CN108350083B - 抗tpbg抗体及使用方法 - Google Patents

抗tpbg抗体及使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108350083B
CN108350083B CN201680062256.2A CN201680062256A CN108350083B CN 108350083 B CN108350083 B CN 108350083B CN 201680062256 A CN201680062256 A CN 201680062256A CN 108350083 B CN108350083 B CN 108350083B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
tpbg
seq
antibodies
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201680062256.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108350083A (zh
Inventor
S·登格尔
S·芬恩
J·费希尔
T·弗里斯
S·英霍夫-容格
B-F·克里彭多夫
C·尚茨
T·施洛特豪尔
C·祖斯特曼
B·韦泽
A·兹维克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN108350083A publication Critical patent/CN108350083A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108350083B publication Critical patent/CN108350083B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • C07K16/465—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another with additional modified FR-residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供抗TPBG抗体及其使用方法。

Description

抗TPBG抗体及使用方法
发明领域
本发明涉及抗TPBG抗体及其使用方法。
发明背景
滋养层糖蛋白(TPBG)是涉及细胞粘附的富亮氨酸跨膜糖蛋白。在成体中，这种蛋白质在多种肿瘤细胞中高度表达且与众多癌症中较差的临床结局相关。
结合TPBG的抗体(也称作“5T4”)公开于例如Shaw et al.(2002)Biochem.J.363:137-45和WO 98/55607。那些文件公开了抗体“H8”，其特异性结合TPBG的构象表位。原始鼠H8抗体和H8抗体的人源化型式的氨基酸序列公开于WO 2006/031653。
别的结合TPBG的抗体公开于例如Woods et al.(2002)Biochem.J.366:353-65(其公开了一种大鼠单克隆抗体)和US 5,869,053(其公开了一种小鼠单克隆抗体)。
别的结合TPGB的抗体公开和表征于例如WO 2007/106744，称作抗体A1，A2和A3。
结合TPBG的抗体在治疗癌症中的治疗性用途公开于例如Myers et al.(2002)Cancer Gene Ther.9:884-896；Shaw et al.(2000)Biochim.Biophys.Acta.1524:238-246；和US 2003/0018004，它们公开了与人IgG1恒定域或鼠B7.1的胞外域融合的抗TPBG抗体序列诱导表达TPBG的肿瘤细胞系的细胞裂解。一项使用PNU-214936(一种与突变型超抗原葡萄球菌肠细胞毒素A(SEA)融合的单克隆抗TPGB抗体的鼠Fab片段)的I期临床试验显示有限的毒性和一些抗肿瘤应答(Cheng et al.(2004)J.Clin.Oncol.22(4):602-9)。
发明概述
本发明提供抗TPBG抗体，其缀合物及其使用方法。还提供的是分离的抗TPBG多肽和编码它们的分离的核酸。
本发明涉及一种分离的结合滋养层糖蛋白(TPBG)的抗体，其中该抗体结合人TPBG(SEQ ID NO:1)和迷你猪TPBG(SEQ ID NO:2)。
在一个方面，本发明涉及一种分离的结合TPBG的抗体，其中该抗体以10-8M或更小的KD特异性结合人和迷你猪TPBG。
在一个实施方案中，该抗体以10-8M或更小的KD特异性结合人TPBG且该抗体以10-8M或更小的KD特异性结合迷你猪TPBG。
在一个实施方案中，该抗体的Fab片段以10-8M或更小的KD特异性结合人和迷你猪TPBG。
在另一个方面，本发明涉及一种分离的结合TPBG的抗体，其中该抗体结合人TPBG(SEQ ID NO:1)和迷你猪TPBG(SEQ ID NO:2)，且其中该抗体在pH 5.5和pH 7.4特异性结合人TPBG。
在另一个方面，本发明涉及一种分离的结合TPBG的抗体，其中该抗体结合人TPBG(SEQ ID NO:1)和迷你猪TPBG(SEQ ID NO:2)，且其中该抗体在pH 5.5和pH 7.4以10-8M或更小的KD特异性结合人TPBG。
在另一个方面，本发明涉及一种分离的结合TPBG的抗体，其中该抗体结合人TPBG(SEQ ID NO:1)和迷你猪TPBG(SEQ ID NO:2)，且其中该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合人TPBG。
在本发明的一个实施方案中，该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合细胞表面表达的人TPBG。
在本发明的一个实施方案中，该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合SW620细胞上的细胞表面表达的TPBG。
在本发明的一个实施方案中，该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合人TPBG，其中在pH 7.2对pH 5.5的结合比小于1.5，在一个优选的实施方案中介于0.8和1.5之间，在另一个优选的实施方案中介于0.9和1.2之间。在一个实施方案中，该结合是经由流式细胞术检测的且该结合比是通过比较均值荧光强度确定的，如实施例18中描述的。在本发明的一个实施方案中，该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合细胞表面表达的人TPBG，其中在pH 7.2对pH 5.5的结合比小于1.5，在一个优选的实施方案中介于0.8和1.5之间，在另一个优选的实施方案中介于0.9和1.2之间。在一个实施方案中，该结合是经由流式细胞术检测的且该结合比是通过比较均值荧光强度确定的，如实施例18中描述的。
在本发明的一个实施方案中，该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合SW620细胞上的细胞表面表达的TPBG，其中在pH 7.2对pH 5.5的结合比小于1.5，在一个优选的实施方案中介于0.8和1.5之间，在另一个优选的实施方案中介于0.9和1.2之间。在一个实施方案中，该结合是经由流式细胞术检测且该结合比是通过比较均值荧光强度确定的，如实施例18中描述的。
在本发明的一个实施方案中，该抗体结合细胞表面表达的人TPBG和细胞表面表达的迷你猪TPBG。
在本发明的一个实施方案中，该抗体在结合至细胞表面表达的TPBG时内在化入表达人或迷你猪TPBG的细胞。
在本发明的一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:5的重链CDR3，SEQ ID NO:8的轻链CDR3，和SEQ ID NO:4的重链CDR2(对应于如本文中公开的抗体“051”的上述CDR)。
在本发明的一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:3的重链CDR1，SEQ ID NO:4的重链CDR2，SEQ ID NO:5的重链CDR3，SEQ ID NO:6的轻链CDR1，SEQ ID NO:7的轻链CDR2，和SEQ ID NO:8的轻链CDR3(对应于本文中公开的抗体“051”的六种CDR)。
在本发明的一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:13的重链CDR3，SEQ ID NO:16的轻链CDR3，和SEQ ID NO:12的重链CDR2(对应于本文中公开的抗体“091”的上述CDR)。
在本发明的一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:11的重链CDR1，SEQ ID NO:12的重链CDR2，和SEQ ID NO:13的重链CDR3，SEQ ID NO:14的轻链CDR1，SEQ ID NO:15的轻链CDR2，和SEQ ID NO:16的轻链CDR3(对应于本文中公开的抗体“091”的六种CDR)。
在本发明的一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:21的重链CDR3，SEQ ID NO:24的轻链CDR3，和SEQ ID NO:20的重链CDR2(对应于本文中公开的抗体“097”的上述CDR)。
在本发明的一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:19的重链CDR1，SEQ ID NO:20的重链CDR2，和SEQ ID NO:21的重链CDR3，SEQ ID NO:22的轻链CDR1，SEQ ID NO:23的轻链CDR2，和SEQ ID NO:24的轻链CDR3(对应于本文中公开的抗体“097”的六种CDR)。
在本发明的一个实施方案中，该抗体是自上述抗体之一衍生的人源化抗体。
在本发明的一个实施方案中，该抗体包含
(a)与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；
(b)与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或
(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含SEQ ID NO:9的VH序列和SEQ ID NO:10的VL序列(对应于本文中公开的抗体“051”的可变域)。
在本发明的一个实施方案中，该抗体包含
(a)与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；
(b)与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或
(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列(对应于本文中公开的抗体“091”的可变域)。
在本发明的一个实施方案中，该抗体包含
(a)与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；
(b)与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或
(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含SEQ ID NO:25的VH序列和SEQ ID NO:26的VL序列(对应于本文中公开的抗体“097”的可变域)。
在本发明的一个实施方案中，该抗体是结合TPBG的抗体片段。在本发明的一个实施方案中，该抗体是结合TPBG的Fab片段。
在一个方面，本发明提供一种分离的核酸，其编码本发明的抗体。在一个方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含所述核酸。
在一个方面，本发明提供一种生成抗体的方法，其包括培养本发明的所述宿主细胞，使得该抗体生成。在所述方法的一个实施方案中，该方法进一步包括自该宿主细胞回收该抗体。
在一个方面，本发明提供一种免疫缀合物，其包含本发明的抗体和细胞毒剂。在一个实施方案中，该细胞毒剂是酶活性毒素或其片段。在一个实施方案中，该细胞毒剂选自由外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))，白喉毒素，蓖麻毒蛋白A链，相思豆毒蛋白A链，蒴莲根毒蛋白A链，α-帚曲毒蛋白，油桐(Aleurites fordii)毒蛋白，石竹毒蛋白，美洲商路(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)，苦瓜(momordicacharantia)抑制剂，麻疯树毒蛋白，巴豆毒蛋白，肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒蛋白，丝林霉素，局限曲菌素，酚霉素，依诺霉素，和单端孢霉烯组成的组。在一个实施方案中，该细胞毒剂是假单胞菌外毒素A或其变体。
在一个方面，本发明提供一种生成本发明的免疫缀合物的方法，其包括将该抗体与该细胞毒剂偶联的步骤。在一个实施方案中，所述方法进一步包括在偶联步骤之前提供该抗体的步骤，其中该抗体是通过培养本发明的宿主细胞(其包含编码本发明的抗体的核酸)，使得该抗体生成而提供的。在一个实施方案中，所述方法进一步包括在偶联步骤之前自该宿主细胞回收该抗体的步骤。
在一个方面，本发明提供一种重组融合蛋白，其包含本发明的抗体和任何其它多肽。在一个实施方案中，该其它多肽融合至该抗体的重链至少之一。在一个实施方案中，该其它多肽融合至该抗体的重链至少之一的C端。
在一个实施方案中，该多肽是细胞毒剂(因而，在这个实施方案中，该重组融合蛋白是免疫缀合物)。在一个实施方案中，该细胞毒剂是酶活性毒素或其片段。在一个实施方案中，该细胞毒剂选自由外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)，白喉毒素，蓖麻毒蛋白A链，相思豆毒蛋白A链，蒴莲根毒蛋白A链，α-帚曲毒蛋白，油桐毒蛋白，石竹毒蛋白，美洲商路毒蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻疯树毒蛋白，巴豆毒蛋白，肥皂草抑制剂，白树毒蛋白，丝林霉素，局限曲菌素，酚霉素，依诺霉素，和单端孢霉烯组成的组。在一个实施方案中，该细胞毒剂是假单胞菌外毒素A或其变体。
在一个方面，本发明提供一种分离的核酸，其编码本发明的重组融合蛋白。在一个实施方案中，该核酸编码本发明的重组融合蛋白，其中该重组融合蛋白是免疫缀合物(在这个实施方案中，该重组融合蛋白中包含的多肽是细胞毒剂)。在一个方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含所述核酸。
在一个方面，本发明提供一种生成重组融合蛋白的方法，其包括培养所述宿主细胞，使得该重组融合蛋白生成。在一个实施方案中，该重组融合蛋白是免疫缀合物。在所述方法的一个实施方案中，该方法进一步包括自该宿主细胞回收该重组融合蛋白。在所述方法的一个实施方案中，该方法进一步包括分离该宿主细胞的包涵体和溶解该包涵体。在所述方法的一个实施方案中，该方法进一步包括使来自溶解的包涵体的材料复性的步骤。在所述方法的一个实施方案中，宿主细胞是细菌细胞。在所述方法的一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
在一个方面，本发明提供一种药物配制剂，其包含本发明的抗体和药学可接受载剂。在一个实施方案中，所述药物组合物进一步包含另外的治疗剂。在一个实施方案中，所述另外的治疗剂是化疗剂。
在一个方面，本发明提供一种药物配制剂，其包含本发明的重组融合蛋白和药学可接受载剂。在一个实施方案中，所述药物组合物进一步包含另外的治疗剂。在一个实施方案中，所述另外的治疗剂是化疗剂。
在一个方面，本发明提供一种药物配制剂，其包含本发明的免疫缀合物和药学可接受载剂。在一个实施方案中，所述药物组合物进一步包含另外的治疗剂。在一个实施方案中，所述另外的治疗剂是化疗剂。
在一个方面，本发明提供本发明的抗体，其用作药物。在一个方面，本发明提供本发明的抗体，其用于治疗癌症。
在一个方面，本发明提供本发明的抗体在制造药物中的用途。
在一个方面，本发明提供一种治疗具有癌症的个体的方法，其包括对该个体施用有效量的本发明的抗体。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将另外的治疗剂施用于该个体。在一个实施方案中，所述另外的治疗剂是化疗剂。
在一个方面，本发明提供本发明的重组融合蛋白，其用作药物。在一个方面，本发明提供本发明的重组融合蛋白，其用于治疗癌症。
在一个方面，本发明提供本发明的重组融合蛋白在制造药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。
在一个方面，本发明提供一种治疗具有癌症的个体的方法，其包括对该个体施用有效量的本发明的重组融合蛋白。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将另外的治疗剂施用于该个体。在一个实施方案中，所述另外的治疗剂是化疗剂。
在一个方面，本发明提供本发明的免疫缀合物，其用作药物。在一个方面，本发明提供本发明的免疫缀合物，其用于治疗癌症。
在一个方面，本发明提供本发明的免疫缀合物在制造药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。
在一个方面，本发明提供一种治疗具有癌症的个体的方法，其包括对该个体施用有效量的本发明的免疫缀合物。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将另外的治疗剂施用于该个体。在一个实施方案中，所述另外的治疗剂是化疗剂。
在一个方面，本发明提供一种筛选结合人TPBG和迷你猪TPBG的抗体的方法，该方法包括测试测试抗体对人TPBG和迷你猪TPBG的结合，并选择结合人TPBG和迷你猪TPBG的抗体的步骤。
在一个实施方案中，该方法用于筛选用于治疗性应用的抗体。
在一个实施方案中，该方法包括测试单价形式的测试抗体的结合的步骤。
在一个实施方案中，该方法包括在pH 5.5和在pH 7.2测试测试抗体对人TPBG的结合，并选择在两种pH(pH 5.5和pH 7.2)均结合人TPBG的抗体的步骤。
在一个方面，本发明提供通过本发明的筛选方法获得的抗体。
在一个方面，本发明提供一种生成结合人TPBG和迷你猪TPBG的抗体的方法，该方法包括下述步骤：(a)给动物免疫接种人TPBG或人TBPG胞外域(ECD)，(b)自该动物的血液分离对人TPBG特异性的B细胞，(c)鉴定由所分离的B细胞生成的抗体的可变域(VH和VL)的氨基酸序列，(d)提供包含所鉴定的可变域的抗体，(e)测试所提供的抗体对人TPBG和迷你猪TPBG的结合，并(f)选择结合人TPBG和迷你猪TPBG的抗体。
在一个实施方案中，该方法用于生成用于治疗性应用的抗体。在一个实施方案中，该动物是啮齿动物。在一个实施方案中，该动物是家兔。
在一个实施方案中，该方法包括测试单价形式的所提供的抗体的结合的步骤。
在一个实施方案中，该方法包括在pH 5.5和在pH 7.2测试所提供的抗体对人TPBG的结合，和选择在两种pH(pH 5.5和pH 7.2)均结合人TPBG的抗体的步骤。
在一个方面，本发明提供通过本发明的生成抗TPBG抗体的方法获得的抗体。
本发明提供在人和迷你猪物种的TPBG之间具有交叉反应性，由此因能用于迷你猪物种中的研究(从而避免猴研究的必要性)而适合于临床开发的结合TPBG的抗体。另外，本发明的结合TPBG的抗体在中性以及微酸性pH均结合它们的靶物，即人TPBG，由此确保肿瘤的微酸性微环境中的抗原结合，这对于该抗体在癌症疗法中的治疗性应用是有利的。另外，本发明的抗体对于数种类型的癌症，例如人非小细胞肺癌的治疗展现卓越的效力。
附图简述
图1：来自食蟹猴和迷你猪的组织的mRNA表达概况(RPKM＝每千碱基的靶物每百万定位读出中指派的读出)(实施例1)。
图2：在不同pH值不同抗TPBG抗体(Fab片段：Fab1＝H8；Fab2＝091；Fab3＝051；Fab4＝097)对细胞表面表达的人TPBG的结合(实施例17)。在不同pH将稳定表达TPBG的人细胞系SW620克隆4与不同Fab一起温育。与荧光染料偶联的二抗一起温育后，通过流式细胞术检测信号。显示了基线修正的均值荧光强度(MFI)。
图3：在肿瘤细胞系MCF7中评估的抗TPBG抗体(Fab片段：正方形＝H8；三角形＝097；菱形＝051；圆形＝091)的内在化(实施例18)。作为时间的函数，y轴展示细胞表面结合的Fab的信号的损失。
图4A：抗TPBG抗体(Fab片段：空心圆形＝051；正方形＝91；三角形＝97；圆形＝H8)对表达迷你猪TPBG的CHO细胞的细胞结合(实施例19)。显示了基线修正的均值荧光强度(MFI)。
图4B：抗TPBG抗体(Fab-PE融合蛋白；Fab片段：正方形＝H8；三角形＝097；菱形＝051；圆形＝091)对在CHO-K1的细胞表面上稳定展示的人TPBG的细胞结合(实施例20)。将Fab-PE的稀释系列添加至细胞。用荧光标记的二抗和流式细胞术中的分析显现细胞结合。显示了基线修正的均值荧光强度(MFI)。
图4C：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(Fab-PE融合蛋白；自抗体衍生的Fab片段：正方形＝H8；三角形＝097；菱形＝051；圆形＝091)对CHO-K1的细胞表面上稳定展示的迷你猪TPBG的细胞结合(实施例20)。将Fab-PE的稀释系列添加至细胞。用荧光标记的二抗和流式细胞术中的分析显现细胞结合。
图5A：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(经由分选酶偶联与PE偶联的Fab：正方形＝H8；三角形＝097；菱形＝051；圆形＝091)对瞬时表达人TPBG的CHO-K1细胞的细胞毒性(实施例21)。
图5B：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(经由分选酶偶联与PE偶联的Fab：正方形＝H8；三角形＝097；菱形＝051；圆形＝091)对瞬时表达迷你猪TPBG的CHO-K1细胞的细胞毒性(实施例21)。
图6A-D：由抗TPBG抗体(受到抗κ链抗体-PE融合蛋白结合的抗TPBG Fab抗体，现有技术抗体H8，A1，A2，A3以及本发明的抗体051，091和097)介导的对表达人和迷你猪TPBG的CHO细胞的细胞毒性(实施例22)。通过ATP释放测定法(CellTiter-Glo)测定存活力并相对于缓冲液处理的对照细胞设置。图6A：经人TPBG稳定转染的CHO-K1。图例：垂直长划线＝非特异性对照；星形＝051；空心三角形＝091；叉号＝097；加号＝H8。图6B：经人TPBG稳定转染的CHO-K1。图例：加号＝H8；空心三角形＝A1；空心菱形＝A2；空心圆形＝A3。图6C：经迷你猪TPBG稳定转染的CHO-K1。图例：点在左的三角形＝非特异性对照；星形＝051；点在下的三角形＝091；叉号＝097；加号＝H8。图6D：经迷你猪TPBG稳定转染的CHO-K1。图例：加号＝H8；空心三角形＝A1；空心菱形＝A2；空心圆形＝A3。
图7A-C：包含抗TPBG抗体(Fab-PE融合蛋白：星形＝非特异性对照；正方形＝H8；菱形＝051；圆形＝091；三角形＝097)的免疫缀合物对表达人和迷你猪TPBG的CHO-K1细胞的细胞毒性(实施例23)。通过ATP释放测定法(CellTiter-Glo)测定存活力。图7A：将经全长人TPBG稳定转染的CHO-K1细胞与免疫缀合物一起温育。图7B：将经全长迷你猪TPBG稳定转染的CHO-K1细胞与免疫缀合物一起温育。图7C：将亲本CHO-K1细胞与免疫缀合物一起温育。
图8：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(抗TPBG Fab-PE融合蛋白)对表达人TPBG的MCF7细胞的细胞结合(实施例24)。通过流式细胞术测定结合(y轴：均值荧光强度＝MFI)。显示了基线修正的均值荧光强度(MFI)。
图9：由本发明的抗TPBG抗体(受到抗κ链抗体-PE融合蛋白结合的抗TPBG Fab抗体)介导的对表达人TPBG的MCF7细胞的细胞毒性(实施例25)。将Fab片段与抗κ结合性Fab-PE(假单胞菌外毒素)一起共温育。将人乳腺癌症细胞系MCF7与Fab:Fab-PE构建物的复合物一起温育。72小时后通过ATP释放测定法(CellTiter-Glo)测定存活力。图例：星形＝非特异性对照；正方形＝H8；菱形＝051；圆形＝091；三角形＝097。
图10：由现有技术抗TPBG抗体H8，A1，A2和A3(受到抗κ链抗体-PE融合蛋白结合的抗TPBG Fab抗体)介导的对表达人TPBG的MCF7细胞的细胞毒性(实施例25)。Fab片段与抗κ结合性Fab-PE(假单胞菌外毒素)一起共温育。将人乳腺癌症细胞系MCF7与Fab:Fab-PE构建物的复合物一起温育。72小时后通过ATP释放测定法(CellTiter-Glo)测定存活力。图例：星形＝非特异性对照；正方形＝H8；三角形＝A1；菱形＝A2；圆形＝A3。
图11：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(经由分选酶偶联与PE片段偶联的Fab)对表达人TPBG的MCF7细胞的细胞毒性(实施例26)。将人乳腺癌症细胞系MCF7与分选酶偶联的Fab-PE构建物一起温育。72小时后通过ATP释放测定法(CellTiter-Glo)测定存活力。图例：星形＝非特异性对照；正方形＝H8；菱形＝051；圆形＝091；三角形＝097。
图12：由抗TPBG抗体(受到抗κ链抗体-PE融合蛋白结合的抗TPBG Fab抗体)介导的对表达人TPBG的H1975非小细胞肺癌症细胞的细胞毒性(实施例27)。将H1975细胞与Fab:Fab-PE构建物的复合物一起温育。72小时后通过ATP释放测定法(CellTiter-Glo)测定存活力。
图13：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(抗TPBG Fab-PE融合蛋白)对表达人TPBG的H1975非小细胞肺癌症细胞的细胞毒性(实施例28)。将人肿瘤细胞系H1975与Fab-PE融合蛋白一起温育。72小时后通过ATP释放测定法(CellTiter-Glo)测定存活力。图例：星形＝非特异性对照；正方形＝H8；菱形＝051；圆形＝091；三角形＝097
图14A-D：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(抗TPBG Fab-PE融合蛋白)应用于表达人TPBG的H1975非小细胞肺癌症细胞的时间过程增殖测定法(实施例29)。将人肿瘤细胞系H1975与相应的Fab-PE构建物一起温育不同时间段。72小时后通过ATP释放测定法(CellTiter-Glo)测定存活力。图14A：与Fab-PE一起连续温育。图14B：与Fab-PE一起温育60分钟。图14C：与Fab-PE一起温育30分钟。图14D：与Fab-PE一起温育10分钟。图例：星形＝非特异性对照；正方形＝H8；菱形＝051；圆形＝091；三角形＝097。
图15：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(抗TPBG Fab-PE融合蛋白)对表达人TPBG的人非小细胞肺癌H1975细胞异种移植物的体内抗肿瘤功效(实施例30)。在y轴上描绘均值肿瘤生长。作为均值的标准误差(SEM)呈现偏差。图例(抗TPBG抗体)：空心菱形＝媒介；长划线＝H8；三角形＝051；正方形＝091；圆形＝097。
图16：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(抗TPBG Fab-PE融合蛋白)对表达人TPBG的人胃癌NCI-N87细胞异种移植物的体内抗肿瘤功效(实施例31)。在y轴上描绘均值肿瘤生长。作为均值的标准误差(SEM)呈现偏差。图例(抗TPBG抗体)：空心菱形＝媒介；长划线＝H8；三角形＝051；正方形＝091；圆形＝097。
图17A-B：使用与包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(抗TPBG Fab-PE融合蛋白)接触的BxPC3/luc细胞进行的蛋白质合成测定法(实施例32)。通过萤光素酶测定法测定存活力并相对于缓冲液处理的对照细胞设置。处理经萤光素酶报告物稳定转染的BxPC-3。图17A：包含现有技术抗体H8的免疫缀合物与包含本发明的抗体051，091或097的夹心构建物的比较。图17B：包含现有技术抗体的免疫缀合物的比较。图例：正方形＝Fab(H8)；三角形＝Fab(A1)；菱形＝Fab(A2)；圆形＝Fab(A3)。
图18：在pH 5.5和pH 7.4包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(抗TPBG Fab-PE融合蛋白)对人TPBG的结合(结合-解离图，实施例35)。图例：标示了免疫缀合物中包含的Fab片段；圆形指示相应免疫缀合物在pH 5.5的结合行为，正方形指示相应免疫缀合物在pH 7.4的结合行为。
图19：抗TPBG抗体(Fab片段)对迷你猪TPBG的结合。
发明详述
I.定义
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
术语“抗TPBG抗体”和“结合TPBG的抗体”指能够以足够的亲和力结合TPBG，使得抗体可用作靶向TPBG中的诊断和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，结合TPBG的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗TPBG抗体结合在来自不同物种的TPBG间保守的TPBG表位。
“测试抗体”指就它结合TPBG的特性而言具有未知特征的抗体。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中与完整抗体结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和自抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了一种例示性竞争测定法。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ，和μ。
如本文中使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)NIH Publication 91-3242。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3，和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有本文中定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”，和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入有外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Bethesda MD(1991),NIH Publication 91-3242,Vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组卡帕I。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环的(“高变环”)和/或含有抗原接触残基的(“抗原接触”)每一个区域。一般地，抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1，H2，H3)，且三个在VL中(L1，L2，L3)。本文中的例示性HVR包括：
(a)高变环，其存在于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)CDR，其存在于氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)，和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)抗原接触，其存在于氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)，和93-101(H3)(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)，(b)，和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)，和94-102(H3)。
除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛，绵羊，猫，犬，和马)，灵长类(例如人和非人灵长类，诸如猴)，家兔，和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者指人。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述参见例如Flatman,S.et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码抗TPBG抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有整个或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫键键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(Washington D.C.，20559)，在那里其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech公司(South San Francisco，California)可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统(包括数码UNIXV4.0D)上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)，与(with)，或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于，与，或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物配制剂”指所处形式使得允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载剂”指药物配制剂中与活性成分不同，且对受试者无毒的组分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。
如本文中使用的，术语“TPBG”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然TPBG，除非另有说明。该术语涵盖“全长”，未加工TPBG以及源自细胞中加工的任何形式的TPBG。该术语还包括天然存在的TPBG变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人TPBG的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：1。一种例示性迷你猪TPBG的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2。
如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每一个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)(参见例如Kindt,T.J.et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),page91)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合该抗原的抗体。参见例如Portolano,S.et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson,T.et al.,Nature 352:624-628(1991))。
如本文中使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体以及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文中使用的，“癌症”包括实体和血液学癌症二者，诸如淋巴瘤，淋巴细胞性白血病，肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金(Hodgkin)氏病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌症，甲状腺癌，副甲状腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌，中枢神经系统(CNS)赘生物，脊轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，施旺细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，脑[脊]膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。
假单胞菌外毒素A：天然，野生型假单胞菌外毒素A是一种66kD细菌毒素，由铜绿假单胞菌分泌，具有SEQ ID NO：52中所示及US 5,602,095中公开的613个氨基酸的序列。这种序列是在没有天然信号肽的情况下显示，天然信号肽作为UniProt登录号P11439.2(gi：12231043)的头25个氨基酸显示。
天然蛋白质具有三个主要结构域。N端域I包含两个亚域，Ia(氨基酸1-252)和Ib(氨基酸365-399)，它们在结构上邻近但在一级氨基酸序列中分开。
域I，特别是域Ia是细胞结合域。域Ib的功能仍未定义。域I形成B亚基的主要成分。在本发明的实践中，天然域Ia序列遭到省略或破坏且因此不能结合LRP1或LRP1B的形式的PE是大大优选的。
已经报告了域II(氨基酸253-364)介导易位入胞质溶胶，但是这仍有争议(Weldon&Pastan 2011FEBS J 278(23):4683-4700)。
域III(氨基酸400-613)介导延伸因子2的ADP核糖基化。域Ib和域III之间的结构边界没有完全确定。依照WO2013/040141，它位于残基399和400之间，但是Weldon和Pastan2011将它置于残基404和405之间。然而，完全的催化活性需要域III以及域Ib的一部分。因而，天然毒素的功能性域III定义为始于残基395。已经发现氨基酸602-613对于NAD(+)-核糖基转移酶活性是无关紧要的，但是天然序列的氨基酸609-613是细胞毒性活性所需要的。这些形成内质网局限化序列(WO 91/09948；Chaudhary et al1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:308-312；Seetharam et al.1991J.Biol.Chem.266:17376-17381)。细胞毒性可以通过将天然ER局限化序列用一种或多种其它ER局限化序列替换来维持或增强。因而，认为天然PE的功能性域III由残基395-601组成。
已经发表了大量的工作，公开了天然PE分子的变体和改良，用于靶向细胞毒素。如本文中使用的，术语“假单胞菌外毒素A”，“假单胞菌外毒素”，“外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)”和“PE”意图涵盖天然PE的保留细胞毒性活性的这些和其它变体和改良。特别是，术语“假单胞菌外毒素A”，“假单胞菌外毒素”和“PE”具体意图包括WO88/02401A1，WO90/12592A1，WO91/09949，WO91/09965，WO93/25690，WO97/13529，WO98/20135，WO2005/052006，WO2007/016150，WO2007/031741，WO2009/32954，WO2011/32022，WO2012/154530，WO2012/170617，WO2013/40141，Mazor R,et al PNAS 111(2014)8571-8576，和Alewine C,et al,Mol Cancer Ther.(2014)2653-61和WO2015/051199中公开的变体和改良。将所有这些出版物完整收入本文用于例示假单胞菌外毒素A/PE的适合用于本发明的且术语“假单胞菌外毒素A”，“假单胞菌外毒素”和“PE”内包括但不局限的变体和改良的目的，其中WO2005/052006，WO2007/016150，WO2007/031741，WO2009/32954，WO2011/32022，WO2012/154530，WO2012/170617，和WO2013/40141中公开的那些变体和改良是优选的，而且WO2009/32954，WO2011/32022，WO2012/154530，WO2012/170617，WO2013/40141，Mazor R,et al PNAS 111(2014)8571-8576，和Alewine C,et al,Mol Cancer Ther.(2014)2653-61和WO2015/051199中公开的那些是特别优选的。
预期未来会开发别的PE的变体和改良。既然本发明涉及针对PE的细胞毒性效应的抗性，那么预期任何此类未来的PE的保留细胞毒性活性的变体和改良也可用于本发明的实践且因此包括在术语“假单胞菌外毒素A”和“PE”内。
一般地，PE毒素会具有包含在SEQ ID NO：52的残基395-601的全长上具有至少50％氨基酸序列同一性的PE功能性域III的多肽序列，其中该PE毒素在导入真核(优选哺乳动物)细胞中时具有细胞毒性活性。优选形式的PE包含(1)在SEQ ID NO：52的残基395-601的全长上具有至少50％氨基酸序列同一性且具有NAD(+)-白喉酰胺ADP核糖基转移酶活性的PE功能性域III，和(2)至少一种内质网局限化序列。在PE与细胞结合剂偶联作为融合多肽的实施方案中，该PE优选还包含(3)允许在摄取入靶细胞中后自细胞结合剂切割PE功能性域III的可切割接头序列，诸如弗林蛋白酶可切割序列(FCS)。
可切割接头(诸如FCS)一般会在PE功能性域III的N端侧。
可以使用其它可切割接头，前提是它们允许在摄取入靶细胞中后自细胞结合剂切割PE。而且，涵盖将PE与细胞结合剂偶联的其它手段，前提仍然是它们允许在摄取入靶细胞中后自细胞结合剂分出PE。例如，细胞结合剂可以非共价连接至PE，或通过允许在还原性条件下释放PE模块的二硫键来连接，或通过免疫缀合物生成领域知道的其它缀合化学来连接。
依照本发明使用的PE一般会缺乏功能性细胞结合域I。
很多关于PE的工作聚焦于消除天然序列中对于在靶向疗法中使用而言不必要和/或不利的部分。例如，将B(受体结合)亚基用另一种细胞结合剂替换降低该分子的非特异性毒性。进一步去除无关紧要的序列降低免疫原性。这特别导致下述截短形式的PE的开发：PE40，PE35，PE38，PE38QQR，PE-LR和PE24。PE40是PE的一种截短衍生物(Pai et al1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3358-62和Kondo et al.1988J.Biol.Chem.263:9470-9475)。PE35是PE的一种35kD羧基末端片段，其中删除了氨基酸残基1-279且该分子以Met始于位置280，接着是PE的氨基酸281-364和381-613，如参照SEQ ID NO：52定义的。PE35和PE40公开于例如US 5,602,095，US 4,892,827，WO93/25690和WO88/02401，通过援引将其每一篇完整收入本文中。
PE38含有PE的易位和ADP核糖基化域但不含细胞结合部分(Hwang etal.1987Cell 48:129-136)。PE38(SEQ ID NO：53)是一种由SEQ ID NO：52的氨基酸253-364和381-613构成的截短PE原蛋白，在细胞内加工后活化成它的细胞毒性形式(参见US 5,608,039，通过援引将其完整收入本文，和Pastan et al.1997Biochim.Biophys.Acta,1333:C1-C6)。PE38QR是PE38的一种变体，具有域III的位置590，606和613处的赖氨酸的突变，允许缀合至抗体。
PE-LR含有除了与SEQ ID NO：52的氨基酸残基274-284(RHRQPRGWEQL(SEQ ID NO：54))对应的弗林蛋白酶可切割序列(FCS)的域II的删除，和域lb的氨基酸残基365-394的删除。如此，PE-LR含有SEQ ID NO：52的氨基酸残基274-284和395-613。PE-LR描述于WO 2009/032954和Weldon et al 2009Blood 113:3792-3800，通过援引将其每一篇完整收入本文。
WO 2012/154530描述了在FCS和PE功能性域III之间添加3至8个独立选自甘氨酸和丝氨酸的氨基酸的柔性短接头改善PE-LR分子的细胞毒性而不破坏弗林蛋白酶的结合。例示性接头是GGS和GGSGGS(SEQ ID NO：55)。
其它工作试图进一步降低PE的免疫原性。
WO2012/154530报告了PE域III内的下述氨基酸残基处的替代降低免疫原性：
D403，D406，R412，R427，E431，R432，R458，D461，R467，R490，R505，R513，E522，R538，E548，R551，R576，K590，Q592和L597。
优选的替代是用甘氨酸，丝氨酸或丙氨酸残基。
WO2012/170617报告了这些残基处的替代可降低B细胞表位的免疫原性，而且残基R427，R458，R467，R490，R505和F538中一个或多个的替代是优选的，特别是用丙氨酸。
WO2013/040141报告了下述另外的氨基酸残基处的替代可降低PE域III内的B细胞表位的免疫原性：
E420，D463，Y481，L516，R563，D581，D589和K606。
优选的替代是用甘氨酸，丝氨酸，丙氨酸或谷氨酰胺残基。
WO2012/170617报告了下述残基处的替代能降低PE域III内的T细胞表位的免疫原性：
R421，L422，L423，A425，R427，L429，Y439，H440，F443，L444，A446，A447，I450，463-519，R551，L552，T554，I555，L556和W558。
优选的替代在残基D463，Y481和L516中一个或多个处，它们也可降低B细胞表位的免疫原性。优选的替代是用甘氨酸，丝氨酸，丙氨酸或谷氨酰胺残基。
WO2012/170617还报告了下述氨基酸残基处的替代能降低PE域II内的T细胞表位的免疫原性：
L294，L297，Y298，L299和R302。
优选的替代是用甘氨酸，丝氨酸，丙氨酸或谷氨酰胺残基。
WO 2012/170617还报告了下述氨基酸残基处的替代能降低PE域II内的B细胞表位的免疫原性：
E282，E285，P290，R313，N314，P319，D324，E327，E331和Q332。
WO2012/170617还报告了一种特别优选的替代组合是D463A/R427A/R458A/R467A/R490A/R505A/R538A。
Alewine et al.2014Mol.Cancer Ther.13(11):2653-61公开了PE域III内降低B细胞免疫原性的7处点突变的一种类似组合，即R427A/R456A/D463A/R467A/R490A/R505A/R538A(就是说，用R456A代替R458A)。
Mazor et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111(23):8571-8576公开了PE域III内的6处点突变连同删除大部分PE域II的一种组合将T细胞应答降低93％。该突变是R427A/F443A/L477H/R494A/R505A/L552E。
因而，PE功能性域III可包含下述位点中任一个或多于一个的任何组合处的突变：
D403，D406，R412，E420，R421，L422，L423，A425，R427，L429，E431，R432，Y439，H440，F443，L444，A446，A447，I450，R456，R458，D461，463-519(优选D463，R467，L477，Y481，R490，R494，R505，R513和/或L516)，E522，R538，E548，R551，L552，T554，I555，L556，W558，R563，R576，D581，D589，K590，Q592，L597和K606。
优选地，与SEQ ID NO：52的氨基酸395-613的未突变序列相比，突变降低免疫原性。
只要PE含有部分或整个域II，它就可包含下述位点中任一个或多于一个的任何组合处处的突变：
E282，E285，P290，L294，L297，Y298，L299，R302，R313，N314，P319，D324，E327，E331和Q332。
优选地，与来自域II的未突变序列相比，突变降低免疫原性。
特别是，在FCS衍生自由氨基酸274-284(RHRQPRGWEQL，SEQ ID NO：54)组成的PE的天然弗林蛋白酶可切割序列的实施方案中，它可包含E282残基的替代，尤其是如果FCS的下游包括来自天然PE序列的邻近序列的话。在不包括来自天然PE序列的邻近序列的实施方案中(诸如PE-LR，其中FCS直接或经由非天然接头序列融合至域III)，无论如何来自天然序列的表位可能遭到破坏使得E282残基处的突变可能不是有利的。
Mazor et al.2014Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111(23):8571-8576；Liu etal.2012Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109(29):11782-7；Kreitman etal.2012J.Clin.Oncol.30(15):1822-8；Pastan et al.2011Leukemia&Lymphoma52Suppl2:87-90；Onda et al.2011Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(14):5742-7；Hansen etal.2010Journal of Immunotherapy 33(3):297-304；Kreitman et al.2009Clin CancerRes.15:5274-5279；Onda et al.2008Proc.Natl.Acad.Sci.USA105(32):11311-6；Ho etal.2005Clin.Cancer Res.11(10):3814-20；Kreitman et al.2000J Clin Oncol.18:1622-1636和Roscoe et al.1994Infection and Immunity 62(11):5055-65均针对降低PE的免疫原性。
变体PE毒素中降低的免疫原性可以指变体序列诱导T细胞应答的能力降低和/或变体序列诱导B细胞(抗体)应答的能力降低，优选二者。用于评估突变对T细胞免疫原性的影响的技术是本领域公知的且描述于WO 2012/170617的实施例。用于评估突变对B细胞免疫原性的影响的技术同样是本领域公知的且描述于例如WO 2013/040141。可以使用人抗体文库通过噬菌体展示针对天然PE序列生成人抗体。PE序列中的突变破坏此类抗体对变体PE分子的结合的能力指示降低的免疫原性。或者，可以对天然和突变PE序列比较携带人抗体全集的转基因小鼠中生成的PE特异性抗体的滴度。
PE功能性域III的C端可含有残基609-613的天然序列，即REDLK(SEQ ID NO：55)。作为天然PE序列的任何其它修饰的补充/替代，PE功能性域III可含有发挥将PR蛋白质维持在内质网中或将蛋白质再循环入内质网的功能的REDLK序列的变体，或其它序列。此类序列在本文中称作“内质网局限化序列”或“ER局限化序列”。优选的ER局限化序列包括诸如KDEL(SEQ ID NO：57)，REDL(SEQ ID NO：58)，RDEL(SEQ ID NO：59)或KEDLK(SEQ ID NO：60)。可以将一种或多种另外的ER局限化序列，优选独立选自KDEL，REDL，REDLK，RDEL和KEDLK，添加至PE多肽序列的C端。用KDEL，或KDEL的2或3次串联重复(KDELKDEL，SEQ ID NO 61；KDELKDELKDEL，SEQ ID NO：62)替代天然REDLK序列，或在天然REDLK序列后面添加KDEL是优选的。参见例如WO 91/099949；Chaudhary et al 1991；Seetharam et al 1991。
WO 91/09949公开了PE功能性域III的C端可缺乏残基602-608中的一些或全部，它们对于NAD(+)-白喉酰胺ADP核糖基转移酶活性不是至关紧要的。
弗林蛋白酶可切割序列(FCS)：如WO 2012/154530中描述的，弗林蛋白酶可切割序列可以是弗林蛋白酶可切割的任何多肽序列。Duckert et al.2004,ProteinEngineering,Design&Selection 17(1):107-112(以下的“Duckert等人”)通过援引完整收入本文中，特别是就它公开的弗林蛋白酶可切割序列和基序而言。Duckert等人公开了弗林蛋白酶是称作枯草杆菌蛋白酶/kexin样原蛋白质转化酶的进化上保守的二价碱和单价碱特异性CA2+依赖性丝氨酸蛋白酶的家族中的一种酶。参见第107页。弗林蛋白酶，也称作“配对碱性氨基酸切割酶”，“PACE”，或PCSK3，是PCSK家族的数种哺乳动物成员之一且牵涉加工数种内源人蛋白质。一般性参见Thomas 2002Nat Rev Mol Cell Biol 10:753-66。它是一种膜联蛋白质，主要见于跨高尔基网络。自1990年代早期起就知道人弗林蛋白酶的序列。参见例如Hatsuzawa et al.1992J Biol Chem 267:16094-16099；和Molloy et al.1992JBiol Chem267:16396-16402。
典型地，以氨基酸残基的单字母代码表示，最小限度弗林蛋白酶可切割序列是R-X-X-R(SEQ ID NO：63)，切割在第二个“R”后面发生。Duckert等人总结了文献中报告的关于38种蛋白质的序列的可得信息以得出弗林蛋白酶可切割序列，包括哺乳动物蛋白质，致病性细菌的蛋白质，和病毒蛋白质。它报告了31种或81％所回顾的切割基序具有R-X-[R/K]-R(SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：65)共有序列，其中11种或29％具有R-X-R-R(SEQ ID NO：65)，而且20种或52％是R-X-K-R(SEQ ID NO：64)。切割基序中的三种只含有最小限度切割序列。对于切割基序自身和周围残基二者，Duckert等人进一步比对基序并鉴定在每一种弗林蛋白酶中的每一个位置处找到的残基。Duckert等人的图1A通过相对大小显示在每一个位置处找到的最常见的残基。按照惯例，自易切断的键(通常以向下的箭标示)起对弗林蛋白酶切割位点周围的残基编号。朝着N端计数，对底物残基指派P1，P2，以此类推，而朝向C端计数，对残基指派P1'，P2'，以此类推。参见Rockwell and Thorner 2004TrendsBiochem.Sci.29:80-87；和Thomas 2002Nat.Rev.Mol.Cell Biol 3:753-766。如此，遵循惯例，可以使用下述序列对最小限度切割序列的残基和周围残基进行比对和编号：P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'，其中将最小限度弗林蛋白酶可切割序列编号为P4-P1。Duckert等人的受到弗林蛋白酶切割的38种序列的比对鉴定出取决于各个位置存在的残基而允许的变异。例如，如果P4处的残基不是R的话，那可以通过在P2和P6处具有精氨酸或赖氨酸残基来补偿。参见第109页。
在天然PE中，弗林蛋白酶切割在位于该毒素的域II中的富精氨酸环中的精氨酸279和甘氨酸280之间发生。PE的域II中的天然弗林蛋白酶可切割序列在下文中列出(编号指示残基在613个氨基酸的天然PE序列中的位置)，并比对以显示它在上文所述惯例下的编号：
274-R H R Q P R G W E Q L-284(SEQ ID NO：66)
P6--P5--P4--P3--P2--P1--P1'-P2'-P3'-P4'-P5'
在WO2012/154530根本的研究中，在位置P3和P2处进行替代以形成下述序列，替代标有下划线：
274-R H R SK R G W E Q L-284(SEQ ID NO：67)。
这种序列显示比天然序列快的切割速率，而且当在一种例示性免疫毒素中使用时导致与天然序列大致相同的对靶细胞的细胞毒性。
基于这项和先前的研究，用于将靶向分子附着至PE域III的弗林蛋白酶可切割序列可以是最小限度弗林蛋白酶可切割序列，R-X-X-R(其中每一个X独立地是任何天然发生氨基酸)，优选R-X-[R/K]-R(其中X是任何天然发生氨基酸且[R/K]表示精氨酸或赖氨酸任一)，或本领域知道的或Duckert等人的图1A许可的任何其它弗林蛋白酶可切割序列，前提是如果鉴定为P2'的位置处存在残基，那么它应当是色氨酸，或者，如果不是色氨酸，那么不应是缬氨酸或丙氨酸。例如，在一些实施方案中，该序列可以是RKKR(SEQ ID NO：68)，RRRR(SEQ ID NO：69)，RKAR(SEQ ID NO：70)，SRVARS(SEQ ID NO：71)，TSSRKRRFW(SEQ ID NO：72)，或ASRRKARSW(SEQ ID NO：73)。
如Duckert等人中记录的，位置P4处可以使用不如R有利的残基(主要是缬氨酸)，如果通过位置P2和P6处的精氨酸或赖氨酸残基补偿的话，使得P2，P4和P6处的三个残基中的至少两个是碱性的。如此，在一些实施方案中，该弗林蛋白酶可切割序列是RRVKKRFW(SEQID NO：74)，RNVVRRDW(SEQ ID NO：75)，或TRAVRRRSW(SEQ ID NO：76)。位置PI处的残基可以是天然序列中存在的精氨酸，或赖氨酸。如此，赖氨酸可以替代位置PI处的精氨酸，例如在上文列出的任何序列中。
在一些实施方案中，该弗林蛋白酶可切割序列含有PE的天然弗林蛋白酶可切割序列：R-H-R-Q-P-R-G-W-E-Q-L(SEQ ID NO：66)或天然序列的截短型式，只要它含有最小限度弗林蛋白酶可切割序列且是弗林蛋白酶可切割的。如此，在一些实施方案中，该弗林蛋白酶可切割序列可以是RQPR(SEQ ID NO：77)，RHRQPRGW(SEQ ID NO：78)，RHRQPRGWE(SEQ IDNO：79)，HRQPRGWEQ(SEQ ID NO：80)，或RQPRGWE(SEQ ID NO：81)。在一些实施方案中，该序列是RHRSKRGWEQL(SEQ ID NO：67)或这种序列的截短型式，只要它含有最小限度弗林蛋白酶可切割序列且是弗林蛋白酶可切割的。如此，在一些实施方案中，该弗林蛋白酶可切割序列可以是RSKR(SEQ ID NO：82)，RHRSKRGW(SEQ ID NO：83)，HRSKRGWE(SEQ ID NO：84)，RSKRGWEQL(SEQ ID NO：85)，HRSKRGWEQL(SEQ ID NO：86)，或RHRSKR(SEQ ID NO：87)。
如上文提到的，自PE衍生的FCS序列的P3'位置处的E282残基可以用另一种氨基酸替换以降低B细胞免疫原性。在该序列缺乏这个残基下游的天然PE残基的情况中，或在该FCS相对于天然PE序列含有其它突变的情况中，此类替换可能不是必需的。
任何特定序列是否是弗林蛋白酶可切割的可通过本领域知道的方法来确定。例如，一种序列是否是弗林蛋白酶可切割的可通过以1:10酶:底物摩尔比将该序列与弗林蛋白酶一起在弗林蛋白酶缓冲液(0.2M NaOAc(pH 5.5)，5mM CaCl2)中于25℃温育16小时来测试。先前已经确立这些条件是对于PE的弗林蛋白酶切割最佳的。优选地，所使用的弗林蛋白酶是人弗林蛋白酶。重组截短人弗林蛋白酶可商购，例如来自New England Biolabs(Beverly，MA)。还可参见Bravo et al.1994J Biol Chem 269(14):25830-25837。
或者，弗林蛋白酶可切割序列可以通过将它与针对细胞表面蛋白的抗体一起制成免疫毒素并在表达该细胞表面蛋白的细胞系上测试所得免疫毒素来测试。合适的抗体序列公开于例如WO 2012/154530和WO 2009/032954。
优选的PE毒素的通式
供依照本发明使用的优选的PE毒素具有下述结构：
FCSl-R1 m-R2 n-R3 p-PE功能性域III-R4 q
其中：
l，m，n，p和q各自独立是0或1；
FCS是弗林蛋白酶可切割序列，优选(i)R-H-R-Q-P-R-G-W-E-Q-L或其含有R-Q-P-R的截短型式，任选R-Q-P-R，R-H-R-Q-P-R-G-W，R-H-R-Q-P-R-G-W-E，H-R-Q-P-R-G-W-E-Q，或R-Q-P-R-G-W-E；或(ii)R-H-R-S-K-R-G-W-E-Q-L或其含有R-S-K-R的截短型式，任选R-S-K-R，R-H-R-S-K-R-G-W，H-R-S-K-R-G-W-E，R-S-K-R-G-W-E-Q-L，H-R-S-K-R-G-W-E-Q-L，或R-H-R-S-K-R，其中与天然PE序列的位置282对应的谷氨酸残基(在存在的情况中)任选用另一种残基，优选甘氨酸，丝氨酸，丙氨酸或谷氨酰胺替换；
R1是1至10个氨基酸的接头序列，优选GGS或GGSGGS；
R2是SEQ ID NO：52的残基285-364的一个或多个连续氨基酸残基，其中残基E285，P290，L294，L297，Y298，L299，R302，R313，N314，P319，D324，E327，E331和Q332中的任一个或多个(在存在的情况中)任选独立用另一种氨基酸，优选甘氨酸，丝氨酸，丙氨酸或谷氨酰胺替换；
R3是SEQ ID NO：52的残基365-394的一个或多个连续氨基酸残基；
PE功能性域III包含SEQ ID NO：52的残基395-613，其中：
(a)任选删除残基602-608中的一些或全部，且
(b)残基609-613任选用另一种ER局限化序列，优选KDEL，REDL，RDEL或KEDLK替换，且
(c)残基D403，D406，R412，E420，R421，L422，L423，A425，R427，L429，E431，R432，Y439，H440，F443，L444，A446，A447，I450，R456，R458，D461，463-519(优选D463，R467，L477，Y481，R490，R494，R505，R513和/或L516)，E522，R538，E548，R551，L552，T554，I555，L556，W558，R563，R576，D581，D589，K590，Q592，L597和(在存在的情况中)K606中的任一个或多个任选独立用另一种氨基酸，优选甘氨酸，丝氨酸，丙氨酸或谷氨酰胺，或组氨酸(在L477的情况中)替换；
R4是一个或多个(优选1或2个)另外的ER局限化序列，优选REDLK，KDEL，REDL，RDEL或KEDLK。
在上文的式中：
l优选是1；就是说，FCS优选存在；
m优选是1；就是说，接头优选存在，尤其在l是1的情况中；
n优选是0；就是说，SEQ ID NO：1的残基285-364优选缺失；
p优选是0；就是说，SEQ ID NO：1的残基365-394优选缺失；
PE功能性域III优选包括突变组合R427A/F443A/L477H/R494A/R505A/L552E，或突变组合R427A/R456A/D463A/R467A/R490A/R505A/R538A，或突变组合R427A/F443A/R456A/D463A/R467A/L477H/R490A/R494A/R505A/R538A/L552E。
供依照本发明使用的特别优选的PE毒素包含与SEQ ID NO：52的氨基酸残基395-613对应，在位置427，456，463，467，490，505和538处具有Ala替代的氨基酸序列(如在WO2015/51199中作为LO10R-456A和SEQ ID NO：37公开的)或与SEQ ID NO：52的氨基酸残基395-613对应，在位置427，443，477，494，505和552处具有Ala替代的氨基酸序列(如在WO2015/051199中作为T18/T20和SEQ ID NO：289公开的)。
II.组合物和方法
在一个方面，本发明部分基于对于人和迷你猪TPGF具有交叉反应性的抗体。在某些实施方案中，提供了在中性以及在微酸性pH结合人TPBG的抗体。本发明的抗体对于例如癌症的诊断或治疗是有用的。
A.例示性抗TPBG抗体
在一个方面，本发明提供分离的结合TPBG的抗体。在某些实施方案中，本发明的抗TPBG抗体结合依照SEQ ID NO:1的人TPBG且结合依照SEQ ID NO:2的迷你猪TPBG。在某些实施方案中，本发明的抗TPBG抗体在pH 5.5和在pH 7.2结合人TPBG。
在一个方面，本发明提供一种抗TPBG抗体，其包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的CDR：(a)SEQ ID NO:3的重链CDR1，(b)SEQ ID NO:4的重链CDR2，(c)SEQ ID NO:5的重链CDR3，(d)SEQ ID NO:6的轻链CDR1，(e)SEQ ID NO:7的轻链CDR2，和(f)SEQ ID NO:8的轻链CDR3(对应于本文中公开的抗体“051”的上述CDR)。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH CDR序列：(a)SEQ ID NO:3的重链CDR1，(b)SEQ ID NO:4的重链CDR2，(c)SEQ IDNO:5的重链CDR3(对应于本文中公开的抗体“051”的上述CDR)。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR3和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR3，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR3，和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)SEQ ID NO:5的重链CDR3，(b)SEQ ID NO:8的轻链CDR3，和(c)SEQID NO:4的重链CDR2。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1；(b)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1；(b)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH CDR序列：(i)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1，(ii)包含SEQID NO:4的氨基酸序列的重链CDR2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1，(ii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR2，和(c)包含选自SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR3。在一个实施方案中，该抗TPBG抗体是自包含上述CDR的抗体衍生的人源化抗体。
在一个方面，本发明提供一种抗TPBG抗体，其包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的CDR：(a)SEQ ID NO:11的重链CDR1，(b)SEQ ID NO:12的重链CDR2，(c)SEQ ID NO:13的重链CDR3，(d)SEQ ID NO:14的轻链CDR1，(e)SEQ ID NO:15的轻链CDR2，和(f)SEQ ID NO:16的轻链CDR3(对应于本文中公开的抗体“091”的上述CDR)。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH CDR序列：(a)SEQ ID NO:11的重链CDR1，(b)SEQ ID NO:12的重链CDR2，(c)SEQID NO:13的重链CDR3(对应于本文中公开的抗体“091”的上述CDR)。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR3和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR3，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR3，和包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)SEQ ID NO:13的重链CDR3，(b)SEQ ID NO:16的轻链CDR3，和(c)SEQ ID NO:12的重链CDR2。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；(b)包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；(b)包含SEQID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH CDR序列：(i)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR1，(ii)包含SEQID NO:12的氨基酸序列的重链CDR2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1，(ii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR2，和(c)包含选自SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。在一个实施方案中，该抗TPBG抗体是自包含上述CDR的抗体衍生的人源化抗体。
在一个方面，本发明提供一种抗TPBG抗体，其包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的CDR：(a)SEQ ID NO:19的重链CDR1，(b)SEQ ID NO:20的重链CDR2，(c)SEQ ID NO:21的重链CDR3，(d)SEQ ID NO:22的轻链CDR1，(e)SEQ ID NO:23的轻链CDR2，和(f)SEQ ID NO:24的轻链CDR3(对应于本文中公开的抗体“097”的上述CDR)。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH CDR序列：(a)SEQ ID NO:19的重链CDR1，(b)SEQ ID NO:20的重链CDR2，(c)SEQID NO:21的重链CDR3(对应于本文中公开的抗体“097”的上述CDR)。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR3和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链CDR3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR3，包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链CDR3，和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)SEQ ID NO:21的重链CDR3，(b)SEQ ID NO:24的轻链CDR3，和(c)SEQ ID NO:20的重链CDR2。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链CDR1；(b)包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列的轻链CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链CDR3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链CDR1；(b)包含SEQID NO:23的氨基酸序列的轻链CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH CDR序列：(i)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR1，(ii)包含SEQID NO:20的氨基酸序列的重链CDR2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链CDR1，(ii)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR2，和(c)包含选自SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQID NO:23的氨基酸序列的轻链CDR2，和(f)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链CDR3。在一个实施方案中，该抗TPBG抗体是自包含上述CDR的抗体衍生的人源化抗体。
在任何上述实施方案中，抗TPBG抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗TPBG抗体包含任何上述实施方案中的CDR，且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在另一个方面，抗TPBG抗体包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列(对应于本文中公开的抗体“051”的可变重链域)具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗TPBG抗体保留结合TPBG的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:9中替代，插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除在CDR以外的区域中(即在FR中)发生。任选地，该抗TPBG抗体包含SEQ ID NO:9中VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，该VH包含一种，两种或三种选自下述的CDR：(i)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1，(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR3。
在另一个方面，提供了一种抗TPBG抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗TPBG抗体保留结合TPBG的能力。在某些实施方案中，在SEQ IDNO:10中替代，插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，该替代，插入，或删除在CDR以外的区域中(即在FR中)发生。任选地，该抗TPBG抗体包含SEQ ID NO:10中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，该VL包含一种，两种或三种选自下述的HVR：(i)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1，(ii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个方面，提供了一种抗TPBG抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQID NO:9和SEQ ID NO:10中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在又一个方面，本发明提供一种抗体，其与本文中提供的抗TPBG抗体结合相同表位。例如，在某些实施方案中，提供了一种抗体，其与包含SEQ ID NO:9的VH序列和SEQ IDNO:10的VL序列的抗TPBG抗体结合相同表位。
在另一个方面，抗TPBG抗体包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列(对应于本文中公开的抗体“091”的可变重链域)具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗TPBG抗体保留结合TPBG的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:17中替代，插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除在CDR以外的区域中(即在FR中)发生。任选地，该抗TPBG抗体包含SEQ ID NO:17中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，该VH包含一种，两种或三种选自下述的CDR：(i)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR1，(ii)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR3。
在另一个方面，提供了一种抗TPBG抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗TPBG抗体保留结合TPBG的能力。在某些实施方案中，在SEQ IDNO:10中替代，插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，该替代，插入，或删除在CDR以外的区域中(即在FR中)发生。任选地，该抗TPBG抗体包含SEQ ID NO:18中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，该VL包含一种，两种或三种选自下述的HVR：(i)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1，(ii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个方面，提供了一种抗TPBG抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQID NO:17和SEQ ID NO:18中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在又一个方面，本发明提供一种抗体，其与本文中提供的抗TPBG抗体结合相同表位。例如，在某些实施方案中，提供了一种抗体，其与包含SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ IDNO:18的VL序列的抗TPBG抗体结合相同表位。
在另一个方面，抗TPBG抗体包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列(对应于本文中公开的抗体“097”的可变重链域)具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗TPBG抗体保留结合TPBG的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:25中替代，插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除在CDR以外的区域中(即在FR中)发生。任选地，该抗TPBG抗体包含SEQ ID NO:25中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，该VH包含一种，两种或三种选自下述CDR：(i)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR1，(ii)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR3。
在另一个方面，提供了一种抗TPBG抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗TPBG抗体保留结合TPBG的能力。在某些实施方案中，在SEQ IDNO:10中替代，插入和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，该替代，插入，或删除在CDR以外的区域中(即在FR中)发生。任选地，该抗TPBG抗体包含SEQ ID NO:26中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，该VL包含一种，两种或三种选自下述的HVR：(i)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链CDR1，(ii)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个方面，提供了一种抗TPBG抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQID NO:25和SEQ ID NO:26中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在又一个方面，本发明提供一种抗体，其与本文中提供的抗TPBG抗体结合相同表位。例如，在某些实施方案中，提供了一种抗体，其与包含SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ IDNO:18的VL序列的抗TPBG抗体结合相同表位。
在本发明的又一个方面，依照任何上述实施方案的抗TPBG抗体是单克隆抗体，包括嵌合，人源化或人抗体。在一个实施方案中，抗TPBG抗体是抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，该抗体是全长抗体，例如完整IgG1抗体或本文中定义的其它抗体类或同种型。
在一个实施方案中，本发明涉及一种分离的结合TPBG的抗体，其中该抗体结合人TPBG(SEQ ID NO:1)和迷你猪TPBG(SEQ ID NO:2)，且其中该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合人TPBG。
在本发明的一个实施方案中，该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合细胞表面表达的人TPBG。
在本发明的一个实施方案中，该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合SW620细胞上的细胞表面表达的TPBG。
在那些不同pH值对人TPBG的结合可以通过“结合比”来定义，在本文中定义为在pH7.2在细胞表面结合测定法(在一个实施方案中，如实施例18中描述的测定法)中通过流式细胞术检测到的均值荧光强度对在pH 5.5通过流式细胞术检测到的均值荧光强度(在一个实施方案中，如实施例18中描述的测定法)的比。
在本发明的一个实施方案中，该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合人TPBG，其中在pH 7.2对pH 5.5的结合比小于1.5，在一个优选的实施方案中介于0.8和1.5之间，在另一个优选的实施方案中介于0.9和1.2之间。在一个实施方案中，该结合是经由流式细胞术检测的且该结合比是通过比较均值荧光强度确定的，如实施例18中描述的。
在本发明的一个实施方案中，该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合细胞表面表达的人TPBG，其中在pH 7.2对pH 5.5的结合比小于1.5，在一个优选的实施方案中介于0.8和1.5之间，在另一个优选的实施方案中介于0.9和1.2之间。在一个实施方案中，该结合是经由流式细胞术检测的且该结合比是通过比较均值荧光强度确定的，如实施例18中描述的。
在本发明的一个实施方案中，该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合细胞表面表达的人TPBG，其中定义为在pH 7.2在细胞表面结合测定法(在一个实施方案中，实施例18中描述的测定法)中通过流式细胞术检测到的均值荧光强度对在pH 5.5通过流式细胞术检测到的均值荧光强度的比的结合比小于1.5，在一个优选的实施方案中介于0.8和1.5之间，在另一个优选的实施方案中介于0.9和1.2之间。
在本发明的一个实施方案中，该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合SW620细胞上的细胞表面表达的TPBG，其中在pH 7.2对pH 5.5的结合比小于1.5，在一个优选的实施方案中介于0.8和1.5之间，在另一个优选的实施方案中介于0.9和1.2之间。在一个实施方案中，该结合是经由流式细胞术检测的且该结合比是通过比较均值荧光强度确定的，如实施例18中描述的。
在本发明的一个实施方案中，该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合SW620细胞上的细胞表面表达的TPBG，其中定义为在pH 7.2在细胞表面结合测定法(在一个实施方案中，实施例18中描述的测定法)中通过流式细胞术检测到的均值荧光强度对在pH 5.5通过流式细胞术检测到的均值荧光强度的比的结合比小于1.5，在一个优选的实施方案中之间介于0.8和1.5，在另一个优选的实施方案中之间介于0.9和1.2。
在又一个方面，依照上述实施方案任一的抗TPBG抗体可以单一地或组合地并入下文1-7节描述的任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，Kd是通过如下面的测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen,Y.et al.,J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。为了建立测定法的条件，将
Figure BDA0001638753030000371
多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(大约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab混合(例如与Presta,L.G.et al.,Cancer Res.57(1997)4593-4599中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时段(例如约65个小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20
Figure BDA0001638753030000381
洗板8次。板干燥后，添加150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽马计数仪(Packard)上对板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法使用
Figure BDA0001638753030000382
-2000或
Figure BDA0001638753030000383
-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)于25℃使用固定化抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(
Figure BDA0001638753030000384
Evaluation软件版本3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么可使用荧光淬灭技术来测定结合速率，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯进行的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH 7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv，和scFv片段，及下文描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plueckthun,A.,In:The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburgand Moore(eds.),Springer-Verlag,New York(1994),pp.269-315；还可参见WO 93/16185；及美国专利No.5,571,894和No.5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见例如EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Holliger,P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合抗体和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison,S.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如自小鼠，大鼠，仓鼠，家兔，或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro,J.C.and Fransson,J.,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann,I.et al.,Nature332:323-329(1988)；Queen,C.et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337，No.7,527,791，No.6,982,321，和No.7,087,409；Kashmiri,S.V.etal.,Methods 36:25-34(2005)(记载SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(记载“重修表面”)；Dall’Acqua,W.F.et al.,Methods 36:43-60(2005)(记载“FR改组”)；Osbourn,J.et al.,Methods 36:61-68(2005)及Klimka,A.et al.,Br.J.Cancer 83:252-260(2000)(记载FR改组的“引导选择”办法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims,M.J.等,J.Immunol.151:2296-2308(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-4289(1992)；及Presta,L.G.等,J.Immunol.,151:2623-2632(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca,M.等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok,M.J.等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk,M.A.and van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-374(2001)及Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有整个或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述参见Lonberg,N.,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可参见例如美国专利No.6,075,181和No.6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了
Figure BDA0001638753030000401
技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M
Figure BDA0001638753030000411
技术，和美国专利申请公开文本No.US 2007/0061900，其描述了
Figure BDA0001638753030000412
技术。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见例如Kozbor,D.,J.Immunol.133:3001-3005(1984)；Brodeur,B.R.et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),pp.51-63；及Boerner,P.et al.,J.Immunol.147:86-95(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li,J.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些记载于例如美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)及Ni,J.,XiandaiMianyixue 26:265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20:927-937(2005)及Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimentaland Clinical Pharmacology 27:185-191(2005)。
也可以如下生成人抗体，即分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库及对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom,H.R.et al.,Methods inMolecular Biology 178:1-37(2001)，并且进一步记载于例如McCafferty,J.et al.,Nature 348:552-554(1990)；Clackson,T.et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks,J.D.et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks,J.D.and Bradbury,A.,Methods inMolecular Biology 248:161-175(2003)；Sidhu,S.S.et al.,J.Mol.Biol.338:299-310(2004)；Lee,C.V.et al.,J.Mol.Biol.340:1073-1093(2004)；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:12467-12472(2004)；及Lee,C.V.et al.,J.Immunol.Methods 284:119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter,G.et al.,Ann.Rev.Immunol.12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths,A.D.et al.,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆非重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom,H.R.and Winter,G.,J.Mol.Biol.227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373及美国专利公开文本No.2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对TPBG，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合TPBG上的两种不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达TPBG的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(参见Milstein,C.and Cuello,A.C.,Nature305:537-540(1983)；WO 93/08829；及Traunecker,A.et al.,EMBO J.10:3655-3659(1991))，和“节-入-穴”工程化(参见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如美国专利No.4,676,980及Brennan,M.et al.,Science 229:81-83(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(参见例如Kostelny,S.A.et al.,J.Immunol.148:1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Holliger,P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber,M.et al.,J.Immunol.152:5368-5374(1994))；及制备三特异性抗体(如例如Tutt,A.et al.,J.Immunol.147:60-69(1991)中所描述的)来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合TPBG及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用Fab”或“DAF”(参见例如US 2008/0069820)。
本文中的抗体或片段还包括WO 2009/080251，WO 2009/080252，WO2009/080253，WO 2009/080254，WO 2010/112193，WO 2010/115589，WO2010/136172，WO 2010/145792，及WO 2010/145793中记载的多特异性抗体。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将适宜的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除，和/或插入和/或替代。可以进行删除，插入，和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。
a)替代，插入，和删除变体
在某些实施方案中，提供具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。例示性变化在下表中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。保守替代在表1中在“优选的替代”的标题下显示。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
表
Figure BDA0001638753030000431
Figure BDA0001638753030000441
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性，亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。一种例示性替代变体是亲和力成熟抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中做出变化(例如替代)，例如以改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”中，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，对所得变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom,H.R.et al.,in Methods in Molecular Biology 178:1-37(2002))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)任一将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的办法，其中将数个HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代，插入，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出保守变化(例如保守替代，如本文中提供的)，其没有实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或是未改变的，或是含有不多于1，2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如记载于Cunningham,B.C.and Wells,J.A.,Science,244:1081-1085(1989)。在这种方法中，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如arg，asp，his，lys，和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原之间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的，双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright,A.and Morrison,S.L.,TIBTECH15(1997)26-32。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖，和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的，杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A.et al.,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.et al.,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.et al.,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；及WO 2004/056312，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki,N.et al.,Biotech.Bioeng.87(2004)614；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(2006)680-688；及WO 2003/085107)。
进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878；美国专利No.6,602,684；及US 2005/0123546。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087；WO1998/58964；及WO 1999/22764。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom,I.等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063)和Hellstrom,I.等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502；美国专利No.5,821,337(见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox
Figure BDA0001638753030000481
非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes,R.等,Proc.Natl Acad.Sci.USA 95(1998)652-656的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro,H.等,J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等,Blood 101(2003)1045-1052；及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova,S.B.等,Int.Immunol.18(2006)1759-1769)。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(参见例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312；及Shields,R.L.et al.,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298，333，和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。
在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551，WO 99/51642，及Idusogie,E.E.等,J.Immunol.164(2000)4178-4184的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,R.L.et al.,J.Immunol.117:587-593(1976)及Kim,J.K.et al.,J.Immunol.24:2429-2434(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn的结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434中的一处或多处具有替代，例如Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。
还可参见Duncan,A.R.and Winter,G.,Nature 322:738-740(1988)；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可能期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体缀合至其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下述残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的另外的非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三
Figure BDA0001638753030000491
烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇，及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着至抗体的聚合物的数目可以变化，而且如果附着了多于一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下述考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能，抗体衍生物是否会用于指定条件下的治疗，等。
在另一个实施方案中，提供抗体和可以通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam,N.W.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，而且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可使用重组方法和组合物来生成抗体，例如如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供编码本文所述抗TPBG抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如已经用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供生成抗TPBG抗体的方法，其中该方法包括在适合于抗体表达的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并任选自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。
对于抗TPBG抗体的重组生成，分离编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)，并插入一种或多种载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体重和轻链的基因)。
适合于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如US 5,648,237；US 5,789,199；及US 5,840,523。还可参见Charlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ(2003),pp.245-254，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。表达后，可以在可溶性级分中自细菌细胞浆分离抗体，并可以进一步纯化。
在原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适合于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；及Li,H.et al.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也是自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生的。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
也可利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利No.5,959,177；No.6,040,498；No.6,420,548；No.7,125,978；及No.6,417,429(其描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用哺乳动物宿主细胞系的其它例子有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham,F.L.et al.,J.Gen Virol.36:59-74(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23:243-252(1980))；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather,J.P.et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki,P.and Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2004),pp.255-268。
C.测定法
可通过本领域已知的多种测定法对本文中提供的抗TPBG抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
1.结合测定法和其它测定法
一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知方法诸如ELISA，Western印迹，等。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与选自如本文中公开的和通过它们的相应VH和VL域氨基酸序列定义的抗体051，091，或097的组的抗体竞争对TPBG的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与选自如本文中公开的和通过它们的相应VH和VL域氨基酸序列定义的抗体051，091，或097的组的抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法参见Morris(1996)“Epitope MappingProtocols,”in Methods in Molecular Biology,vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)。
在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合TPBG，例如选自如本文中公开的和通过它们的相应VH和VL域氨基酸序列定义的抗体051，091，或097的组的抗体)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对TPBG的结合的能力)的溶液中温育固定化TPBG。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化TPBG。在允许第一抗体结合TPBG的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化TPBG联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化TPBG联合的标记物的量相对于对照样品实质性减少，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对TPBG的结合。参见Harlow,E.and Lane,D.,Antibodies:A Laboratory Manual,Chapter14,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1988)。
2.活性测定法
一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗TPBG抗体的测定法。生物学活性可包括例如对表达TPBG的肿瘤细胞的结合。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。
D.免疫缀合物
本发明还提供包含本文中的抗TPBG抗体的免疫缀合物，该抗体与一种或多种细胞毒剂诸如化疗剂或药物，生长抑制剂，毒素(例如蛋白质毒素，细菌，真菌，植物，或动物起源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素缀合。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木生物碱(maytansinoid)(参见US 5,208,020，US 5,416,064和EP 0 425 235B1)；auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(参见US 5,635,483，US 5,780,588，及US 7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见US 5,712,374，US 5,714,586，US 5,739,116，US5,767,285，US 5,770,701，US 5,770,710，US 5,773,001，和US 5,877,296；Hinman,L.M.等人，Cancer Res.53:3336-3342(1993)；及Lode,H.N.等人，Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz,F.等人，Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey,S.C.等人，BioorgMed.Chem.Letters16:358-362(2006)；Torgov,M.Y.等人，Bioconjug.Chem.16:717-721(2005)；Nagy,A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik,G.M.等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King,H.D.等人，J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；及美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷诸如多西他赛(docetaxel)，帕利他赛(paclitaxel)，larotaxel，tesetaxel，和ortataxel；单端孢菌素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与酶活性毒素或其片段缀合，包括但不限于白喉毒素A链，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa)的非结合活性片段，白喉毒素，蓖麻毒蛋白(ricin)A链，相思豆毒蛋白(abrin)A链，蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链，α-帚曲霉素(sarcin)，油桐(Aleurites fordii)毒蛋白，香石竹(dianthin)毒蛋白，美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜(Momordica charantia)抑制物，麻疯树毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物，白树毒蛋白(gelonin)，丝林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。在一个实施方案中，该酶活性毒素是假单胞菌外毒素A或其变体。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与放射性原子缀合以形成放射缀合物。多种放射性同位素可用于生成放射缀合物。实例包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素。在将放射缀合物用于检测时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如TC99m或I123，或自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)，诸如再一次的碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)，活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)，醛类(诸如戊二醛)，双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)，双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)，二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)，和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta,E.S.等,Science 238:1098-1104(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头，肽酶敏感接头，光不稳定接头，二甲基接头，或含二硫化物接头(Chari,R.V.等,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于：商品化(如购自Pierce Biotechnology Inc.,Rockford,IL,U.S.A)的BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，sulfo-EMCS，sulfo-GMBS，sulfo-KMUS，sulfo-MBS，sulfo-SIAB，sulfo-SMCC，和sulfo-SMPB，和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
该抗体和作为多肽的细胞毒剂的缀合物也可以作为重组融合蛋白来提供，例如通过在宿主细胞内直接表达所述融合蛋白，由此不需要另外的偶联步骤进行提供。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗TPBG抗体对于检测生物学样品中TPBG的存在是有用的。如本文中使用的，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包括细胞或组织，诸如肿瘤细胞。
在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的抗TPBG抗体。在又一方面，提供检测生物学样品中TPBG的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在允许抗TPBG抗体结合TPBG的条件下使生物学样品与本文所述抗TPBG抗体接触，并检测是否在抗TPBG抗体与TPBG之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗TPBG抗体来选择适合用抗TPBG抗体治疗的受试者，例如其中TPBG是一种用于选择患者的生物标志物。
可使用本发明的抗体来诊断的例示性病症包括癌症，例如淋巴瘤，淋巴细胞性白血病，肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金(Hodgkin)氏病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌症，甲状腺癌，副甲状腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌，中枢神经系统(CNS)赘生物，脊轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，施旺细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，脑[脊]膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。
在某些实施方案中，提供经标记的抗TPBG抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光，发色，电子致密，化学发光，和放射性标记物)，以及例如经由酶促反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性标记物包括但不限于放射性同位素32P，14C，125I，3H，和131I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明(rhodamine)及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定的自由基，等等。
F.药物配制剂
通过混合具有期望纯度的本文所述抗TPBG抗体与一种或多种任选的药学可接受载剂来制备此类抗体的药物配制剂(Remington's Pharmaceutical Sciences,16thedition,Osol,A.(ed.)(1980))，处于冻干配制剂或水性溶液形式。一般地，药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性药学可接受载剂进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rhuPH20(
Figure BDA0001638753030000561
Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP和使用方法(包括rhuPH20)记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和No.2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO 2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的多于一种活性组分，优选活性互补且彼此没有不利影响的那些。例如，可能想要进一步提供化疗剂，优选下文列出的化疗剂。合适的是，此类活性组分以对于预定目的有效的量组合存在。
活性组分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.(ed.)(1980)。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品形式，例如膜或微胶囊。
用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
G.治疗方法和组合物
本文中提供的任何抗TPBG抗体或包含本文中提供的抗TPBG抗体的重组融合蛋白或免疫缀合物可以在治疗方法中使用。
在一个方面，提供了一种抗TPBG抗体，其用作药物。在又一些方面，提供了一种抗TPBG抗体，其用于治疗癌症。在某些实施方案中，提供了一种抗TPBG抗体，其用于治疗方法。在某些实施方案中，本发明提供一种抗TPBG抗体，其用于一种治疗具有癌症的个体的方法，该方法包括对该个体施用有效量该抗TPBG抗体。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如下文描述的。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。
在又一个方面，本发明提供抗TPBG抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。在又一个实施方案中，该药物用于一种治疗癌症的方法，该方法包括对具有癌症的个体施用有效量的该药物。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如下文描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供一种用于治疗癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括对具有癌症的个体施用有效量的抗TPBG抗体。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如下文描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供包含本文中提供的任何抗TPBG抗体的药物配制剂，例如用于任何上述治疗方法。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗TPBG抗体和药学可接受载剂。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗TPBG抗体和至少一种另外的治疗剂，例如下文描述的。
本发明的抗体可以在疗法中单独或与其它药剂组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共施用。在某些实施方案中，另外的治疗剂是化疗剂。
在一个实施方案中，此类化疗剂包括但不限于抗肿瘤剂，包括烷化剂，包括：氮芥，诸如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，异环磷酰胺(ifosfamide)，美法仑(melphalan)和苯丁酸氮芥(chlorambucil)；亚硝基脲(nitrosourea)，诸如卡莫司汀(carmustine)(BCNU)，洛莫司汀(lomustine)(CCNU)，和司莫司汀(semustine)(methyl-CCNU)；TemodalTM(替莫唑胺(temozolamide))，乙撑亚胺/甲基蜜胺诸如三乙撑蜜胺(TEM)，三乙烯硫代磷酰胺(塞替派(thiotepa))，六甲基蜜胺(HMM，六甲蜜胺(altretamine))；烃基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)；三嗪，诸如达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)；抗代谢物，包括叶酸类似物，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和三甲曲沙(trimetrexate)，嘧啶类似物，诸如5-氟尿嘧啶(5FU)，氟脱氧尿苷，吉西他滨(gemcitabine)，胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，阿糖胞苷(cytarabine))，5-氮胞苷，2,2'-二氟脱氧胞苷，嘌呤类似物，诸如6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，硫唑嘌呤(azathioprine)，T-脱氧柯福霉素(喷司他丁(pentostatin))，erythrohydroxynonyladenine(EHNA)，磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)，和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)，2-CdA)；天然产物，包括抗有丝分裂药物，诸如帕利他赛(paclitaxel)，长春花生物碱(包括长春碱(vinblastine)(VLB)，长春新碱(vincristine)，和长春瑞滨(vinorelbine))，泰索帝(taxotere)，雌莫司汀(estramustine)，和磷酸雌莫司汀；表鬼臼毒素(pipodophylotoxin)，诸如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；抗生素，诸如放线菌素D(actinomycin D)，道诺霉素(daunomycin)(柔红霉素(rubidomycin))，多柔比星(doxorubicin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，伊达比星(idarubicin)，博来霉素(bleomycin)，普卡霉素(plicamycin)(光辉霉素(mithramycin))，丝裂霉素C(mitomycinC)，和放线菌素(actinomycin)；酶，诸如L-天冬酰胺酶；生物学应答改性剂，诸如干扰素-α，IL-2，G-CSF和GM-CSF；包括铂配位复合物的混杂剂，诸如奥沙利铂(oxaliplatin)，顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)，蒽二酮，诸如米托蒽醌(mitoxantrone)，取代的脲，诸如羟基脲，甲基肼衍生物，包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼(procarbazine)，肾上腺皮质阻抑剂，诸如米托坦(mitotane)(o，p-DDD)和氨鲁米特(aminoglutethimide)；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，诸如强的松(prednisone)及等效物，地塞米松(dexamethasone)和氨鲁米特(aminoglutethimide)；GemzarTM(吉西他滨(gemcitabine))，妊娠素，诸如己酸羟基孕酮(hydroxyprogesterone caproate)，乙酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)和乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)；雌激素，诸如己烯雌酚(diethylstilbestrol)和乙炔雌二醇等效物；抗雌激素，诸如他莫昔芬(tamoxifen)；雄激素，包括丙酸睾酮(testosterone propionate)和氟甲睾酮(fluoxymesterone)/等效物；抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)，促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林(leuprolide)；和非类固醇抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)。靶向后成机制的疗法包括但不限于组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，脱甲基化剂(例如Vidaza)和释放转录阻抑(ATRA)疗法也可以与本发明的抗体组合。
在一个实施方案中，化疗剂选自下组：紫杉烷(像例如帕利他赛(Taxol)，多西他赛(Taxotere)，经修饰的帕利他赛(例如Abraxane和Opaxio)，多柔比星，舒尼替尼(Sutent)，索拉非尼(Nexavar)，和其它多激酶抑制剂，奥沙利铂，顺铂和卡铂，依托泊苷，吉西他滨，和长春碱。在一个实施方案中，化疗剂选自下组：紫杉烷(像例如帕利他赛(Taxol)，多西他赛(Taxotere)，经修饰的帕利他赛(例如Abraxane和Opaxio)。在一个实施方案中，别的化疗剂选自5-氟尿嘧啶(5-FU)，亚叶酸，伊立替康，或奥沙利铂。在一个实施方案中，化疗剂为5-氟尿嘧啶，亚叶酸和伊立替康(FOLFIRI)。在一个实施方案中，化疗剂为5-氟尿嘧啶和奥沙利铂(FOLFOX)。
本发明的抗体与另外的化疗剂一起的治疗性应用的具体例子包括例如
-与紫杉烷(例如多西他赛或帕利他赛)或经修饰的帕利他赛(例如Abraxane或Opaxio)，多柔比星，卡培他滨和/或贝伐单抗(Avastin)用于治疗乳腺癌的疗法；
-与卡铂，奥沙利铂，顺铂，帕利他赛，多柔比星(或经修饰的多柔比星(Caelyx或Doxil))，或拓扑替康(Hycamtin)用于治疗卵巢癌的疗法；
-与多激酶抑制剂MKI(Sutent，Nexavar，或706)和/或多柔比星用于治疗肾癌的疗法；
-与奥沙利铂，顺铂和/或放射用于治疗鳞状细胞癌的疗法；和
-与Taxol和/或卡铂用于治疗肺癌的疗法。
因此，在一个实施方案中，别的化疗剂选自下组：紫杉烷(多西他赛或帕利他赛)或经修饰的帕利他赛(Abraxane或Opaxio)，多柔比星，卡培他滨和/或贝伐单抗(用于治疗乳腺癌)。
在一个实施方案中，本发明的抗体在另外的化疗剂缺失下施用。
上文记录的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体的施用。本发明的抗体还可以与放射疗法组合使用。
可以通过任何合适手段，包括胃肠外，肺内，和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的抗体(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适路径(例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射)进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点的多次施用，推注施用，和脉冲输注。
本发明的抗体应当以一种与较好医学实践一致的方式配制，定剂量，和施用。关于这一点考虑的因素包括所治疗的具体病症，所治疗的具体哺乳动物，患者个体的临床状态，病症的起因，药剂递送部位，施用方法，施用日程表，及医学从业人员知道的其它因素。抗体无需但任选与一种或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量，病症或治疗的类型，及上文讨论的其它因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用路径，或者以本文所述剂量的约1-99％，或者以凭经验/在临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。
对于疾病的预防或治疗，本发明的抗体(当单独地或与一种或多种其它别的治疗剂组合地使用时)的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型，抗体的类型，疾病的严重性和病程，施用抗体是出于预防还是治疗目的，之前的疗法，患者的临床史和对抗体的响应，及主治医师的判断。抗体恰当地以一次或一系列治疗施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg至10mg/kg)的抗体可作为施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开的施用或是通过连续输注。取决于上文所述因素，一个典型日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于几天或更长时间的重复施用，取决于状况，治疗一般会持续直至出现疾病症状的期望遏制。抗体的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用一剂或多剂约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，或例如约6剂抗体)。然而，其它剂量摄生法可能是有用的。这种疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
应当理解，可使用本发明的免疫缀合物或本发明的重组融合蛋白实施任何上述配制剂或治疗性方法，作为抗TPBG抗体的替代或补充。
III.制品
在本发明的另一方面，提供一种制品，其包含对于治疗，预防和/或诊断上文所述病症有用的材料。制品包括容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，IV溶液袋，等。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器装有单独或与另一种组合物组合有效治疗，预防和/或诊断疾患的组合物，并且可具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中该组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的这个实施方案中的制品可进一步包括包装插页，其指示可使用组合物来治疗特定状况。或者/另外，制品可进一步包括第二(或第三)容器，其装有药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针，和注射器。
应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物或本发明的重组融合蛋白，作为抗TPBG抗体的替代或补充。
IV.本发明的具体实施方案
下面列出本发明的具体实施方案。
1.一种分离的结合滋养层糖蛋白(TPBG)的抗体，其中该抗体结合人TPBG(SEQ IDNO:1)和迷你猪TPBG(SEQ ID NO:2)。
2.一种分离结合滋养层糖蛋白(TPBG)的抗体，其中该抗体结合人TPBG(SEQ IDNO:1)和细胞表面表达的迷你猪TPBG(SEQ ID NO:2)。
3.一种分离结合滋养层糖蛋白(TPBG)的抗体，其中该抗体结合人TPBG(SEQ IDNO:1)和迷你猪TPBG(SEQ ID NO:2)，且其中该抗体在pH 5.5和pH 7.4特异性结合人TPBG。
4.一种分离结合滋养层糖蛋白(TPBG)的抗体，其中该抗体结合人TPBG(SEQ IDNO:1)和迷你猪TPBG(SEQ ID NO:2)，且其中该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合人TPBG。
5.实施方案1至4任一项的抗体，其中该抗体分别以10-8M或更小的KD特异性结合人和迷你猪TPBG。
6.实施方案1至4任一项的抗体，其中该抗体分别以10-8M至10-13M的KD特异性结合人和迷你猪TPBG。
7.实施方案4至6任一项的抗体，其中该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合细胞表面表达的人TPBG。
8.实施方案4至6任一项的抗体，其中该抗体在pH 5.5和pH 7.2特异性结合SW620细胞上的细胞表面表达的人TPBG。
9.实施方案3至8任一项的抗体，其中该抗体在pH 5.5和pH 7.4以10-8M或更小的KD特异性结合人TPBG。
10.实施方案3至9任一项的抗体，其中该抗体在pH 5.5和pH 7.4以10-8M至10-13M的KD特异性结合人TPBG。
11.实施方案1至10任一项的抗体，其中该抗体在结合时内在化入表达TPBG的细胞。
12.实施方案1至11任一项的抗体，其中该抗体包含
(a)SEQ ID NO:5的重链CDR3，SEQ ID NO:8的轻链CDR3，和SEQ ID NO:4的重链CDR2；或[抗体051]
(b)SEQ ID NO:13的重链CDR3，SEQ ID NO:16的轻链CDR3，和SEQ ID NO:12的重链CDR2；或[抗体091]
(c)SEQ ID NO:21的重链CDR3，SEQ ID NO:24的轻链CDR3，和SEQ ID NO:20的重链CDR2，[抗体097]
或其中该抗体是自(a)，(b)或(c)中所示抗体衍生的人源化抗体。
13.实施方案1至11任一项的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:5的重链CDR3，SEQID NO:8的轻链CDR3，和SEQ ID NO:4的重链CDR2。[抗体051]
14.实施方案1至11任一项的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:13的重链CDR3，SEQID NO:16的轻链CDR3，和SEQ ID NO:12的重链CDR2。[抗体091]
15.实施方案1至11任一项的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:21的重链CDR3，SEQID NO:24的轻链CDR3，和SEQ ID NO:20的重链CDR2。[抗体097]
16.一种人源化抗体，其是自实施方案13至15任一项的抗体衍生的。
17.实施方案1至11任一项的抗体，其中该抗体包含
(a)SEQ ID NO:3的重链CDR1，SEQ ID NO:4的重链CDR2，SEQ ID NO:5的重链CDR3，SEQ ID NO:6的轻链CDR1，SEQ ID NO:7的轻链CDR2，和SEQ ID NO:8的轻链CDR3；或[抗体051]
(b)SEQ ID NO:11的重链CDR1，SEQ ID NO:12的重链CDR2，和SEQ ID NO:13的重链CDR3，SEQ ID NO:14的轻链CDR1，SEQ ID NO:15的轻链CDR2，和SEQ ID NO:16的轻链CDR3；或[抗体091]
(c)SEQ ID NO:19的重链CDR1，SEQ ID NO:20的重链CDR2，和SEQ ID NO:21的重链CDR3，SEQ ID NO:22的轻链CDR1，SEQ ID NO:23的轻链CDR2，和SEQ ID NO:24的轻链CDR3；[抗体097]
或其中该抗体是自(a)，(b)或(c)中所示抗体衍生的人源化抗体。
18.实施方案1至11任一项的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:3的重链CDR1，SEQID NO:4的重链CDR2，SEQ ID NO:5的重链CDR3，SEQ ID NO:6的轻链CDR1，SEQ ID NO:7的轻链CDR2，和SEQ ID NO:8的轻链CDR3。[抗体051]
19.实施方案1至11任一项的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:11的重链CDR1，SEQID NO:12的重链CDR2，和SEQ ID NO:13的重链CDR3，SEQ ID NO:14的轻链CDR1，SEQ ID NO:15的轻链CDR2，和SEQ ID NO:16的轻链CDR3。[抗体091]
20.实施方案1至11任一项的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:19的重链CDR1，SEQID NO:20的重链CDR2，和SEQ ID NO:21的重链CDR3，SEQ ID NO:22的轻链CDR1，SEQ ID NO:23的轻链CDR2，和SEQ ID NO:24的轻链CDR3。[抗体097]
21.一种人源化抗体，其是自实施方案18至20任一项的抗体衍生的。
22.实施方案1至11任一项的抗体，其包含
(a)与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；
(b)与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或
(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。[抗体051]
23.实施方案22的抗体，其包含SEQ ID NO:9的VH序列。[抗体051]
24.实施方案22或23的抗体，其包含SEQ ID NO:10的VL序列。[抗体051]
25.一种抗体，其包含SEQ ID NO:9的VH序列和SEQ ID NO:10的VL序列。[抗体051]
26.一种结合TPBG的人源化抗体，其是自实施方案25的抗体衍生的。
27.实施方案1至11任一项的抗体，其包含
(a)与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；
(b)与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或
(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。[抗体091]
28.实施方案27的抗体，其包含SEQ ID NO:17的VH序列。[抗体091]
29.实施方案27或28的抗体，其包含SEQ ID NO:18的VL序列。[抗体091]
30.一种抗体，其包含SEQ ID NO:17的VH序列和SEQ ID NO:18的VL序列。[抗体091]
31.一种结合TPBG的人源化抗体，其是自实施方案30的抗体衍生的。
32.实施方案1至11任一项的抗体，其包含
(a)与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；
(b)与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或
(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。[抗体097]
33.实施方案32的抗体，其包含SEQ ID NO:25的VH序列。[抗体097]
34.实施方案32或33的抗体，其包含SEQ ID NO:26的VL序列。[抗体097]
35.一种抗体，其包含SEQ ID NO:25的VH序列和SEQ ID NO:26的VL序列。[抗体097]
36.一种结合TPBG的人源化抗体，其是自实施方案35的抗体衍生的。
37.实施方案1至36任一项的抗体，其是单克隆抗体。
38.实施方案1至37任一项的抗体，其是人，人源化，或嵌合抗体。
39.实施方案1至38任一项的抗体，其是结合TPBG的抗体片段。
40.实施方案1至39任一项的抗体，其是结合TPBG的Fab片段。
41.实施方案1至38任一项的抗体，其是IgG同种型的。
42.实施方案1至38任一项的抗体，其是全长IgG抗体。
43.实施方案1至38任一项的抗体，其是IgG1同种型的。
44.实施方案1至38任一项的抗体，其是全长IgG1抗体。
45.一种分离的核酸，其编码实施方案1至44任一项的抗体。
46.一种宿主细胞，其包含实施方案45的核酸。
47.一种生成抗体的方法，其包括培养实施方案46的宿主细胞，使得该抗体生成。
48.实施方案47的方法，其进一步包括自该宿主细胞回收该抗体。
49.一种免疫缀合物，其包含实施方案1至44任一项的抗体和细胞毒剂。
50.实施方案49的免疫缀合物，其中该细胞毒剂是酶活性毒素或其片段。
51.实施方案50的免疫缀合物，其中该细胞毒剂选自由外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)，白喉毒素，蓖麻毒蛋白A链，相思豆毒蛋白A链，蒴莲根毒蛋白A链，α-帚曲毒蛋白，油桐毒蛋白，石竹毒蛋白，美洲商路毒蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻疯树毒蛋白，巴豆毒蛋白，肥皂草抑制剂，白树毒蛋白，丝林霉素，局限曲菌素，酚霉素，依诺霉素，和单端孢霉烯组成的组。
52.实施方案49至51任一项的免疫缀合物，其中该细胞毒剂是假单胞菌外毒素A或其变体。
53.一种生成实施方案49至52任一项的免疫缀合物的方法，包括将该抗体与该细胞毒剂偶联的步骤。
54.实施方案53的方法，其中经由分选酶(sortase)介导的偶联该抗体与该细胞毒剂偶联。
55.实施方案53至54任一项的方法，其包括在偶联步骤之前提供该抗体的步骤。
56.实施方案55的方法，其中该抗体是通过培养实施方案46的宿主细胞，使得该抗体生成而提供的。
57.实施方案56的方法，其进一步包括在偶联步骤之前自该宿主细胞回收该抗体的步骤。
58.一种重组融合蛋白，其包含实施方案1至44任一项的抗体和任何其它多肽。
59.实施方案58的重组融合蛋白，其中该其它多肽融合至该抗体的重链至少之一。
60.实施方案59的重组融合蛋白，其中该其它多肽融合至该抗体的重链至少之一的C端。
61.实施方案58至60任一项的重组融合蛋白，其中该多肽是细胞毒剂。
62.实施方案58至61任一项的重组融合蛋白，其中该多肽是酶活性毒素或其片段。
63.实施方案58至62任一项的重组融合蛋白，其中该细胞毒剂选自由外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)，白喉毒素，蓖麻毒蛋白A链，相思豆毒蛋白A链，蒴莲根毒蛋白A链，α-帚曲毒蛋白，油桐毒蛋白，石竹毒蛋白，美洲商路毒蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻疯树毒蛋白，巴豆毒蛋白，肥皂草抑制剂，白树毒蛋白，丝林霉素，局限曲菌素，酚霉素，依诺霉素，和单端孢霉烯组成的组。
64.实施方案58至63任一项的重组融合蛋白，其中该细胞毒剂是假单胞菌外毒素A或其变体。
65.一种分离的核酸，其编码实施方案58至64任一项的重组融合蛋白。
66.一种宿主细胞，其包含实施方案65的核酸。
67.一种生成重组融合蛋白的方法，其包括培养实施方案66的宿主细胞，使得该重组融合蛋白生成。
68.实施方案67的方法，其进一步包括自该宿主细胞回收该重组融合蛋白。
69.实施方案67或68的方法，其中该重组融合蛋白是包含实施方案1至44任一项的抗体和细胞毒剂的免疫缀合物。
70.实施方案67至69任一项的方法，其包括分离该宿主细胞的包涵体并溶解该包涵体。
71.实施方案70的方法，其进一步包括使来自溶解的包涵体的材料复性的步骤。
72.实施方案67至71任一项的方法，其中该宿主细胞是细菌细胞。
73.实施方案67至72任一项的方法，其中该宿主细胞是大肠杆菌。
74.一种药物配制剂，其包含实施方案1至44任一项的抗体和药学可接受载剂。
75.实施方案74的药物配制剂，其进一步包含另外的治疗剂。
76.实施方案75的药物配制剂，其中该另外的治疗剂是化疗剂。
77.一种药物配制剂，其包含实施方案49至52任一项的免疫缀合物和药学可接受载剂。
78.实施方案77的药物配制剂，其进一步包含另外的治疗剂。
79.实施方案78的药物配制剂，其中该另外的治疗剂是化疗剂。
80.一种药物配制剂，其包含实施方案58至64任一项的重组融合蛋白和药学可接受载剂。
81.实施方案80的药物配制剂，其进一步包含另外的治疗剂。
82.实施方案81的药物配制剂，其中该另外的治疗剂是化疗剂。
83.实施方案80的药物配制剂，其用于与放射疗法组合施用。
84.实施方案1至44任一项的抗体，其用作药物。
85.实施方案1至44任一项的抗体，其用于治疗癌症。
86.实施方案85的用途的抗体，其中该癌症选自淋巴瘤，淋巴细胞性白血病，肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金(Hodgkin)氏病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌症，甲状腺癌，副甲状腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌，中枢神经系统(CNS)赘生物，脊轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，施旺细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，脑[脊]膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。
87.实施方案85或86的用途的抗体，其中该癌症是非小细胞肺癌症。
88.实施方案1至44任一项的抗体在制造药物中的用途。
89.实施方案88的用途，其中该药物用于治疗癌症。
90.实施方案89的用途，其中该癌症选自淋巴瘤，淋巴细胞性白血病，肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金(Hodgkin)氏病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌症，甲状腺癌，副甲状腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌，中枢神经系统(CNS)赘生物，脊轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，施旺细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，脑[脊]膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。
91.实施方案89或90的用途，其中该癌症是非小细胞肺癌症。
92.实施方案89至91任一项的用途，其中该药物用于与一种或多种化疗剂和/或放射疗法组合施用。
93.一种治疗具有癌症的个体的方法，其包括对该个体施用有效量的实施方案1至44任一项的抗体。
94.实施方案93的方法，其进一步包括将另外的治疗剂施用于该个体。
95.实施方案94的方法，其中该另外的治疗剂是化疗剂。
96.实施方案93的方法，其进一步包括将放射疗法施用于该个体。
97.实施方案49至52任一项的免疫缀合物，其用作药物。
98.实施方案49至52任一项的免疫缀合物，其用于治疗癌症。
99.实施方案98的用途的免疫缀合物，其中该癌症选自淋巴瘤，淋巴细胞性白血病，肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金(Hodgkin)氏病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌症，甲状腺癌，副甲状腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌，中枢神经系统(CNS)赘生物，脊轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，施旺细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，脑[脊]膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。
100.实施方案98或99的用途的免疫缀合物，其中该癌症是非小细胞肺癌症。
101.实施方案98至100任一项的用途的免疫缀合物，其中该免疫缀合物用于与化疗剂和/或放射疗法组合施用。
102.实施方案49至52任一项的免疫缀合物在制造药物中的用途。
103.实施方案102的用途，其中该药物用于治疗癌症。
104.实施方案103的用途，其中该癌症选自淋巴瘤，淋巴细胞性白血病，肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金(Hodgkin)氏病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌症，甲状腺癌，副甲状腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌，中枢神经系统(CNS)赘生物，脊轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，施旺细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，脑[脊]膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。
105.实施方案103或104的用途，其中该癌症是非小细胞肺癌症。
106.实施方案102至105任一项的用途，其中该免疫缀合物用于与一种或多种化疗剂和/或放射疗法组合施用。
107.一种治疗具有癌症的个体的方法，其包括对该个体施用有效量的实施方案49至52任一项的免疫缀合物。
108.实施方案107的方法，其进一步包括将另外的治疗剂施用于该个体。
109.实施方案108的方法，其中该另外的治疗剂是化疗剂。
110.实施方案107至109任一项的方法，其进一步包括施用放射疗法。
111.实施方案58至64任一项的重组融合蛋白，其用作药物。
112.实施方案58至64任一项的重组融合蛋白，其用于治疗癌症。
113.实施方案112的用途的重组融合蛋白，其中该癌症选自淋巴瘤，淋巴细胞性白血病，肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金(Hodgkin)氏病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌症，甲状腺癌，副甲状腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌，中枢神经系统(CNS)赘生物，脊轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，施旺细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，脑[脊]膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。
114.实施方案112或113的用途的重组融合蛋白，其中该癌症是非小细胞肺癌症。
115.实施方案112至114任一项的用途的重组融合蛋白，其中该重组融合蛋白用于与化疗剂和/或放射疗法组合施用。
116.实施方案58至64任一项的重组融合蛋白在制造药物中的用途。
117.实施方案116的用途，其中该药物用于治疗癌症。
118.实施方案117的用途，其中该癌症选自淋巴瘤，淋巴细胞性白血病，肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金(Hodgkin)氏病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌症，甲状腺癌，副甲状腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌，中枢神经系统(CNS)赘生物，脊轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，施旺细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，脑[脊]膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。
119.实施方案117或118的用途，其中该癌症是非小细胞肺癌症。
120.实施方案117至119任一项的用途，其中该重组融合蛋白用于与一种或多种化疗剂和/或放射疗法组合施用。
121.一种治疗具有癌症的个体的方法，其包括对该个体施用有效量的实施方案58至64任一项的重组融合蛋白。
122.实施方案121的方法，其进一步包括将另外的治疗剂施用于该个体。
123.实施方案122的方法，其中该另外的治疗剂是化疗剂。
124.实施方案121至123任一项的方法，其进一步包括施用放射疗法。
125.一种筛选结合TPBG的抗体的方法，其中该抗体结合人和迷你猪TPBG，该方法包括测试测试抗体对人TPBG和迷你猪TPBG的结合，并选择结合人TPBG和迷你猪TPBG的抗体的步骤。
126.实施方案125的方法，其包括选择以10-8M或更小的KD结合人TPBG和迷你猪TPBG的抗体的步骤。
127.实施方案125或126的方法，其中该方法用于筛选用于治疗性应用的抗体。
128.实施方案125至127任一项的方法，其中该方法用于筛选实施方案1至44的抗体。
129.实施方案125至128任一项的方法，其中该方法包括测试单价形式的测试抗体的结合的步骤。
130.实施方案125至129任一项的方法，其中该方法包括在pH 5.5和在pH 7.2测试测试抗体对人TPBG的结合，并选择该在pH 5.5和在pH 7.2结合人TPBG的抗体的步骤。
131.实施方案125至130任一项的方法，其中该方法包括在pH 5.5和在pH 7.4测试测试抗体对人TPBG的结合，并选择在pH 5.5和在pH 7.4结合人TPBG的抗体的步骤。
132.实施方案131的方法，其包括选择在pH 5.5和在pH 7.4以10-8M或更小的KD结合人TPBG的抗体的步骤。
133.通过实施方案125至132任一项的方法获得的抗体。
134.一种生成结合TPBG的抗体的方法，其中该抗体结合人和迷你猪TPBG，该方法包括下述步骤：(a)给动物免疫接种人TPBG或人TBPG胞外域(ECD)，(b)自该动物的血液分离对人TPBG特异性的B细胞，(c)鉴定由所分离的B细胞生成的抗体的可变域(VH和VL)的氨基酸序列，(d)提供包含所鉴定的可变域的抗体，(e)测试所提供的抗体对人TPBG和迷你猪TPBG的结合，并(f)选择结合人TPBG和迷你猪TPBG的抗体。
135.实施方案134的方法，其包括选择以10-8M或更小的KD结合人TPBG和迷你猪TPBG的抗体的步骤。
136.实施方案134或135的方法，其中该方法用于生成用于治疗性应用的抗体。
137.实施方案134至136任一项的方法，其中该方法用于筛选实施方案1至44的抗体。
138.实施方案134至137任一项的方法，其中该动物是啮齿动物。
139.实施方案134至138任一项的方法，其中该动物是家兔。
140.实施方案134至139任一项的方法，其中该方法包括测试单价形式的所提供的抗体的结合的步骤。
141.实施方案134至140任一项的方法，其中该方法包括在pH 5.5和在pH 7.2测试所提供的抗体对人TPBG的结合，并选择在pH 5.5和在pH 7.2结合人TPBG的抗体的步骤。
142.实施方案134至141任一项的方法，其中该方法包括在pH 5.5和在pH 7.4测试测试抗体对人TPBG的结合，并选择在pH 5.5和在pH 7.4结合人TPBG的抗体的步骤。
143.实施方案142的方法，其包括选择在pH 5.5和在pH 7.4以10-8M或更小的KD结合人TPBG的抗体的步骤。
144.通过实施方案134至143任一项的方法获得的抗体。
V.氨基酸序列的描述
Figure BDA0001638753030000731
Figure BDA0001638753030000741
Figure BDA0001638753030000751
Figure BDA0001638753030000761
Figure BDA0001638753030000771
Figure BDA0001638753030000781
Figure BDA0001638753030000791
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应理解鉴于上文提供的一般性描述，可以实践各种其他实施方案。
尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细地描述了上述发明，说明书和实施例不应解释为限制发明范围。通过述及明确收录本文中引用的所有专利和科学文献的完整公开内容。
材料和通用方法
重组DNA技术
使用标准方法操作DNA，如Sambrook,J.et al.,Molecular cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989中描述的。依照制造商的用法说明书使用分子生物学试剂。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息见Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Ed.,NIHPublication No 91-3242。依照EU编号方式(Edelman,G.M.,et al.,PNAS 63(1969)78-85；Kabat,E.A.,et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEd.,NIH Publication No 91-3242)对抗体链的氨基酸编号。使用Vector NT1Advance套组版本11.5(Invitrogen)进行序列创建，定位，分析，注释和说明。
DNA测序
通过在SequiServe(Vaterstetten,Germany)和Geneart AG(Regensburg,Germany)实施的双链测序来测定DNA序列。
基因合成
期望的基因区段由Geneart AG(Regensburg,Germany)自合成的寡核苷酸和PCR产物通过自动化基因合成来制备。将侧翼为单个限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入pGA18(ampR)质粒。自经过转化的细菌纯化质粒DNA，并通过UV光谱术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。
实施例1：在迷你猪和食蟹猴中表达TPBG-RNA
先前使用食蟹猴对TPBG特异性抗体或其缀合物评估它们的耐受性(Sapra et al.(2013)Mol Canc Ther 12:38-47)。制备食蟹猴和迷你猪的14不同组织并评估mRNA表达概况。作为带索引的，75bp，配对末端运行，在Illumina NextSeq500上评估通过对来自Roche食蟹猴和迷你猪RNAseq计划的组织RNA测序进行的转录概况分析，平均深度为3千万读出对。作为每千碱基外显子模型每百万读出的独特读出(rpkm)在log刻度上标示基因表达信号，标示中值表达水平和标准偏差。
彼此比较所获得的信号。结果暗示迷你猪和食蟹猴的RNA表达概况很大程度上相当。因而，迷你猪是评估新型迷你猪交叉反应性抗TPBG抗体和Fab-PE构建物的合适毒理学物种(图1)。
实施例2：克隆和瞬时表达TPBG的胞外域
在真核表达载体中克隆全长TPBG(因而包含胞外域，跨膜域和胞内域)或其片段的cDNA。通过标准限制性消化实施克隆。对于含有后面是HIS6-Avi表位标签的C端PreScission位点或后面是huIgG1-Fc-HIS6表位标签的C端PreScission位点的质粒，用BamHI和NotI限制酶实施定点克隆。依照标准分子生物学技术验证质粒的序列并扩增。
在HEK293F(Life Technologies)细胞中瞬时转染含有TPBG的胞外域或其片段的质粒。简言之，在FreeStyle 293-F(Life Technologies)表达培养基中培养细胞。转染前日，以1x106个/ml培养基的密度接种细胞。次日，每ml培养基使用1μg质粒DNA。使用293Free(Life Technologies)转染试剂进行瞬时转染。将经转染细胞在Erlenmeyer烧瓶中于37℃和8％CO2温育7天，同时以125-130rpm摇动。收获上清液并冷冻于-80℃或直接加工进行蛋白质纯化。
实施例3：纯化重组TPBG
使用HiTrap MabSelect Xtra蛋白A柱(GE Healthcare)自细胞培养物上清液纯化含有huIgG1-Fc-HIS6表位标签的重组TPBG(人TPBG：SEQ ID NO：28；迷你猪TPGB：SEQ ID NO：30；食蟹猴TPBG：SEQ ID NO：32；鼠TPBG：SEQ ID NO：34，大鼠TPBG：SEQ ID NO：36；所列序列均包括信号肽)。洗脱在酸性条件(100mM柠檬酸盐缓冲液，pH3.0)下发生。通过添加少量Tris-Cl，pH9.0来中和洗出液的pH。使用HisTrap HP(GE Healthcare)柱自细胞培养物上清液纯化含有HIS6-Avi表位标签的重组TPBG(人TPBG：SEQ ID NO：27；迷你猪TPGB：SEQ IDNO：29；食蟹猴TPBG：SEQ ID NO：31；鼠TPBG：SEQ ID NO：33，大鼠TPBG：SEQ ID NO：35，所列序列均包括信号肽)。洗脱以咪唑分阶梯度发生。随后在HiLoad 16/60Superdex 200制备级(GE Healthcare)大小排阻柱上加载亲和纯化的蛋白质。收集产物峰并用Amicon Ultra滤器(Merck Millipore)通过超速离心调节体积。最终的贮存缓冲液由20mM组氨酸，140mMNaCl，pH 5.5组成。
实施例4：对家兔免疫接种TPBG
对Roche专有的表达人源化抗体全集的转基因家兔免疫接种重组TPBG蛋白质或基因。
一组3只家兔在第0天通过皮内应用免疫接种用完全弗氏佐剂乳化的400μg与huFc偶联的重组人TPBG胞外域(ECD)，并在第7，14，28，56和84天通过交替的肌肉内和皮下应用免疫接种用完全弗氏佐剂乳化的200μg每一种TPBG-huFc。在第20，34，62和90天取得血液(估算血液总体积的10％)。制备血清，用于通过ELISA进行的滴度测定(见下文)，并分离外周单个核细胞，用作B细胞克隆过程中抗原特异性B细胞的来源。
另一组3只家兔使用编码全长人TPBG的质粒表达载体进行基因免疫接种，其通过皮内应用400μg载体DNA，接着电穿孔(5个750V/cm方形脉冲，持续时间10ms，间隔1s)。家兔在第0，14，28，49，70，98和126天接受7次序贯免疫接种。在第35，77，105和133天取得血液(估算血液总体积的10％)。制备血清，用于通过ELISA进行的滴度测定(见下文)，并分离外周单个核细胞，用作B细胞克隆过程中抗原特异性B细胞的来源。
实施例5：测定来自经免疫家兔的血清滴度(ELISA)
在96孔NUNC Maxisorp板上固定化人重组可溶性TPBG胞外域(2μg/ml，100μl/孔，在PBS中)，接着将板用2％Crotein C封闭(在PBS中，200μl/孔)；一式两份应用抗血清的系列稀释液(在含0.5％Crotein C的PBS中，100μl/孔；用(1)HRP缀合的驴抗家兔IgG抗体(Jackson Immunoresearch/Dianova)，或(2)HRP缀合的家兔抗人IgG抗体(Pierce/ThermoScientific；1/5000)，或(3)生物素化的山羊抗人κ抗体(Southern Biotech/Biozol；1/5000)和链霉亲合素-HRP检测；均在含0.5％Crotein C的PBS中稀释，100μl/孔。对于所有步骤，将板于37℃温育1小时。在所有步骤之间，将板用含0.05％Tween 20的PBS清洗3次。通过添加100μl/孔可溶性BM Blue POD底物(Roche)来产生信号；并通过添加100μl/孔1M HCl来停止信号。针对作为参照的690nm，于450nm读取吸光度。滴度定义为产生半最大信号的抗血清的稀释度。
实施例6：分离TPBG特异性B细胞
取得经免疫家兔的血液样品。将含有EDTA的全血用1x PBS(PAA，Pasching，Austria)稀释两倍，之后使用lympholyte mammal(Cedarlane Laboratories，Burlington，Ontario，Canada)依照制造商的说明书进行密度离心。将PBMC用1x PBS清洗两次。将无菌链霉亲合素包被的6孔板(Microcoat，Bernried，Germany)用PBS中的2μg/ml生物素化的人TPBG蛋白胞外域于室温包被3小时。在淘选步骤之前，将这些6孔板用无菌PBS清洗三次。在无菌6孔板(细胞培养级)上接种PBMC以经由非特异性粘附消减巨噬细胞和单核细胞。每一个孔填充最多4ml培养基和多至6x 10e6个来自经免疫家兔的PBMC并容许于37℃和5％CO2结合1小时。将上清液中的细胞(外周血淋巴细胞(PBL))用于抗原淘选步骤。对用TPBG蛋白包被的6孔板接种多至6x 10e6个PBL每4ml培养基并容许于37℃和5％CO2结合1小时以富集TPBG特异性B细胞。通过将孔用1x PBS小心清洗1-2次来去除非贴壁细胞。通过用胰蛋白酶于37℃和5％CO2处理10分钟使剩余粘性细胞脱离。用补充有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT，USA)，2mM谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素溶液(PAA，Pasching，Austria)，2mM丙酮酸钠，10mM HEPES(PAN Biotech，Aidenbach，Germany)和0.05mM b-巯基乙醇(Gibco，Paisley，Scotland)的EL-4B5培养基(EL-4B5：RPMI 1640(Pan Biotech，Aidenbach，Germany)停止胰蛋白酶化。将细胞保持于冰上直至免疫荧光染色。使用抗IgG FITC(AbDSerotec，Düsseldorf，Germany)进行单细胞分选。为了表面染色，将来自消减和富集步骤的细胞与PBS中的抗IgG FITC抗体一起温育并在黑暗中于4℃温育45分钟。染色后，将PBL用冰冷的PBS清洗两次。最后，在冰冷的PBS中重悬浮PBL并立即提交FACS分析。以5μg/ml的浓度添加碘化丙啶(BD Pharmingen，San Diego，CA，USA)，之后进行FACS分析以区分死的和活的细胞。将配备有计算机和FACSDiva软件(BD Biosciences，USA)的Becton DickinsonFACSAria用于单细胞分选。通过Seeber S.et al.,PLoS One.2014Feb4；9(2):e86184描述的方法进行家兔B细胞的培养。简言之，将单个分选的家兔B细胞在96孔板中与200μl/孔含有Pansorbin细胞(1:100000)(Calbiochem(Merck)，Darmstadt，Deutschland)，5％家兔胸腺细胞上清液(MicroCoat，Bernried，Germany)和经伽马照射的鼠EL-4B5胸腺瘤细胞(2.5x10e4个细胞/孔)的EL-4B5培养基一起在温箱中于37℃温育7天。去除B细胞培养的上清液进行筛选并立即收获剩余细胞并在100μl RLT缓冲液(Qiagen，Hilden，Germany)中于-80℃冷冻。
实施例7：B细胞PCR
使用NucleoSpin 8/96RNA试剂盒(Macherey&Nagel)依照制造商的方案自B细胞裂解物(在Qiagen的RLT缓冲液中重悬浮)制备总RNA。用60μl无RNA酶的水洗脱RNA。使用6μlRNA使用Superscript III第一链合成超级混合物(Invitrogen)和寡聚dT引物依照制造商的用法说明书通过逆转录酶反应生成cDNA。在Hamilton ML Star系统上实施所有步骤。使用4μl cDNA用AccuPrime超级混合物(Invitrogen)在50μl终体积中使用用于重链的rbHC.up和rbHC.do和用于轻链的BcPCR_FHLC_leader.fw和BcPCR_huCκ.rev引物扩增免疫球蛋白重和轻链可变区(VH和VL)。所有正向引物是对信号肽(分别是VH和VL的)特异性的，而反向引物是对恒定区(分别是VH和VL的)特异性的。用于RbVH+RbVL的PCR条件如下：热启动94℃5min；35个循环的20s94℃，20s 70℃，45s 68℃，和最终延伸68℃7min。用于HuVL的PCR条件如下：热启动94℃5min；40个循环的20s 94℃，20s 52℃，45s 68℃，和最终延伸68℃7min。
引物序列：
rbHC.up AAGCTTGCCACCATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTC
rbHCf.do CCATTGGTGAGGGTGCCCGAG
BcPCR_FHLC_leader.fw ATGGACATGAGGGTCCCCGC
BcPCR_huCkappa.rev GATTTCAACTGCTCATCAGATGGC
在48E凝胶2％(Invitrogen G8008-02)上加载50μl PCR溶液中的8μl。使用NucleoSpin Extract II试剂盒(Macherey&Nagel；740609250)依照制造商的方案清洁阳性PCR反应并在50μl洗脱缓冲液中洗脱。在Hamilton ML Starlet系统上实施所有清洁步骤。
实施例8：TPBG特异性Fab片段对不同物种的TPBG的结合
为了评估对不同物种的重组TPBG的结合，以用于人，食蟹猴，和迷你猪TPBG的100ng/ml的浓度和以用于小鼠和大鼠TPBG的500ng/ml的浓度用25μl/孔生物素化的相关物种(hu＝人；mu＝小鼠；rt＝大鼠；cy＝食蟹猴；mp＝迷你猪)的TPBG-AviHis包被Nuncmaxisorp链霉亲合素包被板(MicroCoat#11974998001)。将板于4℃温育过夜。清洗(3x90μl/孔，用PBST缓冲液)后，以2μg/ml开始以1:2稀释系列添加抗TPBG样品并于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔，用PBST缓冲液)后，分别以1:7000或1:4000稀释度添加25μl/孔山羊抗c-myc HRP(Bethyl，#A190-104P)或山羊抗huκHRP(Millipore，#AP502P)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔，用PBST缓冲液)后，添加25μl/孔TMB底物(Calbiochem，#CL07)并温育2分钟(对于人和迷你猪TPBG)，3分钟(对于食蟹猴TPBG)和4分钟(对于小鼠和大鼠TPBG)。测量在Safire2读数仪(Tecan)上于370/492nm发生。
为了评估对人TPBG的细胞结合，以21000个细胞/孔的浓度在384孔细胞包被聚D-赖氨酸板(Greiner，#781940)中接种内源表达TPBG的人乳腺癌症肿瘤细胞系MFC7。容许细胞于37℃附着过夜。去除上清液后，以5μg/ml开始以1:2稀释系列添加25μl/孔含有抗TPBG抗体的上清液并于4℃温育1小时。清洗(2x 50μl/孔PBST)后，通过添加50μl/孔在1xPBS缓冲液中稀释的0.05％戊二醛(Sigma，25％)来固定细胞并于室温温育10分钟。清洗(3次；90μl/孔PBS-T)后，添加25μl/孔二抗进行检测：山羊抗c-myc HRP(1:5000，Bethyl)，接着在摇床上于室温温育1小时。清洗(3次；90μl/孔PBS-T)后，添加25μl/孔TMB底物溶液(Calbiochem)。于室温10分钟后，测量在Safire2读数仪(Tecan)上于370/492nm发生。
表1：抗TPBG Fab片段对不同物种的TPBG的结合
Figure BDA0001638753030000851
发现051，091，和097的Fab片段是在人和迷你猪TPBG之间交叉反应性的。确认了对在人乳腺癌症细胞系的细胞上表达的人TPBG的细胞结合。
实施例9：经过纯化的抗体(mAb)对不同物种的TPBG的结合[与现有技术比较]
以用于大鼠，迷你猪，小鼠，食蟹猴的1μg/ml的浓度和以用于人TPBG的500ng/ml的浓度用25μl/孔Fc-TPBG包被Nunc maxisorp板(Nunc，464718)。将板于4℃温育过夜。清洗(3x 90μl/孔；PBS-T缓冲液)后，将板用90μl封闭缓冲液(含2％BSA和0.05％Tween-20的PBS)于室温封闭1小时。清洗(3x90μl/孔，PBST缓冲液)后，以1μg/ml开始以1:2稀释系列添加抗TPBG抗体并于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔，用PBST缓冲液)后，分别以1:4000稀释度或1:1000稀释度添加25μl/孔山羊抗κ抗体-POD缀合物(Millipore，AP502P)或驴抗家兔Fc抗体-POD缀合物(Amersham，NA9310V)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔，用PBST缓冲液)后，添加25μl/孔TMB底物(Roche Diagnostics GmbH，目录号11835033001)并温育5分钟。测量在Safire2读数仪(Tecan)上于370/492nm发生。
对于比较，平行评估WO 2006/031653(抗体H8，如通过WO2006/031653的SEQ IDNO：2和1中所示它的VH和VL域氨基酸序列s定义的)和WO 2007/106744A2(抗体A1，A2，A3；如通过WO 2007/106744的表2中所示它们的VH和VL域氨基酸序列定义的)中公开的现有技术抗体。
表2：抗TPBG抗体(mAb)对不同物种的TPBG的结合
Figure BDA0001638753030000861
(+)…结合，(-)…无结合，(+/-)…部分结合；
hu…人，mp…迷你猪，rt…大鼠，mo…小鼠，cy…食蟹猴
实施例10：抗体(mAb)051，091，和097与现有技术抗体A1，A2，和A3的结合竞争
以200ng/ml的浓度用25μl/孔生物素化的人TPBG-AviHis包被384孔TRSA-SAMaxisorp(MicroCoat)板，接着于4℃温育过夜。用90μl/孔PBS-T清洗3次后，以4μg/ml的浓度添加抗体A1，A2，A3，接着于室温温育1小时。将孔用90μl/孔PBS-T清洗3次。以0.1μg/ml的浓度添加抗TPBG抗体并在摇床上于室温温育1小时。用90μl/孔PBST清洗3次后，添加25μl/孔山羊抗c-myc HRP(1:6000，Bethyl)，接着在摇床上于室温温育1小时。清洗(3次；90μl/孔PBST)后，添加25μl/孔TMB底物溶液(Calbiochem)。于室温10分钟后，测量在Safire2读数仪(Tecan)上于370/492nm发生。
表3：抗TPBG抗体(mAb)051，091，和097和WO 2007/106744中公开的抗体(mAb)A1，A2，和A3之间的结合竞争
Figure BDA0001638753030000862
Figure BDA0001638753030000871
+/-＝很弱的竞争(在BiaCore测定法中确认等于或小于15％)
结果指示抗TPBG抗体051，091和097结合与所示现有技术抗体不同的TPBG上的表位。
实施例11：克隆和表达TPBG特异性Fab
重组表达家兔单克隆二价抗体
对于重组表达家兔单克隆二价抗体，通过悬垂克隆方法(RS Haun et al.,Biotechniques(1992)13,515-518；MZ Li et al.,Nature Methods(2007)4,251-256)作为cDNA将编码VH或VL的PCR产物克隆入表达载体。表达载体含有由包括内含子A的5'CMV启动子，和3'BGH聚腺苷酸化序列组成的表达盒。在表达盒以外，质粒含有pUC18衍生的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因以在大肠杆菌中扩增质粒。使用基础质粒的三种变体：含有家兔IgG恒定区的一种质粒设计成接受VH区而另外两种质粒含有家兔或人κLC恒定区以接受VL区。
通过PCR使用交叠引物扩增线性化的编码κ或γ恒定区和VL/VH插入物的表达质粒。
将经过纯化的PCR产物与生成单链悬垂的T4DNA聚合酶一起温育。通过添加dCTP来停止反应。
在下一步中，组合质粒和插入物并与诱导位点特异性重组的recA一起温育。将重组质粒转化入大肠杆菌。次日，挑取生长的菌落并通过质粒制备，限制性分析和DNA测序来测试正确的重组质粒。
对于抗体表达，将分离的HC和LC质粒瞬时共转染入HEK293细胞并在1周后收获上清液。
重组表达家兔单克隆单价抗体
对于作为单克隆单价抗体重组表达所选择的候选物，将所有VH链的家兔恒定区转变成在CH3区段中包含节突变的人恒定区。对于自家兔野生型B细胞衍生的VL链，将家兔Cκ恒定区转变成人的。用具有(在3’端)与人恒定区(分别是VH和VL的)同源的交叠序列(20bp)的对信号肽特异性的正向引物和对CDR3-J区特异性的反向引物在50μl终体积中用AccuPrime Supermix(Invitrogen 12344-040)使用4μl所选择的候选物的cDNA来扩增免疫球蛋白重和轻链可变区。用于VH和VL链扩增的PCR条件如下：热启动94℃5分钟；35个循环的20s 94℃，20s 68℃，45s 68℃，和最终延伸68℃7分钟。
通过悬垂克隆方法(RS Haun et al.,Biotechniques(1992)13,515-518；MZ Liet al.,Nature Methods(2007)4,251-256)作为cDNA将编码VH或VL的PCR产物克隆入表达载体。表达载体含有由包括内含子A的5'CMV启动子，和3'BGH聚腺苷酸化序列组成的表达盒。在表达盒以外，质粒含有pUC18衍生的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因以在大肠杆菌中扩增质粒。使用基础质粒的两种变体：含有人IgG恒定区的一种质粒设计成接受新的所扩增的VH链而第二种质粒含有人κLC恒定区以接受VL链。
通过PCR使用交叠引物扩增线性化的编码κ或γ恒定区和VL/VH插入物的表达质粒。
将经过纯化的PCR产物与生成单链悬垂的T4DNA聚合酶一起温育。通过添加dCTP来停止反应。
在下一步中，组合质粒和插入物并与诱导位点特异性重组的recA一起温育。将重组质粒转化入大肠杆菌。次日，挑取生长的菌落并通过质粒制备，限制性分析和DNA测序来测试正确的重组质粒。
生成下述多肽：
表4：用于分选酶偶联的Fab和PE的氨基酸序列
Figure BDA0001638753030000881
表5：抗TPBG抗体的依照Kabat的CDR(HC…重链，LC…轻链)
Figure BDA0001638753030000882
Figure BDA0001638753030000891
实施例12：Fab片段与截短的GGG-PE24变体(LR8M)的分选酶偶联
用分选酶经由酶促偶联生成抗TPBG抗体Fab片段和铜绿假单胞菌外毒素A链的截短变体的免疫缀合物。
使用下述多肽：
表6：用于分选酶偶联的Fab和PE的氨基酸序列(HC…重链，LC…轻链)
Figure BDA0001638753030000892
Figure BDA0001638753030000901
将经过纯化的在HEK293-F中瞬时表达的Fab片段(在C端带有LPETG-HIS6基序)和GGG-PE24LR8M(如文献中发表的自大肠杆菌提取物纯化)在20mM Tris，150mM NaCl，5mMCaCl2，pH 7.5中浓缩至7-8mg/ml。以1:1摩尔比组合两种蛋白质。通过添加带HIS标签的分选酶(0.8个摩尔当量)来开始偶联反应。于37℃温育1小时后，在Ni HiTrap柱(GEHealthcare)上层析反应混合物以去除未偶联的Fab和分选酶。偶联的Fab-PE24在流出液中洗脱并在20mM His，140mM NaCl，pH 6.0中在Superdex200凝胶过滤柱上进一步纯化。将最终的产物浓缩至1mg/ml并以等分试样于-80℃冷冻。
实施例13：表达Fab-PE和分离包涵体
经由在大肠杆菌细胞中作为重组融合蛋白表达免疫缀合物，生成抗TPBG抗体Fab片段和铜绿假单胞菌外毒素A链的截短变体的免疫缀合物。将毒素融合至抗TPBG抗体的重链的C端。
使用下述多肽：
表7：抗TPBG Fab-PE融合蛋白的氨基酸序列
Figure BDA0001638753030000902
Figure BDA0001638753030000911
应用Roche内部无抗生素表达系统(EP 0 972 838和US 6,291,245)和化学限定培养基及碱性补料上的发酵工艺(WO2012/028522)，在大肠杆菌细胞中生成可变轻链构建物(LC)和可变重链构建物(HC-PE)。在所有发酵中，产物作为包涵体位于细胞质的不溶性级分中，将其分离并溶解。然后在复性过程期间将溶解的IB材料与它的相应配偶组合以形成TPBG结合性Fab-PE融合分子。简言之，通过电穿孔用相关表达质粒转化大肠杆菌K12菌株CSPZ-25(thi-1，ΔompT，ΔpyrF，Δlon，ΔgalE)。首先让经过转化的大肠杆菌细胞在琼脂板上于37℃生长。对于每一次转化，将自这块板挑取的菌落转移至3mL滚瓶培养并于37℃生长至1-2的光密度(于578nm测量)。然后将1000μl培养物与1000μl无菌86％甘油混合并立即于-80℃冷冻进行长时间贮存。在小规模摇瓶实验中验证这些克隆的正确的产物表达并用SDS-PAGE分析。
对于预培养，对一个具有四块隔板的1000mL摇瓶接种来自科研种子库安瓿的1.0mL。在旋转摇床上于37℃和170rpm实施培养8-11小时直至获得4至8的光密度(578nm)。使用100ml预培养来接种10L生物反应器。培养24小时后，将整个培养液冷却至4-8℃并在发酵罐容器中贮存过夜。用流经离心机(13,000rpm，13l/h)经由离心收获细菌并立即在包涵体分离工艺中加工所获得的生物量或贮存于-20℃直至进一步加工。
收获细菌后直接例行开始10L发酵的包涵体制备(IBP)，在含有12.1g/l Tris，0.246g/l MgSO4*7H2O和12ml/l 25％HCl的缓冲液中重悬浮细胞团粒。缓冲液体积是依赖于生物量的干物质含量计算的。添加溶菌酶(100kU/mg)和少量的BenzonaseTM。然后将悬浮液以900巴匀浆(APV Rannie 5，通过1次)以破坏细菌细胞，接着进一步添加Benzonase并于30-37℃温育30分钟。然后添加第一清洗缓冲液(60g/l Brij，87.6g/l NaCl，22.5g/lEDTA，6ml/l 10N NaOH)并再次将悬浮液温育30分钟。后面的离心步骤(BP12，Sorvall)产生包涵体浆，在第二清洗缓冲液(12.1g/l Tris，7.4g/l EDTA，11ml/l 25％-HCl)中重悬浮并温育20分钟。贮存进一步的分离步骤产生的包涵体，冷冻于-20℃或立即转移至DSP隔室。
实施例14：复性和纯化抗TPBG Fab-PE融合蛋白
将HC-PE和LC(HC＝重链；LC＝轻链)的包涵体分开在6.7M盐酸胍，100mM Tris/HCl，5mM乙酸盐，1mM EDTA pH 8.0+100mM二硫苏糖醇(DTT)中于室温溶解2小时。将溶解的材料调节至pH 5并使用1000kDa膜微量过滤(6.7M盐酸胍，100mM Tris，1mM EDTA，5mM乙酸盐，100mM DTT pH 5.0)。针对6.7M盐酸胍，100mM Tris，10mM EDTA，5mM乙酸盐，pH 5.0渗滤以去除DTT和浓缩后，使用Biuret方法测定总蛋白质浓度。使用Bioanalyzer(AgilentTechnologies)评估HC和LC内容物的纯度。于2-10℃将溶解物在含有0.5M精氨酸，2mMEDTA，pH 10分别加1mM GSH/GSSG的复性缓冲液中以1:1摩尔比稀释。分四步将靶蛋白质浓度提高至0.5g/L，在两剂之间有2小时的温育时间。之后将复性溶液于2-10℃保持过夜。将复性物针对20mM Tris/HCl，40mM NaCl pH 7.4(TPBG-0199为pH8.0)渗滤并泵送到在20mMTris/HCl，40mM NaCl pH 7.4(TPBG-0199为pH8.0)中平衡的阴离子交换柱(AIEX)上。在用平衡缓冲液清洗柱后，用高至20mM Tris/HCl，320mM NaCl，pH 7.4(用于TPBG-0199的pH8.0)的梯度洗脱蛋白质的柱。合并含有Fab-PE的峰级分，浓缩并应用到20mM Tris，150mMNaCl，pH 7.4中的制备性大小排阻柱(SEC)上以去除聚集体，片段和大肠杆菌蛋白质。将最终的蛋白质合并液调节至所需蛋白质浓度并经由Bioanalyzer(Agilent Technologies)，分析性SEC和UV280分析，通过质谱术确认身份。
实施例15：蛋白质的MS分析和身份确认
在有和无在先还原的情况下通过电喷射离子化(ESI)质谱术验证Fab片段的氨基酸主链的正确的分子量(身份)和完整性。还原是使用TCEP(Thermo Scientific)实施的。使用等度甲酸梯度在自填G25-Sephadex-Superfine(GE Healthcare)柱上实施脱盐。在配备有nano ESI源(TriVersa NanoMate，Advion)的Q-TOF仪器(maXis，Bruker)上记录ESI质谱(+ve)。MS参数设置如下：转移：漏斗RF，400Vpp；ISCID能量，0或85eV；多极RF，400Vpp；四极：离子能量，3.0eV；低质量，850m/z；源：干气，8L/min；干气温度，160℃；碰撞室：碰撞能量，8eV；碰撞RF：3800Vpp；离子冷却器：离子冷却器RF，800Vpp；转移时间：140μs；Pre Puls贮存，20μs；扫描范围m/z 600至2000和m/z 1000至4000。使用MassAnalyzer软件(内部开发)进行数据评估。
实施例16：生成稳定的表达TPBG的CHO细胞系
用来自不同物种，即人，或迷你猪的全长TPBG稳定转染CHO-K1细胞以评估新颖的TPBG特异性抗体的细胞结合特性和效力。在补充有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基(无酚红)中培养CHO-K1细胞(ATCC)。在达到80-90％汇合后，使用Roche的XtremeGeneHP转染试剂用TPBG表达载体制备脂质/DNA复合物。预温育后，以总体积2ml选择培养基(DMEM/F12，10％胎牛血清，400μg/ml G418)将脂质/DNA复合物添加至2x105个悬浮的CHO-K1细胞。将细胞在选择压力下培养14天，然后用内部TPBG抗体染色。简言之，将2x105个细胞在冰上用2μg/ml抗TPBG一抗染色30分钟，清洗并用PE标记的抗人κ抗体复染色(1:50，在含有2％胎牛血清的PBS中，在冰上30分钟)。在FacsARIA(BD)上实施具有高或中等至低表达的克隆的单细胞分选并将单细胞沉积入96孔平底细胞培养板。12天后，将每一个物种(人，食蟹猴，迷你猪TPBG)的多个克隆转移至24孔板并再培养3天。如之前描述的用上文提到的内部参照TPBG抗体对克隆染色并在FacsCanto(BD)上分析。将所选择的克隆再培养1周并在含有7.5％DMSO的FCS中保存在液氮中。对于稳定性测试，将细胞再进一步培养2周，然后染色并在FacsCanto(BD)上分析，导致在所观察的时间段上稳定的表达TPBG的CHO细胞的最终选择。
实施例17：抗TPBG抗体对细胞表面表达的人TPBG的pH依赖性结合
评估实施例11中表达的抗TPBG Fab对人TPBG的pH依赖性结合。为此目标，选择稳定表达高水平的TPBG的SW620克隆(克隆4)作为细胞模型。使用Accutase(Sigma)使在对数生长期中生长的细胞脱离并在含有1％胎牛血清的PBS缓冲液(缓冲液A)中制备细胞悬浮液并将pH调节至pH 7.2，6.0，和5.5。将相应的Fab添加至细胞悬浮液且结合在冰上发生30分钟。随后将细胞用相同pH的缓冲液(缓冲液A)清洗两次。然后将细胞在含有2％胎牛血清的PBS，pH 7.4(缓冲液B)中重悬浮并添加与PE(藻红蛋白)联偶的抗κ小鼠抗人单克隆二抗(Life Technologies)，在冰上30分钟。再次然后将细胞用缓冲液B清洗两次并最终在onetime CellFix缓冲液(BD)中重悬浮。为了区分活的与死的细胞，应用Hoechst 33258染料。在FACS Canto II(BD)上检测信号。用FACS Diva软件和Microsoft Excel进行数据评估。在生物学复制品中进行实验。
虽然所应用的pH范围并不密切反映生理值，但是使用它来使用最大的窗口评估不同Fab的pH依赖性结合。根据分析显而易见的是Fab(H8)现有技术抗体展示比本发明的抗体高得多的pH依赖性结合(图2)。这会指示与本发明的抗体相比Fab(H8)的结合很可能具有高得多的氢键贡献。在生物学复制品中，比较pH 5.5和pH 7.2，自该均值荧光强度(MFI)计算的这个因数介于4.2和6.8之间，而它对于本发明的Fab在0.9-1.2的范围中(表8)。
表8：抗TPBG Fab在不同pH值结合细胞表面TPBG的比较
Figure BDA0001638753030000941
Figure BDA0001638753030000951
实施例18：抗TPBG抗体(Fab片段)在表达人TPBG的MCF7细胞中的内在化
在MCF7细胞中评估实施例11中表达的TPBG特异性Fab在靶物结合后的内在化。
使用Accutase(Sigma)使对数生长期中的细胞脱离。将2.5x10e5个细胞每份样品在冰冷的缓冲液(含有2％胎牛血清的PBS)和10μg/mL相应Fab中重悬浮并在冰上保持15分钟。于4℃将细胞以300g 5分钟旋转下来并用150μL冰冷的缓冲液清洗两次。将细胞在100μL缓冲液中重悬浮并于37℃温育30，60或180分钟。将用于时间点零的样品保持在冰上。将用于37℃的时间过程的板在添加样品之前预温热。将细胞在50μL冰冷的含有10μg/mL抗κ轻链RE-PE(藻红蛋白)标记的二抗(Life Technologies)的缓冲液中重悬浮。将悬浮液在冰上温育45分钟。然后如描述的那样将细胞清洗两次并在200μL冰冷的固定缓冲液(BD CellFix)中重悬浮。在FACSCanto II(BD)上测量样品。使用FlowJo软件进行数据加工。用Excel(Microsoft)和XLfit 5.3.1(IDBS)附加项实施数据分析。通过相应的同种型对照的均值荧光强度(MFI)修正每一份Fab样品的几何均值荧光信号。每一个时间点的MFI相对于时间点零设置并作为百分比值计算。内在化的百分比通过自100％减去检测到的抗体的百分比来计算。
所有Fab确实在给定时间框内内在化(图3)。
表9：抗TPBG抗体(Fab片段)在表达人TPBG的MCF7细胞中的内在化
Figure BDA0001638753030000952
实施例19：抗TPBG抗体(Fab片段)对表达迷你猪TPBG的CHO细胞的细胞结合
使用经稳定转染的CHO细胞(实施例16)和基于流式细胞术的测定法评估实施例11中表达的TPBG特异性Fab对细胞表面表达的迷你猪TPBG的结合。
使用表达相似范围中的细胞表面水平的TPBG的稳定转染子进行基于流式细胞术的细胞结合分析。跨越0.01-20μg/ml的浓度范围制备抗体的稀释系列。简言之，在冰冷的含有2％胎牛血清(PAN Biotech)的PBS(Gibco)中制备细胞悬浮液。在v形96孔MTP中每个孔分配2.5x10e5个细胞。作为2倍浓缩溶液添加在相同缓冲液中制备的抗体稀释系列。将样品在冰上温育45分钟，之后将它们用150μL冰冷的含有2％胎牛血清的PBS清洗两次。在中间，于4℃将细胞以300g 5分钟旋转下来。将细胞在50μL冰冷的含有10μg/mL抗κ轻链RE-PE(藻红蛋白)标记的二抗(Life Technologies)的缓冲液中重悬浮。将悬浮液在冰上温育45分钟。如描述的那样将细胞清洗两次并在50μL冰冷的含有1μg/mL Hoechst 33258的缓冲液中重悬浮。10分钟后，将细胞再清洗一次并最终在200μL冰冷的固定缓冲液(BD CellFix)中重悬浮。在FACSCanto II(BD)上测量样品。使用FlowJo软件进行数据加工。用Excel(Microsoft)和XLfit 5.3.1(IDBS)附加项实施数据分析。
本发明的抗体051，091和097以相似的程度结合细胞表面表达的TPBG，而现有技术抗体H8并不以足够的程度结合细胞表面表达的TPBG(图4A)。
实施例20：包含抗TPBG抗体(Fab-PE片段)的免疫缀合物对表达人和迷你猪TPBG的CHO细胞的细胞结合
使用经相应的全长抗原稳定转染的CHO-K1细胞评估TPBG特异性抗体对人(hu)或迷你猪(pg)TPBG任一的结合(实施例16)。使用表达相似范围中的细胞表面水平的TPBG的稳定转染子进行基于流式细胞术的细胞结合分析。跨越400-0.002nM的浓度范围制备Fab-PE(实施例13和14中表达的抗TPBG Fab-PE融合蛋白)的稀释系列。简言之，在冰冷的含有2％胎牛血清(PAN Biotech)的PBS(Gibco)中制备细胞悬浮液。在v形96孔MTP中每个孔分配2.5x10e5个细胞。作为2倍浓缩溶液添加在相同缓冲液中制备的Fab-PE稀释系列。将样品在冰上温育45分钟，之后将它们用150μL冰冷的含有2％胎牛血清的PBS清洗两次。在中间，于4℃将细胞以300g 5分钟旋转下来。将细胞在50μL冰冷的含有10μg/mL抗κ轻链RE-PE(藻红蛋白)标记的二抗(Life Technologies)的缓冲液中重悬浮。将悬浮液在冰上温育45分钟。如描述的那样将细胞清洗两次并在50μL冰冷的含有1μg/mL Hoechst 33258的缓冲液中重悬浮。10分钟后，将细胞再清洗一次并最终在200μL冰冷的固定缓冲液(BD CellFix)中重悬浮。在FACSCanto II(BD)上测量样品。使用FlowJo软件进行数据加工。用Excel(Microsoft)和XLfit 5.3.1(IDBS)附加项实施数据分析。
所有Fab-PE以相似的程度结合表达人TPBG的CHO-K1，EC50有至多2倍差异(图4B)。
只发现包含本发明的抗体051，091和097的Fab-PE结合细胞表面表达的迷你猪TPBG，而包含现有技术抗体H8的Fab-PE并不结合细胞表面表达的迷你猪TPB(图4C)。
表10：对人和迷你猪TPBG的细胞结合
Figure BDA0001638753030000971
实施例21：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(经由分选酶偶联与PE片段偶联的Fab)对表达人和迷你猪TPBG的CHO细胞的细胞毒性
建立一种替代测定法来评估Fab-PE构建物(实施例12中提供的经由分选酶偶联与PE片段偶联的Fab)对表达人(hu)或迷你猪(pg)TPBG的细胞的效力。为此目标，用来自相应物种的全长TPBG瞬时转染CHO-K1细胞。另外，共转染萤光素酶报告物质粒。在用测试化合物处理后，通过测量萤光素酶活性来测定效力。
使用3:1比率的Lipofectamine 3000和3μg总DNA每1x10e6个细胞在悬浮液中以2:1的比率用含有TPBG和萤光素酶的质粒瞬时转染CHO-K1细胞。然后在100μL含有10％胎牛血清(PAN Biotech)的培养基(Gibco)中在98孔MTP中每个孔接种30,000个细胞。容许细胞在添加化合物之前附着21小时。跨越15至0.0003nM的浓度范围在培养基中制备Fab-PE的稀释系列。一式三份测量个别的数据点。添加化合物后24小时，作为细胞蛋白质合成能力的替代标志物，使用Steady Glo(Promega)量化萤光素酶报告物活性。在微量板读数仪(Tecan)中记录发光。用Excel(Microsoft)和XLfit 5.3.1(IDBS)附加项实施数据分析。作为生物学复制品实施实验。
所有包含本发明的抗体(即抗体051，091，和097)的免疫缀合物以及包含现有技术抗体H8的免疫缀合物展示有力且相似的对表达人TPBG的细胞的活性(图5A)。另一方面，本发明的抗体对表达迷你猪TPBG的CHO细胞的活性明显更好，而现有技术抗体H8展示低得多的活性(图5B)。值得注意的是阴性对照，即一种并不结合细胞表面靶物的免疫缀合物，也展示介于1-10nM之间的效力。这是由于瞬时转染规程对细胞施加另外的压力。为此原因，生成稳定表达相应TPBG抗原的CHO-K1克隆(参见实施例16和21)。
实施例22：由抗TPBG抗体(受到抗κ链抗体-PE融合蛋白结合的抗TPBG Fab抗体)介导的对表达人和迷你猪TPBG的CHO细胞的细胞毒性
为了评估抗TPBG Fab片段用于载荷投递的合适性，实施一种替代测定法。在这种测定法中，TPBG特异性Fab与结合TPBG特异性Fab的κ轻链的Fab(二抗)一起以1:3摩尔比在添加至细胞之前共温育30分钟。κ结合性Fab另外携带假单胞菌外毒素(PE)模块。将如此形成的复合物添加至稳定表达人或迷你猪TPBG任一的CHO-K1细胞。用来自相应物种的全长TPBG稳定转染CHO-K1细胞(实施例16)。选择并扩充单克隆。选择在相似范围中表达细胞表面TPBG的克隆进行后续增殖测定法。在选择压力下维持克隆的同时，在无选择压力的培养基中实施实际的增殖测定法。
在100μL含有10％胎牛血清(PAN Biotech)的培养基(Gibco)中在98孔MTP中每个孔接种10,000个细胞。容许细胞在添加化合物之前附着24小时。跨越133至0.002nM的浓度范围在培养基中制备Fab-PE夹心构建物的稀释系列。一式三份测量个别的数据点。添加化合物后72小时，实施CellTiterGlo(Promega)测定法。在微量板读数仪(Tecan)中记录发光。用Excel(Microsoft)和XLfit 5.3.1(IDBS)附加项实施数据分析。作为生物学复制品实施实验。
在经人TPBG稳定转染的CHO-K1上，所有候选物显示一定程度的效力。
自抗体A1，A2，和A3衍生的Fab并不对经迷你猪TPBG稳定转染的CHO-K1展示显著效力。还有，自抗体H8衍生的Fab片段在这种测定法中展示显著更低的效力且具有比对表达人TPBG的细胞低约100倍的对表达迷你猪的细胞的效力(图6A-D)。
表11：抗TPBG Fab-PE夹心构建物对表达人和迷你猪TPBG的CHO细胞的细胞毒性活性(EC50，以[nM]计)
Figure BDA0001638753030000991
实施例23：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(抗TPBG Fab-PE融合蛋白)对表达人和迷你猪TPBG的CHO细胞的细胞毒性
建立一种替代测定法来评估Fab-PE构建物(实施例13和14中表达的抗TPBG Fab-PE融合蛋白)对表达人(hu)或迷你猪(pg)TPBG的细胞的效力。为此目标，用来自相应物种的全长TPBG稳定转染CHO-K1细胞。选择并扩充单克隆。选择在相似范围中表达细胞表面TPBG的克隆进行后续的增殖测定法。在选择压力下维持克隆的同时，在无选择压力的培养基中实施实际的增殖测定法。
在100μL含有10％胎牛血清(PAN Biotech)的培养基(Gibco)中在98孔MTP中每个孔接种10,000个细胞。容许细胞在添加化合物之前附着24小时。跨越133至0.002nM的浓度范围在培养基中制备Fab-PE的稀释系列。一式三份测量个别的数据点。添加化合物后72小时，实施CellTiterGlo(Promega)测定法。在微量板读数仪(Tecan)中记录发光。用Excel(Microsoft)和XLfit 5.3.1(IDBS)附加项实施数据分析。作为生物学复制品实施实验。
所有包含本发明的抗体(即抗体051，091，和097)的免疫缀合物对表达人或迷你猪TPBG任一的细胞展示有力的活性。一种并不结合经转染的CHO-K1细胞的非特异性Fab-PE在所测量的浓度范围中没有活性(图7A)。
为了比较，使用现有技术抗体H8的Fab-PE型式。对于这种免疫缀合物，只观察到较低的对表达迷你猪TPBG的细胞的细胞毒性活性。在亲本CHO-K1上，无一Fab-PE展示活性(图7C)。
表12：抗TPBG Fab-PE融合蛋白对稳定表达人或迷你猪TPBG任一的CHO细胞的细胞毒性活性(EC50，以[nM]计)
Figure BDA0001638753030001001
实施例24：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(抗TPBG Fab-PE融合蛋白)对表达人TPBG的MCF7细胞的细胞结合
使用乳腺癌症肿瘤细胞系MCF7研究实施例13和14中提供的抗TPBG Fab-PE融合蛋白以及实施例12中提供的经由分选酶偶联与PE片段偶联的Fab对人肿瘤细胞的结合。使用Accutase(Sigma)使在对数生长期中生长的细胞脱离。简言之，在冰冷的含有2％胎牛血清(PAN Biotech)的PBS(Gibco)中制备细胞悬浮液。
在v形96孔MTP中每个孔分配2.5x10e5个细胞。作为2倍浓缩溶液添加在相同缓冲液中制备的范围为133-0.001nM的Fab-PE稀释系列。将样品在冰上温育45分钟，之后将它们用150μL冰冷的含有2％胎牛血清的PBS清洗两次。在中间，于4℃将细胞以300g 5分钟旋转下来。将细胞在50μL冰冷的含有10μg/mL抗κ轻链RE-PE(藻红蛋白)标记的二抗(LifeTechnologies)的缓冲液中重悬浮。将悬浮液在冰上温育45分钟。如描述的那样将细胞清洗两次并在50μL冰冷的含有1μg/mL Hoechst 33258的缓冲液中重悬浮。10分钟后，将细胞清洗一次并最终在200μL冰冷的固定缓冲液(BD CellFix)中重悬浮。在FACSCanto II(BD)上测量样品。使用FlowJo软件进行数据加工。用Excel(Microsoft)和XLfit 5.3.1(IDBS)附加项实施数据分析。
所有抗TPBG Fab-PE融合蛋白均在它们对人乳腺肿瘤细胞系MCF7的结合中展示低nM或亚nM的EC50值(图8)。
表13：抗TPBG Fab-PE融合蛋白对表达人TPBG的MCF7细胞的细胞结合(EC50，以[nM]计)
Figure BDA0001638753030001011
实施例25：由抗TPBG抗体(受到抗κ链抗体-PE融合蛋白结合的抗TPBG Fab抗体)介导的对表达人TPBG的MCF7细胞的细胞毒性
适合于投递载荷(特定假单胞菌外毒素)的抗体或抗体片段的理想特性没有好好定义。理论上，可以假设每一种内在化的抗体均会满足这个目的。
为了评估本发明的抗TPBG抗体用于载荷投递的合适性，实施一种替代测定法。在这种测定法中，TPBG特异性Fab与结合TPBG特异性Fab的κ轻链的Fab(二抗)一起以1:3摩尔比在添加至细胞之前共温育30分钟。κ结合性Fab另外携带假单胞菌外毒素(PE)模块。将如此形成的复合物(“Fab-PE夹心构建物”)添加至人MCF7乳腺癌症细胞。
简言之，在100μL含有10％胎牛血清(PAN Biotech)的培养基(Gibco)中在98孔MTP中每个孔接种20,000个细胞。容许细胞在添加化合物之前附着24小时。跨越133至0.002nM的浓度范围在培养基中制备稀释系列，如为相应TPBG特异性Fab计算的。一式三份测量个别的数据点。添加化合物后72小时，实施CellTiter-Glo(Promega)测定法。在微量板读数仪(Tecan)中记录发光。用Excel(Microsoft)和XLfit 5.3.1(IDBS)附加项实施数据分析。作为生物学复制品实施实验。
由TPBG特异性Fab和抗κ-Fab-PE组成的复合物对MCF7细胞引发强细胞毒性应答(图9)。所有Fab-PE夹心构建物均展示低nM至亚nM的活性，而一种与抗κ-Fab-PE一起共温育的无关Fab在这个剂量范围中没有毒性。所有包含本发明的抗体051，091和097的Fab-PE夹心构建物均比包含现有技术抗体H8的Fab-PE夹心构建物略微更有效力地在MCF7细胞中诱导细胞毒性。
这一观察结果能在一项独立实验中再现，如(表14)最后一条柱关于计算效力差异中显示的。此测定法设置中对生物学复制品获得的绝对nM值相差约2-3倍。因此，所有生成的值均参照包含H8的构建物。
表14：抗TPBG Fab-PE夹心构建物对表达人TPBG的MCF7细胞的细胞毒性活性(EC50，以[nM]计)
Figure BDA0001638753030001021
作为另一项比较实验，在上文概述的测定法中就它们用于载荷投递的合适性而言评估别的现有技术抗体A1，A2和A3(US8044178)，并参照现有技术抗体H8进行比较。
在表面等离振子共振和细胞结合实验中确认了抗体A1，A2和A3的功能性(数据未显示)。为了评估这些自抗体A1，A2和A3衍生的Fab用于载荷投递的合适性，实施一种替代测定法。在这种测定法中，TPBG特异性Fab与结合TPBG特异性Fab的κ轻链的Fab(二抗)一起以1:3摩尔比在添加至细胞之前共温育30分钟。κ结合性Fab另外携带假单胞菌外毒素(PE)模块。将如此形成的复合物添加至人MCF7乳腺癌症细胞。简言之，在100μL含有10％胎牛血清(PAN Biotech)的培养基(Gibco)中在98孔MTP中每个孔接种20,000个细胞。跨越133至0.002nM的浓度范围在培养基中制备稀释系列，如为相应TPBG特异性Fab计算的。一式三份测量个别的数据点。添加化合物后72小时，实施CellTiter-Glo(Promega)测定法。在微量板读数仪(Tecan)中记录发光。用Excel(Microsoft)和XLfit 5.3.1(IDBS)附加项实施数据分析。作为生物学复制品实施实验。
与在这些实验中对MCF7具有1.85nM的效力的现有技术抗体H8的Fab片段相比，自抗体A1，A2和A3衍生的Fab展现显著更低的效力(图10)。
表15：抗TPBG Fab-PE夹心构建物对表达人TPBG的MCF7细胞的细胞毒性活性(EC50，以[nM]计)
Figure BDA0001638753030001022
Figure BDA0001638753030001031
实施例26：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(经由分选酶偶联与PE片段偶联的Fab)对表达人TPBG的MCF7细胞的细胞毒性
为了评估Fab-PE构建物(实施例12中提供的经由分选酶偶联与PE片段偶联的Fab)对肿瘤细胞系的效力，选择乳腺癌症细胞系MCF7。在100μL含有10％胎牛血清(PANBiotech)的培养基(Gibco)中在98孔MTP中每个孔接种20,000个细胞。容许细胞在添加化合物之前附着24小时。跨越133至0.002nM的浓度范围在培养基中制备分选酶偶联的Fab-PE的稀释系列。一式三份测量个别的数据点。添加化合物后72小时，实施CellTiter-Glo(Promega)测定法。在微量板读数仪(Tecan)中记录发光。用Excel(Microsoft)和XLfit5.3.1(IDBS)附加项实施数据分析。作为生物学复制品实施实验。
所有所评估的分选酶偶联的Fab-PE构建物均对MCF7细胞展示有力的亚nM活性(图11)。一种并不结合细胞表面的非特异性Fab-PE在这种测定法中没有活性。对于分选酶偶联的包含本发明的抗体051，091和097的Fab-PE构建物，观察到与包含现有技术抗体H8的类似构建物相比相似至略微更高的活性(表16)。
表16：分选酶偶联的抗TPBG Fab-PE构建物对表达人TPBG的MCF7细胞的细胞毒性活性(EC50，以[nM]计)
Figure BDA0001638753030001032
实施例27：由抗TPBG抗体(受到抗κ链抗体-PE融合蛋白结合的抗TPBG Fab抗体)介导的对表达人TPBG的H1975非小细胞肺癌症细胞的细胞毒性
为了评估Fab用于将载荷投递至非小细胞肺癌症细胞的合适性，实施一种替代测定法。
在这种测定法中，如实施例11中所述表达的TPBG特异性Fab与结合TPBG特异性Fab的κ轻链的Fab(二抗)一起以1:3摩尔比在添加至细胞之前共温育30分钟。κ结合性Fab另外携带假单胞菌外毒素(PE)模块。将如此形成的复合物添加至人H1975肺癌症细胞。简言之，在100μL含有10％胎牛血清(PAN Biotech)和青霉素/链霉素(Gibco)的培养基(Gibco)中在98孔MTP中每个孔接种10,000个细胞。容许细胞在添加化合物之前附着24小时。跨越133至0.002nM的浓度范围在培养基中制备稀释系列，如为相应TPBG特异性Fab计算的。一式三份测量个别的数据点。添加化合物后72小时，实施CellTiter-Glo(Promega)测定法。在微量板读数仪(Tecan)中记录发光。用Excel(Microsoft)和XLfit 5.3.1(IDBS)附加项实施数据分析。作为生物学复制品实施实验。
包含现有技术抗体H8的Fab片段，以及本发明的抗体051，091，和097的夹心构建物以亚nM范围中的EC50引发强细胞毒性应答。在三份生物学复制品中，本发明的抗体091的Fab片段一致地表现为最好的候选物(表17)。
包含现有技术抗体A1，A2和A3的Fab片段的夹心构建物展示与其它所测试的构建物相比没有(对于A1和A2)或显著更低的细胞毒性(图12)。
表17：由抗TPBG Fab-PE夹心构建物介导的对表达人TPBG的H1975细胞的细胞毒性活性(EC50，以[nM]计)
Figure BDA0001638753030001041
实施例28：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(抗TPBG Fab-PE融合蛋白)对表达人TPBG的H1975非小细胞肺癌症细胞的细胞毒性
为了评估实施例13和14中表达的抗TPBG Fab-PE融合蛋白对肿瘤细胞系的效力，选择非小细胞肺癌症细胞系H1975。细胞表面TPBG分子的数目是大约30.000个/细胞，如通过基于流式细胞术的受体量化测定的。在100μL含有10％胎牛血清(PAN Biotech)的培养基(Gibco)中在98孔MTP中每个孔接种10,000个细胞。容许细胞在添加化合物之前附着24小时。跨越3至0.00005nM的浓度范围在培养基中制备Fab-PE的稀释系列。一式三份测量个别的数据点。添加化合物后72小时，实施CellTiter-Glo(Promega)测定法。在微量板读数仪(Tecan)中记录发光。用Excel(Microsoft)和XLfit 5.3.1(IDBS)附加项实施数据分析。作为生物学复制品实施实验。
所有抗TPBG Fab-PE构建物的效力均是剂量依赖性的(图13)。一种并不结合H1975的非特异性Fab-PE在所测量的剂量范围中并不显示显著的活性。所有所测试的抗TPBGFab-PE均展示亚nM效力。包含本发明的抗体091的Fab-PE融合蛋白在这种细胞系中一致地比自现有技术抗体H8衍生的融合蛋白效力高约3-4倍(表18)。
表18：由抗TPBG Fab-PE融合蛋白介导的对表达人TPBG的H1975细胞的细胞毒性活性(EC50，以[nM]计)
Figure BDA0001638753030001051
实施例29：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(抗TPBG Fab-PE融合蛋白)应用于表达人TPBG的H1975非小细胞肺癌症细胞的时间过程增殖测定法
在一种不同的实验设置中，改变实施例13和14中表达的抗TPBG Fab-PE融合蛋白对肿瘤细胞的暴露时间。使用非小细胞肺癌症细胞系H1975来评估更短的Fab-PE构建物温育时间是否对增殖测定法中的效力具有影响。
在100μL含有10％胎牛血清(PAN Biotech)的培养基(Gibco)中在98孔MTP中每个孔接种10,000个细胞。容许细胞在添加化合物之前附着24小时。跨越3至0.00005nM的浓度范围在培养基中制备Fab-PE的稀释系列。温育10，30和60分钟后，用新鲜的无Fab-PE的培养基替换培养基并将细胞进一步维持总共72小时。另外，培养持续暴露于Fab-PE的细胞。一式三份测量个别的数据点。添加化合物后72小时，实施CellTiterGlo(Promega)测定法。在微量板读数仪(Tecan)中记录发光。用Excel(Microsoft)和XLfit 5.3.1(IDBS)附加项实施数据分析。
所有所测试的Fab-PE融合蛋白对这种人肿瘤细胞系展示有力的亚nM效力(图14A-D)。更短的Fab-PE融合蛋白温育时段导致效力略微降低。包含本发明的抗体091的Fab片段的抗TPBG Fab-PE融合蛋白比其它所测试的分子更加有力，与实施例30的观察结果一致(表19和20)。
表19：与抗TPBG Fab-PE融合蛋白接触的表达人TPBG的H1975细胞的时间过程增殖实验(EC50，以[nM]计)
Figure BDA0001638753030001061
表20：与抗TPBG Fab-PE融合蛋白接触的表达人TPBG的H1975细胞的时间过程增殖实验(效力与现有技术抗体H8的抗TPBG Fab-PE融合蛋白相比高的倍数)
Figure BDA0001638753030001062
实施例30：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(抗TPBG Fab-PE融合蛋白)对表达人TPBG的人非小细胞肺癌H1975细胞异种移植物的体内抗肿瘤功效
在基于人肿瘤细胞系的接受移植裸鼠模型中监测实施例13和14中表达的抗TPBGFab-PE融合蛋白的体内抗肿瘤功效。选择非小细胞肺癌(NSCLC)NCI-H1975细胞系作为异种移植物模型。独立确认了NCI-H1975展示细胞表面TPBG。
在补充有10％胎牛血清，2.0mM L-谷氨酰胺，和10mM HEPES的含1.0mM丙酮酸钠的RPMI高葡萄糖培养基中于37℃在5％CO2的水饱和气氛中培养NCI-H1975。每3天用胰蛋白酶/EDTA(Life Technologies)拆分实施培养物传代。自饲养者(例如Charles River，Sulzfeld，Germany)购买裸鼠并依照承诺的指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小时光照/12小时黑暗的日周期在无特定病原体条件下维持。实验研究方案得到当地政府的审查和批准。到达后，将动物在动物设备的检疫部分中维持1周以适应新环境和进行观察。定期进行连续健康监测。随意提供食物(Provimi Kliba 3337)和水(酸化的pH 2.5-3)。每天对动物掌握临床症状和不良反应检测。对于贯穿实验的监测，记录动物的体重。
在细胞移植后当均值肿瘤大小为约100-200mm3时在动物随机化之后开始动物处理。作为单一药剂以1mg/kg静脉内施用Fab-PE融合蛋白，一天一次，隔天，进行数次。在相同的日子施用相应媒介。作为来自Roche，Penzberg，Germany的储备溶液提供Fab-PE融合蛋白。缓冲液包括组氨酸且注射溶液在注射前在缓冲液中自储液恰当稀释。
研究第17至44天以1.0mg/kg的剂量用Fab-PE融合蛋白处理携带NCI-H1975NSCLC异种移植物的小鼠，总共8次(第17，19，21，24，26，28，42和44天)。每一个处理组由10只动物组成。结果是，用包含本发明的抗体的Fab-PE融合蛋白处理显示显著的抗肿瘤功效，皮下NCI-H1975异种移植物有较强的肿瘤消退。值得注意的是，实现了大多数完全肿瘤免除(remission)。
本发明的免疫缀合物的强功效在统计学上不同于包含现有技术抗体H8的免疫缀合物(图15)。
实施例31：包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(抗TPBG Fab-PE融合蛋白)对表达人TPBG的人胃癌NCI-N87细胞异种移植物的体内抗肿瘤功效
在基于人肿瘤细胞系的接受移植裸鼠模型中监测实施例13和14中表达的抗TPBGFab-PE融合蛋白的体内抗肿瘤功效。选择胃癌NCI-N87细胞系作为异种移植物模型。独立确认了NCI-N87展示细胞表面TPBG。
在补充有10％胎牛血清，2.0mM L-谷氨酰胺，和10mM HEPES的含1.0mM丙酮酸钠的RPMI高葡萄糖培养基中于37℃在5％CO2的水饱和气氛中培养NCI-N87。每3天用胰蛋白酶/EDTA(Life Technologies)拆分实施培养物传代。自饲养者(例如Charles River，Sulzfeld，Germany)购买裸鼠并依照承诺的指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小时光照/12小时黑暗的日周期在无特定病原体条件下维持。实验研究方案得到当地政府的审查和批准。到达后，将动物在动物设备的检疫部分中维持1周以适应新环境和进行观察。定期进行连续健康监测。随意提供食物(Provimi Kliba 3337)和水(酸化的pH 2.5-3)。每天对动物掌握临床症状和不良反应检测。对于贯穿实验的监测，记录动物的体重。
在细胞移植后当均值肿瘤大小为约100-200mm3时在动物随机化之后开始动物处理。作为单一药剂以1mg/kg静脉内施用Fab-PE融合蛋白，一天一次，隔天，进行数次。在相同的日子施用相应媒介。作为来自Roche，Penzberg，Germany的储备溶液提供Fab-PE蛋白。缓冲液包括组氨酸且注射溶液在注射前在缓冲液中自储液恰当稀释。
研究第15至33天以1.0mg/kg的剂量用Fab-PE融合蛋白处理NCI-N87胃癌异种移植物模型肿瘤小鼠，总共7次(第15，17，19，22，24，26和33天)。每一个处理组由10只动物组成。结果是，用Fab-PE融合蛋白以及参照(H8抗体)处理显示抗肿瘤功效，皮下N87异种移植物有明显的肿瘤消退(图16)。
实施例32：使用与包含抗TPBG抗体的免疫缀合物(抗TPBG Fab-PE融合蛋白)接触的BxPC3/luc细胞的蛋白质合成测定法
通过将BxPC/luc细胞暴露于实施例13和14中表达的抗TPBG Fab-PE融合蛋白来测量对蛋白质合成的抑制。
简言之，用编码萤光素酶(其含有细胞降解信号(Promega)和具有约0.4小时的半衰期)的质粒稳定转染BxPC3细胞。衍生单克隆并重评估稳定的质粒掺入。由假单胞菌外毒素赋予的ADP-核糖基化对蛋白质合成的抑制导致萤光素酶的快速损失且因而可以在细胞裂解和与萤光素一起温育后作为与对照相比的信号损失来测量。
用Accutase(Sigma)使对数生长期中的BxPC3/luc脱离并计数。在100μL含有10％胎牛血清的培养基中在98孔MTP中每个孔接种40,000个BxPC3/luc细胞并在添加化合物之前温育24小时。以3-0.0001nM的浓度范围添加TPBG特异性免疫缀合物。一式三份测量所有样品。
一种非特异性免疫缀合物对萤光素酶信号(ct)没有影响。所有TPBG特异性免疫缀合物均展示亚nM效力。本发明的抗体展示比现有技术抗体H8要高的效力(图17A和表21)。
表21：由抗TPBG Fab-PE融合蛋白介导的对表达人TPBG的BxPC-3细胞的细胞毒性活性(EC50，以[nM]计)
Figure BDA0001638753030001091
另外，在BxPC3/luc中测定由抗体A1，A2，A3和H8构成的抗TPBG Fab-PE夹心构建物对蛋白质合成的抑制。将TPBG特异性Fab与抗人κFab-PE(假单胞菌外毒素)以1:3摩尔比混合并于室温保持15分钟以容许夹心构建物形成。在培养基中制备混合物的稀释系列。最终作用于细胞的浓度范围为133nM至0.002nM，如为TPBG特异性Fab计算的。添加后24小时，实施Steady-Glo萤光素酶测定法(Promega)。一式三份测量所有样品。比较与抗人κFab-PE共温育的Fab揭示A1和A2在给定浓度范围中并不展示活性，而A3展现比H8低约5倍的效力(图17B)。
实施例33：抗TPBG Fab片段对人TPBG的亲和力
通过BiacoreTM评估本发明的抗体051，091，和097的Fab片段(如实施例11中表达的)对人TPBG的亲和力。作为对照评估现有技术抗体H8的Fab片段。
如下评估对人TPBG的亲和力：
将CM5传感器芯片放置入Biacore T200系统。通过空白固定化，作为参照流动室准备流动室1。在流动室2上，固定化约500RU的pH 4.5乙酸盐缓冲液中的1.5μg/ml huTPBG(120s，10μl/min)。如制造商描述的那样进行胺偶联。
将样品以50μl/min的流速以浓度系列4.9nM，14.8nM，44.4nM，133.3nM，400nM和0nM注射150秒，接着是660秒的解离期。
每一次样品注射后通过一个甘氨酸-HCl pH 1.5以30μl/min的40秒脉冲和一次含有0.31M KSCN，1.22M MgCl2，0.61M脲，1.22M Gua-HCl和6.7mM EDTA的再生溶液以30μ/min的40秒长注射，接着是注射后的额外缓冲液清洗来再生样品-抗原复合物。
使用Biacore T200评估软件计算有关动力学数据。
表22：抗TPBG Fab片段对人TPBG的亲和常数
样品 k<sub>a</sub>(1/Ms) k<sub>d</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
051 4.89E+05 7.83E-05 1.60E-10
091 4.87E+05 2.72E-05 5.58E-11
097 9.93E+05 8.14E-04 8.20E-10
H8 1.37E+05 2.17E-07 1.58E-12
实施例34：抗TPBG Fab片段对迷你猪TPBG的亲和力
通过BiacoreTM评估本发明的抗体051，091，和097的Fab片段(如实施例11中表达的)对迷你猪TPBG的亲和力。作为对照评估现有技术抗体H8的Fab片段。
如下评估对人TPBG的亲和力：
将CM5传感器芯片放置入Biacore T200系统。通过空白固定化，作为参照流动室准备流动室1。以1200秒的注射时间，20μg/ml的浓度(在缓冲液中稀释，也在捕捉试剂盒#28958325，GE-HC中提供)和5μl/min的流速经由胺偶联将<huFab>捕捉抗体(#28958325，GE-HC)固定化到流动室2，3和4上。
以60秒的注射时间和20μl/min的流速在流动室2，3和4上连续捕捉样品，接着是迷你猪TPBG稀释系列中的一个稀释度(4.9nM，14.8nM，44.4nM，133.3nM，400nM和2x 0nM)的120秒长注射。660秒的解离期(14.8nM，4.9nM和一次0nM稀释度除外，它们的解离时间设为0秒)后，依照制造商的用法说明书用Fab捕捉试剂盒中提供的再生溶液再生<huFab>表面并进行下一个循环。
使用Biacore T200评估软件计算有关动力学数据。数据指示抗体H8对重组迷你猪TPBG胞外域没有稳定结合(图19和表23)。
表23：抗TPBG Fab片段对迷你猪TPBG的亲和常数
Figure BDA0001638753030001101
Figure BDA0001638753030001111
实施例35：抗TPBG抗体对人TPBG抗原的pH依赖性结合
将CM5传感器芯片放置入Biacore T200系统。通过空白固定化，作为参照流动室准备流动室1。在流动室2上，80RU是pH 4.5乙酸盐缓冲液中的1.5μg/ml huTPBG的固定化的目标。如制造商描述的那样进行胺偶联。
在测定法的一个实施方案中，使用HBS-EP+pH 5.5作为运行和样品缓冲液，在第二个实施方案中使用HBS-EP+pH 7.4。
将样品以1.9nM，5.6nM，2x 16.7nM，50nM，150nM和2x 0nM的浓度系列以50μl/min的流速注射300秒。容许50nM，一次0nM和一次16.7nM样品解离1200秒，所有其它解离期的长度只有10秒。
每一次样品注射后通过一个甘氨酸-HCl pH 1.5以30μl/min的40秒脉冲和一次含有0.31M KSCN，1.22M MgCl2，0.61M脲，1.22M Gua-HCl和6.7mM EDTA的再生溶液以30μ/min的40秒长注射，接着是注射后的额外缓冲液清洗来再生样品-抗原复合物。
使用Biacore T200评估软件计算有关动力学数据。
Fab-PE融合蛋白的实验结果清楚地指示现有技术抗体H8以pH依赖性方式结合。7.4至5.5的pH移变导致KD显著降低，而本发明的抗体051，091，和097的huTPBG结合很大程度不受影响。这也可以在结合-解离图中显现，其突显现有技术抗体H8的pH依赖性结合(图18)。
表24：抗TPBG Fab-PE融合蛋白在不同pH值对人TPBG的亲和常数
Figure BDA0001638753030001112
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 抗TPBG抗体及使用方法
<130> P33180-WO
<150> EP 15192002.2
<151> 2015-10-29
<160> 91
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 389
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 1
Ser Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Phe Ser Ser Ser Ala Pro Phe
1 5 10 15
Leu Ala Ser Ala Val Ser Ala Gln Pro Pro Leu Pro Asp Gln Cys Pro
20 25 30
Ala Leu Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn
35 40 45
Arg Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu Pro Ala Tyr Val Arg Asn
50 55 60
Leu Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe
65 70 75 80
Ala Arg Arg Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gly
85 90 95
Ser Arg Leu Asp Glu Val Arg Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser
100 105 110
Leu Arg Gln Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Ala Asp Leu Ser Pro
115 120 125
Phe Ala Phe Ser Gly Ser Asn Ala Ser Val Ser Ala Pro Ser Pro Leu
130 135 140
Val Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Glu Asp Glu Arg Gln
145 150 155 160
Asn Arg Ser Phe Glu Gly Met Val Val Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg
165 170 175
Ala Leu Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Leu Ala Ser Asn His Phe Leu
180 185 190
Tyr Leu Pro Arg Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Ser Leu Arg His Leu
195 200 205
Asp Leu Ser Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg
210 215 220
Asn Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys
225 230 235 240
Val Leu His Asn Gly Thr Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Pro His Ile
245 250 255
Arg Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala
260 265 270
Asp Met Val Thr Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val Val Gln Gly Lys Asp
275 280 285
Arg Leu Thr Cys Ala Tyr Pro Glu Lys Met Arg Asn Arg Val Leu Leu
290 295 300
Glu Leu Asn Ser Ala Asp Leu Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser
305 310 315 320
Leu Gln Thr Ser Tyr Val Phe Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile Gly
325 330 335
Ala Ile Phe Leu Leu Val Leu Tyr Leu Asn Arg Lys Gly Ile Lys Lys
340 345 350
Trp Met His Asn Ile Arg Asp Ala Cys Arg Asp His Met Glu Gly Tyr
355 360 365
His Tyr Arg Tyr Glu Ile Asn Ala Asp Pro Arg Leu Thr Asn Leu Ser
370 375 380
Ser Asn Ser Asp Val
385
<210> 2
<211> 388
<212> PRT
<213> 猪（Sus scrofa）
<400> 2
Ser Ser Leu Thr Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ser Ser Ala Ser Phe Pro
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ala Ser Ala Leu Pro Pro Leu Pro Gly Arg Cys Pro Gln
20 25 30
Pro Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Gly Arg
35 40 45
Asn Leu Thr Glu Val Pro Ala Asp Leu Pro Pro Tyr Val Arg Thr Leu
50 55 60
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Thr Gly Ala Phe Ala
65 70 75 80
Arg Arg Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ser Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser
85 90 95
Arg Leu Thr Glu Val Gln Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu
100 105 110
Arg Leu Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Ala Asn Leu Ser Ala Phe
115 120 125
Ala Phe Ser Gly Ser Asn Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Pro Leu Val
130 135 140
Asp Leu Ile Leu Asn His Ile Val Thr Ser Ala Ala Gln Arg Gln Asn
145 150 155 160
Arg Ser Phe Glu Gly Met Val Ala Ala Ala Leu Arg Ala Gly His Ala
165 170 175
Leu Arg Gly Leu Arg Arg Leu Glu Leu Ala Ser Asn His Leu Leu Tyr
180 185 190
Leu Pro Leu Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Asp Leu Arg His Leu Asp
195 200 205
Leu Arg Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Phe Phe Arg Asn
210 215 220
Leu Thr His Leu Glu Ser Phe His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val
225 230 235 240
Leu His Asn Gly Thr Leu Ala Glu Leu Gln Ser Leu Pro His Val Arg
245 250 255
Val Phe Leu Asp Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Leu Ala Asp
260 265 270
Met Val Ala Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val Val Gln Asp Lys Ala Arg
275 280 285
Leu Thr Cys Ala Phe Pro Glu Lys Met Arg His Arg Val Leu Leu Glu
290 295 300
Leu Asn Ser Ser Asp Leu Asp Cys Asp Pro Asp Leu Pro Pro Ser Leu
305 310 315 320
Gln Thr Ser Tyr Val Phe Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile Gly Ala
325 330 335
Ile Phe Leu Leu Val Leu Tyr Leu Asn Arg Lys Gly Ile Lys Lys Trp
340 345 350
Met His Asn Ile Arg Asp Ala Cys Arg Asp His Met Glu Gly Tyr His
355 360 365
Tyr Arg Tyr Glu Ile Asn Ala Asp Pro Arg Leu Thr Asn Leu Ser Ser
370 375 380
Asn Ser Asp Val
385
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体051的重链CDR1
<400> 3
Ile Tyr Trp Met Thr
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体051的重链CDR2
<400> 4
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体051的重链CDR3
<400> 5
Asp Tyr Tyr Ser Asn Val Tyr
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体051的轻链CDR1
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体051的轻链CDR2
<400> 7
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体051的轻链CDR3
<400> 8
Gln Gln Ser Asp Ser Pro Pro Tyr Thr
1 5
<210> 9
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体051的可变重链域VH
<400> 9
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Leu Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Tyr Tyr Ser Asn Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体051的可变轻链域VL
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Pro Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体091的重链CDR1
<400> 11
Ser Asp Ala Met His
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体091的重链CDR2
<400> 12
Gly Val Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体091的重链CDR3
<400> 13
Gly Gly Ser Ile Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体091的轻链CDR1
<400> 14
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体091的轻链CDR2
<400> 15
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ile
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体091的轻链CDR3
<400> 16
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 17
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体091的可变重链域VH
<400> 17
Glu Val His Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Asp
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Val Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Gly Ser Ile Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体091的可变轻链域VL
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体097的重链CDR1
<400> 19
Asn Asp Ala Met Thr
1 5
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体097的重链CDR2
<400> 20
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体097的重链CDR3
<400> 21
Gly Gly Ser Trp Gly Asp Trp Tyr Tyr Tyr Phe Tyr Pro Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体097的轻链CDR1
<400> 22
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体097的轻链CDR2
<400> 23
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体097的轻链CDR3
<400> 24
Gln Gln Ser Asp Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 25
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体097的可变重链域VH
<400> 25
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Asp
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Ser Trp Gly Asp Trp Tyr Tyr Tyr Phe Tyr Pro Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体097的可变轻链域VL
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TPBG胞外域, aa 1-355, His6Avi
<400> 27
Met Pro Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asp Gly Arg Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Phe Ser Ser Ser Ala Pro Phe Leu
35 40 45
Ala Ser Ala Val Ser Ala Gln Pro Pro Leu Pro Asp Gln Cys Pro Ala
50 55 60
Leu Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg
65 70 75 80
Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu Pro Ala Tyr Val Arg Asn Leu
85 90 95
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala
100 105 110
Arg Arg Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser
115 120 125
Arg Leu Asp Glu Val Arg Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu
130 135 140
Arg Gln Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Ala Asp Leu Ser Pro Phe
145 150 155 160
Ala Phe Ser Gly Ser Asn Ala Ser Val Ser Ala Pro Ser Pro Leu Val
165 170 175
Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Glu Asp Glu Arg Gln Asn
180 185 190
Arg Ser Phe Glu Gly Met Val Val Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg Ala
195 200 205
Leu Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Leu Ala Ser Asn His Phe Leu Tyr
210 215 220
Leu Pro Arg Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Ser Leu Arg His Leu Asp
225 230 235 240
Leu Ser Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn
245 250 255
Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val
260 265 270
Leu His Asn Gly Thr Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Pro His Ile Arg
275 280 285
Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala Asp
290 295 300
Met Val Thr Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val Val Gln Gly Lys Asp Arg
305 310 315 320
Leu Thr Cys Ala Tyr Pro Glu Lys Met Arg Asn Arg Val Leu Leu Glu
325 330 335
Leu Asn Ser Ala Asp Leu Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser Leu
340 345 350
Gln Thr Ser Ala Ala Ala Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Thr
355 360 365
His His His His His His His His His His Ile Gly Leu Asn Asp Ile
370 375 380
Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
385 390
<210> 28
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TPBG胞外域, aa 1-355 huIgG1-Fc-His6
<400> 28
Met Pro Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asp Gly Arg Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Phe Ser Ser Ser Ala Pro Phe Leu
35 40 45
Ala Ser Ala Val Ser Ala Gln Pro Pro Leu Pro Asp Gln Cys Pro Ala
50 55 60
Leu Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg
65 70 75 80
Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu Pro Ala Tyr Val Arg Asn Leu
85 90 95
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala
100 105 110
Arg Arg Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser
115 120 125
Arg Leu Asp Glu Val Arg Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu
130 135 140
Arg Gln Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Ala Asp Leu Ser Pro Phe
145 150 155 160
Ala Phe Ser Gly Ser Asn Ala Ser Val Ser Ala Pro Ser Pro Leu Val
165 170 175
Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Glu Asp Glu Arg Gln Asn
180 185 190
Arg Ser Phe Glu Gly Met Val Val Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg Ala
195 200 205
Leu Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Leu Ala Ser Asn His Phe Leu Tyr
210 215 220
Leu Pro Arg Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Ser Leu Arg His Leu Asp
225 230 235 240
Leu Ser Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn
245 250 255
Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val
260 265 270
Leu His Asn Gly Thr Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Pro His Ile Arg
275 280 285
Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala Asp
290 295 300
Met Val Thr Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val Val Gln Gly Lys Asp Arg
305 310 315 320
Leu Thr Cys Ala Tyr Pro Glu Lys Met Arg Asn Arg Val Leu Leu Glu
325 330 335
Leu Asn Ser Ala Asp Leu Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser Leu
340 345 350
Gln Thr Ser Ala Ala Ala Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Thr
355 360 365
Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
370 375 380
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
385 390 395 400
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
405 410 415
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
420 425 430
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
435 440 445
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
450 455 460
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
465 470 475 480
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
485 490 495
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
500 505 510
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
515 520 525
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
530 535 540
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
545 550 555 560
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
565 570 575
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
580 585 590
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly His
595 600 605
His His His His His
610
<210> 29
<211> 393
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 迷你猪TPBG胞外域, aa 1-368 His6Avi
<400> 29
Met Pro Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asp Gly Arg Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Leu Thr Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ser Ser Ala Ser Phe Pro Ala
35 40 45
Ser Ala Ala Ser Ala Leu Pro Pro Leu Pro Gly Arg Cys Pro Gln Pro
50 55 60
Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Gly Arg Asn
65 70 75 80
Leu Thr Glu Val Pro Ala Asp Leu Pro Pro Tyr Val Arg Thr Leu Phe
85 90 95
Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Thr Gly Ala Phe Ala Arg
100 105 110
Arg Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ser Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser Arg
115 120 125
Leu Thr Glu Val Gln Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Ala Asn Leu Ser Ala Phe Ala
145 150 155 160
Phe Ser Gly Ser Asn Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Pro Leu Val Asp
165 170 175
Leu Ile Leu Asn His Ile Val Thr Ser Ala Ala Gln Arg Gln Asn Arg
180 185 190
Ser Phe Glu Gly Met Val Ala Ala Ala Leu Arg Ala Gly His Ala Leu
195 200 205
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Glu Leu Ala Ser Asn His Leu Leu Tyr Leu
210 215 220
Pro Leu Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Asp Leu Arg His Leu Asp Leu
225 230 235 240
Arg Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Phe Phe Arg Asn Leu
245 250 255
Thr His Leu Glu Ser Phe His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val Leu
260 265 270
His Asn Gly Thr Leu Ala Glu Leu Gln Ser Leu Pro His Val Arg Val
275 280 285
Phe Leu Asp Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Leu Ala Asp Met
290 295 300
Val Ala Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val Val Gln Asp Lys Ala Arg Leu
305 310 315 320
Thr Cys Ala Phe Pro Glu Lys Met Arg His Arg Val Leu Leu Glu Leu
325 330 335
Asn Ser Ser Asp Leu Asp Cys Asp Pro Asp Leu Pro Pro Ser Leu Gln
340 345 350
Thr Ser Ala Ala Ala Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Thr His
355 360 365
His His His His His His His His His Ile Gly Leu Asn Asp Ile Phe
370 375 380
Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
385 390
<210> 30
<211> 612
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 迷你猪TPBG胞外域, aa 1-368 huIgG1-Fc-His
<400> 30
Met Pro Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asp Gly Arg Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Leu Thr Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ser Ser Ala Ser Phe Pro Ala
35 40 45
Ser Ala Ala Ser Ala Leu Pro Pro Leu Pro Gly Arg Cys Pro Gln Pro
50 55 60
Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Gly Arg Asn
65 70 75 80
Leu Thr Glu Val Pro Ala Asp Leu Pro Pro Tyr Val Arg Thr Leu Phe
85 90 95
Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Thr Gly Ala Phe Ala Arg
100 105 110
Arg Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ser Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser Arg
115 120 125
Leu Thr Glu Val Gln Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Ala Asn Leu Ser Ala Phe Ala
145 150 155 160
Phe Ser Gly Ser Asn Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Pro Leu Val Asp
165 170 175
Leu Ile Leu Asn His Ile Val Thr Ser Ala Ala Gln Arg Gln Asn Arg
180 185 190
Ser Phe Glu Gly Met Val Ala Ala Ala Leu Arg Ala Gly His Ala Leu
195 200 205
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Glu Leu Ala Ser Asn His Leu Leu Tyr Leu
210 215 220
Pro Leu Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Asp Leu Arg His Leu Asp Leu
225 230 235 240
Arg Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Phe Phe Arg Asn Leu
245 250 255
Thr His Leu Glu Ser Phe His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val Leu
260 265 270
His Asn Gly Thr Leu Ala Glu Leu Gln Ser Leu Pro His Val Arg Val
275 280 285
Phe Leu Asp Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Leu Ala Asp Met
290 295 300
Val Ala Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val Val Gln Asp Lys Ala Arg Leu
305 310 315 320
Thr Cys Ala Phe Pro Glu Lys Met Arg His Arg Val Leu Leu Glu Leu
325 330 335
Asn Ser Ser Asp Leu Asp Cys Asp Pro Asp Leu Pro Pro Ser Leu Gln
340 345 350
Thr Ser Ala Ala Ala Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Thr Ile
355 360 365
Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
370 375 380
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
385 390 395 400
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
405 410 415
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
420 425 430
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
435 440 445
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
450 455 460
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
465 470 475 480
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
485 490 495
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
500 505 510
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
515 520 525
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
530 535 540
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
545 550 555 560
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
565 570 575
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
580 585 590
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly His His
595 600 605
His His His His
610
<210> 31
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴TPBG胞外域, aa 1-368 His6Avi
<400> 31
Met Pro Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asp Gly Arg Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Phe Ser Ser Ser Ala Pro Phe Leu
35 40 45
Ala Ser Ala Ala Ser Ala Gln Pro Pro Leu Pro Asp Gln Cys Pro Ala
50 55 60
Leu Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg
65 70 75 80
Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu Pro Leu Tyr Val Arg Asn Leu
85 90 95
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala
100 105 110
Arg Arg Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser
115 120 125
Arg Leu Asp Glu Val Arg Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu
130 135 140
Arg Gln Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Ala Tyr Leu Ser Pro Phe
145 150 155 160
Ala Phe Ser Gly Ser Asn Ala Ser Ile Ser Ala Pro Ser Pro Leu Val
165 170 175
Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Asp Asp Lys Arg Gln Asn
180 185 190
Arg Ser Phe Glu Gly Met Val Ala Ala Ala Leu Val Ala Gly Arg Ala
195 200 205
Leu Gln Gly Leu His Leu Leu Glu Leu Ala Ser Asn His Phe Leu Tyr
210 215 220
Leu Pro Arg Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Ser Leu Arg Tyr Leu Asp
225 230 235 240
Leu Ser Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn
245 250 255
Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val
260 265 270
Leu His Asn Gly Thr Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Pro His Val Arg
275 280 285
Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala Asp
290 295 300
Met Val Thr Trp Leu Lys Gln Thr Glu Val Val Gln Gly Lys Asp Arg
305 310 315 320
Leu Thr Cys Ala Phe Pro Glu Lys Met Arg Asn Arg Val Leu Leu Glu
325 330 335
Leu Asn Ser Ala Asp Leu Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser Leu
340 345 350
Gln Thr Ser Ala Ala Ala Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Thr
355 360 365
His His His His His His His His His His Ile Gly Leu Asn Asp Ile
370 375 380
Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
385 390
<210> 32
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴TPBG胞外域, aa 1-368 huIgG1-Fc-His6
<400> 32
Met Pro Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asp Gly Arg Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Phe Ser Ser Ser Ala Pro Phe Leu
35 40 45
Ala Ser Ala Ala Ser Ala Gln Pro Pro Leu Pro Asp Gln Cys Pro Ala
50 55 60
Leu Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg
65 70 75 80
Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu Pro Leu Tyr Val Arg Asn Leu
85 90 95
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala
100 105 110
Arg Arg Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser
115 120 125
Arg Leu Asp Glu Val Arg Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu
130 135 140
Arg Gln Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Ala Tyr Leu Ser Pro Phe
145 150 155 160
Ala Phe Ser Gly Ser Asn Ala Ser Ile Ser Ala Pro Ser Pro Leu Val
165 170 175
Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Asp Asp Lys Arg Gln Asn
180 185 190
Arg Ser Phe Glu Gly Met Val Ala Ala Ala Leu Val Ala Gly Arg Ala
195 200 205
Leu Gln Gly Leu His Leu Leu Glu Leu Ala Ser Asn His Phe Leu Tyr
210 215 220
Leu Pro Arg Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Ser Leu Arg Tyr Leu Asp
225 230 235 240
Leu Ser Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn
245 250 255
Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val
260 265 270
Leu His Asn Gly Thr Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Pro His Val Arg
275 280 285
Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala Asp
290 295 300
Met Val Thr Trp Leu Lys Gln Thr Glu Val Val Gln Gly Lys Asp Arg
305 310 315 320
Leu Thr Cys Ala Phe Pro Glu Lys Met Arg Asn Arg Val Leu Leu Glu
325 330 335
Leu Asn Ser Ala Asp Leu Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser Leu
340 345 350
Gln Thr Ser Ala Ala Ala Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Thr
355 360 365
Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
370 375 380
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
385 390 395 400
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
405 410 415
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
420 425 430
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
435 440 445
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
450 455 460
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
465 470 475 480
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
485 490 495
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
500 505 510
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
515 520 525
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
530 535 540
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
545 550 555 560
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
565 570 575
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
580 585 590
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly His
595 600 605
His His His His His
610
<210> 33
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠TPBG胞外域, aa 1-374 His6Avi
<400> 33
Met Pro Gly Ala Gly Ser Arg Gly Pro Ser Ala Gly Asp Gly Arg Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ala Ser
20 25 30
Ala Pro Ser Ser Ser Val Pro Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ala Ala Phe
35 40 45
Leu Ala Ser Gly Ser Ala Gln Pro Pro Pro Ala Glu Arg Cys Pro Ala
50 55 60
Ala Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg
65 70 75 80
Asn Leu Leu Glu Val Pro Ala Asp Leu Pro Pro Tyr Val Arg Asn Leu
85 90 95
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Met Thr Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala
100 105 110
Arg Gln Pro Pro Leu Ala Asp Leu Glu Ala Leu Asn Leu Ser Gly Asn
115 120 125
His Leu Lys Glu Val Cys Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Gly Leu
130 135 140
Arg Arg Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Thr Asn Leu Ser Ala Phe
145 150 155 160
Ala Phe Ala Gly Ser Asn Ala Ser Val Ser Ala Pro Ser Pro Leu Glu
165 170 175
Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Glu Asp Gln Arg Gln Asn
180 185 190
Gly Ser Phe Glu Gly Met Val Ala Phe Glu Gly Met Val Ala Ala Ala
195 200 205
Leu Arg Ser Gly Leu Ala Leu Arg Gly Leu Thr Arg Leu Glu Leu Ala
210 215 220
Ser Asn His Phe Leu Phe Leu Pro Arg Asp Leu Leu Ala Gln Leu Pro
225 230 235 240
Ser Leu Arg Tyr Leu Asp Leu Arg Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr
245 250 255
Tyr Ala Ser Phe Arg Asn Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu
260 265 270
Asp Asn Ala Leu Lys Val Leu His Asn Ser Thr Leu Ala Glu Trp His
275 280 285
Gly Leu Ala His Val Lys Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys
290 295 300
Asp Cys Tyr Met Ala Asp Met Val Ala Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val
305 310 315 320
Val Pro Asp Lys Ala Arg Leu Thr Cys Ala Phe Pro Glu Lys Met Arg
325 330 335
Asn Arg Gly Leu Leu Asp Leu Asn Ser Ser Asp Leu Asp Cys Asp Ala
340 345 350
Val Leu Pro Gln Ser Leu Gln Thr Ser Ala Ala Ala Leu Glu Val Leu
355 360 365
Phe Gln Gly Pro Gly Thr His His His His His His His His His His
370 375 380
Ile Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
385 390 395 400
<210> 34
<211> 619
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠TPBG胞外域, aa 1-374 huIgG1-Fc-His6
<400> 34
Met Pro Gly Ala Gly Ser Arg Gly Pro Ser Ala Gly Asp Gly Arg Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ala Ser
20 25 30
Ala Pro Ser Ser Ser Val Pro Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ala Ala Phe
35 40 45
Leu Ala Ser Gly Ser Ala Gln Pro Pro Pro Ala Glu Arg Cys Pro Ala
50 55 60
Ala Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg
65 70 75 80
Asn Leu Leu Glu Val Pro Ala Asp Leu Pro Pro Tyr Val Arg Asn Leu
85 90 95
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Met Thr Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala
100 105 110
Arg Gln Pro Pro Leu Ala Asp Leu Glu Ala Leu Asn Leu Ser Gly Asn
115 120 125
His Leu Lys Glu Val Cys Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Gly Leu
130 135 140
Arg Arg Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Thr Asn Leu Ser Ala Phe
145 150 155 160
Ala Phe Ala Gly Ser Asn Ala Ser Val Ser Ala Pro Ser Pro Leu Glu
165 170 175
Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Glu Asp Gln Arg Gln Asn
180 185 190
Gly Ser Phe Glu Gly Met Val Ala Phe Glu Gly Met Val Ala Ala Ala
195 200 205
Leu Arg Ser Gly Leu Ala Leu Arg Gly Leu Thr Arg Leu Glu Leu Ala
210 215 220
Ser Asn His Phe Leu Phe Leu Pro Arg Asp Leu Leu Ala Gln Leu Pro
225 230 235 240
Ser Leu Arg Tyr Leu Asp Leu Arg Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr
245 250 255
Tyr Ala Ser Phe Arg Asn Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu
260 265 270
Asp Asn Ala Leu Lys Val Leu His Asn Ser Thr Leu Ala Glu Trp His
275 280 285
Gly Leu Ala His Val Lys Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys
290 295 300
Asp Cys Tyr Met Ala Asp Met Val Ala Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val
305 310 315 320
Val Pro Asp Lys Ala Arg Leu Thr Cys Ala Phe Pro Glu Lys Met Arg
325 330 335
Asn Arg Gly Leu Leu Asp Leu Asn Ser Ser Asp Leu Asp Cys Asp Ala
340 345 350
Val Leu Pro Gln Ser Leu Gln Thr Ser Ala Ala Ala Leu Glu Val Leu
355 360 365
Phe Gln Gly Pro Gly Thr Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys
370 375 380
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
385 390 395 400
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
405 410 415
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
420 425 430
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
435 440 445
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
450 455 460
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
465 470 475 480
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
485 490 495
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
500 505 510
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
515 520 525
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
530 535 540
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
545 550 555 560
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
565 570 575
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
580 585 590
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
595 600 605
Pro Gly Lys Ser Gly His His His His His His
610 615
<210> 35
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠TPBG胞外域, aa 1-374 His6Avi
<400> 35
Met Pro Gly Ala Gly Ser Arg Gly Pro Ser Ala Gly Asp Gly Arg Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ala Ser
20 25 30
Ala Pro Ser Ser Ser Leu Pro Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ala Ala Phe
35 40 45
Leu Ala Ser Gly Ser Ala Gln Pro Pro Pro Ala Glu Arg Cys Pro Ala
50 55 60
Ala Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg
65 70 75 80
Asn Leu Leu Glu Val Pro Ala Asp Leu Pro Pro Tyr Val Arg Asn Leu
85 90 95
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Met Thr Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala
100 105 110
Arg Gln Pro Pro Leu Ala Asp Leu Ala Val Leu Asn Leu Ser Gly Asn
115 120 125
His Leu Lys Glu Val Gly Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Gly Leu
130 135 140
Arg Arg Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Thr Asn Leu Ser Ala Phe
145 150 155 160
Thr Phe Ala Gly Ser Asn Val Ser Val Ser Thr Pro Ser Pro Leu Leu
165 170 175
Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Glu Asp Gln Arg Gln Asn
180 185 190
Gly Ser Phe Glu Gly Met Val Ala Phe Glu Gly Met Val Ala Ala Ala
195 200 205
Leu Arg Ser Gly Leu Ala Leu Arg Gly Leu His His Leu Glu Leu Ala
210 215 220
Ser Asn His Phe Leu Tyr Leu Pro Arg Asp Leu Leu Asp Gln Leu Pro
225 230 235 240
Ser Leu Lys His Leu Asp Leu Arg Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr
245 250 255
Tyr Ala Ser Phe Arg Asn Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu
260 265 270
Asp Asn Ala Leu Lys Val Leu His Asn Ser Thr Leu Ala Glu Trp Gln
275 280 285
Gly Leu Ala His Val Arg Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys
290 295 300
Asp Cys Tyr Met Ala Asp Met Val Ser Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val
305 310 315 320
Val Pro Asp Lys Ala Arg Leu Thr Cys Ala Phe Pro Glu Lys Met Arg
325 330 335
Asn Arg Gly Leu Leu Asp Leu Thr Ser Ser Asp Leu Asp Cys Asp Ala
340 345 350
Thr Leu Pro Gln Ser Leu Gln Thr Ser Ala Ala Ala Leu Glu Val Leu
355 360 365
Phe Gln Gly Pro Gly Thr His His His His His His His His His His
370 375 380
Ile Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
385 390 395 400
<210> 36
<211> 619
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠TPBG胞外域, aa 1-374 huIgG1-Fc-His6
<400> 36
Met Pro Gly Ala Gly Ser Arg Gly Pro Ser Ala Gly Asp Gly Arg Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ala Ser
20 25 30
Ala Pro Ser Ser Ser Leu Pro Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ala Ala Phe
35 40 45
Leu Ala Ser Gly Ser Ala Gln Pro Pro Pro Ala Glu Arg Cys Pro Ala
50 55 60
Ala Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg
65 70 75 80
Asn Leu Leu Glu Val Pro Ala Asp Leu Pro Pro Tyr Val Arg Asn Leu
85 90 95
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Met Thr Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala
100 105 110
Arg Gln Pro Pro Leu Ala Asp Leu Ala Val Leu Asn Leu Ser Gly Asn
115 120 125
His Leu Lys Glu Val Gly Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Gly Leu
130 135 140
Arg Arg Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Thr Asn Leu Ser Ala Phe
145 150 155 160
Thr Phe Ala Gly Ser Asn Val Ser Val Ser Thr Pro Ser Pro Leu Leu
165 170 175
Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Glu Asp Gln Arg Gln Asn
180 185 190
Gly Ser Phe Glu Gly Met Val Ala Phe Glu Gly Met Val Ala Ala Ala
195 200 205
Leu Arg Ser Gly Leu Ala Leu Arg Gly Leu His His Leu Glu Leu Ala
210 215 220
Ser Asn His Phe Leu Tyr Leu Pro Arg Asp Leu Leu Asp Gln Leu Pro
225 230 235 240
Ser Leu Lys His Leu Asp Leu Arg Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr
245 250 255
Tyr Ala Ser Phe Arg Asn Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu
260 265 270
Asp Asn Ala Leu Lys Val Leu His Asn Ser Thr Leu Ala Glu Trp Gln
275 280 285
Gly Leu Ala His Val Arg Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys
290 295 300
Asp Cys Tyr Met Ala Asp Met Val Ser Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val
305 310 315 320
Val Pro Asp Lys Ala Arg Leu Thr Cys Ala Phe Pro Glu Lys Met Arg
325 330 335
Asn Arg Gly Leu Leu Asp Leu Thr Ser Ser Asp Leu Asp Cys Asp Ala
340 345 350
Thr Leu Pro Gln Ser Leu Gln Thr Ser Ala Ala Ala Leu Glu Val Leu
355 360 365
Phe Gln Gly Pro Gly Thr Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys
370 375 380
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
385 390 395 400
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
405 410 415
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
420 425 430
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
435 440 445
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
450 455 460
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
465 470 475 480
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
485 490 495
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
500 505 510
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
515 520 525
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
530 535 540
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
545 550 555 560
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
565 570 575
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
580 585 590
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
595 600 605
Pro Gly Lys Ser Gly His His His His His His
610 615
<210> 37
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 无信号肽的用于分选酶偶联的H8重链
<400> 37
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Val Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser His His His His
225 230 235 240
His His
<210> 38
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 无信号肽的用于分选酶偶联的H8轻链
<400> 38
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 39
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 无信号肽的用于分选酶偶联的051重链
<400> 39
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Leu Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Tyr Tyr Ser Asn Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Ser Leu
210 215 220
Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
225 230 235 240
Asp Leu His His His His His His Gly Ala Ala Glu Pro Glu Ala
245 250 255
<210> 40
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 无信号肽的用于分选酶偶联的051轻链
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Pro Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 41
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 无信号肽的用于分选酶偶联的091重链
<400> 41
Glu Val His Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Asp
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Val Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Gly Ser Ile Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Gly Gly Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser
225 230 235 240
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His
245 250 255
Gly Ala Ala Glu Pro Glu Ala
260
<210> 42
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 无信号肽的用于分选酶偶联的091轻链
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 43
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 无信号肽的用于分选酶偶联的097重链
<400> 43
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Asp
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Ser Trp Gly Asp Trp Tyr Tyr Tyr Phe Tyr Pro Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His
245 250 255
His Gly Ala Ala Glu Pro Glu Ala
260
<210> 44
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 无信号肽的用于分选酶偶联的097轻链
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 45
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于分选酶偶联的假单胞菌外毒素
<400> 45
Gly Gly Gly Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Tyr Pro
1 5 10 15
Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Ala Val Ser Phe Ser Thr
20 25 30
Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg
35 40 45
Gln Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe
50 55 60
Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser
65 70 75 80
Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro
85 90 95
Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala Gly
100 105 110
Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser
115 120 125
Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala
130 135 140
Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu
145 150 155 160
Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile
165 170 175
Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile
180 185 190
Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile
195 200 205
Pro Asp Ser Glu Ala Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln
210 215 220
Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu
225 230
<210> 46
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TPBG 051 Fab-PE融合蛋白的重链
<400> 46
Met Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Leu Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile
20 25 30
Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Lys Asp Tyr Tyr Ser Asn Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Lys Ala Ser Gly Gly Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly
245 250 255
Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu
260 265 270
Arg Leu Leu Gln Ala His Ala Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe
275 280 285
Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe
290 295 300
Gly Gly Val Ala Ala Arg Ser Gln Asp Leu Ala Ala Ile Trp Ala Gly
305 310 315 320
Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp
325 330 335
Gln Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg
340 345 350
Val Tyr Val Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu
355 360 365
Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly
370 375 380
His Pro Leu Pro Leu Ala Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu
385 390 395 400
Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr
405 410 415
Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly
420 425 430
Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala
435 440 445
Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu
450 455 460
Lys
465
<210> 47
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TPBG 051 Fab-PE融合蛋白的轻链
<400> 47
Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser
20 25 30
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Pro Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 48
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TPBG 091 Fab-PE融合蛋白的重链
<400> 48
Met Glu Val His Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser
20 25 30
Asp Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Gly Val Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Thr Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Thr Gly Gly Ser Ile Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Lys Ala Ser Gly Gly Arg His Arg
225 230 235 240
Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Pro Thr
245 250 255
Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg
260 265 270
Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Ala Gln
275 280 285
Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu
290 295 300
Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Ala Ala Arg Ser Gln
305 310 315 320
Asp Leu Ala Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala
325 330 335
Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg
340 345 350
Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Ala Ser Ser Leu
355 360 365
Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala
370 375 380
Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Ala Leu Asp
385 390 395 400
Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu
405 410 415
Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro
420 425 430
Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro
435 440 445
Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro
450 455 460
Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
465 470
<210> 49
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TPBG 091 Fab-PE融合蛋白的轻链
<400> 49
Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 50
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TPBG 097 Fab-PE融合蛋白的重链
<400> 50
Met Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn
20 25 30
Asp Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Lys Gly Gly Ser Trp Gly Asp Trp Tyr Tyr Tyr Phe Tyr Pro
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Lys Ala Ser Gly Gly Arg His
225 230 235 240
Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Pro
245 250 255
Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr
260 265 270
Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Ala
275 280 285
Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe
290 295 300
Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Ala Ala Arg Ser
305 310 315 320
Gln Asp Leu Ala Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro
325 330 335
Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala Gly
340 345 350
Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Ala Ser Ser
355 360 365
Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala
370 375 380
Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Ala Leu
385 390 395 400
Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile
405 410 415
Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile
420 425 430
Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile
435 440 445
Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln
450 455 460
Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
465 470
<210> 51
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TPBG 097 Fab-PE融合蛋白的轻链
<400> 51
Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Phe Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 52
<211> 613
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
<400> 52
Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val
1 5 10 15
Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro
20 25 30
Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val
35 40 45
Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu
50 55 60
Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu
65 70 75 80
Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser
85 90 95
Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn
100 105 110
Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His
115 120 125
Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys
130 135 140
Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu
145 150 155 160
Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met
165 170 175
Ala Gln Thr Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser
180 185 190
Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr
195 200 205
Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile
210 215 220
Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys
225 230 235 240
Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu
245 250 255
Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe
260 265 270
Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly
275 280 285
Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser
290 295 300
Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly
305 310 315 320
Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala
325 330 335
Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg
340 345 350
Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp
370 375 380
Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe
385 390 395 400
Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn
405 410 415
Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg
420 425 430
Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln
435 440 445
Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala
450 455 460
Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly
465 470 475 480
Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly
485 490 495
Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr
500 505 510
Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu
515 520 525
Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly
530 535 540
Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu
545 550 555 560
Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg
565 570 575
Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln
580 585 590
Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro
595 600 605
Arg Glu Asp Leu Lys
610
<210> 53
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 假单胞菌外毒素A合成变体PE38
<400> 53
Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro
1 5 10 15
Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu
20 25 30
Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala
35 40 45
Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu
50 55 60
Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu
85 90 95
Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn
100 105 110
Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr
115 120 125
Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg
130 135 140
Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln
145 150 155 160
Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu
165 170 175
Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln
180 185 190
Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala
195 200 205
Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg
210 215 220
Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu
225 230 235 240
Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala
245 250 255
Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp
260 265 270
Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu
275 280 285
Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro
290 295 300
Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro
305 310 315 320
Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro
325 330 335
Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
340 345
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 假单胞菌外毒素A变体PE-LR
<400> 54
Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu
1 5 10
<210> 55
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性甘氨酸丝氨酸接头
<400> 55
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
<400> 56
Arg Glu Asp Leu Lys
1 5
<210> 57
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有内质网局限化序列的PE功能域III的C末端
<400> 57
Lys Asp Glu Leu
1
<210> 58
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有内质网局限化序列的PE功能域III的C末端
<400> 58
Arg Glu Asp Leu
1
<210> 59
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有内质网局限化序列的PE功能域III的C末端
<400> 59
Arg Asp Glu Leu
1
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有内质网局限化序列的PE功能域III的C末端
<400> 60
Lys Glu Asp Leu Lys
1 5
<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有内质网局限化序列的PE功能域III的C末端
<400> 61
Lys Asp Glu Leu Lys Asp Glu Leu
1 5
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有内质网局限化序列的PE功能域III的C末端
<400> 62
Lys Asp Glu Leu Lys Asp Glu Leu Lys Asp Glu Leu
1 5 10
<210> 63
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位点
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然发生氨基酸
<400> 63
Arg Xaa Xaa Arg
1
<210> 64
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位点
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然发生氨基酸
<400> 64
Arg Xaa Lys Arg
1
<210> 65
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位点
<220>
<221> 混杂特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然发生氨基酸
<400> 65
Arg Xaa Arg Arg
1
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
<400> 66
Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu
1 5 10
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰假单胞菌外毒素A的域II中的弗林蛋白酶可切割序列
<400> 67
Arg His Arg Ser Lys Arg Gly Trp Glu Gln Leu
1 5 10
<210> 68
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶可切割序列
<400> 68
Arg Lys Lys Arg
1
<210> 69
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶可切割序列
<400> 69
Arg Arg Arg Arg
1
<210> 70
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶可切割序列
<400> 70
Arg Lys Ala Arg
1
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶可切割序列
<400> 71
Ser Arg Val Ala Arg Ser
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶可切割序列
<400> 72
Thr Ser Ser Arg Lys Arg Arg Phe Trp
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶可切割序列
<400> 73
Ala Ser Arg Arg Lys Ala Arg Ser Trp
1 5
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶可切割序列
<400> 74
Arg Arg Val Lys Lys Arg Phe Trp
1 5
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶可切割序列
<400> 75
Arg Asn Val Val Arg Arg Asp Trp
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶可切割序列
<400> 76
Thr Arg Ala Val Arg Arg Arg Ser Trp
1 5
<210> 77
<211> 4
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
<400> 77
Arg Gln Pro Arg
1
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
<400> 78
Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
<400> 79
Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
<400> 80
His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln
1 5
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
<400> 81
Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu
1 5
<210> 82
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰假单胞菌外毒素A的域II中的截短型式的弗林蛋白酶可切割序列
<400> 82
Arg Ser Lys Arg
1
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰假单胞菌外毒素A的域II中的截短型式的弗林蛋白酶可切割序列
<400> 83
Arg His Arg Ser Lys Arg Gly Trp
1 5
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰假单胞菌外毒素A的域II中的截短型式的弗林蛋白酶可切割序列
<400> 84
His Arg Ser Lys Arg Gly Trp Glu
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰假单胞菌外毒素A的域II中的截短型式的弗林蛋白酶可切割序列
<400> 85
Arg Ser Lys Arg Gly Trp Glu Gln Leu
1 5
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰假单胞菌外毒素A的域II中的截短型式的弗林蛋白酶可切割序列
<400> 86
His Arg Ser Lys Arg Gly Trp Glu Gln Leu
1 5 10
<210> 87
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰假单胞菌外毒素A的域II中的截短型式的弗林蛋白酶可切割序列
<400> 87
Arg His Arg Ser Lys Arg
1 5
<210> 88
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物序列rbHC.up
<400> 88
aagcttgcca ccatggagac tgggctgcgc tggcttc 37
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物序列rbHCf.do
<400> 89
ccattggtga gggtgcccga g 21
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物序列BcPCR_FHLC_leader.fw
<400> 90
atggacatga gggtccccgc 20
<210> 91
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物序列BcPCR_huCkappa.rev
<400> 91
gatttcaact gctcatcaga tggc 24

Claims (12)

1.一种分离的结合滋养层糖蛋白(TPBG)的抗体，其包含如SEQ ID NO:3所列的重链CDR1，如SEQ ID NO:4所列的重链CDR2，如SEQ ID NO:5所列的重链CDR3，如SEQ ID NO:6所列的轻链CDR1，如SEQ ID NO:7所列的轻链CDR2，和如SEQ ID NO:8所列的轻链CDR3。
2.权利要求1的结合TPBG的抗体，其包含如SEQ ID NO:3所列的重链CDR1，如SEQ IDNO:4所列的重链CDR2，如SEQ ID NO:5所列的重链CDR3，如SEQ ID NO:6所列的轻链CDR1，如SEQ ID NO:7所列的轻链CDR2，和如SEQ ID NO:8所列的轻链CDR3，以及与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性的可变重链域(VH)和与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性的可变轻链域(VL)。
3.权利要求1的结合TPBG的抗体，其包含如SEQ ID NO:9的氨基酸序列所列的可变重链域(VH)和如SEQ ID NO:10的氨基酸序列所列的可变轻链域(VL)。
4.权利要求1至3任一项的抗体，其是结合TPBG的Fab片段。
5.一种分离的核酸，其编码权利要求1至4任一项的抗体。
6.一种宿主细胞，其包含权利要求5的核酸。
7.一种生成抗体的方法，其包括培养权利要求6的宿主细胞，使得该抗体生成。
8.一种免疫缀合物，其包含权利要求1至4任一项的抗体和细胞毒剂。
9.权利要求8的免疫缀合物，其中该细胞毒剂是假单胞菌外毒素A或其片段。
10.一种药物配制剂，其包含权利要求1至4任一项的抗体或权利要求8或9的免疫缀合物和药学可接受载剂。
11.权利要求1至4任一项的抗体、权利要求8或9的免疫缀合物或权利要求10的药物配制剂制备用于治疗表达TPBG的癌症的药物的用途。
12.权利要求11的用途，其中该癌症是非小细胞肺癌。
CN201680062256.2A 2015-10-29 2016-10-27 抗tpbg抗体及使用方法 Expired - Fee Related CN108350083B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15192002.2 2015-10-29
EP15192002.2A EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2015-10-29 Anti-tpbg antibodies and methods of use
PCT/EP2016/075881 WO2017072207A1 (en) 2015-10-29 2016-10-27 Anti-tpbg antibodies and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108350083A CN108350083A (zh) 2018-07-31
CN108350083B true CN108350083B (zh) 2021-11-26

Family

ID=54360972

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680062256.2A Expired - Fee Related CN108350083B (zh) 2015-10-29 2016-10-27 抗tpbg抗体及使用方法

Country Status (6)

Country Link
US (2) US10434184B2 (zh)
EP (2) EP3184547A1 (zh)
JP (1) JP2019500853A (zh)
CN (1) CN108350083B (zh)
HK (1) HK1258850A1 (zh)
WO (1) WO2017072207A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
SG11202008399QA (en) 2018-03-12 2020-09-29 Genmab As Antibodies
MY198034A (en) * 2018-12-21 2023-07-27 Hoffmann La Roche Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
EP4028424A1 (en) 2019-09-12 2022-07-20 Genmab A/S Bispecific antibodies binding to 5t4 and cd3 for use in treatment of cancer
WO2021234550A1 (ko) * 2020-05-19 2021-11-25 애니젠 주식회사 신규 뉴클레오린-결합 펩타이드 및 이의 용도

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006031653A2 (en) * 2004-09-10 2006-03-23 Wyeth Humanized anti-5t4 antibodies and anti-5t4 antibody / calicheamicin conjugates
WO2007106744A2 (en) * 2006-03-10 2007-09-20 Wyeth Anti-5t4 antibodies and uses thereof
CN101128483A (zh) * 2004-12-21 2008-02-20 阿斯利康公司 血管生成素-2的抗体及其应用
CN102585002A (zh) * 2006-06-02 2012-07-18 瑞泽恩制药公司 人il-6受体的高亲和力抗体

Family Cites Families (127)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4892827A (en) 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5869053A (en) 1988-03-04 1999-02-09 Cancer Research Campaign Technology, Ltd. 5T4 antigen from human trophoblasts
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
EP0469065B1 (en) 1989-04-21 1996-05-29 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Recombinant antibody-toxin fusion protein
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
EP0506854A4 (en) 1989-12-21 1992-11-19 Us Health An improved toxin for construction of immunotoxins
JP2610740B2 (ja) 1990-01-02 1997-05-14 アメリカ合衆国 標的特異的細胞障害性組み換えシュードモナスエキソトキシン
WO1991009948A1 (en) 1990-01-05 1991-07-11 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5608039A (en) 1990-10-12 1997-03-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Single chain B3 antibody fusion proteins and their uses
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
JP3951062B2 (ja) 1991-09-19 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、２官能性Ｆ（ａｂ’）２抗体の産生のための使用
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69334351D1 (de) 1992-02-06 2011-05-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches Bindeprotein für Tumormarker
EP0646175B1 (en) 1992-06-18 2005-12-28 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Recombinant pseudomonas exotoxin with increased activity
DE69329503T2 (de) 1992-11-13 2001-05-03 Idec Pharma Corp Therapeutische Verwendung von chimerischen und markierten Antikörpern, die gegen ein Differenzierung-Antigen gerichtet sind, dessen Expression auf menschliche B Lymphozyt beschränkt ist, für die Behandlung von B-Zell-Lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
CA2234666A1 (en) 1995-10-13 1997-04-17 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secre Tary, Department Of Health And Human Services Immunotoxin containing a disulfide-stabilized antibody fragment
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
EP0941334B1 (en) 1996-11-06 2004-06-02 THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Protease-activatable pseudomonas exotoxin a-like proproteins
CA2292760A1 (en) 1997-06-04 1998-12-10 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ATE296315T1 (de) 1997-06-24 2005-06-15 Genentech Inc Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
AU760562B2 (en) 1997-12-05 2003-05-15 Scripps Research Institute, The Humanization of murine antibody
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
EP1071700B1 (en) 1998-04-20 2010-02-17 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
EP0972838B1 (en) 1998-07-15 2004-09-15 Roche Diagnostics GmbH Escherichia coli host/vector system based on antibiotic-free selection by complementation of an auxotrophy
US6291245B1 (en) 1998-07-15 2001-09-18 Roche Diagnostics Gmbh Host-vector system
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1141024B1 (en) 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
DK2270150T4 (da) 1999-04-09 2019-08-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle.
ES2248127T3 (es) 1999-10-04 2006-03-16 Medicago Inc. Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos en presencia de nigtrogeno.
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
ATE344801T1 (de) 1999-12-29 2006-11-15 Immunogen Inc Doxorubicin- und daunorubicin-enthaltende, zytotoxische mittel und deren therapeutische anwendung
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EP2314686B2 (en) 2000-10-06 2023-06-21 Kyowa Kirin Co., Ltd. Cells producing antibody compositions
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
WO2002043478A2 (en) 2000-11-30 2002-06-06 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
RU2321630C2 (ru) 2001-08-03 2008-04-10 Гликарт Биотекнолоджи АГ Гликозилированные антитела (варианты), обладающие повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью
ATE430580T1 (de) 2001-10-25 2009-05-15 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
JPWO2003085119A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物のＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合活性を高める方法
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
EA200401325A1 (ru) 2002-04-09 2005-04-28 Киова Хакко Когио Ко., Лтд. Клетки с модифицированным геномом
ES2362419T3 (es) 2002-04-09 2011-07-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Células con depresión o deleción de la actividad de la proteína que participa en el transporte de gdp-fucosa.
US20050031613A1 (en) 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP2289936B1 (en) 2002-12-16 2017-05-31 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
SG10202008722QA (en) 2003-11-05 2020-10-29 Roche Glycart Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
KR101438983B1 (ko) 2003-11-06 2014-09-05 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
US7982011B2 (en) 2003-11-25 2011-07-19 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Mutated anti-cd22 antibodies and immunoconjugates
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
BRPI0508761A (pt) 2004-03-31 2007-08-14 Genentech Inc anticorpo humanizado, composição que compreende um anticorpo humanizado, ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, processo de produção de anticorpo humanizado, método de tratamento de disfunção tgf-beta, método de detecção de tgf-beta, artigo industrializado e método de tratamento de cáncer
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
ES2403055T3 (es) 2004-04-13 2013-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-P-selectina
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
RU2412947C2 (ru) 2004-09-23 2011-02-27 Дженентек, Инк. Антитела, сконструированные на основе цистеинов, и их конъюгаты
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
ES2702650T3 (es) 2005-07-29 2019-03-04 The Government Of The Us Secretary Of Health And Human Services Exotoxinas de pseudomonas mutadas con antigenicidad reducida
EP1922330A1 (en) 2005-09-14 2008-05-21 Cambridge Antibody Technology Limited Pseudomonas exotoxin a cd4+ t-cell epitopes
US8679490B2 (en) 2005-11-07 2014-03-25 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
EP2059533B1 (en) 2006-08-30 2012-11-14 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
WO2009032954A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Deletions in domain ii of pseudomonas exotoxin a that reduce non-specific toxicity
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
AU2009204501B2 (en) 2008-01-07 2015-02-12 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
CA2742968C (en) * 2008-11-07 2020-06-09 Fabrus Llc Combinatorial antibody libraries and uses thereof
KR101431318B1 (ko) 2009-04-02 2014-08-20 로슈 글리카트 아게 전장 항체 및 단일쇄 ｆａｂ 단편을 포함하는 다중특이성 항체
PL2417156T3 (pl) 2009-04-07 2015-07-31 Roche Glycart Ag Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała
BRPI1007602A2 (pt) 2009-05-27 2016-02-16 Hoffmann La Roche "anticorpo tri ou tetraespecífico, método para preparação de um anticorpo triespecífico ou tetraespecífico, célula hospedeira, composição, composição farmacêutica e método para o tratamento de um paciente com necessidade de terapia"
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
JO3246B1 (ar) * 2009-09-09 2018-03-08 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية ذات ألفة تفاعل عالية مع مستقبل 2 المفعل بالبروتين البشري
CA2773665C (en) 2009-09-11 2018-02-20 Ira H. Pastan Improved pseudomonas exotoxin a with reduced immunogenicity
JP5798193B2 (ja) 2010-08-30 2015-10-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ アルカリ性フィード
RU2600067C2 (ru) 2011-05-06 2016-10-20 Дзе Гавермент Оф Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари Оф Дзе Депармент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Рекомбинантный иммунотоксин, нацеленный на мезотелин
BR112013031262A2 (pt) 2011-06-09 2016-11-22 Us Health "exotoxinas a de pseudomonas com menos epítopos imunogênicos de célula b e t, e seu uso no tratamento e prevenção de câncer, bem como molécula quimérica, ácido nucleico, vetor de expressão, células, composição farmacêutica e métodos para inibir crescimento de célula-alvo e de produção de endotoxinas a de pseudomonas e de molécula quimérica".
ES2656505T3 (es) 2011-09-16 2018-02-27 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Exotoxina A de Pseudomonas con epítopos de linfocitos B menos inmunogénicos
CA2926215A1 (en) 2013-10-06 2015-04-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Modified pseudomonas exotoxin a

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006031653A2 (en) * 2004-09-10 2006-03-23 Wyeth Humanized anti-5t4 antibodies and anti-5t4 antibody / calicheamicin conjugates
CN101128483A (zh) * 2004-12-21 2008-02-20 阿斯利康公司 血管生成素-2的抗体及其应用
WO2007106744A2 (en) * 2006-03-10 2007-09-20 Wyeth Anti-5t4 antibodies and uses thereof
CN102585002A (zh) * 2006-06-02 2012-07-18 瑞泽恩制药公司 人il-6受体的高亲和力抗体

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
5t4在肿瘤中的研究进展;蒋遥等;《现代肿瘤医学》;20140731;第22卷(第7期);第1724-1728页 *
immunoglobulin heavy chain variable region, partial [Homo sapiens];GenBank;《GenBank Database》;20140831;ACCESSION NO: AIL31053.1 *
immunoglobulin light chain variable region, partial [Homo sapiens];GenBank;《GenBank Database》;20011231;ACCESSION NO: AAK94824.1 *
Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin;Tim Eisen等;《Curr Oncol Rep》;20140201;第16卷(第2期);第1-6页 *

Also Published As

Publication number Publication date
US10434184B2 (en) 2019-10-08
HK1258850A1 (zh) 2019-11-22
US20180311371A1 (en) 2018-11-01
EP3368576A1 (en) 2018-09-05
WO2017072207A1 (en) 2017-05-04
JP2019500853A (ja) 2019-01-17
EP3184547A1 (en) 2017-06-28
CN108350083A (zh) 2018-07-31
US20200108154A1 (en) 2020-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107001475B (zh) 抗tim3抗体及使用方法
CN109952318B (zh) 抗hla-g抗体及其用途
EP2747781B1 (en) Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
CN106255705B (zh) 结合HER3β-发夹和HER2域II的HER3/HER2双特异性抗体
EP2748200B1 (en) Fc-free antibodies comprising two fab fragments and methods of use
CN108350083B (zh) 抗tpbg抗体及使用方法
CN104755500B (zh) 结合HER3 β-发夹的HER3抗原结合蛋白
US10364290B2 (en) Anti-HER3/HER4 antibodies binding to the beta-hairpin of HER3 and the beta-hairpin of HER4
CN111527107B (zh) 结合hla-a2/wt1的抗体
CN106459207B (zh) 结合HER3β-发夹的抗HER3抗体
CN106459197B (zh) 结合HER1 β-发夹的HER1抗原结合蛋白
JP2019518012A (ja) 修飾された抗テネイシン抗体及び使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1258850

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20211126