FR3053338A1 - Biomarqueur pour le diagnostic de maladies inflammatoires - Google Patents

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'un biomarqueur pour le diagnostic d'une maladie inflammatoire, en particulier des maladies inflammatoires chronique de l'intestin, une méthode de diagnostic, une méthode d'évaluation de l'efficacité d'un traitement, une méthode de dosage, ainsi que des kits et des substrats enzymatiques.

Description

© N° de publication : 3 053 338 (à n’utiliser que pour les commandes de reproduction) © N° d’enregistrement national : 16 56343 ® RÉPUBLIQUE FRANÇAISE
INSTITUT NATIONAL DE LA PROPRIÉTÉ INDUSTRIELLE
COURBEVOIE © Int Cl8 : C 07 K 7/00 (2017.01), G 01 N 33/68, 33/573, 33/531
DEMANDE DE BREVET D'INVENTION A1
©) Date de dépôt : 01.07.16. © Demandeur(s) : IP RESEARCH CONSULTING
(© Priorité : Société par actions simplifiée — FR.
@ Inventeur(s) : PEMBERTON IAIN K..
(© Date de mise à la disposition du public de la
demande : 05.01.18 Bulletin 18/01.
©) Liste des documents cités dans le rapport de
recherche préliminaire : Se reporter à la fin du
présent fascicule
(© Références à d’autres documents nationaux ® Titulaire(s) : IP RESEARCH CONSULTING Société
apparentés : par actions simplifiée.
©) Demande(s) d’extension : © Mandataire(s) : GROSSET FOURNIER ET DEMA-
CHY Société à responsabilité limitée.
BIOMARQUEUR POUR LE DIAGNOSTIC DE MALADIES INFLAMMATOIRES.
(u/J L'invention concerne l'utilisation d'un biomarqueur pour le diagnostic d'une maladie inflammatoire, en particulier des maladies inflammatoires chronique de l'intestin, une méthode de diagnostic, une méthode d'évaluation de l'efficacité d'un traitement, une méthode de dosage, ainsi que des kits et des substrats enzymatiques.
FR 3 053 338 - A1
Figure FR3053338A1_D0001
BIOMARQUEUR POUR LE DIAGNOSTIC DE MALADIES INFLAMMATOIRES
L'invention concerne l'utilisation d'un biomarqueur pour le diagnostic de maladies inflammatoires, en particulier des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, une méthode de diagnostic, une méthode d'évaluation de l'efficacité d'un traitement, une méthode de dosage, ainsi que des kits et des substrats enzymatiques.
Les maladies inflammatoires représentent un vaste groupe de pathologies diverses. Parmi elles, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI, ou IBD pour Inflammatory Bowel Disease) représentent un groupe de pathologies caractérisées par une inflammation chronique du tractus digestif. Ce groupe correspond à deux pathologies principales : la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU, ou RCH pour Rectocolite Hémorragique). Ces deux pathologies présentent de nombreux symptômes communs mais correspondent à des affections distinctes.
Il s'agit de pathologies dont les causes demeurent inconnues. Leur diagnostic, généralement complexe, requiert de procéder à de nombreux examens tels que des analyses de sang, des examens de selles, des endoscopies ou encore des biopsies. En particulier, il est bien souvent difficile de distinguer les MICI d'autres pathologies de l'intestin, telles que le syndrome du côlon irritable, présentant des symptômes similaires (distension abdominale, douleur, diarrhées,...).
Il existe donc actuellement un réel besoin d'outils efficaces permettant de diagnostiquer les maladies inflammatoires, en particulier les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.
Les protéines kinases correspondent à une famille d'enzymes jouant un rôle clé dans la transduction des signaux intracellulaires.
En particulier, la protéine kinase dépendante de l'AMPc (Adenosine monophosphate cyclique), ou protéine kinase A (PKA) est une protéine dimère composée de deux types de sous-unités, une sous-unité catalytique assurant le transfert d'un groupement phosphate à la protéine substrat, et une sous-unité régulatrice, sensible au niveau d'AMPc, contrôlant l'activation ON/OFF de la protéine kinase A. En fonction des niveaux d'AMPc présents dans la cellule, la protéine kinase A permet l'activation de nombreuses protéines par phosphorylation et intervient ainsi dans la régulation de nombreux mécanismes cellulaires (notamment la régulation du métabolisme des sucres et des lipides).
La présente invention propose une méthode de diagnostic des maladies inflammatoires, notamment des MICI, non-invasive, sensible, rapide, et bon marché reposant sur une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat de la protéine kinase A.
L'un des aspects de l'invention concerne ainsi l'utilisation d'une protéine kinase pour le diagnostic des maladies inflammatoires.
Un autre aspect de l'invention concerne une méthode de diagnostic des maladies inflammatoires.
Un autre aspect de l'invention concerne une méthode d'évaluation et de suivi de l'efficacité d'un traitement des maladies inflammatoires.
Un autre aspect de l'invention concerne une méthode de dosage de l'activité kinase A.
Un autre aspect de l'invention concerne également des kits de dosage et de diagnostic, ainsi que des peptides substrats.
Un premier aspect de l'invention a pour objet l'utilisation d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique d'un sujet suspecté de présenter une maladie inflammatoire, comme marqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic in vitro d'une maladie inflammatoire chez ledit sujet.
Selon l'invention, les maladies inflammatoires désignent des maladies résultant directement ou indirectement de la réponse immunitaire. Ces maladies présentent toutes une composante inflammatoire qui contribue de manière importante au développement de la maladie.
De manière non limitative, une maladie inflammatoire est notamment choisie parmi la liste ci-dessous :
- les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin,
- les lombalgies inflammatoires chroniques,
- les maladies autoimmunes, notamment le lupus érythémateux disséminé (SLE, systemic lupus erythematous),
- l'arthrite, notamment l'ostéoarthrite, l'arthrite rhumatoïde et l'arthrite psoriasique,
- la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC),
- la maladie cœliaque,
- les diabètes
- le cancer.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique d'un sujet suspecté de présenter des lombalgies inflammatoires chroniques, comme marqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic in vitro des lombalgies inflammatoires chroniques chez ledit sujet.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique d'un sujet suspecté de présenter une maladie autoimmune, comme marqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic in vitro d'une maladie autoimmune chez ledit sujet.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique d'un sujet suspecté de présenter de l'arthrite, comme marqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic in vitro de l'arthtite chez ledit sujet.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique d'un sujet suspecté de présenter une maladie pulmonaire obstructive chronique, comme marqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic in vitro d'une maladie pulmonaire obstructive chronique chez ledit sujet.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique d'un sujet suspecté de présenter une maladie cœliaque, comme marqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic in vitro d'une maladie cœliaque chez ledit sujet.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique d'un sujet suspecté de présenter un diabète, comme marqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic in vitro du diabète chez ledit sujet.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique d'un sujet suspecté de présenter un cancer, comme marqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic in vitro d'un cancer chez ledit sujet.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique d'un sujet suspecté de présenter une maladie inflammatoire chronique de l'intestin, comme marqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic in vitro d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin chez ledit sujet.
Cette invention repose sur la double observation surprenante faite par les inventeurs que la phosphorylation des substrats de la PKA (activité de la kinase A ou d'une PKA-like) peut être détectée dans le sang et est corrélée avec la présence des maladies inflammatoires, alors que la PKA est normalement une enzyme intracellulaire.
La mesure de l'activité kinase dans le sérum est ainsi utilisée comme outil pour le diagnostic des maladies inflammatoires.
Dans l'invention, l'expression protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1) désigne un groupe d'enzymes possédant une activité kinase type A, c'est-à-dire des enzymes capables de phosphoryler les substrats de la kinase A en présence d'ATP. Ce groupe d'enzymes inclut la protéine kinase A et les protéines PKA-like.
Dans l'invention, le terme protéine kinase A (ou PKA) désigne les kinases dépendantes de l'AMPc (ENZYME ENTRY : EC 2.7.11.11), membres de la famille des kinases à sérine-thréonine, ainsi que leurs différentes isoformes. De manière nonlimitative, la PKA humaine est principalement illustrée par la sous-unité catalytique alpha de séquence SEQ ID NO : 60.
En particulier, le terme protéine kinase A désigne une protéine kinase dont au moins une sous unité présente au moins 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d'identité, avec SEQ ID
NO : 60.
Le terme protéine kinase A peut également désigner une protéine kinase dont au moins une sous unité présente au moins 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d'identité, avec SEQ ID NO : 61 ou SEQ ID NO : 62.
SEQID NO : 60 sous-unité a MGNAAAAKKGSEQESVKEFLAKAKEDFLKKWESPAQNTAHLDQF ERIKTLGTGSFGRVMLVKHKETGNHYAMKILDKQKWKLKQIEH TLNEKRILQAVNFPFLVKLEFSFKDNSNLYMVMEYVPGGEMFSH LRRIGRFSEPHARFYAAQIVLTFEYLHSLDLIYRDLKPENLLID QQGYIQVTDFGFAKRVKGRTWTLCGTPEYLAPEIILSKGYNKAV DWWALGVLIYEMAAGYPPFFADQPIQIYEKIVSGKVRFPSHFSS DLKDLLRNLLQVDLTKRFGNLKNGVNDIKNHKWFATTDWIAIYQ RKVEAPFIPKFKGPGDTSNFDDYEEEEIRVSINEKCGKEFSEF
SEQID NO : 61 sous-unité β MGNAATAKKGSEVESVKEFLAKAKEDFLKKWENPTQNNAGLEDF ERKKTLGTGSFGRVMLVKHKATEQYYAMKILDKQKWKLKQIEH TLNEKRILQAVNFPFLVRLEYAFKDNSNLYMVMEYVPGGEMFSH LRRIGRFSEPHARFYAAQIVLTFEYLHSLDLIYRDLKPENLLID HQGYIQVTDFGFAKRVKGRTWTLCGTPEYLAPEIILSKGYNKAV DWWALGVLIYEMAAGYPPFFADQPIQIYEKIVSGKVRFPSHFSS DLKDLLRNLLQVDLTKRFGNLKNGVSDIKTHKWFATTDWIAIYQ RKVEAPFIPKFRGSGDTSNFDDYEEEDIRVSITEKCAKEFGEF
SEQID NO : 62 sous-unité y MGNAPAKKDTEQEESVNEFLAKARGDFLYRWGNPAQNTASSDQF ERLRTLGMGSFGRVMLVRHQETGGHYAMKILNKQKWKMKQVEH ILNEKRILQAIDFPFLVKLQFSFKDNSYLYLVMEYVPGGEMFSR LQRVGRFSEPHACFYAAQWLAVQYLHSLDLIHRDLKPENLLID QQGYLQVTDFGFAKRVKGRTWTLCGTPEYLAPEIILSKGYNKAV DWWALGVLIYEMAVGFPPFYADQPIQIYEKIVSGRVRFPSKLSS DLKHLLRSLLQVDLTKRFGNLRNGVGDIKNHKWFATTSWIAIYE KKVEAPFIPKYTGPGDASNFDDYEEEELRISINEKCAKEFSEF
Tableau 1. Séquences de référence des sous-unités de la PKA humaine.
Dans l'invention, le terme protéine kinase A-like (ou PKA-like) désigne toute protéine kinase capable de phosphoryler le même substrat peptidique que la protéine kinase A, mais dont la séquence peut être différente de celle de la protéine kinase A.
La protéine kinase A et les protéines kinase A-like sont capables de phosphoryler un susbstrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/TX3(SEQID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Selon l'invention, le terme acide amine naturel désigne un acide aminé choisi parmi l'alanine (A), la valine (V), l'isoleucine (I), la leucine (L), la méthionine (M), la phénylalanine (F), la tyrosine (Y), le tryptophane (W), la sérine (S), la thréonine (T), l'asparagine (N), la glutamine (Q), la cystéine (C), la glycine (G), la proline (P), l'arginine (R), l'histidine (H), la lysine (K), l'acide aspartique (D), l'acide glutamique (E), la sélénocystéine (U) et la pyrrolysine (O). Ces acides aminés peuvent également être modifiés naturellement par une ou plusieurs modifications post-traductionnelles (e.g. méthylation, nitrosylation, phosphorylation).
Selon l'invention, le terme acide aminé non naturel désigne un acide aminé qui n'existe pas naturellement. Il s'agit d'analogues d'acides aminés naturels. Ces peptides ont la même structure chimique de base qu'un acide aminé naturel mais possèdent des groupements et/ou un squelette peptidique modifiés (e.g. la norleucine, l'homosérine, la norleucine, la méthionine sulfoxyde, de sulfonium de méthionine de méthyle).
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique d'un sujet suspecté de présenter une maladie inflammatoire, comme marqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic in vitro d'une maladie inflammatoire chez ledit sujet, ladite protéine kinase étant choisie parmi la protéine kinase A et une protéine PKA-like.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique d'un sujet suspecté de présenter une maladie inflammatoire, comme marqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic in vitro d'une maladie inflammatoire chez ledit sujet, ladite protéine kinase étant la protéine kinase A.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique d'un sujet suspecté de présenter une maladie inflammatoire, comme marqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic in vitro d'une maladie inflammatoire chez ledit sujet, ladite protéine kinase étant une protéine PKA-like.
ίο
Dans un mode de réalisation, la protéine kinase, dont l'activité est mesurée dans la présente invention, est capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé choisi parmi R et K, de préférence R X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C, de préférence parmi L, F, Vetl.
Dans un mode de réalisation, la protéine kinase, dont l'activité est mesurée dans la présente invention, est capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da,
Xa et Xb sont des acides aminés naturels ou non naturels, de préférence choisis parmi P et un acide aminé en D-isomère.
Dans un mode de réalisation, le substrat peptidique comprend ou consiste en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1) ou R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2), où :
Xi est un acide aminé chargé positivement au pH physiologique, en particulier R ou K, plus particulièrement R.
Dans un mode de réalisation, le substrat peptidique comprend ou consiste en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1) ou R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2), où :
X2 est P.
Dans un mode de réalisation, le substrat peptidique comprend ou consiste en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1) ou R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C.
Dans un mode de réalisation, le substrat peptidique comprend ou consiste en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1) ou R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : L, F, V et I.
Dans un mode de réalisation, le substrat peptidique comprend ou consiste en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1) ou R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : Q, R, Μ, K, H et C.
Dans un mode de réalisation, la protéine kinase, dont l'activité est mesurée dans la présente invention, est capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en une des séquences suivantes :
LRRASLG (SEQ ID NO : 4), PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), PRRASLG (SEQ ID NO : 7), PRRWSLG (SEQ ID NO : 8), PRRKSLG (SEQ ID NO : 9), PRRLSLG (SEQ ID NO : 10), PRRRSLG (SEQID NO : 11), PRRTSLG (SEQ ID NO : 12), PRRGSLG (SEQ ID NO : 13), PRRESLG (SEQ ID NO : 14), PRRSSLG (SEQ ID NO : 15), PRRYSLG (SEQ ID NO : 16), PRRHSLG (SEQ ID NO : 17), PRRVSLG (SEQ ID NO : 18), PRRNSLG (SEQ ID NO : 19), PRRCSLG (SEQ ID NO : 20), PRRQSLG (SEQ ID NO : 21), PRRDSLG (SEQ ID NO : 22), PRRASFG (SEQ ID NO : 23), PRRASVG (SEQ ID NO : 24), PRRASIG (SEQ ID NO : 25), PRRASMG (SEQ ID NO : 26), PRRASQG (SEQ ID NO : 27), PRRASNG (SEQ ID NO : 28), PRRASCG (SEQ ID NO : 29), RDLRRASLV (SEQ ID NO : 30), RYLRRATLV(SEQ ID NO : 31), RYLRRPSLG (SEQ ID NO : 32), RPPRRASLG (SEQ ID NO : 33), R{dY}{dL}RRASLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 34), R{dY}{dL}RRPSLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 35), RPPRKASLG (SEQ ID NO : 36), RPPRRPSLG (SEQ ID NO : 37), RPPRRPSI (SEQ ID NO : 38), PRRPTI (SEQ ID NO : 39) et RYLRRASLG (SEQ ID NO : 40).
L'activité de phosphorylation PKA (ou PKA-like) peut être testée en incubant une protéine kinase ou un échantillon biologique susceptible de contenir une protéine kinase en présence d'un substrat peptidique tel que défini ci-dessus et en présence d'ATP.
Dans l'invention, le terme maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (ou MICI ou IBD) regroupe deux pathologies distinctes, la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse. Ces deux pathologies se caractérisent par une inflammation de la paroi d'une partie du tube digestif et évoluent par poussées inflammatoires de durée et de fréquence extrêmement variables en fonction des patients.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle ladite maladie inflammatoire chronique de l'intestin appartient au groupe suivant : la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse.
Dans l'invention, le terme maladie de Crohn (MC) fait référence à une affection inflammatoire chronique touchant n'importe quelle partie du tube digestif, mais s'installant le plus souvent à la jonction de l'intestin grêle et du côlon. La maladie de Crohn, contrairement à la colite ulcéreuse, peut toucher toutes les parties de l'intestin et se caractérise principalement par un granulome épithélioïde observé dans la sousmuqueuse de l'intestin.
Dans l'invention, le terme rectocolite hémorragique ou colite ulcéreuse (CU) fait référence à une inflammation chronique du colon et du rectum caractérisée par l'existence d'ulcérations superficielles ou profondes, isolées ou confluentes.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une protéine kinase telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite kinase est capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est R,
X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V et I.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une protéine kinase telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite kinase est capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ. ID NO : 2), où : Xi est R,
X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V et I,
Xa et Xb sont des acides aminés naturels ou non naturels, de préférence choisis parmi P et un acide aminé en D-isomère.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une protéine kinase telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite kinase est capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xa-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 3), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel, de préférence R,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel, de préférence choisi parmi P et A,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel, de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da,
Xa est un acide aminé naturel ou non naturel, de préférence choisi parmi P et un acide aminé en D-isomère.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une protéine kinase telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite kinase est capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence LRRASLG (SEQ ID NO : 4).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une protéine kinase telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite kinase est capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence PRRPSLG (SEQ ID NO : 5).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une protéine kinase telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite kinase est capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence LPRRPSI (SEQ ID NO : 6).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle ledit échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma ou de sérum.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle ledit échantillon biologique est un échantillon de sang.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle l'activité de ladite protéine kinase est déterminée dans ledit échantillon biologique.
La mesure de l'activité de ladite protéine kinase implique l'utilisation d'ATP, en tant que donneur de phosphate, et d'un substrat peptidique, en tant qu'accepteur de phosphate. La phosphorylation du substrat peptidique peut être mesurée à l'aide de techniques connues de l'homme du métier, notamment à l'aide de marqueurs radioactifs (par exemple, l'ATP marqué au 32P) ou fluorescents (par exemple, un substrat lié à une molécule fluorescente).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle l'activité de ladite protéine kinase est déterminée dans un échantillon de sang dudit sujet.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'au moins un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'au moins un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé choisi parmi R et K, de préférence R X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C, de préférence parmi L, F, Vetl.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'au moins un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2),
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da,
Xa et Xb sont des acides aminés naturels ou non naturels, de préférence choisis parmi P et un acide aminé en D-isomère.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'au moins un substrat peptidique comprenant ou consistant en une séquence choisie parmi :
LRRASLG (SEQ ID NO : 4), PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), PRRASLG (SEQ ID NO : 7), PRRWSLG (SEQ ID NO : 8), PRRKSLG (SEQ ID NO : 9), PRRLSLG (SEQ ID NO : 10), PRRRSLG (SEQ ID NO : 11), PRRTSLG (SEQ ID NO : 12), PRRGSLG (SEQ ID NO : 13), PRRESLG (SEQ ID NO : 14), PRRSSLG (SEQ ID NO : 15), PRRYSLG (SEQ ID NO : 16), PRRHSLG (SEQ ID NO : 17), PRRVSLG (SEQ ID NO : 18), PRRNSLG (SEQ ID NO : 19), PRRCSLG (SEQ ID NO : 20), PRRQSLG (SEQ ID NO : 21), PRRDSLG (SEQ ID NO : 22), PRRASFG (SEQ ID NO : 23), PRRASVG (SEQ ID NO : 24), PRRASIG (SEQ ID NO : 25), PRRASMG (SEQ ID NO : 26), PRRASQG (SEQ ID NO : 27), PRRASNG (SEQ ID NO : 28), PRRASCG (SEQ ID NO : 29), RDLRRASLV (SEQ ID NO : 30), RYLRRATLV(SEQ ID NO : 31), RYLRRPSLG (SEQ ID NO : 32),
RPPRRASLG (SEQ ID NO : 33), R{dY}{dL}RRASLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 34), R{dY}{dL}RRPSLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 35), RPPRKASLG (SEQ ID NO : 36), RPPRRPSLG (SEQ ID NO : 37), RPPRRPSI (SEQ ID NO : 38), PRRPTI (SEQ ID NO : 39) et RYLRRASLG (SEQ ID NO : 40).
Ladite protéine kinase de l'invention est capable de phosphoryler différents substrats peptidiques. Ces différents substrats peptidiques possèdent tous une séquence couverte par la séquence consensus SEQ ID NO : 1 et peuvent posséder un ou plusieurs acides aminés en N-ter ou C-ter de SEQ ID NO : 1. Ces peptides peuvent être utilisés seuls ou en combinaison (c-à-d. un mélange de plusieurs susbstrats peptidiques) pour mesurer l'activité de ladite protéine kinase.
Dans un mode de réalisation, les substrats peptides utilisables dans l'invention ont une taille de 5 à 20 acides aminés, en particulier de 5 à 15 acides aminés, plus particulièrement de 9 acides aminés.
Dans un mode de réalisation, les substrats peptides utilisables dans l'invention ont une taille de 5, 6, 7, 8, 9,10, 11,12, 13,14, 15,16, 17,18, 19 ou 20 acides aminés.
Les substrats peptidiques susceptibles d'être utilisés dans l'invention peuvent contenir un ou plusieurs acides non-naturels. De plus, les substrats peptidiques peuvent intégrer des modifications chimiques supplémentaires, comme par exemple un marquage avec un isotope radioactif ou une modification de la liaison peptidique.
Comme observé par les Inventeurs, la mesure de la phosphorylation de ces substrats permet de déterminer l'activité de ladite protéine kinase dans un échantillon biologique tel que le sang, le plasma ou le sérum, de préférence le sang.
L'activité de ladite protéine kinase dans le sérum (activité PKA ou PKA-like) est faible et très difficile à mesurer, ce qui nécessite des incubations prolongées avec des substrats ayant des propriétés cinétiques presque optimales vis-à-vis de la PKA pour détecter efficacement l'activité de phosphorylation. Bien que d'autres substrats non optimaux puissent être phosphorylés à des concentrations plus importantes de PKA avec une activation par l'AMPc, une activité faible de la PKA extracellulaire ne sera pas détectable à l'aide de ces peptides dans des conditions similaires. Ceci a notamment été observé en limitant la concentration d'une PKA recombinante (bien que toujours présente à une concentration 10 fois supérieure à celle dans le sérum), afin de déterminer le substrat optimal permettant de détecter un faible niveau d'activité kinase extracellulaire.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle la concentration de ladite protéine kinase est déterminée dans ledit échantillon biologique.
En particulier, la concentration de ladite protéine kinase dans le sang est détectée dans un échantillon biologique à l'aide d'un anticorps, ou d'un fragment d'anticorps, spécifique de ladite protéine kinase.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle ledit sujet présente au moins un symptôme appartenant au groupe comprenant : du sang dans les selles, des glaires dans les selles, des nausées et des vomissements, des crampes abdominales douloureuses, surtout dans le bas ventre, du sang dans les selles (voire une hémorragie en cas de poussée grave), une diarrhée chronique, des selles fréquentes, un besoin urgent de déféquer même s'il y a peu ou pas de selles à évacuer (ténesme rectal), une perte de poids en raison d'un appétit réduit et d'une mauvaise absorption des nutriments dans l'intestin, de la fatigue, souvent causée par l'anémie, de la fièvre, des douleurs aux articulations, un retard de croissance et/ou de puberté dans le cas d'un enfant.
La présente invention est de préférence utilisée pour diagnostiquer des MICI chez un patient présentant un ou plusieurs symptômes (distension abdominale, douleurs de l'intestin, diarrhées,...) susceptibles d'être attribués à tort à d'autres pathologies (comme par exemple, le syndrome du côlon irritable).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle ledit sujet est suspecté de souffrir du syndrome du côlon irritable.
La présente invention peut ainsi être utilisée pour établir un diagnostic différenciant les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin de la maladie du syndrome du côlon irritable.
Un second aspect de l'invention a pour objet une méthode de diagnostic et/ou de pronostic in vitro d'une maladie inflammatoire chez un sujet suspecté de présenter une maladie inflammatoire, comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape (ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée à l'étape (i) par rapport à une valeur de référence.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode de diagnostic et/ou de pronostic in vitro des lombalgies inflammatoires chroniques chez un sujet suspecté de présenter des lombalgies inflammatoires chroniques, comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape (ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée à l'étape (i) par rapport à une valeur de référence.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode de diagnostic et/ou de pronostic in vitro d'une maladie autoimmune chez un sujet suspecté de présenter une maladie autoimmune, comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape (ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée à l'étape (i) par rapport à une valeur de référence.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode de diagnostic et/ou de pronostic in vitro de l'arthrite chez un sujet suspecté de présenter de l'arthrite, comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape (ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée à l'étape (i) par rapport à une valeur de référence.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode de diagnostic et/ou de pronostic in vitro d'une maladie pulmonaire obstructive chronique chez un sujet suspecté de présenter une maladie pulmonaire obstructive chronique, comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape (ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée à l'étape (i) par rapport à une valeur de référence.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode de diagnostic et/ou de pronostic in vitro d'une maladie cœliaque chez un sujet suspecté de présenter une maladie cœliaque, comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape (ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée à l'étape (i) par rapport à une valeur de référence.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode de diagnostic et/ou de pronostic in vitro d'un diabète chez un sujet suspecté de présenter un diabète, comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape (ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée à l'étape (i) par rapport à une valeur de référence.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode de diagnostic et/ou de pronostic in vitro d'un cancer chez un sujet suspecté de présenter un cancer, comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape (ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée à l'étape (i) par rapport à une valeur de référence.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode de diagnostic et/ou de pronostic in vitro d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin chez un sujet suspecté de présenter une maladie inflammatoire chronique de l'intestin, comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape (ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée à l'étape (i) par rapport à une valeur de référence.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle ladite protéine kinase est la protéine kinase A ou une protéine PKA-like.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle ladite maladie inflammatoire chronique de l'intestin appartient au groupe suivant : la maladie de Crohn et/ou la colite ulcéreuse.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle ledit échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma ou de sérum.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle ledit échantillon biologique est un échantillon de sang.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée dans un échantillon de sang dudit sujet.
Dans un mode de réalisation, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée en incubant l'échantillon biologique en présence d'ATP et d'un substrat peptidique susceptible d'être phosphorylé par ladite protéine kinase pendant au moins 10 heures.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé choisi parmi R et K, de préférence R,
X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C, de préférence parmi L, F, Vetl.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus la séquence consensus R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2),
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da,
Xa et Xb sont des acides aminés naturels ou non naturels, de préférence choisis parmi P et un acide aminé en D-isomère.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence : R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1) ou R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2), où :
Xi est un acide aminé chargé positivement au pH physiologique, de préférence R ou K.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence : R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1) ou R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2), où :
X2 est P.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence : R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1) ou R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence : R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1) ou R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : L, F, V et I.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence : R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1) ou R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : Q, R, Μ, K, H et C.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en une séquence choisie parmi :
LRRASLG (SEQ ID NO : 4), PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), PRRASLG (SEQ ID NO : 7), PRRWSLG (SEQ ID NO : 8), PRRKSLG (SEQ ID NO : 9), PRRLSLG (SEQ ID NO : 10), PRRRSLG (SEQID NO : 11), PRRTSLG (SEQ ID NO : 12), PRRGSLG (SEQ ID NO : 13), PRRESLG (SEQ ID NO : 14), PRRSSLG (SEQ ID NO : 15), PRRYSLG (SEQ ID NO : 16), PRRHSLG (SEQ ID NO : 17), PRRVSLG (SEQ ID NO : 18), PRRNSLG (SEQ ID NO : 19), PRRCSLG (SEQ ID NO : 20), PRRQSLG (SEQ ID NO : 21), PRRDSLG (SEQ ID NO : 22), PRRASFG (SEQ ID NO : 23), PRRASVG (SEQ ID NO : 24), PRRASIG (SEQ ID NO : 25), PRRASMG (SEQ ID NO : 26), PRRASQG (SEQ ID NO : 27), PRRASNG (SEQ ID NO : 28), PRRASCG (SEQ ID NO : 29), RDLRRASLV (SEQ ID NO : 30), RYLRRATLV(SEQ ID NO : 31), RYLRRPSLG (SEQ ID NO : 32), RPPRRASLG (SEQ ID NO : 33), R{dY}{dL}RRASLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 34), R{dY}{dL}RRPSLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 35), RPPRKASLG (SEQ ID NO : 36), RPPRRPSLG (SEQ ID NO : 37), RPPRRPSI (SEQ ID NO : 38), PRRPTI (SEQ ID NO : 39) et RYLRRASLG (SEQ ID NO : 40).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle ladite valeur de référence est la moyenne de l'activité de ladite protéine kinase déterminée dans un échantillon de même nature que ledit échantillon biologique, pour un groupe de sujets sains.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle ladite valeur de référence est la moyenne de l'activité de ladite protéine kinase déterminée dans un échantillon de même nature que ledit échantillon biologique, pour un groupe de sujets présentant une maladie inflammatoire.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, comprenant en outre :
- une étape iii) de déduction de l'état du sujet.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité de ladite protéine kinase dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée à l'étape (i) par rapport à une valeur de référence,
- une étape iii) de déduction de l'état du sujet.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape iii), ledit sujet est susceptible de présenter une maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon biologique dudit sujet est inférieure par rapport à l'activité de ladite protéine kinase mesurée chez un individu sain dans les mêmes conditions.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape iii), ledit sujet est susceptible de présenter une maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon biologique dudit sujet est inférieure à 0,04 pmol/min/μΙ, en particulier inférieure à 0,02 pmol/min/μΙ.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape iii), ledit sujet est susceptible de présenter une maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon biologique dudit sujet est inférieure 0,04, 0,03, 0,02 ou 0,01 pmol/min/μΙ.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape iii), ledit sujet est susceptible de présenter une maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon biologique dudit sujet est au moins 2 fois inférieure, en particulier au moins 3 fois inférieure, plus particulièrement au moins 3,5 fois inférieure, par rapport à l'activité de ladite protéine kinase mesurée chez un individu sain dans les mêmes conditions.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle :
à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, à l'étape iii), ledit sujet est susceptible de présenter une maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon biologique dudit sujet est au moins 2 fois inférieure, en particulier au moins 3 fois inférieure, plus particulièrement au moins
3,5 fois inférieure, par rapport à l'activité de ladite protéine kinase mesurée chez un individu sain dans les mêmes conditions.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle :
à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé choisi parmi R ou K, de préférence R,
X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C, de préférence choisi parmi L, F, V et I, à l'étape iii), ledit sujet est susceptible de présenter une maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon biologique dudit sujet est au moins 2 fois inférieure, en particulier au moins 3 fois inférieure, plus particulièrement au moins
3,5 fois inférieure, par rapport à l'activité de ladite protéine kinase mesurée chez un individu sain dans les mêmes conditions.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle :
à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQID NO : 2),
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da,
Xa et Xb sont des acides aminés naturels ou non naturels, de préférence choisis parmi P et un acide aminé en D-isomère.
à l'étape iii), ledit sujet est susceptible de présenter une maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon biologique dudit sujet est au moins 2 fois inférieure, en particulier au moins 3 fois inférieure, plus particulièrement au moins
3,5 fois inférieure, par rapport à l'activité de ladite protéine kinase mesurée chez un individu sain dans les mêmes conditions.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle l'activité de ladite protéine kinase est déterminée dans un échantillon de sang dudit sujet à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en :
- la séquence LRRASLG (SEQ ID NO : 4), et dans laquelle, à l'étape iii), ledit sujet est susceptible de présenter une maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon de sang dudit sujet est au moins 2 fois inférieure, en particulier au moins 3 fois inférieure, plus particulièrement au moins 3,5 fois inférieure, par rapport à l'activité de ladite protéine kinase mesurée chez un individu sain dans les mêmes conditions.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle l'activité de ladite protéine kinase est déterminée dans un échantillon de sang dudit sujet à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en :
- la séquence PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), et dans laquelle, à l'étape iii), ledit sujet est susceptible de présenter une maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon de sang dudit sujet au moins 2 fois inférieure, en particulier au moins 3 fois inférieure, plus particulièrement au moins 3,5 fois inférieure, par rapport à l'activité de ladite protéine kinase mesurée chez un individu sain dans les mêmes conditions.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle l'activité de ladite protéine kinase est déterminée dans un échantillon de sang dudit sujet à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en :
- la séquence LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), et dans laquelle, à l'étape iii), ledit sujet est susceptible de présenter une maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon de sang dudit sujet au moins 2 fois inférieure, en particulier au moins 3 fois inférieure, plus particulièrement au moins 3,5 fois inférieure, par rapport à l'activité de ladite protéine kinase mesurée chez un individu sain dans les mêmes conditions.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle l'activité de ladite protéine kinase est déterminée dans un échantillon de sang dudit sujet à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en :
- la séquence LRRASLG (SEQ ID NO : 4), et dans laquelle, à l'étape iii), ledit sujet est susceptible de présenter une maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon biologique dudit sujet est inférieure à 0,04 pmol/min/μΙ, en particulier inférieure à 0,02 pmol/min/pl.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle l'activité de ladite protéine kinase est déterminée dans un échantillon de sang dudit sujet à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en :
- la séquence PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), et dans laquelle, à l'étape iii), ledit sujet est susceptible de présenter une maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon biologique dudit sujet est inférieure à 0,04 pmol/min/μΙ, en particulier inférieure à 0,02 pmol/min/μΙ.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de pronostic telle que définie précédemment, dans laquelle l'activité de ladite protéine kinase est déterminée dans un échantillon de sang dudit sujet à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en :
- la séquence LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), et dans laquelle, à l'étape iii), ledit sujet est susceptible de présenter une maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon biologique dudit sujet est inférieure à 0,04 pmol/min/μΙ, en particulier inférieure à 0,02 pmol/min/pl.
L'activité de ladite protéine kinase peut être mesurée par le biais de la quantité de susbtrat phosphorylé.
Une augmentation de la quantité de substrat phosphorylé indique une augmentation de l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon.
Une diminution de la quantité de substrat phosphorylé indique une diminution de l'activité de ladite protéine kinase dans l'échantillon.
Un troisième aspect de l'invention a pour objet une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire chez un sujet comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée dans ledit échantillon biologique prélevé à différentes dates.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement des lombalgies inflammatoires chroniques chez un sujet comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée dans ledit échantillon biologique prélevé à différentes dates.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie autoimmune chez un sujet comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée dans ledit échantillon biologique prélevé à différentes dates.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement de l'arthrite chez un sujet comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée dans ledit échantillon biologique prélevé à différentes dates.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie pulmonaire obstructive chronique chez un sujet comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée dans ledit échantillon biologique prélevé à différentes dates.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie cœliaque chez un sujet comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée dans ledit échantillon biologique prélevé à différentes dates.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement du diabète chez un sujet comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée dans ledit échantillon biologique prélevé à différentes dates.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'un cancer chez un sujet comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée dans ledit échantillon biologique prélevé à différentes dates.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin chez un sujet comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée dans ledit échantillon biologique prélevé à différentes dates.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin telle que définie précédemment, dans laquelle ladite maladie inflammatoire chronique de l'intestin est choisie parmi : la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire telle que définie précédemment, dans laquelle ledit échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma ou de sérum.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire telle que définie précédemment, dans laquelle à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée dans un échantillon de sang dudit sujet.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé choisi parmi R ou K, de préférence R,
X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C, de préférence choisi parmi L, F, V et I.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2),
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da,
Xa et Xb sont des acides aminés naturels ou non naturels, de préférence choisis parmi P et un acide aminé en D-isomère.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en une séquence choisie parmi :
LRRASLG (SEQ ID NO : 4), PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), PRRASLG (SEQ ID NO : 7), PRRWSLG (SEQ ID NO : 8), PRRKSLG (SEQ ID NO : 9), PRRLSLG (SEQ ID NO : 10), PRRRSLG (SEQID NO : 11), PRRTSLG (SEQ ID NO : 12), PRRGSLG (SEQ ID NO : 13), PRRESLG (SEQ ID NO : 14), PRRSSLG (SEQ ID NO : 15), PRRYSLG (SEQ ID NO : 16), PRRHSLG (SEQ ID NO : 17), PRRVSLG (SEQ ID NO : 18), PRRNSLG (SEQ ID NO : 19), PRRCSLG (SEQ ID NO : 20), PRRQSLG (SEQ ID NO : 21), PRRDSLG (SEQ ID NO : 22), PRRASFG (SEQ ID NO : 23), PRRASVG (SEQ ID NO : 24), PRRASIG (SEQ ID NO : 25), PRRASMG (SEQ ID NO : 26), PRRASQG (SEQ ID NO : 27), PRRASNG (SEQ ID NO : 28), PRRASCG (SEQ ID NO : 29), RDLRRASLV (SEQ ID NO : 30), RYLRRATLV(SEQ ID NO : 31), RYLRRPSLG (SEQ ID NO : 32), RPPRRASLG (SEQ ID NO : 33), R{dY}{dL}RRASLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 34), R{dY}{dL}RRPSLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 35), RPPRKASLG (SEQ ID NO : 36), RPPRRPSLG (SEQ ID NO : 37), RPPRRPSI (SEQ ID NO : 38), PRRPTI (SEQ ID NO : 39) et RYLRRASLG (SEQ ID NO : 40).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape ii), ledit échantillon biologique est prélevé avant et après administration dudit traitement audit sujet.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire telle que définie précédemment, comprenant en outre :
- une étape iii) de déduction de l'efficacité dudit traitement d'une maladie inflammatoire, où :
le traitement est efficace, si l'activité de ladite protéine kinase augmente au cours du temps, et le traitement n'est pas efficace, si l'activité de ladite protéine kinase stagne ou diminue au cours du temps.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire telle que définie précédemment, comprenant :
- une étape i) de détermination de l'activité de ladite protéine kinase dans un échantillon biologique dudit sujet,
- une étape ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée dans ledit échantillon biologique :
- prélevé à différentes dates après administration dudit traitement audit sujet, ou
- prélevé avant et après administration dudit traitement audit sujet,
- une étape iii) de déduction de l'efficacité dudit traitement d'une maladie inflammatoire.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape iii), ledit traitement présente un effet thérapeutique contre ladite maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase a augmenté après l'administration dudit traitement audit sujet.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape iii), ledit traitement présente un effet thérapeutique contre ladite maladie inflammatoire si l'activité de ladite protéine kinase a augmenté d'au moins 2 fois, en particulier d'au moins 3 fois, plus particulièrement d'au moins 3,5 fois, après l'administration dudit traitement audit sujet par rapport à l'activité de la protéine kinase A chez ledit sujet avant l'administration dudit traitement.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire telle que définie précédemment, dans laquelle la concentration de ladite protéine kinase est déterminée dans ledit échantillon biologique.
Un quatrième aspect de l'invention a pour objet une méthode de dosage de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique, comprenant :
- une étape i) d'incubation dudit échantillon, ou de la protéine kinase issue dudit échantillon, en présence d'un substrat peptidique susceptible d'être phosphorylé par ladite protéine kinase pendant au moins 10 heures, de préférence pendant au moins 18 heures.
Cette invention repose sur l'observation surprenante faite par les Inventeurs qu'il est possible de mesurer une activité PKA ou PKA-like dans un échantillon biologique tel que le sang alors que ce type de kinase est normalement une enzyme intracellulaire.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de dosage telle que définie précédemment, dans laquelle ladite ladite protéine kinase étant choisie parmi la protéine kinase A et une protéine PKA-like.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de dosage telle que définie précédemment, comprenant :
- une étape i) d'incubation dudit échantillon, ou de ladite protéine kinase issue dudit échantillon, en présence d'ATP et d'un substrat peptidique susceptible d'être phosphorylé par ladite protéine kinase pendant au moins 10 heures, de préférence au moins 18 heures.
La détection de l'activité PKA dans un échantillon de sang est difficile. Cependant, les
Inventeurs ont observé qu'une incubation prolongée de l'échantillon avec le substrat permet de révéler une activité enzymatique, même faible.
Dans un mode de réalisation particulier, l'échantillon ou la protéine kinase est incubée en présence d'ATP et d'un substrat pendant au moins 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 heures.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de dosage telle que définie précédemment, dans laquelle ledit échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma ou de sérum.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de dosage telle que définie précédemment, dans laquelle ledit substrat peptidique comprend ou consiste en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de dosage telle que définie précédemment, dans laquelle ledit substrat peptidique comprend ou consiste en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé choisi parmi R ou K, de préférence R,
X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C, de préférence choisi parmi L, F, V et I.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de dosage telle que définie précédemment, dans laquelle ledit substrat peptidique comprend ou consiste en la séquence consensus R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2),
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da,
Xa et Xb sont des acides aminés naturels ou non naturels, de préférence choisis parmi P et un acide aminé en D-isomère.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de dosage telle que définie précédemment, dans laquelle ledit substrat peptidique comprend ou consiste en une séquence choisie parmi :
LRRASLG (SEQ ID NO : 4), PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), PRRASLG (SEQ ID NO : 7), PRRWSLG (SEQ ID NO : 8), PRRKSLG (SEQ ID NO : 9), PRRLSLG (SEQ ID NO : 10), PRRRSLG (SEQID NO : 11), PRRTSLG (SEQ ID NO : 12), PRRGSLG (SEQ ID NO : 13), PRRESLG (SEQ ID NO : 14), PRRSSLG (SEQ ID NO : 15), PRRYSLG (SEQ ID NO : 16), PRRHSLG (SEQ ID NO : 17), PRRVSLG (SEQ ID NO : 18), PRRNSLG (SEQ ID NO : 19), PRRCSLG (SEQ ID NO : 20), PRRQSLG (SEQ ID NO : 21), PRRDSLG (SEQ ID NO : 22), PRRASFG (SEQ ID NO : 23), PRRASVG (SEQ ID NO : 24), PRRASIG (SEQ ID NO : 25), PRRASMG (SEQ ID NO : 26), PRRASQG (SEQ ID NO : 27), PRRASNG (SEQ ID NO : 28), PRRASCG (SEQ ID NO : 29), RDLRRASLV (SEQ ID NO : 30), RYLRRATLV(SEQ ID NO : 31), RYLRRPSLG (SEQ ID NO : 32), RPPRRASLG (SEQ ID NO : 33), R{dY}{dL}RRASLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 34), R{dY}{dL}RRPSLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 35), RPPRKASLG (SEQ ID NO : 36), RPPRRPSLG (SEQ ID NO : 37), RPPRRPSI (SEQ ID NO : 38), PRRPTI (SEQ ID NO : 39) et RYLRRASLG (SEQ ID NO : 40).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de dosage telle que définie précédemment, dans laquelle, à l'étape i), ledit échantillon, ou la protéine kinase A issue dudit échantillon, est incubé en présence d'un substrat peptidique susceptible d'être phosphorylé par ladite protéine kinase et en présence d'au moins un inhibiteur de protéase, ledit au moins un inhibiteur de protéase étant de préférence choisi parmi le groupe comprenant: la 1,10-Phénanthroline, l'AEBSF (4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride), l'aprotinine, la bestatine, ΙΈ-64, la leupeptine, la pepstatine A, l'EDTA, l'antipaïne dihydrochloride, la chymostatine, le phosphoramidon, le Pefabloc® SC, l'acide ε-aminocaproïque, le N-Ethylmaléimide, un inhibiteur de trypsine et l'antitrypsine alpha.
De préférence, ledit au moins un inhibiteur de protéase est la 1,10-Phénanthroline et/ou l'AEBSF (4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride).
De manière surprenante, les Inventeurs ont constaté que certains peptides sont suffisamment stables et peuvent être utilisés pour doser l'activité de la protéine kinase dans le sérum sans ajout ou avec une quantité réduite d'inhibiteur de protéase.
Par exemple, les peptides suivants peuvent être utilisés pour doser l'activité PKA ou PKAlike dans un échantillon de sérum, sans ajout ou avec peu d'inhibiteur de protéase : LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), R{dY}{dL}RRASLG (SEQ ID NO : 34) et R{dY}{dL}RRPSLG (SEQ ID NO : 35).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de dosage telle que définie précédemment, comprenant, préalablement à l'étape i) :
- une étape de purification ou de concentration de la protéine kinase présente dans ledit d'échantillon, de préférence à l'aide d'au moins un anticorps reconnaissant la protéine kinase.
L'utilisation d'un anticorps spécifique anti-kinase, éventuellement couplé à une bille ou à une molécule permettant sa purification, permet d'isoler les enzymes d'intérêt de l'échantillon afin de faciliter les tests d'activité (technique dite du pull-down).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de dosage telle que définie précédemment, comprenant en outre :
- une étape ii) de détermination de l'activité de la protéine kinase dans ledit échantillon.
Un autre aspect de l'invention a pour objet un kit de dosage de l'activité d'une protéine kinase, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par ladite protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XiX2-S/T-X3 (SEQ. ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de dosage de l'activité d'une protéine kinase, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par ladite protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé choisi parmi R ou K, de préférence R,
X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C, de préférence choisi parmi L, F, V et I.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de dosage de l'activité d'une protéine kinase, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par ladite protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2),
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da,
Xa et Xb sont des acides aminés naturels ou non naturels, de préférence choisis parmi P et un acide aminé en D-isomère.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de dosage de l'activité d'une protéine kinase, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par ladite protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus
R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé chargé positivement au pH physiologique, de préférence R ou K.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de dosage de l'activité d'une protéine kinase, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par ladite protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
X2 est P.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de dosage de l'activité d'une protéine kinase, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par ladite protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de dosage de l'activité d'une protéine kinase, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par ladite protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : L, F, V et I.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de dosage de l'activité d'une protéine kinase, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par ladite protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : Q, R, Μ, K, H et C.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de dosage tel que défini précédemment, dans laquelle ledit substrat peptidique comprend ou consiste en une séquence choisie parmi :
LRRASLG (SEQ ID NO : 4), PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), PRRASLG (SEQ ID NO : 7), PRRWSLG (SEQ ID NO : 8), PRRKSLG (SEQ ID NO : 9), PRRLSLG (SEQ ID NO : 10), PRRRSLG (SEQID NO : 11), PRRTSLG (SEQ ID NO : 12), PRRGSLG (SEQ ID NO : 13), PRRESLG (SEQ ID NO : 14), PRRSSLG (SEQ ID NO : 15), PRRYSLG (SEQ ID NO : 16), PRRHSLG (SEQ ID NO : 17), PRRVSLG (SEQ ID NO : 18), PRRNSLG (SEQ ID NO : 19), PRRCSLG (SEQ ID NO : 20), PRRQSLG (SEQ ID NO : 21), PRRDSLG (SEQ ID NO : 22), PRRASFG (SEQ ID NO : 23), PRRASVG (SEQ ID NO : 24), PRRASIG (SEQ ID NO : 25), PRRASMG (SEQ ID NO : 26), PRRASQG (SEQ ID NO : 27), PRRASNG (SEQ ID NO : 28), PRRASCG (SEQ ID NO : 29), RDLRRASLV (SEQ ID NO : 30), RYLRRATLV(SEQ ID NO : 31), RYLRRPSLG (SEQ ID NO : 32), RPPRRASLG (SEQ ID NO : 33), R{dY}{dL}RRASLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 34), R{dY}{dL}RRPSLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 35), RPPRKASLG (SEQ ID NO : 36), RPPRRPSLG (SEQ ID NO : 37), RPPRRPSI (SEQ ID NO : 38), PRRPTI (SEQ ID NO : 39) et RYLRRASLG (SEQ ID NO : 40).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une kit de dosage tel que défini précédemment, dans lequel ledit substrat peptidique est différent de SEQ ID NO : 4.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de dosage tel que défini précédemment, ladite protéine kinase étant choisie parmi :
- la protéine kinase A (PKA), et
- les protéines kinases (PKA-like) capables de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où : Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel ou non naturel de caractère hydrophobe.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de dosage tel que défini précédemment, ledit kit comprenant également de ΓΑΤΡ.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de dosage tel que défini précédemment, ledit kit comprenant également au moins un inhibiteur de protéase, de préférence choisi parmi le groupe comprenant: la 1,10-Phénanthroline, l'AEBSF (4-(2Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride), l'aprotinine, la bestatine, ΓΕ-64, la leupeptine, la pepstatine A, l'EDTA, l'antipaïne dihydrochloride, la chymostatine, le phosphoramidon, le Pefabloc® SC, l'acide ε-aminocaproïque, le N-Ethylmaléimide, un inhibiteur de trypsine et l'antitrypsine alpha.
Un autre aspect de l'invention a pour objet un kit de diagnostic d'une maladie inflammatoire, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XiX2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet un kit de diagnostic des lombalgies inflammatoires chroniques, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet un kit de diagnostic d'une maladie autoimmune, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XiX2-S/T-X3 (SEQID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet un kit de diagnostic de l'arthrite, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ. ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet un kit de diagnostic d'une maladie pulmonaire obstructive chronique, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet un kit de diagnostic d'une maladie cœliaque, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XxX2-S/T-X3 (SEQID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet un kit de diagnostic du diabète, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ. ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet un kit de diagnostic d'un cancer, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet un kit de diagnostic d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de diagnostic d'une maladie inflammatoire, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XiX2-S/T-X3 (SEQID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé choisi parmi R ou K, de préférence R,
X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C, de préférence choisi parmi L, F, V et I.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de diagnostic d'une maladie inflammatoire, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XaXb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2),
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da,
Xa et Xb sont des acides aminés naturels ou non naturels, de préférence choisis parmi P et un acide aminé en D-isomère.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de diagnostic d'une maladie inflammatoire, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XxX2-S/T-X3 (SEQID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé chargé positivement au pH physiologique, de préférence R ou K.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de diagnostic d'une maladie inflammatoire, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XxX2-S/T-X3 (SEQID NO : 1), où :
X2 est P.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de diagnostic d'une maladie inflammatoire, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XiX2-S/T-X3 (SEQID NO : 1), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de diagnostic d'une maladie inflammatoire, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XiX2-S/T-X3 (SEQID NO : 1), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : L, F, V et I.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de diagnostic d'une maladie inflammatoire, comprenant au moins un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XiX2-S/T-X3 (SEQID NO : 1), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : Q, R, Μ, K, H et C.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de diagnostic tel que défini précédemment, dans lequel ledit substrat peptidique comprend ou consiste en une séquence choisie parmi :
LRRASLG (SEQ ID NO : 4), PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), PRRASLG (SEQ ID NO : 7), PRRWSLG (SEQ ID NO : 8), PRRKSLG (SEQ ID NO : 9), PRRLSLG (SEQ ID NO : 10), PRRRSLG (SEQID NO : 11), PRRTSLG (SEQ ID NO : 12), PRRGSLG (SEQ ID NO : 13), PRRESLG (SEQ ID NO : 14), PRRSSLG (SEQ ID NO : 15), PRRYSLG (SEQ ID NO : 16), PRRHSLG (SEQ ID NO : 17), PRRVSLG (SEQ ID NO : 18), PRRNSLG (SEQ ID NO : 19), PRRCSLG (SEQ ID NO : 20), PRRQSLG (SEQ ID NO : 21), PRRDSLG (SEQ ID NO : 22), PRRASFG (SEQ ID NO : 23), PRRASVG (SEQ ID NO : 24), PRRASIG (SEQ ID NO : 25), PRRASMG (SEQ ID NO : 26), PRRASQG (SEQ ID NO : 27), PRRASNG (SEQ ID NO : 28), PRRASCG (SEQ ID NO : 29), RDLRRASLV (SEQ ID NO : 30), RYLRRATLV(SEQ ID NO : 31), RYLRRPSLG (SEQ ID NO : 32), RPPRRASLG (SEQ ID NO : 33), R{dY}{dL}RRASLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 34), R{dY}{dL}RRPSLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 35), RPPRKASLG (SEQ ID NO : 36), RPPRRPSLG (SEQ ID NO : 37), RPPRRPSI (SEQ ID NO : 38), PRRPTI (SEQ ID NO : 39) et RYLRRASLG (SEQ ID NO : 40).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de diagnostic tel que défini précédemment, ladite protéine kinase étant choisie parmi :
- la protéine kinase A (PKA), et
- les protéines kinases (PKA-like) capables de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de diagnostic tel que défini précédemment, dans lequel ledit substrat peptidique est différent de SEQ ID NO : 4.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de diagnostic tel que défini précédemment, ledit kit comprenant également de ΓΑΤΡ.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un kit de diagnostic tel que défini précédemment, ledit kit comprenant également au moins un inhibiteur de protéase, de préférence choisi parmi le groupe comprenant: la 1,10-Phénanthroline, l'AEBSF (4-(2Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride), l'aprotinine, la bestatine, ΓΕ-64, la leupeptine, la pepstatine A, l'EDTA, l'antipaïne dihydrochloride, la chymostatine, le phosphoramidon, le Pefabloc® SC, l'acide ε-aminocaproïque, le N-Ethylmaléimide, un inhibiteur de trypsine et l'antitrypsine alpha.
Un autre aspect de l'invention a pour objet l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, pour le diagnostic in vitro d'une maladie inflammatoire à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, pour le diagnostic in vitro des lombalgies inflammatoires chroniques à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, pour le diagnostic in vitro d'une maladie autoimmune à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, pour le diagnostic in vitro de l'arthrite à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, pour le diagnostic in vitro d'une maladie pulmonaire obstructive chronique à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, pour le diagnostic in vitro d'une maladie coeliaque à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, pour le diagnostic in vitro d'un diabète à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, pour le diagnostic in vitro d'un cancer à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, pour le diagnostic in vitro des M ICI à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé choisi parmi R ou K, de préférence R,
X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C, de préférence choisi parmi L, F, V et I, pour le diagnostic in vitro d'une maladie inflammatoire à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2),
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da,
Xa et Xb sont des acides aminés naturels ou non naturels, de préférence choisis parmi P et un acide aminé en D-isomère, pour le diagnostic in vitro d'une maladie inflammatoire à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé chargé positivement au pH physiologique, de préférence R ou K, pour le diagnostic in vitro d'une maladie inflammatoire à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
X2 est P, pour le diagnostic in vitro d'une maladie inflammatoire à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C, pour le diagnostic in vitro d'une maladie inflammatoire à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : L, F, V et I, pour le diagnostic in vitro d'une maladie inflammatoire à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
X3 est un acide aminé choisi parmi : Q, R, Μ, K, H et C, pour le diagnostic in vitro d'une maladie inflammatoire à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en une séquence peptidique choisie parmi :
LRRASLG (SEQ ID NO : 4), PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), PRRASLG (SEQ ID NO : 7), PRRWSLG (SEQ ID NO : 8), PRRKSLG (SEQ ID NO : 9), PRRLSLG (SEQ ID NO : 10), PRRRSLG (SEQ ID NO : 11), PRRTSLG (SEQ ID NO : 12), PRRGSLG (SEQ ID NO : 13), PRRESLG (SEQ ID NO : 14), PRRSSLG (SEQ ID NO : 15), PRRYSLG (SEQ ID NO : 16), PRRHSLG (SEQ ID NO : 17), PRRVSLG (SEQ ID NO : 18), PRRNSLG (SEQ ID NO : 19), PRRCSLG (SEQ ID NO : 20), PRRQSLG (SEQ ID NO : 21), PRRDSLG (SEQ ID NO : 22), PRRASFG (SEQ ID NO : 23), PRRASVG (SEQ ID NO : 24), PRRASIG (SEQ ID NO : 25), PRRASMG (SEQ ID NO : 26), PRRASQG (SEQ ID NO : 27), PRRASNG (SEQ ID NO : 28), PRRASCG (SEQ ID NO : 29), RDLRRASLV (SEQ ID NO : 30), RYLRRATLV(SEQ ID NO : 31), RYLRRPSLG (SEQ ID NO : 32), RPPRRASLG (SEQ ID NO : 33), R{dY}{dL}RRASLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 34), R{dY}{dL}RRPSLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 35), RPPRKASLG (SEQ ID NO : 36), RPPRRPSLG (SEQ ID NO : 37), RPPRRPSI (SEQ ID NO : 38), PRRPTI (SEQ ID NO : 39) et RYLRRASLG (SEQ ID NO : 40), pour le diagnostic in vitro d'une maladie inflammatoire à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
Un autre aspect de l'invention a pour objet un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou d'un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est choisi parmi R ou K, de préférence R,
X2 est choisi parmi P et A,
X3 est choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da,
Xa et Xb sont des acides aminés naturels ou non naturels, de préférence choisis parmi P et un acide aminé en D-isomère.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un peptide comprenant ou consistant en une séquence peptidique choisie parmi :
PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), PRRASLG (SEQ ID NO : 7), PRRWSLG (SEQ ID NO : 8), PRRKSLG (SEQ ID NO : 9), PRRLSLG (SEQ ID NO : 10), PRRRSLG (SEQ ID NO : 11), PRRTSLG (SEQ ID NO : 12), PRRGSLG (SEQ ID NO : 13), PRRESLG (SEQ ID NO : 14), PRRSSLG (SEQ ID NO : 15), PRRYSLG (SEQ ID NO : 16), PRRHSLG (SEQ ID NO : 17), PRRVSLG (SEQ ID NO : 18), PRRNSLG (SEQ ID NO : 19), PRRCSLG (SEQ ID NO : 20),
PRRQSLG (SEQ ID NO : 21), PRRDSLG (SEQ ID NO : 22), PRRASFG (SEQ ID NO : 23),
PRRASVG (SEQ ID NO : 24), PRRASIG (SEQ ID NO : 25), PRRASMG (SEQ ID NO : 26),
PRRASQG (SEQ ID NO : 27), PRRASNG (SEQ ID NO : 28), PRRASCG (SEQ ID NO : 29),
RDLRRASLV (SEQ ID NO : 30), RYLRRATLV(SEQ ID NO : 31), RYLRRPSLG (SEQ ID NO : 32), RPPRRASLG (SEQ ID NO : 33), R{dY}{dL}RRASLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 34), R{dY}{dL}RRPSLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 35), RPPRKASLG (SEQ ID NO : 36), RPPRRPSLG (SEQ ID NO : 37), RPPRRPSI (SEQ ID NO : 38), PRRPTI (SEQ ID NO : 39) et RYLRRASLG (SEQ ID NO : 40).
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un peptide tel que défini ci-dessus, ledit peptide étant différent de SEQ ID NO : 4.
Les peptides de l'invention peuvent être produits selon les différentes techniques connues de l'homme du métier, comme par exemple par l'expression dans une cellule eucaryote ou procaryote, ou par synthèse.
Un autre aspect de l'invention a pour objet l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, en tant que substrat d'une protéine kinase, en particulier en tant que substrat de la protéine kinase A et/ou d'une protéine kinase A-like.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
Xi est choisi parmi R ou K, de préférence R,
X2 est choisi parmi P et A,
X3 est choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C, de préférence choisi parmi L, F, V et I, en tant que substrat d'une protéine kinase, en particulier en tant que substrat de la protéine kinase A et/ou d'une protéine kinase A-like.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xa-Xb-R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 2), où :
Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da,
Xa et Xb sont des acides aminés naturels ou non naturels, de préférence choisis parmi P et un acide aminé en D-isomère, en tant que substrat d'une protéine kinase, en particulier en tant que substrat de la protéine kinase A et/ou d'une protéine kinase A-like.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en une séquence peptidique choisie parmi :
PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), PRRASLG (SEQ ID NO : 7), PRRWSLG 5 (SEQ ID NO : 8), PRRKSLG (SEQ ID NO : 9), PRRLSLG (SEQ ID NO : 10), PRRRSLG (SEQ ID
NO : 11), PRRTSLG (SEQ ID NO : 12), PRRGSLG (SEQ ID NO : 13), PRRESLG (SEQ ID NO : 14), PRRSSLG (SEQ ID NO : 15), PRRYSLG (SEQ ID NO : 16), PRRHSLG (SEQ ID NO : 17), PRRVSLG (SEQ ID NO : 18), PRRNSLG (SEQ ID NO : 19), PRRCSLG (SEQ ID NO : 20),
PRRQSLG (SEQ ID NO : 21), PRRDSLG (SEQ ID NO : 22), PRRASFG (SEQ ID NO : 23),
PRRASVG (SEQ ID NO : 24), PRRASIG (SEQ ID NO : 25), PRRASMG (SEQ ID NO : 26),
PRRASQG (SEQ ID NO : 27), PRRASNG (SEQ ID NO : 28), PRRASCG (SEQ ID NO : 29),
RDLRRASLV (SEQ ID NO : 30), RYLRRATLV(SEQ ID NO : 31), RYLRRPSLG (SEQ ID NO : 32), RPPRRASLG (SEQ ID NO : 33), R{dY}{dL}RRASLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 34), R{dY}{dL}RRPSLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 35), RPPRKASLG (SEQ ID NO : 36), RPPRRPSLG (SEQ ID NO : 37), RPPRRPSI (SEQ ID NO : 38), PRRPTI (SEQ ID NO : 39) et RYLRRASLG (SEQ ID NO : 40), en tant que substrat d'une protéine kinase, en particulier en tant que substrat de la protéine kinase A et/ou d'une protéine kinase A-like.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un peptide tel que définie ci-dessus, ledit peptide étant différent de SEQ ID NO : 4.
Les figures et les exemples suivants illustreront mieux l'invention, sans pour autant en limiter sa portée.
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1. Courbe standard du test de mesure de l'activité kinase.
L'axe des abscisses indique la quantité de kinase recombinante (en ng) et l'axe des ordonnées indique la quantité de peptide substrat (SEQ ID NO : 5) phosphorylé (en pmol/min).
Les résultats ont été obtenus avec une enzyme recombinante. A partir de ces données, il est possible de déterminer l'activité kinase spécifique dans un échantillon vis-à-vis du peptide substrat. Dans les conditions testées (37°C), l'activité est de 3,5 ± 0,12 pmol/min/ng (R2 = 0,99).
Figure 2. Analyse de la cohorte italienne avec le test d'activité : patients souffrant de
MICI (Maladie de Crohn (MC) et Colite ulcéreuse (CU)) versus individus sains.
Les résultats du test d'activité pour chaque population sont présentés sous la forme d'un diagramme de dispersion (médiane et intervalle interquartile). Le peptide substrat est SEQID NO : 5.
Figure 3. Analyse ROC de la cohorte italienne : patients souffrant de MICI versus individus sains.
La courbe a été obtenue à partir des résultats présentés dans la figure 2. L'axe des abscisses indique la spécificité (en %) et l'axe des ordonnées indique la sensibilité (en %).
Figure 4. Analyse ROC de la cohorte américaine : patients souffrant de MICI (Maladie de
Crohn (MC et CU) versus individus sains.
L'axe des abscisses indique la spécificité (en %) et l'axe des ordonnées indique la sensibilité (en %). Le peptide substrat est SEQ ID NO : 5.
Figure 5. Concentrations sériques en enzyme active (activité spécifique mesurée avec le test Act2) pour les patients souffrant de MICI (MC et CU, MICI) et les individus sains (Témoin) de la cohorte italienne (CM1) et de la cohorte américaine (CM2).
L'axe des ordonnées indique la concentration en enzyme active (ng.ml1).
Figure 6. Distribution des fréquences relatives observées pour le test Act2 dans la cohorte italienne (A) et la cohorte américaine (B).
L'axe des abscisess indique la quantité de produit Act2 phosphorylé (en %) et l'axe des ordonnées indique la fréquence relative (en % de la valeur totale de produit Act2 phosphorylé). La courbe grise (inverse Gaussienne) correspond aux patients souffrant de M ICI (MC ou CU). La courbe noire correspond aux individus sains (Gaussienne).
Figure 7. Evaluation de la sensibilité du test d'activité PKA par comparaison avec d'autres tests sérologiques.
L'axe des ordonnées indique la quantité relative de protéine mésurée avec chacun des tests sérologiques.
Abréviations : Hs CRP (High sensibility C-reactive protein); PSA (Prostate Spécifie Antigen); CK (Créatine Kinase).
Figure 8. Activité relative d'une PKA recombinante en fonction de substrats peptidiques
VDPRRASX3G (SEQ ID NO : 41) portant un acide aminé différent en position X3.
L'activité (en % de substrat phosphorylé) est indiquée en fonction de la masse moléculaire (en Da) de l'acide aminé en position X3. Les cercles représentent des acides aminés hydrophobes ou non polaires et les carrés représentent des acides aminés polaires ou chargés positivement. Chaque groupe est distribué selon une courbe de Gauss produisant une activité maximale à 145,1 ± 23,4 Da (R2 = 0.92) pour les acides aminés hydrophobes ou non polaires et 149,2 ± 19.31 Da (R2 = 0.93) pour les acides aminés polaires ou chargés positivement.
Figure 9 : Activité carboxypeptidase N/B dans les sérums des patients souffrant d'IBD et les sérums d'individus sains.
Les sérums ont été incubés avec le peptide substrat Actll (SEQ ID NO : 62) pour détecter l'activité carboxypeptidase N/B aboutissant à la suppression de l'arginine en C-terminal. (A) L'activité carboxypeptidase est représentée en % de produit (% de substrat décarboxylé) en indiquant la moyenne ± la déviation standard pour les individus sains (48,0 ± 9,0; η = 379) et les patients souffrant d'IBD (47,0 ± 8,9; n = 367). Le test statistique non apparié de Mann Whitney indique que les deux populations ne sont pas significativement différentes (P = 0,1). (B) L'analyse ROC des données présentées en (A) indique que les deux populations ont une distribution similaire concernant l'activité carboxypeptidase (ROC AUC = 0,53 ± 0,02; P = 0,1).
Figure 10 : Activité kinase dans les sérums de patients souffrant de lombalgies inflammatoires chroniques (avec cLBP, chronic Low back Pain) et d'individus sains (sans cLBP).
(i) L'activité kinase est représentée en % de produit formé (% substrat phosphorylé) pour chaque échantillon testé et la moyenne ± la déviation standard est donnée pour les individus sains (56.6 ± 20,2; n = 407) et pour les patients souffrant de lombalgies inflammatoires chroniques (44.8 ± 16,0; n = 450). Le test statistique non apparié de Mann Whitney indique que les deux populations sont significativement différentes (P < 0.0001).
(ii) L'analyse de la distribution des fréquences montre des distributions différentes pour les deux types de populations concernant les valeurs d'activité kinase, (iii) L'analyse ROC des données présentées en (i) indique que les deux populations ont une distribution différente (ROC AUC = 0,7 ± 0,1; P < 0,0001).
Figure 11 : Activité carboxypeptidase dans les sérums de patients souffrant de lombalgies inflammatoires chroniques (avec cLBP, chronic Low Back Pain) et d'individus sains (sans cLBP).
(i) L'activité carboxypeptidase est représentée en % de produit formé (% substrat décarboxylé) pour chaque échantillon testé et la moyenne ± la déviation standard est donnée pour les individus sains (57,4 ± 9.6; n = 407) et pour les patients souffrant de lombalgies inflammatoires chroniques (58,5 ± 8,9; n = 450). Le test statistique non apparié de Mann Whitney indique que les deux populations ne sont pas significativement différentes (P < 0,12). (ii) L'analyse de la distribution des fréquences montre des distributions similaires pour les deux types de populations concernant les valeurs d'activité carboxypeptidase, (iii) L'analyse ROC des données présentées en (i) indique que les deux populations ont une distribution similaire (ROC AUC = 0,53 ± 0,02; P = 0,1).
EXEMPLES
I - Mise au point d'un test de mesure de l'activité PKA dans le sérum
Une courbe standard a été obtenue en mesurant l'activité de phosphorylation d'une enzyme PKA recombinante avec le peptide SEQ ID NO : 5, dans les mêmes conditions que celles des échantillons de sérum (Figure 1). La courbe standard obtenue permet d'obtenir une estimation de la quantité d'enzyme active dans un échantillon de sérum.
II - Analyse rétrospective de la cohorte italienne
Les échantillons de sérum de la cohorte italienne (Matériels et Méthodes) ont été analysés à l'aide du test de mesure de l'activité PKA avec le peptide SEQ ID NO : 5 (Figure 2).
Chez les individus contrôles sains (n = 474), la quantité de produit phosphorylé est de 0,06 ± 0,02 pmol/min/μΙ, tandis que chez les patients souffrant de MICI (maladie de Crohn (MC) et colite ulcéreuse (CU)) (n = 1036), la quantité de produit phosphorylé est de 0,017 ± 0,012 pmol/min/μΙ.
A l'aide de la courbe standard décrite ci-dessus, la quantité d'enzyme active a été déterminée dans les échantillons de sérum. Chez les individus sains, la quantité d'enzyme active dans le sérum est de 17,1 ± 5,7 ng/ml, tandis que chez les patients souffrant de MICI, la quantité d'enzyme active dans le sérum est de 4,8 ± 4,2 ng/ml.
Ainsi, dans le sérum des patients souffrant de MICI, la quantité d'enzyme active vis-à-vis du substrat peptidique est réduite de 3,4 fois par rapport à celle des individus sains.
L'analyse de la courbe ROC (Courbe de la fonction d'efficacité du récepteur, Receiver Operator Characteristic) des patients souffrant de MICI par rapport aux individus sains présente une aire sous la courbe (ASC ou AUC, Area Under the Curve) de 93%, ce qui équivaut à une spécificité de 87% et une sensibilité de 86% (Figure 3).
Dans les conditions testées, un niveau de phosphorylation du substrat inférieur à 0,035 ±
0,02 pmol/min/μΙ de sérum est significativement corrélé aux MICI.
Dans les conditions testées, une quantité d'enzyme active inférieure à 10 ng/ml est significativement corrélée aux MICI.
III - Analyse rétrospective de la cohorte américaine
Pour vérifier la pertinence des résultats observés pour la cohorte italienne, d'autres échantillons ont été testés. Les échantillons de sérum de la cohorte américaine ont été analysés à l'aide du test d'activité PKA avec le peptide SEQ ID NO : 2. Les résultats obtenus révèlent la même diminution significative de l'activité kinase dans le sérum chez les individus souffrant de MICI (MC et CU) par rapport aux individus contrôles sains.
Chez les individus sains (n = 356), la quantité d'enzyme active dans le sérum est de 15,1 ± 8,0 ng/ml, tandis que chez les patients souffrant de MICI (n = 480), la quantité d'enzyme active dans le sérum est de 9,14 ± 6,8 ng/ml (Figure 4).
Bien que l'ASC soit plus faible pour la cohorte américaine en comparaison de la cohorte italienne (0,73 vs 0,93), l'utilisation du peptide SEQ ID NO : 5 reste un bon marqueur pour diagnostiquer de MICI (Figure 5, Tableau 2).
MC vs sains CU vs sains MICI vs sains MCvsCU
Cohorte centre 1 0,94 0,93 0,93 0,56
Cohorte centre 2 0,73 0,74 0,74 0,51
Tableau 2. Comparaison de l'ASC entre les cohortes rétrospectives.
Mais surtout, les mêmes types de distribution sont observés pour les deux cohortes, c-à-d une distribution Gaussienne large pour les individus sains contre une distribution Gaussienne inverse plus étroite pour les patients souffrant de MICI (Figure 6).
IV - Evaluation de la sensibilité du test d'activité PKA par comparaison avec d'autres tests sérologiques
A partir des résultats présentés ci-dessus, il apparaît que le test d'activité PKA est très sensible et constitue un outil d'analyse fiable. La figure 7 compare la sensibilité de ce test par rapport à d'autres tests sérologiques couramment utilisés pour diagnostiquer l'inflammation chronique (hs CRP), les maladies cardiovasculaires (Dimère D et Créatine kinase) ou encore le cancer (PSA, prostate spécifie antigen). Ces tests, comme Act2, sont basés sur le protéome mais concernent des concentrations de protéines très différentes dans le sérum (variation d'environ 9 log). Chacune de ces différentes techniques, ainsi que le test Act2, présente une variation de moins d'un log entre la quantité de protéine relative chez les individus sains et celle chez les patients malades.
V - Criblage de différents peptides substrats
L'activité de phosphorylation d'une enzyme PKA humaine recombinante a été déterminée à l'aide de différents peptides substrats et celle-ci a été comparée à l'activité mesurée avec le peptide contrôle LRRASLG (SEQ ID NO : 4) (Tableaux 3 et 4).
Type Peptides testés (RRX2SLG) Comparaison de l'activité par rapport à celle du peptide SEQ ID NO : 4 (en %)
PRRASLG (SEQID NO : 7) >90%
PRRWSLG (SEQID NO: 8) >90%
PRRKSLG (SEQID NO: 9) >90%
PRRLSLG (SEQID NO : 10), >90%
PRRPSLG (SEQID NO: 5) >90%
PRRRSLG (SEQID NO : 11) >90%
PRRTSLG (SEQID NO : 12) >80%
PRRGSLG (SEQID NO : 13) >90%
PRRSSLG (SEQID NO : 15) >80%
PRRYSLG (SEQID NO : 16) >90%
PRRHSLG (SEQID NO : 17) >90%
PRRVSLG (SEQID NO : 18) >90%
PRRNSLG (SEQID NO : 19) >90%
PRRCSLG (SEQ ID NO : 20) >90%
PRRQSLG (SEQID NO : 21) >90%
PRRDSLG (SEQID NO : 22) >50%
PRRESLG (SEQID NO: 14) >50%
Tableau 3. Activité de la PKA observée avec différents substrats peptidiques modifiés sur la position X2.
Peptides testés (RRAS X3G) Comparaison de l'activité par rapport à celle du peptide SEQ ID NO : 4 (en %)
NP RRASGG (SEQID NO : 42) 0.5 ±0.09 (n =12)
NP RRASAG (SEQID NO : 43) 10.8 ±5.0 (n = 8)
NP RRASVG (SEQID NO : 44) 74.8± 25.8 (n = 5)
NP RRASLG (SEQID NO : 45) 99.2 ± 1.1 (n =12)
NP RRASIG (SEQID NO: 46) 100
NP RRASFG (SEQID NO : 47) 86.6 ± 13.0 (n =4)
NP RRASWG (SEQID NO : 48) 15.7 ± 8.5 (n =3)
NP RRASPG (SEQID NO : 49) 2.4 ± 3.0 (n =5)
H, P RRASYG (SEQID NO : 50) 25.9± 3.5 (n=2)
H, P RRASÇG (SEQID NO : 51) 48.7 ±9.4 (n = 2)
P RRASQG (SEQID NO : 52) 48.5 ± 22.5 (n = 2)
P RRASSG (SEQID NO : 53) 2.2 ± 0.8 (n =2)
P RRASTG (SEQID NO : 54) 17.0± 3.2 (n =2)
B RRASKG (SEQID NO : 55) 42.5 ± 8.5 (n =2)
B RRASRG (SEQID NO : 56) 22.1 ± 11.1 (n=3)
B RRASHG (SEQID NO : 57) 35.0 ± 4.0 (n =2)
A RRASEG (SEQID NO : 58) 3.6 ±4.8 (n =2)
A RRASDG (SEQID NO : 59) 2.0
Tableau 4. Activité de la PKA observée avec différents substrats peptidiques modifiés sur la position X3. (H,hydrophobe ; P, Polaire ; NP, non polaire ; B, basique ; A, acide)
Les peptides ayant en position X3 un acide aminé hydrophobe et d'un poids moléculaire 5 de 100 à 200 Da constituent des substrats efficaces pour mesurer l'activité PKA (Figure 8).
Matériels et Méthodes
Peptides: Les peptides utilisés pour mesurer l'activité de la protéine kinase A et/ou des protéines kinases A-like ont été déterminés à partir de la séquence consensus R3-Xi2-X2 _110 S°/T°-X3+1 (SEQ ID NO : 1), où Xi est un acide aminé naturel ou non naturel, de préférence
R, et X2 est un acide aminé naturel ou non naturel, de préférence P ou A (la numérotation indiquant la position par rapport à l'acide aminé phosphorylé (S° ou T°) par la PKA ou la
PKA-like).
Les peptides peuvent être prolongés à partir de SEQ ID NO : 1 en ajoutant des acides aminés supplémentaires en C-ter et/ou N-ter sans altérer les propriétés de ces peptides comme substrats des kinases PKA ou PKA-like. Par exemple, dans les peptides testés dans les tableaux 2 et 3, la séquence SEQ ID NO : 1 est précédée de 3 acides aminés VDP et prolongée d'un acide aminé G.
Les tests d'activité (Activomics) ont été réalisés avec les peptides Actl : LRRASLG (SEQ ID NO : 4), Act2 : PRRPSLG (SEQ ID NO : 5) et LPRRPSI (SEQ ID NO : 6).
Les substrats PRRPSLG (SEQ ID NO: 5) et R{dY}{dL}RRPSLG (SEQ ID NO : 35) sont préférés car ils possèdent une meilleure résistance aux protéases sériques durant des incubations prolongées et, par conséquent, leur utilisation nécessite moins d'inhibiteurs de protéases, lesquels sont susceptibles de réduire l'activité PKA ou PKA-like.
Echantillons : Des échantillons de sérum (300 μΙ/patient) ont été reçus de deux centres cliniques (cohorte italienne et cohorte américaine). Ces échantillons de sérum ont été obtenus à partir de sang circulant de patients diagnostiqués cliniquement comme souffrant de MICI (Maladie de Crohn ou Colite ulcéreuse) et collectés dans des tubes contenant du gel pour éviter une contamination par les cellules sanguines. Des échantillons de sérum contrôle ont été obtenus à partir d'individus sains en utilisant le même protocole. Les échantillons ont été conservés à -40°C avant les analyses. Des analyses de contrôle de la qualité ont été effectuées pour vérifier la qualité des échantillons (notamment la mesure de l'activité carboxypeptidase). Les échantillons ont ainsi montré moins de 15% de perte d'activité après 32 cycles de congélationdécongélation.
Test d'activité kinase (Activomics) : Les peptides fluorescents ont été synthétisés par addition d'un groupement carboxyfluorescéine (FAM) en N-terminal via un spacer acide aminohexanoïque (ahx) et par formation d'un amide en C-terminal (e.g. FAM-ahxpeptide-CONH2). Les peptides lyophilisés ont été dissouts à une concentration de 2mM dans de l'eau stérile, doublement distillée. De manière générale, 20 μΜ de peptide substrats fluorescents ont été incubus avec 3 μΙ de sérum dans un tampon de réaction pour kinase (concentration finale : 50 mM Tris.HCl, pH 7.5; 5 mM MgCI2) supplémenté avec des inhibiteurs de protéase (2.5 mM phénanthroline; 0.5 mM AEBSF) et 0.25 mM de cofacteur adénosine triphosphate (ATP). Ces conditions générales représentent un juste milieu entre l'économie de réactifs pour du screening à grande echelle et la mesure efficace de l'activité kinase (la concentration de peptide est > 5 x Km). Néanmoins, des concentrations (fortes ou faibles) de peptide, de sérum ou de cofacteur peuvent être utilisées en ajustant le temps d'incubation et en déterminant le nombre de moles de produit de phosphorylation/minute/mg de sérum.
Les mélanges réactionnels ont été préparés à l'aide d'un système 96-well benchtop pipettor (Sorenson Bioscience, Inc) dans des plaques noire de microtitatrion 384 puits et incubés à 37°c pendant 18 heures avant de stopper la réaction en ajoutant de l'EDTA à une concentration finale de 50 mM. Les mélanges réactionnels ont ensuite été anlysés par électrophorèse en conditions non-dénaturantes à haut voltage (2000V à une pression de 1.5 psi) dans des canaux microfluidiques en utilisant un LabChip® EZReader (Perkin Elmer).
Les peptides phosphorylés et non-phosphorylés ont été séparés par modification de la mobilité électrophorétique dûe à la charge avant la détection et la quantification de la fluorescence induite par laser (excitation à 470 nm, émission 530 nm).
Analyse des données : La formation du produit de phosphorylation est exprimée d'abord en : % de produit = aire du pic du produit / (aire du pic du produit et du substrat), puis est convertie en concentration en multipliant la concentration initiale de substrat par le % de produit (par exemple : 20 μΜ Act2 x (% produit/100)). Les paramètres statistiques des comparaisons contrôles/patients maladies ont été calculés en utilisant le logiciel Graphpad Prism 6 (Graphpad Software Inc.): la fréquence de distribution a été réalisée pour définir une distribution gaussienne en log par opposition à une distribution gaussienne normale, et donc distincte. Un test-t non paramétrique a été réalisé en utilisant la méthode Mann-Whitney pour analyser les différences statistiquement significatives des médianes respectives ± 95% Cl.
La sensibilité et la spécificité des mesures à l'aide des peptides pour distinguer les patients malades des contrôles sains ont été déterminées par des analyses ROC (Receiver
Operator Characteristic) et le résultat a été rapporté en tant qu'aire sous la courbe (AUC, Area Underthe Curve).
Les valeurs d'activité PKA des sérums ont été comparées, et les concentrations d'enzyme active (ng/ml) ont été extrapolées à partir de courbes standard réalisées par dilution d'une PKA recombinante active dans du sérum inactivé par chauffage et l'activité étant mesurée comme décrit plus haut.
Test de contrôle de l'activité carboxypeptidase : L'activité carboxypeptidase dans le sérum a été mesurée à l'aide d'un peptide fluorescent (Actll : FAM-ahx-RHRSDSSRC00H, SEQ ID NO : 62). En conditions de réaction standard, 2 pl de sérum sont incubés avec 10 μΜ de peptide Actll dans un tampon de réaction carboxypeptidase 50 mM Tris-HCI (pH 8), 5 mM MgCI2, pendant 2 heures à 25°C. L'activité carboxypeptidase reste stable à cette température (>12 heures) mais est moins stable à 37°C. De manière additionnelle, l'activité totale nécessite une prédilution du sérum dans le tampon de réaction carboxypeptidase avant l'ajout du substrat. Les réactions sont réalisées dans des plaques 384 puits et achevées par addition de 10 mM de phénanthroline. Les mélanges réactionnels ont ensuite été analysés par électrophorèse en conditions non-dénaturantes à haut voltage (2500V à une pression de 1.8 psi) dans des canaux microfluidiques en utilisant un LabChip® EZReader (Perkin Elmer).
Les peptides décarboxylés ont été séparés des peptides Actll n'ayant pas réagi, sur la base de leur différence de charge. En effet, la réaction de décarboxylation retire un acide aminé basique en C-terminal, ici l'arginine, modifiant la charge de +1 à 0. Les peptides ont été séparés par modification de la mobilité électrophorétique liée à la charge avant la détection et la quantification de la fluorescence induite par laser (excitation à 470 nm, émission 530 nm).

Claims (10)

  1. REVENDICATIONS
    1. Utilisation d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique d'un sujet suspecté de présenter une maladie inflammatoire, comme marqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic in vitro d'une maladie inflammatoire chez ledit sujet, de préférence, ladite protéine kinase étant capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé choisi parmi R ou K, de préférence R,
    X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
    X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C, de préférence choisi parmi L, F, V et I.
  2. 2. Méthode de diagnostic et/ou de pronostic in vitro d'une maladie inflammatoire chez un sujet suspecté de présenter une maladie inflammatoire, comprenant :
    - une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
    - une étape (ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée à l'étape (i) par rapport à une valeur de référence, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XiX2-S/T-X3 (SEQID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, de préférence, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase étant déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XxX2-S/T-X3 (SEQID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé choisi parmi R ou K, de préférence R,
    X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
    X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C, de préférence choisi parmi L, F, V et I.
  3. 3. Méthode de diagnostic et/ou de pronostic in vitro selon la revendication 2, dans laquelle l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'au moins un substrat peptidique comprenant ou consistant en une séquence choisie parmi :
    LRRASLG (SEQ ID NO : 4), PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), PRRASLG (SEQ ID NO : 7), PRRWSLG (SEQ ID NO : 8), PRRKSLG (SEQ ID NO : 9), PRRLSLG (SEQ ID NO : 10), PRRRSLG (SEQ ID NO : 11), PRRTSLG (SEQ ID NO : 12), PRRGSLG (SEQ ID NO : 13), PRRESLG (SEQ ID NO : 14), PRRSSLG (SEQ ID NO : 15), PRRYSLG (SEQ ID NO : 16), PRRHSLG (SEQ ID NO : 17), PRRVSLG (SEQ ID NO : 18), PRRNSLG (SEQ ID NO : 19), PRRCSLG (SEQ ID NO : 20), PRRQSLG (SEQ ID NO : 21), PRRDSLG (SEQ ID NO : 22), PRRASFG (SEQ ID NO : 23), PRRASVG (SEQ ID NO : 24), PRRASIG (SEQ ID NO : 25), PRRASMG (SEQ ID NO : 26), PRRASQG (SEQ ID NO : 27), PRRASNG (SEQ ID NO : 28), PRRASCG (SEQ ID NO : 29), RDLRRASLV (SEQ ID NO : 30), RYLRRATLV(SEQ ID NO : 31), RYLRRPSLG (SEQ ID NO : 32), RPPRRASLG (SEQ ID NO : 33), R{dY}{dL}RRASLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 34), R{dY}{dL}RRPSLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 35), RPPRKASLG (SEQ ID NO : 36), RPPRRPSLG (SEQ ID NO : 37), RPPRRPSI (SEQ ID NO : 38), PRRPTI (SEQ ID NO : 39) et RYLRRASLG (SEQ ID NO : 40).
  4. 4. Méthode d'évaluation et/ou de suivi de l'efficacité d'un traitement d'une maladie inflammatoire chez un sujet comprenant :
    - une étape i) de détermination de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-X1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où
    Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique dudit sujet,
    - une étape ii) de comparaison de l'activité de ladite protéine kinase déterminée dans ledit échantillon biologique prélevé à différentes dates, dans laquelle, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XxX2-S/T-X3 (SEQID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, en particulier, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2S/T-X3 (SEQID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé choisi parmi R ou K, de préférence R,
    X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
    X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C, de préférence choisi parmi L, F, V et I, plus particulièrement, à l'étape i), l'activité de ladite protéine kinase est déterminée à l'aide d'un substrat peptidique tel que défini selon la revendication 3.
  5. 5. Méthode de dosage de l'activité d'une protéine kinase capable de phosphoryler un substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ. ID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, dans un échantillon biologique, comprenant :
    - une étape i) d'incubation dudit échantillon, ou de la protéine kinase issue dudit échantillon, en présence d'un substrat peptidique susceptible d'être phosphorylé par ladite protéine kinase pendant au moins 10 heures, de préférence pendant au moins 18 heures, ledit substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-XiX2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, en particulier, ledit substrat peptidique comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé choisi parmi R ou K, de préférence R,
    X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
    X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C, de préférence choisi parmi L, F, V et I, plus particulièrement, ledit substrat peptidique est un substrat peptidique tel que défini selon la revendication 3, en particulier, ledit échantillon biologique étant un échantillon de sang, de plasma ou de sérum.
  6. 6. Kit de dosage de l'activité d'une protéine kinase, comprenant au moins :
    - un substrat susceptible d'être phosphorylé par ladite protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, et
    - de l'ATP, de préférence, ledit kit comprenant également au moins un inhibiteur de protéase, de préférence choisi parmi le groupe comprenant: la 1,10-Phénanthroline, l'AEBSF (4-(2Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride), l'aprotinine, la bestatine, l'E-64, la leupeptine, la pepstatine A, l'EDTA, l'antipaïne dihydrochloride, la chymostatine, le phosphoramidon, le Pefabloc® SC, l'acide ε-aminocaproïque, le N-Ethylmaléimide, un inhibiteur de trypsine et l'antitrypsine alpha.
  7. 7. Kit de diagnostic d'une maladie inflammatoire, comprenant au moins :
    - un substrat susceptible d'être phosphorylé par une protéine kinase, ledit substrat comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X3 est un acide aminé naturel choisi parmi : L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, et
    - de l'ATP, de préférence, ledit kit comprenant également au moins un inhibiteur de protéase, de préférence choisi parmi le groupe comprenant: la 1,10-Phénanthroline, l'AEBSF (4-(2Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride), l'aprotinine, la bestatine, l'E-64, la leupeptine, la pepstatine A, l'EDTA, l'antipaïne dihydrochloride, la chymostatine, le phosphoramidon, le Pefabloc® SC, l'acide ε-aminocaproïque, le N-Ethylmaléimide, un inhibiteur de trypsine et l'antitrypsine alpha.
  8. 8. Utilisation d'un peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2S/T-X3 (SEQ. ID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C ou un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, pour le diagnostic in vitro d'une maladie inflammatoire à partir d'un échantillon biologique d'un patient, en particulier, ledit peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus RX1-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé choisi parmi R ou K, de préférence R,
    X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
    X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, Μ, K, H et C, de préférence choisi parmi L, F, V et I.
  9. 9. Utilisation d'un peptide selon la revendication 8, ledit peptide comprenant ou consistant en une séquence peptidique choisie parmi :
    LRRASLG (SEQ ID NO : 4), PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), PRRASLG (SEQ ID NO : 7), PRRWSLG (SEQ ID NO : 8), PRRKSLG (SEQ ID NO : 9), PRRLSLG (SEQ ID NO : 10), PRRRSLG (SEQID NO : 11), PRRTSLG (SEQ ID NO : 12), PRRGSLG (SEQ ID NO : 13), PRRESLG (SEQ ID NO : 14), PRRSSLG (SEQ ID NO : 15), PRRYSLG (SEQ ID NO : 16), PRRHSLG (SEQ ID NO : 17), PRRVSLG (SEQ ID NO : 18), PRRNSLG (SEQ ID NO : 19), PRRCSLG (SEQ ID NO : 20), PRRQSLG (SEQ ID NO : 21), PRRDSLG (SEQ ID NO : 22), PRRASFG (SEQ ID NO : 23), PRRASVG (SEQ ID NO : 24), PRRASIG (SEQ ID NO : 25), PRRASMG (SEQ ID NO : 26), PRRASQG (SEQ ID NO : 27), PRRASNG (SEQ ID NO : 28), PRRASCG (SEQ ID NO : 29), RDLRRASLV (SEQ ID NO : 30), RYLRRATLV(SEQ ID NO : 31), RYLRRPSLG (SEQ ID NO : 32), RPPRRASLG (SEQ ID NO : 33), R{dY}{dL}RRASLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 34), R{dY}{dL}RRPSLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 35), RPPRKASLG (SEQ ID NO : 36), RPPRRPSLG (SEQ ID NO : 37), RPPRRPSI (SEQ ID NO : 38), PRRPTI (SEQ ID NO : 39) et RYLRRASLG (SEQ ID NO : 40).
  10. 10. Peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus R-Xi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X2 est un acide aminé naturel ou non naturel,
    X3 est un acide aminé naturel choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C ou d'un acide aminé non naturel de caractère hydrophobe et d'un poids moléculaire de 100 à 200 Da, en particulier, ledit peptide comprenant ou consistant en la séquence consensus RXi-X2-S/T-X3 (SEQ ID NO : 1), où :
    Xi est un acide aminé choisi parmi R ou K, de préférence R,
    X2 est un acide aminé choisi parmi P et A,
    X3 est un acide aminé choisi parmi L, F, V, I, Q, R, M, K, H et C, de préférence choisi parmi L, F, V et I, ledit peptide étant différent de SEQ ID NO : 4, de préférence, le dit peptide comprenant ou consistant en une séquence peptidique choisie parmi :
    PRRPSLG (SEQ ID NO : 5), LPRRPSI (SEQ ID NO : 6), PRRASLG (SEQ ID NO : 7), PRRWSLG (SEQ ID NO : 8), PRRKSLG (SEQ ID NO : 9), PRRLSLG (SEQ ID NO : 10), PRRRSLG (SEQ ID NO : 11), PRRTSLG (SEQ ID NO : 12), PRRGSLG (SEQ ID NO : 13), PRRESLG (SEQ ID NO : 14), PRRSSLG (SEQ ID NO : 15), PRRYSLG (SEQ ID NO : 16), PRRHSLG (SEQ ID NO : 17), PRRVSLG (SEQ ID NO : 18), PRRNSLG (SEQ ID NO : 19), PRRCSLG (SEQ ID NO : 20),
    PRRQSLG (SEQ ID NO : 21), PRRDSLG (SEQ ID NO : 22), PRRASFG (SEQ ID NO : 23),
    PRRASVG (SEQ ID NO : 24), PRRASIG (SEQ ID NO : 25), PRRASMG (SEQ ID NO : 26),
    PRRASQG (SEQ ID NO : 27), PRRASNG (SEQ ID NO : 28), PRRASCG (SEQ ID NO : 29),
    RDLRRASLV (SEQ ID NO : 30), RYLRRATLV(SEQ ID NO : 31), RYLRRPSLG (SEQ ID NO : 32), RPPRRASLG (SEQ ID NO : 33), R{dY}{dL}RRASLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 34), R{dY}{dL}RRPSLG (où d indique la forme D-isomère d'une acide aminé) (SEQ ID NO : 35), RPPRKASLG (SEQ ID NO : 36), RPPRRPSLG (SEQ ID NO : 37), RPPRRPSI (SEQ ID NO : 38), PRRPTI (SEQ ID NO : 39) et RYLRRASLG (SEQ ID NO : 40).
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