WO2016097613A1 - Composé synthétique biépitopique - Google Patents

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WO2016097613A1
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Florence BETTSWORTH
Sandrine Busseret
Catherine POTHION
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bioMérieux
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    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders

Definitions

  • the present invention relates to the field of diagnosis or prognosis.
  • it relates to a synthetic biepitopic compound useful during the implementation of immunoassays.
  • Immunoassays are widely used in the fields of clinical, food, pharmaceutical and chemical analyzes. Thus, they are intended to determine the presence of a large number of analytes, in the form of proteins (antigens / antibodies), peptides, haptens, such as steroids or vitamins, in samples that may contain these analytes.
  • the immunoassay is a test widely known to those skilled in the art that involves immunological reactions between the analyte to be detected and one or more binding partner (s) for this analyte.
  • immunoassays examples include methods such as Enzyme Linked Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), Enzyme Linked Florescent Assay (ELFA) and Radio Immuno Assay (RIA) which can operate according to the "sandwich” principle. or the principle of "competition”, and immunodetection methods such as immunohistochemistry, immunocytochemistry, immunofluorescence, Western-blot and Dot-blot.
  • ELISA Enzyme Linked Linked Immuno Sorbent Assay
  • ELFA Enzyme Linked Florescent Assay
  • RIA Radio Immuno Assay
  • immunodetection methods such as immunohistochemistry, immunocytochemistry, immunofluorescence, Western-blot and Dot-blot.
  • “Competition” methods are usually used for small molecules such as haptens, with “sandwich” methods being used for other analytes.
  • an analyte by immunoassay in a biological sample that may contain said analyte, it also requires reagents necessary for the above-mentioned test and positive control, the use of a standard curve.
  • a standard curve This is obtained by: i) measuring the signal generated by standards, also called standards or calibrators, which correspond to known and increasing amounts or concentrations of the analyte or of a compound having the same antigenic reactivity as the analyte in the immunoassay used, ii) and then plotting the signal curve as a function of quantity or concentration.
  • standards also called standards or calibrators
  • control solutions or standards must mimic the desired analyte and be recognized in the same way by the binding partners used in the immunoassay.
  • the immunoassay method is a sandwich method
  • the control or standard solutions must include a compound that has both recognition epitopes of the two binding partners used. This is called a biepitopic compound.
  • the two epitopes of a biepitopic compound are identical.
  • the analyte to be detected or quantified is multimeric, at least dimeric, it is possible to use the same binding partner in capture and detection of the sandwich immunoassay.
  • the biepitopic compound will contain twice the same epitope.
  • Control solutions or standards usually used in immunoassay tests may be of human or animal origin and contain the analyte as such in the natural state. These solutions are prepared from lyophilizate, and frozen in unit doses and stored at -20 ° C or -80 ° C. Such preservation is not suitable for a fluid laboratory practice. In addition, to be able to be used, these freeze-dried control solutions or standards need to be put back into solution. But in the context of immunoassay, the implementation of the test must be rapid and this solution in solution results in a loss of time. In addition, carrying out this redissolution can lead to a measurement error due to a bias due to dilution.
  • Control solutions or ready-to-use standards stored in liquid form at + 2/8 ° C, are therefore particularly recommended, for reasons of obvious convenience. Nevertheless, to be representative of the actual conditions of the assay, these control solutions or ready-to-use standards contain only low concentrations of the analyte, for example of the order of pg / ml, ng / ml or ⁇ g. / ml, depending on the measurement range of the analyte concerned, which has the effect of affecting their stability at a temperature of + 2/8 ° C. Therefore, to overcome this disadvantage, synthetic standards have been used.
  • European Patent Application EP 0 650 053 A describes synthetic standards containing active sites for one or more receptors, interconnected by a tree structure. This application more specifically describes synthetic standards of troponin T. However, these standards have a stability period in solution of not more than 3 weeks at 4 ° C.
  • Patent application WO98 / 248166 proposes biepitopic synthetic compounds that can be used as standard in sandwich immunoassays, for the determination of troponin I, which are stable for several months.
  • the described compounds, of formula ⁇ - ⁇ 1--- ⁇ 2- ⁇ comprise two peptide sequences E1 and E2 comprising a minimum epitope of troponin I, each of these epitopes being linked together by a linker group (linker) which may be a central peptide comprising from 1 to 40 amino acids.
  • linker group may be a central peptide comprising from 1 to 40 amino acids.
  • Each epitope may also comprise at its end a peptide sequence of 1 to 10 amino acids ( ⁇ and ⁇ ).
  • the solution proposed in this patent application has the disadvantage that the described biepitopic compounds, in order to be sufficiently immunoreactive with the binding partners used in the immunoassay, must have a significant number of amino acids, so that their synthesis can not be reduced. is not easy.
  • the peptide-only nature a large amount of compound is required in the control or standard solution to have optimal immunoreactivity with the binding partners used in the immunoassay, which represents a significant cost for the test manufacturer. kits containing this control or standard and therefore for the user laboratory of the kit thus produced.
  • US Pat. No. 6,114,180 proposes a synthetic compound that can be used as a control or standard in immunoassays comprising two epitopes of troponin I linked together by a support molecule, such as BSA, for the purpose. to increase its solubility and / or its stability in solution.
  • a support molecule such as BSA
  • the Applicant has surprisingly demonstrated a synthetic compound for use in "sandwich" immunoassays overcoming the disadvantages described in the prior art. Indeed, its synthesis is easy and simplified, it is stable at + 2/8 ° C and at low concentration, it is soluble and it has excellent immunoreactivity with the binding partners used in the immunoassay. In addition, it is not necessary to use a large amount, if the compound is present in the control or standard solution, to have optimal immunoreactivity with the binding partners used in the immunoassay. Finally, the construction of the compound according to the invention guarantees the equimolarity of the two epitopes. to some
  • the present invention firstly relates to a biepitopic compound of formula (I):
  • E1 and E2 which are identical or different, each independently represent a peptide sequence comprising at least one epitope of an analyte
  • X and Y identical or different, each independently represent a linker
  • the carrier molecule is soluble and
  • Z represents an amino acid derivative carrying a thiol function prior to its binding with the carrier molecule.
  • Another subject of the invention relates to a composition containing a compound of formula I in solution in water, in a buffer or in a biological fluid.
  • Yet another object relates to the use of such a biepitopic compound or such a composition containing this compound as a control or standard or adjuster in an immunoassay.
  • Yet another subject of the invention concerns immunoassay methods using as a control and / or standard or adjuster a biepitopic compound of formula I or a composition containing this compound.
  • the last object of the present invention is a kit for the implementation of an immunoassay comprising a biepitopic compound of formula (I) or a composition containing such a compound.
  • the Applicant has therefore developed against all expectations a synthetic biepitopic compound that overcomes all the drawbacks of the state of the art mentioned above.
  • the compound of the invention has the following formula (I):
  • E1 and E2 identical or different, each independently represent a peptide sequence comprising at least one epitope of an analyte
  • X and Y identical or different, each independently represent a linker
  • the carrier molecule is soluble and
  • Z represents an amino acid derivative carrying a thiol function prior to its binding with the carrier molecule.
  • the compound of the invention is therefore a biepitopic compound.
  • biepitopic compound is meant a compound which comprises two epitopes of the same analyte in order to mimic the antigenic recognition in sandwich immunoassay of said analyte.
  • the synthetic biepitopic compound does not consist of the same sequence as the analyte that it mimics.
  • This synthetic compound therefore does not correspond to a sequence of amino acids existing in nature, for example a protein or a protein fragment.
  • the compound of the invention will be called, in an obvious and equivalent manner throughout the application, a biepitopic compound, a non-natural biepitopic compound, a synthetic biepitopic compound or a non-natural synthetic biepitopic compound.
  • the binding partner is necessarily a partner of immunological origin, such as an antibody or a fragment antibody. Indeed, as is well known to those skilled in the art, this term is more widely used to designate also tests and methods in which the binding partner is not a partner of origin / immunological nature but consists, for example, an analyte receptor that one wishes to detect and / or quantify. Regardless of its origin or nature, the binding partner concerned should be able to bind to the desired analyte, preferably in a specific manner.
  • ligand binding assay for assays that use non-immunological binding partners in the strict sense of the term, more broadly called ligand binding assay, which could be translated into French as "assay using binding. to a ligand ", while the term” immuno "is included in the verbatim title corresponding to the acronym ELISA.
  • immuno is used in this application to refer to any biological assay using at least one binding partner adapted to bind to the analyte of interest and detect and / or quantify the latter. preferably, specifically, even when said binding partner is not of a strictly immunological nature or origin.
  • Sandwich type immunoassays use a first binding partner, called “capture binding partner”, to specifically bind the desired analyte, and a second binding partner, said “Detection binding partner”, labeled and also intended to bind specifically with the desired analyte, thereby revealing the binding between the capture binding partner and the analyte, and thus the presence of the analyte.
  • the desired analyte is “sandwiched” between said first and second binding partners, the first binding partner (“capture”) generally being present in excess of the desired analyte.
  • the capture binding partner may, for example, be immobilized on a solid support (by covalent bonding, adsorption or any other suitable method).
  • An epitope also called an antigenic determinant, is the smallest part of an antigen that can be recognized by a paratope that is the variable part of an antibody.
  • the structure of the epitope is complementary to the paratope of the antibody.
  • the structure involved may be the primary structure, in the case of a linear epitope, also called sequential epitope, or the tertiary structure in the case of a conformational epitope, also called discontinuous epitope.
  • sequence of a linear epitope may include so-called conservative modifications that do not significantly change the binding between the epitope and the antibody from a specificity point of view.
  • a mimotope is a macromolecule, often a peptide, that mimics the three-dimensional structure of a given epitope.
  • An antibody that recognizes said epitope is also able to recognize and bind to the mimotope that mimics that epitope.
  • peptide mimotopes therefore linear, are often used to mimic conformational epitopes.
  • the conformational epitopes can be replaced by mimotopes. Mimotopes are also included in the scope of this application by replacing the term epitope.
  • the linear epitopes and the mimotopes correspond to a peptide sequence of variable length.
  • the minimal epitope corresponds to the smaller peptide sequence recognized specifically by the corresponding antibody.
  • a minimal epitope may contain from 3 to 20 amino acids, more often from 4 to 8 amino acids.
  • the optimal epitope corresponds to the specifically recognized peptide sequence that has the best possible reactivity with the corresponding antibody (the most intense signal). It is very often peptide sequences of 6 to 30 amino acids in length.
  • the optimal epitope generally comprises the minimal epitope. In rare cases, the optimal epitope and the minimal epitope can be confused.
  • the compound of the invention is such that it contains two peptide sequences E1 and E2 comprising at least one epitope of an analyte.
  • peptide sequence comprising at least one epitope of an analyte it is meant that the peptide sequence consists of at least amino acids of the minimal epitope.
  • the peptide sequence consists of at most amino acids of optimal epitope.
  • a person skilled in the art knows that it is also possible to add 1, 2, 3, 4 or 5 additional amino acids to one side of the optimal epitope or both sides without greatly affecting the antigenic recognition. Such additional amino acids are also included in the definition.
  • amino acids of these peptide sequences may be the amino acids naturally found in the F analyte sequence or analogous amino acids.
  • analogous amino acids is meant two amino acids whose substitution is a conservative substitution in nature, that is to say taking place in a family of amino acids.
  • amino acids are generally divided into 4 families, namely (1) acidic amino acids such as aspartate and glutamate, (2) basic amino acids such as lysine, arginine and histidine, (3) non-polar amino acids such as alanine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine and tryptophan and (4) polar uncharged amino acids such as glycine, asparagine , glutamine, cysteine, serine, threonine and tyrosine. Phenylalanine, tryptophan and tyrosine are sometimes classified as aromatic amino acids.
  • the amino acids of the peptide sequence are the amino acids naturally found in the analyte.
  • the peptide sequence E1 or the peptide sequence E2 or both are mimotopes and therefore the amino acids of the peptide sequence are mainly different from the amino acids naturally found in the analyte.
  • analyte refers to a substance of biological origin, contained in a sample, detected, identified and / or quantified by analysis. It must be understood in a broad sense to mean a chemical, biological or biochemical substance that is the subject of one or more analyzes. As an example of analytes, there may be mentioned a protein or a peptide.
  • the analyte will be representative of a pathological state or the presence of a microorganism in a medium.
  • pathological condition is meant any altered health status of a patient due to diseases caused by many factors such as environmental (infectious), genetic and / or biological factors.
  • diseases mention may be made of infectious diseases, caused by microorganisms such as viruses, bacteria, parasites (hepatitis, sepsis, etc.), autoimmune diseases, neurodegenerative diseases, cancers (breast, prostate, colon, etc.), cardiovascular diseases (myocardial infarction, etc.), etc.
  • infectious diseases caused by microorganisms such as viruses, bacteria, parasites (hepatitis, sepsis, etc.), autoimmune diseases, neurodegenerative diseases, cancers (breast, prostate, colon, etc.), cardiovascular diseases (myocardial infarction, etc.), etc.
  • Analytes are then associated with various diseases.
  • cardiac troponin I can be mentioned as an analyte for myocardial infarction and proDefensin-A6 as a colon cancer analyte. These analytes will be described in more detail later.
  • E1 and E2 are peptide sequences comprising at least one cardiac troponin I epitope or prodefensin-A6.
  • the central radical Z is an amino acid derivative carrying a thiol function before its binding with the support molecule.
  • amino acid derivative is meant any molecule forming two -CO-NH- peptide bonds with the X and Y linkers to which it is attached.
  • the corresponding amino acid comprises, before binding with the X or Y linkers, a reactive group -NH 2 and a reactive group -COOH. After binding to the X and Y linkers, the amino acid derivative thus has an -NH- group and a -CO- group.
  • the corresponding amino acid also has a thiol function (-SH) prior to its binding to the carrier molecule.
  • Z radicals include cysteine, homocysteine and penicillamine derivatives.
  • the corresponding amino acids used to form these derivatives are of course cysteine, homocysteine and penicillamine, which are amino acids known to those skilled in the art.
  • the two link arms X and Y of the compound of the invention are identical or different from each other.
  • the linking arms are characterized by their ability to form each two -CO-NH- peptide bonds, on the one hand with E1 or E2, and on the other hand with the central Z radical.
  • the linking arms X and Y are then amino acid derivatives having a group -NH- and a group -CO-.
  • the compounds used to form the linking arms comprise, before binding with the peptide sequences E1 or E2, a reactive group -NH 2 and a reactive group -COOH.
  • linking arms may comprise other groups, for example lateral groups, which are not reactive as such or are not reactive because they are protected by protective groups known to those skilled in the art, for example trityl, t-butyl, t-butyl-benzyl ether or benzyl ester groups.
  • the linking arms may be obtained from one or more compounds each having a -COOH reactive group and a -NH 2 reactive group before their engagement in the biepitopic compound of the invention. These compounds will be referred to as "monomers useful for forming the linker arms".
  • the monomers useful for forming the linking arms may be protein-forming ⁇ -amino acids necessary for the synthesis of biological proteins, which are known to those skilled in the art. These proteinogenic ⁇ -amino acids can be genetically encoded; in this case, they are 22 in number.
  • the 20 protein-amino acids universally distributed in all living beings are: L-Alanine, L-Arginine, L-Asparagine, L-Aspartate, L-Cysteine, L-Glutamate , L-Glutamine, L-Glycine, L-Histidine, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine, L-Methionine, L-Phenylalanine, L-Proline, L-Serine, L-Threonine, L-Tryptophan, L -Thyrosine and L-Valine.
  • the 2 other proteinogenic amino acids are much rarer: L-Pyrrolysine is only found in certain methanogenic archaea and L-Selenocysteine is present in only a few enzymes of the family of oxidoreductases.
  • Monomers useful for forming the linking arms may also be pseudo amino acids, also called artificial amino acids, i.e. non-biological amino acids. In this case, the only condition is that the compound comprises two free functions, -COOH and -NH 2 .
  • the X and Y linking arms which are identical or different, each comprise one or more amino acid derivatives (such as protein-forming ⁇ -amino acids and / or amino acids and / or or pseudo amino acids).
  • Linkers may be prepared from one to six amino acids, preferably from one to four amino acids.
  • the linkers may have the GGGS sequence, or the SGGG sequence, or the GSGSGS sequence or the SGSGSG sequence.
  • X and Y in formula (I), that is to say after formation of peptide bonds with E1 / E2 / Z, has one or more monomer derivatives of formula (II). ) next :
  • R is a radical consisting of one or more groups chosen independently from the groups -C (R ') HC (R ") H, (-C (R') HC (R") H-O-), (-C (R ') H-) and (-C (R') HO-), R 'and R "being independently selected from hydrogen, hydroxyl group and C 1 -C 5 alkyl groups.
  • R is composed of one or more groups independently selected from (-CH 2 -CH 2 -O-), (-CH 2 -O-) and (-CH 2 -).
  • the radical R can comprise from one to six groups (-CH 2 -CH 2 -O-), preferably from one to four groups (-CH 2 -CH 2 -O-).
  • R mention may be made of pentaoxaoctadecanoyl, tetraoxapentadecanoyl, trioxadodecanoyl, trioxatridecanoyl, dioxaoctanoyl, oxapentoyl and hexaoxaheneicosanoyl and their derivatives, as an example of a compound that is useful for obtaining a monomer derivative of formula (II) there may be mentioned 8-amino acid -3,6-dioxaoctanoic acid (CAS No.
  • the linking arms may be a dimer or trimer of 8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid, (Ado) 2 or (Ado) 3 .
  • R By way of another example of groups of the radical R, mention may be made of the biological amino acid derivatives mentioned above, in the form of a residue, that is to say without their group -COOH and -NH 2, but comprising an -NH- group and a -CO- group.
  • the compound forming the linking arm is leucine, of formula (CH 3 ) 2 CH-CH 2 -CH (NH 2 ) -COOH, then R of the compound of formula (II) will be
  • Each linking arm has, between the -CO or -NH groups of both ends, a size of between 10 and 60 ⁇ , preferably between 20 and 30 ⁇ , which constitutes a particular embodiment of the invention.
  • the sequence E1-XZY-E2 can be considered as a peptide, hereinafter referred to as a biepitopic peptide, so that it can be produced by peptide synthesis, which has the advantage
  • the biepitopic peptide is obtained according to the procedures well known to those skilled in the art such as the solid phase peptide synthesis described by Merrif ⁇ eld, 1963. The improvements of this technique have been reviewed and discussed by Fields and Noble, 1990.
  • Such a synthesis uses a solid phase on which is fixed the first C-terminal amino acid.
  • each -NH 2 group of the new amino acid, added to form the peptide is protected by a protective group of Fmoc (9-fluoremethyloxycarbonyl) or Boc (t-butoxycarbonyl) type, to promote reaction between the group -NH 2 presented by the solid phase and the group - COOH of the new amino acid added, as well known to those skilled in the art.
  • the length of the biepitopic peptide does not exceed a length corresponding to 100 amino acids, preferably it does not exceed a corresponding length of 20 to 30 amino acids and more preferably it does not exceed a corresponding length of 25 to 27 amino acids.
  • the biepitopic peptide is linked via the radical Z to a support molecule.
  • the support molecule serves to stabilize the biepitopic compound and makes it possible to make the peptide sequences E1 and E2, comprising at least one epitope of the analyte of said biepitopic compound, more available, while maintaining the equimolarity between E1 and E2. .
  • carrier molecule means any soluble molecule that can be coupled to a peptide.
  • a soluble molecule mention may be made of proteins such as bovine serum albumin, immunoglobulin G and thyroglobulin, and polymers such as polylysines.
  • the carrier molecule is a protein whose molecular weight is between 20kDa and 700kDa, preferably between 60kDa and 250kDa.
  • Polylysines are polymers known to those skilled in the art. They are available for example at Sigma-Aldrich.
  • Bovine serum albumin and thyroglobulin are known to those skilled in the art.
  • immunoglobulin G it should be chosen so that it does not come from the species used to obtain the antibodies of the immunoassay, nor from the species from which the sample to be analyzed, to avoid interference problems.
  • immunoglobulins G from rabbits, mice, horses, goats and pigs (non-exhaustive list).
  • the carrier molecule is bovine serum albumin.
  • the carrier molecule is a rabbit immunoglobulin G in an immunoassay whose antibodies originate from the mouse and whose sample to be analyzed comes from humans.
  • the coupling between the biepitopic peptide and the carrier molecule of protein nature at the Z radical can be done covalently, according to methods well known to those skilled in the art.
  • the sulfhydryl group (-SH) present in the side chain of the radical Z is reactive with respect to the maleimide groups, haloacetyl groups and pyridyl disulfides.
  • a crosslinking agent crosslinker in English
  • a crosslinking agent crosslinker in English
  • a crosslinking agent which will be able to react at the level of amino groups (-NH 2 ) accessible of the carrier molecule and thus to introduce on the surface of the carrier molecule reactive groups chosen from maleimides or haloacetyls.
  • These groups are preferred because they make it possible to obtain a coupling by a thioether bond which is stable.
  • crosslinking agents which make it possible to introduce maleimide groups
  • the activated support molecule is purified by desalting, for example by gel filtration chromatography, or by dialysis, in order to remove the excess of the crosslinking agent and the by-products. Finally, the activated support molecule is placed in the presence of the biepitopic peptide comprising the radical Z in a relatively central position.
  • the maleimide or haloacetyl groups react with the sulfhydryl group (-SH) of the Z radical of the biepitopic peptide to form a stable covalent thioether bond.
  • the reaction between maleimide and sulfhydryl groups should be carried out under conditions close to neutral pH (pH 6.5 to 7.5) and the exclusion of foreign thiols, for example most reducing agents, from the composition of the reaction buffer to avoid competition for coupling sites.
  • the reaction between haloacetyl and sulfhydryl groups should be carried out at pH 7.2 to 9.
  • the thiol functions will or will not be deprotected according to techniques known to those skilled in the art.
  • protecting group mention may be made of the t-butylthio group which is easily removed in aqueous medium (0.1 M ammonium bicarbonate) in the presence of DTT (dithiothreitol).
  • aqueous medium 0.1 M ammonium bicarbonate
  • DTT dithiothreitol
  • the coupling arms and / or the peptide sequences do not contain any amino acid derivative carrying a thiol function.
  • the biepitopic compound of the invention comprises one or more of the following characteristics:
  • linker X does not contain a thiol-functional amino acid derivative
  • linker Y does not contain an amino acid derivative bearing a thiol function
  • the peptide sequence E1 does not contain an amino acid derivative bearing a thiol function
  • the peptide sequence E2 does not contain an amino acid derivative carrying a thiol function.
  • the peptide sequences E1 and E2 do not comprise any amino acid derivative bearing a thiol function. According to yet another embodiment, none of X, Y, E1 and E2 comprises an amino acid derivative bearing a thiol function.
  • the compound of the invention for its implementation in an immunoassay, may be contained in a composition which comprises or contains said compound of formula (I) in solution in water, in a buffer or in a biological fluid, which constitutes another object of the invention.
  • a composition containing the biepitopic compound of formula (I) in solution in water is a liquid and clear solution obtained by completely dissolving said compound and whose majority solvent is water, representing at least 50% by volume relative to the volume total of the solution.
  • the amount of solvent is, of course, a function of the analyte in question and will be easily determined by those skilled in the art.
  • the compound of formula (I) may also be in solution in a buffer.
  • the buffers to be used are widely known to those skilled in the art and are a function of the analyte concerned.
  • buffers such as PBS, HEPES and TRIS-HC1 buffers.
  • composition contains a biological fluid
  • it may correspond to the sample that we want to test.
  • sample By way of examples, mention may be made of whole blood or its derivatives, for example serum or plasma, urine, saliva and effusions.
  • the amount of compound of formula (I) in the composition of the invention depends on the analyte concerned and the corresponding measurement range. It will be easily determined by the skilled person. Thus, it may be of the order of pg / mL, ng / mL or ⁇ g / mL. The same characteristics and preferences described above, in particular as regards the choice of El, E2, X, Y, Z, carrier molecule and analyte also apply to the compositions of the invention.
  • compositions of the invention may comprise other compounds, such as salts, filler proteins such as BSA or synthetic polymers such as dextran or polyethylene glycol, detergents, which are well known to those skilled in the art.
  • the compounds and compositions of the invention are particularly advantageous because they are easily synthesized, are stable at + 2/8 ° C and are soluble under the conditions of an immunoassay. Furthermore, the compounds of the invention have, against all odds, an immunoreactivity with the binding partners used in the particularly high immunoassay, ie the binding partners recognize them particularly well, so that, if wants to use them as a control, standard and / or adjuster, they can be contained in control solutions, standard and adjuster in small quantities, while being stable under immunoassay conditions.
  • Another object of the invention is the use of such a biepitopic compound or such a composition containing this compound as a control or standard or adjuster in an immunoassay.
  • control of the compound of formula (I) or the composition containing this compound its use is meant for, inter alia, to verify that the immunoassay functions according to expectations (also called a control or positive control) and that the detection of the analyte in the test sample is not falsely negative.
  • the establishment of the standard range, necessary step to perform quantification of an analyte is a step widely known to those skilled in the art as described above. It consists in measuring the signal generated by increasing or known quantities or concentrations of the analyte, in plotting the curve giving the signal as a function of the quantity or the concentration and in finding a mathematical model. who represents this relationship as faithfully as possible. To do this, several aqueous compositions of the invention are used, each containing a different concentration of analyte. The mathematical model will be used to extrapolate the unknown quantities or concentrations of analyte contained in the test sample.
  • calibrator also called calibrator
  • the compound of formula (I) or the composition containing this compound which is a particular standard
  • the adjuster is used to verify that the measurement (signal) produced during the implementation of the immunoassay corresponds to the expected value. If this is not the case, the adjuster is used to measure the drift which may be corrected mathematically or by physical intervention on the measuring instrument (adjustment).
  • the term standard will include in this application the term adjuster.
  • the analyte is any substance of biological, chemical or biochemical origin contained in a sample, detected, identified and / or quantified by analysis.
  • the analyte is cardiac troponin I and the compound of formula (I) or a composition containing it is used as a control, standard or adjuster in a cardiac troponin I immunoassay.
  • Troponin is known to be a myofibrillar protein complex, consisting of three proteins, the troponins I, T and C. This protein complex makes it possible to contribute to the regulation of the muscle contraction by the Ca 2+ ion, by interacting with myosin and actin.
  • Cardiac troponin I (accession No. Uniprot PI 9429) is the subunit of troponin responsible for the inhibition of binding between myosin and actin.
  • peptide sequences E1 and E2 are chosen from the following sequences:
  • the peptide sequences derived from said peptide sequences by substitution, deletion or insertion of an amino acid also belong to the field of the invention, insofar as they retain the capacity to be recognized by the antibody concerned.
  • the compound of formula (I) or a composition containing it are used as a control, standard or adjuster in an immunoassay of Proconvergefensine-A6.
  • Defensins are a family of antimicrobial peptides involved in host defense against microbial attack. In the mature form, they consist of 30 to 40 amino acids and have the property of selectively disaggregating the membranes. Like other eukaryotic proteins, Defensins may be present not only as a mature protein but also as a precursor. We then speak of Prodisputedfensine. Prodéfensine-A6 (Accession No Uniprot Q01524), has been described as being useful as a marker in the context of cancer and in particular colorectal cancer, in particular in the patent application WO2010 / 112777 of the Applicant.
  • the peptide sequences E1 and E2 are chosen independently in the following groups of sequences, knowing that if E1 is selected from a group, E2 is chosen from another group:
  • controls, standards and / or adjusters are particularly suitable for their implementation in the methods of detecting and / or quantifying an analyte by immunoassay in a test sample capable of containing said analyte.
  • Another subject of the invention relates to a method for detecting an analyte by immunoassay in a test sample capable of containing said analyte comprising
  • an immunoassay test by contacting said test sample with one or more analyte binding partners
  • a test for checking the validity of the immunoassay test by contacting a biepitopic compound of formula I as defined previously or of a composition as defined above, as a positive control, with said one or more partners analyte binding,
  • test sample in the context of the invention may be of various origins, for example of food, environmental, biological, veterinary, clinical, pharmaceutical or cosmetic origin.
  • Examples of food-based samples include, but are not limited to, a sample of milk products (yogurt, cheese, etc.), meat, fish, egg, fruit, vegetable, water, drink (milk, fruit juice, soda, etc.). Of course, these food-based samples may also come from sauces or more elaborate dishes or unprocessed or partially processed raw materials.
  • a food sample may also be derived from a feed intended for animals, such as cakes, animal meal. All these samples, if they are not liquid, are previously treated to be in liquid form.
  • the sample may be of environmental origin and may consist of, for example, surface sampling, water, etc.
  • the sample may also consist of a biological sample, of human or animal origin, which may correspond to samples of biological fluid (urine, whole blood or derivatives such as serum or plasma, saliva, pus, cerebrospinal fluid, etc.). ), stool (eg, cholera diarrhea), nose, throat, skin, wound, organ, tissue or isolated cells, swab specimens. This list is obviously not exhaustive.
  • sample refers to a part or quantity, more specifically a small part or a small quantity, taken from one or more entities for analysis. This sample may possibly have undergone prior treatment, involving for example mixing, dilution or grinding steps, in particular if the starting entity is in the solid state.
  • the sample analyzed is, in general, capable of - or suspected of - containing at least one analyte representative of the presence of microorganisms or a disease to be detected, characterized or monitored.
  • the steps of this method of detecting an analyte by immunoassay are steps widely known to those skilled in the art which have been described previously.
  • the first step consists of contacting the test sample with one or more analyte binding partners, preferably two binding partners for a sandwich test.
  • one of the two partners may be coupled to a label to form a conjugate or a tracer.
  • the other binding partner can be captured on a solid support as known to those skilled in the art. This is called capture partner for the latter and detection partner for the first.
  • the measured signal emitted by the conjugate is then proportional to the amount of analyte of the biological sample.
  • binding partners to the analyte of interest are any molecule capable of binding to the analyte.
  • binding partners of immunological nature or origin such as antibodies (monoclonal or polyclonal) and antibody fragments, which are well known to the patient.
  • binding partners that are not of nature or immunological origin such as nanofitins, analyte receptors if they exist, aptamers, DARPins or any other molecule that is known to have an interaction with said analyte.
  • Nanofitins are small proteins that, like antibodies, are able to bind to a biological target that can detect, capture or simply target within an organism.
  • RNA or DNA oligonucleotides
  • SELEX Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
  • Most aptamers are composed of RNA, because of the ability of 1 RNA to adopt various and complex structures, which makes it possible to create cavities on its surface. various geometries, making it possible to fix various ligands.
  • biochemical tools of interest that can be used in biotechnological, diagnostic or therapeutic applications. Their selectivity and ligand binding properties are comparable to that of antibodies.
  • DARPins for Designed Ankyrin Repeat ProteINS (Boersma YL and Plutckthun A, 2011) are another class of proteins that mimic antibodies and can bind with high affinity and selectivity to target proteins. They derive from the family of ankyrin proteins that are adapter proteins that make it possible to bind integral membrane proteins to the spectrin / actin network that constitutes the "spine" of the cellular plasma membrane. The structure of the ankyrins is based on the repetition of a pattern of about 33 amino acids and so are the DARPins. Each pattern has a secondary structure of helix-turn-helix type. The DARPins contain at least three, preferably four to five repeating units and are obtained by "screening" combinatorial libraries.
  • Marker means, in particular, any molecule containing a group reactive with a group of the binding partner, directly without chemical modification, or after chemical modification to include such a group, which molecule is capable of directly or indirectly generating a detectable signal.
  • a non-limiting list of these direct detection markers consists of:
  • enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, chromophores such as fluorescent compounds, luminescent compounds, dyes,
  • radioactive molecules such as JZ P, JJ S or
  • fluorescent molecules such as Alexa or phycocyanins, and electrochemiluminescent salts such as organometallic derivatives based on acridinium or ruthenium.
  • Indirect detection systems can also be used, such as, for example, ligands capable of reacting with an anti-ligand. The ligand then corresponds to the marker to form, with the binding partner, the conjugate.
  • ligand / anti-ligand pairs are well known to the person skilled in the art, which is the case, for example, of the following pairs: biotin / streptavidin, hapten / antibody, antigen / antibody, peptide / antibody, sugar / lectin, polynucleotide / complementary polynucleotide.
  • the anti-ligand can then be detectable directly by the direct detection markers described above or be itself detectable by another ligand / antiligand pair, and so on.
  • reagents allowing the visualization of the marking or the emission of a detectable signal by any type of suitable measuring device, such as for example a spectrophotometer, a spectrofluorimeter, a densitometer or a high definition camera.
  • the test step of checking the validity of the immunoassay is as described above.
  • the immunoassay test i) and the control test ii) can be implemented in any order, simultaneously or successively, on the same solid support or not.
  • the reading of the immunoassay test is also a step widely known to those skilled in the art that depends on the test used.
  • the last step consists in determining the presence of said analyte in the test sample when the signal obtained by the immunoassay test of step i is greater than the detection threshold of the immunoassay test. This step is also widely known to those skilled in the art.
  • the compounds of the invention are also suitable for quantification of analyte in a test sample.
  • another object of the invention relates to a method for quantifying an analyte by immunoassay in a test sample capable of containing said analyte, comprising
  • an immunoassay test by contacting said test sample with one or more analyte binding partners
  • the steps of the quantization method are as defined above.
  • the immunoassay test i) and the control test ii) can be implemented in any order, simultaneously or successively, on the same solid support or not.
  • the positive control may be any compound useful as a control, which has an antigenic reactivity comparable to the analyte in the immunoassay used.
  • the positive control is a biepitopic compound or a composition as described above.
  • the standard curve is prepared with the compound or composition of the invention. Nevertheless, any other appropriate standard solution can be used.
  • another subject of the invention relates to a method of quantifying an analyte by immunoassay in a test sample capable of containing said analyte comprising
  • an immunoassay test by contacting said test sample with one or more analyte binding partners
  • a test for checking the validity of the immunoassay test by bringing into contact a biepitopic compound of formula I as defined above or a composition as defined above, as a positive control, with said one or more binding partners to the analyte,
  • the analyte may be cardiac troponin I or prodefensin-A6.
  • the immunoassay methods of the invention involve the implementation of diagnostic kits comprising the compounds or compositions of the invention, which constitutes another object of the invention.
  • kits according to the invention may also contain the compounds necessary for the implementation of a method for the detection or quantification by immunoassay of the presence of a analyte of interest, for example by "sandwich” immunoassay, such as binding partners and all compounds necessary for demonstrating the reaction between the binding partner (s) and the analyte of interest.
  • FIG. 1 is a graph giving the RFV fluorescence signal, determined by the VIDAS® automaton, emitted by a biepitopic compound according to the prior art (Compound REF), a biepitopic compound according to the invention (Compound 1) and a biepitopic peptide corresponding to the biepitopic compound 1 of the invention, but not coupled to a carrier molecule (uncoupled peptide 1), depending on their concentration;
  • FIG. 2 is a graph giving the RFV fluorescence signal, determined by the VIDAS® automaton, emitted by the biepitopic compound according to the prior art. (Compound REF) and biepitopic compounds according to the invention (Compounds 1 and 3), depending on their concentration.
  • FIG. 3 is a graph giving the RFV fluorescence signal, determined by the VIDAS® automaton, emitted by the biepitopic compound according to the prior art (REF Compound) and biepitopic compounds according to the invention (Compounds 1 and 4) , depending on their concentration.
  • the peptides were deprotected and cleaved from the polymer in the presence of a mixture of trifluoroacetic acid-ethanedithiol-triisopropylsilane-water (94 / 2.5 / 1 / 2.5 V / V / V / V ) for about 2 hours. After removal of the polymer by filtration, the peptides were isolated by precipitation in diethyl ether at 0 ° C.
  • the peptides were purified by reverse phase preparative high performance liquid chromatography (HPLC) on a VYNAC DENALI TM 120 C18 column, 10 ⁇ (Mandel Scientific Company Inc., Guelph, Ontario, Canada). .
  • HPLC reverse phase preparative high performance liquid chromatography
  • Each peptide was eluted with a step gradient of acetonitrile (from 0 to 95%) in aqueous solution containing 0.1% of trifluoroacetic acid, the percentage of acetonitrile of the bearings having been chosen so as to optimize the isolation. of the peak which corresponds to the peptide of interest.
  • two different analysis techniques were implemented to control and characterize the peptides obtained.
  • Each peptide was also analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC / MS) on a ZORBAX Eclipse Plus Cl 8 R HD 2 column, 1 ⁇ 50 mm, particle size 1, 8 ⁇ (Agilent Technologies, Santa Clara, CA. USA) coupled to a Q-TOF LC / MS 6540UHD mass spectrometer Accurate-Mass (Agilent Technologies).
  • LC / MS liquid chromatography-mass spectrometry
  • Tn1 corresponds to cardiac Troponin I and PDEF-A6 to proefense-A6.
  • Ado corresponds to 8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid (CAS No. 134978-97-5). Table 2. Summary of the biepitopic compounds according to the invention obtained (formula I) and tested in immunoreactivity.
  • LFL * is liras Molecule
  • Tn1 corresponds to cardiac Troponin I and PDEFA6 to proDefensin-A6.
  • Ado corresponds to 8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid (CAS No. 134978-97-5).
  • BSA corresponds to Serum Bovine Albumin.
  • IgG is rabbit immunoglobulin G.
  • the biepitopic compounds were obtained by carrying out covalent couplings between the peptides obtained in Example 1 on the one hand and support molecules on the other.
  • Table 2 presents in detail the different biepitopic compounds according to the invention prepared. All these compounds satisfy formula I.
  • Table 3 summarizes all the couplings carried out, specifying the peptide and support molecule pairs.
  • the protein selected as a carrier molecule was activated in the presence of an excess of Sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, CAS No. 92921-24- 9, Cat No. 22322, Pierce, Thermo Scientif ⁇ c, Villebon sur Yvette, France).
  • Sulfo-SMCC Sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, CAS No. 92921-24- 9, Cat No. 22322, Pierce, Thermo Scientif ⁇ c, Villebon sur Yvette, France.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • the BSA was diluted to 10 mg / mL in PBS pH 7.2 (phosphate buffered saline) and 53 of a 25 mg / mL solution of sulfo-SMCC in water, prepared extemporaneously, was added dropwise. .
  • PBS pH 7.2 phosphate buffered saline
  • the BSA-SMCC was dialyzed against a 50 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl pH 6.8 in a dialysis tubing with a cutoff of 12 to 14 kDa. Dialysis was performed at room temperature and the dialysis bath was changed every hour, 3 times.
  • the protein concentration of the BSA-SMCC solution was determined by measuring the absorbance at 280 nm and this concentration was adjusted to 5 mg / mL in a 50 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl pH 6 8. This step allows the modification of the surface of the carrier molecule which now carries several reactive groups of maleimide type.
  • the peptide to be coupled was dissolved at 5 mg / ml in 50 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA pH 6.8, taking into account the purity.
  • 2.35 mg of BSA-SMCC at a concentration of 5 mg / mL (0.47 mL) was added to 1 mg of peptide at a concentration of 5 mg / mL (200 ⁇ M).
  • This mixture was incubated for 16 hours minimum at 2/8 ° C on a wheel. The reaction was then quenched by addition of 0.1 M 2-mercaptoethylamine (CAS No.
  • the study of the biepitopic character of the compounds was carried out by an immunoassay of cardiac Troponin I using the VIDAS® immunoassay automaton (bioMérieux).
  • the disposable cone serves both as a solid phase for the reaction and as a pipetting system.
  • the cartridge is composed of 10 wells (X0 to X9) sealed with a sealed and labeled aluminum foil.
  • the first well (X0) has a pre-cut part to facilitate the introduction of the sample.
  • the last well (X9) is an optical cuvette in which the fluorescence of the substrate is measured.
  • the different reagents necessary for the analysis are contained in the intermediate wells All the steps of the test are performed automatically by the instrument They consist of a succession of cycles of The immunoassay of the cardiac troponin I was carried out by a one-step sandwich test.
  • the characteristics and the suppliers of the antibodies used are presented in Table 4.
  • the cones were sensitized with 300 of a solution of the monoclonal antibodies 19C7 and B90 each diluted to 2.5 ⁇ g / ml in PBS buffer pH 6.2. After approximately 20 hours of incubation at +18 / 25 ° C. with the sensitization solution, the cones were emptied. Then, 300 of this same solution containing 10 g / l of bovine albumin are added. Passivation continues at + 18/25 ° C overnight. The cones are emptied, dried and stored at + 4 ° C until use, protected from moisture.
  • the compounds to be tested were diluted in PBS-BSA buffer at different concentrations and assayed as a sample.
  • the immunological reaction begins because the capture antibodies are immobilized on this cone.
  • the automaton mixes the sample to be tested (135 ⁇ ) with 270 of the conjugate solution.
  • This solution contains the 2 monoclonal antibodies, 3D5F7 and 7B9, in the form of Fab 'fragments coupled to alkaline phosphatase.
  • conjugates were diluted to approximately 0.75 ⁇ g / ml in 100 mM phosphate buffer pH 6.4, also containing 150 mM NaCl and filler proteins.
  • the incubation lasts 6.8 minutes at 37 ° C. and allows specific binding of cardiac Troponin I, or cardiac TnI biepitopic compounds, or cardiac TnI peptides, to antibodies adsorbed on the cone on the one hand, and conjugates of the other. Then unbound components are removed by 3 washes with a buffer Tris 200 mM H 7.8, 300 mM NaCl, Triton X-100 0.2%.
  • the 4-methylumbelliferyl phosphate substrate is sucked and then forced back into the cone; the conjugate enzyme catalyzes the hydrolysis reaction of this substrate to 4-methylombelliferone whose emitted fluorescence is measured at 450 nm.
  • Figure 1 shows these same data graphically.
  • the peptide 1 comprises 2 epitopes of the cardiac TnI, one recognized by the B90 capture antibody of the immunoassay described above, and the other by the 3D5F7 detection antibody.
  • the peptide 1 is coupled via the median cysteine to the BSA in order to ensure better antigen presentation and improved stability.
  • the compound REF has the same 2 epitopes of Tnl coupled also on the BSA. Unlike compound 1, each of the 2 epitopes is in the form of an individual peptide (peptides 2 and 3) which has been coupled to BSA at the terminal cysteine.
  • Compound 1, compound REF, which corresponds to a biepitopic compound as described in US Pat. No. 6,114,180, and peptide 1, which corresponds to a biepitopic synthetic compound as described in patent application WO98 / 24816, are all reagents in the immunoassay of cardiac TnI but their levels of reactivity are very different.
  • the abbreviation [c] corresponds to the ⁇ en concentration of the compound.
  • the abbreviation S corresponds to the signal in RFV.
  • peptide 1 which comprises 2 different epitopes of cardiac TnI was coupled on 2 different support molecules: BSA (compound 1) and rabbit immunoglobulin G (compound 3). Obtaining these biepitopic compounds is described in Example 2. Comparison of the immunoreactivity of these compounds in the immunoassay of cardiac TnI was performed as described in Example 3 and the results are shown in Table 5 above and FIG. 2, which represents a graph giving the RFV fluorescence signals emitted by the various compounds, a biepitopic compound according to the prior art (compound REF) and biepitopic compounds according to the invention (Compounds 1 and 3), depending on their concentration. The results show that compounds 1 and 3 are both reactive in the immunoassay of cardiac TnI and have a comparable reactivity, much greater than that observed for the compound REF.
  • the compared biepitopic compounds differ only at the spacer arm.
  • the two spacing arms are identical, it is a dimer of the artificial amino acid Ado.
  • Compound 4 for its part, contains the GGGS sequence as X-arm and the SGGG sequence as Y-arm.
  • the two compounds have 2 cardiac TnI epitopes and the support molecule is BSA.
  • Obtaining these biepitopic compounds is described in Example 2. Comparison of the immunoreactivity of these compounds in the immunoassay of cardiac TnI was performed as described in Example 3 and the results are shown in Table 5 above and FIG.
  • the biepitopic compound 5 has been designed to function as a control and / or standard and / or adjuster during an immunoassay of Prodisputedfensine A6.
  • Compound 5 combines a linear epitope (QAEDDPLQAKL) and a mimotope (WTGVLSPTQEYR).
  • the immunoassay for Prodéfensine A6 was carried out using the VIDAS® immunoassay automaton (bioMérieux), following the protocol described in the application WO2010 / 112777, namely using, as capture antibody, the clone 12H4E1 ( bioMérieux), which recognizes the linear minimal epitope of sequence EDDPLQ, and, as detection antibody, clone 1H8C9 (bioMérieux), whose epitope is not linear but is a mimotope of sequence WTGVLSPTQEYR. These epitopes / mimotopes are those found in compound 5.

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Abstract

La présente invention concerne un composé biépitopique de formule I: dans laquelle: -E1 et E2, identiques ou différents, représentent chacun indépendamment une séquence peptidique comprenant au moins un épitope d'un analyte; X et Y, identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un bras de liaison, -la molécule support est soluble et -Z représente un dérivé d'acide aminé porteur d'une fonction thiol avant sa liaison avec la molécule support Elle concerne également les compositions contenant ce composé, ainsi que l'utilisation d'un tel composé ou de la composition contenant ce composé en tant que contrôle ou étalon dans un immunoessai, les procédés utilisant comme contrôle ou étalon le composé ou la composition contenant ce composé et enfin les trousses pour la mise en œuvre d'immunoessai comprenant le composé ou la composition contenant ce composé.

Description

Composé synthétique biépitopique
La présente invention concerne le domaine du diagnostic ou pronostic. En particulier, elle concerne un composé synthétique biépitopique utile lors de la mise en œuvre d'immunoessais.
Les immunoessais sont utilisés couramment dans les domaines d'analyses cliniques, alimentaires, pharmaceutiques et chimiques. Ainsi, ils ont pour but de déterminer la présence d'un grand nombre d'analytes, sous forme de protéines (antigènes/anticorps), de peptides, d'haptènes, comme les stéroïdes ou les vitamines, dans des échantillons susceptibles de contenir ces analytes. L'immunoessai est un test largement connu de l'Homme du Métier qui implique des réactions immuno logiques entre Panalyte à détecter et un ou des partenaire(s) de liaison à cet analyte. A titre d'exemple de tels immunoessais, on peut citer les méthodes telles qu'ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), ELFA (Enzyme Linked Florescent Assay) et RIA (Radio Immuno Assay) qui peuvent fonctionner selon le principe du « sandwich », ou encore selon le principe de la « compétition », et les méthodes d'immunodétection comme l'immunohistochimie, l'immunocytochimie, l'immunofluorescence, le Western-blot et le Dot-blot. Les méthodes en « compétition » sont habituellement utilisées pour des petites molécules telles que les haptènes, les méthodes « sandwich » étant utilisées pour les autres analytes.
Ces immunoessais pratiqués notamment dans les laboratoires d'analyses biologiques nécessitent la fourniture par le fabricant, en plus des réactifs nécessaires au test, tels que les partenaires de liaison, les agents de révélation ou encore les solutions de dilution, d'un contrôle positif du test qui, mis en œuvre dans des conditions analogues à celles du test de l'échantillon à étudier, souvent de manière simultanée, servira à valider le bon déroulement de l'immunoessai. Si le contrôle positif est bien retrouvé positif, le résultat du test est valide et peut être interprété. Si le contrôle positif n'est pas retrouvé positif, cela indique que la mise en œuvre de l'immunoessai ne s'est pas déroulée de manière conforme aux attentes. Il convient alors de ne pas interpréter le résultat du test qui est invalide et de recommencer l'analyse.
Quant à la quantification d'un analyte par immunoessai dans un échantillon biologique susceptible de contenir ledit analyte, elle nécessite en plus des réactifs nécessaires au test et du contrôle positif sus-cités, l'utilisation d'une courbe étalon. Celle-ci est obtenue i) en mesurant le signal généré par des étalons, également appelés standards ou encore calibrateurs, qui correspondent à des quantités ou concentrations croissantes et connues de l'analyte ou d'un composé ayant la même réactivité antigénique que l'analyte dans l'immunoessai utilisé, ii) puis en traçant la courbe donnant le signal en fonction de la quantité ou de la concentration. Très souvent, il est d'usage de trouver un modèle mathématique qui représente de la manière la plus fidèle possible cette relation entre le signal et la quantité ou la concentration, afin de pouvoir calculer facilement les résultats d'un immunoessai quantitatif.
Pour ce faire, les solutions contrôles ou étalons doivent mimer l'analyte recherché et être reconnues de la même façon par les partenaires de liaison utilisés dans l'immunoessai. Ainsi, si la méthode de l'immunoessai est une méthode sandwich, les solutions contrôles ou étalons doivent comprendre un composé qui possède les deux épitopes de reconnaissance des deux partenaires de liaison utilisés. On parle alors de composé biépitopique.
Il n'est pas exclu que les deux épitopes d'un composé biépitopique soient identiques. Lorsque l'analyte à détecter ou quantifier est multimérique, au moins dimérique, il est possible d'utiliser le même partenaire de liaison en capture et en détection de l'immunoessai sandwich. Dans ce cas, le composé biépitopique contiendra deux fois le même épitope.
Les solutions contrôles ou étalons habituellement utilisées dans les tests d'immunoessai peuvent être d'origine humaine ou animale et contenir l'analyte en tant que tel à l'état naturel. Ces solutions sont préparées à partir de lyophilisât, et congelées en doses unitaires et conservées à -20°C ou -80°C. Une telle conservation n'est pas adaptée à une pratique fluide de laboratoire. De plus, pour pouvoir être utilisées, ces solutions contrôles ou étalons lyophilisées ont besoin d'être remises en solution. Or dans le cadre d'immunoessai, la mise en œuvre du test doit être rapide et cette remise en solution a pour conséquence une perte de temps. De plus, le fait d'effectuer cette remise en solution peut entraîner une erreur de mesure due à un biais dû à la dilution. Les solutions contrôles ou étalons prêtes à l'emploi, conservées sous forme liquide à + 2/8°C, sont donc particulièrement recommandées, et ce pour des raisons de commodité évidentes. Néanmoins, pour être représentatives des conditions réelles du dosage, ces solutions contrôles ou étalons prêtes à l'emploi ne contiennent que des faibles concentrations de l'analyte, par exemple de l'ordre du pg/mL, du ng/mL ou du μg/mL, en fonction de la gamme de mesure de l'analyte concerné, ce qui a pour conséquence d'affecter leur stabilité à une température de + 2/8°C. Par conséquent, pour remédier à cet inconvénient, des étalons synthétiques ont été utilisés.
La demande de brevet européen EP 0 650 053 A décrit des étalons synthétiques contenant des sites actifs pour un ou plusieurs récepteurs, reliés entre eux par une structure arborescente. Cette demande décrit plus spécialement des étalons synthétiques de la troponine T. Néanmoins ces étalons présentent une durée de stabilité en solution n'excédant pas 3 semaines à 4°C.
La demande de brevet W098/24816, quant à elle, propose des composés synthétiques biépitopiques utilisables comme étalon dans les immunoessais en « sandwich », pour le dosage de la troponine I, stables pendant plusieurs mois. Les composés décrits, de formule Σ-Ε1-^-Ε2-Ψ, comprennent deux séquences peptidiques El et E2 comprenant un épitope minimum de la troponine I, chacun de ces épitopes étant lié entre eux par un groupe de liaison ^ (linker) qui peut être un peptide central comprenant de 1 à 40 acides aminés. Chaque épitope peut également comprendre à son extrémité une séquence peptidique de 1 à 10 acides aminés (∑ et Ψ). Néanmoins la solution proposée dans cette demande de brevet a pour inconvénient que les composés biépitopiques décrits, pour être suffisamment immunoréactifs avec les partenaires de liaison utilisés dans l'immunoessai, doivent posséder un nombre non négligeable d'acides aminés, de sorte que leur synthèse n'est pas aisée. De plus, de par leur nature uniquement peptidique, une grande quantité de composé est nécessaire dans la solution contrôle ou étalon pour avoir une immunoréactivité optimale avec les partenaires de liaison utilisés dans l'immunoessai, ce qui représente un coût non négligeable pour le fabricant de trousses contenant ce contrôle ou cet étalon et donc pour le laboratoire utilisateur de la trousse ainsi produite.
Le brevet US 6,114,180, propose quant à lui un composé synthétique utilisable comme contrôle ou étalon dans les immunoessais comprenant deux épitopes de la troponine I reliés entre eux par une molécule support, telle que la BSA, dans le but d'augmenter sa solubilité et/ou sa stabilité en solution. Toutefois la construction particulière de ce composé, rend sa production difficile et pose la question de l'équimolarité entre les deux épitopes reliés à la molécule support.
La Demanderesse a mis en évidence de façon surprenante un composé synthétique à utiliser dans les immunoessais en « sandwich » palliant les inconvénients décrits dans l'art antérieur. En effet, sa synthèse est facile et simplifiée, il est stable à + 2/8°C et à faible concentration, il est soluble et il présente une excellente immunoréactivité avec les partenaires de liaison utilisés dans l'immunoessai. De plus, il n'est pas nécessaire d'en utiliser une grande quantité, si le composé est présent dans la solution contrôle ou étalon, pour avoir une immunoréactivité optimale avec les partenaires de liaison utilisés dans l'immunoessai. Enfin, la construction du composé selon l'invention garantit l'équimolarité des deux épitopes. à certaines
Ainsi, la présente invention a pour premier objet un composé biépitopique de formule (I) :
E1 - X - Z - Y - E2
Molécule support (I) dans laquelle :
El et E2, identiques ou différents, représentent chacun indépendamment une séquence peptidique comprenant au moins un épitope d'un analyte,
X et Y, identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un bras de liaison,
la molécule support est soluble et
Z représente un dérivé d'acide aminé porteur d'une fonction thiol avant sa liaison avec la molécule support .
Un autre objet de l'invention concerne une composition contenant un composé de formule I en solution dans l'eau, dans un tampon ou dans un fluide biologique.
Encore un autre objet concerne l'utilisation d'un tel composé biépitopique ou d'une telle composition contenant ce composé en tant que contrôle ou étalon ou ajusteur dans un immunoessai. Encore un autre objet de l'invention concerne les procédés d'immunoessai utilisant en tant que contrôle et/ou étalon ou ajusteur un composé biépitopique de formule I ou une composition contenant ce composé.
Enfin, le dernier objet de la présente invention est une trousse pour la mise en œuvre d'un immunoessai comprenant un composé biépitopique de formule (I) ou une composition contenant un tel composé.
La Demanderesse a donc mis au point contre toute attente un composé synthétique biépitopique qui permet de remédier à tous les inconvénients de l'état de la technique cités précédemment. Le composé de l'invention présente la formule (I) suivante :
E1 - X - Z - Y - E2
Molécule support (I) dans laquelle :
El et E2, identiques ou différents, représentent chacun indépendamment une séquence peptidique comprenant au moins un épitope d'un analyte;
X et Y, identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un bras de liaison,
la molécule support est soluble et
Z représente un dérivé d'acide aminé porteur d'une fonction thiol avant sa liaison avec la molécule support.
Le composé de l'invention est donc un composé biépitopique. Par composé biépitopique, on entend un composé qui comprend deux épitopes d'un même analyte afin de mimer la reconnaissance antigénique en immunoessai sandwich dudit analyte. Bien entendu, en aucun cas, le composé biépitopique synthétique ne consiste en la même séquence que l'analyte qu'il mime. Ce composé synthétique ne correspond donc pas à un enchaînement d'acides aminés existant dans la nature, par exemple une protéine ou un fragment de protéine. On appellera le composé de l'invention, de façon évidente et équivalente dans toute la demande, composé biépitopique, composé biépitopique non naturel, composé biépitopique synthétique ou composé biépitopique synthétique non naturel. Le préfixe « immuno » dans le terme « immunoessai », par exemple, n'est pas à considérer dans la présente demande comme indiquant strictement que le partenaire de liaison est nécessairement un partenaire d'origine immunologique, tel qu'un anticorps ou un fragment d'anticorps. En effet, comme cela est bien connu de l'Homme du Métier, ce terme est plus largement utilisé pour désigner aussi des tests et procédés dans lesquels le partenaire de liaison n'est pas un partenaire d'origine/de nature immunologique mais consiste, par exemple, en un récepteur de l'analyte que l'on souhaite détecter et/ou quantifier. Quelle que soit son origine ou sa nature, le partenaire de liaison concerné devrait être capable de se lier à l'analyte recherché, de préférence de manière spécifique. Ainsi, il est connu de parler du dosage ELISA pour des dosages qui utilisent des partenaires de liaison non immunologiques stricto sensu, appelés plus largement en anglais « ligand binding assay », que l'on pourrait traduire en langue française par « dosage utilisant la liaison à un ligand », alors que le terme « immuno » est inclus dans l'intitulé in extenso correspondant à l'acronyme ELISA. Dans un souci de clarté et d'uniformité, le terme « immuno » est employé dans la présente demande pour désigner toute analyse biologique utilisant au moins un partenaire de liaison adapté pour se lier à l'analyte recherché et détecter et/ou quantifier ce dernier, de préférence de manière spécifique, même quand ledit partenaire de liaison n'est pas de nature ou d'origine immunologique au sens strict.
Les immunoessais de type sandwich (ou plus simplement «immunoessai sandwich ») utilisent un premier partenaire de liaison, dit « partenaire de liaison de capture », pour lier, de manière spécifique, l'analyte recherché, et un deuxième partenaire de liaison, dit « partenaire de liaison de détection », marqué et également destiné à se lier de manière spécifique avec l'analyte recherché, révélant ainsi la liaison entre le partenaire de liaison de capture et l'analyte, et donc la présence de l'analyte. En d'autres termes, l'analyte recherché se trouve pris « en sandwich » entre lesdits premier et deuxième partenaires de liaison, le premier partenaire de liaison (« de capture ») étant généralement présent en excès par rapport à l'analyte recherché. Le partenaire de liaison de capture peut, par exemple, être immobilisé sur un support solide (par liaison covalente, adsorption ou toute autre méthode appropriée). Un épitope, aussi appelé déterminant antigénique, est la plus petite partie d'un antigène qui peut être reconnue par un paratope qui est la partie variable d'un anticorps. La structure de l'épitope est complémentaire avec le paratope de l'anticorps. La structure mise en jeu peut-être la structure primaire, dans le cas d'un épitope linéaire, également appelé épitope séquentiel, ou la structure tertiaire dans le cas d'un épitope conformationnel, également appelé épitope discontinu.
La séquence d'un épitope linéaire peut comporter des modifications dites conservatrices qui ne changent pas signifîcativement la liaison entre l'épitope et l'anticorps d'un point de vue de la spécificité.
Un mimotope est une macromolécule, un peptide souvent, qui imite la structure tridimensionnelle d'un épitope donné. Un anticorps qui reconnaît ledit épitope est également capable de reconnaître et de se fixer sur le mimotope qui imite cet épitope. Dans le cas des antigènes de nature protéique, des mimotopes peptidiques, donc linéaires, sont souvent utilisés pour mimer des épitopes conformationnels. Selon l'invention, les épitopes conformationnels peuvent être remplacés par des mimotopes. Les mimotopes sont également inclus dans la portée de la présente demande en remplaçant le terme épitope.
Lorsque l'antigène est de nature protéique, comme c'est souvent le cas, les épitopes linéaires et les mimotopes correspondent à une séquence peptidique de longueur variable. Dans le cas des épitopes linéaires, il convient de distinguer les notions d'épitope minimal et d'épitope optimal. L'épitope minimal correspond à la séquence peptidique de plus petite taille reconnue de manière spécifique par l'anticorps correspondant. Lorsqu'un acide aminé de l'extrémité N-terminale ou de l'extrémité C- terminale de ladite séquence peptidique est délété, la fixation de l'anticorps n'est plus possible, la reconnaissance est perdue. Un épitope minimal peut contenir de 3 à 20 acides aminés, plus souvent de 4 à 8 acides aminés.
L'épitope optimal correspond à la séquence peptidique reconnue de manière spécifique qui a la meilleure réactivité possible par l'anticorps correspondant (le signal le plus intense). Il s'agit très souvent de séquences peptidiques de 6 à 30 acides aminés de longueur. L'épitope optimal comprend en règle générale l'épitope minimal. Dans de rares cas, l'épitope optimal et l'épitope minimal peuvent être confondus. Le composé de l'invention est tel qu'il contient deux séquences peptidiques El et E2 comprenant au moins un épitope d'un analyte. Par séquence peptidique comprenant au moins un épitope d'un analyte, on entend que la séquence peptidique est constituée au moins des acides aminés de F épitope minimal. Selon un mode de réalisation de l'invention, la séquence peptidique est constituée d'au plus des acides aminés de F épitope optimal. Bien entendu, l'Homme du Métier sait qu'il est également possible d'ajouter 1, 2, 3, 4 ou 5 acides aminés supplémentaires d'un côté de l'épitope optimal ou des deux côtés sans trop affecter la reconnaissance antigénique. De tels acides aminés supplémentaires sont également inclus dans la définition.
Les acides aminés de ces séquences peptidiques peuvent être les acides aminés naturellement retrouvés dans la séquence de F analyte ou bien des acides aminés analogues. Par acides aminés analogues, on entend deux acides aminés dont la substitution est une substitution conservatrice en nature, c'est-à-dire prenant place dans une famille d'acides aminés. Spécifiquement, les acides aminés sont généralement divisés en 4 familles, à savoir (1) les acides aminés acides tels que l'aspartate et le glutamate, (2) les acides aminés basiques tels que la lysine, l'arginine et l'histidine, (3) les acides aminés non polaires tels que l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine et le tryptophane et (4) les acides aminés non chargés polaires tels que la glycine, l'asparagine, la glutamine, la cystéine, la sérine, la thréonine et la tyrosine. La phénylalanine, le tryptophane et la tyrosine sont parfois classés en acides aminés aromatiques. Par exemple, on peut prédire de façon raisonnable qu'un remplacement isolé de leucine par de l'isoleucine ou de la valine, d'un aspartate par un glutamate, d'une thréonine par une sérine, ou un remplacement conservateur similaire d'un acide aminé par un autre acide aminé ayant un rapport structurel, n'aura pas d'effet majeur sur l'activité biologique ou l'antigénicité. L'Homme du Métier déterminera facilement l'acide aminé qui peut tolérer un changement par référence aux plots Hopp/Woods et Kyte-Doolite, bien connus dans la technique. Selon un mode de réalisation, les acides aminés de la séquence peptidique sont les acides aminés naturellement retrouvés dans l'analyte. Selon un autre mode de réalisation, la séquence peptidique El ou la séquence peptidique E2 ou encore les deux sont des mimotopes et par conséquent les acides aminés de la séquence peptidique sont majoritairement différents des acides aminés naturellement retrouvés dans l'analyte.
Le terme analyte désigne une substance d'origine biologique, contenue dans un échantillon, détectée, identifiée et/ou quantifiée par une analyse. Il doit être compris, au sens large, comme désignant une substance chimique, biologique ou biochimique qui fait l'objet d'une ou plusieurs analyses. A titre d'exemple d'analytes, on peut citer une protéine ou un peptide.
L'analyte sera représentatif d'un état pathologique ou de la présence d'un microorganisme dans un milieu. Par état pathologique, on entend tout état de santé altéré d'un patient, dû à des maladies causées par de nombreux facteurs tels que les facteurs environnementaux (infectieux), génétiques et/ou biologiques. A titre d'exemples de maladies, on peut citer les maladies infectieuses, dues à des microorganismes tels que virus, bactéries, parasites (hépatites, sepsis, etc.), les maladies autoimmunes, les maladies neurodégénératives, les cancers (sein, prostate, colon, etc.), les maladies cardiovasculaires (infarctus du myocarde, etc.), etc. Les analytes sont alors associés aux diverses maladies. A titre d'exemple d' analyte, on peut citer la Troponine I cardiaque utile en tant qu'analyte pour l'infarctus du myocarde et la proDefensine-A6 en tant qu'analyte du cancer du côlon. Ces analytes seront décrits plus en détails par la suite. Selon un mode de réalisation, El et E2 sont des séquences peptidiques comprenant au moins un épitope de la troponine I cardiaque ou de la proDéfensine-A6.
Le radical central Z est un dérivé d'acide aminé porteur d'une fonction thiol avant sa liaison avec la molécule support. Par dérivé d'acide aminé, on entend toute molécule formant deux liaisons peptidiques -CO-NH- avec les bras de liaison X et Y auxquels elle est liée. Pour ce faire, l'acide aminé correspondant comporte, avant liaison avec les bras de liaison X ou Y, un groupement réactif -NH2 et un groupement réactif -COOH. Après liaison aux bras de liaison X et Y, le dérivé d'acide aminé comporte donc un groupement -NH- et un groupement -CO-. L'acide aminé correspondant comporte également une fonction thiol (-SH) avant sa liaison avec la molécule support. Des exemples de tels radicaux Z comprennent les dérivés de cystéine, d'homocystéine et de pénicillamine. Les acides aminés correspondants, utilisés pour former ces dérivés, sont bien entendu la cystéine, l'homocystéine et la pénicillamine, lesquelles sont des acides aminés connus de l'Homme du Métier.
Les deux bras de liaison X et Y du composé de l'invention sont identiques ou différents l'un par rapport à l'autre. Les bras de liaison sont caractérisés par leur capacité à former chacun deux liaisons peptidiques -CO-NH-, d'une part avec El ou E2, et d'autre part avec le radical Z central. Les bras de liaison X et Y sont alors des dérivés d'acides aminés comportant un groupement -NH- et un groupement -CO-. Pour ce faire, les composés utilisés pour former les bras de liaison comportent, avant liaison avec les séquences peptidiques El ou E2, un groupement réactif -NH2 et un groupement réactif -COOH. Bien entendu, les bras de liaison peuvent comprendre d'autres groupements, par exemple latéraux, lesquels ne sont pas réactifs en tant que tels ou ne sont pas réactifs car ils sont protégés par des groupements protecteurs connus de l'Homme du Métier par exemple des groupements trityle, t-butyle, t-butyle-éther benzyle ou benzylester. Les bras de liaison peuvent être obtenus à partir d'un ou plusieurs composés présentant chacun un groupement réactif -COOH et un groupement réactif -NH2 avant leur engagement dans le composé biépitopique de l'invention. On appellera ces composés « monomères utiles pour former les bras de liaison ».
Les monomères utiles pour former les bras de liaisons peuvent être des acides α-aminés protéinogènes, nécessaires à la synthèse de protéines biologiques, lesquels sont connus de l'Homme du Métier. Ces acides α-aminés protéinogènes peuvent être codés génétiquement ; dans ce cas, ils sont au nombre de 22. Les 20 acides a-aminés protéinogènes universellement distribués chez tous les êtres vivants sont : L-Alanine, L-Arginine, L-Asparagine, L-Aspartate, L-Cystéine, L-Glutamate, L-Glutamine, L- Glycine, L-Histidine, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine, L-Méthionine, L- Phénylalanine, L-Proline, L-Sérine, L-Thréonine, L-Tryptophane, L-Thyrosine et L- Valine. Les 2 autres acides aminés protéinogènes sont beaucoup plus rares : la L- Pyrrolysine ne se rencontre que chez certaines archées méthanogènes et la L- Sélénocystéine n'est présente que dans quelques enzymes de la famille des oxydoréductases.
Outre ces 22 acides aminés codés génétiquement, il existe plusieurs dizaines d'autres acides aminés biologiques qui peuvent être obtenus à partir des précédents par modifications enzymatiques, comme par exemple la L-Citrulline, l'Acide L- pyroglutamique, la L-Ornithine, la L-3,4-dihydroxyphénylalanine, l'acide γ- amino butyrique et l'acide domoïque.
Les monomères utiles pour former les bras de liaison peuvent également être des pseudo acides aminés, appelés aussi acides aminés artificiels, c'est-à-dire des acides aminés non biologiques. Dans ce cas, la seule condition est que le composé comprenne deux fonctions libres, -COOH et -NH2.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les bras de liaison X et Y, identiques ou différents, comprennent chacun un ou plusieurs dérivés d'acides aminés (tels que acides α-aminés protéinogènes, et /ou acides aminés biologiques et/ou pseudo acides aminés). Les bras de liaison peuvent être préparés à partir de un à six acides aminés, de préférence de un à quatre acides aminés. Par exemple, les bras de liaison peuvent avoir la séquence GGGS, ou la séquence SGGG, ou la séquence GSGSGS ou encore la séquence SGSGSG.
Selon un mode de réalisation de l'invention, X et Y dans la formule (I), c'est-à- dire après formation des liaisons peptidiques avec E1/E2/Z, présente un ou plusieurs dérivés de monomères de formule (II) suivante :
-NH-R-CO- (II)
dans laquelle R est un radical constitué d'un ou plusieurs groupements choisis indépendamment parmi les groupements (-C(R')H-C(R")H, (-C(R')H-C(R")H-0-), (-C(R')H-) et (-C(R')H-O-), R' et R" étant choisis indépendamment parmi l'hydrogène, le groupement hydroxyle et les groupements alkyle en C1 -C5. Selon un mode de réalisation, R est constitué d'un ou plusieurs groupements choisis indépendamment parmi (-CH2-CH2-0-), (-CH2-0-) et (-CH2-). Selon un mode de réalisation particulier, le radical R peut comprendre de un à six groupements (-CH2-CH2-0-), de préférence de un à quatre groupement (-CH2-CH2-0-). A titre d'exemples non limitatifs de radical R, on peut citer le pentaoxaoctadécanoyle, le tétraoxapentadécanoyle, le trioxadodécanoyle, le trioxatridécanoyle, le dioxaoctanoyle, l'oxapentoyle et l'héxaoxahénéicosanoyle et leurs dérivés. A titre d'exemple de composé utile pour donner un dérivé de monomère de formule (II), on peut citer l'acide 8-amino-3,6- dioxaoctanoïque (No CAS : 134978-97-5), lequel est un pseudo acide aminé connu. Par exemple, les bras de liaison peuvent être un dimère ou un trimère de l'acide 8-amino- 3,6-dioxaoctanoïque, (Ado)2 ou (Ado)3.
A titre d'autre exemple de groupements du radical R, on peut citer les dérivés d'acides aminés biologiques cités ci-dessus, sous forme de résidu, c'est-à-dire sans leur groupement -COOH et -NH2 mais comportant un groupement -NH- et un groupement -CO-. Ainsi par exemple, si le composé formant le bras de liaison est la leucine, de formule (CH3)2CH-CH2-CH(NH2)-COOH, alors R du composé de formule (II) sera
ÇHÎCHS £ CH
Chaque bras de liaison a, entre les groupements -CO ou -NH des deux extrémités, une taille comprise entre 10 et 60 Â, de préférence entre 20 et 30 Â, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention.
Comme les monomères utiles pour former les bras de liaison X et Y ont des groupements réactifs -COOH et -NH2 avant leur engagement dans le composé biépitopique de l'invention et permettent la formation de liaisons peptidiques, l'enchaînement E1-X-Z-Y-E2 peut être considéré comme un peptide, appelé ci-après peptide biépitopique, de sorte qu'il peut être produit par synthèse peptidique, ce qui a pour avantage
une synthèse facile, rapide, standardisée, reproductible et simplifiée, la production d'un composé équimolaire par rapport à El et E2.
Le peptide biépitopique est obtenu selon les procédures bien connues de l'Homme du Métier telle que la synthèse peptidique en phase solide décrite par Merrifïeld, 1963. Les améliorations de cette technique ont été revues et discutées par Fields et Noble, 1990. Une telle synthèse utilise une phase solide sur laquelle est fixé le premier acide aminé C-terminal. Dans ce cadre, chaque groupement -NH2 du nouvel acide aminé, ajouté pour former le peptide, est protégé par un groupement protecteur de type Fmoc (9-fluoréméthyloxycarbonyle) ou Boc (t-butoxycarbonyle), pour favoriser la réaction entre le groupement -NH2 présenté par la phase solide et le groupement - COOH du nouvel acide aminé ajouté, comme bien connu de l'Homme du Métier.
Selon l'invention, la longueur du peptide biépitopique n'excède pas une longueur correspondant à 100 acides aminés, de préférence elle n'excède pas une longueur correspondant de 20 à 30 acides aminés et plus préférentiellement elle n'excède pas une longueur correspondant de 25 à 27 acides aminés.
Le peptide biépitopique est lié, via le radical Z, à une molécule support. La molécule support a pour rôle la stabilisation du composé biépitopique et permet de rendre les séquences peptidiques El et E2, comprenant au moins un épitope de l'analyte dudit composé biépitopique, plus disponibles, et ce tout en conservant l'équimolarité entre El et E2.
On entend par molécule support toute molécule soluble qui peut être couplée à un peptide. A titre de molécule soluble, on peut citer les protéines telles que l'Albumine Sérique Bovine, Pimmunoglobuline G et la thyroglobuline, et les polymères telles que les polylysines. Selon un mode de réalisation, la molécule support est une protéine dont le poids moléculaire est compris entre 20kDa et 700kDa, de préférence entre 60kDa et 250kDa.
Les polylysines sont des polymères connus de l'Homme du Métier. Elles sont disponibles par exemple chez Sigma-Aldrich.
L'Albumine Sérique Bovine et la thyroglobuline sont connues de l'Homme du Métier. Pour Pimmunoglobuline G, il convient de la choisir pour qu'elle ne provienne ni de l'espèce utilisée pour obtenir les anticorps de l'immunoessai, ni de l'espèce d'où provient l'échantillon à analyser, afin d'éviter les problèmes d'interférences. On peut citer à titre d'exemple, les immunoglobulines G de lapin, de souris, de cheval, de chèvre, de cochon... (liste non exhaustive).
Selon un mode de réalisation, la molécule support est lAlbumine Sérique Bovine.
Selon un autre mode de réalisation, la molécule support est une immunoglobuline G de lapin dans un immunoessai dont les anticorps proviennent de la souris et dont l'échantillon à analyser provient de l'Homme. Le couplage entre le peptide biépitopique et la molécule support de nature protéique au niveau du radical Z peut se faire par covalence, selon des méthodes bien connues de l'Homme du Métier. Le groupement sulfhydrile (-SH) présent dans la chaîne latérale du radical Z est réactif vis-à-vis des groupements maléimides, haloacétyles et disulfures de pyridyle. Ainsi, dans une première étape, il convient d'activer la molécule support, par réaction avec un excès molaire d'un agent de réticulation (crosslinker en anglais) qui va être capable de réagir au niveau des groupements aminés (-NH2) accessibles de la molécule support et d'introduire ainsi à la surface de la molécule support des groupements réactifs choisis parmi les maléimides ou les haloacétyles. Ces groupements sont préférés car ils permettent d'obtenir un couplage par une liaison thioéther qui est stable. Parmi les agents de réticulation qui permettent d'introduire des groupements maléimides, on peut citer de manière non exhaustive, le N-(8-Maléimidocaproyloxy)succinimide ester, le m- Maléimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, le succinimidyl 4-(N- maléimidométhyl)cyclohexane-l-carboxylate ou encore le sulfo succinimidyl 4-(N- maléimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate. Parmi les agents de réticulation qui permettent d'introduire des groupements haloacétyles, on peut citer de manière non exhaustive, le N-succinimidyl(4-iodoacétyl)aminobenzoate et le sulfosuccinimidyl(4- iodo-acétyl)aminobenzoate. Ensuite, la molécule support activée est purifiée par dessalage, par exemple par chromatographie gel filtration, ou encore par dialyse, afin d'éliminer l'excès de l'agent de réticulation et les sous-produits. Finalement, la molécule support activée est mise en présence du peptide biépitopique comprenant le radical Z en position relativement centrale. Les groupements maléimides ou haloacétyles réagissent avec le groupement sulfhydrile (-SH) du radical Z du peptide biépitopique pour former une liaison covalente thioéther, stable. Il convient d'effectuer la réaction entre les groupements maléimides et sulfhydriles dans des conditions proches du pH neutre (pH 6,5 à 7,5) et d'exclure les thiols étrangers, par exemple la plupart des agents réducteurs, de la composition du tampon réactionnel afin d'éviter la compétition pour les sites de couplage. Il convient d'effectuer la réaction entre les groupements haloacétyles et sulfhydriles à pH 7,2 à 9. Pour limiter la génération d'iode libre qui est susceptible de réagir avec la tyrosine, l'histidine et le tryptophane, il est préférable de réaliser la réaction dans l'obscurité. De tels procédés, connus de l'Homme du Métier, sont décrits par exemple dans « Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking » de Shan S. Wong, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, Etats-Unis, 1991.
Afin de favoriser le couplage du peptide biépitopique sur le radical Z, si les bras de liaison X/Y et/ou les séquences peptidiques E1/E2 contiennent des dérivés d'acides aminés portant une fonction thiol, il convient d'utiliser, pour la formation dudit peptide, des dérivés d'acides aminés protégés au niveau de cette fonction thiol par un groupement protecteur stable durant les étapes de synthèse dudit peptide ainsi que durant l'étape de couplage avec la molécule support. Ainsi, seul l'acide aminé utilisé pour donner le radical Z portera une fonction thiol réactive. Pour éviter une telle étape de protection des fonctions thiols des bras X/Y et/ou des séquences peptidiques E1/E2, il convient que ni X, ni Y, ni El et ni E2 ne contienne un dérivé d'acide aminé portant une fonction thiol, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention.
Les acides aminés protégés au niveau de leur fonction thiol sont disponibles par exemple chez NOVABIOCHEM®.
Après couplage du peptide biépitopique avec la molécule support, les fonctions thiol seront ou non déprotégés selon des techniques connues de l'Homme du Métier. On peut citer comme groupement protecteur le groupement t-butylthio qui est facilement éliminé en milieu aqueux (bicarbonate d'ammonium 0.1 M) en présence de DTT (dithiothréitol). Lorsque seuls les bras de couplage X/Y contiendront des dérivés d'acides aminés portant une fonction thiol, une telle déprotection ne sera pas nécessaire et sera déconseillée. Lorsque les séquences peptidiques E1/E2 contiendront des dérivés d'acides aminés portant une fonction thiol, une telle déprotection sera nécessaire si cela affecte la reconnaissance épitopique.
Il est également possible que les bras de couplage et/ou les séquences peptidiques ne contiennent aucun dérivé d'acide aminé portant une fonction thiol. Ainsi le composé biépitopique de l'invention comprend un ou plusieurs des caractéristiques suivantes :
le bras de liaison X ne comporte pas de dérivé d'acide aminé portant une fonction thiol, le bras de liaison Y ne comporte pas de dérivé d'acide aminé portant une fonction thiol,
la séquence peptidique El ne comporte pas de dérivé d'acide aminé portant une fonction thiol, et
la séquence peptidique E2 ne comporte pas de dérivé d'acide aminé portant une fonction thiol.
Selon un mode de réalisation particulier, les séquences peptidiques El et E2 ne comportent aucun dérivé d'acide aminé portant une fonction thiol. Selon encore un autre mode de réalisation, aucun des éléments parmi X, Y, El et E2 ne comporte de dérivé d'acide aminé portant une fonction thiol.
Le composé de l'invention, pour sa mise en œuvre dans un immunoessai, peut être contenu dans une composition, laquelle comprend ou contient ledit composé de formule (I) en solution dans l'eau, dans un tampon ou dans un fluide biologique, ce qui constitue un autre objet de l'invention.
Une composition contenant le composé biépitopique de formule (I) en solution dans l'eau est une solution liquide et limpide obtenue par dissolution complète dudit composé et dont le solvant majoritaire est l'eau, représentant au moins 50% en volume par rapport au volume total de la solution. La quantité de solvant est bien entendu fonction de Panalyte concerné et sera déterminée facilement par l'Homme du Métier.
Le composé de formule (I) peut également être en solution dans un tampon. Les tampons à utiliser sont largement connus de l'Homme du Métier et sont fonction de l'analyte concerné. A titre d'exemple de tampons, on peut citer des tampons tels que les tampons PBS, HEPES et TRIS-HC1.
Lorsque la composition contient un fluide biologique, celui-ci peut correspondre à l'échantillon que l'on voudra tester. A titre d'exemples, on peut citer le sang total ou ses dérivés, par exemple sérum ou plasma, les urines, la salive et les épanchements.
La quantité de composé de formule (I) dans la composition de l'invention dépend de l'analyte concerné et de la gamme de mesure correspondante. Elle sera facilement déterminée par l'Homme du Métier. Ainsi, elle peut être de l'ordre du pg/mL, du ng/mL ou du μg/mL. Les mêmes caractéristiques et préférences décrites précédemment, notamment quant au choix de El, E2, X, Y, Z, molécule support et analyte s'appliquent également aux compositions de l'invention.
Bien entendu, les compositions de l'invention peuvent comprendre d'autres composés, tels que des sels, protéines de charge comme la BSA ou des polymères synthétiques type dextran ou polyéthylène glycol, détergents, bien connus de l'Homme du Métier.
Comme indiqué précédemment, les composés et les compositions de l'invention sont particulièrement avantageux car ils sont synthétisés facilement, sont stables à + 2/8°C et sont solubles dans les conditions d'un immunoessai. Par ailleurs, les composés de l'invention possèdent contre toute attente une immunoréactivité aux partenaires de liaison utilisés dans l'immunoessai particulièrement élevée, c'est-à-dire que les partenaires de liaison les reconnaissent particulièrement bien, de sorte que, si on veut les utiliser en tant que contrôle, étalon et/ou ajusteur, ils peuvent être contenus dans les solutions contrôle, étalon et ajusteur en faible quantité, tout en étant stables dans les conditions d'immunoessai.
Ainsi, un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un tel composé biépitopique ou d'une telle composition contenant ce composé en tant que contrôle ou étalon ou ajusteur dans un immunoessai.
Par utilisation en tant que contrôle du composé de formule (I) ou la composition contenant ce composé, on entend son utilisation pour, entres autres, vérifier que l'immunoessai fonctionne selon les attentes (également appelé témoin ou contrôle positif) et que la détection de Panalyte dans l'échantillon de test n'est pas faussement négative.
Par utilisation en tant qu'étalon du composé de formule (I) ou la composition contenant ce composé, on entend son utilisation pour l'établissement d'une gamme étalon. L'établissement de la gamme étalon, étape nécessaire pour pouvoir effectuer une quantification d'un analyte, est une étape largement connue de l'Homme du Métier comme décrit précédemment. Il consiste à mesurer le signal généré par des quantités ou concentrations croissantes et connues de l'analyte, à tracer la courbe donnant le signal en fonction de la quantité ou de la concentration et à trouver un modèle mathématique qui représente de la manière la plus fidèle possible cette relation. Pour ce faire, plusieurs compositions aqueuses de l'invention sont utilisées, chacune contenant une concentration différente en analyte. Le modèle mathématique sera utilisé pour déterminer par extrapolation les quantités ou concentrations d' analyte inconnues contenues dans l'échantillon à tester.
Par utilisation en tant qu'ajusteur, également appelé calibrateur, du composé de formule (I) ou la composition contenant ce composé, lequel est un étalon particulier, on entend son utilisation pour ajuster la mesure de l'immunoessai de l'analyte. Dans ce cas, la concentration en analyte est fixe et connue. Le signal généré lors de l'utilisation dans l'immunoessai par l'ajusteur est également connu. L'ajusteur sert à vérifier que la mesure (signal) produite lors de la mise en œuvre de l'immunoessai correspond bien à la valeur attendue. Si ce n'est pas le cas, l'ajusteur sert à mesurer la dérive qui pourra le cas échéant être corrigée mathématiquement ou par une intervention physique sur l'instrument de mesure (ajustement). Par commodité, le terme étalon comprendra dans la présente demande le terme ajusteur.
Comme indiqué précédemment, l'analyte est toute substance d'origine biologique, chimique ou biochimique contenue dans un échantillon, détectée, identifiée et/ou quantifiée par une analyse.
Selon un premier mode de réalisation, l'analyte est la troponine I cardiaque et le composé de formule (I) ou une composition le contenant sont utilisés comme contrôle, étalon ou ajusteur dans un immunoessai de la troponine I cardiaque.
Il est connu que la troponine est un complexe protéique myofïbrillaire, constitué de trois protéines, les troponines I, T et C. Ce complexe protéique permet de contribuer à la régulation de la contraction du muscle par l'ion Ca2+, en interagissant avec la myosine et l'actine.
La troponine I cardiaque (N° accession Uniprot PI 9429) est la sous-unité de la troponine responsable de l'inhibition de la liaison entre la myosine et l'actine.
Les épitopes et mimotopes de la Troponine I cardiaque sont connus de l'Homme du Métier. Dans un mode particulier de l'invention, les séquences peptidiques El et E2 sont choisies parmi les séquences suivantes :
Séquence 1 : ATEPHAKK Séquence 2 : AGLGFAELQDL
Séquence 3 : KISASRKLQLKT
Les séquences peptidiques dérivant desdites séquences peptidiques par substitution, délétion ou insertion d'un acide aminé, appartiennent aussi au domaine de l'invention, dans la mesure où elles conservent la capacité d'être reconnues par l'anticorps concerné.
Selon un autre mode de réalisation, le composé de formule (I) ou une composition le contenant sont utilisés comme contrôle, étalon ou ajusteur dans un immunoessai de la Prodéfensine-A6.
Les Défensines sont une famille de peptides antimicrobiens impliqués dans la défense de l'hôte contre les attaques microbiennes. Sous la forme mature, elles sont constituées de 30 à 40 acides aminés et ont la propriété de désagréger sélectivement les membranes. Comme d'autres protéines eucaryotes, les Défensines peuvent être présentes non seulement sous forme de protéine mature mais également sous forme de précurseur. On parle alors de Prodéfensine. La Prodéfensine-A6 (N° accession Uniprot Q01524), a été décrite comme pouvant être utile comme marqueur dans le cadre du cancer et notamment du cancer colorectal, notamment dans la demande de brevet WO2010/112777 de la Demanderesse.
Des épitopes et mimotopes de la protéine proDéfensine-A6 sont connus et sont décrits par exemple dans la demande de brevet WO2010/112777. Dans un mode particulier de l'invention, les séquences peptidiques El et E2 sont choisies indépendamment dans les groupes de séquences suivants, sachant que si El est choisie dans un groupe, E2 est choisi dans un autre groupe :
Groupe 1 :
- Séquence 4 : NYVTPPWAIFRH
- Séquence 5 : WTGVLSPTQEYR
- Séquence 6 : SHLTPPWMDYRV
- Séquence 7 : VMAVTCSTCDSR
- Séquence 8 : LTPPTEDLRPPD
Groupe 2 :
- Séquence 9 : YGNHSCTHIGHC Séquence 10 : GPSYTCLHFGHC
Séquence 11 : TEREVHNWFPFH
Groupe 3
Séquence 12 YPHPWSMHVIRA
Séquence 13 TTTPHPWALFAV
Séquence 14 TPHPWQRWVVYS
Séquence 15 EDVLRWHPEWPG
Groupe 4
Séquence 16 : YHETWPPKSAQL
Séquence 17 : YHDNWPQPSRSW
Séquence 18 : QHNHQRHGAMGA
Séquence 19 : YHDMWPMSGRMA
Séquence 20 : YHDNWPPLNGAR
Séquence 21 : YHDMWPAIQLSP
Séquence 22 : YHEKFPGPVVLP
Groupe 5
- Séquence 23 : QAEDDPLQAK
Ces contrôles, étalons et/ou ajusteurs sont particulièrement adaptés pour leur mise en œuvre dans les procédés de détection et/ou quantification d'un analyte par immunoessai dans un échantillon de test susceptible de contenir ledit analyte.
Aussi, un autre objet de l'invention concerne un procédé de détection d'un analyte par immunoessai dans un échantillon de test susceptible de contenir ledit analyte comprenant
i. un test d'immunoessai par mise en contact dudit échantillon de test avec un ou plusieurs partenaires de liaison à Γ analyte,
ii. un test de contrôle de la validité du test d'immunoessai par mise en contact d'un composé biépitopique de formule I tel que défini précédemment ou d'une composition telle que définie précédemment, à titre de contrôle positif, avec lesdits un ou plusieurs partenaires de liaison à Γ analyte,
iii. la lecture du test d'immunoessai si le test de contrôle de validité est positif, iv. la détermination de la présence dudit analyte dans l'échantillon de test lorsque le signal obtenu par le test d'immunoessai de l'étape i est supérieur au seuil de détection du test d'immunoessai.
L'échantillon de test dans le cadre de l'invention peut être de diverses origines, par exemple d'origine alimentaire, environnementale, biologique, vétérinaire, clinique, pharmaceutique ou cosmétique.
Parmi les échantillons d'origine alimentaire, on peut citer, de façon non- exhaustive, un échantillon de produits lactés (yaourts, fromages, etc.), de viande, de poisson, d'œuf, de fruit, de légume, d'eau, de boisson (lait, jus de fruits, soda, etc.). Bien évidemment, ces échantillons d'origine alimentaire peuvent aussi provenir de sauces ou de plats plus élaborés ou des matières premières non transformées ou partiellement transformées. Un échantillon alimentaire peut également être issu d'une alimentation destinée aux animaux, telle que des tourteaux, des farines animales. Tous ces échantillons, s'ils ne sont pas liquides, sont préalablement traités pour être sous forme liquide.
Tel qu'indiqué précédemment, l'échantillon peut être d'origine environnementale et peut consister, par exemple, en un prélèvement de surface, d'eau, etc.
L'échantillon peut également consister en un échantillon biologique, d'origine humaine ou animale, pouvant correspondre à des prélèvements de fluide biologique (urine, sang total ou dérivés tels que sérum ou plasma, salive, pus, liquide céphalo- rachidien, etc.), de selles (par exemple diarrhées cholériques), de prélèvements de nez, de gorge, de peau, de plaies, d'organes, de tissus ou de cellules isolées, d'échantillons d'écouvillonnage. Cette liste n'est évidemment pas exhaustive.
D'une manière générale, le terme « échantillon » se réfère à une partie ou à une quantité, plus particulièrement une petite partie ou une petite quantité, prélevée à partir d'une ou plusieurs entités aux fins d'analyse. Cet échantillon peut éventuellement avoir subi un traitement préalable, impliquant par exemple des étapes de mélange, de dilution ou encore de broyage, en particulier si l'entité de départ est à l'état solide. L'échantillon analysé est, en général, susceptible de - ou suspecté de - contenir au moins un analyte représentatif de la présence de microorganismes ou d'une maladie à détecter, caractériser ou suivre.
Les étapes de ce procédé de détection d'un analyte par immunoessai sont des étapes largement connues de l'Homme du Métier qui ont été décrites précédemment. Notamment, la première étape consiste en la mise en contact de l'échantillon de test avec un ou plusieurs partenaires de liaison à Γ analyte, de préférence deux partenaires de liaison pour un test sandwich. Comme décrit précédemment, l'un des deux partenaires peut être couplé à un marqueur pour former un conjugué ou un traceur. L'autre partenaire de liaison peut être capturé sur un support solide comme connu de l'Homme du Métier. On parle alors de partenaire de capture pour ce dernier et partenaire de détection pour le premier.
Le signal mesuré émis par le conjugué est alors proportionnel à la quantité d'analyte de l'échantillon biologique.
Les partenaires de liaison à l'analyte d'intérêt sont toute molécule capable de se lier à l'analyte. A titre d'exemple de partenaires de liaison à l'analyte, on peut citer les partenaires de liaison de nature ou d'origine immuno logiques tels que les anticorps (monoclonaux ou polyclonaux) et les fragments d'anticorps, bien connus de l'Homme du Métier, ainsi que les partenaires de liaison n'étant pas de nature ou d'origine immunologique tels que les nanofitines, les récepteurs à l'analyte s'ils existent, les aptamères, les DARPins ou toute autre molécule qui est connue pour avoir une interaction avec ledit analyte.
Les nanofitines (nom commercial) sont de petites protéines qui, comme les anticorps, sont capables de se lier à une cible biologique permettant ainsi de la détecter, de la capturer ou tout simplement de la cibler au sein d'un organisme.
Les aptamères sont des oligonucléotides, généralement ARN ou ADN, identifiés dans des banques contenant jusqu'à 1015 séquences différentes, par une méthode combinatoire de sélection in vitro appelée SELEX pour « Systematic Evolution of Ligands by Exponentiel Enrichment » (Ellington AD et Szostak JW., 1990). La plupart des aptamères sont composés dARN, en raison de la capacité de 1ARN à adopter des structures variées et complexes, ce qui permet de créer à sa surface des cavités de géométries variées, permettant de fixer des ligands divers. Il s'agit d'outils biochimiques d'intérêt qui peuvent être utilisés dans des applications biotechnologiques, diagnostiques ou thérapeutiques. Leur sélectivité et leurs propriétés de fixation de ligands sont comparables à celle des anticorps.
Les « DARPins » pour Designed Ankyrin Repeat ProteINS (Boersma YL et Plutckthun A, 2011) sont une autre classe de protéines permettant de mimer les anticorps et de pouvoir se fixer avec une affinité et une sélectivité élevées sur des protéines cibles. Ils dérivent de la famille des protéines ankyrines qui sont des protéines adaptatrices permettant de fixer les protéines de membrane intégrales au réseau spectrine/actine qui constitue « la colonne vertébrale » de la membrane plasmatique cellulaire. La structure des ankyrines est basée sur la répétition d'un motif d'environ 33 acides aminés et il en est de même des DARPins. Chaque motif a une structure secondaire de type hélice-coude-hélice (« helix-turn-helix »). Les DARPins contiennent au moins trois, de préférence quatre à cinq motifs répétés et sont obtenus par « screening » de banques combinatoires.
Par marqueur, on entend, notamment, toute molécule contenant un groupement réactif avec un groupement du partenaire de liaison, directement sans modification chimique, ou après modification chimique pour inclure un tel groupement, laquelle molécule est capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs de détection directe consiste en :
les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêta-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants,
32 35 125
• les molécules radioactives comme le JZP, le JJS ou le
les molécules fluorescentes telles que les Alexa ou les phycocyanines, et les sels électrochimiluminescents tels que des dérivés organo- métalliques à base d'acridinium ou de ruthénium. Des systèmes indirects de détection peuvent aussi être utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. Le ligand correspond alors au marqueur pour constituer, avec le partenaire de liaison, le conjugué.
Les couples ligand/anti- ligand sont bien connus de l'Homme du Métier, ce qui est le cas par exemple des couples suivants : biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide.
L'anti-ligand peut alors être détectable directement par les marqueurs de détection directe décrits précédemment ou être lui-même détectable par un autre couple ligand/anti- ligand, et ainsi de suite.
Ces systèmes indirects de détection peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'Homme du Métier, et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR 2781802 ou WO 95/08000 de la Demanderesse.
Selon le type de marquage utilisé, l'Homme du Métier ajoutera des réactifs permettant la visualisation du marquage ou l'émission d'un signal détectable par tout type d'appareil de mesure approprié, comme par exemple un spectrophotomètre, un spectrofluorimètre, un densitomètre ou encore une caméra haute définition.
L'étape de test de contrôle de la validité de l'immunoessai est telle que décrite précédemment.
Le test d'immunoessai i) et le test de contrôle ii) peuvent être mis en œuvre dans n'importe quel ordre, simultanément ou successivement, sur le même support solide ou non.
La lecture du test d'immunoessai est également une étape largement connue de l'Homme du Métier qui dépend du test utilisé.
Enfin, la dernière étape consiste en la détermination de la présence dudit analyte dans l'échantillon de test lorsque le signal obtenu par le test d'immunoessai de l'étape i est supérieur au seuil de détection du test d'immunoessai. Cette étape est également largement connue de l'Homme du Métier.
Outre la détection, les composés de l'invention sont également appropriés pour la quantification d' analyte dans un échantillon de test. Ainsi un autre objet de l'invention concerne un procédé de quantification d'un analyte par immunoessai dans un échantillon de test susceptible de contenir ledit analyte, comprenant
i. un test d'immunoessai par mise en contact dudit échantillon de test avec un ou plusieurs partenaires de liaison à Γ analyte,
ii. un test de contrôle de la validité du test d'immunoessai par mise en contact d'un contrôle positif avec lesdits un ou plusieurs partenaires de liaison à Γ analyte,
iii. la lecture du test d'immunoessai si le test de contrôle de validité est positif, et
iv. la détermination de la quantité dudit analyte dans l'échantillon de test par comparaison du signal du test d'immunoessai avec une courbe étalon préalablement obtenue en utilisant d'un composé biépitopique de formule (I) tel que défini précédemment ou une composition telle que définie précédemment.
Les étapes du procédé de quantification sont telles que définies précédemment. En particulier, le test d'immunoessai i) et le test de contrôle ii) peuvent être mis en œuvre dans n'importe quel ordre, simultanément ou successivement, sur le même support solide ou non.
Dans ce procédé de quantification, le contrôle positif peut être tout composé utile en tant que contrôle, lequel a une réactivité antigénique comparable à Γ analyte dans l'immunoessai utilisé. Selon un mode de réalisation, le contrôle positif est un composé biépitopique ou une composition tels que décrits précédemment.
La courbe étalon est préparée avec le composé ou la composition de l'invention. Néanmoins, toute autre solution étalon appropriée peut être utilisée. Ainsi, un autre objet de l'invention concerne un procédé de quantification d'un analyte par immunoessai dans un échantillon de test susceptible de contenir ledit analyte comprenant
i. un test d'immunoessai par mise en contact dudit échantillon de test avec un ou plusieurs partenaires de liaison à Γ analyte,
ii. un test de contrôle de la validité du test d'immunoessai par mise en contact d'un composé biépitopique de formule I tel que défini précédemment ou une composition telle que définie précédemment, à titre de contrôle positif, avec lesdits un ou plusieurs partenaires de liaison à l'analyte,
iii. la lecture du test d'immunoessai si le test de contrôle de validité est positif, et
iv. la détermination de la quantité dudit analyte dans l'échantillon de test par comparaison du signal du test d'immunoessai avec une courbe étalon.
Les mêmes caractéristiques et préférences décrites précédemment, notamment quant au choix des composés particuliers et des analytes, aux différentes étapes de l'immunoessai s'appliquent également aux procédés de détection et quantification de l'invention.
En particulier, dans tous ces procédés, de détection et de quantification, l'analyte peut être la troponine I cardiaque ou la proDéfensine-A6.
Les procédés d'immunoessai de l'invention impliquent la mise en œuvre de trousses de diagnostic comprenant les composés ou compositions de l'invention, ce qui constitue un autre objet de l'invention.
Outre les composés ou compositions de l'invention tels que décrits ci-dessus, les trousses selon l'invention peuvent également contenir les composés nécessaires à la mise en œuvre d'un procédé pour la détection ou quantification par immunoessai de la présence d'un analyte d'intérêt, par exemple par immunoessai type « sandwich », tels que les partenaires de liaison et tous les composés nécessaires pour la mise en évidence de la réaction entre le ou les partenaires de liaison et l'analyte d'intérêt.
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants qui sont donnés à titre illustratif et non limitatif, ainsi qu'à l'aide des figures, dans lesquelles :
- la Figure 1 est un graphique donnant le signal de fluorescence RFV, déterminé par l'automate VIDAS®, émis par un composé biépitopique selon l'art antérieur (Composé REF), un composé biépitopique selon l'invention (Composé 1) et un peptide biépitopique correspondant au composé biépitopique 1 de l'invention, mais non couplé à une molécule support (Peptide 1 non couplé), en fonction de leur concentration ;
- la Figure 2 est un graphique donnant le signal de fluorescence RFV, déterminé par l'automate VIDAS®, émis par le composé biépitopique selon l'art antérieur (Composé REF) et des composés biépitopiques selon l'invention (Composés 1 et 3), en fonction de leur concentration.
- la Figure 3 est un graphique donnant le signal de fluorescence RFV, déterminé par l'automate VIDAS®, émis par le composé biépitopique selon l'art antérieur (Composé REF) et des composés biépitopiques selon l'invention (Composés 1 et 4), en fonction de leur concentration.
EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse des peptides
Les synthèses peptidiques ont été réalisées en utilisant soit le synthétiseur ABI 433A d'Applied Biosystems (Foster City, CA, Etats-Unis), soit le synthétiseur Liberty de CEM Corporation (Matthews, NC, Etats-Unis). La résine Rink Amide MBHA (Cat. No. 855003, Novabiochem®, Merck Millipore, Molsheim, France) a été utilisée en tant que support solide polymérique.
En fin de synthèse chimique, les peptides ont été déprotégés et clivés du polymère en présence d'un mélange d'acide trifluoroacétique-éthanedithiol- triisopropylsilane-eau (94/2,5/1/2,5 V/V/V/V) pendant environ 2 heures. Après élimination du polymère par filtration, les peptides ont été isolés par précipitation dans de l'éther diéthylique à 0°C.
Afin d'augmenter leur degré de pureté, les peptides ont été purifiés par chromatographie liquide haute performance (HPLC) préparative en phase inverse sur une colonne VYNAC DENALI™ 120Â C18, 10 μιη (Mandel Scientific Company Inc., Guelph, Ontario, Canada). Chaque peptide a été élué par un gradient en paliers d'acétonitrile (de 0 à 95%) en solution aqueuse contenant 0,1% d'acide trifluoroacétique, le pourcentage d'acétonitrile des paliers ayant été choisi de manière à optimiser l'isolement du pic qui correspond au peptide d'intérêt. Après cette étape finale, deux différentes techniques d'analyse ont été mises en œuvre afin de contrôler et de caractériser les peptides obtenus.
Pour chaque peptide, un profil d'HPLC analytique a été généré sur une colonne de phase inverse Chromo lith® High Resolution RP-18 encapped (Merck Millipore, Molsheim, France). L'élution a été effectuée par un gradient linéaire d'acétonitrile (de 0 à 100%) en solution aqueuse contenant 0,1 % d'acide trifluoroacétique et suivie par mesure de l'absorbance à 214 nm. Cette analyse permet de déterminer le niveau de pureté du peptide.
Chaque peptide a également été analysé en chromatographie liquide- spectrométrie de masse (LC/MS) sur une colonne ZORBAX Eclipse Plus Cl 8 R HD 2, 1 X 50 mm, taille de particule 1 ,8μιη (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Etats- Unis) couplé à un spectromètre de masse Q-TOF LC/MS 6540UHD Accurate-Mass (Agilent Technologies). Cette analyse permet de déterminer la masse molaire du peptide.
Les séquences des peptides synthétisés ainsi que les résultats de caractérisation sont présentés dans le Tableau 1.
Tableau 1. Séquences et caractéristiques des peptides synthétisés.
Figure imgf000029_0001
L'abréviation Tnl correspond à Troponine I cardiaque et PDEF-A6 à la proDéfensine-A6. L'abréviation Ado correspond à l'acide 8-amino-3,6- dioxaoctanoïque (No CAS : 134978-97-5). Tableau 2. Récapitulatif des composés biépitopiques selon l'invention obtenus (formule I) et testés en immunoréactivité.
. | lîi *is liras Molécule
1 demi rhinl Anah tc Kpitopc K l Kpilop* 1:1
Y support
Composé 1 Tnl ATEPHAKKK AGLGF AELQDL (Ado)2 (Ado)2 BSA
Composé 2 Tnl KISASRKLQLKT AGLGF AELQDL (Ado)2 (Ado)2 BSA
Composé 3 Tnl ATEPHAKKK AGLGF AELQDL (Ado)2 (Ado)2 IgG
Composé 4 Tnl ATEPHAKKK AGLGF AELQDL GGGS SGGG BSA
PDFF-
Composé 5 A6 QAEDDPLQAK WTGVL .SPTQEYR (Ado)2 (Ado)2 BSA
L'abréviation Tnl correspond à Troponine I cardiaque et PDEFA6 à la proDéfensine-A6. L'abréviation Ado correspond à l'acide 8-amino-3,6- dioxaoctanoïque (No CAS : 134978-97-5). L'abréviation BSA correspond à l'Albumine Sérique Bovine. L'IgG est l'immunoglobuline G de lapin.
Exemple 2 : Préparation des composés biépitopiques
Les composés biépitopiques ont été obtenus en réalisant des couplages covalents entre les peptides obtenus dans l'Exemple 1 d'une part et des molécules support de l'autre. Le Tableau 2 présente de manière détaillée les différents composés biépitopiques selon l'invention préparés. Tous ces composés satisfont la formule I. Le Tableau 3 quant à lui récapitule l'ensemble des couplages effectués, en précisant les couples peptide et molécule support.
Le mode opératoire des couplages est le suivant :
Dans un premier temps, la protéine choisie en tant que molécule support a été activée en présence d'un excès de Sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidyl-4-(N- maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate, No. CAS : 92921-24-9, Cat. No. 22322, Pierce, Thermo Scientifïc, Villebon sur Yvette, France). Pour l'Albumine Sérique Bovine (BSA, Proliant Health & Biologicals, Ankeny, IA, Etats-Unis), nous avons choisi un ratio molaire de BSA/SMCC de 1/20. Ainsi, la BSA a été diluée à 10 mg/mL en PBS pH 7,2 (phosphate buffered saline) et 53 d'une solution de sulfo-SMCC à 25 mg/mL en eau, préparée extemporanément, a été ajoutée goutte à goutte. Après une incubation de 1 heure ± 5 minutes à 30°C ± 2°C au bain-marie, sous agitation magnétique douce, la BSA-SMCC a été dialysée contre un tampon phosphate 50 mM, NaCl 150 mM pH 6,8 dans un boyau de dialyse ayant un seuil de coupure de 12 à 14 kDa. La dialyse a été effectuée à température ambiante et le bain de dialyse a été changé toutes les heures, 3 fois. Après la dialyse, la concentration en protéine de la solution de BSA-SMCC a été déterminée par mesure de l'absorbance à 280 nm et cette concentration a été ajustée à 5 mg/mL en un tampon phosphate 50 mM, NaCl 150 mM pH 6,8. Cette étape permet la modification de la surface de la molécule support qui porte dorénavant plusieurs groupements réactifs de type maleimide.
Le peptide à coupler a été dissous à 5 mg/mL en tampon phosphate 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM pH 6,8, en tenant compte de la pureté. Nous avons choisi un ratio molaire de BSA/peptide de 1/10. Ainsi, 2,35 mg de BSA-SMCC à une concentration de 5 mg/mL (0,47 mL) ont été ajoutés à 1 mg de peptide à une concentration de 5 mg/mL (200 μί). Ce mélange a été incubé 16 heures minimum à 2/8°C sur une roue. La réaction a ensuite été bloquée par addition de 0,1 M de 2- mercaptoéthylamine (No. CAS : 60-23-1, cystéamine) en tampon phosphate 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6,8, préparé extemporanément. Après incubation 20 ± 5 minutes sur roue à la température du laboratoire, le conjugué peptide-BSA a été mis en dialyse contre un tampon PBS pH 7,2 dans un boyau de dialyse ayant un seuil de coupure de 12 à 14 kDa. La dialyse a été poursuivie 16 heures minimum à 2/8°C. Après la dialyse, la concentration en protéine a été ajustée à 2 mg/mL théorique en BSA en tampon PBS pH 7,2. La concentration du conjugué peptide-BSA a ensuite été déterminée par mesure de l'absorbance à 280 nm. Cette étape permet la réaction entre les groupements maleimide et les groupements sulfhydryl (-SH) du peptide, au niveau de la cystéine terminale ou médiane selon la séquence peptidique à coupler, afin de former des liaisons thioethers.
Les composés 1, 2, 4 et 5 ont tous été obtenus en appliquant le mode opératoire décrit ci-dessus. Pour le composé REF, qui correspond au composé biépitopique tel que décrit dans le brevet US 6 114 180, le même mode opératoire a également été appliqué sauf que 2 peptides (peptide 2 et peptide 3) ont été mis en présence de BSA-SMCC simultanément et chaque peptide a été couplé à un ratio molaire théorique BSA/peptide de 1/10. Pour le composé 3, le peptide 1 a été couplé à l'immunoglobuline G polyclonal de lapin (bioMérieux). Le mode opératoire a été identique, sauf que la BSA a été remplacée par une autre molécule support. Le ratio molaire théorique molécule support/peptide a été de 1/10.
Tableau 3. Récapitulatif des couplages peptide - molécule support.
Figure imgf000032_0001
Exemple 3 : Etude de l'immunoréactivité du composé biépitopique 1 selon l'invention
L'étude du caractère biépitopique des composés a été réalisée grâce à un immunodosage de la Troponine I cardiaque en utilisant l'automate d'immunoanalyse VIDAS® (bioMérieux). Le cône à usage unique sert à la fois de phase solide pour la réaction et de système de pipetage. La cartouche est composée de 10 puits (X0 à X9 recouverts d'une feuille d'aluminium scellée et étiquetée. Le premier puits (X0) comporte une partie prédécoupée pour faciliter l'introduction de l'échantillon. Le dernier puits (X9) est une cuvette optique dans laquelle la fluorescence du substrat est mesurée. Les différents réactifs nécessaires à l'analyse sont contenus dans les puits intermédiaires. Toutes les étapes du test sont réalisées automatiquement par l'instrument. Elles sont constituées d'une succession de cycles d'aspiration/refoulement du milieu réactionnel. L' immunodosage de la Troponine I cardiaque a été réalisé par un test sandwich en une étape.
a) Sensibilisation et passivation des cônes
Les caractéristiques et les fournisseurs des anticorps utilisés sont présentés dans le Tableau 4. Les cônes ont été sensibilisés avec 300 d'une solution des anticorps monoclonaux 19C7 et B90 dilués chacun à 2,5 μg/mL dans un tampon PBS pH 6,2. Après environ 20h d'incubation à +18/25°C avec la solution de sensibilisation, les cônes ont été vidés. Ensuite, 300 de cette même solution contenant 10 g/L d'albumine bovine sont ajoutés. La passivation se poursuit à +18/25°C sur la nuit. Les cônes sont vidés, séchés, puis conservés à +4°C jusqu'à utilisation, à l'abri de l'humidité.
Tableau 4. Anticorps utilisés pour l'immunodosage de la Troponine I cardiaque.
Figure imgf000033_0001
l'abréviation TnC correspond à la troponine C cardiaque. L'abréviation Cat. No. correspond à la référence catalogue du fournisseur. b) Mode opératoire de l'immunodosage
Les composés à tester ont été dilués dans un tampon PBS-BSA à différentes concentrations et dosés comme échantillon.
Dès que le cône VIDAS® est en contact avec l'échantillon, la réaction immunologique commence car les anticorps de capture sont immobilisés sur ce cône. L'automate mélange l'échantillon à tester (135 μί) avec 270 de la solution de conjugué. Cette solution contient les 2 anticorps monoclonaux, le 3D5F7 et le 7B9, sous forme de fragments Fab' couplés à la phosphatase alcaline. Ces conjugués ont été dilués à environ 0,75 μg/mL dans un tampon phosphate 100 mM pH 6,4 contenant aussi 150 mM de NaCl et des protéines de charge.
L'incubation dure 6,8 minutes à 37°C et permet la liaison spécifique de la Troponine I cardiaque, ou des composés biépitopiques Tnl cardiaque, ou des peptides Tnl cardiaque, aux anticorps adsorbés sur le cône d'une part et aux conjugués de l'autre. Ensuite, les composants non liés sont éliminés par 3 lavages avec un tampon Tris 200 mM H 7,8, NaCl 300 mM, Triton X-100 0,2%. Lors de l'étape finale de révélation, le substrat 4-méthylombelliferyl phosphate est aspiré puis refoulé dans le cône ; l'enzyme du conjugué catalyse la réaction d'hydrolyse de ce substrat en 4- méthylombelliferone dont la fluorescence émise est mesurée à 450 nm. La valeur du signal de fluorescence (RFV=relative fluorescence value) est proportionnelle à la concentration de l'antigène présent dans l'échantillon.
Le Tableau 5 récapitule les signaux de fluorescence (RFV=relative fluorescence value) déterminés par l'automate VIDAS® lorsque l'on compare l'immunoréactivité du composé biépitopique REF (l'art antérieur), du composé biépitopique 1 selon l'invention et du peptide 1 non couplé (Exemple 1). La Figure 1 représente ces mêmes données sous forme de graphique. Pour rappel, le peptide 1 comprend 2 épitopes de la Tnl cardiaque, l'un reconnu par l'anticorps de capture B90 de l'immunodosage décrit précédemment, et l'autre par l'anticorps de détection 3D5F7. Dans le composé 1 selon l'invention le peptide 1 est couplé via la cystéine médiane sur la BSA afin d'en assurer une meilleure présentation antigénique et une stabilité améliorée. Le composé REF présente les 2 mêmes épitopes de la Tnl couplés également sur la BSA. A la différence du composé 1, chacun des 2 épitopes est sous forme d'un peptide individuel (peptides 2 et 3) qui a été couplé à la BSA au niveau de la cystéine terminale. Le composé 1, le composé REF, qui correspond à un composé biépitopique tel que décrit dans le brevet US 6 114 180, et le peptide 1, qui correspond à un composé synthétique biépitopique tel que décrit dans la demande de brevet W098/24816, sont tous réactifs dans l'immunodosage de la Tnl cardiaque mais leurs niveaux de réactivité sont très différents. Ainsi, pour obtenir un signal d'environ 1000 RFV, il faut 21 μΜ du composé 1 contre 1118 μΜ du composé REF, soit environ 50 fois moins. Le composé 1 présente donc une bien meilleure immunoréactivité que le composé REF. Par ailleurs, la bonne dynamique du signal VIDAS® obtenue avec le composé 1 n'est pas reproduite avec le composé REF, même en testant des concentrations bien plus importantes de ce composé. Le peptide 1 non couplé est beaucoup moins bien reconnu que les deux composés biépitopiques couplés sur la BSA. Tableau 5. Immunoréactivité des composés biépitopiques 1, 3, 4, REF et du peptide 1 Tnl cardiaque.
Figure imgf000035_0001
L'abréviation [c] correspond à la concentration en μΜ du composé. L'abréviation S correspond au signal en RFV.
Exemple 4 : Comparaison de l'immunoréactivité des composés biépitopiques selon l'invention utilisant différentes molécules supports
Dans cet exemple, le peptide 1 qui comporte 2 épitopes différents de la Tnl cardiaque a été couplé sur 2 molécules supports différentes: la BSA (composé 1) et l'immunoglobuline G de lapin (composé 3). L'obtention de ces composés biépitopiques est décrite dans l'Exemple 2. La comparaison de l'immunoréactivité de ces composés dans l'immunodosage de la Tnl cardiaque a été effectuée comme décrite dans l'Exemple 3 et les résultats sont présentés dans le Tableau 5 ci-dessus et la Figure 2, laquelle représente un graphique donnant les signaux de fluorescence RFV émis par les différents composés, composé biépitopique selon l'art antérieur (Composé REF) et composés biépitopiques selon l'invention (Composés 1 et 3), en fonction de leur concentration. Les résultats montrent que les composés 1 et 3 sont tous deux réactifs dans l'immunodosage de la Tnl cardiaque et présentent une réactivité comparable, largement supérieure à celle observée pour le composé REF.
Exemple 5 : Comparaison de l'immunoréactivité des composés biépitopiques selon l'invention utilisant différents bras d'espacement
Dans cet exemple, les composés biépitopiques comparés ne diffèrent qu'au niveau du bras d'espacement. Dans le cas du composé 1, les deux bras d'espacement sont identiques, il s'agit d'un dimère de l'acide aminé artificiel Ado. Le composé 4, quant à lui, comporte la séquence GGGS en tant que bras X et la séquence SGGG en tant que bras Y. Pour rappel, les deux composés présentent 2 épitopes de la Tnl cardiaque et la molécule support est la BSA. L'obtention de ces composés biépitopiques est décrite dans l'Exemple 2. La comparaison de l'immunoréactivité de ces composés dans l'immunodosage de la Tnl cardiaque a été effectuée comme décrite dans l'Exemple 3 et les résultats sont présentés dans le Tableau 5 ci-dessus et la Figure 3, laquelle représente un graphique donnant les signaux de fluorescence RFV émis par les différents composés, composé biépitopique selon l'art antérieur (Composé REF) et composés biépitopiques selon l'invention (Composés 1 et 4), en fonction de leur concentration. Les résultats montrent que le composé 4 comportant des bras GGGS et SGGG est moins bien reconnu que le composé 1 comportant des bras (Ado) mais est bien supérieur au composé REF.
Exemple 6 : Tests de stabilité
Les composés 1 et 2 ont été dilués à 3,75 ng/mL dans les différents tampons indiqués dans le Tableau 6. Un premier dosage a été effectué à J0, le jour de la préparation des solutions. Les valeurs obtenues ont servi de référence pour le suivi des stabilités. Les solutions diluées des composés biépitopiques ont été conservés à +2/8°C et dosées à J7 (7eme jour après la préparation. Le Tableau 6 ci-dessous présente la variation du signal RFV de l'immunodosage entre J0 et J7 (Signal J7 / Signal J0 x 100). Les composés 1 et 2 sont stables et leurs propriétés antigéniques sont préservées lorsqu'ils sont conservés à +2/8°C pendant 1 semaine.
Tableau 6. Stabilité des composés 1 et 2 à +2/8°C pendant 7 jours.
Figure imgf000037_0001
Dans un deuxième temps, une étude de stabilité de plus longue durée a été réalisée pour le composé 1 uniquement, dilué en PBS pH 6,2, BSA 50 g/L. Conservé à +2/8°C, le composé 1 est stable en solution diluée : 97% du signal de l'immunodosage est retrouvé à 1 mois de conservation, 94% à 3 mois et 90%> à 6 mois. Conservé à +18/25°C, le composé 1 est stable en solution diluée pendant environ 1 mois (88% du signal est retrouvé). Il est également important de noter que le composé 1 est capable de supporter au moins 3 cycles de congélation / décongélation à -20°C sans aucune dégradation de ses propriétés antigéniques. Nous n'avons pas testé un nombre plus important de cycles de congélation / décongélation.
L'ensemble de ces résultats démontre l'excellente stabilité des solutions du composé 1 selon l'invention.
Exemple 7 : Etude de l'immunoréactivité du composé biépitopique 5 selon l'invention comprenant un mimotope
Le composé biépitopique 5 a été conçu pour fonctionner en tant que contrôle et/ou étalon et/ou ajusteur lors d'un immunodosage de la Prodéfensine A6. Le composé 5 associe un épitope linéaire (QAEDDPLQAKL) et un mimotope (WTGVLSPTQEYR). L'immunodosage de la Prodéfensine A6 a été réalisée en utilisant l'automate d'immunoanalyse VIDAS® (bioMérieux), en suivant le protocole décrit dans la demande WO2010/112777, à savoir en utilisant, comme anticorps de capture, le clone 12H4E1 (bioMérieux), lequel reconnaît l'épitope minimal linéaire de séquence EDDPLQ, et, comme anticorps de détection, le clone 1H8C9 (bioMérieux), dont l'épitope n'est pas linéaire mais est un mimotope de séquence WTGVLSPTQEYR. Ces épitope/mimotope sont ceux retrouvés dans le composé 5.
Le Tableau 7 ci-dessous récapitule les signaux de fluorescence (RFV=relative fluorescence value) déterminés par l'automate VIDAS® lorsque l'on teste différentes concentrations du composé 5 (masse molaire moléculaire : 98155 Daltons). Le composé 5 est bien réactif dans l'immunodosage de la Prodéfensine A6.
Tableau 7. Immunoréactivité du composé biépitopique 5.
Figure imgf000038_0001
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Claims

REVENDICATIONS
1. Composé biépitopique de formule (I) :
E1 - X - Z - Y - E2
Molécule support (I) dans laquelle :
El et E2, identiques ou différents, représentent chacun indépendamment une séquence peptidique comprenant au moins un épitope d'un analyte; et
X et Y, identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un bras de liaison,
la molécule support est so lubie et
Z représente un dérivé d'acide aminé porteur d'une fonction thiol avant sa liaison avec la molécule support.
2. Composé biépitopique de formule (I) selon la revendication 1, dans lequel les bras de liaison X et Y sont des dérivés d'acides aminés formant chacun deux liaisons peptidiques -CO-NH-, l'une avec El ou E2 et l'autre avec Z.
3. Composé biépitopique de formule (I) selon la revendication 2, dans lequel les bras de liaison X et Y, identiques ou différents, comprennent chacun indépendamment un ou plusieurs dérivés d'acides aminés.
4. Composé biépitopique de formule (I) selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel Z est choisi parmi un dérivé de cystéine, un dérivé d'homocystéine et un dérivé de pénicillamine.
5. Composé biépitopique de formule (I) selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la molécule support est une protéine dont le poids moléculaire est compris entre 20 kDa et 700 kDa, de préférence entre 60 kDa et 250 kDa.
6. Composé biépitopique de formule (I) selon la revendication 5, dans lequel la molécule support est l'Albumine Sérique Bovine.
7. Composé biépitopique de formule (I) selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel El et E2 sont des séquences peptidiques comprenant au moins un épitope de la troponine I cardiaque ou de la proDéfensine-A6.
8. Composition contenant un composé biépitopique de formule (I) tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 en solution dans l'eau, dans un tampon ou dans un fluide biologique.
9. Utilisation d'un composé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une composition telle que définie dans la revendication 8 comme contrôle ou étalon dans un immunoessai.
10. Utilisation d'un composé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une composition telle que définie dans la revendication 8 comme contrôle ou étalon dans un immunoessai de la troponine I cardiaque ou de la proDéfensine-A6.
11. Procédé de détection d'un analyte par immunoessai dans un échantillon de test susceptible de contenir ledit analyte comprenant
i. un test d'immunoessai par mise en contact dudit échantillon de test avec un ou plusieurs partenaires de liaison à Γ analyte,
ii. un test de contrôle de la validité du test d'immunoessai par mise en contact d'un composé biépitopique de formule (I) tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une composition telle que définie dans la revendication 8, à titre de contrôle positif, avec lesdits un ou plusieurs partenaires de liaison à l'analyte, iii. la lecture du test d'immunoessai si le test de contrôle de validité est positif, iv. la détermination de la présence dudit analyte dans l'échantillon de test lorsque le signal obtenu par le test d'immunoessai de l'étape i est supérieur au seuil de détection du test d'immunoessai.
12. Procédé de détection d'un analyte par immunoessai selon la revendication 11, dans lequel Γ analyte est la troponine I cardiaque ou la proDéfensine-A6.
13. Procédé de quantification d'un analyte par immunoessai dans un échantillon de test susceptible de contenir ledit analyte comprenant
i. un test d'immunoessai par mise en contact dudit échantillon de test avec un ou plusieurs partenaires de liaison à l'analyte,
ii. un test de contrôle de la validité de l'immunoessai par mise en contact d'un contrôle positif avec lesdits un ou plusieurs partenaires de liaison à l'analyte, iii. la lecture du test d'immunoessai si le test de contrôle de validité est positif, et
iv. la détermination de la quantité dudit analyte dans l'échantillon de test par comparaison du signal du test d'immunoessai avec une courbe étalon préalablement obtenue en utilisant d'un composé biépitopique de formule (I) tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou une composition telle que définie dans la revendication 8.
14. Procédé de quantification par immunoessai selon la revendication 13, dans lequel le contrôle positif est un composé biépitopique de formule I tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou une composition telle que définie dans la revendication 8.
15. Procédé de quantification d'un analyte par immunoessai dans un échantillon de test susceptible de contenir ledit analyte comprenant
i. un test d'immunoessai par mise en contact dudit échantillon de test avec un ou plusieurs partenaires de liaison à l'analyte,
ii. un test de contrôle de la validité du test d'immunoessai par mise en contact d'un d'un composé biépitopique de formule (I) tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou une composition telle que définie dans la revendication 8, à titre de contrôle positif, avec lesdits un ou plusieurs partenaires de liaison à Panalyte,
iii. la lecture du test d'immunoessai si le test de contrôle de validité est positif, et
iv. la détermination de la quantité dudit analyte dans l'échantillon de test par comparaison du signal du test d'immunoessai avec une courbe étalon.
16. Procédé de quantification par immunoessai selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, dans lequel Γ analyte est la troponine I cardiaque ou la proDéfensine-A6.
17. Trousse pour la mise en œuvre d'un immunoessai comprenant un composé biépitopique de formule I, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou une composition telle que définie dans la revendication 8.
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