CN106459197B - 结合HER1 β-发夹的HER1抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本公开文本涉及结合HER1 β‑发夹的抗HER1抗原结合蛋白(例如抗HER1抗体)，用于选择这些抗原结合蛋白的方法，它们的制备及作为药物的用途。

Description

结合HER1 β-发夹的HER1抗原结合蛋白
本发明涉及结合HER1 β-发夹的抗HER1抗原结合蛋白(例如抗HER1抗体)，用于选择这些抗原结合蛋白的方法，它们的制备及作为药物的用途。
发明背景
HER蛋白质家族由4个成员组成：HER1，也称作表皮生长因子受体(EGFR)或ErbB-1；HER2，也称作ErbB-2；ErbB-3，也称作HER3；和ErbB-4，也称作HER4。ErbB家族蛋白质是受体酪氨酸激酶且代表细胞生长，分化和存活的重要介导物。HER家族代表表皮生长因子家族(EGF家族)像表皮生长因子(EGF)，神经调蛋白(NRG)家族，双调蛋白，和转化生长因子-α(TGF-a)的不同配体的受体蛋白质。
HER1和抗HER1抗体
人HER1(也称作表皮生长因子受体EGFR或Erb-B1)是由c-erbB原癌基因编码的一种170kDa跨膜受体，且展现内在酪氨酸激酶活性(Modjtahedi,H.,et al.,Br.J.Cancer 73(1996)228-235；Herbst,R.S.,and Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611)。SwissProt数据库条目P00533提供HER1的序列(SEQ ID NO:2)。还有HER1的同等型和变体(例如可变RNA转录物，截短型式，多态性，等)，包括但不限于那些通过Swissprot数据库条目号P00533-1，P00533-2，P00533-3，和P00533-4鉴别的。已知HER1结合下述配体，包括α)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-α(TGF)，双调蛋白，肝素结合性EGF(hb-EGF)，β细胞素(betacellulin)，和上皮调蛋白(epiregulin)(Herbst,R.S.,and Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611；Mendelsohn,J.,and Baselga,J.,Oncogene 19(2000)6550-6565)。HER1经酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节众多细胞过程，包括但不限于激活控制细胞增殖，分化，细胞存活，凋亡，血管发生，有丝分裂，和转移的信号转导途径(Atalay,G.,et al.,Ann.Oncology 14(2003)1346-1363；Tsao,A.S.,and Herbst,R.S.,Signal 4(2003)4-9；Herbst,R.S.,and Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611；Modjtahedi,H.,et al.,Br.J.Cancer 73(1996)228-235)。
未缀合的单克隆抗体(单抗)对于治疗癌症可能是有用的药物，如通过美国食品药品管理局批准曲妥珠单抗(HerceptinTM；Genentech Inc.)用于治疗晚期乳腺癌(Grillo-Lopez,A.J.,et al.,Semin.Oncol.26(1999)66-73；Goldenberg,M.M.,Clin.Ther.21(1999)309-18)，利妥昔单抗(RituxanTM；IDEC Pharmaceuticals，San Diego，CA，和Genentech Inc.，San Francisco，CA)用于治疗CD20阳性B细胞，低级或滤泡性非何杰金氏淋巴瘤，吉姆单抗(MylotargTM，Celltech/Wyeth-Ayerst)用于治疗复发性急性髓样白血病，和阿仑单抗(CAMPATHTM，Millenium Pharmaceuticals/Schering AG)用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病证明的。这些产品的成功不仅依赖于它们的功效而且依赖于它们杰出的安全性概况(Grillo-Lopez,A.J.,et al.,Semin.Oncol.26(1999)66-73；Goldenberg,M.M.,Clin.Ther.21(1999)309-18)。尽管有这些药物的成就，对于获得比未缀合的单抗疗法通常所提供的更高的比(specific)抗体活性存在极大兴趣。
许多研究的结果提示Fc受体依赖性机制对细胞毒性抗体针对肿瘤的作用有实质性贡献，而且指出最佳的针对肿瘤的抗体会优先结合活化Fc受体且最小限度地结合抑制性配偶FcγRIIB(Clynes,R.A.,et al.,Nature Medicine 6(4)(2000)443-446；Kalergis,A.M.,and Ravetch,J.V.,J.Exp.Med.195(12)(2002)1653-1659)。例如，至少一项研究的结果提示特别是FcγRIIIa受体中的多态性与抗体疗法的功效强烈相关(Cartron,G.,etal.,Blood 99(3)(2002)754-758)。该研究显示FcγRIIIa纯合的患者对利妥昔单抗具有比杂合患者更好的响应。作者得出结论，卓越的响应是由于更好的该抗体对FcγRIIIa的体内结合，这导致更好的针对淋巴瘤细胞的ADCC活性(Cartron,G.,et al.,Blood 99(3)(2002)754-758)。
已经报告了靶向EGFR和阻断EGFR信号传导途径的多种策略。小分子酪氨酸激酶抑制剂像吉非替尼，厄洛替尼，和CI-1033阻断EGFR在细胞内酪氨酸激酶区中的自我磷酸化，由此抑制下游信号传导事件(Tsao,A.S.,and Herbst,R.S.,Signal 4(2003)4-9)。另一方面，单克隆抗体靶向EGFR的细胞外部分，这导致阻断配体结合并由此抑制下游事件诸如细胞增殖(Tsao,A.S.,and Herbst,R.S.,Signal 4(2003)4-9)。
已经生成了数种鼠单克隆抗体，它们在体外实现了此类阻断且已经在小鼠异种移植物模型中评估了它们影响肿瘤生长的能力(Masui,H.,et al.,Cancer Res.46(1986)5592-5598；Masui,H.,et al.,Cancer Res.44(1984)1002-1007；Goldstein,N.,et al.,Clin.Cancer Res.1(1995)1311-1318)。例如，EMD 55900(EMD Pharmaceuticals)是一种针对人表皮样癌细胞系A431生成的鼠抗EGFR单克隆抗体，而且在具有喉或下咽晚期鳞状细胞癌的患者的临床研究中进行了测试(Bier,H.,et al.,Eur.Arch.Otohinolaryngol.252(1995)433-9)。另外，结合EGFR胞外域的大鼠单克隆抗体ICR16，ICR62，和ICR80已经显示出有效抑制EGF和TGF-α结合受体(Modjtahedi,H.,et al.,Int.J.Cancer 75(1998)310-316)。鼠单克隆抗体425是针对人A431癌细胞系生成的另一种单抗，而且发现它结合人表皮生长因子受体的外部域上的多肽表位(Murthy,U.,et al.,Arch.Biochem.Biophys.252(2)(1987)549-560)。在治疗性处理中使用鼠抗体的一个潜在问题在于非人单克隆抗体会被人宿主识别为外来蛋白质；因此，重复注射此类外来抗体会引起诱导引起有害超敏感性反应的免疫应答。对于基于鼠的单克隆抗体，这常常称作人抗小鼠抗体应答，或“HAMA”应答，或人抗大鼠抗体，或“HARA”应答。另外，这些“外来”抗体会受到宿主的免疫系统攻击，使得它们在它们达到它们的靶部位之前受到有效中和。而且，非人单克隆抗体(例如鼠单克隆抗体)通常缺乏人效应器功能性，即它们不能介导补体依赖性裂解或经由抗体依赖性细胞毒性或Fc受体介导的吞噬裂解人靶细胞等等。
已经开发了包含来自两种或更多种不同物种(例如小鼠和人)的抗体的部分的嵌合抗体作为“缀合”抗体的备选。例如，US 5,891,996(Mateo de Acosta del Rio,C.M.,etal.)讨论了针对EGFR的小鼠/人嵌合抗体R3，而US 5,558,864讨论了鼠抗EGFR单抗425的嵌合和人源化形式的生成。还有，IMC-C225(ImClone)是一种嵌合小鼠/人抗EGFR单克隆抗体(基于小鼠M225单克隆抗体，其在人临床试验中导致HAMA应答)，已经报告在多种人异种移植物模型中展现抗肿瘤功效(Herbst,R.S.,and Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611)。已经将IMC-C225的功效归于数种机制，包括抑制受到EGFR信号传导途径调节的细胞事件及可能升高的抗体依赖性细胞的毒性(ADCC)活性(Herbst,R.S.,and Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611)。IMC-C225也用于临床试验，包括与放疗和化疗组合(Herbst,R.S.,and Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611)。最近，Abgenix，Inc.(Fremont，CA)开发了ABX-EGF用于癌症疗法。ABX-EGF是一种完全人的抗EGFR单克隆抗体(Yang,X.D.,et al.,Crit.Rev.Oncol./Hematol.38(2001)17-23)。
至今不可能选择特异性结合HER1 β-发夹的抗原结合蛋白(特别是抗体)，因为这种HER1 β-发夹呈递隐藏的表位，在HER1处于平衡状态时不可及(见图1及Lemmon,MA,ExpCell Res.Feb 15,2009；315(4):638-648)。
发明概述
我们现在已经找到了一种使用在SlyD支架内以三维取向功能性呈递的HER1 β-发夹(见例如图2，和SEQ ID NO:12至16和18的多肽)来获得此类抗体的方法。
本发明提供一种用于选择结合人HER1的抗原结合蛋白(特别是抗体)的方法，其中该抗原结合蛋白(特别是抗体)在人HER1的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合，其中
使用
a)至少一种选自下组的包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的多肽：
Figure BDA0001144047760000041
来选择显示结合a)下的至少一种多肽的抗原结合蛋白(特别是抗体)，
并由此选择在人HER1的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合的抗原结合蛋白(特别是抗体)。
本发明提供通过此类选择方法获得的抗原结合蛋白(特别是抗体)。
本发明提供一种分离的结合人HER1的抗原结合蛋白(特别是抗体)，其中该抗原结合蛋白(特别是抗体)在人HER1的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合。
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合多肽
SEQ ID NO:13TtSlyDcys-HER1；或
SEQ ID NO:18TgSlyDcys-HER1。
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合多肽
SEQ ID NO:13TtSlyDcys-HER1。
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合多肽
SEQ ID NO:18TgSlyDcys-HER1。
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白在多肽SEQ ID NO:13TtSlyDcys-HER1中包含的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ IDNO:1)内结合。
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白在多肽SEQ ID NO:18TgSlyDcys-HER1中包含的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ IDNO:1)内结合。
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体结合多肽
SEQ ID NO:13TtSlyDcys-HER1；或
SEQ ID NO:18TgSlyDcys-HER1。
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体结合多肽
SEQ ID NO:13TtSlyDcys-HER1。
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体结合多肽
SEQ ID NO:18TgSlyDcys-HER1。
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体在多肽SEQ ID NO:13TtSlyDcys-HER1中包含的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合。
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体在多肽SEQ ID NO:18TgSlyDcys-HER1中包含的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合。
在一个优选实施方案中，该分离的抗原结合蛋白或抗体在EGF缺失下在A549癌细胞(ATCC CCL-185)中不诱导HER1磷酸化。
在一个优选实施方案中，该分离的抗原结合蛋白或抗体在EGF缺失下在A549癌细胞(ATCC CCL-185)中就HER1磷酸化而言是非激动性的。
本发明提供一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体结合活化的HER1中的氨基酸序列SEQ ID NO:1。
本发明提供一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体结合活化的HER1中的氨基酸序列SEQ ID NO:1；且抑制HER1同二聚体的同二聚化。
本发明提供一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体结合活化的HER1中的氨基酸序列SEQ ID NO:1；且抑制HER1/HER2异二聚体的异二聚化。
本发明提供一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体具有一项或多项下述特性：
a)结合氨基酸序列SEQ ID NO:1；和/或
b)结合活化的HER1中的氨基酸序列SEQ ID NO:1；和/或
c)在选自下组的多肽中包含的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合：
Figure BDA0001144047760000061
d)结合HER1的β-发夹区；和/或
e)抑制HER1/HER2异二聚体的异二聚化；和/或
f)与HER2，HER3和/或HER4没有交叉反应性；和/或
g)该抗体结合包含氨基酸序列TYQMDVNPEG(SEQ ID NO:19)的长度为15个氨基酸的多肽；和/或
h)结合由TYQMDVNPEG(SEQ ID NO:19)组成的多肽；和/或
i)该抗体结合包含氨基酸序列MLYNPTTYQ(SEQ ID NO:20)的长度为15个氨基酸的多肽；和/或
j)结合由MLYNPTTYQ(SEQ ID NO:20)组成的多肽；和/或
k)在EGF缺失下在A549癌细胞(ATCC CCL-185)中不诱导HER1磷酸化；和/或
l)在EGF缺失下就HER1磷酸化而言是非激动性抗体；和/或
m)在用表达HER1的A549细胞(ATCC CCL-185)进行的Western印迹测定法中在与该抗体一起温育之后2小时之后在EGF存在下显示大于70％的HER1内在化且在用表达HER1的A549细胞进行的Western印迹测定法中在与该抗体一起温育之后2小时之后在EGF缺失下显示小于55％的HER1内在化。
在一个实施方案中，此类抗HER1抗体为单克隆抗体。
在一个实施方案中，此类抗HER1抗体为人抗体，人源化抗体，或嵌合抗体。
在一个实施方案中，此类抗HER1抗体为结合人HER1的抗体片段。
a)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240)的所有三个重链HVR和所有三个轻链HVR；
b)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241)的所有三个重链HVR和所有三个轻链HVR；
c)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.058.09(DSM ACC3238)的所有三个重链HVR和所有三个轻链HVR；
d)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.186.15(DSM ACC3239)的所有三个重链HVR和所有三个轻链HVR。
本发明的一个实施方案是人源化抗HER1抗体，其包含
a)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240)的所有三个重链HVR和所有三个轻链HVR；
b)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241)的所有三个重链HVR和所有三个轻链HVR；
c)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.058.09(DSM ACC3238)的所有三个重链HVR和所有三个轻链HVR；
d)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.186.15(DSM ACC3239)的所有三个重链HVR和所有三个轻链HVR。
在一个实施方案中，此类抗HER1抗体为全长IgG1抗体或IgG4抗体。
在一个实施方案中，此类抗HER1抗体为Fab片段。
本发明进一步提供分离的核酸，其编码此类抗HER1抗体。
本发明进一步提供一种宿主细胞，其包含此类核酸。
本发明进一步提供一种生成抗体的方法，其包括培养此类宿主细胞使得该抗体生成。
在一个实施方案中，此类方法进一步包括自该宿主细胞回收该抗体。
本发明进一步提供一种免疫缀合物，其包含此类抗HER1抗体和细胞毒剂。
本发明进一步提供一种药物配制剂，其包含此类抗HER1抗体和药学可接受载剂。
本发明进一步提供本文中描述的抗HER1抗体，其用作药物。本发明进一步提供本文中描述的抗HER1抗体或包含该抗HER1抗体和细胞毒剂的免疫缀合物，其用于治疗癌症。本发明进一步提供本文中描述的抗HER1抗体，其用于抑制HER家族二聚化(HER1同或异二聚化，例如HER1同二聚化或HER1/HER2异二聚化)。
本发明进一步提供此类抗HER1抗体或包含该抗HER1抗体和细胞毒剂的免疫缀合物在制造药物中的用途。本发明进一步提供此类用途，其中该药物用于治疗癌症。本发明进一步提供此类用途，其中该药物用于抑制HER1同或异二聚化。
本发明进一步提供一种治疗具有癌症的个体的方法，其包括对该个体施用有效量的本文中描述的抗HER1抗体或包含该抗HER1抗体和细胞毒剂的免疫缀合物。
本发明进一步提供一种在罹患癌症的个体中诱导癌细胞凋亡的方法，其包括对该个体施用有效量的包含本文中描述的抗HER1抗体和细胞毒剂的免疫缀合物，由此在该个体中诱导癌细胞凋亡。
本发明的一个实施方案是一种选自下组的多肽：
Figure BDA0001144047760000081
该多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。
本发明进一步提供选自下组的此类多肽之一用于在实验动物中引发针对SEQ IDNO:1的免疫应答的用途：
Figure BDA0001144047760000091
本发明进一步提供一种用于生成特异性结合具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的HER1β-发夹的抗体的方法，其包括下述步骤：
a)至少一次对实验动物施用选自下组的多肽：
Figure BDA0001144047760000092
其中该多肽包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的HER1 β-发夹，
b)最后一次施用该多肽后3至10天自该实验动物回收生成特异性结合具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的HER1 β-发夹的抗体的B细胞，并
c)培养包含编码抗体(该抗体特异性结合具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的HER1 β-发夹)的核酸的细胞并自该细胞或培养液回收抗体，由此生成特异性结合靶抗原的抗体。
本发明进一步提供选自下组的多肽用于表位作图的用途：
Figure BDA0001144047760000093
其中该多肽包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的HER1 β-发夹中的表位。
使用在SlyD支架内以三维取向功能性呈递的HER1 β-发夹(见例如图2，和SEQ IDNO:12至16和18的多肽)能选择本文中描述的结合这种β-发夹的抗HER1抗原结合蛋白(特别是抗体)。发现了依照本发明的抗原结合蛋白(特别是抗体)具有高价值的特性，诸如结合活化形式的HER1，所以它们在EGF存在下比在EGF缺失下显示明显更强的HER1内在化。它们在EGF缺失下就HER1磷酸化而言是非激动性抗体(它们在表达HER1的癌细胞中不诱导HER1磷酸化)(且因此有可能在HER1抗体疗法期间显示更少的副作用，像例如皮疹)。
附图简述
图1“闭合的”和“开放的”HER1构象的纵览示意图及EGF配体对构象变化的影响。
图2在嗜热栖热菌的SlyD支架内以三维取向功能性呈递的HER1 β-发夹的3D结构。
图3TtSlyD-cas-HER1的Ni-NTA纯化的SDS-PAGE分析。E显示已纯化的级分。SN：纯化之前的大肠杆菌裂解物上清液。
图4嗜热栖热菌TtSlyD-cas-HER1的Ni-NTA纯化级分的SEC洗脱图。
图5结合人HER1 β-发夹的选定的抗体M-31-22，M-47-13，M-50-14(保藏的MAK<HER1-DIB>M-50.097.14)和M-50-23(保藏的MAK<HER1-DIB>M-50.110.23)在IHC中的特异性和反应性的测试。如显示的，所有抗体对于HER1检测都是特异性的，而且显示与HER家族其它成员(HER2，HER3，和HER4)没有交叉反应性。
图6表位作图和丙氨酸扫描办法的策略。调查了HER1(EGFR)ECD，HER2ECD，HER3ECD和HER4ECD的肽发夹序列(肽发夹)，包括它们的结构埋藏(结构性的)。半胱氨酸用丝氨酸替换。
图7HER1抗体M-31-22，M-47-13，M-50-14(保藏的MAK<HER1-DIB>M-50.097.14)和M-50-23(保藏的MAK<HER1-DIB>M-50.110.23)的表位的CelluSpotsTM合成和表位作图。M-47-13结合HER1ECD结合表位TYQMDVNPEG(SEQ ID NO:19)。M-50-14(保藏的MAK<HER1-DIB>M-50.097.14)和M-50-23(保藏的MAK<HER1-DIB>M-50.110.23)结合HER1ECD结合表位MLYNPTTYQ(SEQ ID NO:20)–对结合贡献最大的氨基酸以下划线/粗体标示。
图8 8A(A549细胞)和8B(A431细胞，强HER1表达及轻微的组成性活化的/磷酸化的HER1)。左道显示HER1检测，右道显示磷酸化HER1检测，在EGF缺失或存在下。在这两种癌细胞系中，抗HER1 β-发夹抗体HER1dib1＝M-50-14(＝保藏的MAK<HER1-DIB>M-50.097.14)，HER1dib2＝M-50-23(＝保藏的MAK<HER1-DIB>M-50.110.23)和HER1dib3＝M-47-15在EGF缺失下就HER1磷酸化而言作为非激动性抗体起作用(不诱导HER1磷酸化，-EGF道)，而其它HER1抗体像西妥昔单抗，GA201(记载于例如WO 2006/082515)，或ABT806(mAb806，记载于例如US2011/0076232)强烈诱导磷酸化(与不含抗体的培养基相比)。
图9使用表达HER1的癌细胞系A549在Western印迹中分析抗HER1 β-发夹抗体的结合和抗HER1 β-发夹抗体的内在化。左侧显示在EGF缺失下时间依赖性HER1检测，右侧显示在EGF存在下时间依赖性HER1检测。抗体M-50-14显示在EGF存在下比在EGF缺失下明显更强的HER1内在化(在用表达HER1的A549细胞进行的Western印迹测定法中在与该抗体一起温育之后2小时之后在EGF存在下大于70％的HER1内在化和在用表达HER1的A549细胞进行的Western印迹测定法中在与该抗体一起温育之后2小时之后在EGF缺失下小于55％的HER1内在化)。
图10在EGF存在下本发明的不同抗体对HER1-ECD的结合。
本发明实施方案的详述
I.定义
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力成熟的”抗体指与不拥有此类改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
如本文中使用的，术语“抗原结合蛋白”指本文所述抗体或支架抗原结合蛋白。在一个优选实施方案中，抗原结合蛋白为本文所述抗体。支架抗原结合蛋白是本领域已知的，例如纤连蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)已经作为备选支架用于抗原结合域，参见例如Gebauer and Skerra,Engineered protein scaffolds as next-generationantibody therapeutics.Curr Opin Chem Biol13:245-255(2009)和Stumpp et al.,Darpins:A new generation of protein therapeutics.Drug Discov Today 13:695-701(2008)，二者均通过援引完整收入本文。B.用于为本发明的抗原结合蛋白选择亲本可变域和受体的标准。在一个实施方案中，支架抗原结合蛋白选自下组：CTLA-4(Evibody)；脂笼蛋白；蛋白A衍生分子，诸如蛋白A的Z域(Affibody，SpA)，A域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白，诸如GroEI和GroES；运铁蛋白(trans-body)；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C型凝集素域(Tetranectin)；人γ-晶体蛋白和人遍在蛋白(affilin)；PDZ域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz型域；和纤连蛋白(adnectin)；它已经进行蛋白质工程以获得对除天然配体以外的配体的结合。
CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是一种主要在CD4+T细胞上表达的CD28家族受体。它的胞外域具有可变域样Ig折叠。与抗体CDR对应的环可以用异源序列替代以赋予不同结合特性。改造成具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称作Evibody。更多详情参见Journal of Immunological Methods248(1-2),31-45(2001)。
脂笼蛋白是运输小疏水性分子诸如类固醇，后胆色素，类视黄酸和脂质的一个细胞外蛋白质家族。它们具有刚性β-片层二级结构，在规范结构的开放末端处具有一些环，能改造成结合不同靶抗原。Anticalin尺寸介于160-180个氨基酸之间，而且衍生自脂笼蛋白。更多详情参见Biochim Biophys Acta1482:337-350(2000)；US7250297B1和US20070224633。
Affibody是一种衍生自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的支架，它能改造成结合抗原。该域由大约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过随机化表面残基生成了文库。更多详情参见Protein Eng.Des.Sel.17:455-462(2004)和EP1641818A1。Avimer是衍生自A域支架家族的多域蛋白。大约35个氨基酸的天然域采取限定的二硫键结构。多样性是通过A域家族展现的天然变异的改组生成的。更多详情参见NatureBiotechnology 23(12):1556-1561(2005)和Expert Opinion on Investigational Drugs16(6):909-917(June 2007)。
运铁蛋白是单体血清运输糖蛋白。通过在允许表面环中插入肽序列，运铁蛋白可改造成结合不同靶抗原。工程化运铁蛋白支架的例子包括Transbody。更多详情参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。
设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)衍生自锚蛋白，它是介导膜整合蛋白附着至细胞骨架的一个蛋白质家族。单个锚蛋白重复是33个残基的基序，由两个α-螺旋和一个β-转角组成。通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基，它们能改造成结合不同靶抗原。它们的结合界面可以通过增加模块数目(一种亲和力成熟方法)来扩大。更多详情参见J.Mol.Biol.332:489-503(2003)；PNAS 100(4):1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369:1015-1028(2007)和US20040132028A1。
纤连蛋白是一种能改造成结合抗原的支架。Adnectin由人纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单元的第10域的天然氨基酸序列作为主链组成。在β-三明治的一个末端处的三个环能改造成使得Adnectin能够特异性识别目的治疗靶。更多详情参见ProteinEng.Des.Sel.18:435-444(2005)；US20080139791；WO2005056764和US6818418B1。
肽适体是由恒定支架蛋白(通常是硫氧还蛋白(TrxA)，其含有在活性位点处插入的约束可变肽环)组成的组合识别分子。更多详情参见Expert Opin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。
Microbody衍生自长25-50个氨基酸的天然存在Microprotein，它们含有3-4个半胱氨酸桥–Microprotein的例子包括KalataBI和食鱼螺毒素和knottin。Microprotein具有一个环，它能改造成包括多至25个氨基酸，不影响Microprotein的总体折叠。工程化knottin域的更多详情参见WO2008098796。
其它抗原结合蛋白包括已经作为支架用于改造不同靶抗原结合特性的蛋白质，包括人γ-晶体蛋白和人遍在蛋白(affilin)，人蛋白酶抑制剂的kunitz型域，Ras结合蛋白AF-6的PDZ域，蝎毒素(卡律布德蝎毒素)，C型凝集素域(四连蛋白)，综述见Chapter 7-Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies(2007,edited byStefan Dubel)和Protein Science15:14-27(2006)。本发明的表位结合域可衍生自任何这些备选蛋白域。
术语“抗HER1抗原结合蛋白”，“结合(人)HER1的抗原结合蛋白”和“特异性结合人HER1的抗原结合蛋白”指能够以足够的亲和力结合HER1，使得抗原结合蛋白可用作靶向HER1中的诊断和/或治疗剂的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，抗HER1抗原结合蛋白对无关的，非HER1蛋白的结合程度小于抗原结合蛋白对HER1的结合的约10％，如例如通过表面等离振子共振测定法(例如BIACORE)测量的。在某些实施方案中，结合人HER1的抗原结合蛋白对于结合人HER1的结合亲和力具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的KD值。在一个优选实施方案中，关于HER1结合亲和力，结合亲和力的相应KD值是在表面等离振子共振测定法中使用人HER1的野生型胞外域(ECD)(HER1-ECD)测定的。
术语“抗HER1抗体”，“结合(人)HER1的抗体”和“特异性结合人HER1的抗体”指能够以足够的亲和力结合HER1，使得抗体可用作靶向HER1中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，抗HER1抗体对无关的，非HER1蛋白的结合程度小于抗体对HER1的结合的约10％，如例如通过表面等离振子共振测定法(例如BIACORE)测量的。在某些实施方案中，结合人HER1的抗体对于结合人HER1的结合亲和力具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的KD值。在一个优选实施方案中，关于HER1结合亲和力，结合亲和力的相应KD值是在表面等离振子共振测定法中使用人HER1的野生型胞外域(ECD)(HER1-ECD)测定的。
如本文中使用的，术语“结合活化的HER1中的氨基酸序列SEQ ID NO:1的抗HER1抗原结合蛋白或抗HER1抗体”指结合人HER1-ECD中包含的氨基酸序列SEQ ID NO:1的抗HER1抗原结合蛋白或抗HER1抗体。
在一个优选实施方案中，如本文中使用的，术语“结合氨基酸序列SEQ ID NO:1的抗HER1抗原结合蛋白或抗HER1抗体”指结合多肽SEQ ID NO:13(TtSlyDcys-HER1)中包含的氨基酸序列SEQ ID NO:1的抗HER1抗原结合蛋白或抗HER1抗体。
在一个实施方案中，术语“结合活化的HER1中的氨基酸序列SEQ ID NO:1的抗HER1抗原结合蛋白或抗HER1抗体”指结合多肽SEQ ID NO:13(TtSlyDcys-HER1)中包含的氨基酸序列SEQ ID NO:1的抗HER1抗原结合蛋白或抗HER1抗体。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中与完整抗体结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和自抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了一种例示性竞争测定法。
术语“对(人)HER2，HER3和/或HER4具有/显示交叉反应性(或者与其交叉反应)的抗体(或抗原结合蛋白)”，当它不与人HER2，HER3和/或HER4的胞外域(ECD)交叉反应时，即当在表面等离振子共振测定法中测量的结合信号(以相对单位(RU)计)低于背景信号(噪声)三倍时(例如于25℃作为可溶性分析物注射固定化的(例如捕捉的)以人HER2，HER3和/或HER4-ECD为抗原的抗体)。
如本文中所使用的，术语“癌症”可以是例如肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，细支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌，胃癌(stomach cancer)，胃癌(gastric cancer)，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，何杰金(Hodgkin)氏病，食管癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆癌(biliary cancer)，中枢神经系统(CNS)新生物，脊柱轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤(glioblastomamultiforme)，星形细胞瘤，神经鞘瘤(schwanoma)，室鼓膜瘤(ependymona)，髓母细胞瘤，脑脊膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤，淋巴瘤，淋巴细胞性白血病，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。在一个优选实施方案中，此类癌症是乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，肺癌或前列腺癌。在一个优选实施方案中，此类癌症的进一步特征在于HER1表达或过表达。本发明的又一个实施方案是在原发性肿瘤和新的转移的同时治疗中使用的本发明的抗HER1抗体。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ，和μ。
如本文中使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。在一个优选实施方案中，“细胞毒剂”为假单胞菌外毒素A或其变体。在一个优选实施方案中，“细胞毒剂”为鹅膏蕈毒素或其变体。
如本文中使用的，术语“保藏的抗体”指由通过名称和保藏号鉴别的相应的保藏的杂交瘤细胞生成的抗体。还可见下文生物材料的保藏。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“表位”包括能够与抗体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面聚组，诸如氨基酸，糖侧链，磷酰基，或磺酰基，并且在某些实施方案中可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。表位是抗原中被抗体结合的区域。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)NIH Publication 91-3242。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3，和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有本文中定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”，和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入有外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Bethesda MD(1991),NIH Publication 91-3242,Vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组卡帕I。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化变体”指已经经历人源化的抗体。在一个优选实施方案中，将鼠HVR嫁接入人抗体的框架区以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann,L.et al.,Nature332(1988)323-327；和Neuberger,M.S.et al.,Nature 314(1985)268-270。将鼠可变区氨基酸序列与人种系抗体V基因集合比对，并根据序列同一性和同源性进行分选。根据高总体序列同源性，还有任选的接受者序列中早已存在的正确(right)规范残基的存在来选择接受者序列(参见Poul,M-A.and Lefranc,M-P.,in“Ingénierie des anticorps banquescombinatores”ed.by Lefranc,M-P.and Lefranc,G.,Les Editions INSERM,1997)。种系V基因只编码重链直到HVR3开始和轻链直至HVR3中部的区域。因此，种系V基因的基因不与完整V域比对。人源化构建物包含人框架1至3，鼠HVR，和自人JK4和JH4序列(分别用于轻和重链)衍生的人框架4序列。在选择一种特定接受者序列之前，可确定捐献者抗体的所谓的规范环结构(参见Morea,V.et al.,Methods,Vol 20,Issue 3(2000)267-279)。通过所谓的规范位置处存在的残基的类型来确定这些规范环结构。这些位置(部分)位于HVR区域以外，而且应当在最终的构建物中保持功能上等同，从而保留亲本(捐献者)抗体的HVR构象。在WO2004/006955中报告了一种用于人源化抗体的方法，其包括下述步骤：鉴定非人成熟抗体中的HVR的规范HVR结构类型；获得人抗体可变区的肽序列文库；确定文库中可变区的规范HVR结构类型；并选择其中的规范HVR结构与非人和人可变区内相应位置处的非人抗体规范HVR结构类型相同的人序列。总之，根据高总体同源性和另外任选的接受者序列中早已存在的正确(right)规范残基的存在来选择潜在接受者序列。在一些情况中，简单HVR嫁接仅仅导致部分保留非人抗体的结合特异性。已经发现至少一些特定非人框架残基是重建结合特异性所需要的，而且也不得不嫁接入人框架，即在引入非人HVR以外不得不进行所谓的“回复突变”(参见例如Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10,029-10,033(1989)；Coet al.,Nature 351:501-502(1991))。这些特定框架氨基酸残基参与FR-HVR相互作用且稳定HVR的构象(环)(参见例如Kabat et al.,J.Immunol.147:1709(1991))。在一些情况中，还引入正向突变(forward-mutation)以更加接近地采用人种系序列。如此，“依照本发明的抗体(例如小鼠起源的)的人源化变体”指如下的抗体，其基于小鼠抗体序列，其中VH和VL通过上文所述标准技术进行人源化(包括HVR嫁接和任选的后续框架区和HVR-H1，HVR-H2，HVR-L1或HVR-L2中某些氨基酸的诱变，而HVR-H3和HVR-L3保持不修饰)。
如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环的(“高变环”)和/或含有抗原接触残基的(“抗原接触”)每一个区域。一般地，抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1，H2，H3)，且三个在VL中(L1，L2，L3)。本文中的例示性HVR包括：
(a)高变环，其存在于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)CDR，其存在于氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)，和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)抗原接触，其存在于氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)，93-101(H3)(MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)，(b)，和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)，和94-102(H3)。
除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。
优选地，HVR指存在于氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)，和95-102(H3)处的CDR(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))，即HVR是依照Kabat确定的。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛，绵羊，猫，犬，和马)，灵长类(例如人和非人灵长类，诸如猴)，家兔，和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者指人。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述参见例如Flatman,S.et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码抗HER1抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有整个或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
术语“Mab”指单克隆抗体，而术语“hMab”指此类单克隆抗体的人源化变体。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中(包括如果现有技术有的话免疫缀合物)。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(Washington D.C.，20559)，在那里其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech公司(South San Francisco，California)可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统(包括数码UNIXV4.0D)上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)，与(with)，或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于，与，或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物配制剂”指所处形式使得允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载剂”指药物配制剂中与活性组分不同，且对受试者无毒的组分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。
如本文中使用的，术语“HER1”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然HER1，除非另有说明。该术语涵盖“全长”，未加工HER1以及源自细胞中加工的任何形式的HER1。该术语还包括天然存在的HER1变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人HER1的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:2。人HER1(也称作表皮生长因子受体EGFR或Erb-B1)是由c-erbB原癌基因编码的一种170kDa跨膜受体，且展现内在酪氨酸激酶活性(Modjtahedi,H.,et al.,Br.J.Cancer73(1996)228-235；Herbst,R.S.,and Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611)。SwissProt数据库条目P00533提供HER1的序列(SEQ ID NO:2)。还有HER1的同等型和变体(例如可变RNA转录物，截短型式，多态性，等)，包括但不限于那些通过Swissprot数据库条目号P00533-1，P00533-2，P00533-3，和P00533-4鉴别的。已知HER1结合下述配体，包括α)，表皮生长因子(EGF)(SEQID NO:4)，转化生长因子-α(TGF)，双调蛋白，肝素结合性EGF(hb-EGF)，β细胞素，和上皮调蛋白(Herbst,R.S.,and Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611；Mendelsohn,J.,andBaselga,J.,Oncogene 19(2000)6550-6565)。HER1经酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节众多细胞过程，包括但不限于激活控制细胞增殖，分化，细胞存活，凋亡，血管发生，有丝分裂，和转移的信号转导途径(Atalay,G.,et al.,Ann.Oncology 14(2003)1346-1363；Tsao,A.S.,and Herbst,R.S.,Signal 4(2003)4-9；Herbst,R.S.,and Shin,D.M.,Cancer94(2002)1593-1611；Modjtahedi,H.,et al.,Br.J.Cancer 73(1996)228-235)。如本文中使用的，术语“表皮生长因子”(EGF)指人表皮生长因子(EGF，hEGF)(SEQ ID NO:4)。
有趣的是，在其平衡状态，HER1受体以其“闭合构象”存在，这确实意味着二聚化HER1 β-发夹基序经非共价相互作用系留至HER1ECD域IV(见图1及Lemmon,MA,“Ligand-induced ErbB receptor dimerization”Exp Cell Res.Feb 15,2009；315(4):638-648全文)。假定“闭合”HER1构象能经配体EGF(SEQ ID NO:4)在特定HER1EGF结合位点处的结合而开放。这发生于由HER1ECD域I和域III形成的HER1界面。通过这种相互作用，认为HER1受体活化并转变成它的“开放构象”(见图1)。在这种开放构象中，与另一个HER1分子的同二聚化或与HER家族的另一种成员的异二聚化和信号诱导是可能的(Lemmon,MA,Exp CellRes.Feb 15,2009；315(4):638-648)。
如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每一个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)(参见例如Kindt,T.J.et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),page91)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合该抗原的抗体。参见例如Portolano,S.et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson,T.et al.,Nature 352:624-628(1991)。
如本文中使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体以及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
II.组合物和方法
一方面，本发明部分基于下述发现，使用在SlyD支架内以三维取向功能性呈递的HER1 β-发夹(见例如图2，及SEQ ID NO.12至16和18的多肽)有可能选择对HER1 β-发夹特异性(且不与HER2，HER3和/或HER4交叉反应)的抗体。
在某些实施方案中，本发明提供结合人HER1的抗体，其中该抗体在人HER1的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合。
本发明的抗体对于例如癌症的诊断或治疗是有用的。
A.例示性抗HER1抗原结合蛋白和抗体
本发明提供一种分离的结合人HER1的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合选自下组的多肽：
Figure BDA0001144047760000241
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白在选自下组的多肽中包含的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合：
Figure BDA0001144047760000242
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗原结合蛋白，
a)其中该抗原结合蛋白结合多肽SEQ ID NO:13TtSlyDcys-HER1。
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白在ELISA测定法中以与对多肽SEQ ID NO:11TtSlyDcas的结合相比高至少50倍的ELISA信号(在一个优选实施方案至，以高至少100倍的ELISA信号，在另一个优选实施方案至，以高至少500倍的ELISA信号)结合多肽SEQ ID NO:13TtSlyDcys-HER1，其中TtSlyDcys-HER1和TtSlyDcas以0.5μg/ml的浓度固定化。
优选地，该ELISA信号是用辣根过氧化物酶(HRP)标记的F(ab`)2山羊抗小鼠Fcγ检测的，并且使用2,2'-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(6)]二铵盐(ABTS)作为HRP底物。
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗原结合蛋白，
a)其中该抗原结合蛋白在多肽SEQ ID NO:13(TtSlyDcys-HER1)中包含的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合。
本发明提供一种分离的结合人HER1的抗体，
a)其中该抗体结合选自下组的多肽：
Figure BDA0001144047760000251
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗体，
a)其中该抗体在选自下组的多肽中包含的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合：
Figure BDA0001144047760000252
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗体，
a)其中该抗体结合多肽SEQ ID NO:13TtSlyDcys-HER1。
本发明进一步提供一种分离的结合人HER1的抗体，
a)其中该抗体在多肽SEQ ID NO:13(TtSlyDcys-HER1)中包含的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合。
一方面，本发明提供一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体在人HER1的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合。
在某些实施方案中，本发明提供一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体具有一项或多项下述特性(而且本文中涵盖每种单一特性的每种组合)：
a)该抗体结合氨基酸序列SEQ ID NO:1；和/或
b)该抗体结合活化的HER1中的氨基酸序列SEQ ID NO:1；和/或
c)该抗体在选自下组的多肽中包含的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ IDNO:1)内结合：
Figure BDA0001144047760000261
d)结合HER1的β-发夹区；和/或
e)抑制HER1/HER2异二聚体的异二聚化；和/或
f)对HER2，HER3和/或HER4没有交叉反应性；和/或
g)该抗体结合包含氨基酸序列TYQMDVNPEG(SEQ ID NO:19)的长度为15个氨基酸的多肽；和/或
h)结合由TYQMDVNPEG(SEQ ID NO:19)组成的多肽；和/或
i)该抗体结合包含氨基酸序列MLYNPTTYQ(SEQ ID NO:20)的长度为15个氨基酸的多肽；和/或
j)结合由MLYNPTTYQ(SEQ ID NO:20)组成的多肽；和/或
k)在EGF缺失下在A549癌细胞中不诱导HER1磷酸化(见实施例6)；和/或
l)在EGF缺失下就HER1磷酸化而言是非激动性抗体(见实施例6)；和/或
m)在用表达HER1的A549细胞进行的Western印迹测定法中在与该抗体一起温育之后2小时之后在EGF存在下显示大于70％的HER1内在化且在用表达HER1的A549细胞进行的Western印迹测定法中在与该抗体一起温育之后2小时之后在EGF缺失下显示小于55％的HER1内在化(见实施例5)。
在某些实施方案中，本发明提供一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体结合包含氨基酸序列MLYNPTTYQ(SEQ ID NO:20)的长度为15个氨基酸的多肽。
在某些实施方案中，本发明提供一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体结合包含氨基酸序列TYQMDVNPEG(SEQ ID NO:19)的长度为15个氨基酸的多肽。
一方面，本发明提供一种抗HER1抗体，其包含所有六个选自下组的HVR：
i)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240)；
ii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241；
iii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.058.09(DSM ACC3238)；和
iv)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.186.15(DSM ACC3239)。
优选地，HVR是依照Kabat确定的。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种抗HER1抗体，其包含所有六个选自下组的HVR：
i)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240)；和
ii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241)。
优选地，HVR是依照Kabat确定的。
一方面，本发明提供一种抗HER1抗体，其包含所有六个选自下组的HVR：
i)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240)；
ii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241)；
iii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.058.09(DSM ACC3238)；和
iv)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.186.15(DSM ACC3239)；
其中该抗体具有一项或多项下述特性：
a)该抗体结合氨基酸序列SEQ ID NO:1；和/或
b)该抗体结合活化的HER1中的氨基酸序列SEQ ID NO:1；和/或
c)该抗体在选自下组的多肽中包含的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ IDNO:1)内结合：
Figure BDA0001144047760000271
Figure BDA0001144047760000281
d)结合HER1的β-发夹区；和/或
e)抑制HER1/HER2异二聚体的异二聚化；和/或
f)与HER2，HER3和/或HER4没有交叉反应性；和/或
g)该抗体结合包含氨基酸序列TYQMDVNPEG(SEQ ID NO:19)的长度为15个氨基酸的多肽；和/或
h)结合由TYQMDVNPEG(SEQ ID NO:19)组成的多肽；和/或
i)该抗体结合包含氨基酸序列MLYNPTTYQ(SEQ ID NO:20)的长度为15个氨基酸的多肽；和/或
j)结合由MLYNPTTYQ(SEQ ID NO:20)组成的多肽；和/或
k)在EGF缺失下在A549癌细胞中不诱导HER1磷酸化(见实施例6)；和/或
l)在EGF缺失下就HER1磷酸化而言是非激动性抗体(见实施例6)；和/或
m)在用表达HER1的A549细胞进行的Western印迹测定法中在与该抗体一起温育之后2小时之后在EGF存在下显示大于70％的HER1内在化且在用表达HER1的A549细胞进行的Western印迹测定法中在与该抗体一起温育之后2小时之后在EGF缺失下显示小于55％的HER1内在化(见实施例5)。
优选地，HVR是依照Kabat确定的。
又一方面，本发明提供与本文中提供的抗HER1抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供与选自下组的抗HER1抗体结合相同表位的抗体：
i)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240)；
ii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241)；
iii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.058.09(DSM ACC3238)；和
iv)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.186.15(DSM ACC3239)。
在一个优选实施方案中，提供与下述抗HER1抗体结合相同表位的抗体：
i)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240)；或
ii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241)。
又一方面，本发明提供与本文中提供的抗HER1抗体竞争结合人HER1的抗体。例如，在某些实施方案中，提供与选自下组的抗HER1抗体竞争结合人HER1的抗体：
i)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240)；
ii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241)；
iii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.058.09(DSM ACC3238)；和
iv)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.186.15(DSM ACC3239)。
在一个优选实施方案中，提供与下述抗HER1抗体竞争结合人HER1的抗体：
i)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240)；和
ii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241)。
在某些实施方案中，提供结合在由氨基酸序列MLYNPTTYQ(SEQ ID NO:20)组成的人HER1片段内的表位的抗体。
在某些实施方案中，提供结合在由氨基酸序列TYQMDVNPEG(SEQ ID NO:19)组成的人HER1片段内的表位的抗体。
在一个优选实施方案中，该抗体是IgG1或IgG4同种型的。在一个优选实施方案中，该抗体包含人起源的恒定域(人恒定域)。在本发明的意义内，典型的包含相应人恒定域的人恒定区具有氨基酸序列SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:26(它们部分包含氨基酸替代)。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数KD。
在一个优选实施方案中，KD是使用表面等离振子共振测定法使用
Figure BDA0001144047760000291
于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(
Figure BDA0001144047760000292
Evaluation软件版本3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon或ka)和解离速率(koff或kd)。平衡解离常数(KD)以比率kd/ka(koff/kon)计算。参见例如Chen,Y.et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么可使用荧光淬灭技术来测定结合速率，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯进行的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv，和scFv片段，及下文描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plueckthun,A.,In:The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburgand Moore(eds.),Springer-Verlag,New York(1994),pp.269-315；还可参见WO 93/16185；及美国专利No.5,571,894和No.5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见例如EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Holliger,P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合抗体和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison,S.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如自小鼠，大鼠，仓鼠，家兔，或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro,J.C.and Fransson,J.,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann,I.et al.,Nature332:323-329(1988)；Queen,C.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337，No.7,527,791，No.6,982,321，和No.7,087,409；Kashmiri,S.V.etal.,Methods 36:25-34(2005)(记载SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(记载“重修表面”)；Dall’Acqua,W.F.et al.,Methods 36:43-60(2005)(记载“FR改组”)；Osbourn,J.et al.,Methods 36:61-68(2005)及Klimka,A.et al.,Br.J.Cancer83:252-260(2000)(记载FR改组的“引导选择”办法)；Morea,V.et al.,Methods,Vol 20,Issue 3(2000)267-279)及WO2004/006955(经规范结构的办法)。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk,M.A.and van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-374(2001)及Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有整个或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述参见Lonberg,N.,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可参见例如美国专利No.6,075,181和No.6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了
Figure BDA0001144047760000321
技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M
Figure BDA0001144047760000322
技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900，其描述了
Figure BDA0001144047760000323
技术。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见例如Kozbor,D.,J.Immunol.133:3001-3005(1984)；Brodeur,B.R.et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),pp.51-63；及Boerner,P.et al.,J.Immunol.147:86-95(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li,J.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些记载于例如美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)及Ni,J.,XiandaiMianyixue 26:265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20:927-937(2005)及Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimentaland Clinical Pharmacology 27:185-91(2005)。
也可以如下生成人抗体，即分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库及对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom,H.R.et al.,Methods inMolecular Biology 178:1-37(2001)，并且进一步记载于例如McCafferty,J.et al.,Nature 348:552-554(1990)；Clackson,T.et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks,J.D.et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks,J.D.and Bradbury,A.,Methods inMolecular Biology248:161-175(2003)；Sidhu,S.S.et al.,J.Mol.Biol.338:299-310(2004)；Lee,C.V.et al.,J.Mol.Biol.340:1073-1093(2004)；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:12467-12472(2004)；及Lee,C.V.et al.,J.Immunol.Methods284:119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter,G.et al.,Ann.Rev.Immunol.12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths,A.D.et al.,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆非重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom,H.R.and Winter,G.,J.Mol.Biol.227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373及美国专利公开文本No.2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对HER1，而另一种针对任何其它抗原。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达HER1的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(参见Milstein,C.and Cuello,A.C.,Nature305:537-540(1983)；WO 93/08829；及Traunecker,A.et al.,EMBO J.10:3655-3659(1991))，和“节-入-穴”工程化(参见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如美国专利No.4,676,980及Brennan,M.et al.,Science 229:81-83(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(参见例如Kostelny,S.A.et al.,J.Immunol.148:1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Holliger,P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber,M.et al.,J.Immunol.152:5368-5374(1994))；及制备三特异性抗体(如例如Tutt,A.et al.,J.Immunol.147:60-69(1991)中所描述的)来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合HER1及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用Fab”或“DAF”(参见例如US 2008/0069820)。
本文中的抗体或片段还包括WO 2009/080251，WO 2009/080252，WO 2009/080253，WO 2009/080254，WO 2010/112193，WO 2010/115589，WO 2010/136172，WO 2010/145792，及WO 2010/145793中记载的多特异性抗体。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将适宜的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除，和/或插入和/或替代。可以进行删除，插入，和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。
a)替代，插入，和删除变体
在某些实施方案中，提供具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“优选的替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
表1
Figure BDA0001144047760000341
Figure BDA0001144047760000351
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性，亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。一种例示性替代变体是亲和力成熟抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中做出变化(例如替代)，例如以改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”中，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，对所得变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom,H.R.et al.,in Methods in Molecular Biology 178:1-37(2002))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)任一将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的办法，其中将数个HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代，插入，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出保守变化(例如保守替代，如本文中提供的)，其没有实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或是未改变的，或是含有不多于1，2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如记载于Cunningham,B.C.and Wells,J.A.,Science,244:1081-1085(1989)。在这种方法中，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如arg，asp，his，lys，和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原之间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变附着于Fc区的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的，双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wright,A.and Morrison,S.L.,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖，和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改良特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如复合的，杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki,A.et al.,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki,N.et al.,Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.et al.,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US2003/0157108；及WO 2004/056312，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki,N.et al.,Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.94:680-688(2006)；及WO 2003/085107)。
进一步提供具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878；美国专利No.6,602,684；及US 2005/0123546。还提供在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；及WO1999/22764。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在Ravetch,J.V.and Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(参见例如Hellstrom,I.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))及Hellstrom,I et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337(参见Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.，Mountain View，CA；和CytoTox
Figure BDA0001144047760000391
非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes,R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro,H.et al.,J.Immunol.Methods 202:163-171(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.et al.,Int.Immunol.18:1759-1769(2006))。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(参见例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312；及Shields,R.L.et al.,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区位置298，333，和/或334(EU残基编号方式)的替代的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区中做出改变，其导致改变的(即改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551；WO 99/51642；及Idusogie,E.E.et al.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,R.L.et al.,J.Immunol.117:587-593(1976)及Kim,J.K.et al.,J.Immunol.24:2429-2434(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn的结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434中的一处或多处具有替代，例如Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。
还可参见Duncan,A.R.and Winter,G.,Nature 322:738-740(1988)；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可能期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体缀合至其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下述残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的另外的非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三口恶烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇，及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着至抗体的聚合物的数目可以变化，而且如果附着了多于一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下述考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能，抗体衍生物是否会用于指定条件下的治疗，等。
在另一个实施方案中，提供抗体和可以通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam,N.W.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，而且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可使用重组方法和组合物来生成抗体，例如如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供编码本文所述抗HER1抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如已经用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供生成抗HER1抗体的方法，其中该方法包括在适合于抗体表达的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并任选自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。
对于抗HER1抗体的重组生成，分离编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)，并插入一种或多种载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体重和轻链的基因)。
适合于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如US 5,648,237；US 5,789,199；及US 5,840,523。(还可参见Charlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ(2003),pp.245-254，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)表达后，可以在可溶性级分中自细菌细胞浆分离抗体，并可以进一步纯化。
在原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适合于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；及Li,H.et al.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也是自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生的。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
也可利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利No.5,959,177；No.6,040,498；No.6,420,548；No.7,125,978；及No.6,417,429(其描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用哺乳动物宿主细胞系的其它例子有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham,F.L.et al.,J.Gen Virol.36:59-74(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23:243-252(1980))；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather,J.P.et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki,P.and Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2004),pp.255-268。
C.测定法和抗体(或抗原结合蛋白)选择方法
可通过本领域已知的多种测定法对本文中提供的抗HER1抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
本发明的一个方面是一种用于选择结合人HER1的抗体(或抗原结合蛋白)的方法，其中该抗体(或抗原结合蛋白)在人HER1的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合，
其中使用
a)至少一种选自下组的包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的多肽来选择(在结合测定法中)显示结合a)下的至少一种多肽的抗体(或抗原结合蛋白)：
Figure BDA0001144047760000431
并由此选择在人HER1的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合的抗原结合蛋白(特别是抗体)。
在一个实施方案中，此类选择方法进一步包括下述步骤，其中用选自下组的多肽(测试对该多肽的结合)逆筛选选择的抗体：
SEQ ID NO:11TtSlyDcas
SEQ ID NO:17TgSlyDΔIF
以确认选择的抗体不结合不包含氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)的多肽支架。
本发明提供通过此类选择方法获得的抗体(或抗原结合蛋白)。
一种用于选择特异性结合人HER1的抗体(或抗原结合蛋白)的方法，其包括下述步骤：
a)测定多种抗体(或抗原结合蛋白)对具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的HER1 β-发夹的结合亲和力，其中HER1 β-发夹以选自下组的包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的HER1β-发夹的多肽呈递：
Figure BDA0001144047760000432
Figure BDA0001144047760000441
b)选择具有预定阈水平以上的表观复合物稳定性的抗体(或抗原结合蛋白)。
1.结合测定法和其它测定法
一方面，对本发明的抗体(或抗原结合蛋白)测试其抗原结合活性，例如通过已知方法诸如ELISA，Western印迹，包括表面等离振子共振(例如BIACORE)等。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与下述各项竞争对HER1的结合的抗体：
i)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240)；
ii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241)；
iii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.058.09(DSM ACC3238)；或
iv)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.186.15(DSM ACC3239)。
在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与下述各项所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)：
i)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240；
ii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241)；
iii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.058.09(DSM ACC3238)；或
iv)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.186.15(DSM ACC3239)。
Morris,G.E.(ed.),Epitope Mapping Protocols,In:Methods in MolecularBiology,Vol.66,Humana Press,Totowa,NJ(1996)提供了用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法。别的方法详细记载于实施例4，使用CelluSpotTM技术。
在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合HER1，例如保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240)；MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSMACC3241)；MAK<HER1-DIB>M-37.058.09(DSM ACC3238)；MAK<HER1-DIB>M-37.186.15(DSMACC3239))和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对HER1的结合的能力)的溶液中温育固定化HER1。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化HER1。在允许第一抗体结合HER1的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化HER1联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化HER1联合的标记物的量相对于对照样品实质性减少，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对HER1的结合。参见Harlow,E.and Lane,D.,Antibodies:A Laboratory Manual,Chapter 14,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1988)。
2.活性测定法
一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗HER1抗体(或抗原结合蛋白)的测定法。生物学活性可包括例如抑制HER1磷酸化，在EGF缺失下就HER1磷酸化而言非激动性活性，抑制表达或过表达HER1的癌细胞的癌细胞增殖，抑制HER1/HER1同二聚化，抑制HER1/HER2异二聚化，经Western印迹或FACS测定法的(时间依赖性)内在化，具有表达或过表达HER1的异种移植癌细胞的异种移植物动物(例如小鼠或大鼠)模型中的体内肿瘤生长抑制。还提供了单独的或作为与细胞毒剂的免疫缀合物的在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。针对规定生物学活性的例示性体外或体内测定法记载于实施例2e及实施例5，6和8。
D.免疫缀合物
本发明还提供包含本文所述抗HER1抗体(或抗原结合蛋白)的免疫缀合物，该抗体(或抗原结合蛋白)与一种或多种细胞毒剂诸如化疗剂或化疗药物，生长抑制剂，毒素(例如蛋白质毒素，细菌，真菌，植物，或动物起源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素缀合。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木生物碱(maytansinoid)(参见US 5,208,020，US 5,416,064和EP 0 425 235B1)；奥瑞司他汀(auristatin)诸如单甲基奥瑞司他汀药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(参见US 5,635,483，US 5,780,588，及US 7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见US 5,712,374，US 5,714,586，US 5,739,116，US 5,767,285，US 5,770,701，US 5,770,710，US 5,773,001，和US 5,877,296；Hinman,L.M.et al.，Cancer Res.53:3336-3342(1993)；及Lode,H.N.et al.，Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz,F.et al.，Curr.Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey,S.C.et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.16:358-362(2006)；Torgov,M.Y.et al.，Bioconjug.Chem.16:717-721(2005)；Nagy,A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik,G.M.et al.，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King,H.D.et al.，J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；及美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷诸如多西他赛(docetaxel)，帕利他赛(paclitaxel)，larotaxel，tesetaxel，和ortataxel；单端孢菌素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与酶活性毒素或其片段缀合，包括但不限于白喉毒素A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)，蓖麻毒蛋白(ricin)A链，相思豆毒蛋白(abrin)A链，蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链，α-帚曲霉素(sarcin)，油桐(Aleurites fordii)毒蛋白，香石竹(dianthin)毒蛋白，美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜(Momordica charantia)抑制物，麻疯树毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物，白树毒蛋白(gelonin)，丝林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与假单胞菌外毒素A或其变体缀合的本文所述抗体。假单胞菌外毒素A或其变体记载于例如WO 2011/32022，WO 2009/32954，WO2007/031741，WO 2007/016150，WO 2005/052006和Liu,W.et al.,PNAS 109:11782-11787(2012)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与放射性原子缀合以形成放射缀合物。多种放射性同位素可用于生成放射缀合物。实例包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素。在将放射缀合物用于检测时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如TC99m或I123，或自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)，诸如碘-123，再次碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
可如下制备抗体和细胞毒剂的缀合物：a)使用重组表达技术(例如用于在例如大肠杆菌中表达与Fab或Fv抗体片段融合的基于氨基酸序列的毒素)，或b)使用多肽偶联技术(像基于氨基酸序列的毒素与Fab或Fv抗体片段基于酶分选酶的偶联)，或c)使用多种双功能蛋白质偶联剂，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)，活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)，醛类(诸如戊二醛)，双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)，双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)，二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)，和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta,E.S.et al.,Science 238:1098-1104(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头，肽酶敏感接头，光不稳定接头，二甲基接头，或含二硫化物接头(Chari,R.V.et al.,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于：商品化(例如购自Pierce Biotechnology Inc.,Rockford,IL,U.S.A)的BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，sulfo-EMCS，sulfo-GMBS，sulfo-KMUS，sulfo-MBS，sulfo-SIAB，sulfo-SMCC，和sulfo-SMPB，和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗HER1抗体(或抗原结合蛋白)对于检测生物学样品中HER1的存在是有用的。如本文中使用的，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包含细胞或组织，诸如肿瘤组织。
在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的抗HER1抗体。在又一方面，提供检测生物学样品中HER1的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在允许抗HER1抗体结合HER1的条件下使生物学样品与本文所述抗HER1抗体接触，并检测是否在抗HER1抗体与HER1之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗HER1抗体来选择适合用抗HER1抗体治疗的受试者，例如其中HER1是用于选择患者的生物标志物。
可使用本发明的抗体来诊断的例示性病症包括癌症。
在某些实施方案中，提供经标记的抗HER1抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光，发色，电子致密，化学发光，和放射性标记物)，以及例如经由酶促反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性标记物包括但不限于放射性同位素32P，14C，125I，3H，和131I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明(rhodamine)及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定的自由基，等等。
F.药物配制剂
通过混合具有期望纯度的本文所述抗HER1抗体(或抗原结合蛋白)与一种或多种任选的药学可接受载剂来制备此类抗体的药物配制剂(Remington's PharmaceuticalSciences,16th edition,Osol,A.(ed.)(1980))，处于冻干配制剂或水性溶液形式。一般地，药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性药学可接受载剂进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rhuPH20(
Figure BDA0001144047760000491
BaxterInternational,Inc.)。某些例示性sHASEGP和使用方法(包括rhuPH20)记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和No.2006/0104968。一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO 2006/044908的，后者的配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的多于一种活性组分。
活性组分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.(ed.)(1980)。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品形式，例如膜或微胶囊。
用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
G.治疗性方法和组合物
本文中提供的任何抗HER1抗体(或抗原结合蛋白)或抗HER1抗体(或抗原结合蛋白)缀合细胞毒剂的免疫缀合物可用于治疗方法。
一方面，提供了抗HER1抗体或抗HER1抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物，其用作药物。又一些方面，提供了抗HER1抗体或抗HER1抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物，其用于治疗癌症。在某些实施方案中，提供了抗HER1抗体或抗HER1抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物，其用于治疗方法。在某些实施方案中，本发明提供抗HER1抗体或抗HER1抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物，其用于治疗具有癌症的个体的方法，包括对该个体施用有效量的抗HER1抗体或抗HER1抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物。在又一些实施方案中，本发明提供抗HER1抗体或抗HER1抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物，其用于在癌细胞中诱导凋亡和/或抑制癌细胞增殖。在某些实施方案中，本发明提供抗HER1抗体或抗HER1抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物，其用于在个体中诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖的方法，包括对该个体施用有效量的抗HER1抗体或抗HER1抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物以诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖。依照任何上述实施方案的“个体”优选为人。
又一方面，本发明提供抗HER1抗体或抗HER1抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。在又一个实施方案中，该药物用于治疗癌症的方法，包括对具有癌症的个体施用有效量的药物。在又一个实施方案中，该药物用于诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖。在又一个实施方案中，该药物用于在罹患癌症的个体中诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖的方法，包括对该个体施用有效量的药物以诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖。依照任何上述实施方案，“个体”可以为人。
又一方面，本发明提供用于治疗癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括对具有癌症的个体施用有效量的抗HER1抗体。依照任何上述实施方案的“个体”可以为人。
又一方面，本发明提供用于在罹患癌症的个体中诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖的方法。在一个实施方案中，该方法包括对该个体施用有效量的抗HER1抗体或抗HER1抗体缀合细胞毒性化合物的免疫缀合物以在罹患癌症的个体中诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖。在一个实施方案中，“个体”为人。
又一方面，本发明提供包含本文中提供的任何抗HER1抗体的药物配制剂，其用于例如任何上述治疗方法。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗HER1抗体和药学可接受载剂。
可以通过任何合适手段，包括胃肠外，肺内，和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的抗体(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适路径(例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射)进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点的多次施用，推注施用，和脉冲输注。
本发明的抗体会以一种与较好医学实践一致的方式配制，定剂量，和施用。关于这一点考虑的因素包括所治疗的具体病症，所治疗的具体哺乳动物，患者个体的临床状态，病症的起因，药剂递送部位，施用方法，施用日程表，及医学从业人员知道的其它因素。抗体无需但任选与一种或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量，病症或治疗的类型，及上文讨论的其它因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用路径，或者以本文所述剂量的约1-99％，或者以凭经验/在临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。
对于疾病的预防或治疗，本发明的抗体(当单独地或与一种或多种其它别的治疗剂组合地使用时)的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型，抗体的类型，疾病的严重性和病程，施用抗体是出于预防还是治疗目的，之前的疗法，患者的临床史和对抗体的响应，及主治医师的判断。抗体恰当地以一次或一系列治疗施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg至10mg/kg)的抗体可作为施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开的施用或是通过连续输注。取决于上文所述因素，一个典型日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于几天或更长时间的重复施用，取决于状况，治疗一般会持续直至出现疾病症状的期望遏制。抗体的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用一剂或多剂约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，或例如约6剂抗体)。可施用一个较高的初始加载剂量，接着是一个或多个较低的剂量。一种例示性剂量给药方案包括施用约4mg/kg的初始加载剂量，接着是约2mg/kg抗体的每周一次维持剂量。然而，其它剂量摄生法可能是有用的。这种疗法的进展易于通过常规技术和测定方法来监测。
应当理解，可使用本发明的免疫缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法，作为抗HER1抗体的替代或补充。
III.制品
在本发明的另一个方面，提供一种制品，其包含对于治疗，预防和/或诊断上文所述病症有用的材料。制品包括容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，IV溶液袋，等。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器装有单独或与另一种组合物组合有效治疗，预防和/或诊断疾患的组合物，并且可具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中该组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的这个实施方案中的制品可进一步包括包装插页，其指示可使用组合物来治疗特定状况。或者/另外，制品可进一步包括第二(或第三)容器，其装有药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针，和注射器。
应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物，作为抗HER1抗体的替代或补充。
氨基酸序列的描述
Figure BDA0001144047760000521
Figure BDA0001144047760000531
提供下面的实施例和附图来帮助理解本发明，其真正范围列于所附权利要求书。要理解的是，可以在所列规程中进行修饰而不偏离本发明的精神。
下面列出本发明的数个实施方案：
1.一种用于选择结合人HER1的抗原结合蛋白的方法，其中该抗原结合蛋白在人HER1的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合，
其中使用
a)至少一种选自下组的包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的多肽：
Figure BDA0001144047760000532
来选择显示结合a)下的至少一种多肽的抗原结合蛋白，
并由此选择在人HER1的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合的抗原结合蛋白。
2.通过实施方案1的选择方法获得的抗原结合蛋白。
3.实施方案1的方法或实施方案2的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白为抗体。
4.一种分离的结合人HER1的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白在ELISA测定法中以与对多肽SEQ ID NO:11TtSlyDcas的结合相比高至少50倍的ELISA信号结合多肽SEQID NO:13TtSlyDcys-HER1，其中TtSlyDcys-HER1和TtSlyDcas以0.5μg/ml的浓度固定化。
5.一种分离的结合人HER1的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白在多肽SEQ IDNO:13(TtSlyDcys-HER1)中包含的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK(SEQ ID NO:1)内结合。
6.实施方案4或5的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白为抗体。
7.前述实施方案中任一项的分离的抗原结合蛋白或抗体，其中该抗体在EGF缺失下在A549癌细胞(ATCC CCL-185)中不诱导HER1磷酸化(在EGF缺失下在A549癌细胞(ATCCCCL-185)中就HER1磷酸化而言是非激动性抗体)。
8.前述实施方案中任一项的分离的抗体，其中该抗体在用表达HER1的A549细胞(ATCC CCL-185)进行的Western印迹测定法中在与该抗体一起温育之后2小时之后在EGF存在下显示大于70％的HER1内在化且在用表达HER1的A549细胞进行的Western印迹测定法中在与该抗体一起温育之后2小时之后在EGF缺失下显示小于55％的HER1内在化。
9.一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体结合包含氨基酸序列TYQMDVNPEG(SEQ ID NO:19)的长度为15个氨基酸的多肽。
10.一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体结合包含氨基酸序列MLYNPTTYQ(SEQ ID NO:20)的长度为15个氨基酸的多肽。
11.实施方案6至10中任一项的抗体，其为人抗体，人源化抗体，或嵌合抗体。
12.实施方案6至10中任一项的抗体，其为结合人HER1的抗体片段。
13.一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体包含
i)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240)的(a)HVR-H1；(b)HVR-H2；(c)HVR-H3；(d)HVR-L1；(e)HVR-L2；和(f)HVR-L3；
ii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241)的(a)HVR-H1；(b)HVR-H2；(c)HVR-H3；(d)HVR-L1；(e)HVR-L2；和(f)HVR-L3；
iii)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.058.09(DSM ACC3238)的(a)HVR-H1；(b)HVR-H2；(c)HVR-H3；(d)HVR-L1；(e)HVR-L2；和(f)HVR-L3；
iv)保藏的抗体MAK<HER1-DIB>M-37.186.15(DSM ACC3239)的(a)HVR-H1；(b)HVR-H2；(c)HVR-H3；(d)HVR-L1；(e)HVR-L2；和(f)HVR-L3；
其中所有HVR是依照Kabat确定的。
14.实施方案6至13中任一项的抗体，其为全长IgG1抗体或IgG4抗体。
15.实施方案6至13中任一项的抗体，其为Fab片段。
16.一种免疫缀合物，其包含实施方案6至13中任一项的抗体和细胞毒剂。
17.一种药物配制剂，其包含实施方案6至13中任一项的抗体或实施方案16的免疫缀合物，和药学可接受载剂。
18.实施方案6至13中任一项的抗体或实施方案16的免疫缀合物，其用作药物。
19.实施方案6至13中任一项的抗体或实施方案16的免疫缀合物，其用于治疗癌症。
20.实施方案6至13中任一项的抗体，其用于抑制HER1/HER2和/或HER1/HER1二聚化。
21.实施方案6至13中任一项的抗体或实施方案16的免疫缀合物在制造药物中的用途。
22.实施方案20的用途，其中该药物用于治疗癌症。
23.实施方案6至13中任一项的抗体在制造药物中的用途，其中该药物用于抑制HER1/HER2和/或HER1/HER1二聚化。
24.一种治疗具有癌症的个体的方法，其包括对该个体施用有效量的前述实施方案中任一项的抗体或包含前述实施方案中任一项的抗体和细胞毒剂的免疫缀合物。
25.一种在罹患癌症的个体中诱导癌细胞凋亡的方法，其包括对该个体施用有效量的包含前述实施方案中任一项的抗体和细胞毒剂的免疫缀合物，由此在该个体中诱导癌细胞凋亡。
26.分离的核酸，其编码实施方案6至11中任一项的抗体。
27.一种宿主细胞，其包含实施方案26的核酸。
28.一种生成抗体的方法，其包括培养实施方案27的宿主细胞使得该抗体生成。
29.一种选自下组的多肽：
Figure BDA0001144047760000561
该多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。
生物材料的保藏
下述生物材料已经依照布达佩斯条约保藏于莱布尼茨研究所德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Leibniz-Institut Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ),Inhoffenstr.7B,38124Braunschweig,Germany)。
抗体命名(杂交瘤细胞系) 保藏号 保藏日
MAK<HER1-DIB>M-50.097.14 DSM ACC3240 2014年5月8日
MAK<HER1-DIB>M-50.110.23 DSM ACC3241 2014年5月8日
MAK<HER1-DIB>M-37.058.09 DSM ACC3238 2014年5月8日
MAK<HER1-DIB>M-37.186.15 DSM ACC3239 2014年5月8日
实施例
材料和通用方法
重组DNA技术
使用标准方法操作DNA，如Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork，1989中所述。依制造商的说明书使用分子生物学试剂。
基因合成
从通过化学合成生成的寡核苷酸制备期望的基因区段。包括PCR扩增在内，通过退火和连接寡核苷酸装配侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的400-1600bp长基因区段，并随后经由指定的限制性位点例如EcoRI/BlpI或BsmI/XhoI克隆入下文所述表达载体。通过DNA测序确认亚克隆基因片段的DNA序列。依照Geneart(Regensburg，Germany)给出的说明书定购基因合成片段。
DNA序列测定
通过在Sequiserve GmbH(Vaterstetten，Germany)实施的双链测序测定DNA序列。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
使用Infomax的Vector NT1Advance套组版本11.5.0进行序列创建，定位，分析，注释和说明。
实施例1
抗原和筛选蛋白质的制备-用于选择结合HER1 β-发夹的抗体的功能性β-发夹HER1构建物的生成
为了生成功能性β-发夹HER1构建物，将HER1中的HER1 β-发夹的氨基酸序列移植入包含FKBP域的SlyD多肽框架。在此类构建物中，移植的β-发夹可自由接近，与HER1的天然未活化构象中的隐藏结构(在配体例如EGF缺失下)形成对比(见图1和2，其中HER1的β-发夹是隐藏的)。
所有融合SlyD多肽均可通过使用几乎相同的方案纯化和重折叠。将用特定表达质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在含有用于选择性生长的相应抗生素(卡那霉素30μg/ml，或氨苄青霉素100μg/ml)的LB培养基中于37℃生长至OD600为1.5，并通过添加1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导胞质溶胶过表达。诱导后3小时，通过离心(5,000g，20分钟)来收获细胞，冷冻并保存于-20℃。为了细胞裂解，在补充有7M GdmCl和5mM咪唑的冷却50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)中重悬浮冷冻团粒。其后将悬浮液在冰上搅动2-10小时至细胞完全裂解。离心(25,000g，1h)和过滤(硝酸纤维素膜，8.0μm，1.2μm，0.2μm)后，将裂解物应用到用裂解缓冲液平衡的Ni-NTA柱上。在随后的清洗步骤中，将咪唑浓度提高至10mM(在包含7M GdmCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)中)，并添加5mM TCEP以保持硫醇模块处于还原形式及防止早熟二硫桥形成。应用至少15-20个体积的还原性清洗缓冲液。其后，用包含100mM NaCl，10mM咪唑，和5mM TCEP的50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)替换GdmCl溶液以诱导基质结合的SlyD融合多肽的构象重折叠。为了避免共纯化蛋白酶的再活化，将蛋白酶抑制剂混合物(
Figure BDA0001144047760000581
无EDTA，Roche)添加至重折叠缓冲液。在过夜规程中应用总计15-20个柱体积的重折叠缓冲液。其后，通过用10个柱体积的包含100mM NaCl和10mM咪唑的50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)清洗来去除TCEP和
Figure BDA0001144047760000582
无EDTA抑制剂混合物二者。在最后的清洗步骤中，将咪唑浓度升高至30mM(10个柱体积)以去除粘着的污染物。然后通过应用相同缓冲液中的250mM咪唑来洗脱重折叠的多肽。通过Tricine-SDS-PAGE(Schaegger，H.andvon Jagow，G.，Anal.Biochem.166(1987)368-379)评估含蛋白质级分的纯度。随后，对蛋白质进行大小排阻层析(SuperdexTMHiLoad，Amersham Pharmacia)，使用磷酸钾作为缓冲系统(50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，100mM KCl，0.5mM EDTA)。最后，合并含蛋白质的级分，并在Amicon cell(YM10)中浓缩至约5mg/ml的浓度。TtSlyDcas-HER1的Ni-NTA纯化的例示性SDS-PAGE分析显示于图3，而嗜热栖热菌SlyDcas-HER1的Ni-NTA纯化级分的SEC洗脱概况显示于图4。TtSlyDcas-HER1融合多肽可作为可溶性的和稳定的多肽以其单体形式成功纯化。最后的产量定量为来自级分11和12的30mg纯化蛋白质。
表2：开发的基于SlyD的表位支架(它们携带HER1二聚化域片段作为插入物)的氨基酸序列的汇总。
嗜热栖热菌TtSlyDcas-HER1，TtSlyDcys-HER1，TtSlyD(GSG)-HER1，TtSlyD(CC)-HER1，TtSlyD(SS)-HER1，耐伽马热球菌(Thermococcus gammatolerans)TgSlyDcys-HER1携带HER1二聚化域片段(HER1 β-发夹)作为插入物，并用作免疫原及ELISA筛选中的阳性对照。
使用TtSlyDcas和TgSlyDΔIF作为ELISA筛选中的阴性对照(没有HER1二聚化域片段(HER1 β-发夹)作为插入物)。
当在大肠杆菌中表达表位支架时，N末端甲硫氨酸残基可以存在或不存在。(Nt＝N末端；Ct＝C末端)
Figure BDA0001144047760000591
Figure BDA0001144047760000601
实施例2
a)HER1抗体的免疫接种和选择
为了生成针对HER1 β-发夹的抗体，给Balb/C，NMRI或SJL小鼠免疫接种不同抗原。使用以下蛋白质作为抗原：全长HER1ECD，或表位支架蛋白TtSlyDcas-HER1，TtSlyDcys-HER1和TtSlyD(GSG)-HER1。TtSlyDcas-HER1变体代表第一代表位支架，用于生成HER1二聚化域特异性抗体。
在免疫接种活动开始后的时间点0，6和10周对所有小鼠进行3次免疫接种。在每个时间点给每只小鼠免疫接种在100μl PBS中溶解的100μg无内毒素免疫原。为了第一次免疫接种，将免疫原与100μl CFA混合。为了第二次和第三次免疫接种，将免疫原与IFA混合。第一次和第三次免疫接种是经由腹膜内路径应用的，而第二次免疫接种是皮下应用的。在为了使用杂交瘤技术开发抗体而制备脾细胞前2和3天，用100μl PBS中且无佐剂的12.5μg免疫原对小鼠进行静脉内强化免疫接种。
滴度分析
为了测定针对相应免疫原和筛选蛋白质的血清滴度，在免疫接种活动开始后第11周收集每只小鼠的小量血清。为了ELISA，在平板表面上固定化免疫原或筛选支架蛋白。以1μg/ml的浓度固定化HER1ECD，并以0.5μg/ml的浓度使用支架蛋白TtSlyDcas-HER1，TtSlyDcys-HER1，TtSlyD(GSG)-HER1，TtSlyDcas，TgSlyDΔIF和TgSlyDcys-HER1。使用支架蛋白TtSlyDcas和TgSlyDΔIF作为阴性对照。在含1％BSA的PBS中稀释来自每只小鼠的血清，并将稀释液添加至平板。以1:300，1:900，1:2700，1:8100，1:24300，1:72900，1:218700和1:656100稀释度测试血清。用HRP标记的F(ab`)2山羊抗小鼠Fcγ(Dianova)并用ABTS(Roche)作为底物检测结合的抗体。
即使在血清滴定的水平上，已经显而易见的是经过免疫接种的小鼠产生针对HER1β-发夹域的抗体。在用HER1ECD免疫接种的小鼠中，这可通过针对包含二聚化β-发夹环的支架蛋白之一的滴定来显示。强降低信号可通过下述事实来解释，即通过用HER1ECD免疫接种生成的大部分抗体靶向ECD内的其它部分，只有一小部分结合二聚化β-发夹域。在用包含HER1二聚化环的支架免疫接种的小鼠中，靶向该环的抗体的部分可通过针对HER1ECD的滴定(阳性对照)和针对无HER1插入的对照支架的滴定(阴性对照)来显示。
b)抗体开发和ELISA筛选/选择
使用此处描述的表位支架技术主要提供两种策略用于开发靶向HER1二聚化域(HER1 β-发夹)的抗体。一种策略是免疫接种全长HER1ECD并使用支架筛选二聚化域特异性抗体。另一种策略是直接使用支架进行免疫接种及使用HER1ECD，具有另一种主链的支架或没有插入的支架进行反筛选。利用杂交瘤技术通过将原代B细胞与P3X63Ag8.653骨髓瘤细胞融合产生抗体。最终的强化免疫接种后两天，处死接受免疫接种的小鼠并制备脾细胞群。通过使用PEG融合技术将脾细胞与P3X63Ag8.653融合。将来自融合的细胞批次培养物于37℃在5％CO2下温育过夜。次日将包含融合细胞的细胞批次以300g离心10分钟。之后，将细胞在补充有0.1x重氮丝氨酸-次黄嘌呤(Sigma)的杂交瘤选择培养基中悬浮，并以2.5x104个细胞每孔的浓度接种在96孔板中。将板于37℃在5％CO2下培养至少1周。ELISA分析前3天更换选择培养基。
在针对HER1ECD和各种支架蛋白的ELISA中测试原代培养物上清液。进行针对支架蛋白的测试以证明选定的克隆结合天然HER1ECD的二聚化域β-发夹。进行针对对照支架TtSlyDcas和TgSlyDΔIF的测试以显示选定的克隆结合插入的HER1衍生序列而非支架主链。为了ELISA筛选，使用抗原在下型式(antigen down format)。以1μg/ml的浓度固定化HER1ECD，并以0.5μg/ml的浓度固定化支架蛋白TtSlyDcys-HER1，TgSlyDcys-Her1和TtSlyDcas。将杂交瘤上清液添加至板，并于室温温育1小时。用辣根过氧化物酶(HRP)标记的F(ab`)2山羊抗小鼠Fcγ(Dianova)检测结合的抗体，并使用2,2'-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(6)]二铵盐(ABTS)(Roche)作为HRP底物。
使用HRP标记的F(ab`)2(ABTS)(Roche)作为HRP底物。
表3：通过ELISA对选定克隆的评估。针对支架蛋白TtSlyDcys-HER1和TgSlyDcys-HER1和全长HER1ECD测试克隆以验证它们的HER1二聚化域插入物(HER1 β-发夹(SEQ IDNO:1))特异性。使用支架蛋白TtSlyDcas作为阴性对照。
Figure BDA0001144047760000611
Figure BDA0001144047760000621
c)免疫组织化学
在IHC中测试选定克隆的反应性和特异性。因此用分别编码全长HER1，HER2，HER3或HER4的质粒瞬时转染HEK293细胞。转染后两天，收获此刻正在表达HER1，HER2，HER3或HER4的不同细胞系，随后在福尔马林中固定并在琼脂糖中包埋以产生IHC对照。另外在福尔马林中固定过夜后在石蜡中包埋琼脂糖块。使用未转染的HEK293细胞作为阴性对照，并依照已转染的细胞进行处理。石蜡包埋后，使用切片机制备3μm的薄切片。在玻璃显微镜载玻片上封固切片并干燥2小时。使用Ventana Benchmark XT进行免疫组织化学染色规程的所有进一步步骤。将载玻片脱蜡，并通过加热1小时实施抗原修复。为了抗原修复，使用Ventana缓冲液CC1。以1μg/ml的浓度使用抗体。为了检测结合的抗体，使用VentanaUltraView检测试剂盒。结果显示于图5。所有测试的克隆显示结合HER1，而且检测不到针对HER2，HER3或HER4的交叉反应性。
d)选定抗HER1杂交瘤的DNA测序
为了获得选定杂交瘤克隆的DNA序列，进行5`Race PCR。为了RT-PCR，通过使用总RNA纯化试剂盒(Qiagen)从5x106个细胞制备总RNA。使用5`引发RACE PCR试剂盒(Roche)进行逆转录和PCR。通过凝胶电泳和随后的凝胶纯化纯化自重链和轻链产生的PCR片段。使用Topo Zero-Blunt克隆试剂盒(Invitrogen)克隆PCR片段，并转化入感受态细胞。对来自每个杂交瘤(例如克隆M-31-22，M-37.058.09(MAK<HER1-DIB>M-37.058.09(DSM ACC3238))，M-37-15(MAK<HER1-DIB>M-37.186.15(DSM ACC3239))，M-47-01，M-47-04，M-47-06，M-47-08，M-47-09，M-47-12，M-47-13，M-46-14，M-47-15，M-47-16，M-50-14(MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240))，M-50-21，M-50-23(MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSMACC3241))，M-50-24，M-50-37，M-50-38和M-50-40)的数个克隆进行测序以获得对于选定克隆的一致序列。
实施例3
抗HER1抗体(M-47-13)的例示性表位作图
基于肽的二维表位作图
在另一个实施方案中，使用CelluSpotsTM合成和表位作图技术进行基于肽的表位作图实验以表征HER1ECD表位。依靠与人HER1ECD，HER2 ECD，HER3ECD和HER4ECD肽发夹的序列对应的重叠，固定化肽片段(长度：15个氨基酸)的文库进行表位作图。在图6中显示表位作图的策略。调查了HER1(EGFR)ECD，HER2 ECD，HER3 ECD和HER4 ECD的肽发夹序列(β-发夹)，包括它们的结构埋藏(结构上的)。用丝氨酸替换半胱氨酸。每种合成肽位移一个氨基酸，即，它有14个氨基酸分别与之前和之后的肽重叠。为了制备肽阵列，采用IntavisCelluSpotsTM技术。在这种办法中，用自动化合成仪(Intavis MultiPep RS)在经修饰纤维素圆盘上合成肽，合成后溶解。然后将共价连接至高分子纤维素的个别肽的溶液点到经过包被的显微镜载玻片上。在384孔合成板中在氨基修饰的纤维素圆盘上利用9-芴甲氧羰酰(Fmoc)化学逐步进行CelluSpotsTM合成。在每个偶联循环中，用DMF中的DIC/HOBt溶液活化相应的氨基酸。在偶联步骤之间，用乙酸酐，二异丙基乙胺和1-羟基苯并三唑的混合物给未反应的氨基基团加帽。合成完成后，将纤维素圆盘转移至96孔板并用三氯乙酸(TFA)，二氯甲烷，三异丙基硅烷(TIS)和水的混合物处理以进行侧链脱保护。去除切割溶液后，用TFA，TFMSA，TIS和水的混合物溶解结合有纤维素的肽，用二异丙醚沉淀，并在DMSO中重悬浮。随后使用Intavis载玻片点样机器人将肽溶液点到Intavis CelluSpotsTM载玻片上。
为了表位分析，用乙醇然后用Tris缓冲盐水(TBS；50mM Tris，137mM NaCl，2.7mMKCl，pH 8)清洗如上所述制备的载玻片，之后用5mL 10x Western封闭试剂(Roche AppliedScience)，TBS中的2.5g蔗糖，0.1％Tween 20于4℃封闭16小时。用TBS和0.1％Tween 20清洗载玻片，之后与1μg/mL相应IGF1抗体一起在TBS和0.1％Tween 20中于环境温度温育2小时，随后用TBS+0.1％Tween 20清洗。为了检测，将载玻片与抗家兔/抗小鼠HRP-二抗(TBS-T中1:20000)一起温育，接着与化学发光底物鲁米诺(luminol)一起温育并用LumiImager(Roche Applied Science)显现。对ELISA阳性点定量，并通过相应肽序列的指派鉴定抗体结合表位。
如图7中所绘，M-47-13显示具有氨基酸序列TYQMDVNPEG(SEQ ID NO:19)的HER1ECD表位，对HER2ECD，HER3ECD或HER4ECD中的发夹基序没有可检测信号。M31-22显示略微不同的表位。M-50-14(保藏的MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240))和M-50-23(保藏的MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241))显示具有氨基酸序列MLYNPTTYQ(SEQ IDNO:20)的HER1ECD表位，对HER2 ECD，HER3 ECD或HER4 ECD中的发夹基序没有可检测信号。
实施例4
抗HER1 β-发夹抗体的动力学筛选/结合特性
依照Schraeml等人(Schraml，M.and M.Biehl，Methods Mol Biol 901(2012)171-181)在安装有Biacore CM5传感器的BIAcore 4000仪器上实施动力学筛选。在所有测定法中捕捉测试抗体。系统处于软件版本V1.1控制下。仪器缓冲液是HBS-EP(10mM HEPES(pH7.4)，150mM NaCl，1mM EDTA，0.05％(w/v)P20)。于25℃操作系统。使用EDC/NHS化学依照制造商的用法说明书在流通池1，2，3和4中的点1，2，4和5上固定化10mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中的30μg/ml家兔多克隆抗体(RAM IgG(具有Fcγ特异性的家兔抗小鼠IgG)GEHealthcare)。使用1M乙醇胺饱和传感器。在每个流通池中，使用点1-2和点5-4计算参考信号，点3充当空白对照。将抗原(人重组HER1ECD和包含HER1 β-发夹肽(SEQ ID NO:1)的重组嗜热栖热菌TtSlyDcas-HER1，TtSlyDcys-HER1，TtSlyD(GSG)-HER1，TtSlyD(CC)-HER1，TtSlyD(SS)-HER1，耐伽马热球菌TgSlyDcys-HER1之一)在补充有1mg/ml CMD(羧甲基右旋糖苷，Sigma)以抑制非特异结合的仪器缓冲液中稀释成150nM。在应用它们之前，将杂交瘤培养物上清液在仪器缓冲液中1:5稀释。以30μl/分钟的流速注射稀释的混合物2分钟。监测以响应单位计的抗体捕捉水平(CL)。之后立即以30μl/分钟的流速注射相应抗原3分钟结合时间。之后，记录抗体-抗原复合物解离信号5分钟。通过以30μl/分钟的流速注射10mM甘氨酸-HCl溶液(pH 1.7)2分钟来再生传感器。注射抗原结束之前不久记录的信号表示以响应单位计的结合后期(BL)。解离记录结束之前不久记录的信号表示以响应单位计的稳定后期(SL)。测定，计算解离速率常数。用下述公式计算以分钟计的抗体-抗原复合物稳定性：ln(2)/60*kd。用下述公式计算摩尔比：MW(抗体)/MW(抗原)*BL(抗原)/CL(抗体)。
结合后期(BL)代表在分析物注射结束时的响应单位。测量作为传感器表面上配体捕捉到的抗体的量，作为以响应单位计的捕捉水平(CL)。连同测试的分析物的分子量信息，可计算溶液中抗体和分析物的摩尔比。假使用适当量的抗体配体捕捉水平配置传感器，每个抗体应能够功能性结合溶液中的至少一个分析物，它以摩尔比MR＝1.0代表。然后，摩尔比也是分析物结合的效价模式的指标。对于结合两个分析物的抗体而言，最大效价可以是MR＝2，每个Fab配价对应一个。假使空间限制或功能障碍的分析物结合，摩尔比可指示化学计量下的结合，类似于HER1ECD以其“闭合”构象受到本发明抗HER1 β-发夹抗体结合的情况(因为此β-发夹在闭合构象中是隐藏的)。摩尔比测定中的最大测定偏差是MR＝0.2。
实施例5
经由Western印迹的抗HER1 β-发夹抗体的时间依赖性内在化分析！
使用表达HER1的癌细胞系A549在Western印迹中分析抗HER1 β-发夹抗体的结合和抗HER1 β-发夹抗体的内在化。
在24孔板中接种表达HER1的A549(
Figure BDA0001144047760000661
CCL-185TM肺癌)细胞(3x105个细胞/孔，含有10％FCS的培养基)。次日用饥饿培养基(0.5％FCS)更换培养基。4小时后(细胞裂解之前24小时)，将抗体M-50-14(＝保藏的MAK<HER1-DIB>M-50.097.14)添加至每种细胞系的两个孔至终浓度185μg/ml。次日在下述时间再次添加抗体M-50-14(＝保藏的MAK<HER1-DIB>M-50.097.14)：细胞裂解减6小时，减4小时，减2小时，减1小时。细胞裂解之前10分钟，用hEGF(终浓度200ng/ml)刺激每个时间点的一个孔。用40μl Triton裂解缓冲液裂解细胞。实施SDS-PAGE，接着是半干式Western印迹。将膜与针对HER1(Upstate#06-847)，磷酸化HER1(Epitomics#1139-1)和磷酸化酪氨酸(Millipore#16-105)的抗体一起温育。
结果显示于图9(A549细胞)。左侧显示在EGF缺失下时间依赖性HER1检测，右侧显示在EGF存在下时间依赖性HER1检测。抗体M-50-14显示在EGF存在下比在EGF缺失下明显更强的HER1内在化(在用表达HER1的A549细胞进行的Western印迹测定法中在与该抗体一起温育之后2小时之后在EGF存在下大于70％的HER1内在化和在用表达HER1的A549细胞进行的Western印迹测定法中在与该抗体一起温育之后2小时之后在EGF缺失下小于55％的HER1内在化)。
实施例6
在表达HER1的A549和A431癌细胞中抗HER1抗体结合抑制(不诱导)HER1磷酸化
在24孔板中接种表达HER1的A549(
Figure BDA0001144047760000662
CCL-185TM肺癌)细胞和A431(
Figure BDA0001144047760000663
CRL-1555TM–皮肤癌/表皮样癌)细胞(3x105个细胞/孔，含有10％FCS的培养基)。次日用饥饿培养基(0.5％FCS)更换培养基。4小时后(细胞裂解之前24小时)，将抗体添加至每种细胞系的两个孔至终浓度185μg/ml。次日在下述时间再次添加抗体：细胞裂解减6小时，减4小时，减2小时，减1小时。细胞裂解之前10分钟，用hEGF(终浓度200ng/ml)刺激每个时间点的一个孔。用40μl Triton裂解缓冲液裂解细胞。实施SDS-PAGE，接着是半干式Western印迹。将膜与针对HER1(Upstate#06-847)，磷酸化HER1(Epitomics#1139-1)和磷酸化酪氨酸(Millipore#16-105)的抗体一起温育。
结果显示于图8A(A549细胞)和8B(A431细胞，强HER1表达及轻微的组成性活化的/磷酸化的HER1)。左道显示HER1检测，右道显示磷酸化HER1检测，在EGF缺失或存在下。
在这两种癌细胞系中，抗HER1 β-发夹抗体HER1dib1＝M-50-14(＝保藏的MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240))，HER1dib2＝M-50-23(＝保藏的MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241))和HER1dib3＝M-47-15显示不诱导磷酸化且作为非激动性HER1抗体起作用(在EGF配体缺失下，-EGF道)，而其它HER1抗体像西妥昔单抗，GA201(imgatuzumab，CAS编号959963-46-3，通过人源化亲本ICR62大鼠抗体衍生的一种人源化的糖工程化的IgG1单抗，记载于例如WO 2006/082515)，或ABT806(mAb806，靶向EGFR删除变体，de2-7EGFR以及野生型，记载于例如US 2011/0076232)强烈诱导磷酸化(在EGF缺失下，与不含抗体的培养基或本发明的抗体相比)。
实施例7
在抗HER1 β-发夹抗体存在下配体EGF对HER1(EGFR)-ECD的结合(ELISA)
将链霉亲合素包被的96孔板与含有带SBP标签的HER1-ECD的细胞培养物上清液一起于4℃温育。次日用清洗缓冲液(PBS+0.05％Tween-20)清洗孔3次，并用含有1％BSA的PBS封闭1小时。用清洗缓冲液再清洗3次后，将40μl抗体溶液(在Delfia结合缓冲液中)作为期望终浓度(10-3至103nM)的2x贮液添加至每个孔。立即添加40μl 20nM铕标记的EGF以实现终浓度10nM。将板在摇床上于室温温育2小时。用Delfia清洗缓冲液清洗3次后，添加Delfia增强溶液，并在摇床上温育15分钟(避光)。最后，使用时间解析荧光测量方案在TecanInfinite F200读数仪上测量板。以1:1至的1:10e7稀释度使用HER1dib上清液。抗HER1抗体M-50-14(50.097.14＝MAK<HER1-DIB>M-50.097.14(DSM ACC3240))；M-50-23(50.110.23＝MAK<HER1-DIB>M-50.110.23(DSM ACC3241))；M-47-15(M-47.259.15)；M-31-22(M-31.021.22)；M-37-09(MAK<HER1-DIB>M-37.058.09(DSM ACC3238))；M-37-15(MAK<HER1-DIB>M-37.186.15(DSM ACC3239))的结果显示于图10。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 结合HER1 β-发夹的HER1抗原结合蛋白
<130> P32121-WO
<150> EP14168320.1
<151> 2014-05-14
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人（Homo Sapiens）
<400> 1
Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn
1 5 10 15
Pro Glu Gly Lys
20
<210> 2
<211> 1186
<212> PRT
<213> 人（Homo Sapiens）
<400> 2
Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln
1 5 10 15
Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn
20 25 30
Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg
35 40 45
Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr
50 55 60
Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu
65 70 75 80
Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala
85 90 95
Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro
100 105 110
Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn
115 120 125
Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val
130 135 140
Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu
145 150 155 160
Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp
165 170 175
Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala
180 185 190
Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys
195 200 205
His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys
210 215 220
Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys
225 230 235 240
Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn
245 250 255
Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro
260 265 270
Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly
275 280 285
Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys
290 295 300
Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu
305 310 315 320
Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys
325 330 335
Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe
340 345 350
Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu
355 360 365
Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln
370 375 380
Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu
385 390 395 400
Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val
405 410 415
Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile
420 425 430
Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala
435 440 445
Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr
450 455 460
Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln
465 470 475 480
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
485 490 495
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
500 505 510
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
515 520 525
Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn
530 535 540
Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His
545 550 555 560
Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met
565 570 575
Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
580 585 590
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly
595 600 605
Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr
610 615 620
Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile
625 630 635 640
Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg
645 650 655
Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
660 665 670
Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe
675 680 685
Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
705 710 715 720
Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
725 730 735
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg
740 745 750
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu
755 760 765
Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn
770 775 780
Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly
785 790 795 800
Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
805 810 815
Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe
820 825 830
Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu
835 840 845
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His
850 855 860
Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
865 870 875 880
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
885 890 895
Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro
900 905 910
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
915 920 925
Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe
930 935 940
Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp
945 950 955 960
Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala
965 970 975
Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr
980 985 990
Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr
995 1000 1005
Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val
1010 1015 1020
Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu
1025 1030 1035
Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu
1040 1045 1050
Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr
1055 1060 1065
Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn
1070 1075 1080
Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp
1085 1090 1095
Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu
1100 1105 1110
Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp
1115 1120 1125
Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu
1130 1135 1140
Asp Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys
1145 1150 1155
Pro Asn Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr
1160 1165 1170
Leu Arg Val Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala
1175 1180 1185
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Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn
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Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg
35 40 45
Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr
50 55 60
Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu
65 70 75 80
Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala
85 90 95
Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro
100 105 110
Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn
115 120 125
Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val
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Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu Asn Gly Asp
340 345 350
Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe
355 360 365
Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro
370 375 380
Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly
385 390 395 400
Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn
405 410 415
Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala
420 425 430
Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser
435 440 445
Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp
450 455 460
Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu Gly Lys Val
465 470 475 480
Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly
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530 535 540
Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp Thr Cys Ala Gln Cys Ala His Phe
545 550 555 560
Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser Ser Cys Pro His Gly Val Leu Gly
565 570 575
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580 585 590
Pro Cys His Glu Asn Cys Thr Gln Gly Cys Lys Gly Pro Glu Leu Gln
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Gly Gly Thr Phe Leu Tyr Trp Arg Gly Arg Arg Ile Gln Asn Lys Arg
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Ala Met Arg Arg Tyr Leu Glu Arg Gly Glu Ser Ile Glu Pro Leu Asp
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Cys Ile Lys Val Ile Glu Asp Lys Ser Gly Arg Gln Ser Phe Gln Ala
725 730 735
Val Thr Asp His Met Leu Ala Ile Gly Ser Leu Asp His Ala His Ile
740 745 750
Val Arg Leu Leu Gly Leu Cys Pro Gly Ser Ser Leu Gln Leu Val Thr
755 760 765
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Gly Ala Leu Gly Pro Gln Leu Leu Leu Asn Trp Gly Val Gln Ile Ala
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805 810 815
Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Lys Ser Pro Ser Gln Val Gln Val Ala
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
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1040 1045 1050
Gly Ser Ser Glu Arg Cys Pro Arg Pro Val Ser Leu His Pro Met
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1085 1090 1095
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Leu Arg Ser Leu Glu Ala Thr Asp Ser Ala Phe Asp Asn Pro Asp
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1310 1315 1320
<210> 8
<211> 624
<212> PRT
<213> 人（Homo Sapiens）
<400> 8
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1 5 10 15
Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys
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Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe
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100 105 110
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Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe
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Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro
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Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly
385 390 395 400
Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn
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Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala
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Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser
435 440 445
Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp
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485 490 495
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500 505 510
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595 600 605
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610 615 620
<210> 9
<211> 1283
<212> PRT
<213> 人（Homo Sapiens）
<400> 9
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1 5 10 15
Leu Glu Gln Gln Tyr Arg Ala Leu Arg Lys Tyr Tyr Glu Asn Cys Glu
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Leu Ser Phe Leu Arg Ser Val Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Gly Thr Lys Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Ala Leu Ala Ile Phe Leu
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100 105 110
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130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
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225 230 235 240
Phe Val Tyr Asn Pro Thr Thr Phe Gln Leu Glu His Asn Phe Asn Ala
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275 280 285
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Cys Pro Lys Ala Cys Asp Gly Ile Gly Thr Gly Ser Leu Met Ser Ala
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Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Lys Phe Ile Asn Cys Thr Lys
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Ile Asn Gly Asn Leu Ile Phe Leu Val Thr Gly Ile His Gly Asp Pro
340 345 350
Tyr Asn Ala Ile Glu Ala Ile Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe Arg
355 360 365
Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Phe Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro Pro
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385 390 395 400
Arg Val Leu Tyr Ser Gly Leu Ser Leu Leu Ile Leu Lys Gln Gln Gly
405 410 415
Ile Thr Ser Leu Gln Phe Gln Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala Gly Asn
420 425 430
Ile Tyr Ile Thr Asp Asn Ser Asn Leu Cys Tyr Tyr His Thr Ile Asn
435 440 445
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450 455 460
Asn Arg Lys Ala Glu Asn Cys Thr Ala Glu Gly Met Val Cys Asn His
465 470 475 480
Leu Cys Ser Ser Asp Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Asp Gln Cys Leu
485 490 495
Ser Cys Arg Arg Phe Ser Arg Gly Arg Ile Cys Ile Glu Ser Cys Asn
500 505 510
Leu Tyr Asp Gly Glu Phe Arg Glu Phe Glu Asn Gly Ser Ile Cys Val
515 520 525
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530 535 540
His Gly Pro Gly Pro Asp Asn Cys Thr Lys Cys Ser His Phe Lys Asp
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Gly Pro Asn Cys Val Glu Lys Cys Pro Asp Gly Leu Gln Gly Ala Asn
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Ile Val Gly Leu Thr Phe Ala Val Tyr Val Arg Arg Lys Ser Ile Lys
645 650 655
Lys Lys Arg Ala Leu Arg Arg Phe Leu Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro
660 665 670
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675 680 685
Lys Glu Thr Glu Leu Lys Arg Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe
690 695 700
Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Trp Val Pro Glu Gly Glu Thr Val Lys
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Ile Pro Val Ala Ile Lys Ile Leu Asn Glu Thr Thr Gly Pro Lys Ala
725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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Leu Ala Ala Glu Phe Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Tyr Leu
945 950 955 960
Val Ile Gln Gly Asp Asp Arg Met Lys Leu Pro Ser Pro Asn Asp Ser
965 970 975
Lys Phe Phe Gln Asn Leu Leu Asp Glu Glu Asp Leu Glu Asp Met Met
980 985 990
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995 1000 1005
Ile Tyr Thr Ser Arg Ala Arg Ile Asp Ser Asn Arg Ser Glu Ile
1010 1015 1020
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Asn Thr Leu Gly Lys Ala Glu Tyr Leu Lys Asn Asn Ile Leu Ser
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<210> 10
<211> 626
<212> PRT
<213> 人（Homo Sapiens）
<400> 10
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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<210> 11
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<213> 人工的
<220>
<223> TtSlyDcas
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<213> 人工的
<220>
<223> TtSlyDcas-HER1
<400> 12
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> TtSlyDcys-HER1
<400> 13
Met Arg Ser Lys Val Gly Gln Asp Lys Val Val Thr Ile Arg Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Gln Val Glu Gly Glu Val Leu Asp Gln Gly Glu Leu Ser Tyr Leu
20 25 30
His Gly His Arg Asn Leu Ile Pro Gly Leu Glu Glu Ala Leu Glu Gly
35 40 45
Arg Glu Glu Gly Glu Ala Phe Gln Ala His Val Pro Ala Glu Lys Ala
50 55 60
Tyr Gly Pro Cys Gly Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Gly Cys Gly Lys Asp Leu Asp Phe
85 90 95
Gln Val Glu Val Val Lys Val Arg Glu Ala Thr Pro Glu Glu Leu Leu
100 105 110
His Gly His Ala His Gly Gly Gly Ser Arg Lys His His His His His
115 120 125
His His His
130
<210> 14
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> TtSlyD(GSG)-HER1
<400> 14
Met Arg Ser Lys Val Gly Gln Asp Lys Val Val Thr Ile Arg Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Gln Val Glu Gly Glu Val Leu Asp Gln Gly Glu Leu Ser Tyr Leu
20 25 30
His Gly His Arg Asn Leu Ile Pro Gly Leu Glu Glu Ala Leu Glu Gly
35 40 45
Arg Glu Glu Gly Glu Ala Phe Gln Ala His Val Pro Ala Glu Lys Ala
50 55 60
Tyr Gly Ser Gly Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln
65 70 75 80
Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Gly Ser Gly Lys Asp Leu Asp Phe
85 90 95
Gln Val Glu Val Val Lys Val Arg Glu Ala Thr Pro Glu Glu Leu Leu
100 105 110
His Gly His Ala His Gly Gly Gly Ser Arg Lys His His His His His
115 120 125
His His His
130
<210> 15
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> TtSlyD(CC)-HER1
<400> 15
Met Arg Ser Lys Val Gly Gln Asp Lys Val Val Thr Ile Arg Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Gln Val Glu Gly Glu Val Leu Asp Gln Gly Glu Leu Ser Tyr Leu
20 25 30
His Gly His Arg Asn Leu Ile Pro Gly Leu Glu Glu Ala Leu Glu Gly
35 40 45
Arg Glu Glu Gly Glu Ala Phe Gln Ala His Val Pro Ala Glu Lys Ala
50 55 60
Tyr Gly Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met
65 70 75 80
Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Cys Gly Lys Asp Leu Asp Phe Gln Val
85 90 95
Glu Val Val Lys Val Arg Glu Ala Thr Pro Glu Glu Leu Leu His Gly
100 105 110
His Ala His Gly Gly Gly Ser Arg Lys His His His His His His His
115 120 125
His
<210> 16
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> TtSlyD(SS)-HER1
<400> 16
Met Arg Ser Lys Val Gly Gln Asp Lys Val Val Thr Ile Arg Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Gln Val Glu Gly Glu Val Leu Asp Gln Gly Glu Leu Ser Tyr Leu
20 25 30
His Gly His Arg Asn Leu Ile Pro Gly Leu Glu Glu Ala Leu Glu Gly
35 40 45
Arg Glu Glu Gly Glu Ala Phe Gln Ala His Val Pro Ala Glu Lys Ala
50 55 60
Tyr Gly Ser Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met
65 70 75 80
Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Ser Gly Lys Asp Leu Asp Phe Gln Val
85 90 95
Glu Val Val Lys Val Arg Glu Ala Thr Pro Glu Glu Leu Leu His Gly
100 105 110
His Ala His Gly Gly Gly Ser Arg Lys His His His His His His His
115 120 125
His
<210> 17
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> TgSlyDdeltaIF
<400> 17
Met Lys Val Glu Arg Gly Asp Phe Val Leu Phe Asn Tyr Val Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Glu Asn Gly Glu Val Phe Asp Thr Ser Tyr Glu Ser Val Ala Arg
20 25 30
Glu Gln Gly Ile Phe Val Glu Glu Arg Glu Tyr Ser Pro Ile Gly Val
35 40 45
Thr Val Gly Ala Gly Glu Ile Ile Pro Gly Ile Glu Glu Ala Leu Leu
50 55 60
Gly Met Glu Leu Gly Glu Lys Lys Glu Val Val Val Pro Pro Glu Lys
65 70 75 80
Gly Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Ala Ile Phe Glu Ile Glu Val Val Glu Ile Lys Lys Ala Gly Glu Ala
100 105 110
Leu Glu His His His His His His Leu Glu His His His His His His
115 120 125
<210> 18
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> TgSlyDcys-HER1
<400> 18
Met Arg Gly Ser Lys Val Glu Arg Gly Asp Phe Val Leu Phe Asn Tyr
1 5 10 15
Val Gly Arg Tyr Glu Asn Gly Glu Val Phe Asp Thr Ser Tyr Glu Ser
20 25 30
Val Ala Arg Glu Gln Gly Ile Phe Val Glu Glu Arg Glu Tyr Ser Pro
35 40 45
Ile Gly Val Thr Val Gly Ala Gly Glu Ile Ile Pro Gly Ile Glu Glu
50 55 60
Ala Leu Leu Gly Met Glu Leu Gly Glu Lys Lys Glu Val Val Val Pro
65 70 75 80
Pro Glu Lys Gly Tyr Gly Met Pro Cys Gly Pro Pro Leu Met Leu Tyr
85 90 95
Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Gly Cys Ala
100 105 110
Gly Lys Thr Ala Ile Phe Glu Ile Glu Val Val Glu Ile Lys Lys Ala
115 120 125
Gly Glu Ala Gly Gly Gly Ser His His His His His His His His
130 135 140
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人（Homo Sapiens）
<400> 19
Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly
1 5 10
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人（Homo Sapiens）
<400> 20
Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln
1 5
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人（Homo Sapiens）
<400> 21
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 22
<211> 105
<212> PRT
<213> 人（Homo Sapiens）
<400> 22
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 23
<211> 330
<212> PRT
<213> 人（Homo Sapiens）
<400> 23
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 24
<211> 330
<212> PRT
<213> 人（Homo Sapiens）
<400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 25
<211> 330
<212> PRT
<213> 人（Homo Sapiens）
<400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 26
<211> 327
<212> PRT
<213> 人（Homo Sapiens）
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325

Claims (8)

1.一种分离的结合人HER1的抗体，其中该抗体在多肽SEQ ID NO: 13 (TtSlyDcys-Her1)中包含的氨基酸序列PPLMLYNPTTYQMDVNPEGK (SEQ ID NO: 1)内结合， 其中该抗体与HER2，HER3和HER4没有交叉反应性， 且其中该抗体包含 i)保藏的抗体MAK <HER1-DIB>M-50.097.14 (DSM ACC3240)的(a) HVR-H1；(b) HVR-H2；(c) HVR-H3；(d) HVR-L1；(e)HVR-L2；和(f) HVR-L3；或 ii)保藏的抗体MAK <HER1-DIB> M-50.110.23 (DSM ACC3241)的(a) HVR-H1；(b) HVR-H2；(c) HVR-H3；(d) HVR-L1；(e) HVR-L2；和(f) HVR-L3， 其中所有HVR是依照Kabat确定的，而且指存在于氨基酸残基24-34（L1），50-56（L2），89-97（L3），31-35b（H1），50-65（H2），和95-102（H3）的CDR。
2.权利要求1的抗体，其为人源化抗体或嵌合抗体。
3.权利要求1或2的抗体，其为全长IgG1抗体或IgG4抗体。
4.权利要求1或2的抗体，其为Fab片段。
5.一种免疫缀合物，其包含权利要求1或2的抗体和细胞毒剂。
6.一种药物配制剂，其包含权利要求1或2的抗体或权利要求5的免疫缀合物，和药学可接受载剂。
7.权利要求1或2的抗体或权利要求5的免疫缀合物制备用于治疗癌症的药物的用途。
8.分离的核酸，其编码权利要求1或2的抗体。
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