FR3030758A1 - Marqueurs diagnostiques de la maladie de crohn - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des marqueurs de la maladie de Crohn ainsi que des composés particuliers permettant la détection desdits marqueurs. L'invention concerne également des méthodes de détection, de diagnostic et de suivi de l'évolution de la maladie de Crohn ainsi que des méthodes d'évaluation de l'efficacité d'un traitement dirigé contre cette maladie, et les compositions et kits utilisables pour la mise en œuvre de ces méthodes.

Description

MARQUEURS DIAGNOSTIQUES DE LA MALADIE DE CROHN L'invention relève du domaine de la médecine et concerne plus particulièrement le diagnostic de la maladie de Crohn. Elle identifie pour la première fois des marqueurs spécifiques de la maladie de Crohn au sein des Maladies Inflammatoires de l'Intestin (MICI) ainsi que des composés particuliers permettant leur détection. L'invention concerne également des méthodes de détection, de diagnostic et de suivi de l'évolution de la maladie de Crohn ainsi que des méthodes d'évaluation de l'efficacité d'un traitement dirigé contre cette maladie, et les compositions diagnostiques et kits utilisables pour la mise en oeuvre de ces méthodes.

ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (ou MICI) englobent la maladie de Crohn et la recto-colite hémorragique, deux maladies qui se caractérisent par l'inflammation de la paroi d'une partie du tube digestif, liée à une hyperactivité du système immunitaire digestif. La Maladie de Crohn est une MICI pouvant atteindre n'importe quel segment du tractus digestif, depuis la bouche jusqu'à l'anus. Cette pathologie peut affecter l'intestin, et plus particulièrement l'iléon terminal (iléite) et le colon droit (colite), et peut s'accompagner de manifestations extra-intestinales (articulaires, cutanées, oculaires, etc.). Toutes les couches de la paroi intestinale, de la muqueuse à la séreuse, peuvent alors être atteintes. La maladie de Crohn peut apparaître à n'importe quel âge de la vie, y compris chez le jeune enfant, avec cependant la plus forte incidence dans la deuxième ou troisième décennie de vie, et une tendance vers un plus grand nombre de patients de sexe féminin. La maladie de Crohn va évoluer pendant toute la vie avec des poussées inflammatoires dont la fréquence, l'intensité et la durée sont imprévisibles et très variables d'un patient à l'autre. La maladie de Crohn affecte la qualité de vie, appelle des traitements personnalisés contraignants et coûteux mais malheureusement jamais curatifs et souvent associés à des effets indésirables qui contribuent à la dégradation de la qualité de vie. Les périodes d'hospitalisation peuvent être fréquentes et près de 80% des patients auront un jour recours à la chirurgie. Seulement moins de 5% d'entre eux seront indemnes de lésions endoscopiques dix ans après l'opération (Peyrin-Biroulet et al, 2010). Selon de récentes méta-analyses d'épidémiologie, le risque relatif de cancers colorectaux et de l'intestin grêle ainsi que le risque de mortalité, ajustés selon l'âge, sont significativement augmentés chez les sujets affectés par la maladie de Crohn. Le coût pour le système de santé de la prise en charge des patients atteints de maladie de Crohn en Europe est estimé à 3 milliards d'euros, excluant les traitements biologiques et les coûts indirects (Juillerat et al , 2010). L'étiologie de la maladie de Crohn demeure obscure et il n'existe pas de règles de prévention reconnues, en dehors de l'élimination du tabac (Johnson et al, 2005). Cependant, les études mettent en cause une susceptibilité génétique (Mathew et al, 2008 ; Cho 2008 ; Cleynen et al, 2013), des facteurs environnementaux (Carbonnel et al, 2009), et des altérations du microbiote intestinal (Seksik et al, 2003 ; Mangin et al, 2004; Manichanh et al, 2006; Kleessen et al, 2002; Scanlan et al, 2006 et Gophna et al, 2006) associées à une activation du système immunitaire muqueux intestinal inappropriée (Laroux et al, 2001 ; Artis, 2008 ; Landers et al, 2002). Aujourd'hui, le diagnostic de la maladie de Crohn est très difficile à poser car il n'existe aucun symptôme spécifique de la maladie mais des manifestations communes avec d'autres affections telles que la rectocolite hémorragique en particulier mais également les affections du tractus gastro-intestinal, simple gastroentérite, syndrome de l'intestin irritable ou colite infectieuse. L'ensemble de ces troubles intestinaux, qui touchent 10 à 20 % de la population, font l'objet d'un très grand nombre de consultations, et représentent en conséquence un véritable défi pour le praticien quant à leurs causes. Or, il existe un véritable besoin d'identifier spécifiquement les patients souffrant de la maladie de Crohn afin de les soumettre dès que possible à un traitement thérapeutique adapté qui pourrait leur permettre d'éviter l'intervention chirurgicale souvent nécessaire. A ce jour, et en l'absence de distinction possible, une démarche pragmatique est adoptée avec en première instance une antibiothérapie, et en deuxième instance l'introduction des traitements majeurs (immunosuppresseurs, biothérapie) et la mise en oeuvre d'examens complémentaires invasifs. A défaut de pouvoir guérir, les traitements (dérivés salicylés, corticoïdes à action systémique ou topique, immunosuppresseurs et plus récemment les traitements biologiques anti-TNF a) permettent d'espacer les poussées inflammatoires et d'abaisser le niveau des symptômes ressentis. Mais ces traitements immunosuppresseurs et biologiques ne sont pas anodins, d'autant qu'ils sont le plus souvent pris de manière prolongée par des sujets jeunes. L'utilisation de thiopurines (immunosuppresseurs) est notamment associée à une augmentation franche du risque de cancers cutanés non mélanomes et de lymphomes (Beaugerie et al, 2009 ; Peyrin-Biroulet et al, 2011; Sokol et al, 2009). Les risques à long terme des traitements biologiques sont encore mal connus. La mise à disposition d'un test diagnostique efficace, notamment précoce, permettrait aux patients d'être pris en charge dès le début de la maladie, limitant ainsi les risques de complications sévères et de lésions irréversibles. Ainsi, lorsque la maladie de Crohn est détectée chez l'enfant ou l'adolescent, la prise en charge initiale peut être simplement nutritionnelle. Un exemple d'aliment diététique à usage médical employé dans ce contexte est le Modulen® (aliment complet buvable comportant notamment du TGF beta régulateur de la réponse immunitaire). Certains patients répondent très bien aux traitements mis en place très tôt dans la vie et peuvent être ainsi mis en rémission pour des années. 11 n'existe actuellement aucun marqueur robuste et spécifique de la maladie de Crohn, susceptible de permettre d'établir un diagnostic de cette pathologie ou de suivre son évolution. Le diagnostic de la maladie de Crohn repose aujourd'hui sur un faisceau d'arguments cliniques (signes digestifs, généraux et autres manifestations) et paracliniques (biologie, examens endoscopiques et autres), certains patients pouvant attendre des années avant de mettre un nom sur leur maladie. Ainsi, le délai moyen entre les premières manifestations et la première consultation est de 5 mois, avec un diagnostic posé au bout de 2,6 ans en moyenne. Pourtant, le diagnostic précoce de la maladie de Crohn revêt une importance majeure puisqu'en agissant suffisamment tôt, il est possible de freiner le développement de lésions potentiellement irréversibles (Colombel et al, 2010). A l'inverse, il serait fortement souhaitable de pouvoir exclure de manière fiable et rapide, typiquement dès la première consultation, l'existence de la maladie de Crohn afin d'éviter des examens et des traitements lourds, coûteux, contraignants, inutiles et souvent associées à des effets indésirables. 11 existe de plus un véritable besoin de suivi des patients afin d'évaluer l'amélioration ou encore l'aggravation de la maladie et d'ajuster dès lors les traitements le plus finement possible.

Les inventeurs satisfont à ce besoin grâce à la présente invention et aux marqueurs identifiés dans le présent texte qui permettent de diagnostiquer de manière spécifique la maladie de Crohn, typiquement de distinguer cette maladie de la recto-colite hémorragique, chez un sujet tout en s'affranchissant d'examens cliniques et paracliniques lourds ou invasifs.

RESUME DE L'INVENTION Les inventeurs décrivent des marqueurs permettant de diagnostiquer, pour la première fois de manière fiable, la maladie de Crohn, ainsi que les outils adaptés à la détection desdits marqueurs. Les inventeurs ont pu mettre en évidence l'absence ou la présence en quantité anormalement basse de ces marqueurs dans le système digestif des patients atteints de la maladie de Crohn en période de rémission ou en dehors de poussées inflammatoires. Parmi les marqueurs d'intérêt identifiés, des marqueurs préférés, d'origine bactérienne, correspondent aux séquences d'acides aminés SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et fragments desdites séquences d'acides aminés, ainsi qu'aux séquences d'acide nucléique codant lesdites séquences d'acides aminés et fragments desdites séquences. Sont ainsi décrits dans le présent texte un composé liant tout ou partie d'une bactérie exprimant une séquence peptidique comprenant une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et un fragment de celles-ci, ou comprenant un acide nucléique codant ladite séquence peptique, et un kit, en particulier un kit diagnostic, comprenant un tel composé et au moins un moyen de révélation de la liaison dudit composé à tout ou partie de la bactérie, ainsi que leur utilisation pour rechercher une éventuelle maladie de Crohn chez un sujet ou pour suivre l'évolution d'une maladie de Crohn chez un sujet traité contre ladite maladie de Crohn.

Sont également décrits une composition diagnostique comprenant au moins un composé tel que décrit dans le présent texte et un support acceptable sur le plan pharmaceutique, et un kit, en particulier un kit diagnostic, comprenant une telle composition et au moins un moyen de révélation de la liaison dudit composé à tout ou partie de la bactérie, ainsi que leur utilisation pour rechercher une éventuelle maladie de Crohn chez un sujet ou pour suivre l'évolution d'une maladie de Crohn chez un sujet traité contre ladite maladie de Crohn. Le présent texte décrit également l'utilisation d'un kit diagnostic pour préparer une composition diagnostique selon l'invention ou pour obtenir des informations utiles pour le diagnostic d'une maladie de Crohn. Un autre objet de l'invention concerne une méthode de détection de la présence éventuelle dans un échantillon biologique d'un sujet à tester pour la maladie de Crohn d'au moins une bactérie exprimant une séquence peptidique comprenant une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3 et un fragment de celles-ci, ou comprenant un acide nucléique codant ladite séquence peptique, ou d'une partie de ladite bactérie.

Une méthode de diagnostic de la maladie de Crohn comprenant la mise en oeuvre in vitro ou ex vivo d'une méthode de détection selon l'invention sur un échantillon biologique provenant d'un sujet à tester est également décrite. Elle est caractérisée en ce que l'absence de bactérie ou de partie de celle-ci, ou la détection de bactéries ou de parties de celles-ci, en une quantité inférieure à une valeur contrôle au sein de l'échantillon, permet de diagnostiquer la maladie de Crohn chez ledit sujet, la présence au sein de l'échantillon de bactéries ou de parties de celles-ci en une quantité supérieure à ladite valeur contrôle permettant au contraire d'exclure l'existence de la maladie de Crohn chez ledit sujet. Une autre méthode décrite dans le présent texte permet d'évaluer, chez un sujet, l'efficacité thérapeutique d'un traitement contre la maladie de Crohn. Cette méthode comprend la mise en oeuvre in vitro ou ex vivo d'une méthode de détection selon l'invention sur un échantillon biologique provenant d'un sujet traité contre la maladie de Crohn, l'apparition ou une augmentation de la quantité de bactéries ou de parties de celles-ci révélant l'efficacité dudit traitement, et la disparition ou la diminution de la quantité de bactéries ou de parties de celles- ci révélant au contraire l'inefficacité dudit traitement, lorsque comparé à une valeur contrôle, par exemple lorsque comparé à la quantité de bactéries ou de parties de celles-ci détectées chez ledit sujet avant que ce dernier n'ait été traité contre la maladie de Crohn. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention concerne des marqueurs biologiques de la maladie de Crohn, en particulier des marqueurs d'origine bactérienne, permettant le diagnostic pertinent de cette maladie chez un sujet, le suivi de son évolution et la vérification de l'efficacité d'un traitement dirigé contre celle-ci. L'invention concerne aussi les méthodes de détection de ces marqueurs et les outils permettant la mise en oeuvre de ces méthodes, typiquement les composés (de préférence les composés détectables) liant lesdits marqueurs. Les inventeurs ont en particulier révélé la présence en quantité significative, dans le système digestif de sujets ne souffrant pas de la maladie de Crohn (également identifiés en tant que « sujets sains » dans le présent texte), de marqueurs, en particulier de marqueurs d'origine bactérienne, et ont mis en évidence leur présence en très faible quantité voire en quantité non détectable chez les sujets atteints de la maladie de Crohn. L'invention décrit donc, pour la première fois et de manière particulièrement avantageuse, des méthodes de diagnostic de la maladie de Crohn, de suivi de l'évolution et/ou de l'efficacité d'un traitement dirigé contre la maladie de Crohn, basées sur la mesure dans un échantillon biologique d'un sujet à tester d'au moins un marqueur tel que décrit dans le présent texte. Le marqueur d'intérêt est de préférence une bactérie exprimant une séquence peptidique comprenant une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et un fragment de celles-ci (i.e. un fragment de l'une desdites SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO : 3) ou comprenant un acide nucléique codant ladite séquence peptidique ou ledit fragment de celle-ci. Le marqueur d'intérêt correspond typiquement à une partie de ladite bactérie, qui peut être par exemple une séquence d'acides aminés ou une séquence d'acide nucléique telle que décrite dans el présent texte. La présente description fournit également les outils permettant la mise en oeuvre desdites méthodes. L'absence de détection ou la détection en une quantité inférieure à une valeur contrôle au sein d'un échantillon biologique permet de diagnostiquer de façon certaine la maladie de Crohn chez un sujet, tandis que la présence au sein de l'échantillon en une quantité supérieure à une valeur contrôle permet au contraire d'exclure l'existence de cette maladie très particulière même si le sujet testé soufre bel et bien d'une affection de l'intestin en particulier d'une MICI, typiquement d'une recto-colite hémorragique. Les termes "maladie de Crohn" désignent typiquement l'inflammation persistante des parois et des couches profondes du tube digestif d'un sujet. Cette inflammation peut se caractériser par un épaississement local des parois intestinales ainsi que par des fissures et des plaies. Elle est souvent associée à des troubles intestinaux, des diarrhées, de la fièvre ou une fatigue intense. Dans certains cas, des symptômes non digestifs peuvent se manifester et se présentent au niveau articulaire, cutané et/ou oculaire. Elle se caractérise principalement par des crises de douleurs abdominales et de diarrhées, qui peuvent durer plusieurs semaines ou plusieurs mois.

Fatigue, perte de poids et même dénutrition peuvent alors survenir. La maladie évolue par poussées entrecoupées de périodes de rémission qui peuvent durer plusieurs mois. Il arrive parfois que les symptômes d'une récidive (ou crise) soient tellement intenses (incapacité à s'alimenter, hémorragies, diarrhées, etc.) qu'une hospitalisation devient nécessaire. Dans le cadre de la présente invention le « stade précoce » de la maladie de Crohn est typiquement associé aux symptômes classiquement retrouvés à la fois dans les troubles digestifs chroniques et les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, qui comprennent notamment douleurs abdominales, diarrhée, saignements rectaux, perte de poids, fatigue et fièvre.

On entend par « sujet » un animal, typiquement un mammifère humain ou non humain, de préférence un être humain. Des populations particulières de sujets correspondent aux sujets présentant une prédisposition au développement de la maladie de Crohn (pouvant par exemple résulter d'antécédents familiaux de maladie inflammatoire chronique de l'intestin (MICI) voire précisément de maladie de Crohn) ou aux sujets suspectés de souffrir de la maladie de Crohn pour toute autre raison. Une autre population particulière de sujets correspond aux sujets ne présentant aucun symptôme ou prédisposition connue. Un sujet préférentiellement visé par la présente invention présente des troubles digestifs chroniques ou une maladie inflammatoire chronique de l'intestin non classée (i.e. non spécifiquement identifiée). La présente invention découle de la mise en évidence et de la caractérisation par les inventeurs de marqueurs biologiques ou « biomarqueurs » caractéristiques de la maladie de Crohn. Ces marqueurs permettent de diagnostiquer ou au contraire d'exclure avec certitude l'existence de la maladie de Crohn chez un sujet et présentent l'avantage de pouvoir être dosés à partir de prélèvements non ou peu invasifs, typiquement à partir d'un prélèvement comprenant des matières et/ou eaux fécales, comme expliqué ci-dessous. L'invention décrit ainsi des marqueurs biologiques efficaces, en particulier des acides nucléiques, des protéines, des polypeptides, des peptides ou des combinaisons de peptides, typiquement d'origine bactérienne, utilisables pour diagnostiquer la maladie de Crohn le plus précocement possible. L'un quelconque des marqueurs selon l'invention ainsi que toute combinaison de ceux-ci, dont la détection chez un sujet permet de déterminer, même à un stade précoce, l'existence de la maladie de Crohn, peut également être utilisé pour suivre l'évolution de cette maladie ou l'efficacité d'un traitement dirigé contre celle-ci. Chacun des marqueurs selon l'invention permet en outre avantageusement de distinguer la maladie de Crohn des autres MICI, et en particulier de la recto-colite hémorragique. Dans la présente invention, le terme « bactérie » est entendu au sens large et correspond typiquement à la bactérie ayant conservé son intégrité ou à un mélange de bactéries ayant conservé leur intégrité. Une bactérie préférée au sens de l'invention exprime une séquence peptidique comprenant une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et un fragment de celles-ci (i.e. un fragment de l'une desdites SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3) ou comprend un acide nucléique codant ladite séquence peptidique ou ledit fragment de celle-ci. Par « partie de bactérie », on entend toute molécule ou séquence d'acides aminés ou d'acide nucléique (séquence de nucléotides) provenant d'une bactérie d'intérêt, par exemple de la bactérie Alkaliphilus oremlandii, de préférence d'une bactérie du genre Oscillibacter, ou de plusieurs bactéries d'intérêt, et susceptible d'être reconnue par un composé de l'invention.

Ces « partie(s) de bactérie » correspondent dans la présente demande à des « marqueurs » ou « biomarqueurs » tels que définis précédemment et peuvent également être désignés en tant que « cibles » (« target »). Dans un mode de réalisation particulier, la partie de la bactérie utilisée comme marqueur correspond à une molécule ou séquence d'acides aminés, typiquement choisi parmi une protéine, un polypeptide, un peptide ou une combinaison de peptides (par exemple un complexe peptidique) naturelle ou artificielle. Cette molécule peut correspondre à un fragment de capsule, de paroi cellulaire, de membrane plasmique, de flagelle ou d'endospore ou à un élément du cytoplasme caractéristique d'une ou de plusieurs bactéries d'intérêt. Le marqueur correspond par exemple à une structure extra-cellulaire, ou à une portion polysaccharidique de la paroi externe. Les marqueurs comprenant des acides aminés provenant de laides bactérie(s) d'intérêt sont de préférence des peptides, polypeptides ou protéines retrouvés sur la partie extra-cellulaire d'une bactérie, typiquement « exposées » sur la paroi bactérienne.

De préférence, ces bactéries sont susceptibles d'être facilement détectées avec ou sans altération de la paroi bactérienne. Un marqueur polypeptidique préféré comprend, ou consiste en, une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, de manière encore plus préférée en 20 SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO: 3, et un fragment de l'une ou l'autre desdites séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3. SEQ ID NO: 1 >2136630121072261GL0047428 02 [Lack 3'- 25 end] [mRNA] locus=scaffold20302 4: 1307: 1840:+INAIK01448,K020351map00550 LAAITGKRERRRVFGRKKMEIYERRVTSMKKLLAMVLALVMTLSLAVSANAAFKDD KISISDDYAEAVAVLNGMGVFKIGYEDGSFKPEGNITRIAEVATIIYMYTADVAKIN DKISGLYATYNK1FSDMAGAGWAQGYIGYCANAALVKGYPDGTFKPSGNIVTGYEV LAMILRIAVGYDKNNE 30 SEQ ID NO: 2 >2361546122990291GL0014029 V1 [Lack 3*- end] [mRNA] locus=C4048270 1:32:658:+1N0G094371K01448,K02035,K086541map00550 MKKLLAMVLALVMTLSLAVSANAAFKDDKISISDDYAESVAVLNGMGVFKIGYED GSFKPEGNITRIAEVATHYRIIYTADVAKINDKISGLYATYNKIFSDMAGAGWAQGYI GYCANASLVKIGYPDGTFKPSGKIVTGYEVLAMILRIAVGYDKINNEFSGADWALH VA QTA Q QLGVLDNVAK TTDLNAPASRIELVAELLFOGIQKIAQVTYTPAFGY SEQ NO: 3 >2769615126713221GL0089028 V1 [Lack 3*- end] [mRNA] locus=scaffold19302 2:2:1081:-INAIK01448Imap00550 MKKLLAMVLALVMTLS LAVS AS AVKADEKINEDYAEAVAVLNGMGVFK1GYEDGS FQPK1GDITRIAEVSAIVYRIVYTQDVKDAKASMYATYNKFSDMAGAGWAQGYIGYC ANAELVKI GYPDGTFKPS GK I VT GYEVLA MILRIAVGYDKINGEFS GADWALHVA Q TA Q QA GVLKINVKIGVDLNAPASR1ELVAELLFRAVAES ATVTYTPAFGYVTD K1VL GNAAPTLGYKINFKLVGKDSADKWGRPATKIWTYNVGDKIETLVNDKPVVSYTTKV AECDIAKDLGIS S AKKIEKAYID GQQPGITS ELVS TNK1YGTINPLAT T SYVGAQ GRIL TAVFYMDSDGYRIVEINTYLAKVDKVTAAKTDRNGHT Des exemples de marqueurs peptidiques d'intérêt correspondent à des marqueurs comprenant, ou consistant en, une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NO: 4 (AEVATIIYR), SEQ ID NO: 5 (IYTADVAK), SEQ ID NO: 6 (SGLYATYNK), SEQ ID NO: 7 (TTDLNAPASR), SEQ ID NO: 8 (ELVAELLFQGIQK), SEQ ID NO: 9 (GYEDGSFQPK), SEQ ID NO: 10 (GVDLNAPASR), SEQ ID NO: 11 (VLGNAAPTLGYK), SEQ ID NO: 12 (WTYNVGDK) et SEQ ID NO: 13 (YGTINPLATTSYVGAQGR), ou en une combinaison de plusieurs desdits peptides. Un marqueur peptidique préféré comprend, ou consiste en, une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NO: 8 (ELVAELLFQGIQK), SEQ ID NO: 11 (VLGNAAPTLGYK) et SEQ ID NO: 13 (YGTINPLATTSYVGAQGR), ou en une combinaison de plusieurs desdits peptides. Dans un mode de réalisation particulier, la combinaison de peptides cibles utilisée comprend ou consiste en une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13 ou une combinaison de celle-ci.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la partie de laides bactérie(s) d'intérêt, typiquement d'une bactérie du genre Oscillibacter, utilisée comme marqueur est une molécule d'acide nucléique se présentant sous la forme d'une molécule d'ADN, d'une molécule d'ARN, d'un plasmide, etc., provenant, ou obtenu à partir, de laides bactérie(s) d'intérêt. La séquence d'acide nucléique est par exemple un gène provenant d'une bactérie d'intérêt. Les séquences d'acide nucléique utilisées comprennent, ou consistent en, une séquence ARNm sélectionnée parmi les séquences SEQ ID Nos : 14, 15 ou 16 de manière préférée. Les acides nucléiques de séquences SEQ ID Nos : 14-16 ont en particulier été identifiés par les inventeurs à partir d'échantillons biologiques provenant de sujets sains ou de sujets atteints de la maladie de Crohn, par des techniques d'analyse du génome (comme expliqué dansla partie expérimentale de la présente description). SEQ ID NO :14 >2136630121072261GL0047428 02 [Lack 3*- end] [mRNA] locus=scaffold20302 4:1307:1840:+INAIK01448,K020351map00550 TTGGCAGCAATCACGGGAAAGCGGGAGAGACGGCGGGTGTTCGGCCGCAAGAAG ATGGAAATTTATGAAAGGAGAGTAACATCTATGAAAAAGTTACTCGCAATGGTG CTGGCTCTGGTCATGACTCTGTCTCTGGCCGTCAGCGCCAACGCAGCCTTCAAGG ATGACAAGAGCATCAGCGATGATTACGCTGAGGCCGTTGCCGTTCTGAATGGCAT GGGTGTGTTCAAGGGTTATGAGGATGGTTCCTTCAAGCCCGAGGGCAACATCACC CGCGCTGAGGTAGCTACGATCATCTATCGTATCTACACTGCCGACGTCGCCAAGA ACGATAAGTCCGGCCTCTATGCCACTTATAACAAGTTCAGCGACATGGCTGGCGC CGGTTGGGCTCAGGGCTACATCGGCTACTGCGCCAACGCCGCTCTCGTCAAGGGT TATCCCGACGGCACCTTCAAGCCCTCCGGCAACGTCACGGGCTACGAGGTCCTCG CCATGATCCTCCGCGCGGTTGGCTACGACAAGAACAACGAG SEQ ID NO :15 >2361546122990291GL0014029 V1 [Lack 3'- end] [mRNA] locus=C4048270 1:32:658:+1N0G094371K01448,K02035,K086541map00550 ATGAAAAAGTTACTCGCAATGGTGCTGGCTCTGGTCATGACTCTGTCTCTGGCCG TCAGCGCCAACGCAGCCTTCAAGGATGACAAGAGCATCAGCGATGATTACGCTG AGTCTGTTGCCGTTCTGAATGGCATGGGTGTGTTCAAGGGTTATGAGGATGGTTC CTTCAAGCCCGAGGGCAACATCACCCGCGCTGAGGTAGCTACGATCATCTATCGT ATCTACACTGCCGACGTCGCCAAGAACGATAAGTCCGGCCTCTATGCCACTTATA ACAAGTTCAGCGACATGGCTGGTGCCGGTTGGGCTCAGGGCTACATCGGCTACTG CGCCAACGCCTCCCTCGTCAAGGGCTATCCCGATGGCACCTTCAAGCCGTCCGGC AAGGTCACCGGCTATGAAGTCCTCGCCATGATCCTCCGCGCTGTCGGCTACGACA AGAACAACGAGTTCTCCGGCGCTGACTGGGCGCTCCATGTTGCGCAGACCGCGCA GCAGCTCGGCGTTCTGGACAACGTGGCGAAGACCACCGACCTGAACGCTCCCGCT TCCCGTGAGCTGGTCGCTGAGCTCCTGTTCCAGGGCATCCAGAAGGCTCAGGTCA CCTACACCCCGGCCTTCGGCTAT SEQ ID NO :16 276961512671322IGL0089028 V1 [Lack 3'-end] [mRNA] locus=scaffold19302 2:2:1081:- INAIK01448 Imap00550 ATGAAAAAGTTACTCGCAATGGTGCTGGCTCTGGTCATGACTCTGTCTCTGGCCG TCAGCGCCAGCGCCGTGAAGGCCGACGAGAAGATCAACGAAGATTACGCTGAAG CTGTCGCCGTCCTGAATGGCATGGGTGTTTTCAAGGGTTATGAGGACGGTTCCTTC CAGCCCAAGGGCGACATCACCCGCGCTGAGGTGTCCGCGATCGTTTATCGCGTGT ACACTCAGGACGTCAAGGATGCTAAGGCTTCCATGTACGCCACCTACAACAAGTT CAGCGACATGGCTGGCGCCGGTTGGGCTCAGGGCTACATCGGCTACTGCGCCAAC GCTGAACTGGTCAAGGGCTATCCCGACGGTACCTTCAAGCCCTCCGGCAAGGTCA CCGGCTACGAAGTCCTCGCTATGATCCTCCGCGCTGTCGGTTACGACAAGAACGG TGAGTTCTCCGGCGCTGATTGGGCGCTGCATGTTGCGCAGACCGCGCAGCAGGCC GGCGTGCTCAAGAACGTCAAGGGTGTTGACCTCAACGCTCCCGCTTCCCGTGAGC TGGTTGCTGAGCTGCTGTTCCGCGCCGTCGCTGAGTCCGCCACCGTCACCTACACT CCGGCCTTCGGCTATGTGACCGATAAGGTGCTCGGCAATGCTGCTCCCACCCTCG GCTACAAGAACTTCAAGCTCGTCGGCAAGGATTCCGCTGACAAGTGGGGCCGTCC CGCTACCAAGTGGACCTACAACGTCGGCGACAAGGAGACTCTTGTCAACGACAA GCCCGTCGTCTCCTACACCACCAAGGTTGCCGAGTGCGACATCGCCAAGGATCTG GGCATCTCCTCCGCTAAGAAGATCGAGAAGGCCTACATTGATGGTCAGCAGCCCG GTATTACCTCCGAGCTCGTCAGCACCAACAAGTACGGCACCATCAACCCGCTTGC CACCACCTCCTATGTCGGCGCTCAGGGCCGTTTGACCGCGGTCTTTTACATGGATT CCGACGGTTACCGCATCGTTGAGATCAACACCTACCTCGCCAAGGTCGACAAGGT CACCGCTGCCAAGACCGACCGCAACGGCCACACC Un autre objet de l'invention concerne un composé liant tout ou partie d'un marqueur d'intérêt, typiquement tout ou partie d'une bactérie d'intérêt, de préférence d'une bactérie du genre Oscillibacter. Les termes « composé liant tout ou partie d'une bactérie » (plus simplement désigné en tant que « composé » dans le cadre de la présente description) désignent un composé comprenant, ou en consistant en, une molécule liant tout ou partie d'une bactérie, ladite molécule étant typiquement choisie parmi une molécule constituée d'acides aminés telle qu'une protéine, un peptide, une combinaison de peptides ou un polypeptide ; un acide nucléique tel qu'une molécule d'ADN, une molécule d'ARN ou un plasmide ; un anticorps ; un sucre par exemple un oligosaccharide ou un polysaccharide ; et un mélange quelconque de ceux-ci tel que par exemple un peptidoglycane. Lorsqu'il est de nature peptidique, i.e. lorsqu'il comprend un peptide, le composé peut se présenter avantageusement sous une forme acétylé(e), méthylé(e), phosphorylé(e) glycosylé(e), ou fusionné(e) à un(e) autre protéine, peptide et polypeptide selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

Lorsqu'il comprend, ou consiste en, un acide nucléique, le composé peut se présenter avantageusement inséré dans un fragment d'ADN, ou dans un vecteur de clonage. Dans un mode de réalisation particulier, le composé consiste en un anticorps. Dans un autre mode de réalisation particulier, le composé consiste en une construction peptidique, de préférence choisie parmi une protéine de fusion et une protéine recombinante.

Dans encore un autre mode de réalisation particulier, le composé consiste en une séquence d'acide nucléique pouvant se présenter par exemple sous la forme d'un aptamère. Un composé préféré selon l'invention lie au moins un marqueur biologique au sens de l'invention provenant d'une bactérie d'intérêt, typiquement une molécule d'acide nucléique ou une molécule comprenant des acides aminés. Un tel composé est par exemple choisi parmi une molécule constituée d'acides aminés telle qu'une protéine, un peptide, une combinaison de peptides ou un polypeptide ; un acide nucléique tel qu'une molécule d'ADN, une molécule d'ARN ou un plasmide ; un anticorps ; un sucre par exemple un oligosaccharide ou un polysaccharide ; et un mélange quelconque de ceux-ci tel que par exemple un peptidoglycane.

Dans un mode de réalisation particulier, le composé selon l'invention liant au moins un marqueur biologique au sens de l'invention comprend, ou consiste en, une construction comprenant un peptide ou un acide nucléique liant tout ou partie de laides bactéries d'intérêt. La construction, lorsqu'elle comprend un peptide, est de préférence sélectionnée parmi une protéine de fusion ou une protéine recombinante, typiquement issue de la l'ingénierie moléculaire et obtenue selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. Un composé préféré lie, ou est susceptible de lier, un marqueur correspondant à une molécule d'acides aminés provenant d'une bactérie d'intérêt. Les molécules d'acides aminés utilisées de manière préférée comme cibles comprennent, ou consistent en, une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 3. Ces marqueurs protéiques ont été identifiés par les inventeurs à partir d'échantillons biologiques provenant de sujets sains ou de sujets atteints de la maladie de Crohn, par des techniques d'analyse du protéome connues de l'homme du métier. Un composé particulièrement préféré lie un polypeptide comprenant, ou consistant en, une 5 séquence sélectionnée parmi SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3. Un autre composé préféré lie un peptide comprenant, ou consistant en, une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12 et SEQ ID NO : 13. Un composé particulièrement préféré lie un peptide comprenant, ou consistant en, une 10 séquence sélectionnée parmi SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 13. Dans un mode de réalisation particulier, le composé selon l'invention liant au moins un marqueur biologique au sens de l'invention comprenant des acides aminés comprend, ou consiste en, un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps. De préférence, le ligand est un 15 anticorps spécifique de la molécule d'acides aminés, un fragment d'un tel anticorps (par exemple un Fab, Fab', CDR, etc.), ou un dérivé d'un tel anticorps (par exemple un anticorps simple-chaîne, ScFv, nanobodies, etc.). Le ligand est typiquement immobilisé sur un support, tel qu'une lame, bille, colonne, plaque, etc. La présence ou la quantité de la molécule cible dans l'échantillon peut être détectée/mesurée par mise en évidence d'un complexe entre la 20 cible et l'un de ses ligands. Le ligand peut être marqué pour faciliter sa détection. Un second ligand de révélation peut également être utilisé. Des techniques immunologiques utilisables et bien connues sont les techniques ELISA, RIA, etc. Si nécessaire, la quantité de peptide, polypeptide ou protéine détectée peut être comparée à une valeur contrôle, par exemple à une valeur contrôle observée chez des sujets qui ne sont pas atteints de la maladie de Crohn. 25 Des anticorps spécifiques des marqueurs selon l'invention peuvent être produits par des techniques conventionnelles, notamment par immunisation d'un animal non-humain avec un immunogène comprenant le marqueur peptidique, polypeptidique ou protéique (ou un fragment immunogène de celui-ci), et récupération des anticorps (polyclonaux) ou des cellules productrices (pour produire des anticorps monoclonaux). Des techniques de 30 production d'anticorps poly- ou monoclonaux, de fragments ScFv, d'anticorps humains ou humanisés sont décrites par exemple dans Harlow et al. [Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988]; Ward et al. [Nature 341 (1989) 544]; Bird et al. [Science 242 (1988) 423]; WO 94/02602; US 5,223,409; US 5,877,293; et WO 93/01288. L'immunogène peut être fabriqué par synthèse, ou par expression, dans un hôte approprié, d'un acide nucléique cible tel que défini ci-avant. Un tel anticorps, monoclonal ou polyclonal, ainsi que ses dérivés ayant la même spécificité antigénique, constitue également un composé objet de la présente invention. Selon un mode de réalisation préféré, ces composés lient, ou sont susceptibles de lier, une bactérie d'intérêt, ou une partie de celle-ci (par exemple un gène, une protéine, un polypeptide, un peptide ou une combinaison de peptides). Dans un mode de réalisation préféré, l'invention a pour objet un composé tel que décrit dans le présent texte lié à un marqueur détectable. Ce marqueur détectable sert à la visualisation, voire à la quantification du marqueur d'intérêt. De préférence, ce marqueur détectable est sélectionné parmi une bille, un fluorophore, un fragment chimioluminescent, un isotope stable, une particule (par exemple une nanoparticule) telle qu'une particule magnétique ou une particule métallique détectable par imagerie. Ce marqueur détectable peut être aisément choisi par l'homme de l'art en fonction de la nature du marqueur biologique cible.

L'invention concerne également les compositions comprenant au moins un composé tel que décrit dans le présent texte, typiquement un composé liant au moins un marqueur biologique au sens de l'invention, et leurs utilisations. Une composition diagnostique comprenant au moins un composé selon l'invention, et un support acceptable sur le plan pharmaceutique est ainsi avantageusement décrite. Un support acceptable sur le plan pharmaceutique peut être, par exemple, une substance choisie parmi un excipient, un véhicule, un adjuvant, un tampon, classiquement utilisés avec les outils de détection ou de diagnostic. Le choix de tels supports dépend essentiellement de la méthode de détection ou de diagnostique utilisée.

L'invention concerne typiquement un composé selon l'invention et une composition diagnostique comprenant un tel composé, pour une utilisation pour rechercher chez un sujet une éventuelle maladie de Crohn, de préférence à un stade le plus précoce possible, à partir d'un échantillon biologique provenant dudit sujet. L'invention concerne par ailleurs l'utilisation de composé(s) de l'invention pour suivre l'évolution de la maladie de Crohn typiquement chez un sujet traité contre cette maladie. Dans le contexte de la présente invention, l'expression "échantillon biologique" désigne tout échantillon biologique provenant du sujet à tester, de préférence un échantillon contenant des acides nucléiques, des protéines ou des fragments de ceux-ci. Un échantillon type comprend par exemple des fluides, des tissus, des cellules, des protéines, des acides nucléiques. De préférence, l'échantillon selon l'invention peut être obtenu par toute technique connue en soi, par exemple par prélèvement, par des techniques non invasives, à partir de collections ou banques d'échantillons. L'échantillon correspond typiquement à un prélèvement permettant d'étudier le microbiote intestinal. Un tel échantillon comprend de préférence des matières fécales (selle) et/ou eaux fécales. L'échantillon peut également consister en une biopsie (ou pièce opératoire) de, ou comprendre du, tissu épithélial intestinal ou du mucus intestinal. Dans des modes de réalisation particuliers, l'échantillon est un échantillon de matière fraîche ou un échantillon de matière congelée.

L'échantillon peut par ailleurs être pré-traité pour faciliter l'accessibilité aux molécules cibles, par exemple par lyse (mécanique, chimique, enzymatique, etc.), purification, centrifugation, séparation, etc. L'échantillon peut également être marqué (marquage fluorescent, radioactif, luminescent, chimique, enzymatique, etc.), afin d'être détecté plus facilement. Le marqueur détectable est de préférence sélectionné parmi une bille, une particule inorganique, par exemple une particule métallique, un fluorophore, un fragment chimioluminescent et un isotope stable. Des techniques de lyse cellulaire, de concentration ou de dilution des acides nucléiques ou des protéines sont bien connues de l'homme du métier. L'invention vise en particulier la détection de gènes, peptides, polypeptides ou protéines issus, et de préférence caractéristiques, de la/des bactéries d'intérêt.

Avant la présente invention, il n'existait aucun moyen de diagnostiquer la maladie de Crohn chez un sujet à partir d'un échantillon biologique dudit sujet, typiquement d'un échantillon de matières et/ou eaux fécales. L'invention se rapporte également à un kit diagnostique comprenant au moins un composé ou au moins une composition selon l'invention et au moins un moyen de révélation ou de détection de la liaison dudit composé à tout ou partie d'une bactérie d'intérêt. Dans un mode de réalisation particulier, le kit selon l'invention comprend au moins un anticorps spécifique d'un marqueur de la maladie de Crohn tel que décrit dans le présent texte et un ou des réactifs et/ou tampons de détection.

Dans un autre mode de réalisation particulier, le kit selon l'invention comprend des réactifs spécifiques permettant la détection d'ARN, d'ADN, typiquement d'ADNc, ou de protéine ou fragment de protéine (par exemple des sondes oligonucléotidiques, des amorces ou des anticorps). Dans un mode de réalisation préféré, le kit contient tous les composants nécessaires et suffisants pour conduire la détection, incluant tous les contrôles, directives de protocole d'essais, et si nécessaire, les logiciels pour l'analyse et la présentation des résultats. Les kits peuvent également comprendre, par exemple, des tampons et enzymes de PCR, des séquences de contrôle positif, des amorces de contrôle de la réaction, et des instructions pour amplifier ou détecter les séquences spécifiques.

De tels kits peuvent être utilisés pour détecter tout ou partie d'une ou de plusieurs bactéries d'intérêt et/ou pour doser ladite/lesdites bactéries, dans un échantillon biologique, notamment pour rechercher une éventuelle maladie de Crohn chez un sujet, en particulier pour distinguer au sein d'une cohorte de patients atteint de MICI, les sujets atteints de maladie de Crohn de ceux atteints de recto-colite hémorragique, ou pour obtenir des informations utiles pour le diagnostic d'une maladie de Crohn, ou pour suivre l'évolution d'une maladie de Crohn chez un sujet traité contre cette maladie. Dans un mode particulier de réalisation, le kit de diagnostic est un kit comprenant des moyens de mise en oeuvre d'un test ELISA ou d'un Western-blot. A ce titre, le kit diagnostique contient un moyen de détection d'une ou de plusieurs parties de la bactérie d'intérêt, le moyen de détection correspondant notamment à un ou plusieurs anticorps polyclonaux ou monoclonaux. Le présent texte concerne également un kit pour préparer une composition diagnostique telle que décrite dans le présent texte.

Comme indiqué précédemment, l'invention permet avantageusement de détecter la présence de la maladie de Crohn chez un sujet, et, une fois diagnostiquée, de suivre son évolution. Un objet particulièrement avantageux de l'invention réside dans une méthode de détection de la présence éventuelle dans un échantillon biologique d'un sujet à tester, typiquement d'un sujet à tester pour la maladie de Crohn, d'au moins une bactérie d'intérêt ou partie de celle-ci, par exemple de plusieurs parties de celle-ci (séparément ou relativement les unes aux autres). La présence et/ou la structure des marqueurs d'intérêt peuvent être détectées/analysées au moyen de techniques connues de l'homme du métier, typiquement à l'aide des technologies de protéomique quantitative ciblée. Une méthode préférée utilise la spectrométrie de masse (« SM » ou «MS »). La mise en oeuvre d'une méthode SRM (pour « Selected Reaction Monitoring ») permet de quantifier très finement le/les marqueurs spécifiquement détecté(s) par spectrométrie de masse.

Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, la technologie SRM avec marquage des peptides d'intérêt, de préférence des peptides SEQ ID NO: 4 à SEQ ID NO: 13, est avantageusement mise en oeuvre. Par inférence, la méthode permet de quantifier très précisément l'abondance des protéines SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 3 dans plusieurs échantillons différents. Ces techniques, plus généralement regroupées sous le nom de protéomique ciblée, servent, dans le cadre de la présente invention, à quantifier dans un échantillon biologique d'un sujet à tester au moins une bactérie ou partie de celle-ci (correspondant de préférence à une molécule comprenant des acides aminés, typiquement un peptide, une combinaison de peptides, un polypeptide ou une protéine). Un autre objet particulièrement avantageux de l'invention réside dans une méthode de détection de la présence éventuelle dans un échantillon biologique d'un sujet à tester d'un marqueur d'intérêt, typiquement d'au moins une bactérie d'intérêt ou partie de celle-ci, 15 comprenant : la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un échantillon biologique du sujet à tester avec un composé selon l'invention liant tout ou partie du marqueur d'intérêt, typiquement d'au moins une bactérie d'intérêt; et la détection de la liaison dudit composé audit marqueur d'intérêt, typiquement à ladite au 20 moins une bactérie d'intérêt ou partie de celle-ci, lorsqu'il est présent au sein de l'échantillon biologique, et de préférence la mesure de la quantité dudit marqueur au sein de l'échantillon biologique. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode comprend la détermination de la présence 25 ou de la quantité (relative) de molécule(s) d'acides aminés (peptide, polypeptide ou protéine) en tant que marqueur provenant de la bactérie d'intérêt. La mise en évidence ou le dosage d'une telle molécule d'acides aminés dans un échantillon peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier. Cette mise en évidence est de préférence réalisée à l'aide d'un composé selon l'invention capable de lier tout ou 30 partie de la bactérie d'intérêt tel que décrit précédemment. Dans un autre mode de réalisation particulier, la méthode comprend la mise en contact, dans des conditions permettant une hybridation entre séquences complémentaires, de l'échantillon biologique du sujet à tester, ou d'acides nucléiques extraits dudit échantillon biologique, et d'un ensemble de sondes spécifiques des molécules cibles (biomarqueurs) identifiées par les inventeurs pour obtenir un profil d'hybridation, le profil d'hybridation étant caractéristique de la présence de la maladie de Crohn chez ce sujet, ou de l'(in)efficacité du traitement appliqué au sujet le cas échéant.

Différentes techniques permettant la détection d'une espèce d'acide nucléique dans un échantillon biologique sont utilisables dans la présente invention, comme par exemple le Northern Blot, l'hybridation sélective, l'utilisation de supports revêtus d'oligonucléotides sondes, l'amplification d'acide nucléique comme par exemple par RT-PCR, PCR quantitative ou ligation-PCR, etc. Ces méthodes peuvent comprendre l'utilisation d'une sonde nucléique (par exemple un oligonucléotide) capable de détecter sélectivement ou spécifiquement l'acide nucléique cible dans l'échantillon. L'amplification peut être réalisée selon différentes méthodes connues de l'homme du métier, telles que la PCR, la LCR, l'amplification médiée par transcription (TMA), l'amplification par déplacement de brin (SDA), NASBA, l'emploi d'oligonucléotides spécifiques d'allèles (ASO), l'amplification spécifique d'allèle, le Southern blot, l'analyse conformationnelle SSCA, l'hybridation in situ (par exemple, FISH), la migration sur gel, l'analyse d'hétéroduplexes, etc. Si nécessaire, la quantité d'acide nucléique détectée peut être comparée à une valeur contrôle, par exemple une valeur médiane ou moyenne observée chez des patients qui ne sont pas atteints de la maladie Crohn.

Selon un mode préféré de mise en oeuvre, la méthode comprend la détection de la présence ou de l'absence ou de la quantité (relative) de molécules d'acide nucléique. L'hybridation sélective est typiquement réalisée en utilisant des sondes nucléiques, de préférence immobilisées sur un support, tel qu'un support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation de sondes nucléiques. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, etc. Les sondes nucléiques peuvent être tout acide nucléique (ADN, ARN, PNA, etc.), de préférence simple-brin, comprenant une séquence spécifique d'un marqueur cible tel que défini ci-dessus. Les sondes peuvent être des oligonucléotides synthétiques, produits sur la base des séquences de molécules cibles de l'invention selon des techniques de synthèse classique. On peut également utiliser des couples de sondes, dont un membre est parfaitement apparié à la molécule cible, et un autre présente un mésappariement, permettant ainsi d'estimer le bruit de fond.

Les sondes peuvent être synthétisées préalablement puis déposées sur le support, ou synthétisées directement in situ, sur le support, selon des méthodes connues en soi de l'homme du métier. Les sondes peuvent également être fabriquées par des techniques génétiques, par exemple par amplification, recombinaison, ligation, etc. L'hybridation peut être réalisée dans des conditions classiques, connues de l'homme du métier et ajustables par celui-ci (Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press). En particulier, l'hybridation peut être réalisée dans des conditions de stringence élevée, moyenne ou faible, selon le niveau de sensibilité recherché, la quantité de matériel disponible, etc. Dans un mode de mise en oeuvre typique, les acides nucléiques (ou les puces ou supports) sont pré-hybridés dans un tampon d'hybridation. Les acides nucléiques de l'échantillon sont ensuite mis en contact avec les sondes. De préférence, les acides nucléiques de l'échantillon sont marqués au préalable, par tout marquage connu (radioactif, enzymatique, fluorescent, luminescent, etc.). Les supports sont ensuite lavés. Le profil d'hybridation est analysé selon des techniques classiques, comme par exemple en mesurant le marquage sur le support au moyen d'un instrument adapté. Les conditions de l'hybridation peuvent naturellement être ajustées par l'homme du métier, par exemple en modifiant la température d'hybridation et/ou la concentration saline du tampon ainsi que par ajout de substances auxiliaires comme le formamide ou de l'ADN simple brin. L'amplification sélective est de préférence réalisée en utilisant une amorce ou une paire d'amorces permettant l'amplification de tout ou partie d'un des acides nucléiques cibles dans l'échantillon, lorsque celui-ci y est présent. L'amorce peut être spécifique d'une séquence cible telle que définie précédemment, ou d'une région flanquant la séquence cible dans un acide nucléique de l'échantillon.

Un objet particulièrement avantageux de l'invention concerne une méthode de diagnostic de la maladie de Crohn comprenant la mise en oeuvre in vitro ou ex vivo sur un échantillon biologique provenant d'un sujet à tester d'une méthode de détection telle que décrite précédemment. L'absence de bactérie d'intérêt ou de parties de celle-ci, ou la détection de bactéries d'intérêt ou de parties de celle-ci, en une quantité inférieure à une valeur contrôle au sein de l'échantillon, permet de diagnostiquer la maladie de Crohn chez ledit sujet, et la présence au sein de l'échantillon de bactéries d'intérêt ou de parties de celles-ci en une quantité supérieure à ladite valeur contrôle permet au contraire d'exclure l'existence de la maladie de Crohn chez ledit sujet.

Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de diagnostic décrite est appliquée en dépistage, le sujet ne présentant aucun symptôme ou prédisposition connue. L'invention concerne par ailleurs une méthode permettant d'évaluer, chez un sujet, l'efficacité thérapeutique d'un traitement contre la maladie de Crohn, ladite méthode comprenant la mise en oeuvre in vitro ou ex vivo d'une méthode de détection selon l'invention sur un échantillon biologique provenant d'un sujet traité contre la maladie de Crohn, l'apparition ou une augmentation de la quantité de bactérie(s) d'intérêt ou de parties de celle(s)-ci révélant l'efficacité dudit traitement, et la disparition ou la diminution de la quantité de bactérie(s) d'intérêt ou de parties de celle(s)-ci, révélant au contraire l'inefficacité dudit traitement, lorsque comparé à une valeur contrôle, par exemple lorsque comparé à la quantité de bactéries d'intérêt ou de parties de celles-ci détectées chez ledit sujet avant que ce dernier n'ait été traité contre la maladie de Crohn.

Dans le cadre de l'invention, une "valeur contrôle" désigne une concentration, quantité ou teneur en protéines, polypeptides, peptides ou acides nucléiques provenant de la bactérie d'intérêt telle que mesurée sur un « échantillon de référence » ou « échantillon contrôle », typiquement sur un « échantillon sain » également identifié en tant que « échantillon normal » dans le présent texte.

Cette valeur contrôle est par exemple obtenue à partir de mesures pratiquées dans plusieurs échantillon(s) biologique(s) obtenu(s) à partir d'un sujet, de préférence plusieurs sujets, qui ne souffre(nt) pas de la maladie de Crohn. L'échantillon de référence peut également correspondre à un échantillon obtenu à partir d'un ou plusieurs patients souffrant de la maladie de Crohn. C'est typiquement le cas dans le contexte de la mise en oeuvre d'une méthode de suivi de l'évolution de la maladie de Crohn ou de détermination de l'efficacité d'un traitement de ladite maladie, où la valeur contrôle correspond de préférence à celle déterminée à partir d'un échantillon prélevé sur le sujet qui sera suivi, mais avant que le suivi et/ou le traitement dirigé contre la maladie de Crohn n'ait débuté chez ce sujet.

L'invention concerne également une méthode de traitement d'un sujet identifié (dépisté) comme souffrant de la maladie de Crohn, à l'aide d'un traitement conventionnel de la maladie de Crohn que le praticien saura sélectionner, de préférence à l'aide d'un peptide ou polypeptide (naturel ou synthétique) décrit dans le présent texte ou d'une séquence d'acide nucléique codant un tel peptide ou polypeptide administrée au sujet à traiter par exemple à l'aide d'un vecteur d'expression. La présente invention est illustrée par les figures et exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. FIGURES Figure 1 : Identifiants, séquences et annotation fonctionnelle et phylogénétique de trois protéines SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3 (mass matching contre la banque MetaHit-2009, ré-annotée 2014). Les peptides surlignés en caractères gras sont ceux vus en LC-MS/MS shotgun label-free. Les peptides en caractères gras soulignés désignent les peptides spécifiques ciblés en SRM. Les barres verticales délimitent les peptides vus en shotgun ou ciblés en SRM.

Figure 2: Alignement des séquences des trois protéines de séquences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3 (AlignUniprot - http://www.uniprot.org/blast/) Figure 3 : Recherche des domaines protéiques de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO: 3 dans la base de données InterPro (EMBL-EBI - http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan5/) EXEMPLES Les inventeurs ont découvert et validé, chez des patients en rémission ou en poussées modérées, un panel de signaux protéiques bactériens et humains associés à la maladie de Crohn (Juste et al, 2014). Les protéines bactériennes et quelques protéines humaines adhérentes aux cellules bactériennes sont extraites des selles des sujets. Parmi la myriade de protéines présentes, il a été mis en évidence, de manière surprenante, que certaines sont remarquablement moins abondantes chez les patients comparativement à des témoins en bonne santé, appariés sur l'âge, le sexe et la consommation de tabac.

Trois protéines microbiennes ont été découvertes comme étant plus abondantes chez les sujets sains comparativement aux malades par une méthode de spectrométrie de masse en tandem en shotgun label-free développée par les inventeurs (Guillot et al, 2013). L'identification des protéines repose sur la technique d'empreinte de fragmentation (Mass Matching) et sur l'interrogation des bases de données métagénomiques MetaHit (Qin et al, 2010) à l'aide de l'outil bioinformatique X!TandemPipeline (http://pappso.inra.fr/bioinfo/xtandempipeline/). Leurs identifiants dans la base de données MetaHit 2009 ré-annotée en Février 2014, leurs séquences, ainsi que les peptides vus en spectrométrie de masse et ayant permis leur identification apparaissent sur la figure 1. Matériels et Méthodes Douze micobiotes intestinaux (ensemble des populations microbiennes intestinales) sont extraits à partir de 12 échantillons de selle fraîche (m = 2 g) recueillis chez 6 patients Crohn en rémission et 6 témoins indemnes de toute pathologie intestinale. La méthode d'extraction est celle décrite par les inventeurs (Juste et al., 2014). Elle repose sur la récolte des cellules bactériennes à leur densité de flottaison au sein d'un gradient de Nycodenz continu, préformé par congélation/décongélation. L'échantillon de selle alourdi en Nycodenz est déposé sous le gradient préformé et les cellules bactériennes remontent à leur densité de flottaison au cours d'une centrifugation à faible vitesse (14 567 x g, 45 min, 4°C). L'anaérobie et l'intégrité des bactéries sont ainsi préservées tout au long du processus d'extraction. Les culots bactériens lavés en Tris 20 mM, NaC1 138 mM, KC1 2,7 mM, Na-deoxycholate 0,03% (m/v), pH 7,4 sont conservés à -80°C. Un volume de 1,5 ml de tampon de lyse (urée 8.75 M, thiourée 2,5 M, CHAPS 5% m/v, DTT 75 mM, et dihydrate spermine base 31,25 mM) est déposé sur chaque culot encore congelé. La lyse chimique se fait à température ambiante pendant 1 h au cours de laquelle les échantillons sont vortexés vigoureusement toutes les 10 min. Les lysats sont centrifugés à très grande vitesse (24 5419 x g, 1 h, 18°C) et les surnageants sont récoltés et ramenés à pH neutre avec HCL concentré. Les protéines sont purifiées avec le kit PlusOne SDS-PAGE (GE-Healthcare), puis dosées avec le Kit 2-D Quant (GE-Healthcare). Tous les échantillons sont ramenés à une concentration de protéines de 41..t.g/i..11 avec le tampon de dénaturation de Laemmli. Pour l'étape de découverte, nous utilisons une méthode de protéomique globale non ciblée (shotgun label-free) avec fractionnement préalable de l'échantillon sur gel SDS-PAGE pour une meilleure couverture du protéome. Brièvement, 60 tg de protéines d'un patient Crohn et 60 tg de protéines d'un sujet sain migrent pendant 45 min environ dans un gel SDS-PAGE (gel NuPage Novex 4-12%, 200V, 110mA) monté sur un dispositif XCell SureLockTM (Invitrogen). Après migration, le gel est rincé à l'eau, coloré au bleu de Coomassie et scanné.

Chacune des deux pistes est découpée en 20 bandes équivalentes et chacun des 40 morceaux de gel est soumis à une réduction, alkylation et digestion tryptique selon un protocole standard (Shevchenko et al, 2007). Les peptides trypsiques sont extraits du gel par acétonitrile 50%, acide formique 0,2%, puis séchés sous vide (SpeedVac), repris dans 25 pl de tampon HPLC (acide formique 0.1%, acétonitrile 2%) et analysés individuellement (soit 40 analyses au total) par LC-MS/MS en couplage (NanoLC Ultra System, Eksigent) connectée à un spectromètre de masse (Qexactive, Thermo). Pour ce faire, 4 pl d'extrait peptidique sont chargés sur une pré-colonne (phase stationnaire PepMap 100 C18, 5 pm; colonne 300pm DI, 5mm, Dionex) à un débit de 7,50/min. Au bout de 3 min, la pré-colonne est connectée à une colonne de séparation (phase stationnaire C18 Biosphere, 3 pm; colonne 75pm DI, 150pm, Nanoseparations) et les peptides sont élués en utilisant un gradient linéaire (5-35%) de tampon B (acétonitrile 80%, acide formique 0,1%) en tampon A (acétonitrile 2%, acide formique 0,1%) pendant 40 min pour une durée totale d'acquisition de 50 min par morceau de gel. L'ionisation est réalisée via une aiguille de type TicoTip' (20pm DI, 360pm DE, New Objective). Les ions peptides sont détectés automatiquement en mode data dépendant avec les paramètres suivants: "full scan" MS (m/z 400-1400 th) pour mesurer le rapport m/z des peptides et fragmentation des peptides observés à une énergie normaliser de collision fixer à 30% en HCD, sous le contrôle du logiciel Xcalibur (version 2.1, Thermo). Dans cette étude, seuls les ions précurseurs deux et trois fois chargés ont été sélectionnés pour être fragmentés en MS/MS avec une fenêtre d'exclusion de 40 sec en ayant activé le mode d'autocalibration sur l'ion 445.12003 (diméthycyclosiloxane). Nous utilisons le logiciel X!Tandem pour comparer les masses mesurées des peptides fragmentés avec les masses théoriques de fragmentation générées à partir de la base MetaHit [3 299 822 ORFs complets ou incomplets (Qin et al, 2010) réannotés pour leur fonction et leur taxonomie en Février 2014], associée à la base UniProtKB/Swiss-prot H. sapiens ainsi qu'à notre propre base de contaminants. Les paramètres de recherche ainsi que les seuils de validation des peptides et des protéines sont ceux décrits récemment par les inventeurs (Juste et al, 2014). Pour finir, nous utilisons le logiciel X!TandemPipeline (http://pappsolnra.fr/bioinfo/xtandempipeline/) pour résumer les résultats sous la forme de tableaux donnant le nombre d'ions peptides fragmentés attribués à chaque protéine, ainsi que la séquence de ces peptides. Par inférence, ce nombre permet d'estimer la quantité de ladite protéine dans plusieurs échantillons. Dans la présente invention, et par cette méthode dite du "spectral counting", le nombre total de spectres de fragmentation attribués à chaque protéine a été sommé pour les 20 fractions de l'échantillon "Crohn" d'une part, et les 20 fractions de l'échantillon "Sain" d'autre part. La somme des spectres attribués aux protéines SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3 est remarquablement faible dans l'échantillon "Crohn" comparativement à l'échantillon "Sain". Pour confirmer ces résultats, les 6 échantillons "Crohn" et les 6 échantillons "Sain" préparés plus haut (100 1..t.g de protéines purifiées de chaque échantillon) ont été analysés par la méthode de protéomique ciblée SRM (Selected Reaction Monitoring) avec marquage, détaillée par les inventeurs (Juste et al, 2014). Les peptides trypsiques spécifiques (non partagés avec d'autres protéines au sein de la base MetaHit) des protéines SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3 sont identifiés. Parmi eux, les peptides déjà identifiés en shotgun label-free et présentant des spectres de fragmentation de très bonne qualité sont privilégiés. Les peptides retenus ont une longueur idéale de 7 à 25 acides aminés et ne contiennent ni coupure manquée (« miscleavage ») ni méthionine. La sélection des transitions, la réalisation des essais microLC-SRM avec marquage, l'analyse des données, les contrôles qualité ainsi que les analyses statistiques sont ceux détaillés par les inventeurs (Juste et al, 2014). Dans la présente invention, et par cette méthode SRM avec marquage, la faible abondance des séquences peptidiques SEQ ID NO : 4 à SEQ ID NO : 13 et par inférence, la faible abondance des séquences protéiques SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3, est confirmée chez les malades relativement aux témoins.25 REFERENCES Artis D. Epithelial-cell recognition of commensal bacteria and maintenance of immune "homeostasis in the gut". Nat RevImmuno1.2008;8:411-420 - Beaugerie L, Brousse N, Bouvier AM, et al. Lymphoproliferative disorders in patients receiving thiopurines for inflammatory bowel disease: a prospective observational cohort study. Lancet. 2009;374:1617-1625 Bird et al. [Science 242 (1988) 423 Carbonnel F, Jantchou P, Monnet E, et al. 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Claims (9)

1. REVENDICATIONS1. L Utilisation d'une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et un fragment de celles-ci, ou d'une séquence d'acide nucléique codant ladite séquence d'acides aminés, comme marqueur de diagnostic de la maladie de Crohn, marqueur de suivi de l'évolution de la maladie de Crohn ou marqueur de suivi de l'efficacité d'un traitement dirigé contre la maladie de Crohn.
2. 2. Utilisation selon la revendication I, caractérisée -en ce que le fragment de la séquence 10 d'acides aminés comprend ou consiste en une séquence sélectionné parmi SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12 et SEQ ID NO : 13.
3. 3. Méthode de détection de la présence éventuelle dans un échantillon biologique d'un sujet à 15 tester pour la maladie de Crohn d'au moins une bactérie exprimant une séquence peptidique comprenant une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et un fragment de celles-ci, ou comprenant un acide nucléique codant ladite séquence peptique, ou d'une partie de ladite bactérie. 20
4. 4. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que la détection de ladite au moins une bactérie ou partie de celle-ci est réalisée par protéomique quantitative ciblée.
5. 5. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend: - la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un échantillon biologique du sujet à tester avec un 25 composé liant tout ou partie de ladite au moins une bactérie ou partie de celle-ci; et - la détection de la liaison dudit composé à ladite au moins une bactérie ou partie de celle-ci lorsqu'elle est présente dans l'échantillon biologique.
6. 6. Méthode pour obtenir des informations utiles pour le diagnostic de la maladie de Crohn 30 comprenant la mise en oeuvre in vitro ou ex vivo -d'une méthode de détection selon l'une quelconque des revendications 3 à 5 sur un échantillon biologique provenant d'un sujet à tester, caractérisée en ce que l'absence de bactérie ou de partie de celle-ci, ou la détection de bactéries ou de parties de celles-ci, en une quantité inférieure à une valeur contrôle au sein de l'échantillon, permet de diagnostique la maladie de Crohn chez ledit sujet, la présence ausein de l'échantillon de bactéries ou de parties de celles-ci en une quantité supérieure à ladite valeur contrôle permettant au contraire d'exclure l'existence de la maladie de Crohn chez ledit sujet. -
7. 7. Méthode permettant d'évaluer, chez un sujet, l'efficacité thérapeutique d'un traitement contre la maladie de Crohn, ladite méthode comprenant la mise en oeuvre in vitro ou ex vivo d'une méthode de détection selon l'une quelconque des revendication 3 à 5 sur un échantillon biologique provenant d'un sujet traité contre la maladie de Crohn, l'apparition ou une augmentation de la quantité de bactéries ou de parties de celles-ci révélant l'efficacité dudit traitement, et la disparition ou la diminution de la quantité de bactéries ou de parties de celles- ci révélant au contraire l'inefficacité dudit traitement, lorsque comparé à une valeur contrôle, par exemple lorsque comparé à la quantité de bactéries ou de parties de celles-ci détectées chez ledit sujet avant que ce dernier n'ait été traité contre la maladie de Crohn.
8. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, dans laquelle l'échantillon biologique comprend des matières fécales, des eaux fécales et/ou du tissu épithélial intestinal du sujet à tester ou du sujet souffrant de la maladie de Crohn.
9. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisée en ce que le sujet est un animal, typiquement un mammifère, de préférence un être humain, encore plus préférentiellement un sujet présentant des troubles digestifs chroniques, une maladie inflammatoire chronique de l'intestin (MICI) non classée, ou des antécédents familiaux de MICI.25