FR2931481A1 - Anticorps specifique de la lysine propionylee/butyrylee, son procede d'obtention et ses applications - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un nouvel anticorps ou au moins l'un de ses fragments fonctionnels spécifique comprenant au moins un motif lysyl de formule (I) suivante : g id="ID2931481-2" he="" wi="" file="" img-format="tif"/> > dans laquelle R0 équivaut à H, un alkyle, un aryle, un alkylaryle ou un aralkyle, R1 équivaut à H, un alkyle, un aryle, un alkylaryle, un aralkyle, un sucre, un lipide, un nucléotide ou une entité constituée d'au moins un motif acide aminé, ledit motif acide aminé étant relié au motif lysyl par une liaison peptidique, R2 équivaut à OH, un alkyle, un aryle, un alkylaryle, un aralkyle, un sucre, un lipide, un nucléotide ou une entité constituée d'au moins un motif acide aminé, ledit motif acide aminé étant relié au motif lysyl par une liaison peptidique, ou OR4 où R4 est un alkyle, un aryle, un sucre, un lipide, R3 équivaut à (CH2)n-CH3 où n vaut 1 ou 2. L'invention concerne également un procédé de fabrication de ce nouvel anticorps et une composition le renfermant. En outre, pour des utilisations en recherche, diagnostic et thérapeutique, l'invention concerne des procédés et nécessaires de détections des épitopes de formule (I) et d'auto-anticorps reconnaissant lesdits épitopes de formule (I).

Description

ANTICORPS SPECIFIQUE DE LA LYSINE PROPIONYLEEBUTYRYLEE, SON PROCEDE D'OBTENTION ET SES APPLICATIONS

Domaine technique de l'invention : La présente invention concerne le domaine des modifications des protéines appelées modifications post-traductionnelles et en particulier, le domaine des protéines portant des radicaux acyles. Plus précisément, l'invention porte sur de nouveaux anticorps spécifiques à ces protéines portant des radicaux acyles (en particulier des radicaux propionyle et butyryle) ainsi que sur leur procédé d'obtention et leurs applications.

Art antérieur et problème technique :

La transcription est un phénomène ayant lieu dans le noyau des cellules et aboutissant à la synthèse d'ARNm qui permettent à leur tour, via la traduction dans le cytosol, la formation de protéines. Transcription et traduction sont des mécanismes piliers pour les cellules et les modifications post-transcriptionnelles et post-traductionnelles ont des impacts fondamentaux dans le fonctionnement cellulaire. Les protéines restant à leur état natif et les protéines ayant subi ces modifications chimiques post-traductionnelles montrent de grandes différences tant au niveau de leurs localisations cellulaires, de leurs demi-vies, de leurs propriétés physico-chimiques ainsi que de leurs actions intra ou intercellulaires. Plus de 200 modifications post-traductionnelles ont pu être répertoriées. La plupart d'entre elles sont réalisées par voie enzymatique. En fonction des différentes modifications qu'elles ont subies, les protéines peuvent par exemple être activées ou inhibées, délocalisées ou non, dégradées ou non. Parmi ces modifications, on peut citer : 1- les modifications post-traductionnelles impliquant l'addition d'un groupe fonctionnel telles que ; l'acétylation, soit l'addition d'un groupe acétyl, généralement en N-terminal d'une protéine ; l'alkylation, soit l'addition d'un groupe alkyl, méthyl ou éthyl ; la méthylation soit l'addition d'un groupe méthyl, généralement sur les acides aminés lysine ou arginine ; la biotinylation, qui est l'acylation d'une lysine par un groupement biotine ; la glutamylation, qui est la liaison covalente d'un résidu d'acide glutamique sur la 35 tubuline ou une autre protéine ; la glycylation, qui est la liaison covalente d'un ou plusieurs (jusqu'à 40) résidus glycine sur la partie C-terminale de la tubuline ; la glycosylation, soit l'addition d'un groupe glycosyl sur un résidu asparagine, hydroxylysine, sérine, ou thréonine, produisant ainsi une glycoprotéine ; l'isoprénylation, soit l'addition d'un groupe isoprenoïde (c.a.d. farnesol ou geranylgeraniol) ; la phosphopantetheinylation, ou addition d'un 4'-phosphopantetheinyl depuis le coenzyme A ; la phosphorylation, qui est l'addition d'un groupe phosphate, généralement sur une sérine, tyrosine, thréonine ou histidine acceptrice ; la sulfatation, qui est l'addition d'un groupe sulfate sur une tyrosine ; l'amidation en C-terminal.... 2- les modifications post-traductionnelles impliquant l'addition de groupes peptidiques ou de protéines telles que : l'ubiquitination, qui est une liaison covalente d'ubiquitine sur une lysine acceptrice ; la sumoylation, qui est une liaison covalente de protéine SUMO, généralement sur une 15 lysine acceptrice. 3- les modifications post-traductionnelles changeant la nature chimique des acides aminés telle que : la citrullination, ou déimination soit la conversion d'arginine en citrulline ; la déamidation, soit la conversion de glutamine en acide glutamique ou de l'asparagine 20 en acide aspartique. 4- les modifications post-traductionnelles impliquant des changements structuraux telles que: les ponts di-sulfures qui résultent de la liaison chimique des groupement SH3 de deux cystéines ; 25 les clivages protéiques par une protéase d'un lien peptidique.

Ces modifications ont pour but principalement de : - réguler l'activité des protéines, - les "étiqueter" afin qu'elles soient reconnues par d'autres molécules ou par des 30 systèmes de dégradation, - les ancrer dans une membrane, - les intégrer à une cascade de signalisation, - les "adresser" à un compartiment cellulaire, - définir une identité immunologique (groupes sanguins). 35 Dans la cellule, ces modifications ont un rôle important de régulations (activation/inhibition principalement) à deux niveaux : cytoplasmique et nucléaire. Pour ce qui est des protéines cytoplasmiques, ces diverses modifications post-traductionnelles rendent, entre autres, les protéines aptes ou non à transmettre des signaux reçus par les cellules et à activer les cascades de signalisation appropriées à ces signaux. Pour ce qui est des protéines nucléaires comme les histones entre autres, ces modifications posttraductionnelles vont moduler ou non l'état de compaction de la chromatine (ADN portant des protéines), réguler ainsi la machinerie transcriptionnelle et par conséquent permettre ou non l'expression ou la répression de certains gènes.

Il est aisé de comprendre que certaines de ces modifications sont cruciales dans la physiologie cellulaire, que certains dérèglements sont sources de pathologies. Ainsi, la connaissance et la compréhension des mécanismes régulant ces modifications peuvent s'avérer fort intéressant dans les domaines non seulement de la recherche fondamentale mais aussi et surtout le domaine thérapeutique. En effet, avec des outils précis d'expérimentation, il est possible de lever certains verrous, de comprendre des dysfonctionnements cellulaires et éventuellement de prévenir ou guérir des pathologies.

Il est donc indispensable pour cela de disposer d'outils maitrisés pour identifier, détecter, localiser voire quantifier et induire ou éviter ces modifications. Certaines de ces modifications post-traductionnelles ont été largement décrites dans la littérature. Ainsi, il a été mis en évidence l'importance des phosphorylations des résidus sérine et thréonine précisément dans les transductions cellulaires. Ces phosphorylations sont réalisées via les protéines kinases et sont en partie responsables de la régulation de la protéine p53, une protéine fortement impliquées dans de nombreux cancers. Par ailleurs, on sait que l'acétylation des histones joue, entres autres, un rôle dans la réparation de l'ADN et l'apoptose. Ces deux phénomènes lorsqu'ils sont mal régulés entrainent des pathologies graves. On sait également que ces différentes modifications post-traductionnelles peuvent interagir et se réguler mutuellement par le biais, par exemple, d'une compétition entre elles. C'est précisément le cas, par exemple, pour la méthylation d'un résidu arginine d'une protéine donnée qui peut être empêchée par la phosphorylation d'un résidu voisin, la cellule régulant ainsi l'effet de cette modification post-traductionnelle.

Par ailleurs, certains acides aminés sont plus disposés à subir des modifications posttraductionnelles en fonction de leur structure et de leur accessibilité dans la protéine. Parmi ces acides aminés, la lysine est un acide aminé connu pour être souvent modifié par exemple par méthylation, acétylation, biotinylation, ubiquitination et sumoylation, différentes modifications assurant des rôles essentiels dans la vie cellulaire.

Il a récemment été découvert de nouvelles modifications post-traductionnelles. En effet, Yue Chen et al (Molecular and Cellular Proteomics 6.5, july 2007, 812-819) ont décrit la propionylation et la butyrylation des résidus lysines d'histones in vitro. Etant donné les rôles des propionyl-CoA et des butyryl-CoA dans le métabolisme énergétique cellulaire, ils supposent, à l'instar de deux autres équipes (Garrity et al dans J Biot Chem. 2007 Oct 12;282(41):30239-45 et Leemhuis H et al dans Chembiochem. 2008 Mar 3;9(4):499-503) que ces deux modifications ont des fonctions importantes et distinctes dans la régulation des processus biologiques, comme par exemple l'étude de l'homéostasie du coenzyme A chez les bactéries et par conséquent dans certaines pathologies. Ces changements de charges observés sur les lysines ont été observés par protéomique et en particulier par spectrométrie de masse et marquage au carbone 14. Ces approches ont permis de démontrer qu'il est possible d'observer une propionylation et une butyrylation des protéines et en particulier des histones in vitro. Cependant, la présence de ces modifications in vivo reste à démontrer. De plus, ces techniques utilisées ne permettent pas de localiser, suivre et de mesurer ces modifications posttraductionnelles in vivo ou dans un échantillon biologique. Il apparait donc nécessaire de fournir des moyens et méthodes de détection plus appropriés, fiables, sensibles, reproductibles et de trouver des outils d'identification/ localisation de ces modifications (propionylation et/ou butyrylation de motif lysyl) permettant également d'améliorer la recherche, le diagnostic, le suivi, le pronostic et le traitement des pathologies y étant associées. Aussi, l'inventeur a-t-il développé des anticorps capables de reconnaître et de se lier spécifiquement à ces nouvelles modifications protéiques.

Objectifs principaux de l'invention

L'objectif principal de l'invention est de fournir des moyens et des méthodes de détection desdites modifications post-traductionnelles plus appropriés, plus rapides et fiables que les moyens utilisés dans l'art antérieur, et par conséquent de permettre d'élucider les mécanismes biologiques et d'améliorer le diagnostic, le traitement, le suivi et le pronostic de maladies induites par ces deux modifications post-traductionnelles (propionylation et/ou butyrylation des lysines).

Un autre objectif de la présente invention est de fournir des compositions comportant ce moyen de détection plus approprié utilisables en diagnostic, thérapie et recherche.

Un autre objectif de la présente invention est de fournir des méthodes de diagnostic économiques, performantes, fiables et réalisables simplement in vitro ou in vivo grâce à, d'une part, un procédé et un nécessaire de détection dans un échantillon de molécules comportant lesdites modifications post-traductionnelles (propionylation et butyrylation) et d'autre part un procédé et un nécessaire de détection dans un échantillon d'auto-anticorps dirigés contre lesdites modifications post-traductionnelles in vivo.

Description succincte de l'invention

Ces objectifs, parmi d'autres sont atteints par la présente invention qui concerne tout d'abord de nouveaux anticorps ou au moins l'un de leurs fragments fonctionnels spécifiques d'un épitope contenant au moins un motif lysyl de formule (I) suivante : o R Rù N NH (I) dans laquelle R° équivaut à H, un alkyle, un aryle, un alkylaryle ou un aralkyle, RI équivaut à H, un alkyle, un aryle, un alkylaryle, un aralkyle, un sucre, un lipide, un nucléotide ou une entité constituée d'au moins un motif acide aminé, ledit motif acide aminé étant relié au motif lysyl par une liaison peptidique, R2 équivaut à OH, un alkyle, un aryle, un alkylaryle, un aralkyle, un sucre, un lipide, un nucléotide, une entité constituée d'au moins un motif acide aminé, ledit motif acide aminé étant relié au motif lysyl par une liaison peptidique, ou OR4 où R4 est un alkyle, un aryle, un sucre, un lipide, R3 équivaut à -(CH2)äCH3 où n vaut 1 ou 2. 20 La présente invention concerne également un procédé de fabrication desdits anticorps ou de l'un de leurs fragments fonctionnels consistant, en premier lieu, à fabriquer un synthon de formule (I) ci-dessus, puis à utiliser ce synthon, en tant qu'épitope antigénique pour permettre la production des anticorps grâce à au moins une injection d'au moins cet 25 épitope à un animal approprié.

La présente invention concerne également une composition comportant des anticorps ou des fragments fonctionnels des anticorps selon la présente invention, ladite composition pouvant être utilisée dans au moins l'une des applications suivantes : recherche, 30 diagnostic, analyse, pronostic de pathologie, thérapeutique, test d'efficacité ou de toxicité d'un médicament. 10 15 La présente invention concerne également un procédé et un nécessaire de détection des molécules contenant au moins l'épitope de formule (1) dans un échantillon in vitro ou in vivo. Ceci se fait, d'une part, par la mise en contact de l'échantillon in vitro ou in vivo avec lesdits anticorps de la présente invention puis, d'autre part, par la détection/révélation des complexes anticorps-épitopes de formule (I) par des moyens appropriés. La présente invention concerne également un procédé et un nécessaire de détection des auto-anticorps dirigés contre l'épitope de formule (I) dans un échantillon ou in vivo. Ceci se fait, d'une part, par la mise en contact dudit épitope et dudit échantillon à tester in vitro ou in vivo puis par la détection/révélation des complexes anticorps- épitopes de formule (I) par des moyens appropriés. Description détaillée de l'invention : L'anticorps Pour détecter des modifications moléculaires comme les modifications posttraductionnelles in vitro et in vivo, comprendre leurs implications cellulaires et éventuellement avoir un effet sur elles particulièrement dans le cadre thérapeutique de pathologies induites par ces modifications, il est particulièrement intéressant de disposer d'outils spécifiques, aptes à cibler de façon précise. C'est pourquoi, il est du mérite de l'inventeur d'avoir développé des anticorps isolés ou au moins des fragments fonctionnels de ceux-ci, caractérisés en ce qu'ils sont spécifiques d'un épitope comprenant au moins un motif lysyl de formule (1) suivante : o R ,I RùN 0 R (I) dans laquelle R° équivaut à H, un alkyle, un aryle, un alkylaryle ou un aralkyle, RI équivaut à H, un alkyle, un aryle, un alkylaryle, un aralkyle, un sucre, un lipide, un nucléotide ou une entité constituée d'au moins un motif acide aminé, ledit motif acide aminé étant relié au motif lysyl par une liaison peptidique, R2 équivaut à OH, un alkyle, un aryle, un alkylaryle, un aralkyle, un sucre, un lipide, un nucléotide, une entité constituée d'au moins un motif acide aminé, ledit motif O NH acide aminé étant relié au motif lysyl par une liaison peptidique, ou OR4 où R4 est un alkyle, un aryle, un sucre, un lipide, R3 équivaut à -(CH2),, CH3 où n vaut 1 ou 2.

Dans la présente demande, le terme anticorps désigne par exemple des immunoglobulines (Ig) par exemple de type Gamma (Ig G) ou Mu (Ig M), de préférence IgG. Ces anticorps peuvent être polyclonaux ou monoclonaux. Ils sont issus d'immunisation d'animaux tels que le lapin, la souris et tous les animaux que l'on peut immuniser et connus de l'homme de l'art mais ils peuvent être produits par génie génétique. Par ailleurs, les anticorps selon l'invention peuvent être des anticorps d'origine animale (de préférence murine) naturels ou humanisés. Par extension, les anticorps selon la présente invention peuvent être des fragments fonctionnels et spécifiques desdits anticorps comme le fragment Fab qui contient le site de reconnaissance spécifique à l'antigène ou le fragment F(ab')2 qui contient au moins les deux sites de reconnaissance spécifique à l'antigène. Par spécifique , on entend que les anticorps reconnaissent et se lient à un épitope donné via leur paratope selon les principes connus de l'immunologie. En particulier, l'antigène reconnu est défini par son épitope particulier et ceci selon la structure ou la conformation de celui-ci. Selon la présente invention, l'épitope que l'anticorps reconnait et auquel il se lie est l'épitope de formule (I) telle que détaillée ci-dessus. Ainsi, les anticorps selon la présente invention sont dirigés spécifiquement contre une molécule précise ou une région précise d'une molécule, en particulier une molécule contenant au moins un motif lysyl substitué par R3, c'est-à-dire une molécule contenant au moins un motif lysyl propionylé et/ou butyrylé. Dans la présente demande, le terme épitope désigne par exemple une molécule ou une région de celle-ci qui peut être reconnue par la partie de reconnaissance spécifique d'un anticorps (le paratope). Un antigène est caractérisé par ses épitopes. Il s'agit donc dans la présente demande d'une molécule contenant au moins un motif lysyl de formule (I) suivante : o O R Il H RùN CR2 (CH2)4 NH R 0 (I) dans laquelle R° équivaut à H, un alkyle, un aryle, un alkylaryle ou un aralkyle, RI équivaut à H, un alkyle, un aryle, un alkylaryle, un aralkyle, un sucre, un lipide, un nucléotide ou une entité constituée d'au moins un motif acide aminé, ledit motif acide aminé étant relié au motif lysyl par une liaison peptidique, R2 équivaut à OH, un alkyle, un aryle, un alkylaryle, un aralkyle, un sucre, un lipide, un nucléotide, une entité constituée d'au moins un motif acide aminé, ledit motif acide aminé étant relié au motif lysyl par une liaison peptidique, ou OR4 où R4 est un alkyle, un aryle, un sucre, un lipide, R3 équivaut à -(CH2),,-CH3 où n vaut 1 ou 2.

Par peptide formant l'épitope pour la génération d'anticorps spécifiques selon l'invention, on entend par exemple un peptide comprenant au moins un motif lysyl substitué par un radical propionyl et/ou butyryl, et plus précisément une séquence peptidique comprenant entre 2 et 50 acides aminés, au moins l'un des acides aminés étant un motif lysyl substitué par un radical propionyl et/ou butyryl. On préfèrera une séquence peptidique de 2 à 25 acides aminés et tout particulièrement de 2 à 15 acides aminés.

Par protéine formant l'épitope pour la génération d'anticorps spécifiques selon la présente invention, on entend par exemple une protéine immunogène comprenant au moins un motif lysyl substitué par un radical propionyl et/ou butyryl, et plus précisément une séquence peptidique supérieure à 50 acides aminés, au moins l'un desdits acides aminés étant un motif lysyl substitué par un radical propionyl et/ou butyryl. De préférence, ladite protéine a un poids moléculaire de 5 kDaltons à 100 kDaltons et plus particulièrement un poids moléculaire entre 5 à 20 kDa. On peut citer par exemple les protéines comme p53 ou les histones et plus particulièrement les histones H3, H4, H2A et H2B. Plus particulièrement, l'histone H3 humaine, de poids moléculaire d'environ 15kDa, peut être propionylée et/ou butyrylée sur les lysines en position 4, 9, 14, 18, 23,...et en général sur au moins une lysine (représentée par K). On peut citer également l'histone H4 humaine de poids moléculaire d'environ 11 kDa dont au moins une lysine en position 5, 8, 12, 16, 20,.. peut être propionylée et/ou butyrylée. De même pour l'histone H2B humaine de poids moléculaire d'environ 14 kDa peut être propionylée et/ou butyrylée sur les lysines en position 5, 11, 12, 15, 16,.. ainsi que l'histone H2A humaine de poids moléculaire d'environ 14 kDa peut être propionylée et/ou butyrylée sur les lysines 5, 9, 13, 15,.. Ces lysines propionylées et/ou butyrylées répondent à la formule (1) ci-dessus et peuvent représenter ainsi des antigènes induisant la formation et la reconnaissance spécifique des anticorps selon l'invention.

Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, dans la formule (1) ci-dessus, le radical R° de l'épitope reconnu par l'anticorps est un H. Selon un autre mode particulier de réalisation de la présente invention, R° est un alkyle 5 choisi parmi les alkyles linéaires, ramifiés ou cycliques, substitués ou non par un hétéroatome et comportant de 1 à 20 atomes de carbone. Selon encore un autre mode particulier de réalisation de la présente invention, R° est un aryle choisi parmi les aryles substitués ou non par un hétéroatome et comportant 3 à 20 atomes de carbone 10 R° peut également être un aralkyle substitué ou non par un hétéroatome et comportant 4 à 20 atomes de carbone, un alkylaryle substitué ou non par un hétéroatome et comportant 4 à 20 atomes de carbone. Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le radical RI de l'épitope reconnu par l'anticorps est un H. 15 Selon un autre mode particulier de réalisation de la présente invention, RI est un alkyle choisi parmi les alkyles linéaires, ramifiés ou cycliques, substitués ou non par un hétéroatome et comportant de 1 à 20 atomes de carbone. RI est un aryle choisi parmi les aryles substitués ou non par un hétéroatome et comportant 3 à 20 atomes de carbone. 20 RI peut également être un aralkyle substitué ou non par un hétéroatome et comportant 4 à 20 atomes de carbone, un alkylaryle substitué ou non par un hétéroatome et comportant 4 à 20 atomes de carbone. Dans un autre mode particulier de l'invention, RI est un sucre choisi parmi les restes saccharide, monosaccharide, disaccharide (saccharose, maltose e.g.) ou polysaccharide 25 hydrogéné ou non, et leurs mélanges. Dans un autre mode particulier de l'invention, RI est un lipide choisi parmi les acides gras, leurs dérivés et leurs esters. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, RI peut être un nucléotide choisi parmi les nucléotides connus. 30 Dans un autre mode particulier de réalisation de l'invention, RI est une entité constituée d'au moins un acide aminé lequel forme, via son extrémité C terminale, une liaison peptidique avec le motif lysyl. Il peut ainsi s'agir par exemple d'un acide aminé simple, d'un peptide, de préférence un peptide contenu dans la séquence d'une histone et plus particulièrement les histones H3, H4 ou H2A, d'une protéine, de préférence une protéine 35 histone et plus particulièrement les histones H3, H4 ou H2A, d'une glycoprotéine, d'une lipoprotéine... L'acide aminé impliqué dans la liaison peptidique avec le motif lysyl est peut être n'importe quel acide aminé choisi parmi les 22 acides aminés connus. Au moins un acide aminé est un acide aminé naturel ou non naturel, D ou L.

Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le radical R2 de l'épitope reconnu par l'anticorps est un OH. Selon un autre mode particulier de réalisation de la présente invention, R2 est un alkyle 5 choisi parmi les alkyles linéaires, ramifiés ou cycliques, substitués ou non par un hétéroatome et comportant de 1 à de 1 à 20 atomes de carbone. Selon encore un autre mode particulier de réalisation de la présente invention, R2 est un aryle choisi parmi les aryles substitués ou non par un hétéroatome et comportant 3 à 20 atomes de carbone 10 R2 peut également être un aralkyle substitué ou non par un hétéroatome et comportant 4 à 20 atomes de carbone, un alkylaryle substitué ou non par un hétéroatome et comportant 4 à 20 atomes de carbone. Dans un autre mode particulier de l'invention, R2 est un sucre choisi parmi les restes saccharide, monosaccharide, disaccharide (saccharose, maltose e.g.) ou polysaccharide 15 hydrogéné ou non, et leurs mélanges. Dans un autre mode particulier de l'invention, R2 est un lipide choisi parmi les acides gras, leurs dérivés et leurs esters. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, R2 peut être un nucléotide choisi parmi les nucléotides connus. 20 Dans un autre mode particulier de réalisation de l'invention, R2 est une entité constituée d'au moins un acide aminé lequel forme, via son extrémité N terminale, une liaison peptidique avec le motif lysyl. Il peut ainsi s'agir par exemple d'un acide aminé simple, d'un peptide, de préférence un peptide contenu dans la séquence d'une histone et plus particulièrement les histones H3, H4, H2A ou H2B, d'une protéine, de préférence une 25 protéine histone et plus particulièrement les histones H3, H4, H2A ou H2B, d'une glycoprotéine.... L'acide aminé impliqué dans la liaison peptidique avec le motif lysyl est peut être n'importe quel acide aminé choisi parmi les 22 acides aminés connus dont au moins un acide aminé est un acide aminé naturel ou non naturel, D ou L. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, R2 équivaut à OR4 où R4 est un 30 alkyle, un aryle, un sucre, un lipide tel que défini et/ou exemplifié ci-dessus.

L'épitope contient au moins un site propionylé ou butyrylé. En effet, selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le radical R3 de l'épitope reconnu par l'anticorps selon l'invention est un radical -(CH2)n CH3 où n vaut 1 ou 2. Lorsque n 35 correspond à 1, l'unité lysyl est substituée par un acide propionique. Par convention dans la présente demande, on pourra parler alors de résidu propionyl lié au motif lysyl, ainsi l'épitope de formule (I) selon la présente invention contient un motif lysyl propionylé. Lorsque n correspond à 2, l'unité lysyl est substituée par un acide butyrique (ou par convention un butyryl) formant ainsi un épitope de formule (I) contenant un motif lysyl butyrylé.

Comme on le comprend de la présente formule (I) et de l'exposé ci-dessus, l'épitope reconnu spécifiquement par les anticorps, ou au moins l'un de leurs fragments fonctionnels, selon la présente invention, peut être constitué d'un simple acide aminé substitué, à savoir la lysine substituée par un radical propionyl (n=1) ou un radical butyryl (n=2), c'est le cas où R°, RI sont des H et R2 est un OH mais R°, RI et R2 de cet épitope peuvent être identiques ou différents. Ainsi, l'épitope peut être constitué d'une molécule faite d'au moins deux acides aminés dont l'un est une lysine propionylée ou butyrylée, d'un peptide tel que la séquence N terminale des histones, d'une protéine telle que une histone, une glycoprotéine ou toute autre molécule contenant au moins un motif lysyl substituée par R3 tel que défini ci-dessus. Ces protéines peuvent être des protéines naturelles, cellulaires, tissulaires ou plasmatiques, ou des protéines réalisées artificiellement, des protéines recombinantes produites par génie génétique. Elles sont de préférence des protéines histones et tout particulièrement les histones H3, H4, H2A et H2B. Dans la forme de réalisation préférée de l'invention, R° correspond à H et RI et R2 correspondent à des acides aminés quelconques identiques ou différents.

Lorsque R3 est différent de -(CH2)n CH3 où n vaut 1 ou 2, les anticorps selon l'invention ne se lient pas à la molécule de façon spécifique.

Dans un mode préféré de l'invention, on utilise des peptides riches en lysine pour générer l'anticorps. Il est connu de l'homme de l'art qu'un site antigénique contient généralement 5 à 20 acides aminés mais selon un mode préféré de l'invention l'épitope antigénique spécifique reconnu par l'anticorps peut contenir un nombre inférieur d'acides aminés, c'est-à-dire de un seul acide aminé, la lysine substituée par un radical propionyl ou butyryl elle-même, à 5 acides aminés sans se limiter à ce nombre. En effet, l'épitope peut contenir jusqu'à 10 acides aminés et de préférence 5 acides aminés.

Dans sa forme préférée, le motif lysyl substitué par un radical propionyl ou butyryl est placé de façon la plus centrale possible au sein dudit site antigénique générant l'anticorps selon l'invention. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le peptide ou la protéine comprenant un épitope de formule (1), contient plusieurs lysines propionylées et/ou butyrylées. Ces peptides sont réalisés par des méthodes classiques de synthèse peptidiques connues de l'homme de l'art. Ainsi, par le biais de ces anticorps, l'état de la propionylation et/ou butyrylation des protéines cellulaires impliquées dans les métabolismes et les fonctions cellulaires peut être déterminé, caractérisé et quantifié. En effet, l'outil anticorps selon la présent invention permet une détection qualitative mais également quantitative des molécules portant l'épitope de formule (I) dans des échantillons biologiques, in vitro et in vivo. De plus, on peut obtenir une localisation cellulaire des molécules, de préférence les protéines contenant ledit épitope de formule (I) reconnu de façon spécifique par les anticorps selon la présente invention ainsi qu'une localisation de cet épitope de formule (I) lui-même dans une molécule particulière, de préférence une protéine. Ceci est particulièrement important dans la compréhension de mécanismes cellulaires et par conséquent dans le traitement de pathologies impliquant la propionylation/butyrylation des molécules, de préférence protéines et particulièrement la propionylation de la lysine, telles que le cancer, les maladies neurodégénératives, le diabète et l'inflammation.

Les anticorps selon la présente invention peuvent être présents in vivo et générés soit : - naturellement dans l'organisme, lors de processus pathologiques, il s'agit alors des auto-15 anticorps exposés plus bas, - artificiellement, c'est-à-dire par activation volontaire du système immunitaire d'un organisme donné via l'introduction d'un antigène comportant ledit épitope de formule (I). Ainsi l'organisme concerné produit des anticorps spécifiques de l'épitope, reconnu comme non-soi. 20 Procédé de fabrication de l'anticorps

Les résidus de l'épitope de la formule (1), à savoir R°, R', R2 et R3, sont greffés au résidu lysyl soit naturellement, par exemple in vivo, soit artificiellement in vitro par simple 25 réaction des résidus ou molécules entre elles ou bien par des réactions forcées connues de l'homme du métier. Ainsi, il est possible de produire des anticorps grâce à des antigènes endogènes portant l'épitope de formule (I) ou par la synthèse de ces antigènes. La présente invention concerne ainsi un procédé de fabrication des anticorps ou de leurs fragments fonctionnels tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il consiste à : 30 a) mettre en oeuvre un synthon de formule (I), b) coupler ledit synthon à une molécule porteuse, c) injecter à un animal approprié ledit couple synthon- molécule porteuse, d) récupérer du plasma/sérum dudit animal, e) sélectionner les anticorps spécifiques dudit synthon utilisé à l'étape a) à 35 l'aide d'un ou plusieurs épitopes de formule (I) telle que définie ci-dessus, f) éventuellement purifier les anticorps par les méthodes connues de l'homme de l'art.

Le synthon correspond à la formule (I). Plus précisément, ledit synthon correspond au moins à un acide aminé substitué : une lysine propionylée ou une lysine butyrylée. Le synthon selon la présente invention et tel que défini ci-dessus est réalisé par le procédé décrit par M. Bashir Uddin Surfraz et al dans J. Med. Chem. 2007, 50, 1418-1422 et par Takeshi M.et al dans Biomacromolecules, 2007, 8, 318-321.

Un tel synthon est particulièrement intéressant dans la production des anticorps selon l'invention et particulièrement dans la réalisation de l'antigène constitué par ledit synthon ou le comportant.

Une fois le synthon produit et soit couplé directement à une protéine porteuse, soit inséré dans une séquence peptidique, il peut être utilisé dans la fabrication des anticorps spécifiques dirigés contre lui ou être stocké, de préférence congelé à -20°C pour être utilisé ultérieurement. Par le terme couplé , on entend par exemple lié ou conjugué. Cette liaison ou conjugaison peut se faire chimiquement, par exemple par une liaison covalente, adsorption ou un autre mode de fixation connu de l'homme de l'art. De préférence, le couplage se fait de préférence par un agent de couplage comme par exemple le cardodiimide ou la glutaraldéhyde. La molécule porteuse à laquelle est couplé le synthon est une molécule de poids moléculaire suffisamment important pour induire une réaction immunitaire et la production d'anticorps circulants. Cette molécule peut être une protéine, un polypeptide, un polymère naturel ou synthétique. Elle est de préférence une protéine et en particulier une protéine de poids moléculaire supérieur ou égal à 5 kDaltons telle que l'albumine ou l'hémocyanine de patelle (KLH pour Keyhole Limpet Haemocyanin). Dans une forme préférée de l'invention, on utilise la KLH en tant que protéine porteuse. Le couple synthon-molécule porteuse est injecté à un animal à immuniser. Le couple synthon-molécule porteuse est de préférence en suspension et de préférence mélangé avec une solution d'adjuvant de Freund qui est composée d'huile minérale additionnée d'un agent émulsifiant (adjuvant incomplet) et de particules de bacille inactivé de la tuberculose (adjuvant complet). L'animal auquel est injecté ledit couple synthon-molécule porteuse en suspension peut être le lapin, la souris, le rat, la chèvre, le mouton, le cheval ou le cobaye, de préférence le lapin, le rat et la souris. L'injection dudit couple peut se faire en une seule fois ou en plusieurs fois selon les méthodes classiques et connues d'immunisation. Les principales voies d'administration sont des injections sous- cutanées, intradermiques, ou intramusculaires; les injections intraveineuses et intrapéritonéales ne sont employées que dans des cas particuliers. S'il y a plusieurs injections du couple synthon-molécule porteuse, les types d'anticorps produits, spécifiques du synthon, sont différents. En effet, il peut s'agir d'immunoglobulines de type G ou M.

Les méthodes d'injection sont connues et sont des méthodes classiques dans les protocoles d'immunisation d'animaux, particulièrement de lapins. Ainsi, on injecte de préférence en intramusculaire environ 1 ml dudit couple antigénique à un lapin et environ 100 l à une souris. La concentration en synthon dans le mélange d'injection est d'environ 50 g/ml.

Le sang de l'animal contenant, entre autres, lesdits anticorps spécifiques du synthon injecté est récupéré par prélèvement ou par exsanguination. De préférence, on prélève du plasma ou du sérum contenant également, entre autres, les anticorps spécifiques du synthon tel que défini ci-dessus. Le sérum contenant les anticorps recherchés, dirigés contre ledit synthon, contient normalement plusieurs espèces d'anticorps différents dirigés contre plusieurs épitopes du même antigène, on appelle cette préparation polyclonale. On peut également mettre en oeuvre des techniques permettant d'isoler et de cloner des lymphocytes ne produisant qu'une espèce moléculaire (i.e. clonotype) d'anticorps : les anticorps qui ne reconnaissent qu'un seul épitope de l'antigène.

L'étape de sélection des anticorps spécifiques dudit synthon tel que défini ci-dessus se fait à l'aide de la technique ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). Cette technique de sélection est largement décrite dans la littérature. Pour résumer, ce principe connu de l'homme de l'art, on procède comme suit : - le synthon décrit ci-dessus ou un épitope de formule (I) est fixé à un support classiquement utilisé dans les techniques d'ELISA - au moins un lavage est effectué, - on ajoute sur le support le plasma ou le sérum de l'animal ayant été immunisé - au moins un lavage est effectué, - on ajoute une solution contenant des anticorps, de préférence de chèvre ou de mouton, reconnaissant spécifiquement les anticorps issus de l'animal ayant été immunisé, de préférence le lapin, le rat ou la souris, lesdits anticorps ajoutés étant couplés à une molécule utiles pour leur détection, de préférence une enzyme dégradant un substrat comme la peroxydase dégradant le TMB ou la DAB, - au moins un lavage est effectué, on ajoute le substrat de la molécule utile à la détection (le TMB ou la DAB), - on effectue une lecture de la densité optique révélatrice de la présence des anticorps souhaités et ainsi sélectionnés. Dans cette technique de sélection, on utilise de préférence la BSA propionylée et/ou butyrylée telle que définie dans la présente demande mais le synthon tel que défini ci-dessus couplé à une protéine porteuse ou un peptide contenant au moins un motif lysyl propionylé et/ou butyrylé couplé à une protéine porteuse peuvent être utilisés.

Lorsqu'une étape de purification des anticorps est réalisée, cette dernière peut être faite en phase liquide ou solide et de différentes façons à savoir la chromatographie d'affinité en utilisant soit des colonnes de séparation, des billes magnétiques ou des résines portant ledit synthon en tant que ligand. On préfère un support solide tel qu'une colonne de sépharose sur laquelle les synthons ont été fixés, de préférence par liaison covalente. On fait passer le sang/plasma/sérum sur ladite colonne de fixation où seuls les anticorps contre le synthon devraient s'attacher sur la colonne, toutes les autres protéines du sérum étant lavées dans l'éluat permettant la sélection des anticorps spécifiques des synthons.

Dans une variante de réalisation, l'invention concerne également un procédé de fabrication des anticorps ou de l'un de leurs fragments fonctionnels tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il consiste à : a1) faire réagir une molécule de formule CH3-(CH2) -CO-O-CO-(CH2),, CH3 où n vaut 1 ou 2 avec une molécule porteuse afin de substituer les motifs lysyl de ladite 15 molécule porteuse, bl) injecter à un animal approprié ladite molécule porteuse ainsi substituée, cl) récupérer du plasma/sérum dudit animal, dl) sélectionner les anticorps spécifiques des motifs lysyl substitués réalisés à l'étape al) à l'aide d'un ou plusieurs épitopes de formule (I) tels que définis ci-dessus, 20 el) éventuellement purifier les anticorps selon les méthodes classiques.

L'étape al est réalisée comme suit : La molécule porteuse, de préférence BSA ou KLH est mise à réagir avec l'anhydride propionique ou butyrique, de formule CH3-(CH2),, CO-O-CO-(CH2)äCH3 où n vaut 25 respectivement 1 ou 2, afin que les lysines de cette molécule porteuse réagissent pour former une molécule contenant des lysines substituées et plus précisément des lysines propionylées et/ou butyrylées. On utilise de préférence la BSA qui contient 59 lysines. La protéine porteuse ainsi substituée est incubée au moins 2 heures, de préférence à 22°C, puis dialysée contre un tampon, de préférence du PBS (tampon phosphate). 30 Cette molécule porteuse dont les lysines sont substituées est utilisée comme immunogène comportant les épitopes de formule (1) décrite ci-dessus. Les étapes b l) à e 1) sont identiques aux étapes c) à f) du procédé de fabrication d'anticorps ou de l'un de leurs fragments fonctionnels décrit ci-dessus.

35 La présente invention concerne également un procédé de fabrication des anticorps, ou d'un de leurs fragments fonctionnels, tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il consiste à : a2) mettre en oeuvre un épitope de formule (I) dans laquelle au moins un des résidus R°, RI est différent de H ou R2 est différent de OH, b2) coupler ledit épitope à une molécule porteuse, c2) injecter ledit couple épitope-molécule porteuse à un animal approprié, 5 d2) récupérer du plasma/sérum dudit animal, e2) sélectionner les anticorps spécifiques dudit épitope utilisé à l'étape a) à l'aide d'un ou plusieurs épitopes tels que définis dans la revendication 1 f2) éventuellement purifier les anticorps selon les méthodes classiques. Les étapes b') à f) sont identiques aux étapes b) à f) décrites ci-dessus dans le procédé de 10 réalisation des anticorps spécifiques du synthon lui-même et ne seront donc pas rappelées. La mise en oeuvre d'un épitope tel que défini ci-dessus se fait par la réalisation, la fabrication extemporanée dudit épitope ou par l'utilisation d'un épitope répondant à la formule (I) déjà synthétisé selon les méthodes classiques de synthèse connues, de préférence les synthèses peptidiques ou protéiques. 15 Composition La présente invention concerne également une composition comprenant des anticorps, ou au moins l'un de leurs fragments fonctionnels, tels que définis ci-dessus, ou obtenus selon le procédé tel que défini précédemment. 20 Ladite composition peut avantageusement comprendre des réactifs tels que des anticorps secondaires marqués ou non et des solutions de révélation ou de visualisation permettant de mettre en évidence les réactions anticorpsûantigènes. Ladite composition peut également comprendre des excipients de différentes natures de type de ceux classiquement utilisés dans des compositions contenant des anticorps. 25 Ladite composition, tout comme les anticorps selon l'invention, peuvent avantageusement être utilisés dans le domaine de la recherche, pour expliquer des phénomènes biologiques et tester l'efficacité desdits anticorps ou de la composition telle que définie ci-dessus. Par ailleurs, cette composition comprenant au moins des anticorps spécifiques de l'épitope de formule (I) exposée ci-dessus, peut être utilisée dans au moins l'une des applications 30 suivantes : recherche, diagnostic, analyse, pronostic de pathologie, thérapeutique, test d'efficacité ou de toxicité d'un médicament. Il peut s'avérer particulièrement intéressant d'utiliser cette composition dans le domaine thérapeutique. Certaines pathologies sont liées à des modifications post-traductionnelles. Dans le cadre 35 de la présente invention, la propionylation et/ou la butyrylation en particulier des lysines sont particulièrement visées. Parmi les pathologies liées à la propionylation et/ou la butyrylation de résidus lysine, on peut citer par exemple le cancer, les maladies neurodégénératives, le diabète et les pathologies inflammatoires.

Procédé et nécessaire de détection des épitopes Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un procédé de détection, dans un échantillon in vitro ou in vivo, de l'épitope de formule (I) tel que défini précédemment, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : A) éventuellement fixer sur un support approprié les anticorps ou au moins l'un de leurs fragments fonctionnels tels que définis ci-dessus ou compris dans une composition telle que définie ci-dessus, B) mettre en contact un échantillon contenant potentiellement ledit épitope de formule (I) avec les anticorps ou au moins l'un de leurs fragments fonctionnels tels que définis précédemment ou tels que compris dans une composition telle que définie ci-dessus, C) éventuellement effectuer au moins un lavage, D) détecter/révéler les complexes anticorps-épitope(s) de formule (I). 15 De préférence, au préalable, les anticorps selon la présente invention sont fixés sur un support essentiellement solide ou tout support réactionnel permettant de réaliser un test immunologique. La fixation au support est réalisée, de préférence, par adsorption ou liaison covalente. Une éventuelle étape de lavage permet de supprimer après ladite 20 fixation les anticorps non fixés audit support le cas échéant. L'échantillon concerné, à mettre en oeuvre avec les anticorps selon l'invention, peut être toute substance susceptible de contenir ledit épitope en question de formule (I) telle qu'une substance solide ou liquide, comme par exemple un organe, des cellules de tissus, des extraits nucléaires de cellules données, des extraits cytoplasmiques de cellules données, du sang, 25 du plasma, du sérum, de la lymphe, de l'urine, de la salive. De préférence, on utilise du sérum. Lorsque l'échantillon contient des molécules contenant au moins un motif lysyl substitué répondant à la formule (I) et constituant un épitope, ces molécules via cet épitope vont se lier spécifiquement aux anticorps préalablement fixés sur support adapté. Un éventuel lavage permettra d'éliminer les anticorps non fixés au support et les 30 complexes moléculesûanticorps non spécifiques. Selon des méthodes connues de l'homme de l'art, l'anticorps spécifique peut être utilisé en phase liquide, en solution.

Dans le cadre du procédé et du nécessaire de détection des épitopes de formule (I) de la présente demande, les supports de réactions immunologiques utilisés peuvent être de 35 nature différentes et sont choisis parmi : les lames, les microplaques, les latex fluorescents, les latex magnétiques, les membranes d'immuno-filtration ou les membranes d'immuno-migration, les biochips, les billes, les ailettes, les tubes mais également les liposomes, les vésicules lipidiques, les microparticules biologiques ou obtenues à partir de polymères, les émulsions....

Dans le cadre du procédé et du nécessaire de détection des épitopes de formule (I) de la présente demande, la méthode de détection de l'étape D) peut être déclinée en plusieurs technologies telles que les tests ELISA, l'immunoturbidimétrie, l'agglutination de latex sur lame, la néphélométrie, la turbidimétrie, la turbidimétrie ou néphélométrie amplifiée par particules de latex, immunofluorescence (sur lame, microplaque, latex fluorescent, latex magnétique, test, sur membrane, biochips etc... et de façon générale peut être utilisé tout procédé permettant d'identifier et/ou de quantifier une réaction entre un antigène et plus particulièrement un épitope et un anticorps, quelque soit l'isotype.

Dans une variante, on peut utiliser des techniques permettant la détection directe des anticorps en tant que complexes anticorps-épitope telle que la réfractométrie, la diffraction de rayons lumineux par la surface réactionnelle, des méthodes de modification de la conductivité électrique ou du champ magnétique etc....

Les méthodes d'immunochimie de détection utilisent généralement une marque enzymatique (peroxydase, glucose oxydase, phosphatase alcaline). De préférence, la réaction immunologique, à savoir la reconnaissance de l'anticorps ou de au moins l'un de ses fragments fonctionnels selon l'invention avec l'épitope de formule (I), est suivie par une réaction indicatrice qui permet la détection photométrique de l'activité enzymatique liée au complexe anticorps-épitope de formule (I).

Ces méthodes de détection du complexe anticorps-épitope de formule (I) permettent ainsi non seulement de détecter les épitopes de formule (I) présents dans un échantillon donné in vitro ou in vivo mais elles permettent aussi de d'identifier au niveau subcellulaire la localisation dudit épitope dans une cellule ou dans une molécule donnée et également de quantifier lesdits épitopes ainsi que d'estimer leur rôles biologiques potentiels.

La présente invention concerne également un nécessaire de détection, dans un échantillon in vitro ou in vivo, de molécule contenant au moins l'épitope de formule (I) tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend : au moins un anticorps ou au moins l'un de ses fragments fonctionnels tels que définis ci-dessus, de préférence fixé sur un support et le matériel approprié et nécessaire pour détecter les complexes anticorpsépitopes de formule (I).

Ce nécessaire permet de détecter de façon rapide et fiable la présence ou non de molécule comprenant au moins un épitope de formule (I)

Procédé et nécessaire de détection des auto-anticorps Ces modifications post-traductionnelles de propionylation et/ou butyrylation des lysines ont pu être observées in vitro. Grâce à la présente invention, il est désormais possible d'observer ces modifications in vivo. Elles ont, comme mentionné précédemment, des implications au niveau de différents processus biologiques et peuvent, si elles ne sont pas effectuées correctement, à la bonne localisation ou en sur/sous-nombre, engendrer des pathologies particulièrement comme les pathologies inflammatoires, le cancer, des maladies neurodégénératives et le diabète. Une propionylation/butyrylation inadaptée d'un résidu lysine peut devenir un antigène in vivo et donc induire une réaction immunitaire, la protéine défectueuse étant identifiée comme du non-soi. L'organisme développe alors des anticorps contre son propre organisme appelés auto-anticorps. En effet, dans la présente demande, le terme auto-anticorps désigne par exemple une immunoglobuline dirigée contre un constituant de l'organisme qui produit l'immunoglobuline (ou anticorps) en question. Selon la présente invention, il s'agit d'un anticorps dirigé contre un épitope de formule (I) suivante : o R ,I Rù N O CI H2)4 NH R 0 (I) dans laquelle R° équivaut à H, un alkyle, un aryle, un alkylaryle ou un aralkyle,

RI équivaut à H, un alkyle, un aryle, un alkylaryle, un aralkyle, un sucre, un

lipide, un nucléotide ou une entité constituée d'au moins un motif acide aminé, ledit motif 25 acide aminé étant relié au motif lysyl par une liaison peptidique,

R2 équivaut à OH, un alkyle, un aryle, un alkylaryle, un aralkyle, un sucre, un lipide, un nucléotide, une entité constituée d'au moins un motif acide aminé, ledit motif acide aminé étant relié au motif lysyl par une liaison peptidique, ou OR4 où R4 est un alkyle, un aryle, un sucre, un lipide,

30 R3 équivaut à -(CH2)n CH3 où n vaut 1 ou 2.

Ces auto-anticorps produits induisent donc des pathologies auto-immunes et il peut s'avérer être très important de pouvoir diagnostiquer rapidement la présence ou non d'auto-anticorps in vivo chez un patient, pouvoir réaliser une analyse, un suivi de préférence sérologique et un pronostic vis-à-vis de pathologies. En effet, certaines pathologies auto-immunes, comme la thrombocytopénie induite par l'héparine ou la maladie coeliaque, peuvent avoir des conséquences fatales si elles ne sont pas traitées ou ne sont pas diagnostiquées suffisamment tôt. De plus, la présence de ces auto-anticorps peuvent nuire voire inhiber totalement l'effet de certains traitements impliquant au moins des molécules, de préférence des protéines, portant des épitopes de formule (I). C'est pourquoi l'invention porte également sur un procédé de détection des auto-anticorps spécifiques des épitopes de formule (I) tels que définis ci-dessus, dans un échantillon in vitro ou in vivo, de préférence un plasma ou un sérum, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : Al) éventuellement fixer sur un support approprié au moins un épitope de formule (I), B 1) mettre en contact ledit épitope de formule (I), de préférence fixé sur un 15 support approprié avec un échantillon, Cl) éventuellement effectuer au moins un lavage, Dl) détecter/révéler lesdits (éventuels) complexes auto-anticorps-épitopes de formule (I) par des moyens de détections appropriés.

20 De préférence, le support est solide mais il peut s'agir de tout support réactionnel permettant de réaliser un test immunologique. L'épitope de formule (I) est fixé sur un support adapté. Comme exposé plus haut, de préférence la fixation se fait par adsorbtion mais elle peut également être réalisée par liaison covalente sur un support adapté. On veillera à ce que la quantité d'épitope de formule (I) fixée ne soit pas un facteur limitant 25 afin que tous les auto-anticorps de l'échantillon à tester puissent ainsi s'y fixer spécifiquement.

Les différents supports utilisables sont identiques à ceux utilisables et détaillés ci-dessus pour la mise en oeuvre du procédé et du nécessaire de détection des épitopes de formule 30 (I).

L'échantillon à tester peut être toute substance biologique susceptible de contenir cesdits auto-anticorps spécifiques de l'épitope (I) comme des cellules des tissus, du sang, plasma, du sérum, de l'urine, de la salive .... De préférence, l'échantillon à tester 35 est du plasma ou du sérum d'un patient contenant potentiellement des auto-anticorps dirigés contre l'épitope de formule (I). De préférence, le plasma ou sérum est dilué ou non.

Les éventuels lavages ont pour but d'éliminer d'une part les épitopes non fixés sur le support, mais également et surtout d'éliminer les auto-anticorps libres ou fixés de façon non spécifique à leur épitope spécifique. Selon la présente invention, les différentes méthodes de détections utilisées sont qualitatives et/ou quantitatives. Ces méthodes de détection des complexes auto-anticorps-épitopes sont connues de l'homme du métier. Elles peuvent être déclinées en plusieurs technologies telles que celles exposées précédemment pour le procédé et le nécessaire de détection des épitopes de formule (I).

La présente invention porte également sur un nécessaire de détection des auto-anticorps 10 spécifiques des épitopes de formule (1) tels que définis ci-dessus, dans un échantillon in vitro ou in vivo, de préférence un plasma ou un sérum, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins un épitope de formule (I) tel que défini ci-dessus et 15 - le matériel approprié et nécessaire pour détecter/révéler les complexes anticorpsépitopes de formule (I).

Dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé et du nécessaire de détection des auto-anticorps selon l'invention, est utilisée l'une des différentes méthodes de détection 20 citées ci-dessus dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé ou du nécessaire de détection des épitopes de formule (I).

Grâce audit nécessaire de détection des auto-anticorps, il est ainsi plus simple, plus facile et plus rapide d'établir un diagnostic d'éventuelles pathologies induites par les 25 lysines substituées par un résidu propionyl ou butyryl, de réaliser un suivi et une analyse de la pathologie et surtout de la sérologie du patient à surveiller, d'évaluer l'efficacité et la toxicité d'un médicament ou d'une composition ciblant par exemple ces auto-anticorps ou d'utiliser ces auto-anticorps en recherche.

30 Exemples Les exemples qui suivent illustrent la présente demande.

L'invention sera mieux comprise si l'on se réfère aux figures annexées dans lesquels : - la figure 1 représente deux courbes de titration de sérum de lapin anti-35 lysine propionylée. - la figure 2 représente deux courbes de titration de sérum de lapin antilysine butyrylée. - la figure 3 représente une photographie d'une analyse en western blot de la réaction d'acétylation des histones H3 et H4 révélée grâce à des anticorps anti-acétyl. - la figure 4 représente une photographie d'une analyse en western blot de la réaction de propionylation des histones H3 et H4 révélée grâce aux anticorps objet de l'invention. - La figure 5 représente une photographie d'une analyse en western blot de la réaction de propionylation des histones H3 et H4 en présence ou non de différents cofacteurs et révélée grâce aux anticorps objet de l'invention. - La figure 6 représente une photographie d'une analyse en western blot de 10 la détection de la propionylation naturelle des histones H2A révélée grâce aux anticorps objet de l'invention.

Exemple 1 : Procédé de préparation des anticorps polyclonaux spécifiques de l'épitope de formule (I) 1.1 Préparation des épitopes de formule (1) (étape al) pour la production des immunogènes et des antigènes. 1.1.a/ Préparation des immunogènes (KLH) contenant les motifs lysyl acylés (propionylés et/ou butyrylés) pour l'immunisation des animaux. 20 Cette préparation a été décrite dans l'article suivant :Thomas V et al, dans J Immunol Methods. 2004 Sep;292(1-2):83-95. Brièvement, les antigènes KLH propionylé et KLH butyrylé ont été préparés comme suit : 25 KLHpropionylée : 2mg de KLH solubilisée dans 1 ml de tampon bicarbonate 0.1 M pH 9,5 ont été mis en contact avec 0,7 mmoles d'anhydride propionique (CH3-(CH2)-CO-OCO-(CH2)-CH3). Après une incubation de 2 heures à 22°C, la protéine modifiée, substituée par des radicaux propionyl sur les motifs lysyl est dialysée 3 fois contre 2 litres de tampon PBS. 30 KLH butyrylée :2mg de KLH solubilisée dans 1 ml tampon bicarbonate 0.1 M pH 9,5 ont été mis en contact avec 0,7 mmoles d'anhydride butyrique (CH3-(CH2)2-CO-O-CO-(CH2)2-CH3). Après une incubation de 2 heures à 22°C, la protéine modifiée, substituée par des radicaux butyryl sur les motifs lysyl est dialysée 3 fois contre 2 litres de PBS. 1.1.b/ Préparation des antigènes (BSA) contenant les motifs lysyl acylés (propionylés et/ou butyrylés) pour le test ELISA. 15 35 Pour obtenir la protéine BSA propionylée (BP), la même procédure et les mêmes proportions que pour KHL propionylée ci-dessus sont utilisées. Pour obtenir la protéine BSA butyrylée (BB), la même procédure et les mêmes proportions que pour KLH butyrylée ci-dessus sont utilisées.

Pour obtenir la protéine BSA acétylée (BA), la même procédure et les mêmes proportions que décrite dans Thomas V. et al dans J Immunol Methods. 2004 Sep;292(1-2):83-95 sont utilisées.

1.1.c/ Contrôle du degré d'acylation par dosage spectrophotométrique des amines 10 primaires. A 50 l des solutions de BSA native et de BSA acylée (BP, BB) (2mg/ml) sont ajoutés 50 l d'une solution de tétraborate de sodium saturée et 50 gl d'acide 2, 4, 6-trinitrobenzène sulfonique (O.lmM). L'acide 2, 4, 6-trinitrobenzène sulfonique est un réactif qui permet le dosage colorimétrique des amines primaires. L'acylation consiste à 15 former sur les amines primaires et notamment sur les résidus sNH2 de la lysine de la BSA des liaisons amides. Les résidus amidés ne sont pas réactifs avec l'acide 2, 4, 6-trinitrobenzène sulfonique, il s'ensuit qu'une diminution d'absorbance est proportionnelle au degré d'acylation, cette technique de dosage permet donc de calculer le pourcentage d'amines acylées. Après 30 minutes de réaction, l'absorbance à 420 nm 20 est mesurée par spectrophotométrie. La diminution d'absorbance par rapport à celle obtenue avec la BSA native est exprimée en pourcentage. BSA BSA BSA butyrylée (B) propionylée (BB) (BP) Amine acylée 0 >90 >90 (%) 25 Tableau 1 : Degré d'acylation des protéines par dosage spectro-photométrique des amines primaires. Le tableau 1 montre que pour les 2 antigènes synthétisés (BSA propionylée et BSA butyrylée), l'acylation est pratiquement totale, il en résulte que la quasi totalité des groupements sNH2 accessibles de la lysine présents sur la BSA sont acylés. 30

1.2 Immunisation des animaux 4 lapins femelles New Zealand de 2,5 Kg ont reçu 4 injections par voies intra-dermique et sous-cutanée aux jours JO, J14, J28 et J74 de Iml d'un mélange (50%/50%) d'une solution contenant 100 g de l'immunogène KLH-propionylé (2 lapins) et KLH-butyrylé (2 lapins) et de l'adjuvant de Freund selon le protocole d'immunisation dans le tableau ci-dessous (étape b 1). Des prélèvements réguliers (à J53, J74 et J90) de sang ont été effectués pour contrôler la réponse immunitaire (étape cl). Ce sang est laissé à coaguler pendant 30 minutes puis est centrifugé pendant 10 minutes à 2500 tours par min afin de récupérer le sérum et tester l'immuno-réactivié des anticorps. 10 Jour Protocole 0 Prélèvement de sérum contrôle (4 - 5 ml) et conservation à +4°C 0 Injection intradermique (1 ml / lapin) 0,5 ml Antigène + 0,5 ml Adjuvant Freund Complet 14 Injection sous-cutanée (1 ml / lapin) 0,5 ml Antigène + 0,5 ml Adjuvant Freund Incomplet 28 Injection sous-cutanée (1 ml / lapin) 0,5 ml Antigène + 0,5 ml Adjuvant Freund Incomplet 53 Prélèvement de sérum test (4-5 ml) et conservation à +4°C 74 Injection sous-cutanée (1 ml / lapin) 0,5 ml Antigène + 0,5 ml Adjuvant Freund Incomplet 90 Prélèvement fmal et conservation à +4°C 1.3- Sélection des anticorps spécifiques de l'épitope dans les sérums (étape dl) 15 Les anticorps spécifiques des motifs lysyl substitués ont été sélectionnés dans le sérum avec l'épitope de formule (I) produits ci-dessus grâce à la détermination de l'immunoréactivité du sérum de lapin par la technique ELISA (étape dl). Les antigènes BP ou BB sont adsorbés sur des plaques 96 puits en polystyrène. Pour ce faire, 1001.1l d'une solution 10gg/ml de chaque antigène en tampon bicarbonate 0.1 M 20 pH 9,5 sont distribués par puits. Après une incubation de 2 heures à 37°C, les puits sont vidés et un dépôt de 150 gl/puits d'une solution de BSA 0.5% dans du tampon PBS est réalisé dans le but de saturer les sites d'adsorption excédentaires sur le plastique. Cette étape de saturation nécessite une incubation d'une heure à 37°C. A ce stade, les plaques sont prêtes pour le dépôt des sérums. Pour ce test, les sérums sont utilisés à partir de la 25 dilution de 1/500 en tampon PBS contenant du tween-20 à 0.1%. Ces solutions sont déposées puis dilués de deux en deux directement sur la plaque (1/500, 1/1000, 1/2000 ...) de façon à obtenir 100 U puits de volume final. Après une heure d'incubation à 37°C, les plaques sont lavées 3 fois avec du PBS tween.

Un anticorps de mouton anti IgG (H+L) de lapin marqué à la peroxydase et déposé à raison de 100 l/puits et laissé 30 min. à 37°C. Les plaques sont alors lavées comme précédemment par 3 lavages successifs pour éliminer l'excédent de réactif L'activité peroxydase est révélée en utilisant le réactif eau oxygénée/tetraméthylbenzidine (TMB) (Covalab). La réaction est stoppée avec 100 l de H2 SO4 (2N). L'absorbance est mesurée sur lecteur de plaque à 450 nm.

1.4-purification des anticorps (étape fl) Les étapes d'immuno-purification des anticorps sont réalisées suivant les protocoles 10 décrits dans la publication Thomas V et al dans J Immunol Methods. 2004 Sep;292 (1-2):83-95.

1.5- Résultats : Détermination de l'immunoréactivité des sérums de lapin par ELISA 15 5 .1- Sélection des anticorps de lapin anti N-c-propionyl-L-Lysine avec la BSA acétylée (BA) ou la BSA propionylée (BP). Dilution de Absorbance à 450 nm sérum BA BP 1/500 0.559 2.916 1/1000 0.362 2.357 1/2000 0.250 1.647 1 /4000 0.181 1.085 1/8000 0.144 0.679 1/16000 0.141 0.444 Tableau 2 : Mesures de densité optique suivant les dilutions des sérums. 20 Le tableau 2 reflète l'immunoréactivité des sérums de lapin contenant les anticorps spécifiques des lysines propionylées et/ou butyrylées, vis-à-vis de la BSA acétylée et de la BSA propionylée. La BSA propionylée forme un complexe avec les anticorps spécifiques de la lysine propionylée (absorbance élevée).

25 La figure 1 illustre l'immunoréactivité des sérums vis-à-vis de deux antigènes : BSA acétylée et BSA propionylée. L'axe des ordonnées représente les valeurs de densités optiques mesurées à 450 nm et l'axe des abscisses représente les différentes dilutions du sérum. Cette figure 1 illustre le fait que les sérums contiennent des anticorps spécifiques des 30 lysines propionylées. En effet, les anticorps obtenus et contenus dans le sérum réagissent fortement avec le motif lysyl propionylé contenu dans l'antigène BP (absorbance de 1.647 à la dilution 1/2000 du sérum) alors qu'ils ne réagissent pas ou très peu avec le motif lysyl acétylé contenu dans l'antigène BA (absorbance de 0.250 à la dilution 1/2000 du sérum). Ces anticorps permettent de différencier la N-c-propionyl- L-lysine de la N-g-acétyl-L-lysine et sont donc hautement spécifiques des lysines propionylées.

5.2-Sélection des anticorps de lapin anti N-c-butyryl-L-lysine avec la BSA acétylée (BA) ou la BSA butyrylée (BB). Dilution de Absorbance à 450 nm sérum BA BB 1/500 0.158 1.558 1/1000 0.114 0.965 1 /2000 0.096 0.664 1 /4000 0.082 0.3 84 1/8000 0.080 0.278 1/16000 0.064 0.148 Tableau 3 : Mesures de densité optique suivant les dilutions des sérums. Le tableau 3 reflète l'immunoréactivité des sérums de lapin contenant les anticorps 15 spécifiques des lysines propionylées et/ou butyrylées, vis-à-vis de la BSA acétylée et de la BSA butyrylée. La BSA butyrylée forme un complexe avec les anticorps spécifiques de la lysine propionylée (absorbance élevée).

La figure 2 illustre l'immunoréactivité des sérums vis-à-vis de deux antigènes : BSA 20 acétylée et BSA butyrylée. L'axe des ordonnées représente les valeurs de densités optiques mesurées à 450 nm et l'axe des abscisses représente les différentes dilutions du sérum. Cette figure 2 illustre le fait que les sérums contiennent des anticorps spécifiques des lysines butyrylées. En effet, les anticorps obtenus et contenus dans le sérum réagissent 25 avec le motif lysyl butyrylé contenu dans l'antigène BB (absorbance de 1.558 à la dilution 1/500 du sérum) alors qu'ils ne réagissent pas avec le motif lysyl butyrylé contenu dans l'antigène BA (absorbance de 0.158 à la dilution 1/500 du sérum). Ces anticorps permettent de différentier la N-E-butyryl-L-Lysine de la N-E-acétyl-L-lysine et sont donc hautement spécifiques des lysines butyrylées. 30 Exemple 2. Procédé de production des anticorps

Le synthon est obtenu selon les méthodes décrites par M. Bashir Uddin Surfraz et al dans J. Med. Chem. 2007, 50, 1418-1422 et par Takeshi M.et al dans Biomacromolecules, 2007, 5 8, 318-321. mg de synthon lysyl propionylée et/ou butyrylée est couplé à 2 mg de BSA ou KLH en utilisant le carbodiimide comme agent de couplage pour conjuguer les synthons par les domaines alpha acide carboxylique laissés libres pour la réalisation dudit couplage selon la technique décrite par Thomas V et al dans J Immunol Methods. 2004 Sep;292 (1-2):83- 95. L'immunogène ainsi préparé est injecté aux animaux dans les mêmes conditions et modes opératoires décrits dans l'exemple 1.

Exemple 3. Etude de la spécificité des anticorps anti propionyl et anti butyryl sur 15 les histones modifiés in vitro et in vivo et procédé de détection de l'épitope de formule (I)

La préparation des histones, les électrophorèses en gel de polyacrylamide et les westernblots ont été réalisés selon la méthode référencée dans Bannister AJ et Kouzarides T, 20 Nature. 1996 Dec 19-26;384 (6610):641-3. Les anticorps appropriés utilisés sont l'anticorps monoclonal anti acétyl lysine (clone 11A1 mabO019-Covalab) et les anticorps polyclonaux de lapin anti priopionyl et anti butyryl (objet de l'invention).

Les réactions enzymatiques des histones acétyl tranférases P/CAF et PCB ont été 25 réalisées selon la méthode décrite par Bannister AJ et Kouzarides T dans Nature. 1996 Dec 19-26;384 (6610):641-3 en ajoutant dans le milieu réactionnel les cofacteurs acétyl CoA, propionyl CoA ou le butyryl-CoA à la concentration finales de 100 M.

Traitement des cellules HL60: Les cellules HL60 ont été incubées avec 1.5 M de 30 Trichostatin A (TSA) un inhibiteur des histones désacétylase, pendant 5 heures. Les cellules sont ensuite lavées 3 fois avec du tampon PBS et centrifugées à 13 000g. Le culot cellulaire est ensuite resuspendu dans le tampon IPH (50mM Tris pH 8, 150mM Nacl, 5mM EDTA, 5% NP-40, 1.5uM TSA) puis la suspension est laissée pendant 15 min à 4°C. Les tubes sont ensuite centrifugés à 13 000g pendant 10min. Le culot 35 chromatinien est ensuite repris dans le tampon d'électrophorèse comme décrit précédemment pour réaliser les western blot.

Résultats: - la figure 3 illustre la réaction d'acétylation des histones H3 et H4 des cellules HL60 par les Histone AcétylTransférases HATs (P/CAF & CBP) en présence (+) ou non (-) de l'inhibiteur TSA. La révélation est réalisée avec l'anticorps monoclonal anti acétyl lysine (mab0019). Conclusion : La réaction de contrôle pour vérifier le modèle de modification posttraductionnelle des histones in vitro montre clairement une acétylation importante des histones H3 et H4. L'addition du TSA exerce un effet inhibiteur de l'enzyme HDAC puisque l'intensité du marquage est plus importante. Ces résultats sont en parfaite concordance avec la littérature et valide bien le système utilisé.

- la figure 4 illustre la réaction de propionylation des histones H3 et H4 des cellules HL60 par les Histones AcétylTransférases HATs (P/CAF & CBP) en présence (+) ou non (-) de l'inhibiteur TSA. La révélation est réalisée avec l'anticorps polyclonal de lapin anti lysine propionylée (objet de l'invention). Conclusion : Dans les conditions de modification post-traductionnelles des cellules HL60 démontrées sur la figure 3, ces résultats montrent bien une propionylation des histones H3 et H4. L'addition de TSA montre que l'enzyme HDCA exerce un effet sur la propionylation, à savoir une dépropionylation des lysines des histones. - la figure 5 illustre la réaction de propionylation des histones H3 et H4 des cellules HL60 par les Histones AcétylTransférases HATs (P/CAF & CBP) en présence de : acétyl-CoA (Ac), propionyl-CoA (Pr), butyryl-CoA (Bu) ou sans cofacteur (-). La révélation est réalisée avec l'anticorps polyclonal de lapin anti lysine propionylé (objet de l'invention). Conclusion : Les anticorps polyclonaux anti lysine propionylée reconnaissent spécifiquement les histones H3 et H4 propionylées par l'action des HATs (P/CAF et CBP). - la figure 6 illustre la détection des histones H2A naturellement propionylées des cellules HL60 en présence (+) ou non (-) de l'inhibiteur TSA. La révélation est réalisée avec l'anticorps polyclonal de lapin anti lysine propionylée (objet de l'invention). Conclusion : L'anticorps polyclonal de lapin anti lysine propionylée permet de détecter une propionylation naturelle de l'histone H2A dans les cellules HL60. La propionylation est légèrement affectée par l'action de l'HDAC comme le montre le résultat obtenu avec l'addition du TSA.

Les anticorps de l'invention peuvent également être utilisés en immunohistochimie ou immunocytologie pour la détection des épitopes de formule (I) selon la technique décrite dans Roch et al Int J Cancer. 1991 May 10;48(2):215-20.

Exemple 4 : Procédé de détection des auto-anticorps spécifiques des épitopes de formule (I)

Le même procédé décrit dans l'exemple 1.3 ci-dessus est utilisé pour détecter les auto-anticorps dans un échantillon et en particulier dans un sérum.

Les antigènes BP ou BB sont adsorbés sur des plaques 96 puits en polystyrène. Pour ce faire, 100 l d'une solution 1011g/ml de chaque antigène en tampon bicarbonate 0.1 M pH 9,5 sont distribués par puits. Après une incubation de 2 heures à 37°C, les puits sont vidés et un dépôt de 150 l/puits d'une solution de BSA 0.5% dans du tampon PBS est réalisé dans le but de saturer les sites d'adsorption excédentaires sur le plastique. Cette étape de saturation nécessite une incubation d'une heure à 37°C. A ce stade, les plaques sont prêtes pour le dépôt du sérum à tester. Pour ce test, le sérum à tester est un sérum humain prélevé puis utilisé à différentes dilutions en PBS tween 20 0.1%. Cette solution est déposée puis diluée de deux en deux directement sur la plaque (1/50,1/100, 1/200, ...) de façon à obtenir 100 l/ puits de volume final.

Après une heure d'incubation à 37°C, les plaques sont lavées 3 fois avec du PBS contenant du tween-20 à 0.1 %. Un anticorps de mouton anti IgG (H+L) humaine marqué à la peroxydase et déposé à raison de 100 l/puits et laissé 30 min. à 37°C. Les plaques sont alors lavées par 3 lavages successifs pour éliminer l'excédent de réactif (anticorps de mouton).

Lesdits éventuels complexes épitopes-auto-anticorps sont révélés grâce au substrat de la peroxydase. L'activité peroxydase est révélée en utilisant le réactif eau oxygénée/tetraméthylbenzidine (TMB) (Covalab). La réaction est stoppée avec 100 i de H2 SO4 (2N). L'absorbance est mesurée sur lecteur de plaque à 450 nm.30

Claims (10)

1. REVENDICATIONS1. Anticorps isolés ou au moins l'un des fragments fonctionnels de ceux-ci, caractérisés en ce qu'ils sont spécifiques d'un épitope comprenant au moins un motif lysyl 5 de formule (I) suivante : o R ,I RùN 3~ 0 (I) dans laquelle R° équivaut à H, un alkyle, un aryle, un alkylaryle ou un aralkyle, R' équivaut à H, un alkyle, un aryle, un alkylaryle, un aralkyle, un sucre, un lipide, un nucléotide ou une entité constituée d'au moins un motif acide aminé, ledit motif 10 acide aminé étant relié au motif lysyl par une liaison peptidique, R2 équivaut à OH, un alkyle, un aryle, un alkylaryle, un aralkyle, un sucre, un lipide, un nucléotide, une entité constituée d'au moins un motif acide aminé, ledit motif acide aminé étant relié au motif lysyl par une liaison peptidique, ou OR4 où R4 est un alkyle, un aryle, un sucre, un lipide, 15 R3 équivaut à -(CH2)n CH3 où n vaut 1 ou
2. 2. 2. Procédé de fabrication des anticorps ou de au moins l'un de leurs fragments fonctionnels tels que définis dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à : 20 a) mettre en oeuvre un synthon en tant qu'épitope de formule (1), b) coupler ledit synthon à une molécule porteuse, c) récupérer du plasma/sérum d'un animal auquel a été préalablement injecté ledit couple synthon-molécule porteuse, cl) sélectionner les anticorps spécifiques dudit synthon utilisé à l'étape a) à l'aide 25 d'un ou plusieurs épitopes de formule (I) tels que définis dans la revendication 1, e) éventuellement purifier les anticorps selon les méthodes classiques.
3. 3- Procédé de fabrication des anticorps ou de au moins l'un de leurs fragments fonctionnels tels que définis dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il 30 consiste à : O NHal) faire réagir une molécule de formule CH3-(CH2)n-CO-O-CO-(CH2)R CH3 où n vaut 1 ou 2 avec une molécule porteuse afm de substituer les motifs lysyl de la molécule porteuse, bl) récupérer du plasma/sérum d'un animal auquel a été préalablement injectée 5 ladite molécule porteuse ainsi substituée, cl) sélectionner les anticorps spécifiques des motifs lysyl substitués réalisés à l'étape al) à l'aide d'un ou plusieurs épitopes de formule (I) tels que définis dans la revendication 1, dl) éventuellement purifier les anticorps selon les méthodes classiques. 10
4. 4. Procédé de fabrication des anticorps ou de au moins l'un de leurs fragments fonctionnels tels que définis dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à : a2) mettre en oeuvre un épitope de formule (I) dans laquelle au moins un des 15 résidus R°, RI est différent de H ou R2 est différent de OH, b2) coupler ledit épitope à une molécule porteuse, c2) récupérer du plasma/sérum d'un animal auquel a été préalablement injecté ledit couple épitope-molécule porteuse, d2) sélectionner les anticorps spécifiques dudit épitope utilisé à l'étape a2) à l'aide 20 d'un ou plusieurs épitopes de formule (1) tels que défmis dans la revendication 1, e2) éventuellement purifier les anticorps selon les méthodes classiques.
5. 5. Composition comprenant des anticorps ou au moins l'un de leurs fragments fonctionnels tels que défmis dans la revendication 1, ou obtenus selon le procédé tel que 25 défmi dans l'une des revendications 2 à 4.
6. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est utilisée dans au moins l'une des applications suivantes : recherche, diagnostic, analyse, pronostic de pathologie, thérapeutique, test d'efficacité 30 ou de toxicité d'un médicament.
7. 7. Procédé de détection, dans un échantillon in vitro ou in vivo, de l'épitope de formule (I) tel que défini dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : 35 A) éventuellement fixer sur un support approprié les anticorps ou l'un de leurs fragments fonctionnels tels que définis dans la revendication 1 ou compris dans une composition telle que définie dans la revendication 5,B) mettre en contact un échantillon contenant potentiellement ledit épitope de formule (I) avec les anticorps ou au moins l'un de leurs fragments fonctionnels tels que définis dans la revendication 1 ou compris dans une composition telle que définie dans la revendication 5, C) éventuellement effectuer au moins un lavage, D) détecter/révéler les complexes anticorps-épitope(s) de formule (1).
8. 8. Nécessaire de détection, in vitro ou in vivo, de molécule contenant au moins l'épitope de formule (I) tel que défini dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend : au moins un anticorps tel que défini dans la revendication 1, de préférence fixé sur un support et le matériel approprié et nécessaire pour détecter les complexes anticorpsépitopes de formule (I).
9. 9. Procédé de détection des auto-anticorps spécifiques des épitopes de formule (I) tels que définis dans la revendication 1, dans un échantillon in vitro ou in vivo, de préférence un plasma ou un sérum, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : Al) éventuellement fixer sur un support approprié au moins un épitope de formule (I), B1) mettre en contact ledit épitope de formule (I), de préférence fixé sur un support approprié, avec un échantillon, Cl) éventuellement effectuer au moins un lavage, Dl) détecter/révéler lesdits (éventuels) complexes auto-anticorps-épitopes de formule (I) par des moyens de détections appropriés.
10. 10. Nécessaire de détection des auto-anticorps spécifiques des épitopes de formule (I) tels que définis dans la revendication 1, in vitro ou in vivo, de préférence un 30 plasma ou un sérum, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins un épitope de formule (I) tel que défini dans la revendication 1 et - le matériel approprié et nécessaire pour détecter/révéler les complexes anticorps-35 épitopes de formule (I).