JP2022525101A - ｉｎ ｓｉｔｕでの２本鎖核酸の検出、及びその関連方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ用を含む、標的２本鎖核酸の検出方法を提供する。本発明は、検出対象の標的２本鎖核酸を含む固定された浸透化細胞の試料と、そのような試料を含むスライドも提供する。加えて、本発明は、標的２本鎖核酸を検出するためのキットを提供する。

Description

発明の詳細な説明

本願は、２０１９年３月１２日に出願した米国特許仮出願第６２／８１７，４４９号に基づく利益を主張するものであり、この仮出願の内容の全体は、参照により、本明細書に援用される。

〔背景技術〕
本発明は、広くは、核酸の検出、より具体的には、ｉｎ ｓｉｔｕでの２本鎖核酸の検出に関するものである。

ＤＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、染色体、細胞または組織において、その染色体、細胞及び組織の内容物を保持したまま、所定の配列を検出する目的で広く用いられている分子生物学的技法である（Ｒａｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｅｕｓ ９（６）：ｅ１３２５．ｄｏｉ：１０．７７５９／ｃｕｒｅｕｓ．１３２５（２０１７））。ＤＮＡ ＩＳＨには、研究及び診断における多くの用途がある（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋ．Ｒｅｓ．２（１）：３．ｄｏｉ：１０．１１８６／２０５０－７７７１－２－３（２０１４）、Ｒａｔａｎらによる２０１７年の上記文献、Ｗｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２（２）：１０９－１１９（２００２））。しかしながら、現在のＤＮＡ ＩＳＨ法は、大きいプローブを使用すること、及びそれよりも短い配列に対する感度が限られていることから、大きな染色体領域（１００ｋｂ超）しか検出できない。ヒトゲノムの遺伝子サイズの中央値は、２４キロベースに過ぎないので、上記のことは、現在のＤＮＡ ＩＳＨプローブのほぼすべてが、２つ以上の遺伝子を対象範囲とするため、単一遺伝子レベルでの判断が困難となる場合が多いことを意味する。したがって、さらに短い配列を可視化可能にする、より感度と特異性の高い方法は、依然として技術的課題である。

すなわち、２本鎖核酸、特に、より小さい領域及びまたは個別の遺伝子の２本鎖核酸をｉｎ ｓｉｔｕで検出する方法に対するニーズが存在する。本発明は、このニーズに対応するとともに、関連する利点も提供する。

〔発明の概要〕
本発明は、２本鎖核酸の検出方法を提供する。一実施形態では、本発明は、２本鎖核酸の検出方法であって、（Ａ）２本鎖核酸を１つ以上含む細胞を含む試料を、標的プローブセットと接触させることであって、その標的プローブセットが、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含むことと、（Ｂ）その試料と、第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤とを接触させることと、（Ｃ）その試料を複数の増幅剤と接触させることであって、その増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含むことと、（Ｄ）その試料を複数の標識プローブと接触させることであって、その標識プローブが、標識と、増幅剤に対する結合部位を含むことと、（Ｅ）標的２本鎖核酸に結合した標識プローブを検出することによって、標的２本鎖核酸を検出することを含む方法を提供する。

上記のような方法の一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のような、２本鎖核酸の検出方法の一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のような方法の一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。上記のような方法の別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。上記のような方法のさらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、（Ａ）標的２本鎖核酸を含む少なくとも１つの固定された浸透化細胞と、（Ｂ）標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、（Ｃ）第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤であって、第１の標的プローブと第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされているプレ増幅剤と、（Ｄ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の増幅剤と、（Ｅ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の標識プローブを含む、固定された浸透化細胞の試料であって、そのハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が標的２本鎖核酸上に供給される試料を提供する。

上記のような試料の一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のような試料の一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のような試料の一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。上記のような試料のさらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、（Ａ）標的２本鎖核酸を含む固定された浸透化細胞を少なくとも１つ含む複数の固定された浸透化細胞が上に固定化されているスライドと、（Ｂ）標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、（Ｃ）第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤であって、第１の標的プローブと第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされているプレ増幅剤と、（Ｄ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の増幅剤と、（Ｅ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の標識プローブを含むスライドであって、そのハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が標的２本鎖核酸上に供給されるスライドを提供する。

上記のようなスライドの一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のようなスライドの一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のようなスライドの別の実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。上記のようなスライドのさらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、標的２本鎖核酸を検出するためのキットであって、（Ａ）第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤と、（Ｂ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤と、（Ｃ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブを含むキットを提供する。

上記のようなキットの一実施形態では、そのキットは、標的プローブセットを含み、その標的プローブセットは、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含む。一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

一実施形態では、そのキットは、細胞を浸透化するための試薬を少なくとも１つ含む。

一実施形態では、本発明は、２本鎖核酸の検出方法であって、（Ａ）２本鎖核酸を１つ以上含む細胞を含む試料を、標的プローブセットと接触させることであって、その標的プローブセットが、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含むことと、（Ｂ）その試料と、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤を含むプレ－プレ増幅剤セットとを接触させることであって、第１のプレ－プレ増幅剤が、第１の標的プローブに対する結合部位を含み、第２のプレ－プレ増幅剤が、第２の標的プローブに対する結合部位を含み、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位を複数含むことと、（Ｃ）その試料を複数のプレ増幅剤と接触させることであって、そのプレ増幅剤が、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むことと、（Ｄ）その試料を複数の増幅剤と接触させることであって、その増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含むことと、（Ｅ）その試料を複数の標識プローブと接触させることであって、その標識プローブが、標識と、増幅剤に対する結合部位を含むことと、（Ｆ）標的２本鎖核酸に結合した標識プローブを検出することによって、標的２本鎖核酸を検出することを含む方法を提供する。

上記のような方法の一実施形態では、プレ増幅剤は、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位を含み、両方のプレ－プレ増幅剤との結合の融解温度は、１つのプレ－プレ増幅剤のみとの結合の融解温度よりも高い。

上記のような方法の一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のような方法の一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のような方法の一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。さらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、（Ａ）標的２本鎖核酸を含む少なくとも１つの固定された浸透化細胞と、（Ｂ）標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、（Ｃ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤を含むプレ－プレ増幅剤セットであって、第１のプレ－プレ増幅剤が、第１の標的プローブに対する結合部位を含み、第２のプレ－プレ増幅剤が、第２の標的プローブに対する結合部位を含み、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位を複数含み、プレ－プレ増幅剤が、第１の標的プローブと第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされているプレ－プレ増幅剤セットと、（Ｄ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤であって、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数のプレ増幅剤と、（Ｅ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の増幅剤と、（Ｆ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の標識プローブを含む、固定された浸透化細胞の試料であって、そのハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が標的２本鎖核酸上に供給される試料を提供する。

上記のような試料の一実施形態では、プレ増幅剤は、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位を含み、両方のプレ－プレ増幅剤との結合の融解温度は、１つのプレ－プレ増幅剤のみとの結合の融解温度よりも高い。

上記のような試料の一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のような試料の一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のような試料の一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。さらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、（Ａ）標的２本鎖核酸を含む固定された浸透化細胞を少なくとも１つ含む複数の固定された浸透化細胞が上に固定化されているスライドと、（Ｂ）標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、（Ｃ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤を含むプレ－プレ増幅剤セットであって、第１のプレ－プレ増幅剤が、第１の標的プローブに対する結合部位を含み、第２のプレ－プレ増幅剤が、第２の標的プローブに対する結合部位を含み、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位を複数含み、プレ－プレ増幅剤が、第１の標的プローブと第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされているプレ－プレ増幅剤セットと、（Ｄ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤であって、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数のプレ増幅剤と、（Ｅ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、第１のプレ増幅剤と第２のプレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の増幅剤と、（Ｆ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の標識プローブを含むスライドであって、そのハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が標的２本鎖核酸上に供給されるスライドを提供する。

上記のようなスライドの一実施形態では、プレ増幅剤は、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位を含み、両方の領域との結合の融解温度は、１つの領域のみとの結合の融解温度よりも高い。

上記のようなスライドの一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のようなスライドの一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のようなスライドの一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。さらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、標的２本鎖核酸を検出するためのキットであって、（Ａ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤を含むプレ－プレ増幅剤セットであって、第１のプレ－プレ増幅剤が、第１の標的プローブに対する結合部位を含み、第２のプレ－プレ増幅剤が、第２の標的プローブに対する結合部位を含み、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位を複数含むプレ－プレ増幅剤セットと、（Ｂ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤と、（Ｃ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤と、（Ｄ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブを含むキットを提供する。

上記のようなキットの一実施形態では、そのキットは、標的プローブセットを含み、その標的プローブセットは、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含む。一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のようなキットの一実施形態では、プレ増幅剤は、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位を含み、両方の領域との結合の融解温度は、１つの領域のみとの結合の融解温度よりも高い。

一実施形態では、そのキットは、細胞を浸透化するための試薬を少なくとも１つ含む。

一実施形態では、本発明は、２本鎖核酸の検出方法であって、（Ａ）２本鎖核酸を１つ以上含む細胞を含む試料を、標的プローブセットと接触させることであって、その標的プローブセットが、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含むことと、（Ｂ）その試料と、第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、プレ増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ－プレ増幅剤とを接触させることと、（Ｃ）その試料と、プレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤とを接触させることと、（Ｄ）その試料を複数の増幅剤と接触させることであって、その増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含むことと、（Ｅ）その試料を複数の標識プローブと接触させることであって、その標識プローブが、標識と、増幅剤に対する結合部位を含むことと、（Ｆ）標的２本鎖核酸に結合した標識プローブを検出することによって、標的２本鎖核酸を検出することを含む方法を提供する。

上記のような方法の一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のような方法の一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のような方法の一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。さらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、（Ａ）標的２本鎖核酸を含む少なくとも１つの固定された浸透化細胞と、（Ｂ）標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、（Ｃ）第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、プレ増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ－プレ増幅剤であって、第１の標的プローブと第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされているプレ－プレ増幅剤と、（Ｄ）プレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤であって、プレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数のプレ増幅剤と、（Ｅ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の増幅剤と、（Ｆ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の標識プローブを含む、固定された浸透化細胞の試料であって、そのハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が標的２本鎖核酸上に供給される試料を提供する。

上記のような試料の一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のような試料の一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のような試料の一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。さらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、（Ａ）標的２本鎖核酸を含む固定された浸透化細胞を少なくとも１つ含む複数の固定された浸透化細胞が上に固定化されているスライドと、（Ｂ）標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、（Ｃ）第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、プレ増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ－プレ増幅剤であって、第１の標的プローブと第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされているプレ－プレ増幅剤と、（Ｄ）プレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤であって、プレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数のプレ増幅剤と、（Ｅ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の増幅剤と、（Ｆ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の標識プローブを含むスライドであって、そのハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が標的２本鎖核酸上に供給されるスライドを提供する。

上記のようなスライドの一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のようなスライドの一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のようなスライドの一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。さらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、標的２本鎖核酸を検出するためのキットであって、（Ａ）第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、プレ増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ－プレ増幅剤と、（Ｂ）プレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤と、（Ｃ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤と、（Ｄ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブを含むキットを提供する。

上記のようなキットの一実施形態では、そのキットは、標的プローブセットを含み、その標的プローブセットは、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、標的２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含む。一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

一実施形態では、そのキットは、細胞を浸透化するための試薬を少なくとも１つ含む。

〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕２本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを検出するためのプローブデザイン（２本鎖プローブ（ｄｓ－プローブ））の概略図を示している。各プローブ対（「Ｚ_１」及び「Ｚ_２」として示されている）では、一方のプローブの標的結合領域は、２本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドのセンス鎖に結合するのに対して、もう一方のプローブの標的結合領域は、アンチセンス鎖に結合する。プローブ対の各プローブが同時に結合することで、プレ増幅剤に対する結合部位が形成される（パネルＡ及びＢ）。パネルＡ及びＢは、二者択一の２つの例示的なプローブ配向を示している。パネルＣは、同じプローブデザインをＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）のシグナル増幅システム（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８（１）：１９９８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１７－０２２９５－５（２０１７））に適合させたものを示している。パネルＣには、標的プローブ対の各メンバーがそれぞれ、標的核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖に結合することが示されている。各標的プローブは、別々のプレ－プレ増幅剤に結合する（パネルＣ）。任意に、１対以上のプローブ対が、同じ２本鎖核酸を標的とするように設計できる。

〔図２〕例示的なｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ（左）と、２本鎖核酸を変性させるために、化学変性を用いた修正型アッセイ（右）の工程のフローチャートを示している。簡潔に述べると、標準的なプロトコールは、スライドを６０℃でベーキングした後、脱パラフィンして、固形パラフィンを除去することから開始する（「ベーキング＋脱パラフィン」）。続いて、スライドを抗原賦活用バッファー（「ＥＲ２」）によって８８℃で処理して、標的（複数可）を露出させてから、プロテアーゼ消化（プロテアーゼＩＩＩ）を行う。その後、標的プローブをスライドにハイブリダイゼーションさせ（「プローブ」）、続いて、プレ増幅剤、増幅剤及び標識プローブと逐次ハイブリダイゼーションさせ（「増幅」）、その後、色原体であるＦａｓｔ Ｒｅｄで、標的を検出する（「検出」）。ＤＮＡを検出するための修正型プロトコールには、化学変性工程（「化学変性」、２×ＳＳＣ中の７０％ホルムアミドによって８０℃で２０分）を加える。

〔図３〕線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）のゲノムＤＮＡの検出には、Ｚ１（センス鎖結合）プローブとＺ２（アンチセンス鎖結合）プローブの両方が必要であり、それにより、２本鎖ＤＮＡに対する特異性が確保されることが示されている。ＤＮＡは、核（青色）内の赤色の斑点として検出された。

〔図４〕細胞（ＨＥＫ２９３）及び組織（大腸癌、卵巣癌、正常な膵臓、正常な乳房）における様々な遺伝子をｄｓ－プローブによって検出した結果を示している。ＤＮＡは、核（青色）内の赤色の斑点として検出された。

〔図５〕Ａ～Ｃは、シグナル生成複合体（ＳＧＣ）を用いて、核酸標的を検出する上記方法の概略図を示している。ＰＰＡはプレ－プレ増幅剤、ＰＡはプレ増幅剤、ＡＭＰは増幅剤、ＬＰは標識プローブである。

〔発明を実施するための形態〕
本発明で開示するのは、ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ及び／またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのような２本鎖核酸の検出方法である。その方法は、細胞内の２本鎖核酸が、高い感度及び高い特異性で検出されるようにする。

最近開発されたＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）というＲＮＡ ＩＳＨ技術では、分岐状のＤＮＡ様シグナル増幅システムと組み合わせて、特別に設計されたオリゴヌクレオチドプローブ（「ダブルＺ」またはＺＺプローブと称する場合もある）を使用して、標準的な明視野顕微鏡下で、１キロベースほどの小ささのＲＮＡを確実に、単分子の感度で検出する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７（１０）：２２０１－２２０８（２０１６）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．１４（１）：２２－２９（２０１２））。このようなプローブデザインは、シグナル増幅の特異性を大きく改善させる。それぞれの対における両方のプローブが、それらの想定標的に結合した場合のみに、シグナルの増幅が可能になるからである。しかしながら、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）をＤＮＡの検出に直接適用すると、望ましくないＲＮＡが検出されることが妨げとなる。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）プローブは、ＤＮＡとＲＮＡ標的とを識別できないからである。ＲＮＡは、酵素的な方法（例えばＲＮａｓｅ Ａ）及び化学的な方法（例えばＮａＯＨ）によって排除できるが、これらの工程を加えると、核及び細胞の形態が大きく損なわれ、ｉｎ ｓｉｔｕ検出アッセイにおけるＤＮＡの検出または２本鎖核酸の検出がうまくいかない可能性がある。

本明細書に記載されているのは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）のシグナル増幅システムの原理を用いて、ＲＮＡからの干渉なしに、２本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを特異的に検出するプローブデザインの方策である。この方策は、２本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのような２本鎖核酸の両方の鎖に結合するように、各プローブ対を設計することによって実現する。１本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡには、各対における２つのプローブのうちの１つしか結合せず、１本鎖ＲＮＡ及び１本鎖ＤＮＡの標的のシグナル増幅と検出が効果的に阻止されるので、１本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡは、検出されないことになる。このアッセイ策により、非常に短いＤＮＡ配列（１ｋｂほどの短い配列）を高い感度及び高い特異性で検出可能になり、分解能が、現行のＤＮＡ ＦＩＳＨアッセイよりも約１００倍高くなる。さらに、本発明の方法では、２本鎖ＤＮＡを選択的に検出することで、２本鎖ＤＮＡと１本鎖ＤＮＡを識別可能となる。本発明の方法は、２本鎖ＲＮＡ及び／またはＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドと、１本鎖ＤＮＡ及び／またはＲＮＡを識別するのにも適用できる。加えて、この方法では、ＤＮＡを検出するときに、ＲＮＡが保持されるので、この方法は、細胞または組織切片の同じ試料内のＲＮＡ標的とＤＮＡ標的を同時に検出するのに用いることができる。

本発明は、細胞内の核酸配列、特には２本鎖核酸を高い感度及び高い特異性で検出可能にする方法に関するものである。本発明の方法には、多くの実用性がある（Ｈｕらによる２０１４年の上記文献、Ｒａｔａｎらによる２０１７年の上記文献、Ｗｅｉｅｒらによる２００２年の上記文献）。本発明の方法は例えば、染色体におけるＤＮＡ配列の物理的マッピングと、ゲノムの空間的構造の３次元（３Ｄ）マッピングと、罹患細胞及び罹患組織における遺伝子のコピー数の増加（重複及び増幅）、喪失（欠失）、ならびに遺伝子の再構成（転座及び融合）の検出と、染色体異常の出生前、出生後及び移植前診断と、がんの診断及び予後診断と、コンパニオン診断と、病原体（例えば、細菌及びウイルス）の検出及び特定に用いることができる。

本発明は、シグナルを増幅させるには、各プローブ対が、ＤＮＡのような２本鎖核酸の両方の鎖に結合しなければならないようにすることによって、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）技術の要であるプローブデザインの原理（Ｗａｎｇらによる２０１２年の上記文献）を拡張して、ＤＮＡのような２本鎖核酸を検出するようにしたものである（図１）。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）のプローブと同様に、各プローブは、標的内の特異的な配列に結合する配列セグメントを含む。２本鎖核酸の検出、例えばＤＮＡの検出の際には、２つのプローブは、標的２本鎖核酸において、対向する鎖上の隣接部位に結合する。両方のプローブが、それぞれの標的部位に同時に結合した場合のみに、シグナル増幅分子（例えば、図１Ａ及び１Ｂにおけるようなプレ増幅剤、または図１Ｃにおけるようなプレ－プレ増幅剤）に対する完全な結合部位を形成可能となり、それにより、シグナルの増幅及び検出が達成される。

図１では、標的プローブ「Ｚ_１」は、例えば米国特許第７，７０９，１９８号、米国公開第２００８／００３８７２５号及び同第２００９／００８１６８８号、ならびにＷＯ２００７／００１９８６及びＷＯ２００７／００２００６に記載されているように、「Ｚ型」の構成で示されている。図１に示されているＺ_１の構成は、その標的プローブのプレ増幅剤またはプレ－プレ増幅剤との結合部位の５’側に標的結合部位を有する（図１Ａ～１Ｃ）。図１に記載されているようなこのような構成は、例示的なものに過ぎず、その配向は、逆であることができ、すなわち、標的結合部位は、プレ増幅剤またはプレ－プレ増幅剤との結合部位の３’側であることができることが理解される。例えば、図１Ａに示されているように、プローブ「Ｚ_２」は、標的結合部位の５’側に、プレ増幅剤との結合部位を有するように示されている。図１Ｂでは、プローブ「Ｚ_２」では、標的結合部位が、プレ増幅剤との結合部位の５’側に示されている。図１Ｃでは、「Ｚ_２」プローブは同様に、プレ－プレ増幅剤との結合部位の５’側に、標的結合部位を有するように示されている。標的プローブ対は独立して、いずれの配向であることもでき、すなわち、標的プローブ対の一方のメンバーは、プレ増幅剤またはプレ－プレ増幅剤との結合部位の５’側または３’側に標的結合部位を有することができ、プレ増幅剤またはプレ－プレ増幅剤の５’側または３’側に結合部位を有する第２のプローブと対をなすことができ、その結果、標的プローブ対の配向の考え得る組み合わせは４つとなることが理解される。

また、図１では、例示上の目的で、２本の鎖が、「センス」及び「アンチセンス」として示されている。標的プローブ対が、２本鎖核酸の対向する鎖に結合することが理解される。２本鎖核酸の領域のうち、標的プローブ対が結合する領域は、コード領域、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖を有するＤＮＡのコード領域内の領域である必要はなく、非コード領域内の領域であることもできることがさらに理解される。

本発明の方法の有効性は、実施例１に記載されているとともに、図３及び４に示されているように、実験によって示された。ＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）のシグナル増幅システム（Ｂａｋｅｒらによる２０１７年の上記文献）を使用するために、同じ方策を適合させ（図１Ｃ）、感度と特異性をさらに改善することができる。ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４５（１２），ｐｉｉ：ｄｅｖ１６５７５３，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．１６５７５３（２０１８））のような他のシグナル増幅方法を修正して、本発明で開示されているような、２本鎖プローブデザインの原理を導入することもできる。最新のＨＣＲ（ＨＣＲ ｖ３．０）では、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）と同様の対にしたプローブデザインが用いられている（Ｃｈｏｉらによる２０１８年の上記文献）。この技法では、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させるには、本明細書に記載されているように、両方のＤＮＡ鎖に結合する、同様の設計のプローブ対を使用でき、それにより、ｄｓＤＮＡに対する特異性が確保される。複数の２本鎖核酸標的、例えば、複数のＤＮＡ標的を同時に、同じスライド上で検出するためのマルチプレックス法は、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）またはＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）の技術のいずれかを用いることで容易になる。すなわち、２本鎖核酸の検出について本明細書で記載されているように、標的プローブ対が標的２本鎖核酸の両方の鎖に結合する標的プローブ構成には、本明細書及び上に記載されているような方法など、ｉｎ ｓｉｔｕアッセイで核酸を検出するための様々な方法を適用できることが理解される。

本明細書に開示されている、本発明の方法を用いて、様々な種類の細胞及び組織におけるいずれの２本鎖核酸（ＤＮＡバイオマーカーなど）も検出することができる。本発明の一実施形態では、ｄｓ－プローブデザインをＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）とともに用いて、細胞及び組織内の複数の遺伝子標的を検出する（実施例１及び図４を参照されたい）。本発明の方法を用いて、ＤＮＡの様々な構造変化（新生物及び他の疾患で見られる欠失、挿入、遺伝子融合、転座、重複及び増幅など）の検出及び特徴付けを行うことができる。本発明の方法を用いて、２本鎖に対する特異性によって、２本鎖のウイルスＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびに細菌ＤＮＡを検出することもできる。

本明細書で使用する場合、「標識プローブ」という用語は、標的分子に直接または間接的に、概ね間接的に結合して、標的を検出可能にする物体を指す。標識プローブ（または「ＬＰ」）は、直接または間接的に検出可能なシグナルを供給する標識を１つ以上含む、典型的には１本鎖のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである核酸結合部分を含む。その標識が、そのポリヌクレオチドに共有結合していることもできるし、またはそのポリヌクレオチドが、その標識に結合するように構成されていることもできる。例えば、ビオチン化ポリヌクレオチドは、ストレプトアビジン結合標識と結合できる。標識プローブは例えば、標的核酸に直接ハイブリダイゼーションできる。概して、標識プローブは、標的核酸に逐次にハイブリダイゼーションしている核酸、または標的核酸にハイブリダイゼーションしている１つ以上の他の核酸に逐次にハイブリダイゼーションしている核酸にハイブリダイゼーションできる。すなわち、標識プローブは、標的核酸のポリヌクレオチド配列、特に、標的核酸の一部分と相補的であるポリヌクレオチド配列を含むことができる。あるいは、標識プローブは、本明細書に記載されているように、増幅剤、プレ増幅剤、プレ－プレ増幅剤、シグナル生成複合体（ＳＧＣ）などにおけるポリヌクレオチド配列と相補的であるポリヌクレオチド配列を少なくとも１つ含むことができる。概して、本発明の実施形態では、標識プローブは、増幅剤に結合する。本明細書で使用する場合、酵素標識を含む標識プローブは、オリゴヌクレオチドのような核酸結合部分と、その核酸結合部分にカップリングした酵素とを含む標識プローブを指す。本明細書で開示されているように、酵素の核酸結合部分へのカップリングは、共有結合であるか、またはビオチン／アビジンのような高親和性結合相互作用もしくはその他の類似の高親和性結合分子によるものであることができる。

本明細書で使用する場合、「標的プローブ」は、標的核酸にハイブリダイゼーションして、標識プローブまたはシグナル生成複合体（ＳＧＣ）の成分、例えば、増幅剤、プレ増幅剤もしくはプレ－プレ増幅剤をその標的核酸に捕捉または結合させることができるポリヌクレオチドである。標的プローブは、標識プローブに直接ハイブリダイゼーションできるか、または標識プローブに逐次にハイブリダイゼーションする１つ以上の核酸にハイブリダイゼーションでき、例えば、標的プローブは、ＳＧＣにおける増幅剤、プレ増幅剤またはプレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションできる。すなわち、標的プローブは、標的核酸のポリヌクレオチド配列と相補的である第１のポリヌクレオチド配列と、標識プローブ、増幅剤、プレ増幅剤、プレ－プレ増幅剤などのポリヌクレオチド配列と相補的である第２のポリヌクレオチド配列を含む。概して、本発明の実施形態では、標的プローブは、図１Ａ及び１Ｂにおけるように、プレ増幅剤に結合するか、または図１Ｃにおけるように、プレ－プレ増幅剤に結合する。標的プローブは概して１本鎖であり、上記の相補的配列が、対応する標的核酸、標識プローブ、増幅剤、プレ増幅剤またはプレ－プレ増幅剤とハイブリダイゼーションするのに利用可能なようになっている。本発明の実施形態では、標的核酸が２本鎖である場合、標的プローブは、対として供給され、その場合には、その対の一方のメンバーは、２本鎖核酸の一方の鎖に結合し、もう一方の標的プローブは、２本鎖核酸の反対側の鎖に結合する。

本明細書で使用する場合、「増幅剤」は、複数の標識プローブにハイブリダイゼーションできる分子、典型的にはポリヌクレオチドである。典型的には、増幅剤は、複数の同一の標識プローブにハイブリダイゼーションする。増幅剤は、標的核酸、標的プローブ対の標的プローブの少なくとも１つ、標的プローブ対の標的プローブの両方、または標的プローブに結合した核酸（増幅剤、プレ増幅剤もしくはプレ－プレ増幅剤など）にハイブリダイゼーションすることもできる。例えば、増幅剤は、少なくとも１つの標的プローブ及び複数の標識プローブ、またはプレ増幅剤及び複数の標識プローブにハイブリダイゼーションできる。概して、本発明の実施形態では、増幅剤は、プレ増幅剤にハイブリダイゼーションできる。増幅剤は例えば、直鎖状、フォーク状、櫛状または分岐状の核酸であることができる。すべてのポリヌクレオチドについて本明細書で記載されているように、増幅剤は、修飾ヌクレオチド及び／または非標準的なヌクレオチド間結合、ならびに標準的なデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び／またはホスホジエステル結合を含むことができる。好適な増幅剤は例えば、米国特許第５，６３５，３５２号、同第５，１２４，２４６号、同第５，７１０，２６４号、同第５，８４９，４８１号及び同第７，７０９，１９８号、ならびに米国公開第２００８／００３８７２５号及び同第２００９／００８１６８８号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により援用される。概して、本発明の実施形態では、増幅剤は、プレ増幅剤及び標識プローブに結合する（図５を参照されたい）。

本明細書で使用する場合、「プレ増幅剤」は、１つ以上の標的プローブと１つ以上の増幅剤の間の中間結合成分としての役割を果たす分子、典型的にはポリヌクレオチドである。典型的には、プレ増幅剤は、１つ以上の標的プローブ及び複数の増幅剤に同時にハイブリダイゼーションする。例示的なプレ増幅剤は例えば、米国特許第５，６３５，３５２号、同第５，６８１，６９７号及び同第７，７０９，１９８号、ならびに米国公開第２００８／００３８７２５号、同第２００９／００８１６８８号及び同第２０１７／０１０１６７２号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により援用される。概して、本発明の実施形態では、プレ増幅剤は、標的プローブ対のメンバーの両方（図１Ａ、１Ｂ及び５Ａを参照されたい）、標的プローブ対に結合できるプレ－プレ増幅剤（図５Ｂ）、または標的プローブ対に結合できるプレ－プレ増幅剤対のメンバーの両方（図５Ｃを参照されたい）に結合する。プレ増幅剤は、増幅剤にも結合する（図５を参照されたい）。

本明細書で使用する場合、「プレ－プレ増幅剤」は、１つ以上の標的プローブ及び１つ以上のプレ増幅剤の間の中間結合成分としての役割を果たす分子、典型的にはポリヌクレオチドである。典型的には、プレ－プレ増幅剤は、１つ以上の標的プローブ及び複数のプレ増幅剤に同時にハイブリダイゼーションする。例示的なプレ－プレ増幅剤は例えば、２０１７／０１０１６７２に記載されており、これは、参照により援用される。概して、本発明の実施形態では、プレ－プレ増幅剤は、標的プローブ対（図５Ｂを参照されたい）または標的プローブ対のメンバー（図１Ｃ及び５Ｃを参照されたい）、及びプレ増幅剤（図５Ｃを参照されたい）に結合する。

本明細書で使用する場合、「複数」という用語は、２以上を意味するものとして理解する。すなわち、複数とは例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７５以上、８０以上、８５以上、９０以上、９５以上、１００以上、１１０以上、１２０以上、１３０以上、１４０以上、１５０以上、１６０以上、１７０以上、１８０以上、１９０以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上もしくは１０００以上、または特定の用途で望ましい場合には、これを上回る数を指すことができる。

一実施形態では、本発明は、２本鎖核酸の検出方法であって、（Ａ）２本鎖核酸を１つ以上含む細胞を含む試料を、標的プローブセットと接触させることであって、その標的プローブセットが、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含むことと、（Ｂ）その試料と、第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤とを接触させることと、（Ｃ）その試料を複数の増幅剤と接触させることであって、その増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含むことと、（Ｄ）その試料を複数の標識プローブと接触させることであって、その標識プローブが、標識と、増幅剤に対する結合部位を含むことと、（Ｅ）標的２本鎖核酸に結合した標識プローブを検出することによって、標的２本鎖核酸を検出することを含む方法を提供する。

一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。さらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、２本鎖核酸の検出方法であって、（Ａ）２本鎖核酸を１つ以上含む細胞を含む試料を、標的プローブセットと接触させることであって、その標的プローブセットが、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含むことと、（Ｂ）その試料と、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤を含むプレ－プレ増幅剤セットとを接触させることであって、第１のプレ－プレ増幅剤が、第１の標的プローブに対する結合部位を含み、第２のプレ－プレ増幅剤が、第２の標的プローブに対する結合部位を含み、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位を複数含むことと、（Ｃ）その試料を複数のプレ増幅剤と接触させることであって、そのプレ増幅剤が、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むことと、（Ｄ）その試料を複数の増幅剤と接触させることであって、その増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含むことと、（Ｅ）その試料を複数の標識プローブと接触させることであって、その標識プローブが、標識と、増幅剤に対する結合部位を含むことと、（Ｆ）標的２本鎖核酸に結合した標識プローブを検出することによって、標的２本鎖核酸を検出することを含む方法を提供する。

一実施形態では、プレ増幅剤は、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位を含み、両方のプレ－プレ増幅剤との結合の融解温度は、１つのプレ－プレ増幅剤のみとの結合の融解温度よりも高い。

標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。さらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、２本鎖核酸の検出方法であって、（Ａ）２本鎖核酸を１つ以上含む細胞を含む試料を、標的プローブセットと接触させることであって、その標的プローブセットが、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含むことと、（Ｂ）その試料と、第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、プレ増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ－プレ増幅剤とを接触させることと、（Ｃ）その試料と、プレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤とを接触させることと、（Ｄ）その試料を複数の増幅剤と接触させることであって、その増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含むことと、（Ｅ）その試料を複数の標識プローブと接触させることであって、その標識プローブが、標識と、増幅剤に対する結合部位を含むことと、（Ｆ）標的２本鎖核酸に結合した標識プローブを検出することによって、標的２本鎖核酸を検出することを含む方法を提供する。

上記のような方法の一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のような方法の一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のような方法の一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。さらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

本発明のいくつかの実施形態では、標的核酸に特異的である各標的プローブセットは、同じ標的２本鎖核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。このような場合には、標的核酸に特異的な標的プローブセットにおける標的プローブ対は、標的核酸のうちの異なる非重複配列に結合する。同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションできる標的プローブ対を２対以上有する標的プローブセットを使用する場合には、それらの標的プローブ対に結合する分子、すなわち、プレ増幅剤（図１Ａ、１Ｂ及び５Ａを参照されたい）またはプレ－プレ増幅剤（図１Ｃ、５Ｂ及び５Ｃを参照されたい）のいずれかは、同じ標的プローブセットにおける標的プローブ対において、概ね同じである。すなわち、同じ標的２本鎖核酸に結合する標的プローブ対は、それらの標的プローブ対に結合する、ＳＧＣにおける上記分子、すなわち、プレ増幅剤またはプレ－プレ増幅剤に対する同じ結合部位を含むように設計できる。標的核酸を検出するために、複数の標的プローブ対を使用することにより、同じ標的核酸上で、複数のＳＧＣからなるアセンブリーと関連付けられたさらに高度なシグナルが得られる。いくつかの実施形態では、同じ標的核酸に結合させるのに使用する標的プローブ対の数は、１つの標的当たり１～１０対、１～２０対、１～３０対、１～４０対、１～５０対、１～６０対、１～７０対、１～８０対、１～９０対、１～１００対、１～１１０対、１～１２０対、１～１３０対、１～１４０対、１～１５０対、１～１６０対、１～１７０対、１～１８０対、１～１９０対、１～２００対の範囲もしくはこれを上回る数の対であるか、またはこれらの間のいずれかの整数分の対、例えば、１対、２対、３対、４対、５対、６対、７対、８対、９対、１０対、１１対、１２対、１３対、１４対、１５対、１６対、１７対、１８対、１９対、２０対、２１対、２２対、２３対、２４対、２５対、２６対、２７対、２８対、２９対、３０対、３１対、３２対、３３対、３４対、３５対、３６対、３７対、３８対、３９対、４０対、４１対、４２対、４３対、４４対、４５対、４６対、４７対、４８対、４９対、５０対、５１対、５２対、５３対、５４対、５５対、５６対、５７対、５８対、５９対、６０対、６１対、６２対、６３対、６４対、６５対、６６対、６７対、６８対、６９対、７０対、７１対、７２対、７３対、７４対、７５対、７６対、７７対、７８対、７９対、８０対、８１対、８２対、８３対、８４対、８５対、８６対、８７対、８８対、８９対、９０対、９１対、９２対、９３対、９４対、９５対、９６対、９７対、９８対、９９対、１００対、１０１対、１０２対、１０３対、１０４対、１０５対、１０６対、１０７対、１０８対、１０９対、１１０対、１１１対、１１２対、１１３対、１１４対、１１５対、１１６対、１１７対、１１８対、１１９対、１２０対、１２１対、１２２対、１２３対、１２４対、１２５対、１２６対、１２７対、１２８対、１２９対、１３０対、１３１対、１３２対、１３３対、１３４対、１３５対、１３６対、１３７対、１３８対、１３９対、１４０対、１４１対、１４２対、１４３対、１４４対、１４５対、１４６対、１４７対、１４８対、１４９対、１５０対、１５１対、１５２対、１５３対、１５４対、１５５対、１５６対、１５７対、１５８対、１５９対、１６０対、１６１対、１６２対、１６３対、１６４対、１６５対、１６６対、１６７対、１６８対、１６９対、１７０対、１７１対、１７２対、１７３対、１７４対、１７５対、１７６対、１７７対、１７８対、１７９対、１８０対、１８１対、１８２対、１８３対、１８４対、１８５対、１８６対、１８７対、１８８対、１８９対、１９０対、１９１対、１９２対、１９３対、１９４対、１９５対、１９６対、１９７対、１９８対、１９９対、２００対などである。

本発明の方法を用いて、所望の標的２本鎖核酸の検出を実現できる。一実施形態では、複数の標的プローブ対によって標的核酸を検出する。このような場合には、複数のＳＧＣからなるアセンブリーが、標的核酸上に得られるように、標的プローブ対は、２つ以上の標的核酸領域に結合するように設計する。複数の標的プローブ対を用いて、同じ標的核酸に結合する場合には、ある１つの標的プローブ対の標的結合部位は、別の標的プローブ対の標的結合部位と重複しないことが理解される。

本発明の実施形態では、本発明の方法によって検出する標的核酸は、細胞試料に存在するいずれかの２本鎖標的核酸であることができる。標的２本鎖核酸の検出のための本発明の方法では、標的核酸は独立して、ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであることができることが理解される。すなわち、検出対象の標的核酸は、同じ種類の核酸であることができるが、それは必須ではない。加えて、本発明の方法は、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）またはＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）のような１本鎖核酸の検出方法と組み合わせることができ、その結果、同じ試料内で、２本鎖核酸と１本鎖核酸の両方を検出できるようになる。標的核酸としては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ミトコンドリアＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡなどを含むＲＮＡ、もしくはＤＮＡなど、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが挙げられるが、これらに限らない。標的核酸がＲＮＡである場合には、標的核酸は独立して、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ミトコンドリアＲＮＡ及びノンコーディングＲＮＡからなる群から選択できることが理解される。すなわち、標的核酸は独立して、１本鎖もしくは２本鎖のいずれかであるＤＮＡ、または１本鎖もしくは２本鎖のいずれかであるいずれかの種類のＲＮＡ、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであることができる。

本明細書に記載されているように、本発明の方法は概して、２本鎖核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出に関するものである。核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出法は、当業者には周知である（例えば、ＵＳ２００８／００３８７２５、ＵＳ２００９／００８１６８８、Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．３５：５９５－６０１（２００４）を参照されたい）。本明細書で使用する場合、「ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」または「ＩＳＨ」とは、直接または間接的に標識した相補的なＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖（プローブなど）を用いて、試料、具体的には、組織または細胞の一部または切片（ｉｎ ｓｉｔｕ）における所定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）に結合して、その核酸の位置を特定するタイプのハイブリダイゼーションを指す。そのプローブの種類は、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、１本鎖相補的ＲＮＡ（ｓｓｃＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ及び／または合成オリゴヌクレオチドであることができる。「蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」または「ＦＩＳＨ」という用語は、蛍光標識を利用するタイプのＩＳＨを指す。「発色ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」または「ＣＩＳＨ」という用語は、発色標識を用いるタイプのＩＳＨを指す。ＩＳＨ、ＦＩＳＨ及びＣＩＳＨの方法は、当業者には周知である（例えば、Ｓｔｏｌｅｒ，Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０（１）：２１５－２３６（１９９０）；Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２）、Ｓｃｈｗａｒｚａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｈｅｓｌｏｐ－Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ （２０００）を参照されたい）。

細胞内の核酸標的のｉｎ ｓｉｔｕ検出のための本発明の方法（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたはフローサイトメトリーが挙げられるが、これらに限らない）では、標的プローブをハイブリダイゼーションさせる前に、細胞を任意に固定及び／または浸透化する。細胞を固定及び浸透化することで、核酸標的が細胞内に留まるように促すとともに、標的プローブ、標識プローブ、増幅剤、プレ増幅剤、プレ－プレ増幅剤などが細胞内に入って、標的核酸分子に到達するようにできる。その細胞を任意に洗浄して、核酸標的にキャプチャーされなかった物質を除去する。様々な工程のうちのいずれの後も、例えば、未結合の標的プローブを除去するために、標的プローブを核酸標的にハイブリダイゼーションさせた後や、プレ－プレ増幅剤、プレ増幅剤、増幅剤及び／または標識プローブを標的プローブにハイブリダイゼーションさせた後などに、細胞を洗浄することができる。核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のために、細胞を固定及び浸透化する方法、ならびに標的核酸をハイブリダイゼーション、洗浄及び検出する方法も、当該技術分野において周知である（例えば、ＵＳ２００８／００３８７２５、ＵＳ２００９／００８１６８８、Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．３５：５９５－６０１（２００４）、Ｓｔｏｌｅｒ，Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０（１）：２１５－２３６（１９９０）、Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２）、Ｓｃｈｗａｒｚａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｈｅｓｌｏｐ－Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ（２０００）、Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）、Ｏｒｍｅｒｏｄ，Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９９）を参照されたい）。例示的な固定剤としては、アルデヒド（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）、アセトン、アルコール（メタノール、エタノールなど）が挙げられるが、これらに限らない。例示的な浸透化剤としては、アルコール（メタノール、エタノールなど）、酸（氷酢酸など）、洗浄剤（Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ－４０、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０など）、サポニン、ジギトニン、Ｌｅｕｃｏｐｅｒｍ（商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ならびに酵素（例えば、リゾチーム、リパーゼ、プロテアーゼ及びペプチダーゼ）が挙げられるが、これらに限らない。浸透化は、組織薄切片におけるように、機械的破砕によって行うこともできる。

２本鎖核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出の際には、概して、試料を処理して、試料中の２本鎖核酸を変性させ、標的プローブを到達可能にして、標的プローブが、ハイブリダイゼーションによって、標的２本鎖核酸の両方の鎖に結合するようにする。２本鎖核酸を変性させる条件は、当該技術分野において周知であり、熱及び化学物質、例えば、塩基（ＮａＯＨ）、ホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどによる変性が挙げられる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ Ｔｏｘｉｃｏｌ．２９：ｅ２０１４００７（ｄｏｉ：１０．５６２０／ｅｈｔ．２０１４．２９．ｅ２０１４００７）２０１４、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）を参照されたい）。例えば、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨもしくはＫＯＨ、またはその他の高ｐＨ緩衝剤（ｐＨ１１超）を用いて、ＤＮＡのような２本鎖核酸を変性させることができる。加えて、熱による変性方法と、化学物質による変性方法を併用することができる。

例示的なアッセイプロトコールは、図２に概説されている。図２に示されているアッセイは、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＢＯＮＤ ＲＸシステム（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）で用いるためのＲＮＡＳｃｏｐｅ（商標）２．５ ＬＳ Ｒｅｄアッセイ（ユーザーマニュアル３２２１５０、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｅｗａｒｋ ＣＡ）に対応する。簡潔に述べると、標準的なプロトコールは、スライドを６０℃でベーキングした後、脱パラフィンして、固形パラフィンを除去することから開始する（「ベーキング＋脱パラフィン」）。続いて、スライドを抗原賦活用バッファー（「ＥＲ２」）によって８８℃で処理して、標的（複数可）を露出させてから、プロテアーゼ消化（プロテアーゼＩＩＩ）を行う。その後、標的プローブをスライドにハイブリダイゼーションさせ（「プローブ」）てから、プレ増幅剤、増幅剤及び標識プローブと逐次ハイブリダイゼーションさせ（「増幅」）、その後、色原体であるＦａｓｔ Ｒｅｄで、標的を検出する。ＤＮＡを検出するための修正型プロトコールには、化学変性工程（「化学変性」、２×ＳＳＣ中の７０％ホルムアミドによって８０℃で２０分）を加える。

このようなｉｎ ｓｉｔｕ検出法は、ガラススライドに固定化した組織標本、血液試料から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のような懸濁状のシングルセルなどに対して用いることができる。組織標本としては例えば、組織生検試料が挙げられる。血液試料としては例えば、診断目的で採取した血液試料が挙げられる。血液試料の場合、血液塗抹標本におけるように、血液を直接解析でき、あるいは、血液を処理して、例えば、赤血球細胞の溶解、ＰＢＭＣまたは白血球の単離、標的細胞の単離などを行って、試料中の細胞のうち、本発明の方法によって解析する細胞が、血液試料中に存在するように、または血液試料から抽出されるようにできる。同様に、組織検体の処理を行うことができ、例えば、組織検体を細かく切断し、物理的または酵素的に処理して、組織を破壊して、個々の細胞または細胞クラスターの状態にすることができる。加えて、望ましい場合には、細胞学的試料を処理して、細胞を単離するか、または細胞クラスターを破壊することができる。したがって、当該技術分野において周知の方法を用いて、組織、血液及び細胞学的試料を入手及び処理することができる。本発明の方法は、病態を示すバイオマーカーである２本鎖核酸標的の有無に基づき、病的細胞の有無を確認する診断用途で用いることができる。

本発明の方法を用いて標的２本鎖核酸を検出する際には、いずれかの数の好適な試料を使用できることが、当業者には理解される。本発明の方法で用いる試料は概して、生体試料または組織試料となる。このような試料は、生体対象から得ることができ、個体または何らかの他の生体物質源（生検体、剖検体または鑑定物質など）から採取される生体組織または体液由来の試料が挙げられる。生体試料には、前がん細胞、がん細胞、前がん組織もしくはがん組織を含むか、またはその細胞もしくは組織を含む疑いのある、生体対象の領域から得た試料、例えば組織生検体（細針吸引物、血液試料または細胞学的検体が挙げられる）も含まれる。このような試料は、哺乳動物のような生物から単離した器官、組織、組織断片及び／または細胞であることができるが、これらに限らない。例示的な生体試料としては、細胞培養物（初代細胞培養物を含む）、細胞株、組織、器官、細胞小器官、生体液などが挙げられるが、これらに限らない。追加の生体試料としては、皮膚試料、組織生検体（細針吸引物を含む）、細胞学的試料、便、体液（血液及び／または血清の試料、唾液、精液を含む）などが挙げられるが、これらに限らない。このような試料は、医学または獣医学における診断目的で用いることができる。試料は、他の供給源、例えば、食物、土壌、物体表面など、及び２本鎖核酸の検出が望まれるその他の物質から得ることができる。したがって、本発明の方法は、個体またはその他の供給源から採取した生体試料から、１つ以上の病原体（２本鎖のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス、細菌、真菌、寄生虫のような単細胞生物など）を検出するのに用いることができる。

本発明の方法による解析用の細胞学的試料を採取することは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｄｅｙ，“Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ，Ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ”ｉｎ Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｐｐ．１２１－１３２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（２０１８）、“Ｎｏｎ－Ｇｙｎｏｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ”Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ａｄｏｐｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＡＳＣ ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ ｂｏａｒｄ Ｍａｒｃｈ ２，２００４を参照されたい）。子宮頸部組織の解析用に、試料（組織生検体及び細胞学的試料を含む）を処理する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｃｅｃｉｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｐｌｕｍ，ｅｄｓ．，２０ｔｈ ｅｄ．，ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９６）、Ｃｏｌｐｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ：Ａ Ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｌｌｏｒｓ ａｎｄ Ｓａｎｋａｒａｎａｒａｙａｎａｎ，ｅｄｓ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ（２００３）、Ｋａｌａｆ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．６０：４４９－４５５（２００７）、Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｔｒｉｍｂｌｅ，Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．２６：２３３－２４２（２０１２）、Ｗａｘｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１２０：１４６５－１４７１（２０１２）、Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ＴＯＣ，Ａｐｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（ＡＳＣ）Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ Ｂｏａｒｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ１０，２０００を参照されたい）。一実施形態では、細胞学的試料は、子宮頸部試料、例えばパップスメアである。一実施形態では、その試料は、細針吸引物である。

本発明の特定の実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。本発明の別の特定の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。本発明のさらに別の特定の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

本発明は、２本鎖核酸を検出可能な標識で標識するために、標的２本鎖核酸との間で複合体を構築することに基づくものである。このような複合体は、シグナル生成複合体（ＳＧＣ、例えばＵＳ２０１７０１０１６７２を参照されたい）と称する場合がある。このような複合体、すなわちＳＧＣは、多数の標識を標的２本鎖核酸に結合させる分子の層を構築することによって実現する。

本発明の方法では、シグナル生成複合体（ＳＧＣ）を利用でき、そのＳＧＣは、１つの分子ではなく、複数の分子を含む。このようなＳＧＣは、検出可能なシグナルを増幅して、標的核酸のさらに高感度な検出を行うのに特に有用である。シグナルを増幅するためのこのような方法は例えば、米国特許第５，６３５，３５２号、同第５，１２４，２４６号、同第５，７１０，２６４号、同第５，８４９，４８１号及び同第７，７０９，１９８号、米国公開第２００８／００３８７２５号及び同第２００９／００８１６８８号、ならびにＷＯ２００７／００１９８６及びＷＯ２０１２／０５４７９５に記載されており、これらの各々は、参照により、本明細書に援用される。ＳＧＣの生成は、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）アッセイの原理である（米国特許第７，７０９，１９８号、同第８，６５８，３６１号及び同第９，３１５，８５４号、米国公開第２００８／００３８７２５号、同第２００９／００８１６８８号及び同第２０１６／０２０１１１７号、ならびにＷＯ２００７／００１９８６及びＷＯ２０１２／０５４７９５（これらの各々は、参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）。

基本的なシグナル生成複合体（ＳＧＣ）は、図５Ａに示されている（ＵＳ２００９／００８１６８８（参照により、本明細書に援用される）も参照されたい）。図５に「Ｚ」の対として示されている標的プローブ対は、「標的」と表示されている相補的な分子配列にハイブリダイゼーションする。簡略化のために、図５では、標的が１本の線で示されているが、本発明における標的は、図１に、より詳細に示されているように、２本鎖核酸であることが理解される。各標的プローブは、プレ増幅剤分子（ＰＡ、緑色で示されている）と相補的な追加の配列を含み、このＰＡは、安定して結合するためには、標的プローブ対の両方のメンバーに同時にハイブリダイゼーションしなければならない。プレ増幅剤分子は、各標的プローブにハイブリダイゼーションする領域を有する１つのドメインと、増幅剤分子（Ａｍｐ、黒色で示されている）上の配列とそれぞれ相補的な１連のヌクレオチド配列リピートを含む１つのドメインという２つのドメインから構成される。この配列において複数のリピートが存在することで、１つのプレ増幅剤に複数の増幅剤分子がハイブリダイゼーション可能になり、それにより、全体のシグナル増幅が増大する。各増幅剤分子は、プレ増幅剤にハイブリダイゼーションする領域を有する１つのドメインと、標識プローブ（ＬＰ、黄色で示されている）上の配列とそれぞれ相補的な１連のヌクレオチド配列リピートを含む１つのドメインという２つのドメインから構成され、このことにより、複数の標識プローブが各増幅剤分子にハイブリダイゼーション可能になり、それにより、全体のシグナル増幅がさらに増大する。各標識プローブは、２つの成分を含む。１つの成分は、標識プローブをハイブリダイゼーションさせるように、増幅剤分子上のリピート配列と相補的なヌクレオチド配列から構成される。このヌクレオチド配列は、第２の成分に連結されており、この第２の成分は、いずれのシグナル生成物であることもでき、そのシグナル生成物としては、本明細書に記載されているように、直接可視化するための蛍光標識もしくは発色標識、直接検出可能な金属同位体、または蛍光、発色もしくはその他の検出可能なシグナルを生成する化学反応を促進できる酵素もしくはその他の化学物質が挙げられる。図５Ａでは、標識プローブは、核酸成分を表す線と、シグナル生成成分を表す星印として描かれている。総称して、標的プローブから標識プローブまでのアセンブリーをシグナル生成複合体（ＳＧＣ）という。

図５Ｂには、増幅分子層、このケースでは、プレ－プレ増幅剤分子（ＰＰＡ、赤色で示されている）を加えることによって増強されたＳＧＣが示されている。ＰＰＡは、一方のドメインでは、両方の標的プローブに結合し、もう一方のドメインでは、複数のプレ増幅剤（ＰＡ）に結合する。

図５Ｃには、プレ増幅剤レベルで連携的ハイブリダイゼーションを利用する異なるＳＧＣ構造が示されている（ＵＳ２０１７／０１０１６７２（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）。図５Ａ及び５Ｂで形成されるＳＧＣと同様に、標的プローブ対は、標的分子配列にハイブリダイゼーションする。各標的プローブは、固有のプレ－プレ増幅剤分子（ＰＰＡ－１（紫色で示されている）、ＰＰＡ－２（赤色で示されている））と相補的な追加の配列を含む。２つの独立した分子を使用することで、連携的ハイブリダイゼーションを必要にできる土台が確立される。各プレ－プレ増幅剤分子は、標的プローブのうちの１つにハイブリダイゼーションする領域を有する１つのドメインと、プレ増幅剤分子（ＰＡ、緑色で示されている）内の配列と相補的な配列を両方がそれぞれ含む１連のヌクレオチド配列リピートを含む１つのドメインという２つのドメイン、ならびにＰＰＡとＰＡの結合効率を促進するスペーサー配列から構成される。成長していくＳＧＣに安定して結合するように、各ＰＡは、両方のＰＰＡ分子に同時にハイブリダイゼーションしなければならない。各プレ増幅剤分子は、ハイブリダイゼーションできるように、両方のプレ－プレ増幅剤と相補的な配列を含む１つのドメインと、増幅剤分子（ＡＭＰ、黒色で示されている）上の配列とそれぞれ相補的な１連のヌクレオチド配列リピートを含む１つのドメインという２つのドメインから構成される。増幅剤ハイブリダイゼーション配列の複数のリピートにより、複数の増幅剤分子が各プレ増幅剤にハイブリダイゼーション可能になり、それにより、シグナルの増幅がさらに増大する。図の簡略化のために、増幅剤分子は、１つのプレ増幅剤分子にハイブリダイゼーションするように示されているが、増幅剤が、各プレ増幅剤に結合できることが理解される。各増幅剤分子は、標識プローブ（ＬＰ、黄色で示されている）内の配列と相補的な１連のヌクレオチド配列リピートを含み、これにより、数個の標識プローブが、各増幅剤分子にハイブリダイゼーション可能になる。各標識プローブは、シグナルを検出させるためのシグナル生成エレメントを含む。

上記のように、図１Ａ、１Ｂ及び５Ａに示されている構成、または図１Ｃ及び５Ｃに示されている構成を用いるかにかかわらず、ＳＧＣを構築するには、両方の標的プローブの結合が必要となるように、ＳＧＣの成分を設計する。図１Ａ、１Ｂ、５Ａ及び５Ｂの構成の場合には、プレ増幅剤（または図５Ｂのプレ－プレ増幅剤）は、安定な結合を実現させるには、標的プローブ対のメンバーの両方に結合しなければならない。このことは、標的プローブの両方とプレ増幅剤（またはプレ－プレ増幅剤）との結合の融解温度（Ｔｍ）が、１つの標的プローブとプレ増幅剤（またはプレ－プレ増幅剤）との結合のＴｍよりも高くなるように、かつ１つの標的プローブが結合している状態が、アッセイ条件下では不安定になるように、標的プローブとプレ増幅剤（またはプレ－プレ増幅剤）との結合部位を設計することによって実現する。このデザインは例えば、米国特許第７，７０９，１９８号、米国公開第２００８／００３８７２５号及び同第２００９／００８１６８８号、ＷＯ２００７／００１９８６、ＷＯ２００７／００２００６、Ｗａｎｇらによる上記の２０１２年の文献、Ａｎｄｅｒｓｏｎらによる上記の２０１６年の文献で以前に説明されている。ＳＧＣの成分をこの方法で構成させることによって、両方の標的プローブが標的核酸及びプレ増幅剤に結合すると、ＳＧＣのアセンブルが行われ、それによって、ＳＧＣが偽陽性としてアセンブルされるのが最小限に抑えられることに起因して、バックグラウンドノイズが軽減される。

図１Ｃ及び５Ｃの構成の場合には、それぞれ標的プローブ対の両方のメンバーに逐次に結合しているプレ－プレ増幅剤の両方にプレ増幅剤が結合することを必要とすることによって、標的プローブ対のメンバーの両方が標的核酸に結合した場合のみに、ＳＧＣが形成されなければならないという要件が実現する。両方のプレ－プレ増幅剤とプレ増幅剤との結合の融解温度（Ｔｍ）が、いずれかのプレ－プレ増幅剤単独の融解温度よりも高くなるように、かつプレ－プレ増幅剤のうちの１つがプレ増幅剤に結合している状態が、アッセイ条件下では不安定になるように、プレ－プレ増幅剤とプレ増幅剤との結合部位を設計することによって、上記の要件が実現する。このデザインは、例えば、ＵＳ２０１７０１０１６７２、ＷＯ２０１７／０６６２１１及びＢａｋｅｒらによる上記の２０１７年の文献で以前に説明されている。プレ増幅剤が、両方のプレ－プレ増幅剤に結合しない限り、増幅剤及び標識プローブは、標的核酸に結合したＳＧＣにアセンブルできず、それによって、ＳＧＣが偽陽性としてアセンブルされるのが最小限に抑えられることに起因して、バックグラウンドノイズが軽減される。

本明細書で開示されているように、本発明は、細胞内の標的核酸の存在を検出するために、標的核酸に結合したシグナル生成複合体（ＳＧＣ）を構築することに基づく。核酸のハイブリダイゼーション反応を利用して、ＳＧＣの成分を標的核酸に結合させるように、ＳＧＣを構築するための成分は概して、核酸を含む。適切な領域を選択して、標的核酸に結合する特異的かつ選択的な試薬、具体的には、標的核酸に特異的かつ選択的に結合するオリゴヌクレオチドまたはプローブ、またはＳＧＣの他の成分を設計する方法は、当業者には周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）を参照されたい）。標的プローブは、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションするように設計する。適切な選択の標的核酸領域、及び適切な長さの結合剤（オリゴヌクレオチドまたはプローブなど）を用いて、所望の特異性を実現でき、このような選択方法は、当業者には周知である。当業者は、１つの特異的な標的核酸を、別の標的核酸もしくは非標的核酸よりも高度に標的化したり、ＳＧＣの成分に結合させたりするのに使用できる適切な試薬（オリゴヌクレオチドまたはプローブなど）を容易に把握するとともに、容易に判定できる。すなわち、「特異的にハイブリダイゼーションする」、「特異的に標識する」及び「特異的に結合する」（またはこれらの文法的な変形状態）とは、標的核酸にハイブリダイゼーション、標識または結合するが、非標的核酸、例えば、標的化の対象となるのが望ましくない別の標的核酸または核酸にはハイブリダイゼーション、標識または結合しないことを指すことが理解される。標的特異的ＳＧＣの所定の成分（例えば、標的プローブ、プレ－プレ増幅剤、プレ増幅剤、増幅剤、標識プローブ）が、それぞれの成分に結合して、その標的特異的ＳＧＣが、特異的標的には結合し、別の標的核酸には結合しないように、適切な選択の固有配列を用いることによって、標的特異的ＳＧＣにおいて、同様の特異性を実現できる。

本明細書に記載されているように、本発明の実施形態は、標的プローブ対の使用を含み、その標的プローブ対のそれぞれのメンバーは、２本鎖核酸の対向する鎖に結合する。標的プローブ対が、同じプレ増幅剤（図１Ａ、１Ｂ及び５Ａ）またはプレ－プレ増幅剤（図５Ｂ）に結合する場合には、「Ｚ型」構成と称する場合があるプローブ構成を使用できる。感度を上昇させ、バックグラウンドを軽減するためのこのような構成及びその利点は例えば、米国特許第７，７０９，１９８号、米国公開第２００８／００３８７２５号及び同第２００９／００８１６８８号、ならびにＷＯ２００７／００１９８６及びＷＯ２００７／００２００６で説明されており、これらの各々は、参照により、本明細書に援用される。米国特許第７，７０９，１９８号、ならびに米国公開第２００８／００３８７２５号及び同第２００９／００８１６８８号には、加えて、標的プローブ対のような標的プローブの特徴（長さ、配向、ハイブリダイゼーション条件などを含む）の選択に関する詳細が記載されている。当業者は、本明細書、ならびに例えば、米国特許第７，７０９，１９８号、米国公開第２００８／００３８７２５号、同第２００９／００８１６８８号、ＷＯ２００７／００１９８６及びＷＯ２００７／００２００６の教示に基づき、好適な構成を容易に特定できる。

本明細書に記載されているように、標的プローブ対における標的プローブの標的結合部位は、いずれかの所望の配向及び組み合わせであることができる。例えば、標的プローブ対のメンバーの１つの標的結合部位は、プレ増幅剤またはプレ－プレ増幅剤の結合部位の５’または３’側であることができ、標的プローブ対のもう一方のメンバーは独立して、プレ増幅剤またはプレ－プレ増幅剤の結合部位の５’または３’側に標的結合部位を有する配向にできる。

別の実施形態では、標的２本鎖核酸の存在を検出するのに用いるＳＧＣは、ＳＧＣの１つ以上の成分が連携的にハイブリダイゼーションすることに基づくものである（ＵＳ２０１７０１０１６７２及びＷＯ２０１７／０６６２１１（それぞれ、参照により本明細書に援用される）を参照されたい）。このような連携的ハイブリダイゼーションは、本明細書ではＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）ともいう。連携的ハイブリダイゼーションの作用では、ＳＧＣの２成分間の結合は、２つの結合部位によって媒介され、その２つの部位が同時に結合した場合の融解温度は、１つの部位が単独で結合した場合の融解温度よりも高い（ＵＳ２０１７０１０１６７２及びＷＯ２０１７／０６６２１１を参照されたい）。連携的ハイブリダイゼーションの作用は、ＵＳ２０１７０１０１６７２及びＷＯ２０１７／０６６２１１に記載されているような標的プローブセット構成によって増強できる。

本発明の方法及び関連する組成物では、連携的ハイブリダイゼーションを用いて、２本鎖核酸標的のｉｎ ｓｉｔｕ検出（複雑な生理化学的環境及び圧倒的な数の非標的分子の存在により、ノイズが高くなり得る）において、特異性を向上させるとともに、バックグラウンドを軽減することができる。このような連携的ハイブリダイゼーション法を用いて、ＳＧＣが標的核酸に結合した場合のみに、標識プローブを結合させる。ＵＳ２０１７０１０１６７２及びＷＯ２０１７／０６６２１１に記載され、その図１に図示されているように、この方法は、ＳＧＣの１つ以上の成分における連携的ハイブリダイゼーションの回数を増やすことによって、所望のシグナルノイズ比となるように容易に修正できる。

別の実施形態では、連携的ハイブリダイゼーションは、ＳＧＣの様々な成分に適用できる。例えば、ＳＧＣの成分間の結合は、本明細書に記載されているように、安定な反応にでき、あるいは、その結合は、これも本明細書に記載されているように、連携的ハイブリダイゼーションを必要とする構成にできる。このような場合には、連携的ハイブリダイゼーションが想定される結合成分は、別の成分に結合する２つのセグメントを含むように設計する。

すなわち、標的核酸を検出する方法では、標的核酸に特異的に結合するＳＧＣをもたらす検出システムにおける成分のいずれか１つまたは全部の結合反応に、連携的ハイブリダイゼーションを用いることができる。いくつの成分かつどの成分に連携的ハイブリダイゼーションを適用するかは、所望のアッセイ条件、アッセイする試料の種類、所望のアッセイ感度などに基づいて選択できる。連携的ハイブリダイゼーション結合反応のいずれか１つまたはそれらを組み合わせたものを使用して、アッセイの感度及び特異性を向上できる。本発明の実施形態では、連携的ハイブリダイゼーションは、プレ－プレ増幅剤及びプレ増幅剤の間、プレ増幅剤及び増幅剤の間、増幅剤及び標識プローブの間、またはこれらの組み合わせであることができる（例えば、ＵＳ２０１７０１０１６７２及びＷＯ２０１７／０６６２１１を参照されたい）。

本明細書で開示されているように、これらの成分は概して、互いに直接結合する。核酸を含む成分の場合、結合反応は概して、ハイブリダイゼーションによるものである。ハイブリダイゼーション反応の場合には、成分間の結合は、直接的な結合である。望ましい場合には、ある１つの成分と別の成分との結合が間接的な結合になるように、中間成分を含めることができ、例えば、中間成分は、２つの他の成分を架橋するための相補的な結合部位を含む。

本明細書に記載されているように、各種成分の構成は、所望の安定的または連携的ハイブリダイゼーション結合反応をもたらすように選択できる（例えばＵＳ２０１７０１０１６７２を参照されたい）。本明細書において、結合反応が安定な反応として例示されていても、または連携的ハイブリダイゼーションにおけるように、不安定な反応として例示されていても、そのいずれの結合反応も、標的２本鎖核酸が検出される限りは、所望に応じて改変できることが理解される。さらに、使用するアッセイ条件及びハイブリダイゼーション条件に応じて、構成を変更及び選択できることが理解される。概して、結合反応が安定的であることが望ましい場合には、上記成分間の相補的な核酸配列のセグメントは概して、１０～５０ヌクレオチド以上、例えば１６～３０ヌクレオチドの範囲（１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、４３ヌクレオチド、４４ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、４６ヌクレオチド、４７ヌクレオチド、４８ヌクレオチド、４９ヌクレオチドまたは５０ヌクレオチド以上など）である。連携的ハイブリダイゼーション結合反応を用いる場合のように、結合反応が、比較的不安定であることが望ましい場合には、上記成分間の相補的な核酸配列のセグメントは概して、５～１８ヌクレオチドの範囲（例えば、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドなど）である。このヌクレオチド長は、安定または不安定なハイブリダイゼーションのためには、アッセイで用いる配列（例えばＧＣ含有率）及び条件に応じて、上記よりも若干短いことも長いことも可能であることが理解される。さらに、本明細書で開示されているように、ロックト核酸（ＬＮＡ）または架橋型核酸（ＢＮＡ）のような修飾ヌクレオチドを用いて、修飾塩基において結合強度を向上させることによって、結合セグメントの長さを短縮させることができるのが理解される。すなわち、他の核酸セグメントと相補的である核酸セグメントの長さについては、望ましい場合には、本明細書に記載されている長さをさらに短縮できることが理解される。当業者は、核酸成分間の相互作用が所望のものとなるように、長さ、修飾ヌクレオチドの存在などを含む適切なプローブデザインを容易に判断できる。

相補的な配列を含む２つの核酸配列間の結合部位を設計する際には、その相補的な配列は任意に、融解温度差（ｄＴ_ｍ）が最大になるように設計できる。この設計は、当該技術分野において知られている融解温度算出アルゴリズムを用いることによって行うことができる（例えば、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１４６０－１４６５（１９９８）を参照されたい）。加えて、ロックト核酸（ＬＮＡ）または架橋型核酸（ＢＮＡ）のような人工的な修飾塩基、及び天然の２’－Ｏ－メチルＲＮＡは、相補対間の結合強度を高めることが知られている（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７４－８１（２００３）、Ｍａｊｌｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：２２２４－２２２９（１９９８））。これらの修飾塩基は戦略的に、所望に応じて、ＳＧＣ成分間の結合部位に導入できる。

アプローチの１つは、修飾ヌクレオチド（ＬＮＡ、ＢＮＡまたは２’－Ｏ－メチルＲＮＡ）を用いることである。各修飾塩基は、融解温度を上昇させることができるので、２つの核酸配列（すなわち、相補的な配列）間の結合領域の長さを実質的に短縮できる。修飾塩基とその相補体との結合強度は強くなり、融解温度差（ｄＴ_ｍ）は大きくなる。さらに別の実施形態は、例えば、ハイブリダイゼーションすることになるシグナル生成複合体（ＳＧＣ）の核酸成分の相補的な配列内、または２つの核酸成分間で、３つの修飾塩基（例えば、３つのＬＮＡ、ＢＮＡもしくは２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、または２つもしくは３つの異なる修飾塩基を組み合わせたもの）を用いることである。このような成分は例えば、プレ－プレ増幅剤、プレ増幅剤、増幅剤、標識プローブまたは標的プローブ対であることができる。

ＬＮＡまたはＢＮＡのような修飾塩基は、ＳＧＣの所定成分のセグメント、具体的には、核酸成分間の結合を媒介するセグメントで用いることができ、それにより、その塩基と、その相補的塩基との結合強度を向上して、その相補的なセグメントの長さを短縮可能にする（例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７４－８１（２００３）、米国特許第７，３９９，８４５号を参照されたい）。Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＥＧＩＳ、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４（２１）：６０９５－６１０１（２００６））のように、天然の４つのアルファベットの塩基を拡張させる人工塩基を、ＳＧＣの相互作用成分の中の結合部位に組み込むことができる。これらの人工塩基は、この相互作用成分の特異性を向上でき、ひいては、より低ストリンジェントなハイブリダイゼーション反応を可能にして、より高度なシグナルを生成できる。

標的プローブ対に関しては、標的核酸の直接隣接するセグメント、または標的プローブ対の標的プローブ結合部位の間に、１個から相当数の塩基を有するセグメントに結合するように、標的プローブ対を設計できる。概して、標的プローブ対は、標的核酸に結合して、概して、標的核酸上の結合部位間に、０～５００塩基、例えば、０塩基、５塩基、１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、４５塩基、５０塩基、６０塩基、７０塩基、８０塩基、９０塩基、１００塩基、１２０塩基、１４０塩基、１６０塩基、１８０塩基、２００塩基、２２０塩基、２４０塩基、２６０塩基、２８０塩基、３００塩基、３２０塩基、３４０塩基、３６０塩基、３８０塩基、４００塩基、４２０塩基、４４０塩基、４６０塩基、４８０塩基もしくは５００塩基、またはこれらの間のいずれかの整数の塩基長が存在するように設計する。特定の実施形態では、標的プローブ対に対する結合部位は、０～１００塩基長、例えば、０塩基長、５塩基長、１０塩基長、１５塩基長、２０塩基長、２５塩基長、３０塩基長、３５塩基長、４０塩基長、４５塩基長、５０塩基長、６０塩基長、７０塩基長、８０塩基長、９０塩基長、１００塩基長、またはこれらの間のいずれかの整数の塩基長である。２本鎖核酸標的に結合する場合には、標的プローブ対のメンバーが、その２本鎖核酸の対向する鎖に結合することが理解される（例えば、図１を参照されたい）。すなわち、２本鎖標的核酸の直接隣接する結合部位、または標的プローブ結合部位間に相当数の塩基がある結合部位に関して言えば、標的プローブ対の結合部位は、対向する鎖上にあることが理解される。標的プローブ対が１本鎖標的核酸に結合する場合とは異なり、２本鎖標的の場合には、標的プローブ対のそれぞれのメンバーにおいて、プローブ対の標的結合部位は、対向する鎖上に存在するので、それらの結合部位は重複し得ることが理解される。両方の標的プローブが、それぞれの標的核酸鎖に同時に結合する際に、立体障害が見られない限りは、重複し得ることが理解される。このような重複が望ましい場合には、当業者は、対向する鎖上での標的結合部位間の許容可能な重複を容易に割り出すことができる。

ＳＧＣは、複数の標識プローブ（ＬＰ）も含む。各ＬＰは、検出可能であるセグメントを含む。検出可能な成分は、ＬＰに直接結合でき、あるいは、ＬＰは、検出可能な成分、すなわち標識を含む別の核酸にハイブリダイゼーションできる。本明細書で使用する場合、「標識」とは、分子の検出を促す部分である。本発明の文脈における一般的な標識には、蛍光標識、発光標識、光散乱標識及び／または比色標識が含まれる。好適な標識としては、酵素部分、蛍光部分、発色部分、放射性核種、基質、補因子、阻害剤、化学発光部分、磁性粒子、希土類金属、金属同位体などが挙げられる。本発明の特定の実施形態では、標識は、酵素である。例示的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなど、及び各種プロテアーゼが挙げられるが、これらに限らない。他の標識としては、フルオロフォア、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）などが挙げられるが、これらに限らない。標識は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）、ならびに米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号及び同第４，３６６，２４１号に記載されているように、当業者には周知である。検出可能な酵素／基質の組み合わせ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ ＴＸ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を含め、多くの標識が市販されており、本発明の方法及びアッセイで使用できる。本発明の特定の実施形態では、酵素は、発色基質または蛍光基質を利用して、本明細書に記載されているように、検出可能なシグナルを生成できる。例示的な標識は、本明細書に記載されている。

酵素活性標識または非酵素標識が、それぞれ検出できるものである限りは、いずれの数の酵素標識または非酵素標識も使用できる。本酵素は、検出可能なシグナルを生成し、そのシグナルを利用して、標的核酸を検出できる。特に有用である検出可能なシグナルは、発色シグナルまたは蛍光シグナルである。したがって、標識として用いるのに特に有用な酵素には、発色基質または蛍光基質が利用可能である酵素が含まれる。このような発色基質または蛍光基質を酵素反応によって容易に検出可能な発色生成物または蛍光生成物に変換し、この生成物は、顕微鏡法または分光法を用いて、容易に検出及び／または定量できる。このような酵素は、当業者に周知であり、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられるが、これらに限らない（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）を参照されたい）。周知の発色基質または蛍光基質を有する他の酵素には、様々なペプチダーゼが含まれ、その発色ペプチド基質または蛍光ペプチド基質を用いて、タンパク質切断反応を検出できる。発色基質及び蛍光基質の利用は、細菌の診断でも周知であり、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、６－ホスホ－β－Ｄ－ガラクトシド６－ホスホガラクトヒドロラーゼ、β－グルコシダーゼ、α－グルコシダーゼ、アミラーゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、リパーゼなどの利用が挙げられるが、これらに限らず（Ｍａｎａｆｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５５：３３５－３４８（１９９１））、既知の発色基質または蛍光基質を有するこのような酵素は、本発明の方法で用いるのに容易に適合させることができる。

検出可能なシグナルを生成させるための様々な発色基質または蛍光基質は、当業者に周知であり、市販されている。検出可能なシグナルを生成させるのに利用できる例示的な基質としては、西洋ワサビペルオキシダーゼに対する３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、クロロナフトール（４－ＣＮ）（４－クロロ－１－ナフトール）、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）及び３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、アルカリホスファターゼに対する５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－１－リン酸（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ファストレッド（ファストレッドＴＲ／ＡＳ－ＭＸ）及びｐ－ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）、β－ガラクトシダーゼに対する１－メチル－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド及び２－メトキシ－４－（２－ニトロビニル）フェニルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、β－グルコシダーゼに対する２－メトキシ－４－（２－ニトロビニル）フェニルβ－Ｄ－グルコピラノシドなどが挙げられるが、これらに限らない。例示的な蛍光基質としては、アルカリホスファターゼに対する４－（トリフルオロメチル）ウンベリフェリルリン酸、ホスファターゼに対する４－メチルウンベリフェリルリン酸ビス（２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール）、４－メチルウンベリフェリルリン酸ビス（シクロヘキシルアンモニウム）及び４－メチルウンベリフェリルリン酸、西洋ワサビペルオキシダーゼに対するＱｕａｎｔａＢｌｕ（商標）及びＱｕａｎｔａＲｅｄ（商標）、β－ガラクトシダーゼに対する４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、フルオレセインジ（β－Ｄ－ガラクトピラノシド）及びナフトフルオレセインジ－（β－Ｄ－ガラクトピラノシド）、β－グルコシダーゼに対する３－アセチルウンベリフェリルβ－Ｄ－グルコピラノシド及び４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ならびにα－ガラクトシダーゼに対する４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシドが挙げられるが、これらに限らない。検出可能なシグナルを生成させる例示的な酵素及び基質は例えば、米国公開第２０１２／０１００５４０号にも記載されている。発色基質または蛍光基質を含む様々な検出可能な酵素基質は、周知であり、市販されている（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ ＴＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ、４２ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｏｃａｒｅ）。概して、基質は、標的核酸の部位で沈着する沈殿物を形成する生成物に変換される。他の例示的な基質としては、ＨＲＰ－Ｇｒｅｅｎ（４２ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＢｉｏｃａｒｅのＢｅｔａｚｏｉｄ ＤＡＢ、Ｃａｒｄａｓｓｉａｎ ＤＡＢ、Ｒｏｍｕｌｉｎ ＡＥＣ、Ｂａｊｏｒａｎ Ｐｕｒｐｌｅ、Ｖｉｎａ Ｇｒｅｅｎ、Ｄｅｅｐ Ｓｐａｃｅ Ｂｌａｃｋ（商標）、Ｗａｒｐ Ｒｅｄ（商標）、Ｖｕｌｃａｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ及びＦｅｒａｎｇｉ Ｂｌｕｅ（Ｃｏｎｃｏｒｄ ＣＡ、ｂｉｏｃａｒｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ／ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｓ）が挙げられる。

検出可能な標識として適する例示的な希土類金属及び金属同位体としては、１４１Ｐｒ、１４２Ｎｄ、１４３Ｎｄ、１４４Ｎｄ、１４５Ｎｄ、１４６Ｎｄ、１４７Ｓｍ、１４８Ｎｄ、１４９Ｓｍ、１５０Ｎｄ、１５１Ｅｕ、１５２Ｓｍ、１５３Ｅｕ、１５４Ｓｍ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１５９Ｔｂ、１６０Ｇｄ、１６１Ｄｙ、１６２Ｄｙ、１６３Ｄｙ、１６４Ｄｙ、１６５Ｈｏ、１６６Ｅｒ、１６７Ｅｒ、１６８Ｅｒ、１６９Ｔｍ、１７０Ｅｒ、１７１Ｙｂ、１７２Ｙｂ、１７３Ｙｂ、１７４Ｙｂ、１７５Ｌｕ及び１７６Ｙｂのようなランタニド（ＩＩＩ）同位体が挙げられるが、これらに限らない。金属同位体は、例えば、飛行時間型質量分析（ＴＯＦ－ＭＳ）（例えば、ＦｌｕｉｄｉｇｍのＨｅｌｉｏｓ及びＨｙｐｅｒｉｏｎシステム、ｆｌｕｉｄｉｇｍ．ｃｏｍ／ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いて検出できる。

ビオチン－アビジン（またはビオチン－ストレプトアビジン）は、それらの２つの分子の相互の親和性が非常に高いとともに、１つのアビジン／ストレプトアビジン分子が４つのビオチン分子と結合できるという知見に基づく周知のシグナル増幅システムである。抗体は、免疫組織化学法及びＩＳＨでのシグナル増幅に広く用いられている。チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）は、ペルオキシダーゼ活性によって、多数のハプテン化チラミド分子が沈着することに基づいている。チラミンは、フェノール化合物である。固定化された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、少量の過酸化水素の存在下で、標識基質を、極めて反応性の高い短命な中間体に変換する。続いて、活性化した基質分子は、ペルオキシダーゼ結合部位またはペルオキシダーゼ結合部位の近くで、電子の豊富なタンパク質部分（チロシンなど）と非常に速やかに反応して、その部分に共有結合する。この方法で、チラミドにコンジュゲートした多くのハプテン分子をハイブリダイゼーション部位で、ｉｎ ｓｉｔｕに導入できる。その後、沈着したチラミド－ハプテン分子を直接または間接的に可視化できる。このような検出システムは例えば、米国公開第２０１２／０１００５４０号にさらに詳細に記載されている。

本明細書に記載されている実施形態では、酵素を利用して、適切な発色基質または蛍光基質を用いる検出可能なシグナルを生成できる。あるいは、標識プローブは、その標識プローブの核酸部分に直接結合された検出可能な標識を有することができることが理解される。例示的な検出可能な標識は、当業者に周知であり、発色標識または蛍光標識が挙げられるが、これらに限らない（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）を参照されたい）。標識として有用である例示的なフルオロフォアとしては、ローダミン誘導体、例えば、テトラメチルローダミン、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、スルホローダミンＢ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（スルホローダミン１０１）、ローダミン１１０及びその誘導体（テトラメチルローダミン－５－（または６）など）、リサミンローダミンＢなど、７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール（ＮＢＤ）、フルオレセイン及びその誘導体、ナフタレン（ダンシル（５－ジメチルアミノナフタレン－１－スルホニル）など）、クマリン誘導体（７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸（ＡＭＣＡ）、７－ジエチルアミノ－３－［（４’－（ヨードアセチル）アミノ）フェニル］－４－メチルクマリン（ＤＣＩＡ）、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）など）、４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン（ＢＯＤＩＰＹ（商標））及びその誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ピレン、スルホン化ピレン（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標）など）及びそれらの誘導体（８－メトキシピレン－１，３，６－トリスルホン酸などを含む）、ピリジルオキサゾール誘導体及びダポキシル誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ルシファーイエロー（３，６－ジスルホン酸－４－アミノ－ナフタルイミド）及びその誘導体、ＣｙＤｙｅ（商標）蛍光色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、ＡＴＴＯ３９０、ＤｙＬｉｇｈｔ３９５ＸＬ、ＡＴＴＯ４２５、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ４９０ＬＳ、ＡＴＴＯ４９５、ＡＴＴＯ５１４、ＡＴＴＯ５２０、ＡＴＴＯ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ５４２、ＡＴＴＯ５５０、ＡＴＴＯ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ５９０、ＡＴＴＯ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ６１０、ＡＴＴＯ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ６３３、ＡＴＴＯ６４３、ＡＴＴＯ６４７、ＡＴＴＯ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ６６５、ＡＴＴＯ６８０、ＡＴＴＯ７００、ＡＴＴＯ７２５、ＡＴＴＯ７４０、Ｃｙａｎ５００ ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣＨ，Ｓｉｅｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などが挙げられるが、これらに限らない。例示的な発色団としては、フェノールフタレイン、マラカイトグリーン、芳香族ニトロ化合物（ニトロフェニルなど）、ジアゾ色素、ダブシル（４－ジメチルアミノアゾベンゼン－４’－スルホニル）などが挙げられるが、これらに限らない。

本明細書で開示されているように、本発明の方法は、複数の標的核酸の同時検出を利用できる。フルオロフォアを標識として用いる場合には、複数の標的核酸の検出に用いるフルオロフォアは、標的核酸の同時検出の場合に、各フルオロフォアが識別可能であるとともに、フルオロフォアを蛍光顕微鏡で同時に検出できるように選択する。このようなフルオロフォアは、標的核酸の別個の標識を同時に検出できるように、発光線のスペクトルが分離されるように選択する。本発明の方法で用いるのに適する識別可能なフルオロフォアを選択する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｓｐｅｎｃｅ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（２０１０）を参照されたい）。

顕微鏡、サイトメトリー（例えば、マスサイトメトリー、飛行時間によるサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、フローサイトメトリー）または分光法のような周知の方法を用いて、それぞれの標的核酸と関連する検出可能な発色シグナル、蛍光シグナルまたは金属シグナルを可視化できる。概して、同じ試料内の核酸標的の検出に、１種類の計器を使用できるように、同じアッセイで、それぞれ異なる標識を使用する場合には、特定のアッセイに合わせて、発色基質、蛍光基質、発色標識、蛍光標識または希土類金属同位体のいずれかを使用する。

本発明の方法を用いて、所望の標的２本鎖核酸の検出を実現できる。一実施形態では、複数の標的プローブ対によって標的核酸を検出する。このような場合には、標的プローブ対は、標的２本鎖核酸の、２つ以上の標的核酸領域に結合するように設計する。複数の標的プローブ対を用いて、同じ標的２本鎖核酸に結合する場合には、ある１つの標的プローブ対の標的結合部位は、別の標的プローブ対の標的結合部位と重複しないことが理解される。

別の実施形態では、本発明の方法は、標的２本鎖核酸のマルチプレックス検出に適用できる。一実施形態では、本発明の方法は、２つ以上の標的核酸、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個、またはこれを上回る数の標的核酸の検出に適用する。検出できる標的核酸の数は、検出標識によって決まる。蛍光標識では、概して、最大１０個の核酸標識を検出できる。質量分析ベースの検出を用いる金属タグ付加プローブでは、標的核酸の数は、最大１５０個であることができる。当業者は、試料内の２つ以上の標的２本鎖核酸を検出できるように、適切な別個の標識を容易に選択できる。

さらに別の実施形態では、本発明の方法は、２本鎖核酸及び１本鎖核酸の同時検出、例えば、同じ試料内のＤＮＡ及びＲＮＡの検出に適用できる。このような場合には、プローブは、ＲＮＡのような１本鎖核酸を検出するように（例えば、米国特許第７，７０９，１９８号、米国公開第２００８／００３８７２５号、同第２００９／００８１６８８号及び同第２０１７／０１０１６７２号を参照されたい）、かつ本明細書に記載されているように、２本鎖核酸を検出するように設計して、同じ試料内で、２本鎖核酸及び１本鎖核酸の両方（ＤＮＡ及びＲＮＡなど）を検出できるようにできる。

本明細書で説明されている本発明は概して、試料内の２本鎖核酸の検出に関するものである。加えて、本発明の方法は、標的核酸と、任意に、試料内、特には、標的核酸と同じ細胞内の他の分子を検出することにも適用できることが理解される。例えば、標的核酸を検出するのに加えて、細胞内で発現されたタンパク質も、同時に検出できる。例えば、標的核酸の検出用として、本明細書に記載されているシステムを含む周知の検出システムのいずれかを用いて、タンパク質に特異的な抗体の結合を検出することによって、細胞内のタンパク質を検出することは、当業者には周知である。標的核酸及びタンパク質の検出は、説明されている（例えば、Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ．６（１）：２５－３６（２０１８）を参照されたい）。

２本鎖標的核酸が検出される限りは、本発明は、いずれの所望の順序でも実施できることが理解される。すなわち、本発明の方法では、標的２本鎖核酸が検出される限りは、細胞と、ＳＧＣをアセンブルするためのいずれかの成分とを接触させる工程は、いずれの所望の順序でも実施できるし、逐次的にも実施できるし、もしくは同時にも実施できるし、または所望に応じて、いくつかの工程を逐次的に実施できる一方で、他の工程を同時に実施する。さらに、各種の構成、成分のサイズ、アッセイ条件、アッセイ感度などを使用する目的で、所望に応じて、本明細書に開示されている実施形態は独立して、本明細書に開示されている他の実施形態と組み合わせることができることが理解される。

いくつかの場合には、アッセイ工程数を減らすこと、例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄の工程数を減らすことが望ましいことがある。アッセイ工程数を減らす方法の１つは、細胞と接触させる前に、ＳＧＣの成分の一部または全部を事前にアセンブルすることである。このように事前にアセンブルするのは、標的核酸と接触させる前に、ＳＧＣの成分の一部または全部を併せてハイブリダイゼーションさせることによって行うことができる。

本発明は、標的核酸を検出させるいずれの形式でも実施できることが理解される。本明細書では、本発明の実施については、概してｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて説明してきたが、本発明は、当該技術分野において周知であるように、他の形式で、標的核酸を検出するために、特には、細胞内の標的核酸を検出するために実施できることが理解される。細胞内の標的核酸を検出するのに使用できる方法の１つは、当該技術分野において周知であるように、フローサイトメトリーである（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）、Ｏｒｍｅｒｏｄ，Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９９）を参照されたい）。すなわち、本発明の方法、試料及びキットは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイの形式、またはフローサイトメトリーのような別の形式で使用できる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む核酸検出方法をフローサイトメトリーに適用することは、以前に説明されている（例えば、Ｈａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８（２）：ｅ５７００２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５７００２（２０１３）、Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １２（１０）：２０２９－２０４９（２０１７）を参照されたい）。

いくつかの場合には、アッセイ工程数を減らすこと、例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄の工程数を減らすことが望ましいことがある。アッセイ工程数を減らす方法の１つは、細胞と接触させる前に、ＳＧＣの成分の一部または全部を事前にアセンブルすることである。このように事前にアセンブルするのは、標的核酸と接触させる前に、ＳＧＣの成分の一部または全部を併せてハイブリダイゼーションさせることによって行うことができる。

本発明は、１つの細胞または複数の細胞を含む試料も提供する。その細胞は、任意に固定できる。その細胞は、任意に浸透化できる。細胞を固定及び／または浸透化することは特に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイに適用可能である。

本発明は、一実施形態では、（Ａ）標的２本鎖核酸を含む少なくとも１つの固定された浸透化細胞と、（Ｂ）標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、（Ｃ）第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤であって、第１の標的プローブと第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされているプレ増幅剤と、（Ｄ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の増幅剤と、（Ｅ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の標識プローブを含む、固定された浸透化細胞の試料であって、そのハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が標的２本鎖核酸上に供給される試料も提供する。

上記のような試料の一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のような試料の一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のような試料の一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。さらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、（Ａ）標的２本鎖核酸を含む少なくとも１つの固定された浸透化細胞と、（Ｂ）標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、（Ｃ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤を含むプレ－プレ増幅剤セットであって、第１のプレ－プレ増幅剤が、第１の標的プローブに対する結合部位を含み、第２のプレ－プレ増幅剤が、第２の標的プローブに対する結合部位を含み、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位を複数含み、プレ－プレ増幅剤が、第１の標的プローブと第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされているプレ－プレ増幅剤セットと、（Ｄ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤であって、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数のプレ増幅剤と、（Ｅ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の増幅剤と、（Ｆ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の標識プローブを含む、固定された浸透化細胞の試料であって、そのハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が標的２本鎖核酸上に供給される試料を提供する。

上記のような試料の一実施形態では、プレ増幅剤は、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位を含み、両方のプレ－プレ増幅剤との結合の融解温度は、１つのプレ－プレ増幅剤のみとの結合の融解温度よりも高い。

上記のような試料の一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のような試料の一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のような試料の一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。上記のような試料の別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。上記のような試料のさらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、（Ａ）標的２本鎖核酸を含む少なくとも１つの固定された浸透化細胞と、（Ｂ）標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、（Ｃ）第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、プレ増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ－プレ増幅剤であって、第１の標的プローブと第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされているプレ－プレ増幅剤と、（Ｄ）プレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤であって、プレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数のプレ増幅剤と、（Ｅ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の増幅剤と、（Ｆ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の標識プローブを含む、固定された浸透化細胞の試料であって、そのハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が標的２本鎖核酸上に供給される試料を提供する。

上記のような試料の一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のような試料の一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のような試料の一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。さらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

加えて、本発明は、１つの細胞または複数の細胞を含むスライドを提供する。任意に、その１つの細胞または複数の細胞は、スライドに固定されている。任意に、その１つの細胞または複数の細胞は、浸透化されている。特定の実施形態では、スライド上の細胞は、ｉｎ ｓｉｔｕアッセイ用に固定及び／または浸透化されている。

別の実施形態では、本発明は、（Ａ）標的２本鎖核酸を含む固定された浸透化細胞を少なくとも１つ含む複数の固定された浸透化細胞が上に固定化されているスライドと、（Ｂ）標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、（Ｃ）第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤であって、第１の標的プローブと第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされているプレ増幅剤と、（Ｄ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の増幅剤と、（Ｅ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の標識プローブを含むスライドであって、そのハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が標的２本鎖核酸上に供給されるスライドを提供する。

上記のようなスライドの一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のようなスライドの一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のようなスライドの一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。上記のようなスライドの別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。上記のようなスライドのさらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、（Ａ）標的２本鎖核酸を含む固定された浸透化細胞を少なくとも１つ含む複数の固定された浸透化細胞が上に固定化されているスライドと、（Ｂ）標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、（Ｃ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤を含むプレ－プレ増幅剤セットであって、第１のプレ－プレ増幅剤が、第１の標的プローブに対する結合部位を含み、第２のプレ－プレ増幅剤が、第２の標的プローブに対する結合部位を含み、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位を複数含み、プレ－プレ増幅剤が、第１の標的プローブと第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされているプレ－プレ増幅剤セットと、（Ｄ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤であって、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数のプレ増幅剤と、（Ｅ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、第１のプレ増幅剤と第２のプレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の増幅剤と、（Ｆ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の標識プローブを含むスライドであって、そのハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が標的２本鎖核酸上に供給されるスライドを提供する。

上記のようなスライドの一実施形態では、プレ増幅剤は、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位を含み、両方のプレ－プレ増幅剤との結合の融解温度は、１つのプレ－プレ増幅剤のみとの結合の融解温度よりも高い。

上記のようなスライドの一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のようなスライドの一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のようなスライドの一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。上記のようなスライドの別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。上記のようなスライドのさらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

一実施形態では、本発明は、（Ａ）標的２本鎖核酸を含む固定された浸透化細胞を少なくとも１つ含む複数の固定された浸透化細胞が上に固定化されているスライドと、（Ｂ）標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、（Ｃ）第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、プレ増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ－プレ増幅剤であって、第１の標的プローブと第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされているプレ－プレ増幅剤と、（Ｄ）プレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤であって、プレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数のプレ増幅剤と、（Ｅ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の増幅剤と、（Ｆ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、増幅剤にハイブリダイゼーションされている複数の標識プローブを含むスライドであって、そのハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が標的２本鎖核酸上に供給されるスライドを提供する。

上記のようなスライドの一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のようなスライドの一実施形態では、２本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。

上記のようなスライドの一実施形態では、試料は、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである。別の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである。さらに別の実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである。

本発明は、本明細書に記載されているようなＳＧＣの成分を含むキットも提供し、そのキットは、標的核酸を含まない。このようなキットは、本明細書に開示されているように、プレ増幅剤（ＰＡ）、増幅剤（ＡＭＰ）及び標識プローブ（ＬＰ）、ならびに任意にプレ－プレ増幅剤（ＰＰＡ）を含むことができる。任意に、そのキットは、特定の１つの標的２本鎖核酸または複数の標的２本鎖核酸に対する標的プローブ（ＴＰ）を含むことができる。本発明のキットの成分は任意に、容器に入っていることができ、任意に、そのキットを使用するための説明を提供できる。

一実施形態では、本発明は、標的２本鎖核酸を検出するためのキットであって、（Ａ）第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤と、（Ｂ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤と、（Ｃ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブを含むキットを提供する。

上記のようなキットの一実施形態では、そのキットは、標的プローブセットを含み、その標的プローブセットは、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含む。一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

一実施形態では、そのキットは、細胞を浸透化するための試薬を少なくとも１つ含む。

一実施形態では、本発明は、標的２本鎖核酸を検出するためのキットであって、（Ａ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤を含むプレ－プレ増幅剤セットであって、第１のプレ－プレ増幅剤が、第１の標的プローブに対する結合部位を含み、第２のプレ－プレ増幅剤が、第２の標的プローブに対する結合部位を含み、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位を複数含むプレ－プレ増幅剤セットと、（Ｂ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤と、（Ｃ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤と、（Ｄ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブを含むキットを提供する。

上記のようなキットの一実施形態では、そのキットは、標的プローブセットを含み、その標的プローブセットは、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、その２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含む。一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

上記のようなキットの一実施形態では、プレ増幅剤は、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位を含み、両方のプレ－プレ増幅剤との結合の融解温度は、１つのプレ－プレ増幅剤のみとの結合の融解温度よりも高い。

上記のようなキットの一実施形態では、そのキットは、細胞を浸透化するための試薬を少なくとも１つ含む。

一実施形態では、本発明は、標的２本鎖核酸を検出するためのキットであって、（Ａ）第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、プレ増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ－プレ増幅剤と、（Ｂ）プレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤と、（Ｃ）プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤と、（Ｄ）標識と、増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブを含むキットを提供する。

一実施形態では、そのキットは、標的プローブセットを含み、その標的プローブセットは、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、その標的２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含む。一実施形態では、標的プローブセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む。

一実施形態では、そのキットは、細胞を浸透化するための試薬を少なくとも１つ含む。

本明細書に示されている、本発明の定義内で、本発明の各種実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない修正が行われることも理解される。したがって、下記の実施例は、例示するためのものであり、本発明を限定しないように意図されている。

〔実施例〕
実施例Ｉ
２本鎖核酸のＩｎ ｓｉｔｕ検出
この実施例は、２本鎖核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出を説明するものである。

線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）遺伝子を検出するために、本質的には図１Ｂに示されているように、プローブ対を設計した。ＨＥＫ２９３細胞を、センスプローブ、アンチセンスプローブのいずれかまたは両方と接触させ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出した。このアッセイプロトコールの概略は、化学変性を含む改良型ＬＳ ｒｅｄアッセイとして、図２に示されている（図２、右パネル）。このアッセイは基本的には、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＢＯＮＤ ＲＸシステムとともに用いるＲＮＡＳｃｏｐｅ（商標）２．５ ＬＳ ｒｅｄ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の、メーカーによるアッセイ条件（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓマニュアル３２２１５０）に従って行った。２本鎖核酸の検出のために、変性工程を、２×ＳＳＣ中の７０％ホルムアミドで、８０℃において２０分で含めた（２０×ＳＳＣ－３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）。図３に示されているように、ＦＧＦＲ１のゲノムＤＮＡの検出には、Ｚ１（センス鎖結合）プローブとＺ２（アンチセンス鎖結合）プローブの両方が必要となる。センス鎖結合プローブ及びアンチセンス鎖結合プローブの両方を必要とすることで、２本鎖ＤＮＡに対する特異性をもたらす。ＤＮＡは、核（青色）内の赤色の斑点として検出された。

追加の例示的遺伝子のＩｎ ｓｉｔｕ検出を行った。本質的には上記のようにして、ＨＥＫ２９３細胞と、ＦＧＦＲ１、腫瘍タンパク質５３（ＴＰ５３、ｐ５３ともいう）及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）のゲノムＤＮＡを検出するためのセンスプローブ及びアンチセンスプローブとを接触させて、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出した。図４の上パネルに示されているように、ＦＧＦＲ１、ＴＰ５３及びＣＤＫＮ２Ａは、核（青色）内の赤色の斑点として検出された。

組織試料でも、遺伝子をｉｎ ｓｉｔｕで検出する能力について試験した。本質的には上記のようにして、大腸癌、正常な膵臓及び正常な乳房の組織試料を、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子の検出用のセンスプローブ及びアンチセンスプローブと接触させ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出した。卵巣癌の組織試料を、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＭｄｍ２（ＭＤＭ２）遺伝子の検出用のセンスプローブ及びアンチセンスプローブと接触させた。図４の下パネルに示されているように、細胞株及び各種組織試料において、各種遺伝子が検出された。ＤＮＡは、核（青色）内の赤色の斑点として検出された。

これらの結果から、２本鎖核酸の検出用プローブ対を用いて、細胞株及び組織試料において、遺伝子をｉｎ ｓｉｔｕで検出できることが示された。

本願の全体を通じて、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示内容の全体は、参照により、本発明が属する分野の現状をさらに充分に説明する目的で、本願に援用される。上記の実施例を参照しながら、本発明について説明してきたが、本発明の趣旨から逸脱しなければ、様々な修正を加えることができることは理解されたい。

２本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを検出するためのプローブデザイン（２本鎖プローブ（ｄｓ－プローブ））の概略図を示している。各プローブ対（「Ｚ_１」及び「Ｚ_２」として示されている）では、一方のプローブの標的結合領域は、２本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドのセンス鎖に結合するのに対して、もう一方のプローブの標的結合領域は、アンチセンス鎖に結合する。プローブ対の各プローブが同時に結合することで、プレ増幅剤に対する結合部位が形成される（パネルＡ及びＢ）。パネルＡ及びＢは、二者択一の２つの例示的なプローブ配向を示している。パネルＣは、同じプローブデザインをＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）のシグナル増幅システム（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８（１）：１９９８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１７－０２２９５－５（２０１７））に適合させたものを示している。パネルＣには、標的プローブ対の各メンバーがそれぞれ、標的核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖に結合することが示されている。各標的プローブは、別々のプレ－プレ増幅剤に結合する（パネルＣ）。任意に、１対以上のプローブ対が、同じ２本鎖核酸を標的とするように設計できる。 例示的なｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ（左）と、２本鎖核酸を変性させるために、化学変性を用いた修正型アッセイ（右）の工程のフローチャートを示している。簡潔に述べると、標準的なプロトコールは、スライドを６０℃でベーキングした後、脱パラフィンして、固形パラフィンを除去することから開始する（「ベーキング＋脱パラフィン」）。続いて、スライドを抗原賦活用バッファー（「ＥＲ２」）によって８８℃で処理して、標的（複数可）を露出させてから、プロテアーゼ消化（プロテアーゼＩＩＩ）を行う。その後、標的プローブをスライドにハイブリダイゼーションさせ（「プローブ」）、続いて、プレ増幅剤、増幅剤及び標識プローブと逐次ハイブリダイゼーションさせ（「増幅」）、その後、色原体であるＦａｓｔ Ｒｅｄで、標的を検出する（「検出」）。ＤＮＡを検出するための修正型プロトコールには、化学変性工程（「化学変性」、２×ＳＳＣ中の７０％ホルムアミドによって８０℃で２０分）を加える。 線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）のゲノムＤＮＡの検出には、Ｚ１（センス鎖結合）プローブとＺ２（アンチセンス鎖結合）プローブの両方が必要であり、それにより、２本鎖ＤＮＡに対する特異性が確保されることが示されている。ＤＮＡは、核（青色）内の赤色の斑点として検出された。 細胞（ＨＥＫ２９３）及び組織（大腸癌、卵巣癌、正常な膵臓、正常な乳房）における様々な遺伝子をｄｓ－プローブによって検出した結果を示している。ＤＮＡは、核（青色）内の赤色の斑点として検出された。 Ａ～Ｃは、シグナル生成複合体（ＳＧＣ）を用いて、核酸標的を検出する上記方法の概略図を示している。ＰＰＡはプレ－プレ増幅剤、ＰＡはプレ増幅剤、ＡＭＰは増幅剤、ＬＰは標識プローブである。

Claims (70)

1. ２本鎖核酸の検出方法であって、
   （Ａ）２本鎖核酸を１つ以上含む細胞を含む試料を、標的プローブセットと接触させることであって、前記標的プローブセットが、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、前記２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含む、前記接触させることと、
   （Ｂ）その試料と、前記第１の標的プローブに対する結合部位と、前記第２の標的プローブに対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤とを接触させることと、
   （Ｃ）その試料を複数の増幅剤と接触させることであって、前記増幅剤が、前記プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
   （Ｄ）その試料を複数の標識プローブと接触させることであって、前記標識プローブが、標識と、前記増幅剤に対する結合部位を含む、前記接触させることと、
   （Ｅ）前記標的２本鎖核酸に結合した前記標識プローブを検出することによって、前記標的２本鎖核酸を検出することと、
   を含む前記方法。
2. 前記標的プローブセットが、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記２本鎖核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記試料が、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記試料が、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記試料が、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
7. （Ａ）標的２本鎖核酸を含む少なくとも１つの固定された浸透化細胞と、
   （Ｂ）前記標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、前記２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、
   （Ｃ）前記第１の標的プローブに対する結合部位と、前記第２の標的プローブに対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤であって、前記第１の標的プローブと前記第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされている前記プレ増幅剤と、
   （Ｄ）前記プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、前記プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数の増幅剤と、
   （Ｅ）標識と、前記増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、前記増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数の標識プローブと、
   を含む、固定された浸透化細胞の試料であって、
   前記ハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が前記標的２本鎖核酸上に供給される前記試料。
8. 前記標的プローブセットが、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む、請求項７に記載の試料。
9. 前記２本鎖核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項７または８に記載の試料。
10. 前記試料が、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである、請求項７～９のいずれか１項に記載の試料。
11. 前記試料が、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである、請求項７～９のいずれか１項に記載の試料。
12. 前記試料が、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである、請求項７～９のいずれか１項に記載の試料。
13. （Ａ）標的２本鎖核酸を含む固定された浸透化細胞を少なくとも１つ含む複数の固定された浸透化細胞が上に固定化されているスライドと、
    （Ｂ）前記標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、前記２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、
    （Ｃ）前記第１の標的プローブに対する結合部位と、前記第２の標的プローブに対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤であって、前記第１の標的プローブと前記第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされている前記プレ増幅剤と、
    （Ｄ）前記プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、前記プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数の増幅剤と、
    （Ｅ）標識と、前記増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、前記増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数の標識プローブと、
    を含むスライドであって、
    前記ハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が前記標的２本鎖核酸上に供給される前記スライド。
14. 前記標的プローブセットが、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む、請求項１３に記載のスライド。
15. 前記２本鎖核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項１３または１４に記載のスライド。
16. 前記試料が、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである、請求項１３～１５のいずれか１項に記載のスライド。
17. 前記試料が、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである、請求項１３～１５のいずれか１項に記載のスライド。
18. 前記試料が、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである、請求項１３～１５のいずれか１項に記載のスライド。
19. 標的２本鎖核酸を検出するためのキットであって、
    （Ａ）第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤と、
    （Ｂ）前記プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤と、
    （Ｃ）標識と、前記増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブと、
    を含む前記キット。
20. 前記キットが、標的プローブセットを含み、前記標的プローブセットが、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、前記標的２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含む、請求項１９に記載のキット。
21. 前記標的プローブセットが、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む、請求項２０に記載のキット。
22. 細胞を浸透化するための試薬を少なくとも１つ含む、請求項１９～２１のいずれか１項に記載のキット。
23. ２本鎖核酸の検出方法であって、
    （Ａ）２本鎖核酸を１つ以上含む細胞を含む試料を、標的プローブセットと接触させることであって、前記標的プローブセットが、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、前記２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含む、前記接触させることと、
    （Ｂ）その試料と、第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤を含むプレ－プレ増幅剤セットとを接触させることであって、前記第１のプレ－プレ増幅剤が、前記第１の標的プローブに対する結合部位を含み、前記第２のプレ－プレ増幅剤が、前記第２の標的プローブに対する結合部位を含み、前記第１のプレ－プレ増幅剤と前記第２のプレ－プレ増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位を複数含む、前記接触させることと、
    （Ｃ）その試料を複数のプレ増幅剤と接触させることであって、前記プレ増幅剤が、前記第１のプレ－プレ増幅剤と前記第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
    （Ｄ）その試料を複数の増幅剤と接触させることであって、前記増幅剤が、前記プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
    （Ｅ）その試料を複数の標識プローブと接触させることであって、前記標識プローブが、標識と、前記増幅剤に対する結合部位を含む、前記接触させることと、
    （Ｆ）前記標的２本鎖核酸に結合した前記標識プローブを検出することによって、前記標的２本鎖核酸を検出することと、
    を含む前記方法。
24. 前記プレ増幅剤が、前記第１のプレ－プレ増幅剤と前記第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位を含み、両方の前記プレ－プレ増幅剤との結合の融解温度が、１つの前記プレ－プレ増幅剤のみとの結合の融解温度よりも高い、請求項２３に記載の方法。
25. 前記標的プローブセットが、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む、請求項２３または２４に記載の方法。
26. 前記２本鎖核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記試料が、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記試料が、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記試料が、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の方法。
30. （Ａ）標的２本鎖核酸を含む少なくとも１つの固定された浸透化細胞と、
    （Ｂ）前記標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、前記２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、
    （Ｃ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤を含むプレ－プレ増幅剤セットであって、前記第１のプレ－プレ増幅剤が、前記第１の標的プローブに対する結合部位を含み、前記第２のプレ－プレ増幅剤が、前記第２の標的プローブに対する結合部位を含み、前記第１のプレ－プレ増幅剤と前記第２のプレ－プレ増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位を複数含み、前記プレ－プレ増幅剤が、前記第１の標的プローブと前記第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされている前記プレ－プレ増幅剤セットと、
    （Ｄ）前記第１のプレ－プレ増幅剤と前記第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤であって、前記第１のプレ－プレ増幅剤と前記第２のプレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数のプレ増幅剤と、
    （Ｅ）前記プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、前記プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数の増幅剤と、
    （Ｆ）標識と、前記増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、前記増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数の標識プローブと、
    を含む、固定された浸透化細胞の試料であって、
    前記ハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が前記標的２本鎖核酸上に供給される前記試料。
31. 前記プレ増幅剤が、前記第１のプレ－プレ増幅剤と前記第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位を含み、両方の前記プレ－プレ増幅剤との結合の融解温度が、１つの前記プレ－プレ増幅剤のみとの結合の融解温度よりも高い、請求項３０に記載の試料。
32. 前記標的プローブセットが、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む、請求項３０または３１に記載の試料。
33. 前記２本鎖核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の試料。
34. 前記試料が、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の試料。
35. 前記試料が、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の試料。
36. 前記試料が、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の試料。
37. （Ａ）標的２本鎖核酸を含む固定された浸透化細胞を少なくとも１つ含む複数の固定された浸透化細胞が上に固定化されているスライドと、
    （Ｂ）前記標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、前記２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、
    （Ｃ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤を含むプレ－プレ増幅剤セットであって、前記第１のプレ－プレ増幅剤が、前記第１の標的プローブに対する結合部位を含み、前記第２のプレ－プレ増幅剤が、前記第２の標的プローブに対する結合部位を含み、前記第１のプレ－プレ増幅剤と前記第２のプレ－プレ増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位を複数含み、前記プレ－プレ増幅剤が、前記第１の標的プローブと前記第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされている前記プレ－プレ増幅剤セットと、
    （Ｄ）前記第１のプレ－プレ増幅剤と前記第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤であって、前記第１のプレ－プレ増幅剤と前記第２のプレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数のプレ増幅剤と、
    （Ｅ）前記プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、第１のプレ増幅剤と第２のプレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数の増幅剤と、
    （Ｆ）標識と、前記増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、前記増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数の標識プローブと、
    を含むスライドであって、
    前記ハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が前記標的２本鎖核酸上に供給される前記スライド。
38. 前記プレ増幅剤が、前記第１のプレ－プレ増幅剤と前記第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位を含み、両方の前記プレ－プレ増幅剤との結合の融解温度が、１つの前記プレ－プレ増幅剤のみとの結合の融解温度よりも高い、請求項３７に記載のスライド。
39. 前記標的プローブセットが、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む、請求項３７または３８に記載のスライド。
40. 前記２本鎖核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項３７～３９のいずれか１項に記載のスライド。
41. 前記試料が、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである、請求項３７～４０のいずれか１項に記載のスライド。
42. 前記試料が、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである、請求項３７～４０のいずれか１項に記載のスライド。
43. 前記試料が、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである、請求項３７～４０のいずれか１項に記載のスライド。
44. 標的２本鎖核酸を検出するためのキットであって、
    （Ａ）第１のプレ－プレ増幅剤と第２のプレ－プレ増幅剤を含むプレ－プレ増幅剤セットであって、前記第１のプレ－プレ増幅剤が、第１の標的プローブに対する結合部位を含み、前記第２のプレ－プレ増幅剤が、第２の標的プローブに対する結合部位を含み、前記第１のプレ－プレ増幅剤と前記第２のプレ－プレ増幅剤が、プレ増幅剤に対する結合部位を複数含む前記プレ－プレ増幅剤セットと、
    （Ｂ）前記第１のプレ－プレ増幅剤と前記第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤と、
    （Ｃ）前記プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤と、
    （Ｄ）標識と、前記増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブと、
    を含む前記キット。
45. 前記キットが、標的プローブセットを含み、前記標的プローブセットが、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、前記標的２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含む、請求項４４に記載のキット。
46. 前記標的プローブセットが、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む、請求項４５に記載のキット。
47. 前記プレ増幅剤が、前記第１のプレ－プレ増幅剤と前記第２のプレ－プレ増幅剤に対する結合部位を含み、両方の前記プレ－プレ増幅剤との結合の融解温度が、１つの前記プレ－プレ増幅剤のみとの結合の融解温度よりも高い、請求項４４～４６のいずれか１項に記載のキット。
48. 細胞を浸透化するための試薬を少なくとも１つ含む、請求項４４～４７のいずれか１項に記載のキット。
49. ２本鎖核酸の検出方法であって、
    （Ａ）２本鎖核酸を１つ以上含む細胞を含む試料を、標的プローブセットと接触させることであって、前記標的プローブセットが、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、前記２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含む、前記接触させることと、
    （Ｂ）その試料と、前記第１の標的プローブに対する結合部位と、前記第２の標的プローブに対する結合部位と、プレ増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ－プレ増幅剤とを接触させることと、
    （Ｃ）その試料と、前記プレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤とを接触させることと、
    （Ｄ）その試料を複数の増幅剤と接触させることであって、前記増幅剤が、前記プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
    （Ｅ）その試料を複数の標識プローブと接触させることであって、前記標識プローブが、標識と、前記増幅剤に対する結合部位を含む、前記接触させることと、
    （Ｆ）前記標的２本鎖核酸に結合した前記標識プローブを検出することによって、前記標的２本鎖核酸を検出することと、
    を含む前記方法。
50. 前記標的プローブセットが、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む、請求項４９に記載の方法。
51. 前記２本鎖核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項４９または５０に記載の方法。
52. 前記試料が、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の方法。
53. 前記試料が、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の方法。
54. 前記試料が、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の方法。
55. （Ａ）標的２本鎖核酸を含む少なくとも１つの固定された浸透化細胞と、
    （Ｂ）前記標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、前記２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、
    （Ｃ）前記第１の標的プローブに対する結合部位と、前記第２の標的プローブに対する結合部位と、プレ増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ－プレ増幅剤であって、前記第１の標的プローブと前記第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされている前記プレ－プレ増幅剤と、
    （Ｄ）前記プレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤であって、前記プレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数のプレ増幅剤と、
    （Ｅ）前記プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、前記プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数の増幅剤と、
    （Ｆ）標識と、前記増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、前記増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数の標識プローブと、
    を含む、固定された浸透化細胞の試料であって、
    前記ハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が前記標的２本鎖核酸上に供給される前記試料。
56. 前記標的プローブセットが、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む、請求項５５に記載の試料。
57. 前記２本鎖核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項５５または５６に記載の試料。
58. 前記試料が、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである、請求項５５～５７のいずれか１項に記載の試料。
59. 前記試料が、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである、請求項５５～５７のいずれか１項に記載の試料。
60. 前記試料が、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである、請求項５５～５７のいずれか１項に記載の試料。
61. （Ａ）標的２本鎖核酸を含む固定された浸透化細胞を少なくとも１つ含む複数の固定された浸透化細胞が上に固定化されているスライドと、
    （Ｂ）前記標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第１のプローブと、前記２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションした第２のプローブを含む標的プローブ対を含む標的プローブセットと、
    （Ｃ）前記第１の標的プローブに対する結合部位と、前記第２の標的プローブに対する結合部位と、プレ増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ－プレ増幅剤であって、前記第１の標的プローブと前記第２の標的プローブにハイブリダイゼーションされている前記プレ－プレ増幅剤と、
    （Ｄ）前記プレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含む複数のプレ増幅剤であって、前記プレ－プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数のプレ増幅剤と、
    （Ｅ）前記プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤であって、前記プレ増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数の増幅剤と、
    （Ｆ）標識と、前記増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブであって、前記増幅剤にハイブリダイゼーションされている前記複数の標識プローブと、
    を含むスライドであって、
    前記ハイブリダイゼーションにより、検出可能な標識が前記標的２本鎖核酸上に供給される前記スライド。
62. 前記標的プローブセットが、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む、請求項６１に記載のスライド。
63. 前記２本鎖核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである、請求項６１または６２に記載のスライド。
64. 前記試料が、組織検体であるか、または組織検体から抽出したものである、請求項６１～６３のいずれか１項に記載のスライド。
65. 前記試料が、血液試料であるか、または血液試料から抽出したものである、請求項６１～６３のいずれか１項に記載のスライド。
66. 前記試料が、細胞学的試料であるか、または細胞学的試料から抽出したものである、請求項６１～６３のいずれか１項に記載のスライド。
67. 標的２本鎖核酸を検出するためのキットであって、
    （Ａ）第１の標的プローブに対する結合部位と、第２の標的プローブに対する結合部位と、プレ増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ－プレ増幅剤と、
    （Ｂ）前記プレ－プレ増幅剤に対する結合部位と、増幅剤に対する複数の結合部位を含むプレ増幅剤と、
    （Ｃ）前記プレ増幅剤に対する結合部位と、標識プローブに対する複数の結合部位を含む複数の増幅剤と、
    （Ｄ）標識と、前記増幅剤に対する結合部位を含む複数の標識プローブと、
    を含む前記キット。
68. 前記キットが、標的プローブセットを含み、前記標的プローブセットが、標的２本鎖核酸の第１の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第１のプローブと、前記標的２本鎖核酸の第２の鎖に特異的にハイブリダイゼーションする第２のプローブを含む標的プローブ対を含む、請求項６７に記載のキット。
69. 前記標的プローブセットが、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブ対を２対以上含む、請求項６８に記載のキット。
70. 細胞を浸透化するための試薬を少なくとも１つ含む、請求項６７～６９のいずれか１項に記載のキット。

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