到单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，使得sFv能够形成抗原结合所期望的结构。对于sFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315,1994。
术语“双体抗体”是指通过在VH和VL结构域之间用短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(见前面段落)而制备的小抗体片段，从而实现V结构域的链间而不是链内配对，得到一个二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双体抗体是两个“交叉”sFv片段的异源二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双体抗体更全面地描述于例如EP404,097；WO 93/11161和Hollinger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448,1993。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其所结合的抗原的生物活性的抗体。某些阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。
抗体的“类”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
抗体“效应功能”是指由抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)引起的那些生物活性，并且随抗体同种型不同而变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞激活。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性的形式，其中分泌的Ig结合到某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上，使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀伤靶细胞。抗体“装备”细胞毒性细胞，是这种杀伤所绝对需要的。用于介导ADCC的主要细胞——NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch等人Annu.Rev.Immunol.9:457-492,1991第464页的表3中。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定法，如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述。用于这种测定法的有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外地，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在如Clynes等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656,1998所公开的动物模型中。
“Fc受体”或“FcR”描述了结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可替换的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其细胞质结构域。激活受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见
Figure BDA0003890634210000271
Annu.Rev.Immunol.15:203-234,1997中的综述M)。例如，在Ravetch等人Annu.Rev.Immunol.9:457-492,1991；Capel等人Immunomethods 4:25-34,1994；和de Haas等人J.Lab.Clin.Med.126:330-41,1995中综述了FcR。其它FcR，包括将来要鉴别的FcR，包括在本文的术语“FcR”中。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(参见例如Guyer等人J.Immunol.117:587,1976；和Kim等人J.Immunol.24:249,1994)。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞；其中优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从天然来源例如从血液中分离出来。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下裂解靶细胞。经典补体通路的激活由补体系统的第一组分(C1q)与抗体(适当的亚类)结合起始，所述抗体结合其同源抗原。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法，例如，如Gazzano-Santoro等人J.Immunol.Methods 202:163,1996所述。
“表位”是抗体特异性结合的抗原的部分。对于多肽抗原，表位通常是约4-15个氨基酸残基的肽部分。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中互换地用于指具有与天然抗体结构基本相似的抗体或具有含有本文所定义的Fc区的重链的抗体。
本文所用的术语“半抗体”是指一条免疫球蛋白重链连接一条免疫球蛋白轻链。本领域技术人员将容易地理解，半抗体可以包括其片段，并且还可以具有由单个可变结构域(例如源自骆驼科动物)组成的抗原结合结构域。
“人抗体”是具有氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或使用任何制备人抗体的技术制备的氨基酸序列。人抗体的这种定义特异地排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是表示人免疫球蛋白VL或VH框架序列选择中最常发生的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组(也称为“亚型”)。通常，序列亚组是如Kabat等人Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD,vols.1-3,1991中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如上文Kabat等人中的亚组κIII或κIV。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如上文Kabat等人中的亚组III。
非人(例如啮齿类动物)抗体的“人源化”形式是含有源自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被具有所期望的抗体特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常为两个可变结构域的基本上全部，其中高变环的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的高变环，全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的FR的FR。人源化抗体任选还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关更多的详细信息，参见Jones等人Nature 321:522-525,1986；Riechmann等人Nature 332:323-329,1988；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596,1992。
“免疫缀合物”是抗体与一个或多个异源分子缀合，所述异源分子包括但不限于细胞毒性剂。
当用于描述本文公开的各种抗体时，术语“分离的”是指已从表达其的细胞或细胞培养物中鉴定和分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染成分通常是干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，可以包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶质。在一些实施方案中，抗体被纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)法所测定的。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等人J.Chromatogr.B 848:79-87,2007。在优选的实施方案中，抗体将被纯化至(1)足以通过使用旋转杯测序仪获得至少15个残基的N末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下使用考马斯亮蓝或优选银染色为同质。分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为天然环境中将不存在多肽的至少一种成分。然而，通常通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即包含单个抗体的群是相同的和/或结合相同的表位，除可能的变体抗体之外，例如含有天然存在的突变的变体或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生的变体，这些变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示从基本上均匀的抗体群获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示法和利用转基因动物的方法，所述转基因动物含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，用于制备单克隆抗体的这样的方法和其它示例性方法在本文描述。
术语“多特异性抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VHVL单元具有多表位特异性(即，能够结合一个生物分子上的两个不同表位或不同生物分子上的每个表位)。这样的多特异性抗体包括但不限于全长抗体、具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体、抗体片段如Fab，Fv，dsFv，scFv，双体抗体，双特异性双体抗体和三体抗体、已经被共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”是指特异性结合相同或不同靶上的两个或更多个不同表位的能力。“双重特异性(dual specificity)”或“双特异性(bispecificity)”是指特异性结合相同或不同靶上的两个不同表位的能力。然而，与双特异性抗体不同，双重特异性抗体具有氨基酸序列相同的两个抗原结合臂，每个Fab臂能够识别两种抗原。双重特异性允许抗体作为单个Fab或IgG分子与两种不同抗原以高亲和力相互作用。根据一个实施方案，IgG1形式的多特异性抗体以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合每个表位。“单特异性”是指仅结合一个表位的能力。
“裸抗体”是指不与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物组合物中。
术语“可变”是指在抗体之间可变结构域的某些区段的序列广泛不同的事实。可变或“V”结构域介导抗原结合，并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性不均匀地分布在可变结构域的110个氨基酸上。反而，V区由称为框架区(FR)的相对不变的片段(stretch)和称为“高变区”的极端变异的较短区组成，所述框架区(FR)为15-30个氨基酸，被9-12个氨基酸长的“高变区”分开。在本文中使用时术语“高变区”或“HVR”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区在VL中通常包含来自例如约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)的氨基酸残基，以及在VH中通常包含来自约残基26-35(H1)、49 -65(H2)和95-102(H3)的氨基酸残基(在一个实施方案中，H1约为残基31-35)；Kabat等人，同上)和/或在VL中来自“高变环”(例如，残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3))的那些残基，和在VH中来自26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)的那些残基；Chothia等人J.Mol.Biol.196:901-917,1987。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，主要采用由三个高变区连接的β片层构型，所述高变区形成环连接β片层结构、在一些情况下形成β片层结构的一部分。每条链中的高变区被FR极为接近地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，同上)。因此，HVR和FR序列在VH(或VL)中通常以以下顺序存在：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出各种效应功能，如在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“如Kabat中编号的可变结构域残基”或“如Kabat中编号的氨基酸位置”及其变体是指在Kabat等人，同上中用于抗体编辑的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少或额外的对应于可变结构域的FR或HVR的短缩或插入的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包括H 2的残基52之后的单个氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列的同源区与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定给定抗体残基的Kabat编号。
在涉及可变结构域中的残基(约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时通常使用Kabat编号系统(例如Kabat等，同上)。当涉及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如上述Kabat等人报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非文中另有说明，否则涉及抗体可变结构域中的残基号意味着Kabat编号系统的残基编号。除非另有说明，否则涉及抗体恒定结构域中的残基号意味着EU编号系统的残基编号(例如，参见美国临时申请号60/640,323，EU编号的图)。
如本文所用，“白介素-13(IL-13)”是指任何脊椎动物来源的任何天然IL-13，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)，除非另有说明。IL-13是由许多细胞类型(包括T辅助细胞2型(Th2)细胞)分泌的细胞因子。该术语包括“全长”、未加工的IL-13，以及在细胞中加工产生的任何形式的IL-13。示例性人IL-13的氨基酸序列可以在例如UniProtKB登录号P35225下找到。IL-13与IL-13受体结合，IL-13受体可包括与IL-13受体亚基α1(IL13RA1)或IL-13受体亚基α2(IL13RA2)复合的IL-4受体α(IL4Rα)。例如，IL-13可以结合IL-4受体α和IL-13受体亚基α1的复合体。
术语“抗IL-13抗体”、“结合IL-13的抗体”和“特异性结合IL-13的抗体”是指能够以足够的亲和力结合IL-13的抗体，从而该抗体可用作靶向IL-13的诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗IL-13抗体与不相关的非IL-13蛋白的结合程度小于该抗体与IL-13结合的约10％，例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量的。在某些实施方案中，结合IL-13的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM的解离常数(Kd)(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些实施方案中，抗IL-13抗体结合来自不同物种的IL-13中保守的IL-13表位。示例性抗IL-13抗体包括但不限于雷贝珠单抗(lebrikizumab)、228B/C-1、228A-4、227-26和227-43(参见例如美国专利号7,674,459；8,067,199；8,088,618；8,318,160和8,734,797，其通过引用整体并入本文)。
如本文所用的术语“血管内皮生长因子”或“VEGF”是指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子和相关的121、189和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung等人Science 246:1306,1989,和Houck等人Mol.Endocrin.5:1806,1991所述，以及天然存在的其等位基因和加工形式。术语“VEGF”还指来自非人物种如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时来自特定物种的VEGF由以下术语表示，如hVEGF表示人VEGF、mVEGF表示鼠VEGF等。术语“VEGF”也用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子中的氨基酸8至109或1至109的多肽的截短形式。在本申请中例如可以通过“VEGF109”、“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF165”鉴定涉及任何此类形式的VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置按照天然VEGF序列中所指明的编号。例如，截短的天然VEGF中的氨基酸位置17(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的位置17(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。本文所用的术语“VEGF变体”是指在天然VEGF序列中包括一个或多个氨基酸突变的VEGF多肽。任选地，一个或多个氨基酸突变包括氨基酸取代。为了简化本文描述的VEGF变体名称的目的，注意编号是指沿着推定的天然VEGF的氨基酸序列的氨基酸残基的位置(在Leung等人，同上，和Houck等人，同上中提供)。除非另有说明，本文所用的术语“VEGF”表示VEGF-A。
术语“抗VEGF抗体”、“结合VEGF的抗体”和“特异性结合VEGF的抗体”是指能够以足够的亲和力结合VEGF的抗体，使得该抗体可用作靶向VEGF的诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗VEGF抗体与不相关的、非VEGF蛋白结合的程度小于该抗体与VEGF结合的约10％，如，例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量的。在某些实施方案中，结合VEGF的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM的解离常数(Kd)(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些实施方案中，抗VEGF抗体结合来自不同物种的VEGF中保守的VEGF表位。
抗VEGF抗体的非限制性实例包括例如但不限于，抗VEGF抗体“贝伐单抗(BV或Bev)”，也称为“rhuMAb VEGF”或
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其是重组的人源化抗VEGF单克隆抗体，根据Presta等人Cancer Res.57:4593-4599(1997)生成。贝伐单抗包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的抗原结合互补决定区，所述鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1阻断人VEGF与其受体的结合。贝伐单抗氨基酸序列的约93％(包括框架区的大部分)源自人IgG1，约序列的7％源自鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量，并被糖基化。其它示例性的抗VEGF抗体包括例如美国专利号6,884,879和WO 2005/044853中描述的抗体。另外的实例包括抗VEGF抗体兰尼单抗(
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抗体或rhuFabV2)，其是人源化的、亲和力成熟的抗人VEGF Fab片段。兰尼单抗通过标准重组技术方法在大肠杆菌表达载体和细菌发酵中生成。兰尼单抗是非糖基化的，具有约48,000道尔顿的分子量。参见WO 1998/45331和US 2003/0190317。
如本文所用，“施用”是指向受试者给予一定剂量的化合物(例如本发明的抗体或编码本发明抗体的核酸)或组合物(例如，药物组合物，例如，包含本发明抗体的药物组合物)的方法。用于本文所述方法中的组合物可以例如肌内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内(intraprostatically)、玻璃体内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜内、皮下、结膜下、血管内、粘膜、心包内、脐带内、眼内、眶内、口腔、局部、经皮、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过靶细胞直接的局部灌注浴、通过导管、通过灌洗在霜剂或脂质组合物中施用。用于本文所述方法的组合物也可以全身或局部施用。施用方法可以根据各种因素(例如，所施用的化合物或组合物以及所治疗的病症、疾病或疾患的严重性)而不同。
“血管生成(angiogenesis)”是指从先前存在的血管形成新血管的过程。血管生成与血管发生(vasculogenesis)不同，血管发生是从中胚层细胞前体从头形成内皮细胞。可以通过本发明的组合物和方法治疗与病理性血管生成相关的疾患。这些疾病包括非肿瘤性疾患和细胞增殖性疾患。细胞增殖性疾患包括但不限于下述那些。非肿瘤性疾患包括但不限于眼部病症(非限制性眼部病症包括例如视网膜病变，包括增殖性糖尿病性视网膜病变、脉络膜新生血管形成(CNV)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病和其它缺血相关性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿(DME)、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼组织胞浆菌病、视网膜静脉阻塞(包括中心(CRVO)和分枝(BRVO)形式)、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、早产儿视网膜病变(ROP)、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、Coats病、诺里病、骨质疏松症-假性胶质瘤综合征(OPPG)、结膜下出血和高血压性视网膜病变)、不良或异常肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、牛皮癣斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生(包括格雷夫氏病)、角膜和其它组织移植、慢性炎症、肺部炎症、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压、恶性肺积液、脑水肿(例如，与急性中风/闭合性头部损伤/创伤相关)、滑膜炎症、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥厚骨形成、骨关节炎(OA)、难治性腹水、多囊卵巢疾病、子宫内膜异位症、流体疾病的第三间隔(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、筋膜室综合征、烧伤、肠病)、子宫肌瘤、早产、慢性炎症如IBD(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、肾同种异体移植排斥、炎性肠疾病、肾病综合征、不良或异常组织块生长(非癌症)、血友病关节、肥大性瘢痕、毛发生长抑制、Osler-Weber综合征、化脓性肉芽肿晶状体后纤维素增生、硬皮病、沙眼、血管性粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液(如与心包炎有关)和胸腔积液。
“抗血管生成剂”或“血管生成抑制剂”是指直接或间接地抑制血管生成、血管发生或不期望的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白、重组蛋白、抗体或其缀合物或融合蛋白。应当理解，抗血管生成剂包括结合并阻断血管生成因子或其受体的血管生成活性的那些试剂。例如，抗血管生成剂是如上定义的血管生成剂的抗体或其它拮抗剂，例如，VEGF-A或VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体、抗PDGFR抑制剂如GLEEVECTM(甲磺酸伊马替尼)。抗血管生成剂还包括天然血管生成抑制剂，例如血管抑素、内皮抑素等。参见例如Klagsbrun and D’Amore,Annu.Rev.Physiol.,53:217-39(1991)；Streit and Detmar,Oncogene,22:3172-3179(2003)(例如，表3列出在恶性黑素瘤中的抗血管生成治疗)；Ferrara&Alitalo,Nature Medicine 5(12):1359-1364(1999)；Tonini等人Oncogene,22:6549-6556(2003)(例如，表2列出已知的抗血管生成因子)；和SatoInt.J.Clin.Oncol.,8:200-206(2003)(例如，表1列出用于临床试验的抗血管生成剂)。
哮喘”是指可能涉及气道炎症、高反应性和梗阻的慢性肺部疾病。生理上，用乙酰甲胆碱或组胺扩张支气管后支气管气流的减少记录到的气道高反应性。用过敏原激惹支气管诱导了快速的早期阶段免疫球蛋白E(IgE)介导的支气管气流减少，随后在许多患者中通过晚期IgE介导的反应，伴随支气管气流减少4-8小时。早期反应由炎性物质(如组胺、PGD2、白三烯、类胰蛋白酶和血小板激活因子(PAF)等)的急性释放引起，而晚期反应由从头合成的促炎细胞因子(例如TNFα、IL-4、IL-13)和趋化因子(例如MCP-1和MIP-1α)引起(Busse等人Allergy:Principles and Practice,Ed.Middleston,1173,1998)。在慢性哮喘患者中，持续性肺部症状由Th2细胞升高的反应介导。Th2细胞因子被认为在该疾病中起重要作用(Larche等人J.Allergy Clin.Immunol.111:450,2003)，特别是在气道中由具有NK表型(NKT)的Th2细胞产生的IL-13和IL 4，如在啮齿类动物的哮喘模型中所指出的(Akbari等人Nature Med.,9:582,2003)。哮喘气道的大体病理显示肺过度充气、平滑肌肥大、网状板增厚、粘膜水肿、上皮细胞脱落、纤毛细胞破裂和粘液腺分泌过多。在显微镜下，哮喘的特征在于支气管组织、支气管分泌物和粘液中存在嗜酸粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞数量的增加。最初，通过激活的CD4+T淋巴细胞从血流募集白细胞到气道。激活的T淋巴细胞还引导从嗜酸粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞释放炎性介质。此外，Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-9和IL-13。IL-4与IL-13结合表示从IgM转换到IgE抗体。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状态。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。这样的癌症更具体的实例包括但不限于鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃癌(包括胃肠癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌、黑素瘤、浅表性扩散性黑色素瘤恶性黑色素瘤、恶性雀斑样黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、结节状黑色素瘤以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥散性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴母细胞性NHL；高级小的非裂解细胞性NHL；bulky disease NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；和Waldenstrom巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞性白血病；慢性成髓细胞性白血病和移植后淋巴细胞增生性疾患(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)和Meigs综合征。
术语“细胞增殖性疾患”和“增殖性疾患”是指与某种程度的异常细胞增殖相关的疾患。在一个实施方案中，细胞增殖性疾患是癌症。
术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性疾患”、“增殖性疾患”和“肿瘤”在本文中不是相互排斥的。
本文使用的“肿瘤”是指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性，以及所有癌前和癌细胞和组织。
“疾患”是从治疗中受益的任何病症，例如用治疗性抗体治疗。在一些实施方案中，疾患可以是IL-13介导的疾患或IgE介导的疾患。在其它实施方案中，疾患可以涉及异常或病理性血管生成(例如，过度、不适当或不受控制的血管生成)或血管通透性。疾患可以是慢性的或急性的。
“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺
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烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺(trimethylomelamine)；乙酰类(acetogenins)(特别是bullatacin和布拉它辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(dronabinol,
Figure BDA0003890634210000382
)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康
Figure BDA0003890634210000383
CPT-11(伊立替康，
Figure BDA0003890634210000384
)、乙酰喜树碱、scopolectin和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；足叶草毒素；足叶草酸；替尼泊苷；cryptophycins(特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；五加素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氯嗪、氯膦酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸氧氯化胺、美法仑、新恩比兴、phenesterine、泼尼氮芥、曲洛磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲如卡莫司汀、氯脲霉素、氟托西汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷尼地坦；抗生素如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素，特别是加利车霉素γ1I和加利车霉素ω1I(参见例如Nicolaou等人Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；CDP323，口服α-4整联蛋白抑制剂；dynemicin，包括dynemicin A；esperamicin；以及新抑癌蛋白发色团和相关的色素蛋白烯二烯抗生素发色团)、aclacinomysins、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博莱霉素、cactinomycin、carabicin、caminomycin、carzinophilin、chromomycinis、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括
Figure BDA0003890634210000391
吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射液
Figure BDA0003890634210000392
脂质体多柔比星TLC D-99
Figure BDA0003890634210000393
聚乙二醇化脂质体多柔比星
Figure BDA0003890634210000394
和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类如丝裂霉素C、霉酚酸、诺卡霉素、奥利菌素、peplomycin、porfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢类如甲氨蝶呤、吉西他滨
Figure BDA0003890634210000395
替加氟
Figure BDA0003890634210000396
卡培他滨
Figure BDA0003890634210000397
埃博霉素和5-氟尿嘧啶(5-FU)；康普瑞汀；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶呤素、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如阿米沙星、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺沙星、氟尿苷；雄激素类如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、睾丸醇、美雄烷、睾内酯；抗-肾上腺类如氨基丁二酰亚胺、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如克罗来酸；醋葡醛内酯；醒磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；bisantrene；edatraxate；defofamine；秋水仙胺；亚丝醌；elfomithine；依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登素生物碱如美登素和安曲霉素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidamnol；nitraerine；喷司他丁；phenamet；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-ethylhydrazide；甲基苄肼；
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多糖复合物(JHS NaturalProducts，Eugene，Oreg.)；雷佐生；根霉素；sizofuran；螺环锗；细交链孢菌酮酸；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和anguidine)；乌拉坦；长春地辛；(
Figure BDA0003890634210000401
Figure BDA0003890634210000402
)；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；塞替派；紫杉烷，例如紫杉醇(
Figure BDA0003890634210000403
Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(ABRAXANETM)和多烯紫杉醇(
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Rhome-Poulene Rorer,Antony,France)；chloranbucil；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂剂例如顺铂、奥沙利铂(例如
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)和卡铂；长春花，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括长春花碱
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长春新碱
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长春地辛
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和长春瑞滨
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依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；亚叶酸；novantrone；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视色素，如视黄酸，包括拜沙罗汀
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二膦酸盐如氯膦酸盐(例如
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或
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)、依替膦酸盐
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NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐
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阿仑膦酸盐(
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帕米膦酸盐
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替鲁膦酸盐
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或利塞膦酸盐
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曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制参与异常细胞增殖的信号传导通路中的基因表达的那些，如，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)(例如，厄洛替尼(TARCEVATM))；和降低细胞增殖的VEGF-A；疫苗如
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疫苗和基因治疗疫苗，如
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疫苗、
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疫苗和
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疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如
Figure BDA00038906342100004023
)；rmRH(例如，
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)；BAY439006(索拉非尼；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼，
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Pfizer)；哌立福辛，COX-2抑制剂(例如塞来昔布或依托昔康)、蛋白酶抑制剂(例如PS341)；硼替佐米
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CCI-779；替吡法尼(R11577)；索拉非尼，ABT510；Bcl-2抑制剂，如奥美灵钠
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匹杉琼；EGFR抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂如雷帕霉素(西罗莫司，
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)；法尼基转移酶抑制剂，如拉那非尼(SCH6636,SARASARTM)；和任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合，例如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合治疗的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)组合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)以及上述任何一种物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合。
本文定义的化疗剂包括用于调节、降低、阻断或抑制可促进癌症生长的激素作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”。它们可以是激素本身，包括但不限于：具有混合激动剂/拮抗剂特征的抗雌激素，包括他莫昔芬
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4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬
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异昔芬、屈洛昔芬、雷洛昔芬
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三昔芬、克昔西芬和选择性雌激素受体调节剂(SERM)如SERM3；无激动剂性质的纯抗雌激素试剂，如氟维司群
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和EM800(此类试剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、增加ER周转和/或抑制ER水平)；芳香酶抑制剂，包括甾体芳香酶抑制剂如福美司坦和依西美坦
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和非甾体芳香酶抑制剂如阿那曲唑
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来曲唑
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和氨鲁米特，和其它芳香酶抑制剂包括伏氯唑
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醋酸甲地孕酮
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法多唑和4(5)-咪唑；促黄体激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(
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和
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)、戈舍瑞林、布舍瑞林和曲普瑞林；性类固醇，包括孕酮如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮，雌激素如己烯雌酚和普立马，以及雄激素/类视色素，如氟甲睾酮、所有的transretionic acid和芬维A胺；奥那司酮；抗孕酮；雌激素受体下调剂(ERD)；抗雄激素如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；和任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合。
本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核分解酶；抗生素；毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；和本文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
试剂(例如药物制剂)的“有效量”是指在剂量和持续必要的一段时间内实现所期望的治疗或预防结果所需的有效的量。
在本文中使用时，“生长抑制剂”是指在体外或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期细胞百分比的试剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进程(在S期以外的地方)的试剂，如诱导G1阻滞和M期阻滞的试剂。典型的M期阻断剂包括长春花(长春新碱和长春花碱)、紫杉烷和拓扑异构酶II抑制剂，如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。那些阻滞G1的试剂也会迫使S期阻滞，例如DNA烷化剂如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。更多的信息可以在Mendelsohn等人编辑,The Molecular Basis of Cancer,第1章,题目“Cell cycleregulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”，Murakami等人(W.B.Saunders,Philadelphia,1995),例如，第13页。紫杉烷(紫杉醇和多烯紫杉醇)都是源自紫杉树的抗癌药物。源自欧洲紫杉的多烯紫杉醇(
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Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(
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Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多烯紫杉醇促进从微管蛋白二聚体组装成微管，并通过防止解聚来稳定微管，这导致细胞中有丝分裂的抑制。
本文所用的术语“IL-13介导的疾患”是指由IL-13介导的或与IL-13相关的任何疾患或病症。在一些实施方案中，IL-13介导的疾患与过量的IL-13水平或活性相关，其中由于体内局部和/或全身的IL-13水平或活性而导致非典型症状。IL-13介导的疾患包括例如过敏、哮喘(包括过敏性哮喘、特应性哮喘、严重哮喘和非过敏性(内源性)哮喘)、自身免疫性疾病(例如牛皮癣、类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎、炎性肠疾病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)，或其它炎性疾病。例如，IL-13介导的疾患包括：过敏性鼻炎(例如季节性过敏性鼻炎)、特应性皮炎、过敏性结膜炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏、食物超敏感、乳糜泻、免疫介导的皮肤病(包括例如大疱性皮肤病、多形性红斑、接触性皮炎)、纤维化、肝纤维化、心内膜纤维化、慢性支气管炎、支气管扩张、特发性间质性肺炎、杯状细胞化生、肺炎性疾患、炎性和纤维化肺疾病(包括例如囊性纤维化、特发性肺纤维化和慢性阻塞性肺病(COPD))、谷蛋白敏感性肠病、惠普耳氏病、肺免疫性疾病(包括例如嗜酸粒细胞性肺炎(例如慢性嗜酸粒细胞性肺炎)、特发性肺纤维化、过敏性支气管肺曲霉病和超敏性肺炎)、Churg-Strauss综合征(结节性动脉周围炎加特应性反应)、嗜酸粒细胞性肌痛综合征、高嗜酸粒细胞综合征、水肿反应(包括例如发作性血管性水肿、嗜酸粒细胞性食管炎、嗜酸粒细胞性胃炎、嗜酸粒细胞性肠胃炎、嗜酸粒细胞性肠炎和嗜酸粒细胞性结肠炎)、鼻微息肉病和息肉病、RSV感染、葡萄膜炎、硬皮病、骨质疏松症和恶性肿瘤，包括与IL-13异常表达相关的癌症或肿瘤(包括霍奇金淋巴瘤)。
本文所用的术语“IgE介导的疾患”是指由IgE介导的或与IgE相关的任何疾患或病症。示例性的IgE介导的疾患包括支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、荨麻疹、过敏反应或特应性皮炎。
“分离的核酸”是指已经从其天然环境的成分中分离的核酸分子。分离的核酸包括细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置上。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列包括，例如启动子，任选操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
术语“表达的水平”或“表达水平”可互换使用，通常是指生物样品中多核苷酸或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”通常是指将编码基因的信息转化为在细胞中存在和操作的结构的过程。因此，根据本发明，基因的“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成蛋白质、或甚至蛋白质的翻译后修饰。转录的多核苷酸、翻译的蛋白质或翻译后修饰的蛋白质的片段也应被视为表达，无论它们是源自通过选择性剪接产生的转录本还是降解的转录本、还是源自蛋白质的翻译后加工，例如，通过蛋白质水解。“表达基因”包括转录成作为mRNA的多核苷酸、然后翻译成蛋白质的那些基因，以及转录成RNA但不翻译成蛋白质(例如转运RNA和核糖体RNA)的那些基因。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指其中引入了外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和从其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代的核酸含量可能与亲本细胞不完全相同，也可能含有突变。具有与在原始转化的细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变体后代也包括在本文中。
当核酸被置于与其它核酸序列的功能关系中时，该核酸被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA是可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列是可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位在有助于翻译的位置，则其可操作地连接编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的且在读取相。然而，增强子不一定是连续的。通过在方便的限制性位点连接来实现连接。如果不存在这样的位点，则按照常规实践使用合成的寡核苷酸适配体或接头。
相对于本文鉴定的多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为，在比对序列后，如果需要，引入空位以实现最大序列同一性百分比，候选序列中与比较多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术内的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.撰写，源代码已经与用户文档在美国版权局华盛顿特区20559号的美国版权局提交，并在美国版权注册号TXU510087下注册。ALIGN-2程序可通过加利福尼亚州南旧金山的Genentech公司公开获得。ALIGN-2程序应汇编用在UNIX操作系统上，优选数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设置、不变。
使用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A至、与或对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者可替代地表达为给定氨基酸序列A至、与或对给定氨基酸序列B具有或包含某一氨基酸序列同一性％)如下计算：
100乘以X/Y的分数
其中X是通过序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中打分为相同匹配的氨基酸残基数，其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A至B的氨基酸序列同一性％不等于B至A的氨基酸序列同一性％。除非另有说明，否则本文使用的所有氨基酸序列同一性％值使用ALIGN-2计算机程序如前一段所述获得。
本文所述的氨基酸序列是连续的氨基酸序列，除非另有说明。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这样的治疗产品的适应症、用途、剂量、施用、组合治疗、禁忌症和/或警告的信息。
术语“药物组合物”是指制剂，其以这样的形式使得其中包含的活性成分的生物活性有效，并且不含有对于施用制剂的受试者有不可接受的毒性的其它成分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的成分，其对受试者是无毒的。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本申请中使用的术语“前药”是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其与母体药物相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小，并且能够被酶促激活或转化为更有活性的母体形式。参见例如Wilman,“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”Biochemical SocietyTransactions,14,第375-382页,615th Meeting Belfast(1986)和Stella等人“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,”Directed Drug Delivery,Borchardt等人(ed.),第247-267页,Humana Press(1985)。本发明的前药包括但不限于含磷酸盐的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化前药、含β-内酰胺的前药，任选取代的含苯氧基乙酰胺的前药或任选取代的含苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶核苷前药，其可以转化为更有活性的细胞毒性游离(free)药物。可以衍生成用于本发明的前药形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于上述那些化疗剂。
“降低或抑制”是指引起总体下降优选20％或以上、更优选50％或以上、最优选75％、85％、90％、95％或以上的能力。降低或抑制可以指治疗疾患的症状、转移的存在或大小、原发肿瘤大小的降低或抑制。
“患者”、“受试者”或“个体”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于农场动物(如牛、羊)、运动动物、宠物(如猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物如猴)、以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。
术语“治疗有效量”是指治疗受试者中疾病或疾患的抗体或抗体片段的量。在IL-13介导的疾患的情况下，抗体或抗体片段(例如抗IL-13抗体)的治疗有效量可以减轻或治疗疾病、或预防、降低、减轻或治疗与该疾病相关的症状。在与病理性血管生成相关的疾患的情况下，抗体或抗体片段(例如抗VEGF抗体)的治疗有效量可以减轻或治疗疾病、或预防、降低、减轻或治疗与该疾病相关的症状。在增殖性疾病(例如实体瘤)的情况下，抗体或抗体片段的治疗有效量可以降低癌细胞的数量；降低原发肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减缓优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与疾患相关的一种或多种症状。在抗体或抗体片段可以预防现有癌细胞的生长和/或杀伤现有癌细胞的程度上，它可能是细胞抑制和/或细胞毒性的。例如，可通过评估生存期、疾病进展时间(TTP)、无疾病生存期(DFS)、无进展生存期(PFS)、反应率(RR)、反应持续时间和/或生活质量来测量癌症治疗的体内效率。
如本文所用，“治疗”(及其语法变化如“治疗”或“治疗”)是指试图改变被治疗个体的自然过程的临床干预，并且可以预防地进行或在临床病理过程期间进行。治疗所期望的效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接的病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、减轻或缓解疾病状态、缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。
本文所用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一个类型是“质粒”，其是指可以连接另外的DNA区段的环形双链DNA环。载体的另一个类型是噬菌体载体。载体的另一个类型是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“重组载体”或“表达载体”)。通常，用于重组DNA技术的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用。
II.方法和组合物
一方面，本发明部分基于鉴定包含结合多肽的细菌的新方法，例如筛选表达与标记抗原结合的抗体的细菌的方法。本发明的方法可用于例如筛选抗体，例如筛选具有改善的表达、稳定性和/或亲和力的抗体。另一方面，本发明部分基于结合IL-13或VEGF的新抗体。本发明的抗IL-13抗体可用于例如用于诊断和/或治疗IL-13介导的疾患。本文所述的抗VEGF抗体可用于例如诊断和/或治疗与病理性血管生成相关的疾患(例如癌症)和/或抑制血管通透性。
A.本发明的示例性方法
本发明提供鉴定包含特异性结合靶分子的结合多肽的细菌的方法。本发明还提供鉴定具有改善的结合多肽表达的细菌的方法。本发明还提供鉴定具有改善的表达和/或稳定性的结合多肽的方法。
例如，在一些情况下，本发明提供了一种用于鉴定包含特异性结合靶分子的结合多肽的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供对具有大于约1kDa(例如约1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa、16kDa、17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、25kDa、30kDa、40kDa、50kDa或更高)的分子量的分子具有可通透的外膜的细菌，所述细菌表达编码候选结合多肽的核酸，其中所述候选结合多肽存在于细菌的周质中；(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和(c)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为包含结合多肽。在一些实施方案中，在步骤(c)之后细菌保持存活。在一些实施方案中，使用共价连接的标记来标记靶分子。在其它实施方案中，使用非共价连接的标记来标记靶分子。
在另一个实例中，在一些情况下，本发明提供了一种用于鉴定具有特异性结合靶分子的结合多肽的改善的表达的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供对具有大于约1kDa(例如约1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa、16kDa、17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、25kDa、30kDa、40kDa、50kDa或更高)的分子量的分子具有可通透的外膜的细菌，所述细菌表达编码结合多肽的核酸，其中所述结合多肽存在于细菌的周质中；(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和(c)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为具有改善的结合多肽的表达。在一些实施方案中，在步骤(c)之后细菌保持存活。在一些实施方案中，使用共价连接的标记来标记靶分子。在其它实施方案中，使用非共价连接的标记来标记靶分子。
在任何前述方法的一些情况中，该方法还包括至少一次重复该方法的步骤。例如，该方法还可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次重复该方法的步骤。在一些实施方案中，重复该方法的至少一个步骤。在一些情况下，可至少一次重复(例如，重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次)该方法的所有步骤。在一些情况下，可至少一次依次重复(例如，重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次)该方法的所有步骤。在一些情况下，2次重复该方法的步骤。在一些情况下，3次重复该方法的步骤。在一些情况下，重复以下步骤：(a)提供对具有大于约1kDa(例如约1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa、16kDa、17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、25kDa、30kDa、40kDa、50kDa或更高)的分子量的分子具有可通透的外膜的细菌，所述细菌表达编码候选结合多肽的核酸，其中所述候选结合多肽存在于细菌的周质中；(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和(c)通过标记的靶分子在周质中的存在将细菌鉴定为包含结合多肽。在一些情况下，方法还包括在重复该方法的步骤之前将细菌在生长培养基中孵育。细菌生长培养基的实例包括CRAP、SOC、Luria Broth(LB)或本领域已知的任何其它细菌生长培养基。
在任何前述方法的某些情况下，靶分子具有小于约500kDa(例如，小于约500kDa、约480kDa、约460kDa、约440kDa、约420kDa、约440、约420kDa、约400kDa、约380kDa、约360kDa、约340kDa、约320kDa、约300kDa、约280kDa、约260kDa、约250kDa、约220kDa、约200kDa、约180kDa、约160kDa、约150kDa、约130kDa、约120kDa、约110kDa、约100kDa、约80kDa、约60kDa、约40kDa或约20kDa)的分子量。示例性的靶分子具有约1kDa至约500kDa、约1kDa至约400kDa、约1kDa至约300kDa、约1kDa至约250kDa、约1kDa至约230kDa、约1kDa至约220kDa、约1kDa至约200kDa、约1kDa至约180kDa、约1kDa至约160kDa、约1kDa至约140kDa、约1kDa至约120kDa、约1kDa至约100kDa、约1kDa至约80kDa、约1kDa至约60kDa、约1kDa至约40kDa、约1kDa至约20kDa、约1kDa至约10kDa、约8kDa至约500kDa、约8kDa至约400kDa、约8kDa至约300kDa、约8kDa至约250kDa、约8kDa至约220kDa、约8kDa至约200kDa、约8kDa至约180kDa、约8kDa至约160kDa、约8kDa至约140kDa、约8kDa至约120kDa、约8kDa至约100kDa、约8kDa至约80kDa、约8kDa至约60kDa、约8kDa至约40kDa、或约8kDa至约20kDa的范围内的分子量。
在任何前述方法的某些情况下，靶分子具有约10kDa或更高的分子量。例如，在一些实施方案中，靶分子约10kDa至约700kDa、约10kDa至约600kDa、约10kDa至约500kDa、约10kDa至约480kDa、约10kDa至约470kDa、约10kDa至约460kDa、约10kDa至约450kDa、约10kDa至约440kDa、约10kDa至约430kDa、约10kDa至约420kDa、约10kDa至约410kDa、约10kDa至约400kDa、约10kDa至约390kDa、约10kDa至约380kDa、约10kDa至约370kDa、约10kDa至约360kDa、约10kDa至约350kDa、约10kDa至约340kDa、约10kDa至约330kDa、约10kDa至约320kDa、约10kDa至约310kDa、约10kDa至约300kDa、约10kDa至约290kDa、约10kDa至约280kDa、约10kDa至约270kDa、约10kDa至约260kDa、约10kDa至约250kDa、约10kDa至约240kDa、约10kDa至约230kDa、约10kDa至约220kDa、约10kDa至约210kDa、约10kDa至约200kDa、约10kDa至约190kDa、约10kDa至约180kDa、约10kDa至约170kDa、约10kDa至约160kDa、约10kDa至约150kDa、约10kDa至约140kDa、约10kDa至约130kDa、约10kDa至约120kDa、约10kDa至约110kDa、约10kDa至约100kDa、约10kDa至约90kDa、约10kDa至约80kDa、约10kDa至约70kDa、约10kDa至约60kDa、约10kDa至约50kDa、约10kDa至约40kDa、约10kDa至约30kDa、约10kDa至约20kDa、或约10kDa至约15kDa的范围内的分子量。
在一些情况下，本发明提供了鉴定包含特异性结合靶分子的结合多肽的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含突变的细菌，所述突变允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中，所述细菌表达编码候选结合多肽的核酸，其中候选结合多肽存在于细菌周质中；(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和(c)通过标记的靶分子在周质中的存在将细菌鉴定为包含结合多肽。在一些实施方案中，在步骤(c)之后细菌保持存活。在一些情况下，该方法还包括使细菌在步骤(b)之前经历透化细菌外膜的条件。在一些情况下，该方法还包括使细菌与可检测地标记的靶分子接触后，重新密封细菌外膜。
在其它情况下，本发明提供了鉴定具有特异性结合靶分子的结合多肽的改善的表达的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含突变的细菌，所述突变允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中，所述细菌表达编码结合多肽的核酸，其中结合多肽存在于细菌周质中；(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和(c)通过标记的靶分子在周质中的存在将细菌鉴定为具有结合多肽的改善的表达。在一些实施方案中，在步骤(c)之后细菌保持存活。在一些情况下，该方法还包括使细菌在步骤(b)之前经历透化细菌外膜的条件。在一些情况下，该方法还包括使细菌与可检测地标记的靶分子接触后，重新密封细菌外膜。
在任何前述方法的一些情况中，该方法还包括至少一次重复该方法的步骤。例如，该方法还可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次重复该方法的步骤。在一些实施方案中，重复该方法的至少一个步骤。在一些情况下，可至少一次重复(例如，重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次)该方法的所有步骤。在一些情况下，可至少一次依次重复(例如，重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次)该方法的所有步骤。在一些情况下，2次重复该方法的步骤。在一些情况下，3次重复该方法的步骤。在一些情况下，重复以下步骤：(a)提供包含突变的细菌，所述突变允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中，所述细菌表达编码候选结合多肽的核酸，其中候选结合多肽存在于细菌周质中；(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和(c)通过标记的靶分子在周质中的存在将细菌鉴定为包含结合多肽。在一些情况下，方法还包括在重复所述方法的步骤之前将细菌孵育在生长培养基中。
在其它情况下，本发明提供了鉴定包含特异性结合靶分子的结合多肽的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供表达编码候选结合多肽的核酸的细菌，其中候选结合多肽存在于细菌周质中；(b)使细菌经历透化细菌外膜的条件；(c)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；(d)在步骤(c)之后重新密封细菌外膜；和(e)通过标记的靶分子在周质中的存在将细菌鉴定为包含结合多肽。在一些情况下，在该方法的步骤(e)之后细菌保持存活。
在其它情况中，本发明提供了鉴定具有特异性结合靶分子的结合多肽的改善的表达的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供表达编码结合多肽的核酸的细菌，其中结合多肽存在于细菌周质中；(b)使细菌经历透化细菌外膜的条件；(c)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；(d)在步骤(c)之后重新密封细菌外膜；和(e)通过标记的靶分子在周质中的存在将细菌鉴定为具有结合多肽的改善的表达。在一些情况下，在该方法的步骤(e)之后细菌保持存活。
在一些情况中，该方法还包括至少一次重复该方法的步骤。例如，该方法还可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次重复该方法的步骤。在一些实施方案中，重复该方法的至少一个步骤。在一些情况下，可至少一次重复(例如，重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次)该方法的所有步骤。在一些情况下，可至少一次依次重复(例如，重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次)该方法的所有步骤。在一些情况下，2次重复该方法的步骤。在一些情况下，3次重复该方法的步骤。在一些情况下，重复以下步骤：(a)提供表达编码候选结合多肽的核酸的细菌，其中候选结合多肽存在于细菌周质中；(b)使细菌经历透化细菌外膜的条件；(c)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；(d)在步骤(c)之后重新密封细菌外膜；和(e)通过标记的靶分子在周质中的存在将细菌鉴定为包含结合多肽。
在任何前述方法中，细菌可以将结合多肽的表达改善至少约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约100倍或更多。在一些情况下，细菌可以具有1至10倍的改善的表达、1至7倍的改善的表达、1至6倍的改善的表达、1至5倍的改善的表达、1至4倍的改善的表达、1至3倍的改善的表达、2至10倍的改善的表达、2至8倍的改善的表达或2至6倍的改善的表达。在一些实施方案中，改善是相对于野生型细菌中结合多肽的表达水平。在其它实施方案中，改善是相对于突变细菌中结合多肽的表达水平。
在任何前述方法中，在进行该方法的步骤之后，细菌可以保持存活。在一些情况下，在进行该方法的步骤之后细菌可以经历至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次或更多次细胞分裂。在一些情况下，使用存活力染色例如
Figure BDA0003890634210000531
Green、碘化丙啶或本领域已知的其它存活力染色来测量存活力。在一些情况下，使用活/死染色试剂盒(如Life Technologies的LIVE/
Figure BDA0003890634210000541
细胞存活力测定法)来测量存活力。在一些情况下，通过在细菌培养基平板上铺板细菌来测量存活力。在一些情况下，在细菌培养基平板上铺板后，存活的细胞将产生菌落。
在任何前述方法中，细菌可以包含允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中的突变。可允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中的突变(在一些情况下其也称为“周质渗透的”或“lky”突变体)描述于，例如Hancock,Ann.Rev.Microbiol.38:237-264,1984中，包括但不限于可能影响外膜中脂多糖(LPS)组成的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的深度粗糙(deep-rough)(庚糖缺陷)突变体(例如，rfaD、rfaE、rfaH和rfaRd)、env突变体(例如envA、envB、envM-T)和大肠杆菌中的大肠杆菌素耐受性突变体(例如tolC和tolA、B)。在一些情况下，突变是在编码外膜蛋白和/或影响脂多糖(LPS)组成的蛋白的基因中。在一些情况下，突变是在编码外膜蛋白的基因中，例如在编码主要外膜脂蛋白Lpp(Lpp)、孔蛋白或TolC的基因中。在一些情况下，外膜蛋白是Lpp。可以使用编码Lpp的基因中的任何合适的突变。示例性的lpp突变包括但不限于lpp-1；lpp-21；lpp-3；lpp5508；lpp-6；lpp::Tn5KAN-2；lppD70E,G或S；lppK75S或T；lppK78R；lppR77D或L；lppS22D；lppY76C,D,E,G,N,P或S；lppY76F,H,I或L；Δlpp,Δlpp-254和Δlpp-752::kan,或本文所述的那些突变。这样的lpp突变可以从例如，如CGSC(The Coli Genetic Stock Center)的库获得。在其它情况下，编码Lpp的基因中的突变可以使用标准分子遗传学方法制备。在一些实施方案中，突变在编码影响LPS组成的蛋白的基因中，例如Env蛋白(例如EnvA、EnvB和EnvM)、RfaD、RfaE、RfaH、RfaRd、TolA、TolB和TolD。
在任何前述方法中，该方法可以包括使细菌经历透化外膜的条件。在一些情况下，通透外膜的条件包括用透化剂处理细菌。在一些情况下，透化剂选自螯合剂(包括二价阳离子螯合剂(例如EDTA、BAPTA和EGTA))、NaCl、蔗糖、抗生素(例如氨基糖苷类(例如链霉素和庆大霉素))、多粘菌素B、脱酰基多粘菌素、八肽霉素和苄基青霉素)、洗涤剂、溶菌酶、Tris、Tris-EDTA、抗坏血酸盐、聚赖氨酸、苯扎氯铵，鱼精蛋白、杀菌/通透性增加蛋白(BPI)、血清和/或补体、Ca2+或其组合。在一些实施方案中，透化剂包括螯合剂。在一些情况下，螯合剂是二价阳离子螯合剂(包括例如EDTA、BAPTA和EGTA)。在一些实施方案中，二价阳离子螯合剂是EDTA。在一些情况下，螯合剂(例如EDTA)的浓度为约1μM至约15mM、例如约1μM、10μM、100μM、500μM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM或15mM。在一些情况下，EDTA的浓度为5mM。在一些情况下，透化剂还包括缓冲剂，例如磷酸缓冲盐水(PBS)。在一些情况下，透化剂还包括牛血清白蛋白。在一些情况下，BSA以1％(w/v)至约10％(w/v)存在，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。
在任何前述方法中，该方法可以包括重新密封细菌外膜。外膜可以、但不必被完全重新密封。局部重新密封至允许细胞存活力的水平对于本发明的方法来说是足够的。在一些情况下，与参照或野生型细菌外膜(例如，大肠杆菌62A7细胞的外膜)相比，如果膜通透性屏障恢复到50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％之内，则外膜被重新密封。在一些情况下，基本上重新密封细菌外膜包括使细菌与Mg2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Na+、K+等的盐接触，例如，前述阳离子与阴离子如SO4 2-、F-、Cl2 -、SO3 2-、PO4 3-等的盐。在一些情况下，基本上重新密封细菌外膜包括使细菌与MgCl2接触。在一些实施方案中，MgCl2的浓度为约1mM至约50mM、例如约1mM、2mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。
在任何前述方法中，将细菌与可检测地标记的靶分子接触的步骤还可包括使细菌与核酸染料接触。在一些情况下，核酸染料选自Hoechst 33342(又称Hoechst染色)、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、
Figure BDA0003890634210000561
9、
Figure BDA0003890634210000562
11、
Figure BDA0003890634210000563
12、
Figure BDA0003890634210000564
13、
Figure BDA0003890634210000565
14、
Figure BDA0003890634210000566
15、
Figure BDA0003890634210000567
16、
Figure BDA0003890634210000568
17、
Figure BDA0003890634210000569
41、
Figure BDA00038906342100005610
43、
Figure BDA00038906342100005611
42、
Figure BDA00038906342100005612
44、
Figure BDA00038906342100005613
40、
Figure BDA00038906342100005614
45、
Figure BDA00038906342100005615
59、
Figure BDA00038906342100005616
60、
Figure BDA00038906342100005617
61、
Figure BDA00038906342100005618
62和
Figure BDA00038906342100005619
63、
Figure BDA00038906342100005620
64。在一些实施方案中，使用具有至少约60％(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高)效率的染色细菌细胞的核酸染料。在一些实施方案中，使用具有至少约85％效率的染色细菌细胞的核酸染料。
在任何前述方法中，可检测地标记的靶分子可以包含荧光标记(也称为荧光团)。在一些实施方案中，可以使用与流式细胞术(例如，FACSTM)检测相容的任何荧光标记。例如，可以使用具有允许通过流式细胞术(例如，FACSTM)分选的量子产量的任何荧光标记。在一些情况下，荧光标记包括荧光染料或荧光多肽。各种荧光标记可从各种分销商商购获得，例如Life Technologies。可以基于其激发和发射谱来选择荧光标记。
可以使用的荧光染料的非限制性实例包括但不限于
Figure BDA00038906342100005621
染料(例如,ALEXA
Figure BDA00038906342100005622
488、ALEXA
Figure BDA00038906342100005623
514、ALEXA
Figure BDA00038906342100005624
532、ALEXA 
Figure BDA00038906342100005625
555、ALEXA
Figure BDA00038906342100005626
546、ALEXA 
Figure BDA00038906342100005627
568、ALEXA 
Figure BDA00038906342100005628
594、ALEXA 
Figure BDA00038906342100005629
610、ALEXA
Figure BDA00038906342100005630
633、ALEXA 
Figure BDA00038906342100005631
647、ALEXA 
Figure BDA00038906342100005632
660、ALEXA
Figure BDA00038906342100005633
680、ALEXA
Figure BDA00038906342100005634
700、ALEXA 
Figure BDA00038906342100005635
750和ALEXA
Figure BDA00038906342100005636
790)、
Figure BDA00038906342100005637
染料(例如，
Figure BDA00038906342100005638
350、
Figure BDA00038906342100005639
405、
Figure BDA00038906342100005640
488、
Figure BDA00038906342100005641
550、
Figure BDA00038906342100005642
594、
Figure BDA00038906342100005643
633、
Figure BDA00038906342100005644
650、
Figure BDA00038906342100005645
680、
Figure BDA00038906342100005646
755、和
Figure BDA00038906342100005647
800)、花青染料(例如，
Figure BDA00038906342100005648
2、
Figure BDA00038906342100005649
3和
Figure BDA00038906342100005650
5)、BODIPY、TEXAS
Figure BDA00038906342100005651
荧光素及其衍生物(例如，异硫氰酸荧光素、FITC)和罗丹明及其衍生物(例如四甲基罗丹明、TRITC)。在一些情况下，荧光染料选自：ALEXA
Figure BDA00038906342100005652
488、ALEXA
Figure BDA00038906342100005653
647和
Figure BDA00038906342100005654
649。
可以使用的示例性荧光多肽包括但不限于蓝/UV荧光蛋白(包括TagBFP、mTagBFP2、天青石(Azurite)、EBFP2、mKalama1、天狼星(Sirius)、蓝宝石(Sapphire)和T-Sapphire)、青色荧光蛋白(例如ECFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、单体Midoriishi-Cyan、TagCFP和mTFP1)、绿色荧光蛋白(例如GFP、EGFP、Emerald、超折叠GFP、单体Azami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover和mNeonGreen)、黄色荧光蛋白(例如，EYFP、Citrine、Venus、SYFP2和TagYFP)、橙色荧光蛋白(例如单体Kusabira-Orange、mKOk、mKO2、mOrange和mOrange2)、红色荧光蛋白(例如，mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、RFP、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby和mRuby2)、远红色荧光蛋白(例如mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP)、可光激活荧光蛋白(例如，PA-GFP、PAmCherry1和PATagRFP)和可光转换荧光蛋白(例如，Kaede、KikGR1、PS-CFP2、mEos2、mEos3.2和pSmOrange)。
在一些实施方案中，在约4℃至约25℃(例如约4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃或25℃)的温度下使细菌与可检测地标记的靶分子接触。在一些实施方案中，温度为约4℃。
任何前述方法可以进一步包括至少一个洗涤步骤(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个洗涤步骤)，其包括将细菌重悬在洗涤缓冲液中。在一些情况下，在将细菌与可检测地标记的靶分子接触之后进行至少一个洗涤步骤。在一些情况下，洗涤缓冲液包括缓冲剂，例如PBS。在一些情况下，洗涤缓冲液包含磷酸缓冲盐水。在一些情况下，洗涤缓冲液还包含MgCl2。在一些情况下，洗涤缓冲液包含1mM至50mM之间的MgCl2(例如，1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、30mM、40mM或50mM的MgCl2。
在任何前述方法中，选择步骤还可以包括流式细胞术(例如，FACSTM)。在一些情况下，流式细胞术包括单细胞分选和基于可检测地标记的靶分子信号的分选。在一些情况下，流式细胞术包括基于核酸染料信号的分类。在一些情况下，流式细胞术依次包括(i)基于核酸染料信号的分选；(ii)单细胞分选；和(iii)基于可检测地标记的靶分子信号的分选。在一些实施方案中，细胞的浓度为约1×105至约1×1012细胞/ml，例如约1×105细胞/ml、约1×106细胞/ml、约1×107细胞/ml、约1×108细胞/ml、约1×109细胞/ml、约1×1010细胞/ml、约1×1011细胞/ml或约1×1012细胞/ml。
在任何前述方法中，细菌可以是包括内膜、周质和外膜的细菌。在一些实施方案中，细菌是革兰氏阴性细菌。例如，在一些情况下，细菌是大肠杆菌。可以使用大肠杆菌的任何合适的菌株或遗传背景。常用的大肠杆菌菌株和遗传背景在本领域中是众所周知的。示例性的大肠杆菌菌株包括但不限于实验室菌株如K-12及其亚株(例如Clifton野生型、W3110、DH5αE等)和大肠杆菌B及其亚株(例如，BL21、BL21(DE3)等)。在一些实施方案中，大肠杆菌源自菌株62A7。在一些实施方案中，大肠杆菌源自菌株33D3。在一些实施方案中，大肠杆菌源自菌株66C4。
在任何前述方法中，结合多肽可以以可溶形式在细菌的周质中表达。
在任何前述方法中，结合多肽可以作为融合蛋白在细菌的周质中表达。在一些情况下，结合多肽作为与定位于内膜外表面的蛋白或其片段的融合蛋白被表达。应当理解，可以将另外的多肽(例如接头多肽)序列加入到融合蛋白。这种融合蛋白可以用于将结合多肽锚定在内膜的外表面。在一些实施方案中，前导肽和内膜脂蛋白(例如，NlpA)的前6个氨基酸可以包含在融合蛋白中。这样的融合蛋白可以作为结合多肽至内膜外表面的N末端锚。在一些情况下，融合蛋白包括选自Aas、AcrE(EnvC)、AmiC、AmiD、ArtM、AraH、ArtQ、BtuC、CheY、CysT、CysW、DppB、DppC、DsbB、DsbD、ExbD、ExbB、FecC、FecD、FecR、FepD、FhuB、GlnP、HisM、HisQ、LacY、脂蛋白、LivH、LivM、LivA、LivE、MalF、MalG、MalC、MalD、MglC、ModB、NikB、NikC、NosY、OppB、噬菌体编码的celB、PhnM、PotB、PotC、PotH、PotI、ProW、PstA、PstC、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的支链淀粉酶、RbsC、SecY、TatC、TraB、TolC、TonB、UgpA或UgpE的内膜蛋白或其片段。在一些实施方案中，在融合蛋白中可以包括任何脂蛋白或其片段，其包含信号序列和氨基酸位置2的天冬氨酸(存在于野生型蛋白中或通过诱变(例如，定点诱变)加入)。在一些实施方案中，任何细胞质蛋白的单个跨膜环可用作膜锚。融合蛋白可以是N-末端融合或C-末端融合。
在一些情况下，细菌表达定位于内膜外表面的融合蛋白，所述融合蛋白包含可以特异性结合结合多肽的结构域或其片段。例如，如果结合多肽是抗体，则抗体结合结构域或其片段可以包含在如上所述的具有内膜蛋白或其片段的融合蛋白中。在一些情况下，抗体结合结构域可以源自黄曲霉(Aspergillus flavus)的变应原Asp fl1、Asp fl2或Asp fl3、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Fc-γRI、Fc-γRII、Fc-γRII-a、Fc-γRII-b、Fc-γRII-c、FC-γRIII、Fc-γRIII-a、Fc-γRIII-b、FcRn、MRP蛋白、金黄色葡萄球菌(S.aureus)的蛋白A(spa)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的蛋白B、链球菌属组G(spg)的蛋白G、化脓性链球菌的蛋白H或金黄色葡萄球菌的蛋白sbi。在一些情况下，结构域源自金黄色葡萄球菌的蛋白A(例如，结合IgG的Fc区的ZZ结构域)。对于其它结合多肽、蛋白-蛋白相互作用结构域和/或结合多肽的表位标签可以包含在融合蛋白中。
在任何前述方法中，步骤(a)可以包括提供多种细菌，其中细菌包括编码候选结合多肽的核酸的文库。在一些情况下，核酸的文库可以包括两个或更多个编码多肽的核酸，所述多肽序列基本上相同，优选相同，但在一个或多个特定位置上的变体序列除外。例如，在一些情况下，文库包含编码与参照结合多肽相比具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或更多个)氨基酸残基改变的候选结合多肽变体的多个核酸。
例如，在任何前述方法中，文库可以包括编码候选抗体变体的多个核酸，其中每个候选抗体变体包含与参照抗体相比的一个或多个氨基酸残基改变(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或更多个)。氨基酸残基的改变可以在抗体的任何位置，例如VH和/或VL和/或恒定结构域。例如，在一些情况下，候选抗体变体包括VH和/或VL的HVR和/或FR中的一个或多个氨基酸残基改变。在一些情况下，候选抗体变体包括VH的HVR(例如HVR-H1、HVR-H2和/或HVR-H3)和/或FR(例如，FR-H1、FR-H2、FR-H3和/或FR-H4)中的一个或多个氨基酸残基改变。在一些情况下，候选抗体变体包括VH的HVR(例如HVR-H1、HVR-H2和/或HVR-H3)中的一个或多个氨基酸残基改变。在一些情况下，候选抗体变体包括VH的FR(例如FR-H1、FR-H2、FR-H3和/或FR-H4)中的一个或多个氨基酸残基改变。在其它情况下，候选抗体变体包括VL的HVR(例如HVR-L1、HVR-L2和/或HVR-L3)和/或FR(例如，FR-L1、FR-L2、FR-L3和/或FR-L4)中的一个或多个氨基酸残基改变。在一些情况下，候选抗体变体包括VL的HVR(例如，HVR-L1、HVR-L2和/或HVR-L3)中的一个或多个氨基酸残基改变。在一些情况下，候选抗体变体包括VL的FR(例如FR-L1、FR-L2、FR-L3和/或FR-L4)中的一个或多个氨基酸残基改变。氨基酸残基的改变可以在表面暴露的残基或隐藏的残基中。
在任何前述方法中，文库可以包括编码候选抗体变体的多个核酸，其中与参照抗体相比，每个候选抗体变体包含VH或VL的FR中的氨基酸残基改变，其中氨基酸残基改变是：(a)在与参照抗体具有相同亚型的天然存在的抗体中鉴定，和/或(b)在预测被隐藏的氨基酸残基中。例如，在一些情况下，文库可以包括编码候选抗体变体的多个核酸，其中与参照抗体相比，每个候选抗体变体包含VH或VL的FR中的氨基酸残基改变，其中氨基酸残基改变是：(a)在与参照抗体具有相同亚型的天然存在的抗体中鉴定，和/或(b)在预测被隐藏的氨基酸残基中。在一些情况下，天然存在的抗体中的氨基酸残基改变由体细胞超突变引起。
可以使用本领域已知的任何方法预测和/或确定被隐藏(例如溶剂不可接近)或表面暴露(例如溶剂可接近)的氨基酸残基。例如，可以使用本领域已知的多种算法中的任何预测被隐藏的氨基酸残基。优选使用来自抗体三维模型的坐标来确定溶剂可接近的位置，优选使用如InsighfH程序(Accelrys，San Diego，CA)的计算机程序。也可以使用本领域已知的算法来预测被隐藏的位置(例如，Lee等人J.Mol.Biol.55:379,1971和Connolly,J.Appl.Cryst.16:548,1983)。可以使用适用于蛋白建模的软件和从抗体获得的三维结构信息的软件来进行隐藏位置的预测。可用于这些目的的软件包括SYBYL BiopolymerModule软件(Tripos Associates)。通常，当算法(程序)需要用户输入大小参数时，计算中使用的探针“大小”设置为约1.4埃或更小的半径范围。此外，Pacios，Comput.Chem.18(4):377-386,1994and J.Mol.Model.1:46-53,1995已经描述了使用个人计算机软件确定被隐藏和/或表面暴露区和面积的方法。
在任何前述方法中，文库可以包括约2个结合多肽至约1014个或更多个结合多肽(例如约2、约5、约10、约15、约20、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200、约500、约103、约104、约105、约106、约107、约108、约109、约1010、约1011、约1012、约1013或约1014个结合多肽)。在一些情况下，文库可以包括约108个结合多肽。
任何前述方法可以包括基于周质中标记的靶分子的量将候选结合多肽鉴定为具有增加的表达水平的步骤。在一些情况下，通过Western blot、IHC、质谱、酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的其它方法测定增加的表达水平。在一些情况下，与参照或野生型结合多肽相比，候选结合多肽具有1至20倍增加的表达，例如1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍增加的表达。例如，候选结合多肽可以具有1至10倍增加的表达、1至7倍增加的表达、1至6倍增加的表达、1至5倍增加的表达、1至4倍增加的表达、1至3倍增加的表达、2至10倍增加的表达、2至8倍增加的表达或2至6倍增加的表达。在一些实施方案中，候选结合多肽在细菌(例如大肠杆菌)和哺乳动物细胞中都具有增加的表达。在一些实施方案中，增加是相对于野生型结合多肽的表达水平。在其它实施方案中，增加是相对于变体结合多肽的表达水平。
任何前述方法可以包括基于周质中标记的靶分子的量将候选结合多肽鉴定为具有增加的稳定性的步骤。在一些情况下，通过差示扫描荧光测定法、圆二色性、光谱法或本领域已知的其它方法确定增加的稳定性。在一些情况下，候选结合多肽与参照或野生型结合多肽相比具有1℃至20℃升高的熔解温度(Tm)，例如具有2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃升高的熔解温度。在一些情况下，候选结合多肽具有1℃至10℃、1℃至9℃、1℃至8℃、1℃至7℃、1℃至6℃、1℃至5℃、1℃至4℃、1℃至3℃、1℃至2℃、2℃至10℃、2℃至9℃、2℃至8℃、2℃至7℃、2℃至6℃、2℃至5℃、2℃至4℃或2℃至3℃增加的Tm。在一些实施方案中，候选结合多肽在细菌(例如大肠杆菌)和哺乳动物细胞中均具有增加的稳定性。在一些实施方案中，候选结合多肽具有增加的稳定性和增加的表达。在一些实施方案中，增加是相对于野生型结合多肽的表达水平。在其它实施方案中，增加是相对于变体结合多肽的表达水平。
任何前述方法可以包括基于周质中标记的靶分子的量鉴定对靶分子具有增加的结合亲和力的候选结合多肽的步骤。在一些实施方案中，候选结合多肽与参照结合多肽相比可以具有1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20倍增加的对靶分子的结合亲和力。例如，该方法可以包括筛选与参照抗体相比具有增加的亲和力的抗体。
在任何前述方法中，结合多肽可以是抗体。在一些情况下，任何上述方法的抗体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一些情况下，抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双体抗体或F(ab')2片段。在其它情况下，抗体是全长抗体，例如完整的IgG1抗体、完整的IgG4抗体、或本文定义的其它抗体类型或同种型。在另一个实施方案中，抗体是半抗体，例如，杵入臼半抗体。参见例如美国专利号5,731,168，其中描述了杵入臼技术。在任何前述方法中，抗体可以是治疗性抗体(例如中和抗体)。
在任何前述方法中，结合多肽可以是抗体模拟物，例如亲合体(affibody)、affilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin、avimer、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、fynomer、Kunitz结构域肽或单体。在其它实施方案中，结合多肽可以是定位于周质的细菌蛋白。在其它实施方案中，结合多肽可以是哺乳动物蛋白。例如，在一些实施方案中，结合多肽可以是细胞表面受体、细胞因子或生长因子。
任何前述方法可以进一步包括在选择步骤之后分离核酸。在一些情况下，该方法还包括确定核酸的序列。
在任何前述方法的一些方面，细菌可以包括影响影响结合多肽表达的基因(例如转录调节基因)的突变。在一些情况下，步骤(a)包括提供多个细菌，其中所述多个细菌包含核酸的文库，文库的每个核酸编码转录调节基因的突变体。在一些情况下，转录调节基因选自转录起始因子、抗σ因子、RNA聚合酶亚基或转录因子。在一些情况下，转录起始因子是σ因子。在一些情况下，σ因子选自RpoD(σ70)、RpoE(σ24)、RpoH(σ32)、RpoS(σ38)、RpoN(σ54)、RpoF(σ28)和FecI(σ19)。在特定情况下，σ因子为RpoD(σ70)。在一些情况下，影响转录调节基因的突变存在于合成的质粒上。在其它情况下，影响转录调节基因的突变存在于内源性细菌基因组中。在一些情况下，影响转录调节基因的突变由易错PCR诱变、化学诱变、置换诱变或靶向诱变引起。在特定情况下，影响转录调节基因的突变由易错PCR诱变引起。
可以使用任何前述方法来鉴定具有改善的结合多肽表达的细菌。在一些情况下，细菌可以具有至少约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约100倍或更多的改善的结合多肽的表达。在一些情况下，细菌可以具有1至10倍改善的表达、1至7倍改善的表达、1至6倍改善的表达、1至5倍改善的表达、1至4倍改善的表达、1至3倍改善的表达、2至10倍改善的表达、2至8倍改善的表达或2至6倍改善的表达。在一些实施方案中，改善是相对于野生型细菌中结合多肽的表达水平。在其它实施方案中，改善是相对于突变细菌中结合多肽的表达水平。
B.文库
本发明提供了包含编码结合多肽的多个核酸的文库。例如，在一些情况下，文库包含编码与参照结合多肽相比具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或更多)氨基酸残基改变的候选结合多肽变体的多个核酸。
候选结合多肽可以是候选抗体变体。在一些情况下，候选抗体变体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一些情况下，候选抗体变体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双体抗体或F(ab')2片段。在其它情况下，候选抗体变体是全长抗体，例如完整IgG1抗体、完整IgG4抗体、或本文所定义的其它抗体类型或同种型。在另一个实施方案中，候选抗体变体是半抗体，例如，杵入臼半抗体。在任何前述方法中，候选抗体变体可以是治疗性抗体(例如中和抗体)。
在其它情况下，候选结合多肽可以是抗体模拟物，例如亲合体(affibody)、affilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin、avimer、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、fynomer、Kunitz结构域肽或单体。在其它实施方案中，结合多肽可以是定位于周质的细菌蛋白。在其它实施方案中，结合多肽可以是哺乳动物蛋白。例如，在一些实施方案中，结合多肽可以是细胞表面受体、细胞因子或生长因子。
在一些情况下，文库可以包括编码候选抗体变体的多个核酸，其中每个候选抗体变体包含与参照抗体相比的一个或多个氨基酸残基改变(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或更多)。氨基酸残基改变可以在抗体的任何位置，例如VH和/或VL和/或恒定结构域。例如，在一些情况下，候选抗体变体包括VH和/或VL的HVR和/或FR中的一个或多个氨基酸残基改变。在一些情况下，候选抗体变体包括VH的HVR(例如HVR-H1、HVR-H2和/或HVR-H3)和/或FR(例如，FR-H1、FR-H2、FR-H3和/或FR-H4)中的一个或多个氨基酸残基改变。在一些情况下，候选抗体变体包括VH的HVR(例如HVR-H1、HVR-H2和/或HVR-H3)中的一个或多个氨基酸残基改变。在一些情况下，候选抗体变体包括VH的FR(例如FR-H1、FR-H2、FR-H3和/或FR-H4)中的一个或多个氨基酸残基改变。在其它情况下，候选抗体变体包括VL的HVR(例如HVR-L1、HVR-L2和/或HVR-L3)和/或FR(例如，FR-L1、FR-L2、FR-L3和/或FR-L4)中的一个或多个氨基酸残基改变。在一些情况下，候选抗体变体包括VL的HVR(例如，HVR-L1、HVR-L2和/或HVR-L3)中的一个或多个氨基酸残基改变。在一些情况下，候选抗体变体包括VL的FR(例如FR-L1、FR-L2、FR-L3和/或FR-L4)中的一个或多个氨基酸残基改变。氨基酸残基的改变可以在表面暴露的残基或隐藏的残基中。
在一些情况下，文库可以包括编码候选抗体变体的多个核酸，其中每个候选抗体变体与参照抗体相比包括VH和/或VL的FR中的一个或多个氨基酸残基改变，其中氨基酸残基改变是：(a)在与参照抗体具有相同亚型的天然存在的抗体中鉴定，和/或(b)在预测被隐藏的氨基酸残基中。在一些情况下，文库可以包括编码候选抗体变体的多个核酸，其中每个候选抗体变体与参照抗体相比包括VH和/或VL的FR中的一个或多个氨基酸残基改变，其中氨基酸残基改变是：(a)在与参照抗体具有相同亚型的天然存在的抗体中鉴定，和(b)在预测被隐藏的氨基酸残基中。在一些情况下，每个候选抗体变体与参照抗体相比包括1个氨基酸残基改变。
例如，在一些情况下，文库可以包括编码候选抗体变体的多个核酸，其中每个候选抗体变体与参照抗体相比包括VH的FR(例如FR-H1、FR-H2、FR-H3或FR-H4)中的氨基酸残基改变，其中氨基酸残基改变是：(a)在与参照抗体具有相同亚型的天然存在的抗体中鉴定，和(b)在预测被隐藏的氨基酸残基中。在其它情况下，文库可以包括编码候选抗体变体的多个核酸，其中每个候选抗体变体与参照抗体相比包括VL的FR(例如，FR-L1、FR-L2、FR-L3或FR-L4)中的氨基酸残基改变，其中氨基酸残基改变：(a)是在与参照抗体具有相同亚型的天然存在的抗体中鉴定，和(b)在预测被隐藏的氨基酸残基中。在一些情况下，天然存在的抗体中的氨基酸残基改变由体细胞超突变引起。
具有与参照抗体属于相同亚型的VH和/或VL的天然存在的抗体可以容易地在抗体数据库中找到，例如Kabat数据库、
Figure BDA0003890634210000661
(国际免疫遗传学信息系统)、蛋白质数据库(PDB)、V BASE或本领域已知的其它数据库。
在任何前述实施方案中，文库可包括约2个结合多肽至约1014个或更多个结合多肽(例如约2个至约10个、约2个至约20个、约2个至约30个、约2个至约40个、约2个至约50个、约2个至约60个、约2个至约70个、约2个至约70个、约2个至约80个、约2个至约100个、约2个至约1014个、约2个至约1013个、约2个至约1012个、约2个至约1011个、约2个至约1010个、约2个至约109个、约2个至约108个、约20个至约108个、约30个至约108个、约40个至约108个、约50个至约108个、约60个至约108个、约70个至约108个、约80个至约108个、约90个至约108个、约100个至约108个、约200个至约108个结合、约400个至约108个、约600个至约108个、约800个至约108个、约103个至约108个、约104个至约108个、约105个至约108个、约106个至约108个、或约107个至约108个结合多肽)。在一些情况下，文库可以包括约108个结合多肽。
C.示例的抗IL-13抗体
本发明提供了结合IL-13的分离的抗体。在一些情况下，抗IL-13抗体可以包括选自以下的至少一个、两个或三个HVR：(a)包含AYSVN(SEQ ID NO：7)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含MIWGDGKIVYNSALKS(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含DGYYPYAMDN(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列的HVR-H3，或一种或多种上述HVR和一种或多种与SEQ ID NO：7-9中的任一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的其变体的组合。
在一些情况下，抗IL-13抗体可进一步包括以下重链框架区中的一个、两个、三个或四个：(a)包含
QVTLRQSGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLS(SEQ ID NO：18)，QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGLSLS(SEQ ID NO：19)，QVTLRQSGPALVKPTQTLTLTCTVSGLSLS(SEQ ID NO：20)，或QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLS(SEQ ID NO：21)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WIRQPPGKALEWLA(SEQ ID NO：22)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAG(SEQ ID NO：23)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGSLVTVSS(SEQ ID NO：24)的氨基酸序列的FR-H4。
在一些情况下，抗IL-13抗体还可以包括选自以下的至少一个、两个或三个HVR：(a)包含RASKSVDSYGNSFMH(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含LASNLES(SEQID NO：11)的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含QQNNEDPRT(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列的HVR-L3，或一种或多种上述HVR和一种或多种与SEQ ID NO：10-12中的任一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的其变体的组合。
在一些情况下，抗IL-13抗体还可以包括以下轻链框架区中的一个、两个、三个或四个：(a)包含DIVLTQSPDSLSVSLGERATINC(SEQ ID NO：13)或DIVMTQSPDSLSVSLGERATINC(SEQ ID NO：14)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO：15)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQ ID NO：16)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGGGTKVEIK(SEQ ID NO：17)的氨基酸序列的FR-L4。
在一些情况下，抗IL-13抗体包含(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO：2-5中的任一个具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2-5中的任一个氨基酸序列；(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6具有至少90％序列(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或(c)(a)中的VH结构域和(b)中的VL结构域。例如，在一些情况下，抗体包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQID NO：6的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，抗体包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，抗体包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，抗体包含含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，抗体包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，抗体包含含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，抗体包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，抗体包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列的VL结构域。
在本发明的另一方面，根据上述实施方案中任一的抗IL-13抗体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗IL-13抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双体抗体或F(ab')2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1抗体、完整IgG4抗体、或本文所定义的其它抗体类型或同种型。在另一个实施方案中，抗体是半抗体，例如，杵入臼半抗体。参见例如美国专利号5,731,168，其中描述了杵入臼技术。
在另一方面，根据上述实施方案中任一的抗IL-13抗体可以并入如以下1-7节所述的单独或组合的任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、≤1pM或≤0.1pM的解离常数(KD)(例如，10-6M或更小，例如10-6M至10-9M或更小，例如10-9M至10-13M或更小)。
在一个实施方案中，通过放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量KD。在一个实施方案中，使用Fab版本的感兴趣抗体及其抗原进行RIA。例如，在未标记抗原的滴定系列存在下用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原，测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen等人J.Mol.Biol.293：865-881,1999)。为了建立测定条件，将
Figure BDA0003890634210000691
多孔板(Thermo Scientific)用5μg/ml的捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)在50mM碳酸钠(pH9.6)中过夜包被，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)下封闭2至5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与感性趣Fab的系列稀释液混合(例如，与Presta等人Cancer Res.57:4593-4599,1997中的抗-VEGF抗体、Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣的Fab过夜孵育；然而，孵育可以持续较长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移到捕获板中，以在室温下孵育(例如1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20(
Figure BDA0003890634210000701
-20)将板洗涤8次。当板干燥时，加入150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并将板在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择给出小于或等于最大结合的20％的每个Fab的浓度用于竞争性结合测定法。
根据另一个实施方案，使用
Figure BDA0003890634210000702
表面等离子体共振测定法来测量KD。例如，使用
Figure BDA0003890634210000703
-2000或
Figure BDA0003890634210000704
-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃进行测定法，其中固定的抗原CM5芯片为约10个响应单位(RU)。在一个实施方案中，根据供应商的说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。抗原用10mM乙酸钠(pH4.8)稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射，以获得偶联蛋白的约10个响应单位(RU)。注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将Fab的两倍系列稀释液(0.78nM至500nM)在25℃以流速约25μl/分钟注入具有0.05％聚山梨醇酯20(
Figure BDA0003890634210000705
-20)表面活性剂(PBST)的磷酸缓冲盐水(PBS)中。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(
Figure BDA0003890634210000706
评估软件版本3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)计算为koff/kon比。参见，例如Chen等人(J.Mol.Biol.293:865-881,1999)。如果通过上述表面等离子体共振测定法的结合速率超过106M-1s-1，则可以使用测量荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的荧光猝灭技术来测定结合速率，该荧光发射强度的测量是在25℃下、在PBS(pH7.2)中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)、存在如光谱仪中测量的增加浓度的抗原中进行，所述光谱仪如配置截流的分光光度计(Aviv Instruments)或带有与搅拌比色杯的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv和scFv片段，以及下述其它片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,出自The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其中两个抗原结合位点可以是二价或双特异性的。参见，例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人Nat.Med.9:129-134,2003；和Hollinger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448,1993。在Hudson等人Nat.Med.9:129-134,2003中也描述了三体抗体和四体抗体。
单结构域抗体是包含全部或部分重链可变结构域或全部或部分抗体轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(参见，例如美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)生产，如本文所述。
3.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984)。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是“类型转换”的抗体，其中类型或亚类已经从亲本抗体的类型或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR(或其部分)源自非人抗体以及FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选还将包含至少一部分人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的某些FR残基被来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
对人源化抗体及其制备方法进行了综述，例如，在Almagro等人Front.Biosci.13:1619-1633,2008中，并进一步描述于例如Riechmann等人Nature 332:323-329,1988；Queen等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033,1989；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人Methods 36:25-34,2005(描述了特异性决定区(SDR)接枝)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498,1991(描述了“重新表面化”)；Dall’Acqua等人Methods 36:43-60,2005(描述了“FR 改组”)；和Osbourn等人Methods 36:61-68,2005和Klimka等人Br.J.Cancer,83:252-260,2000(描述了FR改组的“导向选择”)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等人J.Immunol.151：2296,1993)；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285,1992；和Presta等人J.Immunol.,151:2623,1993)；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro等人Front.Biosci.13:1619-1633,2008)；和源自筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人J.Biol.Chem.272:10678-10684,1997和Rosok等人J.Biol.Chem.271:22611-22618,1996)。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术制备人抗体。人抗体通常在van Dijk等人Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74,2001和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459,2008中描述。
可以通过向转基因动物施用免疫原制备人抗体，所述转基因动物已经被修饰以产生具有针对抗原性攻击反应的人可变区的完整人抗体或完整抗体。这样的动物通常含有全部或一部分人免疫球蛋白基因座，其代替内源性免疫球蛋白基因座，或者其存在于染色体外或随机地整合到动物的染色体中。在这样的转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被失活。对于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125,2005。还参见，例如美国专利号6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利号5,770,429，其描述了
Figure BDA0003890634210000731
技术；美国专利号7,041,870，其描述了K-M
Figure BDA0003890634210000732
技术，以及美国专利申请公开号US2007/0061900，其描述了
Figure BDA0003890634210000733
技术。例如，可通过与不同的人恒定区组合来进一步修饰由这些动物产生的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法制备人抗体。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.133:3001,1984；Brodeur等人Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人J.Immunol.147:86,1991)。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在描述于Li等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562,2006中。另外的方法包括例如美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268,2006(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)也在Vollmers等人Histology andHistopathology 20(3):927-937,2005和Vollmers等人Methods and Findings inExperimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-91,2005中描述了。
也可以通过分离选自人源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后将这样的可变结构域序列与期望的人恒定结构域组合。从抗体文库中选择人抗体的技术描述如下。
5.源自文库的抗体
可以通过筛选组合文库中具有所期望一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库，并筛选此类文库中具有所期望结合特征的抗体。这样的方法被综述于，例如Hoogenboom等人Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等人编辑,Human Press,Totowa,NJ,2001)中，进一步描述在，例如McCafferty等人Nature 348:552-554,1990；Clackson等人Nature 352:624-628,1991；Marks等人J.Mol.Biol.222:581-597,1992；Marks等人Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo编辑Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人J.Mol.Biol.338(2):299-310,2004；Lee等人J.Mol.Biol.340(5):1073-1093,2004；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472,2004；和Lee等人J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132,2004。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)独立地克隆了VH和VL基因的库(repertoires)，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以筛选其中的抗原结合噬菌体，如Winter等人Ann.Rev.Immunol.,12:433-455,1994所述。噬菌体通常展示作为单链Fv(scFv)片段或Fab片段的抗体片段。来自免疫源的文库提供对免疫原高亲和力的抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以克隆初始库(naive repertoire)(例如，来自人)，以提供针对非自身和自身抗原的宽范围的单一抗体来源，而无需任何免疫，如Griffiths等人EMBO J.12:725-734,1993所述。最后，还可以通过从干细胞中克隆未重排的V-基因区段合成地制备初始文库、并使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的HVR3区并完成体外重排，如Hoogenboom等人J.Mol.Biol.,227:381-388,1992所述。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段制备。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein等人Nature 305:537,1983；WO 93/08829；和Traunecker等人EMBO J.10:3655,1991)和“杵入臼”工程化(参见例如美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可以通过工程化用于制备抗体Fc-异源二聚体分子的静电转向效应来制备(WO 2009/089004A1)；交联两个或多个抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980和Brennan等人Science，229：81,1985)；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人J.Immunol.,148(5):1547-1553,1992)；使用“双体抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448,1993)；和使用单链Fv(scFv)二聚体(参见例如Gruber等人J.Immunol.152:5368,1994)；和制备三特异性抗体，如Tutt等人J.Immunol.147:60,1991中所述。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点(包括“章鱼抗体”)的工程化抗体也包括在本文中(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双作用Fab”或“DAF”，其包含与IL-13或VEGF以及另一不同抗原结合的抗原结合位点(参见例如US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，包含本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码抗体的核苷酸序列引入适当的修饰来制备、或通过肽合成来制备。这些修饰包括例如抗体氨基酸序列中的残基缺失和/或插入和/或取代。只要最终构建体具有所期望的特征，例如抗原结合、表达和/或稳定性，则可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体。
a)取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。对于取代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守取代显示在表1中“优选取代”的标题下。表1中“示例性取代”的标题下提供更大量的变化，并且如下文参照氨基酸侧链类型进行了进一步描述。可以将氨基酸取代引入感兴趣的抗体中，并筛选出所期望活性的产物，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表1
Figure BDA0003890634210000761
Figure BDA0003890634210000771
可以根据常见的侧链性质对氨基酸进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些类型之一的成员交换成另一个类型。
一种取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得到的变体将在某些生物学特性(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)中相对于亲本抗体具有修饰(例如改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性的取代变体是亲和力成熟抗体，其可以方便地产生，例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，如本文所述的那些。简言之，突变一个或多个HVR残基，并将变体抗体展示在噬菌体上并筛选特定的生物活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中进行改变(例如，取代)，例如以改善抗体亲和力。这种改变可以在HVR“热点”中进行，所述“热点”即由体细胞成熟过程中以高频率进行突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.278：179-196,2008)，和/或接触抗原的残基，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过从二级文库构建和重新选择的亲和力成熟已经描述在，例如Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编辑Human Press,Totowa,NJ,2001)中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任何一种(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建一个二级文库。然后筛选文库以鉴定具有所期望亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)被随机化。可以具体地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别是通常靶向HVR-H3和HVR-L3。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要这些改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如本文提供的保守取代)。这样的改变可以例如在HVR中的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或者不变、或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
用于鉴定可能用于诱变靶向的抗体的残基或区的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham等人Science 244:1081-1085,1989所述。在该方法中，鉴定残基或靶残基组(例如，带电荷的残基如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，Ala或多聚丙氨酸)替代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在显示对初始取代有功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的取代。或者或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和抗原之间的接触点。这样的接触残基和相邻残基可以作为取代的候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否包含所期望的性质。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列间插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N-或C-末端与酶(例如，对于ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体被糖基化的程度。通过改变氨基酸序列使得产生或除去一个或多个糖基化位点可以方便地实现对抗体糖基化位点的添加或缺失。
当抗体包含Fc区时，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链、双天线的寡糖，其通常通过N-键与Fc区的CH2结构域的Asn297连接。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32,1997。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双天线的寡糖结构的“茎”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以在本发明抗体中制备寡糖的修饰以产生具有某些改善的性质的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有碳水化合物结构的抗体变体，其中碳水化合物结构缺乏与Fc区连接(直接或间接)的岩藻糖。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过计算Asn297上糖链中岩藻糖相对于连接到Asn297的所有糖结构(例如复合体、杂合体和高甘露糖结构)的总和的平均量来确定岩藻糖的量，如通过MALDI-TOF质谱法测量，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区的约位置297的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，由于抗体中较小的序列差异，Asn297也可以位于位置297上游或下游约±3个氨基酸，即位置294和300之间。这样的岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号2003/0157108和2004/0093621。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷”抗体变体相关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249,2004；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614,2004。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545,1986；US2003/0157108；和WO 2004/056312 A1,特别是实施例11)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614,2004；Kanda等人Biotechnol.Bioeng.94(4):680-688,2006；和WO 2003/085107)。
还提供了抗体变体，其具有二等分的寡糖，例如其中与抗体Fc区连接的双天线的寡糖被GlcNAc二等分。这样的抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这样的抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878；美国专利号6,602,684；和US 2005/0123546。还提供了在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。这样的抗体变体描述于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964和WO 1999/22764。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，所述人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)。
在某些实施方案中，本发明考虑了具有一些但不是全部效应功能的抗体变体，这使得其在以下应用中成为期望的候选：其中抗体的体内半衰期是重要的但某些效应功能(如补体和ADCC)是不必要的或是有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的减少/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留Fc Rn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞(NK细胞)仅表达FcRγIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch等人Annu.Rev.Immunol.9:457-492,1991第464页的表3中。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7059-7063,1986和Hellstrom等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:1499-1502,1985；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann等人J.Exp.Med.166:1351-1361,1987)。或者，可以使用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology，Inc.Mountain View,CA；和CytoTox
Figure BDA0003890634210000811
非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI)。用于这样的测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外地，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在如Clynes等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:652-656,1998公开的动物模型中。也可以进行C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(参见例如，Gazzano-Santoro等人J.Immunol.Methods 202:163,1996；Cragg等人Blood 101:1045-1052,2003；和Cragg等人Blood 103:2738-2743,2004)。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova等人Intl.Immunol.18(12):1759-1769,2006)。
具有降低的效应功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个取代的那些抗体(美国专利号6,737,056)。这样的Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有取代的Fc突变体，包括其中残基265和297取代为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改善或减弱的与FcR结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；和Shields等人J.Biol.Chem.9(2):6591-6604,2001)。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代的Fc区，例如Fc区的位置298、333和/或334上的取代(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，在Fc区进行改变，其导致改变(即，改善或减弱)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184,2000所描述。
具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)(其负责将母体IgG转移到胎儿(Guyer等人J.Immunol.117：587,1976和Kim等人J.Immunol.24：249,1994))结合的抗体描述于US2005/0014934中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，所述取代改善Fc区与FcRn的结合。这样的Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个上具有取代的那些Fc变体，例如Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
关于Fc区变体的其它实例还参见Duncan等人Nature 322:738-40,1988；美国专利号5,648,260和5,624,821；和WO 94/29351。
d)半胱氨酸工程化的抗体变体
在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在具体实施方案中，取代的残基出现在抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性硫醇基团定位在抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它部分(如药物部分或接头-药物部分)缀合以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，以下残基中的任何一个或多个可以被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化的抗体可以如例如美国专利号7,521,541中所述产生。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，本文提供的抗体可以被进一步修饰以含有本领域已知并且易于获得的其它非蛋白部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧环戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇(propropylene glycol)均聚物、聚环氧丙烷(prolypropylene oxide)/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中具有优势。聚合物可以是任何分子量、并且可以是支链或非支链。连接到抗体上的聚合物数量可以变化，而且如果连接多于一种聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物数量和/或类型可以基于各种考虑来确定，包括但不限于待改善抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于定义条件的治疗中等。
在另一个实施方案中，提供抗体和非蛋白部分的缀合物，其可通过暴露于放射物而选择性加热。在一个实施方案中，非蛋白部分是碳纳米管(Kam等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605,2005)。放射物可以是任何波长，包括但不限于不损害普通细胞但将非蛋白部分加热至某一温度的波长，在该温度下接近抗体非蛋白部分的细胞被杀伤。
D.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物制备抗体，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗IL-13抗体的分离的核酸。在另一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗VEGF抗体的分离的核酸。这样的核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了一种或多种包含这样的核酸的载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含这样的核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经被转化有)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体和包含核酸的第二载体，第一载体包含的核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，第二载体包含的核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、293细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗IL-13抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含编码如上提供的抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组生产抗IL-13抗体或抗VEGF抗体，分离编码例如如上所述的抗体的核酸，并将其插入到一个或多个载体中用于在宿主中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序这样的核酸。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo编著，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。表达后，可以以可溶性级分从细菌细胞糊中分离抗体，并可进一步纯化。
除了原核生物之外，如丝状真菌或酵母的真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其中糖基化通路已被“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。见Gerngross Nat.Biotech.22:1409-1414,2004和Li等人Nat.Biotech.24:210-215,2006。
用于表达糖基化抗体的合适的宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒菌株，其可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚胎肾细胞系(例如描述于如Graham等人J.Gen Virol.36:59,1977中的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(例如描述于如Mather Biol.Reprod.23：243-251,1980中的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，例如描述于如Mather等人Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68,1982中；MRC 5细胞和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216,1980)；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki等人Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo,编著,HumanaPress,Totowa,NJ),第255-268页,2003。
E.测定法
可以通过本领域已知的各种测定鉴定本文所述的任何抗体(例如抗IL-13抗体或抗-VEGF抗体)、筛选或表征其物理/化学性质和/或生物活性。
1.结合测定法和其它测定法
在一个方面，例如，通过已知方法如ELISA、Western blot等测试本文所述的任何抗体(例如，抗IL-13抗体或抗-VEGF抗体)的抗原结合活性。
另一方面，竞争测定法可用于鉴定与本发明的抗IL-13抗体竞争结合IL-13的抗体。在另一方面，竞争测定法可用于鉴定与本文所述的抗VEGF抗体竞争结合VEGF的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体与本发明的抗IL-13抗体结合相同的表位(例如，线性或构象表位)。在某些实施方案中，这样的竞争性抗体与本文所述的抗VEGF抗体结合相同的表位(例如，线性或构象表位)。用于绘制抗体结合表位图的方法在Morris“Epitope MappingProtocols,”Methods in Molecular Biology Vol.66(Humana Press,Totowa,NJ),1996中提供。
在示例性竞争测定法中，在含有与IL-13结合的第一标记抗体和测试其与第一抗体竞争结合IL-13能力的第二未标记抗体的溶液中孵育固定的IL-13。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在含有第一标记抗体但不含第二未标记抗体的溶液中孵育固定的IL-13。在允许第一抗体与IL-13结合的条件下孵育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定的IL-13结合的标记量。如果与固定的IL-13结合的标记量在测试样品中比对照样品中实质上降低，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合IL-13。参见Harlow等人Antibodies:ALaboratory Manual Ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY),1988。
在另一示例性竞争测定法中，在含有与VEGF结合的第一标记抗体和测试其与第一抗体竞争结合VEGF能力的第二未标记抗体的溶液中孵育固定的VEGF。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在含有第一标记抗体但不含第二未标记抗体的溶液中孵育固定的VEGF。在允许第一抗体与VEGF结合的条件下孵育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定的VEGF结合的标记量。如果与固定的VEGF结合的标记量在测试样品中比对照样品中实质上降低，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合VEGF。
2.活性测定法
在一个方面，提供了用于鉴定具有生物活性的其抗IL-13抗体的测定法。生物活性可包括例如在体内或体外(例如，显示在细菌的周质中)或离体与IL-13(例如，血流中的IL-13)或其肽片段结合。在其它实施方案中，生物活性可包括阻断或中和IL-13、或阻止IL-13与配体(例如受体(例如白介素-13受体))结合。还提供了在体内和/或体外具有这种生物活性的抗体。在某些实施方案中，测试本发明抗体的这种生物活性。
在一个方面，提供了用于鉴定具有生物活性的其抗VEGF抗体的测定法。生物活性可包括例如在体内或体外(例如，显示在细菌的周质中)或离体与VEGF(例如，血流中的VEGF)或其肽片段结合。在其它实施方案中，生物活性可包括阻断或中和VEGF、或阻止VEGF与配体(例如受体(例如Tie2、KDR和/或Flt-1))结合。还提供了在体内和/或体外具有这种生物活性的抗体。在某些实施方案中，测试本发明抗体的这种生物活性。
F.免疫缀合物
本发明还提供了包含缀合一种或多种细胞毒性剂的本文所述的任意抗体(例如，抗IL-3抗体或抗VEGF抗体)的免疫缀合物，所述细胞毒性剂如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白毒素、酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于美登木素生物碱(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1)；澳瑞他汀(auristatin)，如单甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588和7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)、加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人Cancer Res.53:3336-3342,1993；和Lode等人Cancer Res.58:2925-2928,1998)；蒽环霉素如柔红霉素或多柔比星(参见Kratz等人Current Med.Chem.13:477-523,2006；Jeffrey等人Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362,2006；Torgov等人Bioconj.Chem.16:717-721,2005；Nagy等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834,2000；Dubowchik等人Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532,2002；King等人J.Med.Chem.45:4336-4343,2002；和美国专利号6,630,579)；甲氨喋呤；长春地辛；紫杉烷，如多烯紫杉醇、紫杉醇、拉罗星(larotaxel)、替西他赛(tesetaxel)和沃塔紫杉醇(ortataxel)；单端孢霉烯和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含缀合酶促活性毒素或其片段的抗体，所述酶促活性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆蛋白A链、蒴莲素(modeccin)A链、α-八叠球菌、Aleurites fordii蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、mitogellin、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯(tricothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合形成放射性缀合物的本文所述的抗体。各种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，其可以包含用于闪烁图研究的放射性原子，例如锝-99m(tc99m)或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用各种双功能蛋白偶联剂制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，所述双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基噻吩(IT)、亚氨酯(如二甲基己二亚酰胺HCl)的双功能衍生物、活性酯(如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人Science 238:1098,1987所述制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫键的接头(参见例如Chari等人Cancer Res.52:127-131,1992；U.S.Patent No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确地考虑但不限于用交联剂试剂制备的这种缀合物，所述交联剂试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，其可商业获得(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
G.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任何抗IL-13抗体可用于检测生物样品中IL-13的存在。本文所用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织，如T辅助2型(Th2)细胞、肥大细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞和非造血细胞，包括平滑肌细胞、上皮细胞、内皮细胞、或成纤维细胞。
在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法的抗IL-13抗体。在另一方面，提供了检测生物样品中IL-13的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括使生物样品与本文所述的抗IL-13抗体在允许抗IL-13抗体与IL-13结合的条件下接触，并检测在抗IL-13抗体和IL-13之间是否形成复合体。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗IL-13抗体选择适合用抗IL-13抗体治疗的受试者，例如其中IL-13是用于选择患者的生物标志物。
可以使用本发明的抗IL-13诊断的示例性疾患包括IL-13介导的疾患或IgE介导的疾患。在一些情况下，IL-13介导的疾患是例如过敏症、哮喘(例如过敏性哮喘、特应性哮喘、严重哮喘和非过敏性(内源性)哮喘)、自身免疫性疾病(例如牛皮癣、类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎和炎性肠疾病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)、炎性疾病、过敏性鼻炎(包括季节性过敏性鼻炎)、特应性皮炎、过敏性结膜炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏、食物超敏感、乳糜泻、免疫介导的皮肤病(包括例如大疱性皮肤病、多形性红斑、接触性皮炎)、硬皮病、纤维化、肝纤维化、心内膜纤维化、慢性支气管炎、支气管扩张、特发性间质性肺炎、杯状细胞化生、肺炎性疾患、炎性和纤维化肺疾病(例如囊性纤维化、特发性肺纤维化和慢性阻塞性肺病(COPD))、谷蛋白敏感性肠病、惠普耳氏病、肺免疫性疾病(例如嗜酸粒细胞性肺炎(包括慢性嗜酸粒细胞性肺炎)、特发性肺纤维化、过敏性支气管肺曲霉病和超敏性肺炎)、Churg-Strauss综合征(结节性动脉周围炎加特应性反应)、嗜酸粒细胞性肌痛综合征、高嗜酸粒细胞综合征、水肿反应(例如发作性血管性水肿、嗜酸粒细胞性食管炎、嗜酸粒细胞性胃炎、嗜酸粒细胞性肠胃炎、嗜酸粒细胞性肠炎和嗜酸粒细胞性结肠炎)、鼻微息肉病和息肉病、RSV感染、葡萄膜炎、骨质疏松症和恶性肿瘤，包括与IL-13异常表达相关的癌症或肿瘤(例如霍奇金淋巴瘤)。在一些实施方案中，疾患是过敏性哮喘、非过敏性(内在性)哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、过敏性结膜炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏、慢性阻塞性肺病、溃疡性结肠炎、RSV感染、葡萄膜炎、硬皮病或骨质疏松症。在一些情况下，IgE介导的疾患是支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、荨麻疹、过敏反应或特应性皮炎。
在某些实施方案中，本发明提供了诊断与VEGF(例如增加的VEGF表达)相关的疾患的方法。在某些实施方案中，该方法包括使测试细胞与本文所述的抗VEGF抗体接触；通过检测抗VEGF抗体与VEGF的结合测定(定量或定性)测试细胞表达的VEGF水平；和比较测试细胞表达的VEGF水平与对照细胞(例如，与测试细胞的组织来源相同的正常细胞或与这样的正常细胞表达相当水平的VEGF的细胞)表达的VEGF水平，其中与对照细胞相比，测试细胞表达较高水平的VEGF表明存在与增加的VEGF表达相关的疾患。在某些实施方案中，测试细胞从怀疑患有与增加的VEGF表达相关的疾患的个体获得。在某些实施方案中，所述疾患是肿瘤，癌症和/或细胞增殖性疾患。
可以使用本文所述的抗VEGF抗体诊断的示例性疾患包括但不限于鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠癌、胃肠道间质癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌、黑色素瘤、浅表性扩散性黑色素瘤、恶性雀斑样黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、结节状黑色素瘤、B型细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞性白血病；慢性成髓细胞性白血病；移植后淋巴细胞增生性疾患(PTLD)、与瘢痣病(phakomatoses)相关的异常血管增生、与脑肿瘤相关的水肿和Meigs综合征。
另一方面，本发明提供了检测生物样品中VEGF的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在允许抗VEGF抗体与VEGF结合的条件下使生物样品与抗VEGF抗体接触，和检测抗VEGF抗体与VEGF之间是否形成复合体。
抗VEGF抗体可用在众多众所周知的检测测定方法的任一种中检测VEGF。例如，可以通过从所期望的来源获得样品、将样品与抗VEGF抗体混合以使抗体与混合物中存在的任何VEGF形成抗体/VEGF复合体、和检测混合物中存在的任何抗体/VEGF复合体来测定生物样品的VEGF。可以通过本领域已知的适合特定样品的方法制备用于测定的生物样品。根据所使用的测定法类型选择混合样品与抗体的方法以及检测抗体/VEGF复合体的方法。
本文描述了标记的抗IL-13或抗VEGF抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光、发色、高电子密度、化学发光和放射性标记)以及间接检测的部分，如酶或配体，例如通过酶反应或分子相互作用检测。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I、荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮、荧光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶、与使用过氧化氢氧化染料前体的酶偶联，如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基等等。
H.药物制剂
通过将具有所期望纯度的这样的抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合制备冻干制剂或水溶液形式的本文所述的任何抗体(例如抗IL-13或抗VEGF抗体)的药物制剂(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著,1980)。药学上可接受的载体通常在使用的剂量和浓度对受体无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚醇、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(
Figure BDA0003890634210000931
Baxter International,Inc.)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
根据所治疗的具体适应症的需要本文中的组合物还可以含有多于一种的活性成分，优选具有不会不良地相互影响的互补活性的那些活性成分。例如，可能需要进一步提供额外的治疗剂(例如，化疗剂、细胞毒性剂、生长抑制剂和/或抗激素剂，如上文所述的那些)。这些活性成分适合以对所企图的目的有效的量存在于组合中。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在大量乳液(macroemulsions)中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这种技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编辑中公开了(1980年)。
可以制备持续释放的制剂。持续释放的制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质为成形制品(例如薄膜或微胶囊)的形式。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以例如通过无菌过滤膜的过滤容易地实现。
I.治疗方法和组合物
本文所述的任何抗体(例如抗IL-13或抗VEGF抗体)均可用于治疗方法中。
一方面，提供了用作药物的抗IL-13抗体。在进一步的方面，提供了用于治疗IL-13介导的疾患的抗IL-13抗体。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法的抗IL-13抗体。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗患有IL-13介导的疾患的个体的方法的抗IL-13抗体，所述方法包括向该个体施用有效量的抗IL-13抗体。在一个这样的实施方案中，方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。根据上述实施方案中任一的“个体”优选为人。
在另一方面，本发明提供抗IL-13抗体在生产或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗IL-13介导的疾患。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗IL-13介导的疾患的方法，所述方法包括向患有IL-13介导的疾患的个体施用有效量的药物。在一个这样的实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供了一种治疗IL-13介导的疾患的方法，所述IL-13介导的疾患包括例如过敏症、哮喘(例如过敏性哮喘、特应性哮喘、严重哮喘和非过敏性(内源性)哮喘)、自身免疫疾病(例如牛皮癣、类风湿关节炎、青少年慢性关节炎和炎性肠疾病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)、炎性疾病、过敏性鼻炎(包括季节性过敏性鼻炎)、特应性皮炎、过敏性结膜炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏、食物超敏感、乳糜泻、免疫介导的皮肤病(例如大疱性皮肤病、多形性红斑、接触性皮炎)、硬皮病、纤维化、肝纤维化、心内膜纤维化、慢性支气管炎、支气管扩张、特发性间质性肺炎、杯状细胞化生、肺炎症性疾病、炎性和纤维化性肺疾病(例如囊性纤维化、特发性肺纤维化和慢性阻塞性肺病(COPD))、谷蛋白敏感性肠病、惠普耳氏病、肺免疫性疾病(例如嗜酸细胞性肺炎(包括慢性嗜酸细胞性肺炎)、特发性肺纤维化、过敏性支气管肺曲霉病和超敏感性肺炎)、Churg-Strauss综合征(结节性动脉周围炎加特应性反应)、嗜酸粒细胞性肌痛综合征、高嗜酸粒细胞综合征、水肿反应(例如发作性血管性水肿、嗜酸粒细胞性食管炎、嗜酸粒细胞性胃炎、嗜酸粒细胞性肠胃炎、嗜酸粒细胞性肠炎和嗜酸粒细胞性结肠炎)、鼻微息肉病和息肉病、RSV感染、葡萄膜炎、骨质疏松症和恶性肿瘤，包括与IL-13异常表达相关的癌症或肿瘤(例如霍奇金淋巴瘤)。在一些实施方案中，疾患是过敏性哮喘、非过敏性(内在性)哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、过敏性结膜炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏、慢性阻塞性肺病、溃疡性结肠炎、RSV感染、葡萄膜炎、硬皮病或骨质疏松症。在一些实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下所述。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在一些情况下，本发明提供了治疗患有哮喘症状的患者的方法，所述方法包括施用有效减少哮喘症状的量的本发明抗IL-13抗体的任一。
在一些情况下，本发明提供了一种抑制患者中IgE抗体产生的方法，所述方法包括向患者施用抑制IgE抗体产生有效量的本发明抗IL-13抗体的任一。在一些情况下，IgE抗体产生的抑制旨在预防支气管哮喘、预防过敏性鼻炎、预防过敏性皮炎、治疗支气管哮喘、治疗过敏性鼻炎、治疗荨麻疹、预防过敏反应或治疗特应性皮炎。
在其它情况下，本发明提供了一种治疗患者中IgE介导的疾患的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本发明的抗IL-13抗体。在一些情况下，IgE介导的疾患是支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、荨麻疹、过敏反应或特应性皮炎。
在另一方面，本发明提供包含本文提供的任何抗IL-13抗体的药物制剂，例如用于任何上述治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗IL-13抗体和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗IL-13抗体和至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。
本发明的抗IL-13抗体可以单独使用或与治疗中的其它试剂组合使用。例如，本发明的抗IL-13抗体可以有利地与其它单克隆或嵌合抗体或淋巴因子或造血生长因子(如，例如IL-2、IL-3、IL-5、IL-7、IFN)组合使用，例如，其用于增加与抗体相互作用的效应细胞的数量或活性。本发明的抗体可以单独施用或与其它类型的治疗组合施用，如与免疫治疗、支气管扩张剂、抗IgE分子、抗组胺或抗白三烯组合施用。
上述这样的组合治疗包括组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或分开的制剂中)和分开施用，在分开施用的情况下，可以在施用另外的治疗剂或试剂之前、同时和/或之后施用本发明的抗体。在一个实施方案中，施用抗IL-13抗体和施用另外的治疗剂彼此发生在约一个月内、约一、二、三周内、或约一、二、三、四、五或六天内。本发明的抗体也可以与放疗组合使用。
在一个方面，本文描述了用作药物的抗VEGF抗体。在另外的方面，本文描述了用于治疗与病理性血管生成相关的疾患的抗VEGF抗体。在某些实施方案中，本文描述了用于治疗方法的抗VEGF抗体。在某些实施方案中，本文描述了用于治疗患有与病理性血管生成相关的疾患的个体的方法中的抗VEGF抗体，所述方法包括向个体施用有效量的抗VEGF抗体。在一个这样的实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。根据上述实施方案中任一的“个体”优选为人。
在另一方面，本文描述了抗VEGF抗体在生产或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗与病理性血管生成相关的疾患。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗与病理性血管发生相关的疾患的方法中，所述方法包括向患有与病理性血管生成相关的疾患的个体施用有效量的药物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供包含本文所述的任何抗VEGF抗体的药物制剂，例如用于任何上述治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文所述的任何抗VEGF抗体和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文所述的任何抗VEGF抗体和至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。
另一方面，本发明提供了例如在患有与病理性血管生成相关的疾患的受试者中减少或抑制血管生成的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的抗VEGF抗体，从而减少或抑制受试者中的血管生成。在某些实施方案中，与病理性血管生成相关的疾患是非肿瘤性的。在某些实施方案中，与病理性血管生成相关的疾患是癌症。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的试剂，例如如下所述。
另一方面，本发明提供了治疗肿瘤、癌症或细胞增殖性疾患的方法，所述方法包括施用本文所述的有效量的抗VEGF抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的试剂，例如如下所述。
本文所述的抗VEGF抗体可以单独使用或与治疗中的其它试剂组合使用。例如，抗VEGF抗体可以与至少一种另外的试剂共同施用。在某些实施方案中，另外的试剂是化疗剂、细胞毒性剂、抗血管生成剂、免疫抑制剂、前药、细胞因子、细胞因子拮抗剂、细胞毒性放疗、皮质类固醇、止吐药、癌症疫苗、止痛剂、生长抑制剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂或其它试剂，如表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼(TARCEVATM)、血小板衍生的生长因子抑制剂(例如GLEEVECTM(甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如塞来昔布)、干扰素、细胞因子、结合除VEGF以外的靶的抗体、或其它生物活性或有机化学试剂。
上述这样的组合治疗包括组合施用(其中两种或更多种试剂包括在相同或分开的组合物中)和分开施用，在分开施用的情况下，可以在施用另外的一种或多种试剂之前、同时和/或之后施用本发明的抗体。在一个实施方案中，施用抗VEGF抗体和施用另外的试剂彼此发生在约一个月内、约一、二、三周内、或约一、二、三、四、五或六天内。本文所述的抗VEGF抗体也可以与放疗组合使用。
本文所述的抗IL-13抗体或抗VEGF抗体(和任何其它治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肌内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、玻璃体内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜内、皮下、结膜下、血管内、粘膜、心包内、脐带内、眼内、眶内、口腔、局部、经皮、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过靶细胞直接的局部灌注浴、通过导管、通过灌洗在霜剂或脂质组合物中施用。用于本文所述方法的组合物也可以全身或局部施用。施用方法可以根据各种因素(例如，所施用的化合物或组合物以及所治疗的病症、疾病或疾患的严重性)而变化。
将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用抗体。在这种情况下考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、疾患的原因、试剂的递送部位、施用方法、施用方案、以及执业医生已知的其它因素。抗体不必、但任选地与目前用于预防或治疗所讨论疾患的一种或多种试剂配制。这样的其它试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、疾患或治疗的类型以及上述讨论的其它因素。其通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或约本文所述剂量的1至99％使用，或以根据经验/临床确定为适当的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本发明抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和病程、抗体是预防还是用于治疗目的施用、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应以及主治医师的判断。将抗体一次或经过一系列治疗适当地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，可以将约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg至10mg/kg)的抗体作为初始候选剂量施用于患者，例如，无论是通过一次或多个分开施用、或通过连续输注。根据上述因素，一种典型的日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围。对于经过几天或更长时间的重复施用，根据病况，治疗通常将持续到发生期望的疾病症状的抑制。抗体的一个示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg中的一种或多种剂量(或其任何组合)。这样的剂量可以间歇施用，例如，每周、每两周、每三周或每四周施用(例如，使得患者接受约二至约二十个、或例如约六个剂量的抗体)。例如，可以每月施用一次剂量(例如通过皮下注射)。可以施用初始较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量。然而，其它剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定法容易地监测该治疗的进展。
应当理解，可以使用免疫缀合物代替抗IL-13抗体或抗VEGF抗体、或除抗IL-13抗体或抗VEGF抗体外还使用免疫缀合物进行任何上述制剂或治疗方法。
在一些实施方案中，所述方法还可包括另外的治疗。另外的治疗可以是放疗、手术、化疗、基因治疗、DNA治疗、病毒治疗、RNA治疗、免疫治疗、骨髓移植、纳米治疗、单克隆抗体治疗或上述的组合。另外的治疗可以是佐剂或新辅助治疗的形式。在一些实施方案中，另外的治疗是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的治疗是施用副作用限制剂(例如，旨在减轻治疗副作用的发生和/或严重性的试剂，例如抗恶心剂等)。在一些实施方案中，另外的治疗是放疗。在一些实施方案中，另外的治疗是手术。在一些实施方案中，另外的治疗是放疗和手术的组合。在一些实施方案中，另外的治疗是γ照射。在一些实施方案中，另外的治疗可以是分开施用一种或多种上述治疗剂。
J.制品
在本发明的另一方面，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质的制品。所述制品包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由各种材料如玻璃或塑料制成。容器容纳组合物本身或与另一种有效用于治疗、预防和/或诊断病症的组合物组合的组合物，并且容器可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺破的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页表示该组合物用于治疗选择的病症。此外，制品可以包括(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性或其它治疗剂。本发明的该实施方案中的制品可以进一步包括指示组合物可用于治疗特定病症的包装插页。或者或另外地，制品还可以包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户的观点所期望的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
应当理解，任何上述制品可以包括本发明的免疫缀合物来代替抗IL-13抗体或抗-VEGF抗体、或者除抗IL-13抗体或抗-VEGF抗体外还包括本发明的免疫缀合物。
K.工程化的细菌
本发明提供工程化的细菌。本发明的细菌可以用于例如本发明的任何方法中，例如用于上述A部分或实施例中所述的方法中。
在一个实例中，本发明提供了一种细菌，其包括(i)允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中的突变；和(ii)编码结合多肽的表达构建体。
在一些情况下，允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中的突变在编码外膜蛋白和/或影响脂多糖(LPS)组成的蛋白的基因中。在一些情况下，突变是在编码外膜蛋白的基因中，例如是编码主要外膜脂蛋白Lpp(Lpp)、孔蛋白或TolC的基因。在一些情况下，外膜蛋白是Lpp。在一些实施方案中，突变在编码影响LPS组成的蛋白的基因中，例如Env蛋白(例如EnvA、EnvB和EnvM)、RfaD、RfaE、RfaH、RfaRd、TolA、TolB和TolD。
在一些情况下，结合多肽可以是抗体。在一些情况下，任何上述方法的抗体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一些情况下，抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双体抗体或F(ab')2片段。在其它情况下，抗体是全长抗体，例如完整的IgG1抗体、完整的IgG4抗体、或本文定义的其它抗体类型或同种型。在另一个实施方案中，抗体是半抗体，例如，杵入臼半抗体。参见，例如美国专利5,731,168，其描述了杵入臼技术。在任何前述方法中，抗体可以是治疗性抗体(例如中和抗体)。
在其它情况下，结合多肽可以是抗体模拟物，例如亲合体(affibody)、affilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin、avimer、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、fynomer、Kunitz结构域肽或单体。在其它实施方案中，结合多肽可以是定位于周质的细菌蛋白。在其它实施方案中，结合多肽可以是哺乳动物蛋白。例如，在一些实施方案中，结合多肽可以是细胞表面受体、细胞因子或生长因子。
例如，本发明提供了一种细菌，其包括(i)在编码主要外膜脂蛋白Lpp(Lpp)的基因中丧失功能的突变；和(ii)编码抗体的表达构建体。在一些情况下，抗体是全长抗体。在一些情况下，抗体是IgG抗体。在一些情况下，抗体是半抗体。在一些情况下，抗体是抗体片段。在一些情况下，抗体片段选自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段。
上述任何细菌可包括在编码Lpp的基因中的任何合适的突变(例如功能丧失的突变)。示例性的lpp突变包括但不限于lpp-1；lpp-21；lpp-3；lpp5508；lpp-6；lpp::Tn5KAN-2；lppD70E、G或S；lppK75S或T；lppK78R；lppR77D或L；lppS22D；lppY76C、D、E、G、N、P或S；lppY76F、H、I或L；Δlpp、Δlpp-254和Δlpp-752::kan或本文所述的那些突变。这样的lpp突变可以从例如，如CGSC(The Coli Genetic Stock Center)的库获得。在其它情况下，可以使用标准分子遗传学方法制备编码Lpp的基因中的突变。在一些情况下，编码Lpp的基因中丧失功能的突变选自点突变、插入突变或缺失突变。在一些情况下，丧失功能的突变是缺失突变。
上述细菌可包括内膜、周质和外膜。在一些情况下，细菌是革兰氏阴性细菌。例如，在一些情况下，细菌是大肠杆菌。可以使用任何合适菌株或遗传背景的大肠杆菌。通常使用的大肠杆菌菌株和遗传背景是本领域熟知的。示例性大肠杆菌菌株包括但不限于实验室菌株，如K-12及其亚株(例如Clifton野生型、W3110、DH5αE等)和大肠杆菌B及其亚株(例如，BL21、BL21(DE3)等)。在一些实施方案中，大肠杆菌源自菌株62A7。在一些实施方案中，大肠杆菌源自菌株33D3。在一些实施方案中，大肠杆菌源自菌株66C4。
在一些情况下，任何前述细菌可包括影响转录调节基因的突变。在一些情况下，转录调节基因选自转录起始因子、抗σ因子、RNA聚合酶亚基或转录因子。在一些情况下，转录起始因子是σ因子。在一些情况下，σ因子选自RpoD(σ70)、RpoE(σ24)、RpoH(σ32)、RpoS(σ38)、RpoN(σ54)、RpoF(σ28)和FecI(σ19)。在特定情况下，σ因子为RpoD(σ70)。在一些情况下，影响转录调节基因的突变存在于合成的质粒上。在其它情况下，影响转录调节基因的突变存在于内源性细菌基因组中。在一些情况下，影响转录调节基因的突变由易错PCR诱变、化学诱变、置换诱变或靶向诱变引起。在一些情况下，影响转录调节基因的突变由易错PCR突变引起。
在一些情况下，本发明提供了多种任意的前述细菌。在一些实施方案中，多种细菌可以包括本发明的文库，例如本文的上文B部分或实施例中描述的任何文库。在一些情况下，多种细菌可以包括核酸的文库，每个核酸编码转录调节基因(例如，σ因子，例如RpoD(σ70))的突变体。
任何前述细菌可以具有至少约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约100倍或以上的改善的结合多肽(例如，抗体)的表达。在一些情况下，细菌可以具有1至10倍改善的表达、1至7倍改善的表达、1至6倍改善的表达、1至5倍改善的表达、1至4倍改善的表达、1至3倍改善的表达、2至10倍改善的表达、2至8倍改善的表达或2至6倍改善的表达。在一些实施方案中，改善是相对于野生型细菌中结合多肽的表达水平。在其它实施方案中，改善是相对于突变细菌中结合多肽的表达水平。
实施方案
1.一种用于鉴定包含特异性结合靶分子的结合多肽的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供对具有大于10kDa的分子量的分子具有可通透的外膜的细菌，所述细菌表达编码候选结合多肽的核酸，其中所述候选结合多肽存在于所述细菌的周质中；
(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和
(c)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为包含结合多肽，其中在步骤(c)之后细菌保持存活。
2.一种用于鉴定具有特异性结合靶分子的结合多肽的改善的表达的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供对具有大于10kDa的分子量的分子具有可通透的外膜的细菌，所述细菌表达编码结合多肽的核酸，其中所述结合多肽存在于所述细菌的周质中；
(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和
(c)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为具有结合多肽的改善的表达，其中在步骤(c)之后细菌保持存活。
3.根据实施方案1或2所述的方法，其中靶分子具有小于250kDa的分子量。
4.根据实施方案3所述的方法，其中靶分子具有小于150kDa的分子量。
5.一种用于鉴定包含特异性结合靶分子的结合多肽的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含突变的细菌，所述突变允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中，所述细菌表达编码候选结合多肽的核酸，其中候选结合多肽存在于细菌周质中；
(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和
(c)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为包含结合多肽，其中在步骤(c)之后细菌保持存活。
6.一种用于鉴定细菌的方法，所述细菌具有特异性结合靶分子的结合多肽的改善的表达，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含突变的细菌，所述突变允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中，所述细菌表达编码候选结合多肽的核酸，其中候选结合多肽存在于细菌周质中；
(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和
(c)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为具有结合多肽的改善的表达，其中在步骤(c)之后细菌保持存活。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，所述方法还包括使细菌在步骤(b)之前经历透化细菌外膜的条件。
8.根据实施方案7所述的方法，所述方法还包括在使细菌与可检测地标记的靶分子接触后重新密封细菌外膜。
9.一种用于鉴定包含特异性结合靶分子的结合多肽的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供表达编码候选结合多肽的核酸的细菌，其中所述候选结合多肽存在于细菌周质中；
(b)使细菌经历透化细菌外膜的条件；
(c)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；
(d)在步骤(c)之后重新密封细菌外膜；和
(e)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为包含结合多肽。
10.一种用于鉴定具有特异性结合靶分子的结合多肽的改善的表达的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供表达编码候选结合多肽的核酸的细菌，其中所述候选结合多肽存在于所述细菌的周质中；
(b)使细菌经历透化细菌外膜的条件；
(c)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；
(d)在步骤(c)之后重新密封细菌外膜；和
(e)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为具有结合多肽的改善的表达。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，所述方法还包括至少一次重复所述方法的步骤，而没有分离核酸的中间步骤。
12.根据实施方案11所述的方法，所述方法还包括在重复所述方法之前在生长培养基中孵育细菌。
13.根据实施方案1-4和7-12中任一项所述的方法，其中所述细菌包含允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中的突变。
14.根据实施方案5、6和13中的任一项所述的方法，其中所述突变在编码外膜蛋白或影响脂多糖(LPS)组成的蛋白质的基因中。
15.根据实施方案14所述的方法，其中所述外膜蛋白是主要外膜脂蛋白Lpp(Lpp)、孔蛋白或TolC。
16.根据实施方案14所述的方法，其中影响LPS组成的蛋白选自EnvA、RfaD、RfaE、RfaH、RfaRd、TolA、TolB和TolD。
17.根据实施方案7-16中任一项所述的方法，其中使细菌经历透化细菌外膜的条件包括用透化剂处理细菌。
18.根据实施方案17所述的方法，其中所述透化剂选自二价阳离子螯合剂、NaCl、蔗糖、抗生素、洗涤剂、溶菌酶、Tris、Tris-EDTA、抗坏血酸盐、聚赖氨酸、苯扎氯铵、鱼精蛋白、杀菌/通透性增加蛋白(BPI)、血清、补体和Ca2+。
19.根据实施方案18所述的方法，其中所述二价阳离子螯合剂是EDTA。
20.根据实施方案18所述的方法，其中所述抗生素选自氨基糖苷、多粘菌素B、脱酰基多粘菌素、八肽霉素和苄基青霉素。
21.根据实施方案8-20中任一项所述的方法，其中重新密封细菌外膜包括使细菌与选自Mg2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Na+或K+的阳离子盐接触。
22.根据实施方案21所述的方法，其中所述阳离子是Mg2+。
23.根据实施方案22所述的方法，其中Mg2+的盐是MgCl2。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中接触步骤还包括使细菌与核酸染料接触。
25.根据实施方案24所述的方法，其中所述核酸染料选自
Figure BDA0003890634210001061
9、
Figure BDA0003890634210001062
41、
Figure BDA0003890634210001063
43、
Figure BDA0003890634210001064
42、
Figure BDA0003890634210001065
44、
Figure BDA0003890634210001066
40和
Figure BDA0003890634210001067
45。
26.根据实施方案25所述的方法，其中所述核酸染料是
Figure BDA0003890634210001068
9或
Figure BDA0003890634210001069
41。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述可检测地标记的靶分子包含荧光标记。
28.根据实施方案27所述的方法，其中所述荧光标记包含荧光染料或荧光多肽。
29.根据实施方案28所述的方法，其中所述荧光染料选自
Figure BDA00038906342100010610
染料或
Figure BDA00038906342100010611
染料。
30.根据实施方案29所述的方法，其中所述
Figure BDA00038906342100010612
染料是ALEXA
Figure BDA00038906342100010613
488或ALEXA
Figure BDA00038906342100010614
647。
31.根据实施方案29所述的方法，其中所述
Figure BDA0003890634210001071
染料是
Figure BDA0003890634210001072
649。
32.根据实施方案1-31中任一项所述的方法，所述方法还包括至少一个洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在细菌与可检测地标记的靶分子接触后将细菌重悬在洗涤缓冲液中。
33.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中鉴定步骤包括流式细胞术。
34.根据实施方案33所述的方法，其中所述流式细胞术包括分选单个细胞且基于可检测地标记的靶分子的信号进行分选。
35.根据实施方案34所述的方法，所述方法还包括基于核酸染料的信号进行分选。
36.根据实施方案35所述的方法，其中所述流式细胞术依次包括(i)基于核酸染料的信号进行分选；(ii)分选单个细胞；和(iii)基于可检测地标记的靶分子的信号进行分选。
37.根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中所述细菌是革兰氏阴性细菌。
38.根据实施方案37所述的方法，其中所述革兰氏阴性细菌是大肠杆菌细菌。
39.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中所述结合多肽在细菌的周质中以可溶形式表达。
40.根据实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述结合多肽是抗体。
41.根据实施方案40所述的方法，其中所述抗体是全长抗体。
42.根据实施方案41所述的方法，其中所述全长抗体是IgG抗体。
43.根据实施方案40-42中任一项所述的方法，其中所述抗体是半抗体。
44.根据实施方案40所述的方法，其中所述抗体是抗体片段。
45.根据实施方案44所述的抗体，其中所述抗体片段选自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段。
46.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括提供多种细菌，其中所述多种细菌包含核酸的文库，各核酸编码候选结合多肽。
47.根据实施方案46所述的方法，其中所述文库包含编码候选抗体变体的多种核酸，其中各候选抗体变体与参照抗体相比在VH或VL的FR中包含氨基酸残基改变，其中氨基酸残基改变：(a)在与参照抗体具有相同亚型的天然存在的抗体中鉴定，和(b)在预测被隐藏的氨基酸残基中。
48.根据实施方案47所述的方法，其中天然存在的抗体中氨基酸残基改变由体细胞超突变引起。
49.根据实施方案46-48中任一项所述的方法，所述方法还包括基于周质中标记的靶分子的量鉴定候选结合多肽为具有增加的表达水平的步骤。
50.根据实施方案46-49中任一项所述的方法，所述方法还包括基于周质中标记的靶分子的量鉴定候选结合多肽为具有增加的稳定性的步骤。
51.根据实施方案1-50中任一项所述的方法，所述方法还包括在鉴定步骤之后分离核酸。
52.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述细菌包含影响转录调节基因的突变。
53.根据实施方案52所述的方法，其中步骤(a)包括提供多种细菌，其中所述多种细菌包含核酸的文库，各核酸编码转录调节基因的突变体。
54.根据实施方案52或53所述的方法，其中所述转录调节基因选自转录起始因子、抗σ因子、RNA聚合酶亚基或转录因子。
55.根据实施方案54所述的方法，其中所述转录起始因子是σ因子。
56.根据实施方案55所述的方法，其中所述σ因子选自RpoD(σ70)、RpoE(σ24)、RpoH(σ32)、RpoS(σ38)、RpoN(σ54)、RpoF(σ28)和FecI(σ19)。
57.根据实施方案56所述的方法，其中所述σ因子是RpoD(σ70)。
58.根据实施方案52-57中任一项所述的方法，其中影响转录调节基因的突变存在于合成的质粒上。
59.根据实施方案52-57中任一项所述的方法，其中影响转录调节基因的突变存在于内源细菌基因组中。
60.根据实施方案52-59中任一项所述的方法，其中影响转录调节基因的突变由易错PCR诱变、化学诱变、置换诱变或靶向诱变引起。
61.根据实施方案60所述的方法，其中影响转录调节基因的突变由易错PCR诱变引起。
62.根据实施方案52-61中任一项所述的方法，其中所述方法鉴定具有结合多肽的改善的表达的细菌。
63.一种细菌，其包含(i)在编码Lpp的基因中丧失功能的突变；和(ii)编码抗体的表达构建体。
64.根据实施方案63所述的细菌，其中所述抗体是全长抗体。
65.根据实施方案64所述的细菌，其中所述全长抗体是IgG抗体。
66.根据实施方案63-65中任一项所述的细菌，其中所述抗体是半抗体。
67.根据实施方案63所述的细菌，其中所述抗体是抗体片段。
68.根据实施方案67所述的细菌，其中所述抗体片段选自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段。
69.根据实施方案63-68中任一项所述的细菌，其中所述细菌是革兰氏阴性细菌。
70.根据实施方案69所述的细菌，其中所述革兰氏阴性细菌是大肠杆菌细菌。
71.根据实施方案63-70中任一项所述的细菌，其中所述抗体在细菌的周质中以可溶形式表达。
72.根据实施方案63-71中任一项所述的细菌，其中丧失功能的突变是点突变、插入突变或缺失突变。
73.根据实施方案72所述的细菌，其中丧失功能的突变是缺失突变。
74.根据实施方案63-73中任一项所述的细菌，其中所述表达构建体包含与编码抗体的基因可操作地连接的启动子。
75.根据实施方案63-74中任一项所述的细菌，其中所述表达构建体包含合成的质粒。
76.根据实施方案63-75中任一项所述的细菌，所述细菌还包含影响转录调节基因的突变。
77.一种细菌，其包含(i)允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中的突变；(ii)编码结合多肽的表达构建体；和(iii)影响转录调节基因的突变。
78.根据实施方案76或77所述的细菌，其中所述转录调节基因选自转录起始因子、抗σ因子、RNA聚合酶亚基或转录因子。
79.根据实施方案78所述的细菌，其中所述转录起始因子是σ因子。
80.根据实施方案79所述的细菌，其中σ因子选自RpoD(σ70)、RpoE(σ24)、RpoH(σ32)、RpoS(σ38)、RpoN(σ54)、RpoF(σ28)和FecI(σ19)。
81.根据实施方案80所述的细菌，其中所述σ因子是RpoD(σ70)。
82.根据实施方案76-81中任一项的细菌，其中影响转录调节基因的突变存在于合成的质粒上。
83.根据实施方案76-81中任一项所述的细菌，其中影响转录调节基因的突变存在于内源细菌基因组中。
84.根据实施方案76-83中任一项所述的细菌，其中影响转录调节基因的突变由易错PCR诱变、化学诱变、置换诱变或靶向诱变引起。
85.根据实施方案84所述的细菌，其中影响转录调节基因的突变由易错PCR诱变引起。
86.根据实施方案77-85中任一项所述的细菌，其中所述结合多肽是抗体。
87.根据实施方案86所述的细菌，其中所述抗体是全长抗体。
88.根据实施方案87所述的细菌，其中全长抗体是IgG抗体。
89.根据实施方案86-88中任一项所述的细菌，其中所述抗体是半抗体。
90.根据实施方案86所述的细菌，其中所述抗体是抗体片段。
91.根据实施方案77-90中任一项所述的细菌，其中允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中的突变是在编码外膜蛋白或影响LPS组成的蛋白的基因中。
92.根据实施方案91所述的细菌，其中所述外膜蛋白是主要外膜脂蛋白Lpp(Lpp)、孔蛋白或TolC。
93.根据实施方案92所述的细菌，其中所述外膜蛋白是Lpp。
94.根据实施方案91所述的细菌，其中影响LPS组成的蛋白选自EnvA、RfaD、RfaE、RfaH、RfaRd、TolA、TolB和TolD。
95.一种特异性结合白介素-13(IL-13)的分离的抗体，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链可变区，和(b)包含氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少95％同一性。
96.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区和(b)包含氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列与SEQID NO：6的氨基酸序列具有至少95％同一性。
97.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区和(b)包含氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列与SEQID NO：6的氨基酸序列具有至少95％同一性。
98.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和(b)包含氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列与SEQID NO：6的氨基酸序列具有至少95％同一性。
99.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链可变区。
100.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区。
101.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区。
102.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区。
103.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区。
104.根据实施方案95-103中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体还包含以下六种HVR：
(a)包含AYSVN(SEQ ID NO：7)的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含MIWGDGKIVYNSALKS(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含DGYYPYAMDN(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含RASKSVDSYGNSFMH(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含LASNLES(SEQ ID NO：11)的氨基酸序列的HVR-L2；和
(f)包含QQNNEDPRT(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列的HVR-L3。
105.根据实施方案95-104中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体以约1nM或更低的KD特异性结合人IL-13。
106.根据实施方案105所述的分离的抗体，其中所述抗体以约1pM至约50pM的KD特异性结合人IL-13。
107.根据实施方案106所述的分离的抗体，其中所述抗体以约29pM至约40pM的KD特异性结合人IL-13。
108.根据实施方案95-107中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
109.根据实施方案95-108中任一项所述的抗体，其中所述抗体是全长抗体。
110.根据实施方案109所述的抗体，其中所述全长抗体是IgG抗体。
111.根据实施方案95-110中任一项所述的抗体，其中所述抗体是半抗体。
112.根据实施方案95-108中任一项所述的抗体，其中所述抗体是结合IL-13的抗体片段。
113.根据实施方案112所述的抗体，其中所述抗体片段选自Fab、Fab'-SH、Fv，scFv和(Fab')2片段。
114.根据实施方案95-113中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单特异性抗体。
115.根据实施方案95-113中任一项所述的抗体，其中所述抗体是多特异性抗体。
116.根据实施方案115所述的抗体，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。
117.一种分离的核酸，其编码实施方案95-116中任一项所述的抗体。
118.一种载体，其包含实施方案117所述的分离的核酸。
119.一种宿主细胞，其包含实施方案118所述的载体。
120.根据实施方案119所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
121.根据实施方案119所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
122.根据实施方案121所述的宿主细胞，其中所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
123.一种生产实施方案95-116任一项所述的抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养实施方案114所述的宿主细胞。
124.根据实施方案123所述的方法，其中所述方法还包括从宿主细胞或培养基中回收抗体。
125.一种组合物，其包含实施方案95-116中任一项所述的抗体。
126.根据实施方案125所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
127.根据实施方案126所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
128.根据实施方案95-116中任一项所述的抗体，用作药物。
129.根据实施方案95-116中任一项所述的抗体，其用于治疗IL-13介导的疾患。
130.一种治疗患有哮喘症状的患者的方法，所述方法包括向患者施用有效量的实施方案95-116中任一项所述的抗体以减少哮喘症状。
131.一种用于抑制患者中IgE抗体产生的方法，所述方法包括向患者施用有效量的实施方案95-116中任一项所述的抗体。
132.根据实施方案131所述的方法，其中抑制IgE抗体产生旨在治疗支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎、荨麻疹、过敏反应或特应性皮炎。
133.一种治疗患者中IL-13介导的疾患的方法，所述方法包括向患者施用有效量的实施方案95-116中任一项所述的抗体。
134.根据实施方案133所述的方法，其中所述疾患是过敏性哮喘、非过敏性(内在性)哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、过敏性结膜炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏、慢性阻塞性肺病、溃疡性结肠炎、RSV感染、葡萄膜炎、硬皮病或骨质疏松症。
135.一种治疗患者中IgE介导的疾患的方法，所述方法包括向患者施用有效量的实施方案95-116中任一项所述的抗体。
136.根据实施方案135所述的方法，其中所述IgE介导的疾患是支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、荨麻疹、过敏反应或特应性皮炎。
137.根据实施方案130-136中任一项所述的方法，其中所述抗体抑制IL-13与其受体结合并抑制一种或多种与IL-13与其受体结合相关的功能。
138.根据实施方案130-137中任一项所述的方法，其中通过一种或多种途径施用抗体，所述一种或多种途径选自静脉内、腹膜内、吸入、肌内、皮下和口服。
139.根据实施方案138所述的方法，其中所述途径是皮下。
140.根据实施方案130-139中任一项所述的方法，其中所述患者是人。
141.一种包含编码候选抗体变体的多种核酸的文库，其中各候选结合多肽变体与参照抗体相比在VH或VL的FR中包含氨基酸残基改变，其中氨基酸残基改变：(a)在与参照抗体具有相同亚型的天然存在的抗体中鉴定，和(b)在预测被隐藏的氨基酸残基中。
142.根据实施方案141所述的文库，其中天然存在的抗体中氨基酸残基改变由体细胞超突变引起。
III.实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，根据上面提供的一般描述，可以实践各种其它实施例。
实施例1：开发与全长多肽相容的活细胞细菌抗体展示系统
开发了与全长结合多肽和配体(例如全长抗体和抗原)相容的活细胞细菌抗体展示的方法。为了克服以前的细菌显示系统的局限性，开发了将配体(例如，由抗体结合的抗原)穿过细菌外膜递送到周质内而不实质损害细菌细胞存活力的新方法。
主要外膜蛋白(胞壁脂蛋白(murein lipoprotein)，Lpp)的缺失使外膜半通透。使用EDTA进一步透化外膜(Leive等人J.Biol.Chem.243:6384-6391,1968；Hancock,Annu.Rev.Microbiol.38:237-264,1984)。使用Δlpp遗传背景将蛋白从周质空间渗漏到培养基中以促进纯化(Kanamori等人Gene 66:295-300,1988)。然而，这种遗传背景原则上也可以用于允许通常被外膜通透性屏障排除的配体扩散到周质中。
为了证明该系统的功能性，在Δlpp背景中表达抗IL-13IgG(Spiess等人J.Biol.Chem.288:26583-26593,2013)，并且使用荧光显微镜确定EDTA处理的细胞是否可以结合外源性添加的荧光标记的IL-13细胞因子。只有表达抗体的细胞保留了抗原(图1A)，表明不需要膜拴系来有效将抗体保留在细胞中。虽然IL-13抗原具有约15kDa的分子量，但用抗Fc F(ab')2的染色表明具有至少100kDa大小的抗原可以有效地进入并保留在透化细胞的周质中。在其它实验中，用全长抗体成功染色细胞，表明具有至少150kDa大小的分子可以有效地进入并保留在透化细胞的周质中。然而，使用EDTA透化细胞导致细胞存活力降低。为了克服存活力下降，在用抗原和EDTA染色后加入MgCl2，这使存活力恢复至EDTA处理前所见的水平(图1B)。
接下来，测试其它抗体形式以确定它们是否能有效地保留在周质中以结合抗原。类似于全长抗体，Fab和半抗体形式都可以表达并用抗原染色而不影响存活力(图1B)。虽然通过流式细胞仪的空载体对照(pBR322)细胞显示归因于背景信号的自动荧光，但是所有测试的抗体形式都给出在该背景之上的能够有效分选的抗原特异性信号(图1C)。使用杵入臼Fc技术的半抗体是令人感兴趣的，因为它们可用于产生全长双特异性抗体(Spiess等人Nat.Biotechnol.31:753-758,2013)。对于所有以下展示实验，使用半抗体构建体。
如下所述，技术(在本文中有时称为广泛而非限制性意义上的细菌抗体展示或“BAD”)通过将全长抗原递送到活细胞中来克服目前细菌展示的局限，允许使用流式细胞术(例如，FACSTM)选择来快速一轮一轮的进展(图1D)。应当理解，BAD不仅可以用于抗体使用，而且可以用于任何合适的结合多肽使用。在第一步中，使用BAD测试从无结合物池富集的结合抗体。将表达抗IL-13抗体的细胞掺入表达抗VEGF抗体的细胞池中。为了追踪混合物中每种抗体的比例，使用仅赋予羧苄西林抗性的质粒表达抗VEGF，而用于表达抗IL-13的质粒赋予羧苄西林和四环素抗性。通过将1:105和1:106比例的混合培养物的系列稀释液点铺板在含有羧苄西林或四环素的板上，起始确定掺入的准确度，这证实抗IL-13抗体以预期频率表示在池中(图2A)。为了更精确地定量随后的分选实验，将较大体积进行铺板，并进行菌落计数以计算每个样品中抗IL-13与抗VEGF的比例。以1:106的抗IL-13：抗VEGF的比例开始，通过分选抗IL-13阳性细胞进行两轮BAD，获得235,000倍富集(图2B)。为了确保单独的抗原/抗体对可以被富集，进行逆向实验，在两轮FACSTM后得到结合的抗VEGF抗体的19,500倍富集(图2B)。这种富集对应于在FACSTM第二轮后的群中的大的VEGF-阳性位移(图2C)。这些实验证实，通过BAD系统可以快速和高度富集结合克隆。
接下来，测试了BAD系统对于相同抗体的最佳表达或倍数变体的富集能力。为了测试系统的分辨率，使用基于抗VEGF.2抗体的半抗体以及具有不同表达水平的三种变体。变体包括轻链(L4M、S24R、F71Y)和重链(E6Q、M34I)突变的不同组合。用抗人Fc抗体通过Western Blot检测未还原的可溶性样品，并将表达水平对抗VEGF.2半抗体野生型(WT)进行标准化(图3A)。抗VEGF.2WT具有最低的功能表达，而L4M.E6Q.M34I、F71Y.E6Q.M34I和S24R.E6Q.M34I分别具有3.7倍、5.6倍和7.2倍表达水平的增加。为了确保表达和FACSTM位移是一致的，使用BAD确定用荧光标记的VEGF染色的抗VEGF.2WT和变体的各FACSTM位移(图3B)。FACSTM平均荧光强度与表达水平以相同顺序排列，其中与WT抗VEGF.2相比，L4M.E6Q.M34I、F71Y.E6Q.M34I和S24R.E6Q.M34I具有1.25+/-0.2、1.37+/-0.2和1.4+/-0.3倍的增加。因此，如果BAD可以选择最佳表达抗体，这些抗体是用于测试的良好候选者。
进行组合抗VEGF.2WT与三种变体的BAD筛选。进行两轮FACSTM，并且在每轮中分选出VEGF结合克隆的前1％。在两轮分选监测四种组合的抗VEGF.2抗体的FACSTM位移(图3C)。在一些样品中观察到细胞的双峰分布，这归因于大肠杆菌的部分细胞透化和背景的自发荧光。在两轮分选后合并的变体的VEGF结合信号与最佳表达变体S24R.E6Q.M34I叠加，表明更好的表达抗体被富集。输入测序显示所有四种抗VEGF.2抗体均存在于分选开始时，而抗VEGF.2WT和L4M.E6Q.M34I在第1轮后部分耗尽(图3D)。第2轮后，未检测到抗VEGF.2WT和L4M.E6Q.M34I，仅富集了F71Y.E6Q.M34I和S24R.E6Q.M34I。这些数据表明，尽管表达差异很小，BAD可以成功地富集表达最好的抗体。
上述方法在许多应用中是有用的。关于抗体工程化，它可以与较大文库用于Fc工程化、抗体发现或亲和力成熟。除了抗体之外，BAD系统可以作为一般的高通量工具应用，来研究大肠杆菌周质中的蛋白输出、折叠或定位，因为它提供细胞宿主环境中真实的读取结果。该系统的主要优点是非拴系的方法，其允许使用天然蛋白形式，不需要给予融合配偶体、报告蛋白或膜拴系。此外，活细胞设置方法可以特别快速地筛选所期望的宿主特征，比以前的展示技术显著改善。
材料
质粒构建和表达
如之前所述通过标准分子生物学技术将抗体克隆到大肠杆菌表达载体(Simmons等人J.Immunol.Methods 263:133-147,2002；Carter等人Biotechnology(N.Y.)10:13-167,1992)或哺乳动物表达载体(Eaton等人Biochemistry 25:8343-8347,1986)。如之前所述使用50mL大肠杆菌细胞培养物(Spiess等人J.Biol.Chem.288:26583-26593,2013)或30mL CHO(Wong等人Biotechnol.Bioeng.106:751-763,2010)或HEK293T(Bos等人J.Biotechnol.180:10-16,2014)细胞的瞬时转染培养物进行抗体表达。
抗体纯化
为了从大肠杆菌中纯化Fab蛋白，如之前所述(Spiess等人Nat.Biotechnol.31:753-758,2013)在具有染色体lpp基因缺失的菌株64B4(Reilly等人AntibodyEngineering,Springer Berlin Heidelberg,第331-344页,2010)中表达蛋白。在30℃下使500mL CRAP培养物生长24小时后，加入EDTA pH8.0至10mM终浓度。在30℃下、200rpm继续孵育1小时，然后加入MgCl2至最终浓度为20mM。通过离心(20分钟，4500rcf，4℃)除去细胞碎片，然后加入400μg脱氧核糖核酸酶I(Sigma-Aldrich,USA)，然后通过GF/F过滤器(Whatman，England)和0.2μPES过滤器(Thermo Fischer Scientific，USA)过滤上清液。将1.5mL蛋白G
Figure BDA0003890634210001194
浆液(GE Healthcare，USA)加入到50mL裂解液中，并在室温下孵育过夜。通过用PBS洗涤去除未结合的蛋白，用4ml 50mM磷酸pH 3洗脱Fab蛋白，用20×PBS中和，并用
Figure BDA0003890634210001195
Ultra-4浓缩仪(10,000MW截至值)(Merck Millipore,Ireland)浓缩。
根据制造商的方案，通过MABSELECT SURETM(GE Healthcare，USA)从哺乳动物培养物上清液中纯化人IgG1。对于来自哺乳动物培养上清液的人Fab纯化，将FLAG标签加入到重链的C末端，并根据制造商的方案(Sigma-Aldrich,USA)用抗FLAG树脂纯化Fab。通过测定280nm处的吸光度并使用蛋白特异性消光系数来定量蛋白产量。
抗原
之前描述了人VEGF8-109的表达和纯化(Muller等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:7192-7197k 1997)。在大肠杆菌中表达Unizyme标记的人IL-1333-146，在变性条件下通过Ni-NTA色谱法(Qiagen，Germany)纯化并重新折叠。根据制造商的方案，用ALEXA
Figure BDA0003890634210001191
488或ALEXA
Figure BDA0003890634210001192
647琥珀酰亚胺酯(Invitrogen，USA)对蛋白荧光标记进行。
Figure BDA0003890634210001193
649标记的山羊抗人IgG Fc F(ab')2片段获自Jackson Immuno Research，USA。
细菌抗体展示和流式细胞术
对于细菌展示，在菌株62A7的Lpp缺失(Δlpp)中表达抗体。通过卡那霉素抗性处理的菌株33D3从亲本菌株33D3得到62A7(Simmons等人J.Immunol.Methods 263:133-147,2002)。对于掺入实验或具有单个框架变体的实验，用相应质粒各自地转化细胞，在30℃下过夜培养生长，以所述比例或等体积组合，并以1:100稀释用于接种50mL CRAP培养物。在30℃下持续24小时后，通过离心(4分钟，6500rcf)收获1个OD等分试样并沉淀。将细胞重悬于具有2％ BSA和5mM EDTA的100μL PBS pH 7.4中，并在4℃下孵育30分钟。初次孵育后，加入
Figure BDA0003890634210001201
41或9核酸染色(Molecular Probes，USA)至最终稀释度1:100，加入ALEXA488或ALEXA647标记的抗原至最终浓度1-2μM。在黑暗中4℃下继续孵育1小时，此时加入MgCl 2至10-20mM的最终浓度。通过用1mL体积的PBS pH 7.4+20mM MgCl 2洗涤3次除去未结合的蛋白。将染色细胞重悬于SOC培养基(New England Biolabs，USA)中至最终浓度1×107个细胞/ml用于分析，1×106个细胞/ml用于使用BD FACSARIATM II流式细胞仪的分选。FACSTM门控策略包括
Figure BDA0003890634210001202
染料阳性的细胞。使用双联体区分门控去除双联体，最后分选抗原阳性细胞。将细胞分选到SOC培养基中，在30℃过夜回收，并用于重新接种表达培养物或作为甘油储备冷冻。
显微镜
用于荧光显微镜的细胞表达和染色与上述细菌展示方案相同地进行。在具有20mMMgCl2的PBS洗涤步骤之后，将细胞重悬于具有20mM MgCl2的100μL PBS中，并在37℃下与1％明胶混合用于载玻片制备。使用Zeiss Axio Imager A1进行荧光显微镜检查。
免疫印迹
如之前所述进行免疫印迹(Spiess等人Nat.Biotechnol.31:753-758,2013)，除了抗体在卡那霉素抗性处理的33D3的衍生菌株中表达。
通过差示扫描荧光测定法测量蛋白的稳定性
在Biorad CFX96实时系统(Bio-Rad，USA)中测定蛋白稳定性，其中
Figure BDA0003890634210001203
Orange染料储液(Molecular Probes，USA)最终稀释为1:500。从20-100℃(0.2℃增量，每步维持10秒)记录PBS中25μL样品的荧光。
周质提取物
为了产生用于Biacore分析的周质提取物，将来自细菌抗体展示菌株的40mL大肠杆菌表达肉汤以5,000rpm离心5分钟、沉淀。将沉淀物重悬于1.5mL冷的50mM Tris pH 8.0、1mM EDTA和500mM蔗糖中，并在冰上摇动孵育30分钟。在9000rpm离心样品10分钟后，收集上清液作为周质提取物。
表面等离子体共振
分别在BIACORETM 3000或T200仪器(GE Healthcare)上使用表面等离子体共振测量抗IL-13和抗VEGF抗体的结合动力学。所有动力学实验在25℃以30μL/min流速进行，其中运行缓冲液为10mM HEPES，pH 7.4、150mM NaCl和0.005％ Tween-20。对于抗IL-13，将人Fab捕获试剂盒(GE Healthcare)中的Fab结合物(Fab Binder)通过基于胺的偶联固定在CM5传感器芯片上，以捕获大肠杆菌周质提取物中的抗IL-13半抗体。使用范围为1.56至50nM的两倍浓度系列的细胞因子测量人IL-13与抗体的结合。记录IL-13结合的传感图，使用120秒的注射时间，然后是1000秒的解离时间和使用甘氨酸pH 2.1的各循环之间的表面再生。对于抗VEGF，将人VEGF通过基于胺的偶联固定在CM5传感器芯片上。使用范围为6.17至500nM的三倍浓度系列的抗VEGF Fab分析与VEGF的结合。记录单次循环动力学传感图，使用120秒的注射时间，然后300秒的解离时间和使用20mM HCl的各循环之间表面再生。使用1:1Langmuir结合模型分析观察的抗原与抗体结合的所有传感图，计算动力学和结合常数。
实施例2：使用细菌抗体展示优化细胞分选
为了最大化分选过程中的细胞存活力，促进使用BAD进行一轮一轮分选的速度和效率，比较了抗体表达后不同野生型大肠杆菌菌株的存活力。大肠杆菌表达菌株在抗体表达后具有可变的存活力；例如野生型64B4细胞与其它野生型菌株(包括62A7细胞)相比，具有约1倍降低的细胞存活力(图8)。此外，缺失Lpp的62A7细胞(62A7Δlpp)具有比64B4Δlpp细胞更大的存活力(图8)。62A7Δlpp细胞在抗体表达和用标记的抗原孵育后的FACSTM分选后保持存活，并可进行多轮标记和分选。因此，选择菌株背景是可用于优化BAD期间细胞分选过程的一个因素。在使用Δlpp缺失的方法中，该方法与能够表达抗体的任何野生型遗传背景兼容。
还优化了流式细胞术分选条件以增加分选后回收的细胞的量。测试各种核酸染料在流式细胞术期间改善检测大肠杆菌细胞的能力。测试了一组六个蓝色核酸染料(
Figure BDA0003890634210001222
染料40-45)与未染色的对照相比染色表达抗VEGF抗体的细胞的效率(图9)。使用各核酸染料检测染料阳性细胞。在测试的菌株中，
Figure BDA0003890634210001221
41给出最高的染色效率(约90％的处理细胞)。在流式细胞术中使用该核酸染料作为选择策略的一部分，增加了从分选中回收的细胞的量。
Figure BDA0003890634210001223
9是染料的非限制性实例，与
Figure BDA0003890634210001224
41具有相当的染色效率。为了促进具有不同表达水平和/或稳定性的抗体的富集，应当将分选过程中抗原阳性细胞的损失最小化。存在细胞双联体(其是粘在一起的两个细胞但是通过流式细胞术作为单个细胞检测)，原则上可能会损害分选后抗原阳性细胞的富集。在这种情况下，抗原阳性细胞可以粘附抗原阴性细胞，从而减少了富集。为了测试在我们的分选条件下是否发生细胞双联体，表达抗VEGF抗体抗VEGF.V48L的细胞用VEGF-ALEXA
Figure BDA0003890634210001225
488标记，而表达抗VEGF.A97T的细胞用VEGF-ALEXA
Figure BDA0003890634210001226
647标记。然后将这些细胞均等混合并进行流式细胞术。在1×108个细胞/mL的分选浓度下，存在细胞双联体，如对于两种抗原均呈阳性的细胞所示(图10)。为了降低双联体，使用1×106个细胞/mL的较低细胞浓度，这足以消除通过流式细胞术分析检测的双联体。
测试以下的分选策略：组合使用62A7Δlpp菌株、分选细胞浓度为1×106细胞/mL以及包括基于核酸染色信号进行分选以促进定位大肠杆菌细胞的流式细胞术、标准双联体区分门控和选择抗原阳性细胞(图11)。为了证实这种分选策略是成功的，使用表达分别用VEGF-ALEXA
Figure BDA0003890634210001227
488或VEGF-ALEXA
Figure BDA0003890634210001231
647标记的抗VEGF.V48L或抗VEGF.A97T的62A7Δlpp大肠杆菌细胞，并均等组合进行单轮BAD(在下文实施例4中描述)。基于与单独标记的抗原的单抗原阳性结合、双阳性结合或双阴性结合来分选细胞(图12A)。从输入克隆的测序中检测到两种抗VEGF变体的均等组合。在一轮分选后，大约93-95％的细胞被分选为表达的单抗原阳性，预期的抗VEGF变体，证实了分选策略的准确性(图12B)。由于发现了两种抗VEGF抗体的均等群(图12B)，双阴性细胞群对任意抗体均没有偏向选择。这些结果表明，本实施例中描述的分选条件适用于在单轮BAD后富集克隆。细胞是存活的，并且可以在分选和铺板后回收，允许在一轮BAD期间容易进行序列分析和一轮一轮的进展能力。此外，由于分选的高成功率，双联体不影响该方法的分选能力，这与用于该分析的FACSTM AriaII仪器固有的选择限度相当。
实施例3：使用本发明的方法生产具有改善的表达和稳定性的抗IL-13抗体
使用实施例1中描述的方法选择增加的功能表达和稳定性的治疗性抗IL-13抗体。已经采用了几种方法增加大肠杆菌中的抗体产量，包括抗体序列中选择位置的饱和诱变。然而，由于该方法主要导致在抗体的天然库中未发现的氨基酸变化，所以存在将免疫原性序列引入治疗性目的抗体的风险。
目前的方法利用体细胞超突变期间发生的天然框架多样性。检查了天然存在的抗体的Kabat数据库(Kabat，同上)，并鉴定了与抗IL-13抗体相同的κ4轻链和VH2重链亚型的框架区中来自种系的氨基酸变化(图6)。不希望受理论的约束，框架残基应该比高变区残基以较低的可能性影响亲和力。此外，框架区中隐藏的残基应有助于改善抗体折叠和稳定性，但与表面暴露的残基相比降低了免疫原性的潜力。
基于抗IL-13可变结构域亚组的主链抗体骨架的带状结构图如图13所示。体细胞超突变可以在框架区和高变区中引入变化。整理Kabat数据库中的数据，汇编在可变κ4(VK4，黄色)和重链2(VH2，灰色)亚型的框架内由体细胞超突变发生的所有氨基酸变化，然后基于抗IL-13同源性模型将选择的变体缩小至非溶剂暴露的残基(球)。使用PyMOL使模型可视化以鉴定非溶剂暴露的残基。制备抗IL-13半抗体的单一框架变体，5个在轻链中、28个在重链中，组合并通过BAD筛选。
使用抗IL-13半抗体框架变体文库进行BAD筛选。监控两轮的FACSTM数据，与抗IL-13WT相比，抗IL-13框架变体显示与IL-13抗原结合的增加(图4A)。基于标记抗原的信号分选前1％的IL-13阳性细胞，并对分选输出进行测序。抗IL-13WT被第2轮消除(图4B)，轻链M4L变体大大地富集(测序克隆的82％)。此外，重链变体E6Q(测序克隆的14％)也被富集，而重链变体S25Y、F27L、L29I和L45P以及轻链变体S12A分别在测序克隆的小于2％中观察到。
为了证实第2轮后鉴定的抗IL-13框架变体增加功能表达，使用抗人Fc Westernblot比较其在大肠杆菌中的表达水平。轻链变体M4L显示出最高的表达增加，比抗IL-13WT高约2倍(图4C)，与BAD的最佳富集相关。重链框架变体E6Q和F27L也具有比抗IL-13WT高的表达水平(图4C)，而其余变体具有与抗IL-13WT相似的表达。Western blot数据与用结合IL-13抗原的各个框架变体所观察到的排序相关，如通过FACSTM平均荧光强度所测量的。使用远高于KD的抗原浓度来最小化亲和力差异的作用，并确保表达水平推动了抗IL-13框架变体的鉴定。收集结合动力学数据，证实了抗IL-13框架变体M4L、E6Q、F27L和抗IL-13WT具有相当的亲和力(表2)。
表2.抗IL-13半抗体框架变体的抗原亲和力。
Figure BDA0003890634210001251
在以前的报告中，增加大肠杆菌中抗体表达的突变不能转变为真核宿主系统(Demarest等人Protein Eng.Des.Sel.19:325-336,2006；Schaefer等人ProteinEng.Des.Sel.25:485-506,2012)。为了确定筛选策略是否鉴定了与哺乳动物细胞中更高分泌水平相关的变体、允许变体选择在表达宿主之间的可转换性，检查了在大肠杆菌中提供表达增加的抗IL-13半抗体在HEK 293T细胞的表达产量。虽然在真核细胞中的增长略小，但观察到两个宿主之间的表达增长几乎呈线性相关(图4C)。因此，本文描述的筛选策略可用于鉴定在大肠杆菌和哺乳动物细胞中显示改善表达的变体。
为了检验表达的改善是否与构象稳定性的增加相关，进行差示扫描荧光测定法(DSF)。将在大肠杆菌中产生的具有M4L、E6Q或F27L突变的抗IL-13Fab的熔解温度(Tm)与WT比较(图4D)。与WT抗IL-13(Tm为69.4±0.4℃)相比，M4L变体热稳定性增加约5℃(Tm为75.1±0.3℃)。然而，E6Q和F27L突变并没有显著增加热力学稳定性。为了验证M4L变体热稳定性的增加与宿主无关，在CHO细胞中生成作为IgG的抗IL-13变体。在真核宿主中观察到类似的热稳定性增加5℃。
通过BAD筛选鉴定的抗IL-13变体的组合可能是加和的并进一步增加功能表达。因此，检查了大肠杆菌和哺乳动物细胞中M4L、E6Q和F27L的组合的表达水平(图4C)。双组合M4L.E6Q显示在两种宿主中表达水平的加和增加。这两个变体是BAD筛选中仅有的高度富集的变体，进一步支持了我们技术的选择能力。另外，仅含有M4L突变的变体组合显示出热稳定性增加5℃(图4D)。因此，鉴定了一组增加功能表达和热稳定性的核心框架变体，以进一步改善抗IL-13治疗性抗体的生物物理性质。虽然分子的体外性质得到改善，但是这些变体的临床相关性尚未测试。
实施例4：使用本发明的方法生产具有改善的表达和稳定性的抗VEGF抗体
为了进一步证实实施例1和3中描述的策略是一般性适用的，使用BAD方法来改善来自不同种系抗VEGF.3抗体的抗体表达和稳定性。抗VEGF.3具有κ1轻链和VH3重链亚型。与实施例2中描述的使用抗IL-13的方法类似，从Kabat数据库整理具有这些亚型的天然存在的抗体，并鉴定了具有来自体细胞超突变的变异性的框架位置(图7)。在分析中排除了已知对VEGF结合重要的位置和溶剂暴露的那些位置，以分别降低对亲和力或免疫原性的影响。
使用实施例1和3中描述的方法、使用鉴定的抗VEGF.3框架变体(组合47个轻链变体、36个重链变体)和抗VEGF.3WT进行BAD筛选。对前0.5％VEGF阳性细胞分选三轮。抗VEGF.3WT被第1轮消除，随着轮数的进展，与抗VEGF.3WT相比，框架变体显示与VEGF抗原结合的增加(图5A)。
在第3轮之后，克隆被富集(图5A)，在大肠杆菌和HEK 293T细胞中测试在BAD中选择的变体的表达和热稳定性。抗VEGF.3重链变体E6Q、V48L和V48I(分别为测序克隆的85％、7％和3％)在大肠杆菌中表达改善约3-4.5倍(图5B)。为了确定改善的表达是否与增加的稳定性相关，进行DSF。与抗VEGF.3WT相比，所有变体显示改善热稳定性约3℃(图5C)。E6和V48的侧链(图5D)位于可变重链VEGF-Fab的β-桶状结构的核心(Fuh等人，同上)。由于E6Q、V48L和V48I变体改善了折叠并提供了出色的稳定性，因此建议不受特定理论的束缚，β-片层界面略微解包装(underpacked)，并且去除电荷或较大的侧链将改善包装。V37I重链变体(第3轮测序克隆的1％)改善表达的程度较小(在大肠杆菌中为2.3倍)，并且热稳定性增加了2℃(图5C)。与E6和V48相反，V37发现在与轻链的界面处(图5D)，说明了链间以及链内接触对抗体稳定性和折叠的重要性。
接下来，组合框架变体来研究加和效应的潜力。所有双变体都具有在大肠杆菌中改善功能表达多至5.6倍的加和效应(图5B)，而三种变体的组合不能进一步改善抗VEGF抗体的表达。重要的是，对于所有单、双和三变体观察到与抗VEGF WT相似的亲和力(表3)。
表3抗VEGF.3 Fab框架变体的抗原亲和力。
Figure BDA0003890634210001271
令人惊讶的是，所有变体组合都观察到对蛋白稳定性的加和效应，通过在所有三个位置上组合变体，相续地将野生型Fab进一步稳定多至7.6℃(图5C)。这种深刻的热稳定性增加突出了在治疗性抗体开发中如何使用本发明的方法来鉴定具有改善的热稳定性的变体。
当这些变体和组合在哺乳动物系统中表达时，几种表达产物与在大肠杆菌中观察到的结果相关(图5B)。除V37I外，所有单变体均将在HEK 293T细胞中的表达提高了近2-3倍。通过组合E6Q和V48I变体观察到表达进一步增加，并且被V37I变体进一步改善。使用该E6Q.V37I.V48I变体观察到最好的表达，其在HEK 293T和大肠杆菌中分别提供了几乎4至6倍的抗体产量的增加。
总之，实施例2和3中描述的研究证明，通过框架区的一些改变可以显著优化抗体的表达产量和构象稳定性，而不改变抗原亲和力。尽管这些框架变体最初在大肠杆菌细胞中鉴定，但在许多情况下，转换到哺乳动物细胞表达还增加。
实施例5：使用全转录机制工程化和细菌抗体展示改善细菌中重组蛋白的表达
除了鉴定具有改善的结合和/或表达的变体结合多肽之外，本发明的方法还可用于工程化改善重组蛋白(例如抗体、半抗体和抗体片段)表达的细菌。在本实施例中，全转录机制工程化(gTME)与BAD结合使用以筛选表达突变σ因子蛋白的细菌，其提供改善的抗体表达。
gTME方法包括诱变(例如通过易错PCR)编码调节全转录组的蛋白的基因，以产生可以高通量方式筛选的复杂表型。在本实施例中，对σ因子进行易错PCR诱变；然而，原则上可以使用在全水平上影响转录的任何基因(例如，RNA聚合酶亚基(例如，RpoA)、转录因子等)。σ因子结合RNA聚合酶并参与转录启动。σ因子的突变会影响许多基因并产生复杂的表型。表4显示了大肠杆菌σ因子的列表。RpoD是大肠杆菌中主要的σ因子，其在生长的指数期间表达，并且被认为控制约2,000个启动子的表达。图14示出了σ因子RpoD(σ70)的结构图。区1(图14中的区1.1和1.2)仅存在于主要σ因子(RpoD和RpoS)中，其参与确保σ因子仅结合DNA启动子区，其中σ因子结合RNA聚合酶。区1和区2之间是在热稳定性方面发挥作用的间隔区。区2结合启动子的-10元件(TATAAT)。区3紧邻RNA聚合酶的结合位点，RNA聚合酶在起始位点与ATP交联。区3含有螺旋转角螺旋的DNA结合区。最后，区4结合启动子的-35元件(TTGACA)。区4也与抗σ因子结合。预期σ因子的诱变将以几个示例性、非限制性方式影响转录。增加的表达可能由与DNA或RNA聚合酶更紧密结合的突变σ因子引起，或由与抗σ因子结合因此阻止天然σ因子抑制的突变σ因子引起。降低的表达可能由与RNA聚合酶或DNA结合并防止转录的突变σ因子引起。
表4：大肠杆菌σ因子
σ因子 号码 作用
RpoD <![CDATA[σ<sup>70</sup>]]> 主要的σ因子；控制约2,000个启动子
RpoE <![CDATA[σ<sup>24</sup>]]> 压力应答的σ因子
RpoH <![CDATA[σ<sup>32</sup>]]> 热休克σ因子
RpoS <![CDATA[σ<sup>38</sup>]]> 稳定期σ因子
RpoN <![CDATA[σ<sup>54</sup>]]> 氮限制的σ因子
RpoF <![CDATA[σ<sup>28</sup>]]> 鞭毛σ因子
FecI <![CDATA[<sup>19</sup>]]> 柠檬酸铁运转次要σ因子
通过易错PCR诱变产生编码突变RpoD蛋白的质粒文库(图15A和15B)。使用引物F_rpoD_AatII5-TATGACGTCGATTAATGCCAAAAGCGGCAGA-3′(SEQ ID NO：25)和R_rpoD_ScaI 5′-TATAGTACTGATTAATCGTCCAGGAAGCTAC-3′(SEQ ID NO：26)扩增rpoD基因和天然启动子，并使用标准方法在AatII和ScaI位点与pACYC177质粒(具有p15A复制起点和卡那霉素抗性标记物(kan))连接在一起。转化体在补充有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上生长。使用引物F_rpoD_check5-CTATTCTCAGAATGACTTGGTTG-3′(SEQ ID NO：27)和R_rpoD_check 5′-GATGCTTTTCTGTGACTGGTG-3′(SEQ ID NO：28)对质粒进行测序来确认正确的构建体。根据制造商的方案，使用
Figure BDA0003890634210001291
II EZ克隆试剂盒(Agilent，Santa Clara，CA)进行片段诱变。在
Figure BDA0003890634210001292
Turbo细胞中增殖质粒文库，并在补充有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上选择。通过测序确定文库的多样性，发现错误率为1-4个突变/kb。估计的文库大小约为106。
接下来，生成用于BAD筛选的含有Lpp基因缺失(Δlpp)的细菌文库(图16A和16B)。用编码抗IL-13抗体的HC和LC与blaβ内酰胺酶抗生素抗性基因和四环素抑制(tetR)基因的MD169质粒转化66C4菌株(Δlpp、ΔfhuA、Δptr3、lacIQ、lacL8、ΔompT(nmpc-fepE)、ΔdegP、ilvG2096(IlvG+；ValR))。选择在补充有20μg/ml四环素的LB琼脂上有生长能力的成功的转化体。接下来，用上述表达独特的突变rpoD和卡那霉素抗生素抗性基因的突变rpoD质粒文库转化得到的转化体(66C4 MD169)。选择在补充有20μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上有生长能力的成功的转化体。通过测序筛选文库样品的多样性。这导致66C4文库池表达rpoD突变体和抗IL-13抗体，其多样性约为106。
接下来，使用BAD筛选66C4文库池(图17A和17B)。文库在CRAP培养基中在30℃、225rpm下生长24小时。收获1个OD单位，用EDTA透化，使用荧光标记的抗原(ALEXA
Figure BDA0003890634210001301
647标记的人IL-13；“
Figure BDA0003890634210001303
647-huIL-13”)和DNA染料(
Figure BDA0003890634210001302
9)染色，用MgCl2重新密封，基本上如实施例1和2所述。使用
Figure BDA0003890634210001304
流式细胞术装置分选细胞。简言之，首先使用
Figure BDA0003890634210001305
9门控细胞来寻找细胞。接下来，基于细胞复杂性来门控细胞。最后，通过流式细胞术基于
Figure BDA0003890634210001306
647-huIL-13信号分离前1-3％的细胞、生长、并重复该过程。使用BAD对66C4文库池进行了总共四轮的分选。
结果表明，与用空载体或野生型rpoD转化的细胞相比，每轮BAD导致基于IL-13结合的荧光强度增加(图18)，表明群池含有增加数量的高表达克隆。相比之下，通过BAD方法将不良表达的克隆分选出去。第四轮后，将细胞铺板，随机选择96个菌落并测序。从测序中鉴定出三个不同的rpoD突变体(图19)。野生型rpoD的氨基酸序列示于SEQ ID NO：29。rpoD突变体1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：30。rpoD突变体2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：31。rpoD突变体3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：32中。突变体1和2包括截短与点突变(突变体1包括P504S和E515K，而突变体2包括Y571F)，而突变体3包括5个点突变(M51L、Y143H、V229I、K236N和D492V)。不希望受理论的束缚，认为截短突变体可以更有效地结合抗σ因子，导致改善重组抗体的表达。单独分析的rpoD突变体显示荧光增加，表明抗体表达增加(图20)。具有最高平均荧光强度的突变体(突变体2)也是测序的克隆中最丰富的(图20)。还使用标准方法通过Western blot(图21A和21B)评估了使用来自1OD细胞的非还原可溶性样品的三个rpoD突变体的抗体表达中的全长抗IL-13的表达。首先在原始宿主菌株66C4中评估突变体(图21A)，其显示与流式细胞术分析相似的结果，其中突变体2给出最高水平的表达。将抗IL-13表达质粒MD169和三个突变体单独地转化到不同的宿主菌株67A6(ΔfhuA、ΔphoA、ilvG2096(IlvG+；Valr)、ΔmanA、Δprc、spr43H1、lacIQ、ΔompT、ΔmenE742、degP210A)，评估σ因子突变体的转移性。与表达天然RpoD蛋白序列的67A6相比，发现所有突变体都增加抗体的表达(图21B)，证明突变体可以转移到其它宿主大肠杆菌菌株中并提供全长抗IL-13抗体表达水平的增加。
总之，本发明的方法可以用于工程化细胞(例如细菌)以具有改善的重组多肽(包括抗体和半抗体)表达。细胞经过多轮筛选保持存活的事实具有许多优点，特别是在高通量筛选方法的背景下，包括更快地鉴定在多个位点具有突变的细菌。该方法与携带质粒的DNA或基因组DNA的许多诱变方法兼容，包括化学诱变、靶向诱变或基于转座子的诱变。
其它实施方案
虽然为了清楚理解的目的，通过说明和实施例的方式对前述发明进行了详细的描述，但是描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用明确地并入本文。
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Claims (26)

1.一种用于鉴定包含特异性结合靶分子的结合多肽的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供对具有大于10kDa的分子量的分子具有可通透的外膜的细菌，所述细菌表达编码候选结合多肽的核酸，其中所述候选结合多肽存在于所述细菌的周质中；
(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和
(c)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为包含结合多肽，其中在步骤(c)之后细菌保持存活。
2.一种用于鉴定具有特异性结合靶分子的结合多肽的改善的表达的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供对具有大于10kDa的分子量的分子具有可通透的外膜的细菌，所述细菌表达编码结合多肽的核酸，其中所述结合多肽存在于所述细菌的周质中；
(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和
(c)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为具有结合多肽的改善的表达，其中在步骤(c)之后细菌保持存活。
3.一种用于鉴定包含特异性结合靶分子的结合多肽的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含突变的细菌，所述突变允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中，所述细菌表达编码候选结合多肽的核酸，其中候选结合多肽存在于细菌周质中；
(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和
(c)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为包含结合多肽，其中在步骤(c)之后细菌保持存活。
4.一种用于鉴定细菌的方法，所述细菌具有特异性结合靶分子的结合多肽的改善的表达，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含突变的细菌，所述突变允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中，所述细菌表达编码候选结合多肽的核酸，其中候选结合多肽存在于细菌周质中；
(b)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；和
(c)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为具有结合多肽的改善的表达，其中在步骤(c)之后细菌保持存活。
5.一种用于鉴定包含特异性结合靶分子的结合多肽的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供表达编码候选结合多肽的核酸的细菌，其中所述候选结合多肽存在于细菌周质中；
(b)使细菌经历透化细菌外膜的条件；
(c)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；
(d)在步骤(c)之后重新密封细菌外膜；和
(e)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为包含结合多肽。
6.一种用于鉴定具有特异性结合靶分子的结合多肽的改善的表达的细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供表达编码候选结合多肽的核酸的细菌，其中所述候选结合多肽存在于所述细菌的周质中；
(b)使细菌经历透化细菌外膜的条件；
(c)使细菌与可检测地标记的靶分子接触；
(d)在步骤(c)之后重新密封细菌外膜；和
(e)通过在周质中存在标记的靶分子将细菌鉴定为具有结合多肽的改善的表达。
7.一种细菌，其包含(i)在编码Lpp的基因中丧失功能的突变；和(ii)编码抗体的表达构建体。
8.一种细菌，其包含(i)允许膜不可通透的分子跨过外膜扩散到周质中的突变；(ii)编码结合多肽的表达构建体；和(iii)影响转录调节基因的突变。
9.一种特异性结合白介素-13(IL-13)的分离的抗体，其中所述抗体包含(a)包含SEQID NO：1的氨基酸序列的轻链可变区，和(b)包含氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少95％同一性。
10.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区和(b)包含氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列与SEQ IDNO：6的氨基酸序列具有至少95％同一性。
11.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区和(b)包含氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列与SEQ IDNO：6的氨基酸序列具有至少95％同一性。
12.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区和(b)包含氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列与SEQ IDNO：6的氨基酸序列具有至少95％同一性。
13.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链可变区。
14.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区。
15.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区。
16.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区。
17.一种特异性结合IL-13的分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区。
18.一种分离的核酸，其编码权利要求9-17中任一项所述的抗体。
19.一种载体，其包含权利要求18所述的分离的核酸。
20.一种宿主细胞，其包含权利要求19所述的载体。
21.一种组合物，其包含权利要求9-17中任一项所述的抗体。
22.一种治疗患有哮喘症状的患者的方法，所述方法包括向患者施用有效量的权利要求9-17中任一项所述的抗体以减少哮喘症状。
23.一种用于抑制患者中IgE抗体产生的方法，所述方法包括向患者施用有效量的权利要求9-17中任一项所述的抗体。
24.一种治疗患者中IL-13介导的疾患的方法，所述方法包括向患者施用有效量的权利要求9-17中任一项所述的抗体。
25.一种治疗患者中IgE介导的疾患的方法，所述方法包括向患者施用有效量的权利要求9-17中任一项所述的抗体。
26.一种包含编码候选抗体变体的多种核酸的文库，其中各候选结合多肽变体与参照抗体相比在VH或VL的FR中包含氨基酸残基改变，其中氨基酸残基改变：(a)在与参照抗体具有相同亚型的天然存在的抗体中鉴定，和(b)在预测被隐藏的氨基酸残基中。
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