CN113795592A - 双链核酸的原位检测及其相关方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于检测靶双链核酸的方法，包括用于原位杂交测定的方法。本发明还提供了具有检测到的靶双链核酸的固定和透化细胞的样品以及含有此类样品的载玻片。本发明另外提供了用于检测靶双链核酸的试剂盒。
Description
本申请要求2019年3月12日提交的美国临时申请号62/817,449的权益，所述临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。
发明背景
本发明总体上涉及核酸的检测，并且更具体地涉及双链核酸的原位检测。
DNA原位杂交(ISH)是广泛用于检测染色体、细胞或组织中的特定序列、同时保留染色体、细胞和组织背景的分子生物学技术(Ratan等人,Cureus 9(6):e1325.doi:10.7759/cureus.1325(2017))。它在研究和诊断方面具有许多应用(Hu等人,Biomark.Res.2(1):3.doi:10.1186/2050-7771-2-3(2014)；Ratan等人,同上,2017；Weier等人,Expert Rev.Mol.Diagn.2(2):109-119(2002))。然而，当前的DNA ISH方法只能检测大染色体区域(>100kb)，因为它们使用大探针并且对较短序列的敏感性有限。由于人基因组中的中值基因大小仅为24千碱基，这意味着几乎所有当前的DNA ISH探针都跨越多于一个基因，这通常很难在单基因水平上得出结论。因此，允许对较短序列进行可视化的更灵敏和更具体的方法仍然是技术挑战。
因此，需要用于双链核酸，尤其是较小区域和或单个基因的原位检测方法。本发明满足了这种需要并且也提供了相关的优点。
发明内容
本发明提供了检测双链核酸的方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种检测双链核酸的方法，所述方法包括(A)使包含含有一种或多种双链核酸的细胞的样品与靶探针组接触，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(B)使所述样品与前置扩增子接触，所述前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(C)使所述样品与多个扩增子接触，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(D)使所述样品与多个标记探针接触，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点；以及(E)检测与所述靶双链核酸结合的标记探针，从而检测所述靶双链核酸。
在这种方法的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在检测双链核酸的这种方法的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种方法的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在这种方法的另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在这种方法的另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种固定和透化细胞的样品，所述样品包含(A)至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞；(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(C)前置扩增子，所述前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述第一和第二靶探针杂交；(D)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，并且其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及(E)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
在这种样品的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种样品的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种样品的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在这种样品的另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种载玻片，所述载玻片包含(A)其上固定有包含至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞的多个固定和透化细胞的载玻片；(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(C)前置扩增子，所述前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述第一和第二靶探针杂交；(D)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，并且其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及(E)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种载玻片的另一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在这种载玻片的另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测靶双链核酸的试剂盒，所述试剂盒包含(A)前置扩增子，所述前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(B)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；以及(C)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点。
在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针。在一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测双链核酸的方法，所述方法包括(A)使包含含有一种或多种双链核酸的细胞的样品与靶探针组接触，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(B)使所述样品与前置前置扩增子组接触，所述前置前置扩增子组包含第一和第二前置前置扩增子，其中所述第一前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点，其中所述第二前置前置扩增子包含用于所述第二靶探针的结合位点，并且其中所述第一和第二前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点；(C)使所述样品与多个前置扩增子接触，其中所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(D)使所述样品与多个扩增子接触，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(E)使所述样品与多个标记探针接触，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点；以及(F)检测与所述靶双链核酸结合的标记探针，从而检测所述靶双链核酸。
在这种方法的一个实施方案中，所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点，其中与两个前置前置扩增子的结合之间的解链温度高于仅一个前置前置扩增子的结合之间的解链温度。
在这种方法的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种方法的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种方法的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种固定和透化细胞的样品，所述样品包含(A)至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞；(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(C)前置前置扩增子组，所述前置前置扩增子组包含第一和第二前置前置扩增子，其中所述第一前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点，其中所述第二前置前置扩增子包含用于所述第二靶探针的结合位点，其中所述第一和第二前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点，并且其中所述前置前置扩增子与所述第一和第二靶探针杂交；(D)多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述第一和第二前置前置扩增子杂交；(E)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及(F)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
在这种样品的一个实施方案中，所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点，其中与两个前置前置扩增子的结合之间的解链温度高于仅一个前置前置扩增子的结合之间的解链温度。
在这种样品的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种样品的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种样品的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种载玻片，所述载玻片包含(A)其上固定有包含至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞的多个固定和透化细胞的载玻片；(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(C)前置前置扩增子组，所述前置前置扩增子组包含第一和第二前置前置扩增子，其中所述第一前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点，其中所述第二前置前置扩增子包含用于所述第二靶探针的结合位点，并且其中所述第一和第二前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点，并且其中所述前置前置扩增子与所述第一和第二靶探针杂交；(D)多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述第一和第二前置前置扩增子杂交；(E)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与所述第一和第二前置扩增子杂交；以及(F)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点，其中与两个区的结合之间的解链温度高于仅一个区的结合之间的解链温度。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测靶双链核酸的试剂盒，所述试剂盒包含(A)前置前置扩增子组，所述前置前置扩增子组包含第一和第二前置前置扩增子，其中所述第一前置前置扩增子包含用于第一靶探针的结合位点，其中所述第二前置前置扩增子包含用于第二靶探针的结合位点，并且其中所述第一和第二前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点；(B)多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(C)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；以及(D)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点。
在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针。在一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种试剂盒的一个实施方案中，所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点，其中与两个区的结合之间的解链温度高于仅一个区的结合之间的解链温度。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测双链核酸的方法，所述方法包括：(A)使包含含有一种或多种双链核酸的细胞的样品与靶探针组接触，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(B)使所述样品与前置前置扩增子接触，所述前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点；(C)使所述样品与多个前置扩增子接触，所述前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(D)使所述样品与多个扩增子接触，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(E)使所述样品与多个标记探针接触，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点；以及(F)检测与所述靶双链核酸结合的标记探针，从而检测所述靶双链核酸。
在这种方法的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种方法的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种方法的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种固定和透化细胞的样品，所述样品包含：(A)至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞；(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(C)前置前置扩增子，所述前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点，其中所述前置前置扩增子与所述第一和第二靶探针杂交；(D)多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述前置前置扩增子杂交；(E)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，并且其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及(F)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
在这种样品的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种样品的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种样品的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种载玻片，所述载玻片包含(A)其上固定有包含至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞的多个固定和透化细胞的载玻片；(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(C)前置前置扩增子，所述前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点，其中所述前置前置扩增子与所述第一和第二靶探针杂交；(D)多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述前置前置扩增子杂交；(E)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，并且其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及(F)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测靶双链核酸的试剂盒，所述试剂盒包含(A)前置前置扩增子，所述前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点；(B)前置扩增子，所述前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(C)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；以及(D)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点。
在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述靶双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针。在一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
附图说明
图1示出用于检测双链DNA、RNA或DNA/RNA杂合体的探针设计(双链探针(ds-探针))的示意图。对于每个探针对(描绘为“Z1”和“Z2”)，一个探针的靶结合区结合至有义链，而另一个探针的靶结合区结合至双链DNA、RNA或DNA-RNA杂合体的反义链。所述对中每个探针的同时结合形成用于前置扩增子的结合位点(图A和图B)。图A和B示出两种替代示例性探针取向。图C示出用于BaseScopeTM信号放大系统的相同探针设计的适配(Baker等人,Nat.Commun.8(1):1998,doi:10.1038/s41467-017-02295-5(2017))。图C描绘所述靶探针对的每个成员分别与靶核酸的有义链和反义链的结合。每个靶探针结合至单独的前置前置扩增子(图C)。任选地，一个或多个探针对可被设计为靶向相同的双链核酸。
图2示出用于示例性原位杂交测定(左)和使用化学变性(右)来使双链核酸变性的改进测定的步骤的流程图。简言之，标准方案首先在60℃下烘烤载玻片，然后脱蜡以除去石蜡(“烘烤+脱蜡”)。然后在88℃下用表位修复缓冲液(“ER2”)处理载玻片以揭示靶标，然后进行蛋白酶消化(蛋白酶III)。然后，使靶探针与载玻片杂交(“探针”)，然后依次与前置扩增子、扩增子和标记探针(“AMP”)杂交，然后用色原固红检测靶标(“检测”)。修改的DNA检测方案增加了化学变性步骤(“化学DN”，在2XSSC中的70％甲酰胺在80℃下20分钟)。
图3示出成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)基因组DNA检测需要Z1(有义链结合)和Z2(反义链结合)探针，这确保了双链DNA的特异性。DNA被检测为细胞核(蓝色)内的红色点状点。
图4示出通过ds探针检测细胞(HEK293)和组织(结肠癌、卵巢癌、正常胰腺、正常乳腺)中的不同基因。DNA被检测为细胞核(蓝色)内的红色点状点。
图5A-5C示出使用信号产生复合物(SGC)检测核酸靶标的前述方法的示意图。PPA，前置前置扩增子；PA，前置扩增子；AMP，扩增子；LP，标记探针。
具体实施方式
本文公开了用于检测双链核酸如DNA、双链RNA和/或DNA/RNA杂合体的方法。所述方法提供细胞中双链核酸的高度灵敏和特异性检测。
最近开发的称为RNAscopeTM的RNA ISH技术使用专门设计的寡核苷酸探针，有时称为“双Z”或ZZ探针，与分支DNA样信号放大系统组合来在标准明视野显微镜下以单分子灵敏度可靠地检测小至1千碱基的RNA(Anderson等人,J.Cell.Biochem.117(10):2201-2208(2016)；Wang等人,J.Mol.Diagn.14(1):22-29(2012))。这种探针设计极大地提高信号放大的特异性，因为只有当每对中的两个探针均与它们的预期靶标结合时才能发生信号放大。然而，用于DNA检测的RNAscopeTM的直接应用受到不想要的RNA检测的阻碍，因为RNAscopeTM探针无法区分DNA和RNA靶标。尽管可通过酶促(例如RNA酶A)和化学(例如NaOH)方法消除RNA，但添加这些步骤可导致细胞核和细胞形态的显著退化，并影响原位检测测定中的DNA检测或双链核酸的检测。
本文描述了一种探针设计策略，所述策略使用RNAscopeTM信号放大系统的原理提供双链DNA、RNA或DNA/RNA杂合体的特异性检测，而不受RNA的干扰。这是通过设计每个探针对以结合至双链核酸(如双链DNA、RNA或DNA/RNA杂合体)的两条链来实现的。将不会检测到单链RNA或DNA，因为每对中的两个探针中只有一个将与单链RNA或DNA结合，这有效地阻止了信号放大和单链RNA和单链DNA靶标的检测。所述测定策略允许对非常短的DNA序列(短至1kb)进行高灵敏度和特异性检测，与当前DNA FISH测定相比提供约100倍的分辨率。此外，本发明的方法选择性地检测双链DNA，这使得区分双链DNA和单链DNA成为可能。本发明的方法也适用于区分双链RNA和/或RNA-DNA杂合体与单链DNA和/或RNA。此外，由于这种方法在检测DNA时保留了RNA，因此所述方法可用于同时检测同一细胞或组织切片样品中的RNA和DNA靶标。
本发明涉及允许对细胞中的核酸序列(特别是双链核酸)进行高灵敏度和特异性检测的方法。本发明的方法具有许多实际应用(Hu等人,同上,2014；Ratan等人,同上,2017；Weier等人,同上,2002)。本发明的方法可用于例如染色体中DNA序列的物理作图；空间基因组组构的三维(3D)映射；患病细胞和组织中的基因拷贝数增加(复制和扩增)、丢失(缺失)和基因重排(易位和融合)的检测；染色体异常的产前、产后和移植前诊断；癌症诊断和预后；伴随诊断；以及病原体(例如细菌和病毒)的检测和鉴定。
本发明通过要求每个探针对结合双链核酸(如DNA)的两条链将RNAscopeTM技术(Wang等人，同上，2012)核心的探针设计原理扩展至双链核酸(如DNA)检测，以出现信号放大(图1)。与RNAscopeTM探针一样，每个探针都含有结合至靶标中的特定序列的序列区段。对于双链核酸检测，例如DNA检测，两个探针结合至靶双链核酸中相对链上的相邻位点。只有当两个探针同时结合至其相应的靶位点时，才能形成信号放大分子(例如，如图1A和1B中的前置扩增子或如图1C中的前置前置扩增子)的完整结合位点，从而导致成功的信号放大和检测。
在图1中，靶探针“Z1”以“Z”配置描绘，如例如在美国专利号7,709,198、美国公布2008/0038725和2009/0081688以及WO2007/001986和WO 2007/002006中所描述。图1中所示的Z1配置具有与靶探针的前置扩增子或前置前置扩增子结合位点的靶结合位点5'(图1A-1C)。可理解，如图1中描绘的这种配置仅仅是示例性的，并且取向可以是相对的，即靶结合位点可在前置扩增子或前置前置扩增子结合位点的3'。例如，如图1A所示，探针“Z2”被描绘为具有在靶结合位点5'的前置扩增子结合位点。在图1B中，探针“Z2”描绘在前置扩增子结合位点5'的靶结合位点。在图1C中，“Z2”探针类似地描绘为具有在前置前置扩增子结合位点5'的靶结合位点。应当理解，靶探针对可独立地处于任一取向，即，靶探针对中的一个成员可具有在前置扩增子或前置前置扩增子结合位点的5'或3'的靶结合位点，并且可与第二探针配对，所述第二探针具有在前置扩增子或前置前置扩增子的5'或3'的结合位点，以使得存在靶探针对的四种可能的取向组合。
同样在图1中，为了说明的目的，两条链被标记为“有义”和“反义”。应理解，靶探针对结合至双链核酸的相对链。还应理解，待由靶探针对结合的双链核酸的区域不需要在编码区中，例如具有有义链和反义链的DNA的编码区，但可在非编码区中。
本发明方法的有效性如实施例1中所述和图3和4中所示通过实验证明。可采用相同的策略来使用BaseScopeTM信号放大系统(Baker等人，同上，2017)(图1C)，从未进一步提高灵敏度和特异性。也可修改其他信号放大方法，如杂交链反应(HCR)(Choi等人,Development145(12),pii:dev165753,doi:10.1242/dev.165753(2018))以并入如本文所公开的双链探针设计原理。HCR(HCR v3.0)的最新版本采用与RNAscopeTM类似的配对探针设计(Choi等人,同上,2018)。这种技术可使用类似设计的结合至两条DNA链的探针对，如本文所述，以起始杂交链反应，这将确保dsDNA特异性。使用RNAscopeTM或BaseScopeTM技术，在同一张载玻片上同时检测多个双链核酸靶标(例如多个DNA靶标)的多路复用非常简单。因此，应当理解，用于在原位测定中检测核酸的各种方法(如本文和上文描述的那些)可应用于靶探针配置，其中靶探针对结合至靶双链核酸的两条链，如本文所述用于检测双链核酸。
本文公开的本发明的方法可用于检测各种细胞和组织类型中的任何双链核酸，如DNA生物标志物。在本发明的一个实施方案中，ds-探针设计与RNAscopeTM一起使用以检测细胞和组织中的多个基因靶标(参见实施例1和图4)。本发明的方法可用于检测和表征在肿瘤和其他疾病中发现的多种DNA结构变异，如缺失、插入、基因融合、易位、复制和扩增。本发明的方法还可用于检测双链病毒DNA和RNA以及具有双链特异性的细菌DNA。
如本文所用，术语“标记探针”是指直接或间接，通常间接地结合靶分子并允许靶标被检测的实体。标记探针(或“LP”)含有通常为单链多核苷酸或寡核苷酸的核酸结合部分，其包含一个或多个直接或间接提供可检测信号的标记。标记可与多核苷酸共价连接，或者多核苷酸可被配置成与标记结合。例如，生物素化的多核苷酸可以结合与链霉亲和素结合的标记。标记探针可例如与靶核酸直接杂交。通常，标记探针可与核酸杂交，所述核酸又与靶核酸杂交或与一种或多种与靶核酸杂交的其他核酸杂交。因此，标记探针可包含与靶核酸的多核苷酸序列，特别是一部分互补的多核苷酸序列。或者，标记探针可包含至少一个与本文所述的扩增子、前置扩增子、前置前置扩增子、信号产生复合物(SGC)等中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。通常，在本发明的实施方案中，标记探针与扩增子结合。如本文所用，包含酶标记的标记探针是指包含核酸结合部分如寡核苷酸和与核酸结合部分偶联的酶的标记探针。如本文所公开的，酶与核酸结合部分的偶联可以是共价的或通过高亲和力结合相互作用，如生物素/抗生物素蛋白或其他类似的高亲和力结合分子。
如本文所用，“靶探针”是能够与靶核酸杂交并捕获或结合标记探针或信号产生复合物(SGC)组分(例如扩增子，前置扩增子或前置前置扩增子)至所述靶核酸的多核苷酸。靶探针可与标记探针直接杂交，或其可与一种或多种核酸杂交，所述核酸又与标记探针杂交；例如，靶探针可与SGC中的扩增子，前置扩增子或前置前置扩增子杂交。因此，靶探针包括与靶核酸的多核苷酸序列互补的第一多核苷酸序列和与标记探针、扩增子、前置扩增子、前置前置扩增子等的多核苷酸序列互补的第二多核苷酸序列。通常，在本发明的实施方案中，靶探针结合至前置扩增子，如图1A和1B所示，或结合至前置前置扩增子，如图1C所示。靶探针通常是单链的，使得互补序列可用于与相应的靶核酸、标记探针、扩增子、前置扩增子或前置前置扩增子杂交。在本发明的实施方案中，其中靶核酸是双链的，靶探针作为一对提供，其中所述对的一个成员结合至双链核酸的一条链，而另一个靶探针结合至双链核酸的相对链。
如本文所用，“扩增子”是能够与多个标记探针杂交的分子，通常是多核苷酸。通常，扩增子与多个相同的标记探针杂交。扩增子还可与靶核酸杂交，与一对靶探针中的至少一个靶探针杂交，与一对靶探针中的两个靶探针杂交，或与结合靶探针的核酸杂交，如扩增子、前置扩增子或前置前置扩增子。例如，扩增子可与至少一个靶探针和多个标记探针杂交，或与前置扩增子和多个标记探针杂交。通常，在本发明的实施方案中，扩增子可以与前置扩增子杂交。扩增子可以是例如线性、叉状、梳状或分支核酸。如本文对所有多核苷酸所述，扩增子可包括修饰的核苷酸和/或非标准核苷酸间连接以及标准脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和/或磷酸二酯键。例如，在美国专利号5,635,352、5,124,246、5,710,264、5,849,481和7,709,198以及美国公开案2008/0038725和2009/0081688中描述了合适的扩增子，所述专利中的每一个以引用的方式并入。通常，在本发明的实施方案中，扩增子结合至前置扩增子和标记探针(参见图5)。
如本文所用，“前置扩增子”是用作一个或多个靶探针与一个或多个扩增子之间的中间结合组分的分子，通常是多核苷酸。通常，前置扩增子同时与一个或多个靶探针和多个扩增子杂交。例如在美国专利号5,635,352、5,681,697和7,709,198以及美国公开案2008/0038725、2009/0081688和2017/0101672中描述了示例性前置扩增子，其各自以引用的方式并入。通常，在本发明的实施方案中，前置扩增子结合至靶探针对的两个成员(参见图1A、1B和5A)，结合至可结合至靶探针对的前置前置扩增子(图5B)，或者结合至可结合至靶探针对的前置前置扩增子对的两个成员(参见图5C)。前置扩增子也结合至扩增子(参见图5)。
如本文所用，“前置前置扩增子”是用作一个或多个靶探针与一个或多个前置扩增子之间的中间结合组分的分子，通常是多核苷酸。通常，前置前置扩增子同时与一个或多个靶探针和多个前置扩增子杂交。例如，在2017/0101672中描述了示例性前置前置扩增子，其以引用的方式并入本文。通常，在本发明的实施方案中，前置前置扩增子结合至靶探针对(参见图5B)或者结合至靶探针对的成员(参见图1C和5C)并且结合至前置扩增子(参见图5C)。
如本文所用，术语“多个”应理解为意指两个或更多个。因此，多个可以指例如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、11个或更多、12个或更多、13个或更多、14个或更多、15个或更多、16个或更多、17个或更多、18个或更多、19个或更多、20个或更多、21个或更多、22个或更多、23个或更多、24个或更多、25个或更多、26个或更多、27个或更多、28个或更多、29个或更多、30个或更多、31个或更多、32个或更多、33个或更多、34个或更多、35个或更多、36个或更多、37个或更多、38个或更多、39个或更多、40个或更多、41个或更多、42个或更多、43个或更多、44个或更多、45个或更多、46个或更多、47个或更多、48个或更多、49个或更多、50个或更多、55个或更多、60个或更多、65个或更多、70个或更多、75个或更多、80个或更多、85个或更多、90个或更多、95个或更多、100个或更多、110个或更多、120个或更多、130个或更多、140个或更多、150个或更多、160个或更多、170个或更多、180个或更多、190个或更多、200个或更多、300个或更多、400个或更多、500个或更多、600个或更多、700个或更多、800个或更多、900个或更多、或1000个或更多、或甚至更大的数量，如果需要用于特定用途。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测双链核酸的方法，所述方法包括：(A)使包含含有一种或多种双链核酸的细胞的样品与靶探针组接触，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(B)使所述样品与前置扩增子接触，所述前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(C)使所述样品与多个扩增子接触，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(D)使所述样品与多个标记探针接触，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点；以及(E)检测与所述靶双链核酸结合的标记探针，从而检测所述靶双链核酸。
在一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测双链核酸的方法，所述方法包括(A)使包含含有一种或多种双链核酸的细胞的样品与靶探针组接触，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(B)使所述样品与前置前置扩增子组接触，所述前置前置扩增子组包含第一和第二前置前置扩增子，其中所述第一前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点，其中所述第二前置前置扩增子包含用于所述第二靶探针的结合位点，并且其中所述第一和第二前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点；(C)使所述样品与多个前置扩增子接触，其中所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(D)使所述样品与多个扩增子接触，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(E)使所述样品与多个标记探针接触，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点；以及(F)检测与所述靶双链核酸结合的标记探针，从而检测所述靶双链核酸。
在一个实施方案中，所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点，其中与两个前置前置扩增子的结合之间的解链温度高于仅一个前置前置扩增子的结合之间的解链温度。
所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测双链核酸的方法，所述方法包括(A)使包含含有一种或多种双链核酸的细胞的样品与靶探针组接触，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(B)使所述样品与前置前置扩增子接触，所述前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点；(C)使所述样品与多个前置扩增子接触，所述前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(D)使所述样品与多个扩增子接触，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(E)使所述样品与多个标记探针接触，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点；以及(F)检测与所述靶双链核酸结合的标记探针，从而检测所述靶双链核酸。
在这种方法的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种方法的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种方法的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在本发明的一些实施方案中，对靶核酸具有特异性的每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶双链核酸特异性地杂交的靶探针。在这种情况下，对靶核酸具有特异性的靶探针组中的靶探针对与靶核酸的不同和非重叠序列结合。当使用具有两对或更多对可与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针的靶探针组时，结合至靶探针对的分子，无论是前置扩增子(参见图1A、1B和5A)，还是前置前置扩增子(参见图1C、5B和5C)，对于相同靶探针组中的靶探针对通常是相同的。因此，结合至相同靶双链核酸的靶探针对可被设计成包含用于SGC中结合至靶探针对的分子(即前置扩增子或前置前置扩增子)的相同结合位点。使用多个靶探针对检测靶核酸提供了与多个SGC在相同靶核酸上的组装相关的更高信号。在一些实施方案中，用于结合相同靶核酸的靶探针对的数目为每个靶1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、1-120、1-130、1-140、1-150、1-160、1-170、1-180、1-190或1-200对，或更大数目的对，或其间的任何整数数目的对，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200等。
本发明的方法可用于实现所需靶双链核酸的检测。在一个实施方案中，用多个靶探针对检测靶核酸。在这种情况下，靶探针对被设计成结合靶核酸的多于一个区域以允许多个SGC组装到靶核酸上。应当理解，如果多个靶探针对用于结合相同的靶核酸，则一个靶探针对的靶结合位点不与另一个靶探针对的靶结合位点重叠。
在本发明的一个实施方案中，通过本发明的方法检测的靶核酸可以是存在于细胞样品中的任何双链靶核酸。在用于检测靶双链核酸的本发明方法中，应理解靶核酸可独立地是DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合体。因此，待检测的靶核酸可以是但不一定是相同类型的核酸。此外，本发明的方法可与用于检测单链核酸的方法(如RNAscopeTM或BaseScopeTM)组合，使得可在同一样品中检测双链和单链核酸。靶核酸包括但不限于RNA，包括信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、核糖体RNA(rRNA)、线粒体RNA、非编码RNA等，或DNA等，或DNA/RNA杂合体。在靶核酸是RNA的情况下，应理解，靶核酸可独立地选自由以下组成的组：信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、核糖体RNA(rRNA)、线粒体RNA和非编码RNA。因此，靶核酸可独立地是DNA(单链或双链)，或任何类型的RNA(信号链或双链)，或DNA/RNA杂合体。
如本文所述，本发明的方法总体上涉及双链核酸的原位检测。用于核酸的原位检测的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如US2008/0038725；US2009/0081688；Hicks等人,J.Mol.Histol.35:595-601(2004))。如本文所用，“原位杂交”或“ISH”是指使用直接或间接标记的互补DNA或RNA链(例如探针)(原位)结合并定位样品(特别是组织或细胞的一部分或切片)中的特定核酸(例如DNA或RNA)的杂交类型。探针类型可以是双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、单链互补RNA(sscRNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、核糖体RNA、线粒体RNA和/或合成的寡核苷酸。术语“荧光原位杂交”或“FISH”是指利用荧光标记的ISH类型。术语“发色原位杂交”或“CISH”是指具有发色标记的ISH类型。ISH、FISH和CISH方法是本领域技术人员熟知的(参见例如Stoler,Clinics in Laboratory Medicine 10(1):215-236(1990)；In situ hybridization.A practical approach,Wilkinson,编辑,IRL Press,Oxford(1992)；Schwarzacher和Heslop-Harrison,Practi cal in situ hybridization,BIOS Scientific Publishers Ltd,Oxford(2000))。
对于用于原位检测细胞中核酸靶的本发明的方法，包括但不限于原位杂交或流式细胞术，任选地在靶探针杂交之前固定和/或透化细胞。将细胞固定和透化可促进核酸靶保留在细胞中并允许靶探针、标记探针、扩增子、前置扩增子、前置前置扩增子等进入细胞并到达靶核酸分子。任选地洗涤细胞以除去未被捕获到核酸靶上的物质。细胞可以在多个步骤中任一个之后洗涤，例如，在靶探针与核酸靶杂交以除去未结合的靶探针之后，在前置前置扩增子、前置扩增子、扩增子和/或标记探针与靶探针杂交之后，等等。用于固定和透化细胞以原位检测核酸的方法，以及用于杂交，洗涤和检测靶核酸的方法也是本领域公知的(参见例如US 2008/0038725；US 2009/0081688；Hicks等人,J.Mol.Histol.35:595-601(2004)；Stoler,Clinics in Laborato ry Medicine 10(1):215-236(1990)；In situhybridization.A practical approach,Wilkinson,编,IRL Press,Oxford(1992)；Schwarzacher和Heslop-Harrison,Practical in situ hybridization,BIOS ScientificPub lishers Ltd,Oxford(2000)；Shapiro,Practical Flow Cytometry第3版,Wiley-Liss,New York(1995)；Ormerod,Flow Cytometry,第2版,Springer(1999))。示例性固定剂包括但不限于醛(甲醛、戊二醛等)、丙酮、醇(甲醇、乙醇等)。示例性透化剂包括但不限于醇(甲醇、乙醇等)、酸(冰醋酸等)、去污剂(Triton、NP-40、TweenTM 20等)、皂苷、洋地黄皂苷、LeucopermTM(BioRad,Hercules,CA)和酶(例如溶菌酶、脂肪酶、蛋白酶和肽酶)。透化也可以通过机械破裂发生，例如在组织切片中。
对于双链核酸的原位检测，通常处理样品以使样品中的双链核酸变性，以使靶探针通过杂交与靶双链核酸的两条链结合。使双链核酸变性的条件是本领域熟知的，并且包括热和化学变性，例如用碱(NaOH)、甲酰胺、二甲亚砜等(参见Wang等人,Environ.HealthToxicol.29:e2014007(doi:10.5620/eht.2014.29.e2014007)2014；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wileyand Sons,Baltimore,MD(1999))。例如，NaOH、LiOH或KOH或其他高pH缓冲液(pH>11)可用于使双链核酸如DNA变性。另外，热和化学变性方法可以组合使用。
图2中概述了示例性测定方案。图2中描绘的测定对应于用于在Leica BiosystemsBOND RX系统(Leica Biosystems,Buffalo Grove,IL)上使用的RNAScopeTM 2.5LS Red测定(用户手册322150，Advanced Cell Diagnostics,Newark CA)。简言之，标准方案首先在60℃下烘烤载玻片，然后脱蜡以除去石蜡(“烘烤+脱蜡”)。然后在88℃下用表位修复缓冲液(“ER2”)处理载玻片以揭示靶标，然后进行蛋白酶消化(蛋白酶III)。然后，使靶探针与载玻片杂交(“探针”)，然后依次与前置扩增子、扩增子和标记探针(“AMP”)杂交，然后用色原固红检测靶标。修改的DNA检测方案增加了化学变性步骤(“化学DN”，在2XSSC中的70％甲酰胺在80℃下20分钟)。
这种原位检测方法可用于固定在载玻片上的组织样本，用于悬浮液中的单细胞，例如从血样中分离的外周血单核细胞(PBMC)等。组织样本包括例如组织活检样品。血样包括例如为诊断目的而采集的血样。在血样的情况下，可以直接分析血液，例如在血涂片中，或者可以处理血液，例如裂解红细胞，分离PBMC或白细胞，分离靶细胞等，使得通过本发明方法分析的样品中的细胞在血样中或来源于血样。类似地，可处理组织样本，例如，切碎并物理或酶处理组织样本以将组织破碎成单个细胞或细胞簇。另外，如果需要，可处理细胞样品以分离细胞或破坏细胞簇。因此，可使用本领域熟知的方法获得和加工组织、血液和细胞样品。本发明的方法可用于诊断应用以基于作为指示病理的生物标志物的双链核酸靶标的存在或不存在来鉴定病理细胞的存在或不存在。
本领域技术人员应理解，许多合适的样品中的任一种可用于使用本发明的方法检测靶双链核酸。用于本发明方法的样品通常是生物样品或组织样品。这样的样品可以从生物受试者获得，包括生物组织或流体来源的样品，其收集自个体或生物材料的一些其他来源，例如活检、尸检或法医材料。生物样品还包括来自含有或疑似含有癌前或癌细胞或组织的生物受试者区域的样品，例如组织活检，包括细针抽吸物、血液样品或细胞学样本。此类样品可以是但不限于从生物体如哺乳动物分离的器官、组织、组织部分和/或细胞。示例性生物样品包括但不限于细胞培养物，包括原代细胞培养物、细胞系、组织、器官、细胞器、生物流体等。另外的生物样品包括但不限于皮肤样品、组织活检(包括细针抽吸物)、细胞样品、粪便、体液(包括血液和/或血清样品)、唾液、精液等。此类样品可用于医学或兽医诊断目的。样品也可从其他来源获得，例如食物、土壤、物体表面等，以及需要检测双链核酸的其他材料。因此，本发明的方法可用于从获自个体或其他来源的生物样品中检测一种或多种病原体，如双链DNA或RNA病毒、细菌、真菌、单细胞生物体如寄生虫等。
用于通过本发明的方法分析的细胞样品的收集是本领域公知的(参见例如，Dey,“Cytology Sample Procurement,Fixation and Proce ssing”in Basic and AdvancedLaboratory Techniques in Histopathol ogy and Cytology第121-132页,Springer,Singapore(2018)；“Non-Gynocological Cytology Practice Guideline”AmericanSociety of Cy topathology,ASC执行委员会于2004年3月2日通过)。加工用于分析宫颈组织的样品(包括组织活检和细胞学样品)的方法是本领域公知的(参见例如，CecilTextbook of Medicine,Bennett和Plum,编,第20版,WB Saunders,Philadelphia(1996)；Colposcopy and Treatment of Cervical Intraepithelial Neoplasia:A Beginner’sManual,Sellors和Sankaranarayanan,编,International Agency for Research on Cancer,Lyon,France(2003)；Kalaf和Cooper,J.Clin.Pathol.60:449-455(2007)；Brown和Trimble,Best Pract.Res.Clin.Obstet.Gynaecol.26:233-242(2012)；Waxman等人,Obstet.Gynecol.120:1465-1471(2012)；Cervical Cytology Practice Guidelines TOC,美国细胞病理学会(ASC)执行委员会批准，2000年11月10日))。在一个实施方案中，细胞样品是宫颈样品，例如巴氏涂片。在一个实施方案中，样品是细针抽吸物。
在本发明的特定实施方案中，样品是组织样本或来源于组织样本。在本发明的其他特定实施方案中，样品是血液样品或来源于血液样品。在本发明的另其他特定实施方案中，样品是细胞样品或来源于细胞样品。
本发明基于在靶双链核酸之间构建复合物以用可检测标记来标记双链核酸。这种复合物有时被称为信号生成复合物(SGC；参见例如US 20170101672)。这种复合物或SGC通过构建允许大量标记连接到靶双链核酸的分子层来实现。
本发明的方法可以使用信号生成复合物(SGC)，其中SGC包含多个分子而不是单个分子。这种SGC特别适用于放大可检测信号，提供对靶核酸的更高敏感性检测。此类用于放大信号的方法描述于例如美国专利号5,635,352、5,124,246、5,710,264、5,849,481和7,709,198，以及美国公开案2008/0038725和2009/0081688，以及WO 2007/001986和WO 2012/054795中，其各自通过引用并入本文。SGC的生成是RNAscopeTM测定的原理(参见美国专利号7,709,198、8,658,361和9,315,854，美国公开案2008/0038725、2009/0081688和2016/0201117，以及WO 2007/001986和WO 2012/054795，其各自通过引用并入本文)。
基本信号生成复合物(SGC)在图5A中示出(也参见US2009/0081688，其通过引用并入本文)。图5中描绘为一对“Z”的一对靶探针与标记为“靶标”的互补分子序列杂交。为简单起见，图5将靶标描绘为单线，而应理解本发明中的靶标是双链核酸，更详细地如图1所示。每个靶探针含有与前置扩增子分子(PA，以绿色示出)互补的附加序列，其必须同时与靶探针对的两个成员杂交以便稳定结合。前置扩增子分子由两个结构域组成：一个结构域具有与每个靶探针杂交的区域，一个结构域含有一系列核苷酸序列重复，每个与扩增子分子(Amp，以黑色示出)上的序列互补。此序列的多个重复的存在允许多个扩增子分子与一个前置扩增子杂交，这增加了整体信号放大。每个扩增子分子由两个结构域组成，一个结构域具有与前置扩增子杂交的区域，并且一个结构域含有一系列核苷酸序列重复，每个与标记探针(LP，以黄色示出)上的序列互补，允许多个标记探针与每个扩增子分子杂交，这进一步增加了整体信号放大。每个标记探针含有两种组分。一种组分由与扩增子分子上的重复序列互补以允许标记探针杂交的核苷酸序列组成。此核苷酸序列与第二组分连接，所述第二组分可以是任何信号生成实体，包括用于直接可视化的荧光或发色标记，可直接检测的金属同位素，或能够促进化学反应产生荧光、发色或其他可检测信号的酶或其他化学品，如本文所述。在图5A中，标记探针被描绘为代表核酸组分的线和代表信号生成组分的星号。从靶探针到标记探针的组装一起被称为信号生成复合物(SGC)。
图5B示出了通过添加扩增分子层(在这种情况下为前置前置扩增子分子(PPA，以红色示出))而放大的SGC。PPA结合一个结构域中的靶探针和另一个结构域中的多个前置扩增子(PA)。
图5C示出在前置扩增子水平上使用协同杂交的不同SGC结构(参见US 2017/0101672，其以引用的方式并入本文)。与图5A和5B中形成的SGC类似，一对靶探针与靶分子序列杂交。每个靶探针含有与独特的前置前置扩增子分子(PPA-1，以紫色示出；PPA-2，以红色示出)互补的另一序列。使用两个独立的分子建立了需要协同杂交的基础。每个前置前置扩增子分子由两个结构域组成，一个结构域具有与靶探针中一个杂交的区域，并且一个结构域含有一系列核苷酸序列重复，每个包含与前置扩增子分子(PA，以绿色示出)内的序列互补的序列，以及促进PPA-PA结合效率的间隔区序列。为了稳定地连接到生长的SGC上，每个PA必须同时与两个PPA分子杂交。每个前置扩增子分子由两个结构域组成，一个结构域含有与两个前置前置扩增子互补以允许杂交的序列，并且一个结构域含有一系列核苷酸序列重复，每个与扩增子分子(AMP，以黑色示出)上的序列互补。扩增子杂交序列的多个重复允许多个扩增子分子与每个前置扩增子杂交，进一步增加信号放大。为了简化说明，扩增子分子被示为与一个前置扩增子分子杂交，但是应当理解，扩增子可以与每个前置扩增子结合。每个扩增子分子含有与标记探针(LP，以黄色示出)内的序列互补的一系列核苷酸序列重复，从而允许几个标记探针与每个扩增子分子杂交。每个标记探针包含信号生成元件以提供信号检测。
如上所述，无论使用图1A、1B和5A所示的配置，还是图1C和5C所示的配置，设计SGC的组分使得需要结合两个靶探针以构建SGC。在图1A、1B、5A和5B的配置的情况下，前置扩增子(或图5B中的前置前置扩增子)必须结合至靶探针对的两个成员以发生稳定结合。这通过设计靶探针和前置扩增子(或前置前置扩增子)之间的结合位点来实现，使得两个靶探针与前置扩增子(或前置前置扩增子)的结合具有比单个靶探针与前置扩增子(或前置前置扩增子)的结合更高的解链温度(Tm)，并且其中单个靶探针的结合在测定条件下是不稳定的。此设计先前已描述于例如美国专利号7,709,198、美国公开2008/0038725和2009/0081688、WO2007/001986、WO 2007/002006，Wang等人，同上，2012，Anderson等人，同上，2016)中。通过以这种方式配置SGC组分，当两个靶探针都结合至靶核酸和前置扩增子时实现了SGC的组装，从而由于最小化作为假阳性的SGC的组装而降低了背景噪声。
在图1C和5C的配置的情况下，仅在靶探针对的两个成员都结合至靶核酸时才形成SGC的要求是通过要求前置扩增子结合至两个前置前置扩增子来实现的，这两个前置前置扩增子又分别结合至靶探针对的两个成员。此要求通过以下来实现：设计前置前置扩增子和前置扩增子之间的结合位点，使得两个前置前置扩增子与前置扩增子的结合之间的解链温度(Tm)高于任一单独的前置前置扩增子的解链温度，并且其中一个前置前置扩增子与前置扩增子的结合在测定条件下是不稳定的。这种设计先前已经描述于例如US20170101672、WO 2017/066211和Baker等人，同上，2017)中。除非前置扩增子与两个前置前置扩增子结合，否则扩增子和标记探针不能组装成与靶核酸结合的SGC，从而由于最小化作为假阳性的SGC的组装而降低了背景噪声。
如本文所公开的，本发明是基于构建与靶核酸结合的信号生成复合物(SGC)以检测细胞中靶核酸的存在。用于构建SGC的组分通常包含核酸，使得核酸杂交反应用于将SGC的组分结合至靶核酸。选择合适区域并设计与靶核酸结合的特异性和选择性试剂的方法，特别是与靶核酸或SGC的其他组分特异性和选择性结合的寡核苷酸或探针，是本领域技术人员众所周知的(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999))。设计靶探针使得探针与靶核酸特异性杂交。可使用对靶核酸区域以及适当长度的结合剂如寡核苷酸或探针的适当选择来实现所需的特异性，并且这种选择方法是本领域技术人员众所周知的。本领域技术人员将容易理解并且可容易地确定合适的试剂，如寡核苷酸或探针，其可用于靶向一种特定靶核酸而不是另一种靶核酸或者而不是非靶核酸，或者提供与SGC组分的结合。因此，应理解“特异性地杂交”、“特异性地标记”和“特异性地结合”(或其语法变型)是指与靶核酸而不是非靶核酸(例如，不需要被靶向的另一种或多种靶核酸)的杂交、标记或结合。可通过使用对独特序列的适当选择，使得靶特异性SGC的给定组分(例如，靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子、扩增子、标记探针)将与相应的组分结合，使得靶特异性SGC与特异性靶标结合而不是与另一种靶核酸结合来实现靶特异性SGC的类似特异性。
如本文所述，本发明的实施方案包括使用靶探针对，所述对的每个成员结合至双链核酸的相对链。在一对靶探针结合至同一前置扩增子(图1A、1B和5A)或前置前置扩增子(图5B)的情况下，可使用探针配置，有时称为“Z”配置。这种配置及其用于增加敏感性和减少背景的优点例如在美国专利号7,709,198、美国公开2008/0038725和2009/0081688，以及WO 2007/001986和WO 2007/002006中进行了描述，其各自以引用的方式并入本文。美国专利号7,709,198和美国公开2008/0038725和2009/0081688另外描述了用于选择靶探针(例如靶探针对)的特征的细节，包括长度、取向、杂交条件等。本领域技术人员可以基于本文的教导和例如美国专利号7,709,198、美国公开2008/0038725和2009/0081688以及WO 2007/001986和WO 2007/002006中的教导容易地确定合适的配置。
如本文所述，靶探针对中的靶探针的靶结合位点可呈任何所需的取向和组合。例如，靶探针对的一个成员的靶结合位点相对于前置扩增子或前置前置扩增子结合位点可以是5'或3'，并且所述对的另一个成员可以独立地将靶结合位点相对于前置扩增子或前置前置扩增子结合位点定位于5'或3'。
在另一个实施方案中，用于检测靶双链核酸存在的SGC是基于SGC的一个或多个组分的协同杂交(参见US 20170101672和WO2017/066211，其各自通过引用并入本文)。这种协同杂交在本文中也称为BaseScopeTM。在协同杂交效应中，SGC的两个组分之间的结合通过两个结合位点介导，并且同时与两个位点结合的解链温度高于单独一个位点结合的解链温度(参见US 20170101672和WO2017/066211)。协同杂交效应可通过如US 20170101672和WO2017/066211中所述的靶探针组配置来增强。
本发明的方法和相关组合物可利用协同杂交来增加特异性并降低双链核酸靶的原位检测中的背景，其中复杂的生理化学环境和大量非靶分子的存在可产生高噪音。使用这种协同杂交方法，标记探针的结合仅在SGC与靶核酸结合时发生。如US 20170101672和WO2017/066211中所述及其图1中所示，通过增加SGC的一个或多个组分中协同杂交的数目，可以容易地修改所述方法以提供所需的信噪比。
在另一个实施方案中，协同杂交可应用于SGC的各种组分。例如，如本文所述，SGC的组分之间的结合可以是稳定的反应，或者也如本文所述，结合可以被配置成需要协同杂交。在这种情况下，设计用于协同杂交的结合组分，使得所述组分含有与另一组分结合的两个区段。
因此，用于检测靶核酸的方法可利用协同杂交用于检测系统中提供与靶核酸特异性结合的SGC的任一个或所有组分之间的结合反应。可以基于所需的测定条件、被测定的样品类型、所需的测定敏感性等选择应用协同杂交的组分的数目和哪些组分。协同杂交结合反应的任一种或组合可用于增加测定的敏感性和特异性。在本发明的实施方案中，协同杂交可以在前置前置扩增子和前置扩增子之间、在前置扩增子和扩增子之间、在扩增子和标记探针之间，或其组合(参见例如US 20170101672和WO2017/066211)。
如本文所公开的，组分通常彼此直接结合。在含有核酸的组分的情况下，结合反应通常通过杂交进行。在杂交反应的情况下，组分之间的结合是直接的。如果需要，可以包括中间组分，使得一种组分与另一种组分的结合是间接的，例如，中间组分含有互补结合位点以桥接两个其他组分。
如本文所述，可选择各种组分的配置以提供所需的稳定或协同杂交结合反应(参见例如US 20170101672)。应理解，即使结合反应在本文中示例为稳定的或不稳定的反应，例如对于协同杂交，任何结合反应可根据需要进行修饰，只要检测到靶双链核酸。还应当理解，可以根据所用的测定和杂交条件改变和选择配置。通常，如果期望结合反应是稳定的，则组分之间的互补核酸序列的区段通常在10至50个核苷酸或更多的范围内，例如16至30个核苷酸，如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸或更多。如果期望结合反应相对不稳定，例如当使用协同杂交结合反应时，组分之间的互补核酸序列的区段通常在5至18个核苷酸的范围内，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个核苷酸。应当理解，对于稳定或不稳定杂交，核苷酸长度可以稍短或稍长，这取决于测定中使用的序列(例如GC含量)和条件。还应当理解，如本文所公开的，修饰的核苷酸如锁核酸(LNA)或桥核酸(BNA)可用于增加修饰碱基处的结合强度，从而允许减少结合区段的长度。因此，应理解，关于与其他核酸区段互补的核酸区段的长度，如果需要，可进一步减少本文所述的长度。本领域技术人员可以容易地确定合适的探针设计，包括长度、修饰核苷酸的存在等，以实现核酸组分之间所需的相互作用。
在设计包含互补序列的两个核酸序列之间的结合位点时，可以任选地设计互补序列以最大化解链温度的差异(dTm)。这可以通过使用本领域已知的解链温度计算算法来完成(参见例如SantaLucia,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:1460–1465(1998))。此外，已知人工修饰的碱基如锁核酸(LNA)或桥核酸(BNA)和天然存在的2'-O-甲基RNA增强互补对之间的结合强度(Petersen和Wengel,Trends Biotechnol.21:74–81(2003)；Majlessi等人,Nucl.Acids Res.26:2224–2229(1998))。这些修饰的碱基可以根据需要策略性地引入到SGC组分之间的结合位点中。
一种方法是利用修饰的核苷酸(LNA、BNA或2′-O-甲基RNA)。因为每个修饰的碱基可以增加解链温度，所以两个核酸序列(即互补序列)之间的结合区的长度可以显著缩短。修饰的碱基与其补体的结合强度更强，并且解链温度的差异(dTm)增加。又另一个实施方案是在待杂交的核酸组分的互补序列中或在例如信号生成复合物(SGC)的两个核酸组分之间使用三个修饰碱基(例如三个LNA，BNA或2'-O-甲基RNA碱基，或两个或三个不同修饰碱基的组合)。这样的组分可以是例如前置前置扩增子、前置扩增子、扩增子、标记探针或靶探针对。
修饰的碱基，如LNA或BNA，可用于SGC选定组分的区段中，特别是介导核酸组分之间结合的那些，这增加了碱基与其互补碱基的结合强度，使得互补区段的长度减少(参见例如Petersen和Wengel,Trends Biotechnol.21:74–81(2003)；美国专利号7,399,845)。扩展天然4字母表如人工扩展的遗传信息系统(AEGIS；Yang等人,Nucl.Acids Res.34(21):6095-6101(2006))的人工碱基可以掺入SGC的相互作用组分之间的结合位点中。这些人工碱基可增加相互作用组分的特异性，这又可允许较低严格性杂交反应产生较高信号。
关于靶探针对，可以将靶探针对设计成结合靶核酸的紧邻区段或在靶探针对的靶探针结合位点之间具有一至多个碱基的区段上。通常，靶探针对被设计成结合靶核酸，使得在靶核酸上的结合位点之间通常存在0至500个碱基，例如0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480或500个碱基，或其间的任何整数长度。在特定实施方案中，所述靶探针对的结合位点介于0与100之间，例如，0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或其间的任何整数长度。在与双链核酸靶标结合的情况下，应理解靶探针对的成员结合至双链核酸的相对链(参见例如图1)。因此，应理解，当提及紧邻的结合位点或在双链靶核酸的靶探针结合位点之间具有多个碱基的结合位点时，靶探针对的结合位点位于相对的链上。与一对靶探针与单链靶标核酸的结合不同，在双链靶标的情况下，应理解所述探针对的靶结合位点可重叠，因为结合位点出现在靶探针对的相应成员的相对的链上。应理解，只要两个靶探针与相应靶核酸链的同时结合没有空间位阻，就可发生重叠。如果需要这种重叠，则本领域技术人员可容易地确定相对链上的靶结合位点之间的允许重叠。
SGC还包含多个标记探针(LP)。每个LP包括可检测的区段。可检测组分可直接连接至LP，或者LP可与包含可检测组分(即标记)的另一种核酸杂交。如本文所用，“标记”是促进分子检测的部分。本发明上下文中的常见标记包括荧光、发光、光散射和/或比色标记。合适的标记包括酶、荧光和发色部分、以及放射性核素、底物、辅因子、抑制剂、化学发光部分、磁性颗粒、稀土金属、金属同位素等。在本发明的一个特定实施方案中，标记是酶。示例性酶标记包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等以及各种蛋白酶。其他标记包括但不限于荧光团、二硝基苯基(DNP)等。标记是本领域技术人员熟知的，例如描述于Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,SanDiego(1996)，以及美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。许多标记是可商购的并且可用于本发明的方法和测定中，包括可检测的酶/底物组合(Pierce,Rockford IL；Santa Cruz Biotechnology,Dallas TX；LifeTechnologies,Carlsbad CA)。在本发明的一个特定实施方案中，酶可利用发色或荧光底物以产生可检测信号，如本文所述。本文描述了示例性标记。
可以使用多种酶或非酶标记中的任一种，只要可以分别检测到酶活性或非酶标记。酶由此产生可检测信号，其可用于检测靶核酸。特别有用的可检测信号是发色或荧光信号。因此，用作标记的特别有用的酶包括可获得发色或荧光底物的酶。这样的发色或荧光底物可以通过酶促反应转化为容易检测的发色或荧光产物，其可以使用显微镜或光谱法容易地检测和/或定量。这些酶是本领域技术人员熟知的，包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等(参见Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996))。具有众所周知的发色或荧光底物的其他酶包括各种肽酶，其中发色或荧光肽底物可用于检测蛋白水解裂解反应。发色和荧光底物的使用在细菌诊断学中也是众所周知的，包括但不限于使用α-和β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、6-磷酸-β-D-半乳糖苷6-磷酸半乳糖苷水解酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、淀粉酶、神经氨酸酶、酯酶、脂肪酶等(Manafi等人,Microbiol.Rev.55:335-348(1991))，并且此类具有已知发色或荧光底物的酶可容易地适用于本发明的方法。
产生可检测信号的各种发色或荧光底物是本领域技术人员熟知的并且是可商购的。可用于产生可检测信号的示例性底物包括但不限于用于辣根过氧化物酶的3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、氯萘酚(4-CN)(4-氯-1-萘酚)、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺二盐酸盐(OPD)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)；用于碱性磷酸酶的5-溴-4-氯-3-吲哚基-1-磷酸(BCIP)、氮蓝四唑(NBT)、固红(固红TR/AS-MX)和对硝基苯基磷酸酯(PNPP)；用于β-半乳糖苷酶的1-甲基-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷和2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-吡喃半乳糖苷；用于β-葡糖苷酶的2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-吡喃葡萄糖苷等。示例性荧光底物包括但不限于用于碱性磷酸酶的4-(三氟甲基)伞形基磷酸酯；用于磷酸酶的4-甲基伞形基磷酸酯双(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)、4-甲基伞形基磷酸酯双(环己基铵)和4-甲基伞形基磷酸酯；用于辣根过氧化物酶的QuantaBluTM和QuantaRedTM；用于β-半乳糖苷酶的4-甲基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)和萘荧光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)；用于β-葡糖苷酶的3-乙酰基伞形基β-D-吡喃葡糖苷和4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡糖苷；和用于α-半乳糖苷酶的4-甲基伞形基-α-D-吡喃半乳糖苷。用于产生可检测信号的示例性酶和底物也描述于例如美国公开案2012/0100540中。各种可检测的酶底物(包括发色或荧光底物)是熟知的且可商购的(Pierce,Rockford IL；Santa Cruz Biotechnology,Dallas TX；Invitrogen,Carlsbad CA；42 Life Science；Biocare)。通常，将底物转化为形成沉淀的产物，沉淀沉积在靶核酸的位点。其他示例性底物包括但不限于HRP-Green(42 Life Science)、BetazoidDAB、Cardassian DAB、Romulin AEC、Bajoran紫、Vina绿、Deep Space BlackTM、Warp RedTM、Vulcan固红和来自Biocare的Ferangi蓝(Concord CA；biocare.net/products/detection/chromogens)。
适合作为可检测标记的示例性稀土金属和金属同位素包括但不限于镧系元素(III)同位素，例如141Pr、142Nd、143Nd、144Nd、145Nd、146Nd、147Sm、148Nd、149Sm、150Nd、151Eu、152Sm、153Eu、154Sm、155Gd、156Gd、158Gd、159Tb、160Gd、161Dy、162Dy、163Dy、164Dy、165Ho、166Er、167Er、168Er、169Tm、170Er、171Yb、172Yb、173Yb、174Yb、175Lu和176Yb。金属同位素可以例如使用飞行时间质谱法(TOF-MS)(例如，Fluidigm Helios和Hyperion systems,fluidigm.com/systems；South San Francisco,CA)测量。
生物素-抗生物素蛋白(或生物素-链霉抗生物素蛋白)是众所周知的信号放大系统，其基于以下事实：两个分子彼此具有特别高的亲和力且一个抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白分子可结合四个生物素分子。抗体被广泛用于免疫组织化学和ISH中的信号放大。酪酰胺信号放大(TSA)是基于因过氧化物酶活性导致大量半抗原化的酪酰胺分子沉积。酪胺是酚类化合物。在少量过氧化氢存在下，固定的辣根过氧化物酶(HRP)将标记的底物转化成短寿命、极具反应性的中间体。然后活化的底物分子在过氧化物酶结合位点处或附近与蛋白质的富电子部分如酪氨酸非常迅速地反应并共价结合。这样，可以在杂交位点原位引入许多与酪酰胺缀合的半抗原分子。随后，沉积的酪酰胺-半抗原分子可以直接或间接可视化。例如在美国公开2012/0100540中更详细地描述了这种检测系统。
本文所述的实施方案可利用酶使用合适的发色或荧光底物产生可检测信号。可以理解，替代地，标记探针可以具有直接偶联到标记探针的核酸部分的可检测标记。示例性可检测标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于发色或荧光标记(参见Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996))。可用作标记的示例性荧光团包括但不限于罗丹明衍生物，例如四甲基罗丹明、罗丹明B、罗丹明6G、磺基罗丹明B、德克萨斯红(磺基罗丹明101)、罗丹明110及其衍生物，如四甲基罗丹明-5-(或6)、丽丝胺罗丹明B等；7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)；荧光素及其衍生物；萘如丹磺酰(5-二甲基氨基萘-1-磺酰基)；香豆素衍生物，例如7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、7-二乙基氨基-3-[(4'-(碘乙酰基)氨基)苯基]-4-甲基香豆素(DCIA)、Alexa荧光染料(MolecularProbes)等；4,4-二氟-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省(BODIPYTM)及其衍生物(MolecularProbes；Eugene,OR)；芘和磺化芘，例如Cascade BlueTM及其衍生物，包括8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸等；吡啶基恶唑衍生物和达巴氧基衍生物(Molecular Probes)；荧光黄(3,6-二磺酸-4-氨基-萘二酰亚胺)及其衍生物；CyDyeTM荧光染料(Amersham/GE Healthcare LifeSciences；Piscataway NJ)；ATTO 390、DyLight 395XL、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 490LS、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO 532、ATTO Rho6G、ATTO 542、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho3B、ATTO Rho11、ATTO Rho12、ATTO Thio12、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 594、ATTO Rho13、ATTO 610、ATTO 620、ATTO Rho14、ATTO 633、ATTO 643、ATTO 647、ATTO 647N、ATTO 655、ATTO Oxa12、ATTO 665、ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740、Cyan 500NHS-酯(ATTO-TECH,Siegen,德国)等。示例性发色团包括但不限于酚酞、孔雀石绿、硝基芳族化合物如硝基苯基、重氮染料、dabsyl(4-二甲基氨基偶氮苯-4'-磺酰基)等。
如本文所公开的，本发明的方法可利用多种靶核酸的并行检测。在使用荧光团作为标记的情况下，选择用于检测多个靶核酸的荧光团，使得每种荧光团是可区分的，并且在并行检测靶核酸的情况下可以在荧光显微镜中被并行地检测。选择这样的荧光团以使发射光谱分离，使得可以并行检测靶核酸的不同标记。选择用于本发明方法的合适的可区分荧光团的方法是本领域熟知的(参见例如Johnson和Spence,“Molecular Probes Handbook,aGuide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,第11版,LifeTechnologies(2010))。
可利用熟知的方法如显微术、细胞计数法(例如，质量细胞计数法，通过飞行时间的细胞计数法(CyTOF)，流式细胞术)或光谱法来可视化与相应靶核酸相关的发色、荧光或金属可检测信号。通常，如果在同一测定中使用不同的标记，则将发色底物或荧光底物，或发色或荧光标记，或稀土金属同位素用于特定测定，使得可以使用单一类型的仪器来检测同一样品中的核酸靶。
本发明的方法可用于实现所需靶双链核酸的检测。在一个实施方案中，用多个靶探针对检测靶核酸。在这种情况下，靶探针对被设计成结合至靶双链核酸的多于一个区域。应当理解，如果多个靶探针对用于结合至相同的靶双链核酸，则一个靶探针对的靶结合位点不与另一个靶探针对的靶结合位点重叠。
在另一个实施方案中，本发明的方法可应用于靶双链核酸的多路复用检测。在一个实施方案中，本发明的方法应用于检测两种或更多种靶核酸，例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种靶核酸。可检测的靶核酸的数量取决于检测标记。对于荧光标记，通常可检测多达10个核酸靶标。对于使用基于质谱法检测的金属标记的探针，靶核酸的数量最多可达150个。本领域技术人员可容易地选择合适的不同标记以允许检测样品中的多于一种靶双链核酸。
在又另一个实施方案中，本发明的方法可用于同时检测双链核酸和单链核酸，例如检测同一样品中的DNA和RNA。在这种情况下，可设计探针以检测单链核酸如RNA(参见，例如，美国专利号7,709,198、美国公布2008/0038725和2009/0081688，和2017/0101672)和双链核酸，如本文所述，使得可在同一样品中检测双链核酸和单链核酸，如DNA和RNA。
本文所述的本发明总体上涉及检测样品中的双链核酸。应当理解，本发明的方法还可应用于检测样品中的靶核酸和任选的其他分子，特别是在与靶核酸相同的细胞中。例如，除了检测靶核酸外，还可同时检测细胞中表达的蛋白质。细胞中蛋白质的检测是本领域技术人员熟知的，例如，通过使用任何熟知的检测系统(包括本文描述的用于检测靶核酸的那些)检测蛋白质特异性抗体的结合。已经描述了靶核酸和蛋白质的检测(参见例如，Schulz等人,Cell Syst.6(1):25-36(2018))。
应当理解，本发明可以任何期望的顺序进行，只要检测到双链靶核酸。因此，在本发明的方法中，使细胞与用于组装SGC的任何组分接触的步骤可以按任何所需顺序进行，可以按顺序进行，或可以同时进行，或一些步骤可以按顺序进行，而其他步骤可以按所需同时进行，只要检测到靶双链核酸。还应当理解，本文公开的实施方案可以根据需要独立地与本文公开的其他实施方案组合，以利用各种配置、组分大小、测定条件、测定敏感性等。
在一些情况下，可能需要减少测定步骤的数目，例如减少杂交和洗涤步骤的数目。减少测定步骤数目的一种方式是在与细胞接触之前预组装SGC的一些或全部组分。这种预组装可以通过在接触靶核酸之前将SGC的一些或全部组分杂交在一起来进行。
应当理解，本发明可以以提供靶核酸检测的任何形式进行。尽管本文已经使用原位杂交一般性地描述了本发明的实施，但是应当理解，如本领域所熟知的，本发明可用于以其他形式检测靶核酸，特别是用于检测细胞中的靶核酸。可用于检测细胞中的靶核酸的一种方法是流式细胞术，如本领域熟知的(参见例如Shapiro,Practical Flow Cytometry第3版,Wiley-Liss,New York(1995)；Ormerod,Flow Cyt ometry,第2版,Springer(1999))。因此，本发明的方法，样品和试剂盒可用于原位杂交测定形式或其他形式，如流式细胞术。核酸检测方法(包括原位杂交)对流式细胞术的应用先前已有描述(参见例如Ha nley等人,PLoS One,8(2):e57002.doi:10.1371/journal.pone.0057002(2013)；Baxter等人,NatureProtocols 12(10):2029-2049(2017))。
在一些情况下，可能需要减少测定步骤的数目，例如减少杂交和洗涤步骤的数目。减少测定步骤数目的一种方式是在与细胞接触之前预组装SGC的一些或全部组分。这种预组装可以通过在接触靶核酸之前将SGC的一些或全部组分杂交在一起来进行。
本发明还提供了包含一个或多个细胞的样品。细胞可任选地被固定。细胞可任选地被透化。将细胞固定和/或透化特别适用于原位杂交测定。
在一个实施方案中，本发明还提供了一种固定和透化细胞的样品，所述样品包含(A)至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞；(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(C)前置扩增子，所述前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述第一和第二靶探针杂交；(D)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，并且其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及(E)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
在这种样品的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种样品的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种样品的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种固定和透化细胞的样品，所述样品包含(A)至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞；(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(C)前置前置扩增子组，所述前置前置扩增子组包含第一和第二前置前置扩增子，其中所述第一前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点，其中所述第二前置前置扩增子包含用于所述第二靶探针的结合位点，其中所述第一和第二前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点，并且其中所述前置前置扩增子与所述第一和第二靶探针杂交；(D)多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述第一和第二前置前置扩增子杂交；(E)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及(F)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
在这种样品的一个实施方案中，所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点，其中与两个前置前置扩增子的结合之间的解链温度高于仅一个前置前置扩增子的结合之间的解链温度。
在这种样品的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种样品的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种样品的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在这种样品的另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在这种样品的另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种固定和透化细胞的样品，所述样品包含(A)至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞；(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(C)前置前置扩增子，所述前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点，其中所述前置前置扩增子与所述第一和第二靶探针杂交；(D)多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述前置前置扩增子杂交；(E)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，并且其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及(F)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
在这种样品的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种样品的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种样品的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
本发明另外提供了包含一个或多个细胞的载玻片。任选地，将一个或多个细胞固定在载玻片上。任选地，将一个或多个细胞透化。在特定的实施方案中，将载玻片上的细胞固定和/或透化用于原位测定。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种载玻片，所述载玻片包含(A)其上固定有包含至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞的多个固定和透化细胞的载玻片；(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(C)前置扩增子，所述前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述第一和第二靶探针杂交；(D)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，并且其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及(E)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在这种载玻片的另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在这种载玻片的另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种载玻片，所述载玻片包含(A)其上固定有包含至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞的多个固定和透化细胞的载玻片；(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(C)前置前置扩增子组，所述前置前置扩增子组包含第一和第二前置前置扩增子，其中所述第一前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点，其中所述第二前置前置扩增子包含用于所述第二靶探针的结合位点，并且其中所述第一和第二前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点，并且其中所述前置前置扩增子与所述第一和第二靶探针杂交；(D)多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述第一和第二前置前置扩增子杂交；(E)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与所述第一和第二前置扩增子杂交；以及(F)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点，其中与两个前置前置扩增子的结合之间的解链温度高于仅一个前置前置扩增子的结合之间的解链温度。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在这种载玻片的另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在这种载玻片的另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
在一个实施方案中，本发明提供了一种载玻片，所述载玻片包含(A)其上固定有包含至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞的多个固定和透化细胞的载玻片；(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(C)前置前置扩增子，所述前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点，其中所述前置前置扩增子与所述第一和第二靶探针杂交；(D)多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述前置前置扩增子杂交；(E)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，并且其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及(F)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
在这种载玻片的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
本发明还提供了一种包含如本文所述的SGC的组分的试剂盒，其中所述试剂盒不包含靶核酸。如本文所公开的，这样的试剂盒可以包含前置扩增子(PA)、扩增子(AMP)和标记探针(LP)，以及任选的前置前置扩增子(PPA)。任选地，试剂盒可包含针对特定靶双链核酸或多种靶双链核酸的靶探针(TP)。本发明试剂盒的组分可以任选地在容器中，并且可以任选地提供使用试剂盒的说明书。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测靶双链核酸的试剂盒，所述试剂盒包含(A)前置扩增子，所述前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(B)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；以及(C)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点。
在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针。在一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测靶双链核酸的试剂盒，所述试剂盒包含(A)前置前置扩增子组，所述前置前置扩增子组包含第一和第二前置前置扩增子，其中所述第一前置前置扩增子包含用于第一靶探针的结合位点，其中所述第二前置前置扩增子包含用于第二靶探针的结合位点，并且其中所述第一和第二前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点；(B)多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(C)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；以及(D)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点。
在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针。在一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在这种试剂盒的一个实施方案中，所述前置扩增子包含用于所述第一和第二前置前置扩增子的结合位点，其中与两个前置前置扩增子的结合之间的解链温度高于仅一个前置前置扩增子的结合之间的解链温度。
在这种试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
在一个实施方案中，本发明提供了用于检测靶双链核酸的试剂盒，所述试剂盒包含(A)前置前置扩增子，所述前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点；(B)前置扩增子，所述前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(C)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；以及(D)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述靶双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针。在一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
应当理解，在本文提供的本发明的定义内还提供了基本上不影响本发明的各种实施方案的活性的修改。因此，以下实施例旨在说明而非限制本发明。
实施例I
双链核酸的原位检测
此实施例描述了双链核酸的原位检测。
设计一对探针用于检测成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)基因，基本上如图1B所示。使HEK293细胞与有义探针、反义探针或两者接触，并通过原位杂交进行检测。测定方案的概述在图2中作为优化的LS红测定与化学变性示出(图2，右图)。测定基本上根据用于与Leica Biosystems BOND RX系统(Advanced Cell Diagnostics手册322150)一起使用的RNAScopeTM 2.5LS红(Advanced Cell Diagnostics)的制造商的测定条件进行。为了检测双链核酸，变性步骤包括在2xSSC中的70％甲酰胺中在80℃下20分钟(20x SSC-3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)。如图3所示，检测FGFR1基因组DNA需要Z1(有义链结合)和Z2(反义链结合)探针。对有义和反义链结合探针的要求为双链DNA提供了特异性。DNA被检测为细胞核(蓝色)内的红色点状点。
进行了另外示例性基因的原位检测。使HEK293细胞与有义和反义探针接触以检测FGFR1、肿瘤蛋白53(TP53，也称为p53)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A(CDKN2A)的基因组DNA，并基本上如上所述通过原位杂交进行检测。如图4上图所示，FGFR1、TP53和CDKN2A被检测为细胞核(蓝色)内的红色点状点。
还针对原位检测基因的能力对组织样品进行了测试。使结肠癌、正常胰腺和正常乳腺的组织样品与有义和反义探针接触以检测表皮生长因子受体(EGFR)基因，并基本上如上所述通过原位杂交进行检测。将卵巢癌的组织样品与有义和反义探针接触，以检测E3泛素蛋白连接酶Mdm2(MDM2)基因。如图4下图所示，在细胞系和各种组织样品中检测到各种基因。DNA被检测为细胞核(蓝色)内的红色点状点。
这些结果表明用于检测双链核酸的探针对可用于原位检测细胞系和组织样品中的基因。
在整个申请中，提及了各种出版物。这些出版物的公开内容全部特此以引用的方式并入本申请，以便更全面地描述本发明所涉及的技术现状。尽管已参考以上提供的实施例描述本发明，但应理解在不脱离本发明精神的情况下可做出各种修改。
Claims (70)
1.一种检测双链核酸的方法，所述方法包括：
(A)使包含含有一种或多种双链核酸的细胞的样品与靶探针组接触，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；
(B)使所述样品与前置扩增子接触，所述前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；
(C)使所述样品与多个扩增子接触，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；
(D)使所述样品与多个标记探针接触，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点；以及
(E)检测与所述靶双链核酸结合的所述标记探针，从而检测所述靶双链核酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述样品是组织样本或来源于组织样本。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述样品是血液样品或来源于血液样品。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
7.一种固定和透化细胞的样品，所述样品包含：
(A)至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞；
(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；
(C)前置扩增子，所述前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述第一靶探针和所述第二靶探针杂交；
(D)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，并且其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及
(E)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；
其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
8.如权利要求7所述的样品，其中所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
9.如权利要求7或8所述的样品，其中所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
10.如权利要求7-9中任一项所述的样品，其中所述样品是组织样本或来源于组织样本。
11.如权利要求7-9中任一项所述的样品，其中所述样品是血液样品或来源于血液样品。
12.如权利要求7-9中任一项所述的样品，其中所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
13.一种载玻片，所述载玻片包含：
(A)其上固定有包含至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞的多个固定和透化细胞的载玻片；
(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；
(C)前置扩增子，所述前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述第一靶探针和所述第二靶探针杂交；
(D)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，并且其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及
(E)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；
其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
14.如权利要求13所述的载玻片，其中所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
15.如权利要求13或14所述的载玻片，其中所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
16.如权利要求13-15中任一项所述的载玻片，其中所述样品是组织样本或来源于组织样本。
17.如权利要求13-15中任一项所述的载玻片，其中所述样品是血液样品或来源于血液样品。
18.如权利要求13-15中任一项所述的载玻片，其中所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
19.一种用于检测靶双链核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
(A)前置扩增子，所述前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；
(B)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；以及
(C)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述靶双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针。
21.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
22.如权利要求19-21中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
23.一种检测双链核酸的方法，所述方法包括：
(A)使包含含有一种或多种双链核酸的细胞的样品与靶探针组接触，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；
(B)使所述样品与前置前置扩增子组接触，所述前置前置扩增子组包含第一前置前置扩增子和第二前置前置扩增子，其中所述第一前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点，其中所述第二前置前置扩增子包含用于所述第二靶探针的结合位点，并且其中所述第一前置前置扩增子和所述第二前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点；
(C)使所述样品与多个前置扩增子接触，其中所述前置扩增子包含用于所述第一前置前置扩增子和所述第二前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；
(D)使所述样品与多个扩增子接触，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；
(E)使所述样品与多个标记探针接触，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点；以及
(F)检测与所述靶双链核酸结合的所述标记探针，从而检测所述靶双链核酸。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述前置扩增子包含用于所述第一前置前置扩增子和所述第二前置前置扩增子的结合位点，其中与两个前置前置扩增子的结合之间的解链温度高于仅一个前置前置扩增子的结合之间的解链温度。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
27.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述样品是组织样本或来源于组织样本。
28.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述样品是血液样品或来源于血液样品。
29.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
30.一种固定和透化细胞的样品，所述样品包含：
(A)至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞；
(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；
(C)前置前置扩增子组，所述前置前置扩增子组包含第一前置前置扩增子和第二前置前置扩增子，其中所述第一前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点，其中所述第二前置前置扩增子包含用于所述第二靶探针的结合位点，其中所述第一前置前置扩增子和所述第二前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点，并且其中所述前置前置扩增子与所述第一靶探针和所述第二靶探针杂交；
(D)多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含用于所述第一前置前置扩增子和所述第二前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述第一前置前置扩增子和所述第二前置前置扩增子杂交；
(E)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及
(F)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；
其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
31.如权利要求30所述的样品，其中所述前置扩增子包含用于所述第一前置前置扩增子和所述第二前置前置扩增子的结合位点，其中与两个前置前置扩增子的结合之间的解链温度高于仅一个前置前置扩增子的结合之间的解链温度。
32.如权利要求30或31所述的样品，其中所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
33.如权利要求30-32中任一项所述的样品，其中所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
34.如权利要求30-33中任一项所述的样品，其中所述样品是组织样本或来源于组织样本。
35.如权利要求30-33中任一项所述的样品，其中所述样品是血液样品或来源于血液样品。
36.如权利要求30-33中任一项所述的样品，其中所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
37.一种载玻片，所述载玻片包含：
(A)其上固定有包含至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞的多个固定和透化细胞的载玻片；
(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；
(C)前置前置扩增子组，所述前置前置扩增子组包含第一前置前置扩增子和第二前置前置扩增子，其中所述第一前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点，其中所述第二前置前置扩增子包含用于所述第二靶探针的结合位点，并且其中所述第一前置前置扩增子和所述第二前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点，并且其中所述前置前置扩增子与所述第一靶探针和所述第二靶探针杂交；
(D)多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含用于所述第一前置前置扩增子和所述第二前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述第一前置前置扩增子和所述第二前置前置扩增子杂交；
(E)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，其中所述扩增子与所述第一前置扩增子和所述第二前置扩增子杂交；以及
(F)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；
其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
38.如权利要求37所述的载玻片，其中所述前置扩增子包含用于所述第一前置前置扩增子和所述第二前置前置扩增子的结合位点，其中与两个前置前置扩增子的结合之间的解链温度高于仅一个前置前置扩增子的结合之间的解链温度。
39.如权利要求37或38所述的载玻片，其中所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
40.如权利要求37-39中任一项所述的载玻片，其中所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
41.如权利要求37-40中任一项所述的载玻片，其中所述样品是组织样本或来源于组织样本。
42.如权利要求37-40中任一项所述的载玻片，其中所述样品是血液样品或来源于血液样品。
43.如权利要求37-40中任一项所述的载玻片，其中所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
44.一种用于检测靶双链核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
(A)前置前置扩增子组，所述前置前置扩增子组包含第一前置前置扩增子和第二前置前置扩增子，其中所述第一前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点，其中所述第二前置前置扩增子包含用于所述第二靶探针的结合位点，并且其中所述第一前置前置扩增子和所述第二前置前置扩增子包含用于前置扩增子的多个结合位点；
(B)多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含用于所述第一前置前置扩增子和所述第二前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；
(C)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；以及
(D)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点。
45.如权利要求44所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述靶双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针。
46.如权利要求45所述的试剂盒，其中所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
47.如权利要求44-46中任一项所述的试剂盒，其中所述前置扩增子包含用于所述第一前置前置扩增子和所述第二前置前置扩增子的结合位点，其中与两个前置前置扩增子的结合之间的解链温度高于仅一个前置前置扩增子的结合之间的解链温度。
48.如权利要求44-47中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
49.一种检测双链核酸的方法，所述方法包括：
(A)使包含含有一种或多种双链核酸的细胞的样品与靶探针组接触，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；
(B)使所述样品与前置前置扩增子接触，所述前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点；
(C)使所述样品与多个前置扩增子接触，所述前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；
(D)使所述样品与多个扩增子接触，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；
(E)使所述样品与多个标记探针接触，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点；以及
(F)检测与所述靶双链核酸结合的所述标记探针，从而检测所述靶双链核酸。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
51.如权利要求49或50所述的方法，其中所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
52.如权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述样品是组织样本或来源于组织样本。
53.如权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述样品是血液样品或来源于血液样品。
54.如权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
55.一种固定和透化细胞的样品，所述样品包含：
(A)至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞；
(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；
(C)前置前置扩增子，所述前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点，其中所述前置前置扩增子与所述第一靶探针和所述第二靶探针杂交；
(D)多个前置扩增子，所述前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述前置前置扩增子杂交；
(E)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，并且其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及
(F)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；
其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
56.如权利要求55所述的样品，其中所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
57.如权利要求55或56所述的样品，其中所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
58.如权利要求55-57中任一项所述的样品，其中所述样品是组织样本或来源于组织样本。
59.如权利要求55-57中任一项所述的样品，其中所述样品是血液样品或来源于血液样品。
60.如权利要求55-57中任一项所述的样品，其中所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
61.一种载玻片，所述载玻片包含：
(A)其上固定有包含至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞的多个固定和透化细胞的载玻片；
(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；
(C)前置前置扩增子，所述前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点，其中所述前置前置扩增子与所述第一靶探针和所述第二靶探针杂交；
(D)多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述前置前置扩增子杂交；
(E)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，并且其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及
(F)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；
其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。
62.如权利要求61所述的载玻片，其中所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
63.如权利要求61或62所述的载玻片，其中所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。
64.如权利要求61-63中任一项所述的载玻片，其中所述样品是组织样本或来源于组织样本。
65.如权利要求61-63中任一项所述的载玻片，其中所述样品是血液样品或来源于血液样品。
66.如权利要求61-63中任一项所述的载玻片，其中所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。
67.一种用于检测靶双链核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
(A)前置前置扩增子，所述前置前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于前置扩增子的多个结合位点；
(B)前置扩增子，所述前置扩增子包含用于所述前置前置扩增子的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；
(C)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；以及
(D)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点。
68.如权利要求67所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述靶双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针。
69.如权利要求68所述的试剂盒，其中所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。
70.如权利要求67-69中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于透化细胞的至少一种试剂。
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