WO2020188216A1 - Méthode ultrasensible de détection de la mort cellulaire - Google Patents

Méthode ultrasensible de détection de la mort cellulaire Download PDF

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WO2020188216A1
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Henrik Laurell
Eric Lacazette
Christian Touriol
Jason IACOVONI
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INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale)
Universite Paul Sabatier Toulouse Iii
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting cell death by using PCR (Polymerase Chain Reaction) techniques: qPCR, i.e. quantitative PCR; ddPCR i.e. digital droplet PCR, ...) or any other technique for detecting a small amount of DNA (nanostring, etc.).
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • Cell death is the irreversible cessation of vital functions with changes in structures at the cellular and molecular level. This cell death process can occur in a number of relatively different ways (Gallouzzi et al., Cell Death Differ, 2018).
  • the methods of detecting apoptosis can be categorized according to 4 main principles, according to whether they detect i) alteration of the plasma membrane, ii) activation of caspases, iii) mitochondrial damage, iv) DNA fragmentation.
  • phosphatidylserines exposed in the outer layer of the plasma membrane is also offered by a large number of suppliers (we will mention Pacific Blue TM Annexin V from BioLegend®).
  • the principle is the use of annexin V (protein which binds specifically to phosphatidylserines in a calcium-dependent manner), coupled to various reporters (mainly fluorescent) allowing its detection.
  • the analysis is carried out by flow cytometry (FACS) or by microscopy. This widely proposed method offers a large choice of fluorochromes and makes it possible to detect apoptotic and necrotic cells.
  • Hooker et al. 2012 (Nucl Acids Res, 40 (15) e13); Hooker et al., 2009 (J Cell Mol Med, 13 (5): 948-958), and Staley et al., 1997 (Cell Death Differ, 4: 66-75) describe a method for detecting fragmented DNA by using a “quantitative ligation-mediated PCR” which makes it possible to amplify the fragments with blunt ends formed following the activation of nucleases. This laborious method requires multiple steps.
  • the present invention relates to a method for detecting cell death based on the detection of fragments of genomic DNA of nuclear origin present in the cell cytoplasm. Indeed, the inventors have developed a very sensitive method for detecting fragments of genomic DNA of nuclear origin in the cytoplasm.
  • cytoplasmic extract is obtained by incubating the cell sample with lysis buffer or hypotonic buffer in order to lyse or permeabilize the plasma membrane without permeabilizing the nuclear membrane.
  • the cytoplasmic extracts correspond to all or part of the cellular cytoplasmic content.
  • the cytoplasmic extract is enriched with genomic DNA of nuclear origin, compared to cells that did not initiate the death process.
  • genomic DNA of nuclear origin present in the cytoplasm is measured by amplification / detection of an area present in at least one copy in the genome.
  • genomic DNA fragments can advantageously be detected and quantified in a sample.
  • the quantity of DNA fragments recovered is proportional to the quantity of cells that triggered the death process in the sample, thus making it possible to detect and quantify this process.
  • the detection of genomic DNA fragments in the cytoplasm, using specific primers targeting repeated sequences present in the genome confers increased sensitivity on the method according to the invention. The comparative results obtained confirm that the sensitivity is greater than that obtained with existing conventional methods already marketed.
  • FIG. 1 represents the level of activation of cell death achieved on cytoplasmic extracts of HepG2 cells obtained using different detergents in the method according to the invention.
  • FIG. 2 represents the level of activation of cell death achieved on cytoplasmic extracts of OCI-AML3 cells obtained using different detergents in the method according to the invention.
  • FIG. 3 represents the level of activation of cell death achieved on cytoplasmic extracts of OCI-AML3 cells obtained using different detergents in the method according to the invention.
  • FIG. 4 represents the level of activation of cell death achieved on cytoplasmic extracts of MDA-MB-231 cells obtained using different detergents in the method according to the invention.
  • FIG. 5 shows the comparison of the sensitivity of the method for detecting cell death by qPCR according to the present invention compared to a method of the state of the art Caspase Glo 3/7.
  • Fig. 6 shows the comparison of the sensitivity of the method for detecting cell death by qPCR according to the present invention compared to a method of the state of the art Caspase Glo 3/7.
  • FIG. 6 represents the comparison of the sensitivity of the method for detecting cell death by qPCR according to the present invention compared to a method of the state of the art flow cytometry (Annexin V labeling, propidium lodide).
  • FIG. 7 represents the comparison of the sensitivity of the method for detecting cell death by qPCR (direct lysis) according to the present invention compared to flow cytometry (Annexin V labeling, propidium lodide).
  • FIG. 8 represents the comparison of the sensitivity of the method for detecting cell death by qPCR according to the present invention compared to flow cytometry (Annexin V labeling, propidium lodide).
  • FIG. 9 represents the comparison of the sensitivity of the method for detecting cell death by qPCR (direct lysis) according to the present invention compared to flow cytometry (Annexin V labeling, propidium lodide).
  • FIG. 10 represents the comparison of the sensitivity as well as of the saturation threshold of the method for detecting cell death by qPCR according to the present invention compared to flow cytometry (Annexin V labeling, propidium lodide.
  • FIG. 1 1 represents the comparison of the sensitivity of the method for detecting cell death by qPCR according to the present invention compared to flow cytometry (Annexin V labeling, propidium lodide).
  • FIG. 12 represents the comparison of the sensitivity of the method for detecting cell death by ddPCR according to the present invention on isolated cells.
  • FIG. 13 represents the level of activation of cell death achieved on cytoplasmic extracts of different cell lines using a pair of primers targeting a sequence present in one copy per genome.
  • FIG. 14 represents the level of activation of cell death achieved on cytoplasmic extracts of different cell lines using a pair of primers targeting a sequence present in two copies per genome.
  • FIG. 15 represents the level of activation of cell death achieved on cytoplasmic extracts from the OCI-AML3 cell line using two pairs of primers each targeting a sequence present in one copy per genome
  • FIG. 16 demonstrates an increase in the quantity of DNA fragments in the cytoplasmic fraction obtained after extraction with a lysis buffer described in the method according to the invention, and detected by capillary electrophoresis, and this exclusively in cells treated with a drug inducing their death (staurosporine) (MDA 50 and MDA 100) compared to cells not treated with staurosporine (MDA NT).
  • the present invention therefore relates to a method for quantifying cell death in a cell sample characterized in that at least one sequence present on fragments of genomic DNA of nuclear origin is amplified from the cytoplasmic extract. of said sample.
  • the inventors have indeed advantageously exploited the abnormal presence of fragments of genomic DNA of nuclear origin located in the cytoplasm of cells during the cell death process. Fragmented genomic DNA of nuclear origin can thus be detected from cytoplasmic extracts of cells.
  • cell death means cell death by apoptosis and / or cell death by necrosis.
  • genomic DNA fragments or “fragmented genomic DNA” refers to DNA fragments of nuclear origin generated during the processes of cell death.
  • the cell sample may be a sample of cells in culture in vitro, such as adherent cells, cells in suspension, a sample comprising circulating tumor cells, a sample comprising purified circulating tumor cells, a blood sample containing circulating cells or any other sample such as a plasma sample, a urine sample, a saliva sample.
  • the method for quantifying cell death in a cell sample comprises:
  • cytoplasmic extract means the soluble part of the cell cytoplasm, also called cytosol, which is recovered after specific permeabilization of the plasma membrane without alteration of the nuclear membrane, followed by centrifugation.
  • the cytoplasmic extract and its methods of obtaining are known to those skilled in the art and are described in the state of the art, for example in Suzuki, Keiko et al. “REAP: A two minute cell fractionation method.” BMC research notes vol. 3,294. 10 Nov. 2010, doi: 10.1 186 / 1756-0500-3-294 or in Gary Zieve and Sheldon Penman, Small RNA species of the HeLa cell: Metabolism and subcellular localization Cell, May 1976, Pages 19-31.
  • the cytoplasmic extract is obtained by incubating the cell sample with lysis buffer or hypotonic buffer.
  • lysis buffer within the meaning of the present invention means any buffer making it possible to lyse or permeabilize the plasma membrane without permeabilization of the nuclear membrane.
  • a nonionic detergent could be used, as described in the patent US5,637,465.
  • an anti-DNA antibody could be used by those skilled in the art to determine the adequate concentration of the buffer to allow lysis or permeabilization of the plasma membrane without permeabilization of the nuclear membrane.
  • the lysis buffer can be chosen from 4- (2-hydroxyethyl) -1 -piperazine ethane sulfonic acid), ethylenediaminetetraacetic acid, sodium chloride, saponins such as digitonin or saponin, Tween-20, NP40, tergitol, Triton X-100, Igepal CA630, Empigen, or a combination.
  • the lysis buffer is a mixture of acid
  • the lysis buffer is a mixture of 4- (2-hydroxyethyl) -1 -piperazine ethanesulfonic acid at 50mM, ethylenediaminetetraacetic acid at 5mM, sodium chloride at 150mM, and of digitonin at 50 pg / ml.
  • the cytoplasmic extract can be obtained by the following steps:
  • the centrifugation or filtration step separates the supernatant from the rest of the cell debris.
  • the "cytoplasmic extract fraction” corresponds to an aliquot fraction of the cytoplasmic extract.
  • the fraction of the cytoplasmic extract can be obtained by the following steps:
  • the method for obtaining the fraction of the cytoplasmic extract may further comprise a step of diluting said aliquot fraction taken, at least 5 times in water, preferably 10 times in water. 'water.
  • the dilution step can be applied when the quantification method is a PCR quantification method.
  • the inventors have demonstrated that it is possible to detect cell death on cytoplasmic extracts using primers targeting a sequence present in one copy on the nuclear genome.
  • the method for quantifying cell death according to the present invention is characterized in that said at least one sequence is a DNA sequence present in one copy on said DNA fragments. genomics.
  • the method for quantifying cell death according to the present invention also makes it possible to detect cell death on cytoplasmic extracts using primers targeting a sequence present in addition to one copy in the nuclear genome.
  • the method according to the present invention makes it possible to detect cell death in cytoplasmic extracts using primers targeting a sequence present in two copies in the nuclear genome.
  • the method for quantifying cell death according to the present invention is characterized in that said at least one sequence is a DNA sequence present in at least two copies on said fragments of Genomic DNA.
  • the sensitivity of the method according to the invention is increased proportionally to the number of repeated DNA sequences when the latter are used as markers for detecting and quantifying the quantity of cytoplasmic genomic DNA.
  • the method for quantifying cell death according to the present invention is characterized in that said at least one sequence is a repeated DNA sequence.
  • genomic DNA typically includes repeated sequences which may be small intercalated nuclear elements (SINE for Short Interspersed Nuclear Elements) or long intercalated nuclear elements (LINE for Long Interspersed Nuclear Elements).
  • SINE small intercalated nuclear elements
  • LINE long intercalated nuclear elements
  • the Alu, MIR, MIR3 sequences can be chosen.
  • the LINE1 sequences can be chosen.
  • the method for quantifying cell death according to the present invention is characterized in that said at least one repeated DNA sequence is chosen from SINEs such as Alu, MIR, MIR3 and LINEs such as LINE1.
  • the method for quantifying cell death according to the present invention is characterized in that several different sequences are amplified simultaneously.
  • the detection / quantification of genomic DNA fragments can be carried out by quantitative PCR techniques or any other technique for detecting a small amount of DNA known to those skilled in the art.
  • the quantification and detection of fragmented genomic DNA is carried out by quantitative PCR (qPCR).
  • qPCR quantitative PCR
  • the principle of qPCR is based on the possibility of determining the amount of DNA template present in a sample in real time using an intercalating agent or a probe (Taqman®).
  • the fluorescence emitted is directly propositional to the amount of amplicons generated during the PCR reaction.
  • the method for quantifying cell death according to the present invention is characterized in that the detection / quantification is carried out by qPCR.
  • the quantification of genomic DNA fragments is performed by digital droplet PCR (ddPCR).
  • DdPCR is a microfluidic PCR based on the partitioning of each sample into 20,000 1 nL droplets.
  • the quantification of genomic DNA fragments is performed by Nanostring technology.
  • the principle of Nanostring is based on two key stages. Upstream, two probes are designed specifically for each target of interest. One of the probes, called a capture probe, is coupled to a biotin, which will be used to immobilize the molecules of interest on a support dedicated to counting. The second probe, called a "reporter”, is specific for the molecule of interest. It contains a succession of 6 fluorochromes of 4 different colors, whose arrangement defines a bar code that will be specific to each molecule of interest. It is this barcode that will allow the ultra-sensitivity of this technique and therefore the possibility of analyzing biological material in small quantities (Nanostring LABEX DEEP platform).
  • the quantification of genomic DNA fragments is carried out by multiplex PCR or multiplexing.
  • a multiplex PCR a set of several pairs of primers will be used so as to simultaneously amplify several sequences present in the genome.
  • a unique sequence is detected and quantified using for example the 5 'sense primer CGCCTGGATCATGTCAAGTCA 3' (SEQ ID NO: 1) and the 5 'antisense primer.
  • a sequence present in two copies is detected and quantified using the 5 'T CT CCAC AACACTT AGTGG ACAGT 3' sense primer (SEQ ID NO: 5) and the anti-sense primer 5.
  • SEQ ID NO: 5 the 5 'T CT CCAC AACACTT AGTGG ACAGT 3' sense primer
  • SEQ ID NO: 6 the anti-sense primer 5.
  • multiplexing can be carried out simultaneously, for example, using the pair of primers SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 with the pair of primers SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. .
  • the Alu sequence is detected and quantified using the 5 'sense primer AG GT G AAACCCCGT CT CT ACT 3' (SEQ ID NO: 7) and the 5 'antisense primer CCATTCTCCTGCCTCAGCCT 3 '(SEQ ID NO: 8).
  • the LINE1 sequence is detected and quantified using the 5 'forward primer GTCAGTGTGGCGATTCCTCAG 3' (SEQ ID NO: 9) and the anti-sense primer 5 'AGTAATGGGATGGCTGGGTCAA 3' (SEQ ID NO : 10) or by using the forward primer 5 'AACAACAGGTGCTGGAGAGGA 3' (SEQ ID NO: 1 1) and the reverse primer 5 'AT CG CCACACT G ACTT CCACA 3' (SEQ ID NO: 12).
  • the amount of nucleic acid amplified in said nucleic acid sample will be compared to the amount of amplified nucleic acid in a control sample.
  • control sample is meant a cell sample in which the process of cell death has not started.
  • an increase in the amount of amplified nucleic acid in said “sample” compared to the amount of amplified nucleic acid in the "control sample” is indicative of cell death.
  • the present invention also relates to a method for monitoring the efficiency and / or the effect of a treatment on cell death comprising the detection of cell death in a cell sample by the method according to the present invention. invention.
  • the method is applicable to in vitro, in vivo and ex vivo conditions.
  • the present invention can allow monitoring of a patient's response to treatment.
  • the detection and quantification of cell death is indicative of whether or not the treatment is effective.
  • the amount of amplified nucleic acid of the sample from the patient can be compared to the amount of amplified nucleic acid of a control sample, said control sample may be a patient sample obtained before administration of the treatment or a sample from the patient. 'a subject not affected by the pathology.
  • an increase in the amount of nucleic acid amplified is synonymous with treatment efficiency, while the absence of significant change can mean treatment failure.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing a pathology involving a cell death process comprising the detection of cell death in a cell sample by the method according to the present invention.
  • the level of activation of cell death in a cell sample would be indicative of a pathology involving a process of cell death.
  • the amount of nucleic acid amplified from the sample from the patient can be compared to the amount of nucleic acid amplified from a control sample, said control sample may be a sample from a subject without the pathology.
  • the present invention also relates to a method for the prognosis of a pathology involving a cell death process comprising the detection of cell death in a cell sample by the method according to the present invention.
  • the present invention also relates to a screening method for compounds comprising:
  • the method according to the invention will make it possible to determine the compound (s) that trigger cell death.
  • a subject of the present invention is also a kit for the detection of cell death in a cell sample comprising:
  • a lysis buffer or a hypotonic buffer capable of specifically lysing or permeabilizing the plasma membrane
  • the lysis buffer advantageously makes it possible to lyse or permeabilize the plasma membrane without permeabilization of the nuclear membrane.
  • the cell sample may be chosen from a sample of cells in culture in vitro, such as adherent cells, cells in suspension, a sample comprising circulating tumor cells, a sample comprising purified circulating tumor cells, a sample blood containing circulating cells or any sample comprising cells having triggered a process of cell death such as a plasma sample, a urine sample, a saliva sample.
  • a sample of cells in culture in vitro such as adherent cells, cells in suspension, a sample comprising circulating tumor cells, a sample comprising purified circulating tumor cells, a sample blood containing circulating cells or any sample comprising cells having triggered a process of cell death such as a plasma sample, a urine sample, a saliva sample.
  • the primers will be specific for the species studied.
  • a centrifugation or filtration step separates the supernatant containing the DNA fragments resulting from its degradation from the rest of the cellular debris.
  • An aliquot of the supernatant is taken, i.e., the fraction of cytoplasmic extract, which will optionally be diluted depending on the method of quantifying cell death used.
  • PCR is performed on the samples using primers specifically amplifying repeated sequences dispersed throughout the genome, or using primers targeting a one-copy or two-copy sequence on the genome.
  • the method for quantifying cell death could be carried out on a cytoplasmic extract obtained from cells lysed directly in the culture medium.
  • the results are analyzed relative to a predetermined control condition.
  • the final result can be obtained in two to three hours.
  • OCI-AML3 cells in suspension are derived from acute myeloid leukemia. They are cultivated in RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) supplemented with Penicillin-Streptomycin (Sigma-Aldrich) and 10% Fetal Calf Serum (SVF - Gibco) at 37 ° C with 5% C0 2 .
  • HepG2 cells are derived from human liver carcinoma. They are cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium - High Glucose (DM EM - Sigma-Aldrich) medium supplemented with Penicillin-Streptomycin (Sigma-Aldrich) and 10% Fetal Calf Serum (SVF - Gibco) at 37 ° C with 5% of C0 2 .
  • DM EM Dulbecco's Modified Eagle Medium - High Glucose
  • Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich
  • Fetal Calf Serum SVF - Gibco
  • MDA-MB-231 (adherent) cells are mammary tumor epithelial cells. They are grown in Dulbecco's Modified Eagle Medium - High Glucose (DMEM - Sigma-Aldrich) medium supplemented with Penicillin- Streptomycin (Sigma-Aldrich) and 10% Fetal Calf Serum (SVF - Gibco) at 37 ° C with 5% of C02.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium - High Glucose
  • Penicillin- Streptomycin Sigma-Aldrich
  • Fetal Calf Serum SVF - Gibco
  • MOLM14 cells in suspension are derived from acute myeloid leukemia. They are cultivated in RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) supplemented with Penicillin-Streptomycin (Sigma-Aldrich) and 10% Fetal Calf Serum (SVF - Gibco) at 37 ° C. with 5% C02.
  • the HeLa cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium - Low Glucose (DMEM - Sigma-Aldrich) supplemented with Penicillin-Streptomycin (Sigma-Aldrich) and 10% Fetal Calf Serum (SVF - Gibco) at 37 ° C with 5% C02.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium - Low Glucose
  • Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich
  • Fetal Calf Serum Sigma-Aldrich
  • the cells in suspension eg: OCI-AML3
  • OCI-AML3 are seeded at 200,000 cells / mL in a 6-well plate.
  • the cells are then treated or not with different drugs, at different concentrations and incubated for 16 hours.
  • the adherent cells are seeded between 20,000 and 30,000 cells / well (eg MDA-MB-231, HepG2) in a 48-well plate in 250 ⁇ L of medium. The cells are then treated or not with different drugs, at different concentrations and incubated for 24 hours.
  • 20,000 and 30,000 cells / well eg MDA-MB-231, HepG2
  • the cells are then treated or not with different drugs, at different concentrations and incubated for 24 hours.
  • the cytoplasmic fraction obtained will be diluted 10 times in water.
  • the kit used is the SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Takara). The samples were previously diluted 1/10 in water. Once the Master Mix has been prepared (as described in the table below), 6 ⁇ l are distributed in each well of the PCR plate. Then 4 ⁇ l of sample are added. PCR is performed in the Light Cycler 480 System real-time PCR reader (Roche). The amplification program is as follows: 95 ° C for 30 seconds, followed by 40 cycles broken down into two stages of 95 ° C for 5 seconds and 60 ° C for 20 seconds.
  • Untreated (NT) or treated (TTT) cells to induce cell death were used in these assays. Under each of the NT and TTT conditions, 100,000 - 10,000 - 1,000 - 100 or 10 cells are transferred to a 96-well plate in 50 ml of medium (in triplicates). Then 50 ⁇ l of Caspase Glo 3/7 reagent is added. After 1 hour of incubation, the light emission resulting from cleavage of the substrate by caspases 3 and 7 is determined using a luminometer.
  • the cells are washed with PBS and then resuspended in 1 ⁇ binding buffer at a concentration of 1 10 6 cells / ml.
  • 10 ⁇ L Annexin V Pacific Blue and 10 ⁇ L of propidium iodide (Biolegend Kit) are added to 200 ⁇ L of this cell suspension which is then incubated for 15 min in the dark and at room temperature. After centrifugation at 300 g for 5 min, the supernatant is gently aspirated and 500 ⁇ L of Binding Buffer 1 X are added.
  • Each ddPCR reaction is performed optimally in about 20,000 droplets of 1 nL in volume.
  • Cytoplasmic extracts from untreated cells and treated to induce cell death were used as samples.
  • a reaction mix of ddPCR (24mI_), requires 11 mI_ of 2X “EvaGreen ddPCR Supermix” (Bio-Rad), 0.22 pL of primers (sense and antisense each at 200nM final), 4mI_ of sample and 6.78 pL of water.
  • the droplets are generated by the QX200 DropletGenerator (Bio-Rad) by emulsifying 20pL of ddPCR mix and 20pL of oil in the wells of DG8 (Bio-Rad) cartridges. Then the droplets / oil mixture is transferred into a 96-well plate which is sealed by “PX1 PCR Plate Sealer” (Bio-Rad).
  • Amplification is carried out in a T100 thermal cycler (Bio-Rad) following the program: Enzyme activation: 95 ° C for 5 min; 40 cycles: denaturation at 95 ° C for 30 s then extension at 60 ° C for 1 min. Signal stabilization: 4 ° C for 5 min then 90 ° C for 5 min.
  • the plate is then read by the QX200 Droplet Reader (Bio-Rad). The results are then exported and the data analyzed with the QuantaSoft software (Bio-Rad).
  • Example 1 Detection of cell death on adherent cells in culture (HepG2 and MDA-MB-231) or cells in suspension (OCI-AML3)
  • Figure 1 shows the level of activation of cell death achieved on cytoplasmic extracts of HepG2 cells obtained using different lysis buffers in the method according to the present invention.
  • the pair of primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 was used on the fractions of cytoplasmic extracts obtained after lysis of the cells with Tween-20 0.075%, Triton X-100 0.0075% and Empigen 0.037%.
  • Figure 2 shows the level of activation of cell death achieved on cytoplasmic extracts of OCI-AML3 cells obtained using different detergents in the method according to the present invention.
  • the cells are treated or not for 18 h with 1 mM of doxorubicin. After centrifugation of 5,000 cells, they are lysed in a buffer containing different detergents: Tergitol 0.1%, Empigen 0.1%, Digitonin 150 ⁇ g / ml, NP40 0.1%. The qPCR is then carried out on fractions of cytoplasmic extracts using the pair of primers of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
  • Figure 3 shows the level of activation of cell death achieved on cytoplasmic extracts of OCI-AML3 cells obtained using a lysis buffer made with different detergents in the method according to the present invention.
  • FIG. 4 represents the level of activation of cell death carried out on cytoplasmic extracts of MDA-MB-231 cells obtained using a lysis buffer produced with different detergents in the method according to the present invention.
  • 20,000 cells are treated or not for 18 hours with 1 mM of doxorubicin and then directly lysed in a buffer containing different detergents: Tergitol 0.1%, Igepal CA630 0.5%, Triton X-100 0.01% and Tween- 20 0.5%.
  • the qPCR is then carried out on fractions of cytoplasmic extracts using the pair of primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • the method according to the present invention advantageously makes it possible to detect cell death and thus to measure its level of activation in samples of adherent cells and of cells in suspension.
  • Example 2 Determination of the sensitivity of the method for detecting cell death by PCR according to the present invention compared to the Caspase qlo 3/7 method of the state of the art
  • MOLM14 cells are treated for 16 h with 1 mM etoposide. Cell death is determined on a sample of cells ranging from 10 to 10,000 cells using the Caspase Glo technique. In parallel, a qPCR is carried out on a cytoplasmic extract originating from an identical number of cells (from 10 to 10,000 cells) with the pair of primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8. The results of l The experiment presented in Figure 5 are means of three independent experiments.
  • Example 3 Determination of the sensitivity of the method for detecting cell death according to the present invention relative to flow cytometry (Annexin V labeling, propidium lodide) of the state of the art
  • the cells are labeled using the Pacific Blue TM Annexin V Kit (Biolegend) according to the supplier's recommendations, then analyzed by flow cytometry (MACSQuant VYB - MiltenyiBiotec). The percentage of positive apoptotic cells (annexin V) is determined.
  • OCI-AML3 cells are treated or not (NT) for 16 h with increasing concentrations of etoposide (0 - 7.5 - 15 or 30 mM).
  • the cells are labeled using the Pacific Blue TM Annexin V Kit (Biolegend) according to the supplier's recommendations, then analyzed by flow cytometry (MACSQuant VYB - Milteny iBiotec). The percentage of positive apoptotic cells (Annexin V) is determined.
  • OCI-AML3 cells are treated or not (NT) for 16 h with increasing concentrations of Bortezomib (0 - 0.125 or 0.25 mM).
  • the cells are labeled using the Pacific Blue TM Annexin V Kit (Biolegend) according to the supplier's recommendations, then analyzed by flow cytometry (MACSQuant VYB - MiltenyiBiotec). The percentage of positive apoptotic cells (Annexin V) is determined.
  • OCI-AML3 cells are treated or not (NT) for 16 h with increasing concentrations of Bortezomib (0 - 0.125 or 0.25 mM).
  • the cells are labeled using the Pacific Blue TM Annexin V Kit (Biolegend) according to the supplier's recommendations, then analyzed by flow cytometry (MACSQuant VYB - MiltenyiBiotec). The percentage of positive apoptotic cells (Annexin V) is determined.
  • MOLM14 cells are treated or not (NT) for 16 h with increasing concentrations of etoposide (0 - 0.62 - 1, 25 - 2.5 - 5 or 10 mM).
  • the cells are labeled using the Pacific Blue TM Annexin V Kit (Biolegend) according to the supplier's recommendations, then analyzed by flow cytometry (MACSQuant VYB - MiltenyiBiotec). The percentage of positive apoptotic cells (annexin V) is determined.
  • a PCR is carried out on a cytoplasmic extract obtained from 10,000 cells lysed after centrifugation, with the pair of primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • the sensitivity of the PCR method according to the present invention is much greater than the flow cytometry.
  • the flow cytometric method reaches a detection level starting from the concentration of 2.5 mM of etoposide, which is not the case for the PCR method. The results are shown in Figure 10.
  • the method also makes it possible to detect cell death directly after lysis in the culture medium, and this in a much more sensitive manner than with the techniques of the prior art.
  • OCI-AML3 cells are treated or not for 16 h with 1 pM of doxorubicin.
  • a PCR is carried out on a cytoplasmic extract originating from these 1000 cells (AV- / IP-) treated (TTT) or untreated (NT), using the pair of primers of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
  • TTT cytoplasmic extract originating from these 1000 cells
  • NT untreated
  • the results of the experiment presented are averages of three independent experiments. The results are shown in Figure 1 1 B.
  • MOLM14 cells are treated or not for 16 hours with 2.5 mM etoposide.
  • the cells are labeled using the Pacific Blue TM Annexin V Kit (Biolegend). For each subpopulation, 1 cell is sorted and a ddPCR (digital droplet) is carried out on a cytoplasmic extract using the pair of primers of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10. The level of activation of death cell is determined and compared with the signals obtained from the cytoplasmic extract of an untreated cell negative for propidium lodide / Annexin V labeling.
  • the method according to the invention makes it possible to detect cell death on a sample of a cell and thus offers optimized sensitivity compared to methods of the state of the art.
  • Example 4 Detection of cell death carried out on cytoplasmic extracts of different cell lines using primers targeting a sequence present in one copy or in two copies on the genome.
  • Figure 13 shows the level of activation of cell death achieved on cytoplasmic extracts of the cell lines indicated on the x-axis (MDA-MB-231, Molm14, HeLa, OCI-AML3).
  • the MDA-MB-231 cells are treated (TTT) or not (NT) for 24 hours with 200 nM of staurosporine.
  • the Molm14 cells are treated (TTT) or not (NT) for 16 h with 0.5 mM of doxorubicin.
  • the HeLa cells are treated (TTT) or not (NT) for 24 hours with 400 nM of staurosporine.
  • the OCI-AML3 cells are treated (TTT) or not (NT) for 16 h with 1 mM of doxorubicin.
  • the qPCR is carried out on the cytoplasmic extracts, diluted 10 times, using the pair of primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • FIG. 14 represents the level of activation of cell death produced on cytoplasmic extracts of the cell lines indicated on the x-axis (MDA-MB-231, Molm14, HeLa, OCI-AML3).
  • the MDA-MB-231 cells are treated (TTT) or not (NT) for 24 hours with 200 nM of staurosporine.
  • the Molm14 cells are treated (TTT) or not (NT) for 16 h with 0.5 mM of doxorubicin.
  • the HeLa cells are treated (TTT) or not (NT) for 24 hours with 400 nM of staurosporine.
  • the OCI-AML3 cells are treated (TTT) or not (NT) for 16 h with 1 mM of doxorubicin.
  • the qPCR is carried out on the cytoplasmic extracts, diluted 10 times, using the pair of primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6
  • the method according to the invention makes it possible to detect cell death by the detection and amplification of a DNA sequence present in one copy on the genome.
  • Example 5 Detection of cell death carried out on cytoplasmic extracts by multiplexing
  • Figure 15 shows the level of activation of cell death achieved on cytoplasmic extracts of the OCI-AML3 cell line.
  • the cells are treated (TTT) or not (NT) for 24 hours with 10 mM aracytine. After centrifugation, the cells are lysed. The qPCR is then carried out on the cytoplasmic extracts, diluted 10 times, simultaneously using the pair of primers of SEQ ID: NO: 1 and SEQ ID NO: 2 with the pair of primers of SEQ ID: NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • the method for detecting cell death according to the present invention can advantageously be implemented by a multiplexing technique.
  • Example 6 detection of the presence of DNA fragments in the cytoplasmic fraction obtained after extraction with a lysis buffer described in the method according to the invention, and detected by capillary electrophoresis in cells treated with a drug inducing their dead (staurosporine) or not (NT)
  • the MDA-MB-231 cells were seeded in 6 T175 at a rate of 3 million cells per 35 ml of high glucose DMEM medium (10% FCS, P / S). The next day, the MDA-MB-231 were treated with 50nM and 100nM of staurosporine. The medium of the 2 untreated T175 was changed. After 24 h of treatment, the MDA-MB-231 cells were lysed with 2 mL of Lysis Buffer added to T175 for 15 min at room temperature, then the 2 mL were transferred to a tube and centrifuged at 2000g for 5 min. .
  • the lysis buffer is a mixture of 4- (2-hydroxyethyl) -1 -piperazine ethanesulfonic acid at 50mM, ethylenediaminetetraacetic acid at 5mM, sodium chloride at 150mM, and digitonin at 50 ⁇ g / ml.
  • DNA fragments are detected in the cytoplasmic fraction of cell samples treated with a drug that induces their death (staurosporine). There is little or no fragmented DNA in the cytoplasmic fraction of the cell sample that has not undergone any treatment that induces cell death.

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Abstract

L'invention concerne une méthode de détection de la mort cellulaire par l'utilisation de techniques de PCR (Polymerase Chain Reaction) : qPCR, i.e. quantitative PCR; ddPCR i.e. digital droplet PCR,...) ou toute autre technique de détection de faible quantité d'ADN (nanostring, etc...).

Description

Description
Titre : Méthode ultrasensible de détection de la mort cellulaire
Domaine technique
[1] L’invention concerne une méthode de détection de la mort cellulaire par l’utilisation de techniques de PCR (Polymerase Chain Reaction) : qPCR, i.e. quantitative PCR ; ddPCR i.e. digital droplet PCR,...) ou toute autre technique de détection de faible quantité d’ADN (nanostring, etc...).
Technique antérieure
[2] La mort des cellules est l’arrêt irréversible des fonctions vitales avec modification des structures au niveau cellulaire et moléculaire. Ce processus de mort cellulaire peut survenir de diverses façons relativement différentes (Gallouzzi ét al., Cell Death Differ, 2018).
[3] On va principalement distinguer la mort cellulaire par apoptose, ou mort cellulaire régulée, qui se produit selon une séquence d’évènements finement régulés et initiée en réponse à un signal de mort (stress oxydatif, stress exogènes, dommages à l’ADN, infection virale,...) ou la mort cellulaire programmée intervenant dans le maintien de l’homéostasie tissulaire où chaque cellule possède une durée de vie plus ou moins déterminée.
[4] La mort par nécrose résulte quant à elle de processus cellulaires en général déclenchés « accidentellement » comme par exemple le gel, la chaleur, une lésion mécanique,... Le choix de la réponse par l’apoptose ou la nécrose peut également être dépendante de l’amplitude de l’agression.
[5] En terme mécanistique, lors de la mort par apoptose, on observe des altérations de la membrane, des signalisations enzymatiques (comme l’activation de protéines caspases), la condensation du noyau et du cytoplasme, une agrégation de la chromatine, des dommages mitochondriaux et la fragmentation de l’ADN nucléaire en fragments inter-nucléosomaux. De façon intéressante, la plupart des agents anti-tumoraux peuvent induire un phénomène d’apoptose. [6] A l’inverse, les critères morphologiques des cellules nécrotiques sont différents. Une déstructuration de la membrane cellulaire va provoquer une entrée massive d’eau dans la cellule, une destruction des organites intracellulaires, ce qui conduit à la libération des enzymes lytiques des lysosomes et des peroxysomes entraînant la digestion de la cellule, une dégradation de l’ADN puis sa mort.
[7] Si les voies menant à la mort cellulaire par apoptose ou par nécrose, sont mécanistiquement très différentes, il a été observé dans chacune de ces voies, une dégradation de l’ADN, précédée par des cassures simple et double brin, la génération de fragments d’ADN de haut poids moléculaire, dégradés progressivement en fragments internucléosomaux (apoptose) ou de façon aléatoire (nécrose).
[8] Les méthodes de détection de l’apoptose peuvent être catégorisées selon 4 grands principes, selon qu’elles détectent i) l’altération de la membrane plasmique, ii) l’activation des caspases, iii) les dommages mitochondriaux, iv) la fragmentation de l’ADN.
[9] Concernant l’activation des caspases, il est possible de mesurer l’activité caspase, par la fusion d’un site tétrapeptidique de clivage par les caspases à un rapporteur fluorométrique ou luminescent (on citera le kit Caspase-GIo® de la société Promega). Cette méthode a pour avantage d’être rapide, simple d’utilisation et distribuée par plusieurs fournisseurs. Cependant, cette méthode est coûteuse, nécessite un spectrofluorimètre ou luminomètre et ne permet de détecter que l’apoptose Caspase-dépendante.
[10] Pour la détection de l’altération de la membrane plasmique, la détection des phosphatidylsérines exposées dans la couche externe de la membrane plasmique est également proposée par un grand nombre de fournisseurs (on citera Pacific Blue™ Annexin V de BioLegend®). Le principe est l’utilisation d’annexine V (protéine se liant spécifiquement aux phosphatidylsérines de façon calcium dépendante), couplée à différents rapporteurs (majoritairement fluorescents) permettant sa détection. L’analyse est réalisée en cytométrie en flux (FACS) ou en microscopie. Cette méthode, largement proposée, offre un choix important de fluorochromes et permet de détecter les cellules apoptotiques et nécrotiques. Cependant, cette méthode nécessite un cytomètre en flux et la quantification de l’apoptose de cellules adhérentes en cytométrie en flux est très délicate. L’utilisation de la microscopie peut permettre de pallier cette problématique. La quantification est cependant plus laborieuse. Cette méthode est donc peu adaptée aux cellules adhérentes.
[11] Parmi les méthodes détectant la fragmentation de l’ADN, on peut tout d’abord citer une méthode de visualisation de l’ADN fragmenté après électrophorèse sur gel suivie d’une révélation par un agent intercalant. Le principe consiste en l’extraction de l’ADN génomique puis la séparation des fragments par électrophorèse sur gel d’agarose (Apoptotic DNA ladder kit). Si cette méthode a l’avantage d’avoir un coût faible et de ne pas nécessiter d’appareils spécifiques et coûteux, cette méthode est extrêmement peu sensible.
[12] On citera également une méthode de quantification de l’ADN cytoplasmique couplé à des histones, par ELISA et l’utilisation d’anticorps contre l’ADN et des histones (kit Cell Death Détection ELISA, de la société Roche). Cette méthode est par exemple décrite dans le brevet US5637465. Bien qu’assez simple à mettre en œuvre, cette méthode est relativement laborieuse. Sa sensibilité, ainsi que la gamme de détection sont limitées bien que son coût soit élevé.
[13] Hooker ét al., 2012 (Nucl Acids Res, 40(15)e1 13) ; Hooker ét al., 2009 (J Cell Mol Med, 13(5):948-958), et Staley ét al., 1997 (Cell Death Differ, 4:66-75) décrivent une méthode de détection de l’ADN fragmenté en utilisant une “quantitative ligation-mediated PCR” qui permet d’amplifier les fragments à bords francs (blunt ends) formés suite à l’activation des nucléases. Cette méthode laborieuse nécessite de multiples étapes.
[14] Enfin, Botezatu ét al., 2000 (Clin Chem 46(8) :1078-1084) ; Umetani et al., 2006 (Clin Chem 52(6) :1062-1069) ; Lou ét al., Int J Mol Med 35 : 72-80) ; Fawzy et al., 2016 (J Egypt Natl Cane Inst, 28 : 235-242) décrivent des méthodes de détection/quantification de l’ADN génomique circulant (ou libre), et plus particulièrement la détection d’ADN génomique issu de la mort cellulaire. Ces méthodes impliquent l’amplification de séquences répétées « Alu » par PCR quantitative. Dans cette méthode, les échantillons d’ADN sont des échantillons de sérum et de plasma. [15] Il reste ainsi nécessaire de mettre au point une méthode de détection de la mort cellulaire sensible, simple et rapide, ayant un coût modéré et fonctionnant sur des cellules adhérentes ou en suspension et même sur des tissus.
Exposé de l’invention
[16] La présente invention concerne une méthode de détection de la mort cellulaire basée sur la détection de fragments d’ADN génomique d’origine nucléaire présents dans le cytoplasme cellulaire. En effet, les inventeurs ont mis au point une méthode très sensible permettant de détecter des fragments d’ADN génomique d’origine nucléaire dans le cytoplasme.
[17] Contrairement aux méthodes de détection de fragments d’ADN par PCR de l’état de la technique selon lesquelles les fragments d’ADN sont détectés et quantifiés dans un extrait cellulaire total (noyau + cytoplasme) ou bien dans des fluides biologiques comme le plasma, la détection se fait sur un extrait cytoplasmique. Cet extrait cytoplasmique est obtenu par incubation de l’échantillon cellulaire avec un tampon de lyse ou un tampon hypotonique afin de lyser ou perméabiliser la membrane plasmique sans perméabilisation de la membrane nucléaire.
[18] La détection à partir d’extraits cytoplasmiques permet d’obtenir une méthode plus rapide, plus simple à mettre en œuvre et moins coûteuse, comparativement aux méthodes de l’état de la technique.
[19] Les extraits cytoplasmiques correspondent à tout ou partie du contenu cytoplasmique cellulaire. Lorsque le processus de mort cellulaire est déclenché, l’extrait cytoplasmique est enrichi en ADN génomique d’origine nucléaire, par rapport à des cellules n’ayant pas enclenché le processus de mort.
[20] La détection des fragments d’ADN génomique d’origine nucléaire présents dans le cytoplasme est mesurée par amplification / détection d’une zone présente en au moins une copie dans le génome. Ainsi, ces fragments d’ADN génomique peuvent être avantageusement détectés et quantifiés dans un échantillon. La quantité de fragments d’ADN récupérés est proportionnelle à la quantité de cellules ayant enclenché le processus de mort dans l’échantillon, permettant ainsi de détecter et quantifier ce processus. [21] La détection de fragments d’ADN génomique dans le cytoplasme, en utilisant des amorces spécifiques ciblant des séquences répétées présentes dans le génome, confère une sensibilité accrue à la méthode selon l’invention. Les résultats comparatifs obtenus confirment que la sensibilité est supérieure à celle obtenue avec des méthodes classiques existantes et déjà commercialisées.
Brève description des dessins
[22] D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1
[23] [Fig. 1 ] représente le niveau d’activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de cellules HepG2 obtenus en utilisant différents détergents dans la méthode selon l’invention.
Fig. 2
[24] [Fig. 2] représente le niveau d’activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de cellules OCI-AML3 obtenus en utilisant différents détergents dans la méthode selon l’invention.
Fig. 3
[25] [Fig. 3] représente le niveau d’activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de cellules OCI-AML3 obtenus en utilisant différents détergents dans la méthode selon l’invention.
Fig. 4
[26] [Fig. 4] représente le niveau d’activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de cellules MDA-MB-231 obtenus en utilisant différents détergents dans la méthode selon l’invention.
Fig. 5
[27] [Fig. 5] représente la comparaison de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par qPCR selon la présente invention par rapport à une méthode de l’état de la technique Caspase Glo 3/7. Fig. 6
[28] [Fig. 6] représente la comparaison de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par qPCR selon la présente invention par rapport à une méthode de l’état de la technique la cytométrie en flux (marquage Annexine V, lodure de propidium).
Fig. 7
[29] [Fig. 7] représente la comparaison de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par qPCR (lyse directe) selon la présente invention par rapport à la cytométrie en flux (marquage Annexine V, lodure de propidium).
Fig. 8
[30] [Fig. 8] représente la comparaison de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par qPCR selon la présente invention par rapport à la cytométrie en flux (marquage Annexine V, lodure de propidium).
Fig. 9
[31] [Fig. 9] représente la comparaison de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par qPCR (lyse directe) selon la présente invention par rapport à la cytométrie en flux (marquage Annexine V, lodure de propidium).
Fig. 10
[32] [Fig. 10] représente la comparaison de la sensibilité ainsi que du seuil de saturation de la méthode de détection de mort cellulaire par qPCR selon la présente invention par rapport à la cytométrie en flux (marquage Annexine V, lodure de propidium.
Fig.11
[33] [Fig. 1 1 ] représente la comparaison de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par qPCR selon la présente invention par rapport à la cytométrie en flux (marquage Annexine V, lodure de propidium).
Fig. 12 [34] [Fig. 12] représente la comparaison de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par ddPCR selon la présente invention sur cellules isolées.
Fig. 13
[35] [Fig. 13] représente le niveau d’activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de différentes lignées cellulaires à l’aide d’un couple d’amorces ciblant une séquence présente en une copie par génome.
Fig. 14
[36] [Fig. 14] représente le niveau d’activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de différentes lignées cellulaires à l’aide d’un couple d’amorces ciblant une séquence présente en deux copies par génome.
Fig. 15
[37] [Fig. 15] représente le niveau d’activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques provenant de la lignée cellulaire OCI-AML3 à l’aide de deux couple d’amorces chacun ciblant une séquence présente en une copie par génome
Fig. 16
[38] [Fig. 16] démontre une augmentation de la quantité des fragments d’ADN dans la fraction cytoplasmique obtenus après extraction avec un tampon de lyse décrit dans la méthode selon l’invention, et détectés par électrophorèse capillaire, et ceci exclusivement dans des cellules traitées par une drogue induisant leur mort (staurosporine) (MDA 50 et MDA 100) comparativement à des cellules non traitées par la staurosporine (MDA NT).
Description détaillée [39] Les dessins et la description ci-après contiennent, pour l’essentiel, des éléments de caractère certain. Ils pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant. [40] La présente invention concerne donc une méthode de quantification de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire caractérisée en ce qu’au moins une séquence présente sur des fragments d’ADN génomique d’origine nucléaire est amplifiée à partir de l’extrait cytoplasmique dudit échantillon.
[41] Les inventeurs ont en effet avantageusement exploité la présence anormale des fragments d’ADN génomique d’origine nucléaire localisés dans le cytoplasme des cellules lors du processus de mort cellulaire. L’ADN génomique fragmenté d’origine nucléaire peut ainsi être détecté à partir d’extraits cytoplasmiques des cellules.
[42] On entend par « mort cellulaire » au sens de la présente invention, la mort cellulaire par apoptose et/ou la mort cellulaire par nécrose.
[43] On entend par « fragments d’ADN génomique» ou « ADN génomique fragmenté », les fragments d’ADN d’origine nucléaire générés lors des processus de mort cellulaire.
[44] L’échantillon cellulaire peut être un échantillon de cellules en culture in vitro, telles que des cellules adhérentes, des cellules en suspension, un échantillon comprenant des cellules tumorales circulantes, un échantillon comprenant des cellules tumorales circulantes purifiées, un échantillon sanguin contenant des cellules circulantes ou tout autre échantillon tel qu’un échantillon de plasma, un échantillon d’urine, un échantillon de salive.
[45] Selon un mode de réalisation, la méthode de quantification de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire comprend :
- l’obtention d’un extrait cytoplasmique à partir d’un échantillon cellulaire ;
- l’amplification d’au moins une séquence dans ledit extrait cytoplasmique ;
- la quantification de l’ADN génomique détecté dans ledit extrait cytoplasmique.
[46] On entend par « extrait cytoplasmique », la partie soluble du cytoplasme cellulaire, encore appelée cytosol, qui est récupéré après la perméabilisation spécifique de la membrane plasmique sans altération de la membrane nucléaire, suivie d’une centrifugation. L’extrait cytoplasmique et ses méthodes d’obtention sont connus de l’homme du métier et sont décrits dans l’état de la technique par exemple dans Suzuki, Keiko et al.“REAP: A two minute cell fractionation method.” BMC research notes vol. 3 294. 10 Nov. 2010, doi:10.1 186/1756-0500-3-294 ou dans Gary Zieve and Sheldon Penman, Small RNA species of the HeLa cell: Metabolism and subcellular localization Cell, May 1976, Pages 19-31.
[47] Typiquement, l’extrait cytoplasmique est obtenu par incubation de l’échantillon cellulaire avec un tampon de lyse ou un tampon hypotonique.
[48] L’incubation de l’échantillon avec le tampon de lyse permet avantageusement de lyser ou perméabiliser la membrane plasmique sans perméabilisation de la membrane nucléaire.
[49] Ainsi, on entend par « tampon de lyse » au sens de la présente invention, tout tampon permettant de lyser ou perméabiliser la membrane plasmique sans perméabilisation de la membrane nucléaire.
[50] L’homme du métier pourra choisir le tampon de lyse adéquat.
Typiquement, un détergent non-ionique pourra être utilisé, tel que décrit dans le brevet US5637465.
[51] L’homme du métier sait également comment choisir la concentration adéquate du tampon pour permettre la lyse ou la perméabilisation de la membrane plasmique sans perméabilisation de la membrane nucléaire.
[52] Typiquement, un anticorps anti-ADN pourra être utilisé par l’homme du métier pour déterminer la concentration adéquate du tampon pour permettre la lyse ou la perméabilisation de la membrane plasmique sans perméabilisation de la membrane nucléaire.
[53] Après traitement des cellules n’ayant pas enclenché le processus de mort avec des concentrations croissantes de détergents, celles-ci sont mises en présence d’un anticorps anti-ADN. L’exclusion nucléaire de cet anticorps confirme l’intégrité de la membrane nucléaire et permet ainsi de déterminer la concentration optimale de détergent. Une trop forte concentration en détergent perméabilisera la membrane nucléaire permettant à l’anticorps de pénétrer dans le noyau et ainsi de détecter l’ADN nucléaire. Cette méthode est calquée sur une méthode de détection d’une protéine à localisation nucléaire (Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some intégral membrane proteins. Goldenthal KL, Hedman K, Chen JW, August JT, Willingham MC. J Histochem Cytochem. 1985 Aug ; 33(8):813-20).
[54] A titre illustratif, le tampon de lyse pourra être choisi parmi l’acide 4-(2- hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique), l’acide éthylènediaminetétraacétique, le chlorure de sodium, les saponines telles la digitonine ou la saponine, le Tween-20, NP40, le tergitol, le Triton X-100, l’Igepal CA630, l’Empigen, ou une combinaison.
[55] Selon un mode de réalisation, le tampon de lyse est un mélange d’acide
4-(2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique, d’acide éthylènediaminetétraacétique, de chlorure de sodium, de digitonine.
[56] Ces tampons permettent de lyser ou perméabiliser la membrane plasmique sans perméabilisation de la membrane nucléaire.
[57] Dans un mode de réalisation, le tampon de lyse est un mélange d’acide 4- (2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique à 50mM, d’acide éthylènediaminetétraacétique à 5mM, de chlorure de sodium à 150mM, et de digitonine à 50 pg/ml..
[58] Selon un mode de réalisation, l’extrait cytoplasmique pourra être obtenu par les étapes suivantes :
- incubation de l’échantillon cellulaire avec un tampon de lyse ou un tampon hypotonique.
- centrifugation ou filtration de l’échantillon cellulaire lysé.
[59] L’étape de centrifugation ou de filtration permet de séparer le surnageant du reste des débris cellulaires.
[60] La « fraction de l’extrait cytoplasmique » correspond à une fraction aliquote de l’extrait cytoplasmique.
[61] Selon un mode de réalisation, la fraction de l’extrait cytoplasmique pourra être obtenue par les étapes suivantes :
- incubation de l’échantillon cellulaire avec un tampon de lyse ou un tampon hypotonique ;
- centrifugation ou filtration de l’échantillon cellulaire lysé ; - prélèvement d’une fraction aliquote de l’extrait cytoplasmique dans le surnageant obtenu après l’étape de centrifugation ou filtration.
[62] Selon un mode de réalisation, la méthode d’obtention de la fraction de l’extrait cytoplasmique pourra comprendre en outre une étape de dilution de ladite fraction aliquote prélevée, au moins 5 fois dans l’eau, préférentiellement 10 fois dans l’eau.
[63] Typiquement, l’étape de dilution pourra être appliquée lorsque la méthode de quantification est une méthode de quantification par PCR.
[64] De manière avantageuse, les inventeurs ont démontré qu’il était possible de détecter la mort cellulaire sur des extraits cytoplasmiques à l’aide d’amorces ciblant une séquence présente en une copie sur le génome nucléaire.
[65] Ainsi, et selon un mode de réalisation, la méthode de quantification de la mort cellulaire selon la présente invention est caractérisée en ce que ladite au moins une séquence est une séquence d’ADN présente en une copie sur lesdits fragments d’ADN génomique.
[66] La méthode de quantification de la mort cellulaire selon la présente invention permet également de détecter la mort cellulaire sur des extraits cytoplasmiques à l’aide d’amorces ciblant une séquence présente en plus d’une copie dans le génome nucléaire.
[67] A titre illustratif, la méthode selon la présente invention permet de détecter la mort cellulaire sur des extraits cytoplasmiques à l’aide d’amorces ciblant une séquence présente en deux copies dans le génome nucléaire.
[68] Ainsi, selon une mode de réalisation, la méthode de quantification de la mort cellulaire selon la présente invention est caractérisée en ce que ladite au moins une séquence est une séquence d’ADN présente en au moins deux copies sur lesdits fragments d’ADN génomique.
[69] La sensibilité de la méthode selon l’invention est accrue proportionnellement au nombre de séquences d’ADN répétées lorsque celles-ci sont utilisées comme marqueurs pour détecter et quantifier la quantité d’ADN génomique cytoplasmique. [70] Selon un mode de réalisation, la méthode de quantification de la mort cellulaire selon la présente invention est caractérisée en ce que ladite au moins une séquence est une séquence d’ADN répétée.
[71] Typiquement, l’ADN génomique inclut des séquences répétées qui pourront être des petits éléments nucléaires intercalés (SINE pour Short Interspersed Nuclear Eléments) ou des longs éléments nucléaires intercalés (LINE pour Long Interspersed Nuclear Eléments).
[72] Parmi les SINE, les séquences Alu, MIR, MIR3 pourront être choisies.
[73] Parmi les LINE, les séquences LINE1 pourront être choisies.
[74] Ainsi, et selon un mode de réalisation, la méthode de quantification de la mort cellulaire selon la présente invention est caractérisée en ce que ladite au moins une séquence d’ADN répétée est choisie parmi les SINE tels que Alu, MIR, MIR3 et les LINE tels que LINE1.
[75] Les inventeurs ont également démontré qu’il est possible de détecter la mort cellulaire sur des extraits cytoplasmiques à l’aide de plusieurs couples d’amorces, chaque couple d’amorces ciblant une séquence d’ADN présente dans le génome nucléaire.
[76] Ainsi, selon un mode de réalisation, la méthode de quantification de la mort cellulaire selon la présente invention est caractérisée en ce que plusieurs séquences différentes sont amplifiées simultanément.
[77] L’homme du métier pourra utiliser tout type de technique permettant de détecter et quantifier les séquences de l’ADN génomique.
[78] La détection/quantification des fragments d’ADN génomique pourra être réalisée par des techniques de PCR quantitative ou toute autre technique de détection de faible quantité d’ADN connues de l’Homme du métier.
[79] Selon un mode de réalisation, la quantification et la détection d’ADN génomique fragmenté est réalisée par PCR quantitative (qPCR). Le principe de la qPCR repose sur la possibilité de déterminer la quantité de matrice d’ADN présente dans un échantillon en temps réel à l’aide d’un agent intercalant ou d’une sonde (Taqman®). La fluorescence émise est directement propositionnelle à la quantité d’amplicons générés pendant la réaction PCR.
[80] L’homme du métier pourra utiliser tout appareil pour mettre en oeuvre la technique de qPCR. A titre illustratif, le lecteur de PCR en temps réel Light Cycler 480 System de la société Roche® pourra être utilisé.
[81] Ainsi, la méthode de quantification de la mort cellulaire selon la présente invention est caractérisée en ce que la détection/quantification est réalisée par qPCR.
[82] Selon un mode de réalisation, la quantification des fragments d’ADN génomique est réalisée par digital droplet PCR (ddPCR). La ddPCR est une PCR par micro-fluidique basée sur le partitionnement de chaque échantillon dans 20000 gouttelettes de 1 nL.
[83] Selon un mode de réalisation, la quantification des fragments d’ADN génomique est réalisée par la technologie Nanostring. Le principe du Nanostring repose sur deux étapes clés. En amont, deux sondes sont conçues spécifiquement pour chaque cible d’intérêt. L’une des sondes, appelée sonde de capture, est couplée à une biotine, qui sera utilisée pour immobiliser les molécules d’intérêt sur un support dédié au comptage. La deuxième sonde, appelée «rapporteur», est spécifique de la molécule d’intérêt. Elle contient une succession de 6 fluorochromes de 4 couleurs différentes, dont l’arrangement définit un code- barres qui sera propre à chaque molécule d’intérêt. C’est ce code-barres qui va permettre l’ultra-sensibilité de cette technique et donc la possibilité d’analyser du matériel biologique en faible quantité (Plateforme Nanostring LABEX DEEP).
[84] Selon un mode de réalisation, la quantification des fragments d’ADN génomique est réalisée par PCR multiplexe ou multiplexage. Pour la mise en oeuvre d’une PCR multiplexe, un set de plusieurs couples d’amorces sera utilisé de manière à amplifier simultanément plusieurs séquences présentes dans le génome.
[85] Selon un mode de réalisation, une séquence unique est détectée et quantifiée en utilisant par exemple l’amorce sens 5’ CGCCTGGATCATGTCAAGTCA 3’ (SEQ ID NO : 1 ) et l’amorce anti-sens 5’ AGGCTAAGTTAGGGCCTCTGC 3’ (SEQ ID NO : 2) ou l’amorce sens 5’ AACATAAGCTGAGGCCAGCCT 3’ (SEQ ID NO : 3) et l’amorce anti-sens 5’ GTGTCTACTGCCAACCTGTGC 3’ (SEQ ID NO : 4).
[86] Selon un mode de réalisation, une séquence présente en deux copies est détectée et quantifiée en utilisant l’amorce sens 5’ T CT CCAC AACACTT AGTGG ACAGT 3’ (SEQ ID NO : 5) et l’amorce anti-sens 5’ AGAGGAGGTGGTAGCTGGAGA 3’ (SEQ ID NO : 6).
[87] Selon un mode de réalisation, un multiplexage peut-être réalisé en utilisant simultanément par exemple le couple d’amorces SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 avec le couple d’amorces SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO :4. .
[88] Selon un mode de réalisation, la séquence Alu est détectée et quantifiée en utilisant l’amorce sens 5’ AG GT G AAACCCCGT CT CT ACT 3’ (SEQ ID NO : 7) et l’amorce anti-sens 5’ CCATTCTCCTGCCTCAGCCT 3’ (SEQ ID NO : 8).
[89] Selon un mode de réalisation, la séquence LINE1 est détectée et quantifiée en utilisant l’amorce sens 5’ GTCAGTGTGGCGATTCCTCAG 3’ (SEQ ID NO : 9) et l’amorce anti-sens 5’ AGTAATGGGATGGCTGGGTCAA 3’ (SEQ ID NO : 10) ou en utilisant l’amorce sens 5’ AACAACAGGTGCTGGAGAGGA 3’ (SEQ ID NO : 1 1 ) et l’amorce anti-sens 5’ AT CG CCACACT G ACTT CCACA 3’ (SEQ ID NO : 12).
[90] Selon un mode de réalisation, la quantité d’acide nucléique amplifié dans ledit échantillon d’acide nucléique sera comparée à la quantité d’acide nucléique amplifié d’un échantillon contrôle.
[91] On entend par «échantillon contrôle », un échantillon cellulaire dans lequel le processus de mort cellulaire n’est pas enclenché.
[92] Typiquement, une augmentation de la quantité d’acide nucléique amplifié dans ledit « échantillon » par comparaison à la quantité d’acide nucléique amplifié de « l'échantillon contrôle » est indicatif de la mort cellulaire.
[93] La quantification de la mort cellulaire par la détection de fragments d’ADN dans le cytoplasme de cellules selon la présente invention permet de diagnostiquer une pathologie, de suivre les effets d’un traitement sur la mort cellulaire, d’obtenir un pronostic de la pathologie, de réaliser un criblage de composés, d’optimiser des conditions de culture cellulaire.
[94] Ainsi, la présente invention concerne également une méthode de suivi de l’efficacité et/ou de l’effet d’un traitement sur la mort cellulaire comprenant la détection de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire par la méthode selon la présente invention.
[95] La méthode s’applique à des conditions in vitro, in vivo et ex vivo.
[96] Typiquement, la présente invention peut permettre le suivi de la réponse d’un patient au traitement. La détection et la quantification de la mort cellulaire sont indicatives de l’efficacité ou non du traitement. La quantité d’acide nucléique amplifié de l’échantillon provenant du patient peut être comparée à la quantité d’acide nucléique amplifié d’un échantillon contrôle, ledit échantillon contrôle pouvant être un échantillon du patient obtenu avant administration du traitement ou un échantillon provenant d’un sujet non atteint de la pathologie. Généralement, une augmentation de la quantité d’acide nucléique amplifié est synonyme d’efficacité de traitement, tandis que l’absence de variation significative peut être synonyme d’échec du traitement.
[97] La présente invention concerne également une méthode de diagnostic d’une pathologie impliquant un processus de mort cellulaire comprenant la détection de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire par la méthode selon la présente invention.
[98] Typiquement, le niveau d’activation de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire serait indicatif d’une pathologie impliquant un processus de mort cellulaire. La quantité d’acide nucléique amplifié de l’échantillon provenant du patient peut être comparée à la quantité d’acide nucléique amplifié d’un échantillon contrôle, ledit échantillon contrôle pouvant être un échantillon provenant d’un sujet non atteint de la pathologie.
[99] La présente invention concerne également une méthode de pronostic d’une pathologie impliquant un processus de mort cellulaire comprenant la détection de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire par la méthode selon la présente invention. [100] La présente invention concerne également une méthode de criblage de composés comprenant :
- le traitement d’un échantillon cellulaire avec un ou plusieurs composés ;
- la détection de la mort cellulaire dans ledit échantillon par la méthode selon la présente invention.
[101] La méthode selon l’invention permettra de déterminer le ou les composés permettant de déclencher la mort cellulaire.
[102] La présente invention a également pour objet un kit pour la détection de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire comprenant :
- un tampon de lyse ou un tampon hypotonique apte à spécifiquement lyser ou perméabiliser la membrane plasmique ;
- au moins une paire d’amorces amplifiant de l’ADN génomique.
[103] Le tampon de lyse permet avantageusement de lyser ou perméabiliser la membrane plasmique sans perméabilisation de la membrane nucléaire.
[104] Le tampon de lyse et les amorces sont tels que ci-avant décrits.
[105] L’échantillon cellulaire pourra être choisi parmi un échantillon de cellules en culture in vitro, telles que des cellules adhérentes, des cellules en suspension, un échantillon comprenant des cellules tumorales circulantes, un échantillon comprenant des cellules tumorales circulantes purifiées, un échantillon sanguin contenant des cellules circulantes ou tout échantillon comprenant des cellules ayant enclenché un processus de mort cellulaire tel qu’un échantillon de plasma, un échantillon d’urine, un échantillon de salive.
[106] Avantageusement également, les amorces seront spécifiques de l’espèce étudiée.
Exemples
[107] Dans les exemples qui suivent, les matériels et méthodes ci-après détaillés ont été utilisés :
[108] Méthode
Afin de mesurer la mort cellulaire dans un échantillon donné, un protocole a été développé. [109] A partir de cellules traitées ou non par différentes drogues déclenchant leur mort, les cellules sont lysées à l’aide d’un tampon afin de libérer dans le milieu les petits fragments d’ADN résultant de sa dégradation.
[110] Une étape de centrifugation ou de filtration permet de séparer le surnageant contenant les fragments d’ADN issus de sa dégradation du reste des débris cellulaires. Une fraction aliquote du surnageant est prélevée, i.e., la fraction d’extrait cytoplasmique, qui sera éventuellement diluée en fonction de la méthode de quantification de la mort cellulaire utilisée. Ensuite, une PCR est réalisée sur les échantillons à l’aide d’amorces amplifiant spécifiquement des séquences répétées dispersées tout au long du génome, ou à l’aide d’amorces ciblant une séquence en une copie ou deux copies sur le génome.
[111] Alternativement, la méthode de quantification de la mort cellulaire pourra être réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de cellules lysées directement dans le milieu de culture.
[112] A l’issue de la méthode de quantification de la mort cellulaire, les résultats sont analysés de manière relative à une condition contrôle prédéterminée. Le résultat final peut-être obtenu en deux à trois heures.
[113] Amorces
[114] Amorces permettant la détection et la quantification d’une séquence unique:
5’ CGCCTGGAT CAT GT CAAGT CA 3’ (SEQ ID NO : 1 ) et
5’ AGGCTAAGTTAGGGCCTCTGC 3’ (SEQ ID NO : 2)
ou
5’ AACATAAGCTGAGGCCAGCCT 3’ (SEQ ID NO : 3) et
5’ GTGTCTACTGCCAACCTGTGC 3’ (SEQ ID NO : 4).
[115] Amorces permettant la détection et la quantification d’une séquence présente en deux copies par génome :
5’ T CT CCACAACACTT AGT G G ACAGT 3’ (SEQ ID NO : 5) et
5’ AGAGGAGGT GGTAGCT GGAGA 3’ (SEQ ID NO : 6).
[116] Amorces permettant la détection et la quantification de la séquence répétée Alu : 5’ AGGTGAAACCCCGTCTCTACT 3’ (SEQ ID NO : 7)
5’ CCATTCTCCTGCCTCAGCCT 3’ (SEQ ID NO : 8).
[117] Amorces permettant la détection et la quantification de la séquence répétée LINE1 :
5’ GTCAGTGTGGCGATTCCTCAG 3’ (SEQ ID NO : 9) et
5’ AGTAATGGGATGGCTGGGTCAA 3’ (SEQ ID NO :10)
ou
5’ AACAACAGGT GCTGGAGAGGA 3’ (SEQ ID NO : 1 1 ) et
5’ ATCGCCACACTGACTTCCACA 3’ (SEQ ID No : 12).
[118] Culture cellulaire
[119] Les cellules OCI-AML3 (en suspension) sont issues de leucémie aiguë myéloïde. Elles sont cultivées dans du milieu RPMI-1640 ( Sigma-Aldrich ) supplémenté en Pénicilline-Streptomycine ( Sigma-Aldrich ) et 10% Sérum de Veau Foetal (SVF - Gibco ) à 37 °C avec 5 % de C02.
[120] Les cellules HepG2 (adhérentes) sont issues de carcinome de foie humain. Elles sont cultivées dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium - High Glucose (DM EM - Sigma-Aldrich) supplémenté en Pénicilline-Streptomycine ( Sigma-Aldrich ) et 10% Sérum de Veau Foetal (SVF - Gibco) à 37°C avec 5 % de C02.
[121] Les cellules MDA-MB-231 (adhérentes) sont des cellules épithéliales de tumeur mammaire. Elles sont cultivées dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium - High Glucose (DMEM - Sigma-Aldrich) supplémenté en Pénicilline- Streptomycine ( Sigma-Aldrich ) et 10% Sérum de Veau Foetal (SVF - Gibco) à 37 °C avec 5 % de C02.
[122] Les cellules MOLM14 (en suspension) sont issues de leucémie aiguë myéloïde. Elles sont cultivées dans du milieu RPMI-1640 ( Sigma-Aldrich ) supplémenté en Pénicilline-Streptomycine ( Sigma-Aldrich ) et 10% Sérum de Veau Foetal (SVF - Gibco) à 37 °C avec 5 % de C02.
[123] Les cellules HeLa ont été cultivées dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium - Low Glucose (DMEM - Sigma-Aldrich) supplémenté en Pénicilline-Streptomycine ( Sigma-Aldrich ) et 10% Sérum de Veau Foetal (SVF - Gibco ) à 37 °C avec 5 % de C02.
[124] Ensemencement et traitement
[125] Les cellules en suspension (ex : OCI-AML3) sont ensemencées à 200 000 cellules/mL dans une plaque 6 puits. Les cellules sont ensuite traitées ou non avec différentes drogues, à différentes concentrations et incubées pendant 16 heures.
[126] Les cellules adhérentes sont ensemencées entre 20 000 et 30 000 cellules/puits (ex : MDA-MB-231 , HepG2) en plaque 48 puits dans 250 pL de milieu. Les cellules sont ensuite traitées ou non avec différentes drogues, à différentes concentrations et incubées pendant 24 heures.
Figure imgf000021_0001
[128] Pour la mise en œuyre de la qPCR, la fraction cytoplasmique obtenue sera diluée 10 fois dans l’eau.
Le kit utilisé est le SYBR qPCR Premix Ex Taq II ( Takara ). Les échantillons ont été préalablement dilués au 1/10e dans de l’eau. Une fois le Master Mix préparé (tel que décrit tableau ci-dessous), 6pL sont distribués dans chaque puits de la plaque PCR. Ensuite 4pL d’échantillon sont ajoutés. La PCR est réalisée dans le lecteur de PCR en temps réel Light Cycler 480 System (Roche). Le programme d’amplification est le suivant : 95 °C pendant 30 secondes, suivi de 40 cycles décomposés en deux étapes de 95 °C pendant 5 secondes et 60 °C pendant 20 secondes.
[129] [Tableau 1]
Figure imgf000021_0002
[130] Caspase Glo
[131] Des cellules non traitées (NT) ou ayant subi un traitement (TTT) afin d’induire la mort cellulaire ont été utilisées pour ces essais. Dans chacune des conditions NT et TTT, 100 000 - 10 000 - 1 000 - 100 ou 10 cellules sont transférées dans une plaque 96 puits dans 50mI_ de milieu (en triplicats). Ensuite 50 pl_ de réactif Caspase Glo 3/7 sont ajoutés. Après 1 heure d’incubation, l’émission lumineuse issue du clivage du substrat par les caspases 3 et 7 est déterminée à l’aide d’un luminomètre.
[132] Marquage Annexin V / lodure de Propidium (IP) - Biolegend
[133] Des cellules non traitées (NT) et ayant subi un traitement (TTT) afin d’induire la mort cellulaire ont été utilisées pour ces essais.
[134] Les cellules sont lavées avec du PBS puis resuspendues dans du Binding Buffer 1 X à la concentration de 1 106cellules/mL. 10pL Annexin V Pacific Blue et 10 pL d’Iodure de propidium (Kit Biolegend) sont rajoutés à 200pL de cette suspension cellulaire qui est ensuite incubée pendant 15 min à l’obscurité et à température ambiante. Après une centrifugation à 300 g pendant 5 min, le surnageant est aspiré délicatement et 500pL de Binding Buffer 1 X sont ajoutés.
[135] Ces cellules sont ensuite utilisées en cytométrie en flux, pour déterminer l’effet du traitement et le nombre de cellules en apoptose. Ces cellules sont triées en fonction de leurs statuts en Annexine V et lodure de propidium afin de réaliser ensuite une PCR.
[136] ddPCR (pour digital droplet PCR)
[137] Chaque réaction de ddPCR est effectuée de façon optimale dans environ 20 000 gouttelettes de 1 nL de volume.
[138] Echantillons et préparation du mix ddPCR.
Des extraits cytoplasmiques issus de cellules non-traitées et traitées afin d’induire la mort cellulaire ont été utilisés comme échantillons. [139] Un mix réactionnel de ddPCR (24mI_), nécessite 11 mI_ de 2X « EvaGreen ddPCR Supermix » (Bio-Rad), 0,22pL d’amorces (sens et anti-sens chacun à 200nM final), 4mI_ d’échantillon et 6,78pL d’eau.
[140] Génération des gouttelettes
Les gouttelettes sont générées par le QX200 DropletGenerator (Bio-Rad) en émulsionnant 20pL de mix ddPCR et 20pL d’huile dans les puits de cartouches DG8 (Bio-Rad). Puis le mélange gouttelettes/huile est transféré dans une plaque 96 puits qui est scellée par « PX1 PCR Plate Sealer » (Bio-Rad).
[141] Amplification
L’amplification est réalisée dans un thermocycleur T100 (Bio-Rad) en suivant le programme : Activation de l’enzyme : 95 °C pendant 5 min ; 40 cycles : dénaturation à 95 °C pendant 30 s puis extension à 60 °C pendant 1 min. Stabilisation du signal : 4°C pendant 5 min puis 90 °C pendant 5 min.
[142] Lecture des gouttelettes
La plaque est ensuite lue par le QX200 Droplet Reader (Bio-Rad). Les résultats sont ensuite exportés et les données analysées avec le logiciel QuantaSoft (Bio- Rad).
[143] Exemple 1 : Détection de la mort cellulaire sur des cellules adhérentes en culture (HepG2 et MDA-MB-231) ou des cellules en suspension (OCI-AML3)
[144] Cellules adhérentes en culture HeoG2
[145] La Figure 1 représente le niveau d’activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de cellules HepG2 obtenus en utilisant des tampons de lyse différents dans la méthode selon la présente invention.
[146] 30000 cellules sont ensemencées, puis traitées ou non durant 18h avec 1 mM de doxorubicine. Les cellules sont ensuite lysées dans un tampon contenant différents détergents : Tween-20 0,075%, Triton X-100 0,0075%, Empigen 0,037% et Tergitol 0,33%. Les extraits cytoplasmiques sont centrifugés, puis une fraction du surnageant est prélevée et diluée (10x) dans de l’eau. La qPCR est ensuite réalisée sur ladite fraction. [147] Le couple d’amorces de SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10 a été utilisé sur les fractions d’extraits cytoplasmiques obtenues après lyse des cellules avec le Tergitol 0,33%. Le couple d’amorces de SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO :8 a été utilisé sur les fractions d’extraits cytoplasmiques obtenues après lyse des cellules avec le Tween-20 0,075%, le Triton X-100 0,0075% et Empigen 0,037%.
[148] Cellules en suspension OCI-AML3
[149] La Figure 2 représente le niveau d’activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de cellules OCI-AML3 obtenus en utilisant différents détergents dans la méthode selon la présente invention.
[150] Les cellules sont traitées ou non durant 18h avec 1 mM de doxorubicine. Après centrifugation de 5 000 cellules celles-ci sont lysées dans un tampon contenant différents détergents : Tergitol 0,1 %, Empigen 0,1 %, Digitonine 150pg/ml, NP40 0,1 %. La qPCR est ensuite réalisée sur des fractions d’extraits cytoplasmiques en utilisant le couple d’amorces de SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10.
[151] La Figure 3 représente le niveau d’activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de cellules OCI-AML3 obtenus en utilisant un tampon de lyse réalisé avec différents détergents dans la méthode selon la présente invention.
[152] 5000 cellules sont traitées ou non durant 18h avec 1 mM de doxorubicine puis directement lysées dans un tampon contenant différents détergents : Tergitol 0,1 %, NP40 0,5%, Triton X-100 0,01 %, Digitonine 50pg/mL. La qPCR est ensuite réalisée sur des fractions d’extraits cytoplasmiques en utilisant le couple d’amorces de SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8. Les résultats de l’expérience présentée sont des moyennes de trois expériences indépendantes.
[153] Cellules adhérentes en culture MDA-MB-231
[154] La Figure 4 représente le niveau d’activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de cellules MDA-MB-231 obtenus en utilisant un tampon de lyse réalisé avec différents détergents dans la méthode selon la présente invention. [155] 20000 cellules sont traitées ou non durant 18h avec 1 mM de doxorubicine puis directement lysées dans un tampon contenant différents détergents : Tergitol 0,1 %, Igepal CA630 0,5%, Triton X-100 0,01 % et Tween-20 0,5%. La qPCR est ensuite réalisée sur des fractions d’extraits cytoplasmiques en utilisant le couple d’amorces de SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8.
[156] La méthode selon la présente invention permet avantageusement de détecter la mort cellulaire et ainsi de mesurer son niveau d’activation dans des échantillons de cellules adhérentes et de cellules en suspension.
[157] Exemple 2 : Détermination de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire par PCR selon la présente invention par rapport à la méthode Caspase qlo 3/7 de l’état de la technique
[158] Des cellules MOLM14 sont traitées durant 16h avec 1 mM d’étoposide. La mort cellulaire est déterminée sur un échantillon de cellules allant de 10 à 10 000 cellules en utilisant la technique du Caspase Glo. En parallèle, une qPCR est réalisée sur un extrait cytoplasmique provenant d’un nombre identique de cellules (de 10 à 10 000 cellules) avec le couple d’amorces de SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8. Les résultats de l’expérience présentée dans la Figure 5 sont des moyennes de trois expériences indépendantes.
[159] La comparaison de la méthode selon la présente invention avec une méthode de l’état de la technique (Caspase Glo), permet de mettre avantageusement en évidence la meilleure sensibilité et un seuil de détection inférieur de la méthode selon la présente invention.
[160] Exemple 3 : Détermination de la sensibilité de la méthode de détection de mort cellulaire selon la présente invention par rapport à la cytométrie en flux (marquage Annexine V, lodure de propidium) de l’état de la technique
[161] Cellules OCI-AML3 traitées ou non avec des concentrations croissances d’étoposide
[162] qPCR sur un extrait cytoplasmique issu de cellules lysées après centrifugation. [163] Des cellules OCI-AML3 sont traitées ou non (NT) durant 16h avec des concentrations croissantes d’étoposide (0 - 7,5 - 15 ou 30 mM).
[164] Les cellules sont marquées à l’aide du Kit Pacific Blue™ Annexin V (Biolegend) selon les recommandations du fournisseur, puis analysées par cytométrie en flux (MACSQuant VYB - MiltenyiBiotec). Le pourcentage de cellules apoptotiques (annexine V) positives est déterminé.
[165] En parallèle, une qPCR est réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de 10000 cellules lysées après centrifugation avec le couple d’amorces de SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10. Les résultats sont présentés dans la Figure 6.
[166] qPCR réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de cellules lysées directement dans le milieu de culture.
[167] Des cellules OCI-AML3 sont traitées ou non (NT) durant 16h avec des concentrations croissantes d’étoposide (0 - 7,5 - 15 ou 30 mM).
[168] Les cellules sont marquées à l’aide du Kit Pacific Blue™ Annexin V (Biolegend) selon les recommandations du fournisseur, puis analysées par cytométrie en flux (MACSQuant VYB - Milteny iBiotec). Le pourcentage de cellules apoptotiques (Annexine V) positives est déterminé.
[169] En parallèle, une PCR est réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de 10000 cellules lysées directement dans le milieu de culture après centrifugation, avec le couple d’amorces de SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10. Les résultats sont présentés dans la Figure 7.
[170] Cellules OCI-AML3 traitées ou non avec des concentrations croissances de Bortezomib
[171] qPCR sur un extrait cytoplasmique issu de cellules lysées après centrifugation.
[172] Des cellules OCI-AML3 sont traitées ou non (NT) durant 16h avec des concentrations croissantes de Bortezomib (0 - 0,125 ou 0,25 mM).
[173] Les cellules sont marquées à l’aide du Kit Pacific Blue™ Annexin V (Biolegend) selon les recommandations du fournisseur, puis analysées par cytométrie en flux (MACSQuant VYB - MiltenyiBiotec). Le pourcentage de cellules apoptotiques (Annexine V) positives est déterminé.
[174] En parallèle, une PCR est réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de 10000 cellules lysées après centrifugation avec le couple d’amorces de SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10. Les résultats sont présentés dans la Figure 8.
[175] gPCR réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de cellules lysées directement dans le milieu de culture
[176] Des cellules OCI-AML3 sont traitées ou non (NT) durant 16h avec des concentrations croissantes de Bortezomib (0 - 0,125 ou 0,25 mM).
[177] Les cellules sont marquées à l’aide du Kit Pacific Blue™ Annexin V (Biolegend) selon les recommandations du fournisseur, puis analysées par cytométrie en flux (MACSQuant VYB - MiltenyiBiotec). Le pourcentage de cellules apoptotiques (Annexine V) positives est déterminé.
[178] En parallèle, une PCR est réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de 10000 cellules lysées directement dans le milieu de culture après centrifugation, avec le couple d’amorces de SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10. Les résultats sont présentés dans la Figure 9.
[179] Cellules MOLM14 traitées ou non avec des concentrations croissances d’Etoposide
[180] gPCR sur un extrait cytoplasmique issu de cellules lysées après centrifugation
[181] Des cellules MOLM14 sont traitées ou non (NT) durant 16h avec des concentrations croissantes d’étoposide (0 - 0,62 - 1 ,25 - 2,5 - 5 ou 10 mM).
[182] Les cellules sont marquées à l’aide du Kit Pacific Blue™ Annexin V (Biolegend) selon les recommandations du fournisseur, puis analysées par cytométrie en flux (MACSQuant VYB - MiltenyiBiotec). Le pourcentage de cellules apoptotiques (annexine V) positives est déterminé.
[183] En parallèle, une PCR est réalisée sur un extrait cytoplasmique issu de 10000 cellules lysées après centrifugation, avec le couple d’amorces de SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8. [184] La sensibilité de la méthode par PCR selon la présente invention est beaucoup plus importante que la cytométrie en flux. De plus, la méthode par cytométrie en flux arrive à un palier de détection à partir de la concentration de 2,5 mM d’étoposide, ce qui n’est pas le cas pour la méthode PCR. Les résultats sont présentés dans la Figure 10.
[185] La comparaison de la méthode selon la présente invention avec une méthode de l’état de la technique (marquage Annexine V, lodure de propidium), permet de mettre avantageusement en évidence la meilleure sensibilité et une moindre saturabilité de la méthode selon la présente invention.
[186] La méthode permet également de détecter la mort cellulaire directement après lyse dans le milieu de culture, et ce de manière beaucoup plus sensible qu’avec les techniques de l’art antérieur.
[187] Cellules OCI-AML3 traitées avec 1 mM de doxorubicine
[188] Des cellules OCI-AML3 sont traitées ou non durant 16h avec 1 pM de doxorubicine.
[189] Les cellules sont marquées à l’aide du Kit Pacific Blue™ Annexin V (Biolegend). 1000 cellules doublement négatives (population dn - Annexine V négatives - lodure de propidium négatives) traitées ou non-traitées sont triées. Ces résultats sont représentés dans la Figure 1 1 A.
[190] Une PCR est réalisée sur un extrait cytoplasmique provenant de ces 1000 cellules (AV-/IP-) traitées (TTT) ou non traitées (NT), en utilisant le couple d’amorces de SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10. Les résultats de l’expérience présentée sont des moyennes de trois expériences indépendantes. Les résultats sont présentés dans la Figure 1 1 B.
[191] Il apparaît que la méthode selon la présente invention permet de détecter l’apparition de la mort cellulaire sur des cellules considérées comme doublement négative au marquage Annexine V / lodure de Propidium par le test de l’état de la technique au vu du seuil de sensibilité en faveur de la présente invention. La présente invention permet une détection plus précoce de la mort cellulaire que par le test standard de l’état de la technique. [192] Cellules isolées
[193] Des cellules MOLM14 sont traitées ou non durant 16h avec 2,5mM d’étoposide.
[194] Les cellules sont marquées à l’aide du Kit Pacific Blue™ Annexin V (Biolegend). Pour chaque sous-population 1 cellule est triée et une ddPCR (digital droplet) est réalisée sur un extrait cytoplasmique en utilisant le couple d’amorces de SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10. Le niveau d’activation de la mort cellulaire est déterminé et comparé avec les signaux obtenus à partir de l’extrait cytoplasmique d’une cellule non-traitée négative au marquage lodure de propidium/ Annexine V.
[195] Les résultats tels que présentés dans la Figure 12 représentent la moyenne des résultats obtenus avec 5-6 cellules.
[196] La méthode selon l’invention permet de détecter la mort cellulaire sur un échantillon d’une cellule et offre ainsi une sensibilité optimisée par rapport aux méthodes de l’état de la technique.
[197] Exemple 4 : Détection de la mort cellulaire réalisée sur des extraits cytoplasmiques de différentes lignées cellulaires à l’aide d’amorces ciblant une séquence présente en une copie ou en deux copies sur le génome.
[198] La Figure 13 représente le niveau d’activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques des lignées cellulaires indiquées sur l’axe des abscisses (MDA-MB-231 , Molm14, HeLa, OCI-AML3).
[199] Les cellules MDA-MB-231 sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 24h avec 200nM de staurosporine. Les cellules Molm14 sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 16h avec 0,5mM de doxorubicine. Les cellules HeLa sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 24h avec 400nM de staurosporine. Les cellules OCI- AML3 sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 16h avec 1 mM de doxorubicine. Après action du tampon de lyse, la qPCR est réalisée sur les extraits cytoplasmiques, dilués 10 fois, en utilisant le couple d’amorces de SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO : 2. [200] La Figure 14 représente le niveau d’activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques des lignées cellulaires indiquées sur l’axe des abscisses (MDA-MB-231 , Molm14, HeLa, OCI-AML3).
[201] Les cellules MDA-MB-231 sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 24h avec 200nM de staurosporine. Les cellules Molm14 sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 16h avec 0,5mM de doxorubicine. Les cellules HeLa sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 24h avec 400nM de staurosporine. Les cellules OCI- AML3 sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 16h avec 1 mM de doxorubicine. Après action du tampon de lyse et la centrifugation, la qPCR est réalisée sur les extraits cytoplasmiques, dilués 10 fois, en utilisant le couple d’amorces de SEQ ID NO :5 et SEQ ID NO : 6
[202] Avantageusement, la méthode selon l’invention permet de détecter la mort cellulaire par la détection et l’amplification d’une séquence d’ADN présente en une copie sur le génome.
[203] Exemple 5 : Détection de la mort cellulaire réalisée sur des extraits cytoplasmiques par multiplex
[204] La Figure 15 représente le niveau d’activation de la mort cellulaire réalisé sur des extraits cytoplasmiques de lignée cellulaire OCI-AML3.
[205] Les cellules sont traitées (TTT) ou non (NT) durant 24h avec 10mM d’aracytine. Après centrifugation les cellules sont lysées. La qPCR est ensuite réalisée sur les extraits cytoplasmiques, dilués 10 fois, en utilisant simultanément le couple d’amorces de SEQ ID : NO : 1 et SEQ ID NO : 2 avec le couple d’amorces de SEQ ID : NO : 3 et SEQ ID NO : 4.
[206] La méthode de détection de la mort cellulaire selon la présente invention peut avantageusement être mise en œuvre par une technique de multiplexage.
[207] Ainsi, et de manière avantageuse, les inventeurs ont mis au point une méthode de détection de la mort cellulaire sensible, simple et rapide, ayant un coût modéré et fonctionnant sur des cellules adhérentes ou en suspension. Cette méthode possède une sensibilité accrue, un seuil de détection très inférieur, et une moindre saturabilité par rapport aux méthodes de l’état de la technique. [208] Exemple 6: détection de la présence de fragments d’ADN dans la fraction cytoplasmique obtenus après extraction avec un tampon de lyse décrit dans la méthode selon l’invention, et détectés par électrophorèse capillaire dans des cellules traitées par une drogue induisant leur mort (staurosporine) ou non (NT)
[209] Les cellules MDA-MB-231 ont été ensemencées dans 6 T175 à raison de 3 millions de cellules pour 35mL de milieu DMEM high glucose (10% SVF, P/S). Le lendemain les MDA-MB-231 ont été traitées par 50nM et 100nM de staurosporine. Le milieu des 2 T175 non traitées a été changé. Après 24h de traitement, les cellules MDA-MB-231 ont été lysées avec 2mL de Tampon de lyse ajoutés dans les T175 pendant 15 min à température ambiante, puis, les 2 mL ont été transférés dans un tube et centrifugés à 2000g pendant 5 min. Ensuite, le surnageant a été traité à la RNaseA (20 mo/itiί) puis à la Protéinase K (utilisation à 100ug/mL), et placé 15 min à 70 °C. Le tampon de lyse est un mélange d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique à 50mM, d’acide éthylènediaminetétraacétique à 5mM, de chlorure de sodium à 150mM, et de digitonine à 50 pg/ml.
[210] Ensuite, 1/10e de volume d’acétate de sodium (NaAc) (3M, pH5.2) ont été ajoutés. L’ADN a été précipité avec 1 volume d’isopropanol. Les échantillons ont été laissés 15 min à température ambiante puis centrifugés à 20 000g pendant 20 min à +4°C. Le surnageant a été aspiré et le culot a été lavé avec de l’éthanol à 75%. Le culot a été séché puis resuspendu dans 30mI de TE à pH8 et analysés au fragment analyzer.
[211] La présence d’ADN dans la fraction cytoplasmique des cellules MDA-MB 231 non-traitées ou traitées 24h avec 50 ou 100 nM de staurosporine a été analysée et ce tel que représenté à la Figure 16.
Les fragments d’ADN, marqueur de la mort cellulaire, sont détectés dans la fraction cytoplasmique des échantillons cellulaire traités par une drogue induisant leur mort (staurosporine). Il n’y a pas ou très peu d’ADN fragmenté dans la fraction cytoplasmique de l’échantillon cellulaire n’ayant pas subi de traitement induisant la mort cellulaire..

Claims

Revendications
[Revendication 1] Méthode de quantification de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire caractérisée en ce qu’au moins une séquence présente sur des fragments d’ADN génomique d’origine nucléaire est amplifiée à partir de l’extrait cytoplasmique dudit échantillon.
[Revendication 2] Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce qu’elle comprend :
- l’obtention d’un extrait cytoplasmique à partir d’un échantillon cellulaire ;
- l’amplification d’au moins une séquence dans ledit extrait cytoplasmique ;
- la quantification de ADN génomique détecté dans ledit extrait cytoplasmique.
[Revendication 3] Méthode selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l’extrait cytoplasmique est obtenu par incubation de l’échantillon cellulaire avec un tampon de lyse ou un tampon hypotonique.
[Revendication 4] Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que ladite au moins une séquence est une séquence d’ADN présente en une copie par génome.
[Revendication 5] Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que ladite au moins une séquence est une séquence d’ADN présente au moins deux fois par génome.
[Revendication 6] Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que ladite au moins une séquence est une séquence d’ADN répétée.
[Revendication 7] Méthode selon la revendication 6 caractérisée en ce que ladite au moins une séquence d’ADN répétée est choisie parmi les SINE et les LINE.
[Revendication 8] Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que l’amplification est réalisée par une technique de PCR ou une technique de détection de faible quantité d’ADN choisie parmi la PCR quantitative, la digital droplet PCR, la technologie de Nanostring, la PCR multiplexe.
[Revendication 9] Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l’amplification est réalisée par PCR quantitative, digital droplet PCR ou PCR multiplexe.
[Revendication 10] Méthode de suivi de l’efficacité d’un traitement sur la mort cellulaire comprenant la détection de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire par la méthode selon les revendications 1 à 9.
[Revendication 11] Méthode de diagnostic d’une pathologie impliquant un processus de mort cellulaire comprenant la détection de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire par la méthode selon les revendications 1 à 9.
[Revendication 12] Méthode de criblage de composés comprenant :
- le traitement d’un échantillon cellulaire avec au moins un composé ;
- la détection de la mort cellulaire dans ledit échantillon par la méthode selon les revendications 1 à 9.
[Revendication 13] Kit pour la détection de la mort cellulaire dans un échantillon cellulaire comprenant :
- un tampon de lyse ou un tampon hypotonique apte à spécifiquement lyser ou perméabiliser la membrane plasmique ;
-au moins une paire d’amorces amplifiant l’ADN génomique.
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