FR3040790A1 - Procede de determination de la presence d'un trematode parasitaire ou d'une infection associee, par detection d'au moins une proteine val ou d'un anticorps dirige contre au moins une proteine val - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de détermination de la présence d'un trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma, chez un mammifère, et en particulier, chez un être humain, le procédé comprenant les étapes successives suivantes : - disposer d'un échantillon biologique dudit mammifère, - détecter dans l'échantillon biologique l'éventuelle présence d'au moins une protéine VAL (« Venom-Allergen-Like ») dudit trématode parasitaire ou d'au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL dudit trématode parasitaire, - en déduire la présence ou l'absence dudit trématode parasitaire cible chez ledit mammifère, ainsi qu'une trousse de détermination de la présence dudit trématode parasitaire. La présente invention concerne aussi un procédé de diagnostic d'une infection causée par un trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma chez un mammifère, ainsi qu'une trousse de diagnostic d'une infection causée par ledit trématode parasitaire.
Description
La présente invention concerne le domaine de la parasitologie. Plus précisément, la présente invention est relative à un procédé de détermination de la présence d'un trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma, chez un mammifère. L'invention concerne également un procédé de diagnostic d'une infection causée par un trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma, chez un mammifère et les trousses associées à de tels procédés.
La schistosomiase (aussi appelée bilharziose) est une parasitose chronique provoquée par des vers trématodes du genre Schistosoma. L'infection se produit lorsque les larves du parasite (stade cercaire), libérées par des gastéropodes d'eau douce, pénètrent dans la peau d'un mammifère, notamment d'un être humain, lorsqu'il est en contact avec une eau infestée. Le trématode se développe alors selon un cycle bien défini : après pénétration des larves par voie transcutanée (stade cercaire), ces dernières se développent (stade schistosomule), puis passent au stade du schistosome adulte. Ces parasites vivent alors dans les vaisseaux sanguins, dans lesquels les femelles pondent leurs œufs. Certains des œufs sortent de l'organisme par les matières fécales ou l'urine et le cycle de vie parasitaire se poursuit (voir Figure 1). D'autres œufs sont piégés dans les tissus de l'organisme, provoquant une réaction immunitaire et des lésions évolutives dans les organes. Il se forme des granulomes. Ces lésions peuvent conduire notamment à l'apparition d'un début de cancer et au développement de carcinomes à plus long terme. L’OMS a estimé que plus de 300 millions de personnes dans la zone intertropicale, notamment en Afrique et en Asie, sont infectées et plus de 600 millions sont à risque d’infection dans 78 pays endémiques. La schistosomiase est la deuxième maladie parasitaire tropicale humaine la plus répandue, après le paludisme. Cette infection est plutôt considérée comme une infection touchant les pays en voie de développement. Toutefois, elle n'est pas limitée aux pays endémiques et peut également concerner les pays dits industrialisés lorsque des expatriés, des migrants, des militaires, du personnel humanitaire reviennent dans leur pays (Holtfreter MC, Moné H, Müller-Stôver I, Mouahid G, Richter J. Schistosoma haematobium infections acquired in Corsica, France, August 2013. Euro Surveifl 2014; 19(22):pii=20821 ; Brunet J, Pfaff AW, Hansmann Y, Gregorowïcz G, Pesson B, Abou-Bacar A, Candolfi E. An unusual case of hematuria in a French family returning from Corsica. Int J Infect Dis. 2015 Feb;31:59-60. doî: 10.1016/j.ijid.2014.10.024 ; Gautret P, Cramer JP, Field V, Caumes E, Jensenius M,
Gkrania-Kiotsas E, deVries PJ, Grobusch MP, Lopez-Velez R, Castelli F, Schlagenhauf P, Hervius Askling H, von Sonnenburg F, Lalloo DG, Loutan L, Rapp C, Basto F, Santos O'Connor F, Weld L, Parola P; EuroTravNet Network. Infectious diseases among travellers and migrants in Europe, EuroTravNet 2010. Euro SurveiH. 2012 Jun 28; 17(26). pii:20205).
Malgré le fait que le cycle biologique du trématode du genre Schistosoma ait été révélé il y a plus de 100 ans, très peu de connaissances au niveau moléculaire sont disponibles, en particulier, en termes d'interactions hôte-pathogène et de tropisme au sein de l'hôte définitif.
Le diagnostic de la schistosomiase chez l'être humain reste difficile ; notamment du fait que de nombreux symptômes en phases aiguë et chronique se confondent avec ceux d'autres maladies. En effet, les symptômes de cette maladie peuvent être notamment, des douleurs abdominales, une toux, des diarrhées, une fatigue, de la fièvre, etc. De plus, la maladie ne confère pas une immunité stable. Il existe donc un risque majeur pour des personnes, notamment vivant dans les pays endémiques, qu'elles soient à nouveau infectées.
En raison des symptômes non spécifiques de la schistosomiase, la confirmation par un test biologique est nécessaire pour s'assurer de la présence du trématode parasitaire. À l'heure actuelle, cette confirmation par test biologique s'effectue par la combinaison, d'une part, d'un test sanguin pour éosinophilie et d'autre part, d'une recherche d'œufs dans les échantillons filtrés de selles ou d'urines au microscope (test Kato-Katz).
Le test sanguin pour éosinophilie n'est pas spécifique d'une infection due au trématode parasitaire, notamment du genre Schistosoma. Ce test permet seulement de mettre en évidence une helminthiase. Il est donc nécessaire de le coupler avec un examen parasitologique des selles ou des urines.
Le test Kato-Katz est actuellement le test de référence pour détecter une schistosomiase. Ce test consiste en l'observation visuelle des œufs dans les échantillons de selles ou d'urines au microscope optique. Malheureusement, ce test n'est informatif que lorsqu'un couple de trématodes a atteint la maturité sexuelle et que la femelle a commencé à pondre des œufs, c'est-à-dire entre trois à six mois après l'infection. Ce test ne permet donc pas de détecter les parasites aux premiers stades de l'infection. De plus, ce type de test nécessite un matériel performant et du personnel qualifié; ce qui est coûteux. Dans de nombreuses régions endémiques, ce test ne peut donc pas être mis en œuvre en raison d'un manque de matériel, tel que les microscopes. Récemment, un test sérologique a été proposé. Il utilise deux protéines sécrétées par les œufs de la femelle adulte : l'antigène circulant cathodique (CCA) et l'antigène circulant anodique (CAA) (Lamberton, P.H., Kabatereine, N.B., Oguttu, D.W., Fenwick, A., Webster, IP. (2014) Sensitivity and specificity of multiple Kato-Katz thick smears and a circulating cathodic antigen test for Schistosoma mansoni diagnosis pre- and post-repeated-praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 8(9): e3139 ; Degarege, A., Legesse, M., Medhin, G., Teklehaymanot, T., Erko, B. (2014) Day-to-day fluctuation of point-of-care circulating cathodic antigen test scores and faecal egg courts in children infected with Schistosoma mansoni in Ethiopia. BMC Infect Dis. 14: 210.). Toutefois, ce test sérologique utilise des marqueurs tardifs de la maladie, puisqu'il faut attendre que la femelle atteigne le stade d'adulte mature sexuellement pour pondre des œufs. En outre, ce test est utilisé en complément du test de référence, le test Kato-Katz, ou en complément d'un examen de tissus à partir de biopsies du foie ou de la vessie, par exemple. Ce test sérologique ne permet pas de détecter la présence du trématode parasitaire, notamment du genre Schistosoma, à un stade précoce du développement de l'infection et donc de traiter rapidement la personne infectée.
Ainsi, l'identification par un test biologique d'une infection par un trématode parasitaire, notamment par un trématode parasitaire du genre Schistosoma, n'est toujours pas satisfaisante. Il existe donc toujours un besoin de disposer d'un test de détermination de la présence chez un sujet d'un trématode parasitaire, notamment du genre Schistosoma, ou de l'infection due à la présence dudit trématode parasitaire, qui soit simple à mettre en œuvre, rapide et efficace. Il existe également un besoin de disposer d'un test de détermination de la présence de ce trématode parasitaire, notamment à un stade précoce de son développement.
Le séquençage des génomes des trématodes parasitaires et notamment ceux appartenant à l'espèce Schistosoma mansoni (S. mansoni), espèce dont la propagation dans le monde entier est la plus large, des génomes des trématodes parasitaires appartenant à l'espèce Schistosoma japonicum (S. Japonicum) et à l'espèce Schistosoma haematobium {S. haematobium) a été réalisé (Berriman M., Haas BJ., LoVerde P.T., Wilson R.A., Dillon G.P., Cerqueira G.C., Mashiyama S.T., Al-Lazikani B., Andrade L.F., Ashton P.D., Aslett M.A., Bartholomeu D.C., Blandin G.,
Caffrey C.R., Coghlan A., Coulson R., Day T.A., Delcher A., DeMarco R., Djikeng A-, Eyre T., Gamble J.A., Ghedin E., Gu Y., Heitz-Fowler C., H irai H., Hirai Y., Houston R., Ivens A., Johnston D.A., Lacerda D., Maœdo C.D., McVeigh P., Ning Z., Oliveira G., Overington J.P,. Parkhill J,. Pertea M., Pierce RJ,. Protasio A.V., Quail M.A., Rajandream M.A., Rogers J., Sajid M., Salzberg S.L., Stanke M., Tivey A.R., White O., Williams D.L., Wortman J., Wu W,, Zamanian M., Zerlotini A., Fraser-Liggett CM., Barrell B.G., El-Sayed N.M. (2009). The genome of the blood fluke Schistosoma mansoni. Nature. 460: 352-358. doi: 10.1038/nature08160 ; Young N.D., Jex A.R., U B., Liu S., Yang L., Xiong Z., Li Y., Cantaœssi €,, Hall R.S., Xu X., Chen F., Wu X., Zerlotini A., Oliveira G., Hofmann A., Zhang G., Fang X., Kang Y., Campbell B.E., Loukas A., Ranganathan S., Rollinson D., Rinaldi G., Brindley P.J., Yang H., Wang J., Wang J., Gasser R.B. (2012). Whole-genome sequence of Schistosoma haematobium. Nature Genet 44(2): 221-225. doi: 10.1038/ng.l065 ; Schistosoma japonïcum Genome Sequencing and Funational Analysis Consortium. (2009). The Schistosoma japonicum genome reveals features of host-parasite interplay. Nature460(7253): 345-351. doi: 10.1038/nature08140).
Une étude génomique effectuée par Chalmers I.W et al (Chalmers, I.W., McArdle, A J., Coulson, R.M., Wagner, M.A., Schmid, R., Hirai, H. and Hoffmann, K. F. (2008), Developmentally regulated expression, alternative splicing and distinct sub-groupings in members of the Schistosoma mansoni venom allergen-like (srnVAL) gene family. BMC Genomics9: 89.), a été réalisée sur les ARN transcrits à partir de l'ADN génomique de 5. mansoni. Il a été démontré que l'expression transcriptionnelle d'une famille de protéines appelées protéines VAL pour Venon Antigen-Like variait en fonction du cycle de vie du trématode parasitaire. Cette famille comprend 29 membres pour l'espèce Schistosoma mansoni. Aucune fonction n'a été, pour l'instant, décrite pour les protéines de cette famille, puisqu'elles ne possèdent pas de fonction enzymatique. Les analyses de séquences génomiques et protéiques in si/ico ont permis de montrer que cette famille appartenait à la superfamille des protéines SCP/Tpx-l/Ag 5/Pr-l/Sc 7 (famille SCP/TAPS) qui sont impliquées dans de nombreux processus biologiques tels que les réponses immunitaires, le développement testîcules/sperme, l'absorption de substance venimeuse par inoculation et l'invasion de l'hôte définitif par un nématode parasite. I.W. Chalmers et ai ont montré que le nombre d'ARN transcrits de certains membres de cette famille variait en fonction du cycle de vie du trématode parasitaire, et notamment que les ARN transcrits de smVALl, smVAL4 et smVALlO étaient plus abondants lorsque le trématode est au stade cercaire ; que les ARN transcrits de smVAL2, smVAL3, smVAL5 et smVAL9 étaient plus abondants lorsque le trématode est au stade miracidium tandis que d'autres ARN transcrits tels que ceux de smVAL6, smVAL7, smVALll et smVAL13 avaient un profil ubiquitaire quel que soit le cycle de vie du trématode. Toutefois, ce profil d'expression d'ARN transcrits en fonction du cycle de vie du trématode n'a pas été confirmé par des expériences de profil d'expression protéique. Or, il est bien connu que de nombreux processus biologiques peuvent survenir entre la transcription d'un ARNm et sa traduction en protéine et que la quantité de protéine transcrite ne correspond pas nécessairement au profil d'expression d'ARN, de sorte qull n'y a pas de lien entre le profil d'expression d'ARN et la quantité de protéines (Jackson DA, Pombo A, Iborra F. The balance sheet for transcription: an analysis of nuclear RNA metabolism in mammalian cells. FASEB J. 2000 Feb; 14(2) :242-54. ; Trask HW, Cowper-Sal-lari R, Sartor MA, Gui J, Heath CV, Renuka J, Higgins AJ, Andrews P, Korc M, Moore JH, Tomlinson CR. Microarray analysis of cytoplasmîc versus whole cell RNA reveals a considérable number of missed and false positive mRNAs. RNA. 2009 Oct;15(10): 1917-28. doi: 10.1261/rna. 1677409 ; Latchman, David S. (2005). Gene régulation: a eukaryotic perspective. Ed. Taylor & Francis). D'autres études se sont concentrées sur l'identification des protéines sécrétées par les œufs du trématode parasitaire afin de comprendre les mécanismes immunologiques et de pathogénèse dudit trématode. C.L Cass et al ont identifié 188 protéines différentes, sécrétées par les œufs de S. mansoni dont smVAL2, smVAL3, smVAL5 et smVAL 9 (Cass, C.L., Johnson J.R., Califf LL, Xu T., Hernandez H.J., Stadecker M.J., Yates III J.R., Williams D.L., (2007). Proteomic analysis of Schitosoma mansoni egg sécrétions. Molecular & Biochemica! Parasitoloy 155, 84-93). Aucune fonction et aucun rôle de ces protéines n'ont été cependant mentionnés. De plus, une telle étude réalisée sur les œufs n'étudie pas le profil d'expression de protéines qui seraient sécrétées en fonction du développement du trématode, et encore moins le profil d'expression de protéines lorsque le trématode est au sein d'un hôte.
Wilson R.A a cité un grand nombre de protéines de Schistosoma pouvant potentiellement être des facteurs de virulence, parmi lesquelles figurent les protéines VAL4, VAL10 et VAL 18, sans toutefois fournir aucune donnée expérimentale ou démonstration à ce sujet (Wilson R.A., (2012) Virulence factors of schistosomes. Microbes and Infection 14, 1442-1450). Il est mentionné dans cet article que la fonction des protéines appartenant à la famille VAL est inconnue. Ces protéines n'étant pas des protéines enzymatiques, il est difficile de leur attribuer une fonction.
La Demanderesse a maintenant démontré que des protéines VAL (Venom-Allergen-Like) d'un trématode parasitaire, notamment du genre Schistosoma, étaient de bonnes cibles, pour déterminer la présence d'un trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma, dans un échantillon biologique, notamment à un stade précoce de son développement, par utilisation des protéines elles-mêmes en tant que marqueurs antigèniques ou des anticorps dirigés contre ces protéines en tant que marqueurs sérologiques, appelés ci-après marqueurs dIntérêt. Ces protéines et ces anticorps sont également de bons marqueurs de diagnostic d'une infection causée par ledit trématode parasitaire, notamment à un stade précoce de l'infection. L'utilisation de ces marqueurs offre donc des possibilités de développer différents tests rapides et fiables de détermination de la présence d'un trématode parasitaire, de préférence du genre de Schistosoma, et ce, quel que soit le stade de développement dudit trématode.
Elle permet également de développer différents tests de diagnostics rapides et fiables d'une infection causée par un trématode parasitaire, de préférence du genre de Schistosoma, chez des mammifères, notamment des tests qui permettent un diagnostic d'une infection précoce.
En outre, tes tests de détermination de la présence d'un trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma, et les tests de diagnostic d'une infection causée par un trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma, selon l'invention ne nécessitent pas d'appareillage coûteux et complexe. Ils peuvent donc être mis en œuvre dans des centres de santé éloignés des métropoles ou dans des dispensaires éloignés, situés dans les régions tropicales et subtropicales, par exemple au chevet du patient En outre, leur interprétation ne nécessite pas nécessairement un personnel hautement qualifié.
Un premier objet de llnvention concerne un procédé de détermination de la présence d'un trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma, chez un mammifère, et en particulier chez un être humain, le procédé comprenant les étapes successives suivantes : - disposer d'un échantillon biologique dudit mammifère, - détecter dans l'échantillon biologique l'éventuelle présence d'au moins une protéine VAL (« Venom-Allergen-Like ») dudit trématode parasitaire ou d'au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL dudit trématode parasitaire, - en déduire la présence ou l'absence dudit trématode parasitaire cible chez ledit mammifère.
Un deuxième objet de l'invention concerne un procédé de diagnostic d'une infection causée par un trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma, chez un mammifère, et en particulier chez un être humain, le procédé comprenant les étapes successives suivantes : - disposer d'un échantillon biologique dudit mammifère, - détecter dans l'échantillon biologique l'éventuelle présence d'au moins une protéine VAL (« Venom-Allergen-Like ») dudit trématode parasitaire ou d'au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL dudit trématode parasitaire, - en déduire si ledit mammifère est atteint ou non par une infection causée par ledit trématode parasitaire.
Selon un mode de réalisation, au moins deux protéines VAL différentes dudit trématode parasitaire ou au moins deux anticorps, chacun étant dirigé contre une protéine VAL différente dudit trématode parasitaire, peuvent être détectés dans les procédés de l'invention.
Avantageusement, lesdites au moins deux protéines VAL, détectées en tant que telles ou du fait des anticorps dirigés contre elles, dites protéines VAL cibles, sont sécrétées par ledit trématode à différents stades de son développement.
Avantageusement, au moins une protéine VAL cible est sécrétée par ledit trématode à un stade précoce de son développement et au moins une protéine VAL cible est sécrétée par ledit trématode à un stade avancé de son développement.
Avantageusement, le trématode parasitaire appartient au genre Schistosoma, de préférence appartient à l'espèce S. mansoni,
Selon un mode de réalisation, on détecte : - au moins une protéine smVAL (VAL de 5. mansoni) choisie parmi smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7 et smVALlO de SEQ ZD N° 10, et - au moins une protéine smVAL choisie parmi smVAL8 de SEQ ID N° 8, smVALll de SEQ ID N° 11, et smVAL13 de SEQ ID N° 13.
Avantageusement, au moins la protéine smVAL4 de SEQ ID N° 4 et la protéine smVALlS de SEQ ID N° 13 sont détectées.
Avantageusement, la détection d'au moins une protéine VAL en tant que marqueur antigénique est réalisée grâce à au moins un anticorps dirigé contre ladite protéine VAL, choisi parmi les anticorps monodonaux et polyclonaux et les fragments de tels anticorps. Selon un mode de réalisation concernant la détection de marqueurs dits sérologiques, on détecte : - au moins un anticorps choisi parmi les anticorps dirigés contre la protéine smVAL4 de SEQ ID N° 4, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL7 de SEQ ID N° 7, et les anticorps dirigés contre la protéine smVALlO de SEQ ID N° 10, et - au moins un anticorps choisi parmi les anticorps dirigés contre la protéine smVALS de SEQ ID N° 8, les anticorps dirigés contre la protéine smVALll de SEQ ID N° 11, et les anticorps dirigés contre la protéine smVAL13 de SEQ ID N° 13.
Avantageusement, on détecte au moins un anticorps dirigé contre la protéine smVAL4 de SEQ ID N° 4 et un anticorps dirigé contre la protéine smVAL13 de SEQ ID N° 13.
Avantageusement, la détection d'un anticorps dirigé contre une protéine VAL peut être réalisée grâce à un partenaire de liaison dudit anticorps, qui peut notamment être la protéine VAL, notamment smVAL, contre laquelle l'anticorps est dirigé, ou un fragment de ladite protéine comprenant un site de reconnaissance ou épitope pour l'anticorps. Ce partenaire de liaison peut être d'origine native ou préparé de façon recombinante par des techniques connues de l'homme du métier.
Avantageusement, l'anticorps éventuellement présent dans ledit échantillon que l'on cherche à détecter peut être une immunoglobuline, de préférence une immunoglobuline de classe M, une immunoglobuline de classe G, ou une immunoglobuline de classe E, de manière encore plus préférée une immunoglobuline humaine de classe M ou une immunoglobuline humaine de classe G ou une immunoglobuline humaine de classe E. L'échantillon biologique peut être un échantillon de sang, notamment de sérum, un échantillon de selles ou un échantillon d'urine.
Un troisième objet de l'invention concerne une trousse de détection de la présence d'un trématode parasitaire, notamment du genre Schistosoma chez un mammifère, et en particulier, chez un être humain, ladite trousse pouvant comprendre, pour la détection du marqueur antigénique, au moins un partenaire de liaison d'une protéine VAL, et notamment au moins un partenaire de liaison d'une protéine smVAL, ou, pour la détection du marqueur sérologique, au moins un partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une protéine VAL, et notamment au moins un partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une protéine smVAL, ainsi que des instructions d'utilisation permettant d'apporter une conclusion quant à la présence ou l'absence dudit trématode parasitaire cible chez ledit mammifère.
Un quatrième objet de l'invention concerne une trousse de détermination de la présence d'un trématode parasitaire, notamment du genre Schistosoma, chez un mammifère, et en particulier, chez un être humain, par détermination à la fois d'un marqueur antigénique et d'un marqueur sérologique, caractérisée en ce que ladite trousse comprend au moins un partenaire de liaison d'une protéine VAL et au moins un partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une protéine VAL, notamment au moins un partenaire de liaison d'une protéine smVAL et au moins un partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une protéine smVAL, et des instructions d'utilisation permettant d'apporter une conclusion quant à la présence ou l'absence d'une infection causée par ledit trématode parasitaire chez ledit mammifère.
Selon un premier mode de réalisation, les trousses selon l'invention comprendront au moins un partenaire de liaison d'une protéine VAL qui peut être un anticorps dirigé contre une protéine VAL, notamment dirigé contre une protéine smVAL, l'anticorps étant choisi parmi les anticorps monoclonaux, les anticorps polyclonaux et les fragments de tels anticorps.
Dans le cas où les trousses comprennent au moins un partenaire de liaison d'une protéine VAL, lesdites trousses peuvent comprendre, en outre, la protéine VAL du partenaire de liaison, notamment une des protéines smVAL, à titre de contrôle positif.
Selon un mode de réalisation, les trousses selon l'invention comprendront un partenaire de liaison qui sera un anticorps dirigé contre une protéine VAL choisie parmi smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7, smVALlO de SEQ ID N° 10, smVAL8 de SEQID N° 8, smVALll de SEQ ID N° 11 et smVAL13 de SEQ ID N° 13.
Selon un mode de réalisation, les trousses peuvent comprendre au moins deux partenaires de liaison, l'un pour une protéine VAL et l'autre pour une autre protéine VAL, les deux protéines VAL appartenant à la même espèce de trématode parasitaire, notamment deux partenaires de liaison chacun d'une protéine smVAL différente.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, les trousses selon llnvention comprendront au moins deux partenaires de liaison qui seront des anticorps, le premier anticorps étant dirigé contre une première protéine VAL choisie parmi smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7 et smVALlO de SEQ ID N° 10 et le deuxième anticorps étant dirigé contre une deuxième protéine VAL choisie parmi smVAL8 de SEQ ID N° 8, smVALll de SEQ ID N° 11 et smVAL13 de SEQ ID N° 13.
Selon un deuxième mode de réalisation, les trousses selon llnvention comprendront au moins un partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une protéine VAL choisie parmi smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7, smVALlO de SEQ ID N° 10, smVAL8 de SEQ ID N° 8, smVALll de SEQ ID N° 11 et smVAL13 de SEQ ID N° 13. Ledit partenaire de liaison pourra être ladite protéine smVAL ou un fragment de ladite protéine comprenant un site de reconnaissance par l'anticorps.
Selon un mode de réalisation, les trousses comprennent au moins deux partenaires de liaison, chacun pour un anticorps dirigé contre une protéine VAL différente, les deux protéines VAL appartenant à la même espèce de trématode parasitaire, notamment un premier anticorps dirigé contre une première protéine smVAL et un deuxième anticorps dirigé contre une deuxième protéine smVAL différente de la première.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, les trousses selon llnvention comprendront au moins deux partenaires de liaison, un premier partenaire de liaison pour un anticorps dirigé contre une première protéine VAL choisie parmi smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7 et smVALlO de SEQ ID N° 10 et un deuxième partenaire de liaison pour un anticorps dirigé contre une deuxième protéine VAL choisie parmi smVAL8 de SEQ ID N° 8, smVALll de SEQ ID N° 11 et smVAL13 de SEQ ID N° 13. Lesdits partenaires de liaison pourront être ladite protéine smVAL ou un fragment de ladite protéine comprenant un site de liaison pour l'anticorps.
La description ci-après, en référence aux figures annexées permet de mieux comprendre l'invention.
La Figure 1 illustre schématiquement un cycle de vie d'un trématode du genre Schîstosoma.
La Figure 2 représente des photographies d'un gel d'électrophorèse SDS-PAGE de protéines recombinantes smVAL4 et smVAL13 ayant ou non une étiquette GST (Figure 2A), ayant ou non une étiquette intéine (Figure 2B).
La Figure 3 représente : - partie A : une photographie d'une membrane obtenue après un Western Blot des protéines recombinantes smVAL4 et smVAL13, après coupure du tag GST, - partie B : une photographie d'un gel d'électrophorèse SDS-PAGE de protéines smVAL4 et smVAL13.
La Figure 4 représente une photographie d'une membrane obtenue après un Western Blot d'une réaction croisée avec des anticorps polyclonaux anti-smVAL4 et anti-smVAL13.
La Figure 5 représente une photographie d'une membrane obtenue après un Western Blot d'échantillons homogénats de ver 5. mansoni à différents stades de son développement. La détermination de la présence de protéines est effectuée avec un anticorps polyclonal antî-smVAL4 (Figure 5A) et avec un anticorps polyclonal anti-smVAL13 (Figure 5B).
La Figure 6 représente une photographie d'une membrane obtenue après un Western Blot d'échantillons de sérum de souris infectées par 5. mansoni. La détermination de la présence des protéines est effectuée avec un anticorps polyclonal anti-smVAL4 (Figure 6A) et avec un anticorps polyclonal anti-smVAL13 (Figure 6B). L'invention a pour premier objet un procédé de détermination, in vitro, de la présence d'un trématode parasitaire, de préférence du genre Schîstosoma, chez un mammifère, et en particulier chez un être humain, ledit procédé comprenant les étapes successives suivantes : - disposer d'un échantillon biologique dudit mammifère, - détecter dans l'échantillon biologique l'éventuelle présence d'au moins une protéine VAL (« Venom-Allergen-Like ») dudit trématode parasitaire ou d'au moins un anticorps dirigé contre ladite au moins une protéine VAL dudit trématode parasitaire, - en déduire la présence ou l'absence dudit trématode parasitaire cible chez ledit mammifère. L'invention concerne également un procédé de diagnostic, in vitro, d'une infection causée par un trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma, chez un mammifère, et en particulier, chez un être humain, ledit procédé comprenant les étapes successives suivantes : - disposer d'un échantillon biologique dudit mammifère, - détecter dans l'échantillon biologique l'éventuelle présence d'au moins une protéine VAL (« Venom-Allergen-Like ») dudit trématode parasitaire ou d'au moins un anticorps dirigé contre ladite au moins une protéine VAL dudit trématode parasitaire, - en déduire si ledit mammifère est atteint ou non par une infection causée par ledit trématode parasitaire.
Par « trématode parasitaire », on entend un trématode pouvant vivre aux dépens d'au moins un autre organisme, dit hôte. Le trématode parasitaire tire profit en se nourrissant, en s'abritant ou en se reproduisant aux dépens de l'hôte. Les trématodes parasitaires appartiennent au groupe des plathelminthes et vivent aux dépens d'au moins un autre organisme tel que, par exemple, les mammifères et en particulier les êtres humains, les bovins, les ovins et les équidés. De préférence, le trématode parasitaire peut être un trématode appartenant au genre Schistosoma, de manière encore plus préférée appartenant à l'espèce Schistosoma mansoni.
Par « infection», on entend une maladie infectieuse provoquée par la transmission d'un trématode parasitaire, notamment par un trématode parasitaire appartenant au genre Schistosoma. La maladie infectieuse peut être une schistosomiase, une opistorchîase ou une distomatose, et est, de préférence, une schistosomiase.
Le trématode du genre Schistosoma est un ver qui se développe au cours d'un cycle dixène gonochorique où l'hôte intermédiaire est un mollusque d'eau douce et l'hôte définitif est un mammifère, notamment un être humain. Ce cycle est représenté sur la Figure 1. Les couples de trématodes adultes (1) vivent dans le sang de l'hôte définitif, en particulier, un être humain (veines périportales pour les espèces causant la schistosomiase intestinale; veines péri-vessie pour celles qui causent la schistosomiase urogénitale). Chaque femelle pond de 20 à 1000 œufs/jour, selon les espèces. Les œufs (2) sont reconnaissables par leur morphologie: (a) œufs de S. haematobium présentent une épine terminale, (b) œufs de S. mansoni ont une épine latérale; (c) œufs de S. japonicum sont ronds. Les œufs sont excrétés soit par les selles (b, c), soit par l'urine (a). Une fois qu'ils atteignent une source d'eau douce, ils éclosent en un stade appelé miracidium cilié vivant en liberté (3). Celui-ci a une vie brève, et a 24h-48h pour nager vers son hôte, le mollusque, et le pénétrer. A l'intérieur des escargots d'eau douce, le nombre de parasites augmente par reproduction asexuée. Deux stades de développements successifs résultent du miracidium: la sporocyste mère (4) et la sporocyste fille (5). Cette dernière rejette dans l'eau des milliers de larves libres à vie brève (cercatre) (6), qui représentent le stade infectieux pour l'hôte, notamment l'être humain. Les cercaires sont capables de pénétrer la peau humaine intègre ou lésée et de se développer en une forme juvénile: le schistosomule (7). Le schistosomule subit une maturation, essentiellement morphologique, qui lui permet de quitter les poumons et de gagner le système circulatoire péri-hépatique où il se différencie en schistosome adulte mâle ou femelle sexuellement mûrs (1). La femelle atteint sa maturité sexuelle, dès lors qu'elle se loge dans le canal gynécophore du mâle. Le couple migre alors vers le lieu de ponte (plexus mésentériques pour S. mansoni) où il se localise définitivement. À ce stade, la femelle commence à pondre des œufs en continu (jusqu'à 300 par jour pour S. mansoni), dont une partie est piégée dans les tissus où ils formeront des granulomes, à l'origine d'une infection. L'autre partie des œufs traverse la paroi intestinale ou vésicale pour finalement être excrétée dans les selles ou les urines. Le même cycle, mais avec un hôte définitif différent, peut ainsi décrire les stades de développement des trématodes parasitaires, tels que ceux cités dans le tableau n°l ci-après. Ce cycle est donc commun à tous les trématodes parasitaires.
Il existe plusieurs trématodes parasitaires qui sont classés en différents genres parmi lesquels on peut notamment citer le genre Schistosoma, le genre Opisthorchiidae, le genre Fascioia et le genre Cionorchis. Chaque espèce peut avoir différents hôtes qui diffèrent d'une espèce à l'autre et provoque un type de schistosomiase, une distomatose ou une opistorchiase. Certaines espèces peuvent être co-endémiques.
Les espèces connues à ce jour du trématode parasitaire du genre Schistosoma sont les suivantes: - Schistosoma mansoni (5. mansonî) dont l'hôte est notamment un être humain et qui est responsable de schistosomiases intestinales. Il est notamment présent en Afrique, en Amérique latine et aux Antilles. Cette espèce est la plus propagée dans le monde entier, 90% des cas étant néanmoins situés en Afrique. - Schistosoma haematobium {S. haematobium) dont l'hôte est notamment un être humain et qui est responsable de schistosomiases urogénitales. Il est notamment présent en Afrique, en Inde et dans la Péninsule arabique. C'est le premier parasite pour lequel un lien direct avec un carcinome épidermoide de la vessie a été établi. - Schistosoma japonicum (5. japonicum) dont l'hôte est notamment un être humain ou un bovin. Il est responsable de schistosomiases intestinales avec des complications artério-veineuses. Il est notamment présent en Chine, aux Philippines, au Cambodge, en Indonésie et en Thaïlande. - Schistosoma mekongi {S. mekongi) dont l'hôte est notamment un être humain et qui est responsable de schistosomiases intestinales avec des complications artério-veineuses. Il est notamment présent en Chine, en particulier, méridionale (province de Guan Xi), au Laos, au Cambodge et en Thaïlande. - Schistosoma intercalatum (5. intercaiaturri) dont l'hôte est notamment un être humain et qui est responsable de schistosomiases intestinales avec des complications génitales ou rectales, Il est notamment présent en Afrique centrale-occidentale (Congo-Cameroun). - Schistosoma bovis (S. bovis) dont l'hôte est notamment un bovin, un ovin ou un équidé. Il est répandu dans les pays de la Méditerranée et en Afrique. - Schistosoma incognitum, S. indicum, S. spindaie ont pour hôte un bovin et sont répandus en Asie (leur génome n'a pas été séquencé).
Une espèce connue à ce jour du trématode parasitaire du genre Opisthorchiidae est notamment Opisthorchis veverrini dont l'hôte est un être humain. Opisthorchis veverrini && responsable d'une maladie appelée opistorchiase. Il infecte les voies biliaires humaines. Il est notamment présent en Asie.
Les espèces connues à ce jour du trématode parasitaire du genre Fasdola sont : - Fascioia hepatica dont l'hôte est notamment un mammifère, en général, un ruminant. Il infecte les voies biliaires et provoque une distomatose ; - Fasciofa gigantica dont l'hôte est notamment un ruminant.
Une espèce connue à ce jour du trématode parasitaire du genre Qonorchis est notamment Qonorchis sinensis dont l’hôte est un être humain. Ce trématode est responsable de la distomatose humaine. Il est notamment présent en Extrême-Orient.
Le mammifère dont est issu l'échantillon biologique utilisé dans le cadre de l'invention pour réaliser la détection, sera adapté au genre du trématode, de manière préférée à l'espèce de Schistosoma, à détecter selon les informations ci-dessus.
Par « protéine VAL », on entend une protéine appartenant à la famille des protéines Venon Allergen Like. L'alignement des séquences en acides aminés de ces protéines montrent qu'elles possèdent un domaine SCP/TAPS (Sperm çoating protein/Tpx- 1/Ag5/PR- 1/Sc7) (Pfam domain PF00188, http://pfam.sanger.ac.uk/). Une protéine appartient à la famille des protéines VAL si elle présente plus de 30 % d'identité avec la séquence du domaine SCP/TAPS. Il convient également de préciser que le processus d'appartenance au Pfam domain PF00188 n'est pas seulement basé sur l'identité de séquence, après un alignement multiple, mais aussi sur un profil dit « Hidden Markov Model », qui est un modèle de probabilité et statistique pour mettre en évidence des homologies des séquences même en présence d'insertions ou délétions. Le tableau 1 ci-dessous liste le nombre actuellement connu de protéines VAL déduites de séquences génomiques de différents trématodes parasitaires.
Tableau 1
Les protéines VAL actuellement identifiées par analyses protéiques sont listées dans le tableau 2. La littérature citée dans le tableau 2 est basée sur des expériences de protéomique qui visent à identifier toutes les protéines présentes dans les échantillons analysés ; les auteurs ne se sont pas intéressés aux profils d'expression protéiques, autrement dit, les auteurs ne se sont pas intéressés à quantifier le niveau d'expression des protéines, ni à comparer l’expression desdites protéines dans les différents stades de développement du parasite.
Tableau 2
Par « protéine VAL cible », on entend soit le marqueur antigènique, c'est-à-dire la protéine détectée, soit la protéine contre laquelle est dirigée le marqueur sérologique dételé. Par « marqueur d'intérêt », on entend la protéine détectée ou l'anticorps détecté.
Dans le cadre de l'invention, la Demanderesse a démontré que la présence d'un trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma chez son hôte, notamment chez un mammifère et en particulier, chez un être humain, pouvait être déterminée en détectant dans un échantillon biologique issu dudit hôte, la présence éventuelle d'au moins une protéine VAL, notamment d'au moins une protéine VAL appartenant à l'espèce S. mansoni, ci-après appelée protéine smVAL, ou la présence éventuelle d'au moins un anticorps dirigé contre ladite au moins une protéine VAL, notamment d'au moins un anticorps dirigé contre ladite au moins une protéine smVAL. Ainsi, si la protéine VAL ou l'anticorps sont présents dans l'échantillon testé, cela signifie que le trématode parasitaire est présent chez l'hôte.
La détermination de la présence d'au moins une protéine VAL, notamment smVAL, ou d'au moins un anticorps dirigé contre ladite au moins une protéine VAL, notamment contre ladite au moins une protéine SmVAL, dans un échantillon biologique permet également de conclure s'il y a une infection ou non. Ainsi, si au moins un marqueur d'intérêt parmi la protéine VAL et l'anticorps sont présents dans l'échantillon testé, cela signifie que l'hôte est infecté par le trématode parasitaire.
En outre, la Demanderesse a montré qu'en sélectionnant certaines protéines VAL cibles, il était possible de détecter la présence dudit trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma, dès les premiers jours de l'infection de l'hôte par ledit trématode, donc à un stade précoce de l'infection.
De plus, la Demanderesse a également montré qu'en sélectionnant certaines protéines VAL cibles, il était possible de déterminer le stade du cycle de vie dudit trématode parasitaire à l'intérieur de son hôte.
Ainsi, il est possible grâce aux procédés de l'invention, lorsque le trématode parasitaire, en particulier, un trématode de l'espèce 5. mansoni est présent dans son hôte, notamment chez l'être humain, de déterminer la présence dudit trématode parasitaire à un stade précoce ou à un stade avancé de son développement.
Par «stade précoce de son développement », on entend tout trématode à l'état de larve cercaire ou à l'état juvénile, c'est-à-dire à un stade de son développement où il n'est pas capable de pondre des œufs. Le stade précoce de développement d'un trématode parasitaire, de préférence d'un trématode du genre Schistosoma, peut être notamment le stade cercaire, et tous les stades des schistosomules ou larves juvéniles.
Par « stade avancé de son développement », on entend un trématode à l'âge adulte, notamment sexuellement différencié, capable de pondre des œufs. Le stade avancé de développement d'un trématode, de préférence d'un trématode du genre Schistosoma, peut donc être le stade adulte male ou le stade adulte femelle, ou correspondre aux œufs piégés dans les tissus de l'hôte, qui sont la cause du stade chronique et avancé de la maladie.
La détermination de la présence du trématode parasitaire à un stade précoce ou avancé de son développement a son importance pour le traitement des personnes ayant une infection due audit trématode. Elle permet ainsi de proposer un traitement médical approprié à la personne infectée.
Selon un mode de réalisation, au moins deux protéines VAL différentes, mais appartenant à la même espèce de trématode parasitaire, notamment au moins deux protéines smVAL, sont détectées. Dans ce mode de réalisation, les deux protéines VAL sont différentes dans leurs structures primaires protéiques. De manière préférée, lorsqu'au moins deux protéines VAL sont détectées, ces dernières seront des protéines VAL d'une même espèce de Schistosome, par exemple, de 5. mansoni, de S. japonicum ou de S. haematobium. Elles peuvent être notamment sécrétées par ledit trématode au même stade de son développement. Par exemple, les deux protéines peuvent être sécrétées à un stade précoce ou bien les deux protéines peuvent être sécrétées à un stade avancé de son développement. En particulier, on peut détecter au moins deux protéines VAL, notamment au moins deux protéines smVAL, sécrétées toutes les deux à un stade précoce du développement dudit trématode, par exemple, l'une sécrétée au stade miracidium et l'autre au stade cercaire.
Selon un autre mode de réalisation, les protéines VAL détectées, notamment les protéines smVAL détectées, sont sécrétées par ledit trématode à des stades différents de son développement, notamment l'une peut être sécrétée à un stade précoce de son développement et l'autre à un stade avancé. Ce mode de réalisation présente l'avantage de pouvoir déterminer si un hôte, notamment un être humain, est en cours de réinfection par ledit trématode.
Par « protéine sécrétée », on entend toute protéine directement accessible pour la détection par les procédés de l'invention. C'est notamment le cas lorsque la protéine est libérée par le trématode parasitaire à l'extérieur de ces cellules ou que la protéine se trouve en surface de ces cellules.
La ou les protéîne(s) VAL détectée(s) peuvent être choisies parmi : smVALl de SEQ ID n°l, smVAL2 de SEQ ID n°2, smVAL3 de SEQ ID n°3, smVAL4 de SEQ ID n°4, smVALS de SEQ ID n°5, smVAL6 de SEQ ID n°6, smVAL7 de SEQ ID n°7, smVALS de SEQ ID n°8, smVAL9 de SEQ ID n°9, smVALlO de SEQ ID n°10, smVALll de SEQ ID n°ll, smVAL12 de SEQ ID n°12, smVAL13 de SEQ ID n°13, smVAL14 de SEQ ID n°14, smVAL15 de SEQ ID n°15, smVALlô de SEQ ID n°16, smVAL17 de SEQ ID n°17, smVAL18 de SEQ ID n°18, smVAL19 de SEQ ID n°19, smVAL20 de SEQ ID n°20, smVAL21 de SEQ ID n°21, smVAL22 de SEQ ID n°22, smVAL23 de SEQ ID n°23/ smVAL24 de SEQ ID n°24, smVAL25 de SEQ ID n°25, smVAL26 de SEQ ID n°26, smVAL27 de SEQ ID n°27, smVAL28 de SEQ ID n°28/ smVAL28 de SEQ ID n°29, sjVALl de SEQ ID n°30, sjVAL6 de SEQ ID n°31/ sjVAL9 de SEQ ID n°32, sjVALll de SEQ ID n°33, sjVAL13 de SEQ ID n°34 et sjVAL14 de SEQ ID n°35 ou leurs homologues.
Les séquences protéiques SEQ ID n°l à 35 sont regroupées dans le tableau 3 à la fin de la description de la présente demande.
Comme il est bien connu de l'homme du métier, il existe des polymorphismes protéiques et les séquences données ci-dessus ne sont qu'indicatives. Ce sont des séquences consensus indiquées dans la base de donnés Swiss-Prot, mais il peut exister des substitutions d'acides aminés dans un pourcentage qui sera évalué par l'homme du métier pour considérer qu'il s'agit d'une protéine homologue. Dans le cadre de la présente invention, il est donc possible que la protéine VAL détectée corresponde exactement aux séquences ci-dessus mentionnées, ou à une protéine homologue à ladite protéine VAL.
De façon générale, le terme « homologue » se réfère à des protéines ayant une séquence et une structure protéique native présentant une ou plusieurs additions, substitutions (généralement conservatrices en termes de nature) et/ou délétions d'acide aminé, par rapport à la molécule native, dans la mesure où les modifications ne détruisent pas la réactivité antigènique.
Les homologues particulièrement préférés incluent les substitutions conservatrices en nature, c'est-à-dire les substitutions qui prennent place dans une famille d'acides aminés. Spécifiquement, les acides aminés sont généralement divisés en 4 familles, à savoir (1) les acides aminés acides tels que l'aspartate et le glutamate, (2) les acides aminés basiques tels que la lysine, l'arginine et lîiistidine, (3) les acides aminés non polaires tels que l'alanine, la leucine, llsoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine et le tryptophane et (4) les acides aminés non chargés polaires tels que la glycine, l'asparagine, la glutamine, la cystéine, la sérine, la thréonine et la tyrosine. La phénylalanine, le tryptophane et la tyrosine sont parfois classés en acides aminés aromatiques. Par exemple, on peut prédire, de façon raisonnable, qu'un remplacement isolé de leucine par de llsoleucine ou de la valîne, d'un aspartate par un glutamate, d'une thréonine par une sérine, ou un remplacement conservateur similaire d'un acide aminé par un autre acide aminé ayant un rapport structurel, n'aura pas d'effet majeur sur l'activité biologique. L'homme du métier déterminera facilement les régions de la protéine d'intérêt qui peuvent tolérer un changement par référence aux plots Hopp/Woods et Kyte-Doolite, bien connus dans la technique.
Par « homologie », on entend le pourcentage d'identité entre deux molécules protéiques. Deux séquences d'acides aminés seront considérées comme « homologues » l'une par rapport à l'autre, lorsque leurs séquences présentent au moins 60%, de préférence au moins 75%, de préférence encore au moins 85%, de préférence encore au moins 90% et davantage préféré au moins 95%, voire 98% ou plus d'identité de séquence. L'identité de séquence sera déterminée de manière globale, de préférence, selon la technique décrite par Smith, Temple F.; and Waterman, Michael S., dans « Identification of Common Molecular Subsequences », Journal of Molecular Bioloav. vol. 147, 1981, p. 195-197.
Selon un mode de réalisation particulier, la ou les protéine(s) VAL détectée(s) est (sont) choisie(s) parmi les protéines VAL du trématode parasitaire appartenant à l'espèce S. japonicum. Avantageusement, ce mode de réalisation permet de diagnostiquer une infection résultante d'une schistosomiase intestinale avec potentiellement des complications artério-veineuses, en particulier, à partir d'un échantillon biologique issu d'un être humain ou d'un bovin (notamment buffle ou vache).
Selon un autre mode de réalisation, la ou les protéine(s) VAL détectée(s) est (sont) choisie(s) parmi les protéines VAL du trématode parasitaire appartenant à 5. haematobium. Avantageusement, ce mode de réalisation permet de diagnostiquer une infection résultant d'une schistosomiase urogénitale, en particulier, à partir d'un échantillon issu d'un être humain.
Selon un mode de réalisation préféré, la ou les protéine(s) VAL détectée(s) est (sont) choisie(s) parmi les protéines VAL du trématode parasitaire appartenant à 5. mansoni. Avantageusement, ce mode de réalisation permet de diagnostiquer une infection résultant d'une schistosomiase intestinale, en particulier à partir d'un échantillon biologique issu d'un être humain.
De manière avantageuse, la ou les protéine(s) VAL détectée(s) est (sont) choisie(s) parmi les protéines VAL du trématode parasitaire appartenant à S. mansoni et sont choisies dans le groupe formé par smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7, smVALlO de SEQ ID N° 10, smVALS de SEQ ID N° 8, smVALll de SEQ ID N° 11, smVAL13 de SEQ ID N° 13,
Selon le mode de réalisation dans lequel au moins deux protéines VAL sont détectées, alors au moins une première protéine VAL est choisie parmi smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7, smVALlO de SEQ ID N° 10, et au moins une deuxième protéine VAL est choisi parmi smVAL8 de SEQ ID N° 8, smVALll de SEQ ID N° 11, smVAL1.3 de SEQ ID N° 13, de manière préférée, la première protéine VAL est smVAL4 de SEQ ID N° 4 et la deuxième protéine VAL est smVAL13 de SEQ ID N° 13.
Selon un autre mode de réalisation des procédés de l'invention, au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL, notamment dirigé contre au moins une protéine smVAL, est détecté. Par « anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL », on entend un anticorps contenu dans l'échantillon biologique à caractériser qui a été produit par l'hôte en présence de la protéine VAL sécrétée par le trématode parasitaire et qui est capable de former un complexe immunologique avec au moins une protéine VAL, notamment au moins une protéine smVAL. Cet anticorps peut notamment être une immunoglobuline, de préférence une immunoglobuline de classe G (IgGs), une immunoglobuline de classe M (IgMs), ou une immunoglobuline de classe E (IgEs), de manière encore plus préférée, une immunoglobuline humaine de classe G, une immunoglobuline humaine de classe M ou une immunoglobuline humaine de classe E.
Dans un mode de réalisation de l'invention, au moins deux anticorps sont détectés, chacun étant dirigé contre une protéine VAL différente, mais appartenant à la même espèce de trématode parasitaire. Dans ce mode de réalisation, on réalisera la détection d'anticorps dirigés contre au moins deux protéines VAL différentes dans leurs structures primaires protéiques. Ces protéines peuvent être des protéines VAL, notamment d'une même espèce de Schistosoma, par exemple, de S. mansoni, de S. japonicum ou de S. haematobium. Elles peuvent être notamment sécrétées par ledit trématode au même stade de son développement. Par exemple, les deux protéines peuvent être sécrétées à un stade précoce ou bien les deux protéines peuvent être sécrétées à un stade avancé de son développement. En particulier, on réalisera la détection d'au moins deux anticorps, l'un dirigé contre une protéine VAL et l'autre dirigé contre une autre protéine VAL de la même espèce du trématode parasitaire, notamment au moins un anticorps dirigé contre une protéine smVAL et un autre anticorps dirigé contre une autre protéine smVAL, les deux protéines étant sécrétées à un stade précoce du développement dudit trématode, par exemple, l'une sécrétée au stade schistosomulum et l'autre, au stade cercaîre. On détectera alors au moins deux anticorps permettant de déterminer la présence d'un trématode parasitaire à un stade précoce de son développement chez l'hôte.
Selon un autre mode de réalisation, la détection sera réalisée sur des anticorps de protéines VAL, notamment de protéines smVAL, sécrétées par ledit trématode à des stades différents de son développement, notamment l'une peut être sécrétée à un stade précoce de son développement et l'autre à un stade avancé. Dans ce mode de réalisation, la détection des anticorps permet avantageusement de pouvoir déterminer si un hôte, notamment un être humain, est en cours de réinfection par ledit trématode.
Le ou les anticorps dirigé(s) contre au moins une protéine VAL détecté(s) peuvent être choisis parmi : les anticorps dirigés contre la protéine smVALl de SEQ ID n°l, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL2 de SEQ ID n°2, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL3 de SEQ ID n°3, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL4 de SEQ ID n°4, les anticorps dirigés contre la protéine smVALS de SEQ ID n°5, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL6 de SEQ ID n°6, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL7 de SEQ ID n°7, un anticorps dirigé contre la protéine smVAL8 de SEQ ID n°8, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL9 de SEQ ID 110¾ un anticorps dirigé contre la protéine smVALlO de SEQ ID n°10, les anticorps dirigés contre la protéine smVALll de SEQ ID n°ll, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL12 de SEQ ID n°12, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL13 de SEQ ID n013, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL14 de SEQ ID n°14, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL15 de SEQ ID n°15, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL 16 de SEQ ID n°16, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL17 de SEQ ID n°17, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL18 de SEQ ID n°18, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL19 de SEQ ID n°19, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL20 de SEQ ID n°20, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL21 de SEQ ID n°21/ les anticorps dirigés contre la protéine smVAL22 de SEQ ID n°22, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL23 de SEQ ID n°23, les anticorps dirigés contre ta protéine smVAL24 de SEQ ID n°24, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL25 de SEQ ID n°25, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL26 de SEQ ID n°26, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL27 de SEQ ID n°27, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL28 de SEQ ID n°28, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL28 de SEQ ID n°29, les anticorps dirigés contre la protéine sjVALl de SEQ ID n°30, les anticorps dirigés contre la protéine sjVAL.6 de SEQ ID n°31/ les anticorps dirigés contre la protéine sjVAL.9 de SEQ ID n°32/ les anticorps dirigés contre la protéine sjVALl 1 de SEQ ID n°33, les anticorps dirigés contre la protéine sjVAL13 de SEQ ID n°34 et les anticorps dirigés contre la protéine sjVAL14 de SEQ ID n°35.
Avantageusement, le ou les anticorps détecté(s) sont dirigés contre au moins une protéine VAL du trématode parasitaire appartenant à S. mansoni. Avantageusement, ce mode de réalisation permet de diagnostiquer une infection résultant d'une schistosomiase intestinale, en particulier, à partir d'un échantillon biologique issu d'un être humain.
De manière avantageuse, le ou les anticorps détecté(s) sont dirigés contre au moins une protéine VAL du trématode parasitaire appartenant à S. mansoni, ledit anticorps étant choisi parmi le groupe formé par les anticorps dirigés contre la protéine smVAL4 de SEQ ID N° 4, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL7 de SEQ ID N° 7, les anticorps dirigés contre la protéine smVALlO de SEQ ID N° 10, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL8 de SEQ ID N° 8, les anticorps dirigés contre la protéine smVALll de SEQ ID N° 11 et les anticorps dirigés contre la protéine smVAL13 de SEQ ID N° 13.
Selon le mode de réalisation dans lequel au moins deux anticorps différents, dirigés chacun contre une protéine VAL différente, mais appartenant à la même espèce de trématode parasitaire, sont détectés, alors au moins un premier anticorps est choisi parmi les anticorps dirigés contre la protéine smVAL4 de SEQ ID N° 4, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL7 de SEQ ID N° 7 et les anticorps dirigés contre la protéine mVALlO de SEQ ID N° 10, et au moins un deuxième anticorps est choisi parmi les anticorps dirigés contre la protéine smVAL8 de SEQ ID N° 8, les anticorps dirigés contre la protéine smVALll de SEQ ID N° 11, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL13 de SEQ ID N° 13, de manière préférée, le premier anticorps est un anticorps dirigé contre la protéine smVAL4 de SEQ ID N° 4 et le deuxième anticorps est un anticorps dirigé contre la protéine smVAL13 de SEQ ID N° 13.
Selon un autre mode de réalisation, au moins un anticorps dirigé contre une protéine VAL, de préférence une protéine smVAL, et au moins une protéine VAL, de préférence une protéine smVAL, seront détectés. Toutes les caractéristiques décrites ci-dessus eu égard au choix et nombre de la protéine VAL en tant que marqueur antigénique et de l'anticorps dirigé contre une protéine VAL en tant que marqueur sérologique, sont applicables à ce mode de réalisation.
La détection de l'éventuelle présence de la ou des protéine(s) VAL et/ou du ou des anticorps dirigé(s) contre au moins une protéine VAL pourra être réalisée dans tout type d'échantillon biologique issu du mammifère pour lequel on souhaite réaliser la détermination de la présence dudit trématode ou le diagnostic d'une infection causée par ledit trématode.
Par « échantillon biologique », on entend tout échantillon biologique susceptible de contenir au moins une protéine VAL d'intérêt et notamment, au moins deux protéines VAL d'intérêt, de préférence au moins une protéine smVAL d'intérêt et notamment, au moins deux protéines smVAL d'intérêt, mais appartenant à la même espèce de trématode parasitaire, et/ou susceptible de contenir au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL et notamment, au moins deux anticorps dirigés chacun contre une protéine VAL différente, mais appartenant à la même espèce de trématode parasitaire, de préférence au moins un anticorps dirigé contre une protéine smVAL d'intérêt et notamment, au moins deux anticorps différents dirigés chacun contre une protéine smVAL différente. A titre d’exemples de tels échantillons, on peut citer les échantillons solides tels que les tissus provenant de la biopsie d'un granulome, les selles. On peut également citer les échantillons liquides tels que le sang ou ses dérivés - par exemple le sérum ou le plasma - les urines, les selles liquides, la salive et les cellules purifiées à partir de ces échantillons solides ou liquides. On préfère le sang ou ses dérivés, ainsi que les selles solides ou liquides, les urines et les cellules purifiées à partir de ces échantillons. De manière encore plus préférée, ledit échantillon biologique est un échantillon de sang total, de sérum ou notamment de plasma. L'échantillon biologique peut être utilisé tel quel, ou bien il peut subir préalablement à la mise en œuvre du ou des procédé(s) de l'invention, une étape de préparation. Un exemple de préparation préalable de l'échantillon peut consister à effectuer un préfractionnement de l'échantillon biologique, afin de séparer les protéines des autres constituants de l'échantillon, tel que, par exemple, en une filtration des selles comme pour le test Kato-Katz, une séparation du sérum ou du plasma. Les techniques de préparation d'échantillon sont bien connues de l'homme du métier.
La détection de l'éventuelle présence, dans ('échantillon biologique, d'au moins une protéine VAL d'intérêt, notamment d'au moins une protéine smVAL d'intérêt, et/ou d'au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL, notamment contre au moins une protéine smVAL, peut être mise en œuvre par tout procédé de détection de la présence d’une protéine ou d'un anticorps dans un échantillon connu de l'homme du métier, comme, par exemple, par un test biochimique, notamment un test ou un dosage immunologique (nommé immunoessai) via au moins un partenaire de liaison de la protéine VAL d'intérêt ou de l'anticorps d'intérêt dirigé contre ladite protéine VAL.
Bien entendu, le préfixe « immuno » dans le terme « immunoessai », par exemple, n'est pas à considérer dans la présente demande comme indiquant strictement que le partenaire de liaison est nécessairement un partenaire d'origine immunologique, tel qu'un anticorps ou un fragment d'anticorps. En effet, comme cela est bien connu de l'homme du métier, ce terme est plus largement utilisé pour désigner des tests et procédés dans lesquels le partenaire de liaison n'est pas un partenaire d'origine/de nature immunologique mais consiste, par exemple, en un récepteur d'une protéine VAL d'intérêt, notamment d'une protéine smVAL d'intérêt, que l'on souhaite détecter et/ou quantifier.
La condition est que, en fonction du mode de détection choisi selon le marqueur d'intérêt à détecter, le partenaire de liaison concerné soit capable de se lier soit à au moins une protéine VAL d'intérêt, notamment à au moins une protéine smVAL d'intérêt, et ce, de préférence, de manière spécifique, soit à au moins un anticorps dirigé contre une protéine VAL d'intérêt, notamment une protéine smVAL d'intérêt, et ce, de préférence, de manière spécifique. Ainsi, il est connu de parler de test ELISA pour des tests qui utilisent des partenaires de liaison non immunologiques stricto sensu, appelés plus largement en anglais « ligand binding assay », que l'on pourrait traduire en langue française par « dosage utilisant la liaison à un ligand », alors que le terme « immuno » est inclus dans l'intitulé in extenso correspondant à l'acronyme ELISA. Dans un souci de clarté et d'uniformité, le terme « immuno » est employé dans la présente demande pour désigner toute analyse biologique utilisant au moins un partenaire de liaison adapté pour se lier soit à au moins une protéine VAL d'intérêt, notamment à au moins une protéine smVAL d'intérêt, de préférence, de manière spécifique, soit à au moins un anticorps dirigé contre une protéine VAL d'intérêt, notamment une protéine smVAL d'intérêt, et détecter et/ou quantifier cette dernière ou ce dernier, de préférence, de manière spécifique, même quand ledit partenaire de liaison n'est pas de nature ou d'origine immunologique au sens strict.
Des exemples de partenaires de liaison n'étant pas de nature ou d'origine immunologique comprennent les nanofitines, les récepteurs à une protéine VAL d'intérêt, notamment à une protéine smVAL d'intérêt, les aptamères, les DARPins ou toute autre molécule qui est connue pour avoir une interaction avec au moins une protéine VAL d'intérêt, notamment à au moins une protéine smVAL d'intérêt, ou un anticorps dirigé contre une protéine VAL d'intérêt, notamment une protéine smVAL d'intérêt.
Les nanofitines (nom commercial) sont de petites protéines qui, comme les anticorps, sont capables de se lier à une cible biologique permettant ainsi de la détecter, de la capturer ou tout simplement de la cibler au sein d'un organisme.
Les aptamères sont des oligonucléotides, généralement ARN ou ADN, identifiés dans des banques contenant jusqu'à 1015 séquences différentes, par une méthode combinatoire de sélection in vitro appelée SELEX pour « Systematic Evolution of Ligands by Exponentiel Enrichment » (Ellington AD et Szostak JW., 1990, Nature, 346 : 818-822). La plupart des aptamères sont composés d'ARN, en raison de la capacité de l'ARN à adopter des structures variées et complexes, ce qui permet de créer à sa surface des cavités de géométries variées, permettant de fixer des ligands divers. Il s'agit d'outils biochimiques d'intérêt qui peuvent être utilisés dans des applications biotechnologiques, diagnostiques ou thérapeutiques. Leur sélectivité et leurs propriétés de fixation de ligands sont comparables à celles des anticorps.
Les « DARPins » pour Designed Ankyrin Repeat ProteINS (Boersma YL et Plütckthun A, 2011, Curr. Opin. Biotechnol, 22 : 849-857) sont une autre classe de protéines permettant de mimer les anticorps et de pouvoir se fixer avec une affinité et une sélectivité élevées sur des protéines cibles. Ils dérivent de la famille des protéines ankyrines qui sont des protéines adaptatrices permettant de fixer les protéines de membrane intégrales au réseau spectrine/actîne qui constitue « la colonne vertébrale » de la membrane plasmatique cellulaire. La structure des ankyrines est basée sur la répétition d'un motif d'environ 33 acides aminés et il en est de même des DARPins. Chaque motif a une structure secondaire de type hélice-coude-hélice (« helix-turn-heiîx »). Les DARPins contiennent au moins trois, de préférence, quatre à cinq motifs répétés et sont obtenus par « screening » de banques combinatoires.
De préférence, la détection peut être réalisée grâce à un test biochimique connu de l’homme du métier et impliquant des réactions immunologiques entre le marqueur dIntérêt, à savoir ladite protéine VAL, notamment ladite protéine smVAL, ou bien l'anticorps anti-protéine VAL, notamment anti-protéine smVAL, et un ou des partenaire(s) de liaison spécifique(s) ou non spécifique^).
Un partenaire de liaison du marqueur, à savoir de ladite protéine VAL recherchée dans le procédé de l’invention, notamment de ladite protéine smVAL recherchée, ou d'un anticorps dirigé contre une protéine VAL recherché, notamment une protéine smVAL, en fonction du mode de détection sélectionné, et tout partenaire susceptible de se lier à ce marqueur. Le partenaire de liaison utilisé sera, de préférence, spécifique, c'est-à-dire qu'il sera capable de se lier au marqueur dintérêt, avec une spécificité élevée, de préférence avec une spécificité supérieure à 90%, voire une spécificité de 100%, notamment quand il est capable de se lier de façon exclusive, ou quasi-exclusive, au marqueur d'intérêt. Un partenaire de liaison est dit non spécifique lorsque sa spécificité de liaison au marqueur dintérêt est faible et qu’il est alors capable de se lier à d’autres ligands, tels que d'autres protéines ou anticorps. A titre d’exemple de partenaires de liaison spécifiques ou non pour les protéines VAL, on peut citer des anticorps polyclonaux, notamment des anticorps polyclonaux spécifiques, des anticorps monoclonaux, des fractions d’anticorps ou dérivés de ceux-ci, par exemple, des fragments, ou des analogues d'anticorps, des récepteurs et toute autre molécule capable de se lier à cette ou ces protéine(s) VAL, notamment à une ou des protéine(s) smVAL. Les techniques de production de tels anticorps sont connues de l'homme du métier.
Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d’un animal avec la protéine VAL dintérêt, notamment avec la protéine smVAL d'intérêt, un fragment de ladite protéine ou encore un équivalent proche sur le plan structural de ladite protéine, selon les techniques bien connues de l'homme du métier.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybridomes, largement connue de l'homme du métier.
Les anticorps monoclonaux peuvent être également des anticorps recombinants obtenus par génie génétique, par des techniques bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemples de fragments d'anticorps, on peut citer les fragments Fab, Fab', F(ab')2 ainsi que les chaînes scFv (de l'anglais « Single chain variable fragment »), dsFv (de l'anglais « Double-stranded variable fragment »). Ces fragments fonctionnels peuvent notamment être obtenus par génie génétique.
Les partenaires de liaison spécifiques ou non de la ou des protéines VAL recherchée(s), et notamment de la ou des protéines smVAL recherchée(s), dans le procédé de l'invention, en particulier, les anticorps polyclonaux, peuvent être utilisés comme réactifs de capture, comme réactifs de détection ou comme réactifs de capture et de détection. L'étape de détection dans l'échantillon biologique de l'éventuelle présence d'au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL s'effectue, par exemple, par l'utilisation de ladite protéine VAL ou d'un fragment de ladite protéine comprenant un site de reconnaissance par l'anticorps, en tant que partenaire de liaison pour l'anticorps à détecter. On pourra également utiliser comme partenaire de liaison des anticorps anti-immunoglobulines ainsi que leurs fragments tels que définis ci-dessus.
La visualisation des réactions immunologiques, c'est-à-dire soit de la liaison protéine VAL dlntérêt/partenaire de liaison, notamment la liaison protéine smVAL d'intérêt/partenaire de liaison lorsque l'on souhaite détecter la présence d'au moins une protéine VAL, soit de la liaison anticorps d'intérêt dirigé contre une protéine VAL7partenaire de liaison, notamment la liaison anticorps d'intérêt dirigé contre une protéine smVAL partenaire de liaison, lorsque l'on souhaite détecter la présence d'au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL, peut être effectuée par tout moyen de détection, en particulier, par marquage ou résonance plasmonique de surface.
Par marquage, on entend la fixation d'un réactif marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces réactifs marqueurs consiste en : - les enzymes qui produisent un signal détectable, par exemple, par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la β-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, - les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants, - les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 125I, et - les molécules fluorescentes telles que les Alexa ou les phycocyanines, - les électrochimiiuminescents tels que des dérivés organométalliques à base d'acridinium ou de ruthénium.
La détection d'au moins un marqueur d'intérêt peut être réalisée de manière directe, c'est-à-dire par marquage du partenaire de liaison, soit de manière indirecte, c'est-à-dire en utilisant un anti-ligand du partenaire de liaison (ligand).
Les couples ligand/anti-lîgand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas, par exemple, des couples suivants : biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. Dans ce cas, c'est le ligand qui porte le partenaire de liaison, notamment un anticorps polyclonal dirigé contre une protéine VAL recherchée, notamment une protéine smVAL recherchée, ou un anticorps monoclonal dirigé contre une protéine VAL recherchée, notamment une protéine smVAL recherchée. L'anti-ligand peut être détectable directement par les réactifs marqueurs décrits au paragraphe précédent ou être lui-même détectable par un ligand/anti-ligand.
Ces systèmes indirects de détection peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du métier, et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR2781802A1 ou W09508000A2 de l'une des Demanderesses.
Selon le type de marquage utilisé, l'homme du métier ajoutera des réactifs permettant la visualisation du marquage ou l'émission d'un signal détectable par tout type d'appareil de mesure approprié, comme, par exemple, un spectrophotomètre, un spectrofluorimètre, un densitomètre ou encore une caméra haute définition.
Le partenaire de liaison permettant de détecter la protéine VAL d'intérêt ou l'anticorps que l'on cherche à détecter peut être notamment fixé sur un support solide. De manière connue, le support solide peut se présenter sous toutes formes appropriées telles qu'une plaque, un cône, une bille, la bille étant éventuellement radioactive, fluorescente, magnétique et/ou conductrice, une barrette, un tube de verre, un puits, une feuille, notamment de format papier, une puce, une plaque de micro-titration ou analogues. Lorsque le support est sous la forme de billes, celles-ci ont, le plus souvent, un diamètre allant de la centaine de micromètres au nanomètre. De préférence, le partenaire de liaison fixé sur le support, utilisé comme partenaire de capture, sera spécifique du marqueur d'intérêt et le partenaire de liaison utilisé en détection sera spécifique ou non du marqueur d'intérêt.
Lorsqu'au moins deux protéines VAL, notamment au moins deux protéines smVAL, sont détectées ou lorsqu'au moins deux anticorps, chacune étant dirigée contre une protéine VAL différente, notamment contre une protéine smVAL différente, ou lorsqu'une protéine VAL, notamment smVAL, et un anticorps antiprotéine VAL, notamment anti-smVAL, sont détectés, cette détection peut notamment s'effectuer séquentiellement, c'est-à-dire qu'un premier marqueur d'intérêt sera détecté puis le deuxième marqueur d'intérêt sera détecté, chacun des partenaires de liaison de ces deux marqueurs d'intérêt pouvant être fixé sur un support solide différent. La détection peut aussi s'effectuer simultanément, notamment grâce aux partenaires de liaison qui pourront alors être fixés sur le même support solide mais à des endroits différents, comme, par exemple, des puits différents lorsqu'une plaque de micro-titration est utilisée. A titre d'exemples de tests immunologiques tels que définis ci-dessus, on peut citer les méthodes « sandwich » telles qu'ELISA, ELFA, IRMA et RIA, les méthodes dites de compétition et les méthodes d'immunodétection directe comme l'immunohistochimie, l'immunocytochimie, le Western-blot et le Dot-blot.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la détection d'au moins une protéine VAL d'intérêt, notamment d'au moins une protéine smVAL d'intérêt, ou d'au moins un anticorps d'intérêt dirigé contre au moins une protéine VAL, notamment d'un anticorps d'intérêt dirigé contre au moins une protéine smVAL, est réalisée par immunochromatographîe, également nommée immunoessai par flux latéral. Les dispositifs généralement utilisés dans de tels teste comprennent un milieu de diffusion qui permet la migration de l'échantillon liquide, généralement immobilisé sur un support. On distingue classiquement plusieurs zones au niveau du milieu de diffusion qui sont une zone d’application de l'échantillon liquide, une zone de marquage et une zone réactionnelle, cette dernière comprenant une zone de visualisation (également nommée zone capture) et une zone de contrôle. Ces différentes zones sont en communication de fluide. Ainsi, si le marqueur d'intérêt à détecter est une protéine VAL, notamment au moins une protéine smVAL, celle-ci, si elle est présente dans l’échantillon déposé au niveau de la zone d’application, se lie à un premier partenaire de liaison marqué au niveau de la zone de marquage, le complexe ainsi formé migre ensuite jusqu'à la zone réactionnelle, où il est immobilisé au niveau de la zone de capture par réaction avec un deuxième partenaire de liaison lié au milieu de diffusion, et l'utilisateur peut déterminer si le marqueur est bien présent par mise en évidence d'un signal détectable, qui est déterminé par le type de marquage associé au premier partenaire de liaison. Généralement, la présence de la ou les protéine(s) VAL d'intérêt, notamment de la ou les protéine(s) smVAL d'intérêt, dans l’échantillon est matérialisée sous la forme d’une ligne détectable, habituellement dénommée ligne test. En général, la zone réactionnelle comprend également une zone de contrôle de la migration de l’échantillon qui va indiquer à l’utilisateur que l’échantillon a migré correctement au travers du milieu de diffusion, en amont de la zone de visualisation. Ce peut être, par exemple, par la révélation d'une ligne de contrôle d'une couleur prédéterminée. On peut citer, à titre d'exemples, les demandes de brevet WO 2004/003559, WO 2006/092103, WO 2007/081330, US 2004/0161859 et WO 2012/172232 qui décrivent de tels dispositifs. Le même principe s'applique lorsque le ou les anticorps d'intérêt dirigé(s) contre au moins une protéine VAL est (sont) détecté(s). L'homme du métier saura adapter ces dispositifs lorsqu'il souhaite détecter le ou les anticorps d'intérêt dirigé(s) contre au moins une protéine VAL. Avantageusement, ce mode de réalisation permet de détecter la présence dudit trématode ou permet de diagnostiquer une infection causée par ledit trématode dans les zones reculées où il n'existe pas de laboratoires d'analyses ou de dispensaires. Il permet de mettre en œuvre les procédés de l'invention au plus proche des zones endémiques.
La détection utilisée dans les procédés de l'invention peut être qualitative ou quantitative.
Par « quantitative », on entend que la concentration d'au moins une protéine VAL d'intérêt, notamment d'au moins une protéine smVAL d'intérêt, ou d'au moins un anticorps d'intérêt dirigé contre au moins une protéine VAL, notamment dirigé contre au moins une protéine smVAL, est déterminée. De manière classique, pour déterminer la quantité d'au moins un marqueur d'intérêt, dans un échantillon biologique, le signal proportionnel (dans le cas d'un procédé de détection direct) ou inversement proportionnel (dans le cas d'un procédé indirect) à la quantité dudit marqueur de l'échantillon, pourra être comparé à une courbe de calibration obtenue au préalable par des techniques largement connues de l'homme du métier. Ainsi, par exemple, la courbe de calibration est obtenue en effectuant un dosage utilisant la même protéine VAL, notamment la même protéine smVAL, ou le même anticorps dirigé contre la protéine VAL, notamment dirigé contre la protéine smVAL, ainsi que des quantités croissantes de ce marqueur. Une courbe est ainsi obtenue en mettant en abscisse, la concentration de la protéine VAL d'intérêt, notamment de la protéine smVAL d'intérêt ou respectivement de l'anticorps dirigé contre la protéine VAL, notamment dirigé contre la protéine smVAL, et en ordonnée, le signal correspondant obtenu après dosage.
Les procédés selon l'invention permettent soit de déterminer la présence d'un trématode parasitaire, notamment du genre Schistosome, chez un mammifère, en particulier chez un être humain, soit de diagnostiquer une infection causée par un trématode parasitaire, notamment du genre Schistosoma, chez un mammifère, et, en particulier, chez un être humain. La détermination et le diagnostic peuvent être établis par la comparaison des données fournies par la détection selon l'invention à une donnée de référence ou valeur de référence.
Une donnée ou une valeur de référence correspond à une donnée ou une valeur de détection de la même protéine VAL, ou respectivement du même anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL, déterminée chez un mammifère sain ou groupe de mammifères sains, notamment chez un ou des être(s) humain(s) sain(s).
Les procédés selon l'invention qui conduisent à une mesure quantitative, pourront notamment être utilisés dans le cadre d'un suivi de traitement.
Le procédé de l'invention peut être utilisé tant pour le diagnostic précoce que pour le dépistage, le suivi thérapeutique, le pronostic et le diagnostic d'une réinfection causée par un trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma, puisqu'il a été démontré dans le cadre de l'invention que ce trématode parasitaire sécrète des protéines VAL dans l'hôte qu'il habite et que le choix des protéines VAL à détecter ou des anticorps dirigés contre ces protéines VAL permettait de détecter un stade du développement du trématode parasitaire dans son hôte, plus ou moins précoce, en fonction de la ou des protéines VAL cibles sélectionnées, le marqueur étant la ou les protéines cibles, ou un ou des anticorps dirigés contre ladite ou lesdites protéines VAL cibles. L'invention a également pour objet les trousses de diagnostic comprenant au moins un partenaire de liaison pour la protéine ou l'anticorps que l'on souhaite détecter et des instructions permettant d'apporter les conclusions souhaitées.
Le ou les partenaires de liaison contenu(s) dans les trousses sont tels que définis précédemment.
Selon un premier mode de réalisation, dans lequel le marqueur d'intérêt est une protéine VAL, notamment une protéine smVAL, le partenaire de liaison peut être un anticorps dirigé contre la protéine VAL d'intérêt, notamment dirigé contre la protéine smVAL d'intérêt, l'anticorps étant choisi parmi choisi les anticorps monoclonaux, les anticorps polyclonaux et les fragments de tels anticorps.
En particulier, le partenaire de liaison peut être un anticorps dirigé contre une protéine VAL du trématode parasitaire appartenant à l'espèce 5. mansoni ou 5. japonicum. De préférence, l'anticorps, notamment l'anticorps polyclonal ou monoclonal, est dirigé contre une protéine VAL choisie parmi smVALl de SEQ ID n°l, smVAL2 de SEQ ZD n°2, smVAL3 de SEQ ID n°3, smVAL4 de SEQ ID n°4, smVALS de SEQ ID n°5, smVALô de SEQ ID n°6, smVAL7 de SEQ ID n°7, smVALS de SEQ ID n°8, smVAL9 de SEQ ID n°9, smVALlO de SEQ ID n°10, smVALll de SEQ ID n°ll, smVAL12 de SEQ ID n°12, smVAL13 de SEQ ID n°13, smVAL14 de SEQ ID n°14, smVALlS de SEQ ID n°15, smVAL16 de SEQ ID n°16, smVALl? de SEQ ID n°17, smVAL18 de SEQ ID n°18, smVAL19 de SEQ ID n°19, smVAL20 de SEQ ID n°20, smVAL21 de SEQ ID n°21, smVAL22 de SEQ ID n°22, smVAL23 de SEQ ID n°23, smVAL24 de SEQ ID n°24, smVAL25 de SEQ ID n°25, smVAL26 de SEQ ID n°26, smVAL27 de SEQ ID n°27, smVAL28 de SEQ ID n°28, smVAL28 de SEQ ID n°29, sjVALl de SEQ ID n°30, sjVALô de SEQ ID n°31, sjVAL9 de SEQ ID n°32, sjVALll de SEQ ID n°33, sjVAL13 de SEQ ID n°34 et sjVAL14 de SEQ ID n°35.
De manière préférée, l'anticorps, notamment l'anticorps polyclonal ou monoclonal, est dirigé contre une protéine VAL choisi parmi smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7, smVALlO de SEQ ID N° 10, smVAL8 de SEQ ID N° 8, smVALl 1 de SEQ ID N° 11 et smVAL13 de SEQ ID N° 13.
Dans un mode de réalisation préféré, les trousses selon l'invention peuvent comprendre au moins deux partenaires de liaison de deux protéines VAL différentes, mais appartenant à la même espèce de trématode parasitaire, notamment de deux protéines smVAL différentes.
Selon ce mode de réalisation, les partenaires de liaison peuvent être des anticorps différents, chacun étant dirigé contre une protéine VAL différente, mais appartenant à la même espèce de trématode parasitaire. Il pourra s'agir notamment de deux anticorps dirigés contre deux protéines smVAL différentes, les anticorps pouvant être choisis parmi les anticorps monoclonaux, les anticorps polyclonaux et les fragments de tels anticorps.
De préférence, les partenaires de liaison sont des anticorps, notamment des anticorps polyclonaux, le premier anticorps étant dirigé contre une première protéine VAL choisie parmi smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7 et smVALlO de SEQ ID N° 10 et le deuxième anticorps étant dirigé contre une deuxième protéine VAL choisie parmi smVALS de SEQ ID N° 8, smVALll de SEQ ID N° 11 et smVAL13 de SEQ ID N° 13.
Avantageusement, les trousses telles que définies ci-dessus comprennent, en outre, à titre de contrôle positif, la ou les protéine(s) VAL, notamment la protéine smVAL correspondant au(x) marqueur(s) antigénique(s) sélectionné(s).
De manière préférée, le premier anticorps est un anticorps dirigé contre la protéine smVAL4 de SEQ ID N° 4, le deuxième anticorps est un anticorps dirigé contre la protéine smVAL13 de SEQ ID N° 13, et la trousse comprend éventuellement un premier contrôle positif qui est la protéine smVAL4 de SEQ ID n°4 et un deuxième contrôle positif qui est la protéine smVAL13 de SEQ ID n°13.
Dans un deuxième mode de réalisation où l'on souhaite détecter au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL, la détection sera réalisée en utilisant au moins un partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une protéine VAL du trématode appartenant au genre Schistosoma, de préférence choisie parmi smVALl de SEQ ID n°l, smVAL2 de SEQ ID n°2, smVAL3 de SEQ ID n°3, smVAL4 de SEQ ID n°4, smVAL5 de SEQ ID n°5, smVALô de SEQ ID n°6, smVAL7 de SEQ ID n°7, smVAL8 de SEQ ID n°8, smVAL9 de SEQ ID n°9,
smVALlO de SEQ ID n°10, smVALll de SEQ ID n°ll, smVAL12 de SEQ ID n°12, smVAL13 de SEQ ID n°13, smVAL14 de SEQ ID n°14, smVAL15 de SEQ ID n°15, smVAL16 de SEQ ID n°16, smVAL17 de SEQ ID n°17, smVAL18 de SEQ ID n°18, smVAL19 de SEQ ID n°19, smVAL20 de SEQ ID n°20, smVAL21 de SEQ ID n°21, smVAL22 de SEQ ID n°22, smVAL23 de SEQ ID n°23,
smVAL24 de SEQ ID n°24, smVAL25 de SEQ ID n°25, smVAL26 de SEQ ID n°26, smVAL27 de SEQ ID n°27, smVAL28 de SEQ ID n°28, smVAL28 de SEQ ID n°29, sjVALl de SEQ ID n°30, sjVAL6 de SEQ ID n°31, sjVAL9 de SEQ ID n°32/ sjVALl 1 de SEQ ID n°33, sjVAL13 de SEQ ID n°34 et sjVAL14 de SEQ ID n°35. Le partenaire de liaison peut, par exemple, être choisi parmi lesdites protéines VAL ou fragment desdites protéines comprenant un site de reconnaissance par l'anticorps.
Dans ce mode de réalisation, de manière encore plus préférée, la détection sera réalisée en utilisant au moins un partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une protéine VAL choisie parmi smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7, smVALlO de SEQ ID N° 10, smVALS de SEQ ID N° 8, smVALll de SEQ ID N° 11 et smVAL13 de SEQ ID N° 13.
Dans ce mode de réalisation, les trousses selon l'invention peuvent comprendre avantageusement au moins deux partenaires de liaison d'un anticorps dirigé contre une protéine, un premier partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une première protéine VAL et un deuxième partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une deuxième protéine VAL différente de la première, les deux protéines VAL appartenant à la même espèce de trématode parasitaire, et étant notamment deux protéines smVAL différentes.
Avantageusement, la trousse comprendra un premier partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une première protéine VAL choisie parmi smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7 et smVALlO de SEQ ID N° 10 et un deuxième partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une deuxième protéine VAL choisie parmi smVAL8 de SEQ ID N° 8, smVALll de SEQ ID N° 11 et smVALB de SEQ ID N° 13.
De manière encore plus préférée dans ce mode de réalisation, la première protéine peut être la protéine smVAL4 de SEQ ID N° 4 et la deuxième protéine peut être la protéine smVAL13 de SEQ ID N° 13.
Avantageusement, les trousses selon ce deuxième mode de réalisation comprennent, en outre, à titre de contrôle positif, un anticorps anti-protéine VAL, notamment anti-protéine smVAL.
Dans un troisième mode de réalisation, où l'on souhaite détecter au moins une protéine VAL et au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL, la détection sera réalisée en utilisant au moins un partenaire de liaison de la protéine VAL et au moins un partenaire de l'anticorps dirigé contre une protéine VAL du trématode selon les caractéristiques décrites précédemment.
Le Tableau 3 présente les séquences protéiques et les séquences d'ADN codantes connues à ce jour des protéines VAL dont la détection ou la détection d'anticorps est notamment envisagée dans le cadre de l'invention.
Tableau 3
Les séquences ont été téléchargées de la banque de données GeneDB (http://genedb.org; Zerlotini A., Aguiar E.R., Yu F.f Xu H., Li Y., Young N.D., Gasser R.B., Protasio A.V., Berriman M., Roos D.S., Kissinger J.C., Olîveira G. (2013) « SchistoDB: an updated genome resource for ttie three key schistosomes of humans ». Nuc/eic Acids Res. 41(Database issue): D728-731. doi: 10.1093/nar/g ksl087.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif.
Exemples
Tous les réactifs sont de qualité analytique sauf indication contraire et ont été achetés chez Sigma-Aldrich sauf indication contraire.
Une banque d'ADNc provenant de formes adultes et larvaires de 5. mansoni de Porto Rico, fournie par le Professeur Karl Hoffman, de l'Université de Aberysthwyth (GB), a été utilisée. 1. Protocoles
1.1 Production de protéines recombinantes smVAL
Stratégie pour {'obtention de protéine recombinante smVAL L'ADNc codant pour la protéine smVAL4 a été amplifiée par PCR (polymerase chain reaction) en utilisant l'ADN polymérase Pfu (Takara) et les produits d'amplification ont été clonés dans les plasmides d’expression commerciaux suivants: - pGEX4T-l (GE Healthcare) au niveau des sites de restriction BamHI et Xhol, et - pTXBl (New England Biolabs Inc.) au niveau des sites de restriction Ndel et Sapl.
Les plasmides d'expression sont introduits dans la souche BL21 (DE3) û'Escherichia coli (Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific) et l'expression protéique est induite par l'ajout d'iso-propyl-thio-galacto-pyranoside (IPTG) dans le milieu de culture. Dans le plasmide d'expression pGEX4T-l, (GE-Healthcare) une étiquette GST (Glutathion S-transferase) détachable est ajoutée au niveau de l'extrémité N-terminale de la protéine smVAL4. Dans le plasmide d'expression pTXBl, (New England Biolabs Inc.) une étiquette intéine autoclivable, avec un domaine de liaison à la chitine, a été ajoutée au niveau de l’extrémité C-terminale de la protéine smVAL4.
Une stratégie similaire a été appliquée pour la protéine smVAL13. Toutefois, les protéines smVAL.7, smVAL.8, smVALlO, et smVALll ont été, seulement clonées dans le vecteur d'expression pTXBl et comportent donc une étiquette intéine autoclivable, avec un site de liaison à la chitine, au niveau de leur extrémité C-terminale. Les gènes clonés dans pTXBl ont été exprimés dans la souche ER2566 de E coii (New England Biolabs Inc.),
Toutes les séquences nucléiques codantes et les séquences protéiques des protéines smVAL utilisées dans les exemples figurent dans le Tableau 3 précédent
Protocole de l'amplification par PCR 1 pL d'ADNc (100 ng/pL) de la banque provenant de formes adultes et larvaires de S. mansoni a été mélangé avec 1,5 pL d'amorces oligonucleotides 5' (100 ng/pL) et 1,5 pL d'amorces oligonucleotides 3’ (100 ng/pL) auquel ont été ajoutés 5 pL de dNTP (2 mM), 5 pL de tampon spécifique Pfu (lOx) et 35 pL d’eau stérile bidîstillée. Les séquences des amorces utilisées sont présentées dans le Tableau 4 ci-dessous. Une fois que tous les composants ont été bien mélangés, 1 pL d’ADN polymérase Pfu (2U/pL) de chez TAKARA a été ajouté pour démarrer la réaction dans un thermocycleur. Le protocole pour la réaction en chaîne par polymérase a été réalisé selon les instructions du fabricant TAKARA et a été le suivant: - 1 cycle à 94°C pendant 4 minutes; - 25 cycles effectués avec les étapes suivantes: 45 secondes à 94 °C, 45 secondes à 63-68 °C (la température d'hybridation des amorces est fonction de la nature de l'oligonucléotide) et 2 minutes à 72 °C; - 1 cycle à 72 °C pendant 10 minutes.
Tableau n°4 Les séquences paires font référence aux oligo sens, celles impaires font référence aux oligo anti-sens. Toutes les séquences sont écrites selon le sens conventionnel du 5’ vers le 3’.
Clonage des produits de PCR dans des vecteurs d'expression
Les produits obtenus à Ilssue des cycles de PCR ont été remis en suspension dans un tampon de charge (50% glycérol, 1% SDS, 0,2 M EDTA pH 8,0, 0,2% Bleu de BromoPhénol), et ont été déposés sur un gel d'agarose à 2% (qualité biologie moléculaire BioRad) dans un tampon TBE Ix (tampon Tris-Borate-EDTA) pour une séparation par électrophorèse. La migration est effectuée à 75 Volts constants pendant 20 minutes.
Le gel a été ensuite coloré pendant 2 minutes avec une solution de 0,2% de bromure d'éthidium (BET). Les bandes correspondant à la taille des produits obtenus par PCR ont été détectées sous une lampe UV, découpées avec un scalpel, pondérées et purifiées en utilisant le kit d'extraction de PCR-gel (Qiagen). Chaque produit purifié a été quantifié par spectroscopie ultraviolet-visible à l'aide de TrayCeîl nano-cuvette (HELLMA). Les produits de PCR purifiés contenant les gènes d'intérêt (100 ng chacun) ont été digérés pendant 2h à 37 °C avec les enzymes de restrictions mentionnées ci-dessus. En parallèle, les plasmides d'expression (200 ng chacun) ont également été digérés pendant 2h à 37 °C avec ces mêmes enzymes de restriction.
La ligature des produits de PCR purifiés dans les vecteurs d'expression a été réalisée avec le kit DNA ligase T4 (New England Biolabs) selon les instructions du fabricant. Deux réactions par vecteur d'expression ont été mises en place, dans lesquelles 0,02 pmol de vecteur ont été mélangés avec soit 0,06 soit 0,09 pmoles de chaque produit de PCR d'intérêt purifié. A ce mélange, il a été ajouté 2 pL de tampon de ligase lOx et de l'eau de qualité biologie moléculaire stérile jusqu'à un volume final de 20 pL. Chaque mélange réactionnel a été mélangé délicatement par pipetage et pour finir 1 pL de DNA ligase T4 a été ajouté. Les réactions ont été incubées à température ambiante pendant 20 minutes, inactivées par choc thermique à 65 °C pendant 10 minutes, puis transférées dans de la glace. Transformation de bactéries d’Escherichia coli avec les plasmides 50 pL de bactéries déjà compétentes de E coii BL21 (DE3) (One shot® BL21 (DE3) Life Technologies) ont été transformées avec 1 pL de chaque produit obtenu après ligature et comprenant le plasmide recombinant. Ce microlitre a été déposé, sans mélanger, dans le tube contenant les bactéries décongelées dans la glace. Le mélange a été incubé 30 minutes dans la glace, puis les tubes ont subi un choc thermique pendant 30 secondes à 42 °C dans un bain d'eau et pour finir, ont été placés pendant 2 minutes dans la glace. Les bactéries transformées ont été placées dans 800 pL de milieu LB (BD DIFCO™) pendant 1 h à 37 °C, en agitant à 180 tours par minute. Après cette période de récupération, 50 et 200 pL de chaque tube ont été ensemencés dans des boîtes de Pétri de 10 cm contenant 30 g de LB-agar enrichi avec 100 pg/mL d'ampicilline (sel de sodium, Sigma-Aldrich). Les boîtes ont été incubées pendant une nuit à 37 °C.
Les colonies cultivées ont été contrôlées, quant à la présence effective du plasmide recombinant, par PCR, en utilisant REDTaq® ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma-Aldrich). Au moins deux colonies positives pour chaque vecteur ont été sélectionnées pour les faire pousser dans 10 mL de milieu LB enrichi d'ampicilline à 100 pg/mL.
Ensuite, 8 mL ont été utilisés pour la purification de plasmide (QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN), selon le manuel du fabricant et 2 mL ont été mélangés avec du glycérol stérile jusqu'à 20% et stockés à -70 °C. Les plasmides purifiés ont été envoyés à MWG-Bîotech pour le séquençage et il a ainsi été vérifié que la procédure de clonage s'est produite sans erreur.
Production de protéines recombinantes smVAL IL de milieu LB + ampicilline à 100 pg/mL ont été inoculé avec 1 mL de bactéries E coii BL21 (DE3) transformées avec les plasmides comprenant les séquences des protéines recombinantes smVAL d'intérêt obtenues précédemment. Les bactéries ont été placées, pour leur croissance, à 37 °C sous agitation à 180 tours par minute pendant environ 3h, jusqu'à ce que l'absorbance à 600 nm atteigne 0,8 (mesurée dans une cuve à usage unique de 1,5 mL dans un photomètre Eppendorf). A ce degré de densité cellulaire, la production de protéines recombinantes a été induite par l'ajout dans chaque erlenmeyer de 1 mL d'isopropyl thio-galactopyranoside 0,1 M (IPTG, Sigma-Aldrich). La solution de stockage d'IPTG a été préparée en dissolvant la poudre d'IPTG dans de l'eau bidistillée stérile et puis en la filtrant avec un filtre à seringue de 0,22 pm de diamètre (Minisart, Sartorius). Une fois l'IPTG ajouté, les erlenmeyers ont été placés à 20 °C pendant 12 heures, sous agitation à 180 tours par minute. Les bactéries ont ensuite été rassemblées en un culot et séparées du milieu de culture par centrifugation dans des tubes centrifuges de IL (Natgene) dans une centrifugeuse préparative Beckman-Coulter pendant 10 minutes à 4000 tours par minute. Les culots cellulaires ont été ensuite transférés dans des tubes de 50 mL (Falcon) et stockés à -20 °C jusqu'à utilisation pour la purification.
Purification de protéines recombinantes smVAL comprenant une étiquette GST
Les culots des cultures bactériennes de IL, comprenant le plasmide d'expression pGEX4T-l-smVAL d'intérêt, ont été remis en suspension dans 40 mL de TBS, pH 7,4, puis 11) de DIMase I (Sigma-Aldrich) et une plaquette d'inhibiteurs de protéases EDTA-free (Roche) ont été ajoutés. La suspension a été soumise aux ultrasons pendant 15 minutes avec des impulsions de 3 secondes, suivi de 10 secondes sans impulsion à 60% d'amplitude (Sonic Tecnochimica moderna), afin de rompre les membranes cellulaires. Ce passage a eu lieu dans un bac de glace pour éviter de surchauffer la suspension protéique. La fraction soluble a été séparée des débris cellulaires par centrifugation de la suspension soumise aux ultrasons pendant 1 heure à 30 000 tpm dans une ultracentrifugeuse préparative (Beckmann), Le surnageant a ensuite été introduit dans une colonne GSH-Sepharose (GE Healthcare) équilibrée avec du TBS, pH 7,4 et connectée à un système AKTA (GE Healthcare). Le surnageant était injecté à une vitesse de 1 mL/min, puis la colonne a été lavée avec 20 volumes de TBS jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm descende à un niveau de base. A ce stade, un gradient de 0 à 10 mM de GSH (GSH= glutathion réduit) dans du TBS, pH 7,4 a été effectué. La protéine recombinante marquée par GST a été éluée et collectée. La purification a pu être effectuée avec un haut rendement. A ce stade, le protocole a été modifié, afin de cliver l'étiquette GST directement sur la colonne. A cette fin, après l'étape de iavage de la colonne, le clivage est effectué de la manière suivante : 10 U de thrombine bovine (Sigma-Aldrich) ont été ajoutés à 10 mL de tampon TBS, pH 7,4. Cette solution a été injectée dans la colonne à la vitesse de 0,5 mL / min. Une fois la solution chargée, la colonne a été fermée et le clivage s'effectue à 4 °C. Après 24 heures, la colonne a été ouverte et les protéines clivées pures ont été récupérées par percolation et ensuite, en ajoutant 10 mL de tampon TBS, pH 7,4. La pureté a été vérifiée par SDS gel et les protéines ont été ensuite concentrées à 5 mg/mL par centrifugation (Amicon Ultra-15, Merck-Millipore coupure 10 kDa) et stockées à -20 °C.
Purification de protéines recombinantes smVAL comprenant une étiquette intéine
Toutes les protéines, portant l'étiquette intéine, ont été exprimées dans la souche de £ coii ER2566 (NEB Inc.) et purifiées comme ci-dessus, à ceci près que des billes de chitine (NEB Inc.) ont été utilisées comme résine. La purification a été effectuée conformément au protocole du fournisseur (NEB INc.) avec un tampon 50 mM Tris, 0,5 M NaO pH 8,5 (tampon chitine). Ce tampon facilite une liaison spécifique du ligand à la chitine. Après lavage, l’étiquette a été coupée sur la colonne en incubant la suspension pendant la nuit à 20 °C avec 1 volume du tampon 50 mM Tris, 0,5 M NaCI pH 8,5 + 50 mM DTT (dithiothréitol). Le lendemain, les protéines clivées ont été récupérées par percolation et dialysées contre le tampon chitine à 4°C pour éliminer toute trace de DTT,
La pureté a été contrôlée par SDS-PAGE et spectrophotométrie UV/VIS (Ultraviolet^Visible) (rapport de l'absorbance à 280/260 nm). Les protéines ont été concentrées jusqu'à 2 mg/ml et congelées à -20 °C. 1.2 Production d'anticorps polyclonaux dirigés contre une protéine smVAL d'intérêt
Les protéines purifiées ont été envoyées au Cambridge Research Biochemicals (CRB, Royaume-Uni) pour la production d'anticorps polyclonaux de lapin. 1.3 Détection par Western B/ot
Les échantillons à tester sont soumis à une électrophorèse en gel de polyacrylamide SDS-PAGE à 12%. Après avoir lancé la migration pendant 40 minutes à 30mA, les protéines des échantillons sont séparées, puis transférées sur des membranes Polyfluorure de vinylidène (PVDF), de Millipore, avec l'appareil « wet-tank » de BioRad dans un tampon TGS lx (Tris, Glycine, SDS, BioRad) enrichi avec 20% de méthanol (Sîgma-Aldrich). Le transfert a été réalisé en appliquant une différence de potentiel constante de 100 V pendant 1 heure à 4 °C.
La membrane a été ensuite incubée 1 heure à température ambiante (22°C) avec du tampon TBS-T (Tris BufFered Saline-Tween 20) contenant 5% de lait en poudre, pour éviter toute liaison non spécifique. Puis, les membranes ont été incubées lh avec l'anticorps primaire dirigé contre la protéine smVal d'intérêt (dilué à 1: 500), puis lavées trois fois avec du TBS pendant 5 minutes. Ensuite, un anticorps secondaire (chèvre-anti-lapin-HRP, BioRad) a été incubé 1 heure à température ambiante, après dilution 1: 7500 (HRP=Horseradish peroxidase). La membrane a, également, été lavée trois fois avec du tampon TBS et enfin séchée. 5 mL Lumina crescendo (Millipore) ont été utilisés pour la détection finale sous ChemiDoc (BioRad).
Les échantillons testés étaient les suivants: - l'extrait du surnageant de protéines recombinantes produites par E. coli, - l'éluât obtenu avant ou après clivage de l'étiquette portée par les protéines recombinantes, - un extrait cellulaire de ver 5. mansoni à différents stade de son développement, - un extrait de sérum de souris infectées par le ver S. mansoni. 1.5Protocole d'obtention d'extraits cellulaires de S. mansoni
Les extraits de œrcaire, schistosomules et de vers adultes mâles et femelles sous la forme d'homogénats ont été achetés à l'Institut de Médecine tropicale de Londres. 1.6 Dosage des protéines smVAL dans un échantillon biologique 1.6.1 Chez un modèle murin d'infection
Trois souris BALB/c ont été infectées avec les cercaires de S. mansoni et 0,5 mL de sang ont été prélevés à différents intervalles de temps jusqu'à 2 mois, alors qu'une souris saine a reçu du tampon PBS seul, et son sang a été utilisé comme témoin négatif.
Le protocole d'infection utilisé est décrit dans Pica-Mattoccia L, Doenhoff MJ, Vaile C, Basso A, Troiani AR, Liberti P, Festucci A, Guidi A, Cioli D. Genetic analysis of decreased praziquantel sensitîvity in a laboratory strain of Schistosoma mansoni. Acta Trop. 200PJul;lll(l):82-5. doi: 10.1Û16/j.actatropica.2009.01.012,
La détection de protéines smVAL dans l'échantillon de sérum des souris s'effectue par la technique du Western Blot, comme indiqué au paragraphe 1.3 ci-dessus. 2- Résultats smVAL4 et smVAL13 ont été choisies comme antigènes putatifs dans l'élaboration d’un test sérologique pour le diagnostic de la schistosomiase intestinale, la forme la plus répandue de cette maladie tropicale négligée. 2.1 Analyse de l'expression des protéines recombinantes smVAL chez E. coli
Afin d'obtenir des anticorps dirigés contre ces protéines, il a été nécessaire dans un premier temps d'obtenir des quantités importantes de protéines pour pouvoir immuniser un animal. Pour cela, des protéines recombinantes smVAL ont été utilisées. Les Figures 2A et 2B montrent l'expression de ces protéines recombinantes chez E. coi/.
Sur la Figure 2A, la piste 1 correspond au dépôt d'un échantillon d'éluât comprenant la protéine GST-smVAL13. La piste 2 correspond au dépôt d'un échantillon d'éluât comprenant la protéine GST-smVAL13 après 30 min d'incubation avec de la thrombine. La piste 3 correspond au dépôt d'un échantillon d'éluât comprenant la protéine GST-smVAL13 après 60 min d'incubation avec de la thrombine. La piste 4 correspond au dépôt d'un échantillon d'éluât comprenant la protéine GST-smVAL13 après 3 heures d'incubation avec de la thrombine. La piste M correspond aux marqueurs de poids moléculaire (en KDa, kilo Dalton).
Sur la Figure 2B, la piste 1 correspond au dépôt d'un échantillon de surnageant exprimant la protéine recombinante intéine-smVAL4. La piste 2 correspond au dépôt d'un échantillon d'éluât comprenant la protéine smVAL4 sans l'étiquette intéine. La piste 3 correspond au dépôt d'un échantillon de surnageant exprimant la protéine recombinante ïntéine-smVAL13. La piste 4 correspond au dépôt d'un échantillon d'éluât comprenant la protéine smVAll3 sans l'étiquette intéine. La piste M correspond aux marqueurs de poids moléculaire (en KDa, kilo Dalton). Le carré blanc montre la présence de la protéine recombinante smVAL4 et le carré noir montre la présence de la protéine recombinante smVAL13. smVAL4 et smVAL13 ont d'abord été exprimées sous forme de protéines à étiquette GST choisie en vue d'améliorer la quantité de protéines solubles. smVAL4 et smVAL13 avec une étiquette GST ont été exprimées dans £ coli BL21 (DE3) après induction à I1PTG 100 μΜ, à 20°C. Même si le rendement est amélioré, environ 30-40% des protéines recombinantes demeurent sous forme de corps d'inclusion. Le protocole pour cliver l'étiquette a également été ajustée (Figure 2A) et le temps de coupure a été étendu à toute la nuit.
Les protéines smVAL4 et smVAL13, ainsi que les autres protéines smVAL 7, smVALlO, smVAL8 et smVALll ont été clonées dans un vecteur différent, pTXBl, qui porte une étiquette autoclivable intéine-chitine au niveau de l’extrémité C-terminale ces protéines VAL. Ce changement a été décidé afin d'éviter tout éventuel ajout d'acide aminé supplémentaire en raison de l'étiquette commerciale, et donc d'améliorer la spécificité des anticorps.
La Figure 2B montre qu'il a été possible d'exprimer et de purifier les protéines recombînantes smVAL4 et smVAL13. 2.2 Analyse de la spécificité des anticorps polyclonaux
Une analyse standard de Western blot a été effectuée pour vérifier les performances des anticorps polyclonaux.
La Figure 3A représente une photographie d'une membrane obtenue après un Western Blot (WB) des protéines recombinantes smVAL4 et smVAL13. Les pistes 1, 2 et 3 correspondent aux protéines recombinantes smVAL4 et les pistes 4, 5 et 6 correspondent aux protéines recombinantes smVAL13, Les deux carrés de membrane sont le WB d'un double du SDS-PAGE montré en Figure 3B.
La Figure 3B représente une photographie d'un gel d'électrophorèse SDS-PAGE de protéines smVAL 4 et smVAL13. La piste 1 correspond au dépôt d'un échantillon de lysat bactérien exprimant la protéine recombinante Hîs-smVAL4, la piste 2 correspond au dépôt d'un échantillon d'éluât de protéines recombinantes purifiées His-smVAL4. La piste 3 correspond au dépôt d'un échantillon du culot après sonication de Hîs-smVAL4. La piste 4 correspond au dépôt d'un échantillon de lysat bactérien exprimant la protéine recombinante Hïs-smVAL13. La piste 5 correspond au dépôt d'un échantillon d'éluât de protéines recombinantes purifiées smVAL13. La piste 6 correspond au dépôt d'un échantillondu culot après sonication de His-smVAL13, La piste NI correspond aux marqueurs de poids moléculaire (en KDa, kilo Dalton).
La Figure 3A montre qu'il est possible pour un anticorps polyclonal de reconnaître smVAL4 et smVAL13 parmi les protéines exprimées par £ coH.
La Figure 3B montre qu'il est possible de produire les protéines VAL de manière recombinante dans la bactérie £ coH.
La spécificité des anticorps polyclonaux pAb-antï-VAL4 et pAb-anti-VAL13 a été étudiée ainsi que la possibilité d'avoir des réactions croisées entre les deux protéines. Les résultats sont présentés sur la Figure 4.
Sur le panneau supérieur de la Figure 4 pAb-anti-VAL4, la piste 1 correspond au dépôt de 5 pg de protéine recombinante smVÂL4 utilisée comme contrôle positif. Les pistes 2, 3, 4 et 5 correspondent respectivement au dépôt de 30 pg, 20 pg, 15 pg et 5pg de protéine recombinante smVAL13.
Sur le panneau inférieur de la Figure 4 pAb-anti-VAL13, la piste 1 correspond au dépôt de 1 pg de protéine recombinante smVAL13 utilisée comme contrôle positif. Les pistes 2, 3, 4 et 5 correspondent respectivement au dépôt de 30 pg, 20 pg, 15 pg et 5pg de protéine recombinante smVAL4.
Il a été constaté que chaque anticorps reconnaît son ligand et pas un autre (Figure 4). En effet, l'anticorps polyclonal pAb-anti-VAL4 reconnaît bien la protéine recombinante smVAL 4 (piste 1, panneau du haut) et ne reconnaît pas la protéine smVAL13 (pistes 2, 3, 4 et 5, panneau du haut). Inversement, l'anticorps polyclonal pAb-anti-VAL13 reconnaît bien la protéine recombinante smVAL13 (piste 1, panneau du bas) et ne reconnaît pas la protéine smVAL4 (pistes 2, 3, 4 et 5, panneau du haut). 2.3 Analyse de la reconnaissance de la protéine native par les anticorps polyclonaux.
Les anticorps polyclonaux ont ensuite été mis en contact avec des extraits à différents stades larvaires de souche de S. mansoni de Porto-Rico. Les anticorps ont été mis en contact avec des extraits de cercaires (C), de schistosomules de 5 jours (S), de vers juvéniles (JW) et de vers adultes (AW) femelles ou males. Les résultats sont présentés sur les Figures 5A et 5B.
Sur la Figure 5A, la piste 1 correspond au dépôt d'un échantillon de protéine recombinante smVAL4 (contrôle positif). La piste 2 correspond à un dépôt d'un échantillon d'un extrait total soluble de S. mansoni au stade cercaire (C). La piste 3 correspond à un dépôt d'un échantillon d'un extrait total soluble de S. mansoni au stade schistosomule (S). Les pistes 4 et 5 correspondent à un dépôt de deux échantillons de deux extraits totaux solubles de S. mansoni au stade ver juvénile (JW). La piste 6 correspond à un dépôt d'un échantillon d'un extrait total soluble de S. mansoni au stade ver adulte femelle (AW). La piste 7 correspond à un dépôt d'un échantillon d'un extrait total soluble de S. mansoni au stade ver adulte male (AW). 100 pg total de chaque extrait ont été déposés dans chaque puits. Pour le contrôle positif 5 pg de protéine recombinante sans le tag GST ont été déposés dans le puits du gel.
Sur la Figure 5B, la piste 1 correspond à un dépôt d'un échantillon d'un extrait total soluble de S. mansoni au stade schistosomule (S). La piste 2 correspond à un dépôt d'un échantillon d'un extrait total soluble de S. mansoni au stade cercaire (C). Les pistes 3 et 4 correspondent chacune à un dépôt d'un échantillon de deux extraits totaux solubles de S. mansoni au stade ver juvénile (JW). La piste 5 correspond à un dépôt d'un échantillon d'un extrait total soluble de S. mansoni au stade ver adulte male (AW). La piste 6 correspond à un dépôt d'un échantillon d'un extrait total soluble de S. mansoni au stade ver adulte femelle (AW). La piste 7 correspond au dépôt d'un échantillon de protéine recombinante smVAL13 (contrôle positif). 100 pg total de chaque extrait ont été déposés dans chaque puits. Pour le contrôle positif, 5 pg de protéine recombinante sans le tag GST ont été déposés dans le puits du gel.
La Figure 5A montre que l'anticorps polyclonal pAb-anti-VAL4 reconnaît la protéine recombinante smVAL4 (Piste 1) et les protéines natives smVAL4 (pistes 2 à 6).
En outre, cette Figure 5A permet de montrer que le profil d'expression de la protéine smVAL4 varie en fonction du cycle de vie du ver S. mansoni. La protéine smVAL4 est fortement exprimée/secrétée au stade précoce du développement du ver, c'est-à-dire avant qu'il ne soit capable de pondre des œufs. Cette protéine est peu ou pas exprimée/sécrétée au stade avancé du développement du ver, c'est-à-dire à l'âge où il peut pondre des œufs.
La Figure 5B montre que l'anticorps polyclonal pAb-anti-VAL13 reconnaît la protéine recombinante smVAL13 (Piste 7) et les protéines natives smVAL13 (pistes 1 à 6).
Par ailleurs, cette Figure 5B permet de montrer que le profil d'expression de la protéine smVAL13 varie en fonction du cycle de vie du ver S. mansoni. La protéine smVAL13 est fortement exprimée/secrétée au stade avancé du développement du ver, c'est-à-dire lorsqu'il est capable de pondre des œufs. Cette protéine est peu ou pas exprimée/secrétée au stade précoce du développement du ver, c'est-à-dire à l'âge où il n'est pas capable de pondre des œufs. 2.4 Détermination de ta présence d'un ver S. mansoni chez un modèle murin en fonction du stade de développement dudit ver.
Les anticorps polyclonaux ont été ensuite testés sur un échantillon de modèle murin d'infection par S. mansoni Les résultats obtenus sont reportés sur la Figure 6A et la Figure 6B.
Sur la Figure 6A, la piste 1 correspond au dépôt d'un échantillon de protéines recombinantes smVAL4. Les pistes 2, 3 et 4 et 5 correspondent au dépôt d'un échantillon de sérum de trois souris différentes ml, m2 et m3 prélevé respectivement à un jour, une semaine, un mois et 3 mois après infection. La piste 6 correspond au dépôt d'un échantillon de sérum d'une souris non infectée après un mois (contrôle négatif). 10 pL de sérum ont été déposés dans chaque puits, qui correspond environ à 600 pg total de protéines sériques.
Sur la Figure 6B, où l'anticorps pAb-anti-VAL13 a été utilisé pour la détection, les pistes 1 et 2 correspondent au dépôt d'un échantillon de sérum d'une souris non infectée respectivement après une semaine et un mois (contrôle négatif). Les pistes 3, 4 et 5 correspondent respectivement au dépôt d'un échantillon de sérum de trois souris différentes ml, m2 et m3 prélevé à une semaine après infection. Les pistes 6, 7 et 8 correspondent respectivement au dépôt d'un échantillon de sérum de trois souris différentes ml, m2 et m3 prélevé un mois dInfection après infection. Les pistes 9, 10 et 11 correspondent respectivement au dépôt d'un échantillon de sérum de trois souris différentes ml, m2 et m3 prélevé deux mois après infection. Sur le gel, 10 pL de sérum ont été déposés dans chaque puits, qui correspond environ à 600 pg total de protéines sériques.
Il est possible grâce à l'anticorps polyclonal pAb-anti-VAL4 de déterminer la présence de la protéine native smVAL4 dans le sérum d'une souris dès le premier jour de l'infection par S. mansoni, soit à un stade très précoce de l'infection (voir Figure 6A piste 2).
Il est, en outre, possible grâce à l'anticorps polyclonal pAb-anti-VAL13 de déterminer la présence de la protéine native smVAL13 dans le sérum d'une souris plusieurs mois après l'infection par S. mansoni{yo\r Figure 6B pistes 8, 9 et 10).
Conclusion
Les anticorps polyclonaux dirigés contre des protéines recombinantes excrétées ou sécrétées, smVAL4 et smVAL13, sont capables de détecter et de reconnaître la présence des protéines du ver, non seulement dans des cellules bactériennes les sur-exprimant, mais aussi dans des extraits de vers à différents stades de leur développement et surtout dans le sérum d'un modèle animal. Malgré le fait que la souris soit un animal non permissif à une infection par 5. mansoni, la souris Balb/c est actuellement utilisée dans les expériences biomédicales nécessitant un modèle animal pour leur validation.
Par conséquent, sur la base de ces résultats, il apparaît que les 6 protéines VAL recombinantes choisies (c'est-à-dire smVAL4, smVAL7, smVAL8, smVALlO, smVALll, smVAL13) peuvent être utilisées seules, ou en combinaison, dans une trousse de diagnostic qui permet de donner une réponse rapide (oui ou non) sur la présence d'infections par S. mansoni, voire de détecter le stade de l'infection, afin d'ajuster la thérapie à appliquer chez un patient. Références 1) Lamberton, P.H., Kabatereine, IM.B., Oguttu, D.W., Fenwick, A., Webster, J.P. (2014) « Sensitivity and specificity of multiple Kato-Katz thick smears and a circulating cathodic antigen test for Schistosoma mansoni diagnosis pre- and post-repeated-prazîquantel treatment ». PLoS Negl Trop Dis. 8(9): e3139 2) Degarege, A., Legesse, M., Medhîn, G., Teklehaymanot, T., Erko, B. 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Claims (19)
- REVENDICATIONS1- Procédé de détermination de la présence d'un trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma, chez un mammifère, et en particulier, chez un être humain, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : disposer d'un échantillon biologique dudit mammifère, détecter dans l'échantillon biologique l'éventuelle présence d'au moins une protéine VAL (« Venom-Ailergen-Lîke ») dudit trématode parasitaire ou d'au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL dudit trématode parasitaire, en déduire la présence ou l'absence dudit trématode parasitaire cible chez ledit mammifère.
- 2 - Procédé de diagnostic d'une infection causée par un trématode parasitaire, de préférence du genre Schistosoma, chez un mammifère, et en particulier chez un être humain, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : disposer d'un échantillon biologique dudit mammifère, détecter dans l'échantillon biologique l'éventuelle présence d'au moins une protéine VAL (« Venom-Ailergen-Lîke ») dudit trématode parasitaire ou d'au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL dudit trématode parasitaire, en déduire si ledit mammifère est atteint ou non par une infection causée par ledit trématode parasitaire.
- 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on détecte : - au moins deux protéines VAL différentes dudit trématode parasitaire, ou - au moins deux anticorps, chacun étant dirigé contre une protéine VAL différente dudit trématode parasitaire.
- 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les au moins deux protéines VAL détectées ou les au moins deux protéines VAL contre lesquels sont dirigés les anticorps détectés sont sécrétées par ledit trématode parasitaire à différents stades de son développement.
- 5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on détecte : - au moins une protéine VAL sécrétée par ledit trématode parasitaire à un stade précoce de son développement et au moins une protéine VAL sécrétée par ledit trématode parasitaire à un stade avancé de son développement, ou - au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL sécrétée par ledit trématode parasitaire à un stade précoce de son développement et au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine VAL sécrétée par ledit trématode parasitaire à un stade avancé de son développement.
- 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le trématode parasitaire appartient au genre Schistosoma, de préférence appartient à l'espèce S. mansoni.
- 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on détecte : - soit au moins une protéine smVAL (VAL de S. mansoni) choisie parmi smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7, et smVALlO de SEQ ID N° 10, et au moins une protéine smVAL choisie parmi smVAL8 de SEQ ID N° 8, smVALll de SEQ ID N° 11, et smVAL13 de SEQ ID N° 13, - soit au moins un anticorps choisi parmi les anticorps dirigés contre la protéine smVAL4 de SEQ ID N° 4, les anticorps dirigés contre la protéine smVAL7 de SEQ ID N° 7 et les anticorps dirigés contre la protéine smVALlO de SEQ ID N° 10, et au moins un anticorps choisi parmi les anticorps dirigés contre la protéine smVAL8 de SEQ ID N° 8, les anticorps dirigés contre la protéine smVALll de SEQ ID N° 11 et les anticorps dirigés contre la protéine smVAL13 de SEQ ID N° 13.
- 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on détecte : - soit au moins la protéine smVAL4 et la protéine smVAL13 ; - soit au moins un anticorps dirigé contre la protéine smVAL4 et un anticorps dirigé contre la protéine smVAL13.
- 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de sang, notamment de sérum, un échantillon de selles ou un échantillon d'urine.
- 10 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la détection de ladite au moins protéine VAL éventuellement présente dans l'échantillon est réalisée grâce à au moins un anticorps dirigé contre ladite protéine VAL, choisi parmi les anticorps monoclonaux et polyclonaux et les fragments de tels anticorps ou en ce que la détection dudit au moins anticorps éventuellement présent dans l'échantillon est réalisée grâce à au moins une protéine VAL contre laquelle l'anticorps est dirigé.
- 11 - Trousse de détermination de la présence d'un trématode parasitaire, notamment du genre Schistosoma, chez un mammifère, et en particulier chez un être humain, caractérisée en ce que ladite trousse comprend au moins un partenaire de liaison d'une protéine VAL et/ou au moins un partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une protéine VAL, notamment au moins un partenaire de liaison d'une protéine smVAL et/ou au moins un partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une protéine smVAL, et des instructions d'utilisation permettant d'apporter une conclusion quant à la présence ou l'absence dudit trématode parasitaire cible chez ledit mammifère ou quant à la présence ou l'absence d'une infection causée par ledit trématode parasitaire chez ledit mammifère.
- 12 - Trousse selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un partenaire de liaison d'une protéine VAL choisi parmi les anticorps dirigés contre une protéine VAL choisie parmi smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7, smVALlO de SEQ ID N° 10, smVAL8 de SEQ ID N° 8, smVALll de SEQ ID N° 11 et smVAL13 de SEQ ID N° 13.
- 13 - Trousse selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une protéine VAL choisie parmi les protéines smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7, smVALlO de SEQ ID N° 10, smVAL8 de SEQ ID N° 8, smVALll de SEQ ID N° 11 et smVAL13 de SEQ ID N° 13.
- 14 - Trousse selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisée en ce que la trousse comprend au moins deux partenaires de liaison, chacun pour une protéine VAL différente dudit trématode parasitaire, notamment au moins deux partenaires de liaison de deux protéines smVAL différentes.
- 15 - Trousse selon la revendication 14, caractérisée en ce que lesdits au moins deux partenaires de liaison sont des anticorps, à savoir au moins un premier anticorps dirigé contre une première protéine VAL choisie parmi smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7 et smVALlO de SEQ ID N° 10 et un deuxième anticorps dirigé contre une deuxième protéine VAL choisie parmi smVAL8 de SEQ ID N° 8, smVALll de SEQ ID N° 11 et smVAL13 de SEQ ID N° 13.
- 16 - Trousse selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisée en ce que la trousse comprend au moins deux partenaires de liaison d'un anticorps dirigé contre une protéine VAL, un premier partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une première protéine VAL et un deuxième partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une deuxième protéine VAL différente de la première, les deux protéines VAL correspondant audit trématode parasitaire, et étant notamment deux protéines smVAL différentes et/ou comprend au moins deux protéines VAL différentes, notamment au moins deux protéines smVAL différentes.
- 17 - Trousse selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle comprend un premier partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une première protéine VAL choisie parmi smVAL4 de SEQ ID N° 4, smVAL7 de SEQ ID N° 7 et smVALlO de SEQ ID N° 10 et un deuxième partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une deuxième protéine VAL choisie parmi smVAL8 de SEQ ID N° 8, smVALll de SEQ ID N° Il et smVAL13 de SEQ ID N° 13.
- 18 - Trousse selon l'une des revendications 11, 12, 14 et 15, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un partenaire de liaison d'une protéine VAL choisi parmi les anticorps monoclonaux, les anticorps polydonaux et les fragments de tels anticorps.
- 19 - Trousse selon l'une des revendications 11, 13, 16 et 17, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un partenaire de liaison d'un anticorps dirigé contre une protéine VAL choisie parmi les protéines VAL et les fragments desdites protéines comprenant un site de reconnaissance par l'anticorps.
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