CN103649119B - 特异性结合胰岛素样生长因子1的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合如下表位的分离的抗体，该表位包含在对人胰岛素样生长因子1前体(SEQ？ID？NO:1)已知的范围为氨基酸76至氨基酸84的氨基酸区段中。新的抗体具有极大效用，因为它们允许甚至在存在高过量浓度的紧密相关的胰岛素样生长因子2的情况下灵敏且特异性检测胰岛素样生长因子1。可以例如在体液样品中检测胰岛素样生长因子1。

Description

特异性结合胰岛素样生长因子1的抗体
发明背景
人胰岛素样生长因子1(UniProtKB条目P05019，IGF1_人，(SEQIDNO:1))，也称为生长调节素C和生长调节素A，处于其成熟形式，即一种70个aa的多肽(SEQIDNO:2)，其与IGF-2和胰岛素共享大段的序列同一性和高结构同源性(Rinderknecht,E.和Humbel,R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA73(1976)2365-2369;Rinderknecht,E.和Humbel,R.E.,J.BiologicalChemistry253(1978)2769-2776)。人IGF-2以IGF-1的500倍摩尔过量存在于人血清中(Jones,J.I.和Clemmons,D.R.,Endocr.Rev.16(1995)3-34)。IGF-2的较高血清浓度及其与IGF-1的序列同源性是对IGF-1特异性免疫检测的主要障碍。因此，生成清楚地在IGF-1和IGF-2之间进行区分的IGF-1特异性抗体(即没有与IGF-2的交叉反应性的抗体)是具有挑战性的，而且将构成对体液样品中IGF-1的特异性检测的基石。
与胰岛素类似，IGF-1多肽链可分成域。IGF-1包含4个域，分别为B(氨基酸残基1-29)、C(30-41)、A(42-62)和D(63-70)。域A和B分别是胰岛素B和A链的结构同源物，域C与胰岛素原的连接肽类似，而D域在胰岛素中没有对应物。
如ManesS.等,J.Endocrinol.154(1997)293-302总结的，认为IGF-1介导生长激素(GH)的促生长活性(Sara,V.R.和Hall,K.,PhysiolRev.70(1990)591-614)。在多种细胞类型中经由旁分泌或自分泌途径对细胞生长、分化和存活的局部控制中，它也被视为是关键的(JonesJ.I.和Clemmons,D.R.,Endocrin.Rev.16(1995)3-34)。已提出IGF-1的假定受体，即1型IGF受体(IGF-1R)(Ullrich,A.等,EMBOJ.,5(1986)2503-2512)在肿瘤发生中起着关键作用(Sell,C.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)11217-11221)。有足够证据指示许多肿瘤表达IGF-1R，且生成并向胞外环境分泌IGF-1或IGF-2(Baserga,R.,Cell79(1994)927-930;Werner,H.等,Int.J.Biochem.CellBiol.27(1995)987-994)，由此以自分泌方式促进连续细胞生长。
IGF-1和IGF-I2均在大量组织和细胞类型中表达且可具有自分泌、旁分泌和内分泌功能。成熟的IGF-1和IGF-2在人、牛和猪蛋白之间高度保守(100%同一性)，且还展现出跨物种活性。IGFL(胰岛素样生长因子样)家族包括在人中的4种小的(约11kDa)、可能分泌的家族成员和小鼠中的1种。
鉴于IGF-1的重要作用，生成IGF-1特异性的抗体，即没有与IGF-2的交叉反应性的抗体，对于IGF-1的特异性检测既是挑战性的也是极为重要的。尽管事实上已知胰岛素样生长因子达超过30年，但迄今为止乃至今天在体液样品中特异性检测IGF-1或在组织样品中定位蛋白质胰岛素样生长因子1仍然是困难的。这可能是例如由于本领域已知抗体的不充足的结合亲和力和/或对相关分子的不同水平交叉反应性所致。
在IGF-1的血清检测中，大多数仪器使用严格的清洗步骤来降低并克服其中使用的特异性结合剂(例如抗体)的非特异性结合。通常，通过用天然IGF-1免疫形成的抗体以比其识别IGF-2更高的亲和力和抗原复合物稳定性识别其真正的免疫原，所述IGF-2以较低的亲和力和抗原复合物稳定性起交叉反应。例如，自用天然重组人IGF-1对小鼠的免疫活动衍生的鼠单克隆抗体<IGF-1>-M2.28.44显示对IGF-1的结合动力学特征(signature)(见图8)为KD=0.03x10-9mol/L亲和力，t1/2解离=92min，而IGF-2以KD=5x10-9mol/L的亲和力和t1/2解离=5min结合。根本性差异在于抗原复合物稳定性。这类抗体对IGF-1特异性测定法的成功使用强烈依赖于仪器的清洗设置，因为需要相对于<IGF-1>-M2.28.44交叉反应性抗体消耗IGF-2。简言之，仅可以依靠复杂的清洗步骤来克服展现出与IGF-2的交叉反应性的IGF-1结合抗体的技术限制。
不言自明的是，对于在平衡条件下，特别是在不实施抗体-抗原免疫复合物的任何清洗或纯化规程的诊断系统中所应用的抗体，IGF-1特异性要求高得多。在其它实施方案中，体内情况原理上也以热力学平衡为特征。因此，在平衡条件下，证实缺乏任何IGF-2相互作用尤其具有最重要的意义。
本发明的任务是开发出克服本领域已知的这些问题的抗体。适合于在平衡条件下应用的IGF-1特异性抗体的关键要求不仅在于识别并以高亲和力结合IGF-1，而且即使在高IGF-2血清浓度时也没有可检出的IGF-2结合ka(1/Ms)。
从原理上讲，IGF-1和IGF-2之间的免疫学区分应仅在相应抗体靶向IGF-1表位，而该表位与IGF-2对应物在氨基酸序列或构象上明显不同时才是可行的。事实上，在IGF-1和IGF-2之间仅有一个显著的连续偏差，值得注意地在IGF-1氨基酸位置74-90处在IGF-1的转角-环基序中，其以信号和前肽(UniProtKB条目P05019,IGF1_人)开始编号。迄今为止，仍然不能使用天然IGF-1作为实验动物中的免疫原通过常规免疫策略来获得靶向作为表位的此IGF-1基序的抗体。
本发明涉及分离的抗体，其特异性结合在人胰岛素样生长因子1前体(SEQIDNO:1)中范围为氨基酸76至氨基酸84的氨基酸区段内的此真正的IGF-1表位。
新抗体具有极大效用，因为它们允许甚至在存在大量过量的紧密相关的IGF-2的情况下灵敏且高度特异性检测胰岛素样生长因子1。
令人惊讶地，已发现可以利用人胰岛素样生长因子1前体(SEQIDNO:1)的氨基酸76至氨基酸90(SEQIDNO:5)的氨基酸区段并将其工程化改造成替代免疫原，由此为生成特异性结合天然IGF-1的C域的抗体铺平道路。我们还发现，在IGF-1的免疫学检测中使用结合包含在人胰岛素样生长因子1前体(SEQIDNO:1)的氨基酸76至氨基酸84内的表位的分离抗体可以具有极大的优点。
发明概述
令人惊讶地，已发现结合胰岛素样生长因子1(IGF-1)的相当短的部分序列，即由SEQIDNO:1代表的IGF-1前体的氨基酸76至84(SEQIDNO:3)的抗体具有相当有利的特性且能克服至少一些本领域中已知的问题。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的抗体，其结合包含在胰岛素样生长因子1前体的氨基酸76-84(SEQIDNO:3)内的表位。
在本发明的一个实施方案中，公开了结合包含在SEQIDNO:3中的表位，或在此氨基酸区段内的部分序列(SEQIDNO:4)（例如范围为IGF-1前体(SEQIDNO:1)的氨基酸77至84）的单克隆抗体。
本发明还涉及特异性结合IGF-1的抗体的部分序列和免疫测定方法，所述方法包括下述步骤，将液体样品与依照本发明的抗体一起温育，由此发生所述抗体对所述样品中胰岛素样生长因子1的结合，并检测所述样品中结合至抗胰岛素样生长因子1抗体的IGF-1。
发明详述
成熟的人胰岛素样生长因子1(IGF-1)具有约8kDa的分子量并由70个氨基酸组成。IGF-1包含4个明确限定的区域，分别是SEQIDNO:2的B(氨基酸残基1-29)、C(30-41)、A(42-62)和D(63-70)。
本发明涉及一种分离的抗体，其结合包含在胰岛素样生长因子1的环区(SEQIDNO:5)内的表位。
在一个实施方案中，本发明涉及一种分离的抗体，其在胰岛素样生长因子1前体(SEQIDNO:1)的氨基酸残基76-84(SEQIDNO:3)内结合。换言之，依照本发明的分离的抗体结合包含在SEQIDNO:3中的表位。
除非另外解释，本文中使用的所有技术和科学术语与本文公开的发明所属领域中普通技术人员的理解具有相同的意义。
冠词“一个/一种”用于本文指一个/种或超过一个/种(即至少一个/种)冠词语法对象。举例而言，“一个/一种抗体”意指一个/种抗体或超过一个/种抗体。
“表位”是靶分子(例如抗原，如蛋白质或核酸分子)上与抗原结合分子(例如抗体、抗体片段、含有抗体结合区的支架蛋白质或适体)结合的位点。表位既可以从靶分子的连续残基形成，也可以从邻近的不连续残基(例如氨基酸残基)形成。从连续残基(例如氨基酸残基)形成的表位通常也称为线性表位。表位通常包含至少5个且多达约12个残基，大多数介于6个和10个残基(例如氨基酸残基)之间。“分离的”抗体是已鉴定并与其天然环境的组分分开和/或从其回收的抗体。其天然环境的污染物组分是会干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的材料，且可以包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至按抗体重量计大于70%，如通过例如Lowry方法测定的，且在一些实施方案中，纯化至按重量计超过80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。在一个优选的实施方案中，将依照本发明的分离的抗体纯化至超过90%纯度，如通过还原性条件下的SDS-PAGE使用用于蛋白质检测的考马斯蓝染色测定的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体是多克隆抗体。结合包含在SEQIDNO:3中的序列的多克隆抗体能够例如通过免疫吸附获得，其使用含有此序列的亲和柱作为免疫吸附材料进行。在一个实施方案中，依照本发明的抗体是单克隆抗体。
显而易见的是，通过现有技术方法根本不可能生成针对IGF-1C域的抗体。实际上，用天然重组的IGF-1免疫以及用自IGF-1衍生的肽免疫(ManesS.等,J.Endocrinol.154(1997)293-302)不能生成针对所述表位区域的单克隆抗体。最突出地，用包含胰岛素样生长因子1前体的氨基酸76至84的线性多肽序列来免疫实验动物不能生成既不对天然构象性IGF-1，也不对其线性肽基序展现出结合活性的抗体。
早期为了免疫实验动物而试图合成充足量的包含胰岛素样生长因子1前体的氨基酸序列76至84的约束性IGF-1肽是不成功的。
基于本文中公开的新方法，现在可以以可再现方式生成这类难以获得的抗体。简言之，本文中显示的方法包括工程化嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)SlyD的使用。SlyDIF(Insert-In-Flap)底物结合域用来自胰岛素样生长因子1前体的氨基酸序列76至84替换，由此构成具有嫁接的肽免疫原的热稳定性支架模块。
氨基酸嫁接物由嗜热栖热菌SlyDFKBP域以约束性、焓有利的方式呈现，其保留IGF-1插入基序的天然样二级结构。将此嵌合多肽用作免疫原以免疫实验动物。针对完整多肽的体液免疫应答也靶向插入基序。通过例如相对于野生型伴侣或相对于天然成熟的IGF-1进行比较筛选，可以选出特异性识别IGF-1插入基序的抗体。如此，此嵌合多肽充当天然IGF-1的替代多肽，且令人惊讶地，使得我们第一次能够将免疫应答导向预选择的表位以生成高亲和力抗体。
提供的方法及由此生成的抗体在研究和常规事务（例如对于治疗和诊断性应用两者）中分别具有重大价值。
如本文中使用的，术语“结合人IGF-1”或“抗IGF-1抗体”是可交换的。优选地，依照本发明的结合人IGF-1抗原的抗体具有于25℃为1.0x10-8mol/l或更低的KD值，在一个实施方案中，于25℃为1.0x10-9mol/l或更低的KD值。用标准的结合测定法如表面等离振子共振技术(GE-HealthcareUppsala,Sweden)测定结合亲和力。用于测定结合亲和力的KD值的方法记载于实施例部分。如此，如本文中使用的，“结合人IGF-1的抗体”指于25℃以至少1.0x10-8mol/l或更低的KD，优选KD1.0x10-9mol/l至KD10x10-12mol/l结合人IGF-1抗原的抗体。
本文中描述的抗体于25℃对IGF-2不显示任何可测量的结合速率常数ka(1/Ms)。该抗体对IGF-1显示从至少ka9x105(1/Ms)或更快(在扩散限附近)的结合速率常数ka(1/Ms)。如此，在一个实施方案中，依照本发明的抗体于25℃对IGF-2不显示可测量的结合速率常数。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体于25℃显示从至少kd2x10-3(1/s)至kd3x10-5(1/s)或更缓慢的抗原复合物稳定性。
如熟练技术人员会领会的，术语“特异性”用于指示样品中存在的其它生物分子不显著结合特异性结合例如胰岛素样生长因子1的抗体。优选地，结合胰岛素样生长因子1以外的生物分子的水平导致可忽略的，即依靠ELISA或例如使用Biacore4000仪的亲和力测定测量不到的结合亲和力。
“特异性结合胰岛素样生长因子1”的抗体不会结合胰岛素样生长因子-2。更准确地，使用高度灵敏性BiacoreT200仪的动力学测量不显示这类抗体对IGF-2的任何可测量的结合速率常数ka(1Ms)，即使在高分析物浓度时(见例如图7)。此外，“特异性结合胰岛素样生长因子1”的抗体的特征在于在25℃对IGF-1的全功能性化学计量结合，其以一个抗体能够同时结合两个IGF-1多肽的方式进行，该方式由从MR=1.7到MR=2.0的摩尔比(MR)值指示(见图8)。
使用T200仪(GEHealthcare,Biacore)测定结合亲和力KD。
BiacoreT200仪(GEHealthcare)用于对杂交瘤培养上清液动力学评估对IGF-1肽的结合特异性。将CM5系列S传感器嵌入系统并依照制造商用法说明书在HBSN缓冲液(10mMHEPESpH7.4,150mMNaCl)中标准化。将系统缓冲液变为HBS-ET(10mMHEPESpH7.4,150mMNaCl,0.05%TWEEN20)。所述样品缓冲液是补充有1mg/mlCMD(羧甲基葡聚糖，Sigma#86524)的系统缓冲液。系统于25℃运行。
将10000个RURAMIgGFC(相对单位的相应小鼠免疫球蛋白G亚类的家兔抗小鼠F(c)γ片段/JacksonLaboratories)依照制造商用法说明书固定化，其在流动池FC1(亚类1的抗小鼠F(c)γ)、FC2、FC3和FC4上使用EDC/NHS化学进行。使用1M乙醇胺将传感器失活。
动力学测试抗体对例如SEQIDNO:3(IGF-176-84)的肽的结合活性。通过将在样品缓冲液中以1:3稀释的粗制杂交瘤上清液以10μl/min注射1分钟来捕捉抗体。
流速设定为100μl/min。将例如SEQIDNO:(IGF-1前体位置76-84)的肽以0nM、1.1nM、3nM、10nM、30nM和90nM的不同浓度步骤分别注射3分钟。使用Kinject命令监测解离达600秒。实现传感器表面的酸性再生，其使用10mM甘氨酸pH1.5以30μl/min连续注射3次达30秒进行。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体以于25℃为1.0x10-8mol/l或更低的KD值特异性结合包含在SEQIDNO:3的氨基酸序列内的表位，即包含在胰岛素样生长因子1前体(SEQIDNO:1)氨基酸76至84内的表位。如上文提述的，依照本发明的多克隆抗体，即结合包含在SEQIDNO:3中的表位的多克隆抗体可例如通过使用SEQIDNO:3的肽进行免疫吸附的免疫吸附从免疫后动物的血清中分离。
可以以恒定质量且以几乎不受限制的数量生产单克隆抗体。在一个优选的实施方案中，结合SEQIDNO:3中包含的表位的抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中，结合SEQIDNO:3的抗体是由杂交瘤细胞系10.07.09(生成MAb<h-IGF-1>M-10.07.09)生成的单克隆抗体。
新生成的两种<IGF-1>单克隆抗体(分别是生成MAb<h-IGF-1>M-11.11.17的11.11.17和生成MAb<h-IGF-1>M-11.09.15的11.09.15)结合SEQIDNO:3内包含的甚至更小的表位，即它们结合由SEQIDNO:4代表的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体结合包含胰岛素样生长因子1前体的氨基酸76至84的表位，即结合成熟IGF-1的氨基酸28至36(SEQIDNO:4)。在一个实施方案中，本发明的抗体结合SEQIDNO:43到SEQIDNO:49的合成的15聚体肽，即结合那些包含由胰岛素样生长因子1前体的氨基酸76至84(SEQIDNO:3)组成的表位的肽。
在一个实施方案中，本发明的抗体结合包含胰岛素样生长因子1前体的氨基酸77至84(SEQIDNO:4)的表位。在一个实施方案中，本发明的抗体结合SEQIDNO:43到SEQIDNO:50的合成的15聚体肽，即结合那些包含由胰岛素样生长因子1的氨基酸77至84(SEQIDNO:4)组成的表位的肽。
优选地，如实施例部分描述的，通过PepScan分析评估抗体是否结合在SEQIDNO:3或SEQIDNO:4中分别给出的氨基酸序列的表位。例如，如果包含SEQIDNO:3序列的各种PepScan肽在这类分析中用研究的抗体测试呈阳性，那么就承认对SEQIDNO:3的表位的结合。
本发明还涉及特异性结合IGF-1的抗体，其特征在于包含SEQIDNO:15的CDR3区作为重链可变域CDR3区。
优选地，特异性结合IGF-1的抗体的特征在于，重链可变域包含SEQIDNO:15的CDR3区和SEQIDNO:16的CDR2区。
优选地，特异性结合IGF-1的抗体的特征在于，重链可变域包含SEQIDNO:15的CDR3区、SEQIDNO:16的CDR2区和SEQIDNO:17的CDR1区。
本发明还涉及结合人IGF-1的抗体，其特征在于重链可变域包含SEQIDNO:15的CDR3H区、SEQIDNO:16的CDR2H区和SEQIDNO:17的CDR1H区，轻链可变域包含SEQIDNO:18的CDR3L区、SEQIDNO:19的CDR2L区和SEQIDNO:20的CDR1L区。
本发明还涉及一种抗体或其人源化型式，所述抗体特征在于重链可变域VH是SEQIDNO:21；且轻链可变域VL是SEQIDNO:22。
本发明还涉及特异性结合人IGF-1的抗体，其特征在于包含SEQIDNO:23的CDR3区作为重链可变域CDR3区。
优选地，特异性结合IGF-1的抗体的特征在于，重链可变域包含SEQIDNO:23的CDR3区和SEQIDNO:24的CDR2区。
优选地，特异性结合IGF-1的抗体的特征在于，重链可变域包含SEQIDNO:23的CDR3区、SEQIDNO:24的CDR2区和SEQIDNO:25的CDR1区。
本发明还涉及结合人IGF-1的抗体，其特征在于重链可变域包含SEQIDNO:23的CDR3H区、SEQIDNO:24的CDR2H区和SEQIDNO:25的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQIDNO:26的CDR3L区、SEQIDNO:27的CDR2L区和SEQIDNO:28的CDR1L区。
本发明还涉及一种抗体或其人源化型式，所述抗体特征在于重链可变域VH是SEQIDNO:29；且轻链可变域VL是SEQIDNO:30。
本发明还涉及一种抗体或其人源化型式，所述抗体特征在于重链可变域VH是SEQIDNO:31；且轻链可变域VL是SEQIDNO:32。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体是单克隆的。在一个实施方案中，依照本发明的抗体是人源化的或人的。在一个实施方案中，依照本发明的抗体是IgG1或IgG4亚类的。在一个实施方案中，依照本发明的抗体是IgG1亚类的单克隆人源化抗体。
本发明还涉及嵌合的或人源化的抗体，其包含分别为SEQIDNO:15或SEQIDNO:23的HCDR3。
术语“抗体”涵盖抗体结构的各种形式，包括但不限于全抗体和抗体片段。优选地，依照本发明的抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或者是另外的经遗传工程化的抗体，只要保留依照本发明的特征性特性。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选是其可变域，或至少是其抗原结合位点。抗体片段的例子包括双抗体、单链抗体分子和从抗体片段形成的多特异性抗体。scFv抗体例如记载于Huston,J.S.,MethodsinEnzymol.203(1991)46-88。另外，抗体片段包含单链多肽，其具有结合IGF-1的VH域或VL域的属性，所述VH域能与VL域装配在一起，所述VL域能与VH域装配在一起，从而形成功能性抗原结合位点并由此提供依照本发明的抗体的特性。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有单一氨基酸组成的抗体分子的制备物。
术语“嵌合抗体”指包含来自小鼠的可变区(即结合区)和自不同来源或物种衍生的恒定区的至少一部分的单克隆抗体，其通常通过重组DNA技术制备。特别优选包含小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。这类小鼠/人嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包含编码小鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它形式是那些其中类或亚类已从原始抗体修饰或改变的形式。这类“嵌合”抗体也称为“类转换抗体”。用于生成嵌合抗体的方法牵涉本领域中现在公知的常规的重组DNA和基因转染技术。参见例如Morrison,S.L.等,Proc.Natl.AcadSci.USA81(1984)6851-6855;US5,202,238和US5,204,244。
术语“人源化抗体”或“抗体的人源化型式”指其中框架或“互补决定区”(CDR)已经经过修饰以包含相比于亲本免疫球蛋白的特异性具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，将VH和VL的CDR嫁接到人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann,L.等,Nature332(1988)323-327；和Neuberger,M.S.等,Nature314(1985)268-270。重链和轻链可变框架区可自相同或不同的人抗体序列衍生。人抗体序列可以是天然存在的人抗体的序列。人重链和轻链可变框架区列于例如Lefranc,M.-P.,CurrentProtocolsinImmunology(2000)-Appendix1PA.1P.1-A.1P.37中且可经由IMGT，国际ImMunoGeneTics信息系统(http://imgt.cines.fr)或经由http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk获得。任选地，可通过进一步突变来修饰框架区。特别优选的CDR对应于那些代表识别上文针对嵌合抗体所记载的抗原的序列的CDR。优选地，这类人源化型式嵌合有人恒定区。如本文中使用的，术语“人源化抗体”还包括在恒定区中经过修饰以生成依照本发明的特性(尤其是关于C1q结合和/或FcR结合方面)的这类抗体，例如通过“类转换”，即改变或突变Fc部分(例如从IgG1变为IgG4和/或IgG1/IgG4突变)实现。
如本文中使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(vanDijk,M.A.和vandeWinkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗体还可在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫后在缺乏内源性免疫球蛋白生成的情况下能生成人抗体的完整全集或选择。人种系免疫球蛋白基因阵列在这类种系突变体小鼠中的转移将导致抗原攻击时人抗体的生成(参见例如Jakobovits,A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555;Jakobovits,A.等,Nature362(1993)255-258;Brueggemann,M.D.等,YearImmunol.7(1993)33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中生成(Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388;Marks,J.D.等,J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。还可使用Cole,A.等和Boerner,P.等的技术来制备人单克隆抗体(Cole,A.等,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,Liss,A.R.(1985)p.77;和Boerner,P.等,J.Immunol.147(1991)86-95)。如已对依照本发明的人源化抗体提述的，如本文中使用的，术语“人抗体”还包括在恒定区中经过修饰以生成依照本发明的特性(尤其是关于C1q结合和/或FcR结合方面)的这类抗体，例如通过“类转换”，即改变或突变Fc部分(例如从IgG1变为IgG4和/或IgG1/IgG4突变)实现。
如本文中使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创造或分离的所有人抗体，如从宿主细胞如NS0或CHO细胞或从对于人免疫球蛋白基因为转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体，或者使用转染到宿主细胞中的重组表达载体所表达的抗体。这类重组的人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。依照本发明的重组人抗体已进行过体内体细胞高突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，尽管其自人种系VH和VL序列衍生并与之相关，但可能不天然存在于体内人抗体种系全集内。
已证实依照本发明的抗体在借助于免疫测定法从液体样品检测胰岛素样生长因子1中极为有用。
免疫测定法是熟练的技术人员公知的。用于实施这类测定的方法以及实际应用和规程汇总在相关教科书中。相关教科书的例子是Tijssen,P.,Preparationofenzyme-antibodyorotherenzyme-macromoleculeconjugates，于：PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays,pp.221-278,Burdon,R.H.和v.Knippenberg,P.H.(eds.),Elsevier,Amsterdam(1990)，和涉及免疫学检测方法的MethodsinEnzymology,Colowick,S.P.和Caplan,N.O.(编),AcademicPress的多个卷，特别是卷70、73、74、84、92和121。
在依照本发明的方法的一个实施方案中，在免疫测定规程中测量IGF-1蛋白。
在某些实施方案中，在酶联免疫吸附测定法(ELISA)或基于电化学发光的免疫测定法(ECLIA)中检测IGF-1。
在一个实施方案中，在夹心式测定法(夹心型测定法形式)中检测IGF-1。在一个实施方案中，IGF-1的测量在夹心式免疫测定法中实施，其采用与至少两种不重叠表位反应性的至少两种抗体进行。
在一个实施方案中，本发明涉及用于经由夹心式免疫测定法检测体液样品中的IGF-1的方法，该方法包括以下步骤：将样品与依照本发明的抗体一起温育，由此发生所述抗体对所述样品中胰岛素样生长因子1的结合，将样品与结合不包含IGF-1的氨基酸76至84的表位的针对IGF-1的二抗一起温育，由此发生二抗的结合，并测量在步骤(a)和(b)中形成的免疫夹心式复合物，由此检测样品中的IGF-1。
夹心式测定法是最有用的且普遍使用的测定法之一。存在许多夹心测定技术的变化，且所有均意图为本发明涵盖。简言之，在一种典型的正向测定法中，将未标记的抗体固定化于固体基底(或固相)上，并使要测试的样品与结合的分子接触。此捕获抗体的固定化可通过直接吸附于固相，或例如经由特异性结合对，例如经由链霉亲合素-生物素结合对间接吸附于固相实现。在合适的温育期后，达到足以允许形成抗体-抗原复合物的时段，然后，添加用能够产生可检测信号的报告分子标记的、结合该抗原的二抗，并温育，允许足以形成抗体-抗原-经标记的抗体的夹心式复合物的时间。洗掉任何未反应的材料，并通过观察由报告分子产生的信号来测定IGF-1的存在。结果可以是定性的，即通过简单观察可见信号，或者可以通过与含有已知量的生物标志物的对照样品比较来定量。
在典型的夹心式测定法中，第一抗体共价或非共价结合于固体表面。固体表面通常是玻璃或聚合物，最通常使用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以以管、珠、微板的盘或任何其它适用于进行免疫测定法的表面的形式。结合过程是本领域中公知的，且一般由交联、共价结合或物理吸附组成。通常对经抗体包被的固体表面(“固相复合物”)进行处理以封闭非特异性结合并清洗，为测试样品做准备。然后，向固相复合物添加要测试的样品的等分试样，并在合适的条件(例如从室温到40℃，如介于25℃和32℃之间，包含端点)下温育足够的一段时间(例如2-40分钟或者若更方便的话，过夜)，所述条件和时间段容许第一抗体或捕获抗体与相应抗原之间结合。在该温育期后，清洗包含第一抗体或捕获抗体及与其结合的抗原的固相，并与结合抗原上另一表位的二抗或经标记的抗体一起温育。该二抗与报告分子连接，其用于指示二抗对第一抗体和感兴趣抗原的复合物的结合。
测定法的变化包括同时测定法，其中向结合的抗体或能够结合至固相的抗体同时添加样品和经标记的抗体两者。这些技术是本领域中技术人员公知的，其包括如会容易显而易见的任何次要变化。
一种备选的竞争性方法牵涉将IGF-1固定化于固相上，然后将此固定化的靶物连同样品一起暴露于针对IGF-1的特异性抗体(其可以用或不用报告分子标记)。根据靶物的量和报告分子信号的强度，靶分子的竞争经由这类经标记的抗体可以直接可检测。或者，可以将特异性结合IGF-1的抗体固定化且可经由样品中的IGF-1与经标记的IGF-1的竞争来测定IGF-1。
在一个优选的实施方案中，使用体液作为样品材料来实践依照本发明的方法。在一个别的实施方案中，体液样品选自全血、血清或血浆。在一个别的实施方案中，所述样品材料是血清或血浆。在一个实施方案中，用于测量IGF-1的免疫测定法使用血清作为样品材料。在一个实施方案中，用于测量IGF-1的免疫测定法使用尿液作为样品材料。
对于在IGF-1检测中的使用，本发明还提供试剂盒或制品。这些试剂盒可包含载体手段，其区室化为在紧密约束中接受一个或多个容器手段如管形瓶、管等，每个容器手段包含要在所述方法中使用的不同要素之一。例如，一个容器手段可包含依照本发明的抗体。试剂盒还可具有包含报告手段，如与报告分子(如酶、荧光或放射性同位素标记物)结合的结合IGF-1的二抗的容器。这类试剂盒将通常包含如上文描述的容器和一个或多个包含从商业和用户观点而言期望的材料的其它容器，所述材料包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针、注射器和具有使用说明的包装插页。容器上可存在标签以指示该组合物用于特定应用，且还可指示使用指导。
在一个别的具体的实施方案中，对于基于抗体的试剂盒，该试剂盒可包含例如：(1)特异性结合IGF-1的第一抗体(例如附接于固体支持物或能够结合固体支持物)和(2)结合IGF-1的第二不同抗体。优选地，后一抗体用报告分子标记。当然，在设计此类测定法时，还可以将第一抗体交换为第二抗体或反之亦然。
提供以下实施例、序列表和图以帮助对本发明的理解，其真实范围在所附权利要求书中列出。应理解可在不背离本发明的精神的前提下对所列规程进行修改。
序列表的描述
SEQIDNO:1人胰岛素样生长因子1前体的序列
SEQIDNO:2成熟人胰岛素样生长因子1的序列
SEQIDNO:3人胰岛素样生长因子1前体的部分序列(位置76至84)
SEQIDNO:4人胰岛素样生长因子1前体的部分序列(位置77至84)
SEQIDNO:5人胰岛素样生长因子1前体的部分序列(位置74至90)
SEQIDNO:6人工序列：(gly-gly-gly-ser)
SEQIDNO:7人工序列：(His标签)
SEQIDNO:8人工序列：FkBP-IGF-1(74-90)融合蛋白
SEQIDNO:9人工序列：SlyD-FkBP-IGF-1(74-90)融合蛋白
SEQIDNO:10人工序列：嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合蛋白
SEQIDNO:11人工序列：嗜热栖热菌(Thermusthermophile)野生型SlyD蛋白
SEQIDNO:12人工序列：缺少IF域的嗜热栖热菌SlyD
SEDIDNO:13人工序列：ThermococcusgammatoleransSlyD-IGF-1(74-90)融合蛋白
SEDIDNO:14人工序列：ThermococcusgammatoleransSlyD-IGF-2(53-65)融合蛋白
SEQIDNO:15MAb10.07.09的重链CDR3H
SEQIDNO:16MAb10.07.09的重链CDR2H
SEQIDNO:17MAb10.07.09的重链CDR1H
SEQIDNO:18MAb10.07.09的轻链CDR3H
SEQIDNO:19MAb10.07.09的轻链CDR2H
SEQIDNO:20MAb10.07.09的轻链CDR1H
SEQIDNO:21MAb10.07.09的重链可变域VH
SEQIDNO:22MAb10.07.09的轻链可变域VL
SEQIDNO:23MAb11.11.17的重链CDR3H
SEQIDNO:24MAb11.11.17的重链CDR2H
SEQIDNO:25MAb11.11.17的重链CDR1H
SEQIDNO:26MAb11.11.17的轻链CDR3H
SEQIDNO:27MAb11.11.17的轻链CDR2H
SEQIDNO:28MAb11.11.17的轻链CDR1H
SEQIDNO:29MAb11.11.17的重链可变域VH
SEQIDNO:30MAb11.11.17的轻链可变域VL
SEQIDNO:31MAb11.09.15的重链可变域VH
SEQIDNO:32MAb11.09.15的轻链可变域VL
SEDIDNO:33-62表位分析中使用的人胰岛素样生长因子1前体的部分序列。
附图说明
图1嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽的SDSPAGE(考马斯染色)和抗his标签Western印迹(10秒暴露)。M-NovexSharp标准品；1-2.5μg嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽；2-5.0μg嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽；3-10μg嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽；M*-MagicMark。
图2嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽的分析性HPLC层析谱(上方线：分子量标准品；下方线：融合多肽)。
图312周免疫后通过ELISA测定的小鼠中的血清滴度，其分别使用嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)和人IGF-1(=IGF-1)作为捕捉抗原进行(mE=毫吸光度)。
图4对原代培养物的ELISA筛选，其显示对IGF-1、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽和嗜热栖热菌野生型SlyD多肽的结合信号(mE=毫吸光度，IGF-1=人IGF-1)。
图5原代培养物<IGF-1>M-11.0.15对IGF-1、IGF-2、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽和嗜热栖热菌野生型SlyD多肽的例示性BIAcore动力学筛选。(该原代培养物称为11.0.15，而在最终克隆后名称是11.10.15)。
图6克隆培养上清液对IGF-1、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽和嗜热栖热菌野生型SlyD多肽的ELISA筛选。用IGF-1和嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽检测到指示改进的结合亲和力的升高的吸收信号。
图7<IGF-1>M-11.11.17-IgG对IGF-1、IGF-2、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽、嗜热栖热菌野生型SlyD多肽、Thermococcusgammatolerans野生型SlyD多肽嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽和ThermococcusgammatoleransSlyD-IGF-2(53-65)融合多肽的BIAcore测量。
图8具有新开发的抗IGF-1抗体的结合动力学的表。mAb：单克隆抗体；RU：传感器上捕获的单克隆抗体的相对应答单位；抗原：溶液中抗原；kDa：作为溶液中分析物注射的抗原的分子量；ka：结合速率常数；kd：解离速率常数；t1/2解离：依照公式t1/2解离=ln(2)/60xkd计算的抗体-抗原复合物半衰期；KD：解离常数；R最大：90nM分析物注射结合阶段结束时的结合信号；MR：摩尔比；χ2：测量的卡方检验；n.d.：未检出。
实施例
实施例1
生成单克隆抗体的通用规程
将预配制的融合多肽免疫原以不同剂量对实验动物腹膜内施用，所述实验动物如小鼠、大鼠、家兔、绵羊或仓鼠。在收集B细胞前，实施加强免疫。可依照Koehler和Milstein(Koehler,G.和Milstein,C.,Nature256(1975)495-497)的方法获得B细胞杂交瘤。将获得的杂交瘤作为单一克隆或细胞存储在多孔板的孔中。用动力学筛选方法进一步筛选分泌的抗体就抗体结合而言测试呈阳性的原代杂交瘤培养物。
实施例2
使用SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽生成针对胰岛素样生长因子1的抗体
在针对IGF-1的单克隆抗体的生成中，可将包含氨基酸序列NKPTGYGSSSRRAPQTG(SEQIDNO:5)的融合多肽用于免疫实验室动物。
为了改进免疫原性多肽的呈现，SEQIDNO:5的IGF-1转角-环基序侧翼可以有在该氨基酸序列N端和C端的GGGS接头(SEQIDNO:6)，或者有在IGF-1氨基酸序列N端的HG二肽以及有在IGF-1氨基酸序列C端的GA二肽。
将SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽用作免疫原以及也用作开发抗IGF-1抗体的筛选试剂，该抗IGF-1抗体特异性结合由NKPTGYGSSSRRAPQTG(SEQIDNO:5)组成的IGF-1氨基酸序列。
还包含SEQIDNO:7的氨基酸序列标签的FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽具有以下氨基酸序列：
MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGGGGSNKPTGYGSSSRRAPQTGGGSTLVFDVELLXLEGGGSKKHHHHHHHH(SEQIDNO:8)
包含SEQIDNO:7的氨基酸序列标签的SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽具有以下氨基酸序列：
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVVESPVSAPLDYLHGHGSLISGLEIALLGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRPLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVSQRAKLTISPDYAYGGGGSNKPTGYGSSSKRAPQTGGGGSTLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SLQIDNO:9).
使用ELISA分析从用SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽免疫过的NMRI小鼠获得的细胞。将NuncMaxisorbF多孔板用SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)或SlyD/FKBP12对照(缺少SEQIDNO:5的肽)包被，其通过应用包含每ml0.41μg多肽的溶液进行。随后，通过在室温应用包含PBS中1%RPLA的溶液1小时来封闭游离结合位点。将孔用包含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液清洗3次。将化学生物素化的IGF-1(Peprotech，人IGF-1，Cat.#100-11)和包含SEQIDNO:5的氨基酸3至15的生物素化IGF-1肽环分别固定化于StreptaWellHighBindSA多孔板的孔中，其通过分别应用包含90ng/ml生物素化的IGF-1或500ng/ml生物素化的IGF-1肽环的溶液进行。该环肽开始于与SEQIDNO:5的位置2对应的半胱氨酸，且另外含有对应于SEQIDNO:5的位置16的半胱氨酸。这两个半胱氨酸已经用于环化该肽，由此形成肽环。N端半胱氨酸进一步用于生物素化。
作为样品，使用用PBS以1:50稀释的小鼠血清。以1:4阶梯实施任选的进一步稀释直至最终稀释为1:819,200。温育时间为室温1小时。将孔用包含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液清洗3次。作为检测抗体，使用与过氧化物酶缀合的针对靶抗体的恒定域的多克隆抗体(PAK<M-Fcγ>S-F(ab’)2-POD)。以包含1%(w/v)RSA的PBS中80ng/ml的浓度应用检测抗体。温育时间为室温1小时。将孔用包含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液清洗3次。然后，将孔与ABTS溶液在室温温育15分钟。用光度计测定显现颜色的强度。例示性结果在下表呈现。
表
-：ELISA中检测不到结合
免疫后10周，通过ELISA测定抗体滴度。用SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)(SEQIDNO:9)融合多肽免疫的小鼠显示对IGF-1、对SEQIDNO:5的肽、对SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合多肽和对SlyD/FKBP12对照多肽(没有SEQIDNO:5序列的SEQIDNO:9)的低滴度。仅有一只小鼠提供足够高的抗IGF-1滴度(上表中的K1576M1)，并将其用于生成杂交瘤。未能鉴定出生成在这些实验中特异性识别天然IGF-1的抗体的杂交瘤。SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)似乎不适合用作用于开发IGF-1特异性抗体的免疫试剂。以后，凭实验确认(数据未显示)多肽SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)不是热力学稳定的。仅SlyD域而非FKBP12-IGF-1(74-90)域是正确折叠的。因此，由于FKBP12支架的微小热力学稳定性，该融合多肽没有有效呈现IGF-1(74-90)嫁接序列。
实施例3
使用嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽生成针对胰岛素样生长因子1的抗体
最终，通过用嵌合嗜热栖热菌-SlyD-抗原融合多肽免疫小鼠生成抗原特异性抗体。多个表位可靶定于此支架的表面上，即在FKBP域和IF域之间的连接区中。可以鉴定结合嫁接的靶抗原的抗体，其通过对作为阴性对照的野生型嗜热栖热菌-SlyD，或对作为阳性对照的天然重组抗原(IGF-1)的差别筛选进行。本实施例证明了热稳定性SlyD支架相比于中间稳定性人FKBP12的有利特性，如前文描述的。嗜热栖热菌-SlyD使得能够呈现焓的、刚性且稳定的结构，并因此适合用作抗原呈现支架以用于开发对替代的、天然蛋白质结构的单克隆抗体，该蛋白质结构在其它情况中不能到达例如实验动物的免疫系统。
3.1.嗜热栖热菌SlyD融合多肽的生成
盐酸胍(GdmCl)(A级)购自NIGU(Waldkraiburg,Germany)。无EDTA蛋白酶抑制剂片、咪唑和EDTA来自RocheDiagnosticsGmbH(Mannheim,Germany)，所有其它化学品为分析级，来自Merck(Darmstadt,Germany)。超滤膜(YM10,YM30)购自Amicon(Danvers,MA,USA)，微透析膜(VS/0.025μm)和超滤单元(Biomaxultrafree滤器装置)来自Millipore(Bedford,MA,USA)。用于过滤粗制裂解物的硝酸纤维素和醋酸纤维素膜(1.2μm、0.45μm和0.2μm孔径)来自Sartorius(Goettingen,Germany)。
表达盒的克隆
从SwissProt数据库检索到来自嗜热栖热菌的SlyD多肽的序列(登录号Q72H58)。从Prosite数据库检索到来自Thermococcusgammatolerans的SlyD多肽的序列(登录号C5A738)。编码嗜热栖热菌SlyD、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)和嗜热栖热菌SlyD-ΔIF的合成基因购自SloningBiotechnologyGmbH(Germany)，并且克隆到pQE80L表达载体中。针对大肠杆菌宿主细胞中的表达优化密码子选择。因而，编码ThermococcusgammatoleransSlyD、ThermococcusgammatoleransSlyD-IGF-2(53-65)、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)抗原和ThermococcusgammatoleransSlyD-IGF-1(74-90)抗原的类似合成基因购自Geneart(Germany)，并且克隆到pET24表达载体(Novagen,Madison,Wisconsin,USA)中。
另外，纳入GS接头(GGGS，SEQIDNO:6)并将His标签(SEQIDNO:7)融合至羧基端以允许依靠固定化的金属离子亲和层析(IMAC)对融合多肽进行亲和纯化。
为了生成特异性结合IGF-1片段74-90(氨基酸序列NKPTGYGSSSRRAPQTG，见SEQIDNO:5)的单克隆抗体，将此氨基酸嫁接到源自嗜热栖热菌的分子伴侣SlyD上，其通过分子替换亲本嗜热栖热菌SlyD蛋白的氨基酸71-122(即IF域)进行。由于对IGF-1插入序列的角度优化，将重组多肽的第70位的天冬氨酸残基和第88位的亮氨酸残基各自用甘氨酸取代(D70G和L88G)。如此，所得融合多肽具有氨基酸序列：
MRGSKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHGNKPTCYGSSSRRAPQTGGAGKDLDTVVCVVKVRFATPEELLHGHAIGGGSRKHHHHHHHH(SCQIDNO:10).
将此嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽(对于SDSPage和Western印迹，见图1)用作免疫原以及也用作开发抗IGF-1抗体的筛选试剂，该抗IGF-1抗体靶向IGF-1氨基酸序列NKPTGYGSSSRRAPQTG(SEQIDNO:5)。
作为一个阴性对照，将来自嗜热栖热菌的重组“野生型”SlyD(SEQIDNO:11)用于筛选目的。
MKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYGPHDPEGVQVVPLSAFPEDAEVVPGAQFYAQDMEGNPMPLTVVAVEGEEVTVDFNHPLAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGSRKHHHHHH(SEQIDNO:11).
另外，生成嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽(SEQIDNO:12)，用于筛选和特异性测试。此嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽缺少IF域，该域用氨基酸序列基序AGSGSS替换，且包含SEQIDNO:7的C端氨基酸序列标签。
MRGSKVGQDKVVTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEATQAHVPAEKAYGPHGAGSGSSGAGKDLDFQVEVVKVREATPEELLHGHAHGGGLSRKHHHHHHHH(SEQIDNO:12,)
作为另一个对照，使用来自Thermococcusgammatolerans的天然SlyD，其包含SEQIDNO:7的C端氨基酸序列：
MKVFRGDFVLFNYVGRYENGFVFDTSYESVAREQGIFVEEREYSPIGVTVGAGEIIPGIEEAllGMELGEKKEVVVPPEKGYKMPREDLIVPVPTEQFTSAGLEPVECMYVMTDAGIAKILKVEEKTVRLDTNHPLAGKTAIFEIEVVEIKKACEAGGGSRKHHHHH(SEQIDNO∶13).
为了评估对IGF-2的交叉反应性，将来自人IGF-2的结构同源序列(氨基酸53-65)插入到ThermococcusgammatoleransSlyD中，将其与GS间隔物和六组氨酸标签(用于纯化和重折叠)在C端融合：
MKVERGDFVLFNYVGRYENGEVFDTSYESVAREQGIFVEEREYSPTGVTVGAGEIIPGIEEALLGMELGEKKEVVVPPEKCYGMP-G-SRVSRRSRG-G-AGKTAIFEIEVVEIKKAGEAGGGSRJHHHHHH(SEQIDNO∶14).
融合多肽的表达、纯化和重折叠
可以通过使用几乎相同的方案纯化并重折叠所有的SlyD多肽。于37℃在含有用于选择性生长的相应抗生素(卡那霉素30μg/ml或氨苄青霉素(100μg/ml))的LB培养基中培养含有特定表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞至OD600为1.5，并通过添加1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导胞质溶胶过表达。在诱导后3小时，通过离心(以5,000g持续20min)收获细胞，冷冻并于-20℃贮存。对于细胞裂解，将冷冻的团粒重悬于冷的补充有7MGdmCl和5mM咪唑的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中。接着，将悬液在冰上搅动2-10小时至完全细胞裂解。离心(25,000g,1h)和过滤(硝酸纤维素膜，8.0μm、1.2μm、0.2μm)后，将裂解物施加到用裂解缓冲液平衡的Ni-NTA柱上。在后续清洗步骤中，将咪唑浓度提高至10mM(在包含7MGdmCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中)，并添加5mMTCEP以保持硫醇模块处于还原形式并预防过早的二硫化物桥接。至少施加15至20个体积的还原性清洗缓冲液。然后，将GdmCl溶液用包含100mMNaCl、10mM咪唑和5mMTCEP的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)替代以诱导基质结合的SlyD融合多肽的构象性重折叠。为了避免共纯化蛋白酶的再活化，向重折叠缓冲液添加蛋白酶抑制剂混合物(无EDTA，Roche)。在过夜规程中施加总共15至20个柱体积的重折叠缓冲液。接着，除去TCEP和无EDTA抑制剂混合物两者，其通过用10个柱体积的包含100mMNaCl和10mM咪唑的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)清洗进行。在最后一个清洗步骤中，将咪唑浓度提高至30mM(10个柱体积)以除去粘着的污染物。然后通过施加相同缓冲液中的250mM咪唑来洗脱重折叠的多肽。通过Tricine-SDS-PAGE评估含蛋白质级分的纯度(Schaegger,H.和vonJagow,G.,Anal.Biochem.166(1987)368-379)并将其合并。接着，使用磷酸钾作为缓冲液系统(50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，100mMKCl，0.5mMEDTA)对蛋白质进行大小排阻层析(SuperdexTMHiLoad,AmershamPharmacia)。最后，合并含蛋白质的级分并在Amicon单元(YM10)中浓缩至约5mg/ml的浓度。
嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽(SEQIDNO:10)可以以单体形式作为可溶的且稳定的多肽成功纯化(见图2)。
UV分光测量
用UVIKONXL双束分光光度计实施蛋白质浓度测量。依照Pace(Pace,C.N.等,ProteinSci.4(1995)2411-2423)计算SlyD变体的摩尔消光系数(ε280)。CD分光测量
为了检查依照本发明的嵌合融合蛋白是否采用折叠构象，测量近UV区的CD光谱。依照制造商推荐使用JASCOJ-720仪和JASCO软件记录并评估CD光谱。使用具有0.2cm路径长度的石英小杯。仪器参数设置为1℃分辨率、1nm带宽且5mdeg灵敏度。样品缓冲液为50mM磷酸钾pH7.5，100mMNaCl，1mMEDTA。每次分析的蛋白质浓度为36μM(对于嗜热栖热菌野生型SlyD)、23μM(对于嗜热栖热菌SlyD-ΔIF)、16μM(对于嗜热栖热菌SlyD抗原)、19μM(对于Thermococcusgammadurans野生型SlyD)和16μM(对于ThermococcusgammaduransSlyD抗原)。于20℃介于250nm和330nm之间以0.5nm分辨率和每分钟20nm的扫描速度记录CD信号。为了改进信噪比，累积光谱(9次)。在后续的实验性实施方案中，CD信号以在固定波长处温度的函数记录。对于ThermococcusgammatoleransSlyD衍生物(20℃-100℃//100℃-20℃)以及对于嗜热栖热菌SlyD衍生物(20℃-85℃//85℃-20℃)于277nm记录解链和重折叠曲线。加热和冷却速率为每分钟1℃。
已记录融合多肽嗜热栖热菌野生型SlyD、嗜热栖热菌SlyD-ΔIF和具有嫁接抗原插入物的嗜热栖热菌SlyD的CD光谱。近UVCD特征清楚显示，于20℃所有融合多肽均折叠成压缩的、推定为天然样的构象，即使当IF域缺乏或用异源氨基酸(抗原)嫁接物替换时。
在加热/冷却循环后，即在蛋白质样品的热诱导性解折叠和随后的冷却后，基本恢复具有嫁接抗原的嗜热栖热菌SlyD的近UVCD光谱。也即，在解链和重折叠后嗜热栖热菌SlyD的近UVCD光谱实际上与天然分子的光谱相同。这强烈指示具有抗原插入物的嗜热栖热菌SlyD的热诱导性解折叠是完全可逆的。与解折叠的可逆性组合的高内在热力学稳定性是免疫原的高度期望特征。
对于ThermococcusgammatoleransSlyD抗原多肽，热诱导性解折叠甚至在100℃也是不完全的。换言之，即使在水的沸点(其构成我们的实验设置中可达的温度限)，支架/嫁接分子的相当大的部分保留其天然样折叠。如此，来自嗜热生物体的FKBP域的突出的稳定性使得能够通过替换相应的IF域来嫁接多肽，而同时很大程度上保留新生成的嵌合支架蛋白质的总体折叠。简言之，热稳定性FKBP域充当分子钳的角色，其中免疫原肽可以以明确限定的构象固定。
3.2用嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)免疫小鼠并开发针对IGF-1的单克隆抗体
用100μg嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)分别对8-12周龄Balb/c和NMRI小鼠进行重复的腹膜内免疫。将小鼠免疫3次，即还在初始免疫后6周和10周的时间点时。第一次免疫可以使用完全弗氏佐剂(Freund’sadjuvant)实施，第二和第三次免疫使用不完全弗氏佐剂进行。在12周后通过如下文描述的ELISA方法测试对天然重组IGF-1和嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)的小鼠血清滴度。ELISA在Firmware：V3.1519/03/01；XREADPLUS版本：V4.20下运行的TecanSunrise上实施。将NuncMaxisorbF多孔板用嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)包被，其通过应用包含每ml0.5μg多肽的溶液进行。将分离的且生物素化的IGF-1固定化于StreptaWellHighBindSA多孔板的孔中，其通过应用包含90ng/ml生物素化IGF-1的溶液进行。随后，通过在室温应用包含PBS中1%RPLA的溶液1小时来封闭游离结合位点。将孔用包含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液清洗3次。将小鼠血清用PBS1:50稀释并用作样品。任选的以1:4阶梯实施进一步稀释直至最终稀释为1:819200。温育时间为室温1小时。将孔用包含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液清洗3次。作为检测抗体，使用缀合于过氧化物酶的针对靶抗体的恒定域的多克隆抗体(PAK<M-Fcγ>S-F(ab’)2-POD)。检测抗体以包含1%(w/v)RSA的PBS中80ng/ml的浓度应用。温育时间为室温1小时。将孔用包含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液清洗3次。然后，将孔与ABTS溶液在室温温育15分钟。光度计测定显色强度。图3显示获得的小鼠血清滴度。
在制备脾细胞并与骨髓瘤细胞系融合前3天，通过i.v.注射100μg嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽实施最终加强免疫。
ELISA筛选
通过ELISA分别对原代培养上清液测试针对免疫原嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)、生物素化的天然IGF-1和野生型嗜热栖热菌SlyD以及空白板的反应性。ELISA由TecanSUNRISE，Firmware：V3.1519/03/01；XREADPLUS版本：V4.20驱动。将NuncMaxisorbF多孔ELISA板用5μg/mlSlyD-融合多肽包被。将StreptaWellHighBindSA多孔板用125ng/ml重组生物素化的IGF-1抗原包被。随后，于室温通过PBS中的1%RPLA封闭游离结合位点1小时。将孔用包含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液清洗3次。将RPMI1640培养基中未稀释的杂交瘤上清液用作样品。温育时间为室温1小时。将孔用包含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液清洗3次。作为检测抗体，使用与过氧化物酶缀合的针对靶抗体的恒定域的多克隆抗体(PAK<M-Fcγ>S-F(ab’)2-POD)。将检测抗体以包含1%(w/v)RSA的PBS中80ng/ml的浓度应用。温育时间为室温1小时。将孔用包含0.9%(w/v)氯化钠和0.05%(w/v)Tween的溶液清洗3次。然后，将孔与ABTS溶液在室温温育15分钟。于405nm以光度法测定显现颜色的强度。参照波长为492nm(见图4)。将在结合重组IGF-1、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)和较少结合嗜热栖热菌SlyD后在ELISA中显示快速且强烈的颜色形成的原代杂交瘤上清液转移到如下文中描述的动力学筛选过程中。
基于SPR的动力学筛选
在基于SPR的动力学筛选分析中使用嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)、天然重组IGF-1、天然重组IGF-2、野生型嗜热栖热菌SlyD和嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)。对于SPR分析，一般公认使用溶液中的单体和单价分析物来依照Langmuir模型测定抗体结合动力学。此外，对于SPR测量使用具有较高分子量的分析物以增加测量的灵敏性是相当有利的，因为SPR是一种质量灵敏性分析。
在BIAcoreA100仪上在软件版本V1.1的控制下实施动力学筛选。将BIAcoreCM5芯片嵌入仪器中，并依照制造商说明书以流体动力学寻址和预条件化。作为运行缓冲液，使用HBS-EP缓冲液(10mMHEPES(pH7.4)，150mMNaCl，1mMEDTA，0.05%(w/v)P20)。将多克隆家兔抗小鼠IgGFc捕捉抗体在10mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)中30μg/ml以10,000RU固定化于流动池1、2、3和4中的点1、2、4和5(图5)。将抗体经由NHS/EDC化学共价固定化。然后，用1M乙醇胺溶液使传感器失活。将点1和5用于测定并将点2和4用作参照点。在应用于传感器芯片前，将杂交瘤上清液在HBS-EP缓冲液中以1:2稀释。将稀释的溶液以30μl/min的流速注射1min。其后，立即将分析物如嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽以30μl/min的流速注射2min。然后，记录信号达5min解离时间。通过以30μl/min的流速注射10mM甘氨酸-HCl溶液(pH1.7)2min将传感器再生。将两个报告点，在分析物注射结束前不久(称为结合后期(BL))记录的信号和在解离时间结束前不久(稳定性后期(SL))记录的信号用于表征动力学筛选性能。
此外，依照Langmuir模型计算解离速率常数kd(1/s)，并依照ln(2)/(60*kd)公式以分钟计算抗体/抗原复合物半衰期。
如可以看到的，通过用抗原嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)免疫，并用嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)、嗜热栖热菌SlyD“野生型”、天然IGF-1和天然IGF-2筛选来获得单克隆抗体。基于支架的筛选办法允许特异性地开发结合IGF-1(包含在SEQIDNO:5中的表位)的抗体。
进一步开发原代培养上清液，其通过本领域中已知的方法通过有限稀释成克隆培养上清液进行。在功能性测定法中测试克隆培养上清液的亲和力和特异性。
分别与对嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)和嗜热栖热菌-SlyD的结合相比，依靠ELISA分析克隆培养物对IGF-1的特异性结合(见图6)。
3.3生成抗体的克隆培养上清液的BIAcore表征
使用BIAcoreT200仪(GEHealthcare)及嵌入系统中的BIAcoreCM5传感器。将传感器通过以100μl/min注射0.1%SDS，50mMNaOH，10mMHCl和100mMH3PO41min来预条件化传感器。
系统缓冲液为PBS-DT(10mMNa2HPO4,0.1mMKH2PO4,2.7mMKCl,137mMNaCl,0.05%20,5%DMSO)。样品缓冲液为系统缓冲液。
BIAcoreT200系统在控制软件V1.1.1下驱动。依照制造商说明书，经由EDC/NHS化学将多克隆家兔IgG抗体<IgGFCγM>R(JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.)在10mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)中30μg/ml以6500RU分别固定化于流动池1、2、3和4上。最后，将传感器表面用1M乙醇胺溶液封闭。在25℃实施全部实验。
将含有约40nM的相应抗体的克隆培养上清液以5μl/min的流速在<IgGFCγM>R表面上捕捉2min。作为溶液中分析物，使用重组天然IGF-1(PeprotechInc.Cat.#100-11)、重组天然IGF-2(PeprotechInc.Cat.#100-12)、嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)、重组野生型嗜热栖热菌SlyD、重组嗜热栖热菌SlyD-ΔIF、重组野生型ThermococcusgammaduransSlyD、重组ThermococcusgammaduransSlyD-IGF-2(53-65)融合多肽。嗜热栖热菌SlyD-ΔIF仅为嗜热栖热菌SlyD的缺少IF域的FKBP域。与IGF-2发夹插入形成对比，使用ThermococcusgammaduransSlyD-IGF-2(53-65)来反筛选并研究对IGF-1发夹的特异性。以90nM、30nM、10nM、3.3nM、1.1nM和0nM的不同浓度阶梯注射相应分析物。以100μl/min的流速监测结合阶段达3min。以100μl/min的流速监测解离达10min。使用10mM甘氨酸缓冲液(pH1.7)将系统再生。使用BIAcore评估软件估测动力学。
本文中使用以下术语：mAb：单克隆抗体；RU：传感器上捕获的单克隆抗体的相对应答单位；抗原：溶液中抗原；kDa：以溶液中分析物注射的抗原的分子量(按千道尔顿计)；ka：结合速率常数；kd：解离速率常数；t1/2解离：依照公式t1/2解离=ln(2)/60*kd计算的抗体抗原复合物半衰期；KD：解离常数；R最大：90nM分析物注射结合阶段结束时的结合信号；MR：摩尔比；χ2：测量失败；n.d.：未检出。
图7中显示了用抗IGF-1单克隆抗体mAb<IGF1>M-11.11.17的例示性BIAcore测量，该抗体是从嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽免疫活动获得的。该抗体特异性结合嗜热栖热菌-SlyD-IGF-1(74-90)融合多肽和IGF-1但不结合测试的所有其它多肽。
以类似的方式获得生成单克隆抗体mAb<IGF1>M-11.09.15的另一个杂交瘤细胞系。
图8显示支架衍生的单克隆抗体M-11.11.17对IGF-1具有皮摩尔亲和力。支架衍生的单克隆抗体M-10.7.9对IGF-1具有纳摩尔亲和力。没有检测到对IGF-2、或对野生型嗜热栖热菌SlyD、或对野生型ThermococcusgammatoleransSlyD、或对嗜热栖热菌SlyD-ΔIF融合多肽、或对ThermococcusgammatoleransSlyD-IGF-2(53-65)融合多肽的交叉反应性。
M-2.28.44是一种通过用重组人IGF-1常规免疫小鼠获得的单克隆抗体。尽管事实上该抗体对IGF-1显示30pM的亲和力，但还发现对IGF-2的500pM的交叉反应性(亦见图8)。由于此单克隆抗体不结合嗜热栖热菌SlyD-IGF-1(74-90)和ThermococcusgammatoleransSlyD-IGF-2(53-65)两者，因此可以得出结论，交叉反应的IGF-2表位不是IGF发夹区。
3.3对<IGF-1>单克隆抗体的表位分析
CelluSpotsTM合成和表位定位
依靠对应于人IGF1序列的重叠的、固定化的肽片段(长度：15个氨基酸)的文库来实施表位定位。合成的每种肽迁移1个氨基酸，即它与前一种肽和后一种肽分别有14个氨基酸的重叠。为了制备肽阵列，采用IntavisCelluSpotsTM技术。在该办法中，用自动化合成仪(IntavisMultiPepRS)在经修饰的纤维素盘上合成肽，该盘在合成后溶解。然后，将共价连接于大分子纤维素的各种肽的溶液点样到包被的显微镜载玻片上。逐步实施CelluSpotsTM合成，其利用在384孔合成板中经氨基修饰的纤维素盘上的9-芴基甲氧基羰基(fluorenylmethoxycarbonyl)(Fmoc)化学进行。在每个偶联循环中，将相应的氨基酸用在DMF中的DIC/HOBt溶液活化。在偶联步骤之间，将未反应的氨基基团用乙酸酐、二异丙基乙胺和1-羟基苯并三唑的混合物加帽。在完成合成后，将纤维素盘转移至96孔板并用三氟乙酸(TFA)、二氯甲烷、三异丙基硅烷(triisoproylsilane)(TIS)和水的混合物处理以进行侧链去保护。在除去切割溶液后，将纤维素结合的肽用TFA、TFMSA、TIS和水的混合物溶解，用二异丙醚沉淀并重悬于DMSO中。随后，使用Intavis载玻片点样机器人将肽溶液点样到IntavisCelluSpotsTM载玻片上。
对于表位分析，将如上文描述的那样制备的载玻片用乙醇，然后用Tris缓冲的盐水(TBS;50mMTris,137mMNaCl,2.7mMKCl,pH8)清洗，接着用5mL10xWestern封闭试剂(RocheAppliedScience)，即TBS，0.1%Tween20中2.5g蔗糖于4℃封闭16h。将载玻片用TBS和0.1%Tween20清洗，接着与TBS和0.1%Tween20中1μg/mL相应的IGF1抗体在环境温度温育2h，接着用TBS+0.1%Tween20清洗。对于检测，将载玻片与抗家兔/抗小鼠HRP二抗(在TBS-T中以1:20000)中温育，接着与化学发光底物鲁米诺(luminal)温育并用LumiImager(RocheAppliedScience)显现。量化ELISA阳性SPOT，并且经由相应肽序列的归配鉴定出抗体结合表位。
用于表位定位的序列(为了方便，仅给出前32种，但已扫描完整的IGF-1分子)：
发现单克隆抗体MAb<IGF-1>M-10.7.9结合SEQIDNO:43至49的肽。这对应于由SEQIDNO:3代表的表位。
以类似的方式分别测定了针对MAb<IGF-1>11.11.17和MAb<IGF-1>11.09.15的表位。发现这两种单克隆抗体结合SEQIDNO:43至50的肽。这对应于由SEQIDNO:4代表的表位。

Claims (7)

1.一种分离的抗体，其特征在于重链可变域包含SEQIDNO:15所示的CDR3H区、SEQIDNO:16所示的CDR2H区和SEQIDNO:17所示的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQIDNO:18所示的CDR3L区、SEQIDNO:19所示的CDR2L区和SEQIDNO:20所示的CDR1L区。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体结合包含在胰岛素样生长因子1前体(SEQIDNO:1)的氨基酸76至84(SEQIDNO:3)内的表位。
4.一种分离的抗体，其特征在于重链可变域包含SEQIDNO:23所示的CDR3H区、SEQIDNO:24所示的CDR2H区和SEQIDNO:25所示的CDR1H区，且轻链可变域包含SEQIDNO:26所示的CDR3L区、SEQIDNO:27所示的CDR2L区和SEQIDNO:28所示的CDR1L区。
5.权利要求4的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
6.权利要求4或5的抗体，其中所述抗体结合包含在胰岛素样生长因子1前体(SEQIDNO:1)的氨基酸77至84(SEQIDNO:4)内的表位。
7.一种用于经由夹心式免疫测定法检测体液样品中的胰岛素样生长因子1的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将所述样品与依照权利要求1至6中任一项的抗体一起温育，由此发生所述抗体对包含在所述样品中的胰岛素样生长因子1的结合，
b)将所述样品与结合不包含胰岛素样生长因子1前体的氨基酸76至84的表位的针对胰岛素样生长因子1的第二抗体一起温育，由此发生所述第二抗体的结合，并
c)测量在步骤(a)和(b)中形成的免疫学夹心复合物，由此检测所述样品中的胰岛素样生长因子1。
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