CN104177502A - 一种鲎素肽-抗体融合蛋白及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鲎素肽-抗体融合蛋白，包括至少一个鲎素肽单元，编码鲎素肽单元的基因T直接连接或通过编码接头单元的连接肽基因LU连接于编码抗体单元的基因M的重链或轻链的3’端或5’端；该融合蛋白的制备方法包括(1)将鲎素肽基因通过接头基因或直接与抗体基因相连，并连接到表达载体中，得到重组表达质粒，(2)将含有(T-L)N–M的载体转入到宿主细胞中，并进行融合蛋白的诱导表达；(3)纯化获得融合蛋白。本发明的鲎素肽-抗体融合蛋白作为抗体靶向药物具有很好的应用前景。

Description

一种鲎素肽-抗体融合蛋白及制备方法
技术领域
本发明涉及肿瘤学、病原微生物学和生物药学领域，本发明涉及一种鲎素肽-抗体融合蛋白及制备方法，具体而言，本发明提供了可以产生靶向肿瘤或致病菌杀伤作用的含有鲎素肽的融合蛋白、及其制备方法，进而为肿瘤和病原微生物感染的靶向治疗提供了优良的候选药物。
背景技术
鲎素肽来源于鲎血细胞提取物，是含有17-18个氨基酸残基的多肽，其氨基端和羧基端都是碱性氨基酸，羧基端还具有一个独特的精氨酸-酰胺结构。四个Cys形成2个二硫键维持鲎素肽折叠成发夹结构。目前发现了5种鲎素肽，tachyplesin I和tachyplesin II发现于东方鲎血细胞中，tachyplesin III发现于圆尾鲎血细胞中，polyphemusin I和polyphemusin II发现于美洲鲎血细胞中，其各自氨基酸序列如下：
tachyplesin I       K-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-R-C-R-NH2
tachyplesin II      R-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-K-C-R-NH2
tachyplesin III     K-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-K-C-R-NH2
polyphemusin I      R-R-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-R-C-R-NH2
polyphemusin II     R-R-W-C-F-R-V-C-Y-K-G-F-C-Y-R-K-C-R-NH2
化学性质稳定，耐高温。各种研究资料显示鲎素肽具有强烈抗菌作用，具体特点如下：
抗菌活性：(1)杀菌活力高，致死浓度均在μmol/L级，(2)作用迅速，往往在几秒或几分钟内可将99％以上的病原杀灭，(3)对真核生物细胞无毒性，(4)活性稳定，比较耐热，100℃处理30min不丧失其抗菌活性，(5)在高盐环境下同样具有抗菌活性，这是海洋抗菌肽的一个重要特征。鲎素的抗微生物作用远远超过目前抗生素药物的作用范畴，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌及囊膜病毒均能产生有效的杀伤作用，且没有耐药性问题，因此应用前景十分诱人。
抗癌活性：不仅如此，同时还发现鲎素肽具有很强的抗肿瘤作用，国内外均有文献报道对白血病细胞，淋巴瘤细胞，乳腺癌细胞，肺癌细胞，肝癌细胞，胃癌细胞，黑色素瘤细胞，人宫颈癌细胞等等都具有很好的抑制作用，毒副作用低。鲎素肽不仅是抑制肿瘤细胞活性强，同时具备抑制多种肿瘤细胞的活性，毒副作用低，不易产生耐药性。
鲎素肽缺点，虽然鲎素肽的优势明显，但对其在生物药物的研究并不多，甚至一度出现了停滞的现象，目前文献中提出的对于鲎素肽的利用主要在农作物和畜禽养殖业上的应用。导致这一问题的主要原因是鲎素肽本身分子量太低，仅有2.3kD左右，虽然具有很好的抗菌和抗癌作用，但作为药物应用于体内时，由于分子量太低，体内代谢快，还未产生对肿瘤和致病菌的杀伤作用已经排除体外，也正是因为这个缺点，鲎素肽在药物方向的应用受到限制。虽然一些文献提出了鲎素肽在抗癌药物方向的应用，但没有根本的解决这一问题。
改造方法，天然鲎素肽始终存在分子量低的这一明显问题，因此无论怎么改变和优化提取方法是不能解决这一问题的。通过检索，我们检索到利用基因工程方法表达鲎素肽的专利有如下：1、一种鲎素的基因及表达其的方法(CN 1323166C)。本发明涉及一种旨在提高其抗菌活性的鲎素基因的设计、人工合成及在表达系统中高效表达方法。此鲎素可广泛应用于饲料、医药卫生和植物病害防治等领域。2、一种抗真菌多肽鲎素的遗传工程合成方法(CN1182134A)。本发明涉及一种抗真菌多肽鲎素的遗传工程合成方法包括合成鲎素的基因，构建表达载体和转化受体菌。所合成的鲎素对于发生在水稻、小麦、花生、油菜、黄瓜、辣椒等多种作物上的真菌病害具有防治作用。3、中国鲎素组成型毕赤酵母言行表达菌株(CN103710276A)。本发明涉及一种中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株，属于生物技术领域。本发明应用的两个关键点在于:一是抗菌肽的高效表达。抗菌肽是动物的体内成分之一，是一类小分子短肽，具有安全、无残留、无毒副作用的良好特性，是理想的安全抗菌制剂，无任何毒副作用，对多种病毒和细菌性疾病均有显著的预防效果，同时具有改善畜禽生产生长性能、减少机体发病的作用，能有效替代饲用抗生素或化学合成药物的使用，具有良好的推广应用前景。二是酵母菌体蛋白。发酵产物富含生物活性蛋白、优质的维生素及促生长因子，可显著提高机体免疫力和健康水平。具有天然酸、甜、酒曲、酵母芳香味，诱食效果佳，可显著提高畜禽出栏重。4、中国鲎素组成型酵母表达载体及其制备方法(CN 103233035A)。本发明涉及一种中国鲎素组成型酵母表达载体及其制备方法，属于生物技术领域。本发明的目的是采用微生态理论和分子生物学技术，将中国鲎抗菌肽Tachyplesins I(TP I)基因克隆到组成型表达载体pGAPZαA中，构建鲎素抗菌肽基因GAP启动于酵母表达载体。本发明筛远能够高效表达、零污染的鲎素抗菌肽酵母高效表达基因工程菌。
以上专利文献虽然同为基因工程方法，本专利申请与上述公开专利文献的技术方案有本质的不同。1、上述专利对于鲎素肽分子量上的改造几乎是没有变化的，也就是说表达出来的鲎素肽依然不具备开发成药的特点。而本发明根本的解决了鲎素肽分子量小、体内代谢快的这一缺点，不仅明显增加鲎素肽的分子量，并且在不影响其活性的同时赋予其新的功能。2、上述专利对于鲎素肽的利用方面来看，仅停留在农作物和畜禽养殖业上的应用。而本发明已经将鲎素肽的利用面向了治疗肿瘤和病原微生物感染的疾病上。3、上述专利对于鲎素肽活性上的认识还停留在其抗菌活性上。而本发明着重体现了其抗癌活性，并经改造后抗癌效率大大增加。
ADCs又称抗体靶向药物，在肿瘤治疗方面应用较多，即保持抗体的靶向性又具有药物的高效性，可以将抗肿瘤药物靶向结合在肿瘤部位，因此，ADCs为靶向治疗肿瘤提供很好的前景。单抗-药物偶联物以单抗提供靶向性，主要依靠药物杀伤肿瘤靶细胞。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，而提供一种鲎素肽-抗体融合蛋白及制备方法。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种鲎素肽-抗体融合蛋白，编码所述融合蛋白的基因序列包括至少一个鲎素肽单元，编码鲎素肽单元的基因T直接连接或通过编码接头单元的连接肽基因LU连接于编码抗体单元的基因M的重链或轻链的3’端或5’端，鲎素肽-抗体偶联表达方式为：(T-LU)N–M，其中，N是≥1的整数，
其中，所述鲎素肽单元为：tachyplesin I、tachyplesin II、tachyplesin III、polyphemusin I和polyphemusin II五种鲎素肽中的至少一种，
其中，所述接头单元是基因工程技术所能利用的连接肽，是根据具体采用的抗体单元及鲎素肽单元的重叠次数而设计，LU为核酸，编码连接肽，
其中，所述抗体单元是单克隆抗体，包含鼠或人或人源化的重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列。
而且，所述鲎素肽单元为以五种鲎素肽氨基酸序列为基础进行的增加、删减、重复、联合，替代和修饰而得到的对癌细胞或致病菌具有生长抑制或毒性活性的多肽，所述编码鲎素肽单元的基因T编码上述任意一种鲎素肽。
而且，所述鲎素肽单元具体包括tachyplesin I，以T1表示和tachyplesin II，以T2表示，上述T为编码T1和T2的核酸。
而且，所述鲎素肽接头单元具体为G4S，其氨基酸序列为SQ7，LU为编码G4S的核酸，其核酸序列为SQ15。
而且，所述单克隆抗体是完整的抗体，或抗体片段。
而且，所述抗体片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、双特异抗体(diabody)、线型抗体、scFv、或scFv-Fc片段中的至少一种，核酸M编码单克隆抗体或抗体片段。
而且，所述单克隆抗体具体为能够特异性结合B淋巴瘤细胞表面抗原CD19的单克隆抗体的Fab片段，简写为anti-CD19Fab，其氨基酸序列为SQ6，M具体为编码anti-CD19Fab的核酸，其核酸序列为SQ14。
而且，所述anti-CD19Fab进一步的包括轻链和重链，轻链即L链，重链即H链，L链包括轻链可变区VL和轻链恒定区VL，H链包括重链可变区VH和重链恒定区CH1，L链和H链氨基酸序列分别为SQ18和SQ19；L链和H链的核酸序列分别为SQ20和SQ21。
而且，该融合蛋白是将T1的基因通过G4S基因与anti-CD19Fab L链3’端相连，并且连接上终止密码子TAA，形成新的序列L-T1，其核酸序列为SQ16，将T2的基因通过G4S基因与anti-CD19Fab H链3’端相连，并且连接上终止密码子TAA，形成新的序列H-T2，其核酸序列为SQ22。
而且，将L-T1和H-T2序列相连接，由此完成表达式(T-LU)N–M的一种新序列L-T1-H-T2，以此序列表达形成鲎素肽-抗体融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2，其完整氨基酸序列为SQ8，完整核酸基因序列为SQ17。
一种鲎素肽-抗体融合蛋白的制备方法，将鲎素肽基因T直接连接或通过编码接头单元的连接肽基因LU连接于编码抗体单元的基因M的重链或轻链的3’端或5’端，形成(T-LU)N–M方式，构建重组表达质粒，通过宿主细胞表达其融合蛋白，制备方法包括步骤如下：
(1)利用基因工程方法将鲎素肽基因通过接头基因或直接与抗体基因相连，并连接到表达载体中，得到重组表达质粒，具体步骤为：
①利用重叠延伸PCR技术，以anti-CD19Fab L链，序列为SQ20，为模板通过两次PCR，将G4S基因、T1基因和终止密码子TAA基因连接到anti-CD19Fab L链的3’端并扩增，扩增出包含L链、G4S、T1、终止密码子TAA序列的PCR产物L-T1；
②利用重叠延伸PCR技术以信号肽-anti-CD19Fab H链，序列为SQ23，为模板通过两次PCR，将G4S基因、T2基因和终止密码子TAA连接到anti-CD19Fab H链的3’端并扩增，扩增出包含H链、G4S、T2基因和终止密码子TAA的PCR产物H-T2；
③利用酶切和连接方法，将上述两种PCR产物，即L-T1和H-T2基因，通过引物赋予的酶切位点，与表达载体PETdiabody的双酶切产物相连接；
所述L-T1基因3’端与H-T2基因的5’端通过相同的酶切位点Nhe I相连，L-T1基因5’端与载体PETdiabody一端通过相同的酶切位点Mlu I相连，H-T2基因3’端与载体PETdiabody的另一端通过酶切位点Sph I连接在一起，从而构建成了包含有anti-CD19Fab-T1+T2基因的载体，形成(T-L)N–M模式，完成表达载体PET-anti-CD19Fab-T1+T2的构建；
(2)利用基因工程方法将含有(T-L)N–M的载体转入到宿主细胞中，并进行融合蛋白的诱导表达；
(3)纯化获得融合蛋白。
而且，所述步骤(1)中①步骤中扩增出包含L链、G4S、T1和终止密码子TAA的PCR产物L-T1所需要的3个引物P5，P9和P10的序列如下：
P5的序列为SQ34：
5’-ACAAACGCGTACGCTGACATTGTGC-3’
下划线标记的为Mlu I酶切位点，
P9的序列为SQ38：
5’-ACCACGGTAGCAAACACGGAAGCACCATTTCGACGGTGGCGGTGGACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3’
P10的序列为SQ39：
5’-CTAGCTAGCGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCAGCTTAACGGCAACGACGGTAGCAGATACCACGGTAGCAAACACGGA-3’。
下划线标记的为Nhe I酶切位点；
而且，所述步骤(1)中②步骤中扩增出包含H链、G4S、T2基因和终止密码子的PCR产物H-T2所需要的3个引物P11，P12和P13的序列如下：
P11的序列为SQ40：
5’-GGCGCTAGCACGCAAGTTCACGTAAAAACGG-3’
下划线标记的为Nhe I酶切位点，
P12的序列为SQ41：
5’-GGTAGCAAACACGGAAGCACCAACGCGATGGCGGTGGCGGTGTGTGAGTTTTGTCACAAG-3’
P13的序列为SQ42：
5’-ACATGCATGCCGCGTTAACGGCATTTACGGTAGCAGATACCACGGTAGCAAACACGGAAGCAC-3’
下划线标记的为Sph I酶切位点；
而且，所述步骤(2)的具体方法为：将含有L-T1-H-T2基因的质粒PET-anti-CD19Fab-T1+T2转化入宿主细胞大肠杆菌16C9中，通过低温诱导将融合蛋白表达到细菌的周质腔中，收集菌体后通过裂解的方式将融合蛋白释放到上清液中，收集上清液。
而且，所述步骤(3)纯化获得的融合蛋白的具体方法为：用纯化所用的上样缓冲液将含有融合蛋白的上清液进行透析后，过亲和层析柱完成纯化，或将透析液超滤浓缩后再过柱纯化，最终获得鲎素肽-抗体的融合蛋白，即anti-CD19Fab-T1+T2融合蛋白。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明提供的鲎素肽-抗体融合蛋白作为抗体靶向药物的优势明显：能够特异性、高效的杀伤肿瘤细胞和致病菌，毒副作用低，较难产生耐药性。鲎素肽-抗体融合蛋白较改造之前鲎素肽根本的解决了分子量低的缺点，在不改变其活性的前提下，赋予其对目标物的导向性和特异性，使其能够为我所用，能够真正的用于治疗癌症和病原微生物感染疾病成为了可能。
2、本发明采用PCR、重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOEPCR)以及酶切、连接等方法，人工合成鲎素肽基因并加以改造使其通过linker有效的与抗体基因相连，抗体与鲎素肽进行基因重组，构建该融合蛋白表达载体，随后转入表达受体中进行诱导表达，再经亲和层析法分离纯化获得融合蛋白。MTT法检测融合蛋白与改造前鲎素肽对相应肿瘤细胞和致病微生物的细胞毒性的对比。利用小鼠体内代谢检测对比融合蛋白和改造前鲎素肽体内代谢时间的变化。该融合蛋白即含有鲎素肽的靶向抗体药物。
3、优势结论：
①靶向性：改造后的鲎素肽被赋予了抗体的靶向性功能。
本发明应用流式细胞检测技术(FACS)分析结果表明，anti-CD19Fab-T1+T2与Raji、BJAB细胞特异结合，并且具有较强的亲和力，亲和能力与抗CD19Fab抗体相当。
②体外活性：体外抗癌活性试验表明，本发明的融合蛋白对癌细胞杀伤活性较单用抗体或鲎素肽强。
本发明中获得的融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2对RAJI细胞的IC50＝2.78±0.48μM，对BJAB细胞的IC50＝3.2±0.51μM，并且对正常人单核细胞没有毒性。而anti-CD19Fab对以上两种细胞没有杀伤作用，T1和T2以等比例混匀加药对RAJI细胞的IC50＝22.6±0.46μM，对BJAB细胞的IC50＝25.2±0.45μM进行改造。改造后的融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2的抗癌活性明显高于改造前的鲎素肽。
对无特异性CD19抗原的K562细胞的IC50值改造前后并无明显变化，说明anti-CD19Fab-T1+T2较好的保留了鲎素肽的细胞毒作用，并对肿瘤细胞有选择性杀伤作用，鲎素肽被赋予了靶向性。
因此证实改造后的鲎素肽在被赋予了靶向性后使其增效，抗癌活性大大提高。
体外抗菌活性实验表明，本发明的融合蛋白没有丧失掉鲎素肽的抗菌活性。
③体内活性：体内实验表明本发明改造后的鲎素肽对肿瘤具有明显的抑制作用，并且具有剂量依赖性。
观察本发明中获得的融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2对裸鼠移植性CD19+B淋巴瘤模型的治疗作用，结果表明改造后的融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2对裸鼠移植性CD19+B细胞淋巴瘤的生长具有抑制作用，并且具有剂量依赖性，而对比样品T1+T2由于代谢快并缺乏靶向性的原因，体内抑瘤实验效果不理想。
④体内代谢时间：经本发明对鲎素肽的改造，大大延长了其代谢时间，根本的改变了鲎素肽代谢快的缺点。
本发明本发明中获得的融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2应用同位素示踪法与T1+T2对比代谢时间，结果发现改造后的鲎素肽anti-CD19Fab-T1+T2代谢时间延长了约6个小时，效果显著。
本发明中获得的融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2，用不同浓度的融合蛋白处理细胞，结果表明可引起细胞不同程度的DNA损伤、细胞周期阻滞及细胞凋亡。由此提供了新型的、由鲎素肽和抗体融合而成的可用于肿瘤和病原微生物感染疾病治疗的候选靶向治疗药物。因此，本发明作为抗体靶向药物具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明构建的表达质粒PET-anti-CD19Fab-T1+T2的结构示意图；
图2为重组表达质粒anti-CD19Fab-T1+T2的限制性内切酶分析结果图，其中，
1为重组质粒PET-anti-CD19Fab-T1+T2/Nhe I+Sph I，
2为重组质粒PET-anti-CD19Fab-T1+T2/Mlu I+Nhe I，
3为重组质粒PET-anti-CD19Fab-T1+T2/Sph I，
4为DNA分子量标准(DL2000)；
图3为融合蛋白Fab-T1+T2表达产物的SDS-PAGE分析结果图，其中，
1为重组菌株PET-anti-CD19Fab-T1+T2周质腔蛋白非还原纯化后；
2为重组菌株PET-anti-CD19Fab-T1+T2周质腔蛋白非还原流出液；
3为重组菌株PET-anti-CD19Fab-T1+T2周质腔蛋白非还原上样前；
4分子量蛋白标准；
5为重组菌株PET-anti-CD19Fab-T1+T2周质腔蛋白还原纯化后；
6为重组菌株PET-anti-CD19Fab-T1+T2周质腔蛋白还原流出液；
7为重组菌株PET-anti-CD19Fab-T1+T2周质腔蛋白还原上样前
8分子量蛋白标准；
图4为抗CD19Fab和anti-CD19Fab-T1+T2与Raji细胞的结合活性的FACS分析结果图，其中，▲代表抗CD19Fab，█代表anti-CD19Fab-T1+T2；
图5为表示融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2与T1+T2对不同细胞的IC50的比较图，其中，□代表T1+T2；█代表anti-CD19Fab-T1+T2；
图6表示融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2对裸鼠移植性CD20+B细胞淋巴瘤模型的治疗作用图，其中，
●代表抗CD19Fab 4nmol/kg；
█代表anti-CD19Fab-T1+T2 2nmol/kg；
▲代表T1+T2 4nmol/kg；
◆代表anti-CD19Fab-T1+T2 4nmol/kg；
×代表T1+T2 2nmol/kg。
序列说明：
SQ6：anti-CD19Fab氨基酸序列，序列中1～23为信号肽，24～131为轻链可变区，132～237为轻链恒定区，238～260为信号肽，261～382为重链可变区，383～490为重链恒定CH1区。
SQ8：anti-CD19Fab-T1+T2氨基酸序列，序列中1～23为信号肽，24～131为轻链可变区，132～237为轻链恒定区，238～242为G4S，243～259为T1，260～282为信号肽，283～404为重链可变区，405～512为重链恒定CH1区，513～517为G4S，518～534为T2。
SQ14：anti-CD19Fab的核酸序列，序列中1～69为信号肽，70～393为轻链可变区基因序列，394～711为轻链恒走区基因序列，712～714为终止密码子，715～794为轻重链缓冲序列，795～863为信号肽，864～1229为重链可变区基因序列，1229～1533为重链CH1区基因序列，1554～1556为终止密码子，1557～1562为酶切位点序列。
SQ16：L-T1核酸序列，序列1～11为酶切位点序列，12～335为抗CD19抗体的轻链可变区基因序列，336～653为人IgG1轻链恒定区基因序列，654～668为G4S基因序列，669～719为T1基因序列，720～722为终止密码子，723～758为部分轻重链缓冲序列和酶切位点序列。
SQ17：anti-CD19Fab-T1+T2核酸序列，序列中1～69为信号肽，70～393为轻链可变区基因序列，394～711为轻链恒走区基因序列，712～726为G4S基因序列，727～777为T1基因序列，778～780为终止密码子，781～860为轻重链缓冲序列，861～929为信号肽，930～1295为重链可变区基因序列，1296～1619为重链CH1区基因序列，1620～1634为G4S基因序列，1635～1685为T2基因序列，1686～1688为终止密码子，1686～1698为酶切位点。
SQ18：anti-CD19Fab L链氨基酸序列，序列中1～108为轻链可变区，109～214为轻链恒定区。
SQ19：anti-CD19Fab H链氨基酸序列，序列中1～122为重链可变区，123～230为重链恒定区。
SQ20：anti-CD19Fab L链核酸序列，序列中1～11为酶切位点序列，12～335为抗CD19抗体的轻链可变区基因序列，336～653为人IgG1轻链恒定区基因序列。
SQ21：anti-CD19Fab H链核酸序列，序列中1～366抗CD19抗体的重链可变区基因序列，367～690为人IgG1重链恒定区CH1基因序列。
SQ22：H-T2核酸序列，序列中1～6为酶切位点序列，7～50为部分轻重链缓冲序列，51～119为信号肽基因序列，120～485为重链可变区基因序列，486～809为重链恒定区CH1基因序列，810～824为G4S基因序列，825～875为T2基因序列，876～878为终止密码子，878～888为酶切位点序列。
SQ23：信号肽-anti-CD19Fab H链核酸序列，序列中1～80为轻重链缓冲序列，81～149为信号肽基因序列，150～515为重链可变区基因序列，516～839为重链恒定区CH1基因序列。
SQ26：anti-CD19-VL’核酸序列，序列中1～15为部分信号肽并包含酶切位点基因序列，16～339为轻链可变区基因序列，340～369为部分轻链恒定区基因序列。
SQ27：anti-CD19-VH’核酸序列，序列中1～366为重链可变区基因序列，367～393为部分重链恒定区基因序列。
具体实施方式
以下对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员根据公知的知识和现有技术的教导能够想到的等价的变体都包含在本发明的保护范围中。
本发明的构思原理
鲎素肽改造的前提：鲎素肽具有很好的抗菌抗癌活性，将其开发成药的最大障碍在于其分子量太小。利用基因工程技术将鲎素肽偶联蛋白可以增大其分子量，然而盲目的为其偶联大分子量蛋白基因是不行，改造鲎素肽需要以下几个前提：1、改造后的鲎素肽不能丧失活性。2、改造后的鲎素肽能更利于其发挥抗菌抗癌活性。3、融合蛋白必须低毒低副作用、不易产生耐药性。4、连接分子不影响抗体与鲎素肽的活性。5、连接分子必须在储藏和血液循环是时有较强的稳定性。因此本发明将鲎素肽改造成为抗体药物偶联物(antibody drug conjugates,ADCs)。
选择抗体靶向药物的条件：1、有很强的杀伤肿瘤细胞的活性。2、低毒低副作用。3、低免疫原性，不易产生耐药性。而鲎素肽完全符合这些条件，具备成为药物的条件。并且这种设计不仅弥补了鲎素肽分子量小，体内代谢快的问题，同时赋予了鲎素肽新的活性-靶向性，它可以引导鲎素肽特异性的找到目标物，提高杀伤效率。还有一个不要忽略的问题就是鲎素肽还具有非常强的抗菌作用，因此选择致病菌表面抗原产生的抗体与鲎素肽偶联，同样能够提供给鲎素肽抗菌的导向性，提高杀菌效率。
一种鲎素肽-抗体融合蛋白，包括至少一个鲎素肽单元，编码鲎素肽单元的基因T直接连接或通过编码接头单元的连接肽基因LU连接于编码抗体单元的基因M的重链或轻链的3’端或5’端，鲎素肽-抗体偶联表达方式为：(T-LU)N–M，其中，N是≥1的整数，
其中，鲎素肽单元为：tachyplesin I、tachyplesin II、tachyplesin III、polyphemusin I和polyphemusin II五种鲎素肽中的至少一种，五种鲎素肽各自氨基酸序列如下：
tachyplesin I     K-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-R-C-R-NH2，氨基酸序列SQ1，核酸序列SQ9；
tachyplesin II    R-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-K-C-R-NH2，氨基酸序列SQ2，核酸序列SQ10；
tachyplesin III   K-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-K-C-R-NH2，氨基酸序列SQ3，核酸序列SQ11；
polyphemusin I    R-R-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-R-C-R-NH2，氨基酸序列SQ4，核酸序列SQ12；
polyphemusin II   R-R-W-C-F-R-V-C-Y-K-G-F-C-Y-R-K-C-R-NH2，氨基酸序列SQ5，核酸序列SQ13；
其中，所述接头单元是基因工程技术所能利用的连接肽，是根据具体采用的抗体单元及鲎素肽单元的重叠次数而设计，LU为核酸，编码连接肽，
其中，所述抗体单元是单克隆抗体，包含鼠或人或人源化的重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列。
所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，所述鲎素肽单元为，以五种鲎素肽氨基酸序列为基础进行的增加、删减、重复、联合，替代和修饰而得到的对癌细胞或致病菌具有生长抑制或毒性活性的多肽，所述编码鲎素肽单元的基因T编码上述任意一种鲎素肽。
在本发明的具体实施中，所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，所述鲎素肽单元具体包括tachyplesin I，T1表示和tachyplesin II，T2表示，上述T为编码T1和T2的核酸。
在本发明的具体实施中，所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，所述鲎素肽接头单元具体为G4S，其氨基酸序列为SQ7，LU为编码G4S的核酸，其核酸序列为SQ15。
其中，所述单克隆抗体为完整的抗体，或抗体片段，
其中所述抗体片段包括：Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv片段，双特异抗体(diabody)，线型抗体，scFv，或scFv-Fc，M一种核酸，其编码上述任意一种单克隆抗体或抗体片段。
在本发明的具体实施中，所述单克隆抗体具体为能够特异性结合B淋巴瘤细胞表面抗原CD19的单克隆抗体的Fab片段，简写为anti-CD19Fab，其氨基酸序列SQ6。M具体为编码anti-CD19Fab的核酸，其核酸序列如SQ14。
所述anti-CD19Fab进一步的包括轻链和重链，轻链即L链，重链即H链，L链包括轻链可变区VL和轻链恒定区VL，H链包括重链可变区VH和重链恒定区CH1，L链和H链氨基酸序列分别为SQ18和SQ19；L链和H链的核酸序列分别为SQ20和SQ21。
在本发明的具体实施中，该融合蛋白是将T1的基因通过G4S基因与anti-CD19Fab L链3’端相连，并且连接上终止密码子TAA，形成新的序列L-T1，其核酸序列为SQ16，将T2的基因通过G4S基因与anti-CD19Fab H链3’端相连，并且连接上终止密码子TAA，形成新的序列H-T2，其核酸序列为SQ22。
在本发明的具体实施中，将L-T1和H-T2序列相连接，由此完成表达式(T-LU)N–M的一种新序列L-T1-H-T2，以此序列表达形成鲎素肽-抗体融合蛋白为anti-CD19Fab-T1+T2，其完整氨基酸序列为SQ8，完整核酸基因序列为SQ17。
一种鲎素肽-抗体融合蛋白的制备方法，利用基因工程方法在基因水平上改造鲎素肽基因，将鲎素肽基因T直接连接或通过编码接头单元的连接肽基因LU连接于编码抗体单元的基因M的重链或轻链的3’端或5’端，形成(T-LU)N–M方式，构建重组表达质粒，通过宿主细胞表达其融合蛋白，
制备方法包括步骤如下：
(1)利用基因工程方法将鲎素肽基因通过接头基因或直接与抗体基因相连，并连接到表达载体中，得到重组表达质粒，具体步骤为
①利用重叠延伸PCR技术，以anti-CD19Fab L链，序列为SQ20，为模板通过两次PCR，将G4S基因、T1基因和终止密码子TAA基因连接到anti-CD19Fab L链的3’端并扩增，扩增出包含L链、G4S、T1、终止密码子TAA序列的PCR产物L-T1，序列为SQ16；
②利用重叠延伸PCR技术以信号肽-anti-CD19Fab H链，序列为SQ23，为模板通过两次PCR，将G4S基因、T2基因和终止密码子TAA连接到anti-CD19Fab H链的3’端并扩增，扩增出包含H链、G4S、T2基因和终止密码子TAA的PCR产物H-T2，序列为SQ22；
③利用酶切和连接方法，将上述两种PCR产物，即L-T1和H-T2基因，通过引物赋予的酶切位点，与表达载体PETdiabody(Improvement in soluble expression levels of a diabody byexchanging expression vectors.Fang Liu,Zhong Chen,Wenguo Jiang，et.al.Protein Expressionand Purifcation62(2008)15–20)的双酶切产物相连接；
所述L-T1基因3’端与H-T2基因的5’端通过相同的酶切位点Nhe I相连，L-T1基因5’端与载体PETdiabody一端通过相同的酶切位点Mlu I相连，H-T2基因3’端与载体PETdiabody的另一端通过酶切位点Sph I连接在一起，从而构建成了包含有anti-CD19Fab-T1+T2基因的载体，形成(T-L)N–M模式，完成表达载体PET-anti-CD19Fab-T1+T2的构建。
(2)利用基因工程方法将含有(T-L)N–M的载体转入到宿主细胞中，并进行融合蛋白的诱导表达；
(3)纯化获得的融合蛋白。
在本发明的具体实施中，扩增出包含L链、G4S、T1和终止密码子TAA的PCR产物L-T1所需要的3个引物P5，P9和P10的序列如下：
P5的序列为SQ34：
5’-ACAAACGCGTACGCTGACATTGTGC-3’
下划线标记的为Mlu I酶切位点
P9的序列为SQ38：
5’-ACCACGGTAGCAAACACGGAAGCACCATTTCGACGGTGGCGGTGGACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3’
P10的序列为SQ39：
5’-CTAGCTAGCGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCAGCTTAACGGCAACGACGGTAGCAGATACCACGGTAGCAAACACGGA-3’。
下划线标记的为Nhe I酶切位点
在本发明的具体实施中，扩增出包含H链、G4S、T2基因和终止密码子的PCR产物H-T2所需要的3个引物P11，P12和P13的序列如下：
P11的序列为SQ40：
5’-GGCGCTAGCACGCAAGTTCACGTAAAAACGG-3’
下划线标记的为Nhe I酶切位点
P12的序列为SQ41：
5’-GGTAGCAAACACGGAAGCACCAACGCGATGGCGGTGGCGGTGTGTGAGTTTTGTCACAAG-3’
P13的序列为SQ42：
5’-ACATGCATGCCGCGTTAACGGCATTTACGGTAGCAGATACCACGGTAGCAAACACGGAAGCAC-3’。
下划线标记的为Sph I酶切位点
在本发明的具体实施中，方法(2)进一步为将含有L-T1-H-T2基因的质粒PET-anti-CD19Fab-T1+T2转化入宿主细胞大肠杆菌16C9中，通过低温诱导将融合蛋白表达到细菌的周质腔中，收集菌体后通过裂解的方式将融合蛋白释放到上清液中，收集上清液。
在本发明的具体实施中，方法(3)进一步为用纯化所用的上样缓冲液将含有融合蛋白的上清液进行透析后，过亲和层析柱完成纯化，或将透析液超滤浓缩后再过柱纯化，最终获得鲎素肽-抗体的融合蛋白，即anti-CD19Fab-T1+T2融合蛋白。
实施例1
1.获得抗CD19抗体的轻链可变区基因(VL)和重链可变区(VH)基因:
抗CD19抗体的轻链可变区基因(VL)和重链可变区(VH)基因的序列来自专利：用于靶向结合淋巴细胞白血病细胞的抗CD19的工程抗体及其用途(公开号CN 1775808A)。
抗CD19抗体的轻链可变区(VL)基因，即anti-CD19VL的核酸序列为SQ24。
抗CD19抗体的重链可变区(VH)基因，即anti-CD19VH的核酸序列为SQ25。
以上两段基因序列通过合成方法获得，同时为了方便构建表达载体和可变区与恒定区的连接，在VL基因的5’端引入酶切位点Mlu I和保护碱基其序列为：ACAAACGCGTACGCT，在VL基因的3’端引入部分恒定区序列：ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC，因此合成后的VL的序列为SQ26，命名anti-CD19-VL’。
在VH基因的3’端引入部分恒定区序列：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC，因此合成后的VH的序列为SQ27，命名为anti-CD19-VH’。所合成序列-20℃保存。
2.扩增人IgG1的轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH1)基因
应用RT-PCR方法从人B淋巴细胞扩增人的IgG1的轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH1)基因：
(1)RNA提取：采用Trizol一步法，1)取人B淋巴细胞约106，加入1m1Trizol，吹打混匀，室温静置5分钟。2)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置2-3分钟。3)12000rpm，4℃，离心15分钟。4)取上清，加入0.5m1异丙醇室温静置15分钟。5)12000rpm，4℃，离心15分钟。6)弃上请，加入1m175％的乙醇，7500rpm，4℃，离心5分钟。7)弃上清，沉淀晾干，加入30μ1DEPC处理的水溶解RNA。
(2)逆转录为cDNA(40μ1)：取2.5mM dNTP4μ1，5×first strand buffer8μ1，DTT4μ1，oligodT2μ1，水16.6μ1，混匀后加入RNA约2g，65℃水浴5分钟，快速冰浴2-3分钟。加入50u/μ1RNasin0.4μ1，Superscript II(200u/μ1)1μl混匀后37℃水浴>1小时。取出后70℃水浴10分钟。-20℃保存。
(3)PCR扩增人IgG1的轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH1)基因
轻链恒定区(CL)基因PCR扩增反应体系(50μ1)：上游引物P1：5'-ACT GTG GCT GCACCA TCT GTC TTC-3'(SQ28)；下游引物P2：5'-ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT-3'(SQ29)。以cDNA为模板，高保真pyrobest聚合酶扩增。PCR循环程序为94℃5min；94℃50s，54℃1min，72℃1min；最后72℃延伸10min，共30个循环。PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收纯化，该PCR产物命名为：人IgG1CL，其序列为SQ30，-20℃保存。
重链恒定区(CH1)基因PCR扩增反应体系(50μ1)：上游引物P3：5'-GCC TCC ACC AAGGGC CCA TCG GT-3'(SQ31)；下游引物P4：5'-TGT GTG AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGGC-3'(SQ32)。以cDNA为模板，高保真pyrobest聚合酶扩增。PCR循环程序为94℃5min；94℃，30s，57℃，lmin，72℃，lmin；最后72℃延伸10min，共30个循环。PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收纯化，该PCR产物命名为：人IgG1CH1，其序列为SQ33，-20℃保存。
3.SOE-PCR扩增抗CD19轻链(L链)，即VL-CL
将anti-CD19-VL’和人IgG1CL，互为引物进行扩增，反应条件：94℃变性1分钟，60℃返火1分钟，72℃延伸2分钟，共10个循环，然后72℃再延伸10分钟，生成少量抗CD19VL-人IgG1CL模板。完成上步反应后，补加P5(SQ34)和P2引物，进行扩增，反应条件:94℃变性1分钟，60℃返火1分钟，72℃延伸2分钟，共30个循环，72℃再延伸10分钟。得到PCR产物命名为VL-CL或抗CD19轻链或anti-CD19Fab L链(约653bp)，序列为SQ20，将反应产物VL-CL进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收纯化，-20℃保存。
4.SOE-PCR扩增抗CD19重链(H链)，即VH-CH1
将anti-CD19-VH’和人IgG1CH1，互为引物进行扩增，反应条件：94℃变性1分钟，60℃返火1分钟，72℃延伸2分钟，共10个循环，然后72℃再延伸10分钟，生成少量抗CD19VH-人IgG1CH1模板，即VH-CH1。完成上步反应后，补加P6(SQ35)和P4引物，进行扩增，反应条件：94℃变性1分钟，60℃返火1分钟，72℃延伸2分钟，共30个循环，72℃再延伸10分钟。得到PCR产物命名为VH-CH1或抗CD19重链或anti-CD19Fab H链(约690bp)，SQ21，将反应产物VH-CH1进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收纯化，-20℃保存。
5.通过重叠PCR为anti-CD19Fab H链引入信号肽
以anti-CD19Fab H链(VH-CH1)为模版，利用引物P7、P8和P4，通过两次PCR，将轻重链缓冲序列和信号肽st Ⅱ与anti-CD19Fab H链相连。
具体地，以anti-CD19Fab H链为模板，用P8(SQ37)作为5'端引物，P4(SQ32)作为3'端引物，进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟，59℃返火1分钟，72℃延伸1分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72℃延伸10分钟。得到基因片段A(754bp)。将片段A进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收纯化，-20℃保存。
以片段A为模板，用P7(SQ36)作为5'端引物，用P4作为3'端引物，进行PCR扩增，反应条件：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟，60℃返火1分钟，72℃延伸1分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72℃延伸10分钟。得到含有轻重链缓冲序列、信号肽stⅡ和anti-CD19Fab H基因片段，命名为：信号肽-anti-CD19Fab H链(约839bp)，序列为SQ23。将信号肽-anti-CD19Fab H链进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收纯化，-20℃保存。
6.重组克隆质粒pGMT-L-T1的构建
PCR扩增L-T1
以anti-CD19Fab L链(VL-CL)为模版，利用引物P5、P9和P10，通过两次PCR，将G4S基因、T1基因和终止密码子(TAA)连接到抗CD19轻链的3’端并扩增，PCR引物由相关技术服务公司合成，所用到的三个引物序列如下：
P5的序列为SQ34:
5’-ACAAACGCGTACGCTGACATTGTGC-3’
下划线标记的为Mlu I酶切位点
P9的序列为SQ38:
5’-ACCACGGTAGCAAACACGGAAGCACCATTTCGACGGTGGCGGTGGACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3’
P10的序列为SQ39:
5’-CTAGCTAGCGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCAGCTTAACGGCAACGACGGTAGCAGATACCACGGTAGCAAACACGGA-3’
下划线标记的为Nhe I酶切位点
引物P5中5’端引入保护碱基和酶切位点Mlu I，引物P9中含有L链的3’端序列+G4S+部分T1序列，P10中含有部分T1序列+终止密码子+轻、重链缓冲序列+Nhe I酶切位点和保护碱基。
具体地，以anti-CD19Fab L链(VL-CL)做为模板，用引物P5作为5'端引物，引物P9作为3'端引物，进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟，56℃返火1分钟，72℃延伸1分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72℃延伸10分钟。得到以Mlu I酶切位点开头的含有L链+G4S+部分T1序列的基因片段B(约702bp)。将片段B进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收纯化，-20℃保存。
再以片段B为模板，用P5为5’端引物，引物P10作为3'端引物，进行PCR扩增反应条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟，56℃返火1分钟，72℃延伸1分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72℃延伸10分钟。得到以Mlu I酶切位点开头的含有L+G4S+T1+终止密码子+轻、重链缓冲序列+Nhe I酶切位点+保护碱基的基因片段(765bp)，即L-G4S-T1-TAA-轻、重链缓冲序列基因，命名为L-T1，其序列为SQ16。将L-T1进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收纯化，-20℃保存。
pGMT-L-T1的构建
将L-T1经过72℃延伸15分钟加入粘端后，与pGM-T载体在室温中连接15分钟后进行转化，将连接产物加入到100μl的DH5a中，冰浴30min，42℃90s，冰浴3分钟，加入900μlYT培养基，150rpm37℃孵育45分钟，然后取100μl涂布于含有氨苄青霉素的固体培养基上，37℃倒置培养过夜，第二天进行菌落PCR验证，将验证成功的单克隆挑入在还有氨苄青霉素的液体培养基中37℃过夜培养，转天保存菌种，提取质粒送去测序，得到含有L-G4S-T1-TAA-轻、重链缓冲序列基因的克隆质粒，命名为pGMT-L-T1。经测序验证，结果正确。
7.重组克隆质粒pGMT-H-T2的构建
PCR过增H-T2
具体地，以信号肽-anti-CD19Fab H链做为模板，利用引物P11、P12和P13，通过两次PCR，将G4S基因、T2基因和终止密码子(TAA)基因连接到信号肽-anti-CD19Fab H链的3’端并扩增，PCR引物由相关技术服务公司合成，所用到的三个引物序列如下：
P11中5’端引入酶切位点Nhe I，P12中含有H的3’端序列+G4S+部分T2序列，P13中含有部分T2序列+终止密码子+Sph I酶切位点。
P11的序列为SQ40:
5’-GGCGCTAGCACGCAAGTTCACGTAAAAACGG-3’
下划线标记的为Nhe I酶切位点
P12的序列为SQ41:
5’-GGTAGCAAACACGGAAGCACCAACGCGATGGCGGTGGCGGTGTGTGAGTTTTGTCACAAG-3’
P13的序列为SQ42：
5’-ACATGCATGCCGCGTTAACGGCATTTACGGTAGCAGATACCACGGTAGCAAACACGGAAGCAC-3’
下划线标记的为Sph I酶切位点
具体地，以信号肽-anti-CD19Fab H链为模板，用P11作为5'端引物，P12作为3'端引物，进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟，56℃返火1分钟，72℃延伸1分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72℃延伸10分钟。得到以Nhe I酶切位点开头的含有H+G4S+部分T2序列的基因片段C(853bp)。将片段C进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收纯化。
再以片段C为模板，用P11为5’端引物，P13为3’端引物。进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟，56℃返火1分钟，72℃延伸1分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72℃延伸10分钟。得到以Nhe I酶切位点开头的含有H+G4S+T2序列+Sph I酶切位点+保护碱基的基因片段(约888bp)，即H-G4S-T2-TAA基因，命名为H-T2，其序列是SQ22。将H-T2进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收纯化。
pGMT-H-T2的构建
将H-T2经过72℃延伸15分钟加入粘端后，与pGM-T载体在室温中连接15分钟后进行转化，将连接产物加入到100μl的DH5a中，冰浴30min，42℃90s，冰浴3分钟，加入900μlYT培养基，150rpm37℃孵育45分钟，然后取100μl涂布于含有氨苄青霉素的固体培养基上，37℃倒置培养过夜，第二天进行菌落PCR验证，将验证成功的单克隆挑入在还有氨苄青霉素的液体培养基中37℃过夜培养，转天保存菌种，提取质粒送去测序。得到含有H-G4S-T2-TAA基因的克隆质粒命名为pGMT-H-T2。经测序验证，结果正确。
8.重组表达质粒PET-anti-CD19Fab-T1+T2的构建
将提取的质粒pGMT-L-T1用Mlu I和Nhe I双酶切、pGMT-H-T2质粒用Nhe I和Sph I双酶切和表达载体PETdiabody(Improvement in soluble expression levels of a diabody byexchanging expression vectors.Fang Liu,Zhong Chen,et.al.Protein Expression and Purifcation62(2008)15–20)经Mlu I和Sph I双酶切的产物，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收纯化。
将纯化后的以上三种片段按照6：6：1的比例用快速连接酶在室温连接30分钟，连接产物加入到100μl的DH5a中，冰浴30min，42℃90s，冰浴3分钟，加入900μlYT培养基，150rpm37℃孵育45分钟，然后取100μl涂布于含有卡那霉素的固体培养基上，37℃倒置培养过夜，第二天进行菌落PCR验证，将验证成功的单克隆挑入在含有卡那霉素的液体培养基中37℃过夜培养，转天保存菌种，提取质粒送去测序，结果表明，融合基因重组表达质粒的酶切和测序结果与预期完全一致，融合蛋白的基因编码序列为1698bp，序列正确，得到含有L-G4S-T1-TAA-轻、重链缓冲序列-H-G4S-T2-TAA的基因，即L-T1-H-T2，其基因的序列为SQ17，命名为anti-CD19Fab-T1+T2，得到含有anti-CD19Fab-T1+T2序列的表达质粒，命名为PET-anti-CD19Fab-T1+T2。该表达质粒的结构如图1所示。表达质粒酶切产物的电泳图参见图2，表达质粒PET-anti-CD19Fab-T1+T2经Sph I单酶切后成线性条带正确；表达质粒PET-anti-CD19Fab-T1+T2经Mlu I和Nhe I释放出L-T1约758bp，条带正确；表达质粒PET-anti-CD19Fab-T1+T2经Nhe I和Sph I双酶切释放出H-T2约888bp，条带正确。
9.融合蛋白的表达
以上步获得到重组质粒PET-anti-CD19Fab-T1+T2转化大肠杆菌16C9，得到重组转化菌PET-anti-CD19Fab-T1+T2。挑取单克隆接种于50mL2×YT培养基中(含50μg/mL卡那霉素),37℃200rpm振荡培养过夜；离心收集菌体，将菌体重悬于100mL2×YT培养基(含50μg/mL卡那霉素及1mMIPTG),30℃，振荡培养4h；离心收集菌体，将菌体于-20℃冷冻。分别制备全细胞蛋白组分、培养液上清组分、细胞周质腔组分、可溶性细胞质和不可溶性细胞质(包涵体)组分，然后在变性条件下进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析外源蛋白表达情况。结果表明，经诱导的重组菌株表达了大量外源蛋白，且anti-CD19Fab-T1+T2的表达产物主要存在于细菌可溶性周质腔中。
10.融合蛋白的纯化
菌体反复冻融后，加入1/20 2×YT体积裂解液，充分混匀，冰上100rpm裂解1小时，8000rpm，30分钟，收集上清液即表达产物的粗提物。将粗提物用PBS4℃透析24小时，每隔三个小时换一次PBS，并用0.45μm滤膜过滤出去沉淀，在快速蛋白层析仪(FPLC)上进行蛋白上样。层析柱为Protein G Bestarose4FF，流动相流速为2ml/min，洗脱液为0.1MpH3.0甘氨酸缓冲液，收集的目的蛋白样品迅速用1MpH9.0的Tris-HCl中和至pH7.0。用灭菌的PBS置换洗脱液并浓缩蛋白，得到纯化的融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2，样品分装后保存于-20℃。纯化后蛋白电泳结果如图3，将鲎素肽改造后的到的融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2分子量约53.1kD，还原后得到两条带分子量分别约为26kD和27.1kD，电泳结果显示纯化效果明显，目的条带正确。
11.融合蛋白浓度测定
采用BCA蛋白定量试剂盒，绘制标准曲线：将标准蛋白按照0、0.025、0.125、0.5、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0mg/ml浓度配置成标准蛋白液。各个浓度的标准蛋白液25μl或待测纯化蛋白样品加200μl的工作液，振摇30秒，37℃孵育30分钟。冷却至室温后酶标仪562处测定吸光度值。根据标准曲线得到直线回归方程，将待测样品的吸光度值代入方程，计算相应的蛋白浓度。
12.anti-CD19Fab-T1+T2的免疫学活性
通过流式细胞仪测定anti-CD19Fab-T1+T2的免疫荧光结合活性。将1×106个Raji细胞重悬于含有不同浓度的FITC标记的抗CD19Fab和anti-CD19Fab-T1+T2的100μL PBS溶液中，4℃放置1h，2000g，离心10分钟，弃上清液，PBS洗3次，FACS分别测定抗CD19Fab和anti-CD19Fab-T1+T2结合Raji细胞的阳性率。证明相同浓度的抗CD19Fab及anti-CD19Fab-T1+T2与Raji细胞的结合活性基本相同，anti-CD19Fab-T1+T2融合蛋白保留了与靶抗原特异性结合的能力，如图4所示。
13.融合蛋白对体外培养的肿瘤细胞的特异性的细胞杀伤作用
以噻唑蓝(MTT)法进行测定细胞杀伤作用。取对数生长期的Raji或BJAB细胞、计数，104个/孔铺于96孔板，在37℃含5％CO2的培养箱中培养24小时后加入不同浓度的药物，每个药物浓度设3个平行孔。继续培养72小时，2000rpm离心10分钟，弃上清。每孔加入50μl无血清RPMI1640培养液溶解的MTT(2mg/ml)，37℃继续培养4小时，2000rpm离心10分钟，轻轻吸去上请，加入150μl二甲基亚枫(DMSO)，室温下摇床振摇15分钟，酶标仪上测定560nm光吸收值。每次试验均设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔。按下述公式计算细胞的存活率及半数抑制浓度(IC50)值:
细胞存活率＝(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100％。
结果发现融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2对Raji、BJAB细胞的IC50值分别为2.78±0.48μM和3.2±0.51μM，对无特异性CD19抗原的K562细胞的IC50值为26±0.47μM，而鲎素肽对Raji、BJAB细胞的IC50值分别为22.6±0.46μM和25.2±0.45μM，对无特异性CD19抗原的K562细胞的IC50值为26.5±0.46μM，表明anti-CD19Fab-T1+T2较好的保留了鲎素肽的细胞毒作用，并对肿瘤细胞有选择性杀伤作用，改造后对靶细胞抑制活性明显提高，如图5所示。
14.Fab-T1+T2对裸鼠移植性CD20+B细胞淋巴瘤模型的治疗作用
将生长状态良好的体重为16-18克的5周龄BALB/c裸鼠随机分组，经Cs照射后，24h内接种于裸鼠腋窝皮下Raji细胞2×107个/只，饲养18天，尾静脉注射给药，9天后再次注射给药，观察anti-CD19Fab-T1+T2对裸鼠皮下淋巴瘤的治疗作用，绘制小鼠肿瘤的生长曲线。对照组静脉注射生理盐水0.2ml/只。其余各组分别给予不同剂量的融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2，T1和T2等比例混匀样品T1+T2及4nmol/kg的抗CD19Fab，均为尾静脉注射，0.2ml/只。试验期间，每三天测量一次肿瘤的长径a和短径b，并记录动物体重。以公式V＝0.5ab2计算瘤体积，并计算抑瘤率，如图6所示。融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2的治疗结果表明，2nmol/kg、4nmol/kg二个剂量组的anti-CD19Fab-T1+T2均能显著抑制或延迟裸鼠移植性淋巴瘤的生长，均表现出比相应剂量游离鲎素肽更强的肿瘤生长抑制作用，提高了鲎素肽的治疗效果。在实验第40天的结果显示，4nmol/kg和2nmol/kg两个剂量组的anti-CD19Fab-T1+T2的抑瘤率分别为89％和72％，显著强于相应剂量鲎素肽样品T1+T2组23％和18％的抑瘤率。T1+T2组体外抗癌活性明显，但由于其分子量小代谢快的原因，体内实验没有表现出理想的抑瘤效果。在实验治疗期间，动物体重有所增加，一般状况良好，表明动物可耐受所给剂量。
结果发现融合蛋白Anti-CD19Fab-T1+T2对裸鼠移植性CD20+B细胞淋巴瘤的生长有显著的抑制作用，并且具有剂量依赖性。
15.代谢实验
利用同位素示踪法，用碘标记T1、T2和anti-CD19Fab-T1+T2，采用三氯乙酸沉淀法检测放射性浓度，。3P87软件判断房室模型和计算各种参数，并检测样品尾静脉注射大鼠后不同时间的血药浓度。
具体为，首先对检测样品T1、T2和anti-CD19Fab-T1+T2采用双相氯胺-T法标记制备。同位素标记，放射性化学纯度均≥95％，比放射性为5.513×105Bq/μg。标记后的样品分别记作：125I-T1、125I-T2和125I-anti-CD19Fab-T1+T2，由于125I-T1和125I-T2为等比例混合给药，因此记作125I-T1+T2。
选取动物为SD大鼠，雌雄各半，体质量200～220g，36只SD大鼠随机分为125I-T1+T2组和125I-anti-CD19Fab-T1+T2组两个大组，每个大组18只，雌雄各半，每个组设3个剂量，高剂量组(40μg/kg)、中剂量组(20μg/kg)和低剂量组(3μg/kg)，每剂量6只，雌雄各半。禁食12h后3个剂量组大鼠按每只2ml/kg静脉给药。一次性注射给药后0、2、5、10、20、40min，1、2、4、6、8、24、48、72h于尾静脉采血，每次采血约100μl，置于肝素处理过的Eppedorf离心管中，于4℃冰箱过夜，10000r/min离心2min，分离血浆后于-20℃低温保存待测。
在塑料试管中加入10μl血浆，190μl蒸馏水，20％TCA(三氯乙酸)，摇匀静置10min，再加入200μl20％TCA，弃上清，使用FT-2008γ放射性计数仪测定沉淀部分的放射性(cpm，均为双管平行测定)根据每次注射样品的放射性比活性、放射性衰变、放射测量时间和仪器计数效率矫正，计算血浆中125I-T1+T2或者125I-anti-CD19Fab-T1+T2的质量浓度(ng/ml)。
根据各时间点测得的血液中放射性换算成药物浓度，并用2P87药代动力学程序计算静脉注射各计量组的数据，Akaike信息标准(AIC)法判断房室模型。根据F检测(P<0.01)和AIC值最小原则，选择房室数为2，权重1/C2为最适合动力学模型。以房室数2，权重1/C2对静脉注射各组数据进行批处理的计算。按125I-T1+T2或者125I-anti-CD19Fab-T1+T2在大鼠体内代谢模型符合二房室分布模型，计算得出药代动力学参数。125I-T1+T2的三个计量组半衰期分别为30.5、28.8和26.2min；125I-anti-CD19Fab-T1+T2的三个计量组的半衰期分别为6.52、6.96和6.30h。
结果证实了本发明改造的鲎素肽大大的延长了体内代谢时间，根本解决了鲎素肽代谢快的缺点。

Claims (15)

1.一种鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于：编码所述融合蛋白的基因序列包括至少一个鲎素肽单元，编码鲎素肽单元的基因T直接连接或通过编码接头单元的连接肽基因LU连接于编码抗体单元的基因M的重链或轻链的3’端或5’端，鲎素肽-抗体偶联表达方式为：(T-LU)N–M，其中，N是≥1的整数， 
其中，所述鲎素肽单元为：tachyplesin I、tachyplesin II、tachyplesin III、polyphemusin I和polyphemusin II五种鲎素肽中的至少一种， 
其中，所述接头单元是基因工程技术所能利用的连接肽，是根据具体采用的抗体单元及鲎素肽单元的重叠次数而设计，LU为核酸，编码连接肽， 
其中，所述抗体单元是单克隆抗体，包含鼠或人或人源化的重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列。 
2.根据权利要求1所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于：所述鲎素肽单元为以五种鲎素肽氨基酸序列为基础进行的增加、删减、重复、联合，替代和修饰而得到的对癌细胞或致病菌具有生长抑制或毒性活性的多肽，所述编码鲎素肽单元的基因T编码上述任意一种鲎素肽。 
3.根据权利要求1所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于：所述鲎素肽单元具体包括tachyplesin I，以T1表示和tachyplesin II，以T2表示，上述T为编码T1和T2的核酸。 
4.根据权利要求1所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于：所述鲎素肽接头单元具体为G4S，其氨基酸序列为SQ7，LU为编码G4S的核酸，其核酸序列为SQ15。 
5.根据权利要求1所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于：所述单克隆抗体是完整的抗体，或抗体片段。 
6.根据权利要求5所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于：所述抗体片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、双特异抗体(diabody)、线型抗体、scFv、或scFv-Fc片段中的至少一种，核酸M编码单克隆抗体或抗体片段。 
7.根据权利要求6所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于：所述单克隆抗体具体为能够特异性结合B淋巴瘤细胞表面抗原CD19的单克隆抗体的Fab片段，简写为anti-CD19Fab，其氨基酸序列为SQ6，M具体为编码anti-CD19Fab的核酸，其核酸序列为SQ14。 
8.根据权利要求7所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于：所述anti-CD19Fab进一步的包括轻链和重链，轻链即L链，重链即H链，L链包括轻链可变区VL和轻链恒定区VL，H链包括重链可变区VH和重链恒定区CH1，L链和H链氨基酸序列分别为SQ18和SQ19；L链和H链的核酸序列分别为SQ20和SQ21。 
9.根据权利要求1－8所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白是将T1的基因通过G4S基因与anti-CD19Fab L链3’端相连，并且连接上终止密码子TAA，形成新 的序列L-T1，其核酸序列为SQ16，将T2的基因通过G4S基因与anti-CD19Fab H链3’端相连，并且连接上终止密码子TAA，形成新的序列H-T2，其核酸序列为SQ22。 
10.根据权利要求9所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于：将L-T1和H-T2序列相连接，由此完成表达式(T-LU)N–M的一种新序列L-T1-H-T2，以此序列表达形成鲎素肽-抗体融合蛋白anti-CD19Fab-T1+T2，其完整氨基酸序列为SQ8，完整核酸基因序列为SQ17。 
11.一种鲎素肽-抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于：将鲎素肽基因T直接连接或通过编码接头单元的连接肽基因LU连接于编码抗体单元的基因M的重链或轻链的3’端或5’端，形成(T-LU)N–M方式，构建重组表达质粒，通过宿主细胞表达其融合蛋白，制备方法包括步骤如下： 
(1)利用基因工程方法将鲎素肽基因通过接头基因或直接与抗体基因相连，并连接到表达载体中，得到重组表达质粒，具体步骤为： 
①利用重叠延伸PCR技术，以anti-CD19Fab L链，序列为SQ20，为模板通过两次PCR，将G4S基因、T1基因和终止密码子TAA基因连接到anti-CD19Fab L链的3’端并扩增，扩增出包含L链、G4S、T1、终止密码子TAA序列的PCR产物L-T1； 
②利用重叠延伸PCR技术以信号肽-anti-CD19Fab H链，序列为SQ23，为模板通过两次PCR，将G4S基因、T2基因和终止密码子TAA连接到anti-CD19Fab H链的3’端并扩增，扩增出包含H链、G4S、T2基因和终止密码子TAA的PCR产物H-T2； 
③利用酶切和连接方法，将上述两种PCR产物，即L-T1和H-T2基因，通过引物赋予的酶切位点，与表达载体PETdiabody的双酶切产物相连接； 
所述L-T1基因3’端与H-T2基因的5’端通过相同的酶切位点Nhe I相连，L-T1基因5’端与载体PETdiabody一端通过相同的酶切位点Mlu I相连，H-T2基因3’端与载体PETdiabody的另一端通过酶切位点Sph I连接在一起，从而构建成了包含有anti-CD19Fab-T1+T2基因的载体，形成(T-L)N–M模式，完成表达载体PET-anti-CD19Fab-T1+T2的构建； 
(2)利用基因工程方法将含有(T-L)N–M的载体转入到宿主细胞中，并进行融合蛋白的诱导表达； 
(3)纯化获得融合蛋白。 
12.根据权利要求11所述的鲎素肽-抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中①步骤中扩增出包含L链、G4S、T1和终止密码子TAA的PCR产物L-T1所需要的3个引物P5，P9和P10的序列如下： 
P5的序列为SQ34： 
5’-ACAAACGCGTACGCTGACATTGTGC-3’ 
下划线标记的为Mlu I酶切位点， 
P9的序列为SQ38： 
5’-ACCACGGTAGCAAACACGGAAGCACCATTTCGACGGTGGCGGTGGACACTCTCC CCTGTTGAAGC-3’ 
P10的序列为SQ39： 
5’-CTAGCTAGCGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCAGCTTAACGGCAACGACG GTAGCAGATACCACGGTAGCAAACACGGA-3’。 
下划线标记的为Nhe I酶切位点。 
13.根据权利要求11所述的鲎素肽-抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中②步骤中扩增出包含H链、G4S、T2基因和终止密码子的PCR产物H-T2所需要的3个引物P11，P12和P13的序列如下： 
P11的序列为SQ40： 
5’-GGCGCTAGCACGCAAGTTCACGTAAAAACGG-3’ 
下划线标记的为Nhe I酶切位点， 
P12的序列为SQ41： 
5’-GGTAGCAAACACGGAAGCACCAACGCGATGGCGGTGGCGGTGTGTGAGTTTTG TCACAAG-3’ 
P13的序列为SQ42： 
5’-ACATGCATGCCGCGTTAACGGCATTTACGGTAGCAGATACCACGGTAGCAAACAC GGAAGCAC-3’ 
下划线标记的为Sph I酶切位点。 
14.根据权利要求11所述的鲎素肽-抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的具体方法为：将含有L-T1-H-T2基因的质粒PET-anti-CD19Fab-T1+T2转化入宿主细胞大肠杆菌16C9中，通过低温诱导将融合蛋白表达到细菌的周质腔中，收集菌体后通过裂解的方式将融合蛋白释放到上清液中，收集上清液。 
15.根据权利要求11所述的鲎素肽-抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)纯化获得的融合蛋白的具体方法为：用纯化所用的上样缓冲液将含有融合蛋白的上清液进行透析后，过亲和层析柱完成纯化，或将透析液超滤浓缩后再过柱纯化，最终获得鲎素肽-抗体的融合蛋白，即anti-CD19Fab-T1+T2融合蛋白。 
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