WO2022254164A1 - Procede de detection d'un virus en replication - Google Patents

Procede de detection d'un virus en replication Download PDF

Info

Publication number
WO2022254164A1
WO2022254164A1 PCT/FR2022/051066 FR2022051066W WO2022254164A1 WO 2022254164 A1 WO2022254164 A1 WO 2022254164A1 FR 2022051066 W FR2022051066 W FR 2022051066W WO 2022254164 A1 WO2022254164 A1 WO 2022254164A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
plpro
virus
fluorophore
protease
Prior art date
Application number
PCT/FR2022/051066
Other languages
English (en)
Inventor
Stéphane PICOT
Bastien DOUMECHE
Anne-Lise BIENVENU
Original Assignee
Universite Claude Bernard Lyon 1
Hospices Civils De Lyon
Centre National De La Recherche Scientifique
Ecole Superieure De Chimie Physique Electronique De Lyon
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Claude Bernard Lyon 1, Hospices Civils De Lyon, Centre National De La Recherche Scientifique, Ecole Superieure De Chimie Physique Electronique De Lyon filed Critical Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority to EP22734663.2A priority Critical patent/EP4347863A1/fr
Publication of WO2022254164A1 publication Critical patent/WO2022254164A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus

Definitions

  • the invention relates to a rapid test for detecting the presence of a replicating virus in a sample.
  • the international community is currently facing a pandemic of acute respiratory syndrome due to the coronavirus designated SARS-CoV-2.
  • SARS-CoV-2 coronavirus
  • the diagnostic test by RT-PCR from nasopharyngeal swabs has been the most widespread test to detect the presence of this virus at the individual or population level.
  • this test cannot be used to detect a person in real time, whether they are symptomatic or not, but contagious.
  • Other individual tests exist, based on immunochromatography techniques or on gene amplification techniques, but they do not provide an answer concerning the immediate contagiousness of the person.
  • the inventors now propose a rapid and reliable test for detecting the contagious risk.
  • the invention relates to an in vitro method for determining whether a sample contains a replicating virus, in particular a coronavirus, such as a SARS-Cov-2, said method comprising the detection of a Papain-like protease activity ( PLpro) of coronavirus.
  • Replicating virus is any virus that expresses a PLpro.
  • the method comprises bringing the sample into contact with at least one detectably labeled PLpro protease substrate peptide. More specifically, the activity of PLpro is revealed by a fluorescence test.
  • the sample is a saliva sample, the presence of which has been shown to potentiate the fluorescence signal.
  • the test allows the presence of PLpro to be revealed in less than 30 minutes, advantageously less than 15 minutes.
  • Figure 1 is a graph which shows the fluorescence assay of PLpro activity on the Z-RLRGG-AMC substrate, in comparison with the activity of PLpro on the ISG15-AMC substrate for a period of 60 minutes.
  • concentrations of the Z-RLRGG-AMC peptide were increased while respecting an enzyme/substrate ratio of 1/200.
  • FIG. 2 is a graph which reports the measurement of the fluorescence emitted by the labeled substrate peptide in the presence of human saliva (3 samples) and of PLPro and of Triton X100, for a period of 30 minutes. Each saliva was tested in triplicate and the means and standard deviations are represented.
  • Figure 3 is a graph that shows the potentiating effect of saliva on the observed fluorescence intensity.
  • the graph follows the assay of the activity of PLpro at a concentration of 50 nM on the substrate peptide Z -RLRGG-AMC at a concentration of 25 mM. Controls do not include enzyme or substrates.
  • Figure 4 is a graph showing the effect of 4 ions in the form of CaC, MgC, KCl and NaCl on the activity of PLpro against the substrate peptide Z-RLRGG-AMC.
  • the activity of PLpro (10 nM) on the Z-RLRGG-AMC substrate (50 mM) is monitored over time.
  • a sample without ion serves as a reference.
  • Figure 5 is a graph showing the effect of Ca 2+ at different concentrations (from 0.2 to 20 mM).
  • the activity of PLpro (5 nM) on the Z-RLRGG-AMC substrate (50 mM) is monitored over time.
  • a sample without ion serves as a reference.
  • the objective of the test is to detect the presence of a virus, in particular a replicative coronavirus, in saliva samples or any other sample, biological or non-biological.
  • replicative or “in replication” it is meant that the virus produces virions, and multiplies.
  • the test is based on the detection of the enzymatic activity of the papain-like protease (PLpro) of the virus, in particular a coronavirus, making it possible to reveal its replication activity, preferably by means of fluorescence labeling, in liquid medium or not.
  • PLpro papain-like protease
  • the test can be self-testing, i.e. a test that can be performed without the help of a healthcare professional.
  • the sample can be a biological or non-biological sample, for example a sample obtained from an inert support.
  • the biological sample may be a sample obtained from a human subject, adult or child, or from a non-human animal, especially a non-human mammal, preferably a domestic animal. It can be for example a pet such as a cat or a dog. It may still be a farm animal. A preferred example is a ruminant such as cattle. According to other aspects, the mammal can be chosen from sheep, goats, pigs, or equines.
  • the subject to be tested is preferably suspected or likely to be infected with a coronavirus or another virus exhibiting PLpro activity. It can be a symptomatic subject (for example presenting a fever and/or cough, in humans), or asymptomatic.
  • a biological sample examples include saliva or a nasopharyngeal swab.
  • the biological sample is a saliva sample.
  • a saliva sample can be obtained by sputum (Sapkota et al., 2020) or using a sponge-type device or pipette aspiration or similar device. You can also test any other sample of body fluid (such as blood or plasma) or tissue biopsy.
  • the sample is an environmental, sewage or food sample.
  • the method makes it possible to check whether an object or a material is contaminated by a virus, in particular a coronavirus, in replication, and likely to represent an infectious risk.
  • the sample is obtained by taking a sample from an object, material, or machine, which has been or is likely to have been in contact with an infectious subject.
  • the object may be a hospital bed or a medical device that has been used by a patient infected with coronavirus.
  • the sample is preferably brought into contact with a lysis buffer, comprising for example at least one detergent or a mixture of detergents, intended to release the membrane proteins of the sample.
  • a lysis buffer containing Triton X100 can for example be used.
  • the lysis buffer can also contain a mucolytic agent, such as N-acetyl-cysteine (Nac) for example.
  • the test can detect the presence of any virus with PLpro activity, i.e. any virus that expresses PLpro.
  • the virus is a coronavirus, especially a SARS-CoV, MERS-CoV, or SARS-CoV-2.
  • the coronavirus is SARS-CoV-2.
  • the method of the invention makes it possible to detect any variant of SARS-CoV-2.
  • SARS-CoV-2 viruses are detectable: - Lineage B or Wuhan
  • the coronavirus is SARS-CoV-2
  • the sample is a saliva sample.
  • the coronavirus is an FCoV feline coronavirus.
  • the virus to be detected is a picornavirus, preferably an aphthovirus (responsible for foot-and-mouth disease), more preferably a ruminant aphthovirus.
  • PLPro is a protease located in nonstructural protein 3 (NS3) of the coronavirus polyprotein (Osipiuk et al, 2021).
  • the method according to the invention preferably comprises bringing the sample into contact with at least one substrate peptide of the protease PLpro, preferably labeled in a detectable manner.
  • the substrate peptide consists of the sequence RLRGG (SEQ ID NO:2).
  • the substrate peptide is used at a concentration ranging from 0.1 mM to 1 mM, preferably 0.1 to 500 mM, preferably 1 to 100 mM, more preferably about 1 to 50 mM.
  • the substrate peptide can be freeze-dried, and suspended by adding the sample to the lysis buffer.
  • the sample is a saliva sample which provides the liquid to release the lyophilized substrate peptide.
  • a cofactor of the enzymatic reaction between the papain-like protein (PLpro) and the substrate peptide consisting of the sequence RLRGG (SEQ ID NO: 2) is added.
  • the substrate peptide in the presence of divalent cations, in particular Ca 2+ cations (provided for example in the CaC form).
  • the salts are used at a concentration between 5 and 40 mM, preferably 20 mM.
  • a concentration of 20 mM CaC offers a potentiating effect on the enzymatic reaction.
  • the substrate peptide is placed in the presence of a reaction medium comprising a buffer, supplemented with a lysing agent such as Triton X100, Nac, and CaC, preferably before the addition of saliva.
  • the enzymatic activity of PLPro in the sample can be detected by any means known to those skilled in the art, in liquid medium or not.
  • the assay uses a PLpro substrate peptide that is detectably labeled.
  • the peptide itself preferably carries a detectable label.
  • detectable marker refers to a molecule or compound or group of molecules or group of compounds used to measure the enzymatic activity of PLpro.
  • the detectable label can advantageously be detected directly.
  • the enzymatic activity is revealed by a fluorescence test.
  • the substrate peptide carries a fluorophore, preferably at its C-terminal end.
  • the substrate peptide bears a fluorophore at one end, and a protective group at the other.
  • Any fluorophore can be used, preferably a small organic fluorophore (less than 1 kDa).
  • a coumarin derivative such as aminomethylcoumarin (AMC) or methylumbelliferone (MEU)
  • AMC aminomethylcoumarin
  • MEU methylumbelliferone
  • the peptide derivatives of 7-amino-4-methylcoumarin are fluorogenic markers which exhibit fluorescence emission at approximately 420-480 nm upon release of the fluorophore. Any fluorophore allowing detection in wavelengths ranging from 350 to 500 nm, preferably 420 - 480 nm, is also envisaged.
  • derivatives of pyrene or naphthalene can also be used as fluorophores.
  • the method thus comprises bringing the sample into contact with at least one substrate peptide of the protease PLpro bearing a fluorophore, the fluorophore being an aminomethyl coumarin (AMC) group, preferably carried at the C end. -terminal of the substrate peptide.
  • AMC aminomethyl coumarin
  • the substrate peptide is Z-RLRGG-(AMC), where (AMC) is aminomethyl coumarin, and Z is a carboxybenzyl protecting group.
  • the invention also provides a useful kit for carrying out the test described above.
  • kit may optionally comprise a container intended to receive the sample to be tested a container, which may be the container intended to receive the sample to be tested, comprising a lysis buffer, including for example at least one detergent or a mixture of detergents, intended to release proteins from the sample; and a container comprising the PLpro substrate peptide, detectably labeled with a fluorophore.
  • a container intended to receive the sample to be tested a container, which may be the container intended to receive the sample to be tested, comprising a lysis buffer, including for example at least one detergent or a mixture of detergents, intended to release proteins from the sample; and a container comprising the PLpro substrate peptide, detectably labeled with a fluorophore.
  • all of the reagents may be contained in a single compartment, preferably in lyophilized form.
  • the lysis buffer also comprising Nac and CaC.
  • the sample to be tested is saliva
  • it is the addition of the saliva which resuspends all of the reagents and initiates the reaction.
  • the test can thus be carried out entirely in a single step after taking the sample.
  • G saliva sample is deposited without delay in the container described above and brought into contact instantly with the reaction medium at room temperature indoors.
  • the container is then agitated by inversion (typically 3 to 5 times) and the reaction proceeds without intervention for approximately 15 minutes.
  • the container is brought into contact with the fluorescence detector which may or may not be of portable format, the reading wavelength of which is that specific to the fluorescence marker selected.
  • the fluorescence reading is instantaneous and gives a positive or negative signal depending on the detection threshold identified by the substrate peptide carrying a fluorophore.
  • Example 1 Detection of the enzymatic activity of PLpro by fluorescence measurement
  • the enzymatic activity of PLpro was tested using a substrate protein of the enzyme, presenting at its C-terminal end a fluorophore, aminomethyl coumarin (AMC). More specifically, the substrate protein used is ISGI 5, a protein of approximately 17 kDa for which the PLpro enzyme has a high affinity.
  • the fluorescence curve obtained also made it possible to detect a significant activity in a time approximately equal to 11-12 minutes.
  • Example 1 The fluorescence measurement obtained in Example 1 with the ISG15-AMC substrate was compared with another substrate: Z-RLRGG-AMC which allows advantageous use at higher concentrations.
  • Figure 1 shows a very increased fluorescence for the same substrate/enzyme ratio.
  • Figure 2 shows the very good results obtained with the saliva of three donors, in the presence of external PLpro, the response being significantly detectable, from 10 minutes of reaction. Each test was repeated three times using 50 ⁇ L of saliva containing the PLP to be detected. The mean and standard deviations for these three donors are shown in Figure 2
  • Example 3 Impact of saliva on the fluorescence signal (substrate: Z-RLRGG-AMC)
  • Example 4 Assay of the enzymatic activity of PLpro by measuring fluorescence under the influence of different ions.
  • a fluorescence measurement was performed on the Z-RLRGG-AMC substrate by testing the influence of different ions diluted in dilution buffer (HEPES).
  • HEPES dilution buffer
  • ions were thus tested, provided in the form of MgC, CaC, KCl and NaCl.
  • the PLpro is at a concentration of 10 nM and the substrate Z-RLRGG-AMC at a concentration of 50 mM.
  • Triton X100 [0.001%] was also added for virus lysis. Normalization of enzyme activity was performed relative to controls. Saliva was also retained when measuring PLpro activity.
  • the Ca 2+ cation provides the best reaction potentiating effect after 15 minutes.
  • the inventors also tested the influence of Ca 2+ cations on the enzymatic activity of PLpro at different concentrations of CaC (from 0.2 to 20 mM) (FIG. 5).
  • the PLpro is at a concentration of 5 nM and the substrate Z-RLRGG-AMC at a concentration of 50 mM.
  • Triton X100 [0.001%] was also added for virus lysis. Increasing the ion concentration increases the potentiating effect on the activity of PLpro.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

L'invention vise un procédé in vitro pour déterminer si un échantillon contient un virus en réplication, ledit procédé comprenant la détection d'une activité protéasique Papaïne-like (PLpro) du virus.

Description

PROCEDE DE DETECTION D'UN VIRUS EN REPLICATION
Domaine de l'invention
L’invention concerne un test rapide permettant de détecter la présence d’un virus en réplication, dans un échantillon.
Figure imgf000002_0001
La communauté internationale fait actuellement face à une pandémie de syndrome respiratoire aigu due au coronavirus désigné SARS-CoV-2. Le test de diagnostic par RT- PCR à partir d'écouvillons nasopharyngés a été le test le plus répandu pour détecter la présence de ce virus au niveau individuel ou au niveau d’une population. Cependant, en raison de ses caractéristiques techniques (détection de la présence d’ARN), ce test ne peut être utilisé pour détecter en temps réel une personne qu’elle soit symptomatique ou non, mais contagieuse. D’autres tests individuels existent, basés sur des techniques d’immunochromatographie ou sur des techniques d’amplification géniques, mais ils n’apportent pas de réponse concernant la contagiosité immédiate de la personne.
La perception du risque et les comportements à risque deviennent des variables importantes pour prédire la propagation de la pandémie. Fournir des outils abordables, fiables et faciles d’utilisation, reste un défi pour évaluer le risque réel au niveau individuel.
Des tests rapides systématiques et hautement performants sont essentiels pour réduire l'impact médical et économique de la Covid-19.
De tels tests rapides seraient également extrêmement utiles au-delà du SARS-CoV-2, pour détecter un risque contagieux vis-à-vis d’autres virus, notamment dans le domaine vétérinaire.
Résumé de l’invention
Dans ce contexte, les inventeurs proposent maintenant un test rapide et fiable pour détecter le risque contagieux.
Plus généralement, l’invention concerne un procédé in vitro pour déterminer si un échantillon contient un virus en réplication, notamment un coronavirus, tel qu’un SARS-Cov-2, ledit procédé comprenant la détection d’une activité protéasique Papaïne-like (PLpro) de coronavirus. Le virus en réplication est tout virus qui exprime une PLpro.
Pour cela, le procédé comprend la mise en contact de l’échantillon avec au moins un peptide substrat de la protéase PLpro marqué de manière détectable. Plus précisément l’activité de la PLpro est révélée par un test de fluorescence.
De manière spécialement préférée, l’échantillon est un échantillon de salive, dont la présence s’est avérée potentialiser le signal de fluorescence. Le test permet la révélation de la présence de la PLpro en moins de 30 minutes, avantageusement moins de 15 minutes.
Figures
La Figure 1 est un graphe qui montre le dosage par fluorescence de l’activité de la PLpro sur le substrat Z-RLRGG-AMC, en comparaison avec l’activité de la PLpro sur le substrat ISG15-AMC pendant une durée de 60 minutes. Les concentrations du peptide Z-RLRGG- AMC ont été augmentées en respectant un rapport enzyme/substrat de 1/200.
La Figure 2 est un graphe qui rapporte la mesure de la fluorescence émise par le peptide substrat marqué en présence de salive humaine (3 échantillons) et de PLPro et de Triton X100, pendant une durée de 30 minutes. Chaque salive a été testée en triplicata et les moyennes et écart-types sont représentés.
La Figure 3 est un graphe qui montre l’effet potentialisateur de la salive sur l’intensité de la fluorescence observée. Le graphe suit le dosage de l’activité de la PLpro à une concentration de 50nM sur le peptide substrat Z -RLRGG-AMC à une concentration de 25mM. Les contrôles ne comportent pas d’enzyme ou de substrats.
La Figure 4 est un graphe montrant l’effet de 4 ions sous la forme de CaC , MgC , KCI et NaCI sur l’activité de la PLpro vis-à-vis du peptide substrat Z -RLRGG-AMC . L’activité de la PLpro (10 nM) sur le substrat Z-RLRGG-AMC (50 mM) est suivie au cours du temps. Un échantillon sans ion sert de référence.
La Figure 5 est un graphe montrant l’effet du Ca2+ à différentes concentrations (de 0,2 à 20 mM). L’activité de la PLpro (5 nM) sur le substrat Z-RLRGG-AMC (50 mM) est suivie au cours du temps. Un échantillon sans ion sert de référence.
Figure imgf000003_0001
L'objectif du test est de détecter la présence d’un virus, notamment un coronavirus, réplicatif dans des échantillons de salive ou tout autre échantillon, biologique ou non biologique.
Par « réplicatif » ou « en réplication », on entend que le virus produit des virions, et se multiplie. Le test est basé sur la détection de l’activité enzymatique de la protéase de type papaïne (PLpro) du virus, notamment un coronavirus, permettant de révéler son activité de réplication, de préférence au moyen d’un marquage par fluorescence, en milieu liquide ou non. Lorsque le virus est un virus humain, le test peut être auto-test, c’est-à-dire d’un test qui peut être réalisé sans l’aide d’un professionnel de santé.
Echantillon
L’échantillon peut être un échantillon biologique ou non-biologique, par exemple un prélèvement obtenu à partir d’un support inerte. Dans un mode de réalisation préféré, l’échantillon biologique peut être un échantillon obtenu d’un sujet humain, adulte ou enfant, ou d’un animal non-humain, spécialement un mammifère non-humain, de préférence un animal domestique. Il peut s’agir par exemple d’un animal de compagnie comme un chat ou un chien. Il peut encore s’agir d’un animal d’élevage. Un exemple préféré est un ruminant tel que des bovins. Selon d’autres aspects, le mammifère peut être choisi parmi des ovins, des caprins, des porcins, ou des équidés. Le sujet à tester est de préférence suspecté ou susceptible d’être infecté par un coronavirus ou un autre virus présentant une activité PLpro. Il peut s’agir d’un sujet symptomatique (par exemple présentant une fièvre et/ou de la toux, chez les humains), ou asymptomatique.
Parmi les exemples préférés d’échantillon biologique, on peut citer la salive ou un prélèvement nasopharyngé. De manière la plus avantageuse, l’échantillon biologique est un échantillon de salive. Par exemple un échantillon de salive peut être obtenu par crachat (Sapkota et al., 2020) ou à l’aide d’un dispositif de type éponge ou une aspiration par pipette ou dispositif similaire. On peut également tester tout autre échantillon de liquide biologique (comme du sang ou du plasma) ou biopsie tissulaire.
Alternativement, l’échantillon est un échantillon issu de l’environnement, des eaux usées ou un échantillon de nourriture.
Dans un autre mode de réalisation, le procédé permet de vérifier si un objet ou un matériau est contaminé par un virus, notamment un coronavirus, en réplication, et susceptible de représenter un risque infectieux. Dans un exemple particulier, l’échantillon est obtenu par prélèvement sur un objet, matériau, ou machine, qui a été ou est susceptible d’avoir été contact avec un sujet infectieux. Par exemple, l’objet peut être un lit d’hôpital ou un dispositif médical ayant été utilisé par un patient infecté par un coronavirus.
L’échantillon est de préférence mis en contact avec un tampon de lyse, comprenant par exemple au moins un détergent ou un mélange de détergents, destiné à libérer les protéines membranaires de l’échantillon. Un tampon de lyse contenant du Triton X100 peut être par exemple utilisé. Le tampon de lyse peut également contenir un agent mucolytique, comme de la N-acétyl-cystéine (Nac) par exemple.
Virus présentant une activité PLpro
Le test permet de détecter la présence de tout virus présentant une activité PLpro, c’est-à- dire tout virus qui exprime une PLpro.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le virus est un coronavirus, notamment un SARS-CoV, MERS-CoV, ou SARS-CoV-2. De préférence le coronavirus est le SARS-CoV-2.
En outre, le procédé de l’invention permet de détecter n’importe quel variant du SARS-CoV- 2. Par exemple sont détectables les virus SARS-CoV-2 suivants : - Lignée B ou Wuhan
- Lignée B.1
- Lignée B.1.1.7 ou variant britannique SARS-CoV-2 VOC 202012/01
- Lignée B.1 .351 ou variant sud-africain VOC-202012/02
- Lignée B.1 .1.207 ou variant nigérian
- Variant danois cluster 5 (AFVI-spike)
- Lignée B.1 .1.248 ou variant brésilien VOC-202101/02
- Lignée B.1 .525 britannique ou variant Nigérian VUI-202102/03 (PHE)
- Lignée B.1 .526 ou variant de New York
- Lignées B.1 .427 ou B.1.429 ou variant californien CAL.20C
- Variant 20A/484Q (B.1 .617) ou variant indien, plus précisément le variant B.671 .2 encore appelé variant Delta,
- Lignées AY.1 à AY.25 (sous lignées du variant B.1 .617)
- Variant B.1.1.529 ou variant Omicron
- Variants BA.1 à BA.5 dits sous variants de B.1.1.529.
- Recombinant « Deltacron » XD
- Recombinant XE
- Variant C.37 ou variant Lambda
- Variant B.1.621 ou variant Mu
- Variant B.1.616 ou variant breton
- Variant B.1.640 ou variant congolais
De préférence, le coronavirus est un SARS-CoV-2, et l’échantillon est un échantillon de salive.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le coronavirus est un coronavirus félin FCoV.
Selon un autre aspect, le virus à détecter est un picornavirus, de préférence un aphtovirus (responsable de la fièvre aphteuse), de préférence encore un aphtovirus de ruminants.
Protéase de type papaïne (PLpro) et peptide substrat
La PLPro est une protéase localisée dans la protéine non structurale 3 (NS3) de la polyprotéine des coronavirus (Osipiuk et al, 2021).
La caractérisation in vitro des activités enzymatiques de la PLpro a révélé que cette dernière peut reconnaître et hydrolyser les protéines cellulaires associées à l’ubiquitine (Ub) et la protéine ubiquitine-like (UBL) ISG15 (interferon-induced gene 15), toutes deux portant le motif de reconnaissance LXGG (SEQ ID NO :1) à leur extrémité C-terminale (Lindner et al., 2007 ; Lindner et al, 2005).
Le procédé selon l’invention comprend de préférence la mise en contact de l’échantillon avec au moins un peptide substrat de la protéase PLpro, de préférence marqué de manière détectable.
Le peptide substrat consiste en la séquence RLRGG (SEQ ID NO :2).
Dans un mode de réalisation préféré, le peptide substrat est utilisé à une concentration allant de 0,1 mM à 1mM, de préférence 0,1 à 500mM, de préférence 1 à 100mM, de préférence encore environ 1 à 50mM.
Avantageusement, le peptide substrat peut être lyophilisé, et mis en suspension par ajout de l’échantillon dans le tampon de lyse. Dans un mode de réalisation préféré, l’échantillon est un échantillon de salive qui apporte le liquide permettant de libérer le peptide substrat lyophilisé.
Dans un mode de réalisation préféré, un cofacteur de la réaction enzymatique entre la protéine de type papaïne (PLpro) et le peptide substrat consistant en la séquence RLRGG (SEQ ID NO : 2) est ajouté. En particulier, il peut être avantageux de mettre le peptide substrat en présence de cations divalents, notamment des cations Ca2+ (apportés par exemple sous forme CaC ). De préférence, les sels sont utilisés à une concentration entre 5 et 40 mM, de préférence 20 mM. En particulier, comme le montre la Figure 5, une concentration de 20mM de CaC offre un effet potentialisateur de la réaction enzymatique. Dans un exemple particulièrement avantageux, le peptide substrat est mis en présence d’un milieu réactionnel comprenant un tampon, complété par un agent de lyse comme le Triton X100, du Nac, et du CaC , de préférence avant l’ajout de salive.
Révélation de l’activité enzymatique
L’activité enzymatique de la PLPro dans l’échantillon peut être détectée par tout moyen connu de l’homme du métier, en milieu liquide ou non.
Dans un mode de réalisation préféré, le test utilise un peptide substrat de la PLpro qui est marqué de manière détectable.
Pour cela, le peptide est de préférence lui-même porteur d’un marqueur détectable.
Le terme «marqueur détectable» tel qu'utilisé ici se réfère à une molécule ou un composé ou un groupe de molécules ou un groupe de composés utilisés pour mesurer l'activité enzymatique de la PLpro. Le marqueur détectable peut avantageusement être détecté directement.
Avantageusement, l’activité enzymatique est révélée par un test de fluorescence. Le peptide substrat porte un fluorophore, de préférence à son extrémité C-terminale. De manière avantageuse, le peptide substrat porte un fluorophore à une extrémité, et un groupement protecteur à l’autre.
Tout fluorophore peut être utilisé, de préférence un fluorophore organique de petite taille (inférieure à 1kDa).
De préférence, on peut utiliser comme fluorophore un dérivé de la coumarine, comme l’aminomethylcoumarine (AMC) ou la methylumbelliferone (MEU). Par exemple les dérivés peptidiques de la 7-amino-4-méthylcoumarine sont des marqueurs fluorogènes qui présentent une émission de fluorescence à environ 420 - 480 nm lors de la libération du fluorophore. Tout fluorophore permettant une détection dans des longueurs d’onde allant de 350 à 500 nm, de préférence 420 - 480 nm, est également envisagé.
A titre d’exemples non limitatifs, on peut également utiliser comme fluorophores des dérivés du pyrène ou du naphtalène.
De préférence, le procédé comprend ainsi la mise en contact de l’échantillon avec au moins un peptide substrat de la protéase PLpro porteur d’un fluorophore, le fluorophore étant un groupe aminométhyl coumarine (AMC), de préférence porté à l’extrémité C-terminale du peptide substrat.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le peptide substrat est Z- RLRGG- (AMC), où (AMC) est l’aminométhyl coumarine, et Z est un groupement protecteur carboxybenzyle.
Kit ou dispositif
L’invention fournit également un kit utile pour la mise en oeuvre du test décrit ci-dessus.
Un tel kit peut comprendre optionnellement un récipient destiné à accueillir l’échantillon à tester un récipient, qui peut être le récipient destiné à accueillir l’échantillon à tester, comprenant un tampon de lyse, incluant par exemple au moins un détergent ou un mélange de détergents, destiné à libérer les protéines de l’échantillon ; et un récipient comprenant le peptide substrat de la PLpro, marqué de manière détectable par un fluorophore.
Dans un autre mode de réalisation, tous les réactifs peuvent être contenus dans un seul compartiment, de préférence sous forme lyophilisée.
Dans un exemple particulièrement avantageux, le tampon de lyse comprenant également du Nac et du CaC .
De manière préférée, lorsque l’échantillon à tester est de la salive, c’est l’ajout de la salive qui remet en suspension l’ensemble des réactifs et initie la réaction. Le test peut ainsi être entièrement réalisé en une seule étape après prélèvement de l’échantillon. Dans un exemple préféré, G échantillon de salive est déposé sans délai dans le récipient décrit ci-avant et mis en contact instantanément avec le milieu réactionnel à température ambiante en intérieur. Le récipient est alors agité par retournement (typiquement 3 à 5 fois) et la réaction se déroule sans intervention pendant environ 15 minutes. Au bout de ce délai, le récipient est mis en contact avec le détecteur de fluorescence qui peut être de format portable ou non, dont la longueur d’onde de lecture est celle spécifique du marqueur de fluorescence sélectionné.
La lecture de la fluorescence est instantanée et donne un signal positif ou négatif en fonction du seuil de détection identifié par le peptide substrat porteur d’un fluorophore.
Les exemples et figures illustrent l’invention sans en limiter la portée.
Exemples
Exemple 1 : Détection de l’activité enzymatique de la PLpro par mesure de fluorescence
1.1. Mesure par fluorescence (substrat : ISG15-AMC)
L’activité enzymatique de la PLpro a été testée à l’aide d’une protéine substrat de l’enzyme, présentant en son extrémité C-terminale d’un fluorophore, l’aminométhyl coumarine (AMC). Plus précisément, la protéine substrat utilisée est l’ISGI 5, protéine d’environ 17 kDa pour qui l’enzyme PLpro possède une haute affinité.
Dans le but de vérifier que l’enzyme PLpro est capable de cliver le substrat ISG15-AMC, un test de suivi de fluorescence au cours du temps a été réalisé et témoigne de l’activité de l’enzyme PLpro.
La courbe de fluorescence obtenue a également permis de détecter une activité significative en un temps environ égal à 11-12 minutes.
1 .2. Influence du tampon de dilution sur l’activité de l’enzyme PLpro
L’impact du tampon de dilution sur l’activité de l’enzyme a été évalué à l’aide du suivi de la fluorescence émise au cours du temps. Trois combinaisons de tampons ont été testées (1) HEPES
(2) HEPES + NaCI
(3) HEPES + NaCI + Tris(2 carboxyethyl)phosphine (TCEP).
Les courbes de suivi de la fluorescence ont montré une augmentation de la fluorescence émise, sans différence significative entre les tampons de dilutions testés. On peut donc en conclure que le tampon de dilution n’a pas d’impact sur l’activité de l’enzyme PLpro. Exemple 2 : Détection de l’activité enzymatique de la PLpro par mesure de fluorescence (substrat : Z-RLRGG-AMC)
La mesure de fluorescence obtenue à l’exemple 1 avec le substrat ISG15-AMC a été comparée avec un autre substrat : Z-RLRGG-AMC qui permet une utilisation avantageuse à de plus fortes concentrations.
La figure 1 montre une fluorescence très augmentée pour un même rapport substrat/enzyme. La figure 2 montre les très bons résultats obtenus avec les salives de trois donneurs, en présence de PLpro externe, la réponse étant significativement détectable, dès 10 minutes de réaction. Chaque test a été répété trois fois en utilisant 50pL de salive contenant la PLP à détecter. La moyenne et les écart-types pour ces trois donneurs sont représentés sur la figure 2
Exemple 3 : Impact de la salive sur le signal de fluorescence (substrat : Z-RLRGG- AMC)
Les inventeurs ont ensuite démontré que la salive mise en contact avec le mélange réactionnel augmente de façon considérable (doublement) le signal de fluorescence (Figure 3).
La fluorescence, liée à l’activité de l’enzyme, a été mesurée en présence de salive ou de tampon HEPES.
Les courbes obtenues ont montré que l’activité enzymatique de la PLpro est augmentée en présence de salive humaine.
Exemple 4 : Dosage de l’activité enzymatique de la PLpro par mesure de fluorescence sous l’influence de différents ions.
Une mesure de fluorescence a été réalisée sur le substrat Z-RLRGG-AMC en testant l’influence de différents ions dilués dans du tampon de dilution (HEPES). Quatre ions ont ainsi été testés, apportés sous la forme de MgC , CaC , KCI et NaCI. Dans cet exemple, la PLpro est à une concentration de 10 nM et le substrat Z-RLRGG-AMC à une concentration 50mM. Du Triton X100 [0,001%] a également été ajouté pour la lyse des virus. Une normalisation de l’activité de l’enzyme a été effectuée par rapport aux témoins. La salive a également été conservée lors de la mesure de l’activité de la PLpro.
Comme le montre la Figure 4, le cation Ca2+ offre le meilleur effet de potentialisation de la récation, après 15 minutes.
Les inventeurs ont aussi testé l’influence des cations Ca2+ sur l’activité enzymatique de la PLpro à différentes concentrations de CaC (de 0,2 à 20 mM) (Figure 5). Dans cet exemple, la PLpro est à une concentration de 5 nM et le substrat Z-RLRGG-AMC à une concentration 50mM. Du triton X100 [0.001%] a également été ajouté pour la lyse des virus. L’augmentation de la concentration en ion augmente l’effet potentialisateur sur l’activité de la PLpro. Références
- Lindner, H. A., Fotouhi-Ardakani, N., Lytvyn, V., Lachance, P., Sulea, T., Ménard, R., 2005. The papain-like protease from the severe acute respiratory syndrome coronavirus is a deubiquitinating enzyme. J. Virol. 79, 15199-15208.
- Lindner, H. A., Lytvyn, V., Qi, H., Lachance, P., Ziomek, E., Ménard, R., 2007. Selectivity in ISG15 and ubiquitin récognition by the SARS coronavirus papain-like protease. Arch. Biochem. Biophys. 466, 8-14.
- Osipiuk, J., Azizi, SA., Dvorkin, S. et al. 2021.Structure of papain-like protease from SARS- CoV-2 and its complexes with non-covalent inhibitors. Nat Commun 12, 743
- Rut, W., Lv, Z., Zmudzinski, M., Patchett, S., Nayak, D., Snipas, S. J., El Oualid, F., Huang, T. T., Bekes, M., Drag, M., Olsen, S. K., 2020. Activity profiling and structures of inhibitor- bound SARS-CoV-2-PLpro protease provides a framework for anti-COVID-19 drug design. bioRxiv. - Sapkota, D., Soland, T.M., Galtung, H. K., Sand, L.P., Giannecchini, S., To, K.K.W.,
Mendes-Correa, M.C., Giglio, D., Hasséus, B., Braz-Silva, P. H., 2020. COVID-19 salivary signature: diagnostic and research opportunities. J. Clin. Pathol.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé in vitro pour déterminer si un échantillon contient un virus en réplication, ledit virus étant un virus étant un virus exprimant une protéase Papaïne-like (PLpro) et ledit procédé comprenant la détection d’une activité protéasique PLpro du virus, par i) la mise en contact de l’échantillon avec un peptide substrat de la protéase PLpro qui consiste en la séquence d’acides aminés RLRGG, et qui porte un fluorophore, et ii) la mesure de la fluorescence émise.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le virus est un coronavirus.
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le coronavirus est un SARS-CoV-2.
4. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le coronavirus est un coronavirus félin FCoV.
5. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le virus est un picornavirus.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel le picornavirus est un aphtovirus, de préférence un aphtovirus de ruminants.
7. Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, dans lequel la détection de l’activité PLpro est mise en évidence par mesure de fluorescence, ledit procédé comprenant de préférence la mise en contact de l’échantillon avec au moins un peptide substrat de la protéase PLpro porteur d’un fluorophore.
8. Procédé selon la revendication 7, comprenant la mise en contact de l’échantillon avec au moins un peptide substrat de la protéase PLpro, ledit peptide substrat portant un fluorophore à une extrémité, et un groupement protecteur à l’autre.
9. Procédé selon l’une des revendications 7 ou 8, comprenant la mise en contact de l’échantillon avec au moins ledit peptide substrat de la protéase PLpro porteur d’un fluorophore, le fluorophore étant un groupe aminométhyl coumarine (AMC), de préférence porté à l’extrémité C-terminale du peptide substrat.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel le peptide substrat est Z-RLRGG-(AMC), où (AMC) est l’aminométhyl coumarine, et Z est un groupement carboxybenzyle.
11. Procédé selon l’une des revendications 1 à 10, dans lequel l’échantillon est un échantillon de salive.
12. Procédé selon l’une des revendications 1 à 11 , dans lequel l’échantillon est mis en présence de cations divalents, de préférence de cations Ca2+.
13. Procédé in vitro pour déterminer si un sujet humain est infecté par un coronavirus et est contagieux, ledit procédé comprenant i) la mise en contact d’un échantillon biologique dudit sujet, de préférence un échantillon de salive, avec au moins un peptide substrat de la protéase PLpro, marqué de manière détectable par un fluorophore, ledit peptide consistant en la séquence RLRGG, et ii) la mesure de la fluorescence émise.
14. Kit comprenant un premier récipient comprenant un tampon de lyse; et un deuxième récipient comprenant le peptide RLRGG porteur d’un fluorophore, éventuellement assorti d’un mode d’emploi pour utiliser le kit dans un procédé tel que défini à l’une des revendications 1 à 13.
15. Kit selon la revendication 14, dans ledit premier récipient est le récipient destiné à accueillir l’échantillon à tester.
16. Kit comprenant le peptide RLRGG porteur d’un fluorophore, et un tampon de lyse, éventuellement assorti d’un mode d’emploi pour utiliser le kit dans un procédé tel que défini à l’une des revendications 1 à 13.
PCT/FR2022/051066 2021-06-04 2022-06-03 Procede de detection d'un virus en replication WO2022254164A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22734663.2A EP4347863A1 (fr) 2021-06-04 2022-06-03 Procede de detection d'un virus en replication

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR2105925A FR3123658A1 (fr) 2021-06-04 2021-06-04 Procede de detection d'un coronavirus en replication
FRFR2105925 2021-06-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022254164A1 true WO2022254164A1 (fr) 2022-12-08

Family

ID=77999040

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2022/051066 WO2022254164A1 (fr) 2021-06-04 2022-06-03 Procede de detection d'un virus en replication

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4347863A1 (fr)
FR (1) FR3123658A1 (fr)
WO (1) WO2022254164A1 (fr)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007029262A2 (fr) * 2005-09-08 2007-03-15 Mnd Diagnostic Ltd. Compositions et methodes d'utilisation de ces dernieres en vue de detecter des virus
US10962529B1 (en) * 2020-12-01 2021-03-30 King Abdulaziz University Fluorescent probe based biosensor and assay for the detection of SARS-CoV-2

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007029262A2 (fr) * 2005-09-08 2007-03-15 Mnd Diagnostic Ltd. Compositions et methodes d'utilisation de ces dernieres en vue de detecter des virus
US10962529B1 (en) * 2020-12-01 2021-03-30 King Abdulaziz University Fluorescent probe based biosensor and assay for the detection of SARS-CoV-2

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN ZINUO ET AL: "Ginkgolic acid and anacardic acid are specific covalent inhibitors of SARS-CoV-2 cysteine proteases", CELL & BIOSCIENCE, vol. 11, no. 1, 28 February 2021 (2021-02-28), XP055873052, DOI: 10.1186/s13578-021-00564-x *
LINDNER, H.A.FOTOUHI-ARDAKANI, N.LYTVYN, V.LACHANCE, P.SULEA, T.MÉNARD, R.: "The papain-like protease from the severe acute respiratory syndrome coronavirus is a deubiquitinating enzyme", J. VIROL., vol. 79, 2005, pages 15199 - 15208
LINDNER, H.A.LYTVYN, V.QI, H.LACHANCE, P.ZIOMEK, E.MÉNARD, R.: "Selectivity in ISG15 and ubiquitin récognition by the SARS coronavirus papain-like protease", ARCH. BIOCHEM. BIOPHYS., vol. 466, 2007, pages 8 - 14, XP022258753, DOI: 10.1016/j.abb.2007.07.006
OSIPIUK, J.AZIZI, SA.DVORKIN, S. ET AL.: "Structure of papain-like protease from SARS-CoV-2 and its complexes with non-covalent inhibitors.", NAT COMMUN, vol. 12, 2021, pages 743, XP055872953, DOI: 10.1038/s41467-021-21060-3
RUT, W.LV, Z.ZMUDZINSKI, M.PATCHETT, S.NAYAK, D.SNIPAS, S.J.EL OUALID, F.HUANG, T.T.BEKES, M.DRAG, M.: "Activity profiling and structures of inhibitor-bound SARS-CoV-2-PLpro protease provides a framework for anti-COVID-19 drug design", BIORXIV, 2020
SAPKOTA, D.SOLAND, T.M.GALTUNG, H.K.SAND, L.P.GIANNECCHINI, S.TO, K.K.W.MENDES-CORREA, M.C.GIGLIO, D.HASSÉUS, B.BRAZ-SILVA, P.H.: "COVID-19 salivary signature: diagnostic and research opportunities", J. CLIN. PATHOL., 2020

Also Published As

Publication number Publication date
EP4347863A1 (fr) 2024-04-10
FR3123658A1 (fr) 2022-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2789692B1 (fr) Méthode de mesure de cellules et réactif pour la mesure des cellules
US11851698B2 (en) Method for pathogen identification
US10458916B2 (en) Rapid tests for the detection of inhibitors of enzymes and human exposure to the same
WO2008104680A2 (fr) Milieu de détection et/ou d'identification de bactéries
WO2010018349A2 (fr) Milieu de culture permettant de differencier staphylococcus aureus des staphylococcus a coagulase negative
WO2022254164A1 (fr) Procede de detection d'un virus en replication
EP3094738B1 (fr) Utilisation d'au moins un substrat de carboxylestérase et/ou de triacylglycérol-lipase pour la détection des bactéries du groupe bacillus cereus
EP0815260A1 (fr) Procede de detection qualitative et quantitative de lesions de l'adn
EP1334205B1 (fr) Procede d'identification de listeria monocytogenes et milieu de culture
CN109097482B (zh) 细粒棘球绦虫线粒体nd6基因的应用
EP1137802B1 (fr) Procede de determination de l'activite d'une substance mettant en oeuvre un test fonctionnel in vitro
CA2584474A1 (fr) Atp-metrie pour detecter et denombrer les virus
FR2869908A1 (fr) Substrat peptidique reconnu par la toxine botulique de type a, bont/a et son utilisation pour detecter et/ou doser ladite toxine ou des inhibiteurs de son activite
CA3128119A1 (fr) Methode ultrasensible de detection de la mort cellulaire
FR3053339A1 (fr) Biomarqueur pour le diagnostic de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin
EP1335202B9 (fr) Procédé D'Identification de Composés Modulateurs des Neuromédiateurs
EP4244378A1 (fr) Detection d'acides nucleiques dans un echantillon biologique
EP1431401A2 (fr) Méthode de détection et/ou de quantification d'une fonction connue à partir d'un échantillon d'acides nucléiques
FR3053338A1 (fr) Biomarqueur pour le diagnostic de maladies inflammatoires
WO2015155018A1 (fr) Procédé de détection et d`identification de clostridium difficile
FR2983215A1 (fr) Dosage de la capacite de controle de c1inh
WO2013038022A1 (fr) Procede de caracterisation de bacteries, par detection de proteines non-structurales de bacteriophages

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22734663

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022734663

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022734663

Country of ref document: EP

Effective date: 20240104