CA3128119A1 - Methode ultrasensible de detection de la mort cellulaire - Google Patents

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Henrik Laurell
Eric Lacazette
Christian Touriol
Jason IACOVONI
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Toulouse III Paul Sabatier
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Toulouse III Paul Sabatier
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Abstract

L'invention concerne une méthode de détection de la mort cellulaire par l'utilisation de techniques de PCR (Polymerase Chain Reaction) : qPCR, i.e. quantitative PCR; ddPCR i.e. digital droplet PCR,...) ou toute autre technique de détection de faible quantité d'ADN (nanostring, etc...).

Description

Description Titre : Méthode ultrasensible de détection de la mort cellulaire Domaine technique [1] L'invention concerne une méthode de détection de la mort cellulaire par l'utilisation de techniques de PCR (Polymerase Chain Reaction) : qPCR, i.e.
quantitative PCR ; ddPCR i.e. digital droplet PCR,...) ou toute autre technique de détection de faible quantité d'ADN (nanostring, etc...).
Technique antérieure
[2] La mort des cellules est l'arrêt irréversible des fonctions vitales avec modification des structures au niveau cellulaire et moléculaire. Ce processus de mort cellulaire peut survenir de diverses façons relativement différentes (Gallouzzi et al., Cell Death Differ, 2018).
[3] On va principalement distinguer la mort cellulaire par apoptose, ou mort cellulaire régulée, qui se produit selon une séquence d'évènements finement régulés et initiée en réponse à un signal de mort (stress oxydatif, stress exogènes, dommages à l'ADN, infection virale,...) ou la mort cellulaire programmée intervenant dans le maintien de l'homéostasie tissulaire où chaque cellule possède une durée de vie plus ou moins déterminée.
[4] La mort par nécrose résulte quant à elle de processus cellulaires en général déclenchés accidentellement comme par exemple le gel, la chaleur, une lésion mécanique,... Le choix de la réponse par l'apoptose ou la nécrose peut également être dépendante de l'amplitude de l'agression.
[5] En terme mécanistique, lors de la mort par apoptose, on observe des altérations de la membrane, des signalisations enzymatiques (comme l'activation de protéines caspases), la condensation du noyau et du cytoplasme, une agrégation de la chromatine, des dommages mitochondriaux et la fragmentation de l'ADN nucléaire en fragments inter-nucléosomaux. De façon intéressante, la plupart des agents anti-tumoraux peuvent induire un phénomène d'apoptose.
6 PCT/FR2020/050571 [6] A l'inverse, les critères morphologiques des cellules nécrotiques sont différents. Une déstructuration de la membrane cellulaire va provoquer une entrée massive d'eau dans la cellule, une destruction des organites intracellulaires, ce qui conduit à la libération des enzymes lytiques des lysosomes et des peroxysomes entraînant la digestion de la cellule, une dégradation de l'ADN puis sa mort.
[7] Si les voies menant à la mort cellulaire par apoptose ou par nécrose, sont mécanistiquement très différentes, il a été observé dans chacune de ces voies, une dégradation de l'ADN, précédée par des cassures simple et double brin, la génération de fragments d'ADN de haut poids moléculaire, dégradés progressivement en fragments internucléosomaux (apoptose) ou de façon aléatoire (nécrose).
[8] Les méthodes de détection de l'apoptose peuvent être catégorisées selon 4 grands principes, selon qu'elles détectent i) l'altération de la membrane plasmique, ii) l'activation des caspases, iii) les dommages mitochondriaux, iv) la fragmentation de l'ADN.
[9] Concernant l'activation des caspases, il est possible de mesurer l'activité
caspase, par la fusion d'un site tétrapeptidique de clivage par les caspases à
un rapporteur fluorométrique ou luminescent (on citera le kit Caspase-Glo de la société Promega). Cette méthode a pour avantage d'être rapide, simple d'utilisation et distribuée par plusieurs fournisseurs. Cependant, cette méthode est couteuse, nécessite un spectrofluorimètre ou luminomètre et ne permet de détecter que l'apoptose Caspase-dépendante.
[10] Pour la détection de l'altération de la membrane plasmique, la détection des phosphatidylsérines exposées dans la couche externe de la membrane plasmique est également proposée par un grand nombre de fournisseurs (on citera Pacific BlueTM Annexin V de BioLegend ). Le principe est l'utilisation d'annexine V (protéine se liant spécifiquement aux phosphatidylsérines de façon calcium dépendante), couplée à différents rapporteurs (majoritairement fluorescents) permettant sa détection. L'analyse est réalisée en cytométrie en flux (FACS) ou en microscopie. Cette méthode, largement proposée, offre un choix important de fluorochromes et permet de détecter les cellules apoptotiques et nécrotiques. Cependant, cette méthode nécessite un cytomètre en flux et la quantification de l'apoptose de cellules adhérentes en cytométrie en flux est très délicate. L'utilisation de la microscopie peut permettre de pallier cette problématique. La quantification est cependant plus laborieuse. Cette méthode est donc peu adaptée aux cellules adhérentes.
[11] Parmi les méthodes détectant la fragmentation de l'ADN, on peut tout d'abord citer une méthode de visualisation de l'ADN fragmenté après électrophorèse sur gel suivie d'une révélation par un agent intercalant. Le principe consiste en l'extraction de l'ADN génomique puis la séparation des fragments par électrophorèse sur gel d'agarose (Apoptotic DNA ladder kit). Si cette méthode a l'avantage d'avoir un coût faible et de ne pas nécessiter d'appareils spécifiques et coûteux, cette méthode est extrêmement peu sensible.
[12] On citera également une méthode de quantification de l'ADN
cytoplasmique couplé à des histones, par ELISA et l'utilisation d'anticorps contre l'ADN et des histones (kit Oeil Death Detection ELISA, de la société Roche).
Cette méthode est par exemple décrite dans le brevet US5637465. Bien qu'assez simple à mettre en oeuvre, cette méthode est relativement laborieuse. Sa sensibilité, ainsi que la gamme de détection sont limitées bien que son coût soit élevé.
[13] Hooker et aL, 2012 (Nucl Acids Res, 40(15)e113) ; Hooker et aL, 2009 (J
Cell Mol Med, 13(5):948-958), et Staley et aL, 1997 (Cell Death Differ, 4:66-75) décrivent une méthode de détection de l'ADN fragmenté en utilisant une "quantitative ligation-mediated PCR" qui permet d'amplifier les fragments à
bords francs (blunt ends) formés suite à l'activation des nucléases. Cette méthode laborieuse nécessite de multiples étapes.
[14] Enfin, Botezatu et aL, 2000 (Clin Chem 46(8) :1078-1084) ; Umetani et aL, 2006 (Clin Chem 52(6) :1062-1069) ; Lou et al., Int J Mol Med 35 : 72-80) ;
Fawzy et aL, 2016 (J Egypt Natl Canc lnst, 28 : 235-242) décrivent des méthodes de détection/quantification de l'ADN génomique circulant (ou libre), et plus particulièrement la détection d'ADN génomique issu de la mort cellulaire. Ces méthodes impliquent l'amplification de séquences répétées Alu par PCR
quantitative. Dans cette méthode, les échantillons d'ADN sont des échantillons de sérum et de plasma.
[15] Il reste ainsi nécessaire de mettre au point une méthode de détection de la mort cellulaire sensible, simple et rapide, ayant un coût modéré et fonctionnant sur des cellules adhérentes ou en suspension et même sur des tissus.
Exposé de l'invention
[16] La présente invention concerne une méthode de détection de la mort cellulaire basée sur la détection de fragments d'ADN génomique d'origine nucléaire présents dans le cytoplasme cellulaire. En effet, les inventeurs ont mis au point une méthode très sensible permettant de détecter des fragments d'ADN
génomique d'origine nucléaire dans le cytoplasme.
[17] Contrairement aux méthodes de détection de fragments d'ADN par PCR
de l'état de la technique selon lesquelles les fragments d'ADN sont détectés et quantifiés dans un extrait cellulaire total (noyau + cytoplasme) ou bien dans des fluides biologiques comme le plasma, la détection se fait sur un extrait cytoplasmique. Cet extrait cytoplasmique est obtenu par incubation de l'échantillon cellulaire avec un tampon de lyse ou un tampon hypotonique afin de lyser ou perméabiliser la membrane plasmique sans perméabilisation de la membrane nucléaire.
[18] La détection à partir d'extraits cytoplasmiques permet d'obtenir une méthode plus rapide, plus simple à mettre en oeuvre et moins couteuse, comparativement aux méthodes de l'état de la technique.
[19] Les extraits cytoplasmiques correspondent à tout ou partie du contenu cytoplasmique cellulaire. Lorsque le processus de mort cellulaire est déclenché, l'extrait cytoplasmique est enrichi en ADN génomique d'origine nucléaire, par rapport à des cellules n'ayant pas enclenché le processus de mort.
[20] La détection des fragments d'ADN génomique d'origine nucléaire présents dans le cytoplasme est mesurée par amplification / détection d'une zone présente en au moins une copie dans le génome. Ainsi, ces fragments d'ADN génomique peuvent être avantageusement détectés et quantifiés dans un échantillon. La quantité de fragments d'ADN récupérés est proportionnelle à la quantité de cellules ayant enclenché le processus de mort dans l'échantillon, permettant ainsi de détecter et quantifier ce processus.
[21] La détection de fragments d'ADN génomique dans le cytoplasme, en utilisant des amorces spécifiques ciblant des séquences répétées présentes dans le génome, confère une sensibilité accrue à la méthode selon l'invention. Les résultats comparatifs obtenus confirment que la sensibilité est supérieure à
celle 5 obtenue avec des méthodes classiques existantes et déjà commercialisées.
Brève description des dessins
[22] D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l'analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1
[23] [Fig. 1] représente le niveau d'activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de cellules HepG2 obtenus en utilisant différents détergents dans la méthode selon l'invention.
Fig. 2
[24] [Fig. 2] représente le niveau d'activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de cellules OCI-AML3 obtenus en utilisant différents détergents dans la méthode selon l'invention.
Fig. 3
[25] [Fig. 3] représente le niveau d'activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de cellules OCI-AML3 obtenus en utilisant différents détergents dans la méthode selon l'invention.
Fig. 4
[26] [Fig. 4] représente le niveau d'activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de cellules MDA-MB-231 obtenus en utilisant différents détergents dans la méthode selon l'invention.
Fig. 5
[27] [Fig. 5] représente la comparaison de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par qPCR selon la présente invention par rapport à
une méthode de l'état de la technique Caspase Glo 3/7.

Fig. 6
[28] [Fig. 6] représente la comparaison de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par qPCR selon la présente invention par rapport à
une méthode de l'état de la technique la cytométrie en flux (marquage Annexine V, Iodure de propidium).
Fig. 7
[29] [Fig. 7] représente la comparaison de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par qPCR (lyse directe) selon la présente invention par rapport à la cytométrie en flux (marquage Annexine V, Iodure de propidium).
Fig. 8
[30] [Fig. 8] représente la comparaison de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par qPCR selon la présente invention par rapport à la cytométrie en flux (marquage Annexine V, Iodure de propidium).
Fig. 9
[31] [Fig. 9] représente la comparaison de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par qPCR (lyse directe) selon la présente invention par rapport à la cytométrie en flux (marquage Annexine V, Iodure de propidium).
Fig. 10
[32] [Fig. 10] représente la comparaison de la sensibilité ainsi que du seuil de saturation de la méthode de détection de mort cellulaire par qPCR selon la présente invention par rapport à la cytométrie en flux (marquage Annexine V, Iodure de propidium.
Fig.11
[33] [Fig. 11] représente la comparaison de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par qPCR selon la présente invention par rapport à la cytométrie en flux (marquage Annexine V, Iodure de propidium).
Fig. 12
[34] [Fig. 12] représente la comparaison de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par ddPCR selon la présente invention sur cellules isolées.
Fig. 13
[35] [Fig. 13] représente le niveau d'activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de différentes lignées cellulaires à l'aide d'un couple d'amorces ciblant une séquence présente en une copie par génome.
Fig. 14
[36] [Fig. 14] représente le niveau d'activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de différentes lignées cellulaires à l'aide d'un couple d'amorces ciblant une séquence présente en deux copies par génome.
Fig. 15
[37] [Fig. 15] représente le niveau d'activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques provenant de la lignée cellulaire OCI-AML3 à
l'aide de deux couple d'amorces chacun ciblant une séquence présente en une copie par génome Fig. 16
[38] [Fig. 16] démontre une augmentation de la quantité des fragments d'ADN

dans la fraction cytoplasmique obtenus après extraction avec un tampon de lyse décrit dans la méthode selon l'invention, et détectés par électrophorèse capillaire, et ceci exclusivement dans des cellules traitées par une drogue induisant leur mort (staurosporine) (MDA 50 et MDA 100) comparativement à des cellules non traitées par la staurosporine (MDA NT).
Description détaillée
[39] Les dessins et la description ci-après contiennent, pour l'essentiel, des éléments de caractère certain. Ils pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.
[40] La présente invention concerne donc une méthode de quantification de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire caractérisée en ce qu'au moins une séquence présente sur des fragments d'ADN génomique d'origine nucléaire est amplifiée à partir de l'extrait cytoplasmique dudit échantillon.
[41] Les inventeurs ont en effet avantageusement exploité la présence anormale des fragments d'ADN génomique d'origine nucléaire localisés dans le cytoplasme des cellules lors du processus de mort cellulaire. L'ADN génomique fragmenté d'origine nucléaire peut ainsi être détecté à partir d'extraits cytoplasmiques des cellules.
[42] On entend par mort cellulaire au sens de la présente invention, la mort cellulaire par apoptose et/ou la mort cellulaire par nécrose.
[43] On entend par fragments d'ADN génomique ou ADN génomique fragmenté , les fragments d'ADN d'origine nucléaire générés lors des processus de mort cellulaire.
[44] L'échantillon cellulaire peut être un échantillon de cellules en culture in vitro, telles que des cellules adhérentes, des cellules en suspension, un échantillon comprenant des cellules tumorales circulantes, un échantillon comprenant des cellules tumorales circulantes purifiées, un échantillon sanguin contenant des cellules circulantes ou tout autre échantillon tel qu'un échantillon de plasma, un échantillon d'urine, un échantillon de salive.
[45] Selon un mode de réalisation, la méthode de quantification de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire comprend :
- l'obtention d'un extrait cytoplasmique à partir d'un échantillon cellulaire ;
- l'amplification d'au moins une séquence dans ledit extrait cytoplasmique ;
- la quantification de l'ADN génomique détecté dans ledit extrait cytoplasmique.
[46] On entend par extrait cytoplasmique , la partie soluble du cytoplasme cellulaire, encore appelée cytosol, qui est récupéré après la perméabilisation spécifique de la membrane plasmique sans altération de la membrane nucléaire, suivie d'une centrifugation. L'extrait cytoplasmique et ses méthodes d'obtention sont connus de l'homme du métier et sont décrits dans l'état de la technique par exemple dans Suzuki, Keiko et al. "REAP: A two minute cell fractionation method."

BMC research notes vol. 3 294. 10 Nov. 2010, doi:10.1186/1756-0500-3-294 ou dans Gary Zieve and Sheldon Penman, Small RNA species of the HeLa cell:
Metabolism and subcellular localization Ce!!, May 1976, Pages 19-31.
[47] Typiquement, l'extrait cytoplasmique est obtenu par incubation de l'échantillon cellulaire avec un tampon de lyse ou un tampon hypotonique.
[48] L'incubation de l'échantillon avec le tampon de lyse permet avantageusement de lyser ou perméabiliser la membrane plasmique sans perméabilisation de la membrane nucléaire.
[49] Ainsi, on entend par tampon de lyse au sens de la présente invention, tout tampon permettant de lyser ou perméabiliser la membrane plasmique sans perméabilisation de la membrane nucléaire.
[50] L'homme du métier pourra choisir le tampon de lyse adéquat.
Typiquement, un détergent non-ionique pourra être utilisé, tel que décrit dans le brevet US5637465.
[51] L'homme du métier sait également comment choisir la concentration adéquate du tampon pour permettre la lyse ou la perméabilisation de la membrane plasmique sans perméabilisation de la membrane nucléaire.
[52] Typiquement, un anticorps anti-ADN pourra être utilisé par l'homme du métier pour déterminer la concentration adéquate du tampon pour permettre la lyse ou la perméabilisation de la membrane plasmique sans perméabilisation de la membrane nucléaire.
[53] Après traitement des cellules n'ayant pas enclenché le processus de mort avec des concentrations croissantes de détergents, celles-ci sont mises en présence d'un anticorps anti-ADN. L'exclusion nucléaire de cet anticorps confirme l'intégrité de la membrane nucléaire et permet ainsi de déterminer la concentration optimale de détergent. Une trop forte concentration en détergent perméabilisera la membrane nucléaire permettant à l'anticorps de pénétrer dans le noyau et ainsi de détecter l'ADN nucléaire. Cette méthode est calquée sur une méthode de détection d'une protéine à localisation nucléaire (Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Goldenthal KL, Hedman K, Chen JW, August JT, Willingham MC. J
Histochem Cytochem. 1985 Aug ; 33(8):813-20).
[54] A titre illustratif, le tampon de lyse pourra être choisi parmi l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique), l'acide 5 éthylènediaminetétraacétique, le chlorure de sodium, les saponines telles la digitonine ou la saponine, le Tween-20, NP40, le tergitol, le Triton X-100, l'Igepal CA630, l'Empigen, ou une combinaison.
[55] Selon un mode de réalisation, le tampon de lyse est un mélange d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pi pérazi ne éthane sulfonique, d'acide 10 éthylènediaminetétraacétique, de chlorure de sodium, de digitonine.
[56] Ces tampons permettent de lyser ou perméabiliser la membrane plasmique sans perméabilisation de la membrane nucléaire.
[57] Dans un mode de réalisation, le tampon de lyse est un mélange d'acide (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique à 50mM, d'acide éthylènediaminetétraacétique à 5mM, de chlorure de sodium à 150mM, et de digitonine à 50 pg/m1..
[58] Selon un mode de réalisation, l'extrait cytoplasmique pourra être obtenu par les étapes suivantes :
- incubation de l'échantillon cellulaire avec un tampon de lyse ou un tampon hypotonique.
- centrifugation ou filtration de l'échantillon cellulaire lysé.
[59] L'étape de centrifugation ou de filtration permet de séparer le surnageant du reste des débris cellulaires.
[60] La fraction de l'extrait cytoplasmique correspond à une fraction aliquote de l'extrait cytoplasmique.
[61] Selon un mode de réalisation, la fraction de l'extrait cytoplasmique pourra être obtenue par les étapes suivantes :
- incubation de l'échantillon cellulaire avec un tampon de lyse ou un tampon hypotonique ;
- centrifugation ou filtration de l'échantillon cellulaire lysé ;

- prélèvement d'une fraction aliquote de l'extrait cytoplasmique dans le surnageant obtenu après l'étape de centrifugation ou filtration.
[62] Selon un mode de réalisation, la méthode d'obtention de la fraction de l'extrait cytoplasmique pourra comprendre en outre une étape de dilution de ladite fraction aliquote prélevée, au moins 5 fois dans l'eau, préférentiellement 10 fois dans l'eau.
[63] Typiquement, l'étape de dilution pourra être appliquée lorsque la méthode de quantification est une méthode de quantification par PCR.
[64] De manière avantageuse, les inventeurs ont démontré qu'il était possible de détecter la mort cellulaire sur des extraits cytoplasmiques à l'aide d'amorces ciblant une séquence présente en une copie sur le génome nucléaire.
[65] Ainsi, et selon un mode de réalisation, la méthode de quantification de la mort cellulaire selon la présente invention est caractérisée en ce que ladite au moins une séquence est une séquence d'ADN présente en une copie sur lesdits fragments d'ADN génomique.
[66] La méthode de quantification de la mort cellulaire selon la présente invention permet également de détecter la mort cellulaire sur des extraits cytoplasmiques à l'aide d'amorces ciblant une séquence présente en plus d'une copie dans le génome nucléaire.
[67] A titre illustratif, la méthode selon la présente invention permet de détecter la mort cellulaire sur des extraits cytoplasmiques à l'aide d'amorces ciblant une séquence présente en deux copies dans le génome nucléaire.
[68] Ainsi, selon une mode de réalisation, la méthode de quantification de la mort cellulaire selon la présente invention est caractérisée en ce que ladite au moins une séquence est une séquence d'ADN présente en au moins deux copies sur lesdits fragments d'ADN génomique.
[69] La sensibilité de la méthode selon l'invention est accrue proportionnellement au nombre de séquences d'ADN répétées lorsque celles-ci sont utilisées comme marqueurs pour détecter et quantifier la quantité d'ADN
génomique cytoplasmique.
[70] Selon un mode de réalisation, la méthode de quantification de la mort cellulaire selon la présente invention est caractérisée en ce que ladite au moins une séquence est une séquence d'ADN répétée.
[71] Typiquement, l'ADN génomique inclut des séquences répétées qui pourront être des petits éléments nucléaires intercalés (SINE pour Short lnterspersed Nuclear Elements) ou des longs éléments nucléaires intercalés (LINE
pour Long lnterspersed Nuclear Elements).
[72] Parmi les SINE, les séquences Alu, MIR, MI R3 pourront être choisies.
[73] Parmi les LIN E, les séquences LINE1 pourront être choisies.
[74] Ainsi, et selon un mode de réalisation, la méthode de quantification de la mort cellulaire selon la présente invention est caractérisée en ce que ladite au moins une séquence d'ADN répétée est choisie parmi les SINE tels que Alu, MIR, MIR3 et les LINE tels que LINE1.
[75] Les inventeurs ont également démontré qu'il est possible de détecter la mort cellulaire sur des extraits cytoplasmiques à l'aide de plusieurs couples d'amorces, chaque couple d'amorces ciblant une séquence d'ADN présente dans le génome nucléaire.
[76] Ainsi, selon un mode de réalisation, la méthode de quantification de la mort cellulaire selon la présente invention est caractérisée en ce que plusieurs séquences différentes sont amplifiées simultanément.
[77] L'homme du métier pourra utiliser tout type de technique permettant de détecter et quantifier les séquences de l'ADN génomique.
[78] La détection/quantification des fragments d'ADN génomique pourra être réalisée par des techniques de PCR quantitative ou toute autre technique de détection de faible quantité d'ADN connues de l'Homme du métier.
[79] Selon un mode de réalisation, la quantification et la détection d'ADN
génomique fragmenté est réalisée par PCR quantitative (qPCR). Le principe de la qPCR repose sur la possibilité de déterminer la quantité de matrice d'ADN
présente dans un échantillon en temps réel à l'aide d'un agent intercalant ou d'une sonde (Taqman,0). La fluorescence émise est directement propositionnelle à la quantité d'amplicons générés pendant la réaction PCR.
[80] L'homme du métier pourra utiliser tout appareil pour mettre en oeuvre la technique de qPCR. A titre illustratif, le lecteur de PCR en temps réel Light Cycler 480 system de la société Roche pourra être utilisé.
[81] Ainsi, la méthode de quantification de la mort cellulaire selon la présente invention est caractérisée en ce que la détection/quantification est réalisée par qPCR.
[82] Selon un mode de réalisation, la quantification des fragments d'ADN
génomique est réalisée par digital droplet PCR (ddPCR). La ddPCR est une PCR
par micro-fluidique basée sur le partitionnement de chaque échantillon dans 20000 gouttelettes de 1 nL.
[83] Selon un mode de réalisation, la quantification des fragments d'ADN
génomique est réalisée par la technologie Nanostring. Le principe du Nanostring repose sur deux étapes clés. En amont, deux sondes sont conçues spécifiquement pour chaque cible d'intérêt. L'une des sondes, appelée sonde de capture, est couplée à une biotine, qui sera utilisée pour immobiliser les molécules d'intérêt sur un support dédié au comptage. La deuxième sonde, appelée rapporteur , est spécifique de la molécule d'intérêt. Elle contient une succession de 6 fluorochromes de 4 couleurs différentes, dont l'arrangement définit un code-barres qui sera propre à chaque molécule d'intérêt. C'est ce code-barres qui va permettre l'ultra-sensibilité de cette technique et donc la possibilité
d'analyser du matériel biologique en faible quantité (Plateforme Nanostring LABEX DEEP).
[84] Selon un mode de réalisation, la quantification des fragments d'ADN
génomique est réalisée par PCR multiplexe ou multiplexage. Pour la mise en oeuvre d'une PCR multiplexe, un set de plusieurs couples d'amorces sera utilisé
de manière à amplifier simultanément plusieurs séquences présentes dans le génome.
[85] Selon un mode de réalisation, une séquence unique est détectée et quantifiée en utilisant par exemple l'amorce sens 5' CGCCTGGATCATGTCAAGTCA 3' (SEQ ID NO: 1) et l'amorce anti-sens 5' AGGCTAAGTTAGGGCCTCTGC 3' (SEQ ID NO: 2) ou l'amorce sens 5' AACATAAGCTGAGGCCAGCCT 3' (SEQ ID NO: 3) et l'amorce anti-sens 5' GTGTCTACTGCCAACCTGTGC 3' (SEQ ID NO : 4).
[86] Selon un mode de réalisation, une séquence présente en deux copies est détectée et quantifiée en utilisant l'amorce sens 5' TCTCCACAACACTTAGTGGACAGT 3' (SEQ ID NO: 5) et l'amorce anti-sens 5' AGAGGAGGTGGTAGCTGGAGA 3' (SEQ ID NO : 6).
[87] Selon un mode de réalisation, un multiplexage peut-être réalisé en utilisant simultanément par exemple le couple d'amorces SEQ ID NO : 1 et SEQ
ID NO : 2 avec le couple d'amorces SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO :4..
[88] Selon un mode de réalisation, la séquence Alu est détectée et quantifiée en utilisant l'amorce sens 5' AGGTGAAACCCCGTCTCTACT 3' (SEQ ID NO: 7) et l'amorce anti-sens 5' CCATTCTCCTGCCTCAGCCT 3' (SEQ ID NO : 8).
[89] Selon un mode de réalisation, la séquence LINE1 est détectée et quantifiée en utilisant l'amorce sens 5' GTCAGTGTGGCGATTCCTCAG 3' (SEQ
ID NO: 9) et l'amorce anti-sens 5' AGTAATGGGATGGCTGGGTCAA 3' (SEQ ID
NO: 10) ou en utilisant l'amorce sens 5' AACAACAGGTGCTGGAGAGGA 3' (SEQ ID NO: 11) et l'amorce anti-sens 5' ATCGCCACACTGACTTCCACA 3' (SEQ ID NO :12).
[90] Selon un mode de réalisation, la quantité d'acide nucléique amplifié
dans ledit échantillon d'acide nucléique sera comparée à la quantité d'acide nucléique amplifié d'un échantillon contrôle.
[91] On entend par échantillon contrôle , un échantillon cellulaire dans lequel le processus de mort cellulaire n'est pas enclenché.
[92] Typiquement, une augmentation de la quantité d'acide nucléique amplifié
dans ledit échantillon par comparaison à la quantité d'acide nucléique amplifié
de l'échantillon contrôle est indicatif de la mort cellulaire.
[93] La quantification de la mort cellulaire par la détection de fragments d'ADN
dans le cytoplasme de cellules selon la présente invention permet de diagnostiquer une pathologie, de suivre les effets d'un traitement sur la mort cellulaire, d'obtenir un pronostic de la pathologie, de réaliser un criblage de composés, d'optimiser des conditions de culture cellulaire.
[94] Ainsi, la présente invention concerne également une méthode de suivi de l'efficacité et/ou de l'effet d'un traitement sur la mort cellulaire comprenant la 5 détection de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire par la méthode selon la présente invention.
[95] La méthode s'applique à des conditions in vitro, in vivo et ex vivo.
[96] Typiquement, la présente invention peut permettre le suivi de la réponse d'un patient au traitement. La détection et la quantification de la mort cellulaire 10 sont indicatives de l'efficacité ou non du traitement. La quantité d'acide nucléique amplifié de l'échantillon provenant du patient peut être comparée à la quantité
d'acide nucléique amplifié d'un échantillon contrôle, ledit échantillon contrôle pouvant être un échantillon du patient obtenu avant administration du traitement ou un échantillon provenant d'un sujet non atteint de la pathologie.
Généralement, 15 une augmentation de la quantité d'acide nucléique amplifié est synonyme d'efficacité de traitement, tandis que l'absence de variation significative peut être synonyme d'échec du traitement.
[97] La présente invention concerne également une méthode de diagnostic d'une pathologie impliquant un processus de mort cellulaire comprenant la détection de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire par la méthode selon la présente invention.
[98] Typiquement, le niveau d'activation de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire serait indicatif d'une pathologie impliquant un processus de mort cellulaire. La quantité d'acide nucléique amplifié de l'échantillon provenant du patient peut être comparée à la quantité d'acide nucléique amplifié d'un échantillon contrôle, ledit échantillon contrôle pouvant être un échantillon provenant d'un sujet non atteint de la pathologie.
[99] La présente invention concerne également une méthode de pronostic d'une pathologie impliquant un processus de mort cellulaire comprenant la détection de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire par la méthode selon la présente invention.
[100] La présente invention concerne également une méthode de criblage de composés comprenant :
- le traitement d'un échantillon cellulaire avec un ou plusieurs composés ;
- la détection de la mort cellulaire dans ledit échantillon par la méthode selon la présente invention.
[101] La méthode selon l'invention permettra de déterminer le ou les composés permettant de déclencher la mort cellulaire.
[102] La présente invention a également pour objet un kit pour la détection de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire comprenant :
- un tampon de lyse ou un tampon hypotonique apte à spécifiquement lyser ou perméabiliser la membrane plasmique ;
- au moins une paire d'amorces amplifiant de l'ADN génomique.
[103] Le tampon de lyse permet avantageusement de lyser ou perméabiliser la membrane plasmique sans perméabilisation de la membrane nucléaire.
[104] Le tampon de lyse et les amorces sont tels que ci-avant décrits.
[105] L'échantillon cellulaire pourra être choisi parmi un échantillon de cellules en culture in vitro, telles que des cellules adhérentes, des cellules en suspension, un échantillon comprenant des cellules tumorales circulantes, un échantillon comprenant des cellules tumorales circulantes purifiées, un échantillon sanguin contenant des cellules circulantes ou tout échantillon comprenant des cellules ayant enclenché un processus de mort cellulaire tel qu'un échantillon de plasma, un échantillon d'urine, un échantillon de salive.
[106] Avantageusement également, les amorces seront spécifiques de l'espèce étudiée.
Exemples
[107] Dans les exemples qui suivent, les matériels et méthodes ci-après détaillés ont été utilisés :
[108] Méthode Afin de mesurer la mort cellulaire dans un échantillon donné, un protocole a été
développé.
[109] A partir de cellules traitées ou non par différentes drogues déclenchant leur mort, les cellules sont lysées à l'aide d'un tampon afin de libérer dans le milieu les petits fragments d'ADN résultant de sa dégradation.
[110] Une étape de centrifugation ou de filtration permet de séparer le surnageant contenant les fragments d'ADN issus de sa dégradation du reste des débris cellulaires. Une fraction aliquote du surnageant est prélevée, i.e., la fraction d'extrait cytoplasmique, qui sera éventuellement diluée en fonction de la méthode de quantification de la mort cellulaire utilisée. Ensuite, une PCR est réalisée sur les échantillons à l'aide d'amorces amplifiant spécifiquement des séquences répétées dispersées tout au long du génome, ou à l'aide d'amorces ciblant une séquence en une copie ou deux copies sur le génome.
[111] Alternativement, la méthode de quantification de la mort cellulaire pourra être réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de cellules lysées directement dans le milieu de culture.
[112] A l'issue de la méthode de quantification de la mort cellulaire, les résultats sont analysés de manière relative à une condition contrôle prédéterminée. Le résultat final peut-être obtenu en deux à trois heures.
[113] Amorces
[114] Amorces permettant la détection et la quantification d'une séquence unique:
5' CGCCTGGATCATGTCAAGTCA 3' (SEQ ID NO :1) et 5' AGGCTAAGTTAGGGCCTCTGC 3' (SEQ ID NO :2) ou 5' AACATAAGCTGAGGCCAGCCT 3' (SEQ ID NO :3) et 5' GTGTCTACTGCCAACCTGTGC 3' (SEQ ID NO : 4).
[115] Amorces permettant la détection et la quantification d'une séquence présente en deux copies par génome :
5' TCTCCACAACACTTAGTGGACAGT 3' (SEQ ID NO :5) et 5' AGAGGAGGTGGTAGCTGGAGA 3' (SEQ ID NO : 6).
[116] Amorces permettant la détection et la quantification de la séquence répétée Alu :

5' AGGTGAAACCCCGTCTCTACT 3' (SEQ ID NO :7) 5' CCATTCTCCTGCCTCAGCCT 3' (SEQ ID NO : 8).
[117] Amorces permettant la détection et la quantification de la séquence répétée LINE1 :
5' GTCAGTGTGGCGATTCCTCAG 3' (SEQ ID NO :9) et 5' AGTAATGGGATGGCTGGGTCAA 3' (SEQ ID NO :10) ou 5' AACAACAGGTGCTGGAGAGGA 3' (SEQ ID NO :11) et 5' ATCGCCACACTGACTTCCACA 3' (SEQ ID No :12).
[118] Culture cellulaire
[119] Les cellules OCI-AML3 (en suspension) sont issues de leucémie aiguë
myéloïde. Elles sont cultivées dans du milieu RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) supplémenté en Pénicilline-Streptomycine (Sigma-Aldrich) et 10% Sérum de Veau Foetal (SVF - Gibco) à 37 C avec 5 % de CO2.
[120] Les cellules HepG2 (adhérentes) sont issues de carcinome de foie humain. Elles sont cultivées dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium ¨

High Glucose (DMEM ¨ Sigma-Aldrich) supplémenté en Pénicilline-Streptomycine (Sigma-Aldrich) et 10% Sérum de Veau Foetal (SVF - Gibco) à 37 C avec 5 % de CO2.
[121] Les cellules MDA-MB-231 (adhérentes) sont des cellules épithéliales de tumeur mammaire. Elles sont cultivées dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium ¨ High Glucose (DMEM ¨ Sigma-Aldrich) supplémenté en Pénicilline-Streptomycine (Sigma-Aldrich) et 10% Sérum de Veau Foetal (SVF - Gibco) à
37 C avec 5 % de CO2.
[122] Les cellules MOLM14 (en suspension) sont issues de leucémie aiguë
myéloïde. Elles sont cultivées dans du milieu RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) supplémenté en Pénicilline-Streptomycine (Sigma-Aldrich) et 10% Sérum de Veau Foetal (SVF - Gibco) à 37 C avec 5 % de CO2.
[123] Les cellules HeLa ont été cultivées dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium ¨ Low Glucose (DMEM ¨ Sigma-Aldrich) supplémenté en Pénicilline-Streptomycine (Sigma-Aldrich) et 10% Sérum de Veau Foetal (SVF -Gibco) à 37 C avec 5 % de CO2.
[124] Ensemencement et traitement
[125] Les cellules en suspension (ex : OCI-AML3) sont ensemencées à 200 000 cellules/mL dans une plaque 6 puits. Les cellules sont ensuite traitées ou non avec différentes drogues, à différentes concentrations et incubées pendant 16 heures.
[126] Les cellules adhérentes sont ensemencées entre 20 000 et 30 000 cellules/puits (ex: MDA-MB-231, HepG2) en plaque 48 puits dans 250 pt de milieu. Les cellules sont ensuite traitées ou non avec différentes drogues, à
différentes concentrations et incubées pendant 24 heures.
[127] qPCR
[128] Pour la mise en oeuvre de la qPCR, la fraction cytoplasmique obtenue sera diluée 10 fois dans l'eau.
Le kit utilisé est le SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Takara). Les échantillons ont été préalablement dilués au 1/10e dans de l'eau. Une fois le Master Mix préparé
(tel que décrit tableau ci-dessous), 6 L sont distribués dans chaque puits de la plaque PCR. Ensuite 4pL d'échantillon sont ajoutés. La PCR est réalisée dans le lecteur de PCR en temps réel Light Cycler 480 system (Roche). Le programme d'amplification est le suivant : 95 C pendant 30 secondes, suivi de 40 cycles décomposés en deux étapes de 95 C pendant 5 secondes et 60 C pendant 20 secondes.
[129] [Tableau 1]
Préparation du Master Mix (MM) Volume Réactifs Concentration Concentration pour Sauce-mère Finale 1 Réaction ( L) Ex taq II 2x mix 2 x 1 x 5,00 Primer F-R 10 300 0,30 ROX 50X 0,12 H20 0,58 Volume total (pl) 6,00
[130] Caspase Glo
[131] Des cellules non traitées (NT) ou ayant subi un traitement (TTT) afin d'induire la mort cellulaire ont été utilisées pour ces essais. Dans chacune des 5 conditions NT et TTT, 100 000 ¨ 10 000 ¨ 1 000 ¨ 100 ou 10 cellules sont transférées dans une plaque 96 puits dans 50 .1_ de milieu (en triplicats).
Ensuite 50 pL de réactif Caspase Glo 3/7 sont ajoutés. Après 1 heure d'incubation, l'émission lumineuse issue du clivage du substrat par les caspases 3 et 7 est déterminée à l'aide d'un luminomètre.
10 [132] Marquage Annexin V / Iodure de Propidium (IF) - Biolegend [133] Des cellules non traitées (NT) et ayant subi un traitement (TTT) afin d'induire la mort cellulaire ont été utilisées pour ces essais.
[134] Les cellules sont lavées avec du PBS puis resuspendues dans du Binding Buffer 1X à la concentration de 1.106ce11u1e5/mL. 10 .1_ Annexin V Pacific Blue et 15 10 pL d'Iodure de propidium (Kit Biolegend) sont rajoutés à 200pL de cette suspension cellulaire qui est ensuite incubée pendant 15 min à l'obscurité et à
température ambiante. Après une centrifugation à 300 g pendant 5 min, le surnageant est aspiré délicatement et 500pt de Binding Buffer 1X sont ajoutés.
[135] Ces cellules sont ensuite utilisées en cytométrie en flux, pour déterminer 20 l'effet du traitement et le nombre de cellules en apoptose. Ces cellules sont triées en fonction de leurs statuts en Annexine V et Iodure de propidium afin de réaliser ensuite une PCR.
[136] ddPCR (pour digital droplet PCR) [137] Chaque réaction de ddPCR est effectuée de façon optimale dans environ 20 000 gouttelettes de lnL de volume.
[138] Echantillons et préparation du mix ddPCR.
Des extraits cytoplasmiques issus de cellules non-traitées et traitées afin d'induire la mort cellulaire ont été utilisés comme échantillons.

[139] Un mix réactionnel de ddPCR (24pL), nécessite 11pL de 2X EvaGreen ddPCR Supermix (Bio-Rad), 0,22pL d'amorces (sens et anti-sens chacun à
200nM final), 4pL d'échantillon et 6,78pL d'eau.
[140] Génération des gouttelettes Les gouttelettes sont générées par le 0X200 DropletGenerator (Bio-Rad) en émulsionnant 20pL de mix ddPCR et 20pL d'huile dans les puits de cartouches DG8 (Bio-Rad). Puis le mélange gouttelettes/huile est transféré dans une plaque 96 puits qui est scellée par PX1 PCR Plate Sealer (Bio-Rad).
[141] Amplification L'amplification est réalisée dans un thermocycleur T100 (Bio-Rad) en suivant le programme : Activation de l'enzyme : 95 C pendant 5 min ; 40 cycles :
dénaturation à 95 C pendant 30 s puis extension à 60 C pendant 1 min.
Stabilisation du signal : 4 C pendant 5 min puis 90 C pendant 5 min.
[142] Lecture des gouttelettes La plaque est ensuite lue par le 0X200 Droplet Reader (Bio-Rad). Les résultats sont ensuite exportés et les données analysées avec le logiciel QuantaSoft (Bio-Rad).
[143] Exemple 1 : Détection de la mort cellulaire sur des cellules adhérentes en culture (HepG2 et MDA-MB-231) ou des cellules en suspension (OCI-AML3) [144] Cellules adhérentes en culture HepG2 [145] La Figure 1 représente le niveau d'activation de la mort cellulaire réalisé
sur des extraits cytoplasmiques de cellules HepG2 obtenus en utilisant des tampons de lyse différents dans la méthode selon la présente invention.
[146] 30000 cellules sont ensemencées, puis traitées ou non durant 18h avec lp.M de doxorubicine. Les cellules sont ensuite lysées dans un tampon contenant différents détergents : Tween-20 0,075%, Triton X-100 0,0075%, Empigen 0,037%
et Tergitol 0,33%. Les extraits cytoplasmiques sont centrifugés, puis une fraction du surnageant est prélevée et diluée (10x) dans de l'eau. La qPCR est ensuite réalisée sur ladite fraction.

[147] Le couple d'amorces de SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO : 10 a été utilisé sur les fractions d'extraits cytoplasmiques obtenues après lyse des cellules avec le Tergitol 0,33%. Le couple d'amorces de SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO :8 a été
utilisé sur les fractions d'extraits cytoplasmiques obtenues après lyse des cellules avec le Tween-20 0,075%, le Triton X-100 0,0075% et Empigen 0,037%.
[148] Cellules en suspension OCI-AML3 [149] La Figure 2 représente le niveau d'activation de la mort cellulaire réalisé
sur des extraits cytoplasmiques de cellules OCI-AML3 obtenus en utilisant différents détergents dans la méthode selon la présente invention.
[150] Les cellules sont traitées ou non durant 18h avec 1 M de doxorubicine.
Après centrifugation de 5 000 cellules celles-ci sont lysées dans un tampon contenant différents détergents : Tergitol 0,1%, Empigen 0,1%, Digitonine 1504/ml, NP40 0,1%. La qPCR est ensuite réalisée sur des fractions d'extraits cytoplasmiques en utilisant le couple d'amorces de SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO:
10.
[151] La Figure 3 représente le niveau d'activation de la mort cellulaire réalisé
sur des extraits cytoplasmiques de cellules OCI-AML3 obtenus en utilisant un tampon de lyse réalisé avec différents détergents dans la méthode selon la présente invention.
[152] 5000 cellules sont traitées ou non durant 18h avec 1 M de doxorubicine puis directement lysées dans un tampon contenant différents détergents :
Tergitol 0,1%, NP40 0,5%, Triton X-100 0,01%, Digitonine 50 g/mL. La qPCR est ensuite réalisée sur des fractions d'extraits cytoplasmiques en utilisant le couple d'amorces de SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8. Les résultats de l'expérience présentée sont des moyennes de trois expériences indépendantes.
[153] Cellules adhérentes en culture MDA-MB-231 [154] La Figure 4 représente le niveau d'activation de la mort cellulaire réalisé
sur des extraits cytoplasmiques de cellules MDA-MB-231 obtenus en utilisant un tampon de lyse réalisé avec différents détergents dans la méthode selon la présente invention.

[155] 20000 cellules sont traitées ou non durant 18h avec luM de doxorubicine puis directement lysées dans un tampon contenant différents détergents :
Tergitol 0,1%, lgepal CA630 0,5%, Triton X-100 0,01% et Tween-20 0,5%. La qPCR est ensuite réalisée sur des fractions d'extraits cytoplasmiques en utilisant le couple d'amorces de SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8.
[156] La méthode selon la présente invention permet avantageusement de détecter la mort cellulaire et ainsi de mesurer son niveau d'activation dans des échantillons de cellules adhérentes et de cellules en suspension.
[157] Exemple 2: Détermination de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par PCR selon la présente invention par rapport à la méthode Caspase qlo 3/7 de l'état de la technique [158] Des cellules MOLM14 sont traitées durant 16h avec 1pM d'étoposide. La mort cellulaire est déterminée sur un échantillon de cellules allant de 10 à

cellules en utilisant la technique du Caspase Glo. En parallèle, une qPCR est réalisée sur un extrait cytoplasmique provenant d'un nombre identique de cellules (de 10 à 10 000 cellules) avec le couple d'amorces de SEQ ID NO : 7 et SEQ ID
NO : 8. Les résultats de l'expérience présentée dans la Figure 5 sont des moyennes de trois expériences indépendantes.
[159] La comparaison de la méthode selon la présente invention avec une méthode de l'état de la technique (Caspase Glo), permet de mettre avantageusement en évidence la meilleure sensibilité et un seuil de détection inférieur de la méthode selon la présente invention.
[160] Exemple 3: Détermination de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire selon la présente invention par rapport à la cvtométrie en flux (marquage Annexine V. Iodure de propidium) de l'état de la technique [161] Cellules OCI-AML3 traitées ou non avec des concentrations croissances d'étoposide [162] qPCR sur un extrait cytoplasmique issu de cellules lysées après centrifugation.

[163] Des cellules OCI-AML3 sont traitées ou non (NT) durant 16h avec des concentrations croissantes d'étoposide (0 - 7,5 - 15 ou 30 M).
[164] Les cellules sont marquées à l'aide du Kit Pacific BlueTM Annexin V
(Biolegend) selon les recommandations du fournisseur, puis analysées par cytométrie en flux (MACSQuant VYB - MiltenyiBiotec). Le pourcentage de cellules apoptotiques (annexine V) positives est déterminé.
[165] En parallèle, une qPCR est réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de 10000 cellules lysées après centrifugation avec le couple d'amorces de SEQ ID
NO :9 et SEQ ID NO : 10. Les résultats sont présentés dans la Figure 6.
[166] qPCR réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de cellules lysées directement dans le milieu de culture.
[167] Des cellules OCI-AML3 sont traitées ou non (NT) durant 16h avec des concentrations croissantes d'étoposide (0 - 7,5 - 15 ou 30 M).
[168] Les cellules sont marquées à l'aide du Kit Pacific BlueTM Annexin V
(Biolegend) selon les recommandations du fournisseur, puis analysées par cytométrie en flux (MACSQuant VYB ¨ Milteny iBiotec). Le pourcentage de cellules apoptotiques (Annexine V) positives est déterminé.
[169] En parallèle, une PCR est réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de 10000 cellules lysées directement dans le milieu de culture après centrifugation, avec le couple d'amorces de SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO : 10. Les résultats sont présentés dans la Figure 7.
[170] Cellules OCI-AML3 traitées ou non avec des concentrations croissances de Bortezomib [171] qPCR sur un extrait cytoplasmique issu de cellules lysées après centrifugation.
[172] Des cellules OCI-AML3 sont traitées ou non (NT) durant 16h avec des concentrations croissantes de Bortezomib (0- 0,125 ou 0,25 M).
[173] Les cellules sont marquées à l'aide du Kit Pacific BlueTM Annexin V
(Biolegend) selon les recommandations du fournisseur, puis analysées par cytométrie en flux (MACSQuant VYB - MiltenyiBiotec). Le pourcentage de cellules apoptotiques (Annexine V) positives est déterminé.
[174] En parallèle, une PCR est réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de 10000 cellules lysées après centrifugation avec le couple d'amorces de SEQ ID
5 NO :9 et SEQ ID NO : 10. Les résultats sont présentés dans la Figure 8.
[175] qPCR réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de cellules lysées directement dans le milieu de culture [176] Des cellules OCI-AML3 sont traitées ou non (NT) durant 16h avec des concentrations croissantes de Bortezomib (0- 0,125 ou 0,25 M).
10 [177] Les cellules sont marquées à l'aide du Kit Pacific BlueTM Annexin V
(Biolegend) selon les recommandations du fournisseur, puis analysées par cytométrie en flux (MACSQuant VYB - MiltenyiBiotec). Le pourcentage de cellules apoptotiques (Annexine V) positives est déterminé.
[178] En parallèle, une PCR est réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de 15 10000 cellules lysées directement dans le milieu de culture après centrifugation, avec le couple d'amorces de SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO : 10. Les résultats sont présentés dans la Figure 9.
[179] Cellules MOLM14 traitées ou non avec des concentrations croissances d'Etoposide 20 [180] qPCR sur un extrait cytoplasmique issu de cellules lysées après centrifugation [181] Des cellules MOLM14 sont traitées ou non (NT) durant 16h avec des concentrations croissantes d'étoposide (0 ¨ 0,62 - 1,25 ¨ 2,5 ¨ 5 ou 10 M).
[182] Les cellules sont marquées à l'aide du Kit Pacific BlueTM Annexin V
25 (Biolegend) selon les recommandations du fournisseur, puis analysées par cytométrie en flux (MACSQuant VYB - MiltenyiBiotec). Le pourcentage de cellules apoptotiques (annexine V) positives est déterminé.
[183] En parallèle, une PCR est réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de 10000 cellules lysées après centrifugation, avec le couple d'amorces de SEQ ID

NO : 7 et SEQ ID NO : 8.

[184] La sensibilité de la méthode par PCR selon la présente invention est beaucoup plus importante que la cytométrie en flux. De plus, la méthode par cytométrie en flux arrive à un palier de détection à partir de la concentration de 2,5 pM d'étoposide, ce qui n'est pas le cas pour la méthode PCR. Les résultats sont présentés dans la Figure 10.
[185] La comparaison de la méthode selon la présente invention avec une méthode de l'état de la technique (marquage Annexine V, Iodure de propidium), permet de mettre avantageusement en évidence la meilleure sensibilité et une moindre saturabilité de la méthode selon la présente invention.
[186] La méthode permet également de détecter la mort cellulaire directement après lyse dans le milieu de culture, et ce de manière beaucoup plus sensible qu'avec les techniques de l'art antérieur.
[187] Cellules OCI-AML3 traitées avec 1 M de doxorubicine [188] Des cellules OCI-AML3 sont traitées ou non durant 16h avec 1pM de doxorubicine.
[189] Les cellules sont marquées à l'aide du Kit Pacific BlueTM Annexin V
(Biolegend). 1000 cellules doublement négatives (population dn ¨ Annexine V
négatives ¨ Iodure de propidium négatives) traitées ou non-traitées sont triées.
Ces résultats sont représentés dans la Figure 11A.
[190] Une PCR est réalisée sur un extrait cytoplasmique provenant de ces 1000 cellules (AV-/1F-) traitées (TTT) ou non traitées (NT), en utilisant le couple d'amorces de SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10. Les résultats de l'expérience présentée sont des moyennes de trois expériences indépendantes. Les résultats sont présentés dans la Figure 11B.
[191] II apparait que la méthode selon la présente invention permet de détecter l'apparition de la mort cellulaire sur des cellules considérées comme doublement négative au marquage Annexine V / Iodure de Propidium par le test de l'état de la technique au vu du seuil de sensibilité en faveur de la présente invention. La présente invention permet une détection plus précoce de la mort cellulaire que par le test standard de l'état de la technique.

[192] Cellules isolées [193] Des cellules MOLM14 sont traitées ou non durant 16h avec 2,5 M
d'étoposide.
[194] Les cellules sont marquées à l'aide du Kit Pacific BlueTM Annexin V
(Biolegend). Pour chaque sous-population 1 cellule est triée et une ddPCR
(digital droplet) est réalisée sur un extrait cytoplasmique en utilisant le couple d'amorces de SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10. Le niveau d'activation de la mort cellulaire est déterminé et comparé avec les signaux obtenus à partir de l'extrait cytoplasmique d'une cellule non-traitée négative au marquage Iodure de propidium/ Annexine V.
[195] Les résultats tels que présentés dans la Figure 12 représentent la moyenne des résultats obtenus avec 5-6 cellules.
[196] La méthode selon l'invention permet de détecter la mort cellulaire sur un échantillon d'une cellule et offre ainsi une sensibilité optimisée par rapport aux méthodes de l'état de la technique.
[197] Exemple 4: Détection de la mort cellulaire réalisée sur des extraits cytoplasmiques de différentes lignées cellulaires à l'aide d'amorces ciblant une séquence présente en une copie ou en deux copies sur le génome.
[198] La Figure 13 représente le niveau d'activation de la mort cellulaire réalisé
sur des extraits cytoplasmiques des lignées cellulaires indiquées sur l'axe des abscisses (MDA-MB-231, Molm14, HeLa, OCI-AML3).
[199] Les cellules MDA-MB-231 sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 24h avec 200nM de staurosporine. Les cellules Molm14 sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 16h avec 0,5 M de doxorubicine. Les cellules HeLa sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 24h avec 400nM de staurosporine. Les cellules OCI-AML3 sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 16h avec 11.1.M de doxorubicine.
Après action du tampon de lyse, la qPCR est réalisée sur les extraits cytoplasmiques, dilués 10 fois, en utilisant le couple d'amorces de SEQ ID NO
:1 et SEQ ID NO : 2.

[200] La Figure 14 représente le niveau d'activation de la mort cellulaire réalisé
sur des extraits cytoplasmiques des lignées cellulaires indiquées sur l'axe des abscisses (MDA-MB-231, Molm14, HeLa, OCI-AML3).
[201] Les cellules MDA-MB-231 sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 24h avec 200nM de staurosporine. Les cellules Molm14 sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 16h avec 0,5 M de doxorubicine. Les cellules HeLa sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 24h avec 400nM de staurosporine. Les cellules OCI-AML3 sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 16h avec 11.1.M de doxorubicine.
Après action du tampon de lyse et la centrifugation, la qPCR est réalisée sur les extraits cytoplasmiques, dilués 10 fois, en utilisant le couple d'amorces de SEQ ID
NO :5 et SEQ ID NO :6 [202] Avantageusement, la méthode selon l'invention permet de détecter la mort cellulaire par la détection et l'amplification d'une séquence d'ADN présente en une copie sur le génome.
[203] Exemple 5: Détection de la mort cellulaire réalisée sur des extraits cytoplasmiques par multiplex [204] La Figure 15 représente le niveau d'activation de la mort cellulaire réalisé
sur des extraits cytoplasmiques de lignée cellulaire OCI-AML3.
[205] Les cellules sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 24h avec 10 M
d'aracytine. Après centrifugation les cellules sont lysées. La qPCR est ensuite réalisée sur les extraits cytoplasmiques, dilués 10 fois, en utilisant simultanément le couple d'amorces de SEQ ID : NO : 1 et SEQ ID NO : 2 avec le couple d'amorces de SEQ ID : NO : 3 et SEQ ID NO :4.
[206] La méthode de détection de la mort cellulaire selon la présente invention peut avantageusement être mise en oeuvre par une technique de multiplexage.
[207] Ainsi, et de manière avantageuse, les inventeurs ont mis au point une méthode de détection de la mort cellulaire sensible, simple et rapide, ayant un coût modéré et fonctionnant sur des cellules adhérentes ou en suspension.
Cette méthode possède une sensibilité accrue, un seuil de détection très inférieur, et une moindre saturabilité par rapport aux méthodes de l'état de la technique.

[208] Exemple 6: détection de la présence de fragments d'ADN dans la fraction cytoplasmique obtenus après extraction avec un tampon de lyse décrit dans la méthode selon l'invention, et détectés par électrophorèse capillaire dans des cellules traitées par une drogue induisant leur mort (staurosporine) ou non (NT) [209] Les cellules MDA-MB-231 ont été ensemencées dans 6 T175 à raison de 3 millions de cellules pour 35mL de milieu DMEM high glucose (10% SVF, PIS).
Le lendemain les MDA-MB-231 ont été traitées par 50nM et 100nM de staurosporine. Le milieu des 2 T175 non traitées a été changé. Après 24h de traitement, les cellules MDA-MB-231 ont été lysées avec 2mL de Tampon de lyse ajoutés dans les T175 pendant 15 min à température ambiante, puis, les 2 mL
ont été transférés dans un tube et centrifugés à 2000g pendant 5 min. Ensuite, le surnageant a été traité à la RNaseA (20 ilg/mL) puis à la Proteinase K
(utilisation à 10Oug/mL), et placé 15 min à 70 C. Le tampon de lyse est un mélange d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pi pérazi ne éthane sulfonique à
50mM, d'acide éthylènediaminetétraacétique à 5mM, de chlorure de sodium à 150mM, et de digitonine à 50 pg/ml.
[210] Ensuite, 1/10e de volume d'acétate de sodium (NaAc) (3M, pH5.2) ont été
ajoutés. L'ADN a été précipité avec 1 volume d'isopropanol. Les échantillons ont été laissés 15 min à température ambiante puis centrifugés à 20 000g pendant min à +4 C. Le surnageant a été aspiré et le culot a été lavé avec de l'éthanol à
75%. Le culot a été séché puis resuspendu dans 30 I de TE à pH8 et analysés au fragment analyzer.
[211] La présence d'ADN dans la fraction cytoplasmique des cellules MDA-MB
231 non-traitées ou traitées 24h avec 50 ou 100 nM de staurosporine a été
analysée et ce tel que représenté à la Figure 16.
Les fragments d'ADN, marqueur de la mort cellulaire, sont détectés dans la fraction cytoplasmique des échantillons cellulaire traités par une drogue induisant leur mort (staurosporine). Il n'y a pas ou très peu d'ADN fragmenté dans la fraction cytoplasmique de l'échantillon cellulaire n'ayant pas subi de traitement induisant la mort cellulaire..

Claims

Revendications [Revendication 1] Méthode de quantification de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire caractérisée en ce qu'au moins une séquence présente sur des fragments d'ADN génomique d'origine nucléaire est amplifiée à partir de 5 l'extrait cytoplasmique dudit échantillon.
[Revendication 2] Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend :
- l'obtention d'un extrait cytoplasmique à partir d'un échantillon cellulaire ;
- l'amplification d'au moins une séquence dans ledit extrait cytoplasmique ;
10 - la quantification de l' ADN génomique détecté dans ledit extrait cytoplasmique.
[Revendication 3] Méthode selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'extrait cytoplasmique est obtenu par incubation de l'échantillon cellulaire avec un tampon de lyse ou un tampon hypotonique.
[Revendication 4] Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 15 caractérisée en ce que ladite au moins une séquence est une séquence d'ADN
présente en une copie par génome.
[Revendication 5] Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que ladite au moins une séquence est une séquence d'ADN
présente au moins deux fois par génome.
20 [Revendication 6] Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que ladite au moins une séquence est une séquence d'ADN
répétée.
[Revendication 7] Méthode selon la revendication 6 caractérisée en ce que ladite au moins une séquence d'ADN répétée est choisie parmi les SINE et les LINE.
25 [Revendication 8] Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que l'amplification est réalisée par une technique de PCR
ou une technique de détection de faible quantité d'ADN choisie parmi la PCR
quantitative, la digital droplet PCR, la technologie de Nanostring, la PCR
multiplexe.

[Revendication 9] Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'amplification est réalisée par PCR quantitative, digital droplet PCR ou PCR multiplexe.
[Revendication 10] Méthode de suivi de l'efficacité d'un traitement sur la mort cellulaire comprenant la détection de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire par la méthode selon les revendications 1 à 9.
[Revendication 11] Méthode de diagnostic d'une pathologie impliquant un processus de mort cellulaire comprenant la détection de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire par la méthode selon les revendications 1 à 9.
[Revendication 12] Méthode de criblage de composés comprenant :
- le traitement d'un échantillon cellulaire avec au moins un composé ;
- la détection de la mort cellulaire dans ledit échantillon par la méthode selon les revendications 1 à 9.
[Revendication 13] Kit pour la détection de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire comprenant :
- un tampon de lyse ou un tampon hypotonique apte à spécifiquement lyser ou perméabiliser la membrane plasmique ;
-au moins une paire d'amorces amplifiant l'ADN génomique.
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