CN106554420A

CN106554420A - Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途

Info

Publication number: CN106554420A
Application number: CN201510632934.1A
Authority: CN
Inventors: 李俊; 周华
Original assignee: Shanghai Zhonghe Pharmaceutical Polytron Technologies Inc
Current assignee: Shanghai Zhonghe Pharmaceutical Polytron Technologies Inc
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2017-04-05

Abstract

本发明提供了一种PCSK9抗体、其抗原结合片段及其医药用途，还提供了包含所述抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体、包含人PCSK9抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及所述抗体在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。

Description

PCSK9抗体、其抗原结合片段及其医药用途

技术领域

本发明涉及一种PCSK9抗体，PCSK9的抗原结合片段，包含所述PCSK9抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，以及包含PCSK9抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为降脂药物的用途。

背景技术

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是全球的头号致死因素，每年导致大量病人死亡。《中国心血管病报告2010》的数据显示，2009年我国城市居民冠心病死亡率94.9/10万人，农村居民71.27/10万人；城市居民脑卒中死亡率为126.3/10万人，农村居民为152.1/10万人。全年心血管疾病死亡人数超过300万人，占疾病死亡人数的41％。欧美国家也存在同样问题，因此心血管疾病是世界范围的疾病，2008年全球冠心病的死亡人数为1730万人，占疾病死亡人数的30％，预计到2030年，将有近2360万人死于冠心病。心血管疾病在危害人类健康的同时，也严重影响世界的经济发展，欧盟和美国每年直接或间接的经济损失分别为1690亿欧元和2970亿美元。尽管大多数心血管疾病是可以预防的，但是由于重视程度和用药的限制(副作用等)，使得预防性治疗远远不够，导致全球范围内发病率的大幅攀升。

临床上关于人体胆固醇的指标包括总胆固醇(指所有血浆胆固醇水平的总和)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。研究显示，高胆固醇血症是指高LDL-C水平，目前仍然是全球心血管疾病发病和死亡的首要原因和主要风险因子，而无论是中国还是全球范围，LDL-C水平高于正常水平的人群数以亿计(美国20岁以上成人患有高LDL-C的人口为7100万，中国18岁以上血脂异常率为18.6％，约2亿人口)。在众多的患者中，杂合子家族性高胆固醇血症者(heFH)尤其令人担忧，由于遗传原因，这些病人的LDL-C水平严重超标，很多人尚未成年就患早发冠心病并因心脏病死亡，流行病学研究估计每500人中，就有一人携带heFH相关的基因突变。

大量的随机临床试验和Cholesterol Treatment Trialist’Collaboration(CTT)对超过17万例病人的荟萃分析证明了降低LDL-C水平可以极其显著地减少冠心病及其它心血管疾病的发病率和死亡率。为了更好的帮助病人控制胆固醇水平以预防心血管疾病，多个国家和地区纷纷发布了不同人群LDL-C控制目标。

他汀类药物是目前最广泛使用且最有效的降脂药物，单独使用能够降低LDL-C的水平及心血管疾病的发病率和致死率，联合贝特类、依折麦布能使LDL-C水平再降低15-20％，大大改善了高胆固醇病人的LDL-C水平。但是对于偏高危及超高危病人，即使他汀类药物和贝特类、依折麦布等联合使用依然无法达到治疗目标：一项针对8个欧洲国家、超过15000名服用降脂药物患者的调查中发现，45％患者的LDL-C水平未达到既定目标(＜96mg/dL或＜115mg/dL)；一项针对美国退伍军人超过20000名冠心病人的研究发现，59％的高危患者没有达标(＜70mg/dL)；此外许多患者不能耐受与他汀类药物相关的副作用，如肌肉疼痛尤其高剂量用药情况下的肌肉溶解，调查显示大约5-10％患者无法耐受他汀类药物的治疗；对于heFH患者而言，由于其LDL-C基础水平太高，绝大多数病人无法通过现有药物降低他们的LDL-C至安全线水平。毋庸置疑，上述患者出于安全性和有效性，迫切需要新的高效降脂药。如果没有新药，绝大多数的男性和女性患者将在60岁前患上冠心病，其中一半的男性和15％的女性将因此面临高死亡风险。

随着医疗实践和研究的不断深入，新的LDL-C治疗标准也变得越来越高，而相对应的LDL-C指标则越来越低，因此医学界急切需要全新机理的、有效的药物，通过与现有机理的药物联合使用以达到降低LDL-C、减少心血管病的目标。目前除了他汀类药物外，其它的药物只有贝特类和胆固醇吸收抑制剂类两种药物可以联合使用，而且效果有限，所以医生和病人都希望出现新的降脂药物，能够在他汀类药物的疗效基础上进一步大幅降低LDL-C水平。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type9，PCSK9)与家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia，FH)的相关性于2003年被发现，，而FH为一种发病率较高的常染色体显性遗传病，主要特征为血浆中低密度脂蛋白-胆固醇(简称LDL-C)水平大幅升高，可引起早发动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)甚至冠心病(coronary heart disease，CHD)。

PCSK9基因属于前蛋白转化酶(PC)家族，由信号肽、前结构域、催化结构域和羧基末端结构域组成。大量研究发现，PCSK9蛋白能够直接结合并介导LDLR在胞内的降解，从而间接调节血浆LDL-C水平；而PCSK9的两类主要天然突变——功能获得型和功能缺失型，可分别导致高胆固醇血症和低胆固醇血症。2006年，Helen Hobbs领导的研究小组在柳叶刀杂志发表了一个动脉粥样硬化风险流行病学研究报告，他们发现两个PCSK9无义突变(Y142×和C679×)存在于2％的非裔美国人，这两个突变不仅造成了血浆LDL-C水平平均降低28％，同时降低冠心病发病率88％。这项重大成果显示PCSK9的功能缺失型人群血液中胆固醇含量明显低于同样生活习惯的正常人群，而胆固醇浓度与心血管疾病发生事件成正相关；另一个研究报道显示，长期服用他汀类药物诱导PCSK9和LDLR表达水平的升高，因此降低血液中PCSK9的含量和/或活性是治疗高胆固醇症的潜在新方法，而且应该与他汀类药物发生较好的协同作用。

目前有多家跨国制药公司在研发针对PCSK9的单克隆抗体，其中安进公司的Repath，赛诺菲/再生元联合开发的Praluent于2015年先后获得欧盟和美国FDA批准上市。这两个PCSK9抗体抑制剂均通过阻断PCSK9与LDLR的结合来抑制由PCSK9诱导的LDLR的细胞内吞和降解，从而降低血液中的LDL-C水平，达到降脂的目的。这类PCSK9抗体抑制剂受制于其体内半衰期，需要每两周给药一次，不便于患者的长期治疗，也增加了治疗费用，所以工业界在积极开发下一代旨在能显著降低给药频率的长效型PCSK9抗体抑制剂。

本发明提供有着高亲和力，高选择性，高生物活性的长效型PCSK9抗体。

发明内容

本发明提供一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含：

抗体轻链可变区，所述的抗体轻链可变区至少1个选自如以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9；和

抗体重链可变区，所述的抗体重链可变区至少1个选自如以下序列所示的HCDR：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。

在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO：7所示的LCDR1。

在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR2。

在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO：9LCDR3区。

在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO：4所示的HCDR1。

在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR2。

在本发明一个优选的实施方案中，本发明提供一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO：6所示的HCDR3。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为鼠源抗体或其片段。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的鼠源抗体或其片段，其抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的鼠源抗体或其片段，其进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的鼠源抗体或其片段，其抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3，IgG4或其变体的重链FR区。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的鼠源抗体或其片段，其进一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3，IgG4或其变体的重链恒定区。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为嵌合抗体或其片段。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9嵌合抗体或其片段，其中所述的嵌合抗体轻链可变区序列为：SEQ ID NO：11。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9嵌合抗体或其片段，其中所述的嵌合抗体重链可变区序列为：SEQ ID NO：10。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9嵌合抗体或其片段，其进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9嵌合抗体或其片段，其进一步包含人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG1。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为人源化抗体或其片段。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9人源化抗体或其片段，其人源化抗体轻链可变区进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链FR区。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体轻链可变区上的轻链FR区序列，如来源于人种系轻链IGKV1-39和JK4的组合序列；其包含人种系轻链IGKV1-39的FR1，FR2，FR3区和JK4的FR4区。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体轻链可变区变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化；所述人源化抗体轻链可变区上的可变区序列变体的氨基酸变化优选为A43S。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9人源化抗体或其片段，其进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9人源化抗体或其片段，其人源化抗体重链可变区进一步包含人源IgG1，IgG2，IgG3，IgG4或其变体的重链FR区。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体重链可变区上的重链FR区序列，如来源于人种系重链IgHV3-7和JH6的组合序列，包含人种系重链IgHV3-7的FR1，FR2，FR3区和JH6的FR4区。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9人源化抗体或其片段，其进一步包含人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区。因为IgG2或IgG4没有ADCC毒性，或者使用氨基酸突变后无ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG1。所述的变体优选ADCC效应功能降低或缺失的重链恒定区突变，更优选IgG1的N297A，L234A，L235A；IgG2/4chimera，IgG4的F235E，或L234A/E235A突变。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗原结合片段为Fab、Fv、sFv、F(ab’)₂。

本发明进一步提供一种编码如上所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段的DNA分子。

本发明进一步提供一种含有如上所述的DNA分子的表达载体。

本发明进一步提供一种用如上所述的表达载体转化的宿主细胞。

在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的宿主细胞，其中所述的宿主细胞为哺乳动物细胞，优选为CHO细胞。

本发明进一步提供一种药物组合物，其含有根据本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段和可药用的赋形剂、稀释或载体。

本发明进一步提供一种根据本发明所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段、或包含其的的药物组合物，在制备用于治疗PCSK9介导的疾病或病症的药物中的用途；其中所述的疾病优选为高胆固醇血症；更优选为高表达PCSK9或PCSK9增强型突变引起的高胆固醇血症。

附图说明：

图1 抗人PCSK9鼠杂交瘤抗体对人，猕猴和小鼠PCSK9蛋白的结合曲线(ELISA)。

图2 纯化的鼠杂交瘤抗体对PCSK9抑制LDL-C摄取的拮抗活性。

图3 抗体拮抗PCSK9的有效浓度。

图4 鼠杂交瘤抗体对PCSK9/LDL-R结合的阻断活性。

图5 SDS-PAGE分析纯化的人鼠嵌合型F3-9(chF3-9)。

图6 以人PCSK9作为流动相的抗体的结合动力学

图7 以猕猴PCSK9作为流动相的抗体的结合动力学

图8 猕猴单次静脉滴注1，3mg·kg^-1F3-9抗体后血清中F3-9抗体药时曲线变化。

发明内容

一、术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如

J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

本发明所述的抗体指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链，6链γ，α链，ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。

在本发明中，本发明所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。

在本发明中，本发明所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1，2，3，4或其变体。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1，HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDE2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。

术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人PCSK9的单克隆抗体。制备时用人PCSK9蛋白抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源PCSK9抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。

术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的PCSK9嵌合抗体的抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区，抗体轻链可变区序列如SEQ ID NO：11所示。所述的PCSK9嵌合抗体的抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3，IgG4或其变体的重链FR区，抗体重链可变区序列如SEQID NO：9所示。人抗体的恒定区可选自人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG1。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。在本发明一个优选的实施方案中，所述的PCSK9人源化抗体小鼠的CDR序列选自SEQ ID NO：3，4，5，6，7，8。人的抗体可变区框架经过设计选择，其中所述抗体轻链可变区上的轻链FR区序列，如来源于人种系轻链IGKV1-39和JK4的组合序列，包含人种系轻链IGKV1-39的FR1，FR2，FR3区和JK4的FR4区；其中所述抗体重链可变区上的重链FR区序列，如来源于人种系重链IgHV3-7和JH6的组合序列，包含人种系重链IgHV3-7的FR1，FR2，FR3区和JH6的FR4区。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。

本发明中所述的“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab‘片段，F(ab’)2片段，以及与人PCSK9结合的Fv片段sFv片段；包含本发明所述抗体的选自SEQ IDNO：4至SEQ ID NO：9中的一个或多个CDR区。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(sFv)。本发明的术语“与PCSK9结合”，指能与人PCSK9相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

本发明中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，是指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。可通过对IgG上Fc段的修饰，降低或消除抗体的ADCC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变，如选自IgG1的N297A，L234A，L235A；IgG2/4chimera，IgG4的F235E，或L234A/E235A突变。

本发明中所述的融合蛋白是一种通过DNA重组，得到的两个基因共表达的蛋白产物。重组PCSK9胞外区His融合蛋白通过DNA重组，把PCSK9胞外区和6His片段共表达的融合蛋白。所述的人PCSK9胞外区，是指PCSK9蛋白表达在细胞膜以外的部分，序列见下面SEQIDNO：1划线区。

生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。如，小鼠可以用人PCSK9或其片段免疫，所得到的抗体能被复性，纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人FR区。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。具体的，本发明所述的抗体或抗原结合片段所用的轻链FR种系包括A3和O2。本发明所述的抗体或抗原结合片段所用的具体的种系重链FR包括VH3-21和VH3-23。

本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链(SEQID NO：10)和轻链(SEQID NO：11)的CDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在FC区的高度保守N端。通过表达与人PCSK9特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或GSepharose FF柱进行过柱。洗去非特异性结合的组分。再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛，离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。

本发明的抗体指单克隆抗体。本发明所述的单克隆抗体或mAb，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术(如CDR-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。

“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。

“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽本发明的实施方案(例如治疗方法或制品) 在缓解每个患都有的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。

“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。

整个说明书和权利要求书中使用的术语“基本上由……组成”或其变形表示包括所有所述元件或元件组，并且任选包括与所述元件类似或不同性质的其它元件，所述其它元件非显著改变指定给药方案、方法或组合物的基本性质或新性质。作为非限制性例子，基本上由所提及的氨基酸序列组成的结合化合物还可以包括一种或多种氨基酸，其不显著影响结合化合物的性质。

“有效量”包含足以改善或预防医字病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

“外源性”指要据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据背景在细胞、生物或人体内产生的物质。

“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源怀百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。

本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。

本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring HarborSymp.Ouant.Biol.51：263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶以扩增或产生核酸的特定部分。

“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

具体实施方式

以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1：小鼠单克隆抗体的制备

生成针对人PCSK9的鼠源单克隆抗体：用纯化的重组人PCSK9胞外区His融合蛋白(huPCSK9-His)(SEQID NO：1)，免疫Balb/C小鼠。人PCSK9-His抗原购自Novoprotein，货号CA83，NCBI Reference Sequence：Q8NBP7。

huPCSK9-His，重组人PCSK9胞外区蛋白(SEQ ID NO：1)：

QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGY LTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYL LDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTV SGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGA TNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRL IHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAIARCAPDEELLSCSSFSRS GKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVE DLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLG AYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEEAVTAVAICCR SRHLAQASQELQHHHHHH。

对于使用人PCSK9胞外区His融合蛋白的免疫，使用的纯化抗原分别为高剂量(50ug)和低剂量(10ug)。用完全弗氏佐剂分别于第0，14，35天进行3次免疫，通过眼窝后放血监测免疫应答。通过ELISA筛选血浆，获取有抗人PCSK9人免疫球蛋白滴度的小鼠。于第56天，对有最高的抗PCSK9人免疫球蛋白滴度的小鼠进行加强免疫。3天后，处死小鼠并取出脾来与Sp20小鼠骨髓瘤细胞进行融合。融合后的杂交瘤细胞进行抗体筛选，得到鼠单抗mF3-9。鼠单抗mF3-9的重链和轻链可变区采用高保真的Phusion酶通过克隆扩增PCR，每个扩增至少挑取10个不同克隆测序，获得的序列如下：

mF3-9HCVR(SEQ ID NO：13)

QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYSFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNFNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCGNYDYDGEIPYWGQGTTLTVSS mF3-9L CVR(SEQID NO：12)

DIFLTQSPAILSVSPGERVNFSCRASQTIGTSLHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTEFTLRINSVESEDIADYYCQQSSKWPLTFGQGTKVEIK其含有下列CDR序列：

名称	序列	编号
			HCDR1	GYSFSSYW	SEQID NO：7
HCDR2	IYPGDGDT	SEQID NO：8
			HCDR3	GNYDYDGEIPY	SEQID NO：9
LCDR1	QTIGTS	SEQID NO：4
			LCDR2	YAS	SEQID NO：5
LCDR3	QQSSKWPLT	SEQID NO：6

实施例2：小鼠杂交瘤抗体株的筛选

PCSK9杂交瘤抗体体外ELISA结合实验：

PCSK9抗体是通过和PCSK9胞外区的结合，从而阻断PCSK9和其配体LDL-R的信号通路。体外的ELISA实验被用来检测PCSK9抗体对人，猕猴和小鼠PCSK9的结合特性。生物素标记的三种种属的PCSK9胞外区His融合蛋白(PCSK9FC)通过和中和亲和素的结合，包被到96孔板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和PCSK9的结合特性。

用PBS缓冲液将用于和生物素结合的中和亲和素稀释至1μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔板中，于4℃放置16h-20h。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(PH7.4PBS含0.05％tweeen20)缓冲液洗板1次后，加入120μl/孔PBST/1％milk，室温孵育1h进行封闭。移去封闭液，用PBST缓冲液洗板1次后，加入用PBST/1％milk稀释的1μg/ml的生物素标记PD1-FC，置室温孵育1h。移去封闭液，用PBST缓冲液洗板3次后，加入用PBST/1％milk稀释至合适浓度的待测PCSK9抗体，置室温孵育1.5h。移去反应体系，用PBST洗板3次后，以100μl/孔加入用PBST/1％milk稀释HRP标记的抗鼠抗体二抗(The Jackson Laboratory)，室温孵育1h。用PBST洗板3次后，加入100μl/孔TMB，于室温孵育5-10min。加入100μl/孔1M H₂SO₄终止反应。用NOVOStar酶标仪在450nm处读取吸收值，计算ELISA结合EC₅₀值。

cyPCSK9，猕猴PCSK9胞外区His融合蛋白(SEQ ID NO：2)：猕猴PCSK9胞外区His融合蛋白购自Novoprotein，货号CA87，NCBI Reference Sequence：A8T666。

QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLADAPEHGATATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHRSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHHLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPARYRADEYQPPKGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFESVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGAGLRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVFNAA CQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSRSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHRAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAQDEELLSCSSFSRSGKRRGERIEAQGGKRVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQVNCSVHTAPPAGASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVIVACEDGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEEAVAAVAICCR SRHLVQASQELQHHHHHH。

moPCSK9，小鼠PCSK9胞外区His融合蛋白(SEQ ID NO：3)：小鼠PCSK9胞外区His融合蛋白购自Novoprotein，货号CA86，NCBI Reference Sequence：Q80W65。

QDEDGDYEELMLALPSQEDGLADEAAHVATATFRRCSKEAWRLPGTYIVVLMEETQRLQIEQTAHRLQTRAARRGYVIKVLHIFYDLFPGFLVKMSSDLLGLALKLPHVEYIEEDSFVFAQSIPWNLERIIPAWHQTEEDRSPDGSSQVEVYLLDTSIQGAHREIEGRVTITDFNSVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGTSLHSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLIQPSGPLVVLLPLAGGYSRILNAACRHLARTGVVLVAAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGKDIIGASSDCSTCFMSQSGTSQAAAHVAGIVARMLSREPTLTLAELRQRLIHFSTKDVINMAWFPEDQQVLTPNLVATLPPSTHETGGQLLCRTVWSAHSGPTRTATATARCAPEEELLSCSSFSRSGRRRGDWIEAIGGQQVCKALNAFGGEGVYAVARCCLVPRANCSIHNTPAARAGLETHVHCHQKDHVLTGCSFHWEVEDLSVRRQPALRSRRQPGQCVGHQAASVYASCCHAPGLECKIKEHGISGPSEQVTVACEAGWTLTGCNVLPGASLTLGAYSVDNLCVARVHDTARADRTSGEATVAAAICCRSRPSAKASWVQHHHHHH。

表1、鼠杂交瘤抗体对人，猕猴和小鼠PCSK9蛋白的结合活性

nM	huPCSK9	CyPCSK9	moPCSK9
				F3-1	0.76	1.00	0.97
F3-9	0.68	0.62	不结合

图1是通过ELISA法检测两个代表性小鼠单抗与不同种属的PCSK9蛋白的结合曲线。

表1显示抗体F3-9对人源PCSK9(huPCSK9)和猕猴PCSK9(cyPCSK9)都有着非常高的结合活性，但不结合小鼠PCSK9蛋白。

PCSK9抗体对PCSK9抑制HepG2细胞摄取LDL的拮抗

HepG2细胞接种于96孔板(Corning)的聚-D-赖氨酸涂覆密度在30000细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中。24小时后，将培养基置换为缺乏低密度脂蛋白的血清DMEM培养基中。18小时后，将纯化的PCSK9蛋白与待检抗体在室温下孵育20分钟后加入细胞，37℃孵育1小时后，加入10毫克/毫升AF标记的LDL，37℃孵育5小时，然后用含2mg/mL BSA的PBS洗涤细胞3次。最后，将细胞裂解于100uL的裂解缓冲液中。将裂解液转移到96井黑板(Labsystems)，用荧光分光光度计测量荧光值(激发波长520nm和发射波长580nm)。每个样品用BCA法测定细胞总蛋白，将荧光值/总蛋白进行作图分析。

图2显示鼠单抗F3-9能有效拮抗PCSK9对LDL摄取的抑制，且显示明显的量效关系。图3显示的是抗体浓度滴定实验，mF3-9鼠单抗的有效活性浓度(EC50)值为10nM。

PCSK9抗体对PCSK9/LDL-R结合的阻断实验：

本实验中，将LDL-R重组蛋白包被96孔板后，加入待测的PCSK9抗体，进行孵育反应；稍后再加入生物素标记的人PCSK9蛋白，孵育反应。洗板后，检测生物素标记的PCSK9结合量，评估每个鼠抗对PCSK9/LDL-R结合的阻断效率。

用pH9.6d的完全结合缓冲液(1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃溶于1L蒸馏水)将LDL-R重组蛋白稀释至1μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔板中，于4℃放置16h-20h。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(pH7.4PBS，含0.05％tweeen20)缓冲液洗板1次后，加入120μl/孔PBST/1％milk，室温孵育1h进行封闭。移去封闭液，用PBST缓冲液洗板1次后，加入90μl用样品稀释液(pH7.4PBS含5％BSA，0.05％Tween20)稀释至合适浓度的待测PCSK9抗体，置4℃预孵育1h。以10μl/孔的体积加入10×浓度的生物素标记PCSK9(Novoprotein)(10μg/ml)，在振荡器上振荡、混匀后，置37℃孵育1h。移去反应体系，用PBST洗板6次后，加入100ul/孔用PBST缓冲液1∶400稀释的Streptavidin-Peroxidase Polymer，室温振荡孵育50分钟。用PBST洗板6次后，加入100μl/孔TMB，于室温孵育5-10min。加入100μl/孔1M H₂SO₄终止反应。用NOVOStar酶标仪在450nm处读取吸收值，计算PCSK9抗体对PCSK9/LDL-R结合的阻断效率。

实验结果显示鼠单抗F3-9基本不阻断LDL-R与PCSK9之间的结合(图4)。阳性对照抗体为31H4(安进公司公开发表的、能阻断PCSK9/LDL-R结合的PCSK9抗体，Chan et al.，PNAS，Vol.106，page 9820-9825)。

实施例3：人-鼠嵌合型F3-9抗体的制备

通过常规的分子亚克隆方法，将鼠F3-9抗体的重链和轻链可变区克隆到人kappa和IgG2的恒定区表达载体中，测序验证并夺得F3-9嵌合抗体(chF3-9)，其重轻链的蛋白序列如下。

重组chF3-9轻链序列(SEQ ID NO：12)

MVSTPQFLVFLLFWIPASRGDIFLTQSPAILSVSPGERVNFSCRASQTIGTSLHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTEFTLRINSVESEDIADYYCQQSSKWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

重组chF3-9重链序列(SEQ ID NO：13)

MEWSWIFLFLLSVTEGVHSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYSFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNFNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCGNYDYDGEIPYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

将chF3-9的重轻链质粒载体，通过Fectin293脂质体(Invitrogen)共转染HEK-293细胞，进行瞬时表达，经电泳观察表达量可达50mg/L以上，收获上清通过Protein-A亲和层析初步纯化，进而采用阳离子交换进一步纯化和多粘菌素B亲和柱清除内毒素，产物经SDS-PAGE(图5)和HPLC分析纯度大于98％。

实施例4：Fortebio动力学测定PCSK9抗原与嵌合型F3-9重组单抗亲和力

生物传感器(如Biacore，ForteBio等)方法是一个公认的客观检测蛋白相互间亲和力和动力学的检测方法。我们通过ForteBio分析了本发明待测PCSK9抗体表征亲和力及结合动力学。

利用由ForteBio公司提供的试剂盒，将2mg/ml的抗体溶液通过Loading上样步骤固定化到抗人Fc的芯片上，摸索人和猕猴PCSK9抗原上样适合的浓度范围，即抗原流过(Association)固定化有人单抗的芯片能够产生0.1-1RU可接受的检测信号，然后用PBS解离结合的抗原，机器检测反应信号，通过4-5个不同浓度组合，利用ForteBio的自带分析软件以1∶1(Langmuir)Global结合模型分析抗原抗体结合的结合常数ka与解离常数kd值。用此法获得的结果显示图6，图7所示，即以AHC固定chF3-9，其中图6以人PCSK9作为流动相，Fortebio affinity为0.42nM，图7以猕猴PCSK9作为流动相，Fortebio affinity为1.27nM。经分析计算，chF3-9抗体对人PCSK9的亲和力(Kd)达到了0.42nM；对猕猴PCSK9的亲和力为1.27nM(表2)。

Fortebio analysis procedure：

Initial baseline：初始系统平衡基线PBS，pH7.2，30s

Loading：抗体固定到Anti-hFc芯片，2mg/ml单抗90s

Baseline：PBS，pH 7.2，再次平衡基线

Association：PBS调整的PCSK9，不同浓度梯度，抗原抗体结合60s

Dissociation：PBS进行抗原抗体结合的解离，120s

表2 嵌合PCSK9抗体F3-9的结合动力学参数

实施例5：猕猴体内药效药代动力学

本实验内容为猕猴单次不同剂量静脉滴注嵌合人鼠PCSK9抗体(chF3-9)，观察血药浓度-时间变化(PK)以及药效动力学(PD)，为临床试验方案的制定提供理论与实验依据。猕猴8只，北京协尔鑫生物资源研究所有限责任公司(生产许可证SCXK(京)2010-0007)，雌雄各半，体重3.68±0.14kg。用猴标准饲料喂养，自由饮水，每日给新鲜水果两次。单次给药设受试品F3-9抗体二个剂量组，分别为1和3mg·kg-1。

在PK研究中，根据动物的体重以及给药剂量，用生理盐水将药物配制50mL，后肢静脉内衡速滴注，30min内滴注完毕，在静脉滴注前以及滴注15min、30min(停止滴注)，给药后(均以给药前开始计算)1、4、8、24、48、72、96、144、192、240和288h后在对侧静脉采血1ml，分离血清，在 PD研究中，在静脉滴注前以及滴注15min、30min(停止滴注)，给药后(均以给药前开始计算)1、4、8、24、48、72、96、144、192h取血1mL。所有样品室温离心，5000rpm/min，离10min。抽取上清置于-80℃保存。

PK分析方法

在PK研究中，采用ELISA试剂盒分析方法研究血清中F3-9抗体浓度水平。

检测原理：本方法采用双抗夹心ELISA法对F3-9抗体进行定量。使用猴血清吸附的羊抗人IgG作为一抗包被到96孔板上，再加入一系列浓度标准品和稀释好的血样，标准品溶液和血样中的抗人PCSK9单克隆嵌合抗体会与一抗特异性结合，之后再加入稀释好的猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP(二抗)，二抗会与结合到一抗上的抗人PCSK9单克隆嵌合抗体特异性结合，然后加入底物显色剂，最后用硫酸终止，在酶标仪450/560nm下读数。颜色的深浅程度与样品中抗人PCSK9单克隆嵌合抗体的浓度成一定比例。

猕猴血清样品中chF3-9抗体浓度计算：由实验获得的原始数据，用Microcal公司Origin软件作浓度与OD值绘制标准曲线，计算未知样品浓度。校正曲线方程为：

其中A1为曲线的上端渐进线的估计值(OD值)，A2为曲线的下端渐进线的估计值(OD值)。P为校正曲线的斜率，X0为IC₅₀，即为50％光吸收值所对应的样品浓度值。通过拟合最优即拟合误差最小(χ2值最小)的曲线作为校正曲线。通过同一批次试验上的校正曲线计算出未知样品的浓度(mMG/ml)。

药代动力学参数计算与统计分析

用Microsoft Excel 2007软件用统计矩方法计算各种药代动力学参数，猕猴组间用Student’s t-检验进行统计学判断。实验结果线性回归用Microcal Origin7.0回归方程及相关统计参数，并作图。所有小于LLOQ的个体血清药物浓度值均不参与PK计算。所有以上计算获得个体值的统计计算通过Excel 2007(Microsoft Corporation)完成。

PD分析方法

PD血清样本中的LDL-C浓度采用目前临床实验室常规使用的匀相法。

表3 猕猴静脉滴注嵌合F3-9抗体后血清中LDL-C与给药前的百分比变化(n＝4)

表3是猕猴分别静脉滴注1、3MG·KG^-1F3-9后血清中LDL-C与给药前的百分比变化(n＝4)。

图8显示的是猕猴单次静脉滴注1，3MG·KG-1F3-9后血清中LDL-C与给药前百分比变化。

药效动力学结果如表3和图7所示，与给药前血清LDL-C浓度相比，不同剂量的PCSK9抗体(chF3-9)对体内LDL-C的浓度有明显的降低效果，在3mg·KG^-1静脉滴注后最大下降率达到30％，且持续效应达100小时左右(48h-144h)。

表4 猕猴静脉滴注1mg·KG^-1PCSK9抗体后的药代参数(n＝4)

*，代表P＜0.05；**，代表P＜0.01

表5 猕猴静脉滴注3mg·KG^-1PCSK9抗体后药代参数

表4和表5分别是猕猴单次静脉滴注1、3MG·KG^-1F3-9后药代动力学参数。猕猴单次静脉滴注F3-9抗体低、高两个剂量(1、3MG·KG-1)后末端相半衰期T1/2分别为64.6±20.3和168.7±78.8H；AUC(0-T)分别为327.9±73.4和1，784.5±323.1MG·H·ML-1，两者之间比较均有统计学差异(P＜0.05)；全身清除率CL分别为2.9±0.7和1.4±0.2ML·H-1·KG-1，低剂量组和高剂量组有统计学差异(P＜0.05)；峰浓度CMAX分别为9.4±1.0和32.9±8.1MG/ML。剂量之比为1∶3，AUC(0-T)的比为1∶5.4，CMAX的增长为1∶3.5，AUC和CMAX比均高于剂量比，在低、高剂量范围内表现为非线性药代动力学特征。

药效药代分析结果显示，PCSK9抗体chF3-9在猕猴体内的后末端相半衰期在3mg/kg的剂量时达到168.7小时，明显长于发表的阻断PCSK9/LDL-R结合的PCSK9抗体(例如，安进公司的31H4在3mg/kg静脉注射后的猴体体内半衰期为61±9小时，Chan et al.，PNAS，Vol.106，page 9820-9825；再生元的316P抗体在5mg/kg静脉注射条件的半衰期为83小时，WO2010/077854)。

Claims

1.一种PCSK9抗体或其抗原结合片段，其包含：

抗体轻链可变区，所述的抗体轻链可变区包含至少1个选自如以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9；和

抗体重链可变区，所述的抗体重链可变区包含至少1个选自如以下序列所述的HCDR：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。

2.如权利要求1所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO：7所示的LCDR1。

3.如权利要求1所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO：8所示的LCDR2。

4.如权利要求1所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO：9所示的LCDR3。

5.如权利要求1所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO：4所示的HCDR1。

6.如权利要求1所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO：5所示的HCDR2。

7.如权利要求1所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO：6所示的HCDR3。

8.如权利要求1-7任一项所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其片段。

9.如权利要求1-7任一项所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或其片段。

10.如权利要求9所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的嵌合抗体轻链可变区序列还包含：SEQ ID NO：11。

11.如权利要求9所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的嵌合抗体重链可变区序列还包含：SEQ ID NO：10。

12.如权利要求1-7任一项所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其片段。

13.一种编码如权利要求1-12任一项所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段的DNA分子。

14.一种含有如权利要求13所述的DNA分子的表达载体。

15.一种用如权利要求14所述的表达载体转化的宿主细胞。

16.如权利要求15所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞为哺乳动物细胞，优选为CHO细胞。

17.一种药物组合物，其含有如权利要求1至12任一项所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段和可药用的赋形剂、稀释剂或载体。

18.如权利要求1至12任一项所述的PCSK9抗体或其抗原结合片段、如权利要求17所述的药物组合物，在制备用于治疗PCSK9介导的疾病或病症的药物中的用途，其中所述的疾病或病症优选为高胆固醇血症；更优选为高表达PCSK9或PCSK9增强型突变引起的高胆固醇血症。