CN103620031A - 呈递融合多肽的氨基酸序列及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明中报道式(I)的融合多肽:NH2-S2-X1-S1-COOH(式I),其中X1包含随机的氨基酸序列,或包含衍生自第一多肽的氨基酸序列;S2和S1是衍生自第二多肽的非重叠氨基酸序列;且-表示肽键;其中该第二多肽是具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性(PPI酶活性)的多肽,或是衍生自FKBP折叠结构域家族的多肽,其中插入X1来取代该第二多肽的插入flap结构域。
Description
本文报道包含一种或多种肽基脯氨酰顺/反异构酶或FKBP家族成员的一个或多个片段的融合多肽,及其在用于抗体筛选/选择、用于表位定位的方法中的用途,以及其在产生特异性结合该融合多肽呈递的免疫原性肽或二级结构的抗体中作为免疫原的用途。
背景技术
近年来,治疗性抗体的产生稳定增长,治疗性抗体可能将在不久的将来成为可用于治疗多种疾病的疗法中最大的一组。治疗性抗体的影响源自其特异性,如特异性靶标识别和结合功能。
可以从用免疫原免疫的实验动物获得抗体。免疫原在大多数情况下是多肽或多肽的片段。为了以足够的量和纯度提供免疫原,可以利用重组产生的免疫原。
通常,原核和真核细胞可以用于重组产生多肽。重组多肽可以以可溶性形式或作为沉淀(包含体)获得。在层析纯化之前,必须增溶包含在包含体中的不溶性多肽。
通常,免疫原是合成的或肽类的或重组产生的或融合或嵌合的或支持物缀合的多肽。对于免疫,免疫原可以单独施用或与佐剂(如弗氏佐剂)组合施用。
Knappe,T.A.等(J.Mol.Biol.368(2007)1458-1468)报道了可以用结构上相关的大肠杆菌(E.coli)蛋白伴侣SlyD的IF结构域来取代FKBP12的Flap区。与分离的多肽相比,嵌合的FKBP12-SlyD融合多肽具有提高200倍的肽基脯氨酰顺/反异构酶活性。
大肠杆菌SlyD和FKBP12(野生型及突变体C23A和C23S)可以以可溶性形式在大肠杆菌中高产量重组产生(Standaert,R.F.等,Nature346(1990)671-674)。
衍生自嗜热生物的FKBP和大肠杆菌SlyD可以在融合多肽在大肠杆菌中的重组表达中用作蛋白伴侣(Ideno,A.等,Appl.Microbiol.Biotechnol.64(2004)99-105)。大肠杆菌SlyD和FKBP12多肽是可逆折叠的多肽(Scholz,C.等,J.Biol.Chem.271(1996)12703-12707)。
FKBP12多肽的氨基酸序列在60位处包含单个色氨酸残基。因此,可以简单地通过分析色氨酸荧光来分析FKBP12突变体的结构完整性(DeCenzo,M.T.等,Protein Eng.9(1996)173-180)。可以通过测定保留的旋转异构酶活性来进行FKBP12突变体保留的催化活性的测试(Brecht,S.等,Neuroscience120(2003)1037-1048;Schories,B.等,J.Pept.Sci.13(2007)475-480;Timerman,A.P.等,J.Biol.Chem.270(1995)2451-2459)。还可能通过测定FK506或纳巴霉素结合来测定FKBP12突变体的结构完整性(DeCenzo,M.T.等,Protein Eng.9(1996)173-180)。
McNamara,A.等(J.Org.Chem.66(2001)4585-4594)报道了通过两个C(α)位间的脂肪族连接限制的肽:i,(i+4)-连接肽的设计、合成及意料之外的构象特性。
Suzuki等(Suzuki,R.等,J.Mol.Biol.328(2003)1149-1160)报道了具有肽基脯氨酰顺/反异构酶和蛋白伴侣样活性的双功能的古细菌(archaic)FKBP的三维溶液结构。EP1516928中报道了表达载体、宿主、融合多肽、用于产生融合多肽的方法和用于产生蛋白质的方法。Knappe,T.A.等报道了蛋白伴侣结构域的插入将FKBP12转化为有力的蛋白质折叠催化剂(J.Mol.Biol.368(2007)1458-1468)。WO2007/077008中报道了具有优良的蛋白伴侣活性和折叠活性的嵌合融合多肽。在WO03/000878中,报道了FKBP蛋白伴侣作为表达工具的用途。在EP1621555中,报道了免疫原、用于免疫学用途的组合物及用其产生抗体的方法。Rebuzzini,G.(在Milano-Bicocca大学(意大利)的博士研究(2009))报道了应用于化学发光免疫测定的丙型肝炎病毒NS3解旋酶结构域的研究。
在WO2007/077008中,报道了具有优良的蛋白伴侣活性和折叠活性的嵌合融合蛋白质。Knappe等(Knappe,T.A.等,J.Mol.Biol.368(2007)1458-1468)报道了通过插入蛋白伴侣结构域来将FKBP12转化为有力的蛋白质折叠催化剂。
发明概述
本文中报道的融合多肽是这样的融合多肽,其包含:i)衍生自具有PPI酶活性或隶属于FKBP家族的一种(即相同)或不同多肽的一个或多个部分;和ii)插入其间的免疫原性多肽。
本文中报道的融合多肽可以用于免疫动物来产生特异性结合插入衍生自具有PPI酶活性或隶属于FKBP家族的一种或多种多肽的一个或多个部分的免疫原性多肽的抗体。
本文中报道的一个方面是式I的融合多肽
NH2-S2-X1-S1-COOH(式I)
其中
X1包含随机的氨基酸序列,或包含衍生自第一多肽的氨基酸序列;
S2和S1是衍生自第二多肽的非重叠氨基酸序列;且
-表示肽键;
其中该第二多肽是具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性(PPI酶活性)的多肽,或是衍生自FKBP结构域家族的多肽。
已发现,可以用本文中报道的融合多肽来获得特异性结合(天然存在的)氨基酸序列的内部(所谓的隐藏或埋藏)表位的抗体。内部表位在经典的免疫流程中不可接近,因为这些表位例如仅在抗原性多肽(如受体)活化和伴随的构象变化时可接近。此外,可以获得特异性结合免疫原性多肽的抗体,该免疫原性多肽衍生自否则将难以以足够的量或质量提供的结构。
本文中报道的融合多肽是嵌合、重组多肽,其可以例如在用于抗体筛选/选择或用于表位定位的方法中用于肽、二级和三级结构展示,以及用作用于产生特异性结合所呈递的抗原性氨基酸序列或二级结构的抗体的免疫原。本文中报道的多肽可以重组产生,热力学稳定,是单体,且在水溶液中可溶。
本文中报道的一个方面是式II的融合多肽
NH2-S4-X2-S3-S2-X1-S1-S0-COOH(式II)
其中
X1包含随机的氨基酸序列,或包含衍生自第一多肽的氨基酸序列;
S2和S1是衍生自第二多肽的非重叠氨基酸序列;
S3和S0缺乏,或是衍生自第三多肽的非重叠氨基酸序列;
S4缺乏,或是衍生自第四多肽的氨基酸序列;
X2缺乏,或是肽接头序列;且
-表示肽键;
其中该第二多肽和该第三多肽和该第四多肽相互不同,且是具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性(PPI酶活性)的多肽,或是衍生自FKBP结构域家族的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性或衍生自FKBP结构域家族的第二多肽是SlyD。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是来自嗜热生物的多肽。
在一个实施方案中,该嗜热生物是嗜热菌。在一个实施方案中,该嗜热菌来自栖热菌科(Thermaceae)。在一个实施方案中,该嗜热生物是嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)。
在一个实施方案中,该嗜热生物是嗜热古细菌(Archaea)。在一个实施方案中,该嗜热古细菌是超嗜热古细菌。在一个实施方案中,该嗜热生物来自热球菌纲(Thermococci)。在一个实施方案中,该嗜热生物是Thermococcus gammatolerans。
在一个实施方案中,该嗜热生物具有至少60℃的最适生长温度。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该免疫原性序列包含在X1氨基酸序列中。在一个实施方案中,该X1氨基酸序列包含免疫原性序列,及衍生自具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性(PPI酶活性)的其他多肽的一个或多个部分或衍生自来自FKBP折叠结构域家族的其他多肽的一个或多个部分,该其他多肽由此不同于第二多肽。
插入X1的氨基酸序列来取代第二多肽的插入flap结构域(IF结构域)。因此,如果X1与IF结构域相同,即具有IF结构域的氨基酸序列,则融合多肽S2-X1-S1与天然存在的第二多肽的对应部分相同。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,衍生自第二多肽的S2和S1氨基酸序列通过野生型(天然存在的)第二多肽中的IF结构域相互连接(直接)。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,插入X1来取代第二多肽的插入flap结构域(IF结构域)。
本文中报道的一个方面是在排除X1测定时,与式I的多肽具有至少70%氨基酸序列同一性的多肽,或是在排除X1、X2和缺失的序列测定时,与式II的多肽具有至少70%氨基酸序列同一性的多肽。在一个实施方案中,该多肽具有至少80%氨基酸序列同一性。在一个实施方案中,该多肽具有至少90%氨基酸序列同一性。在一个实施方案中,该多肽具有至少95%氨基酸序列同一性。在一个实施方案中,该多肽具有至少98%氨基酸序列同一性。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,X1包含对应于隐藏表位的氨基酸序列。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,X1具有从4至约500个氨基酸残基的氨基酸序列长度。在一个实施方案中,X1具有从5至约100个氨基酸残基的氨基酸序列长度。在一个实施方案中,X1具有约7至约60个氨基酸残基的氨基酸序列长度。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,X1的至少一个氨基酸残基包含翻译后修饰。在一个实施方案中,X1的一个或两个或三个或四个或五个或六个或七个或八个或九个或十个氨基酸残基包含翻译后修饰。
在一个实施方案中,该融合多肽按照下式
NH2-S3-S2-X1-S1-S0-COOH
其中
X1包含随机的氨基酸序列,或包含衍生自第一多肽的氨基酸序列,
S2和S1是衍生自第二多肽的非重叠氨基酸序列,
S3和S0缺失,或是衍生自第三多肽的非重叠氨基酸序列,且
-表示肽键,
其中该第二多肽和该第三多肽相互不同,且是具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性(PPI酶活性)的多肽,或是衍生自FKBP结构域家族的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽和该第三多肽和该第四多肽来自不同的物种。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是人多肽,或植物多肽,或细菌多肽,或古细菌多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第三多肽是人多肽,或细菌多肽,或古细菌多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第四多肽是细菌多肽,或古细菌多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第四多肽是细菌多肽。在一个实施方案中,该细菌多肽是来自嗜热菌的多肽。在一个实施方案中,该嗜热生物来自栖热菌科。在一个实施方案中,该嗜热生物是嗜热栖热菌。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第四多肽是古细菌多肽。在一个实施方案中,该古细菌多肽是来自超嗜热古细菌的多肽。在一个实施方案中,该嗜热生物来自热球菌纲。在一个实施方案中,该古细菌生物是Thermococcus gammatolerans。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该嗜热生物具有至少60℃的最适生长温度。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第一多肽是人多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,X1是随机氨基酸序列,或是衍生自第一多肽的氨基酸序列,其中在N端加上二肽GS,在C端加上三肽GSS。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,X1是式III的多肽
XaXbXcXd-X0-XeXfXgXh(式III)
其中X0是随机氨基酸序列或第一多肽的氨基酸序列;且
其中Xa至Xh中的每一个表示(天然存在的)氨基酸残基,且Xa-h中的任一个可以独立地存在或缺乏。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,X1是选自式IV至式XIII(见下)的多肽
GS-X0-GSS (式IV);
AGS-X0-GSS (式V);
CG-X0-GC (式VI);
C-X0-GC (式VII);
G-X0-G (式VIII);
S-X0-GSS (式IX);
GG-X0-GG (式X);
G-X0-TGG (式XI);
GGGS-X0-GGGS (式XII);
GGNP-X0-GPT (式XIII);
其中X0是随机氨基酸序列,或是衍生自第一多肽的氨基酸序列。
在一个实施方案中,X0在其N端和C端由单个(单一)半胱氨酸残基位于侧翼。
在一个实施方案中,X1包含N端氨基酸残基内的半胱氨酸残基和C端氨基酸残基内的半胱氨酸残基。在一个实施方案中,该N端或C端氨基酸残基是八个末端残基。在一个实施方案中,X1在其N端包含一个半胱氨酸残基,在其C端包含一个半胱氨酸残基。
在一个实施方案中,X1是环状受限的(circularly constrained)多肽。
在一个实施方案中,X1是环状多肽。
在一个实施方案中,X1的半胱氨酸残基具有4.3埃至6.5埃的α碳原子距离。在一个实施方案中,X1的半胱氨酸残基具有4.5埃的α碳距离。在一个实施方案中,X1的半胱氨酸残基具有5.6埃的平均α碳原子距离。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,X1或X0具有从4至约500个氨基酸残基的长度。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,X2是从约10至约30个氨基酸残基的接头氨基酸序列。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是拟南芥(Arabidopsis thaliana)FKBP13(SEQ ID NO:01),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,S4、X2、S3和S0缺乏。在一个实施方案中,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:02(DRGAGC),S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:03(CLIPPASV),S4、X2、S3和S0缺乏。在一个实施方案中,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:04,S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:05,S4、X2、S3和S0缺乏,X1是式IV(GS-X0-GSS)的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是人FKBP12(SEQ ID NO:06),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,S4、X2、S3和S0缺乏。在一个实施方案中,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:07,S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:08(LVFDVELLKLE),S4、X2、S3和S0缺乏,X1是式III(GS-X0-GSS)或式VI((P)CG-X0-GC)的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是嗜热栖热菌SlyD(SEQ ID NO:09),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,S4、X2、S3和S0缺乏。在一个实施方案中,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:10,S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:11,S4、X2、S3和S0缺乏,X1是式V(AGS-X0-GSS)或式VI((P)CG-X0-GC)的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是拟南芥FKBP13(SEQ ID NO:01),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第三多肽是人FKBP12(SEQ ID NO:06),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,S4和X2缺乏。在一个实施方案中,S3具有SEQ ID NO:07的氨基酸序列,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:02(DRGAGC),S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:03(CLIPPASV),S0具有氨基酸序列SEQ ID NO:08(LVFDVELLKLE),S4和X2缺乏,X1是式IV(GS-X0-GSS)或式VI((P)CG-X0-GC)的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是拟南芥FKBP13(SEQ ID NO:01),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第三多肽是嗜热栖热菌SlyD(SEQ ID NO:09),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,S4和X2缺乏。在一个实施方案中,S3具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:02(DRGAGC),S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:03(CLIPPASV),S0具有氨基酸序列SEQ ID NO:11(LVFDVELLKLE),S4和X2缺乏,X1是式IV(GS-X0-GSS)或式VI((P)CG-X0-GC)的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是拟南芥FKBP13(SEQ ID NO:01),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第三多肽是人FKBP12(SEQ ID NO:06),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,S4和X2缺乏。在一个实施方案中,S3具有SEQ ID NO:07的氨基酸序列,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:02(DRGAGC),S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:03(CLIPPASV),S0具有氨基酸序列SEQ ID NO:08(LVFDVELLKLE),S4和X2缺乏,X1是式IV(GS-X0-GSS)或式VI((P)CG-X0-GC)的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是拟南芥FKBP13(SEQ ID NO:01),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第三多肽是人FKBP12(SEQ ID NO:06),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第四多肽是大肠杆菌SlyD(SEQ ID NO:12),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽。在一个实施方案中,S4具有氨基酸序列SEQ ID NO:12,X2具有氨基酸序列SEQ ID NO:13,S3具有SEQ ID NO:07的氨基酸序列,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:02(DRGAGC),S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:03(CLIPPASV),S0具有氨基酸序列SEQ ID NO:08(LVFDVELLKLE),X1是式IV(GS-X0-GSS)或式VI((P)CG-X0-GC)的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是拟南芥FKBP13(SEQ ID NO:01),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第三多肽是嗜热栖热菌SlyD(SEQ ID NO:09),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第四多肽是大肠杆菌SlyD(SEQ ID NO:12),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽。在一个实施方案中,S4具有氨基酸序列SEQ ID NO:12,X2具有氨基酸序列SEQID NO:13,S3具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列,S2具有氨基酸序列SEQID NO:02(DRGAGC),S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:03(CLIPPASV),S0具有氨基酸序列SEQ ID NO:11(LVFDVELLKLE),X1是式IV(GS-X0-GSS)或式VI((P)CG-X0-GC)的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是嗜热栖热菌SlyD(SEQ ID NO:09),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第四多肽是大肠杆菌SlyD(SEQ ID NO:12),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,S3和S0缺乏。在一个实施方案中,S4具有氨基酸序列SEQ ID NO:12,X2具有氨基酸序列SEQ ID NO:13,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:10,S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:11,S3和S0缺乏,X1是式V(AGS-X0-GSS)或式VI((P)CG-X0-GC)的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是拟南芥FKBP13(SEQ ID NO:01),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第四多肽是大肠杆菌SlyD(SEQ ID NO:12),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,S3和S0缺乏。在一个实施方案中,S4具有氨基酸序列SEQ ID NO:12,X2具有氨基酸序列SEQ ID NO:13,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:04,S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:05,S3和S0缺乏,X1是式IV(GS-X0-GSS)或式VI((P)CG-X0-GC)的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是Thermococcus gammatolerans SlyD(SEQ ID NO:106),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,S4、X2、S3和S0缺乏。在一个实施方案中,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:107,S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:108,S4、X2、S3和S0缺乏,X1是选自式IV至式XIII的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是拟南芥FKBP13(SEQ ID NO:01),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第三多肽是Thermococcus gammatolerans SlyD(SEQ ID NO:106),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,S4和X2缺乏。在一个实施方案中,S3具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:02(DRGAGC),S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:03(CLIPPASV),S0具有氨基酸序列SEQ ID NO:108,S4和X2缺乏,X1是选自式IV至式XIII的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是拟南芥FKBP13(SEQ ID NO:01),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第三多肽是人FKBP12(SEQ ID NO:06),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第四多肽是Thermococcus gammatolerans SlyD(SEQ ID NO:106),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽。在一个实施方案中,S4具有氨基酸序列SEQ ID NO:106,X2具有氨基酸序列SEQ ID NO:13,S3具有SEQ ID NO:07的氨基酸序列,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:02(DRGAGC),S1具有氨基酸序列SEQID NO:03(CLIPPASV),S0具有氨基酸序列SEQ ID NO:08(LVFDVELLKLE),X1是选自式IV至式XIII的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是拟南芥FKBP13(SEQ ID NO:01),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第三多肽是Thermococcus gammatolerans SlyD(SEQ ID NO:106),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第四多肽是大肠杆菌SlyD(SEQ ID NO:12),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽。在具体实施方案中,S4具有氨基酸序列SEQ ID NO:12,X2具有氨基酸序列SEQ ID NO:13,S3具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:02(DRGAGC),S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:03(CLIPPASV),S0具有氨基酸序列SEQ ID NO:108,X1是选自式IV至式XIII的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是Thermococcus gammatolerans SlyD(SEQ ID NO:106),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第四多肽是大肠杆菌SlyD(SEQ ID NO:12),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,S3和S0缺乏。在一个实施方案中,S4具有氨基酸序列SEQ ID NO:12,X2具有氨基酸序列SEQ ID NO:13,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:107,S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:108,S3和S0缺乏,X1是选自式IV至式XIII的多肽。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,该第二多肽是拟南芥FKBP13(SEQ ID NO:01),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,该第四多肽是Thermococcus gammatolerans SlyD(SEQ ID NO:106),或具有至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%,或至少98%氨基酸序列同一性的多肽,S3和S0缺乏。在一个实施方案中,S4具有氨基酸序列SEQ ID NO:107,X2具有氨基酸序列SEQ ID NO:13,S2具有氨基酸序列SEQ ID NO:04,S1具有氨基酸序列SEQ ID NO:05,S3和S0缺乏,X1是选自式IV至式XIII的多肽。
本文中报道的方面的融合多肽具有许多应用,因为它们可以例如在大肠杆菌中以良好的产量重组产生。例如,该融合多肽可以用于呈递用于免疫的氨基酸序列、抗体产生、抗体筛选、抗体表位定位或免疫组织化学筛选。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,X2具有氨基酸序列GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(SE Q ID NO:14)。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,X1具有氨基酸序列GGGSGGNPX0GPTGGGS(SEQ ID NO:32),其中X0是从4至85个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一个实施方案中,用包含大肠杆菌SlyD和人FKBP12氨基酸序列的融合多肽来呈递非稳定构象的多肽。
在一个实施方案中,用包含人FKBP12和拟南芥FKBP13,或仅嗜热栖热菌SlyD,或嗜热栖热菌SlyD和拟南芥FKBP13,或仅Thermococcusgammatolerans SlyD,或Thermococcus gammatolerans SlyD和拟南芥FKBP13氨基酸序列的融合多肽来呈递稳定的二级结构。
本文中报道的一个方面是本文中报道的融合多肽在在动物中引发针对X1或X0的免疫反应中的用途。
本文中报道的一个方面是用于在动物中引发针对多肽的免疫反应的方法,其包括对该动物施用本文中报道的融合多肽至少一次的步骤,X0由此是免疫原性氨基酸序列。
本文中报道的一个方面是用于获得编码特异性结合靶抗原的抗体的核酸的方法,其包括以下步骤:
a)对动物施用本文中报道的融合多肽至少一次,X1的氨基酸序列由此包含该靶抗原的氨基酸序列;
b)最后一次施用该多肽后三至十天从该动物回收产生特异性结合该靶抗原的抗体的B细胞;
c)从该B细胞获得编码特异性结合靶抗原的抗体的核酸。
本文中报道的一个方面是用于产生特异性结合靶抗原的抗体的方法,其包括以下步骤:
a)对动物施用本文中报道的融合多肽至少一次,X1的氨基酸序列由此包含该靶抗原的氨基酸序列;
b)最后一次施用该多肽后三至十天从该动物回收产生特异性结合该靶抗原的抗体的B细胞;
c)可选地从该B细胞获得编码特异性结合该靶抗原的抗体的核酸;和
d)培养包含编码特异性结合该靶抗原的抗体的核酸的细胞,并从该细胞或培养基回收该抗体,从而产生特异性结合靶抗原的抗体。
本文中报道的一个方面是用于产生特异性结合靶抗原的抗体的方法,其包括以下步骤:
a)施用本文中报道的融合多肽后从实验动物回收产生特异性结合具有X0的氨基酸序列的靶抗原的抗体的B细胞;和
b)培养包含编码特异性结合X0的氨基酸序列的抗体的核酸的细胞,并从该细胞或培养基回收该抗体,从而产生特异性结合靶抗原的抗体。
本文中报道的一个方面是本文中报道的融合多肽在表位定位中的用途,X1的氨基酸序列由此包含该表位。
本文中报道的一个方面是用于选择特异性结合靶抗原的抗体的方法,其包括以下步骤:
a)测定多种抗体与靶抗原的结合亲和力,本文中报道的融合多肽的X1的氨基酸序列由此包含该靶抗原的氨基酸序列;
b)选择具有高于预定阈值水平的表观复合物稳定性的抗体。
本文中报道的一个方面是用于选择适合用于靶多肽的免疫组织化学分析的抗体的方法,其包括以下步骤:
a)测定多种抗体的结合动力学;
c)选择具有高于预定阈值水平的表观复合物稳定性的抗体。
本文中报道的一个方面是用于定位抗体与靶氨基酸序列的结合部位的方法,其包括以下步骤:
a)使固定了本文中报道的融合多肽的固体支持物与抗体接触,X1的氨基酸序列由此包含该靶氨基酸序列;
b)测定该抗体与本文中报道的融合多肽的动力学特性;
c)选择具有高于预定阈值水平的表观复合物稳定性的抗体。
本文中报道的一个方面是本文中报道的融合多肽在测定结构-功能关系中的用途,X1的氨基酸序列由此包含将测定其结构-功能关系的多肽。
本文中报道的一个方面是本文中报道的融合多肽在以其正确的二级和/或三级结构呈递多肽中的用途,X1的氨基酸序列由此包含该多肽。
本文中报道的一个方面是本文中报道的融合多肽在筛选方法中的用途。
在一个实施方案中,该筛选方法是用于鉴定或选择特异性结合X1的分子的筛选方法。在一个实施方案中,该分子是小分子或多肽。在一个实施方案中,该多肽是抗体,或抗体片段,或抗体融合多肽。
本文中报道的一个方面是本文中报道的融合多肽在核糖体展示中的用途。
本文中报道的一个方面是本文中报道的融合多肽在噬菌体展示中的用途。
本文中报道的一个方面是本文中报道的融合多肽在细胞表面展示中的用途。在一个实施方案中,该细胞是原核细胞。在一个实施方案中,该原核细胞是细菌细胞。在一个实施方案中,该细胞是真核细胞。在一个实施方案中,该真核细胞是CHO细胞,或HEK细胞,或BHK细胞,或Sp2/0细胞,或NS0细胞,或酵母细胞。
本文中报道的一个方面是通过本文中报道的方法产生的抗体。
本文中报道的一个方面是包含本文中报道的融合多肽和可药用载体的药物制剂。
本文中报道的一个方面是诊断制剂,其包含与可检测标记缀合的本文中报道的融合多肽。
本文中报道的一个方面是本文中报道的融合多肽在制备药物中的用途。
本文中报道的一个方面是本文中报道的融合多肽在治疗疾病中的用途。
本文中报道的一个方面是处理个体的方法,其包括对该个体施用有效量的本文中报道的融合多肽。
发明详述
通常,插入例如包含在X1的氨基酸序列中的抗原或抗原性或免疫原性氨基酸序列来取代本文中报道的融合多肽中第二多肽的SlyD部分的插入flap结构域(IF结构域)。
在本文中报道的所有方面的一个实施方案中,X0选自天然存在的多肽的片段,或是随机氨基酸序列。在一个实施方案中,该天然存在的多肽是人多肽。
包含X1氨基酸序列的融合多肽可以在一方面用于免疫动物来产生抗体,在另一方面用于筛选通过随机化或在免疫后获得的抗体文库。还可以用任意筛选和展示方法来鉴定特异性结合剂,如核糖体展示、噬菌体展示、细胞表面展示、病毒展示及本文中报道的基于融合多肽的展示。
嗜热栖热菌SlyD以及Thermococcus gammadurans SlyD是甚至在用外源氨基酸插入X1来取代其Flap结构域时也具有可逆折叠的能力的高度稳定的蛋白质。这些分子可以基本上按照Mattheakis,L.C.等Proc.Natl.Acad.Sci USA91(1994)9022-9026的方法用于核糖体展示来在嗜热栖热菌SlyD或Thermococcus gammadurans SlyD的框架中展示多肽序列X1。所谓的三元复合物由附着于编码(3)核糖体呈递的融合多肽的遗传信息的(2)mRNA的(1)核糖体亚基组成。
三元复合物可以用于针对特异性识别X1氨基酸序列的抗体或抗体片段的淘选方法。
本文中报道的融合多肽可以用于筛选/选择通过用本文中报道的融合多肽免疫动物获得的抗体,其中该用于免疫动物的融合多肽和该用于筛选所获得的抗体的融合多肽具有相同的X1氨基酸序列,而其余氨基酸序列不同。这允许去选择特异性结合支架而不结合免疫原性肽X1的抗体。
在一个实施方案中,该用于免疫的融合多肽和该用于筛选的融合多肽具有小于20%的序列同一性。在一个实施方案中,该序列同一性小于10%。
本文中作为一个方面报道融合多肽,在其N端包含嗜热栖热菌SlyD多肽的N端片段(SEQ ID NO:10),即嗜热栖热菌SlyD多肽的残基2至64(以M作为SEQ ID NO:09的残基1开始编号)。然后,插入包含在X1中的免疫原性序列。该融合多肽的C端由嗜热栖热菌SlyD多肽的氨基酸残基123至149(SEQ ID NO:11)及具有氨基酸序列GSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:16)的可选纯化标记形成。
本文中作为一个方面报道融合多肽,在其N端包含Thermococcusgammatolerans SlyD多肽的N端片段(SEQ ID NO:106),即Thermococcusgammatolerans SlyD多肽的残基2至85(以M作为SEQ ID NO:107的残基1开始编号)。然后,插入包含在X1中的免疫原性序列。该融合多肽的C端由Thermococcus gammatolerans SlyD多肽的氨基酸残基137至156(SEQ ID NO:108)及具有氨基酸序列GSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:16)的纯化标记形成。
本文中作为一个方面报道融合多肽,在其N端包含大肠杆菌SlyD多肽的N端片段,即大肠杆菌SlyD多肽的残基1至165(以M作为残基1开始编号)。然后,插入接头,该接头将大肠杆菌SlyD片段的C端与人FKBP12多肽的N端的片段,即人FKBP12多肽的残基2至84(以M作为残基1开始编号)连接。可以然后,插入5至500个氨基酸残基的氨基酸序列。该多肽的C端由人FKBP12多肽的氨基酸残基97至108及具有氨基酸序列GSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:16)的可选纯化标记形成。
本文中报道的一个方面是本文中报道的融合多肽的变体,其就亲本多肽而言具有至少70%氨基酸序列同一性,且与亲本多肽相比具有提高的熔点。在一个实施方案中,该熔点是至少55℃。在一个实施方案中,该熔点是至少60℃。在一个实施方案中,该熔点是至少65℃。
术语“衍生自多肽”指存在各多肽的全长氨基酸序列的片段,该片段由此与该全长多肽中的各序列具有至少70%氨基酸序列同一性。
X1和X0氨基酸序列分别可以自由地选择,只要它的长度至少为5个氨基酸残基。例如,插入序列可以衍生自以下,即可以包含以下的片段:白细胞标记,CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD7,CD8,CD11a、b、c,CD13、CD14,CD18,CD19,CD20,CD22,CD23,CD27及其配体,CD28及其配体B7.1、B7.2、B7.3,CD29及其配体,CD30及其配体,CD40及其配体gp39,CD44,CD45及同种型,CDw52(Campath抗原),CD56,CD58,CD69,CD72,CTLA-4,LFA-1和TCR;组织相容性抗原,MHCI或II类、Lewis Y抗原、SLex、SLey、SLea和SLeb;整联蛋白VLA-1、VLA-2、VLA-3、VLA-4、VLA-5、VLA-6、αVβ3、和LFA-1、Mac-1、和pl50,95、αVβ1、gpIIbIIIa、αRβ3、α6β4、αVβ5、αVβ6和αV627;选择蛋白,L-选择蛋白、P-选择蛋白和E-选择蛋白,及其反受体VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2和LFA-3;白细胞介素,IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14和IL-15;白细胞介素受体,选自IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-8R、IL-9R、IL-10R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-14R和IL-15R;趋化因子,选自PF4、RANTES、MIP1α、MCP1、NAP-2、Groα、Groβ和IL-8;生长因子,选自TNFα、TGFβ、TSH、VEGF/VPF、VEGFA、VEGFB、VEGF111、VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、PTHrP、EGF家族、FGF、PDGF家族、内皮素、Fibrosin(FSF-1)、人层粘连蛋白和胃泌素释放肽(GRP)、PLGF、HGH、HGHR;生长因子受体,选自TNFαR、RGFβR、TSHR、VEGFR/VPFR、FGFR、EGFR、PTHrPR、PDGFR家族、EPO-R、GCSF-R和其他造血受体;干扰素受体,选自IFNCαR、IFNβR和IFNλR;Ig及其配体,选自IgE、FcγRI和FcγRII;肿瘤抗原,选自her2-neu、黏蛋白、CEA和内皮唾液酸蛋白;变应原,选自屋尘螨抗原、lol p1(草)抗原和漆儿茶酚;病毒多肽,选自CMV糖蛋白B、H和gCIII,HIV-1包膜糖蛋白,RSV包膜糖蛋白,HSV包膜糖蛋白,HPV包膜糖蛋白,肝炎病毒家族表面抗原;毒素,选自假单胞菌内毒素和骨桥蛋白/尿桥蛋白、蛇毒、蜘蛛毒和蜂毒食鱼螺毒素;血液因子,选自补体C3b、补体C4a、补体C4b-9、Rh因子、纤维蛋白原、纤维蛋白和髓鞘相关生长抑制剂;及酶,选自胆固醇酯转移多肽、膜结合基质金属蛋白酶和谷氨酸脱羧酶(GAD)。
术语“肽接头序列”指天然和/或合成来源的肽接头。它们由线性氨基酸链组成,其中20种天然存在的氨基酸是单体构件。该链具有10至50个氨基酸,尤其是10至30个氨基酸的长度。该接头可以包含重复氨基酸序列或天然存在的多肽(如具有铰合功能的多肽)的序列。在一个实施方案中,该肽接头氨基酸序列是设计为富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基的“合成接头氨基酸序列”。这些残基例如以至多5个氨基酸的小重复单位排列,如GGGGS、QQQQG或SSSSG(SEQ ID NO:17、18或19)。这些小的重复单位可以重复两次至六次来形成多聚单位。在多聚单位的氨基端和/或羧基端,可以加入至多六个附加的任意天然存在的氨基酸。其他合成肽接头由重复10至20次的单种氨基酸组成,且可以在氨基端和/或羧基端包含至多六个附加的任意天然存在的氨基酸,例如接头GSSSSSSSSSSSSSSSG(SEQ ID NO:20)中的丝氨酸。下表中显示具体的接头氨基酸序列。在一个实施方案中,该接头氨基酸序列选自[GQ4]3GNN(SEQ ID NO:21)、G3[SG4]2SG(SEQ ID NO:22)、G3[SG4]2SG2(SEQ ID NO:23)、(G3S)5GGG(SEQ ID NO:24)。所有肽接头都可以由核酸分子编码,因此可以重组表达。
表
接头氨基酸序列 | SEQ ID NO: |
(GQ4)3 | 25 |
(GQ4)3G | 26 |
(GQ4)3GNN | 27 |
(G2S)3 | 28 |
(G2S)4 | 29 |
(G2S)5 | 30 |
(G3S)3 | 31 |
(G3S)4 | 32 |
(G3S)5 | 33 |
(G3S)5GGG | 34 |
(G4S)2 | 35 |
(G4S)2G | 36 |
(G4S)2GG | 37 |
(G4S)2GGG | 38 |
(G4S)2GN | 39 |
(G4S)3 | 40 |
(G4S)3G | 41 |
(G4S)3T | 42 |
(G4S)3GG | 43 |
(G4S)3GGT | 44 |
(G4S)3GGN | 45 |
(G4S)3GAS | 46 |
(G4S)4 | 47 |
(G4S)5 | 48 |
(G4S)5G | 49 |
(G4S)5GG | 50 |
(G4S)5GAS | 51 |
G(S)15G | 52 |
G(S)15GAS | 53 |
就参考多肽序列而言的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口来达到最大百分比序列同一性,而不将任意保守取代视为序列同一性的部分之后,候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可以以本领域技术之内的多种方式来达到以测定百分比氨基酸序列同一性为目的的比对,例如,使用公开可得的计算机软件,如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数,包括在所比较的序列的全长内达到最大比对所需的任意算法。但是,为了本文的目的,用序列比较计算机程序ALIGN-2来产生%氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写,源代码已随用户文件提交美国版权办公室,Washington D.C.,20559,它在美国版权办公室注册为美国版权注册号TXU510087。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,South SanFrancisco,California公开可得,或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应编译用在UNIX操作系统上,包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变动。
在利用ALIGN-2来进行氨基酸序列比较的情况下,按以下计算给定氨基酸序列A与(或相比)给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(其可以备选地叙述为,具有或包含与(或相比)给定氨基酸序列B的某%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A):
100乘以分数X/Y
其中X是在该程序的A和B的比对中通过序列比对程序ALIGN-2评分为相同的匹配的氨基酸残基的数目,且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应理解,在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时,A与B的%氨基酸序列同一性将不等于B与A的%氨基酸序列同一性。除非明确地另有说明,本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值都是用ALIGN-2计算机程序按前一段落中所述获得。
术语“动物”指选自小鼠、大鼠、兔、绵羊、猫、狗、仓鼠、猕猴和黑猩猩的动物。尤其是,该动物是小鼠或兔或仓鼠或大鼠。在一个实施方案中,该动物是非人动物。
在一个实施方案中,术语“回收”包括:a)(i)永生化来自用靶抗原免疫的动物的B细胞,和(ii)针对特异性结合该靶抗原的抗体的分泌筛选所得到的永生化细胞;或b)(i)在饲养细胞的存在下共培养单种保藏的B细胞,和(ii)针对特异性结合该靶抗原的抗体的存在筛选培养上清。
术语“特异性结合靶抗原”指抗体以至少10-8mol/l的解离常数(=KDiss.),尤其是以至少10-10mol/l的KDiss.结合靶抗原。同时,通过10-7mol/l或更差,例如10-5mol/l的KDiss.来保证不特异性结合靶抗原的特性。
术语“药物制剂”指这样的制剂,其处于这样的形式,以致允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效,且其不包含对将对其施用该制剂的个体具有不可接受的毒性的附加成分。
“可药用载体”指药物制剂中除活性成分外的成分,其对个体无毒性。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“大肠杆菌SlyD”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHD(SEQ ID NO:12).。
术语“指具有以下氨基酸序列的多肽”指所给出的氨基酸序列的多肽,且还包括其变体,该变体就X1而言具有与该多肽相同的特性。在一个实施方案中,该术语指具有至少70%氨基酸序列同一性的多肽。在一个实施方案中,该术语指具有至少80%氨基酸序列同一性的多肽。在一个实施方案中,该术语指具有至少90%氨基酸序列同一性的多肽。在一个实施方案中,该术语指具有至少95%氨基酸序列同一性的多肽。在一个实施方案中,该术语指具有至少98%氨基酸序列同一性的多肽。
如果多肽在大肠杆菌中产生或衍生自大肠杆菌,则蛋白酶通常未有效地切除氨基端的甲硫氨酸残基,因此氨基端的甲硫氨酸残基部分存在于所产生的多肽中。为了解释这一点,所有序列都带着起始甲硫氨酸残基给出。
术语“嗜热栖热菌SlyD”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHDPEGVQVVPLSAFPEDAEVVPGAQFYAQDMEGNPMPLTVVAVEGEEVTVDFNHPLAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH(SEQ ID NO:09).。
术语“Therm ococcus gammatolerans SlyD”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MKVERGDFVLFNYVGRYENGEVFDTSYESVAREQGIFVEEREYSPIGVTVGAGEIIPGIEEALLGMELGEKKEVVVPPEKGYGMPREDLIVPVPIEQFTSAGLEPVEGMYVMTDAGIAKILKVEEKTVRLDFNHPLAGKTAIFEIEVVEIKKAGEA(SEQ ID NO:106).。
术语“人FKBP12”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE(SEQ ID NO:06).。
术语“拟南芥FKBP13”指具有以下氨基酸序列的多肽:
ETTSCEFSVSPSGLAFCDKVVGYGPEAVKGQLIKAHYVGKLENGKVFDSSYNRGKPLTFRIGVGEVIKGWDQGILGSDGIPPMLTGGKRTLRIPPELAYGDRGAGCKGGSCLIPPASVLLFDIEYIGKA(SEQ ID NO:01).。
术语“FKBP12融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MRSGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYG-X1-TLVFDVELLKLE(SEQ ID NO:109),
其中X1是待通过FKBP12融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列。
此氨基酸序列及其变体是本文中报道的单个方面。
术语“SlyD-FKBP12融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHD-X2-RSGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYG-X1-TLVFDVELLKLE(SEQ ID NO:110),
其中X1是待通过SlyD-FKBP12融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列;且
其中X2是接头的氨基酸序列。
此氨基酸序列及其变体是本文中报道的单个方面。
术语“FKBP12/13融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MRSGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGDRGAGCGS-X1-GSSCLIPPASVLVFDVELLKLE(SEQ ID NO:54),
其中X1是待通过FKBP12/13融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列。
此氨基酸序列及其变体是本文中报道的单个方面。
术语“SlyD-FKBP12/13融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHD-X2-GVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGDRGAGCGS-X1-GSSCLIPPASVLVFDVELLKLE(SEQ ID NO:55),
其中X1是待通过SlyD-FKBP12/13融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列;且
其中X2是接头的氨基酸序列。
此氨基酸序列及其变体是本文中报道的单个方面。
术语“嗜热栖热菌SlyD融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MRSKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAY-X1-GKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH(SEQID NO:56),
其中X1是待通过嗜热栖热菌SlyD融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列。
此氨基酸序列及其变体是本文中报道的单个方面。
术语“SlyD-嗜热栖热菌SlyD融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHD-X2-KVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAY-X1-GKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH(SEQ IDNO:57),
其中X1是待通过SlyD-嗜热栖热菌SlyD融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列;且
其中X2是接头的氨基酸序列。
此氨基酸序列及其变体是本文中报道的单个方面。
术语“Thermococcus gammatolerans SlyD融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MKVERGDFVLFNYVGRYENGEVFDTSYESVAREQGIFVEEREYSPIGVTVGAGEIIPGIEEALLGMELGEKKEVVVPPEKGYGMP-X1-AGKTAIFEIEVVEIKKAGEA(SEQ ID NO:111),
其中X1是待通过Thermococcus gammatolerans SlyD融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列。
此氨基酸序列及其变体是本文中报道的单个方面。
术语“SlyD-Thermococcus gammatolerans SlyD融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MKVAKDLV VSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHD-X2-KVERGDFVLFNYVGRYENGEVFDTSYESVAREQGIFVEEREYSPIGVTVGAGEIIPGIEEALLGMELGEKKEVVVPPEKGYGMP-X1-AGKTAIFEIEVVEIKKAGEA(SEQ ID NO:112),
其中X1是待通过Thermococcus gammatolerans SlyD融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列;且
其中X2是接头的氨基酸序列。
此氨基酸序列及其变体是本文中报道的单个方面。术语“嗜热栖热菌SlyD-FKBP13融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
GDRGAGCGS-X1-GSSCLIPPASVLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH(SEQ ID NO:58),
其中X1是待通过嗜热栖热菌SlyD-FKBP13融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列。
此氨基酸序列及其变体是本文中报道的单个方面。
术语“SlyD-嗜热栖热菌SlyD-FKBP13融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHD-X2-KVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGDRGAGCGS-X1-GSSCLIPPASVLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAH(SEQ ID NO:59),
其中X1是待通过SlyD-嗜热栖热菌SlyD-FKBP13融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列;且
其中X2是接头的氨基酸序列。
此氨基酸序列及其变体是本文中报道的单个方面。
术语“拟南芥FKBP13融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
ETTSCEFSVSPSGLAFCDKVVGYGPEAVKGQLIKAHYVGKLENGKVFDSSYNRGKPLTFRIGVGEVIKGWDQGILGSDGIPPMLTGGKRTLRIPPELAYGDRGAGCGS-X1-GSSCLIPPASVLLFDIEYIGKA(SEQ ID NO:60),
其中X1是待通过拟南芥FKBP13融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列。
此氨基酸序列及其变体是本文中报道的单个方面。
术语“SlyD-拟南芥FKBP13融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHD-X2-ETTSCEFSVSPSGLAFCDKVVGYGPEAVKGQLIKAHYVGKLENGKVFDSSYNRGKPLTFRIGVGEVIKGWDQGILGSDGIPPMLTGGKRTLRIPPELAYGDRGAGCGS-X1-GSSCLIPPASVLLFDIEYIGKA(SEQ ID NO:61),
其中X1是待通过SlyD-拟南芥FKBP13融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列;且
其中X2是接头的氨基酸序列。
此氨基酸序列及其变体是本文中报道的单个方面。
术语“SlyD-FKBP12/13融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHD-X2-GVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGDRGAGC-X1-CLIPPASVLVFDVELLKLEGGGSRPLLPPLPGG(SEQ ID NO:113),
其中X1是待通过SlyD-FKBP12/13融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列;且
其中X2是接头的氨基酸序列。
在以上方面的一个实施方案中,X2具有氨基酸序列GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:13)。
对于直接检测,可检测标记可以选自任意已知的可检测标记基团,如染料、发光标记基团,如化学发光基团,例如吖啶酯或二噁二酮(dioxetane),或荧光染料,例如荧光素、香豆素、罗丹明、嗪、试卤灵、花菁及其衍生物。可检测标记的其他实例是发光金属络合物,如钌或铕络合物,例如用于ELISA或用于CEDIA(克隆酶供体免疫测定)的酶,及放射性同位素。在一个实施方案中,可以通过电化学发光检测的金属螯合物也是用作可检测标记的信号发射基团,尤其优选钌螯合物。在一个实施方案中,该标记基团是钌(二吡啶基)3 2+螯合物。
间接检测系统包括,例如,用结合对的第一配偶体标记检测试剂,例如检测抗体。适宜的结合对的实例是半抗原或抗原/抗体,生物素或生物素类似物(如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素)/抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白,糖/凝集素,核酸或核酸类似物/互补核酸,及受体/配体,例如类固醇激素受体/类固醇激素。在一个实施方案中,第一结合对成员选自半抗原、抗原和激素。在一个实施方案中,半抗原选自地高辛和生物素及其类似物。通常标记这种结合对的第二配偶体(例如抗体、链霉抗生物素蛋白等),以允许例如通过上文提到的标记直接检测。
本文中报道的融合多肽基于来自FKBP结构域蛋白质家族的多肽(即具有PPI酶活性的蛋白质),如人FKBP12(Handschumacher,R.E.等,Science226(1984)544-547),或拟南芥FKBP13,或大肠杆菌SlyD,或嗜热栖热菌SlyD,或Thermococcus gammatolerans SlyD。本文中报道的融合多肽是用于呈递包含在X1的氨基酸序列中的多肽的支架。
X1的氨基酸序列可以取代FKBP12部分中的Flap结构域(氨基酸残基A85至A96)和β-突起(氨基酸残基S39至P46)和/或SlyD部分中的IF结构域(氨基酸残基G69至D120)。随之可能省去全长蛋白质免疫原的耗时的重组制备和纯化。
多肽X1或X0的插入氨基酸序列和/或与之相关的结构基序分别在本文报道的融合多肽中的定义的呈递允许以足够的量、质量以及以正确的三维结构有效和节省成本地分别产生包含在X1和X0中的免疫原性氨基酸序列。
可以插入任意氨基酸序列,如螺旋、螺旋-转角-螺旋基序、卷曲螺旋结构、螺旋束、转角-环基序、β-发夹结构、β-折叠、折叠-螺旋基序、折叠-转角-折叠基序等。还可能呈递限定的天然三级结构、多结构域多肽的单个结构域或亚域、结合结构域、抗体片段、酶等。
例如就可溶性和/或可逆折叠(复性/变性)而言,与分别从其衍生X1或X0的氨基酸序列的全长多肽相比,免疫原性多肽可以改进。本文中报道的融合多肽提供衍生自多肽的X1的氨基酸序列(将获得抗该氨基酸序列的抗体)插入的支架,且它分别稳定X1和X0的氨基酸序列的结构,因为降低了构象熵。
如果存在,则N端SlyD介导蛋白伴侣的功能性,并保持完整的融合多肽作为单体、可溶和稳定的多肽。此外,它提高融合多肽的分子量,这对它在质量敏感的分析(如SPR测量)中的使用有益。
独立于含有其flap区的FKBP12的存在,融合多肽的一个或多个SlyD衍生多肽部分折叠为正确(天然)的三维构象。融合多肽的嵌合FKBP12结构域似乎未正确折叠。与在320nm处显示固有的Trp荧光发射峰的野生型FKBP12多肽不同,SlyD-FKBP12融合多肽的荧光光谱分析显示在320nm处没有峰,但在350nm处有典型的非固有的Trp发射迁移。350nm峰扩宽。SlyD-FKBP12融合多肽中的单个Trp部分暴露于溶剂。这表明SlyD-FKBP12融合多肽内的FKBP结构域部分或完全解折叠。
SlyD-FKBP12融合多肽衍生物对固定的bi-FK506的BIAcore结合测定也显示无结合活性,表明本文中报道的多肽中FKBP12衍生部分的结构-功能丧失。
基于这些发现,不受限于理论,目前的SlyD-FKBP12插入结构模型是,该多肽由充分折叠的SlyD部分及结构上受妨碍的FKBP12折叠组成,该FKBP12折叠至少向溶剂提供其单个核心Trp残基。该多肽为单体、可溶、可逆折叠,且就其应用而言显示足够的热稳定性。
因此,本文中报道的融合多肽是适合用于模拟结构多样的肽二级结构基序的支架,只要所插入的肽二级结构基序不折叠为分开的、自主折叠的结构。
假定结构多样的肽二级结构基序例如存在于免疫组织化学实验中的石蜡包埋、福尔马林固定的组织中((Abe等,Anal.Biochem.318(2003)118-123))。
X1或X0的氨基酸序列分别可以由G3S接头序列位于侧翼来确保与第二多肽的氨基酸序列的足够距离和柔性,以分别避免对X1或X0的氨基酸序列的结构完整性的影响。
本文中报道的融合多肽具有至少15kDa的分子量。这消除了将该多肽缀合至载体蛋白质(如KLH或颗粒)或用于免疫的物质的需要,并通过KLH偶联减少了新表位(neo-epitope)的出现。
但是,应需要缀合,这通过选择性活化序列基序GSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:16)中的赖氨酸残基而成为可能,该赖氨酸残基可以用LC-SPDP(6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺)通过相邻的组氨酸和精氨酸残基来活化。
制备蛋白质免疫原期间通常未识别出免疫组织化学分析条件下的结构或部分/完全变形或新表位的产生。尤其是在福尔马林处理期间,氨基酸残基Lys、Tyr、His和Cys的侧链交联。此外,多肽的三级和四级结构在使用组织固定试剂、(热)孵育、石蜡包埋和乙醇处理组织脱水的组织制备期间扭曲(见例如Fowler,C.B.等,Lab.Invest.88(2008)785-791)。仍不清楚抗原修复方法是否能够完全去除福尔马林诱导的交联来恢复天然构象的蛋白质结构。因此,可以形成新的二级结构,且可以产生新表位,或甚至在修复方法后保留新表位。
这些新的和非天然的结构在免疫活动期间不存在。通过使用常规抗体制备技术,没有或就算有也只是有限数目的适合IHC的抗体可以获得。
此外,溶液中的游离多肽具有大的构象熵,产生使得针对确定焓的二级结构表位的免疫反应变得困难的瞬时结构(见例如Scott,K.A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA104(2007)2661-2666;Gamacho,C.J.等,PLoSComput.Biol.4(2008)e10002311-8)。用作免疫原的游离肽可以导致仅制备出抗各肽的末端的抗体。
除在免疫动物和产生免疫反应中的用途外,本文中报道的融合多肽可以用于定位抗体表位,如线性表位或构象表位。可以分别用X1或X0的氨基酸序列呈递不同的结构基序(=表位、抗原性(免疫原性)氨基酸序列)。这些不同的结构基序还可以用来产生分别对X1或X0的氨基酸序列具有特异性的适合用于免疫组织化学(IHC)的抗体。为了此目的,以这样的方式选择X1的氨基酸序列,使得可以预期在福尔马林处理期间仅形成有限数目的新表位。尤其可以通过选择适当的序列来最小化赖氨酸、酪氨酸、组氨酸和半胱氨酸残基的数目。还可能用丝氨酸残基取代单个残基,如半胱氨酸残基。作为X1序列,可以使用例如小的二级结构基序,其显示重折叠为它们的构象来源结构的高概率。通过将X1移植入FKBP结构域,插入的多肽的末端不再自由并可接近,结构焓提高。
本文中报道的一个方面是式I的融合多肽
NH2-S2-X1-S1-COOH(式I)
其中
X1包含随机的氨基酸序列,或包含衍生自第一多肽的氨基酸序列;
S2和S1是衍生自第二多肽的非重叠氨基酸序列;且
-表示肽键;
其中该第二多肽是具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性(PPI酶活性)的多肽,或是FKBP结构域家族的成员。
在一个实施方案中,该具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性的多肽是SlyD。
在一个实施方案中,该第二多肽是来自嗜热生物的多肽。
在一个实施方案中,该嗜热生物是嗜热菌。在一个实施方案中,该嗜热菌来自栖热菌科。在一个实施方案中,该嗜热生物是嗜热栖热菌。
在一个实施方案中,该嗜热生物是嗜热古细菌。在一个实施方案中,该嗜热古细菌是超嗜热古细菌。在一个实施方案中,该嗜热生物来自热球菌纲。在一个实施方案中,该嗜热生物是Thermococcus gammatolerans。
在一个实施方案中,该嗜热生物具有至少60℃的最适生长温度。
本文中报道的一个方面是式II的融合多肽
S4-X2-S3-S2-X1-S1-S0(式II)
其中
X1是随机氨基酸序列,或是衍生自第一多肽的氨基酸序列;
S2和S1是衍生自第二多肽的非重叠氨基酸序列;
S3和S0缺乏,或是衍生自第三多肽的非重叠氨基酸序列;
S4缺乏,或是衍生自第四多肽的氨基酸序列;
X2缺乏,或是肽接头序列;且
-表示肽键;
其中该第二多肽和该第三多肽和该第四多肽相互不同,且是具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性(PPI酶活性)的多肽或FKBP结构域家族的成员。
在一个实施方案中,本文中报道的融合多肽包含氨基酸序列标记。
在一个实施方案中,该氨基酸序列标记选自聚组氨酸标记、Avi标记、聚谷氨酸标记、聚精氨酸标记、Strep标记、链霉抗生物素蛋白结合肽、表位标记及其组合。
在一个实施方案中,该氨基酸序列标记是八组氨酸标记。
术语“氨基酸序列标记”指具有特异性结合特性的通过肽键相互连接的氨基酸残基的序列。在一个实施方案中,该氨基酸序列标记是亲和或纯化标记。在一个实施方案中,该氨基酸序列标记选自精氨酸标记、组氨酸标记、Flag标记、3xFlag标记、Strep标记、Nano标记、SBP标记、c-myc标记、S标记、钙调素结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标记或MBP标记。在另一实施方案中,该氨基酸序列标记选自SEQID NO:16(GSRKHHHHHHHH),或SEQ ID NO:62(RRRRR),或SEQID NO:63(RRRRRR),或SEQ ID NO:64(HHHHHH),或SEQ ID NO:65(KDHLIHNVHKEFHAHAHNK),或SEQ ID NO:66(DYKDDDDK),或SEQ ID NO:67(DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK),或SEQ ID NO:68(AWRHPQFGG),或SEQ ID NO:69(WSHPQFEK),或SEQ ID NO:70(MDVEAWLGAR),或SEQ ID NO:71(MDVEAWLGARVPLVET),或SEQ ID NO:72(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP),或SEQ ID NO:73(EQKLISEEDL),或SEQ ID NO:74(KETAAAKFERQHMDS),或SEQ ID NO:75(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL),或SEQ ID NO:76(纤维素结合结构域),或SEQ ID NO:77(纤维素结合结构域),或SEQ ID NO:78(TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPA LWQLQ),或SEQ ID NO:79(GST标记),或SEQ ID NO:80(MBP标记)。在前面报道的所有方面的一个实施方案中,该氨基酸序列标记具有选自SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:80的氨基酸序列。在一个实施方案中,该氨基酸序列标记具有SEQ ID NO:16,或SEQ ID NO:64,或SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
如果在大肠杆菌菌株中产生多肽,则蛋白酶通常未有效切除氨基端的甲硫氨酸残基,因此氨基端的甲硫氨酸残基部分存在于所产生的多肽中。因此,本文中给出的所有序列都列出N端甲硫氨酸残基,尽管在分离的多肽中此残基可以缺乏。但是,包含N端甲硫氨酸的氨基酸序列还将涵盖其中此甲硫氨酸缺失的氨基酸序列。
如果X1或X0氨基酸序列分别具有非螺旋结构,则可以分别在X1或X0的氨基酸序列的N端和C端引入GGGS接头(SEQ ID NO:81)。
如果X1或X0氨基酸序列分别具有螺旋结构,则可以分别插入X0或X1的氨基酸序列的N端GGGSGGNP接头(SEQ ID NO:82)和GPTGGGS接头(SEQ ID NO:83)。
可以用SlyD/FKBP12-抗原、嗜热栖热菌SlyD-抗原和Thermococcusgammattolerans SlyD-抗原融合多肽来呈递抗原。
嗜热栖热菌SlyD(Loew,C.等,J.Mol.Biol.398(2010)375-390)源自古细菌嗜热栖热菌。Thermococcus gammatolerans SlyD源自古细菌Thermococcus gammatolerans。与人FKBP12、FKBP13、嵌合FKBP12/13以及大肠杆菌SlyD相反,两种蛋白质都显示提高的热力学稳定性。在本文中报道的融合多肽中包含嗜热栖热菌SlyD或Thermococcusgammatoerans SlyD时,可以省去N端的大肠杆菌SlyD衍生多肽(即在第四多肽是大肠杆菌SlyD时)。
通常,包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列标记的FKBP12-抗原融合多肽具有以下氨基酸序列:
MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAWHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGGGGS-X1-GGGSTLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:84),
其中X1是待通过FKBP12-抗原融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列。
人FKBP12衍生多肽可以在N端与大肠杆菌SlyD衍生多肽融合。
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列标记的SlyD/FKBP12-抗原融合多肽具有以下氨基酸序列:
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGGGGS-X1-GGGSTLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:85),
其中X1是待通过SlyD/FKBP12-抗原融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列。
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列标记的SlyD/FKBP12-对照多肽(SDS和Western印迹见图1)具有以下氨基酸序列:
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGGGGSGGNPGPTGGGSTLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:86).。
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列标记的嗜热栖热菌-SlyD-抗原融合多肽具有以下氨基酸序列:
MRGSKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHG-X1-GAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSRKHHHHHHHH(SEQ IDNO:87),
其中X1是待通过嗜热栖热菌-SlyD-抗原融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列。
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列标记的Thermococcusgammatolerans-SlyD-抗原融合多肽具有以下氨基酸序列:
MKVERGDFVLFNYVGRYENGEVFDTSYESVAREQGIFVEEREYSPIGVTVGAGEIIPGIEEALLGMELGEKKEVVVPPEKGYGMP-X1-AGKTAIFEIEVVEIKKAGEAGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:114),
其中X1是待通过Thermococcus gammatolerans-SlyD-抗原融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列。
嗜热栖热菌-SlyD-抗原融合多肽和Thermococcusgammatolerans-SlyD-抗原融合多肽不需要N端的大肠杆菌SlyD蛋白伴侣结构域。在这些融合多肽中,可以通过抗原环颈部的二硫键来稳定免疫原性序列(抗原序列)插入,其是本文中报道的实施方案。在嗜热栖热菌-SlyD-抗原融合多肽中,可以在氨基酸位置H66C和A70C设置两个半胱氨酸突变,并可以各引入甘氨酸残基来优化支架和插入之间的连接。
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列标记的二硫键稳定的嗜热栖热菌-SlyD-抗原融合多肽具有以下氨基酸序列:
MRGSKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPCG-X1-GCGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSRKHHHHHHHH(SEQ IDNO:88),
其中X1是待通过二硫键稳定的嗜热栖热菌-SlyD-抗原融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列。
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列标记的二硫键稳定的Thermococcus gammatolerans-SlyD-抗原融合多肽具有以下氨基酸序列:
MKVERGDFVLFNYVGRYENGEVFDTSYESVAREQGIFVEEREYSPIGVTVGAGEIIPGIEEALLGMELGEKKEVVVPPEKGYGMPCG-X1-GCAGKTAIFEIEVVEIKKAGEAGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:115),
其中X1是待通过Thermococcus gammatolerans-SlyD-抗原融合多肽呈递的接头,或肽,或抗原,或二级或三级结构的氨基酸序列。
适合用于IHC应用的抗-ERCC1抗体
用SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽作为筛选试剂来制备靶向ERCC1(ERCC=切除修复交叉互补;Tripsianes,K.等,Structure13(2005)1849-1858)的C端结构域内的螺旋-环-螺旋区域的适合用于IHC染色的抗-ERCC1抗体。
ERCC1多肽的功能主要在损伤DNA的核苷酸切除修复中(Aggarwal,C.等,J.Natl.Compr.Canc.Netw.8(2010)822-832;Rahn,J.J.等,Environment.Mol.Mutagen.51(2010)567-581;Westerveld,A.等,Nature310(1984)425-429)。
ERCC1具有诊断相关性,因为它是与多种疾病指征紧密联系的预测和预后标记(Gandara,D.R.等,J.Thorac Oncol.5(2010)1933-1938;Hwang,I.G.等,Cancer113(2008)1379-1386;Azuma,K.等,CancerChemother.Pharmacol.64(2009)565-573)。
通常,可能在IHC条件下通过福尔马林诱导的交联事件产生新表位(Lin,W.等,J.Histochem.Cytochem.45(1997)1157-1163;Webster,J.D.等,J.Histochem.Cytochem.57(2009)753-761)。可以在组织制备及随后的抗原修复过程中通过严格的条件来部分或完全变性或至少在结构上修饰真实的结构(Rait,V.K.等,Lab.Invest.84(2004)300-306)。表位区域很可能类似于不能通过线性、合成产生的肽充分代表的多个不稳定的一级或二级结构。因此,必须使用能够应付所有这些任务,同时稳定且在生物化学上可靠的免疫原或适宜的抗体筛选试剂。
与在IHC应用中所假定的一样,SlyD/FKBP12-ERCC1支架可以模拟结构多样的线性化、完全变性、部分变性、部分重折叠或完整二级结构基序。同时,该支架保证热力学稳定性和可靠的处理。
利用SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽来从通过线性肽免疫策略获得的多个抗体筛选适合用于IHC应用的抗-ERCC1抗体。
从ERCC1(PDB1Z00)结构提取螺旋-环-螺旋二级结构基序(图2)。C端ERCC1结构域可以在结构上表征为主要为螺旋多肽。这使得难以鉴定通常用于线性肽免疫方法的连续的线性表位。为了获得特异性识别预期的序列基序的抗体,用线性KHL偶联肽来免疫动物。
提取的人ERCC1C274S序列是氨基酸序列IAASREDLALSPGLGPQKARRLFD(SEQ ID NO:89)。该序列代表螺旋-转角-螺旋基序。已将原来存在于插入序列的11位(在SEQ ID NO:89中下划线)处的半胱氨酸残基变为丝氨酸残基来避免氧化聚集。
由于插入的序列具有螺旋构象,在插入的氨基酸序列的N端引入附加氨基酸序列GGGSGGNP(SEQ ID NO:82),并在插入的氨基酸序列的C端引入了氨基酸序列GPTGGGS(SEQ ID NO:83)。因此,获得了末端侧翼基序GGGGSGGNP和GPTGGGS。不受限于理论,推测这类基序通过帽化序列基序的脯氨酸螺旋促进螺旋倾向。
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列标记的FKBP12-ERCC1融合多肽具有以下氨基酸序列:
MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGGGGSGGNPIAASREDLALSPGLGPQKARRLFDGPTGGGSTLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:90).。
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列标记的SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽具有以下氨基酸序列:
MKVAKDLWSLAYVRTEDGVLVDESPVSApLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGYDENLVRVPKDVFMGVDELVGMRFLAETDGPVPVEITAVEDDHVWDGNHMLAGNLKFNVEWAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGGVVETISPGDGRTFPKRGTAWHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKEVIRGWEEGVAQMSVGRAKLTISPDYAYGGGGSGGNpIAASREDLALSPGLGPQKARRLFDGPTGGGSTLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:91).。
将SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽和SlyD/FKBP12对照多肽用于筛选方法来鉴定产生抗-ERCC1抗体的细胞克隆。
SlyD/FKBP12对照多肽具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
通常,为了纯化该融合多肽,在离液剂的存在下在变性条件下使用亲和层系步骤。融合多肽捕获在亲和基质上。通过用生理缓冲溶液洗涤柱来将离液缓冲液转入非变性缓冲液条件。然后重折叠SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽的大肠杆菌SlyD部分。将重折叠的融合多肽从亲和层析柱回收在生理缓冲液中。
透析亲和纯化的融合多肽,并过滤(SDS凝胶见图3)。UV/Vis光谱定量SlyD/FKBP12-ERCC1。用蛋白质荧光测量来测试SlyD/FKBP12-ERCC1的构象性质(图4)。FKBP12突变体C22A作为用于多肽插入的载体尤其有用,因为可以用单个FKBP12Trp部分来测定FKBP12部分的结构完整性(Scholz,C.等,J.Biol.Chem.271(1996)12703-12707;Russo,A.T.等,J.Mol.Biol.330(2003)851-866)。处于其天然结构的FKBP12C22A在320nm处显示单个荧光发射峰(Zoldak,G.等,J.Mol.Biol.386(2009)1138-1152)。
不受限于理论,350nm处固有的Trp溶剂致变色(solvatochromic)荧光发射在折叠的FKBP12蛋白质环境中将强烈猝灭,而它随FKBP12的解折叠而提高。从25℃至85℃的温度筛选未显示任何其他荧光发射峰,但显示350nm发射的温度依赖性荧光猝灭。检测不到指示FKBP12的结构完整性的320nm发射(见图4)。
以融合多肽SlyD/FKBP12-ERCC1作为溶液中的分析物对传感器表面呈递的配体bi-FK506的BIAcore结合测定(图5和6)显示无FK506结合活性,表明融合多肽中FKBP12部分的结构-功能丧失。对照多肽FKBP12(C22A)显示FK506结合活性。
SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽不结合固定的FK-506提供了不同于FKBP12(C22A)构象的结构的SlyD/FKBP12-ERCC1结构的证据。这伴随着嵌合FKBP12结构域的结合活性的丧失。
荧光测量和FK506结合测定提供了SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽的结构-功能丧失的证据。N端大肠杆菌SlyD结构域保持该融合多肽处于其可溶和单体的状态。这通过SlyD/FKBP12-ERCC1和SlyD/FKBP12-ctrl融合多肽的HPLC分析(见图7和8)得到证明。
用涵盖人ERCC1(切除修复交叉互补蛋白质)的氨基酸219-245的KHL偶联肽对小鼠进行腹膜内免疫。按照Koehler和Milstein的方法进行杂交瘤原代培养物的产生。分离杂交瘤,并通过所述ELISA方法针对抗原结合进行筛选。将在对肽ERCC1[219-245]的ELISA中显示阳性颜色形成的原代杂交瘤细胞培养物转移至动力学筛选(见图9至12)。为了避免选择到不适合用于IHC的抗体,用本文中报道的融合多肽进行筛选。将SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽和SlyD/FKBP12对照多肽用于动力学筛选方法来鉴定结合ERCC1氨基酸序列基序的抗体。将适宜的原代培养物进一步扩大为克隆培养物。图12中显示所选择的细胞克隆的特性。图13示例性显示克隆<ERCC1>-M-5.3.35的BIAcore测量。SlyD/FKBP12-ERCC1相互作用高度特异。未检测到与SlyD/FKBP12对照样品的相互作用。未检测到非特异性结合。该相互作用指Langmuir动力学模型。
对于Western印迹,将OVCAR-3或HEK293细胞裂解物上样至SDS凝胶的泳道上。图14显示克隆<ERCC1>-M-5.1.35的Western印迹结果。检测到37kDa处的ERCC1特异性条带。
对于FFPE包埋的人癌组织中ERCC1的免疫组织化学检测,制备了SCLC癌样品的组织切片。图15显示阳性IHC染色模式。白色箭头指示ERCC1的特异性染色部位。仅用具有SEQ ID NO:89的多肽,即仅用未整合入本文中报道的融合多肽的多肽进行了类似的筛选和选择方法。通过两种筛选方法从在此基于肽的筛选中鉴定的14个候选细胞克隆选择了9个克隆。尽管在BIAcore芯片上的捕获水平相同,但来自基于多肽的筛选方法的5个命中不结合SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽。
已发现,大肠杆菌SlyD-FKBP12-抗原融合多肽和嗜热栖热菌SlyD-抗原融合多肽(见例如Kang,C.B.第,Neurosignals 16(2008)318-325)和Thermococcus gammatolerans SlyD-抗原融合多肽可以用作组合免疫原和筛选工具来制备靶向包含在该多肽中的抗原的表位特异性单克隆抗体。
此外,已发现,大肠杆菌SlyD-FKBP12/13-抗原融合多肽和嗜热栖热菌SlyD-抗原融合多肽和Thermococcus gammatolerans SlyD-抗原融合多肽都同样可以翻译后修饰,然后可以用作组合免疫原和筛选工具来制备靶向包含在该多肽中的翻译后修饰的翻译后修饰位点特异性单克隆抗体。在一个实施方案中,本文中报道的融合多肽之一用于产生抗体,本文中报道的第二种不同的融合多肽用来选择用第一融合多肽获得的抗体,其中两种融合多肽不同,但包含相同的抗原氨基酸序列,即X1或X0在两种融合多肽中相同。
本文中报道的融合多肽可以用于通过使用结构模拟或支架技术的靶向表位方法来产生功能性抗体。尤其是对于抗常规免疫活动中不易接近的抗原(所谓的隐藏表位)的抗体的产生,本文中报道的融合多肽尤其适合。
抗-IGF-1抗体
人IGF-1和IGF-2显示67%氨基酸序列同源性和高结构同源性(见图16)。在血清中,IGF-2以比IGF-1多500倍存在(Jones,J.I.和Clemmons,D.R.,Endocrin.Rev.16(1995)3-34)。
因此,IGF-1特异性抗体,即与IGF-2无交叉反应性的抗体的产生具有挑战。IGF-1和IGF-2之间在以信号和前肽开始编号的IGF-1氨基酸位置74-90(UniProtKB入口P05019,IGF1_人)处的IGF-1转角-环基序中存在小的序列偏差。对应的氨基酸序列NKPTGYGSSSRRAPQTG(SEQID NO:92)可以作为氨基酸序列X0插入本文中报道的SlyD/FKBP-12融合多肽,或嗜热栖热菌SlyD融合多肽,或Thermococcus gammatoleransSlyD融合多肽。
包含氨基酸序列NKPTGYGSSSRRAPQTG(SEQ ID NO:92)的融合多肽可以用于免疫动物来获得特异性结合此转角-环基序的抗体。
为了改善免疫原性多肽的呈递,IGF-1转角-环基序可以由氨基酸序列N端和C端的GGGS接头(SEQ ID NO:81),或由IGF-1氨基酸序列N端的HG二肽及IGF-1氨基酸序列C端的GA二肽位于侧翼。
用SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽作为免疫原以及作为筛选试剂来制备特异性结合IGF-1氨基酸序列NKPTGYGSSSRRAPQTG(SEQID NO:92)的抗-IGF-1抗体。
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列标记的FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽可以具有以下氨基酸序列:
MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGGGGSNKPTGYGSSSRRAPQTGGGSTLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:93).。
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列标记的SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽可以具有以下氨基酸序列:
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGGGGSNKPTGYGSSSRRAPQTGGGGSTLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:94).。
包含SEQ ID NO:16的C端氨基酸序列标记的嗜热栖热菌-SlyD野生型多肽具有以下氨基酸序列:
MRGSKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHDPEGVQVVPLSAFPEDAEVVPGAQFYAQDMEGNPMPLTVVAVEGEEVTVDFNHPLAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:97).。
用嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽(SDS Page和Western印迹见图17)作为免疫原以及作为筛选试剂来制备靶向IGF-1氨基酸序列NKPTGYGSSSRRAPQTG(SEQ ID NO:92)的抗-IGF-1抗体。
包含SEQ ID NO:16的C端氨基酸序列标记的嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽(SDS和Western印迹见图3)可以具有氨基酸序列:
MRGSKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHGNKPTGYGSSSRRAPQTGGAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:95),
或氨基酸序列:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHGNKPTGYGSSSRRAPQTGGAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHPSGHHHHHH(SEQ ID NO:96).。
对于筛选和特异性测试,产生了嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽。嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽缺乏IF结构域,其被短的氨基酸序列基序取代。
包含SEQ ID NO:16的C端氨基酸序列标记的嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽可以具有氨基酸序列:
MRGSKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHGAGSGSSGAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:116).。
对于筛选和特异性测试,产生了具有结构上同源的IGF-2(53-65)发夹插入的Thermococcus gammatolerans SlyD融合多肽。
包含SEQ ID NO:16的C端氨基酸序列标记的Thermococcusgammatolerans SlyD-IGF-2(53-65)融合多肽可以具有氨基酸序列:
MKVERGDFVLFNYVGRYENGEVFDTSYESVAREQGIFVEEREYSPIGVTVGAGEIIPGIEEALLGMELGEKKEVVVPPEKGYGMP-G-SRVSRRSRG-G-AGKTAIFEIEVVEIKKAGEAGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:117).。
所有融合多肽都在大肠杆菌中产生。所有融合多肽都通过使用与本文中所述实质上相同的流程来纯化和重折叠。用SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽和嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽对小鼠进行腹膜内免疫。免疫后十周,利用ELISA测定抗体效价(图19和20)。用SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽免疫的小鼠显示对IGF-1、对受限制的IGF-1(74-90)肽环、对SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽及对SlyD/FKBP12对照多肽的低效价。仅一只小鼠提供足够高的IGF-1效价(图19中的K1576M1),并用于产生杂交瘤。
已发现,用嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽免疫的小鼠显示对嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽的效价比对SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽的效价高(见图19和20)。
按照Koehler和Milstein的方法进行杂交瘤原代培养物的产生。通过有限稀释分离原代杂交瘤,并通过ELISA针对抗原结合进行筛选。用动力学筛选方法进一步评价原代杂交瘤细胞培养物,该原代杂交瘤细胞培养物在对SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽、嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽和IGF-1的ELISA中显示阳性颜色形成,以及对嗜热栖热菌-SlyD野生型融合多肽和SlyD/FKBP12对照多肽的较低信号。
发现只有两个来自SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽免疫活动的原代培养物对IGF-1具有阳性ELISA信号。发展为克隆培养物之后,在表面等离振子共振(SPR)分析中检测不到动力学结合信号。发现了几个原代培养物,其对IGF-1和嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽显示适宜的ELISA结合信号,但对嗜热栖热菌-SlyD野生型多肽显示降低的信号强度(见图21)。
通过对天然IGF-1、对天然IGF-2、对嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽及对嗜热栖热菌-SlyD野生型多肽的动力学筛选方法来分析原代培养物(图22)。检测产生IGF-1特异性抗体的原代培养物,并通过有限稀释扩大来获得克隆培养物。
利用ELISA针对对IGF-1的特异性结合分析了克隆培养物(见图23)。图24中显示获自嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽免疫活动的抗-IGF-1抗体的示例性BIAcore测量。该抗体以10pM结合亲和力特异性结合嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽和天然IGF-1。不结合天然IGF-2和野生型嗜热栖热菌SlyD(见图25)。
已发现,对于IGF-1特异性抗体的产生,通过刚性、焓支架稳定IGF-1转角-环基序来保持其天然折叠具有重要意义。在呈递在亚稳态多肽支架(如FKBP12)上时,不受限于此理论,推测序列NKPTGYGSSSRRAPQTG(SEQ ID NO:18)具有太多的旋转自由度。最后,未获得天然IGF-1结合抗体。
已通过近-UV-CD光谱测量发现,SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽中的FKBP-12部分解折叠。HPLC分析显示,SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽是单体。DSC测量显示,该融合多肽能够可逆地折叠和解折叠。不受限于理论,甚至在C端FKBP结构域部分或完全解折叠时,可以可逆折叠的N端大肠杆菌SlyD结构域也保持该融合多肽在溶液中稳定且是单体(见图26)。
如已经针对SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽发现,SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽可以呈递结构多样的线性化、完全变性、部分变性、部分重折叠或完整的二级结构基序。
对于天然IGF-1结合抗体的制备,已发现必须使用以其天然构象呈递多肽插入的支架。因此,呈递融合多肽需是稳定折叠的多肽。已发现,这可以通过使用来自嗜极端生物(即嗜热生物)的FKPB结构域(如嗜热栖热菌SlyD或Thermococcus gammatolerans SlyD)来达到。
为了检查本文中报道的融合多肽是否采用折叠构象,测定了近-UV区中的CD光谱。近-UV-CD测定多肽中芳族残基的不对称环境,因此是用于有序三级结构的敏感测试。天然SlyD在近-UV区中具有典型的CD特征。因此,由IF结构域中的插入引起的结构扭曲或空间冲突应在近-UV CD光谱中可见。图27中显示野生型嗜热栖热菌SlyD、缺乏IF结构域的野生型嗜热栖热菌SlyD的FKBP结构域(嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽)和嗜热栖热菌SlyD-抗原融合多肽(其中插入了来自人胞外受体片段的22个氨基酸的插入)的光谱的叠加。已发现嗜热栖热菌IF结构域的取代未导致其余IF结构域的总体结构的改变。可以看到,光谱的特征相似。由于解折叠将废除任何近-UV CD信号,此结果提供证据证明,融合多肽中保持了天然样折叠。
嗜热栖热菌SlyD-抗原融合多肽是包含来自人生长因子受体胞外域(ECD)的22个氨基酸的β发夹二级结构插入的融合多肽。CD特征证明,在20℃下,所有多肽都充分折叠为它们的天然结构。
图28显示嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽的温度依赖性CD光谱。温度诱导解折叠后,嗜热栖热菌SlyD FKBP结构域可以在再次冷却时重折叠。因此,可以通过柱上重折叠来亲和纯化该融合多肽,此外,与关于SlyD-FKBP12-IGF-1融合多肽的发现不同,嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽具有以稳定构象在FKBP结构域上呈递IGF-1二级结构基序的结构稳定性。在与嗜热栖热菌-抗原融合多肽相比时,Thermococcus gammatolerans SlyD-抗原融合多肽的温度依赖性近-UV CD光谱显示甚至更高的稳定性(见图29)。两种支架都携带相同的来自人生长因子受体ECD的22个氨基酸的β发夹二级结构插入。Thermococcusgammatolerahs SlyD-抗原可逆地折叠和解折叠。已发现,在给定的物理条件下,甚至在100℃的温度下也不能达到Thermococcus gammatoleransSlyD-抗原融合多肽的完全解折叠。
已发现,古细菌FKBP结构域的稳定性使得能够通过取代它们的IF结构域来移植免疫原性多肽,由此同时保持新产生的嵌合支架蛋白的总体稳定性。
将嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽纯化为稳定和单体的多肽(见图18)。
在反复的冻融循环和温度应力测试后重新层析Thermococcusgammatolerans SlyD-抗原融合多肽的单体级分(见图30)。
用SEQ ID NO:96的多肽免疫了小鼠。用ELISA分析所获得的B细胞。用嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽、嗜热栖热菌-SlyD野生型多肽、IGF-1和IGF-2作为对照。
包含SEQ ID NO:16的C端氨基酸序列标记的嗜热栖热菌-SlyD野生型多肽(SDS和Western印迹见图31)具有以下氨基酸序列:
MRGSKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHDPEGVQVVPLSAFPEDAEVVPGAQFYAQDMEGNPMPLTVVAVEGEEVTVDFNHPLAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:97).。
所有克隆培养物上清(CCS)都在37℃与IGF-1和嗜热栖热菌SlyD-IGF-1融合多肽形成稳定复合物。用CCS中的任一个都检测不到与嗜热栖热菌SlyD-野生型多肽的交叉反应。除一个克隆外,检测不到与IGF-2的交叉反应性(见图32)。从图33可见,前8个克隆培养物上清具有2分钟的t/2-diss,而分析物IGF-1更快地结合后4个克隆培养物上清,且更慢地解离。它停留在复合物中长于40分钟。图22中显示一个克隆的示例性传感图。可以看到,抗体结合IGF-1和嗜热栖热菌-IGF-1融合多肽,而检测不到与IGF-1和嗜热栖热菌-野生型多肽的结合。
因此,可以用嗜热栖热菌SlyD-抗原融合多肽和Thermococcusgammatolerans SlyD-抗原融合多肽作为组合免疫原和筛选工具来制备靶向包含在该多肽中的免疫原的表位特异性单克隆抗体。
图25显示支架衍生的单克隆抗体<IGF-1>M-11.11.17和<IGF-1>M-10.7.9对IGF-1具有皮摩尔亲和力。单克隆抗体<IGF-1>M-11.11.17显示t1/2diss=560分钟的IGF-1复合物稳定性。检测不到对IGF-2、野生型嗜热栖热菌SlyD、野生型Thermococcus gammatolerans SlyD、嗜热栖热菌SlyD-ΔIF和Thermococcus gammatolerans SlyD-IGF-2(53-65)的交叉反应性。
通过用重组人IGF-1常规免疫小鼠获得了单克隆抗体M-2.28.44。虽然该抗体对IGF-1具有30pM结合亲和力,但该抗体还对IGF-2具有交叉反应性(500pM的结合亲和力)。用嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽和Thermococcus gammatolerans SlyD-IGF-2(53-65)融合多肽作为分析物,可以显示交叉反应的IGF-2表位不在IGF-1/2发夹区域中。
这通过线性表位定位得到确认(见例如Frank,R.和Overwin,H.,Methods in Molecular Biology66(1996)149-169)。克隆11.11.17和11.9.15的线性IGF-1结合贡献都识别表位TGYGSSSR(SEQ ID NO:124)。克隆10.7.9的线性结合部分结合表位PTGYGSSSR(SEQ ID NO:125)。该表位定位在IGF-1发夹结构的顶部,因此不存在于IGF-2中。
通常,本文中报道的融合多肽可以用于通过使用结构模拟物的靶向表位方法来产生功能性抗体。尤其是对于抗使用重组免疫原的常规免疫活动不易接近的抗原的抗体的产生,本文中报道的融合多肽尤其适合。已发现,在作为本文中报道的融合多肽中的插入良好地呈递时,可以用所谓的隐藏表位(其埋藏在天然蛋白质构象的内侧)作为免疫原。尤其是,可以通过将这些结构移植入本文中报道的融合多肽来将新表位(其仅在变构、配体诱导的构象变化时可靶向)用作免疫原。
嵌合FKBP12/13支架:
本文中报道的一些融合多肽基于包含人FKBP12的部分和拟南芥FKBP13的部分的融合多肽。已发现,包含至少部分人FKBP12和至少部分拟南芥FKBP13的融合多肽可以用作免疫原。在此融合多肽中,人FKBP12衍生的部分作为支架在热力学上稳定。FKBP13包含稳定IF结构域的二硫键。将此序列移植入人FKBP12衍生部分来稳定该融合多肽。
包含SEQ ID NO:16的C端氨基酸序列标记的FKBP12/13融合多肽具有氨基酸序列:
MRSGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGDRGAGCGSGSSCLIPPASVLVFDVELLKLE GGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:118).。
FKBP12/13融合多肽在大肠杆菌中作为可溶性蛋白质表达(见图34)。HPLC分析(见图35)证明FKBP12/13融合多肽是单体。按上文所述进行CD光谱测量。CD光谱证明FKBP12/13融合多肽在20℃下折叠。基于嗜热栖热菌和Thermococcus gammatolerans的支架显示比FKBP12/13融合多肽高的温度稳定性。
抗-PLGF抗体:
这种情况下插入的氨基酸序列具有转角-环基序,应产生适合用于IHC的抗体。插入(片段)具有氨基酸序列DWSEYPSEVEHMFSPSS(SEQ IDNO:98)。已将免疫原中的C端半胱氨酸残基变为丝氨酸残基。
包含SEQ ID NO:16的C端氨基酸序列标记的FKBP12-PLGF融合多肽具有以下氨基酸序列:
MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAWHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGGGGSDWSEYPSEVEHMFSPSSGGGSTLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:99).。
包含C端氨基酸序列标记的SlyD/FKBP12-PLGF融合多肽具有以下氨基酸序列:
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGGGGSDVVSEYPSEVEHMFSPSSGGGSTLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:100).。
用包含PLGF(60-76)的序列的免疫原免疫小鼠。随后产生杂交瘤,并进行ELISA以及动力学筛选。
在动力学筛选方法中,用SlyD/FKBP12-PLGF融合多肽和单独移植在链霉抗生物素蛋白上的生物素化PLGF(60-76)肽来鉴定对PLGF(60-76)具有结合活性的原代培养物上清。两种分析物都产生1:1Langmuir动力学,但融合多肽显示以比SA探针移植的生物素化PLGF肽低的卡方值拟合的更好的解离。因此,基于融合多肽的筛选方法利用单体状态,及融合多肽中的免疫原在与SA探针相比时改善的表位可接近性。
通过此方法制备的抗体(如克隆53.4.1)能够在Western印迹中特异性检测PLGF。
SlyD-FKBP12/13-CSF1R融合多肽:
术语“SlyD-FKBP12/13-CSF1R融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGDRGAGCGSGGVDYKNIHLEKKYVRRDSGFSSQGVDTYVEMRPVSTSSNDSFSEQDLDKEDGGSSCLIPPASVLVFDVELLKLEGGGSRPLLPPLPGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:119).。
按本文中所述在大肠杆菌中表达该多肽,并按本文中所述纯化。Ni-NTA亲和纯化后进行大小排阻层析。将融合蛋白上样在HiLoad26/60SuperdexTM75pg柱上。用非变性SDS凝胶分析洗脱级分(见图37)。
用于产生抗体的X1氨基酸序列对应于CSF1R胞内激酶插入结构域。Src激酶、EGF1R和CSF1R自身可以磷酸化酪氨酸残基,尤其是激酶结构域环结构中的酪氨酸残基,其由苏氨酸和缬氨酸位于侧翼(见SEQ IDNO:119中297位的Y残基,还以斜体和下划线给出)。
纯化后,可以用适宜的激酶磷酸化该融合蛋白。因此,可能提供具有翻译后修饰的X1氨基酸序列,从而可能用本文中报道的融合多肽产生抗翻译后修饰的多肽的抗体。融合多肽可以用于不同的应用,如筛选、特异性测试或作为免疫原。通常,可以将作为酶促翻译后修饰或化学修饰的底物的肽作为X1氨基酸序列插入支架。用蛋白质荧光测量来测试SlyD/FKBP12/13-CSF1R融合多肽的构象性质。在20℃和25℃下,300nm至425nm扫描在305nm处出峰(见图38)。FKBP12结构域中的单个色氨酸部分显示典型的固有的色氨酸溶剂致变色荧光发射,因为它埋藏在FKBP12结构域的疏水核心中。因此,假定FKBP12/13-CSF1R多肽部分是折叠的。在50℃下,发射峰迁移至344nm,其证明色氨酸部分现在处在水性环境中,FKBP结构域部分或完全解折叠。在30℃和40℃下,可以测定折叠和解折叠的蛋白质的中间状态。
已发现,可能通过将FKBP12改造为FKBP12/13融合多肽来稳定融合多肽中的FKBP12结构域,其中用含有二硫键的FKBP13结构和来自CSF1R受体的环结构基序取代FKBP12的FLAP结构域。
融合多肽在40℃下就已经显示显著的解折叠蛋白质部分,其主要指FKBP12/13-CSF1R结构域,因为大肠杆菌SlyD不包含色氨酸。
为了用嵌合FKBP结构域作为支架来呈递正确折叠的天然二级或三级结构作为免疫原,此发现强调需要进一步稳定嵌合FKBP12,以产生非亚稳态支架。此外,不可能省去融合多肽中的大肠杆菌SlyD结构域,因为否则表达产量显著降低(数据未显示)。
表位定位;
SlyD-FKBP融合多肽还可以携带复杂的氨基酸插入基序,例如含有二硫键的二级结构。由于融合多肽不含半胱氨酸,适当条件下的柱上重折叠便于此外由SlyD自身的蛋白伴侣功能性辅助的二硫键在插入内的正确形成。
将融合多肽SlyD-FKBP12-CD81和SlyD-FKBP12-ctrl用于表位定位的目的。人CD81是丙型肝炎病毒包膜E2糖蛋白的受体。CD81是隶属于四跨膜(tetraspanin)家族的跨膜蛋白质。CD81是长度为90个氨基酸的同二聚体蛋白质,其显示所谓的蘑菇样结构(PDB1IV5)。已知涉及病毒结合的残基可以定位至所谓的长度为35个氨基酸的“头亚域”上,提供了设计抗病毒药物和疫苗的基础。由于病毒结合部位的头亚域序列长度仅为35个氨基酸,用常规交叉封闭实验难定位10kDa CD81蛋白质上的抗体表位。
难以从只是在附近或在CD81LEL结构中的其他地方结合的抗体区分直接在蘑菇样头亚域上结合的抗体。所有这些抗体都将显示HCV E2包膜蛋白竞争效应,但不特异性结合靶结构头域。因此,头域结构移植入FKBP和连续的表位定位是有利的方法。首先,避免了CD81LEL蛋白质的一些生物化学问题,因为该蛋白质自身趋向于寡聚。其次,它适于从只是结合全长CD81蛋白质的大量抗体选择抗体表位。
SlyD-FKBP12-CD81融合多肽:
术语“SlyD-FKBP12-CD81融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGGGGSCCGSSTLTALTTSVLKNNLCPSGSNIISNLFKEDCGGGSTLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SEQ IDNO:126).。
SlyD-FKBP12-ctrl融合多肽(见图1):
术语“SlyD-FKBP12-ctrl融合多肽”指具有以下氨基酸序列的多肽:
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGGGGSGGNPGPTGGGSTLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:86).。
在25℃下使用将BIAcore CM5传感器安放入系统的BIAcore2000仪器(GE Healthcare)。通过EDC/NHS化学品将每种蛋白质配体固定入流动池2、3和4。流动池1用作参考。将以下物质固定在传感器上:流动池2:SlyD-FKBP12ctrl;流动池3:SlyD-FKBP12-CD81;和流动池4:CD81LEL。注入31种抗体分析物。作为参考信号2-1、3-1和4-1监测传感图,并通过使用BIAcore评价软件4.1来评价。在分析物注入结束时,设定报告点来定量最大分析物结合信号。将最高分析物结合信号设为100%来归一化数据。归一化的抗体结合反应显示,在所测试的30种抗-CD81-LEL抗体中,只有6种显示与CD81头域上的表位结合。不结合阴性对照多肽SlyD-FKBP12ctrl。阳性对照多肽CD81-LEL(其同时是免疫原)被所有抗体结合。Slyd-FKBP12-CD81仅在抗体表位定位在蘑菇结构域中时结合。
通过X射线结晶分析确认表位定位结果
通过已知的方法使抗体K05和K04的Fab片段与CD81-LEL蛋白质共结晶,并通过x射线衍射分析来分析(Seth Harris,Palo Alto)。所获得的分辨率为K04直接识别靶表位序列,而K05在靶标之外结合。因此,x射线分析与基于支架的表位定位方法直接关联。
提供以下实施例、附图和序列来辅助理解本发明,本发明的真实范围在所附权利要求中显示。应理解,可以在所示方法中进行改变而不背离本发明的精神。
附图简述
图1SlyD/FKBP12-对照多肽的SDS PAGE(考马斯染色)和Western印迹(用抗八组氨酸标记的抗体孵育10秒)。
图2A:ERCC1(PDB1Z00):画圈的螺旋转角螺旋基序(IAASREDLALSPGLGPQKARRLFD,C274S);B:FKBP12C22A:画圈的取代序列;FKBP12嵌合体在C端与大肠杆菌SlyD融合。
图3SlyD/FKBP12-ERCC1多肽的SDS PAGE(考马斯染色)和抗组氨酸标记Western印迹(10秒暴露)。M-Novex Sharp Standard;1-2.5μgSlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽;2-5.0μg SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽;3-10μg SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽;M*-Magic Mark。
图4按600nm/分钟驱动300nm-600nm的波长扫描,记录SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽在25℃、35℃、45℃、55℃、85℃下的荧光发射强度。
图5用于测定SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽与FK-506的结合的BIAcore测定的示意图。
图6300nM SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽和300nM野生型FKBP12作为溶液中的分析物对传感器表面呈递的生物素化配体bi-FK506。
图7SlyD/FKBP12-ctrl融合多肽的分析型HPLC层析图。Ni-NTA纯化后,SlyD/FKBP12-ctrl作为单体峰洗脱。
图8SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽的分析型HPLC层析图。Ni-NTA纯化后,SlyD/FKBP12-ERCC1作为单体峰洗脱。
图9以SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽和300nM SlyD/FKBP12-ctrl作为溶液中的分析物的BIAcore结合测定动力学筛选的示意图。CM5传感器,捕获RAMFCy:兔抗小鼠Fcγ捕获抗体。
图10通过用SlyD/FKBP12-ERCC1作为溶液中的分析物的动力学筛选测定的显示抗-ERCC1抗体的动力学特性的后稳定性(Stability Late)/后结合(Binding Late)作图。所有克隆都在后结合值>40RU时定位在10-51/s趋势线,表明非凡的抗原复合物稳定性。未检测到对SlyD/FKBP12-ctrl的结合。
图11通过动力学筛选测定的抗-ERCC1抗体的特性。后结合/抗体捕获水平作图按趋势线显示结合效价通道。所有5.00X.35姐妹克隆(画圈)都定位摩尔比=0.5和摩尔比=1之间的效价通道,并选择用于进一步处理。
图12含有通过动力学筛选测定的抗-ERCC1抗体的动力学特性的表格。BL:后结合,SlyD/FKBP12-ERCC1结合期结束时以相对反应单位表示的信号振幅高度。SL:后稳定,SlyD/FKBP12-ERCC1解离期结束时以相对反应单位表示的信号振幅高度。Kd:解离期的Langmuir拟合的解离速率常数(1/s)。t1/2diss:以分钟表示的抗体-SlyD/FKBP12-ERCC1复合物半衰期,按照公式t1/2diss=ln(2)/(60*kd)计算。
图13克隆<ERCC1>M-5.3.35的示例性抗-ERCC1抗体单浓度动力学,用SlyD/FKBP12-ERCC1作为溶液中的分析物。
图14使用克隆<ERCC1>M-5.1.35的Western印迹。NuPAGE SDS凝胶(Invitrogen)上的每个泳道上样5μg OVCAR-3和HEK293细胞裂解物。检测到37kDa处的特异性ERCC1条带。
图15SCLC癌样品的FFPE包埋人癌组织中ERCC1的免疫组织化学检测。白色箭头指示以更深的颜色出现的具有提高的EECC1水平的细胞。
图16IGF-1(PDB:1PMX)和IGF-2(PDB:1IGL)PyMOL1.4的重叠。IGF-1和IGF-2的序列比对(clustalW)。黑框表示IGF-1(74-90)和IGF-2(53-65)发夹序列。
图17嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽的SDS PAGE(考马斯染色)和抗组氨酸标记Western印迹(10秒暴露)。M-Novex Sharp标准品;1-2.5μg嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽;2-5.0μg嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽;3-10μg嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽;M*-Magic Mark。
图18嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽的分析型HPLC层析图。
图19用SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)免疫NMRI小鼠12周后通过ELISA测定的血清效价。mE:毫吸光度,IGF-1:天然人IGF-1(Peprotech)。
图20免疫Balb/C和NMRI小鼠12周后通过ELISA测定的血清效价。mE:毫吸光度,IGF-1:天然人IGF-1(Peprotech)。
图21对IGF-1、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽和嗜热栖热菌SlyD野生型多肽具有结合信号的原代培养物的ELISA筛选。mE:毫吸光度,IGF-1:天然人IGF-1(Peprotech)。
图22原代培养物<IGF-1>M-11.0.15对IGF-1、IGF-2、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽和嗜热栖热菌SlyD野生型多肽的示例性BIAcore动力学筛选。
图23克隆培养物上清对IGF-1、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽和嗜热栖热菌SlyD野生型多肽的ELISA筛选。对IGF-1和嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽可检测到提高的结合吸收信号。
图24支架制备的<IGF-1>M-11.11.17-IgG对I GF-1、IGF-2、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽、嗜热栖热菌SlyD野生型多肽、Thermococcus gammatolerans SlyD野生型多肽、嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽、Thermococcus gammatolerans SlyD-IGF-2(53-65)融合多肽的BIAcore测量。
图25包含融合多肽制备的抗IGF-1抗体的结合动力学的表格。mAb:单克隆抗体;RU:捕获在传感器上的单克隆抗体的相对反应单位;抗原:溶液中的抗原;kDa:作为溶液中的分析物注入的抗原的分子量;ka:结合速率常数;kd:解离速率常数;t1/2diss:按公式t1/2diss=ln(2)/60*kd计算的抗体-抗原复合物半衰期;KD:解离常数;RMAX:90nM分析物注入的解离期结束时的结合信号;MR:摩尔比;Chi2:测量失败;n.d.:检测不到。
图26DSC测量,在10℃至95℃的温度梯度中熔化SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽的两次实验的重叠图。SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽可逆地折叠。
图27嗜热栖热菌SlyD野生型多肽、嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽(FKBP)和嗜热栖热菌SlyD-抗原融合多肽的近UV CD光谱。在20℃下,所有多肽都折叠为它们的天然结构。
图28嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽的温度依赖性CD光谱。反复的加热和冷却显示,嗜热栖热菌SlyD的FKBP结构域可逆地折叠。嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽稳定至65℃,并在85℃解折叠。
图29Thermococcus gammatolerans SlyD-抗原融合多肽的温度依赖性CD光谱。在100℃下未达到更低的信号平台,表明融合多肽尚未完全解折叠。直至80℃,该融合多肽都是稳定和折叠的。
图30反复的冻融循环和温度应力测试后,重新层析包含单体Thermococcus gammatolerans SlyD-抗原融合多肽的级分。0.75ml/分钟下100μl50mM K2HPO4/KH2PO4、pH7.0、100mM KCl、0.5mM EDTA中的300μg Thermococcus gammatolerans SlyD-抗原融合多肽的Ni-NTA洗脱级分的280nm SUX200图。
图31嗜热栖热菌SlyD野生型多肽的SDS PAGE(考马斯染色)和Western印迹(用抗八组氨酸标记抗体孵育10秒)。
图32用于抗-IGF-1抗体的此动力学筛选方法的定量。空单元格表示各值检测不到/不可测定。
图3312个克隆培养物上清结合IGF-1的动力学。
图34在大肠杆菌中表达的FKBP12/13融合多肽的SDS PAGE(考马斯染色)。
图35FKBP12/13融合多肽:Ni-NTA纯化物质的HPLC SEC洗脱图。FKBP12/13融合多肽大部分是单体。
图36SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽的分析型HPLC层析图。
图37考马斯染色的非变性8-16%Tris-Glycine Mini Gel(Invitrogen)。BM:BenchMarkTM Pre-Stained Protein Ladder(Invitrogen)。F4至f10:大小排阻层析洗脱级分。级分8和级分9在37kDa处显示单个不同的蛋白质条带。
图38SlyD-FKBP12/13-CSF1R在不同温度下的荧光发射。
图39嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽的SDS PAGE(考马斯染色)和抗组氨酸Western印迹(10秒暴露)。黑色箭头指示蛋白质条带。M-NovexSharp Standard;1-2.5μg嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽;2-5.0μg嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽;3-10μg嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽;M*Magic Mark。
图40Ni-NTA层析纯化的SlyD-FKBP12-CD81的SDS page(左)和Western印迹(右)。M:Novex Sharp标准品,1:SlyD/FKBP12-CD81;2.5μg MW:36kD,2:SlyD/FKBP12-CD81;5.0μg,3:SlyD/FKBP12-CD81;10μg M*:Magic Mark。
实施例
实施例1
表达和纯化
按照已知的方法在大肠杆菌(pQE80L载体/大肠杆菌BL21CodonPlus-RP细胞系)中产生多肽。
为了纯化粗多肽,在离液剂的存在下在非变性条件下或在变性条件下使用亲和层析步骤。对于包含SlyD部分的融合多肽,离液剂存在下的纯化尤其适合,因为可以从大肠杆菌细胞分离融合多肽的总量。此外,以无规卷曲构象获得整个融合多肽。通过用生理盐溶液洗涤柱来将仍结合于亲和层析材料的融合多肽转入非变性条件。由于融合多肽的SlyD和FKBP12部分的自发折叠,插入的氨基酸序列也转化为其天然构象。用含有咪唑梯度的生理缓冲液从亲和层析柱回收重折叠的融合多肽。
实施例2
化学衍生
用LC-SPDP(6-(3-[2-吡啶基二硫代]-(丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺)(Pierce,目录号:68181-17-9)在酸性条件(pH6)下活化C端赖氨酸残基。
精氨酸和赖氨酸是可以摄取赖氨酸的烷基铵基团的质子的碱。可以用任意羟基琥珀酰亚胺基活化的碳酸来衍生自由氨基。
实施例3
福尔马林处理
可以用福尔马林溶液处理所衍生的融合多肽。然后可以通过大小排阻层析来纯化固定的衍生融合多肽,以获得具有确定的寡聚状态(单体、寡聚体、多聚体)的组合物。
实施例4
产生抗体的克隆培养物上清的BIAcore表征
使用将BIAcore CM5传感器安放入系统的BIAcore T100仪器(GEHealthcare)。按100μl/分钟注入0.1%SDS、50mM NaOH、10mM HCl和100mM H3PO4来预处理传感器1分钟。
系统缓冲液是HBS-ET(补充了150mM NaCl、1mM EDTA、0.05%(w/v)20的10mM HEPES(pH7.4))。样品缓冲液是系统缓冲液。
BIAcore T100系统在控制软件V1.1.1下驱动。按厂家的说明通过EDC/NHS化学品将多克隆兔IgG抗体<IgGFCγM>R(JacksonImmunoResearch Laboratories Inc.)以30μg/ml于10mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中按6500RU分别固定在流动池1、2、3和4上。最后,用1M乙醇胺溶液封闭传感器表面。整个实验在25℃下进行。
按5μl/分钟的流速在<IgGFCγM>R表面上捕获包含35nM至190nM的各抗体的克隆培养物上清1分钟。作为溶液中的分析物,使用了重组抗原、生物素化二硫键桥接重组抗原、SlyD/FKBP12-抗原、嗜热栖热菌SlyD-抗原、SlyD/FKBP12-对照和/或嗜热栖热菌SlyD-wt融合多肽。按90nM、30nM、10nM、3.3nM、1.1nM和0nM的不同浓度梯度注入各分析物。按100μl/分钟的流速监测结合期3.5分钟。按100μl/分钟的流速监测解离15分钟。用10mM甘氨酸缓冲液(pH1.7)再生系统。用BIAcore评价软件评价动力学。
实施例5
IHC样品制备
用有机溶剂处理基质固定的LC-SPDP融合多肽,加热,并用酸性缓冲液处理。然后在还原条件下回收基质结合的多肽。为了获得具有确定组成的物质,可以进行大小排阻层析。这样获得的物质具有确定的寡聚状态(单体、寡聚体和多聚体),可以用作用于免疫实验动物的免疫原,但它还可以用作用于选择和筛选抗体的测试抗原。
实施例6
免疫
按不同剂量对实验动物(如小鼠、大鼠、兔、绵羊或仓鼠)腹膜内施用预先配制的免疫原性融合多肽。在采集B细胞之前,进行加强免疫。B细胞杂交瘤可以按照Koehler和Millstein的方法(Kohler,G.和Milstein,C.,Nature256(1975)495-497)获得。所获得的杂交瘤作为单克隆或细胞保藏在多孔板的孔中。用动力学筛选方法进一步筛选就分泌性抗体对该抗体的结合而言测试为阳性的原代杂交瘤培养物。
实施例7
抗-IGF-1抗体
用ELISA分析了获自四只免疫的NMRI小鼠的细胞。通过加入含有0.41μg多肽/ml的溶液来用SlyD/FKBP12-IGF-1、SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1、SlyD/FKBP12-对照或嗜热栖热菌SlyD-wt包被Nunc Maxisorb F多孔板。通过加入含有90ng/ml生物素化IGF-1或500ng/ml生物素化IGF-1-肽环的溶液来将分离的抗原IGF-1固定在StreptaWell High Bind SA多孔板的孔中。
然后通过在室温下加入含1%RPLA的PBS溶液来封闭自由结合部位。用含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液洗涤孔三次。用PBS1:50稀释的小鼠血清作为样品。按1:4梯度进行可选的进一步稀释,直至1:819,200的最终稀释度。孵育时间为室温下1小时。用含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液洗涤孔三次。用缀合至过氧化物酶的抗靶抗体的恒定结构域的多克隆抗体作为检测抗体(PAK<M-Fcγ>S-F(ab′)2-POD)。按含1%(w/v)RSA的PBS中80ng/ml的浓度加入检测抗体。孵育时间为室温下1小时。用含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液洗涤孔三次。然后用ABTS溶液室温下孵育孔15分钟。分光光度计测定显色的强度。下表中提供示例性结果。
表
-:在ELISA中检测不到结合
实施例8
杂交瘤培养物上清的动力学筛选
为了选择适合用于IHC的抗体,设定靶复合物37℃半衰期为10分钟。
在软件版本V1.1的控制下在BIAcore A100上进行动力学筛选。将BIAcore CM5芯片装至机器,并按厂家的说明进行流体动力学研究,然后处理芯片。用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05%(w/v)P20)作为运行缓冲液。将10mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中浓度为30μg/ml的多克隆抗-IgG Fc捕获抗体组合物预浓缩至流动池1、2、3和4中的斑点1、2、4和5。通过NHS/EDC按10,000RU共价固定抗体。然后通过用1M乙醇胺溶液饱和来去活化传感器。斑点1和2用于测定,斑点2和4用作参考。在加至传感芯片之前,将杂交瘤培养物上清1:5稀释在HBS-EP缓冲液中。按30μl/分钟的流速加入稀释的溶液1分钟。然后立即按30μl/分钟的流速注入抗原2分钟。然后再记录信号5分钟。通过按30μl/分钟的流速注入10mM甘氨酸-HCl溶液(pH1.7)2分钟来再生传感器。抗原的注入结束前不久记录的信号表示为后结合(BL)。解离的记录结束前不久记录的信号表示为后稳定性(SL)。用其来按以下公式计算表观复合物稳定性:
(1-[BL(RU)-SL(RU)/BL(RU)]
通过FACS(FACSAria(Becton Dickinson),软件V4.1.2)来将动力学筛选中选择的杂交瘤细胞保藏为单细胞。在24孔板中或在100ml转瓶中在RPMI-1640培养基中培养单克隆。
实施例9
免疫组织化学分析
手动或在Ventana Benchmark XT或Discovery XT8R机器上自动进行IHC分析。在适合的阳性或genitive、福尔马林固定或冷冻保存的组织或细胞上测试抗体。
备选地,用编码靶多肽的核酸转染细胞。裂解转染的细胞,并通过Western印迹测试它们作为阳性或阴性对照的适合性。
实施例10
抗-ERCC1抗体的SlyD/FKB12-抗原支架辅助产生
免疫
用100μg KHL偶联的涵盖人ERCC1(切除修复交叉互补)的氨基酸219-245的ERCC1衍生肽对8-12周龄SJL小鼠进行腹膜内免疫。通过肽合成来合成产生ERCC1衍生物。
免疫小鼠3次(初次及初次加强后6周和10周)。第一次免疫用弗氏完全佐剂进行,第二和第三次免疫用弗式不完全佐剂进行。在进行杂交瘤融合前三天用100μg KLH偶联的肽抗原静脉内进行最后一次加强。按照Kohler和Milstein(Kohler,G和Milstein,C.,Nature256(1975)495-497)进行杂交瘤原代培养物的产生。通过有限稀释将杂交瘤分离入96孔MTP,并利用ELISA针对抗原结合进行筛选。ELISA由在固件V3.1519/03/01、XREAD PLUS版本V4.20下运行的Tecan Sunrise驱动。将在ELISA中通过对涵盖氨基酸219-245的生物素化ERCC1衍生肽的结合显示阳性颜色形成的原代杂交瘤细胞培养物转入本文中所述的动力学筛选方法。
为了避免选择到不适合用于IHC、只是结合线性肽的抗体,用基于支架的方法进行了进一步的筛选努力。支架方法进一步去选择在其末端结合免疫原性肽的抗体。
SlyD/FKBP12-ERCC1的产生
编码SlyD/FKBP12-ERCC1和SlyD/FKBP12-ctrl的合成基因购自Sloning Biotechnology GmbH(德国),并克隆入pQE80L表达载体。多肽作为大肠杆菌密码子优化的基因构建体在大肠杆菌BL21CodonPlus-RP中产生(见图3和8)。
为了纯化粗融合多肽,在离液剂的存在下在变性条件下使用亲和层析步骤。对于含有SlyD部分的融合多肽,尤其使用离液剂存在下的纯化,因为可以从大肠杆菌细胞分离融合多肽的总量。此外,以无规卷曲构象获得整个融合多肽。通过用生理盐溶液洗涤柱来将仍结合于亲和层析材料的融合多肽转入非变性条件。由于融合多肽的SlyD和FKBP12部分的自发折叠,插入的氨基酸序列也可以转化为其天然构象。用含有咪唑梯度的生理缓冲液从亲和层析柱回收重折叠的融合多肽。图3中显示SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽的SDS凝胶和Western印迹。<His6>-Western印迹显示融合多肽的C端完整性。未检测到其他多肽条带。
荧光测量
对75mM HEPES缓冲液(pH7.5、150mM NaCl、6.5%(w/v)蔗糖、10mM半胱氨酸)透析亲和纯化的融合多肽并过滤。用针对35380.301Da多肽计算的消光系数在7.4mg/ml下UV/Vis光谱定量SlyD/FKBP12-ERCC1(图4)。在从220nm至340nm的波长筛选中,获得了衍生自单个FKBP12Trp的280nm吸收峰。未检测到340nm吸收。
用蛋白质荧光测量来测试SlyD/FKBP12-ERCC1的构象性质。FKBP12C22A作为用于多肽插入的载体尤其有用,因为单个FKBP12Trp部分可以用来诊断FKBP12部分的结构完整性(Scholz,C.等,J.Biol.Chem.271(1996)12703-12707;Russo,A.T.等,J.Mol.Biol.330(2003)851-866)。处于其天然结构的FKBP12C22A在320nm处显示单个荧光发射峰(Zoldak,G.等,J.Mol.Biol.386(2009)1138-1152)。
在不同温度下分析了250μl含2.5mg/ml SlyD/FKBP12-ERCC1的HBS-E缓冲液(pH7.4)。按5nm的激发和发射带宽使用扫描软件版本1.1(132)下的Cary Eclipse仪器。在600nm/分钟下驱动300nm-600nm的波长扫描。将固有的色氨酸荧光的激发设为294nm。获得了350nm处的宽峰(图4)。按照理论,350nm处固有的Trp溶剂致变色(solvatochromic)荧光发射在折叠的FKBPl2蛋白质环境中将强烈猝灭,而它随FKBPl2的解折叠而提高。从25℃至85℃的温度筛选未显示任何其他荧光发射峰,但显示350nm发射的温度依赖性荧光猝灭。检测不到指示FKBPl2的结构完整性的320nm发射。
因此,SlyD/FKBPl2-ERCCl融合多肽中的单个Trp残基在25℃下已经暴露于溶剂,表明SlyD-FKBPl2背景中的嵌合FKBPl2部分或完全解折叠。
因此,支架是用于模拟和呈递结构多样的不稳定构象的理想平台,因为它们通常在免疫组织化学实验期间存在于石蜡包埋、福尔马林固定的组织中(Abe,M.等,Anal.Biochem.318(2003)118-123)。
FK506BIAcore结合测定
按照厂家的说明用传感SA芯片装配软件版本V4.1控制下的BIAcore3000仪器。用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05%(w/v)P20(非离子型表面活性剂多乙氧基醚20(Tween20)的10%水溶液))作为运行缓冲液。在流动池4上捕获1213RU的bi-接头-FK506缀合物(Roche Diagnostics Mannheim,德国)。
按30μl/分钟向系统中注入300nM纯化的SlyD/FKBPl2-ERCCl融合多肽和300nM SlyD/FKBP12对照多肽,3分钟结合时间和3分钟解离时间。
通过按30μl/分钟的流速注入10mM甘氨酸-HCl溶液(pH1.7)2分钟来再生传感器。
以300nM融合多肽SlyD/FKBP12-ERCC1作为溶液中的分析物对传感器表面呈递的配体bi-FK506(图5)的BIAcore结合测定显示无结合活性(图6),表明嵌合融合多肽中FKBP12部分的结构功能丧失。对照多肽FKBP12(C22A)显示结合活性。
SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽不能结合FK-506提供了不同于FKBP12(C22A)构象的结构的SlyD/FKBP12-ERCC1结构的另一证据。这伴随着嵌合FKBP12结构域的结合活性的丧失。
分析型HPLC层析分析
用融合多肽进行了分析型HPLC层析分析来分析该融合多肽的寡聚状态。
按厂家的建议在25℃使用配有在HBS-E缓冲液(pH7.4)中平衡的TSK3000SWXL柱的Chromeleon Dionex HPLC设备。缓冲液流速为0.7ml/分钟。将100μl含有SlyD/FKBP12-ERCC1的溶液(7.4mg/ml)注入系统(见图8)。在另一工作流程中,将含有SlyD/FKBP12对照的溶液(9.5mg/ml)注入系统(见图7)。在另一工作流程中,将含有嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)的溶液(3mg/ml)注入系统(见图18)。在另一工作流程中,将含有SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)的溶液(5.4mg/ml)注入系统(见图36)。UV/VIS检测器设为280nm。按照厂家的说明用Dionex软件版本6.80SP2Build2284评价数据。用分子标准品Oriental Yeast,目录号46804000校准系统。
图8显示Ni-NTA亲和纯化的SlyD/FKBP12-ERCC1的柱洗脱图。可以发现整个洗脱图91.5%的面积积分定位于在12.37分钟保留时间处洗脱的5号峰中(1310.319mAU)。图显示单体SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽。仅在最初的Ni-NTA纯化步骤后就已经获得了单体融合多肽。
使用动力学筛选
将SlyD/FKBP12-ERCC1融合多肽用于SPR结合分析。用溶液中的单体和单价的分析物来按照Langmuir模型测定抗体结合动力学是有帮助的。此外,用具有提高的(例如高)分子量的分析物来提高测量的质量灵敏度对SPR测量有帮助。同时,必须提供表位可接近性。
图9中显示BIAcore筛选测定的示意图。
在软件版本V1.1的控制下在BIAcore A100仪器上进行动力学筛选。将BIAcore CM5芯片装至机器,并按厂家的说明进行流体动力学研究。然后处理芯片。用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05%(w/v)P20)作为运行缓冲液。将10mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中浓度为30μg/ml的抗-IgG Fc捕获抗体的多克隆组合物预浓缩至流动池1、2、3和4中的斑点1、2、4和5。通过NHS/EDC化学按10,000RU共价固定抗体。然后用1M乙醇胺溶液去活化传感器。斑点1和2用于测定,斑点2和4用作参考。在加至传感芯片之前,将杂交瘤上清1:5稀释在HBS-EP缓冲液中。按30μl/分钟的流速应用稀释的溶液1分钟。然后立即按30μl/分钟的流速注入配制的抗原(如FKBP12融合多肽)2分钟。然后再记录信号5分钟。通过按30μl/分钟的流速注入10mM甘氨酸-HCl溶液(pH1.7)2分钟来再生传感器。抗原的注入结束前不久记录的信号表示为后结合(BL)。解离的记录结束前不久记录的信号表示为后稳定性(SL)。两个数据点都对彼此作图。所选择的的抗体具有等于后稳定性值的后结合值。这些抗体在图中定位在指示BL=SL的趋势线附近的区域。
图10显示所选择的抗-ERCC1抗体的数据。可以看到,SlyD/FKBP12-ERCC1相互作用高度特异。没有检测到与SlyD/FKBP12对照样品的相互作用。总体上没有非特异性结合可见。
图11显示抗体的效价分析。显示饱和表面呈递的抗体(捕获水平,RU)的以反应单位表示的抗原量(后结合,RU)。图11中的趋势线和箭头指示表面呈递的抗体的效价(摩尔比)。所有姐妹克隆(克隆ID5.00x.35)都定位在效价通道MR0.5-MR1.0,而所有其他克隆都定位在指示更少功能性的低于MR0.5的通道。没有检测到对SlyD/FKBP12对照的功能性结合。
图12显示此动力学筛选方法的定量。所有6个姐妹克隆(5.001.35至5.006.35)都显示适宜的后结合和后稳定性值。结合速率常数kd(1/s)显示高抗原复合物稳定性,符合适合用于IHC的抗体的要求。对于全部6个姐妹克隆,计算的t1/2diss抗原复合物稳定性半衰期为204分钟。
图13示例性显示克隆5.003.35对分析物SlyD/FKBP12-ERCC1和SlyD/FKBP12对照的动力学筛选特征。由于SlyD/FKBP12-ERCC1是稳定、可溶和单体的分析物,它完美地符合1:1Langmuir解离模型(红色的解离原始数据上的黑线)。没有检测到非特异性结合。没有检测到对SlyD/FKBP12对照的相互作用。
Western印迹
图14显示使用克隆5.001.35的Western印迹实验。Western印迹可以用作随后的抗体IHC适合性的指示。
对于Western印迹,将5μg OVCAR-3和5μg HEK-293细胞裂解物上样在4-12%NuPAGE SDS凝胶(Invitrogen)上的凝胶泳道中。两种细胞系都未例如通过照射或顺铂预处理。
用NuPAGE缓冲液和和试剂(Invitrogen)按照标准流程进行Western印迹。抗体5.001.35按50ng/ml的浓度使用。一抗孵育在室温(RT)下进行30分钟。按照厂家的说明(Roche Applied Science,Mannheim,德国)用LumiImager与LumiLight试剂一起显色膜。内源性基础ERCC1水平在Western印迹中特异性检测为单条37kDa条带。
IHC实验
图15显示FFPE人癌组织中ERCC1的IHC检测。对于免疫组织化学检测,制备SCLC癌样品的2μm切片。按厂家的标准操作说明用Ventana缓冲液和试剂在Ventana Benchmark XT自动IHC染色仪上进行所有染色方法。一抗(克隆<ERCC1>M-5.1.35)按5μg/ml的浓度使用。一抗于37℃在切片上孵育32分钟。按厂家的建议用Ventana iViewTM检测试剂盒检测一抗。白色箭头指示以更深的颜色出现的具有提高的ERCC1水平的细胞。
摘要
与小分子量ERCC1肽(2kDa)不同,本文中所用的支架是高分子量分析物(36kDa),其在基于SPR的动力学筛选方法中放大了信号。
基于肽的筛选试剂具有选择出识别肽末端的抗体的风险,通过使用本文中报道的支架方法完全避开了该风险,其中将肽包埋在N端和C端多肽背景中。尽管提供了多种亚稳态肽插入,但支架融合多肽总体上是稳定、可溶和单体的。可以利用生物传感器容易地测量1:1Langmuir动力学。
在此背景(set up)中使用融合多肽,非常适于模拟FFPE IHC环境,因此是非常适合用于制备适用于IHC的抗体的筛选试剂。
不受限于理论,该融合多肽包含折叠的SlyD衍生部分和解折叠或部分解折叠的人FKBP12衍生部分,该FKBP12衍生部分至少为溶剂接触提供其单个核心Trp残基,如针对SlyD/FKBP12-ERCC1所显示。SlyD可逆地折叠,并显示对技术应用而言足够的热稳定性。
SlyD/FKBP-12支架是适合用于模拟多种肽二级结构基序(如存在于免疫组织化学实验中的石蜡包埋、福尔马林固定组织中的那些(见Abe等(2003)上文))的平台。
例如就可溶性、可逆折叠(复性/变性)及有待正确形成的二硫键的缺乏而言,与从其衍生插入的(免疫原性)氨基酸序列的全长多肽相比,融合多肽尤其适合作为免疫原。本文中报道的融合多肽提供了免疫原性氨基酸序列插入的支架。它稳定所插入的免疫原性氨基酸序列的结构(不受限于理论,通过降低构象熵)。不受限于理论,假定N端SlyD融合多肽保持整个嵌合融合多肽处于可溶且热力学稳定,但部分解折叠的形式。
Rebuzzini,G.(在Milano-Bicocca大学(意大利)的博士研究(2009))报道了应用于化学发光免疫测定的丙型肝炎病毒NS3解旋酶结构域的研究。在他的研究中,Rebuzzini报道了用作用于呈递具有Knappe,T.A.等(J.Mol.Biol.368(2007)1458-1468)的插入序列的NS3解旋酶结构域的免疫原的嵌合FKBP12在热力学上不稳定。这符合我们的发现,SlyD-FKBP12-抗原融合多肽中的嵌合FKBP12部分部分或完全解折叠。与Rebuzzini的发现不同,本文中发现SlyD/FKBP12-抗原融合多肽是单体且稳定。
实施例11
IGF-1(74-90)特异性抗体的产生
通过用嵌合嗜热栖热菌-SlyD-抗原融合多肽免疫小鼠来获得抗原特异性抗体。可以靶向支架表面上的多个表位,通过对作为阴性对照的野生型嗜热栖热菌-SlyD或对作为阳性对照的天然重组抗原(IGF-1)的差示筛选来从其鉴定结合靶抗原的抗体。在下文中,实例证明古细菌SlyD衍生物与潜在的亚稳态人FKBP12相比的特性。嗜热栖热菌-SlyD允许呈递焓、刚性和稳定的结构,因此适合用于制备抗天然蛋白质结构的单克隆抗体。
嗜热栖热菌SlyD融合多肽的产生
盐酸胍(GdmCl)(A级)购自NIGU(Waldkraiburg,德国)。无EDTA蛋白酶抑制剂片剂、咪唑和EDTA来自Roche Diagnostics GmbH(Mannheim,德国),所有其他化学药品都是来自Merck(Darmstadt,德国)的分析级。超滤膜(YM10,YM30)购自Amicon(Danvers,MA,USA),微量渗透膜(VS/0.025μm)和超滤单元(Biomax ultrafree过滤装置)来自Millipore(Bedford,MA,USA)。用于过滤粗裂解物的硝酸纤维素和醋酸纤维素膜(1.2μm、0.45μm和0.2μm孔径)来自Sartorius(Goettingen,德国)。
表达盒的克隆
从SwissProt数据库检索来自嗜热栖热菌的SlyD多肽的序列(检索号Q72H58)。从Prosite数据库检索来自Thermococcus gammatolerans的SlyD多肽的序列(检索号C5A738)。编码嗜热栖热菌SlyD、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)和嗜热栖热菌SlyD-ΔIF的合成基因购自SloningBiotechnology GmbH(德国),并克隆入pQE80L表达载体。针对在大肠杆菌宿主细胞中的表达优化密码子选择。编码Thermococcusgammatolerans SlyD、Thermococcus gammatolerans SlyD-IGF-2(53-65)、嗜热栖热菌SlyD-抗原和Thermococcus gammatolerans SlyD-抗原的合成基因购自Geneart(德国),并克隆入pET24表达载体(Novagen,Madison,Wisconsin,USA)。针对在大肠杆菌宿主细胞中的表达优选密码子选择。
此外,将GS接头(GGGS,SEQ ID NO:81)和His标记融合至羧基端,以允许通过固定化金属离子交换层析来亲和纯化融合多肽。
为了产生特异性结合IGF-1片段74-90(氨基酸序列NKPTGYGSSSRRAPQTG,SEQ ID NO:92)的单克隆抗体,通过缺失原蛋白质的氨基酸68-120来将各肽氨基酸序列融合入衍生自嗜热栖热菌的蛋白伴侣SlyD。由于IGF-1插入的角度适应,用Gly取代70位的Asp和88位的Leu(D70G和L88G)。因此,融合多肽具有氨基酸序列:
MRGSKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHGNKPTGYGS S SRRAPQTGGAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:101).。
作为对照,使用了来自嗜热栖热菌的天然野生型SlyD:
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHDPEGVQVVPLSAFPEDAEVVPGAQFYAQDMEGNPMPLTVVAVEGEEVTVDFNHPLAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSRKHHHHHH(SEQ ID NO:104).。
对于筛选和特异性测试,产生了嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽。嗜热栖热菌SlyD-ΔIF缺乏IF结构域(其被氨基酸序列基序AGSGSS取代),且包含SEQ ID NO:16的C端氨基酸序列标记:
MRGSKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHGAGSGSSGAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:120).。
作为对照,使用了包含SEQ ID NO:16的C端氨基酸序列标记的来自Thermococcus gammatolerans的天然SlyD:
MKVERGDFVLFNYVGRYENGEVFDTSYESVAREQGIFVEEREYSPIGVTVGAGEIIPGIEEALLGMELGEKKEVVVPPEKGYGMPREDLIVPVPIEQFTSAGLEPVEGMYVMTDAGIAKILKVEEKTVRLDFNHPLAGKTAIFEIEVVEIKKAGEAGGGSRKHHHHHH(SEQ ID NO:121).。
作为交叉反应性的对照,将来自人IGF-2(53-65)的结构上同源的发夹序列插入在C端与GS接头和六组氨酸标记融合的Thermococcusgammatolerans SlyD:
MKVERGDFVLFNYVGRYENGEVFDTSYESVAREQGIFVEEREYSPIGVTVGAGEIIPGIEEALLGMELGEKKEVVVPPEKGYGMP-G-SRVSRRSRG-G-AGKTAIFEIEVVEIKKAGEAGGGSRKHHHHHH(SEQ ID NO:122).。
融合多肽的表达、纯化和重折叠
可以通过使用几乎相同的流程来纯化和重折叠所有SlyD多肽。在含有用于选择性生长的各抗生素(卡那霉素30μg/ml,或氨苄青霉素(100μg/ml))的LB培养基中37℃培养包含具体表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞至OD600为1.5,通过加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导胞质过量表达。诱导后3小时,通过离心(5,000g,20分钟)收集细胞,冷冻,并保存在-20℃。对于细胞裂解,将冷冻的沉淀重悬在冷却的补充了7M GdmCl和5mM咪唑的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中。然后冰上搅拌悬液2-10小时至细胞完全裂解。离心(25,000g,1小时)和过滤(硝酸纤维素膜,8.0μm,1.2μm,0.2μm)后,将裂解物上样至用裂解缓冲液平衡的Ni-NTA柱上。在随后的洗涤步骤中,咪唑浓度提高至10mM(在含有7M GdmCl、5.0mM TCEP的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中),并加入5mM TCEP,以保持硫羟基部分处于还原形式,并防止过早的二硫键桥接。应用至少15至20体积的还原洗涤缓冲液。然后,用包含100mM NaCl、10mM咪唑和5mM TCEP的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)取代GdmCl溶液,以诱导基质结合的SlyD融合多肽的构象重折叠。为了避免共纯化的蛋白酶的再活化,向重折叠缓冲液加入蛋白酶抑制剂混合物(无EDTA,Roche)。在过夜方法中应用总计15至20个柱体积的重折叠缓冲液。然后,通过用10柱体积包含100mM NaCl和10mM咪唑的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)洗涤来去除TCEP和无EDTA抑制剂混合物二者。在最后的洗涤步骤中,咪唑浓度提高至30nM(10柱体积),以去除顽固污染物。通过应用相同缓冲液中的250mM咪唑来洗脱天然多肽。通过N-三(羟甲基)甲基甘氨酸-SDS-PAGE(Schaegger,H.和von Jagow,G.,Anal.Biochem.166(1987)368-379)评估含蛋白质的级分的纯度,并混合。随后,用磷酸钾作为缓冲系统(50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、100mM KCl、0.5mM EDTA)对蛋白质进行大小排阻层析(SuperdexTM HiLoad,Amersham Pharmacia)。最后,混合含蛋白质的级分,并在Amicon cell(YM10)中浓缩至~5mg/ml的浓度。
UV光谱测量
用UVIKON XL双束分光光度计进行蛋白质浓度测量。按照Pace(Pace,C.N.等,Protein Sci.4(1995)2411-2423)计算SlyD变体的摩尔消光系数(ε280)。
CD光谱测量
为了检查本发明的嵌合融合蛋白质是否采用折叠构象,测量了近UV区域中的CD光谱。按厂家的建议用A JASCO J-720仪器和JASCO软件记录和评价CD光谱。使用具有0.2cm光程的石英杯。将仪器设为1℃分辨率、1nm带宽、5mdeg灵敏度和累积模式1。样品缓冲液是50mM磷酸钾pH7.5、100mM NaCl、1mM EDTA。每次分析的蛋白质分析物浓度为36μM嗜热栖热菌SlyD野生型、23μM嗜热栖热菌SlyD-ΔIF、16μM嗜热栖热菌SlyD-抗原、19μM Thermococcus gammatolerans SlyD野生型和16μM Thermococcus gammatolerans SlyD-抗原。在20℃记录具有0.5nm分辨率和每分钟20nm扫描的250nm和330nm之间的CD信号。在随后的实验性实施方案中,在277nm恒定波长下在分别用于Thermococcus gammatolerans SlyD衍生物的(20℃-100℃)和(100℃-20℃)、用于嗜热栖热菌SlyD衍生物的(20℃-85℃)和(85℃-20℃)的温度梯度中测定CD信号。按每分钟1℃驱动温度梯度。
图27显示融合多肽嗜热栖热菌SlyD野生型、嗜热栖热菌SlyD-ΔIF和嗜热栖热菌SlyD-抗原的三个CD光谱的叠加。CD特征显示,在20℃下,所有融合多肽甚至在IF结构域缺失或被氨基酸移植取代时都折叠为它们的天然结构。
图28显示融合多肽嗜热栖热菌SlyD-抗原在20℃至85℃的温度梯度中的温度依赖性近UV CD光谱。嗜热栖热菌SlyD-抗原可逆地解折叠和重折叠。
在给定的物理条件下,甚至在100℃也不能达到Thermococcusgammatolerans SlyD-抗原的完全解折叠(见图29)。古细菌FKBP结构域非凡的稳定性使得能够通过取代它们的IF结构域来移植多肽,其中同时保持了新产生的嵌合支架蛋白的总体稳定性。
用嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)免疫小鼠并制备抗IGF-1的单克隆抗体
用100μg嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)对8-12周龄Balb/c和NMRI小鼠进行反复的腹膜内免疫。在初次免疫后6周和10周的时间点免疫小鼠三次。第一次免疫可以用弗氏完全佐剂进行,第二和第三次免疫用弗式不完全佐剂进行。12周后通过下文中所述的ELISA方法测试小鼠血清对天然重组IGF-1和嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)的效价。12周后,用ELISA分析血清效价。ELISA由在固件V3.1519/03/01、XREAD PLUS版本V4.20下运行的Tecan Sunrise驱动。通过加入含0.5μg多肽/ml的溶液来用嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)包被Nunc Maxisorb F多孔板。通过加入含有90ng/ml生物素化IGF-1的溶液来将分离的抗原IGF-1固定在StreptaWell High Bind SA多孔板的孔中。然后通过在室温下加入含1%RPLA的PBS溶液1小时来封闭自由结合部位。用含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液洗涤孔三次。用PBS1:50稀释的小鼠血清作为样品。按1:4梯度进行可选的进一步稀释,直至1:819,200的最终稀释度。孵育时间为室温下1小时。用含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液洗涤孔三次。用缀合至过氧化物酶的抗靶抗体的恒定结构域的多克隆抗体作为检测抗体(PAK<M-Fcγ>S-F(ab′)2-POD)。按含1%(w/v)RSA的PBS中80ng/ml的浓度应用检测抗体。孵育时间为室温下1小时。用含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液洗涤孔三次。然后用ABTS溶液室温下孵育孔15分钟。分光光度计测定显色的强度。图20显示所获得的小鼠血清效价。
制备脾细胞并与骨髓瘤细胞系融合前三天,通过静脉内注射100μg嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽来进行最后一次加强免疫。可以按照Koehler和Milstein(Koehler,G.和Milstein,C.,Nature.256(1975)495-497)的方法进行杂交瘤原代培养物的产生。
ELISA筛选
通过ELISA测试原代培养物上清对免疫原嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)、生物素化天然IGF-1和野生型嗜热栖热菌SlyD各空白板的反应性。Elisa由Tecan Sunrise,固件V3.1519/03/01、XREAD PLUS版本V4.20驱动。用5μg/ml SlyD-融合多肽包被Nunc Maxisorb F多孔ELISA板。用125ng/ml重组生物素化IGF-1抗原包被StreptaWell High Bind SA多孔板。然后用含1%RPLA的PBS在室温下封闭自由结合部位1小时。用含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液洗涤孔三次。用RPMI1640培养基中未稀释的杂交瘤上清作为样品。孵育时间为室温下1小时。用含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液洗涤孔三次。用缀合至过氧化物酶的抗靶标抗体的恒定结构域的多克隆抗体作为检测抗体(PAK<M-Fcγ>S-F(ab′)2-POD)。按含1%(w/v)RSA的PBS中80ng/ml的浓度加入检测抗体。孵育时间为室温下1小时。用含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液洗涤孔三次。然后用ABTS溶液室温下孵育孔15分钟。在405nm分光光度计测定显色的强度。参考波长为492nm。将在ELISA中通过与重组IGF-1、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)结合显示快速和强烈的颜色形成,且与嗜热栖热菌SlyD结合较少的原代杂交瘤上清转入下文中所述的动力学筛选方法。
基于SPR的动力学筛选
将嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)、天然重组IGF-1、天然重组IGF-2、野生型嗜热栖热菌SlyD和嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)用于基于SPR的动力学筛选分析。对于SPR分析,通常接受用溶液中的单体和单价的分析物来按照Langmuir模型测定抗体结合动力学。此外,对于SPR测量,用具有较高分子量的分析物来提高测量的灵敏度非常有利,因为SPR是质量敏感的分析。
在软件版本V1.1的控制下在BIAcore A100仪器上进行动力学筛选。将BIAcore CM5芯片安放入仪器,并按厂家的说明进行流体动力学研究处理。用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、1mMEDTA、0.05%(w/v)P20)作为运行缓冲液。将10mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中30μg/ml的多克隆兔抗-小鼠IgG Fc捕获抗体按10,000RU固定至流动池1、2、3和4中的斑点1、2、4和5(图23)。通过NHS/EDC化学共价固定抗体。然后用1M乙醇胺溶液去活化传感器。斑点1和5用于测定,斑点2和4用作参考。在应用至传感芯片之前,将杂交瘤上清1:2稀释在HBS-EP缓冲液中。按30μl/分钟的流速加入稀释的溶液1分钟。然后立即按30μl/分钟的流速注入分析物(如嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽)2分钟。然后记录信号5分钟解离时间。通过按30μl/分钟的流速注入10mM甘氨酸-HCl溶液(pH1.7)2分钟来再生传感器。用两个报告点来表征动力学筛选表现,这两个报告点是分析物注入结束前不久的记录信号,表示为后结合(BL),解离时间结束前不久的记录信号,后稳定性(SL)。
此外,按照Langmuir模型计算解离速率常数kd(1/s),并可以按照公式ln(2)/(60*kd)计算以分钟表示的抗体/抗原复合物半衰期。
通过用抗原嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)免疫,并用嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)、嗜热栖热菌SlyD野生型、天然IGF-1和天然IGF-2筛选来获得抗体。基于支架的筛选方法允许特异性制备结合预定的IGF-1发夹表位的抗体。
通过已知的方法通过有限稀释将原代培养物上清进一步发展为克隆培养物上清。在针对亲和力和特异性的功能测定中测试克隆培养物上清。
产生抗体的克隆培养物上清的BIAcore表征
使用将BIAcore CM5传感器安放入系统的BIAcore T200仪器(GEHealthcare)。按100μl/分钟注入0.1%SDS、50mM NaOH、10mM HCl和100mM H3PO4来预处理传感器1分钟。
BIAcore T200系统在控制软件V1.1.1下驱动。按厂家的说明通过EDC/NHS化学品将多克隆兔IgG抗体<IgGFCγM>R(JacksonImmunoResearch Laboratories Inc.)以30μg/ml于10mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中按6500RU分别固定在流动池1、2、3和4上。最后,用1M乙醇胺溶液封闭传感器表面。整个实验在25℃下进行。
按5μl/分钟的流速在<IgGFCγM>R表面上捕获包含约40nM的各抗体的克隆培养物上清2分钟。作为溶液中的分析物,使用了重组天然IGF-1、重组天然IGF-2、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)、重组野生型嗜热栖热菌SlyD、重组嗜热栖热菌SlyD-ΔIF、重组野生型Thermococcusgammatolerans SlyD、重组Thermococcus gammatolerans SlyD-IGF-2(53-65)融合多肽。嗜热栖热菌SlyD-ΔIF仅是缺乏IF结构域的嗜热栖热菌SlyD的FKBP结构域。与IGF-2发夹插入不同,Thermococcusgammatolerans SlyD-IGF-2(53-65)用来反向筛选和研究对IGF-1发夹的特异性。按90nM、30nM、10nM、3.3nM、1.1nM和0nM的不同浓度梯度注入各分析物。按100μl/分钟的流速监测结合期3分钟。按100μl/分钟的流速监测解离10分钟。用10mM甘氨酸缓冲液(pH1.7)再生系统。用BIAcore评价软件评价动力学。
本文中使用以下术语:mAb:单克隆抗体;RU:捕获在传感器上的单克隆抗体的相对反应单位;抗原:溶液中的抗原;kDa:作为溶液中的分析物注入的抗原的分子量;ka:结合速率常数;kd:解离速率常数;t1/2diss:按公式t1/2diss=ln(2)/60*kd计算的抗体-抗原复合物半衰期;KD:解离常数;RMAX:90nM分析物注入的结合期结束时的结合信号;MR:摩尔比;Chi2:测量失败;n.d.:检测不到。
图25显示,制备了对IGF-1具有皮摩尔亲和力的支架衍生的单克隆抗体M-11.11.17和M-10.7.9。检测不到对IGF-2,或对野生型嗜热栖热菌SlyD,或对野生型Thermococcus gammatolerans SlyD,或对嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽,或对Thermococcus gammatolerans SlyD-IGF-2(53-65)融合多肽的交叉反应性。
M-2.28.44是通过用重组人IGF-1常规免疫小鼠获得的单克隆抗体。尽管该抗体对IGF-1显示30pM亲和力的事实,但可以检测到对IGF-2的500pM交叉反应性。用嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)和Thermococcusgammatolerans SlyD-IGF-2(53-65)作为分析物,可以看到交叉反应的IGF-2表位不是IGF发夹区域。
实施例12
抗-PLGF抗体的产生
用含有PLGF(60-76)的序列的免疫原免疫小鼠。随后产生杂交瘤,并进行ELISA和动力学筛选(详细的一般方法见实施例10和11)。
在动力学筛选方法中,用SlyD/FKBP12-PLGF和单独移植在链霉抗生物素蛋白上的生物素化肽PLGF(60-76)-bi来鉴定对PLGF(60-76)具有结合活性的原代培养物上清。两种分析物都产生1:1Langmuir动力学,但支架显示以比SA-探针移植的二肽低的卡方值拟合的更好的解离。不受限于理论,基于支架的筛选方法利用单体状态,及支架在与仔细制备的SA-探针相比时改善的表位可接近性。
通过此方法制备的抗体(如克隆53.4.1)能够在Western印迹中特异性检测PLGF。
实施例13
用SlyD-FKBP12-IGF-1(74-90)产生的抗-IGF-1抗体
按照已知的方法在大肠杆菌(pQE80L载体/大肠杆菌BL21CodonPlus-RP细胞系)中产生SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)(见图2和8)和SlyD/FKBP12-ctrl(见图7)融合多肽。用100μg SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)对8-12周龄Balb/c和NMRI小鼠进行反复的腹膜内免疫。
10周后用ELISA分析血清效价。通过加入含有0.41μg多肽/ml的溶液来用SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)包被Nunc Maxisorb F多孔板。通过加入含有90ng/ml生物素化IGF-1的溶液来将分离的抗原IGF-1固定在StreptaWell High Bind SA多孔板的孔中。然后通过在室温下加入含1%RPLA的PBS溶液1小时来封闭自由结合部位。用含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液洗涤孔三次。用PBS1:50稀释的小鼠血清作为样品。按1:4梯度进行可选的进一步稀释,直至1:819,200的最终稀释度。孵育时间为室温下1小时。用含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液洗涤孔三次。用缀合至过氧化物酶的抗靶抗体的恒定结构域的多克隆抗体作为检测抗体(PAK<M-Fcγ>S-F(ab′)2-POD)。按含1%(w/v)RSA的PBS中80ng/ml的浓度加入检测抗体。孵育时间为室温下1小时。用含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液洗涤孔三次。然后用ABTS溶液室温下孵育孔15分钟。分光光度计测定显色的强度。图19显示所获得的小鼠血清效价。与用嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)免疫(图20)相比,用SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)获得了较低的效价。按实施例12下所述进行其他抗体制备。最后,在已描述的BIAcore动力学筛选方法中未选择出具有对IGF-1的结合的抗体。
实施例14
用FKBP12/13融合多肽产生的抗体
本文中报道且用于此实施例的融合多肽包含衍生自人FKBP12的部分和衍生自拟南芥FKBP13的部分。由至少一个来自人FKBP12的氨基酸序列和至少一个来自拟南芥FKBP13的氨基酸序列组成的融合多肽可以作为支架在热力学上稳定人FKBP12,并避免FKBP12与大肠杆菌SlyD的N端融合。在自然界中,FKBP13包含二硫键。将此FKBP13序列移植入FKBP12,以稳定该嵌合多肽用于其他序列移植方法。
包含SEQ ID NO:16的C端氨基酸序列标记的嵌合FKBP12/13融合多肽具有序列:
MRSGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDS SRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGDRGAGCGSGSSCLIPPASVLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SEQ ID NO:123).。
在所述大肠杆菌中作为可溶和单体蛋白质表达FKBP12/13融合多肽。按实施例12中所述进行CD光谱测量。CD光谱显示FKBP12/13融合多肽在20℃折叠。
实施例15
SlyD-FKBP12/13-CSF1R融合多肽的产生
按上文所述在大肠杆菌中表达多肽,并按上文所述纯化。Ni-NTA亲和纯化后,进行大小排阻层析。将50mg蛋白质上样在HiLoad26/60SuperdexTM75pg(GE Healthcare)中。将洗脱级分上样入非变性凝胶,并按已知的方法分开。
对包含100mM KCl和0.5mM EDTA的50mM KH2PO4缓冲液pH7.0透析亲和纯化的融合多肽,并过滤通过0.22μm滤器。用针对39744.9Da多肽计算的消光系数e=20525L·mol-1·cm-1按1.19mg/ml UV/Vis光谱定量SlyD/FKBP12/13-CSF1R。
用蛋白质荧光测量来测试SlyD/FKBP12/13-CSF1R的构象性质。作为用于多肽插入的载体的FKBP12C22A可以用作参考,因为单个FKBP12Trp部分可以用来诊断FKBP12部分的结构完整性(Scholz,C.等,J.Biol.Chem.271(1996)12703-12707;Russo,A.T.等,J.Mol.Biol.330(2003)851-866)。处于其天然结构的FKBP12C22A在320nm处显示单个荧光发射峰(Zoldak,G.等,J.Mol.Biol.386(2009)1138-1152)。
在不同温度下分析了250μl含1.19mg/ml SlyD-FKBP12/13-CSF1R的KH2PO4缓冲液pH7.0。用KH2PO4缓冲液pH7.0作为参考。按5nm的激发和发射带宽使用扫描软件版本1.1(132)下的Cary Eclipse仪器。按120nm/分钟驱动300nm-425nm的波长扫描。将固有的色氨酸荧光的激发波长设为280nm。
实施例16
用于选择结合抗原的抗体的基于支架的反向筛选方法
用100μg含有元件Thermococcus gammadurans SlyD-抗原(TgSlyD-抗原)的重组嵌合融合多肽对6周龄NMRI小鼠进行3次腹膜内免疫。10周后,用25μg TgSlyD-抗原加强小鼠两次。按照已知的方法产生杂交瘤细胞。通过有限稀释分离原代杂交瘤,并通过ELISA针对抗原结合进行筛选。
50ng/ml TgSlyD-抗原融合多肽、50ng/ml TgSlyDΔIF和1μg/ml分离的抗原各在4℃下在30x384孔(Nunc)板中过夜包被。将1片碳酸盐-碳酸氢盐片(Sigma,C3041-100CAP99)溶解在100ml双蒸H2O(ddH2O)中来新鲜配制包被缓冲液。100μl洗涤缓冲液(含150mM NaCl、10mlTween20(Sigma)、40ml Bromidox L(Roche)的1l dH2O)。用BioTek洗板机用100μl洗涤缓冲液(含150mM NaCl、10ml Tween20(Sigma)、40ml Bromidox L(Roche)的1l dH2O)洗涤孔三次。用30μl封闭缓冲液(含10g BSA、10x PBS小片(Gibco)的1L ddH2O)室温下封闭孔1小时,然后用100μl洗涤缓冲液洗涤3次。用Liquidator将30μl1:1000稀释的杂交瘤上清转入孔中,并在室温下孵育1小时。用抗原阳性血清作为阳性对照。用100μl洗涤缓冲液洗涤孔3次。将过氧化物酶缀合的F(ab′)2片段山羊抗-小鼠IgG抗体(Dianova)1:30000稀释在封闭缓冲液中,并将30μl转入各孔。室温下孵育1小时,然后用100μl洗涤缓冲液洗涤3次。30μl即用ABTS底物在各孔中室温孵育30分钟。用PowerWave XSReader(BioTek)在405nm/492nm监测吸收信号作为参考信号。选择对包含融合多肽和分离的抗原的TgSlyD-抗原显示阳性ELISA信号,而对包含融合多肽的TgSlyDΔIF无信号的15个杂交瘤培养物,并进一步培养。
分离原代杂交瘤上清,并通过按照与上文所述相同的方式进行的第二ELISA反向筛选来针对抗原结合进行筛选。在第二筛选中,用附加的筛选试剂来细化包含抗体的培养物上清的特异性。
用50ng/ml TgSlyD-抗原融合多肽、50ng/ml TgSlyDΔIF、500ngttSlyD-抗原融合多肽和1μg/ml分离的抗原在384孔(Nunc)板中室温(RT)包被1小时。按上文所述进行ELISA。由于它们不同的物种来源,T.th.SlyD和T.g.SlyD显示很小的序列同源性。只有36%的氨基酸相同,且按照blossom62计算,仅存在48%序列相似性。但TgSlyDΔIF缺乏插入。因此,该多肽非常好地适合用于ELISA反向筛选。
因此,通过用支架替代多肽免疫,可以预靶向天然抗原结构域中的特异性表位。
实施例17
表位定位
SlyD-FKBP融合多肽还可以携带复杂的氨基酸插入基序,例如含有二硫键的二级结构。由于融合多肽不含半胱氨酸,适当条件下的柱上重折叠便于此外由SlyD自身的蛋白伴侣功能性辅助的二硫键在插入内的正确形成。在大肠杆菌中表达SlyD-FKBP融合多肽,并按上文所述柱上重折叠。按9.5mg/ml的浓度在含有150mM NaCl、6.5%(w/v)蔗糖、10mM半胱氨酸的75mM HEPES缓冲液(pH7.5)中透析SlyD-FKBP12ctrl。在含有100mM NaCl、1mM EDTA的50mM磷酸钾缓冲液pH7.0中透析SlyD-FKBP12-CD81融合多肽的1mg/ml部分,以避免CD81插入中的二硫键改组,CD81插入包含形成具有结构功能相关性的两个二硫键的4个半胱氨酸。将融合多肽SlyD-FKBP12-CD81和SlyD-FKBP12ctrl用于表位定位的目的。
人CD81是丙型肝炎病毒包膜E2糖蛋白的受体。CD81是隶属于四跨膜家族的跨膜蛋白质。CD81是长度为90个氨基酸的同二聚体蛋白质,其显示所谓的蘑菇样结构(PDB1IV5)。已知涉及病毒结合的残基可以定位至所谓的长度为35个氨基酸的“头亚域”上,提供了设计抗病毒药物和疫苗的基础。由于病毒结合部位的头亚域序列长度仅为35个氨基酸,用常规交叉封闭实验难以定位10kDa CD81蛋白质上的抗体表位。难以从在附近或在CD81LEL结构中的其他地方结合的抗体区分直接在相关蘑菇样头域上特异性结合的抗体。所有抗体都将独立于它们的结合部位显示HCV E2包膜蛋白竞争效应,但不特异性结合靶结构,即头域。因此,相关的头域结构移植入FKBP及连续的表位定位由于多种原因而是有用的方法。首先,避免了CD81LEL蛋白质的一些生物化学问题,因为该蛋白质自身趋向于寡聚。其次,它非常适于从全都结合全长CD81蛋白质的大量抗体鉴定抗体表位。
图40中显示Ni-NTA层析纯化的SlyD-FKBP12-CD81的SDS page(左)和Western印迹(右)。
在25℃下使用将BIAcore CM5传感器安放入系统的BIAcore2000仪器(GE Healthcare)。按100μl/分钟注入0.1%SDS、50mM NaOH、10mMHCl和100mM H3PO41分钟来预处理传感器。用HBS-EP缓冲液(10mMHEPES(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05%(w/v)P20)作为运行缓冲液。样品缓冲液是系统缓冲液。通过EDC/NHS化学品将10mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)中30μg/ml的各蛋白质配体固定入流动池2、3和4。流动池1用作参考。用1M乙醇胺pH8.0溶液去活化传感器。将以下用反应单位(RU)表示的质量固定在传感器上:流动池2:1800RUSlyD-FKBP12ctrl(32.8kDa),流动池3:SlyD-FKBP12-CD81(35.8kDa),流动池4:900RU CD81LEL(10kDa)。按30μl/分钟注入各为50nM的31种抗体分析物,3分钟结合期,3分钟解离期。30种抗体衍生自10kDaCD81LEL蛋白质的免疫活动。按20μl/分钟使用100mM HCl的3个连续的30秒注入来再生传感器表面。监测传感图作为参考信号2-1(流动池2减流动池1)、3-1和4-1,并通过使用BIAcore评价软件4.1来评价。在分析物注入结束时,设置报告点来定量最大分析物结合信号。将最高分析物结合信号设为100%来归一化数据。
在下表中,显示归一化的抗体结合反应。在所测试的30种<CD81-LEL>M抗体中,只有6种(黑体)显示CD81头域上的确切表位。不结合阴性对照多肽SlyD-FKBP12ctrl。阳性对照多肽(其同时是免疫原)被所有抗体识别。Slyd-FKBP12-CD81只有在抗体表位精确定位在蘑菇结构域中时结合。
表
通过X射线结晶分析确认表位定位结果
使抗体K05和K04的Fab片段与CD81-LEL蛋白质共结晶,并通过x射线衍射分析来分析(Seth Harris,Palo Alto)。所获得的分辨率为抗体K05在蘑菇结构域中结合,而抗体K04结合蘑菇序列之外的表位。
Claims (26)
1.融合多肽,其包含式I的多肽
NH2-S2-X1-S1-COOH(式I)
其中
X1包含随机的氨基酸序列,或包含衍生自第一多肽的氨基酸序列;
S2和S1是衍生自第二多肽的非重叠氨基酸序列;
-表示肽键;
其中所述第二多肽是具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性(PPI酶活性)的多肽,或是衍生自FKBP折叠结构域家族的多肽;和
其中插入X1来取代所述第二多肽的插入flap结构域(IF结构域)。
2.权利要求1的融合多肽,其特征在于所述融合多肽包含式II的多肽
NH2-S4-X2-S3-S2-X1-S1-S0-COOH(式II)
其中
X1包含随机的氨基酸序列,或包含衍生自第一多肽的氨基酸序列;
S2和S1或者是衍生自第二多肽的非重叠氨基酸序列;
S3和S0缺乏,或是衍生自第三多肽的非重叠氨基酸序列;
S4缺乏,或是衍生自第四多肽的氨基酸序列;和
X2缺乏,或是肽接头序列;
其中所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽相互不同,且是具有肽基脯氨酰顺/反异构酶活性(PPI酶活性)的多肽,和/或是衍生自FKBP折叠结构域家族的多肽;和
其中插入X1来取代所述第二多肽的插入flap结构域(IF结构域)。
3.前述权利要求中任一项的融合多肽,其特征在于所述S2-X1-S1多肽是天然存在的多肽的片段,或如果X1是IF结构域,则所述S2-X1-S1多肽是天然存在的全长多肽。
4.前述权利要求中任一项的融合多肽,其特征在于所述第二多肽是SlyD。
5.前述权利要求中任一项的融合多肽,其特征在于所述第二多肽是来自嗜热生物的多肽。
6.权利要求5的融合多肽,其特征在于所述嗜热生物是嗜热菌或嗜热古细菌。
7.权利要求5至6中任一项的融合多肽,其特征在于所述嗜热生物来自栖热菌科。
8.权利要求5至7中任一项的融合多肽,其特征在于所述嗜热生物是嗜热栖热菌。
9.权利要求5至6中任一项的融合多肽,其特征在于所述嗜热古细菌是超嗜热古细菌。
10.权利要求5至6和9中任一项的融合多肽,其特征在于所述嗜热生物来自热球菌纲。
11.权利要求5至6和9至10中任一项的融合多肽,其特征在于所述嗜热生物是Thermococcus gammatolerans。
12.前述权利要求中任一项的融合多肽,其特征在于X1包含对应于隐藏表位的氨基酸序列。
13.权利要求2至12中任一项的融合多肽,其特征在于所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽来自不同物种。
14.前述权利要求中任一项的融合多肽,其特征在于所述第二和/或第三多肽是来自具有至少60℃的最适生长温度的嗜热生物的多肽。
15.权利要求14的融合多肽,其特征在于所述嗜热生物是嗜热栖热菌或Thermococcus gammatolerans。
16.前述权利要求中任一项的融合多肽,其特征在于X1是式III的多肽
XaXbXcXd-X0-XeXfXgXh(式III)
其中X0是随机氨基酸序列,或是衍生自第一多肽的氨基酸序列;和
其中Xa至Xh中的每一个表示氨基酸残基,且Xa-h中的每一个可以独立地存在或缺乏。
17.前述权利要求中任一项的融合多肽,其特征在于X1是选自以下的多肽
GS-X0-GSS (式VI),
AGS-X0-GSS (式V),
CG-X0-GC (式VI),
C-X0-GC (式VII),
G-X0-G (式VIII),
S-X0-GSS (式IX),
GG-X0-GG (式X),
G-X0-TGG (式XI),
GGGS-X0-GGGS (式XII),
GGNP-X0-GPT (式XIII),
其中X0是随机氨基酸序列,或是衍生自第一多肽的氨基酸序列。
18.权利要求1至17中任一项的融合多肽的用途,用于在实验动物中引发针对X1的免疫反应。
19.用于在实验动物中引发针对多肽的免疫反应的方法,其包括对所述实验动物施用权利要求1至17中任一项的融合多肽至少一次,X1由此是所述多肽的氨基酸序列。
20.用于产生特异性结合靶抗原的抗体的方法,其包括以下步骤:
a)对实验动物施用权利要求1至17中任一项的融合多肽至少一次,X1的氨基酸序列由此包含所述靶抗原的氨基酸序列;
b)最后一次施用所述多肽后三至十天从所述实验动物回收B细胞,所述B细胞产生特异性结合所述靶抗原的抗体;
c)培养包含编码特异性结合所述靶抗原的抗体的核酸的细胞,并从所述细胞或培养基回收所述抗体,从而产生特异性结合靶抗原的抗体。
21.用于产生特异性结合靶抗原的抗体的方法,其包括以下步骤:
a)施用权利要求1至17中任一项的融合多肽后从实验动物回收B细胞,所述B细胞产生特异性结合X1的氨基酸序列的抗体;和
b)培养包含编码特异性结合X1的氨基酸序列的抗体的核酸的细胞,并从所述细胞或培养基回收所述抗体,从而产生特异性结合靶抗原的抗体。
22.权利要求1至17中任一项的融合多肽的用途,用于表位定位,X1的氨基酸序列由此包含所述表位。
23.用于选择特异性结合靶抗原的抗体的方法,其包括以下步骤:
a)测定多个抗体与固定的靶抗原的结合亲和力,权利要求1至17中任一项的融合多肽的X1的氨基酸序列由此包含所述靶抗原的氨基酸序列;
b)选择具有高于预定阈值水平的表观复合物稳定性的抗体。
24.用于选择特异性结合靶抗原的抗体的方法,其中用包含嗜热栖热菌SlyD插入的融合多肽进行动物的免疫来产生抗体,用包含Thermococcusgammatolerans SlyD插入的融合多肽来选择所述抗体。
25.用于选择特异性结合靶抗原的抗体的方法,其中用包含嗜热栖热菌SlyD插入的融合多肽进行特异性结合抗原的抗体的选择,用包含Thermococcus gammatolerans SlyD插入的融合多肽来产生抗体(免疫)。
26.抗体,其通过权利要求19至21和23至25中任一项的方法获得。
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