JP2019500853A - 抗ｔｐｂｇ抗体と使用方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗ＴＰＢＧ抗体と同抗体を使用する方法に関する。
【選択図】図４Ａ

Description

本発明は抗ＴＰＢＧ抗体と同抗体を使用する方法に関する。
トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）は、細胞接着に関与するロイシンリッチ膜貫通糖タンパク質である。成人では、このタンパク質は多くの腫瘍細胞において高度に発現し、多数のがんにおける臨床転帰不良と関連している。
ＴＰＢＧに結合する抗体（「５Ｔ４」とも称される）は、例えばShaw等(2002) Biochem. J. 363: 137-45及び国際公開第９８／５５６０７号に開示されている。それら文献は、ＴＰＢＧの立体構造エピトープに特異的に結合する抗体「Ｈ８」を開示している。元のマウスＨ８抗体及びＨ８抗体のヒト化型のアミノ酸配列は、国際公開第２００６／０３１６５３号に開示されている。
ＴＰＢＧに結合する更なる抗体は、例えば、Woods等 (2002) Biochem. J. 366: 353-65（ラットモノクローナル抗体を開示）と米国特許第５８６９０５３号（マウスモノクローナル抗体を開示）に開示されている。
ＴＰＧＢに結合する更なる抗体は、例えば、国際公開第２００７／１０６７４４号に開示され、特徴付けられており、抗体Ａ１、Ａ２及びＡ３と称される。
がんの治療におけるＴＰＢＧに結合する抗体の治療的使用は、例えば、Myers等 (2002) Cancer Gene Ther. 9: 884-896、Shaw等(2000) Biochim. Biophys. Acta. 1524: 238-246；及びヒトＩｇＧ１定常ドメイン又はマウスＢ７．１の細胞外ドメインに融合した抗体配列の抗ＴＰＢＧ抗体がＴＰＢＧ発現腫瘍細胞株の細胞溶解を誘導することを開示している米国特許出願公開第２００３／００１８００４号に開示されている。変異したスーパー抗原ブドウ球菌エンテロサイトトキシンＡ（ＳＥＡ）に融合したモノクローナル抗ＴＰＧＢ抗体のマウスＦａｂ断片であるＰＮＵ−２１４９３６を使用する第Ｉ相臨床試験は、毒性が限定され、幾らかの抗腫瘍応答があることを示した（Cheng等 (2004) J. Clin. Oncol. 22(4):602-9）。
本発明は、抗ＴＰＢＧ抗体、そのコンジュゲート及びこれらを使用する方法を提供する。また提供されるのは、単離された抗ＴＰＢＧポリペプチドとこれらをコードする単離された核酸である。
本発明は、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）に結合する単離された抗体であって、ヒトＴＰＢＧ（配列番号：１）及びミニブタＴＰＢＧ（配列番号：２）に結合する抗体に関する。
一態様では、本発明は、ＴＰＢＧに結合する単離された抗体であって、１０−８Ｍ以下のＫＤでヒト及びミニブタＴＰＢＧに特異的に結合する抗体に関する。
一実施態様では、抗体は１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＴＰＢＧに特異的に結合し、かつ抗体は１０−８Ｍ以下のＫＤでミニブタＴＰＢＧに特異的に結合する。
一実施態様では、抗体のＦａｂ断片は、１０−８Ｍ以下のＫＤでヒト及びミニブタＴＰＢＧに特異的に結合する。
別の態様では、本発明は、ＴＰＢＧに結合する単離された抗体であって、ヒトＴＰＢＧ（配列番号：１）とミニブタＴＰＢＧ（配列番号：２）に結合し、かつｐＨ５．５とｐＨ７．４でヒトＴＰＢＧに特異的に結合する抗体に関する。
別の態様では、本発明は、ＴＰＢＧに結合する単離された抗体であって、ヒトＴＰＢＧ（配列番号：１）とミニブタＴＰＢＧ（配列番号：２）に結合し、かつｐＨ５．５とｐＨ７．４で１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＴＰＢＧに特異的に結合する抗体に関する。
別の態様では、本発明は、ＴＰＢＧに結合する単離された抗体であって、ヒトＴＰＢＧ（配列番号：１）とミニブタＴＰＢＧ（配列番号：２）に結合し、かつｐＨ５．５とｐＨ７．２でヒトＴＰＢＧに特異的に結合する抗体に関する。
本発明の一実施態様では、抗体は、ｐＨ５．５とｐＨ７．２で細胞表面に発現されたヒトＴＰＢＧに特異的に結合する。
本発明の一実施態様では、抗体は、ｐＨ５．５とｐＨ７．２でＳＷ６２０細胞上の細胞表面に発現されたヒトＴＰＢＧに特異的に結合する。
本発明の一実施態様では、抗体はｐＨ５．５とｐＨ７．２でヒトＴＰＢＧに特異的に結合し、ｐＨ５．５に対するｐＨ７．２での結合比は１．５未満であり、好ましい一実施態様では０．８〜１．５であり、他の好ましい実施態様では０．９〜１．２である。一実施態様では、結合はフローサイトメトリーによって検出され、結合比は実施例１８に記載のように平均蛍光強度を比較することによって決定される。本発明の一実施態様では、抗体はｐＨ５．５とｐＨ７．２で細胞表面に発現されたヒトＴＰＢＧに特異的に結合し、ｐＨ５．５に対するｐＨ７．２での結合比は１．５未満であり、好ましい一実施態様では０．８〜１．５であり、別の好ましい実施態様では０．９〜１．２である。一実施態様では、結合はフローサイトメントリーによって検出され、結合比は実施例１８に記載のように平均蛍光強度を比較することによって決定される。
本発明の一実施態様では、抗体はｐＨ５．５とｐＨ７．２でＳＷ６２０細胞上の細胞表面に発現されたＴＰＢＧに特異的に結合し、ｐＨ５．５に対するｐＨ７．２での結合比は１．５未満であり、好ましい一実施態様では０．８〜１．５であり、別の好ましい実施態様では０．９〜１．２である。一実施態様では、結合はフローサイトメントリーによって検出され、結合比は実施例１８に記載のように平均蛍光強度を比較することによって決定される。
本発明の一実施態様では、抗体は、細胞表面に発現されたヒトＴＰＢＧと細胞表面に発現されたミニブタＴＰＢＧに結合する。
本発明の一実施態様では、抗体は、細胞表面に発現されたＴＰＢＧへの結合の際にヒト又はミニブタＴＰＢＧ発現細胞中に内部移行する。
本発明の一実施態様では、抗体は、（ここに開示された抗体「０５１」の上述のＣＤＲに対応する）配列番号：５の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：８の軽鎖のＣＤＲ３、及び配列番号：４の重鎖のＣＤＲ２を含む。
本発明の一実施態様では、抗体は、（ここに開示された抗体「０５１」の６つのＣＤＲに対応する）配列番号：３の重鎖のＣＤＲ１、配列番号：４の重鎖のＣＤＲ２、配列番号：５の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：６の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号：７の軽鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：８の軽鎖のＣＤＲ３を含む。
本発明の一実施態様では、抗体は、（ここに開示された抗体「０９１」の上述のＣＤＲに対応する）配列番号：１３の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：１６の軽鎖のＣＤＲ３、及び配列番号：１２の重鎖のＣＤＲ２を含む。
本発明の一実施態様では、抗体は、（ここに開示された抗体「０９１」の６つのＣＤＲに対応する）配列番号：１１の重鎖のＣＤＲ１、配列番号：１２の重鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：１３の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：１４の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号：１５の軽鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：１６の軽鎖のＣＤＲ３を含む。
本発明の一実施態様では、抗体は、（ここに開示された抗体「０９７」の上述のＣＤＲに対応する）配列番号：２１の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：２４の軽鎖のＣＤＲ３、及び配列番号：２０の重鎖のＣＤＲ２を含む。
本発明の一実施態様では、抗体は、（ここに開示された抗体「０９７」の６つのＣＤＲに対応する）配列番号：１９の重鎖のＣＤＲ１、配列番号：２０の重鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：２１の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：２２の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号：２３の軽鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：２４の軽鎖のＣＤＲ３を含む。
本発明の一実施態様では、抗体は、上述の抗体の一つに由来するヒト化抗体である。
本発明の一実施態様では、抗体は、
（ａ）配列番号：９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；
（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は
（ｃ）（ａ）のＶＨ配列と（ｂ）のＶＬ配列
を含む。
一態様では、本発明は、（ここに開示された抗体「０５１」の可変ドメインに対応する）配列番号：９のＶＨ配列と配列番号：１０のＶＬ配列を含む抗体を提供する。
本発明の一実施態様では、抗体は、
（ａ）配列番号：１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；
（ｂ）配列番号：１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は
（ｃ）（ａ）のＶＨ配列と（ｂ）のＶＬ配列
を含む。
一態様では、本発明は、（ここに開示された抗体「０９１」の可変ドメインに対応する）配列番号：１７のＶＨ配列と配列番号：１８のＶＬ配列を含む抗体を提供する。
本発明の一実施態様では、抗体は、
（ａ）配列番号：２５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；
（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は
（ｃ）（ａ）のＶＨ配列と（ｂ）のＶＬ配列
を含む。
一態様では、本発明は、（ここに開示された抗体「０９７」の可変ドメインに対応する）配列番号：２５のＶＨ配列と配列番号：２６のＶＬ配列を含む抗体を提供する。
本発明の一実施態様では、抗体は、ＴＰＢＧに結合する抗体断片である。本発明の一実施態様では、抗体は、ＴＰＢＧに結合するＦａｂ断片である。
一態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする単離された核酸を提供する。一態様では、本発明は、前記核酸を含む宿主細胞を提供する。
一態様では、本発明は、抗体が産生されるように本発明の前記宿主細胞を培養することを含む抗体の製造方法を提供する。前記方法の一実施態様では、該方法は、抗体を宿主細胞から回収することを更に含む。
一態様では、本発明は、本発明の抗体と細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲートを提供する。一実施態様では、細胞傷害性剤は、酵素的に活性な毒素又はその断片である。一実施態様では、細胞傷害性剤は、（緑膿菌由来）外毒素Ａ鎖、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、及びトリコテセン（tricothecenes）からなる群から選択される。一実施態様では、細胞傷害性剤はシュードモナス外毒素Ａ又はその変異体である。
一態様では、本発明は、抗体を細胞傷害性剤に結合させる工程を含む、本発明のイムノコンジュゲートを製造する方法を提供する。一実施態様では、前記方法は、抗体が産生されるように、本発明の抗体をコードする核酸を含む本発明の宿主細胞を培養することにより、抗体が提供される、抗体提供工程を結合工程の前に更に含む。一実施態様では、前記方法は、結合工程の前に宿主細胞から抗体を回収する工程を更に含む。
一態様では、本発明は、本発明の抗体と任意の他のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質を提供する。一実施態様では、他のポリペプチドは、抗体の重鎖の少なくとも一つに融合される。一実施態様では、他のポリペプチドは、抗体の重鎖の少なくとも一つのＣ末端に融合される。
一実施態様では、ポリペプチドは細胞傷害性剤である（その結果、この実施態様では、組換え融合タンパク質はイムノコンジュゲートである）。一実施態様では、細胞傷害性剤は酵素的に活性な毒素又はその断片である。一実施態様では、細胞傷害性剤は、（緑膿菌由来）外毒素Ａ鎖、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、及びトリコテセン（tricothecenes）からなる群から選択される。一実施態様では、細胞傷害性剤はシュードモナス外毒素Ａ又はその変異体である。
一態様では、本発明は、本発明の組換え融合タンパク質をコードする単離された核酸を提供する。一実施態様では、核酸は、本発明の組換え融合タンパク質をコードし、組換え融合タンパク質はイムノコンジュゲートである（この実施態様では、組換え融合タンパク質に含まれるポリペプチドは細胞傷害性剤である）。一態様では、本発明は前記核酸を含む宿主細胞を提供する。
一態様では、本発明は、組換え融合タンパク質が産生されるように前記宿主細胞を培養することを含む、組換え融合タンパク質を製造する方法を提供する。一実施態様では、組換え融合タンパク質はイムノコンジュゲートである。前記方法の一実施態様では、該方法は、組換え融合タンパク質を宿主細胞から回収することを更に含む。前記方法の一実施態様では、該方法は、宿主細胞の封入体を単離し、封入体を可溶化することを更に含む。前記方法の一実施態様では、該方法は、可溶化された封入体から材料を再生する工程を更に含む。前記方法の一実施態様では、宿主細胞は細菌細胞である。前記方法の一実施態様では、宿主細胞は大腸菌細胞である。
一態様では、本発明は、本発明の抗体と薬学的に許容可能な担体とを含有する薬学的製剤を提供する。一実施態様では、前記薬学的組成物は更なる治療剤を更に含有する。一実施態様では、前記更なる治療剤は化学療法剤である。
一態様では、本発明は、本発明の組換え融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含有する薬学的製剤を提供する。一実施態様では、前記薬学的組成物は更なる治療剤を更に含有する。一実施態様では、前記更なる治療剤は化学療法剤である。
一態様では、本発明は、本発明のイムノコンジュゲートと薬学的に許容可能な担体とを含有する薬学的製剤を提供する。一実施態様では、前記薬学的組成物は更なる治療剤を更に含有する。一実施態様では、前記更なる治療剤は化学療法剤である。
一態様では、本発明は、医薬として使用される本発明の抗体を提供する。一態様では、本発明は、がんの治療において使用される本発明の抗体を提供する。
一態様では、本発明は、医薬の製造における本発明の抗体の使用を提供する。
一態様では、本発明は、本発明の抗体の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法を提供する。一実施態様では、前記方法は、個体に更なる治療剤を投与することを更に含む。一実施態様では、前記更なる治療剤は化学療法剤である。
一態様では、本発明は、医薬として使用される本発明の組換え融合タンパク質を提供する。一態様では、本発明は、がんの治療において使用される本発明の組換え融合タンパク質を提供する。
一態様では、本発明は、医薬の製造における本発明の組換え融合タンパク質の使用を提供する。一実施態様では、医薬はがんの治療のためのものである。
一態様では、本発明は、本発明の組換え融合タンパク質の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法を提供する。一実施態様では、前記方法は、個体に更なる治療剤を投与することを更に含む。一実施態様では、前記更なる治療剤は化学療法剤である。
一態様では、本発明は、医薬として使用される本発明のイムノコンジュゲートを提供する。一態様では、本発明は、がんの治療に使用される本発明のイムノコンジュゲートを提供する。
一態様では、本発明は、医薬の製造における本発明のイムノコンジュゲートの使用を提供する。一実施態様では、医薬はがんの治療のためのものである。
一態様では、本発明は、本発明のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法を提供する。一実施態様では、前記方法は、個体に更なる治療剤を投与することを更に含む。一実施態様では、前記更なる治療剤は化学療法剤である。
一態様では、本発明は、ヒトＴＰＢＧとミニブタＴＰＢＧに結合する抗体をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、ヒトＴＰＢＧとミニブタＴＰＢＧに対する試験抗体の結合を試験する工程と、ヒトＴＰＢＧとミニブタＴＰＢＧに結合する抗体を選択する工程を含む。
一実施態様では、本方法は、治療的適用のための抗体のスクリーニングのためのものである。
一実施態様では、本方法は、一価形態の試験抗体の結合を試験する工程を含む。
一実施態様では、本方法は、ｐＨ５．５とｐＨ７．２でのヒトＴＰＢＧへの試験抗体の結合を試験する工程と、両ｐＨ（ｐＨ５．５とｐＨ７．２）でヒトＴＰＢＧと結合する抗体を選択する工程を含む。
一態様では、本発明は、本発明のスクリーニング方法によって得られる抗体を提供する。
一態様では、本発明は、ヒトＴＰＢＧとミニブタＴＰＢＧに結合する抗体を作製する方法であって、（ａ）ヒトＴＰＢＧ又はヒトＴＢＰＧ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）で動物に免疫する工程、（ｂ）動物の血液からヒトＴＰＢＧに特異的なＢ細胞を単離する工程、（ｃ）単離されたＢ細胞によって産生された抗体の可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）のアミノ酸配列を同定する工程、（ｄ）同定された可変ドメインを含む抗体を提供する工程、（ｅ）提供された抗体のヒトＴＰＢＧとミニブタＴＰＢＧへの結合を試験する工程、及び（ｆ）ヒトＴＰＢＧとミニブタＴＰＢＧに結合する抗体を選択する工程を含む方法を提供する。
一実施態様では、本方法は、治療的適用のための抗体を作製するためのものである。一実施態様では、動物はげっ歯類である。一実施態様では、動物はウサギである。
一実施態様では、本方法は、一価形態の提供された抗体の結合を試験する工程を含む。
一実施態様では、本方法は、ｐＨ５．５とｐＨ７．２でのヒトＴＰＢＧへの提供された抗体の結合を試験する工程と、両ｐＨ（ｐＨ５．５とｐＨ７．２）でヒトＴＰＢＧと結合する抗体を選択する工程を含む。
一態様では、本発明は、本発明の抗ＴＰＢＧ抗体を作製する方法によって得られる抗体を提供する。
本発明は、ヒト及びミニブタ種のＴＰＢＧ間で交差反応性であり、よってミニブタ種における研究に使用することができる（従って、サルの研究の必要性を回避）ので臨床開発に適している、ＴＰＢＧに結合する抗体を提供する。加えて、ＴＰＢＧに結合する本発明の抗体は、それらの標的、すなわちヒトＴＰＢＧに、中性並びに僅かに酸性のｐＨの両方で結合し、それによって腫瘍の僅かに酸性の微小環境下での抗原結合を保証し、これはがん治療における抗体の治療的適用に有利である。加えて、本発明の抗体は、幾つかのタイプのがん、例えばヒト非小細胞肺がんの治療に優れた効力を示す。
カニクイザルとミニブタの組織のｍＲＮＡ発現プロファイル（ＲＰＫＭ＝１００万マッピングされたリード当たりの標的のキロベース当たりに割り当てられたリード）（実施例１）。 異なるｐＨ値での細胞表面に発現されたヒトＴＰＢＧへの異なるＴＰＢＧ抗体（Ｆａｂ断片：Ｆａｂ１＝Ｈ８；Ｆａｂ２＝０９１；Ｆａｂ３＝０５１；Ｆａｂ４＝０９７）の結合（実施例１７）。ＴＰＢＧを安定して発現するヒト細胞株ＳＷ６２０クローン４を様々なｐＨで異なったＦａｂと共にインキュベートした。蛍光色素に結合させた二次抗体とのインキュベーションの際に、シグナルをフローサイトメトリーによって検出した。ベースライン補正平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 腫瘍細胞株ＭＣＦ７において評価した抗ＴＰＢＧ抗体（Ｆａｂ断片：四角＝Ｈ８；三角＝０９７；菱形＝０５１；円＝０９１）の内部移行（実施例１８）。ｙ軸は、細胞表面に結合したＦａｂのシグナル消失を時間の関数として示す。 ミニブタ−ＴＰＢＧ発現ＣＨＯ細胞への抗ＴＰＢＧ抗体（Ｆａｂ断片：白丸＝０５１；四角＝９１；三角＝９７；円＝Ｈ８）の細胞結合（実施例１９）。ベースライン補正平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 ＣＨＯ−Ｋ１の細胞表面に安定に提示されたヒトＴＰＢＧへの抗ＴＰＢＧ抗体（Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質；Ｆａｂ断片：四角＝Ｈ８；三角＝０９７；菱形＝０５１；円＝０９１）の細胞結合（実施例２０）。Ｆａｂ−ＰＥの希釈系列を細胞に添加した。二次蛍光標識抗体で細胞結合を可視化し、フローサイトメトリーで分析した。ベースライン補正平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 ＣＨＯ−Ｋ１の細胞表面に安定に提示されたミニブタＴＰＢＧへの抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質；抗体由来のＦａｂ断片：四角＝Ｈ８；三角＝０９７；菱形＝０５１；円＝０９１）の細胞結合（実施例２０）。Ｆａｂ−ＰＥの希釈系列を細胞に添加した。二次蛍光標識抗体で細胞結合を可視化し、フローサイトメトリーで分析した。 ヒトＴＰＢＧを一過性に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（ソルターゼカップリングによってＰＥに結合させたＦａｂ：四角＝Ｈ８；三角＝０９７；菱形＝０５１；円＝０９１）の細胞傷害性（実施例２１）。 ミニブタＴＰＢＧを一過性に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（ソルターゼカップリングによってＰＥに結合させたＦａｂ：四角＝Ｈ８；三角＝０９７；菱形＝０５１；円＝０９１）の細胞傷害性（実施例２１）。 ヒト及びミニブタ−ＴＰＢＧ発現ＣＨＯ細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体（抗カッパ鎖抗体−ＰＥ融合タンパク質が結合した抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ抗体、従来技術の抗体Ｈ８、Ａ１、Ａ２、Ａ３並びに本発明の抗体０５１、０９１及び０９７）によって媒介される細胞傷害性（実施例２２）。生存率は、ＡＴＰ放出アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）によって決定し、緩衝液で処理した対照細胞との関連で設定した。図６Ａ：ヒトＴＰＢＧで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１。図の凡例：垂直なダッシュ記号＝非特異的対照；星印＝０５１；白抜き三角＝０９１；十字形＝０９７；プラス＝Ｈ８。 ヒトＴＰＢＧで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１。図の凡例：プラス＝Ｈ８；白抜き三角＝Ａ１；白抜き菱形＝Ａ２；白丸＝Ａ３。 ミニブタＴＰＢＧで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１。図の凡例：左向き三角＝非特異的対照；星印＝０５１；下向き三角＝０９１；十字形＝０９７；プラス＝Ｈ８。 ミニブタＴＰＢＧで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１。図の凡例：プラス＝Ｈ８；白抜き三角＝Ａ１；白抜き菱形＝Ａ２；白丸＝Ａ３。 ヒト及びミニブタ−ＴＰＢＧ発現ＣＨＯ−Ｋ１に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質：星印＝非特異的対照；四角＝Ｈ８；菱形＝０５１；円＝０９１；三角＝０９７）の細胞傷害性（実施例２３）。生存率は、ＡＴＰ放出アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）によって決定した。図７Ａ：全長ヒトＴＰＢＧで安定にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞をイムノコンジュゲートと共にインキュベートした。 全長ミニブタＴＰＢＧで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞をイムノコンジュゲートと共にインキュベートした。 親ＣＨＯ−Ｋ１細胞をイムノコンジュゲートと共にインキュベートした。 ヒトＴＰＢＧ発現ＭＣＦ７細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）の細胞結合（実施例２４）。結合はフローサイトメトリーによって決定した（ｙ軸：平均蛍光強度＝ＭＦＩ）。ベースライン補正平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 ヒトＴＰＢＧ発現ＭＣＦ７細胞に対する本発明の抗ＴＰＢＧ抗体（抗κ鎖抗体−ＰＥ融合タンパク質が結合した抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ抗体）によって媒介される細胞傷害性（実施例２５）。Ｆａｂ断片を抗κ結合Ｆａｂ−ＰＥ（シュードモナス外毒素）と共にインキュベートした。ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ７をＦａｂ：Ｆａｂ−ＰＥコンストラクトの複合体と共にインキュベートした。生存率は、７２時間後にＡＴＰ放出アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）によって決定した。図の凡例：星印＝非特異的対照；四角＝Ｈ８；菱形＝０５１；円＝０９１；三角＝０９７。 ヒトＴＰＢＧ発現ＭＣＦ７細胞に対する従来技術の抗ＴＰＢＧ抗体Ｈ８、Ａ１、Ａ２及びＡ３（抗κ鎖抗体−ＰＥ融合タンパク質が結合した抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ抗体）によって媒介される細胞傷害性（実施例２５）。Ｆａｂ断片を抗κ結合Ｆａｂ−ＰＥ（シュードモナス外毒素）と共にインキュベートした。ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ７をＦａｂ：Ｆａｂ−ＰＥコンストラクトの複合体と共にインキュベートした。生存率は、７２時間後にＡＴＰ放出アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）によって決定した。図の凡例：星印＝非特異的対照；四角＝Ｈ８；三角＝Ａ１；菱形＝Ａ２；円＝Ａ３。 ヒトＴＰＢＧ発現ＭＣＦ７細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（ソルターゼカップリングによってＰＥ断片に結合させたＦａｂ）の細胞傷害性（実施例２６）。ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ７をソルターゼカップリングＦａｂ−ＰＥコンストラクトと共にインキュベートした。生存率は、７２時間後にＡＴＰ放出アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）によって決定した。図の凡例：星印＝非特異的対照；四角＝Ｈ８；菱形＝０５１；円＝０９１；三角＝０９７。 ヒトＴＰＢＧ発現Ｈ１９７５非小細胞肺がん細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体（抗κ鎖抗体−ＰＥ融合タンパク質が結合する抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ抗体）によって媒介される細胞傷害性（実施例２７）。Ｈ１９７５細胞をＦａｂ：Ｆａｂ−ＰＥコンストラクトの複合体と共にインキュベートした。生存率は、７２時間後にＡＴＰ放出アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）によって決定した。 ヒトＴＰＢＧ発現Ｈ１９７５非小細胞肺がん細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）の細胞傷害性（実施例２８）。ヒト腫瘍細胞株Ｈ１９７５をＦａｂ−ＰＥ融合タンパク質と共にインキュベートした。生存率は、７２時間後にＡＴＰ放出アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）によって決定した。図の凡例：星印＝非特異的対照；四角＝Ｈ８；菱形＝０５１；円＝０９１；三角＝０９７ ヒトＴＰＢＧ発現Ｈ１９７５非小細胞肺がん細胞に適用された抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）の時間経過増殖アッセイ（実施例２９）。ヒト腫瘍細胞株Ｈ１９７５を、各Ｆａｂ−ＰＥコンストラクトと共に異なる時間インキュベートした。生存率は、７２時間後にＡＴＰ放出アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）によって決定した。図１４Ａ：Ｆａｂ−ＰＥと共に連続インキュベーション。 Ｆａｂ−ＰＥと共に６０分間のインキュベーション。 Ｆａｂ−ＰＥを共に３０分間のインキュベーション。 Ｆａｂ−ＰＥを共に１０分間のインキュベーション。図の凡例：星印＝非特異的対照；四角＝Ｈ８；菱形＝０５１；円＝０９１；三角＝０９７。 ヒトＴＰＢＧ発現ヒト非小細胞肺がんＨ１９７５細胞異種移植片に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）のインビボ抗腫瘍効力（実施例３０）。平均腫瘍増殖をｙ軸上に示す。偏差は、平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示される。図の凡例（抗ＴＰＢＧ抗体）：白抜き菱形＝ビヒクル；ダッシュ＝Ｈ８；三角＝０５１；四角＝０９１；円＝０９７。 ヒトＴＰＢＧ発現ヒト胃がんＮＣＩ−Ｎ８７細胞異種移植片に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）のインビボ抗腫瘍効力（実施例３１）。平均腫瘍増殖をｙ軸上に示す。偏差は、平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示される。図の凡例（抗ＴＰＢＧ抗体）：白抜き菱形＝ビヒクル；ダッシュ＝Ｈ８；三角＝０５１；四角＝０９１；円＝０９７。 抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）と接触させたＢｘＰＣ３／ｌｕｃ細胞を使用したタンパク質合成アッセイ（実施例３２）。生存率は、ルシフェラーゼアッセイによって決定し、緩衝液処理対照細胞との関連で設定した。ルシフェラーゼレポーターで安定にトランスフェクトしたＢｘＰＣ−３を処理した。図１７Ａ：本発明の抗体０５１、０９１又は０９７を含むサンドイッチコンストラクトとの従来技術抗体Ｈ８を含むイムノコンジュゲートの比較。 従来技術抗体を含むイムノコンジュゲートの比較。図の凡例：四角＝Ｆａｂ（Ｈ８）；三角＝Ｆａｂ（Ａ１）；菱形＝Ｆａｂ（Ａ２）；円＝Ｆａｂ（Ａ３）。 ｐＨ５．５とｐＨ７．４でのヒトＴＰＢＧに対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）の結合（会合解離プロット、実施例３５）。図の凡例：イムノコンジュゲートに含まれるＦａｂ断片が示される；円はｐＨ５．５での各イムノコンジュゲートの結合挙動を示し、四角はｐＨ７．４での各イムノコンジュゲートの結合挙動を示す。 ミニブタＴＰＢＧへの抗ＴＰＢＧ抗体（Ｆａｂ断片）の結合。
Ｉ．定義
ここでの目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はそれはアミノ酸配列変化を含んでいてもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる一又は複数の改変を一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）に持つ抗体を意味する。
「抗ＴＰＢＧ抗体」及び「ＴＰＢＧに結合する抗体」という用語は、ＴＰＢＧを標的とする診断及び／又は治療薬剤として抗体が有用であるのに十分な親和性でＴＰＢＧに結合することができる抗体を意味する。所定の実施態様では、ＴＰＢＧに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。所定の実施態様では、抗ＴＰＢＧ抗体は、様々な種由来のＴＰＢＧ間で保存されているＴＰＢＧのエピトープに結合する。
「試験抗体」は、ＴＰＢＧに対するその結合特性に関して未知の特性を有する抗体を意味する。
ここでの「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む、様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する抗体を指し、逆に参照抗体は、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する。例示的な競合アッセイはここに提供される。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の起源又は種に由来する一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
ここで使用される「細胞傷害性剤」という用語は、細胞機能を抑制もしくは防止し、及び／又は細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性剤には、限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；毒素、例えば小分子毒素又は細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又は変異体を含む）；及び以下に開示される様々な抗腫瘍又は抗がん剤が含まれる。
「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプで変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション；並びにＢ細胞活性化が含まれる。
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な投薬量及び期間での有効な量を指す。
ここでの「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していても存在していなくともよい。ここで特に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat, E.A.等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載のように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に四つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般にＶＨ（又はＶＬ）の次の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、ここでは互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又はここで定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには、初代形質転換細胞と、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全には同一ではない場合があるが、変異を含みうる。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされ又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異型子孫がここには含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般には、配列のサブグループは、Kabat, E.A.等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔ等にあるサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔ等にあるサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合によっては、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
ここで使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変である抗体可変ドメインの領域（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）及び／又は構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、抗体は、ＶＨに三つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに三つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の六つのＨＶＲを含む。ここでの例示的なＨＶＲには、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Chothia及びLesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（MacCallum等 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ
が含まれる。
特に示されない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、ここでは上掲のＫａｂａｔ等に従って番号付けされる。
「イムノコンジュゲート」は、限定されないが細胞傷害性剤を含む、一又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
「個体」又は「対象」は哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により定量して、９５％又は９９％を上回る純度まで精製される。抗体純度の評価法の概説については、例えばFlatman, S.等, J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照のこと。
「単離された」核酸とは、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は染色体外に存在しているか又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
「抗ＴＰＢＧ抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一又は複数の核酸分子を指し、単一のベクター内又は別々のベクター内のそのような核酸分子と、宿主細胞内の一又は複数の位置に存在しているそのような核酸分子を含む。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造中に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異抗体を除き、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対するものである。従って、「モノクローナル」との修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法はここに記載されている。
「天然抗体」は、天然に生じる様々な構造を持つ免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している二つの同一の軽鎖と二つの同一の重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、それに三つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、それに定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、二つの種類のうちの一つに割り当てることができる。
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に常套的に含められ、適応症、用法、用量、投与方法、併用療法、禁忌についての情報及び／又はそのような治療製品の使用に関する注意事項を含む説明書のことを指すために使用される。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないこととしたときの、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のアラインメントは、当該技術分野における技量の範囲内にある様々な方法で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的では、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して作成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社によって著作され、そのソースコードは米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ジェネンテック社（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、又はそれとの、又はそれに対するアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、又はそれとの、又はそれに対するアミノ酸配列同一性％を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａということもできる）は、次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡ及びＢのアラインメントにおいて同一の一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢ中のアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくないことが理解されるであろう。特に断らない限り、ここで使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で記載した通りに得られる。
「薬学的製剤」という用語は、その中に含まれている活性成分の生物学的活性が有効になることを可能にする形態であり、かつ製剤が投与される対象に許容できない程度に毒性のある更なる成分を含んでいない調製物を指す。
「薬学的に許容可能な担体」は、活性成分以外の薬学的製剤中の成分であって、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容可能な担体は、限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定剤、又は保存料を含む。
ここで使用される「ＴＰＢＧ」という用語は、他に断りがない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＴＰＢＧを指す。この用語は、「全長」の未処理ＴＰＢＧ並びに細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のＴＰＢＧを包含する。この用語はまたＴＰＢＧの天然に生じる変異体、例えば、スプライスバリアント又はアレルバリアントを包含する。例示的ヒトＴＰＢＧのアミノ酸配列は、配列番号：１に示される。例示的なミニブタＴＰＢＧのアミノ酸配列は、配列番号：２に示される。
ここで使用される場合、「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」など、その文法上の派生語）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床的病理の過程において実施されうる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発の防止、症状の軽減、疾患の直接的又は間接的な病理的帰結の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後を含む。幾つかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるか、又は疾患の進行を遅くするために使用される。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、各ドメインが四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む類似構造を有する。（例えば、Kindt, T.J.等 Kuby Immunology, 6版, W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), p91を参照）。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分でありうる。更に、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体に由来するＶＨ又はＶＬドメインを使用しそれぞれ相補的なＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングして、単離されうる。例えば、Portolano, S.等, J. Immunol. 150 (1993) 880-887；Clackson, T.等, Nature 352 (1991) 624-628)を参照。
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を増やすことができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノム中に組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが作用可能に連結されている核酸の発現をもたらすことができる。そのようなベクターはここでは「発現ベクター」と称される。
ここで使用される「がん」という用語には、固形がんと血液がんの双方、例えばリンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性（bronchioloalviolar）細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫で、上記がんの何れかの難治型を含み、又は上記がんの一又は複数の組み合わせが含まれる。
シュードモナス外毒素Ａ：天然野生型シュードモナス外毒素Ａは、緑膿菌（シュードモナス・エルジノーサ）によって分泌され、配列番号：５２に示される６１３個のアミノ酸配列を有し、また米国特許第５６０２０９５号に開示されている６６ｋＤの細菌性毒素である。この配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１１４３９．２（ｇｉ：１２２３１０４３）の最初の２５個のアミノ酸として示される、天然シグナルペプチドなしで示される。
天然タンパク質は、３つの主要な構造ドメインを有する。Ｎ末端ドメインＩは、構造的に隣接しているが、一次アミノ酸配列において分離している２つのサブドメインＩａ（アミノ酸１〜２５２）及びＩｂ（アミノ酸３６５〜３９９）を含む。
ドメインＩ、特にドメインＩａは細胞結合ドメインである。ドメインＩｂの機能は不明確なままである。ドメインＩはＢサブユニットの主要構成要素を形成する。本発明の実施においては、天然ドメインＩａ配列が取り除かれ又は破壊され、結果としてＬＲＰ１又はＬＲＰ１Ｂに結合することができないＰＥの形態が非常に好ましい。
ドメインＩＩ（アミノ酸２５３〜３６４）はサイトゾルへの転座を媒介すると報告されているが、これには議論の余地が残っている（Weldon及びPastan 2011 FEBS J 278(23):4683-4700）。
ドメインＩＩＩ（アミノ酸４００〜６１３）は、伸長因子２のＡＤＰリボシル化を媒介する。ドメインＩｂとドメインＩＩＩとの間の構造境界は完全には解決されていない。国際公開第２０１３／０４０１４１号によれば、それは残基３９９と４００の間にあるが、Ｗｅｌｄｏｎ及びＰａｓｔａｎ２０１１はそれを残基４０４と４０５の間に置いている。しかし、完全な触媒活性はドメインＩｂの一部とドメインＩＩＩを必要とする。従って、その天然毒素の機能的ドメインＩＩＩは残基３９５から開始すると定義される。アミノ酸６０２〜６１３はＮＡＤ（＋）−リボシルトランスフェラーゼ活性には不必要であることが見出されているが、天然配列のアミノ酸６０９〜６１３は細胞傷害活性には必要とされる。これらは小胞体局在化配列を形成する（国際公開第９１／０９９４８号，Chaudhary等 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 308-312，Seetharam等 1991 J. Biol. Chem. 266: 17376-17381）。細胞傷害性は、天然ＥＲ局在化配列を一又は複数の他のＥＲ局在化配列で置換することによって維持され又は増強されうる。従って、天然ＰＥの機能的ドメインＩＩＩは、残基３９５〜６０１からなると考えられる。
標的化された細胞毒素において使用するための天然ＰＥ分子の変異体及び改良体を開示する広範な研究が公開されている。ここで使用される「シュードモナス外毒素Ａ」、「シュードモナス外毒素」、「外毒素Ａ鎖（緑膿菌（シュードモナス・エルジノーサ）由来）」及び「ＰＥ」という用語は、細胞傷害活性を保持する天然ＰＥのこれらの変異体及び他の変異体並びに改良体を包含することを意図する。特に、「シュードモナス外毒素Ａ」、「シュードモナス外毒素」及び「ＰＥ」という用語は、国際公開第８８／０２４０１Ａ１号、国際公開第９０／１２５９２Ａ１号、国際公開第９１／０９９４９号、国際公開第９１／０９９６５号、国際公開第９３／２５６９０号、国際公開第９７／１３５２９号、国際公開第９８／２０１３５号、国際公開第２００５／０５２００６号、国際公開第２００７／０１６１５０号、国際公開第２００７／０３１７４１号、国際公開第２００９／３２９５４号、国際公開第２０１１／３２０２２号、国際公開第２０１２／１５４５３０号、国際公開第２０１２／１７０６１７号、国際公開第２０１３／４０１４１号、Mazor R等 PNAS 111 (2014) 8571-8576、及びAlewine C等, Mol Cancer Ther. (2014) 2653-61及び国際公開第２０１５／０５１１９９号に開示された変異体及び改良体を含むことが特に意図される。本発明での使用に適しており、「シュードモナス外毒素Ａ」、「シュードモナス外毒素」及び「ＰＥ」という用語内に限定されることなく含められるシュードモナス外毒素Ａ／ＰＥの変異体及び改良体を例証する目的でこれら全ての刊行物の全体がここに援用され、国際公開第２００５／０５２００６号、国際公開第２００７／０１６１５０号、国際公開第２００７／０３１７４１号、国際公開第２００９／３２９５４号、国際公開第２０１１／３２０２２号、国際公開第２０１２／１５４５３０号、国際公開第２０１２／１７０６１７号、及び国際公開第２０１３／４０１４１号に開示された変異体及び改良体が好ましく、国際公開第２００９／３２９５４号、国際公開第２０１１／３２０２２号、国際公開第２０１２／１５４５３０号、国際公開第２０１２／１７０６１７号、国際公開第２０１３／４０１４１号、Mazor R等 PNAS 111 (2014) 8571-8576、及びAlewine C等 Mol Cancer Ther. (2014) 2653-61及び国際公開第２０１５／０５１１９９号に開示されているものが特に好ましい。
ＰＥの更なる変異体及び改良体が将来開発されることが予想される。本発明はＰＥの細胞傷害作用に対する耐性に関するものであるため、細胞傷害活性を保持するＰＥのそのような将来の変異体及び改良体もまた本発明の実施に使用することができ、従って「シュードモナス外毒素Ａ」及び「ＰＥ」という用語内に含まれる。
一般に、ＰＥ毒素は、配列番号：５２の残基３９５〜６０１の全長にわたって少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するＰＥ機能性ドメインＩＩＩを含むポリペプチド配列を有し、ＰＥ毒素は、真核（好ましくは哺乳動物）細胞に導入された場合に細胞傷害活性を有する。ＰＥの好ましい形態は、（１）配列番号：５２の残基３９５〜６０１の全長にわたって少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつＮＡＤ（＋）−ジフタミドＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を有するＰＥ機能性ドメインＩＩＩと、（２）少なくとも一つの小胞体局在化配列を含む。ＰＥが融合ポリペプチドとして細胞結合剤に結合される実施態様では、ＰＥは、好ましくは、（３）切断可能リンカー配列、例えば標的細胞への取り込み後に細胞結合剤からのＰＥ機能ドメインＩＩＩの切断を可能にするフューリン切断可能配列（ＦＣＳ）をまた含む。
切断可能リンカー（例えばＦＣＳ）は一般にＰＥ機能ドメインＩＩＩのＮ末端側にあるであろう。
標的細胞への取り込み後に細胞結合剤からのＰＥの切断を可能にするならば、他の切断可能リンカーを使用してもよい。更に、再び標的細胞への取り込み後にＰＥを細胞結合剤から分離させることができるならば、ＰＥを細胞結合剤に結合させる他の手段も考えられる。例えば、細胞結合剤を、ＰＥに非共有結合的に連結させてもよく、又は還元条件下でＰＥ部分の放出を可能にするジスルフィド結合によって連結させてもよく、又はイムノコンジュゲート生産の分野で知られている他のコンジュゲーション化学によって連結させてもよい。
本発明に従って使用されるＰＥは、一般に、機能的細胞結合ドメインＩを欠いているであろう。
ＰＥに関する研究の多くは、標的療法において使用するのに不必要であり、及び／又は不利である天然配列部分を除去することに焦点を当てている。例えば、Ｂ（受容体結合）サブユニットを別の細胞結合剤で置換することにより、分子の非特異的毒性が減少した。不必要な配列の更なる除去は、免疫原性を低下させた。これは、特に、ＰＥの次の切断型の開発をもたらした：ＰＥ４０、ＰＥ３５、ＰＥ３８、ＰＥ３８ＱＱＲ、ＰＥ−ＬＲ及びＰＥ２４。ＰＥ４０はＰＥの切断型誘導体である（Pai等 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3358-62及びKondo等 1988 J. Biol. Chem. 263:9470-9475）。配列番号：５２を参照して定義される場合、ＰＥ３５は、アミノ酸残基１〜２７９が欠失されたＰＥの３５ｋＤのカルボキシル末端断片であり、分子は２８０位のＭｅｔで始まり、ＰＥのアミノ酸２８１〜３６４及び３８１〜６１３が続く。ＰＥ３５及びＰＥ４０は、例えば、米国特許第５６０２０９５号、米国特許第４８９２８２７号、国際公開第９３／２５６９０号及び国際公開第８８／０２４０１号に開示されており、その各々は出典明示によりその全体がここに援用される。
ＰＥ３８は、ＰＥの転移及びＡＤＰリボシル化ドメインを含むが、細胞結合部分は含まない（Hwang等 1987 Cell 48:129-136）。ＰＥ３８（配列番号：５３）は、配列番号：５２のアミノ酸２５３〜３６４及び３８１〜６１３からなる切断型ＰＥプロタンパク質であり、細胞内でのプロセシングの際にその細胞傷害性形態に活性化される（その全体が出典明示によりここに援用される米国特許第５６０８０３９号、及びPastan等 1997 Biochim. Biophys. Acta, 1333:C1-C6を参照のこと）。ＰＥ３８ＱＲは、抗体へのコンジュゲーションを可能にする、ドメインＩＩＩの５９０、６０６及び６１３位のリジンの変異を有するＰＥ３８の変異体である。
ＰＥ−ＬＲは、配列番号：５２のアミノ酸残基２７４〜２８４（ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ（配列番号：５４））に対応するフューリン切断可能配列（ＦＣＳ）以外のドメインＩＩの欠失とドメインＩｂのアミノ酸残基３６５〜３９４の欠失を含む。従って、ＰＥ−ＬＲは、配列番号：５２のアミノ酸残基２７４〜２８４及び３９５〜６１３を含む。ＰＥ−ＬＲは、国際公開第２００９／０３２９５４号及びWeldon等 2009 Blood 113:3792-3800に記載されており、これらはそれぞれその全体が出典明示によりここに援用される。
国際公開第２０１２／１５４５３０号は、ＦＣＳとＰＥ機能ドメインＩＩＩの間のグリシン及びセリンからそれぞれ独立して選択される３〜８アミノ酸の短い可撓性リンカーの付加が、フューリンによる結合を破壊することなくＰＥ−ＬＲ分子の細胞傷害性を改善することを記載している。例示的なリンカーはＧＧＳ及びＧＧＳＧＧＳ（配列番号：５５）である。
他の研究では、ＰＥの免疫原性を更に低下させることが探索されている。
国際公開第２０１２／１５４５３０号は、ＰＥドメインＩＩＩ内の次のアミノ酸残基における置換が免疫原性を低下させることを報告している：
好ましい置換はグリシン、セリン又はアラニン残基とのものである。
国際公開第２０１２／１７０６１７号は、これらの残基における置換がＢ細胞エピトープの免疫原性を低下させ得、残基Ｒ４２７、Ｒ４５８、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５及びＦ５３８の一又は複数での置換、特にアラニンでの置換が好ましいことを報告している。
国際公開第２０１３／０４０１４１号は、次の更なるアミノ酸残基における置換が、ＰＥドメインＩＩＩ内のＢ細胞エピトープの免疫原性を低下させうることを報告している：
好ましい置換は、グリシン、セリン、アラニン又はグルタミン残基でのものである。
国際公開第２０１２／１７０６１７号は、次の残基における置換がＰＥドメインＩＩＩ内のＴ細胞エピトープの免疫原性を低下させうることを報告している：
好ましい置換は、残基Ｄ４６３、Ｙ４８１及びＬ５１６の一又は複数におけるものであり、Ｂ細胞エピトープの免疫原性をまた低下させうる。好ましい置換は、グリシン、セリン、アラニン又はグルタミン残基でのものである。
国際公開第２０１２／１７０６１７号はまた、次のアミノ酸残基における置換が、ＰＥドメインＩＩ内のＴ細胞エピトープの免疫原性を低下させうることを報告している：
好ましい置換は、グリシン、セリン、アラニン又はグルタミン残基でのものである。
国際公開第２０１２／１７０６１７号は次のアミノ酸残基における置換が、ＰＥドメインＩＩ内のＢ細胞エピトープの免疫原性を低下させうることをまた報告している：
国際公開第２０１２／１７０６１７はまた特に好ましい置換の組み合わせが、Ｄ４６３Ａ／Ｒ４２７Ａ／Ｒ４５８Ａ／Ｒ４６７Ａ／Ｒ４９０Ａ／Ｒ５０５Ａ／Ｒ５３８Ａであることを報告している。
Alewine等 2014 Mol. Cancer Ther. 13(11): 2653-61は、Ｂ細胞免疫原性を低下させるＰＥドメインＩＩＩ内の７つの点変異の同様の組合せ、すなわち、Ｒ４５７Ａ／Ｒ４５６Ａ／Ｄ４６３Ａ／Ｒ４６７Ａ／Ｒ４９０Ａ／Ｒ５０５Ａ／Ｒ５３８Ａ（つまり、Ｒ４５８Ａの代わりにＲ４５６Ａを伴う）を開示している。
Mazor等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111(23): 8571-8576は、ＰＥドメインＩＩＩ内の６つの点変異の組み合わせが、殆どのＰＥドメインＩＩの欠失と共に、Ｔ細胞応答を９３％減少させたことを開示している。変異は、Ｒ４２７Ａ／Ｆ４４３Ａ／Ｌ４７７Ｈ／Ｒ４９４Ａ／Ｒ５０５Ａ／Ｌ５５２Ｅである。
従って、ＰＥ機能ドメインＩＩＩは、次の部位の何れか一つ又は二つ以上の任意の組み合わせに変異を含みうる：
好ましくは、変異は配列番号：５２のアミノ酸３９５〜６１３の非変異配列と比較して免疫原性を低下させる。
ＰＥはドメインＩＩの一部又は全部を含んでいる限り、それは次の部位の何れか一つ又は二つ以上の任意の組み合わせに変異を含みうる：
好ましくは、変異はドメインＩＩ由来の非変異配列と比較して免疫原性を低下させる。
特に、ＦＣＳが、アミノ酸２７４〜２８４（ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ，配列番号：５４）からなるＰＥの天然フューリン切断可能配列に由来する実施態様では、特に天然ＰＥ配列由来の隣接配列がＦＣＳの下流に含まれる場合、Ｅ２８２残基の置換を含みうる。天然ＰＥ配列由来の隣接配列が含まれない実施態様（例えば、ＦＣＳがドメインＩＩＩに直接又は非天然リンカー配列を介して融合されているＰＥ−ＬＲ）では、天然配列由来のエピトープが、Ｅ２８２残基における変異が有利ではないようにとにかく破壊されうる。
Mazor等 2014 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111(23): 8571-8576、Liu等 2012 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(29): 11782-7、Kreitman等 2012 J. Clin. Oncol. 30(15): 1822-8、Pastan等 2011 Leukemia & Lymphoma 52 Suppl 2:87-90、Onda等 2011 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(14): 5742-7、Hansen等 2010 Journal of Immunotherapy 33(3): 297-304、Kreitman等 2009 Clin Cancer Res. 15:5274-5279、Onda等 2008 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(32): 11311-6、Ho等 2005 Clin. Cancer Res. 11(10): 3814-20、Kreitman等 2000 J Clin Oncol. 18:1622-1636及びRoscoe等 1994 Infection and Immunity 62(11): 5055-65は、全てＰＥの免疫原性を低下させることに関している。
変異体ＰＥ毒素における免疫原性の低下は、Ｔ細胞応答を誘導する変異体配列の能力の低下及び／又はＢ細胞（抗体）応答を誘導する変異体配列の能力の低下、好ましくはその両方を意味しうる。Ｔ細胞免疫原性に対する変異の影響を評価するための技術は、当該技術分野で周知であり、国際公開第２０１２／１７０６１７号の実施例に記載されている。同様に、Ｂ細胞免疫原性に対する変異の影響を評価するための技術は、当該技術分野において周知であり、例えば国際公開第２０１３／０４０１４１号に記載されている。ヒト抗体は、ヒト抗体ライブラリーを使用してファージディスプレイにより、天然ＰＥ配列に対して産生されうる。このような抗体の変異体ＰＥ分子への結合を破壊するＰＥ配列中の変異の能力は、免疫原性の低下を意味している。あるいは、ヒト抗体レパートリーを保有するトランスジェニックマウスにおいて産生されたＰＥ特異的抗体の力価を、天然ＰＥ配列及び変異ＰＥ配列について比較してもよい。
ＰＥ機能ドメインＩＩＩのＣ末端は、残基６０９〜６１３の天然配列、すなわちＲＥＤＬＫ（配列番号：５５）を含みうる。天然ＰＥ配列の任意の他の修飾に加えて、又はその代わりに、ＰＥ機能ドメインＩＩＩは、ＰＲタンパク質を小胞体内に維持する機能又はタンパク質を小胞体中にリサイクルする機能を有する、ＲＥＤＬＫ配列の変異体、又は他の配列を含みうる。そのような配列は、ここでは「小胞体局在化配列」又は「ＥＲ局在化配列」と称される。好ましいＥＲ局在化配列には、ＫＤＥＬ（配列番号：５７）、ＲＥＤＬ（配列番号：５８）、ＲＤＥＬ（配列番号：５９）又はＫＥＤＬＫ（配列番号：６０）などが含まれる。好ましくはＫＤＥＬ、ＲＥＤＬ、ＲＥＤＬＫ、ＲＤＥＬ及びＫＥＤＬＫから独立して選択される、一又は複数の更なるＥＲ局在化配列を、ＰＥポリペプチド配列のＣ末端に付加してもよい。天然ＲＥＤＬＫ配列のＫＤＥＬ、又はＫＤＥＬの２つ又は３つのタンデムリピート（ＫＤＥＬＫＤＥＬ，配列番号６１；ＫＤＥＬＫＤＥＬＫＤＥＬ，配列番号：６２）への置換、あるいは天然ＲＥＤＬＫ配列の後のＫＤＥＬの付加が好ましい。例えば、国際公開第９１／０９９９４９号、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ等１９９１、Ｓｅｅｔｈａｒａｍ等１９９１を参照のこと。
国際公開第９１／０９９４９号は、ＰＥ機能ドメインＩＩＩのＣ末端が、ＮＡＤ（＋）−ジフタミドＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性に必須ではない残基６０２〜６０８の一部又は全部を欠いている場合があることを開示している。
フューリン切断可能配列（ＦＣＳ）：国際公開第２０１２／１５４５３０号に記載されるように、フューリン切断可能配列は、フューリンによって切断可能な任意のポリペプチド配列でありうる。Duckert等 2004, Protein Engineering, Design & Selection 17(1):107-112 （以下、「Ｄｕｃｋｅｒｔ等」）は、その全体が、特にそれが開示するフューリン切断可能配列及びモチーフに関して、出典明示によりここに援用される。Ｄｕｃｋｅｒｔ等は、フューリンは、サブチリシン・ケキシン様プロタンパク質転換酵素と呼ばれる、進化的に保存された二塩基性及び一塩基性の特異的ＣＡ２＋依存性セリンプロテアーゼのファミリーの酵素であることを開示している。１０７頁を参照のこと。「ペアード塩基性アミノ酸切断酵素」、「ＰＡＣＥ」、又はＰＣＳＫ３としても知られるフューリンは、ＰＣＳＫファミリーの幾つかの哺乳動物メンバーの一つであり、幾つかの内在性ヒトタンパク質のプロセシングに関与している。一般に、Thomas 2002 Nat Rev Mol Cell Biol 10:753-66を参照のこと。それは、主にトランスゴルジネットワークに見出される膜結合タンパク質である。ヒトフューリンの配列は１９９０年代初期から知られている。例えば、Hatsuzawa等 1992 J Biol Chem 267: 16094-16099；及びMolloy等 1992 J Biol Chem 267:16396-16402を参照のこと。
最小フューリン切断可能配列は、典型的には、アミノ酸残基の１文字コードで、Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒ（配列番号：６３）であり、第二の「Ｒ」の後で切断が生じる。Ｄｕｃｋｅｒｔ等は、哺乳動物タンパク質、病原性細菌のタンパク質、及びウイルスタンパク質を含むフューリン切断可能配列を有することが文献に報告されている３８のタンパク質の配列について利用可能な情報を要約している。それは、検討された切断モチーフのうちの３１個又は８１％が、ＲＸ−［Ｒ／Ｋ］−Ｒ（配列番号：６４，配列番号６５）コンセンサス配列を有し、その１１個又は２９％がＲ−Ｘ−Ｒ−Ｒ（配列番号：６５）を有し、２０個又は５２％がＲ−Ｘ−Ｋ−Ｒ（配列番号：６４）を有していたことを報告している。切断モチーフのうちの３個は最小切断配列のみを含んでいた。Ｄｕｃｋｅｒｔ等は、モチーフを更に整列させ、切断モチーフ自体及び周囲の残基の両方の各フューリンの各位置に見出される残基を同定した。Ｄｕｃｋｅｒｔ等の図１Ａは、各位置に最も一般的に見出される残基を相対的なサイズで示している。慣例により、フューリン切断部位を取り囲む残基は、切断しやすい結合（典型的には下向きの矢印によって示される）から番号付けされる。Ｎ末端に向かって数えて、基質残基はＰ１、Ｐ２等々と名付けられ、Ｃ末端に向かって数えて、残基はＰ１’、Ｐ２’等々と名付けられる。Rockwell及びThorner 2004 Trends Biochem. Sci. 29:80-87；及びThomas 2002 Nat. Rev. Mol. Cell Biol 3:753-766を参照のこと。従って、慣例に従い、次の配列を使用して、最小切断配列の残基及び周囲の残基を整列させて番号を付けることができる：
ここで、最小フューリン切断可能配列はＰ４−Ｐ１と番号付けされている。フューリンによって切断された３８の配列のＤｕｃｋｅｒｔ等の整列は、様々な位置に存在する残基に依存して許容される変異を同定する。例えば、Ｐ４の残基がＲでなければ、それはＰ２及びＰ６にアルギニン又はリジン残基を持たせることによって補償されうる。１０９頁を参照のこと。
天然ＰＥでは、フューリン切断は、毒素のドメインＩＩに位置するアルギニンリッチのループにおけるアルギニン２７９とグリシン２８０の間で生じる。ＰＥのドメインＩＩにおける天然フューリン切断可能配列を以下に示し（数字は６１３のアミノ酸天然ＰＥ配列中の残基の位置を示す）、整列させて、上記の慣例下でのその番号付けを示す：
国際公開第２０１２／１５４５３０号の基礎となる研究では、次の配列を形成するために位置Ｐ３及びＰ２で置換がなされ、その置換に下線を付した：
この配列は、天然配列よりも速い切断速度を示し、例示的な免疫毒素において使用される場合、天然配列のものとほぼ同じ細胞傷害性を標的細胞にもたらした。
この研究及び以前の研究に基づいて、ＰＥドメインＩＩＩにターゲティング分子を結合させるために使用されるフューリン切断可能配列は、最小フューリン切断可能配列Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒ（ここで、各Ｘは、独立して任意の天然に生じるアミノ酸である）、好ましくはＲＸ−［Ｒ／Ｋ］−Ｒ（ここで、Ｘは任意の天然に生じるアミノ酸であり、［Ｒ／Ｋ］はアルギニン又はリジンの何れかを示す）、又は当該技術分野で知られているか又はＤｕｃｋｅｒｔ等の図１Ａによって許容されている他のフューリン切断可能配列の何れかであり得、但し、Ｐ２’と特定された位置に残基が存在する場合、それはトリプトファンでなければならず、又はトリプトファンでなければバリン又はアラニンであってはならない。例えば、幾つかの実施態様では、配列は、ＲＫＫＲ（配列番号：６８）、ＲＲＲＲ（配列番号：６９）、ＲＫＡＲ（配列番号：７０）、ＳＲＶＡＲＳ（配列番号：７１）、ＴＳＳＲＫＲＲＦＷ（配列番号：７２）、又はＡＳＲＲＫＡＲＳＷ（配列番号：７３）でありうる。
Ｄｕｃｋｅｒｔ等に記載されているように、位置Ｐ２及びＰ６のアルギニン又はリジン残基によって補償される場合、Ｒ（主にバリン）よりも好ましくない残基がＰ４に使用され得、従ってＰ２、Ｐ４及びＰ６の３つの残基の少なくとも２つが塩基性である。よって、幾つかの実施態様では、フューリン切断可能配列は、ＲＲＶＫＫＲＦＷ（配列番号：７４）、ＲＮＶＶＲＲＤＷ（配列番号：７５）、又はＴＲＡＶＲＲＲＳＷ（配列番号：７６）である。位置ＰＩの残基は、天然配列中に存在するアルギニン、又はリジンでありうる。よって、リジンは、例えば上に記載した任意の配列中の位置ＰＩでアルギニンと置き換えることができる。
幾つかの実施態様では、フューリン切断可能配列は、最小フューリン切断可能配列を含み、フューリンによって切断可能である限り、ＰＥの天然のフューリン切断可能配列：Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ−Ｑ−Ｌ（配列番号：６６）又は天然配列の切断型を含む。よって、幾つかの実施態様では、フューリン切断可能配列は、ＲＱＰＲ（配列番号：７７）、ＲＨＲＱＰＲＧＷ（配列番号：７８）、ＲＨＲＱＰＲＧＷＥ（配列番号：７９）、ＨＲＱＰＲＧＷＥＱ（配列番号：８０）、又はＲＱＰＲＧＷＥ（配列番号：８１）でありうる。幾つかの実施態様では、配列は、最小フューリン切断可能配列を含み、フューリンによって切断可能である限り、ＲＨＲＳＫＲＧＷＥＱＬ（配列番号：６７）又はこの配列の切断型である。よって、幾つかの実施態様では、フューリン切断可能配列は、ＲＳＫＲ（配列番号：８２）、ＲＨＲＳＫＲＧＷ（配列番号：８３）、ＨＲＳＫＲＧＷＥ（配列番号：８４）、ＲＳＫＲＧＷＥＱＬ（配列番号：８５）、ＨＲＳＫＲＧＷＥＱＬ（配列番号：８６）、又はＲＨＲＳＫＲ（配列番号：８７）でありうる。
上記のように、ＰＥ由来のＦＣＳ配列のＰ３’位のＥ２８２残基は、Ｂ細胞免疫原性を低下させるために別のアミノ酸で置換されうる。配列がこの残基の下流の天然ＰＥ残基を欠いている場合、又はＦＣＳが天然ＰＥ配列に対して他の変異を含んでいる場合、このような置換は必要ではないかもしれない。
任意の特定の配列がフューリンによって切断可能であるか否かは、当該分野で知られている方法によって決定することができる。例えば、配列がフューリンによって切断可能であるか否かは、フューリン緩衝液（０．２ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＣａＣｌ２）中のフューリンと共に１：１０の酵素：基質モル比で、２５℃で１６時間、インキュベートすることによって試験することができる。これらの条件は、ＰＥのフューリン切断に最適であることが以前に確立されている。好ましくは、使用されるフューリンはヒトフューリンである。組換え切断型ヒトフューリンは、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Beverly, MA）から市販されている。また、Bravo等 1994 J Biol Chem 269(14):25830-25837を参照のこと。
あるいは、フューリン切断可能配列は、細胞表面タンパク質に対する抗体を用いてそれを免疫毒素にし、得られた免疫毒素をその細胞表面タンパク質を発現する細胞株で試験することによって、試験することができる。適切な抗体配列は、例えば国際公開第２０１２／１５４５３０号及び国際公開第２００９／０３２９５４号に開示されている。
［好ましいＰＥ毒素の一般式］
本発明に従って使用される好ましいＰＥ毒素は、次の構造を有する：
ここで、
ｌ、ｍ、ｎ、ｐ及びｑはそれぞれ独立して、０又は１であり；
ＦＣＳはフューリン切断可能配列、好ましくは（ｉ）Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ−Ｑ−Ｌ、又はＲ−Ｑ−Ｐ−Ｒ、場合によってはＲ−Ｑ−Ｐ−Ｒ、Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｗ、Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ、Ｈ−Ｒ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ−Ｑ、もしくはＲ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅを含むその切断型；あるいは（ｉｉ）Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ−Ｑ−Ｌ、又はＲ−Ｓ−Ｋ−Ｒ、場合によってはＲ−Ｓ−Ｋ−Ｒ、Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｇ−Ｗ、Ｈ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ、Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ−Ｑ−Ｌ、Ｈ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ−Ｑ−Ｌ、もしくはＲ−Ｈ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｒを含むその切断型であり、ここで、天然ＰＥ配列の２８２位に対応するグルタミン酸残基（存在する場合）が場合によっては別の残基、好ましくはグリシン、セリン、アラニン又はグルタミンに置換されており；
Ｒ１は１〜１０個のアミノ酸のリンカー配列、好ましくはＧＧＳ又はＧＧＳＧＧＳであり；
Ｒ２は、残基Ｅ２８５、Ｐ２９０、Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、Ｒ３０２、Ｒ３１３、Ｎ３１４、Ｐ３１９、Ｄ３２４、Ｅ３２７、Ｅ３３１及びＱ３３２（存在する場合）の何れかの一又は複数が、場合によっては、別のアミノ酸、好ましくはグリシン、セリン、アラニン又はグルタミンに独立して置換されている、配列番号：５２の残基２８５〜３６４の一又は複数の連続アミノ酸残基であり；
Ｒ３は、配列番号：５２の残基３６５〜３９４の一又は複数の連続アミノ酸残基であり；
ＰＥ機能ドメインＩＩＩは、配列番号：５２の残基３９５〜６１３を含み、ここで、
（ａ）残基６０２〜６０８の一部又は全部が場合によっては欠失され、及び
（ｂ）残基６０９〜６１３は、場合によっては別のＥＲ局在化配列、好ましくはＫＤＥＬ、ＲＥＤＬ、ＲＤＥＬ又はＫＥＤＬＫによって置換され、及び
（ｃ）残基Ｄ４０３、Ｄ４０６、Ｒ４１２、Ｅ４２０、Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｅ４３１、Ｒ４３２、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、Ｒ４５６、Ｒ４５８、Ｄ４６１、４６３−５１９（好ましくはＤ４６３、Ｒ４６７、Ｌ４７７、Ｙ４８１、Ｒ４９０、Ｒ４９４、Ｒ５０５、Ｒ５１３及び／又はＬ５１６）、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｅ５４８、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、Ｗ５５８、Ｒ５６３、Ｒ５７６、Ｄ５８１、Ｄ５８９、Ｋ５９０、Ｑ５９２、Ｌ５９７及び（存在する場合）Ｋ６０６の何れかの一又は複数が、場合によっては、別のアミノ酸、好ましくはグリシン、セリン、アラニン又はグルタミン、Ｌ４７７の場合はヒスチジンに独立して置換されており；
Ｒ４は、一又は複数（好ましくは１又は２）の付加的なＥＲ局在化配列、好ましくはＲＥＤＬＫ、ＫＤＥＬ、ＲＥＤＬ、ＲＤＥＬ又はＫＥＤＬＫである。
上記式中、
ｌは、好ましくは１であり；すなわち、ＦＣＳが好ましくは存在し、
ｍは、好ましくは１であり；すなわち、特にｌが１の場合にリンカーが好ましくは存在し、
ｎは、好ましくは０であり；すなわち、配列番号：１の残基２８５〜３６４は好ましくは存在せず、
ｐは、好ましくは０であり；すなわち、配列番号：１の残基３６５〜３９４は好ましくは存在せず；
ＰＥ機能ドメインＩＩＩは、好ましくは、変異Ｒ４２７Ａ／Ｆ４４３Ａ／Ｌ４７７Ｈ／Ｒ４９４Ａ／Ｒ５０５Ａ／Ｌ５５２Ｅの組み合わせ、又は変異Ｒ４２７Ａ／Ｒ４５６Ａ／Ｄ４６３Ａ／Ｒ４６７Ａ／Ｒ４９０Ａ／Ｒ５０５Ａ／Ｒ５３８Ａの組み合わせ、又は変異Ｒ４２７Ａ／Ｆ４４３Ａ／Ｒ４５６Ａ／Ｄ４６３Ａ／Ｒ４６７Ａ／Ｌ４７７Ｈ／Ｒ４９０Ａ／Ｒ４９４Ａ／Ｒ５０５Ａ／Ｒ５３８Ａ／Ｌ５５２Ｅの組み合わせを含む。
本発明に従って使用される特に好ましいＰＥ毒素は、配列番号：５２のアミノ酸残基３９５〜６１３に対応するアミノ酸配列を含み、位置４２７、４５６、４６３、４６７、４９０、５０５及び５３８にＡｌａ置換を有し（ＬＯ１０Ｒ−４５６Ａ及び配列番号：３７として国際公開第２０１５／５１１９９号に開示）、又は配列番号：５２のアミノ酸残基３９５〜６１３に対応するアミノ酸配列を含み、位置４２７、４４３、４４７、４９４、５０５及び５５２にＡｌａ置換を有する（Ｔ１８／Ｔ２０及び配列番号：２８９として国際公開第２０１５／０５１１９９号に開示）。
ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、ヒト及びミニブタＴＰＧＦと交差反応性である抗体に部分的に基づいている。所定の実施態様では、中性並びに僅かに酸性のｐＨでヒトＴＰＢＧに結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、がんの診断又は治療に有用である。
Ａ．例示的抗ＴＰＢＧ抗体
一態様では、本発明はＴＰＢＧに結合する単離された抗体を提供する。所定の実施態様では、本発明の抗ＴＰＢＧ抗体は、配列番号：１によるヒトＴＰＢＧに結合し、かつ配列番号：２によるミニブタＴＰＢＧに結合する。所定の実施態様では、本発明の抗ＴＰＢＧ抗体は、ｐＨ５．５とｐＨ７．２でヒトＴＰＢＧに結合する。
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：３の重鎖のＣＤＲ１、（ｂ）配列番号：４の重鎖のＣＤＲ２、（ｃ）配列番号：５の重鎖のＣＤＲ３、（ｄ）配列番号：６の軽鎖のＣＤＲ１、（ｅ）配列番号：７の軽鎖のＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号：８の軽鎖のＣＤＲ３から選択される少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＣＤＲ（ここに開示された抗体「０５１」の上述のＣＤＲに対応）を含む抗ＴＰＢＧ抗体を提供する。
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：３の重鎖のＣＤＲ１、（ｂ）配列番号：４の重鎖のＣＤＲ２、（ｃ）配列番号：５の重鎖のＣＤＲ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列（ここに開示された抗体「０５１」の上述のＣＤＲに対応）を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３を含む。別の実施態様では、抗体は、配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３と配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３を含む。更なる実施態様では、抗体は、配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３、配列番号：５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３、及び配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ２を含む。更なる実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：５の重鎖のＣＤＲ３、（ｂ）配列番号：８の軽鎖のＣＤＲ３、及び（ｃ）配列番号：４の重鎖のＣＤＲ２を含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号：６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１；（ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２；及び（ｃ）配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１；（ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２；及び（ｃ）配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：５から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ１、（ｂ）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号：５から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３、（ｄ）配列番号：６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１、（ｅ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗ＴＰＢＧ抗体は、上述のＣＤＲを含む抗体に由来するヒト化抗体である。
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１１の重鎖のＣＤＲ１、（ｂ）配列番号：１２の重鎖のＣＤＲ２、（ｃ）配列番号：１３の重鎖のＣＤＲ３、（ｄ）配列番号：１４の軽鎖のＣＤＲ１、（ｅ）配列番号：１５の軽鎖のＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号：１６の軽鎖のＣＤＲ３から選択される少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＣＤＲ（ここに開示された抗体「０９１」の上述のＣＤＲに対応）を含む抗ＴＰＢＧ抗体を提供する。
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１１の重鎖のＣＤＲ１、（ｂ）配列番号：１２の重鎖のＣＤＲ２、（ｃ）配列番号：１３の重鎖のＣＤＲ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列（ここに開示される抗体「０９１」の上述のＣＤＲに対応）を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、配列番号：１３のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３を含む。別の実施態様では、抗体は、配列番号：１３のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３と配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３を含む。更なる実施態様では、抗体は、配列番号：１３のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３、配列番号：１３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３、及び配列番号：１２のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ２を含む。更なる実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：１３の重鎖のＣＤＲ３、（ｂ）配列番号：１６の軽鎖のＣＤＲ３、及び（ｃ）配列番号：１２の重鎖のＣＤＲ２を含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１；（ｂ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２；及び（ｃ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１；（ｂ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２；及び（ｃ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：１３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ１、（ｂ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号：１３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３、（ｄ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１、（ｅ）配列番号：１５のアミノ酸を含む軽鎖のＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗ＴＰＢＧ抗体は、上述のＣＤＲを含む抗体に由来するヒト化抗体である。
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１９の重鎖のＣＤＲ１、（ｂ）配列番号：２０の重鎖のＣＤＲ２、（ｃ）配列番号：２１の重鎖のＣＤＲ３、（ｄ）配列番号：２２の軽鎖のＣＤＲ１、（ｅ）配列番号：２３の軽鎖のＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号：２４の軽鎖のＣＤＲ３から選択される少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＣＤＲ（ここに開示された抗体「０９７」の上述のＣＤＲに対応）を含む抗ＴＰＢＧ抗体を提供する。
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１９の重鎖のＣＤＲ１、（ｂ）配列番号：２０の重鎖のＣＤＲ２、（ｃ）配列番号：２１の重鎖のＣＤＲ３（ここに開示される抗体「０９７」の前述のＣＤＲに対応）から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号：２１のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３を含む。別の実施態様では、抗体は、配列番号：２１のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３と配列番号：２４のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３を含む。更なる実施態様では、抗体は、配列番号：２１のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３、配列番号：２１のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３、及び配列番号：２０のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ２を含む。更なる実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：２１の重鎖のＣＤＲ３、（ｂ）配列番号：２４の軽鎖のＣＤＲ３、及び（ｃ）配列番号：２０の重鎖のＣＤＲ２を含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１；（ｂ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２；及び（ｃ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１；（ｂ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２；及び（ｃ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３を含む。
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：２１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３から選択される少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ１、（ｂ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号：２１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３、（ｄ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１、（ｅ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗ＴＰＢＧ抗体は、上述のＣＤＲを含む抗体に由来するヒト化抗体である。
上記実施態様の何れかにおいて、抗ＴＰＢＧ抗体はヒト化される。一実施態様では、抗ＴＰＢＧ抗体は、上記実施態様の何れかにおけるようなＣＤＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを更に含む。
別の態様では、抗ＴＰＢＧ抗体は、配列番号：９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ここに開示される抗体「０５１」の可変重鎖ドメインに対応）を含む。所定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＴＰＢＧ抗体は、ＴＰＢＧに結合する能力を保持する。所定の実施態様では、配列番号：９において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失されている。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で生じる。場合によっては、抗ＴＰＢＧ抗体は、配列番号：９のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ｉ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：５から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３から選択される一つ、二つ又は三つのＣＤＲを含む。
別の態様では、配列番号：１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ＴＰＢＧ抗体が提供される。所定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＴＰＢＧ抗体は、ＰＲＯに結合する能力を保持する。所定の実施態様では、配列番号：１０において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失されている。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で生じる。場合によっては、抗ＴＰＢＧ抗体は、配列番号：１０のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ｉ）配列番号：６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３から選択される一つ、二つ又は三つのＨＶＲを含む。
別の態様では、上に提供された実施態様の何れかのＶＨと上に提供された実施態様の何れかのＶＬを含む抗ＴＰＢＧ抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、配列番号：９及び配列番号：１０のＶＨ及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
更なる態様では、本発明は、ここで提供される抗ＴＰＢＧ抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、所定の実施態様では、配列番号：９のＶＨ配列と配列番号：１０のＶＬ配列を含む抗ＴＰＢＧ抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
別の態様では、抗ＴＰＢＧ抗体は、（ここに開示された抗体「０９１」の可変重鎖ドメインに対応する）配列番号：１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。所定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＴＰＢＧ抗体は、ＴＰＢＧに結合する能力を保持する。所定の実施態様では、配列番号：１７において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失されている。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で生じる。場合によっては、抗ＴＰＢＧ抗体は、配列番号：１７のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ｉ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：１３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３から選択される一つ、二つ又は三つのＣＤＲを含む。
別の態様では、配列番号：１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ＴＰＢＧ抗体が提供される。所定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＴＰＢＧ抗体は、ＰＲＯに結合する能力を保持する。所定の実施態様では、配列番号：１０において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失されている。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で生じる。場合によっては、抗ＴＰＢＧ抗体は、配列番号：１８のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ｉ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３から選択される一つ、二つ又は三つのＨＶＲを含む。
別の態様では、上に提供された実施態様の何れかのＶＨと上に提供された実施態様の何れかのＶＬを含む抗ＴＰＢＧ抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、配列番号：１７及び配列番号：１８のＶＨ及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
更なる態様では、本発明は、ここで提供される抗ＴＰＢＧ抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、所定の実施態様では、配列番号：１７のＶＨ配列と配列番号：１８のＶＬ配列を含む抗ＴＰＢＧ抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
別の態様では、抗ＴＰＢＧ抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ここに開示される抗体「０９７」の可変重鎖ドメインに対応）を含む。所定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＴＰＢＧ抗体は、ＴＰＢＧに結合する能力を保持する。所定の実施態様では、配列番号：２５において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失されている。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で生じる。場合によっては、抗ＴＰＢＧ抗体は、配列番号：２５のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ｉ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）配列番号：２１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３から選択される一つ、二つ又は三つのＣＤＲを含む。
別の態様では、配列番号：２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ＴＰＢＧ抗体が提供される。所定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＴＰＢＧ抗体は、ＰＲＯに結合する能力を保持する。所定の実施態様では、配列番号：１０において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換され、挿入され、及び／又は欠失されている。所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で生じる。場合によっては、抗ＴＰＢＧ抗体は、配列番号：２６のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３から選択される一つ、二つ又は三つのＨＶＲを含む。
別の態様では、上に提供された実施態様の何れかのＶＨと上に提供された実施態様の何れかのＶＬを含む抗ＴＰＢＧ抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、配列番号：２５及び配列番号：２６のＶＨ及びＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
更なる態様では、本発明は、ここで提供される抗ＴＰＢＧ抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、所定の実施態様では、配列番号：１７のＶＨ配列と配列番号：１８のＶＬ配列を含む抗ＴＰＢＧ抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
本発明の更なる態様では、上記実施態様の何れかに係る抗ＴＰＢＧ抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様では、抗ＴＰＢＧ抗体は、抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施態様では、抗体は全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１抗体又はここで定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
一実施態様では、本発明は、ＴＰＢＧに結合する単離された抗体であって、ヒトＴＰＢＧ（配列番号：１）及びミニブタＴＰＢＧ（配列番号：２）に結合し、かつｐＨ５．５及びｐＨ７．２でヒトＴＰＢＧに特異的に結合する抗体に関する。
本発明の一実施態様では、ｐＨ５．５及びｐＨ７．２で細胞表面に発現されたヒトＴＰＢＧに特異的に結合する。
本発明の一実施態様では、ｐＨ５．５及びｐＨ７．２でＳＷ６２０細胞上の細胞表面に発現されたＴＰＢＧに特異的に結合する。
これらの異なるｐＨ値におけるヒトＴＰＢＧの結合は、ここでは、ｐＨ７．２で細胞表面結合アッセイ（一実施態様では、実施例１８に記載のアッセイ）におけるフローサイトメトリーによって検出された平均蛍光強度の、ｐＨ５．５でフローサイトメトリー（一実施態様では、実施例１８に記載のアッセイ）によって検出された平均蛍光強度に対する比としてここでは定義される「結合比」によって定義することができる。
本発明の一実施態様では、抗体はｐＨ５．５及びｐＨ７．２でヒトＴＰＢＧに特異的に結合し、ここで、ｐＨ５．５に対するｐＨ７．２での結合比は１．５未満であり、好ましい一実施態様では０．８〜１．５であり、他の好ましい実施態様では０．９〜１．２である。一実施態様では、結合はフローサイトメトリーによって検出され、結合比は実施例１８に記載のように平均蛍光強度を比較することによって決定される。
本発明の一実施態様では、抗体はｐＨ５．５及びｐＨ７．２で細胞表面に発現されたヒトＴＰＢＧに特異的に結合し、ここで、ｐＨ５．５に対するｐＨ７．２での結合比は１．５未満であり、好ましい一実施態様では０．８〜１．５であり、他の好ましい実施態様では０．９〜１．２である。一実施態様では、結合はフローサイトメトリーによって検出され、結合比は実施例１８に記載のように平均蛍光強度を比較することによって決定される。
本発明の一実施態様では、抗体はｐＨ５．５及びｐＨ７．２で細胞表面に発現されたヒトＴＰＢＧに特異的に結合し、ここで、ｐＨ７．２で細胞表面結合アッセイ（一実施態様では、実施例１８に記載のアッセイ）におけるフローサイトメトリーによって検出された平均蛍光強度の、ｐＨ５．５でフローサイトメトリーによって検出された平均蛍光強度に対する比としてここでは定義される結合比が１．５未満、好ましい一実施態様では０．８〜１．５、他の好ましい実施態様では０．９〜１．２である。
本発明の一実施態様では、抗体は、ｐＨ６．５及びｐＨ７．２でＳＷ６２０細胞上の細胞表面に発現されたＴＰＢＧに特異的に結合し、ｐＨ５．５に対するｐＨ７．２での結合比が１．５未満、好ましい一実施態様では０．８〜１．５、他の好ましい実施態様では０．９〜１．２である。一実施態様では、結合はフローサイトメトリーによって検出され、結合比は実施例１８に記載の平均蛍光強度を比較することによって決定される。
本発明の一実施態様では、抗体は、ｐＨ５．５及びｐＨ７．２でＳＷ６２０細胞上の細胞表面に発現されたＴＰＢＧに特異的に結合し、ｐＨ７．２で細胞表面結合アッセイ（一実施態様では、実施例１８に記載のアッセイ）におけるフローサイトメトリーによって検出された平均蛍光強度の、ｐＨ５．５でフローサイトメトリーによって検出された平均蛍光強度に対する比としてここでは定義される結合比が１．５未満、好ましい一実施態様では０．８〜１．５、別の好ましい実施態様では０．９〜１．２である。
更なる態様では、上記実施態様の何れかに記載の抗ＴＰＢＧ抗体は、以下のセクション１〜７に記載される通りに、特徴の何れかを単独で又は組み合わせて取り込みうる。
１．抗体親和性
所定の実施態様では、ここで提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
一実施態様では、Ｋｄは、次のアッセイにより記載されるように、対象の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原でＦａｂを平衡化し、ついで抗Ｆａｂ抗体被覆プレートで結合した抗原を捕捉することによって、抗原に対するＦＡＢの溶液結合親和性を測定する（例えばChen, Y.等, J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照）。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コートし、続いてＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンで室温（およそ２３℃）で２〜５時間、遮断する。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）において、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した対象のＦａｂと混合する（例えば、Presta, L.G.等, Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599における抗ＶＥＧＦ抗体，Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで対象のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを担保するため長時間（例えば約６５時間）かかる場合がある。その後、混合物を捕捉プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。ついで、溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したところで、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間カウントする。最大結合の２０％より少ないか又は等しい濃度の各Ｆａｂを選択して競合結合測定に使用する。
他の実施態様によれば、Ｋｄは、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡潔に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）が、供給者の説明書に従い、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、およそ１０応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を達成するように５μｌ／分の流量で注入する。抗原の注入後、未反応基を遮断するために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動態測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、およそ２５ｕｌ／分の流量で２５℃で注入する。会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングさせることにより算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）は比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出される。例えば、Chen, Y.等, J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによるオン速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、オン速度は、分光計、例えば、ストップフロー式分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを用いる８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下でのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を使用することによって決定されうる。
２．抗体断片
所定の実施態様では、ここに提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び以下に記載される他の断片を含む。所定の抗体断片の概説については、Hudson, P.J.等, Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg及びMoore (編), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号もまた参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の検討については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第０４７４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson, P.J.等, Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及びHolliger, P.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照。トリアボディやテトラボディもまたHudson, P.J.等, Nat. Med. 9 (20039 129-134)に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む抗体断片である。所定の実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照）。
抗体断片は、限定されないが、ここに記載のように、インタクトな抗体のタンパク質消化、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む様々な技術によって作製されうる。
３．キメラ及びヒト化抗体
所定の実施態様では、ここで提供される抗体はキメラ抗体である。所定のキメラ抗体が、例えば米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison, S.L.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが、親抗体のものから変化させられている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
所定の実施態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しつつ、ヒトへの免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト定常領域の少なくとも一部をまた含むであろう。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
ヒト化抗体とそれらの作製方法は、例えば、Almagro, J.C.及びFransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に概説され、Riechmann, I.等, Nature 332 (1988) 323-329；Queen, C.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号、及び第７０８７４０９号；Kashmiri, S.V.等, Methods 36 (2005) 25-34 （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記載）；Padlan, E.A.等, Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498（「リサーフェシング」を記載）；Dall'Acqua, W.F.等, Methods 36 (2005) 43-60（「ＦＲシャッフリング」を記載）；及びOsbourn, J.等, Methods 36 (2005) 61-68及びKlimka, A.等, Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（ＦＲシャッフリングへの「ガイドセレクション」アプローチを記載）に更に記載されている。
ヒト化に使用されうるヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims, M.J.等, J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308）；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter, P.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及びPresta, L.G.等, J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C.及びFransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照）；及びＦＲライブラリースクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca, M.等, J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及びRosok, M.J.等, J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)を参照）を含む。
４．ヒト抗体
所定の実施態様では、ここで提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において知られている様々な技術を使用して生産されうる。ヒト抗体は一般にvan Dijk, M.A.及びvan de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459に記載されている。
ヒト抗体は、抗原投与に応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物へ免疫原を投与することにより、調製されうる。そのような動物は、典型的にはヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てもしくは一部を含み、これが内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、又は染色体外にもしくは該動物の染色体内に無作為に取り込まれて存在する。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、通常は不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している米国特許第６０７５１８１号及び６１５０５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号、及びＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）もまた参照のこと。そのような動物により生成されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変されうる。
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によってもまた作製されうる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は記載されている。（例えば、Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005；Brodeur, B.R.等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63；及びBoerner, P.等, J. Immunol. 147 (1991) 86-95を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって作製されたヒト抗体はまたLi, J.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562に記載されている。更なる方法は、例えば米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載）及びNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 （ヒト−ヒトハイブリドーマを記載）に記載されているものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまたVollmers, H.P.及びBrandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937及びVollmers, H.P.及びBrandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191に記載されている。
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても作製されうる。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
５．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、一又は複数の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離されうる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための、様々な方法が当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R.等, Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37に概説され、例えば、McCafferty, J.等, Nature 348 (1990) 552-554；Clackson, T.等, Nature 352 (1991) 624-628；Marks, J.D.等, J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597；Marks, J.D.及びBradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175；Sidhu, S.S.等, J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310；Lee, C.V.等, J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093；Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472；及びLee, C.V.等, J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132に更に記載されている。
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリー中で無作為に組換えられ、ついでこれが、Winter, G.等, Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455に記載されるようにして、抗原結合ファージについてスクリーニングされうる。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として又はＦａｂ断片としての何れかで、抗体断片を提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要がなく、免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。あるいは、Griffiths, A.D.等, EMBO J. 12 (1993) 725-734により記載されるように、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングすることができ、如何なる免疫化も伴わず、広範囲の非自己抗原とまた自己抗原への抗体の単一供給源を提供する。最後に、ナイーブライブラリーは、Hoogenboom, H.R.及びWinter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388に記載されるように、幹細胞から再編成されていないＶ−遺伝子セグメントをクローニングし、無作為配列を含むＰＣＲプライマーを使用して超可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再編成を達成することにより、合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号、及び第２００９／０００２３６０号を含む。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、ここでのヒト抗体又はヒト抗体断片と考えられる。
６．多重特異性抗体
所定の実施態様では、ここで提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。所定の実施態様では、結合特異性のうちの一つはＴＰＢＧに対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。所定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＴＰＢＧの二つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異性抗体はまたＴＰＢＧを発現する細胞に細胞傷害性剤を局在化させるために使用することもできる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製されうる。
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein, C.及びCuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker, A.等, EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照）及び「ノブ−イン−ホール」（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）操作（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた抗体のＦｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；二つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号；及びBrennan, M.等, Science 229 (1985) 81-83を参照）；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を生成すること（例えば、Kostelny, S.A.等, J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照）；二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Holliger, P.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber, M等, J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照）；及び例えば、Tutt, A.等, J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載されるように三重特異性抗体を調製することによって、作製されうる。
「オクトパス抗体」を含む、三つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体もまたここに含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照）。
ここでの抗体又は断片はまたＴＰＢＧ並びに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）。
ここでの抗体又は断片はまた国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開第２０１０／１４５７９３号に記載される多重特異性抗体を含む。
７．抗体変異体
所定の実施態様では、ここに提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により、調製することができる。そのような修飾は、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合性を有していることを条件として、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行うことにより、最終コンストラクトに到達することができる。
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
所定の実施態様では、一又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。例示的な変化が、「例示的置換」の見出しの下で次の表に提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下に更に記載される。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しの下で表１に示す。アミノ酸置換を、目的の抗体に導入することができ、その産物が、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングされる。
アミノ酸は、共通の側鎖特性によってグループ化されうる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの一つのメンバーを別のクラスのものと交換することを必要とするであろう。
置換変異体の一つの種類は、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、更なる研究のために選択される得られた変異体は、親抗体と比較して、所定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の減少）を有し、及び／又は親抗体の所定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、これは、例えばここに記載されるもののようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して、簡便に作製されうる。簡潔に言えば、一又は複数のＨＶＲ残基を変異させ、変異抗体がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
改変（例えば、置換）は、例えば抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて行うことができる。そのような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟過程の間に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において行われ得、得られる変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築しそこから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Hoogenboom, H.R.等 in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様では、多様性が、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。ついで、二次ライブラリーが作製される。ついで、ライブラリーが、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するための別の方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）が無作為化されるＨＶＲ指向アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に同定することができる。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的化される。
所定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、一又は複数のＨＶＲ内で生じうる。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えばここで提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。そのような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」又はＳＤＲの外にある場合がある。上で提供された変異体ＶＨ及びＶＬ配列の所定の実施態様では、各ＨＶＲは改変されていないか、又はわずか一つ、二つもしくは三つのアミノ酸置換を含む。
変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham, B.C.及びWells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、一残基又は標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されうる。あるいは、又は加えて、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原の間の接触点を同定する。そのような接触残基と隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除されうる。変異体は、それらが所望の性質を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされうる。
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含むポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えばＡＤＥＰＴのための）又はポリペプチドに対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合物を含む。
ｂ）グリコシル化変異体
所定の実施態様では、ここに提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度が増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一又は複数のグリコシル化部位が作成され又は除去されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成されうる。
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに結合する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合により一般に結合した分岐した、二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright, A.及びMorrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照のこと。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコース、並びにマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸を含みうる。幾つかの実施態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、所定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するためになされうる。
一実施態様では、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）結合したフコースを欠く糖鎖構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％でありうる。フコースの量は、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に結合している全ての糖構造の合計（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指す；しかし、Ａｓｎ２９７はまた抗体における軽微な配列変異のため、２９７位のおよそ±３アミノ酸の上流又は下流に、すなわち２９４位と３００位の間に位置されうる。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させる場合がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号を参照。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する刊行物の例には、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Okazaki, A.等, J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249；Yamane-Ohnuki, N.等, Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622が含まれる。脱フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例には、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka, J.等, Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子，ＦＵＴ８，ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki, N.等, Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622；Kanda, Y.等, Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）が含まれる。
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している場合がある。このような抗体変異体の例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号；米国特許第６６０２６８４号；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号に記載される。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも一つのガラクトース残基を持つ抗体変異体もまた提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させている場合がある。このような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号；国際公開第１９９８／５８９６４号；及び国際公開第１９９９／２２７６４号に記載される。
ｃ）Ｆｃ領域変異体
所定の実施態様では、一又は複数のアミノ酸修飾を、ここに提供される抗体のＦｃ領域に導入することにより、Ｆｃ領域変異体が作製される。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含みうる。
所定の実施態様では、本発明は、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要ないしは有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を考慮している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞傷害性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを、抗体がＦｃγＲ結合性を欠く（よって、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞のＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号（例えば、Hellstrom, I.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及びHellstrom, I.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502；及びHellstrom, I等, Proc. Natl Acad. Sci. USA 82(1985) 1499-1502）；同第５８２１３３７号（Bruggemann, M.等, J. Exp. Med. 166(1987) 1351-1361を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes, R.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されたもののような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを、抗体がＣ１ｑに結合することができず、よってＣＤＣ活性を欠くことを確認するために実施することもまたできる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Gazzano-Santoro, H.等, J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171；Cragg, M.S.等, Blood 101 (2003) 1045-1052；及びCragg, M.S.及びM.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照）。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定をまた、当該分野で知られている方法を使用して実施することができる（例えば、Petkova, S.B.等, Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769を参照）。
エフェクター機能が低下した抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの一又は複数の置換を伴うものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の二以上に置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
ＦｃＲへの改善又は減少した結合性を有する所定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L.等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照）。
所定の実施態様では、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
幾つかの実施態様では、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie, E.E.等, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に記載されるように、改変された（すなわち改善されたか又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる改変がＦｃ領域においてなされる。
半減期が延長され、胎児への母性ＩｇＧの移送を担う（Guyer, R.L.等, J. Immunol. 117 (1976) 587-593、及びKim, J.K.等, J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合性が改善された抗体が米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。その抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換をそこに伴うＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの一又は複数に置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を含むものを含む（米国特許第７３７１８２６号）。
また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関する、Duncan, A.R.及びWinter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
ｄ）システイン操作抗体変異体
所定の実施態様では、抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換された残基は抗体の接近可能な部位に存在する。ここに更に記載されるように、その残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基を抗体の接近可能な部位に位置させ、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分にコンジュゲートさせるために使用して、イムノコンジュゲートを作製することができる。所定の実施態様では、次の残基のうちの何れかの一又は複数がシステインで置換されうる：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されているようにして作製されうる。
ｅ）抗体誘導体
所定の実施態様では、ここで提供される抗体は、当該技術分野で知られており、容易に入手可能な更なる非タンパク質部分を含むように更に修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーの何れか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン（prolypropylene）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有しうる。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合されるポリマーの数は変動しうるが、一を超えるポリマーが結合される場合、それらは同じか又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定されるものではないが、改善されるべき抗体の特定の性質又は機能、抗体誘導体が定まった条件下で治療に使用されるかどうか等々を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
別の実施態様では、放射線への曝露によって選択的に加熱されうる非タンパク質部分と抗体とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Kam, N.W.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は任意の波長のものであり得、限定されないが、通常の細胞を害さないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅する温度まで非タンパク質部分を加熱する波長を含む。
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組換え方法及び組成物を使用して製造されうる。一実施態様では、ここに記載の抗ＴＰＢＧ抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードしうる。更なる実施態様では、そのような核酸を含む一又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施態様では、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換されている）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列と抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクターと、抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、抗ＴＰＢＧ抗体を作製する方法であって、抗体の発現に適した条件下で、上で提供された抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、場合によっては宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することとを含む方法が提供される。
抗ＴＰＢＧ抗体の組換え生産のために、例えば上述のような、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクター中に挿入される。そのような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を使用して（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定されうる。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、ここに記載の原核生物細胞又は真核生物細胞を含む。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合には、抗体は、細菌内で産生されうる。細菌中での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号、及び同第５８４０５２３号を参照のこと。（また、大腸菌における抗体断片の発現について記載している、Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.(編), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照のこと）。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。
原核生物に加えて、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されていて、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす真菌株及び酵母株を含む、糸状菌又は酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及びLi, H.等, Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照のこと。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からまた得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫細胞を含む。特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用されうる多数のバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号、及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物において抗体を生産するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照のこと。
脊椎動物細胞もまた宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合化された哺乳動物細胞株が有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎株（例えば、Graham, F.L.等, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74）に記載された２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather, J.P.等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub, G.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した所定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki, P.及びWu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (編), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照のこと。
Ｃ．アッセイ
ここで提供される抗ＴＰＢＧ抗体は、当該技術分野で知られている様々なアッセイによって同定され、その物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴付けされうる。
１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、本発明の抗体を、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの既知の方法によって、その抗原結合活性について試験する。
別の態様では、競合アッセイを使用して、ＴＰＢＧへの結合についてここに開示された抗体０５１、０９１、又は０９７の群から選択され、ＶＨ及びＶＬドメインのその各アミノ酸配列によって定まる抗体と競合する抗体を同定することができる。所定の実施態様では、そのような競合する抗体は、ここに開示された抗体０５１、０９１、又は０９７の群から選択され、ＶＨ及びＶＬドメインのその各アミノ酸配列によって定まる抗体が結合する同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法が、Morris, G.E.(編), Epitope Mapping Protocols, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996)に提供される。
例示的競合アッセイでは、固定化ＴＰＢＧが、ＴＰＢＧに結合する第一標識抗体（例えば、ここに開示された抗体０５１、０９１、又は０９７の群から選択され、ＶＨ及びＶＬドメインのその各アミノ酸配列によって定まる抗体）及びＴＰＢＧへの結合について第一抗体と競合するその能力について試験されている第二非標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化したＴＰＢＧを、第一標識抗体を含むが第二非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートする。ＴＰＢＧへの第一抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体を除去し、固定化したＴＰＢＧに結合した標識の量を測定する。固定化したＴＰＢＧに結合した標識の量が対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体がＴＰＢＧへの結合に関して第一抗体と競合していることを示している。Harlow, E.及びLane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照のこと。
２．活性アッセイ
一態様では、生物学的活性を有するその抗ＴＰＢＧ抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、ＴＰＢＧ発現腫瘍細胞への結合を含みうる。インビボ及び／又はインビトロでそのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
所定の実施態様では、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた一又は複数の細胞傷害性剤、例えば化学療法剤もしくは薬物、増殖阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、又はその断片）又は放射性同位体にコンジュゲートしたここでの抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、抗体が、限定されないがメイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号を参照）；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号、第５７８０５８８号、及び第７４９８２９８号を参照）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、米国特許第５７１４５８６号、米国特許第５７３９１１６号、米国特許第５７６７２８５号、米国特許第５７７０７０１号、米国特許第５７７０７１０号、米国特許第５７７３００１号、及び米国特許第５８７７２９６号； Hinman, L.M.等, Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342；及びLode, H.N.等, Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928を参照）；アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシン（Kratz, F.等, Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523；Jeffrey, S.C.等, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362；Torgov, M.Y.等, Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721；Nagy, A.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834；Dubowchik, G.M.等, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532；King, H.D.等, J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343；及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含む、一又は複数の薬物にコンジュゲートしている抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、（緑膿菌由来）外毒素Ａ鎖の非結合活性断片、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリアコン阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、及びトリコテセン（tricothecenes）を含む、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートしているここに記載の抗体を含む。一実施態様では、酵素的に活性な毒素はシュードモナス外毒素又はその変異体である。
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートしたここに記載の抗体を含み、放射性コンジュゲートを形成する。放射性コンジュゲートの製造には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートを検出に使用する場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフ検査用の放射性原子、例えばＴＣ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含む。
抗体と細胞傷害性剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン ２，６−ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta, E.S.等, Science 238 (1987) 1098-1104に記載のようにして調製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞内で細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」でありうる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V.等, Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５２０８０２０号）が使用されうる。
ここでのイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されるものではないが、（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから）市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を限定しないが含む架橋試薬を用いて調製されたコンジュゲートが明示的に考えられる。
ポリペプチドである細胞傷害性剤と抗体のコンジュゲートもまた、組換え融合タンパク質として、例えば宿主細胞内で前記融合タンパク質を直接発現させることにより、提供のための更なるカップリング工程を必要としないで、提供されうる。
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
所定の実施態様では、ここで提供される抗ＴＰＢＧ抗体の何れも、生物学的試料中のＴＰＢＧの存在を検出するために有用である。ここで使用される「検出する」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。所定の実施態様では、生物学的試料は、腫瘍細胞などの細胞又は組織を含む。
一実施態様では、診断又は検出の方法で使用される抗ＴＰＢＧ抗体が提供される。更なる態様では、生物学的試料中のＴＰＢＧの存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様では、その方法は、抗ＴＰＢＧ抗体のＴＰＢＧへの結合を許容する条件下で、ここに記載される抗ＴＰＢＧ抗体に生物学的試料を接触させ、抗ＴＰＢＧ抗体とＴＰＢＧとの間に複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボの方法でありうる。一実施態様では、抗ＴＰＢＧ抗体は、例えばＴＰＢＧが患者の選択のためのバイオマーカーである場合に、抗ＴＰＢＧ抗体を用いた治療法に適格な対象を選択するために使用される。
本発明の抗体を使用して診断されうる例示的疾患には、がん、例えばリンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性（bronchioloalviolar）細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫で、上記がんの何れかの難治型を含み、又は上記がんの一又は複数の組み合わせが含まれる。
所定の実施態様では、標識された抗ＴＰＢＧ抗体が提供される。標識には、限定されないが、直接検出される標識又は部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識）並びに、例えば酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。例示的な標識には、限定されないが、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＲＰなどの色素前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素に結合した複素環式オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル等々が含まれる。
Ｆ．薬学的製剤
ここに記載される抗ＴＰＢＧ抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するこのような抗体を、一又は複数の任意選択的な薬学的に許容可能な担体と混合することによって（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16版, Osol, A. (編) (1980)）、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に調製される。薬学的に許容可能な担体は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して一般に非毒性であり、限定されるものではないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール、レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリ（ビニルピロリドン）等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及びその他の糖質；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。ここでの例示的な薬学的に許容可能な担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）等の介在性薬物分散剤、例えばｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標），Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。ｒｈｕＰＨ２０を含む、所定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の一又は複数の更なるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤が米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
ここでの製剤は治療されている特定の適応症に必要な一を超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものをまた含みうる。例えば、化学療法剤、好ましくは以下に列挙される化学療法剤を更に提供することが望ましい場合がある。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
活性成分は、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョン中において、例えばコアセルベーション技術又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルのそれぞれに封入されうる。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16版, Osol, A. (編) (1980)に開示されている。
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。
インビボ投与に使用される製剤は、一般に無菌である。無菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成される。
Ｇ．治療方法及び組成物
ここで提供される抗ＴＰＢＧ抗体又はここで提供される抗ＴＰＢＧ抗体を含む組換え融合タンパク質又はイムノコンジュゲートの何れも治療方法において使用されうる。
一態様では、医薬として使用される抗ＴＰＢＧ抗体が提供される。更なる態様では、がんの治療に使用される抗ＴＰＢＧ抗体が提供される。所定の実施態様では、治療方法において使用される抗ＴＰＢＧ抗体が提供される。所定の実施態様では、本発明は、有効量の抗ＴＰＢＧ抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法において使用される抗ＴＰＢＧ抗体を提供する。そのような一実施態様では、前記方法は、例えば以下に記載される少なくとも一種の更なる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における、抗ＴＰＢＧ抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬はがんの治療のためのものである。更なる実施態様では、医薬は、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、がんを治療する方法における使用のためのものである。そのような一実施態様では、前記方法は、例えば以下に記載される少なくとも一種の更なる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」はヒトでありうる。
更なる態様では、本発明はがんを治療する方法を提供する。一実施態様では、前記方法は、がんを有する個体に有効量の抗ＴＰＢＧ抗体を投与することを含む。そのような一実施態様では、前記方法は、以下に記載される少なくとも一種の更なる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」はヒトでありうる。
更なる態様では、本発明は、例えば上記治療方法の何れかにおいて使用するための、ここで提供される抗ＴＰＢＧ抗体の何れかを含有する薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、ここで提供される抗ＴＰＢＧ抗体の何れかと薬学的に許容可能な担体とを含有する。他の実施態様では、薬学的製剤は、ここで提供される抗ＴＰＢＧ抗体の何れかと、例えば以下に記載されるような少なくとも一種の更なる治療剤とを含有する。
本発明の抗体は、治療において、単独で又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも一種の更なる治療剤と同時投与されうる。所定の実施態様では、更なる治療剤は化学療法剤である。
一実施態様では、このような化学療法剤には、限定されないが、アルキル化剤を含む抗腫瘍性薬剤、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシルのようなナイトロジェンマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、及びセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）；テモダール（ＴＭ）（テモゾロマイド）、エチレンイミン／メチルメラミン、例えばトリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン；トリアジン、例えばダカルバジン（ＤＴＩＣ）；葉酸アナログ、例えばメトトレキサート及びトリメトレキサート、ピリミジンアナログ、例えば５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジン、プリンアナログ、例えば６−メルカプトプリン、６−チオグアニン（thioguamne）、アザチオプリン、Ｔ−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリトロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）を含む代謝拮抗薬；抗有糸分裂薬、例えばパクリタキセル、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビンを含むビンカアルカロイド、タキソテール、エストラムスチン、及びリン酸エストラムスチンを含む天然物；ピポドフィロトキシン、例えばエトポシド及びテニポシド；抗生物質、例えばアクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、及びアクチノマイシン；酵素、例えばＬ−アスパラギナーゼ；生物学的応答修飾剤、例えばインターフェロン−アルファ、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦ；白金配位錯体、例えばオキサリプラチン、シスプラチン及びカルボプラチン、アントラセンジオン、例えばミトキサントロン、置換尿素、例えばヒドロキシウレア、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、例えばミトタン（ｏ、ｐ−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドを含む様々な薬剤；副腎皮質ステロイドアンタゴニスト、例えばプレドニゾンとその等価物、デキサメタゾン及びアミノグルテチミドを含むホルモン及びアンタゴニスト；ジェムザール（ＴＭ）（ゲムシタビン）、プロゲスチン、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロテステロンアセテート及び酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物；抗エストロゲン、例えばタモキシフェン；テストステロンプロピオナート及びフルオキシメステロン／等価物を含むアンドロゲン；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ及びロイプロリド；及び非ステロイド性抗アンドロゲン、例えばフルタミドが含まれる。限定されないが、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、脱メチル化剤（例えばＶｉｄａｚａ）及び転写抑制解除（ＡＴＲＡ）療法を含むエピジェネティック機序を標的とする治療法をまた本発明の抗体と組み合わせることができる。
一実施態様では、化学療法剤は、タキサン（例えばパクリタキセル（タキソール）等）、ドセタキセル（タキソテール）、修飾されたパクリタキセル（例えば、アブラキサン及びオパキシオ）、ドキソルビシン、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、及び他の多標的キナーゼ阻害剤、オキサリプラチン、シスプラチン及びカルボプラチン、エトポシド、ゲムシタビン、並びにビンブラスチンからなる群から選択される。一実施態様では、化学療法剤は、タキサン（例えばタキソール（パクリタキセル）等）、ドセタキセル（タキソテール）、修飾されたパクリタキセル（例えば、アブラキサン及びオパキシオ）からなる群より選択される。一実施態様では、更なる化学療法剤は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン、又はオキサリプラチンから選択される。一実施態様では、化学療法剤は、５−フルオロウラシル、ロイコボリン及びイリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）である。一実施態様では、化学療法剤は、５−フルオロウラシル、及びオキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）である。
更なる化学療法剤を伴う本発明の抗体の治療的適用の特定の例には、例えば、
− 乳がんの治療のためのタキサン（例えば、ドセタキセルもしくはパクリタキセル）又は修飾されたパクリタキセル（例えば、アブラキサン又はオパキシオ）、ドキソルビシン、カペシタビン及び／又はベバシズマブ（アバスチン）を用いる療法；
− 卵巣がんのためのカルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドキソルビシン（又は修飾されたドキソルビシン（Ｃａｅｌｙｘ又はドキシル））、又はトポテカン（ハイカムチン）を用いる療法；
− 腎臓がんの治療のための多標的キナーゼ阻害剤、ＭＫＩ，（スーテント、ネクサバール、又は７０６）及び／又はドキソルビシンを用いる療法；
− 扁平上皮癌の治療のためのオキサリプラチン、シスプラチン及び／又は放射線を用いる療法；
− 肺がんの治療のためのタキソール及び／又はカルボプラチンを用いる治療
が含まれる。
従って、一実施態様では、更なる化学療法剤は、乳がんの治療のためのタキサン（ドセタキセル又はパクリタキセル又は修飾されたパクリタキセル（アブラキサン又はオパキシオ）、ドキソルビシン、カペシタビン及び／又はベバシズマブからなる群から選択される。
一実施態様では、本発明の抗体は、更なる化学療法剤の非存在下で投与される。
上記のこうした併用療法は、併用投与（二種以上の治療剤が、同一又は別々の製剤に含められる）、及び本発明の抗体の投与が、更なる治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起こりうる分離投与を包含する。本発明の抗体はまた放射線療法と組み合わせて使用することができる。
本発明の抗体（及び任意の更なる治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療が望まれるのであれば、病巣内投与を含む、任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、任意の適切な経路により、例えば、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存して、例えば静脈内又は皮下注射などの注射により、なされうる。限定されないが、単一又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投薬スケジュールがここで考慮される。
本発明の抗体は、適正な医療行為に一致した様式で製剤化され、用量決定され、投与される。こうした観点において考慮すべき因子として、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、及び医師に既知のその他の因子が挙げられる。抗体は、必要ではないが場合によっては、当該疾患の予防又は治療のために現在使用されている一又は複数の薬剤と共に製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患又は治療の種類、及び上で検討された他の因子に依存する。これらは一般には、ここに記載されているものと同じ投薬量及び投与経路で、又はここに記載の投薬量の約１から９９％で、又は経験的に／臨床的に適切であると判断された任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
疾患の予防又は治療に対して、本発明の抗体の適切な投薬量は、（単独で又は一もしくは複数の他の更なる治療剤との併用で使用される場合）治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体の投与が予防目的か治療目的か、治療歴、患者の臨床歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。抗体は、一回で又は一連の治療にわたって患者へ適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数回の別個の投与によるか、又は連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が患者への投与のための初期候補投薬量となりうる。一つの典型的な１日投薬量は、上記の因子に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であるかもしれない。数日以上にわたる反復投与に関しては、状態に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。抗体の例示的な一投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであろう。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はその何れかの組み合わせ）が患者に投与されうる。このような用量は断続的に、例えば毎週又は三週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば約６用量の抗体を受けるように）投与されうる。しかしながら、他の投薬量レジメンが有用でありうる。この治療の進行は、一般的な技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
上記の製剤又は治療方法の何れも、抗ＴＰＢＧ抗体の代わりに又はそれに加えて本発明のイムノコンジュゲート又は本発明の組換え融合タンパク質を使用して実施することができることが理解される。
ＩＩＩ．製造品
本発明の別の態様では、上述した疾患の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、単独の又は疾患の治療、予防、及び／又は診断に効果的である別の組成物と併用の組成物を収容し、滅菌のアクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内溶液バッグでありうる）。該組成物中の少なくとも一種の活性剤は本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、該組成物が選択される疾患の治療のために使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物を中に収容する第一容器と、（ｂ）更なる細胞傷害性剤又はその他の治療剤を含む組成物を中に収容する第二容器とを含みうる。本発明のこの実施態様の製造品は、組成物が特定の疾患を治療するために使用できることを示す添付文書を更に含みうる。あるいは又は加えて、製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含みうる。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望ましいその他の材料を更に含みうる。
上記製造品の何れも、抗ＴＰＢＧ抗体の代わりに又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲート又は本発明の組換え融合タンパク質を含んでいてもよいことが理解される。
ＩＶ．本発明の特定の実施態様
次に本発明の特定の実施態様を列挙する。
１．トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）に結合する単離された抗体であって、ヒトＴＰＢＧ（配列番号：１）及びミニブタＴＰＢＧ（配列番号：２）に結合する抗体。
２．トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）に結合する単離された抗体であって、ヒトＴＰＢＧ（配列番号：１）及び細胞表面に発現されたミニブタＴＰＢＧ（配列番号：２）に結合する抗体。
３．トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）に結合する単離された抗体であって、ヒトＴＰＢＧ（配列番号：１）及びミニブタＴＰＢＧ（配列番号：２）に結合し、ｐＨ５．５及びｐＨ７．４でヒトＴＰＢＧに特異的に結合する抗体。
４．トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）に結合する単離された抗体であって、ヒトＴＰＢＧ（配列番号：１）及びミニブタＴＰＢＧ（配列番号：２）に結合し、ｐＨ５．５及びｐＨ７．２でヒトＴＰＢＧに特異的に結合する抗体。
５．それぞれ１０−８Ｍ以下のＫＤでヒト及びミニブタＴＰＢＧに特異的に結合する、実施態様１から４の何れか一項に記載の抗体。
６．それぞれ１０−８Ｍ〜１０−１３ＭのＫＤでヒト及びミニブタＴＰＢＧに特異的に結合する、実施態様１から４の何れか一項に記載の抗体。
７．ｐＨ５．５及びｐＨ７．２で細胞表面に発現されたヒトＴＰＢＧに特異的に結合する、実施態様４から６の何れか一項に記載の抗体。
８．ｐＨ５．５及びｐＨ７．２でＳＷ６２０細胞上の細胞表面に発現されたヒトＴＰＢＧに特異的に結合する、実施態様４から６の何れか一項に記載の抗体。
９．ｐＨ５．５及びｐＨ７．４において１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＴＰＢＧに特異的に結合する、実施態様３から８の何れか一項に記載の抗体。
１０．ｐＨ５．５及びｐＨ７．４において１０−８Ｍ〜１０−１３ＭのＫＤでヒトＴＰＢＧに特異的に結合する、実施態様３から９の何れか一項に記載の抗体。
１１．結合の際にＴＰＢＧ発現細胞中に内部移行する、実施態様１から１０の何れか一項に記載の抗体。
１２．実施態様１から１１の何れか一項に記載の抗体であって、
（ａ）配列番号：５の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：８の軽鎖のＣＤＲ３、及び配列番号：４の重鎖のＣＤＲ２；又は［抗体０５１］
（ｂ）配列番号：１３の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：１６の軽鎖のＣＤＲ３、及び配列番号：１２の重鎖のＣＤＲ２；又は［抗体０９１］
（ｃ）配列番号：２１の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：２４の軽鎖のＣＤＲ３、及び配列番号：２０の重鎖のＣＤＲ２，［抗体０９７］
を含み、又は（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示された抗体由来のヒト化抗体である、抗体。
１３．実施態様１から１１の何れか一項に記載の抗体であって、配列番号：５の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：８の軽鎖のＣＤＲ３、及び配列番号：４の重鎖のＣＤＲ２を含む、抗体。［抗体０５１］
１４．実施態様１から１１の何れか一項に記載の抗体であって、配列番号：１３の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：１６の軽鎖のＣＤＲ３、及び配列番号：１２の重鎖のＣＤＲ２を含む、抗体。［抗体０９１］
１５．実施態様１から１１の何れか一項に記載の抗体であって、配列番号：２１の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：２４の軽鎖のＣＤＲ３、及び配列番号：２０の重鎖のＣＤＲ２を含む、抗体。［抗体０９７］
１６．実施態様１３から１５の何れか一項に記載の抗体由来のヒト化抗体。
１７．実施態様１から１１の何れか一項に記載の抗体であって、
（ａ）配列番号：３の重鎖のＣＤＲ１、配列番号：４の重鎖のＣＤＲ２、配列番号：５の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：６の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号：７の軽鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：８の軽鎖のＣＤＲ３；又は［抗体０５１］
（ｂ）配列番号：１１の重鎖のＣＤＲ１、配列番号：１２の重鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：１３の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：１４の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号：１５の軽鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：１６の軽鎖のＣＤＲ３；又は［抗体０９１］
（ｃ）配列番号：１９の重鎖のＣＤＲ１、配列番号：２０の重鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：２１の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：２２の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号：２３の軽鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：２４の軽鎖のＣＤＲ３；［抗体０９７］
を含み、又は（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示された抗体由来のヒト化抗体である、抗体。
１８．実施態様１から１１の何れか一項に記載の抗体であって、配列番号：３の重鎖のＣＤＲ１、配列番号：４の重鎖のＣＤＲ２、配列番号：５の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：６の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号：７の軽鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：８の軽鎖のＣＤＲ３を含む、抗体。［抗体０５１］
１９．実施態様１から１１の何れか一項に記載の抗体であって、配列番号：１１の重鎖のＣＤＲ１、配列番号：１２の重鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：１３の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：１４の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号：１５の軽鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：１６の軽鎖のＣＤＲ３を含む、抗体。［抗体０９１］
２０．実施態様１から１１の何れか一項に記載の抗体であって、配列番号：１９の重鎖のＣＤＲ１、配列番号：２０の重鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：２１の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：２２の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号：２３の軽鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：２４の軽鎖のＣＤＲ３を含む、抗体。［抗体０９７］
２１．実施態様１８から２０の何れか一項に記載の抗体に由来するヒト化抗体。
２２．実施態様１から１１の何れか一項に記載の抗体であって、
（ａ）配列番号：９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；
（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は
（ｃ）（ａ）のＶＨ配列と（ｂ）のＶＬ配列
を含む抗体。［抗体０５１］
２３．配列番号：９のＶＨ配列を含む、実施態様２２に記載の抗体。［抗体０５１］
２４．配列番号：１０のＶＬ配列を含む、実施態様２２又は２３に記載の抗体。［抗体０５１］
２５．配列番号：９のＶＨ配列と配列番号：１０のＶＬ配列を含む抗体。［抗体０５１］
２６．実施態様２５に記載の抗体に由来する、ＴＰＢＧに結合するヒト化抗体。
２７．実施態様１から１１の何れか一項に記載の抗体であって、
（ａ）配列番号：１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；
（ｂ）配列番号：１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は
（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列
を含む抗体。［抗体０９１］
２８．配列番号：１７のＶＨ配列を含む、実施態様２７に記載の抗体。［抗体０９１］
２９．配列番号：１８のＶＬ配列を含む、実施態様２７又は２８に記載の抗体。［抗体０９１］
３０．配列番号：１７のＶＨ配列と配列番号：１８のＶＬ配列を含む抗体。［抗体０９１］
３１．実施態様３０に記載の抗体に由来する、ＴＰＢＧに結合するヒト化抗体。
３２．実施態様１から１１の何れか一項に記載の抗体であって、
（ａ）配列番号：２５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；
（ｂ）配列番号：２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は
（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列
を含む抗体。［抗体０９７］
３３．配列番号：２５のＶＨ配列を含む、実施態様３２に記載の抗体。［抗体０９７］
３４．配列番号：２６のＶＬ配列を含む、実施態様３２又は３３に記載の抗体。［抗体０９７］
３５．配列番号：２５のＶＨ配列と配列番号：２６のＶＬ配列を含む抗体。［抗体０９７］
３６．実施態様３５に記載の抗体に由来する、ＴＰＢＧに結合するヒト化抗体。
３７．モノクローナル抗体である、実施態様１から３６の何れか一項に記載の抗体。
３８．ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である、実施態様１から３７の何れか一項に記載の抗体。
３９．ＴＰＢＧに結合する抗体断片である、実施態様１から３８の何れか一項に記載の抗体。
４０．ＴＰＢＧに結合するＦａｂ断片である、実施態様１から３９の何れか一項に記載の抗体。
４１．ＩｇＧアイソタイプのものである、実施態様１から３８の何れか一項に記載の抗体。
４２．全長ＩｇＧ抗体である、実施態様１から３８の何れか一項に記載の抗体。
４３．ＩｇＧ１アイソタイプのものである、実施態様１から３８の何れか一項に記載の抗体。
４４．全長ＩｇＧ１抗体である、実施態様１から３８の何れか一項に記載の抗体。
４５．実施態様１から４４の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
４６．実施態様４５に記載の核酸を含む宿主細胞。
４７．抗体が産生されるように実施態様４６に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体の製造方法。
４８．宿主細胞から抗体を回収することを更に含む、実施態様４７に記載の方法。
４９．実施態様１から４４の何れか一項に記載の抗体と細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲート。
５０．細胞傷害性剤が酵素的に活性な毒素又はその断片である、実施態様４９に記載のイムノコンジュゲート。
５１．細胞傷害性剤が、（緑膿菌由来）外毒素Ａ鎖、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、及びトリコテセン（tricothecenes）からなる群から選択される、実施態様５０に記載のイムノコンジュゲート。
５２．細胞傷害性剤がシュードモナス外毒素Ａ又はその変異体である、実施態様４９から５１の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
５３．抗体を細胞傷害性剤に結合させる工程を含む、実施態様４９から５２の何れか一項に記載のイムノコンジュゲートを製造する方法。
５４．抗体がソルターゼ媒介性カップリングによって細胞傷害性剤に結合される、実施態様５３に記載の方法。
５５．結合工程の前に抗体を提供する工程を含む、実施態様５３から５４の何れか一項に記載の方法。
５６．抗体が産生されるように実施態様４６に記載の宿主細胞を培養することによって抗体が提供される、実施態様５５に記載の方法。
５７．結合工程の前に抗体を宿主細胞から回収する工程を更に含む、実施態様５６に記載の方法。
５８．実施態様１から４４の何れか一項に記載の抗体と任意の他のポリペプチドとを含む組換え融合タンパク質。
５９．他のポリペプチドが抗体の重鎖の少なくとも一つに融合されている、実施態様５８に記載の組換え融合タンパク質。
６０．他のポリペプチドが抗体の重鎖の少なくとも一つのＣ末端に融合されている、実施態様５９に記載の組換え融合タンパク質。
６１．ポリペプチドが細胞傷害性剤である、実施態様５８から６０の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
６２．ポリペプチドが酵素的に活性な毒素又はその断片である、実施態様５８から６１の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
６３．細胞傷害性剤が、（緑膿菌由来）外毒素Ａ鎖、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、及びトリコテセン（tricothecenes）からなる群から選択される、実施態様５８から６２の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
６４．細胞傷害性剤がシュードモナス外毒素Ａ又はその変異体である、実施態様５８から６３の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
６５．実施態様５８から６４の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質をコードする単離された核酸。
６６．実施態様６５に記載の核酸を含む宿主細胞。
６７．組換え融合タンパク質が産生されるように実施態様６６に記載の宿主細胞を培養することを含む、組換え融合タンパク質を製造する方法。
６８．組換え融合タンパク質を宿主細胞から回収することを更に含む、実施態様６７に記載の方法。
６９．組換え融合タンパク質が、実施態様１から４４の何れか一項に記載の抗体と細胞傷害性剤とを含むイムノコンジュゲートである、実施態様６７又は６８に記載の方法。
７０．宿主細胞の封入体を単離し、封入体を可溶化することを含む、実施態様６７から６９の何れかに記載の方法。
７１．可溶化された封入体からの物質の再生工程を更に含む、実施態様７０に記載の方法。
７２．宿主細胞が細菌細胞である、実施態様６７から７１の何れかに記載の方法。
７３．宿主細胞が大腸菌である、実施態様６７から７２の何れかに記載の方法。
７４．実施態様１から４４の何れか一項に記載の抗体と薬学的に許容可能な担体とを含有する薬学的製剤。
７５．更なる治療剤を更に含有する、実施態様７４に記載の薬学的製剤。
７６．更なる治療剤が化学療法剤である、実施態様７５に記載の薬学的製剤。
７７．実施態様４９から５２の何れか一項に記載のイムノコンジュゲートと薬学的に許容可能な担体とを含有する薬学的製剤。
７８．更なる治療剤を更に含有する、実施態様７７に記載の薬学的製剤。
７９．更なる治療剤が化学療法剤である、実施態様７８に記載の薬学的製剤。
８０．実施態様５８から６４の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含有する薬学的製剤。
８１．更なる治療剤を更に含有する、実施態様８０に記載の薬学的製剤。
８２．更なる治療剤が化学療法剤である、実施態様８１に記載の薬学的製剤。
８３．放射線療法と組み合わせて投与するための実施態様８０に記載の薬学的製剤。
８４．医薬として使用するための実施態様１から４４の何れか一項に記載の抗体。
８５．がんの治療に使用するための実施態様１から４４の何れか一項に記載の抗体。
８６．がんが、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性（bronchioloalviolar）細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫で、上記がんの何れかの難治型を含み、又は上記がんの一又は複数の組み合わせから選択される、実施態様８５に記載の使用のための抗体。
８７．がんが非小細胞肺がんである、実施態様８５又は８６に記載の使用のための抗体。
８８．医薬の製造における実施態様１から４４の何れか一項に記載の抗体の使用。
８９．医薬ががんの治療のためのものである、実施態様８８に記載の使用。
９０．がんが、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性（bronchioloalviolar）細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫で、上記がんの何れかの難治型を含み、又は上記がんの一又は複数の組み合わせから選択される、実施態様８９に記載の使用。
９１．がんが非小細胞肺がんである、実施態様８９又は９０に記載の使用。
９２．医薬が、一又は複数の化学療法剤及び／又は放射線療法と組み合わせて投与するためのものである、実施態様８９から９１の一項に記載の使用。
９３．実施態様１から４４の何れかに記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法。
９４．個体に更なる治療剤を投与することを更に含む、実施態様９３に記載の方法。
９５．更なる治療剤が化学療法剤である、実施態様９４に記載の方法。
９６．個体に放射線療法を施すことを更に含む、実施態様９３に記載の方法。
９７．医薬として使用するための実施態様４９から５２の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
９８．がんの治療に使用するための実施態様４９から５２の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
９９．がんが、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性（bronchioloalviolar）細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫で、上記がんの何れかの難治型を含み、又は上記がんの一又は複数の組み合わせから選択される、実施態様９８に記載の使用のためのイムノコンジュゲート。
１００．がんが非小細胞肺がんである、実施態様９８又は９９に記載の使用のためのイムノコンジュゲート。
１０１．イムノコンジュゲートが、化学療法剤及び／又は放射線療法と組み合わせて投与するためのものである、実施態様９８から１００の一項に記載の使用のためのイムノコンジュゲート。
１０２．医薬の製造における実施態様４９から５２の何れか一項に記載のイムノコンジュゲートの使用。
１０３．医薬ががんの治療のためのものである、実施態様１０２に記載の使用。
１０４．がんが、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性（bronchioloalviolar）細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫で、上記がんの何れかの難治型を含み、又は上記がんの一又は複数の組み合わせから選択される、実施態様１０３に記載の使用。
１０５．がんが非小細胞肺がんである、実施態様１０３又は１０４に記載の使用。
１０６．イムノコンジュゲートが、一又は複数の化学療法剤及び／又は放射線療法と組み合わせて投与するためのものである、実施態様１０２から１０５の一項に記載の使用。
１０７．実施態様４９から５２の何れか一項に記載のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法。
１０８．個体に更なる治療剤を投与することを更に含む、実施態様１０７に記載の方法。
１０９．更なる治療剤が化学療法剤である、実施態様１０８に記載の方法。
１１０．放射線療法を施すことを更に含む、実施態様１０７から１０９の一項に記載の方法。
１１１．医薬として使用するための実施態様５８から６４の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
１１２．がんの治療に使用するための実施態様５８から６４の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
１１３．がんが、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性（bronchioloalviolar）細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫で、上記がんの何れかの難治型を含み、又は上記がんの一又は複数の組み合わせから選択される、実施態様１１２に記載の使用のための組換え融合タンパク質。
１１４．がんが非小細胞肺がんである、実施態様１１２又は１１３に記載の使用のための組換え融合タンパク質。
１１５．組換え融合タンパク質が、化学療法剤及び／又は放射線療法と組み合わせて投与するためのものである、実施態様１１２から１１４の一項に記載の使用のための組換え融合タンパク質。
１１６．医薬の製造における実施態様５８から６４の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質の使用。
１１７．医薬ががんの治療のためのものである、実施態様１１６に記載の使用。
１１８．がんが、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性（bronchioloalviolar）細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫で、上記がんの何れかの難治型を含み、又は上記がんの一又は複数の組み合わせから選択される、実施態様１１７に記載の使用。
１１９．がんが非小細胞肺がんである、実施態様１１７又は１１８に記載の使用。
１２０．組換え融合タンパク質が、一又は複数の化学療法剤及び／又は放射線療法と組み合わせて投与するためのものである、実施態様１１７から１１９の一項に記載の使用。
１２１．実施態様５８から６４の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法。
１２２．個体に更なる治療剤を投与することを更に含む、実施態様１２１に記載の方法。
１２３．更なる治療剤が化学療法剤である、実施態様１２２に記載の方法。
１２４．放射線療法を施すことを更に含む、実施態様１２１から１２３の一項に記載の方法。
１２５．ＴＰＢＧに結合する抗体であってヒト及びミニブタＴＰＢＧに結合する抗体をスクリーニングする方法において、試験抗体のヒトＴＰＢＧ及びミニブタＴＰＢＧへの結合を試験する工程と、ヒトＴＰＢＧ及びミニブタＴＰＢＧに結合する抗体を選択する工程とを含む、方法。
１２６．ヒトＴＰＢＧ及びミニブタＴＰＢＧに１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する抗体を選択する工程を含む、実施態様１２５に記載の方法。
１２７．方法が治療的適用のための抗体をスクリーニングするためのものである、実施態様１２５又は１２６に記載の方法。
１２８．方法が実施態様１から４４に記載の抗体をスクリーニングするためのものである、実施態様１２５から１２７の何れか一項に記載の方法。
１２９．一価形態の試験抗体の結合を試験する工程を含む、実施態様１２５から１２８の何れか一項に記載の方法。
１３０．ｐＨ５．５とｐＨ７．２でのヒトＴＰＢＧへの試験抗体の結合を試験する工程と、ｐＨ５．５とｐＨ７．２でヒトＴＰＢＧに結合する抗体を選択する工程を含む、実施態様１２５から１２９の何れか一項に記載の方法。
１３１．ｐＨ５．５とｐＨ７．４でのヒトＴＰＢＧへの試験抗体の結合を試験する工程と、ｐＨ５．５とｐＨ７．４でヒトＴＰＢＧに結合する抗体を選択する工程を含む、実施態様１２５から１３０の何れか一項に記載の方法。
１３２．ｐＨ５．５とｐＨ７．４でヒトＴＰＢＧに１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する抗体を選択する工程を含む、実施態様１３１に記載の方法。
１３３．実施態様１２５から１３２の何れか一項に記載の方法によって得られる抗体。
１３４．ＴＰＢＧに結合する抗体であってヒトＴＰＢＧ及びミニブタＴＰＢＧに結合する抗体を作製する方法において、（ａ）ヒトＴＰＢＧで又はヒトＴＢＰＧ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）で動物を免疫する工程、（ｂ）動物の血液からヒトＴＰＢＧに特異的なＢ細胞を単離する工程、（ｃ）単離されたＢ細胞によって産生される抗体の可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）のアミノ酸配列を同定する工程、（ｄ）同定された可変ドメインを含む抗体を提供する工程、（ｅ）提供された抗体のヒトＴＰＢＧとミニブタＴＰＢＧへの結合を試験する工程、及び（ｆ）ヒトＴＰＢＧ及びミニブタＴＰＢＧに結合する抗体を選択する工程を含む、方法。
１３５．ヒトＴＰＢＧ及びミニブタＴＰＢＧに１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する抗体を選択する工程を含む、実施態様１３４に記載の方法。
１３６．治療的適用のための抗体を作製するための方法である、実施態様１３４又は１３５に記載の方法。
１３７．実施態様１から４４に記載の抗体をスクリーニングするための方法である、実施態様１３４から１３６の何れか一項に記載の方法。
１３８．動物がげっ歯類である、実施態様１３４から１３７の何れか一項に記載の方法。
１３９．動物がウサギである、実施態様１３４から１３８の何れか一項に記載の方法。
１４０．一価形態の提供された抗体の結合を試験する工程を含む、実施態様１３４から１３９の何れか一項に記載の方法。
１４１．ｐＨ５．５とｐＨ７．２でのヒトＴＰＢＧへの提供された抗体の結合を試験する工程と、ｐＨ５．５とｐＨ７．２でヒトＴＰＢＧに結合する抗体を選択する工程を含む、実施態様１３４から１４０の何れか一項に記載の方法。
１４２．ｐＨ５．５とｐＨ７．４でのヒトＴＰＢＧへの試験抗体の結合を試験する工程と、ｐＨ５．５とｐＨ７．４でヒトＴＰＢＧに結合する抗体を選択する工程を含む、実施態様１３４から１４１の何れか一項に記載の方法。
１４３．ｐＨ５．５とｐＨ７．４でヒトＴＰＢＧに１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する抗体を選択する工程を含む、実施態様１４２に記載の方法。
１４４．実施態様１３４から１４３の何れか一項に記載の方法によって得られる抗体。
Ｖ．アミノ酸配列の説明
ＶＩ．実施例
次は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、様々な他の実施態様が実施されうることが理解される。
上記の発明は、理解を明確にするために、例示及び実施例によって幾らか詳細に記載されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。ここで引用された全ての特許及び科学文献の開示は、その全体が出典明示により明示的に援用される。
材料及び一般的方法
（組換えＤＮＡ技術）
Sambrook, J.等, Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は製造者の説明書に従って使用した。
（ＤＮＡ及びタンパク質配列解析及び配列データ管理）
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A.等, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, ５版, NIH Publication No 91-3242に与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、ＥＵ番号付け（Edelman, G.M.等, PNAS 63 (1969) 78-85；Kabat, E.A.等, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, ５版, NIH Publication No 91-3242）に従って番号付けされる。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅバージョン１１．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、配列作成、マッピング、解析、アノテーション及び図解に使用した。
（ＤＮＡ配列決定）
ＤＮＡ配列は、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施された二本鎖配列決定により決定した。
（遺伝子合成）
所望の遺伝子セグメントは、自動遺伝子合成により、合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製された。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントをｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングした。形質転換細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光測定法により濃度を定量した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
実施例１：
ミニブタ及びカニクイザルにおけるＴＰＢＧ−ＲＮＡの発現
ＴＰＢＧ特異的抗体又はそのコンジュゲートをそれらの許容性について評価するためにカニクイザルが過去に使用されていた（Sapra等(2013) Mol Canc Ther 12: 38-47）。カニクイザル及びミニブタの１４の異なる組織を調製し、ｍＲＮＡ発現プロファイルを評価した。Ｒｏｃｈｅのカニクイザル及びミニブタＲＮＡｓｅｑ−ｐｒｏｊｅｃｔから得られた組織ＲＮＡの配列決定による転写プロファイリングを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００上で、平均深度３０００万リードペアを有するインデックス付きの７５ｂｐのペアードエンドランとして評価した。遺伝子発現シグナルは、発現レベル中央値及び標準偏差を示す対数尺度での百万リード当たりキロベースエキソンモデル当たりのユニークリード（ｒｐｋｍ）として示される。
得られたシグナルを互いに比較した。その結果は、ミニブタとカニクイザルのＲＮＡ発現プロファイルがほぼ同等であることを示唆している。よって、ミニブタは、新規なミニブタ交差反応性抗ＴＰＢＧ抗体及びＦａｂ−ＰＥコンストラクトを評価するのに適した毒物学種である（図１）。
実施例２：
ＴＰＢＧの細胞外ドメインのクローニング及び一過性発現
細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む何れかの全長ＴＰＢＧのｃＤＮＡ又はその断片を、真核生物発現ベクターにクローニングした。クローニングは標準的な制限消化により実施した。Ｃ末端ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ部位と続くＨＩＳ６−Ａｖｉエピトープタグ又はＣ末端ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ部位と続くｈｕＩｇＧ１−Ｆｃ−ＨＩＳ６エピトープタグを含むプラスミドについて、部位特異的クローニングを、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素を用いて実施した。標準的な分子生物学的手法に従って、プラスミドを配列検証し、増幅した。
ＴＰＢＧの細胞外ドメイン又はその断片を含むプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｆ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞中で一過性にトランスフェクトした。簡単に述べると、細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）発現培地中で培養した。トランスフェクションの前日に、細胞を１×１０６／ｍｌ培地の密度で播種した。翌日、培地１ｍｌ当たり１μｇのプラスミドＤＮＡを使用した。２９３Ｆｒｅｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）トランスフェクション試薬を一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクションされた細胞を、三角フラスコ中で１２５〜１３０ｒｐｍで振盪させながら３７℃及び８％ＣＯ２で７日間インキュベートした。上清を採取し、−８０℃で凍結させるか又はタンパク質精製のために直接処理した。
実施例３：
組換えＴＰＢＧの精製
ｈｕＩｇＧ１−Ｆｃ−ＨＩＳ６エピトープタグを含む組換えＴＰＢＧ（ヒトＴＰＢＧ：配列番号：２８；ミニブタＴＰＧＢ：配列番号：３０；カニクイザルＴＰＢＧ：配列番号：３２；マウスＴＰＢＧ：配列番号：３４、ラットＴＰＢＧ：配列番号：３６；列挙の配列は全てシグナルペプチドを含む）を、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＸｔｒａプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して細胞培養上清から精製した。溶出は酸性条件下（１００ｍＭのクエン酸緩衝液，ｐＨ３．０）で起こった。少量のＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９．０）の添加により溶離液のｐＨを中和した。ＨＩＳ６−Ａｖｉエピトープタグを含む組換えＴＰＢＧ（ヒトＴＰＢＧ：配列番号：２７；ミニブタＴＰＧＢ：配列番号：２９；カニクイザルＴＰＢＧ：配列番号：３１；マウスＴＰＢＧ：配列番号：３３、ラットＴＰＢＧ：配列番号：３５、列挙の配列は全てシグナルペプチドを含む）を、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを使用して細胞培養上清から精製した。溶出はイミダゾール段階勾配で行った。続いて、アフィニティー精製タンパク質を、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００プレップグレード（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）サイズ排除カラムにロードした。生成物ピークを収集し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた超遠心分離によって容量を調整した。最終貯蔵緩衝液は、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ５．５から構成された。
実施例４：
ＴＰＢＧに対するウサギの免疫化
ヒト化抗体レパートリーを発現するＲｏｃｈｅ所有のトランスジェニックウサギを、組換えＴＰＢＧタンパク質を用いるか又は遺伝的に免疫化した。
３匹１セットのウサギを、０日目に皮内適用により完全フロイントアジュバントで乳化させたｈｕＦｃに結合した４００μｇの組換えヒトＴＰＢＧ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を用いて、また７、１４、２８、５６及び８４日目に筋肉内適用と皮下適用を交互に行うことによって完全フロイントアジュバントで乳化させた各２００μｇのＴＰＢＧ−ｈｕＦｃを用いて、免疫化した。２０、３４、６２及び９０日目に血液（推定された総血液量の１０％）を採取した。血清を調製し、これをＥＬＩＳＡ（下記参照）による力価測定に使用し、末梢単核細胞を単離し、これを、Ｂ細胞クローニングプロセスにおける抗原特異的Ｂ細胞の供給源として使用した。
３匹の別のセットのウサギを、全長ヒトＴＰＢＧをコードするプラスミド発現ベクターを使用し、４００μｇのベクターＤＮＡの皮内適用と、続くエレクトロポレーション（７５０Ｖ／ｃｍの５平方パルス、持続時間１０ｍｓ、間隔１ｓ）によって遺伝的に免疫化した。ウサギは、０、１４、２８、４９、７０、９８及び１２６日目に７回の連続した免疫化を受けた。血液（推定された総血液量の１０％）を３５、７７、１０５及び１３３日目に採取した。血清を調製し、これをＥＬＩＳＡ（下記参照）による力価測定に使用し、末梢単核細胞を単離し、これを、Ｂ細胞クローニングプロセスにおける抗原特異的Ｂ細胞の供給源として使用した。
実施例５：
免疫したウサギの血清力価の定量（ＥＬＩＳＡ）
ヒト組換え可溶性ＴＰＢＧ細胞外ドメインを、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウェル）で９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に固定し、続いて、そのプレートをＰＢＳ中２％のクロテインＣ（２００μｌ／ウェル）を用いて遮断し；ＰＢＳ中０．５％クロテインＣ中の抗血清の段階希釈液（１００μｌ／ウェル）（二通り）を適用し；（１）ＨＲＰにコンジュゲートしたロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｄｉａｎｏｖａ）か、又は（２）ＨＲＰにコンジュゲートしたウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１／５０００）か、又は（３）ビオチン化ヤギ抗ヒトκ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｂｉｏｚｏｌ；１／５０００）及びストレプトアビジン−ＨＲＰ（それぞれＰＢＳ中０．５％クロテインＣ（１００μｌ／ウェル）で希釈）の何れかを用いて検出した。全ての工程について、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。全ての工程の間、プレートをＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。シグナルは、可溶性のＢＭブルーＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ）（１００μｌ／ウェル）の添加により発生させ；１ＭのＨＣｌ（１００μｌ／ウェル）の添加により停止させた。吸光度は、４５０ｎｍにおいて、６９０ｎｍを参照として、読み取られた。力価は、最大値の半分のシグナルをもたらす抗血清の希釈として定義された。
実施例６：
ＴＰＢＧ特異的Ｂ細胞の単離
免疫したウサギから血液試料を採取した。ＥＤＴＡ含有全血を１×ＰＢＳ（ＰＡＡ，Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）で２倍に希釈した後、製造者の仕様に従ってリンパ球分離溶液ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ ｍａｍｍａｌ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用し密度遠心分離した。ＰＢＭＣを１×ＰＢＳで２回洗浄した。滅菌ストレプトアビジンを被覆した６ウェルプレート（Ｍｉｃｒｏｃｏａｔ，Ｂｅｒｎｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、室温において３時間、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのヒトＴＰＢＧタンパク質のビオチン化細胞外ドメインで被覆した。パンニング工程の前に、これらの６ウェルプレートを滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＭＣを滅菌６ウェルプレート（細胞培養グレード）に播種して、非特異的接着によってマクロファージ及び単球を枯渇させた。各ウェルを、最大４ｍｌの培地と免疫化ウサギ由来の最大６×１０ｅ６のＰＢＭＣで満たし、３７℃及び５％ＣＯ２において１時間結合させた。上清中の細胞（末梢血リンパ球（ＰＢＬ））を抗原パニング工程に使用した。ＴＰＢＧタンパク質で被覆された６ウェルプレートに、培地４ｍｌ当たり６×１０ｅ６までのＰＢＬを播種し、３７℃及び５％ＣＯ２において１時間結合させて、ＴＰＢＧ特異的Ｂ細胞を濃縮した。１×ＰＢＳを用いてウェルを慎重に１〜２回洗浄することにより、非接着細胞を除去した。残りの粘着性細胞は、３７℃、５％ＣＯ２において１０分間、トリプシンにより脱着させた。トリプシン処理は、１０％のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）、２ｍＭのグルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＰＡＡ，Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び０．０５ｍＭのｂ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を補填したＥＬ−４ Ｂ５培地（ＥＬ−４ Ｂ５：ＲＰＭＩ１６４０（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて停止した。細胞を免疫蛍光染色まで氷上に維持した。抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を単一細胞選別に使用した。表面の染色のために、枯渇及び富化工程からの細胞をＰＢＳ中の抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ抗体と共にインキュベートし、４℃の暗所において４５分間インキュベートした。染色後、ＰＢＬを氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。最後にＰＢＬを氷冷ＰＢＳに再懸濁し、直ちにＦＡＣＳ分析に供した。５μｇ／ｍｌの濃度のヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）をＦＡＣＳ分析の前に添加して、死細胞と生細胞を区別した。コンピュータとＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを備えたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）を単一細胞選別に使用した。ウサギＢ細胞の培養は、Seeber S.等, PLoS One. 2014 Feb 4;9(2):e86184に記載の方法により行った。簡潔に述べると、単一選別したウサギＢ細胞を、インキュベーターにおいて３７℃で７日間、Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ細胞（１：１０００００）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃｋ），Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）、５％のウサギ胸腺細胞上清（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ，Ｂｅｒｎｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びガンマ線照射マウスＥＬ−４Ｂ５胸腺腫細胞（２．５×１０ｅ４細胞／ウェル）を含む２００μｌ／ウェルのＥＬ−４ Ｂ５培地と共にインキュベートした。Ｂ細胞培養の上清をスクリーニングのために除去し、残りの細胞を直ちに収集し、１００μｌのＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中−８０℃で凍結させた。
実施例７：
Ｂ細胞ＰＣＲ
全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従って、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ８／９６ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ）を使用してＢ細胞溶解液（ＲＬＴ緩衝液−Ｑｉａｇｅｎに再懸濁）から調製した。ＲＮＡをリボヌクレアーゼフリーの水６０μｌを用いて溶出させた。６μｌのＲＮＡを使用して、製造業者の説明書に従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩファーストストランド合成スーパーミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びオリゴｄＴ−プライマーを使用して逆転写酵素反応によってｃＤＮＡを作製した。全ての工程はＨａｍｉｌｔｏｎ社のＭＬ Ｓｔａｒシステムで実施した。４μｌのｃＤＮＡを使用して、重鎖についてはプライマーｒｂＨＣ．ｕｐ及びｒｂＨＣ．ｄｏ、軽鎖についてはＢｃＰＣＲ＿ＦＨＬＣ＿ｌｅａｄｅｒ．ｆｗ及びＢｃＰＣＲ＿ｈｕＣｋａｐｐａ．ｒｅｖを使用して最終容量５０μｌ中でＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を増幅した。全ての正方向プライマーは、（それぞれＶＨ及びＶＬの）シグナルペプチドに対して特異的であったが、逆方向プライマーは、（それぞれＶＨ及びＶＬの）定常領域に対して特異的であった。ＲｂＶＨ＋ＲｂＶＬのＰＣＲ条件は次の通りであった：ホットスタート、９４℃で５分間；９４℃で２０秒、７０℃で２０秒、６８℃で４５秒の３５サイクル、及び６８℃で７分の最終伸張。ＨｕＶＬのＰＣＲ条件は次の通りであった：ホットスタート、９４℃で５分間；９４℃で２０秒、５２℃で２０秒、６８℃で４５秒の４０サイクル、及び６８℃で７分の最終伸張。
プライマー配列：
５０μｌ中８μｌのＰＣＲ溶液を、４８Ｅ−Ｇｅｌ２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇ８００８−０２）にロードした。陽性ＰＣＲ反応物を、製造業者のプロトコールに従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ；７４０６０９２５０）を使用して洗浄し、５０μｌの溶出緩衝液中で溶出させた。全ての洗浄工程をＨａｍｉｌｔｏｎ ＭＬ Ｓｔａｒｌｅｔシステムで実施した。
実施例８：
異なる種のＴＰＢＧへのＴＰＢＧ特異的Ｆａｂ断片の結合
異なる種の組換えＴＰＢＧの結合を評価するために、Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジン被覆プレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を、ヒト、カニクイザル、及びミニブタＴＰＢＧについては１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、マウス及びラットＴＰＢＧについては５００ｎｇ／ｍｌの濃度で、関連する種（ｈｕ＝ヒト；ｍｕ＝マウス；ｒｔ＝ラット；ｃｙ＝カニクイザル；ｍｐ＝ミニブタ）の２５μｌ／ウェルのビオチン化ＴＰＢＧ−ＡｖｉＨｉｓを用いて被覆した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、抗ＴＰＢＧ試料を２μｇ／ｍｌで開始する１：２希釈系列で加え、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ抗ｃ−ｍｙｃ ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ，＃Ａ１９０−１０４Ｐ）又はヤギ抗ｈｕκＨＲＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，＃ＡＰ５０２Ｐ）を１：７０００又は１：４０００希釈でそれぞれ加え、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，＃ＣＬ０７）を加え、ヒト及びミニブタＴＰＢＧに対して、２分、カニクイザルＴＰＢＧに対して３分、並びにマウス及びラットＴＰＢＧに対して４分、インキュベートした。Ｓａｆｉｒｅ２リーダー（Ｔｅｃａｎ）上で３７０／４９２ｎｍで測定を行った。
ヒトＴＰＢＧの細胞結合を評価するために、ＴＰＢＧを内因的に発現するヒト乳がん腫瘍細胞株ＭＦＣ７を、３８４ウェル細胞コートポリ−Ｄ−リジンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，＃７８１９４０）中に２１０００細胞／ウェルの濃度で播種した。細胞を３７℃で一晩付着させた。上清を除去した後、抗ＴＰＢＧ抗体を含む２５μｌ／ウェルの上清を５μｇ／ｍｌで開始する１：２希釈系列で加え、４℃で１時間インキュベートした。洗浄（２×５０μｌ／ウェルＰＢＳＴ）の際、１×ＰＢＳ緩衝液で希釈した０．０５％のグルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，２５％）５０μｌ／ウェルを添加することにより細胞を固定し、室温で１０分間インキュベートした。洗浄後（３回；９０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔ）、２５μｌ／ウェルの二次抗体ヤギ抗ｃ−ｍｙｃ ＨＲＰ（１：５０００，Ｂｅｔｈｙｌ）を検出用に添加し、続いて振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（３回；９０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔ）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を加えた。室温で１０分後、Ｓａｆｉｒｅ２リーダー（Ｔｅｃａｎ）上で３７０／４９２ｎｍで測定を行った。
０５１、０９１、及び０９７のＦａｂ断片は、ヒト及びミニブタＴＰＢＧの間で交差反応性であることが見出された。ヒト乳がん細胞株の細胞上に発現されたヒトＴＰＢＧの細胞結合が確認された。
実施例９：
異なる種のＴＰＢＧへの精製抗体（ｍＡｂ）の結合［従来技術との比較］
Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，４６４７１８）を、ラット、ミニブタ、マウス、カニクイザルについて１μｇ／ｍｌの濃度で、ヒトＴＰＢＧについて５００ｎｇ／ｍｌの濃度で、２５μｌ／ウェルのＦｃ−ＴＰＢＧで被覆した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。洗浄後（３×９０μｌ／ウェル；ＰＢＳ−Ｔ緩衝液）、室温において１時間、９０μｌのブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）でプレートを遮断した。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、抗ＴＰＢＧ抗体を、１μｇ／ｍｌで開始する１：２希釈系列で加え、室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ抗カッパ抗体−ＰＯＤコンジュゲート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＡＰ５０２Ｐ）又はロバ抗ウサギＦｃ抗体−ＰＯＤコンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＮＡ９３１０Ｖ）を、それぞれ１：４０００の希釈又は１：１０００の希釈で加え、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，カタログ番号：１１８３５０３３００１）を加え、５分間インキュベートした。Ｓａｆｉｒｅ２リーダー（Ｔｅｃａｎ）上で３７０／４９２ｎｍで測定を行った。
比較のため、国際公開第２００６／０３１６５３号（国際公開第２００６／０３１６５３号の配列番号：２及び１に示されたそのＶＨ及びＶＬドメインアミノ酸配列によって定義される抗体Ｈ８）及び国際公開第２００７／１０６７４４号（国際公開第２００７／１０６７４４号の表２に示されるそのＶＨ及びＶＬドメインアミノ酸配列によって定義される抗体Ａ１、Ａ２、Ａ３）に開示された従来技術の抗体を並行して評価した。
実施例１０：
従来技術の抗体Ａ１、Ａ２、及びＡ３との抗体（ｍＡｂ）０５１、０９１及び０９７の結合の競合
３８４ウェルのＴＲＳＡ−ＳＡ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ）プレートを、２００ｎｇ／ｍｌの濃度の２５μｌ／ウェルのビオチン化ヒトＴＰＢＧ−ＡｖｉＨｉｓで被覆し、続いて４℃で一晩インキュベートした。９０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、抗体Ａ１、Ａ２、Ａ３を４μｇ／ｍｌの濃度で加え、続いて室温において１時間インキュベートした。ウェルを９０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。抗ＴＰＢＧ抗体を０．１μｇ／ｍｌの濃度で添加し、振盪機上で室温において１時間インキュベートした。９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄した後、２５μｌ／ウェルのヤギ抗ｃ−ｍｙｃ ＨＲＰ（１：６０００，Ｂｅｔｈｙｌ）を加え、続いて振盪機上で室温において１時間インキュベートした。洗浄後（３回；９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加した。室温において１０分後、Ｓａｆｉｒｅ２リーダー（Ｔｅｃａｎ）上で３７０／４９２ｎｍで測定を行った。
結果は、抗ＴＰＢＧ抗体０５１、０９１及び０９７が、示された従来技術の抗体とＴＰＢＧ上の異なるエピトープに結合することを示している。
実施例１１：
ＴＰＢＧ特異的Ｆａｂのクローニング及び発現
（ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現）
ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現のために、ＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ産物を、オーバーハングクローニング法（RS Haun等, Biotechniques (1992) 13, 515-518；MZ Li等, Nature Methods (2007) 4, 251-256）によって発現ベクター中にｃＤＮＡとしてクローニングした。発現ベクターは、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモーターと、３’ＢＧＨポリアデニル化配列とからなる発現カセットを含んでいた。発現カセットに加えて、プラスミドはｐＵＣ１８由来の複製起点と大腸菌中でのプラスミド増幅のためにアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。三つの基本的プラスミド変異体を使用した：一つのプラスミドは、ＶＨ領域を受け入れるように設計されたウサギＩｇＧ定常領域を含み、二つの更なるプラスミドは、ＶＬ領域を受け入れるためのウサギ又はヒトκＬＣ定常領域を含んでいる。
カッパ又はガンマ定常領域及びＶＬ／ＶＨ挿入断片をコードしている鎖状化発現プラスミドを、重複プライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。
精製ＰＣＲ産物をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートし、一本鎖オーバーハングを作製した。反応をｄＣＴＰの添加によって停止させた。
次の工程では、プラスミド及び挿入断片を組合せ、部位特異的組換えを誘導するｒｅｃＡと共にインキュベートした。組換えプラスミドを大腸菌中に形質転換した。翌日、成長したコロニーを採取し、プラスミドの調製、制限分析及びＤＮＡ配列解析によって正しい組換えプラスミドについて試験した。
抗体発現のために、単離されたＨＣ及びＬＣプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に一過性に同時トランスフェクションし、上清を１週間後に収集した。
（ウサギモノクローナル一価抗体の組換え発現）
モノクローナル一価抗体として選択された候補の組換え発現のために、全てのＶＨ鎖のウサギ定常領域を、ＣＨ３セグメントにノブ変異を封入するヒト定常領域に転換させた。ウサギ野生型Ｂ細胞由来のＶＬ鎖については、ウサギＣカッパ定常領域をヒトに転換させた。選択された候補の４μｌのｃＤＮＡを使用して、シグナルペプチドに特異的な順方向プライマー及び（それぞれＶＨ及びＶＬの）ヒト定常領域に相同な重複配列（２０ｂｐ）を（３’末端に）有するＣＤＲ３−Ｊ領域に特異的な逆方向プライマーを用いて５０μｌの最終容量で、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２３４４−０４０）を用いて免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域を増幅した。ＶＨ及びＶＬ鎖増幅のためのＰＣＲ条件は次の通りであった：ホットスタート、９４℃で５分間；９４℃で２０秒、６８℃で２０秒、６８℃で４５秒の３５サイクル、及び６８℃で７分の最終伸張。
ＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ産物を、オーバーハングクローニング法（RS Haun等, Biotechniques (1992) 13, 515-518；MZ Li等, Nature Methods (2007) 4, 251-256）によって発現ベクター中にｃＤＮＡとしてクローニングした。発現ベクターは、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモーターと、３’ＢＧＨポリアデニル化配列とからなる発現カセットを含んでいた。発現カセットに加えて、プラスミドはｐＵＣ１８由来の複製起点と大腸菌中でのプラスミド増幅のためにアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。二つの基本的プラスミド変異体を使用した：一つのプラスミドは、新しい増幅されたＶＨ鎖を受け入れるように設計されたヒトＩｇＧ定常領域を含み、第二のプラスミドは、ＶＬ鎖を受け入れるためのヒトκＬＣ定常領域を含んでいる。
カッパ又はガンマ定常領域及びＶＬ／ＶＨ挿入断片をコードしている鎖状化発現プラスミドを、重複プライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。
精製ＰＣＲ産物をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートし、一本鎖オーバーハングを作製した。反応をｄＣＴＰの添加によって停止させた。
次の工程では、プラスミド及び挿入断片を組合せ、部位特異的組換えを誘導するｒｅｃＡと共にインキュベートした。組換えプラスミドを大腸菌中に形質転換した。翌日、成長したコロニーを採取し、プラスミドの調製、制限分析及びＤＮＡ配列解析によって正しい組換えプラスミドについて試験した。
次のポリペプチドを作製した：
実施例１２：
切断型ＧＧＧ−ＰＥ２４変異体（ＬＲ８Ｍ）へのＦａｂ断片のソルターゼカップリング
抗ＴＰＢＧ抗体Ｆａｂ断片と緑膿菌の外毒素Ａ鎖の切断型変異体のイムノコンジュゲートを、ソルターゼを用いた酵素的カップリングによって作製した。
次のポリペプチドを使用した：
ＨＥＫ２９３−Ｆ（Ｃ末端にＬＰＥＴＧ−ＨＩＳ６モチーフを有する）及びＧＧＧ−ＰＥ２４ ＬＲ８Ｍ（文献で公表されている大腸菌抽出物から精製）で一過性に発現された精製Ｆａｂ断片を、２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２，ｐＨ７．５中、７〜８ｍｇ／ｍｌに濃縮した。両タンパク質を１：１のモル比で混合した。カップリング反応は、ＨＩＳ標識ソルターゼ（０．８モル当量）を加えることによって開始した。３７℃で１時間インキュベートした後、反応混合物をＮｉ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でクロマトグラフィー処理して、未結合Ｆａｂ及びソルターゼを除去した。カップリングしたＦａｂ−ＰＥ２４は、フロースルーで溶出され、２０ｍＭのＨｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ６．０中でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過カラムで更に精製した。最終生成物を１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、アリコートを−８０℃で凍結させた。
実施例１３：
Ｆａｂ−ＰＥの発現及び封入体の単離
抗ＴＰＢＧ抗体Ｆａｂ断片及び緑膿菌の外毒素Ａ鎖の切断型変異体のイムノコンジュゲートを、大腸菌細胞中で組換え融合タンパク質としてのイムノコンジュゲートの発現によって作製した。毒素は、抗ＴＰＢＧ抗体の重鎖のＣ末端に融合した。
次のポリペプチドを使用した：
可変軽鎖コンストラクト（ＬＣ）及び可変重鎖コンストラクト（ＨＣ−ＰＥ）を、Ｒｏｃｈｅ社内の抗生物質不使用の発現系（欧州特許出願公開第０９７２８３８号及び米国特許第６２９１２４５号）及び化学的に定まったアルカリ性給餌培地（国際公開第２０１２／０２８５２２号）を適用して大腸菌細胞中で産生した。全ての発酵において、生成物は封入体として細胞質の不溶性画分に位置し、これを単離し、可溶化した。ついで、可溶化したＩＢ材料を、再生プロセス中にその各パートナーと組み合わせて、ＴＰＢＧ結合Ｆａｂ−ＰＥ融合分子を生じさせた。簡潔に述べると、大腸菌Ｋ１２株ＣＳＰＺ−２５（ｔｈｉ−１、ΔｏｍｐＴ、ΔｐｙｒＦ、Δｌｏｎ、ΔｇａｌＥ）を、関連する発現プラスミドを用いたエレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換した大腸菌細胞を先ず寒天プレート上で３７℃で成長させた。各形質転換に対して、このプレートから選んだコロニーを３ｍＬのローラー培養に移し、３７℃で１〜２の光学密度（５７８ｎｍで測定）まで増殖させた。次に、１０００μｌの培養物を１０００μｌの滅菌８６％−グリセロールと混合し、直ちに−８０℃で凍結させて長期保存した。これらのクローンの正確な産物発現を、小規模の振盪フラスコ実験で確認し、ＳＤＳ−Ｐａｇｅで分析した。
前培養のために、４つのバッフルを備えた一つの１０００ｍＬ振盪フラスコに、研究用種子バンクアンプルのうち１．０ｍＬを接種した。４〜８の光学密度（５７８ｎｍ）が得られるまで、培養を、３７℃、１７０ｒｐｍで８〜１１時間回転振盪機上で実施した。１００ｍｌの前培養を使用して、１０Ｌのバイオリアクターに接種した。培養２４時間後、全ブロスを４〜８℃に冷却し、発酵槽に一晩保存した。フロースルー遠心分離機（１３０００ｒｐｍ、１３ｌ／ｈ）による遠心分離によって細菌を収集し、得られたバイオマスを封入体分離法で直ちに処理するか、又は更なる処理まで−２０℃で保存した。
１２．１ｇ／ｌのトリス、０．２４６ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１２ｍｌ／ｌの２５％−ＨＣｌを含む緩衝液中での細胞ペレットの再懸濁を伴う細菌収集の直後に、１０Ｌ発酵の封入体調製（ＩＢＰ）を常套的に開始した。緩衝液の容量はバイオマスの乾物含量に依存して計算した。リゾチーム（１００ｋＵ／ｍｇ）と少量のベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）ＴＭを追加した。ついで、懸濁液を、細菌細胞を破砕するために９００ｂａｒ（ＡＰＶ Ｒａｎｎｉｅ５、１パス）でホモジナイズし、ベンゾナーゼの更なる添加と３０〜３７℃での３０分間のインキュベーションを続けた。ついで、第一洗浄緩衝液（６０ｇ／ＬのＢｒｉｊ、８７．６ｇ／ｌのＮａＣｌ、２２．５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、６ｍｌ／ｌの１０ＮのＮａＯＨ）を加え、再度、懸濁液を３０分間インキュベートした。続く遠心分離工程（ＢＰ１２、Ｓｏｒｖａｌｌ）により封入体スラリーが得られ、これを、第二洗浄緩衝液（１２．１ｇ／ｌのトリス、７．４ｇ／ｌのＥＤＴＡ、１１ｍｌ／ｌの２５％−ＨＣｌ）に再懸濁し、２０分間インキュベートした。更なる分離工程により封入体が得られ、これは−２０℃で凍結保存されるか、又は直ちにＤＳＰ部門に移される。
実施例１４：
抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質の再生及び精製
ＨＣ−ＰＥ及びＬＣ（ＨＣ＝重鎖；ＬＣ＝軽鎖）の封入体を、室温において２時間、６．７Ｍのグアニジニウム塩酸塩、１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ、５ｍＭの酢酸塩、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０＋１００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）中で別個に可溶化した。可溶化した物質をｐＨ５に調整し、１０００ｋＤａの膜を使用して精密濾過した（６．７Ｍのグアニジニウム−ＨＣｌ、１００ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸塩、１００ｍＭのＤＴＴ ｐＨ５．０）。ＤＴＴを除去するため及び濃度のための６．７Ｍのグアニジニウム−ＨＣｌ、１００ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．０に対する透析濾過の後、総タンパク質濃度をビウレット法を使用して定量した。ＨＣ及びＬＣ含量の純度は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して推定した。可溶化液を、２〜１０℃において０．５Ｍのアルギニン、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ１０＋１ｍＭのＧＳＨ／ＧＳＳＧをそれぞれ含む再生緩衝液で１：１のモル比で希釈した。標的タンパク質濃度は、２回の用量間に２時間のインキュベーション時間を伴わせて、０．５ｇ／Ｌまで４段階で増加させた。その後、再生溶液を２〜１０℃に一晩維持した。再生液を、２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、４０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４（ＴＰＢＧ−０１９９についてはｐＨ８．０）に対して透析濾過し、２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、４０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４（ＴＰＢＧ−０１９９についてはｐＨ８．０）で平衡化した陰イオン交換カラム（ＡｌＥＸ）上にポンピングした。カラムを平衡緩衝液で洗浄した後、タンパク質を２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、３２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＴＰＢＧ−０１９９についてはｐＨ８．０）までの勾配で溶出させた。Ｆａｂ−ＰＥを含むピーク画分をプールし、濃縮し、２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の調製用サイズ排除カラム（ＳＥＣ）上に適用して、凝集物、断片及び大腸菌タンパク質を除去した。最終タンパク質プールを必要とされるタンパク質濃度に調整し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、分析用ＳＥＣ及びＵＶ２８０により分析し、同一性を質量分析によって確認した。
実施例１５：
タンパク質のＭＳ分析及び同一性確認
Ｆａｂ断片のアミノ酸骨格の正確な分子量（同一性）及び完全性は、事前の還元を伴う及びこれを伴わないエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法により確認した。還元は、ＴＣＥＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施された。脱塩は、アイソクラティックなギ酸勾配を使用して、自己充填Ｇ２５−Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムで実施された。ＥＳＩ質量スペクトル（＋ｖｅ）を、ナノＥＳＩ源（ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ，Ａｄｖｉｏｎ）を備えたＱ−ＴＯＦ機器（ｍａＸｉｓ，Ｂｒｕｋｅｒ）で記録した。ＭＳパラメーターの設定は次の通りであった：移動：ファンネルＲＦ、４００Ｖｐｐ；ＩＳＣＩＤエネルギー、０又は８５ｅＶ；多重極ＲＦ、４００Ｖｐｐ；四重極：イオンエネルギー、３．０ｅＶ；低質量、８５０ｍ／ｚ；供給源：乾燥ガス、８Ｌ／分；乾燥ガス温度、１６０℃；衝突セル：衝突エネルギー、８ｅＶ；衝突ＲＦ：３８００Ｖｐｐ；イオンクーラー：イオンクーラーＲＦ、８００Ｖｐｐ；移動時間：１４０μ秒；プレパルス蓄積、２０μ秒；スキャン範囲ｍ／ｚ６００〜２０００及びｍ／ｚ１０００〜４０００。データを評価するために、（社内で開発した）ＭａｓｓＡｎａｌｙｚｅｒソフトウェアを使用した。
実施例１６：
安定したＴＰＢＧを発現するＣＨＯ細胞株の作製
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、異なる種、すなわちヒト又はミニブタ由来の全長ＴＰＢＧで安定にトランスフェクトして、新規なＴＰＢＧ特異的抗体の細胞結合特性及び効力を評価した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％のウシ胎仔血清及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（フェノールレッドなし）で培養した。８０〜９０％のコンフルエンシーに達すると、ＲｏｃｈｅのＸｔｒｅｍｅＧｅｎｅＨＰトランスフェクション試薬を使用して、ＴＰＢＧ発現ベクターを用いて脂質／ＤＮＡ複合体を調製した。プレインキュベーション後、脂質／ＤＮＡ複合体を、全量２ｍｌの選択培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２，１０％のウシ胎仔血清、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８）の懸濁液中の２×１０５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞に添加した。細胞を選択圧下で１４日間培養し、ついで社内のＴＰＢＧ抗体で染色した。簡単に述べると、２×１０５個の細胞を２μｇ／ｍｌの一次抗ＴＰＢＧ抗体で氷上で３０分間染色し、洗浄し、ＰＥ標識抗ヒトκ抗体（２％のウシ胎仔血清を含むＰＢＳ中１：５０、氷上で３０分間）で対比染色した。高発現又は中程度ないしは低発現クローンの単一細胞選別をＦａｃｓＡＲＩＡ（ＢＤ）で実施し、単一細胞を９６ウェル平底細胞培養プレート中に沈着させた。１２日後、各種（ヒト、カニクイザル、ミニブタＴＰＢＧ）に対する様々なクローンを２４ウェルプレートに移し、更に３日間培養した。クローンを、以前に記載された上述の内部基準ＴＰＢＧ抗体で染色し、ＦａｃｓＣａｎｔｏ（ＢＤ）で分析した。選択されたクローンを更に１週間培養し、液体窒素中に７．５％のＤＭＳＯを含むＦＣＳ中に保存した。安定性試験のために、細胞を更に２週間培養した後、染色し、ＦａｃｓＣａｎｔｏ（ＢＤ）で分析し、観察期間にわたって安定したＴＰＢＧ発現ＣＨＯ細胞の最終選択物を得た。
実施例１７：
細胞表面に発現されたヒトＴＰＢＧへの抗ＴＰＢＧ抗体のｐＨ依存的結合
実施例１１において発現された抗ＴＰＢＧ ＦａｂのヒトＴＰＢＧへのｐＨ依存的結合を評価した。この目的のために、高レベルのＴＰＢＧを安定に発現するＳＷ６２０クローン（クローン４）を細胞モデルとして選択した。対数増殖期で増殖する細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用して分離し、細胞懸濁液を、１％のウシ胎仔血清を含みｐＨ７．２、６．０、及び５．５に調整したＰＢＳ緩衝液（緩衝液Ａ）中で調製した。それぞれのＦａｂを細胞懸濁液に添加し、結合が氷上で３０分間生じた。続いて、細胞を同じｐＨの緩衝液（緩衝液Ａ）で２回洗浄した。ついで、細胞を２％のウシ胎仔血清を含むＰＢＳ，ｐＨ７．４（緩衝液Ｂ）に再懸濁し、ＰＥ（phyoerythrin）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に結合した二次抗κマウス抗ヒトｍＡｂを氷上で３０分間加えた。ついで、細胞を再び緩衝液Ｂで２回洗浄し、最後に１回限りのＣｅｌｌＦｉｘ緩衝液（ＢＤ）に再懸濁した。死細胞から生細胞を区別するために、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色を適用した。シグナルはＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ）で検出した。データ評価は、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア及びマイクロソフトのエクセルを用いて行った。実験は生物学的複製で行った。
適用されるｐＨ範囲は生理学的値を厳密には反映しないが、最大ウィンドウを使用して異なるＦａｂのｐＨ依存性結合を評価するためにそれを使用した。その分析から、Ｆａｂ（Ｈ８）の従来技術の抗体が本発明の抗体よりも更に高いｐＨ依存的結合を示すことは明らかである（図２）。これは、本発明の抗体と比較してＦａｂ（Ｈ８）の結合では水素結合の寄与が更に高いことを示している。生物学的複製において、ｐＨ５．５とｐＨ７．２とを比較すると、この要因は平均蛍光強度（ＭＦＩ）から計算して４．２と６．８の間であり、本発明のＦａｂについては０．９〜１．２の範囲であった（表８）。
実施例１８：
ヒトＴＰＢＧ発現ＭＣＦ７細胞における抗ＴＰＢＧ抗体（Ｆａｂ断片）の内部移行
実施例１１において発現されたＴＰＢＧ特異的Ｆａｂの標的結合時の内部移行をＭＣＦ７細胞で評価した。
対数増殖期にある細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用して脱離させた。試料当たり２．５×１０ｅ５個の細胞を氷冷緩衝液（２％のウシ胎仔血清を含むＰＢＳ）及び１０μｇ／ｍＬの各Ｆａｂに再懸濁し、氷上で１５分間維持した。細胞を４℃で５分間３００ｇで遠心沈殿させ、１５０μＬの氷冷緩衝液で２回洗浄した。細胞を１００μＬの緩衝液に再懸濁し、３７℃において３０、６０又は１８０分間インキュベートした。時間点ゼロの試料は氷上に残った。３７℃での時間経過のためのプレートを、試料添加前に予め加温した。細胞を、１０μｇ／ｍＬの抗κ軽鎖ＲＥ−ＰＥ（フィコエリトリン）で標識した二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む５０μＬの氷冷緩衝液に再懸濁した。懸濁液を氷上で４５分間インキュベートした。ついで、細胞を記載のように２回洗浄し、２００μＬの氷冷固定緩衝液（ＢＤ ＣｅｌｌＦｉｘ）に再懸濁した。試料をＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ）で測定した。データ処理は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して行った。エクセル（マイクロソフト）及びＸＬｆｉｔ５．３．１（ＩＤＢＳ）アドインを用いてデータ解析を実施した。各Ｆａｂ試料のＧｅｏＭｅａｎ蛍光シグナルを、対応するアイソタイプ対照の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって補正した。各時点のＭＦＩは、時点ゼロに関して設定し、パーセンテージ値として計算した。内部移行のパーセンテージは、検出された抗体のパーセンテージを１００％から引くことによって計算した。
全てのＦａｂは、与えられた時間内に内部移行した（図３）。
実施例１９：
ミニブタ−ＴＰＢＧを発現するＣＨＯ細胞への抗ＴＰＢＧ抗体（Ｆａｂ断片）の細胞結合
安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（実施例１６）及びフローサイトメトリーに基づくアッセイを使用して、細胞表面に発現されたミニブタＴＰＢＧへの実施例１１に示されたＴＰＢＧ特異的Ｆａｂの結合を評価した。
同様の範囲の細胞表面レベルのＴＰＢＧを発現する安定な形質転換体を、フローサイトメトリーに基づく細胞結合の分析に使用した。希釈系列の抗体を、０．０１〜２０μｇ／ｍｌの濃度範囲にわたり調製した。簡潔に述べると、細胞懸濁液を、２％ウシ胎仔血清（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で調製した。ｖ型９６ウェルＭＴＰ中に１ウェル当たり２．５×１０ｅ５細胞を分配した。同じ緩衝液で調製した抗体希釈系列を二倍濃縮溶液として加えた。試料を氷上で４５分間インキュベートし、２％ウシ胎仔血清を含む１５０μＬの氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。その間に、細胞を４℃で５分間３００ｇでスピンダウンさせた。細胞を、１０μｇ／ｍＬの抗κ軽鎖ＲＥ−ＰＥ（フィコエリトリン）で標識した二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む５０μＬの氷冷緩衝液に再懸濁した。懸濁液を氷上で４５分間インキュベートした。細胞を記載のように２回洗浄し、１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８を含む５０μＬの氷冷緩衝液に再懸濁した。１０分後、細胞をもう一度洗浄し、最後に２００μＬの氷冷固定緩衝液（ＢＤ ＣｅｌｌＦｉｘ）に再懸濁した。試料をＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ）で測定した。データ処理は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して行った。エクセル（マイクロソフト）及びＸＬｆｉｔ５．３．１（ＩＤＢＳ）アドインを用いてデータ解析を実施した。
本発明の抗体０５１、０９１及び０９７は、細胞表面に発現されたＴＰＢＧに同様の程度で結合したが、従来技術の抗体Ｈ８は十分な度合いでは細胞表面に発現されたＴＰＢＧに結合しなかった（図４Ａ）。
実施例２０：
ヒト及びミニブタ−ＴＰＢＧを発現するＣＨＯ細胞への抗ＴＰＢＧ抗体（Ｆａｂ−ＰＥ断片）を含むイムノコンジュゲートの細胞結合
ヒト（ｈｕ）又はミニブタ（ｐｇ）ＴＰＢＧへのＴＰＢＧ特異的抗体の結合を、それぞれの全長抗原で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用して（実施例１６）評価した。同様の範囲の細胞表面レベルのＴＰＢＧを発現する安定な形質転換体を、フローサイトメトリーに基づく細胞結合の分析に使用した。Ｆａｂ−ＰＥの希釈系列（実施例１３及び１４において発現された抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）を、４００〜０．００２ｎＭの濃度範囲にわたり調製した。簡潔に述べると、細胞懸濁液を、２％ウシ胎仔血清（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で調製した。ｖ型９６ウェルＭＴＰ中に１ウェル当たり２．５×１０ｅ５細胞を分配した。同じ緩衝液で調製したＦａｂ−ＰＥ希釈系列を二倍濃縮溶液として加えた。試料を氷上で４５分間インキュベートし、２％ウシ胎仔血清を含む１５０μＬの氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。その間に、細胞を４℃で５分間３００ｇでスピンダウンさせた。細胞を、１０μｇ／ｍＬの抗κ軽鎖ＲＥ−ＰＥ（フィコエリトリン）で標識した二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む５０μＬの氷冷緩衝液に再懸濁した。懸濁液を氷上で４５分間インキュベートした。細胞を記載のように２回洗浄し、１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８を含む５０μＬの氷冷緩衝液に再懸濁した。１０分後、細胞をもう一度洗浄し、最後に２００μＬの氷冷固定緩衝液（ＢＤ ＣｅｌｌＦｉｘ）に再懸濁した。試料をＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ）で測定した。データ処理は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して行った。エクセル（マイクロソフト）及びＸＬｆｉｔ５．３．１（ＩＤＢＳ）アドインを用いてデータ解析を実施した。
全てのＦａｂ−ＰＥは、ヒトＴＰＢＧを発現するＣＨＯ−Ｋ１に同様の程度で結合し、ＥＣ５０において最大で２倍の差異があった（図４Ｂ）。
本発明の抗体０５１、０９１及び０９７を含むＦａｂ−ＰＥのみが、細胞表面に発現されたミニブタＴＰＢＧに結合することが見出されたが、従来技術の抗体Ｈ８を含むＦａｂ−ＰＥは細胞表面に発現されたミニブタＴＰＢＧに結合しなかった（図４Ｃ）。
実施例２１：
ヒト及びミニブタ−ＴＰＢＧを発現するＣＨＯ細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（ソルターゼカップリングによってＰＥ断片に結合したＦａｂ）の細胞傷害性
ヒト（ｈｕ）又はミニブタ（ｐｇ）ＴＰＢＧを発現する細胞に対するＦａｂ−ＰＥコンストラクト（実施例１２で提供されるソルターゼ結合を介してＰＥフラグメントに結合したＦａｂ）の効力を評価する代替アッセイを確立した。この目的のために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、それぞれの種由来の全長ＴＰＢＧで一過性にトランスフェクトした。加えて、ルシフェラーゼレポータープラスミドを同時トランスフェクトした。試験化合物で処理して、ルシフェラーゼ活性を測定することによって効力を決定した。
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１×１０ｅ６細胞当たり３μｇの全ＤＮＡと３：１の比のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用し、懸濁状態で２：１の比でＴＰＢＧ及びルシフェラーゼ含有プラスミドを用いて一過性にトランスフェクトした。ついで、ウェル当たり３００００細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む１００μＬの培地（Ｇｉｂｃｏ）中の９８ウェル−ＭＴＰに播種した。細胞を化合物の添加前の２１時間の間、付着させた。１５〜０．０００３ｎＭの濃度範囲にわたってＦａｂ−ＰＥ希釈系列を培地中で調製した。個々のデータ点は３通り測定した。化合物添加の２４時間後、細胞タンパク質合成能の代替マーカーとしてのルシフェラーゼレポーター活性を、Ｓｔｅａｄｙ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して定量した。マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）にルミネセンスを記録した。データ解析はエクセル（マイクロソフト）及びＸＬｆｉｔ５．３．１（ＩＤＢＳ）アドインを用いて実施した。実験は生物学的複製として実施した。
本発明の抗体（すなわち、抗体０５１、０９１、及び０９７）を含む全てのイムノコンジュゲート並びに従来技術の抗体Ｈ８を含むイムノコンジュゲートは、ヒトＴＰＢＧを発現する細胞に対して強力かつ類似の活性を示した（図５Ａ）。一方、ミニブタ発現ＣＨＯ細胞に対する活性は、本発明の抗体では明らかに良好であったが、従来技術の抗体Ｈ８は、遙かに低い活性を示した（図５Ｂ）。陰性対照、すなわち細胞表面の標的に結合しないイムノコンジュゲートも１〜１０ｎＭの効力を示すことは注目に値する。これは、細胞に更なるストレスを加える一過性トランスフェクション手順に起因する。この理由のため、それぞれのＴＰＢＧ抗原を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１クローンを作製した（実施例１６及び２１参照）。
実施例２２：
ヒト及びミニブタ−ＴＰＢＧ発現ＣＨＯ細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体（抗カッパ鎖抗体−ＰＥ融合タンパク質に結合した抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ抗体）により媒介される細胞傷害性
ペイロード送達のための抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ断片の適合性を評価するために、代替アッセイを実施した。このアッセイでは、ＴＰＢＧ特異的Ｆａｂのκ軽鎖に結合する第二のＦａｂと共に細胞への添加前にＴＰＢＧ特異的Ｆａｂを１：３のモル比で３０分間共インキュベートした。κ結合性Ｆａｂには更にシュードモナス外毒素（ＰＥ）部分が含まれていた。このように形成された複合体を、ヒト又はミニブタＴＰＢＧの何れかを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞に添加した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、それぞれの種由来の全長ＴＰＢＧで安定にトランスフェクトした（実施例１６）。単一クローンを選択して増殖させた。同様の範囲で細胞表面ＴＰＢＧを発現するクローンを、その後の増殖アッセイのために選択した。クローンを選択圧下に維持しながら、実際の増殖アッセイを選択圧なしの培地で実施した。
１０％のウシ胎仔血清（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む１００μＬの培地（Ｇｉｂｃｏ）中の９８ウェル−ＭＴＰ中に１ウェル当たり１００００細胞を播種した。細胞を化合物の添加前の２１時間の間、付着させた。１３３〜０．００２ｎＭの濃度範囲にわたってＦａｂ−ＰＥサンドイッチコンストラクト希釈系列を培地中で調製した。個々のデータ点は３通り測定した。化合物添加の７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを実施した。マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）にルミネセンスを記録した。データ解析はエクセル（マイクロソフト）及びＸＬｆｉｔ５．３．１（ＩＤＢＳ）アドインを用いて実施した。実験は生物学的複製として実施した。
ヒトＴＰＢＧで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１に対して全ての候補がある程度の効力を示した。
抗体Ａ１、Ａ２及びＡ３由来のＦａｂは、ミニブタＴＰＢＧで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１に対して有意な効力を示さない。また、抗体Ｈ８に由来するＦａｂ断片は、このアッセイにおいて有意に低い効力を示し、ヒトＴＰＢＧを発現する細胞よりもミニブタを発現する細胞に対して約１００倍低い効力を有する（図６Ａ−Ｄ）。
実施例２３：
ヒト及びミニブタ−ＴＰＢＧ発現ＣＨＯ細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）の細胞傷害性
ヒト（ｈｕ）又はミニブタ（ｐｇ）ＴＰＢＧを発現する細胞に対するＦａｂ−ＰＥコンストラクト（実施例１３及び１４で発現される抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）の効力を評価する代替アッセイを確立した。この目的のために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をそれぞれの種由来の全長ＴＰＢＧで安定にトランスフェクトした。単一クローンを選択して増殖させた。同様の範囲で細胞表面ＴＰＢＧを発現するクローンを、その後の増殖アッセイのために選択した。クローンを選択圧下に維持しながら、実際の増殖アッセイを選択圧なしの培地で実施した。
１０％のウシ胎仔血清（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む１００μＬの培地（Ｇｉｂｃｏ）中の９８ウェル−ＭＴＰ中に１ウェル当たり１００００細胞を播種した。細胞を化合物の添加前の２４時間の間、付着させた。１３３〜０．００２ｎＭの濃度範囲にわたってＦａｂ−ＰＥ希釈系列を培地中で調製した。個々のデータ点は３通り測定した。化合物添加の７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを実施した。マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）にルミネセンスを記録した。データ解析はエクセル（マイクロソフト）及びＸＬｆｉｔ５．３．１（ＩＤＢＳ）アドインを用いて実施した。実験は生物学的複製として実施した。
本発明の抗体（すなわち、抗体０５１、０９１、及び０９７）を含む全てのイムノコンジュゲートは、ヒト又はミニブタＴＰＢＧの何れかを発現する細胞に対して強力な活性を示した。トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞に結合しない非特異的Ｆａｂ−ＰＥは、測定された濃度範囲において活性を有さない（図７Ａ）。
比較のため、従来技術の抗体Ｈ８のＦａｂ−ＰＥ型を使用した。このイムノコンジュゲートでは、ミニブタＴＰＢＧを発現する細胞に対して低い細胞傷害活性だけが観察された。親ＣＨＯ−Ｋ１では、何れのＦａｂ−ＰＥも活性を示さなかった（図７Ｃ）。
実施例２４：
ヒトＴＰＢＧを発現するＭＣＦ７細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）の細胞結合
実施例１３及び１４に提供される抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質の結合、並びにヒト腫瘍細胞への実施例１２において提供されたようなソルターゼカップリングによりＰＥ断片に結合したＦａｂの結合を、乳がん腫瘍細胞株ＭＣＦ７を使用して研究した。対数増殖期で増殖している細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用して脱離させた。簡潔に述べると、細胞懸濁液を、２％のウシ胎仔血清（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で調製した。
ｖ型９６ウェルＭＴＰ中に１ウェル当たり２．５×１０ｅ５細胞を分配した。同じ緩衝液で調製したＦａｂ−ＰＥ希釈系列を二倍濃縮溶液として加えた。試料を氷上で４５分間インキュベートし、２％ウシ胎仔血清を含む１５０μＬの氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。その間に、細胞を４℃で５分間３００ｇでスピンダウンさせた。細胞を、１０μｇ／ｍＬの抗κ軽鎖ＲＥ−ＰＥ（フィコエリトリン）で標識した二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む５０μＬの氷冷緩衝液に再懸濁した。懸濁液を氷上で４５分間インキュベートした。細胞を記載のように２回洗浄し、１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８を含む５０μＬの氷冷緩衝液に再懸濁した。１０分後、細胞をもう一度洗浄し、最後に２００μＬの氷冷固定緩衝液（ＢＤ ＣｅｌｌＦｉｘ）に再懸濁した。試料をＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ）で測定した。データ処理は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して行った。エクセル（マイクロソフト）及びＸＬｆｉｔ５．３．１（ＩＤＢＳ）アドインを用いてデータ解析を実施した。
全ての抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質は、ヒト乳腺腫瘍細胞株ＭＣＦ７へのその結合において低いｎＭ又はサブｎＭ ＥＣ５０値を示す（図８）。
実施例２５：
ヒトＴＰＢＧを発現するＭＣＦ７細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体（抗κ鎖抗体−ＰＥ融合タンパク質が結合した抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ抗体）によって媒介される細胞傷害性
ペイロード、特にシュードモナス外毒素の送達に適した抗体又は抗体断片の理想的な特性は、明確には定義されていない。理論的には、あらゆる内部移行抗体がこの目的を果たすと仮定することができる。
ペイロード送達のための本発明の抗ＴＰＢＧ抗体の適合性を評価するために、代替アッセイを実施した。このアッセイでは、ＴＰＢＧ特異的Ｆａｂのκ軽鎖に結合する第二のＦａｂを含む細胞への添加前にＴＰＢＧ特異的Ｆａｂを１：３のモル比で３０分間共インキュベートした。κ結合性Ｆａｂには更にシュードモナス外毒素（ＰＥ）部分が含まれていた。このように形成された複合体（「Ｆａｂ−ＰＥサンドイッチコンストラクト」）をヒトＭＣＦ７乳がん細胞に添加した。
簡潔に述べると、１０％のウシ胎仔血清（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む１００μＬの培地（Ｇｉｂｃｏ）中の９８ウェル−ＭＴＰ中に１ウェル当たり２００００細胞を播種した。細胞を化合物の添加前の２４時間の間、付着させた。それぞれのＴＰＢＧ特異的Ｆａｂについて計算して１３３〜０．００２ｎＭの濃度範囲にわたって希釈系列を培地中で調製した。個々のデータ点は３通り測定した。化合物添加の７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを実施した。マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）にルミネセンスを記録した。データ解析はエクセル（マイクロソフト）及びＸＬｆｉｔ５．３．１（ＩＤＢＳ）アドインを用いて実施した。実験は生物学的複製として実施
ＴＰＢＧ特異的Ｆａｂ及び抗κ−Ｆａｂ−ＰＥからなる複合体は、ＭＣＦ７細胞に対して強い細胞傷害性応答を誘導した（図９）。全てのＦａｂ−ＰＥサンドイッチコンストラクトは、低いｎＭないしはサブｎＭ活性を示したが、抗カッパ−Ｆａｂ−ＰＥと同時インキュベートした無関係のＦａｂは、この用量範囲において毒性を有していなかった。本発明の抗体０５１、０９１及び０９７を含む全てのＦａｂ−ＰＥサンドイッチコンストラクトは、従来技術の抗体Ｈ８を含むＦａｂ−ＰＥサンドイッチコンストラクトよりもＭＣＦ７細胞において細胞傷害性を誘導する傾向が僅かに高かった。
この知見は、計算された効力の差について（表１４）の最後の列に示されているように、独立した実験で再現することができた。このアッセイ設定は、生物学的複製について得られた絶対ｎＭ値が約２〜３倍異なる。従って、生成された全ての値は、Ｈ８を含むコンストラクトに参照された。
更なる比較実験として、上で概説したアッセイにおけるペイロード送達に対するそれらの適合性に関して更なる従来技術の抗体Ａ１、Ａ２及びＡ３（米国特許第８０４４１７８号）を評価し、従来技術の抗体Ｈ８を参照して比較した。
抗体Ａ１、Ａ２及びＡ３の機能性を、表面プラズモン共鳴及び細胞結合実験で確認した（データ示さず）。ペイロード送達のための抗体Ａ１、Ａ２及びＡ３に由来するこれらのＦａｂの適合性を評価するために、代替アッセイを実施した。このアッセイでは、ＴＰＢＧ特異的Ｆａｂのκ軽鎖に結合する第二のＦａｂと共に細胞への添加前にＴＰＢＧ特異的Ｆａｂを１：３のモル比で３０分間共インキュベートした。κ結合性Ｆａｂには更にシュードモナス外毒素（ＰＥ）部分が含まれていた。このように形成された複合体をヒトＭＣＦ７乳がん細胞に添加した。簡潔に述べると、１０％のウシ胎仔血清（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む１００μＬの培地（Ｇｉｂｃｏ）中の９８ウェル−ＭＴＰ中に１ウェル当たり２００００細胞を播種した。細胞を化合物の添加前の２４時間の間、付着させた。それぞれのＴＰＢＧ特異的Ｆａｂについて計算して１３３〜０．００２ｎＭの濃度範囲にわたって希釈系列を培地中で調製した。個々のデータ点は３通り測定した。化合物添加の７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを実施した。マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）にルミネセンスを記録した。データ解析はエクセル（マイクロソフト）及びＸＬｆｉｔ５．３．１（ＩＤＢＳ）アドインを用いて実施した。実験は生物学的複製として実施した。
この実験においてＭＣＦ７に対して１．８５ｎＭの効力を有する従来技術の抗体Ｈ８のＦａｂ断片と比較して、抗体Ａ１、Ａ２及びＡ３に由来するＦａｂは、有意に低い効力を示した（図１０）。
実施例２６：
ヒトＴＰＢＧを発現するＭＣＦ７細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（ソルターゼカップリングによってＰＥ断片に結合したＦａｂ）の細胞傷害性
腫瘍細胞株に対するＦａｂ−ＰＥコンストラクト（実施例１２で提供されたソルターゼカップリングによってＰＥ断片に結合したＦａｂ）の効力を評価するために、乳がん細胞株ＭＣＦ７を選択した。ウェル当たり２００００個の細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む１００μＬの培地（Ｇｉｂｃｏ）中の９８ウェル−ＭＴＰに播種した。細胞を化合物の添加前の２４時間の間、付着させた。１３３〜０．００２ｎＭの濃度範囲にわたってソルターゼカップリングによるＦａｂ−ＰＥの希釈系列を培地中で調製した。個々のデータ点は３通り測定した。化合物添加の７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを実施した。マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）にルミネセンスを記録した。データ解析はエクセル（マイクロソフト）及びＸＬｆｉｔ５．３．１（ＩＤＢＳ）アドインを用いて実施した。実験は生物学的複製として実施した。
評価された全てのソルターゼカップリングによるＦａｂ−ＰＥコンストラクトは、ＭＣＦ７細胞に対して強力なサブｎＭ活性を示した（図１１）。このアッセイでは、細胞表面に結合しない非特異的なＦａｂ−ＰＥは活性を有していなかった。本発明の抗体０５１、０９１及び０９７を含むソルターゼカップリングによるＦａｂ−ＰＥコンストラクトでは、従来技術の抗体Ｈ８を含む類似のコンストラクトと比較して同様のないしは僅かに高い活性が観察された（表１６）。
実施例２７：
ヒトＴＰＢＧを発現するＨ１９７５非小細胞肺がん細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体（抗κ鎖抗体−ＰＥ融合タンパク質によって結合された抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ抗体）によって媒介される細胞傷害性
非小細胞肺がん細胞へのペイロード送達のためのＦａｂの適合性を評価するために、代替アッセイを実施した。
このアッセイでは、ＴＰＢＧ特異的Ｆａｂのκ軽鎖に結合する第二のＦａｂと共に細胞への添加前に実施例１１に記載のように発現されたＴＰＢＧ特異的Ｆａｂを１：３のモル比で３０分間共インキュベートした。κ結合性Ｆａｂには更にシュードモナス外毒素（ＰＥ）部分が含まれていた。このように形成された複合体を、ヒトＨ１９７５肺がん細胞に添加した。簡潔に述べると、１０％のウシ胎仔血清（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含む１００μＬの培地（Ｇｉｂｃｏ）中の９８ウェル−ＭＴＰ中に１ウェル当たり１００００細胞を播種した。細胞を化合物の添加前の２４時間の間、付着させた。それぞれのＴＰＢＧ特異的Ｆａｂについて計算して１３３〜０．００２ｎＭの濃度範囲にわたって希釈系列を培地中で調製した。個々のデータ点は３通り測定した。化合物添加の７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを実施した。マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）にルミネセンスを記録した。データ解析はエクセル（マイクロソフト）及びＸＬｆｉｔ５．３．１（ＩＤＢＳ）アドインを用いて実施した。実験は生物学的複製として実施した。
従来技術の抗体Ｈ８並びに本発明の抗体０５１、０９１及び０９７のＦａｂ断片を含むサンドイッチコンストラクトは、サブｎＭ範囲のＥＣ５０を有する強力な細胞傷害性応答を誘導した。３つの生物学的複製において、本発明の抗体０９１のＦａｂ断片は、一貫して最良の候補としての性能を示した（表１７）。
従来技術の抗体Ａ１、Ａ２及びＡ３のＦａｂ断片を含むサンドイッチコンストラクトは、細胞傷害性を示さないか（Ａ１及びＡ２）又は他の試験したコンストラクトよりも有意に低い細胞傷害性を示した（図１２）。
実施例２８：
ヒトＴＰＢＧを発現するＨ１９７５非小細胞肺がん細胞に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）の細胞傷害性
実施例１３及び１４で発現された抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質の腫瘍細胞株に対する効力を評価するために、非小細胞肺がん細胞株Ｈ１９７５を選択した。細胞表面のＴＰＢＧ分子の数は、フローサイトメトリーに基づく受容体定量によって決定して、およそ３００００／細胞であった。１０％のウシ胎仔血清（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む１００μＬの培地（Ｇｉｂｃｏ）中の９８ウェル−ＭＴＰ中に１ウェル当たり１００００細胞を播種した。細胞を化合物の添加前の２４時間の間、付着させた。３〜０．００００５ｎＭの濃度範囲にわたってＦａｂ−ＰＥ希釈系列を培地中で調製した。個々のデータ点は３通り測定した。化合物添加の７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを実施した。マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）にルミネセンスを記録した。データ解析はエクセル（マイクロソフト）及びＸＬｆｉｔ５．３．１（ＩＤＢＳ）アドインを用いて実施した。実験は生物学的複製として実施した。
全抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥコンストラクトの効力は用量依存性であった（図１３）。Ｈ１９７５に結合しない非特異的Ｆａｂ−ＰＥは、測定された用量範囲において有意な活性を示さなかった。試験した全ての抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥは、サブｎＭの効力を示した。本発明の抗体０９１を含むＦａｂ−ＰＥ融合タンパク質は、従来技術の抗体Ｈ８に由来する融合タンパク質よりも一貫してこの細胞株において約３〜４倍強力であった（表１８）。
実施例２９：
ヒトＴＰＢＧを発現するＨ１９７５非小細胞肺がん細胞に適用された抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）の時間経過増殖アッセイ
異なる実験設定では、実施例１３及び１４で発現された抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質の腫瘍細胞への曝露時間を変化させた。非小細胞肺がん細胞株Ｈ１９７５を使用して、Ｆａｂ−ＰＥコンストラクトとのより短いインキュベーション時間が増殖アッセイにおける効力に影響を及ぼすかどうかを評価した。
１０％のウシ胎仔血清（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む１００μＬの培地（Ｇｉｂｃｏ）中の９８ウェル−ＭＴＰ中に１ウェル当たり１００００細胞を播種した。細胞を化合物の添加前の２４時間の間、付着させた。３〜０．００００５ｎＭの濃度範囲にわたってＦａｂ−ＰＥ希釈系列を培地中で調製した。１０、３０及び６０分のインキュベーション後、培地をＦａｂ−ＰＥを含まない新鮮培地と交換し、細胞を更に計７２時間維持した。加えて、Ｆａｂ−ＰＥに連続的に曝露した細胞を培養した。個々のデータ点は３通り測定した。化合物添加の７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを実施した。マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）にルミネセンスを記録した。データ解析はエクセル（マイクロソフト）及びＸＬｆｉｔ５．３．１（ＩＤＢＳ）アドインを用いて実施した。
試験した全てのＦａｂ−ＰＥ融合タンパク質は、このヒト腫瘍細胞株に対して強力なサブｎＭの効力を示した（図１４Ａ〜Ｄ）。Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質とのより短いインキュベーション期間は、効力の僅かな低下をもたらした。本発明の抗体０９１のＦａｂ断片を含む抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質は、実施例３０（表１９及び２０）の観察と一致する他の試験分子よりも強力であった。
実施例３０：
ヒトＴＰＢＧを発現するヒト非小細胞肺がんＨ１９７５細胞異種移植片に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）のインビボ抗腫瘍効力
実施例１３及び１４で発現された抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質のインビボ抗腫瘍効力を、移植ヌードマウスのヒト腫瘍細胞株に基づくモデルにおいてモニターした。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株を異種移植モデルとして選択した。ＮＣＩ−Ｈ１９７５は、独立に確認されたように、細胞表面ＴＰＢＧを提示する。
ＮＣＩ−Ｈ１９７５を、１０％のウシ胎仔血清、２．０ｍＭのＬ−グルタミン、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補充した１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ高グルコース培地中、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気中、３７℃において培養した。培養継代は、３日毎に分けてトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。ヌードマウスをブリーダー（例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、コミットされたガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って１２時間明／１２時間暗の一日サイクルで特定の病原体を含まない条件下に維持した。実験研究プロトコールは、地方政府によってレビューされ承認された。到着後、動物を動物施設の隔離部に１週間維持して、新しい環境及び観察に慣れるようにした。継続的な健康モニタリングは定期的に実施した。食餌食物（Ｐｒｏｖｉｍｉ Ｋｌｉｂａ ３３３７）及び水（酸性化ｐＨ ２．５〜３）は自由に与えられた。臨床症状及び有害作用の検出のために動物を毎日管理した。実験を通してモニターするために、動物の体重を記録した。
平均腫瘍サイズが約１００〜２００ｍｍ３の細胞移植後、動物の無作為化後に動物処置を開始した。Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質を１日１回、２日ごとに数回、１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖで単剤として投与した。対応するビヒクルを同じ日に投与した。Ｆａｂ−ＰＥタンパク質は、Ｒｏｃｈｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙからストック溶液として提供された。緩衝液にはヒスチジンが含まれ、注射溶液は注射前のストックから緩衝液で適切に希釈された。
ＮＣＩ−Ｈ１９７５ ＮＳＣＬＣ異種移植片を有するマウスを、研究日１７日目から４４日目まで１．０ｍｇ／ｋｇの用量で合計８回（１７、１９、２１、２４、２６、２８、４２及び４４日目）のＦａｂ−ＰＥ融合タンパク質で処置した。各処置群は１０匹の動物からなっていた。結果として、本発明の抗体を含むＦａｂ−ＰＥ融合タンパク質を用いた処置は、ｓ．ｃ．ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植片の強い腫瘍退縮を伴う有意な抗腫瘍効果を示した。特に、大部分の完全腫瘍寛解が達成された。
本発明のイムノコンジュゲートの強い効力は、従来技術の抗体Ｈ８を含むイムノコンジュゲートとは統計的に異なっていた（図１５）。
実施例３１：
ヒトＴＰＢＧを発現するヒト胃がんＮＣＩ−Ｎ８７細胞異種移植片に対する抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）のインビボ抗腫瘍効果
実施例１３及び１４で発現された抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質のインビボ抗腫瘍効力を、移植ヌードマウスのヒト腫瘍細胞株に基づくモデルにおいてモニターした。胃がんＮＣＩ−Ｎ８７細胞株を異種移植モデルとして選択した。ＮＣＩ−Ｎ８７は、独立に確認されたように、細胞表面ＴＰＢＧを提示する。
ＮＣＩ−Ｎ８７を、１０％のウシ胎仔血清、２．０ｍＭのＬ−グルタミン、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補充した１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ高グルコース培地中、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気中、３７℃において培養した。培養継代は、３日毎に分けてトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。ヌードマウスをブリーダー（例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、コミットされたガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って１２時間明／１２時間暗の一日サイクルで特定の病原体を含まない条件下に維持した。実験研究プロトコールは、地方政府によってレビューされ承認された。到着後、動物を動物施設の隔離部に１週間維持して、新しい環境及び観察に慣れるようにした。継続的な健康モニタリングは定期的に実施した。食餌食物（Ｐｒｏｖｉｍｉ Ｋｌｉｂａ ３３３７）及び水（酸性化ｐＨ ２．５〜３）は自由に与えられた。臨床症状及び有害作用の検出のために動物を毎日管理した。実験を通してモニターするために、動物の体重を記録した。
平均腫瘍サイズが約１００〜２００ｍｍ３の細胞移植後、動物の無作為化後に動物処置を開始した。Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質を１日１回、２日ごとに数回、１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖで単剤として投与した。対応するビヒクルを同じ日に投与した。Ｆａｂ−ＰＥタンパク質は、Ｒｏｃｈｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙからストック溶液として提供された。緩衝液にはヒスチジンが含まれ、注射溶液は注射前のストックから緩衝液で適切に希釈された。
ＮＣＩ−Ｎ８７胃がん異種移植片モデルにおいて腫瘍マウスを、研究日１５日目から３３日目まで１．０ｍｇ／ｋｇの用量で合計７回（１５、１７、１９、２２、２４、２６及び３３日目）のＦａｂ−ＰＥ融合タンパク質で処置した。各処置群は１０匹の動物からなっていた。結果として、Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質並びに参照（Ｈ８抗体）を用いた処置は、ｓ．ｃ．Ｎ８７異種移植片の明確な腫瘍退縮を伴う抗腫瘍効果を示した（図１６）。
実施例３２：
抗ＴＰＢＧ抗体を含むイムノコンジュゲート（抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質）と接触させたＢｘＰＣ３／ｌｕｃ細胞を使用するタンパク質合成アッセイ
実施例１３及び１４において発現された抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質にＢｘＰＣ／ｌｕｃ細胞を曝露することによって、タンパク質合成の阻害を測定した。
簡潔に述べると、ＢｘＰＣ３細胞を、細胞分解シグナルを含み、約０．４時間の半減期を有するルシフェラーゼをコードするプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）で安定にトランスフェクトした。単一クローンを誘導し、安定したプラスミド組み込みについて再評価した。シュードモナス外毒素によって付与されるＡＤＰ−リボシル化によるタンパク質合成の阻害は、ルシフェラーゼの急速な喪失をもたらし、よって、細胞溶解及びルシフェリンとのインキュベーション時に、対照と比較したシグナルの消失として測定されうる。
対数増殖期にあるＢｘＰＣ３／ｌｕｃをＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）で脱離させ、計数した。１ウェル当たり４００００個のＢｘＰＣ３／ｌｕｃ細胞を、１０％のウシ胎仔血清を含む１００μｌの培地中の９６ウェル−ＭＴＰに播種し、化合物添加前の２４時間、インキュベートした。ＴＰＢＧ特異的イムノコンジュゲートを３〜０．０００１ｎＭの濃度範囲で添加した。全試料を３通り測定した。
非特異的イムノコンジュゲートは、ルシフェラーゼシグナル（ｃｔ）に影響を及ぼさない。全てのＴＰＢＧ特異的イムノコンジュゲートは、サブｎＭの効力を示す。本発明の抗体は、従来技術の抗体Ｈ８より高い効力を示す（図１７Ａ及び表２１）。
加えて、抗体Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＨ８からなる抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ−ＰＥサンドイッチコンストラクトによるタンパク質合成の阻害を、ＢｘＰＣ３／ｌｕｃで決定した。ＴＰＢＧ特異的Ｆａｂを抗ヒトκＦａｂ−ＰＥ（シュードモナス外毒素）と１：３モル比で混合し、サンドイッチコンストラクトの形成を可能にするために室温に１５分間保った。この混合物の希釈系列を培地で調製した。細胞上の最終濃度は、ＴＰＢＧ特異的Ｆａｂについて計算して１３３ｎＭから０．００２ｎＭの範囲であった。添加の２４時間後にＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を実施した。全試料を３通り測定した。抗ヒトκＦａｂ−ＰＥと共インキュベートされたＦａｂを比較すると、Ａ１及びＡ２は与えられた濃度範囲で活性を示さず、Ａ３はＨ８よりも約５倍低い効力を示したことが明らかになった（図１７Ｂ）。
実施例３３：
ヒトＴＰＢＧに対する抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ断片の親和性
（実施例１１において発現された）本発明の抗体０５１、０９１、及び０９７のＦａｂ断片のヒトＴＰＢＧへの親和性を、ＢｉａｃｏｒｅＴＭによって評価した。従来技術の抗体Ｈ８のＦａｂ断片を対照として評価した。
ヒトＴＰＢＧに対する親和性を次のように評価した：
ＣＭ５センサーチップをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システムに取り付けた。ブランク固定化によって、フローセル１を参照フローセルとして調製した。フローセル２上で、ｐＨ４．５酢酸緩衝液中の１．５μｇ／ｍｌのｈｕＴＰＢＧ約５００ＲＵを固定化した（１０μｌ／分で１２０秒）。アミンカップリングは、製造者の説明通りに行った。
試料を、流速５０μｌ／分で１５０秒間、４．９ｎＭ、１４．８ｎＭ、４４．４ｎＭ、１３３．３ｎＭ、４００ｎＭ及び０ｎＭの濃度シリーズで注入し、これに６６０秒の解離相を続けた。
３０μｌ／分でのグリシン−ＨＣｌ ｐＨ１．５の１回の４０秒パルス及び３０μｌ／分での０．３１ＭのＫＳＣＮ、１．２２ＭのＭｇＣｌ２、０．６１Ｍの尿素、１．２２ＭのＧｕａ−ＨＣｌ及び６．７ｍＭのＥＤＴＡを含む再生溶液の１回の４０秒長さの注入と、続く緩衝液での注射後の更なる洗浄により、試料−抗原複合体を毎試料注入後に再生した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して関連する動態データを計算した。
実施例３４：
ミニブタＴＰＢＧに対する抗ＴＰＢＧ Ｆａｂ断片の親和性
（実施例１１において発現された）本発明の抗体０５１、０９１、及び０９７のＦａｂ断片のミニブタＴＰＢＧへの親和性を、ＢｉａｃｏｒｅＴＭによって評価した。従来技術の抗体Ｈ８のＦａｂ断片を対照として評価した。
ヒトＴＰＢＧに対する親和性を次のように評価した：
ＣＭ５センサーチップをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システムに取り付けた。ブランク固定化によって、フローセル１を参照フローセルとして調製した。２０μｇ／ｍｌの濃度（緩衝液に希釈、捕捉キット＃２８９５８３２５，ＧＥ−ＨＣにおいてまた提供）及び５μｌ／分の流速で１２００秒の注入時間で、フローセル２、３及び４上にアミンカップリングによって＜ｈｕＦａｂ＞捕捉抗体（＃２８９５８３２５，ＧＥ−ＨＣ）を固定化した。
試料を６０秒の注入時間及び２０μｌ／分の流速でフローセル２、３及び４で連続して捕捉し、続いて希釈シリーズ（４．９ｎＭ、１４．８ｎＭ、４４．４ｎＭ、１３３．３ｎＭ、４００ｎＭ及び２×０ｎＭ）から一つのミニブタＴＰＢＧ希釈物を１２０秒間注入した。６６０秒の解離相の後（１４．８ｎＭ、４．９ｎＭ及び解離時間を０秒に設定した一つの０ｎＭ希釈を除く）、＜ｈｕＦａｂ＞表面を、Ｆａｂ捕捉キットに提供された再生溶液を用いて製造者の指示に従って再生し、次のサイクルを実施した。
関連する動態データを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して計算した。データは、ミニブタＴＰＢＧの組換え細胞外ドメインへの抗体Ｈ８の安定な結合がないことを示している（図１９及び表２３）。
実施例３５：
ヒトＴＰＢＧ抗原への抗ＴＰＢＧ抗体のｐＨ依存性結合
ＣＭ５センサーチップをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システムに取り付けた。ブランク固定化によって、フローセル１を参照フローセルとして調製した。フローセル２では、ｐＨ４．５の酢酸緩衝液中１．５μｇ／ｍｌのｈｕＴＰＢＧを用いた固定化の目的は８０ＲＵであった。アミンカップリングは、製造者の説明通りに行った。
アッセイの一実施態様では、ＨＢＳ−ＥＰ＋ｐＨ５．５をランニング及び試料緩衝液として使用し、第二の実施態様では、ＨＢＳ−ＥＰ＋ｐＨ７．４を使用した。
試料を、５０μｌ／分の流速で１．９ｎＭ、５．６ｎＭ、２×１６．７ｎＭ、５０ｎＭ、１５０ｎＭ及び２×０ｎＭの濃度シリーズで３００秒間注入した。５０ｎＭ、一つの０ｎＭ及び一つの１６．７ｎＭの試料を１２００秒で解離させ、他の解離相は全て僅か１０秒であった。
３０μｌ／分でのグリシン−ＨＣｌ ｐＨ１．５の１回の４０秒パルス及び３０μｌ／分での０．３１ＭのＫＳＣＮ、１．２２ＭのＭｇＣｌ２、０．６１Ｍの尿素、１．２２ＭのＧｕａ−ＨＣｌ及び６．７ｍＭのＥＤＴＡを含む再生溶液の１回の４０秒長さの注入と、続く緩衝液での注射後の更なる洗浄により、試料−抗原複合体を毎試料注入後に再生した。
関連する動態データを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して計算した。
Ｆａｂ−ＰＥ融合タンパク質に対する実験結果は、従来技術の抗体Ｈ８がｐＨ依存的に結合することを明白に示している。７．４から５．５へのｐＨシフトはＫＤの有意な減少をもたらすが、本発明の抗体０５１、０９１、及び０９７のｈｕＴＰＢＧ結合は殆ど影響を受けない。これは、従来技術の抗体Ｈ８のｐＨ依存性結合を強調している結合解離ブロットで視覚化することもできる（図１８）。

Claims (17)

  1. トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）に結合する単離された抗体であって、ヒトＴＰＢＧ（配列番号：１）及びミニブタＴＰＢＧ（配列番号：２）に１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する抗体。
  2. 抗体が細胞表面に発現されたミニブタＴＰＢＧ（配列番号：２）に結合する、請求項１に記載の抗体。
  3. 抗体がｐＨ５．５及びｐＨ７．４でヒトＴＰＢＧに特異的に結合する、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. 抗体がｐＨ５．５及びｐＨ７．２でヒトＴＰＢＧに特異的に結合し、ｐＨ５．５に対するｐＨ７．２での結合比が１．５未満である、請求項３に記載の抗体。
  5. 抗体が、
    （ａ）配列番号：３の重鎖のＣＤＲ１、配列番号：４の重鎖のＣＤＲ２、配列番号：５の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：６の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号：７の軽鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：８の軽鎖のＣＤＲ３；又は
    （ｂ）配列番号：１１の重鎖のＣＤＲ１、配列番号：１２の重鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：１３の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：１４の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号：１５の軽鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：１６の軽鎖のＣＤＲ３；又は
    （ｃ）配列番号：１９の重鎖のＣＤＲ１、配列番号：２０の重鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：２１の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：２２の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号：２３の軽鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：２４の軽鎖のＣＤＲ３；
    を含む、又は、
    抗体が（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示された抗体由来のヒト化抗体である、
    請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
  6. 抗体が、配列番号：１１の重鎖のＣＤＲ１、配列番号：１２の重鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：１３の重鎖のＣＤＲ３、配列番号：１４の軽鎖のＣＤＲ１、配列番号：１５の軽鎖のＣＤＲ２、及び配列番号：１６の軽鎖のＣＤＲ３を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
  7. 請求項６に記載の抗体由来のＴＢＰＧに結合するヒト化抗体。
  8. 配列番号：９のＶＨ配列と配列番号：１０のＶＬ配列；又は
    配列番号：１７のＶＨ配列と配列番号：１８のＶＬ配列；又は
    配列番号：２５のＶＨ配列と配列番号：２６のＶＬ配列
    の何れかを含む抗体。
  9. 請求項８に記載の抗体由来のＴＢＰＧに結合するヒト化抗体。
  10. 請求項１から９の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
  11. 請求項１０に記載の核酸を含む宿主細胞。
  12. 抗体が産生されるように請求項１１に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体の製造方法。
  13. 請求項１から９の何れか一項に記載の抗体と細胞傷害性剤とを含むイムノコンジュゲート。
  14. 抗体を細胞傷害性剤に結合させる工程を含む、請求項１３に記載のイムノコンジュゲートを製造する方法。
  15. 請求項１から９の何れか一項に記載の抗体と任意の他のポリペプチドとを含む組換え融合タンパク質。
  16. 請求項１から９の何れか一項に記載の抗体、請求項１３に記載のイムノコンジュゲート、又は請求項１５に記載の組換え融合タンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含有する薬学的製剤。
  17. 医薬として使用するための請求項１から９の何れか一項に記載の抗体。
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