CN104673905B - 检测单个细胞中的核酸和鉴定异质大细胞群中罕见细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过核酸间接捕获标记来检测单个细胞中多种靶核酸的方法。也提供通过按参比核酸水平标准化来检测靶核酸相对水平的方法。描述了通过检测核酸来检测大的异质细胞群中单个细胞，特别是罕见细胞的方法。还提供相关的组合物、系统和试剂盒。

Description

检测单个细胞中的核酸和鉴定异质大细胞群中罕见细胞的方法

本申请是申请日为2006年06月19日、申请号为200680021808.1、名称为“检测单个细胞中的核酸和鉴定异质大细胞群中罕见细胞的方法”的发明申请的分案。

相关申请的交叉引用

本申请是非临时性应用专利申请，要求Luo和Chen于2005年6月20日提交的先前临时专利申请题为“检测和计数异质大细胞群中罕见细胞的方法(Method of Detecting and Enumerating Rare Cells from Large Heterogeneous CellPopulations)”的编号USSN60/691,834的优先权，出于所有目的将此专利全部内容纳入本文作参考。

发明领域

本发明总体涉及核酸化学和生物化学试验。更具体说，本发明涉及原位检测单个细胞中核酸分析物的方法。本发明还涉及检测和鉴定单个细胞，特别是罕见细胞。

发明背景

大量证据证明癌细胞可脱离原发肿瘤部位经循环进入淋巴结、骨髓、外周血液或其它体液。已证明这种循环性肿瘤细胞(CTC)可反映原发肿瘤的生物学特性，包括肿瘤转移和复发能力。因此检测到CTC极可能表明疾病复发、肿瘤细胞播散和远处转移。所有这些都是鉴定高危癌症病人疾病状态的重要临床信息因素(如Vogel等,2002；Gilbey等,2004；Molnar等,2003；Vlems等,2003；Ma等,2003)。

临床上可用CTC检测结果作为预后指标的验证，但进展不如预计的那样快，主要是由于缺乏合适的检测技术。检测外周血或其它体液中CTC的一个关键性难题是循环中存在的CTC浓度极低，估计其范围是10⁶－10⁷个正常白细胞中只有一个肿瘤细胞。因此，此种应用性检测技术必须具有优越的灵敏度和特异性，假阴性和假阳性率应限制在可接受水平。

现有的一种方法采用免疫磁珠分离技术来检测CTC完整细胞(US6,365,362；US6,645,731)。采用此技术时，将癌症病人的血样与包被了抗上皮细胞表面抗原如EpCAM的抗体磁珠一起培育(Cristofanilli等，2004)，然后用电磁分离器分离磁珠标记的细胞。下游分析时进一步加工免疫磁珠富集的细胞组分来鉴定CTC。采用此技术，在一项前瞻性研究中显示，转移性乳腺癌病人治疗后的CTC数可独立预测疾病无发展的存活率和总体存活率(Cristofanilli等，2004)。虽然据报道此技术灵敏度高，但其应用受限于能否得到针对特定类型CTC的高灵敏度高特异性检测抗体。抗体非特异性结合其它细胞组分可能导致低信噪比而损伤CTC的检测。结合CTC的抗体也能低水平结合其它类型细胞上的抗原，导致高水平的假阳性。

检测CTC的另一种现有方法是检测血液中肿瘤细胞特异性表达的信使RNA。已采用实时逆转录聚合酶链反应(QPCR)将检测到的CTC结果与病人的预后相关联。已用实时RT-PCR检测结肠直肠癌病人外周血中的CEA mRNA(Ito等，2002)。术后血CEAm RNA阳性的病人无疾病存活率显著低于CEAmRNA阴性病例。这些结果提示在结肠直肠癌病人中如果肿瘤细胞进入血流将导致病人不良结局。另一报道显示临床上可利用多种mRNA标记对高危AJCC期IIBC和IIIAB黑素瘤病人的CTC作QPCR分子检测(Mocellin等，2004)。检测肿瘤特异性mRNA表达的优点是，可利用任何肿瘤特异性基因作为诊断/预后标志。然而QPCR方法需要进行分离和逆转录血样品中的mRNA，然后进行PCR反应，步骤费力。用此技术时由于样品污染染色体DNA，或所选标志在正常血细胞中也有低水平表达而常出现假阳性(Fava等，2001)。此外，此技术的检测灵敏度最高上限是每毫升血最多含约一个肿瘤细胞，因此此技术不能提供精确的CTC计数。

非常需要检测和定量血液和其它体液中单个细胞水平的肿瘤细胞特异性mRNA表达。能检测细胞悬液中单个细胞多种特异性mRNA表达的技术，应能灵敏和特异性检测和计数血液和其它体液中的CTC。此外，这种技术应能收集CTC细胞供下游细胞学和分子学分析。但目前已有技术不能满足这些需求。

原位杂交(ISH)技术是一种已建立的定位和形态学检测保存的组织切片或细胞制备物中特异性mRNA序列的方法(Hicks等，2004)。最常用的标本是冰冻切片、石蜡包埋切片或经细胞离心沉淀在载玻片上用甲醇固定的悬浮细胞。进行检测时采用与细胞和组织中特定核酸序列互补而能与其杂交的核酸探针。此技术的灵敏度即检测的域值水平范围是每个细胞10-20个拷贝的mRNA。

然而，ISH技术面临许多技术问题限制了其广泛应用。首先，固定在固体表面的细胞显示杂交动力学性能差。其次，在靶mRNA的探针的选择、标记和检测中，在每个组织切片的固定和渗透以及杂交和洗涤中，一般都需要进行试验优化。此外，需要对探针的特异性、组织mRNA的性能和实验方法的杂交效率进行各种实验加以控制。除技术问题外，就检测灵敏度和重复性而言，目前的ISH技术性能标准较差。假阳性率仍高，除非利用形态学手工再检查相关细胞，但该过程费时费力。目前的ISH技术也不能定量测定细胞的mRNA表达水平，或同时测定多种靶mRNA的表达，而这种测定结果可提供临床上有价值的信息，如提高的检测灵敏度和特异性以及鉴定原发肿瘤的类型、来源和阶段。

常用于进行细胞内原位杂交的探针有四种类型：寡核苷酸探针(通常长20－40个碱基)、单链DNA探针(长200－500个碱基)、双链DNA探针或RNA探针(长200－5000个碱基)。RNA探针是目前原位杂交应用最广泛的探针，因为它们具有以下优点：RNA-RNA杂交体对温度非常稳定并且能抵抗RNA酶的消化。但RNA探针直接标记方法遇到许多困难。首先，必须分别制备检测各感兴趣mRNA的标记探针。其次，技术上难以同时原位检测多种感兴趣mRNA的表达。因此，目前据报道对多种mRNA只能用不同的标记方法依次检测(Schrock等，1996；Kosman等，2004)。另外，用直接标记方法，不能很好地控制与细胞中非特异性序列可能的交叉杂交。分支DNA(bDNA)原位杂交是检测单个细胞中mRNA的间接标记方法(Player等，2001)。此法采用的一系列寡核苷酸探针中的部分(序列)能与感兴趣的特异性mRNA杂交，另一部分能与bDNA杂交而放大信号和检测。bDNA ISH的优点是试验中可利用非标记的寡核苷酸探针来检测各种感兴趣的mRNA并且放大信号和检测的是通用成分。然而理论上，需要对bDNA ISH中所用的基因特异性探针进行筛选，应不能与细胞中其它mRNA序列发生非特异性杂交相互反应。当bDNA ISH中采用多种探针检测低丰度mRNA时，寡核苷酸探针的非特异性杂交可能产生严重问题。类似地，虽然需要采用bDNA ISH来检测或定量多种mRNA，但寡核苷酸探针的这种非特异性杂交也是一个潜在的需要解决的问题。

本发明克服了上述困难，本发明提供了检测和鉴定单个细胞中核酸的方法。通过阅读以下内容将获得对本发明的完全了解。

发明概述

本发明提供检测单个细胞中靶核酸，包括检测单个细胞中多种靶(核酸)的方法。描述了通过检测核酸来检测异质大细胞群中单个细胞，特别是罕见细胞的方法。也描述了相关的组合物、系统和试剂盒。

第一种通用类型的实施方式包括：检测单个细胞中两种或多种靶核酸的方法。此方法中，提供含有细胞的样品。所述细胞含有或被怀疑含有第一靶核酸和第二靶核酸。第一标记探针含有第一标记，第二标记探针含有第二标记，其中提供的第一标记发出的第一信号可与第二标记发出的第二信号相区别。还提供至少第一捕获探针和至少第二捕获探针。

第一捕获探针与细胞中的第一靶核酸杂交(当细胞中存在第一靶核酸时)，第二捕获探针与细胞中的第二靶核酸杂交(当细胞中存在第二靶核酸时)。第一标记探针被第一捕获探针捕获，第二标记探针被第二捕获探针捕获，从而第一标记探针被第一靶核酸捕获，第二标记探针被第二靶核酸捕获。然后检测第一标记发出的第一信号和第二标记发出的第二信号。由于第一和第二标记通过捕获探针与它们各自的靶核酸结合，细胞中存在此种标记可表明细胞中存在相应的靶核酸。此方法任选可定量测定。因此可测定第一信号的强度和第二信号的强度。可将第一信号的强度与细胞中第一靶核酸的含量相关联，同时将第二信号的强度与细胞中第二靶核酸的含量相关联。

一方面，所述标记探针能直接结合所述捕获探针。例如，在一类实施方式中，提供一种第一捕获探针和一种第二捕获探针。第一标记探针可与第一捕获探针杂交，第二标记探针可与第二捕获探针杂交。在一相关类型实施方式中，提供两种或多种第一捕获探针和两种或多种第二捕获探针，以及多个第一标记探针(如二个或多个相同的第一标记探针)和多个第二标记探针(如二个或多个相同的第二标记探针)。使两种或多种第一捕获探针与第一靶核酸杂交，使两种或多种第二捕获探针与第二靶核酸杂交。使一种第一标记探针与各个第一捕获探针杂交，使一种第二标记探针与各个第二捕获探针杂交。

另一方面，标记探针间接通过例如辅放大核酸(preamplifer)和/或放大核酸(amplifier)被捕获探针所捕获。在采用放大核酸的一类实施方式中，提供一种第一捕获探针，一种第二捕获探针，多个第一标记探针和多个第二标记探针。使第一放大核酸与第一捕获探针杂交并与多种第一标记探针杂交，使第二放大核酸与第二捕获探针杂交并与多种第二标记探针杂交。在另一类型实施方式中，提供两种或多种第一捕获探针，两种或多种第二捕获探针，多个第一标记探针和多个第二标记探针。使两种或多种第一捕获探针与第一靶核酸杂交，使两种或多种第二捕获探针与第二靶核酸杂交。使第一放大核酸与各个第一捕获探针杂交，多个第一标记探针与第一放大核酸杂交。使第二放大核酸与各个第二捕获探针杂交，和多个第二标记探针与第二放大核酸杂交。

在采用辅放大核酸的一类实施方式中，提供一种第一捕获探针，一种第二捕获探针，多个第一标记探针和多个第二标记探针。使第一辅放大核酸与第一捕获探针杂交，使多个第一放大核酸与第一辅放大核酸杂交，和使多个第一标记探针与第一放大核酸杂交。使第二辅放大核酸与第二捕获探针杂交，使多个第二标记探针与第二放大核酸杂交。在另一类型实施方式中，提供两种或多种第一捕获探针，两种或多种第二捕获探针，多个第一标记探针和多个第二标记探针。使两种或多种第一捕获探针与第一靶核酸杂交，使两种或多种第二捕获探针与第二靶核酸杂交。使第一辅放大核酸与各个第一捕获探针杂交，多个第一标记探针与第一放大核酸杂交。使第二辅放大核酸与各个第二捕获探针杂交，多个第二放大核酸与各个第二辅放大核酸杂交，多个第二标记探针与第二放大核酸杂交。

在采用两种或多种第一捕获探针和/或两种或多种第二捕获探针的实施方式中，捕获探针优先与它们各自靶核酸中非重叠性多核苷酸序列杂交。

在一类实施方式中，提供多个第一标记探针和多个第二标记探针。通过滚动循环扩增与第一捕获探针杂交的第一环形多核苷酸产生扩增的第一多核苷酸。该第一环形多核苷酸至少包含一个拷贝的与第一标记探针中某多核苷酸序列相同的多核苷酸序列，因此扩增的第一多核苷酸含有多个拷贝的与第一标记探针中该多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。然后使多个第一标记探针与该扩增的第一多核苷酸杂交。类似地，通过滚动循环扩增与第二捕获探针杂交的第二环形多核苷酸产生扩增的第二多核苷酸。该第二环形多核苷酸至少包含一个拷贝的与第二标记探针中某多核苷酸序列相同的多核苷酸序列，因此扩增的第二多核苷酸含有多个拷贝的与第二标记探针中该多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。然后使该多种第二标记探针与扩增的第二多核苷酸杂交。所述扩增的多核苷酸保持与捕获探针的结合，从而使标记探针被捕获到靶核酸。

该方法适用于多重核酸检测，包括同时检测多于两种的靶核酸。因此，所述细胞任选含有或被怀疑含有第三靶核酸，所述方法任选包括：提供含有第三标记的第三标记探针，其中，所述第三标记产生的第三信号可与第一和第二信号相区别；提供至少第三捕获探针；在细胞中第三捕获探针与第三靶核酸(细胞中存在的话)杂交；第三标记探针被第三捕获探针捕获；以及检测第三标记产生的第三信号。类似地，如需要可同时检测第四、第五、第六等靶核酸。宜同时进行所有靶核酸的各个杂交或捕获步骤。

靶核酸基本上指细胞中要检测的任何核酸。例如，靶核酸可以是DNA、染色体DNA、RNA、mRNA、microRNA、核糖体RNA等。靶核酸可以是细胞的内源性核酸。另一例子，靶核酸可以是病原体感染细胞而导入细胞或在细胞中表达的核酸，如病毒或细菌的基因组RNA或DNA、质粒、病毒或细菌的mRNA等。

所述第一和第二(和/或任选第三、第四等)靶核酸(序列)可以是一个核酸分子的一部分，或它们可以是分离的分子。在一类实施方式中，第一靶核酸是第一种mRNA，第二靶核酸是第二种mRNA。在另一类实施方式中，第一靶核酸包含某mRNA的第一区域，第二靶核酸包含该同一mRNA的第二区域。在另一类实施方式中，第一靶核酸包含第一染色体DNA的多核苷酸序列，第二靶核酸包含第二染色体DNA的多核苷酸序列。所述第一和第二染色体DNA的多核苷酸序列任选位于同一染色体中，如同一基因中，或不同染色体中。

一方面，标准化靶核酸产生的信号。在一类实施方式中，第二靶核酸包括参比核酸，此方法包括：按第二信号标准化第一信号。所述标记(第一、第二、第三等)基本上可以是任何方便的能提供可检测信号的直接或间接标记。一方面，第一标记是第一荧光标记，第二标记是第二荧光标记。

基本上可用上述方法检测任何类型样品细胞中存在的靶核酸。例如，样品可来源于体液如血液。可利用检测细胞中靶核酸的方法来鉴定细胞。例如，可根据何种核酸及其所含水平来鉴定某细胞是否为所需类型。因此，在一类实施方式中，所述方法包括根据某细胞中检测到的第一和第二信号(任选第三、第四信号等)来鉴定该细胞是否为所需靶细胞。作为几个例子，细胞可以是循环性肿瘤细胞、病毒感染的细胞、母血中的胚胎细胞、生物样品中的细菌细胞或其它微生物细胞、前体内皮细胞、或血中心肌细胞。

与捕获探针杂交前通常要固定和渗透处理所述细胞，以保留细胞中的靶核酸和使捕获探针、标记探针等能进入细胞。任选洗涤细胞以除去没有被靶核酸之一捕获的物质。各种步骤后进行细胞洗涤，例如捕获探针与靶核酸杂交后洗涤以去除未结合的捕获探针，辅放大核酸、放大核酸和/或标记探针与捕获探针杂交后，等等。对于双链靶核酸宜加热变性后才能使相应的捕获探针与靶核酸杂交。

此法的所有或大多数步骤中优选采用细胞悬浮液。因此在一类实施方式中，杂交、捕获和/或检测步骤的样品采用含有细胞的悬浮液。在其它实施方式中，杂交、捕获和/或检测步骤的样品可采用细胞悬浮液和被固定在基材上的细胞。例如，杂交、捕获和任选的洗涤步骤采用细胞悬浮液，而检测步骤细胞固定在基材上。在细胞为悬浮液的方式中，可用流式细胞术方便地检测第一和第二信号(任选包括第三信号等)。通常可在一次操作中检测各标记发出的信号。

一种通用类型实施方式提供检测单个细胞中一种或多种靶核酸相对水平的方法。此方法中提供含细胞的样品。所述细胞含有或被怀疑含有第一靶核酸和第二参比核酸。还提供了含第一标记的第一标记探针，含第二标记的第二标记探针，其中提供的第一标记发出的信号可与第二标记发出的第二信号相区别。在细胞中，第一标记探针被第一靶核酸(当细胞中存在的话)捕获，第二标记探针被第二参比核酸捕获。检测单个细胞中第一标记发出的第一信号，第二标记发出的第二信号，并测定各信号的强度。将第一信号的强度按第二(参比)信号的强度标准化。从而可检测出细胞中第一靶核酸与第二参比核酸的相对水平，因为第一和第二标记与它们各自的核酸相关联。这些方法任选可定量测定，而得以衡量细胞中第一靶核酸含量相对于第二参比核酸的水平。可将细胞中按第二信号标准化的第一信号强度与第一靶核酸的含量相关联。

标记探针可直接结合核酸。例如，第一标记探针可与第一靶核酸杂交，和/或第二标记探针可与第二参比核酸杂交。或者，标记探针可间接，例如通过捕获探针与核酸结合。在一类实施方式中，提供至少一种第一捕获探针和至少一种第二捕获探针。在细胞中，第一捕获探针与第一靶核酸杂交，第二捕获探针与第二参比核酸杂交。第一标记探针被第一捕获探针捕获，第二标记探针被第二捕获探针捕获，从而使第一标记探针被第一靶核酸捕获，第二标记探针被第二参比核酸捕获。关于标记和捕获探针的结构和用数，任选采用辅放大核酸和/或放大核酸、环形多核苷酸的滚动循环扩增等，以上方法所述的特征也可应用于这些实施方式。

上述方法也可用于核酸多重检测，包括同时检测两种或多种靶核酸。因此，所述细胞任选含有或被怀疑含有第三靶核酸，所述方法任选包括：提供含有第三标记的第三标记探针，其中第三标记发出的第三信号可与第一和第二信号相区别；在细胞中使第三标记探针被第三靶核酸(当细胞中存在时)捕获；检测第三标记发出的第三信号，该检测包括测定第三信号的强度；按第二信号强度标准化第三信号强度。如需要，类似地同时检测细胞中的第四、第五、第六信号等。

可采用检测细胞靶核酸相对水平的方法来鉴定细胞。例如，可根据细胞所含核酸和其水平鉴定细胞是否为所需类型。因此，在一类实施方式中，所述方法包括根据标准化的第一信号(和任选的标准化第三、第四等信号)鉴定细胞是否为所需靶细胞。

上述方法提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项；例如，靶核酸与参比核酸的类型、细胞类型、样品来源、细胞的固定和渗透处理、细胞洗涤、双链靶核酸与参比核酸的变性、标记的类型、采用任选的封闭探针、信号的检测、流式细胞术或显微镜检测(及强度测定)、细胞以悬浮液存在或固定在基材上等等。

另一类通用实施方式提供对单个细胞基因表达进行比较分析的方法。该方法中，先提供含有一种或多种特定类型细胞的第一混合细胞群。检测第一群特定类型细胞中的一种或多种靶核酸相对于参比核酸表达的表达水平，以提供第一表达模式。提供含有一种或多种特定类型细胞的第二混合细胞群，检测第二群特定类型细胞中的一种或多种靶核酸相对于参比核酸表达的表达水平，提供第二表达模式。然后比较该第一与第二表达模式。

上述方法提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项；例如，靶核酸与参比核酸的类型、细胞类型、样品来源、细胞的固定和渗透处理、细胞洗涤、双链靶核酸与参比核酸的变性、标记的类型、采用任选的封闭探针、信号的检测、流式细胞术或显微镜检测(及强度测定)、细胞以悬浮液存在或固定在基材上等等。

一方面，本发明提供有利于高密度标记物与细胞中靶核酸结合的方法。一类通用的实施方式提供检测单个细胞中两种或多种靶核酸的方法。此方法中提供含细胞的样品。所述细胞含有或被怀疑含有第一靶核酸和第二靶核酸。在细胞中，第一标记被第一靶核酸捕获(当细胞中存在时)，第二标记被第二靶核酸捕获(当细胞中存在时)。第一标记发出的第一信号可与第二标记发出的第二信号相区别。因此，第一靶核酸中跨越第一靶核酸至少20个毗连核苷酸区域的每个核苷酸平均至少捕获一个拷贝的第一标记，第二靶核酸中跨越第二靶核酸至少20个毗连核苷酸区域的每个核苷酸平均至少捕获一个拷贝的第二标记。检测第一标记发出的第一信号和第二标记发出的第二信号。

在一类实施方式中，第一靶核酸中跨越第一靶核酸至少20个毗连核苷酸区域的每个核苷酸平均至少捕获4、8或12个拷贝的第一标记，第二靶核酸中跨越第二靶核酸至少20个毗连核苷酸区域的每个核苷酸平均至少捕获4、8或12个拷贝的第二标记。在一实施方式中，第一靶核酸中跨越第一靶核酸至少20个毗连核苷酸区域的每个核苷酸平均至少16个拷贝的第一标记，第二靶核酸中跨越第二靶核酸至少20个毗连核苷酸区域的每个核苷酸平均至少捕获16个拷贝的第二标记。

上述方法提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项；例如，标记的类型，信号的检测，细胞的类型、处理和悬浮等。任选第三、第四、第五、第六等靶核酸捕获的第三、第四、第五、第六等标记的密度相似。

另一类通用实施方式提供检测某特定类型单个细胞的方法。此方法中，提供的包含混合类型细胞的样品含有至少一个特定类型的细胞。第一标记探针含有第一标记，第二标记探针含有第二标记，其中提供的第一标记发出的第一信号可与第二标记发出的第二信号相区别。在细胞中，第一标记被第一靶核酸捕获(当细胞中存在第一靶核酸时)，第二标记被第二靶核酸捕获(当细胞中存在第二靶核酸时)。检测第一标记发出的第一信号和第二标记发出的第二信号，并与细胞中存在、缺失第一和第二靶核酸，或它们的含量相关联。根据对细胞中存在、缺失第一和第二靶核酸，或它们的含量测定，鉴定细胞是否为特定类型，根据细胞中存在、缺失第一靶核酸或其含量，或根据细胞中存在、缺失第二靶核酸或其含量(即此特定类型细胞中该靶核酸是冗余标志)可将特定类型细胞与混合物中其它类型的细胞相区别。任选测定细胞中第一信号的强度和第二信号的强度并与存在的相应核酸含量相关联。在一类实施方式中，所述细胞含有第一靶核酸和第二靶核酸，根据对细胞中第一和第二靶核酸二者的存在或含量检测来鉴定是否为特定类型，根据细胞中第一靶核酸的存在或含量，或第二靶核酸的存在或含量，将特定类型细胞与混合物中其它类型的细胞相区别。

标记探针能直接结合靶核酸。例如，第一标记探针能与第一靶核酸杂交，和/或第二标记探针能与第二靶核酸杂交。可任选通过捕获探针使靶核酸捕获标记探针。在一类实施方式中，提供至少一种第一捕获探针和至少一种第二捕获探针。在细胞中，第一捕获探针与第一靶核酸杂交，第二捕获探针与第二靶核酸杂交。第一捕获探针捕获第一标记探针，第二捕获探针捕获第二标记探针，从而使第一靶核酸捕获第一标记探针，第二靶核酸捕获第二标记探针。上述方法提及的特征也可应用于这些实施方式，关于标记和捕获探针的结构和数目，任选采用辅放大核酸和/或放大核酸、环形多核苷酸的滚动循环扩增等等。

任选检测细胞中的第三、第四、第五靶核酸等。例如，此方法任选包括：提供含第三标记的第三标记探针，其中第三标记发出的第三信号可与第一和第二信号相区别，细胞中第三靶核酸捕获此第三标记探针(当细胞中存在此第三靶核酸时)，和检测第三标记发出的第三信号。任选使第三、第四、第五等标记探针与它们相应的核酸直接杂交，或通过第一和第二标记探针中所述的捕获探针间接捕获它们。

可按第三信号标准化第一和/或第二信号。因此，在某些实施方式中，所述细胞含有第三靶核酸，该方法包括根据标准化的第一和/或第二信号来鉴定细胞的特定类型，例如在一些实施方式中，根据第一和/或第二靶核酸的拷贝数而不是它们单单存在于靶细胞类型而不存在于其它类型细胞中，来区分特定靶细胞类型与混合物中其它类型的细胞。

作为另一个例子，第三靶核酸可作为靶细胞类型的第三种冗余标志，例如来提高检测所需细胞类型试验的特异性。因此在一类实施方式中，所述方法包括将检测到的细胞第三信号与细胞中存在、缺失第三靶核酸或其含量相关联，根据该细胞中第一靶核酸的存在、缺失或其含量，或第二靶核酸的存在、缺失或其含量，或第三靶核酸的存在、缺失或其含量，来区分特定靶细胞类型与混合物中其它类型的细胞。

可应用上述方法检测和鉴定罕见细胞类型。例如，混合细胞群中特定类型细胞与其它类型细胞的比率任选低于1:1x10⁴、低于1:1x10⁵、低于1:1x10⁶、低于1:1x10⁷、低于1:1x10⁸、或甚至低于1:1x10⁹。

上述方法提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项；例如，靶核酸的类型、细胞类型、样品来源、细胞的固定和渗透处理、细胞洗涤、双链核酸的变性、标记的类型、采用任选的封闭探针、信号的检测、流式细胞术或显微镜检测单个细胞发出的信号(和检测其强度)、细胞以悬浮液存在或固定在基材上等等。

本发明还提供用于实施所述方法或所述方法产生的组合物。一类示范性实施方式提供的组合物包含：含有和被怀疑含有第一靶核酸和第二靶核酸的经固定和渗透处理的细胞，至少一种能与第一靶核酸杂交的第一捕获探针，至少一种能与第二靶核酸杂交的第二捕获探针，含有第一标记的第一标记探针，和含有第二标记的第二标记探针。第一标记发出的第一信号可与第二标记发出的第二信号相区别。所述细胞任选含有第一和第二捕获探针及标记探针。第一和第二捕获探针任选能与细胞中它们各自的靶核酸杂交。

上述方法中标记探针间接捕获靶核酸的特征可应用于这些实施方式，在标记和捕获探针的结构和数量，任选采用辅放大核酸和/或放大核酸等方面。

在一类实施方式中，所述组合物包含：多个第一标记探针，多个第二标记探针，与第一捕获探针杂交的第一环形多核苷酸经滚动循环扩增产生的扩增的第一多核苷酸，与第二捕获探针杂交的第二环形多核苷酸经滚动循环扩增产生的扩增的第二多核苷酸。所述第一环形多核苷酸包含至少一个拷贝的与第一标记探针中某多核苷酸序列相同的多核苷酸序列，而扩增的第一多核苷酸包含多个拷贝的与第一标记探针中该多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。所述第二环形多核苷酸包含至少一个拷贝的与第二标记探针中某多核苷酸序列相同的多核苷酸序列，而扩增的第二多核苷酸包含多个拷贝的与第二标记探针中该多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。所述组合物也可包含产生该扩增的多核苷酸所必须的试剂，例如外源提供的核酸聚合酶、外源提供的核酸连接酶、和/或外源提供的三磷酸核苷(如dTNP)。

所述细胞任选包含其它靶核酸，所述组合物(和细胞)可包含检测这些靶分子的试剂。例如所述细胞可含有和被怀疑含有第三靶核酸，所述组合物可包含至少能与第三靶核酸杂交的第三捕获探针，和含第三标记的第三标记探针。第三标记发出的第三信号可与第一和第二信号相区别。所述细胞任选包含第四、第五、第六靶核酸等，所述组合物任选包含第四、第五、第六等标记探针和捕获探针。

所述细胞可以是细胞混合物，如复杂的异质混合细胞。在一类实施方式中，所述细胞是某特定类型，所述组合物包含一种或多种其它类型细胞。这些其它细胞可以是过量，甚至大大过量存在的细胞。例如，该组合物中特定类型的细胞与所有其它类型细胞的比率任选低于1:1x10⁴、低于1:1x10⁵、低于1:1x10⁶、低于1:1x10⁷、低于1:1x10⁸、或甚至低于1:1x10⁹。

上述方法提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项；例如，关于靶核酸的类型和细胞来源、各种靶序列在同一分子或不同分子上的位置、标记的类型、包括任选的封闭探针等等。所述细胞任选用此组合物的悬浮液。

在一类通用实施方式中提供含有细胞的组合物，所述细胞包含：第一靶核酸；第二靶核酸；第一标记，细胞中第一标记的存在指示该细胞中存在第一靶核酸；第二标记，细胞中第二标记的存在指示该细胞中存在第二靶核酸，其中第一标记发出的第一信号可与第二标记发出的第二信号相区别。该细胞中第一靶核酸中跨越第一靶核酸至少20个毗连核苷酸区域的每个核苷酸平均至少存在一个拷贝的第一标记，该细胞中第二靶核酸中跨越第二靶核酸至少20个毗连核苷酸区域的每个核苷酸平均至少存在一个拷贝的第二标记。

在一类实施方式中，第一标记的拷贝与第一靶核酸实质上相关联，第二标记的拷贝与第二靶核酸实质上相关联。例如，第一标记是第一标记探针中的一部分，第二标记是第二探针中的一部分，而这些标记探针被靶核酸所捕获。

上述实施方式提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项；例如，标记的类型和数目、细胞悬浮液等等。任选第三、第四、第五、第六等靶核酸存在类似密度的标记。

本发明另一方面提供用于实施所述方法的试剂盒。一类通用实施方式提供检测单个细胞中第一靶核酸和第二靶核酸的试剂盒。在该试剂盒的一个或多个容器中装有：至少一种用于固定和/或渗透处理细胞的试剂，至少一种能与第一靶核酸杂交的第一捕获探针，至少一种能与第二靶核酸杂交的第二捕获探针，含有第一标记的第一标记探针和含有第二标记的第二标记探针，其中第一标记发出的第一信号可与第二标记发出的第二信号相区别。

上述实施方式提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项；例如，靶核酸的数目、标记和捕获探针的构型和数目、包括辅放大核酸和/或放大核酸、包括封闭探针、包括扩增试剂、靶核酸的类型、各种靶序列在单一分子或不同分子上的位置、标记的类型、包括任选的封闭探针等等。

另一类通用实施方式提供的试剂盒，通过检测第一靶核酸和第二靶核酸来检测混合类型细胞中某特定类型的单个细胞。该试剂盒的一个或多个容器中装有：至少一种用于固定和/或渗透处理细胞的试剂，含有第一标记的第一标记探针和含有第二标记的第二标记探针，其中第一标记发出的第一信号可与第二标记发出的第二信号相区别。可通过细胞中第一靶核酸的存在、缺失或含量，或第二靶核酸的存在、缺失或含量来区分此特定类型细胞与混合物中其它类型的细胞。

上述实施方式提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项；例如，靶核酸的数目、包括捕获探针、标记和/或捕获探针的构型和数目、包括辅放大核酸和/或放大核酸、包括封闭探针、包括扩增试剂、靶核酸的类型、各种靶序列在单一分子或不同分子上的位置、标记的类型、包括任选的封闭探针等等。

附图简要说明

图1说明一示范性实施方式的QMAGEX技术流程图。

图2说明标记探针与靶核酸杂交的直接标记方法。

图3说明标记探针通过与靶核酸杂交的捕获探针杂交而间接标记的方法。

图4说明利用一对独立的捕获探针来提高靶核酸捕获标记探针特异性的间接标记的捕获探针设计方法。

图5说明利用三对或多对独立的捕获探针来提高靶核酸捕获标记探针特异性的间接标记的捕获探针设计方法。

图6说明利用二对独立捕获探针直接标记(分图A)或间接标记(分图B)平行检测多种靶分子的探针设计方法。

图7说明通过将多种类型信号产生粒子(标记)连接于同一靶分子来减少罕见细胞鉴定中假阳性率的探针设计方法。分图A显示一种靶分子上多种类型的信号产生粒子(标记)。分图B显示大于一种靶分子上多种类型的信号产生粒子(标记)，各靶分子间维持相对的粒子组信号强度。分图C显示一种靶分子上一组信号产生粒子(标记)，不同靶分子有不同组的独特信号产生粒子。

图8分图A-D说明示范性放大核酸的不同结构。

图9说明采用滚动循环扩增来扩增信号。分图A显示环形核苷酸分子结合捕获探针。分图B显示滚动循环扩增产生的含许多重复序列的长链分子。分图C显示许多信号探针可与此重复序列杂交而实现信号放大。

图10说明试验装置结构的一种实施方式。

以上示意图并不按照比例。

定义

除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员共同理解的含义相同。以下定义补充了本领域的定义是针对本申请书的，不归因于任何相关或无关文件，如任何共同拥有的专利或申请。虽然可采用与本文所述类似或相等的方法和材料来实施本发明的检测，但本文所述的是优选的材料和方法。因此本文所用的术语目的只是描述具体的实施方式，而非限制本发明的范围。

如本说明书和附件权利要求书中所述，单数形式的“一个”、“一种”和“这种”包括复数，除非文中另有明确阐述。因此，例如称“一种分子”包括多个此种分子等等。

术语“约”本文用于指给定数值的变化范围为其值的±10％、或任选其值的±5％、或在某些实施方式中所述值的±1％。

术语“多核苷酸”(和等价术语“核酸”)包括单体核苷酸的任何物理串，可对应于一串核苷酸，包括核苷酸的聚合体(如典型的DNA或RNA聚合体)、肽核酸(PNA)、修饰的寡核苷酸(如含有生物RNA或DNA通常没有的核苷酸的寡核苷酸，如2’-O-甲基寡核苷酸)等的聚合体。此种多核苷酸中的核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸类似物，可以是天然或非天然产生的，可以是无取代、无修饰的、或是取代的或修饰的。诸核苷酸可通过磷酸二酯键、或硫代磷酸键、甲基磷酸键、硼代磷酸键等连接。多核苷酸还可含非核苷酸成分，如标记、淬灭、封闭基团等。多核苷酸可以是单链或双链。

“核酸靶”或“靶核酸”是指待检测的核酸，或任选核酸的一部分。

“多核苷酸序列”或“核苷酸序列”是核苷酸组成的聚合体(寡核苷酸、DNA、核酸等)，或代表核苷酸聚合体的特征串，视上下文而定。可测定给定核酸或互补多核苷酸序列(如互补核酸)中的任何特定多核苷酸序列。

术语“基因”广泛用于指与生物学功能相关的任何核酸。基因通常包含编码序列和/或表达编码序列所需的调控序列。术语基因可应用于特定基因组序列，及该基因组序列编码的cDNA或mRNA。基因还包含不表达的核酸区段，例如形成其它蛋白的识别序列。不表达的调控序列包括启动子和增强子，调控蛋白如转录因子与它们结合后可导致毗连的或附近的序列转录。

二种多核苷酸例如在相应试验条件下结合形成稳定的双链体时称为“杂交”。核酸杂交是由于各种熟知的特征性理化作用力所致，如氢键、溶剂排斥、碱基堆积力等。核酸杂交的全面指南可参见Tijssen(1993)Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with nucleic Acid probes第2章第1部分，“杂交原理和核酸探针试验策略的综述”(Elsevier,new York)以及Ausubel，同上。

能与第二多核苷酸“杂交”的第一多核苷酸含有与第二多核苷酸中的第二多核苷酸序列互补的第一多核苷酸序列。该第一和第二多核苷酸(例如)能在相关试验条件下形成稳定的双链体。

在特定条件下(如相关试验条件下)核酸双链体的“T_m”(解链温度)是此双链体群中一半碱基对解离而另一半结合时的温度。例如可获得某特定双链体的温度变化曲线来计算和/或测定该双链体的T_m(此时T_m是所观察到的从双链形式转变为单链形式相应的中点温度)。

术语“互补”指在相关试验条件下，多核苷酸与其“互补”序列形成稳定的双链体。通常彼此互补的二个多核苷酸序列错配的碱基应不到约20％，不到约10％，优选不到约5％，更优选无错配。

“标记”是有利于分子检测的部分。本文中常用的标记包括：荧光、冷光、光散射和/或颜色标记。合适的标记包括酶和荧光分子，以及放射性核素、底物、辅因子、抑制剂、化学发光分子、磁性颗粒等等。说明这些标记用途的专利包括：美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。许多标记可从市场上购买到用于本发明。

术语“标记探针”指能直接或间接结合靶分子而使该靶分子能通过读数仪检测的任何物质。标记探针(或“LP”)通常是含有至少一种能直接或间接提供可检测信号的标记物的单链多核苷酸。标记可共价连接于该多核苷酸，或可构建能结合标记物的多核苷酸(如生物素化多核苷酸可结合链霉亲和素相连的标记)。例如，可使标记探针与靶核酸直接杂交，或可与靶核酸杂交的核酸再杂交，或与靶核酸杂交的一种或多种其它核酸杂交。因此，标记探针可含有与靶核酸中某多核苷酸序列互补的多核苷酸序列，或可含有至少一种与捕获探针、放大核酸等中某多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

“捕获探针”是能与靶核酸杂交和使靶核酸捕获标记探针的多核苷酸。捕获探针可与标记探针直接杂交，或可与标记探针杂交的一种或多种核酸杂交；例如，捕获探针可与放大核酸或辅放大核酸杂交。捕获探针可包含：与靶核酸中某多核苷酸序列互补的第一多核苷酸序列，和与标记探针、放大核酸、辅放大核酸等中某多核苷酸序列互补的第二多核苷酸序列。优选捕获探针为单链。

“放大核酸(amplifier)”通常是能与多种标记探针杂交的多核苷酸。一般放大核酸能与多个相同的标记探针杂交。放大核酸也能与至少一个捕获探针或与已与捕获探针结合的核酸杂交。例如，放大核酸能与至少一个捕获探针和多个标记探针杂交，或与一个辅放大核酸和多个标记探针杂交。放大核酸可以是线状、叉状、梳状或分枝状核酸。如所有的多核苷酸所述的那样，放大核酸可包含修饰的核苷酸和/或非标准核苷酸之间的连接键以及标准的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、和/或磷酸二酯键。合适的放大核酸描述可参见例如美国专利USPN5,635,352；USPN5,124,246；USPN5,710,264T和USPN5,849,481。

“辅放大核酸(preamplifier)”通常是一种起着一个或多个捕获探针与放大核酸之间(结合)中介作用的多核苷酸分子。通常辅放大核酸能同时与一个或多个捕获探针和多个放大核酸杂交。示范性的辅放大核酸可参见例如UAPN5,635,352和USPN5,681,697。

“病原体”是一种能引起其宿主患病的生物试剂，通常是微生物。

“微生物”是显微或亚显微大小的生物，例子包括但不限于：细菌、真菌、酵母菌、原虫、微型海藻(如单子叶海藻)、病毒(通常包括在此类中，虽然它们不能在宿主细胞外生长和复制)、亚病毒生物、类病毒体和支原体。

本文包括各种其它术语或另作特征说明的定义。

发明详述

在其它方面内容中，本发明提供可用于同时检测和任选定量检测单个细胞中两种或多种靶核酸的多重试验方法。本发明的一相关方面提供检测单个细胞中一种或多种靶核酸与参比核酸相对水平的方法。

总体上讲，在本发明的试验中，标记探针被各靶核酸捕获。标记探针可通过与靶核酸直接结合而被靶核酸捕获。然而优选标记探针间接通过与能够结合靶核酸的捕获探针、放大核酸和/或辅放大核酸结合而被捕获。采用任选的放大核酸和辅放大核酸可促进多个拷贝的标记探针被靶核酸捕获，从而放大靶核酸的信号而不需要酶促反应扩增靶核酸本身。捕获探针的结合任选为协同性，可减少捕获探针与非靶核酸不希望的交叉杂交所产生的背景噪声(与单一试验相比，这在多重试验中更加严重问题，因为多重试验必须采用更多探针，因而交叉杂交的几率增加)。

本发明的一个方面内容涉及检测单个细胞，包括检测异质混合细胞中的罕见细胞。通过检测单个细胞中特征性核酸的存在、缺失、拷贝数等来检测单个细胞。

也提供与该方法相关的组合物、试剂盒和系统。

检测核酸和细胞的方法

核酸的多重检测

如上所述，本发明一方面提供单个细胞的多重核酸检测试验。因此，一种通用类型的实施方式包括检测单个细胞中两种或多种靶核酸的方法。所述方法提供含有细胞的样品。所述细胞含有和被怀疑含有第一靶核酸和第二靶核酸。还提供含第一标记的第一标记探针，含第二标记的第二标记探针，其中提供的第一标记发出的第一信号可与第二标记发出的第二信号相区别。还提供至少第一捕获探针和至少第二捕获探针。

细胞中第一捕获探针与第一靶核酸杂交(当细胞中存在此第一靶核酸时)，第二捕获探针与第二靶核酸杂交(当细胞中存在此第二靶核酸时)。第一标记探针被第一捕获探针捕获，第二标记探针被第二捕获探针捕获，从而使第一标记探针被第一靶核酸捕获，第二标记探针被第二靶核酸捕获。然后检测第一标记发出的第一信号和第二标记发出的第二信号。因为第一和第二标记探针通过捕获探针与它们各自的靶核酸结合，细胞中存在此类标记就表明该细胞中存在相对应的靶核酸。所述方法任选为定量测定法。因此可测定第一信号的强度和第二信号的强度，将第一信号的强度与该细胞中第一靶核酸的含量相关联，同时将第二信号的强度与该细胞中第二靶核酸的含量相关联。

一方面，标记探针可直接结合捕获探针。例如，在一类实施方式中，提供一种第一捕获探针和一种第二捕获探针，使第一标记探针与第一捕获探针杂交而第二标记探针与第二捕获探针杂交。在相关的一类实施方式中，提供两种或多种第一捕获探针和两种或多种第二捕获探针，以及多个第一标记探针(如二个或多个相同的第一标记探针)，多个第二标记探针(如二个或多个相同的第二标记探针)。使两种或多种第一捕获探针与第一靶核酸杂交，和使两种或多种第二捕获探针与第二靶核酸杂交。单个第一标记探针各自与第一捕获探针杂交，单个第二标记探针各自与第二捕获探针杂交。

另一方面，标记探针例如通过辅放大核酸和/放大核酸被捕获探针捕获。采用放大核酸和辅放大核酸的好处是能提高信号强度，因为它们可促进大量标记探针与各靶核酸结合。

在采用放大核酸的一类实施方式中，提供一种第一捕获探针，一种第二捕获探针，多个第一标记探针，和多个第二标记探针。使第一放大核酸与第一捕获探针和多个第一标记探针杂交，第二放大核酸与第二捕获探针和多个第二标记探针杂交。在另一类实施方式中，提供二个或多个第一捕获探针，二个或多个第二捕获探针，多个第一标记探针，和多个第二标记探针。使二个或多个第一捕获探针与第一靶核酸杂交，二个或多个第二捕获探针与第二靶核酸杂交。使第一放大核酸与各个第一捕获探针杂交，和使多个第一标记探针与第一放大核酸杂交。使第二放大核酸与各个第二捕获探针杂交，和使多个第二标记探针与第二放大核酸杂交。

在采用辅放大核酸的一类实施方式中，提供一种第一捕获探针，一种第二捕获探针，多个第一标记探针，和多个第二标记探针。使第一辅放大核酸与第一捕获探针杂交，使多个第一放大核酸与第一辅放大核酸杂交，多个第一标记探针与第一放大核酸杂交。使第二辅放大核酸与第二捕获探针杂交，使多个第二放大核酸与第二辅放大核酸杂交，多个第二标记探针与第二放大核酸杂交。在另一类实施方式中，提供二个或多个第一捕获探针，二个或多个第二捕获探针，多个第一标记探针和多个第二标记探针。使二个或多个第一捕获探针与第一靶核酸杂交，二个或多个第二捕获探针与第二靶核酸杂交。使第一辅放大核酸与各个第一捕获探针杂交，使多个第一放大核酸与各个第一辅放大核酸杂交，多个第一标记探针与第一放大核酸杂交。使第二辅放大核酸与各个第二捕获探针杂交，使多个第二放大核酸与各个第二辅放大核酸杂交，多个第二标记探针与第二放大核酸杂交。任选采用其它辅放大核酸作为与捕获探针杂交的辅放大核酸与放大核酸之间的中介物。

在以上类型实施方式中，一个捕获探针与一个标记探针、放大核酸或辅放大核酸杂交。在其它类型实施方式中，二个或多个捕获探针与标记探针、放大核酸或辅放大核酸杂交。参见例如标题为“实施，应用和优点”的以下章节。

在采用两种或多种第一捕获探针和/或两种或多种第二捕获探针的实施方式中，捕获探针优先与它们各自靶核酸中非重叠的多核苷酸序列杂交。捕获探针可以但不一定覆盖靶核酸的毗连区域。任选提供封闭探针并与靶核酸杂交，这些封闭探针是能够与没有被捕获探针占据的靶核酸区域杂交的多核苷酸。对于某给定的靶核酸，其相应的捕获探针和封闭探针优选与该靶核酸中物理上独特的非重叠序列互补，这些非重叠序列优选但不一定是毗连序列。在某些实施方式中，捕获探针和任选的封闭探针彼此毗连可提高杂交强度、消除二级结构和确保信号更加均一和再现。

在例如以上许多实施方式中，不需要用酶来使捕获探针捕获标记探针。然而在其它实施方式中，可采用酶，特别是扩增捕获探针与标记探针之间的中介核酸时，这有利于靶核酸的检测。例如在一类实施方式中，提供多个第一标记探针和多个第二标记探针。使滚动循环扩增第一环形多核苷酸产生的扩增的第一多核苷酸与第一捕获探针杂交。该第一环形多核苷酸包含至少一个拷贝的与第一标记探针中某多核苷酸序列相同的多核苷酸序列，因此该扩增的第一多核苷酸含有多个拷贝的与第一标记探针中该多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。然后使多个第一标记探针与该扩增的第一多核苷酸杂交。类似地，使滚动循环扩增第二环形多核苷酸产生的扩增的第二多核苷酸与第二捕获探针(优选在产生第一扩增的多核苷酸同时)杂交。第二环形多核苷酸包含至少一个拷贝的与第二标记探针中某多核苷酸序列相同的多核苷酸序列，因此该扩增的第二多核苷酸含有多个拷贝的与第二标记探针中该多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。然后使多个第二标记探针与该扩增的第二多核苷酸杂交。扩增的多核苷酸保持与捕获探针的(如共价)结合，因此标记探针被靶核酸捕获。可提供环形多核苷酸使其与捕获探针杂交，或可采用线性多核苷酸通过连接环化后使之与捕获探针(如扣锁探针)结合。滚动循环扩增技术，包括采用扣锁探针的技术是本领域熟知的，可参见如Larsson等(2004)“通过靶引导的滚动循环扩增扣锁探针原位基因分型各DNA分子(In situ genotyping individual DNA molecules bytarget-primed rolling-circle amplification of padlock probes)”Nat Methods.1(3):227-32,Nilsson等(1994),Science 265:2085-2088和Antson等(2000)“PCR产生的扣锁探针可检测基因组DNA中的单个核苷酸变异(PCR-generated padlockprobes detect single nucleotide variation in genomic DNA)”Nuci Acids Res28(12):E58。

任选检测捕获探针序列是否能与非对应的靶核酸、辅放大核酸、放大核酸、标记探针和/或任何相关基因组序列发生相互作用。通常在捕获探针中不要选用预计会与不需要的核酸发生交叉反应的序列，其检测可采用例如目视(如目视观察互补性)、计算机(如对相关基因组数据库的BLAST检索或结合自由能作计算机比较)和/或实验(如交叉杂交实验)。宜同时检验标记探针序列以便最大程度减少不良交叉杂交。

捕获探针、辅放大核酸和/或标记探针任选包含至少一个非天然核苷酸。例如，与之杂交的捕获探针和辅放大核酸(或放大核酸或标记探针)任选在互补位置上包含至少一对彼此碱基配对但不是属于生物DNA或RNA典型碱基(即A、C、G、T或U)的Watson-Crick碱基对的非天然核苷酸。非天然核苷酸的例子包括但不限于：Locked Nucleic^TM的核苷酸(购自ExiqonA/S(www.)exiqon.com；参见如SantaLucia jr.(1998)Proc Natl Acad Sci95:1460-1465)和isoG、isoC及AEGIS系统(Artificially Expanded GeneticInformation System,购自EraGen Biosciences(www.)eragen.com中所用的其它核苷酸；参见如USPN6,001,983；USPN6,037,120和USPN6,140,496)。在探针中采用这种非天然碱基对(如isoG-isoC碱基对)通过减少交叉杂交而降低背景噪声和/或简化探针设计，或者当该非天然碱基对的结合亲和力高于天然碱基对时可允许采用较短的探针。

如上所述，用于多重核酸检测的方法包括同时检测大于二种的靶核酸。因此所述细胞任选可含有和被怀疑含有第三靶核酸，所述方法任选包括：提供含第三标记的第三标记探针，该第三标记发出的第三信号可与第一和第二信号相区别；提供至少一种第三捕获探针，在细胞中使第三捕获探针与第三靶核酸(当细胞存在第三靶核酸时)杂交，使第三标记探针被第三捕获探针捕获，并检测第三标记发出的第三信号。类似地，需要时可同时检测细胞中的第四、率五、第六等靶核酸。

靶核酸可以基本上是细胞中需要检测的任何核酸。例如，靶核酸可以是DNA、染色体DNA、RNA、mRNA、microRNA、核糖体RNA等等。靶核酸可以是细胞的内源性核酸。另一个例子，靶核酸可以是病原体如病毒或细菌基因组RNA或DNA、质粒、病毒或细菌mRNA等感染细胞而导入细胞或在细胞中表达的核酸等。

第一和第二(和/或任选的第三、第四等)靶核酸可以是单一核酸分子的一部分，或者可以是不同的分子。在以下“实施、应用和优点”章节中更详细讨论了此二种方法各自的优点和应用。在一类实施方式中，第一靶核酸是第一mRNA，第二靶核酸是第二mRNA。在另一类型实施方式中，第一靶核酸包含mRNA的第一区域，第二靶核酸包含该同一mRNA的第二区域；此法可提高mRNA检测的特异性。在另一类型实施方式中，第一靶核酸包含第一染色体DNA多核苷酸序列，第二靶核酸包含第二染色体DNA多核苷酸序列。该第一和第二染色体DNA多核苷酸序列任选位于同一染色体中，如同一基因中，或者不同的染色体中。

一方面，标准化靶核酸发出的信号。在一类实施方式中，第二靶核酸包括参比核酸，所述方法包括按第二信号标准化第一信号。参比核酸是选出作为比较标准品的核酸。已知参比核酸的选择取决于所需的应用。例如，对于基因表达分析，当要测定第一和任选的第三、第四等靶核酸mRNA的表达水平时，参比核酸可以是管家基因转录的mRNA。另一个例子，第一靶核酸可以是疾病状态时表达改变的mRNA，如肿瘤细胞表达而正常细胞不表达，或肿瘤细胞表达高于正常细胞的mRNA，同时第二靶核酸是在疾病状态时表达不改变的管家基因或类似基因表达的mRNA。还有一个例子，第一靶核酸可以是在肿瘤细胞中扩增或缺失的染色体DNA序列，而第二靶核酸是在肿瘤细胞中维持正常拷贝数的另一染色体DNA序列。本文描述了示范性的参比核酸，本领域熟知许多这种核酸。

任选将靶细胞测定结果与参比细胞测定结果作比较。检测参比细胞，例如根据所需应用选择作为标准的非肿瘤性未感染细胞或其它健康正常细胞中的第一和第二靶核酸。可按上述参比核酸标准化发出的信号。作为一个例子，第一靶核酸可以是Her-2基因，目的是检测Her-2基因的扩增。可按照在基因组DNA中拷贝数保持稳定的参比基因标准化此Her-2的信号。可与正常细胞作比较，将靶细胞(如肿瘤细胞或怀疑为肿瘤细胞)Her-2基因的标准化信号与参比细胞(如正常细胞)的标准化信号作比较，来确定癌细胞中的拷贝数。

所述标记(第一、第二、第三等)必须是能直接或间接提供可检测信号的任何常规标记。一方面，第一标记是第一荧光标记，第二标记是第二荧光标记。因此检测标记发出的信号包括检测标记发出的荧光信号。已知有多种相互区别的荧光标记，包括例如，荧光斑点和量子斑点。作为其它例子，所述标记可以是冷光标记、散射光标记(如胶体金颗粒)或酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)标记。

可用所述方法检测基本上任何样品类型的细胞中存在的靶核酸。例如样品可得自：体液、肌体废液、血液、骨髓、痰液、尿液、淋巴结、粪便、阴道分泌液、宫颈乳头涂片、口腔拭子和其它拭子或涂片、骨髓液、唾液、痰液、射精液、精液、淋巴液、细胞间液、组织(如组织匀浆液)、活检组织样品和/或肿瘤组织。样品和/或细胞可得自人体、动物、植物或培养的细胞中的一种或多种。本发明方法筛检的样品可得自甚至较大体积的物质如体液或肌体废液，这些样品的取得采用的是相对无侵害性的方法。任选在征得同意后采用标准的实验室方法获得这些样品。

检测细胞中靶核酸的方法可用于鉴定细胞。例如，根据细胞所含核酸和其水平来鉴定细胞是否为所需类型。因此，在一类实施方式中，所述方法包括根据细胞中的第一和和第二信号(及任选的第三、第四等信号)来鉴定细胞是否为所需的靶细胞。可根据一种或多种靶核酸的存在与否鉴定细胞。类似地，可根据一种或多种靶核酸的相对信号强度或表达水平来鉴定细胞。通常如上所述将信号标准化和/或与参比细胞的信号作比较。

甚至可用所述方法来检测和鉴定罕见细胞类型。因此样品所含的细胞可能是所需靶细胞和其它非靶细胞的混合物，其中非靶细胞存在的量超过靶细胞。例如，样品中靶细胞与所有其它类型细胞的比率任选低于1:1x10⁴、低于1:1x10⁵、低于1:1x10⁶、低于1:1x10⁷、低于1:1x10⁸、或甚至低于1:1x10⁹。

采用上述方法和适当选择的靶核酸，根据细胞中核酸成分(是否存在一种或多种核酸、其表达水平和拷贝数)的不同，可检测和鉴定基本上任何类型的细胞。作为几个例子，生物学样品(如血液或其它体液)中的所述细胞可以是循环性肿瘤细胞、病毒感染细胞、母血中的胚胎细胞、细菌细胞或其它微生物细胞、或血液中的内皮细胞、内皮前体细胞、心肌细胞、干细胞或T细胞。如需要可用本领域已知方法(如裂解红细胞，分离外周血单个核细胞，通过磁激活细胞分离术(MACS)等进一步富集罕见细胞)先富集罕见细胞然后进行检测。所述方法任选与其它技术如核DNA的DAPI染色术联用。证明所述方法可任选同时检测各种不同的核酸标志物而用于鉴定细胞。例如，可根据细胞中存在一种靶核酸或其相对表达水平，和不存在另一种靶核酸来鉴定细胞；例如如果存在肿瘤细胞中所见的而血细胞中未见(或表达水平不同)的一种或多种标志，可鉴定为循环性肿瘤细胞，并且不存在血细胞和非循环性肿瘤细胞中的一种或多种标志可证实其肿瘤细胞身份。此原理可延伸至任何其它类型的标志，如单种细胞的蛋白质标志。

通常细胞需要先固定和渗透处理，然后再与捕获探针杂交，以保留细胞的靶核酸并允许捕获探针、标记探针等进入细胞。任选洗涤细胞以除去未被任一靶核酸捕获的物质。可任意步骤之后洗涤细胞，例如捕获探针与靶核酸杂交后洗涤细胞以除去未结合的捕获探针，辅放大核酸、放大核酸和/或标记探针与捕获探针杂交后洗涤细胞等等。

可同时或依次以基本上任何方便的顺序进行各捕获和杂交步骤。优选同时进行所有靶核酸的给定杂交步骤。例如，可一次将所有的捕获探针加入细胞使它们与其相应的靶核酸杂交，洗涤细胞，使放大核酸(第一、第二等)与相应的捕获探针杂交，洗涤细胞，使标记探针与相应的放大核酸杂交，再洗涤细胞，然后检测标记物。另一例子是，捕获探针与靶核酸杂交，洗涤细胞，一起加入放大核酸和标记探针使之杂交，洗涤细胞然后检测。证明宜通过例如加热变性双链靶核酸，再使相应的捕获探针与靶核酸杂交。

所用方法的所有或大部分步骤中细胞宜为悬浮液，以便于操作。然而，所述方法也可用于固态组织样品(如组织切片)和/或固定在基材(如载玻片或其它表面)上的细胞。因此，在一类实施方式中，样品是含有细胞的悬浮细胞，和/或杂交、捕获和/或检测步骤均为悬浮细胞。例如杂交、捕获、任选的洗涤和检测步骤中细胞样品是悬浮细胞。在其它实施方式中，样品为含有细胞的悬浮液，而在杂交、捕获和/或检测步骤期间细胞固定在基材上。例如，在杂交、捕获、任选的洗涤和检测步骤时为悬浮细胞，而在检测步骤时为固定在基材上的细胞。

可任选用本领域熟知的任何一种技术检测标记发出的信号和它们的强度。例如，在细胞为悬浮液的实施方式中，可用流式细胞术方便地检测第一和第二(任选第三等)信号。在细胞固定在基材上的实施方式中，可用激光扫描或显微镜如荧光或自动化扫描显微镜检测第一和第二(任选第三等)信号。如上所述，检测是单个细胞水平的检测。通常可在一次操作(如一次流式细胞术或一次显微镜或扫描观察时)中检测各标记发出的信号，而不是在分开的操作中依次检测各标记。这种一次检测操作包括例如，在检测不同标记时更换滤光片，但不是检测第一标记，然后捕获第二标记后，然后再检测第二标记。在某些实施方式中，使第一和第二(任选第三等)标记同时被它们各自的靶核酸捕获，但在分开的检测步骤或操作中检测。

可将本文描述的，如以下标题为“实施、应用和优点”的章节中描述的其它特征应用于相关方法。例如以下更详细描述的方法中，标记探针可包括一种以上相同或不同的标记。如需要，任选可根据二靶核酸之间预计的拷贝数调节信号强度；例如，可扩增低水平表达的mRNA的信号强度(如每个标记探针采用更多标记，和/或利用辅放大核酸、放大核酸使每个拷贝的靶核酸捕获更多标记探针)使之高于高表达mRNA的信号强度。

本发明另一方面，通过单个细胞核酸的原位扩增检测两种或多种核酸。为了防止所产生的扩增子漏出细胞，可按照Li等(2006)“检测和定量罕见序列变体的BEAMing up(BEAMing up for detection and quantification of raresequence variants)”Nature Methods.3(2):95-7所述制备油包水乳液，将单个细胞隔离在不同区室中。

按参比核酸标准化，检测相对水平

如上简述，检测到的感兴趣核酸信号可按标准的参比核酸信号标准化。一通用类型实施方式提供检测单个细胞中一种或多种靶核酸的相对水平的方法。在所述方法中提供含细胞的样品。所述细胞含有或被怀疑含有第一靶核酸和第二参比核酸。也提供含第一标记的第一标记探针，含第二标记的第二标记探针，第一标记发出的信号可与第二标记发出的信号相区别。在细胞中，第一标记探针被第一靶核酸捕获(当细胞中存在此第一靶核酸时)，第二标记探针被第二参比核酸捕获。然后检测单个细胞中第一标记发出的第一信号和第二标记发出的第二信号，并测定各信号的强度。将第一信号的强度按第二(参比)信号标准化。由于第一和第二标记与它们各自的核酸相关联，从而可测定此细胞中第一靶核酸相对于第二参比核酸的水平，所述方法任选为定量方法，而允许检测细胞中第一靶核酸对第二参比核酸的相对含量。因此可将按第二信号标准化的第一信号的强度与细胞中存在的第一靶核酸含量相关联。

标记探针可直接与核酸结合。例如，第一标记探针可与第一靶核酸杂交，和/或第二标记探针可与第二参比核酸杂交。或者，某些或所有的标记探针可通过捕获探针间接结合它们相应的核酸。例如，第一和第二标记探针可直接结合核酸，或一种直接结合而另一种间接结合，或二者都间接结合。

任选通过捕获探针使标记探针被核酸捕获。在一类实施方式中，提供至少一种第一捕获探针和至少一种第二捕获探针。在细胞中，第一捕获探针与第一靶核酸杂交，第二捕获探针与第二参比核酸杂交。第一标记探针被第一捕获探针捕获，第二标记探针被第二捕获探针捕获，进而使第一标记探针被第一靶核酸捕获，第二标记探针被第二参比核酸捕获。也可将上述方法描述的特征应用于这些实施方式，即关于标记和捕获探针的构型和数目、任选采用辅放大核酸和/或放大核酸、滚动循环扩增环形多核苷酸等等。

所述方法可用于核酸的多重检测，包括同时检测两种或多种靶核酸。因此所述细胞任选含有或被怀疑含有第三靶核酸，所述方法任选包括：提供含第三标记的第三标记探针，其中第三标记发出的第三信号可与第一和第二信号相区别；在细胞中使第三标记探针被第三靶核酸(当细胞中存在时)捕获；检测第三标记发出的第三信号，该检测包括测定第三信号的强度；和将第三信号的强度按第二信号强度标准化。或者，可按不同的参比核酸标准化第三信号。如需要可类似地同时检测第四、第五、第六核酸等。任选使第三、第四第五等标记探针与它们相应的核酸直接杂交，或如第一和第二标记探针所述，可通过捕获探针使它们间接被捕获。

所述方法用于基因表达分析、基因检测、扩增或缺失、或疾病检测或诊断只是举了几个例子。靶核酸基本上可以是要检测的细胞中的任何核酸。例如，靶核酸可以是DNA、染色体DNA、RNA、mRNA、microRNA、核糖体RNA等等。靶核酸可以是细胞的内源性核酸，或另一例子，靶核酸可以是病原体如病毒或细菌基因组RNA或DNA、质粒、病毒或mRNA等感染细胞而导入的或在细胞中表达的核酸。参比核酸类似地可以是DNA、mRNA、染色体DNA、mRNA、细胞的内源性RNA等等。

如上所述，可根据所需应用来选择参比核酸。例如，对于基因表达分析，当要检测第一和任选的第三、第四等靶核酸是mRNA的表达水平时，参比核酸可以是从管家基因转录的mRNA。另一例子，第一靶核酸可以是在疾病状态时表达发生改变的mRNA，如肿瘤细胞表达而正常细胞不表达，或肿瘤细胞表达水平高于正常细胞的mRNA，而参比核酸是管家基因表达的或与其类似的在疾病状态时表达不改变的基因的mRNA。在一类似例子中，靶核酸可以是病毒或细菌核酸，而参比核酸是细胞的内源核酸。还有一个例子，第一靶核酸可以是肿瘤细胞中扩增的或缺失的染色体DNA序列，而参比核酸是该肿瘤细胞中维持正常拷贝数的另一染色体DNA序列。本文描述了示范性的参比核酸，本领域熟知有更多的参比核酸。

在一类实施方式中，第一靶核酸是第一mRNA，第二参比靶核酸是第二mRNA。在另一类实施方式中，第一靶核酸包含第一染色体DNA多核苷酸序列，第二参比靶核酸包含第二染色体DNA多核苷酸序列。该第一和第二染色体DNA多核苷酸序列任选位于同一染色体或不同染色体上。

任选将细胞的标准化(检测)结果与参比细胞的标准化结果作比较。即也检测参比细胞如非肿瘤、非感染的或其它健康的正常细胞中的靶核酸和参比核酸，选择用作比较的标准取决于所需的应用。作为一个例子，第一靶核酸可以是Her-2基因，目的是检测Her-2基因的扩增。可按照在基因组DNA中拷贝数保持稳定的参比基因标准化此Her-2的信号。可与正常细胞作比较，将靶细胞(如肿瘤细胞或怀疑为肿瘤细胞)Her-2基因的标准化信号与参比细胞(如正常细胞)的标准化信号作比较来确定癌细胞中的拷贝数。

如需要，任选根据靶核酸与参比核酸预计的拷贝数调节它们之间的信号强度。例如，可放大低水平表达的靶mRNA信号(如每个标记探针采用多个标记和/或采用捕获探针、辅放大核酸和放大核酸使每个拷贝的靶核酸捕获更多的标记探针)使其强度高于高表达的mRNA(例如可以使标记探针直接结合参比核酸，或利用捕获探针和放大核酸而不用辅放大核酸来检测等等)。

可利用检测细胞中靶核酸相对水平的方法来鉴定细胞。例如，可根据细胞所含的核酸及其水平来鉴定细胞是否为所需类型。在一类实施方式中，所述方法包括根据标准化的第一信号(和任选标准化的第三、第四等信号)来鉴定是否为所需靶细胞。如本文所述，可根据一种或多种靶核酸的存在与否来鉴定细胞。类似地，可根据一种或多种靶核酸的信号强度或表达水平来鉴定细胞。任选将其信号与参比细胞的信号作比较。

可采用所述方法来检测和鉴定甚至罕见的细胞。因此，所述样品包含的细胞可能是所需靶细胞与其它非靶细胞的混合物，其中非靶细胞存在的量可能超过靶细胞。例如，样品中靶细胞与所有其它细胞的比率任选低于1:1x10⁴、低于1:1x10⁵、低于1:1x10⁶、低于1:1x10⁷、低于1:1x10⁸、或甚至低于1:1x10⁹。

利用所述方法和适当选择的靶核酸和参比核酸可检测和鉴定基本上任何类型的细胞，根据其核酸组成(根据一种或多种核酸的存在、缺失或拷贝数)进行区分。作为几个例子，生物样品(如血液或其它体液)中的所述细胞可以是循环性肿瘤细胞、病毒感染细胞、母血中的胚胎细胞、细菌细胞或其它微生物细胞、或血液中的内皮细胞、内皮前体细胞、或心肌细胞。如需要可用本领域已知方法(如裂解红细胞，分离外周血单个核细胞)先富集罕见细胞然后进行检测。所述方法任选与其它技术，如核DNA的DAPI染色术联用。证明所述方法可任选同时检测各种不同类型的核酸标志物来鉴定细胞。例如，可根据细胞中存在一种靶核酸或其相对表达水平，和不存在另一种靶核酸来鉴定细胞，例如存在肿瘤细胞中所见的而血细胞中未见(或表达水平不同)的一种或多种标志，并且不存在血细胞和非循环性肿瘤细胞中存在的一种或多种标志，可鉴定为循环性肿瘤细胞。此原理可延伸至任何其它类型标志，如单种细胞的蛋白质标志。

上述方法提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项；例如，关于样品的来源、细胞的固定和渗透、细胞洗涤、双链靶核酸与参比核酸的变性、标记的类型、采用任选的封闭探针、信号的检测、流式细胞术或显微镜检测(和强度测定)、细胞以悬浮液存在或固定在基材上等等。还有，可将本文所述，如题为“实施、应用和优点”章节中所述的其它特征应用于相关方法中。

本发明方法可用于分析单个细胞中的基因表达。目前基因表达分析的是异质细胞群如血液或肿瘤标本。血液含有各种亚型的白细胞，当测到全血或从血中分离的RNA基因表达变化时，不确切知道是哪种亚型血细胞的基因表达发生变化。例如，在疾病中或药物治疗时可能只有某一种亚型血细胞的基因表达受到影响。因此需要能够测定单个细胞中基因表达，从而检测单个细胞中基因表达的变化的技术。类似地，肿瘤标本包含的异质细胞群包括肿瘤细胞、正常细胞、基质细胞、免疫细胞等。目前的技术通过总RNA或细胞裂解液测定的是这些细胞的总体表达。然而，此种总体表达不能代表肿瘤靶细胞的表达。因此再次表明需要观察单个细胞的表达变化，从而可专门检查肿瘤靶细胞，观察肿瘤靶细胞的基因表达如何变化以及它们对药物治疗如何反应。

一方面，本发明提供分析单个细胞中基因表达的方法。可通过检测靶基因的表达和如上所述按管家基因的表达标准化来执行单细胞基因表达的分析。作为一些例子，可将疾病时标准化的表达与正常时的作比较，或可将药物治疗时的表达与正常时的作比较。单细胞中的表达变化具有生物学显著性时，表明疾病发展、治疗有效和/或有毒性、肿瘤的阶段和类型等等。

因此，一类通用实施方式提供比较单个细胞基因表达的分析方法。此方法中，提供的第一混合细胞群包含一种或多种特定类型的细胞。提供的第二混合细胞群也包含一种或多种特定类型的细胞。检测第一群特定类型细胞中一种或多种靶核酸与参比核酸的相对表达水平以提供第一表达模式。检测第二群特定类型细胞中一种或多种靶核酸与参比核酸的相对表达水平以提供第二表达模式。比较该第一与第二表达模式。

在一类实施方式中，所述一种或多种靶核酸是一种或多种mRNA，如二种或更多种，三种或更多种，四种或更多种等mRNA。可检测各mRNA与作为参比核酸的管家基因mRNA的相对表达水平。

该第一和/或第二混合细胞群除特定类型细胞外包含至少一种其它类型细胞，更具体说，包含至少二种或更多种其它类型细胞，和任选的几种到多种其它类型细胞(如全血、肿瘤或其它复杂生物样品中的细胞)。特定类型细胞与所有其它类型细胞的比率任选低于1:1x10⁴、低于1:1x10⁵、低于1:1x10⁶、低于1:1x10⁷、低于1:1x10⁸、或甚至低于1:1x10⁹。

如将证明的那样，二个细胞群之间基因表达模式的变化可提示疾病状态、药物反应、治疗效果等。因此例如，第一混合细胞群可以是已诊断或待诊断患某具体疾病病人的，而第二混合细胞群是健康个体的细胞群。类似地，例如所述第一和第二混合细胞群可得自同一位个体但采自不同时间，以随访疾病的发展或评估对药物治疗的反应。因此，该第一混合细胞群可得自药物或其它化合物开始治疗前的个体(如人)，而第二群得自开始治疗后某特定时间的该个体。另一个例子，第一混合群得自治疗个体，而第二混合群得自未治疗的个体。

上述方法提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项；例如，靶和参比核酸的类型、样品的来源、细胞的固定和渗透处理、细胞洗涤、双链靶和参比核酸的变性、标记的类型、标记探针、捕获探针、辅放大核酸和/或放大核酸的使用和构型、采用任选的封闭探针、信号的检测、流式细胞术或显微镜检测(和其强度检测)、细胞以悬浮液存在或固定在基材上等等。本文描述的是示范性靶核酸和参比核酸。

另一方面，可采用所述方法来比较第一群(如肿瘤细胞)单个细胞中的拷贝数与第二群(如用作参比的正常细胞)单个细胞中的拷贝数。所述靶核酸可以是转录物或基因组DNA，例如，将Her-2基因的扩增或缺失程度与肿瘤发展相关联。另一方面，可将所述方法用于甚至一种细胞群(包括例如同类型但处在细胞周期不同阶段)的单个细胞基因表达分析。

标记密度

与现有技术相比，本发明的方法允许更多的标记被靶核酸中的小区域所捕获。例如，标准的FISH技术通常采用得自覆盖20kb或更长(区域)的探针，该探针一般含有化学方法偶联的荧光团，密度为探针每7个核苷酸约一个荧光分子。当采用分子信标检测时，一对标记被靶核酸中该信标覆盖的通常约40个核苷酸的区域所捕获。目前的示范性技术的其它讨论可参见如美国专利申请公布号2004/0091880和2005/0181463、USPN6,645,731及国际专利申请公布号WO95/09245和03/019141。

比较而言，本文所述方法在一个捕获探针所覆盖的靶核酸区域(如20-25个核苷酸或更多)中不难捕获数百个(如400个或更多)标记。理论上对于任何给定构型的捕获探针、放大核酸等，不难计算出一个捕获探针可达到的放大程度；例如，理论上一个捕获探针可达到的放大程度以及由此该捕获探针每个核苷酸长度的标记数等于与该捕获探针结合的辅放大核酸数乘以结合各辅放大核酸的放大核酸数，再乘以结合各辅放大核酸的标记探针数，再乘以每个标记探针中的标记数。

因此在一方面，本发明提供促进高密度标记与细胞中靶核酸结合的方法。一类通用实施方式提供检测单个细胞中两种或多种靶核酸的方法。在此方法中，提供含细胞的样品。所述细胞含有或被怀疑含有第一靶核酸和第二靶核酸。所述细胞中，第一标记被第一靶核酸(当细胞中存在时)捕获，第二标记被第二靶核酸(当细胞中存在时)捕获。第一标记发出的第一信号可与第二标记发出的第二信号相区别。如上所述标记被高密度捕获。因此，第一靶核酸的横跨至少20个毗连核苷酸的区域中每个核苷酸平均至少捕获一个拷贝的第一标记，第二靶核酸的横跨至少20个毗连核苷酸的区域中每个核苷酸平均至少捕获一个拷贝的第二标记。检测第一标记发出的第一信号和第二标记发出的第二信号。

在一类实施方式中，第一靶核酸的横跨至少20个毗连核苷酸的区域中每个核苷酸平均至少捕获4、8或12个拷贝的第一标记，第二靶核酸的横跨至少20个毗连核苷酸的区域中每个核苷酸平均至少捕获4、8或12个拷贝的第二标记。在一实施方式中，第一靶核酸的横跨至少20个毗连核苷酸的区域中每个核苷酸平均至少捕获16个拷贝的第一标记，第二靶核酸的横跨至少20个毗连核苷酸的区域中每个核苷酸平均至少捕获16个拷贝的第二标记。

上述方法提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项；例如，关于标记的类型，信号的检测，细胞的类型、处理和悬浮等。第一和第二靶核酸的所述区域任选横跨至少25、50、100、200个或更多毗连核苷酸和/或最多2000、1000、500、200、100、50个或更少核苷酸。对于第三、第四、第五、第六等靶核酸任选存在相同密度的第三、第四、第五、第六等标记。

靶细胞的检测

如上所述，可通过检测细胞的组成核酸来检测和鉴定细胞。对于某些应用，宜检测大的异质混合细胞中的罕见细胞、检测多种冗余的核酸标志来检测罕见细胞。以下假设的实施例说明了检测冗余标志的一种益处。

假设在血样品中检测到循环性肿瘤细胞(CTC)，CTC的浓度是10⁶个正常白细胞中一个肿瘤细胞。如CTC的一种标志核酸(例如，此核酸的存在或拷贝数是独特的、足够与细胞群中的其它细胞相区别)具有的检测特异性为10³中一个，当计数10⁶个细胞时将有1000个细胞被错误鉴定为CTC。(此假阳性可能来自相关探针或类似因子非特异性结合所产生的随机背景信号)。如果包括自身检测特异性也为10³中一个的另一种独立标志，只有在这二种标志均阳性时细胞才鉴定为CTC，此种联合检测的特异性理论上将显著提高到10³x10³＝10⁶中一个。在这种推测下，此特异性对正常血白细胞的CTC直接检测已足够。类似地，如果采用三种独立的冗余标志检测CTC，检测特异性可增加至10⁹中一个。因此采用两种或多种冗余标志可减少假阳性数而有利于检测复杂样品中的罕见细胞。

因此，一通用实施方式提供检测特定类型单个细胞的方法。此方法中提供的样品包含含有至少一种特定类型细胞的细胞混合物。提供的第一标记探针含第一标记，第二标记探针含第二标记，其中第一标记发出的信号可与第二标记发出的信号相区别。在细胞中，第一标记探针被第一靶核酸(当细胞中存在第一靶核酸时)捕获，第二标记探针被第二靶核酸(当细胞中存在第二靶核酸时)捕获。检测第一标记发出的第一信号和第二标记发出的第二信号，并将其与细胞中相应的第一和第二靶核酸存在与否或含量相关联。根据细胞中第一和第二靶核酸存在与否或含量(如非零含量)的检测鉴定该细胞是否为特定类型细胞，根据细胞中第一靶核酸的存在与否或含量，或者第二靶核酸存在与否或含量(即该特定类型细胞冗余标志的靶核酸)，区别混合群中的特定类型细胞与其它类型细胞。任选测定第一信号强度和第二信号强度，并将其与细胞中存在的相应核酸含量相关联。

各靶核酸可作为特定类型细胞的标志，通过其在细胞中的存在、含量(拷贝数，如基因拷贝数或转录物表达水平)、或细胞缺失此标志(标志阴性)，来区分该特定类型细胞与其它类型细胞。一组靶核酸可包括不同类型的这种标志；即一种靶核酸可作为阳性标志，通过其在细胞中的存在或非零含量鉴别该细胞，而另一种作为阴性标志，通过其在细胞中的缺失鉴别该细胞。例如在一类实施方式中，所述细胞包含第一靶核酸和第二靶核酸，根据细胞中检测到的第一和第二靶核酸二者的存在或含量，鉴定该细胞是否为特定类型，根据细胞中第一靶核酸的存在或含量，或者第二靶核酸存在或含量，区别混合群中的特定类型细胞与其它类型细胞。

标记探针可直接与靶核酸结合。例如，第一标记探针可与第一靶核酸杂交，第二标记探针可与第二靶核酸杂交。或者，某些或所有的标记探针可间接通过例如捕获探针与它们相应的靶核酸结合。例如，第一和第二标记探针可直接结合靶核酸，或者一个直接结合而另一个间接结合，或二者均间接结合。

标记探针可任选通过捕获探针捕获靶核酸。在一类实施方式中，提供至少一种第一捕获探针和至少一种第二捕获探针。在细胞中第一捕获探针与第一靶核酸杂交，第二捕获探针与第二靶核酸杂交。第一标记探针被第一捕获探针捕获，第二标记探针被第二捕获探针捕获，从而使第一标记探针被第一靶核酸捕获，和第二标记探针被第二靶核酸捕获。以上方法所述的特征也可应用于这些实施方式，包括标记和捕获探针的构型和数目、任选采用辅放大核酸和/或放大核酸、环形多核苷酸的滚动循环扩增等等。

任选检测细胞中的第三、第四、第五等靶核酸。例如，该方法任选包括：提供含第三标记的第三标记探针，其中第三标记发出的第三信号可与第一和第二信号相区别，在细胞中第三标记探针被第三靶核酸(当细胞中存在时)捕获，检测第三标记发出的第三信号。任选使第三、第四、第五等标记探针与它们相应的核酸直接杂交，或如第一和第二标记探针所述那样通过捕获探针间接捕获。

在各种方法中可任意采用其它标志。例如，所述细胞可能含有第三靶核酸，可将第一和/或第二信号按第三信号标准化。所述方法包括根据标准化的第一和/或第二信号鉴定细胞是否为特定类型；在这种实施方式中，可根据第一和/或第二靶核酸的拷贝数，而不只是根据它们存在于靶细胞类型中但不存在其它类型细胞中，来鉴别靶细胞类型与混合物中其它类型细胞。例子包括根据不同基因表达模式检测细胞，根据一种或多种特定mRNA的过度表达检测CTC或其它肿瘤细胞，和根据一种或多种特定染色体区域的扩增或确实来检测CTC或其它肿瘤细胞。

作为另一例子，可利用第三靶核酸作为靶细胞类型的第三冗余标志，来提高对所需细胞类型的检测特异性。因此在一类实施方式中，所述方法包括将细胞测到的第三信号与细胞中第三靶核酸的存在、缺失或含量相关联，和根据细胞中第一、第二和第三靶核酸的存在、缺失或含量来鉴定细胞是否为特定类型，根据细胞中第一靶核酸的存在、缺失或含量，第二靶核酸的存在、缺失或含量，或第三靶核酸的存在、缺失或含量，来鉴别特定类型细胞与混合物中其它类型的细胞。

还有另一例子可利用其它标志帮助鉴定细胞类型。例如，第一和第三的存在、缺失或含量可能足以鉴定细胞类型，如同第二和第四标记的存在、缺失或其含量足以鉴定细胞类型；可检测所有四种标志以提供二套冗余标志，从而提高了检测的特异性。作为另一例子，可利用一种或多种其它标志对不需要的细胞类型作阴性选择；例如，可通过血细胞和非循环性肿瘤细胞中不存在的一种或多种标志进一步验证某细胞的身份是否为CTC。

检测其它靶核酸还可提供进一步的信息用于诊断、结局预测等，而不论此靶核酸是否作为特定类型细胞的标志。例如，其它靶核酸可以是包括增殖能力、凋亡、或其它转移性、遗传性、或后成性变化的标志。

任选将其它靶核酸的信号按上述参比核酸标准化。如需要，任选依据它们预计的拷贝数调节靶核酸之间的信号强度。如上所述任选将细胞中的靶核酸信号与参比细胞的信号作比较。

靶核酸基本上可以是细胞中需要检测的任何核酸。例如，靶核酸可以是DNA、染色体DNA、RNA、mRNA、microRNA、核糖体RNA等等。靶核酸可以是细胞的内源性核酸，作为另一例子，靶核酸可以是病原体如病毒或细菌基因组RNA或DNA、质粒、病毒或mRNA等感染细胞而导入的或在细胞中表达的核酸。

第一和第二(和/或任选的第三、第四等)靶核酸可以是一种核酸分子的组成部分，或它们可以是分开的分子。例如在以下题为“实施、应用和优点”章节中更详细讨论了此二种方法的各种优点和应用。在一类实施方式中，第一靶核酸是第一mRNA，第二靶核酸是第二mRNA。在另一类实施方式中，第一靶核酸包含某mRNA的第一区域，第二靶核酸包含该同一mRNA的第二区域。另一类实施方式中，第一靶核酸包含第一染色体DNA多核苷酸序列，第二靶核酸包含第二染色体DNA多核苷酸序列。该第一和第二染色体DNA多核苷酸序列任选位于同一染色体如同一基因中，或位于不同染色体上。

甚至可用所述方法来检测和鉴定罕见类型的细胞。例如，混合群中特定类型的细胞与所有其它类型细胞的比率任选低于1:1x10⁴、低于1:1x10⁵、低于1:x10⁶、低于1:1x10⁷、低于1:1x10⁸、或甚至低于1:1x10⁹。

利用上述方法，根据合适的标志进行区分，可检测和鉴定基本上任何类型的细胞。作为几个例子，所述细胞可以是循环性肿瘤细胞、病毒感染细胞、母血中的胚胎细胞、生物学样品(如血液或其它体液)中的细菌细胞或其它微生物细胞、血液中的内皮细胞、内皮前体细胞、或心肌细胞、干细胞或T细胞。如需要可用本领域已知方法(如裂解红细胞、分离外周血单个核细胞等)先富集罕见细胞然后进行检测。

上述方法提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项；例如，样品来源、细胞的固定和渗透处理、细胞洗涤、双链核酸的变性、标记的类型、采用任选的封闭探针、信号的检测、流式细胞术或显微镜检测单个细胞发出的信号(和检测其强度)、细胞以悬浮液存在或固定在基材上等等。还有本文例如在题为“实施、应用和优点”章节中所述的其它特征可应用于相关方法中。

另一方面，如上所述检测特定类型的单个细胞，但该类型细胞的第一和第二靶核酸不一定是冗余标志。这类靶核酸基本上可以是任何需要的核酸，包括例如，该类型细胞的冗余和/或非冗余标志。

组合物和试剂盒

本发明还提供用于实施的或所述方法产生的组合物。一类示范性实施方式提供的组合物包含固定和经渗透处理的细胞，该细胞含有或被怀疑含有第一靶核酸和第二靶核酸、至少一种能与第一靶核酸杂交的第一捕获探针和至少一种能与第二靶核酸杂交的第二捕获探针、含第一标记的第一标记探针和含第二标记的第二标记探针。第一标记发出的第一信号可与第二标记发出的第二信号相区别。所述细胞任选包含第一和第二捕获探针和标记探针。该第一和第二捕获探针任选能与细胞中它们各自的靶核酸杂交。

直接使标记探针被靶核酸捕获的以上方法所述特征也可应用于这些实施方式。例如，标记探针可与捕获探针杂交。在一类实施方式中，所述组合物包含一种第一捕获探针和一种第二捕获探针，其中第一标记探针能与第一捕获探针杂交，第二标记探针能与第二捕获探针杂交。在另一类实施方式中，所述组合物包含二种或更多种第一捕获探针和二种或更多种第二捕获探针、多个第一标记探针和多个第二标记探针。单个第一标记探针能与各自的第一捕获探针杂交，单个第二标记探针能与各自的第二捕获探针杂交。

另一方面，可利用放大核酸来提高各靶核酸捕获的标记探针数。例如，在一类实施方式中，所述组合物包含一种第一捕获探针、一种第二捕获探针、多个第一标记探针、多个第二标记探针、第一放大核酸和第二放大核酸。该第一放大核酸能与第一捕获探针杂交和与多个第一标记探针杂交，该第二放大核酸能与第二捕获探针杂交和与多个第二标记探针杂交。在另一类实施方式中，所述组合物包含二种或更多种第一捕获探针、二种或更多种第二捕获探针、多个第一标记探针、多个第二标记探针、第一放大核酸和第二放大核酸。该第一放大核酸能与一个第一捕获探针和多个第一标记探针杂交，该第二放大核酸能与一个第二捕获探针和多个第二标记探针杂交。

另一方面，可采用辅放大核酸使标记探针被靶核酸捕获。在一类实施方式中，所述组合物包含一种第一捕获探针、一种第二捕获探针、多个第一标记探针、多个第二标记探针、多个第一放大核酸、多个第二放大核酸、第一辅放大核酸和第二辅放大核酸。该第一辅放大核酸能与第一捕获探针杂交和与多个第一放大核酸杂交，该第二辅放大核酸能与第二捕获探针杂交和与多个第二放大核酸杂交。而第一放大核酸能与第一辅放大核酸和多个第一标记探针杂交，第二放大核酸能与第二辅放大核酸和多个第二标记探针杂交。在一类相关实施方式中，所述组合物包含二种或更多种第一捕获探针、二种或更多种第二捕获探针、多个第一标记探针、多个第二标记探针、多个第一放大核酸、多个第二放大核酸、多个第一辅放大核酸和多个第二辅放大核酸。该第一辅放大核酸能与一个第一捕获探针和多个第一放大核酸杂交，该第二辅放大核酸能与一个第二捕获探针和多个第二放大核酸杂交，第一放大核酸能与第一辅放大核酸和多个第一标记探针杂交，第二放大核酸能与第二辅放大核酸和多个第二标记探针杂交。任选可采用其它辅放大核酸作为(与捕获探针杂交的)辅放大核酸与放大核酸之间的中介物。

在上述类型的实施方式中，一个捕获探针与各个标记探针、放大核酸或辅放大核酸杂交。在另一类相关实施方式中，二个或多个捕获探针与标记探针、放大核酸或辅放大核酸杂交。

在一类实施方式中，所述组合物包含多个第一标记探针、多个第二标记探针、与第一捕获探针杂交的第一环形多核苷酸滚动循环扩增产生的扩增的第一多核苷酸，与第二捕获探针杂交的第二环形多核苷酸滚动循环扩增产生的扩增的第二多核苷酸。该第一环形多核苷酸包含至少一个拷贝的与第一标记探针中某多核苷酸序列相同的多核苷酸序列，该扩增的第一多核苷酸包含多个拷贝的与第一标记探针中该多核苷酸序列互补的多核苷酸序列(和因此能与多个标记探针杂交)。该第二环形多核苷酸包含至少一个拷贝的与第二标记探针中某多核苷酸序列相同的多核苷酸序列，该扩增的第二多核苷酸包含多个拷贝的与第二标记探针中该多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。所述组合物还包含产生所述扩增的多核苷酸必须的试剂，如外源提供的核酸聚合酶、外源提供的核酸连接酶、和/或外源提供的核苷酸三磷酸(如dNTP)。

所述细胞任选包含其它靶核酸，所述组合物(和细胞)可包含检测这些靶核酸的试剂。例如，所述细胞可含有或被怀疑含有第三靶核酸，所述组合物可包含至少能与第三靶核酸杂交的第三捕获探针和含第三标记的第三标记探针。第三标记发出的第三信号可与第一和第二信号相区别。所述细胞任选包含第四、第五、第六等靶核酸，所述组合物任选包含第四、第五、第六等标记探针和捕获探针。

上述方法提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项，例如，靶核酸的类型、各种靶(序列)处在一种分子或不同分子中的位置、标记的类型、包括任选的封闭探针等等。例如，值得注意的是第二靶核酸任选包括参比核酸。在其它实施方式中，第一和第二靶核酸用作特定类型细胞的标志，如冗余标志。

所述细胞基本上可以是任何来源任何类型的细胞，具体可根据其核酸组成(存在、缺失一种或多种核酸或其拷贝数)区分细胞。作为几个例子，生物学样品(如血液或其它体液)中的细胞可以是循环性肿瘤细胞、病毒感染细胞、母血中的胚胎细胞、细菌细胞或其它微生物细胞、或血液中的内皮细胞、内皮前体细胞、心肌细胞。例如，所述样品可得自：体液、血液、骨髓、痰液、尿液、淋巴结、粪便、宫颈乳头涂片、口腔拭子和其它拭子或涂片、骨髓液、唾液、痰液、精液、淋巴液、细胞间液、组织(如组织匀浆液)、活检组织样品和/或肿瘤组织。所述细胞可得自人体、动物、植物或培养的细胞之一种或多种。

所述细胞可以是混合细胞，例如，复杂的异质细胞混合物。在一类实施方式中，所述细胞是特定类型，所述组合物包含一种或多种类型细胞。这些其它细胞可过量，甚至大大过量存在。例如该组合物中特定类型细胞与所有其它类型细胞的比率任选低于1:1x10⁴、低于1:1x10⁵、低于1:1x10⁶、低于1:1x10⁷、低于1:1x10⁸、或甚至低于1:1x10⁹。

细胞任选地固定在基材上，以组织切片存在等。然而优选细胞悬浮在该组合物中。该组合物可装在流式细胞计数仪或类似仪器中。本文中如在题为“实施、应用和优点”章节中所述的其它特征可应用于任选的相关组合物。

本发明另一方面提供含有大量与各靶核酸相关标记的组合物。一类通用实施方式提供含细胞的组合物，所述细胞包含第一靶核酸和第二靶核酸；细胞中存在第一标记表明细胞中存在第一靶核酸，细胞中存在第二标记表明细胞中存在第二靶核酸，其中第一标记发出的信号可与第二标记发出的信号相区别。细胞中第一靶核酸的横跨至少20个毗连核苷酸的区域中每个核苷酸平均至少捕获1个拷贝的第一标记，第二靶核酸的横跨至少20个毗连核苷酸的区域中每个核苷酸平均至少捕获1个拷贝的第二标记。

在一类实施方式中，第一标记的拷贝与第一靶核酸在实质相关，第二标记的拷贝与第二靶核酸在实质相关。例如，第一标记是第一标记探针的组成部分，第二标记是第二标记探针的组成部分，所述标记探针被靶核酸捕获。

在一类实施方式中，细胞中第一靶核酸的横跨至少20个毗连核苷酸的区域中每个核苷酸平均至少捕获4、8或12个拷贝的第一标记，第二靶核酸的横跨至少20个毗连核苷酸的区域中每个核苷酸平均至少捕获4、8或12个拷贝的第二标记。在一实施方式中，第一靶核酸的横跨至少20个毗连核苷酸的区域中每个核苷酸平均至少捕获16个拷贝的第一标记，第二靶核酸的横跨至少20个毗连核苷酸的区域中每个核苷酸平均至少捕获16个拷贝的第二标记。

上述实施方式所涉及的基本上所有特征也适用于这些实施方式及相关事项，例如关于标记的类型、细胞的悬浮等。第一和第二靶核酸的所述区域通常是检测各个靶核酸所用的探针、引物或类似多核苷酸所覆盖的区域。第一和第二靶核酸的所述区域任选横跨至少25、50、100、200个或更多个毗连核苷酸和/或最多2000、1000、500、200、100、50个或更少核苷酸。任选第三、第四、第五、第六等靶核酸捕获同样密度的标记。在原位多重复合物检测靶核酸的实施方式中，所述组合物任选包含PCR引物、热稳定的聚合酶等。

本发明另一方面是用于实施所述方法的试剂盒。一通用实施方式提供检测单个细胞中第一靶核酸和第二靶核酸的试剂盒。该试剂盒的一个或多个容器中装有至少一种固定和/或渗透处理细胞的试剂，至少一种能与第一靶核酸杂交的第一捕获探针、至少一种能与第二靶核酸杂交的第二捕获探针、含第一标记的第一标记探针和含第二标记的第二标记探针，其中第一标记发出的第一信号可与第二标记发出的第二信号相区别。

上述实施方式提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项，例如，关于靶核酸的数目、标记和捕获探针的构型和数目、包括辅放大核酸和/或放大核酸、包括封闭探针、包括扩增试剂、靶核酸的类型、各种靶(序列)在一种分子或不同分子上的位置、标记的类型、包括任选的封闭探针等等。该试剂盒任选可装有检测细胞中靶核酸和/或鉴定细胞是否是特定类型的说明书，一种或多种缓冲液(如稀释液、杂交缓冲液、和/或洗涤缓冲液)、含有一种或多种靶核酸的参比细胞等等。

另一通用实施方式提供通过检测第一靶核酸和第二靶核酸来检测混合类型细胞群中特定类型单个细胞的试剂盒。该试剂盒的一个或多个容器中装有至少一种固定和/或渗透处理细胞的试剂，含第一标记的第一标记探针(为检测第一靶核酸)和含第二标记的第二标记探针(为检测第二靶核酸)，其中第一标记发出的第一信号可与第二标记发出的第二信号相区别。通过细胞中第一靶核酸的存在、缺失或含量，或通过细胞中第二靶核酸的存在、缺失或含量，可鉴别特定类型细胞与混合物中其它类型的细胞(即该二种靶核酸是该特定类型细胞的冗余标志)。

上述实施方式提及的基本上所有特征都可应用于这些实施方式及相关事项，例如，关于靶核酸的数目、包括捕获探针、标记和/或捕获探针的构型和数目、包括辅放大核酸和/或放大核酸、包括封闭探针、包括扩增试剂、靶核酸的类型、各种靶(序列)在一种分子或不同分子上的位置、标记的类型、包括任选的封闭探针等等。该试剂盒任选还装有鉴定细胞是否是特定类型的说明书，一种或多种缓冲液(如稀释液、杂交缓冲液、和/或洗涤缓冲液)、含有一种或多种靶核酸的参比细胞等等。

实施、应用和优点

下面更详细描述本发明的各方面内容。也描述示范性的实施方式和应用。

本文公开的新技术(方法、组合物、系统和试剂盒)、QMAGEX(QuantitativeMultiplex Analysis of Gene Expression in Singal Cell，多重定量分析单个细胞中的基因表达)能检测和定量单个细胞中的多种核酸。该技术与目前的ISH技术在几个方面有显著不同，虽然二者均可检测单个细胞中的mRNA表达。首先，在本发明试验的所有或至少大部分试验步骤中细胞宜保持悬浮状态，这大大改进了试验的杂交动力学，导致更好的重现性和缩短试验时间。其次，此技术能同时和定量分析细胞中多种mRNA转录物的表达。这点很需要，因为例如，多种肿瘤标志的检测可大大提高CTC鉴定的准确性(Mocellin等，2004)和大大减少假阳性率。定量分析基因表达水平不仅有助于区分CTC与其它类型细胞，而且能帮助区分原代肿瘤的类型和来源以及肿瘤发展的阶段。第三，此技术采用流式细胞计数仪作为检测基础，与显微镜检测仪器相比具有更高的处理量。此外，流式细胞计数仪能选拣细胞如肿瘤细胞作进一步研究。检测和定量mRNA的表达之后，分离CTC或其它细胞对进一步确认身份或进一步作细胞学和分子学分析是有益的。第四，本发明技术大大提高了检测灵敏度和重现性，能进行单拷贝基因检测和定量。此外，本发明技术采用标准的通用标记探针和检测技术(如相同的辅放大核酸、放大核酸和标记探针可用于检测多种不同的靶核酸，对于各种新的靶核酸组只需要合成一组新的捕获探针即可)，并任选采用标准程序进行细胞固定与渗透处理，杂交与洗涤。还有，此技术可包括用于控制检测特异性和有效性的固有内标。

本发明技术不仅可用于检测和计数血液样品或其它体液中的罕见细胞，而且可用于任何类型罕见细胞的鉴定和计数。应用包括但不限于：检测白血病和淋巴瘤的最小残留病灶；化疗后(肿瘤)的复发监测(Hess等)；检测体液中的其它前癌细胞如检测含HPV的宫颈细胞；检测感染细胞中的病毒或细菌核酸；检测母血中的胚胎细胞；检测肿瘤生长早期的微小肿瘤病灶；或检测手术后周边残留的肿瘤细胞。在所有这些例子中，肿瘤细胞的特异性基因表达可能埋藏在大量异质细胞群的背景中。因此，需要从大细胞群分离mRNA的微阵列或RT-PCR表达分析将难以精确和可靠地检测这些罕见细胞的存在，而采用本发明技术则不难。

还应注意到，虽然本文说明的主要应用是单个细胞检测和定量多种mRNA转录物，但此技术可同样应用于检测其它罕见细胞，包括其染色体DNA或细胞核酸成分的变化。例子包括但不限于：检测Her-2/neu基因的扩增、检测Rb基因的缺失、检测体细胞突变、检测例如慢性髓性白血病(BCR-ABL)中的染色体转位、或检测宫颈癌细胞染色体DNA中的HPV插入。

最后，此技术中探针设计、多重复合和扩增方面的内容可应用于定量分析多重基因表达和测定固体组织切片(例如福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样品)中单个细胞水平的染色体DNA的变化。

QMAGEX技术包括试验和任选的实施该试验的相关自动化装置。图1说明QMAGEX试验工作流程的主要步骤，采用放大核酸的一示范性实施方式包括：

固定和渗透处理：样品细胞以悬浮液固定和渗透处理(经渗透处理的细胞)。固定步骤可使细胞结构的核酸(如mRNA或染色体DNA)固定并使其交联。然后，经渗透处理的细胞膜使靶核酸特异性探针和信号产生粒子如荧光标记核酸探针能进入细胞与靶核酸结合。

变性：如果要检测的靶核酸是双链染色体DNA，可加入变性步骤将双链靶核酸转变为单链DNA，准备好与靶特异性探针结合。

捕获探针杂交：使精心选择的靶特异性捕获探针或探针组与靶核酸杂交。捕获探针的作用是特异性连接靶分子与信号产生粒子。此技术使细胞中的多种靶基因能够同时和高度特异性地被不同的探针所识别。

信号放大：可通过大的支架分子(放大核酸)与捕获探针或探针组的结合来放大靶分子的信号。各支架分子含有多个接受标记探针和信号产生粒子的位点。在多重试验中，采用多种独特的放大核酸。

标记：此步骤中使结合于信号产生粒子的标记探针与放大核酸杂交。在多重试验中，采用多种不同的标记探针。

洗涤：通过洗涤步骤除去未结合的或非特异性结合的过量探针或信号产生粒子，此步骤降低了背景噪声和提高了信噪比。在捕获探针杂交或信号扩增步骤中加入额外的洗涤步骤可进一步提高试验性能。

检测：采用荧光激活细胞分拣(FACS)仪或流式细胞计数仪检测标记的悬浮细胞，或用显微镜或扫描仪检测固定在固体表面的细胞。

在以下章节中将详细描述QMAGEX技术的主要组成。以下描述中，术语标记探针指能直接或间接结合靶分子而使该靶分子能够通过读出仪检测的物质。标记探针一般包含能直接或间接结合靶分子的和结合一个或多个“信号产生粒子”(即标记物，能产生可被读出仪识别的信号)的核酸或修饰的核酸分子。在间接模式中，标记探针或通过结合捕获探针与靶分子直接结合，或通过结合放大核酸进而与捕获探针相连。示范性的信号产生粒子(标记物)包括但不限于：荧光分子、纳米颗粒、放射性同位素、化学发光分子(如地高辛、二硝基苯)，荧光分子包括但不限于：荧光素(FITC)、cy3、cy5、alexa染料、藻红素等等。纳米颗粒包括但不限于荧光量子斑点、荧光散射颗粒等。术语捕获探针指能直接或间接连接靶核酸与特定类型标记探针的核酸或修饰的核酸。术语“捕获探针组”指能直接或间接连接靶核酸与特定类型标记探针的多个核酸或修饰的核酸，以提高试验的灵敏度。术语放大核酸指能结合一个或多个捕获探针，或一侧结合辅放大核酸另一侧结合多个标记探针的大支架分子。

固定

此步骤中，核酸在细胞结构中通过交联而固定在细胞内。已有采用固定试剂固定悬浮细胞和封闭内源性RNA酶活性的各种熟知方法，这些方法适合用于本发明。固定试剂包括：福尔马林(甲醛)、低聚甲醛、戊二醛、乙醇、甲醇等。一种常用的组织切片固定溶液是含0.25％戊二醛和4％低聚甲醛的磷酸缓冲液。另一种常用的组织切片固定液含50％乙醇、10％福尔马林(含37％甲醛)和5％乙酸。任选采用本领域熟知的技术，测试不同浓度的固定试剂的不同组合以寻找固定悬浮细胞的最优组合。也要优化固定处理的时间。固定溶液可含有一些不同的RNA酶抑制剂，如RNAlater(Ambion)、柠檬或LiCl等。

渗透处理

固定将导致靶核酸与细胞中的蛋白质或其它细胞成分交联，而阻碍或阻止了捕获探针渗入细胞和屏蔽了要杂交的靶分子。本发明的试验通常包括使细胞中核酸能够杂交的后续渗入处理步骤。一种技术包括加热持续不同时间来破坏交联。证明此法可提高细胞中mRNA的杂交可及性。也可利用洗涤剂(如TritonX-100或SDS)和蛋白酶K来提高固定细胞的可渗透性。洗涤剂处理常采用Triton X-100或SDS通过抽提脂质使膜可渗透。蛋白酶K是在广泛pH范围都具有活性和不易被灭活的一种非特异性蛋白酶。用其来消化围绕靶mRNA的蛋白质。另外，可如本领域熟知的那样，经实验确定优化的浓度和处理时间，然后进行细胞洗涤步骤除去渗透处理步骤产生的溶解物质。

任选在固定和渗透处理前，收集悬浮细胞，处理灭活RNA酶和/或减少自身荧光。已证明DEPS处理(如Braissant和Wahli(1988)“在原位杂交方案中用非放射性标记探针扩增以检测组织切片的富含和罕见的mRNA(A simplified insitu hybridization protocol using non-radioactively labeled probes to detectabundant and rare mRNAs on tissue sections)”Biochemica 1：10-16)和RNAlater(Ambion，Inc)能有效稳定和保护细胞RNA。也已证明硼氢化钠和高热能保存RNA的完整性和减少自身荧光，有利于低水平表达基因的检测(Capodieci等，2005“组织内单个细胞中的基因表达概况(Gene expression profiling in singlecells within tissue)”Nat Methods 2(9):663-5)。任选采用减少细胞自身荧光的其它方法，如采用台盼兰(Mosiman等，1997“减少流式细胞术中的细胞自身荧光：原位方法(Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry:an in situmethod)”Cytometry 30(3)：151-6)或单标记的猝灭剂寡核苷酸探针(Nolan等，2003“一种减少荧光背景的简单方法及其在直接检测特异性mRNA中的应用(A simple quenching method for fluorescence background reduction and itsapplication to the direct,quantitative detection of specific mRNA)”Anal Chem，200375(22)：6236-43)。

捕获探针杂交

此试验步骤中，捕获探针或捕获探针组与预计的靶分子通过杂交而结合。靶分子成功杂交的一个指标是特异性，即捕获探针或捕获探针组基本上只应使标记探针连接于感兴趣的特定靶分子，而不是任何其它分子。探针的选择和设计在实现特异性杂交中至关重要。

探针的选择和设计

本发明试验采用“直接标记”和“间接标记”二类探针设计方法使细胞中的靶核酸与信号产生粒子相连。在直接标记方法中，靶分子直接杂交或捕获一个或多个标记探针(LP)。所述LP含有图2所示的信号产生粒子(SGP)。需要采用不同的LP在靶分子不同部位结合更多的SGP。为确保杂交的特异性，宜严格选择标记探针以确保它不会与非特异性核酸序列杂交。

在间接标记方法中，采用额外的捕获探针(CP)。一个例子见图3。靶分子通过捕获探针捕获标记探针。各捕获探针中至少一个区段T与靶分子上的某区段互补，另一区段L与标记探针上的某区段互补。此T和L区段通过区段C相连。为在同一靶分子上不同位置结合更多的SGP，需要不同的捕获探针，但标记探针可保持相同。精心选择L序列以确保它基本上不会与细胞中核酸的任何序列发生交叉杂交。在另一实施方式中，捕获探针和标记探针的L部分含有不会与细胞中天然核苷酸杂交的修饰或非天然核苷酸。在另一实施方式中，此L部分和标记探针(或其一部分)甚至不是核酸序列。例如，L可以是能识别信号产生探针的亲和结合力弱的抗体，此时要包括抗原；L可共价偶联于含捕获探针T区段的寡核苷酸。对于二个毗邻的捕获探针，其T区段任选与靶分子杂交，同时二个低结合亲和力抗体与标记探针上的抗原结合，产生抗原的强亲和力结合。捕获和标记探针对感兴趣靶基因是特异性的。多个捕获探针(探针组)可结合同一感兴趣靶基因，从而以较高的检测灵敏度结合更多信号产生粒子。此时，同一靶基因的探针组具有相同的标记探针。

虽然本发明技术中可采用上述二种方法，但优选间接法，因为它能使标记探针独立于靶基因，进一步描述表明其特异性和灵敏度更好。

在图4显示的间接捕获实施方式中，二个毗邻的捕获探针组成靶向感兴趣基因的探针。设计的T₁和T₂与靶核酸上二个独特和毗邻区段互补。相同或不同的L₁和L₂与标记探针上二个毗邻区段互补。设计其结合区段T、L或二者，使标记探针与靶基因之间的连接不稳定，当只有一个捕获探针原位杂交时在杂交温度下易于松脱。这种设计应具有预计的特异性，因为只有当二个独立的捕获探针共同识别该靶基因和结合毗邻序列或在非常靠近靶基因时，产生信号的标记探针才能结合感兴趣的靶基因。在其它实施方式中，二个捕获探针T区段的解链温度T_m显著高于杂交温度，而L区段的T_m低于杂交温度。结果，如果只存在一种捕获探针，杂交期间T区段与靶分子的结合牢固而稳定，但L区段与标记探针的结合弱而不稳定。然而，如果存在二种捕获探针，杂交期间L₁和L₂的组合在杂交期间保持标记探针牢固和稳定结合。在另一实施方式中，T区段的T_m低于杂交温度而L区段的T_m大大高于杂交温度。以同样的方式，只有当二种捕获探针以协同方式与靶分子杂交时，标记探针与靶分子之间的连接经受杂交过程。

在另一实施方式中，细胞中需要采用三种或更多种靶核酸特异性、毗邻的捕获探针来稳定捕获一种标记探针(图5)。如上所述探针的基础设计相同，但捕获一个产生信号的探针的特异性甚至比采用二种毗邻探针时更高，因为现在需要有三个独立探针结合于同一个感兴趣靶分子中的毗邻部位来产生信号。

多重复合(检测)

如图6所示，为进行一种以上靶基因的多重检测，各靶基因必须与不同的捕获和标记探针特异性结合。此外，产生信号的粒子(标记)结合标记探针后应为各靶基因提供独特的不同信号，可用检测仪器读取。在直接标记方法中(如图6分图A)，可能更难找到具有最低交叉杂交的合适探针，因为各标记探针必须能牢固结合靶基因又必须与系统中任何其它核酸分子不发生交叉杂交。为使本发明方法提供最佳结果，明智地是设计的标记探针靶结合部分基本上不会与非特异性序列交叉杂交。在间接标记方法中(图6分图B)，由于独特的多种捕获探针设计，即使有一个捕获探针结合非特异性靶分子，也不会导致标记探针非特异性结合该靶分子，因而试验的特异性得到大大提高。因此图4和图5说明的捕获探针设计在某些多重复合试验应用中通常是优选的。在一类实施方式中，结合于不同靶基因的信号产生粒子是具有独特发射光谱的不同荧光分子。

能够同时检测多于一个参数的本发明技术可用于检测大异质细胞群中的罕见细胞。如上所述，CTC的浓度范围估计是每10⁶－10⁷个正常血细胞一个肿瘤细胞。另一方面，现有的FACS免疫试验中，细胞的随机染料凝聚可导致每一万个细胞中有一个假阳性细胞计数。因此由于此种不可接受的高假阳性率，这种试验不能用于CTC检测。采用本发明技术可精细地解决此问题。在一具体实施方式中，利用大于一种的肿瘤基因表达作为多重检测的靶点。只有表达所有这些靶基因的细胞才计数为肿瘤细胞。以此方式，可显著降低CTC检测的假阳性率。例如，由于细胞的染料聚集具有随机性，如果用单色检测的假阳性率为10^-4，那么二色和三色检测的假阳性率可分别低至10^-8或10^-12。在靶基因相对表达水平已知的情况下，可用本文所述的多重检测方法测定这些相对水平并利用此信息进一步降低假阳性率。

在另一实施方式中，如图7分图A说明，使大于一个的信号产生粒子与同一靶核酸相连。这些粒子可在检测仪器中产生独特信号。通过设计结合靶基因的各类型粒子的数目，预先确定这些信号的相对强度。在探针设计中可通过如以下章节中所述的改变探针组的数目或采用不同的信号放大方法，来控制靶分子上的信号产生粒子的数目。只有当检测仪器检测到这些粒子的相对信号强度等于该预定值时才鉴定为罕见细胞。此实施方式可用于没有充分适合的标志或它们在特定类型罕见细胞中的表达水平未知时的情况。在还有一实施方式中，如图7分图B所示，同一组信号产生粒子结合多于一种的靶分子。对所有选择的靶分子可控制粒子组发出的相对信号强度使其相同。当所鉴定的罕见细胞存在任何一种靶分子的情况下可采用此实施方式。在还有另一实施方式中，如图7分图C所示，各靶分子含有与其结合的一组信号产生粒子，但此粒子组在靶分子与靶分子之间不相同而可区别。

多种感兴趣靶核酸的检测可用于定量测定一种靶分子。由于样品和实验条件不同，细胞中特定靶分子的丰度通常不能通过检测与靶分子结合的信号水平来精确测定。然而，可将感兴趣基因的信号按参比/管家基因的信号标准化来精确测定。参比/管家基因的定义为细胞中通常总是存在和表达的基因。参比/管家基因的表达一般是组成性表达，在不同生物条件下不易变化。通常认为18S、28S、GAPD、ACTS、PPIB等可作为参比或管家基因，它们已用于标准化不同样品和/或在不同试验条件下产生的基因表达数据。

在另一实施方式中，可设计不与任何捕获探针或靶分子特异性结合的特殊标记探针组。可利用与此标记探针相关的信号来确定单个细胞中杂交信号的背景。如此可先减去背景杂交信号，然后按减去背景的参比/管家基因杂交信号标准化，来定量测定特定靶分子的丰度。

在还有一实施方式中，可同时检测细胞中两种或多种感兴趣的染色体DNA序列。检测细胞中多种DNA序列时，这些DNA序列的标记探针相互不同，它们之间不会发生交叉杂交，在采用协同间接捕获的实施方式中，由于设计方案，即使有一个探针结合了非特异性DNA序列，也不会导致产生信号的探针被该非特异性DNA序列捕获。

在还有一实施方式中，对感兴趣的多种染色体DNA序列的检测能够定量分析单个细胞中的基因扩增、基因缺失或基因转座。这可通过将感兴趣基因的信号按参比基因的信号标准化而实现。将感兴趣特定细胞中感兴趣基因与参比基因的信号比与参比细胞中的信号比作比较。参比基因定义为能在基因组DNA中稳定保持其拷贝数的基因。参比细胞定义为含有正常拷贝数感兴趣基因与参比基因的细胞。如果感兴趣细胞中的信号比高于参比细胞，即测到基因扩增。如果感兴趣细胞中的信号比低于参比细胞，即测到基因缺失。

信号扩增和标记

图2和图6分图A所述的直接标记法的灵敏度有限，因为每个标记探针只结合了较少数目的信号产生粒子(标记)。一种提高灵敏度的方法是采用体外转录的掺入了信号产生粒子但特异性不受影响的RNA。

“间接标记”方法不仅能如上所述改进特异性还能用于提高检测的灵敏度。此方法中，标记探针与放大核酸分子杂交或连接，因而提供了标记探针更多的结合位点。放大核酸的结构和结合方法可有许多形式。图8分图A-D显示了一些扩增方案作为示范性例子。分图A中，多个单标记的标记探针结合于放大核酸。分图B中，多个多标记的标记探针结合于放大核酸。分图C中，多个单标记的标记探针结合于放大核酸，并且多个拷贝的放大核酸结合于辅放大核酸。在一具体实施方式中，放大核酸是一种分支或多分支的DNA分子(分图D)。宜精心选择标记探针的序列使其基本上不会与细胞中任何内源核酸发生交叉杂交。事实上，标记探针不一定是天然聚苷核酸分子。例如可化学修饰该分子，使之含有非天然核苷酸，从而确保该标记探针只与放大核酸杂交而不与细胞中天然产生的核酸分子杂交。在多重试验中，设计独特的放大核酸和标记探针用于不同的靶分子。

在一实施方式中，如图9所示说明，环形聚苷核酸分子被捕获探针组捕获。该环形聚苷核酸中，一条序列或同一序列上大于一个重复区与标记探针结合(图9分图A)。在该试验的信号扩增步骤中，进行滚动循环(Larsson等，2004)。此扩增产生了结合于捕获探针的长链聚苷核酸分子(图9分图B)。沿此链有多个重复序列，标记探针可通过杂交与之结合(图9分图C)。在多重试验中，设计和采用独特的捕获探针、滚动循环和标记探针。

在一实施方式中，可用PCR扩增产生标记信号探针的一部分。在另一实施方式中，可用PCR同时扩增多种产生标记信号探针的各部分。

虽然已用特异性捕获方法(用捕获探针间接标记)说明了图8和图9的标记和放大方案，但重要的是应注意，可联用先前章节中描述的其它探针捕获方法、直接或间接方法，和这些章节中描述的标记和放大方案。上述捕获探针、标记方法和放大核酸构型互相独立，可在具体试验设计中以任何联合方式应用。

杂交条件

杂交溶液的组成可能影响杂交过程的效率。杂交通常依赖于寡核苷酸在其解链点(T_m)以下温度能否与互补mRNA链退火。T_m值是存在的寡核苷酸双链体有一半是单链形式时的温度。影响寡核苷酸探针与靶核酸杂交的因素包括：温度、pH、单价阳离子浓度、有机溶剂的存在等。典型的杂交溶液可包含某些或所有的以下试剂：如硫酸葡聚糖、甲酰胺、DTT(二硫苏糖醇)、SSC(NaCl加柠檬酸钠)、EDTA等。也可加入其它组分来减少寡苷核酸探针非特异结合的机会，包括例如，单链DNA、作为运载体RNA的tRNA、聚A、Denhardt溶液等。示范性的杂交条件可在专业文献中找到和/或如本领域所知凭经验确定。参见公开的美国专利申请2002/0172950、Player等(2001)J.Histochem.Cytochem.49:603-611和Kenny等(2002)J HistochemCytochem.50:1219-1227，它们还描述了固定、渗透处理和洗涤。

任选进行额外的预杂交以降低背景染色。预杂交包括用含有杂交溶液除探针外的所有组分的溶液培育固定的组织或细胞。

洗涤

标记步骤后，宜洗涤细胞除去未结合的探针或松弛结合于不完美匹配序列的探针。开始时通常用低严谨洗涤缓冲液，如2X SSC+1Mm(1X SSC是0.15MNaCl,0.015M柠檬酸钠)洗涤，然后用较高严谨性洗涤缓冲液如0.2XSSC+1mM EDTA或0.1X SSC+1mM EDTA洗涤。

洗涤对降低该试验的背景噪声、提高定量测定时的信噪比至关重要。已建立的洗涤方法可参见如Bauman和bentvalzen(1988)“原位杂交荧光流式细胞术检测悬浮细胞中的核糖体RNA(Flow cytometric detection of ribosomal RNA insuspended cells by fluorescent in situ hybridization)”Cytometry9(6):517-24，及Yu等(1992)“流式细胞术灵敏检测单个细胞中的RNA(Sensitive detection of RNAsin single cells by flow cytometry)”Nucleic Acids Res.20(1):83-8。

进行合适轮次的循环洗涤，即一轮或多轮洗涤。每轮通常包括以下步骤：混合细胞与合适的缓冲液、洗脱与细胞非特异性结合的物质、将缓冲液与废物一起除去。每个步骤的更详细说明见下文。

混合细胞与洗涤缓冲液：在某些试验中，将细胞固定在基材表面然后洗涤。此种例子中，将洗涤缓冲液与基材表面混合在一起。在许多其它实施方式中，自由漂浮洗涤细胞。将洗涤缓冲液加入细胞沉淀中或悬浮细胞液中。

洗脱与细胞非特异性结合的物质：在细胞经渗透处理和探针杂交后，可采用许多技术来降低非特异性结合以促进非特异性结合的探针脱离细胞溶入洗涤缓冲液中。这些方法包括提高温度恰好至略低于特异性结合探针的解链温度，和采用磁力或机械搅拌棒搅拌，或用声波或超声波搅拌。也可用摇动或旋涡运动振摇容器搅拌混合液。

缓冲液与废物一起除去：可采用任何方便的方法分离或除去洗涤缓冲液和样品中除靶细胞以外的废物。例如，通过离心将漂浮细胞或结合细胞的基材与缓冲液和废物分开。离心后细胞或基材形成位于容器底部的沉淀。倒掉上部的缓冲液和废物。

作为另一实施例，任选将此混合液移入底部用多孔膜制作(或构成)的容器中。所选的膜孔径小于靶细胞或结合细胞基材的大小，但足够大到能允许碎片和其它废物通过。为了除去废物，任选调节气压或液压使容器内压高于外压，驱使缓冲液和废物流出容器同时依靠膜将靶细胞保留在容器内。也可例如通过压力、重力或离心力使缓冲液和废物滤过膜而除去。

还有另一实施例，通过细胞固定或利用表面蛋白的亲和结合使细胞固定在大的基材如载玻片或容器底部的表面。利用真空倒掉上部或倒置容器，直接除去缓冲液和废物。还有另一实施例，任选通过化学固定或表面蛋白亲和结合将细胞固定在磁珠上。然后通过安置在容器上的磁场吸力将磁珠固定在容器中。然后直接倒去缓冲液和废物而不会丢失细胞，上述实施例已描述了相同的方法。还有一实施例，用电学方法将细胞中的非特异性结合探针诱导移出细胞外同时保留特异性结合的探针。

如上所述，进行上述三步骤完成一轮洗涤，进行一轮或多轮洗涤完成洗涤。在不同的洗涤轮次中可采用不同的洗涤缓冲液、洗脱或废物去除技术。

检测

本发明技术中，在洗涤除去非特异性结合探针和其它废物后，可鉴定出大异质细胞群中与细胞中靶核酸特异性杂交的含有信号产生粒子(标记)的靶细胞。可采用基本上任何方便的检测和鉴定方法。

在一实施方式中，如上所述在标记和洗涤步骤后将悬浮细胞固定在固体基材上。用显微镜仪器检测。具体说，当探针产生的信号是化学发光时，可用带CCD照相机的摄像显微镜或扫描显微镜将光信号转变为数字信息。当探针携带的标记可发射荧光信号时，可用荧光成像或扫描显微镜检测。此外，由于靶细胞通常是大细胞群中的罕见细胞，可采用自动寻找算法来自动鉴定和计数群体中的靶细胞数。可用任何一种技术将悬浮细胞固定在固体表面。在一实施方式中，采用具有大的平底表面的容器装悬浮细胞液。离心该容器迫使细胞沉降到底部。与细胞溶液浓度相比，如果容器底表面足够大，细胞不会在底表面重叠。大多数情况下，即使细胞重叠，它们也不会是靶细胞，因为在大细胞群中它们很罕见。在另一实施方式中，将悬浮细胞离心沉降在平表面上。除去液体后，依靠表面张力将细胞固定在表面上。

在本发明的优选实施方式中，细胞漂浮(悬浮液)或固定在漂浮的基材如珠上，故可在溶液中有效进行检测之前的步骤，如杂交和洗涤。检测大漂浮细胞群中罕见细胞有几种方法。优选的方法是采用流式细胞术为基础的检测系统，其中漂浮细胞或基材成线流一个接一个地通过激发光和检测光前面。通过与细胞中靶核酸特异性结合的探针发出的光信号鉴定靶细胞。光信号可以是例如特定波长的发射光或荧光。

优点

总之，本发明QMAGEX技术具有许多能检测单个细胞中的多种核酸和检测靶细胞的独特组分。这些组分包括：

利用细胞内固定的核酸作为鉴定CTC(或其它细胞类型)的标志。与蛋白标志相比，核酸更稳定并可广泛获得，检测时可提供更佳的信噪比。此外，此检测技术容易应用于各种肿瘤，或其它细胞鉴定或分类方面的应用。另一优点是，可定量测定单个细胞而不是混合细胞群的核酸分子水平。此特征确保了作为研究生物系统中关键功能单元的细胞的保存。在涉及混合细胞群的许多应用中，此特点在提取真实有用的试验信息上非常有用(如根据检测细胞中一组核酸标志的存在或表达水平来鉴定CTC；细胞中其它核酸的存在或拷贝数可提供用于诊断、预测结局等的额外信息)。

在最终检测前的所有试验步骤中任选保持细胞悬浮或保持为可重悬浮的细胞沉淀。此特点显著改进了试验的动力学、简化了程序、提高了重现性和保持细胞处在最佳相关功能状态。另一方面，本发明的一些重要方面内容，包括探针的选择和设计、多重复合、扩增和标记，可直接用于原位杂交技术来检测和计数组织样品中的罕见细胞。

任选采用独特的间接捕获探针设计方法来获得罕见靶点的杂交特异性，使检测时信噪比更佳。

所述试验能同时检测多种靶基因或同一基因的多种参数。此特点在一些方法中有助于检测罕见细胞如CTC。首先，可降低假阳性率，这在癌症诊断中是必需的。其次，可提供与检测肿瘤相关的更多临床重要信息，包括原发癌症的发展阶段和/或原始类型和来源。

本发明技术结合信号放大过程，从而提高了检测灵敏度，并能以高置信度检测大量正常细胞中的罕见细胞。

可在FACS或流式细胞计数仪或显微镜平台上进行检测。前者可完全自动化，提供快速检测和选拣出所鉴定的细胞供进一步研究而具有额外的好处。后者显微镜平台的优点是更容易获得并且能通过形态学最终手动操作进行鉴定。

系统

一方面，本发明提供进行这类新型试验用的系统和装置。所述装置或系统包括一种或多个(优选所有)至少以下的步骤。

液体处理：所述任选包括加入试剂的子系统，如果试验需要倒掉样品容器中的液体(如去除或固定、丢弃或重新使用容器如样品试管、多孔板等)。所述子系统可以是基于移液器类型的液体转移系统，采用装有一次性枪头的各个泵处理不同的液体。作为替代实施例，各试剂可具有自己专用的流体通道。

混合和搅拌：所述装置任选包括混合样品液中不同试剂和促进非特异性结合物质从细胞脱去的仪器。该仪器可具有诱导样品容器保持件涡旋或摇动的机构，或可向容器施加声波或超声波。或者，可将磁力搅拌子放入样品容器中，用安置在容器保持件中的元件所产生旋转磁场驱动搅拌。

温度控制：通过在样品容器室中安置加热器和温度探头，将样品的温度控制在高于室温水平。可用控温仪将温度水平控制在高于或低于室温。温度控制是重要的，例如在试验中对于杂交和洗涤步骤的性能至关重要。

分离细胞与废液：所述装置任选包括可除去样品混合物中的废液同时保留细胞供进一步分析的仪器。此仪器可包括底部为多孔膜的样品容器。膜的孔径小于细胞但大于混合液中的废物。膜下面的空间密封并连接真空泵。作为另一实施例，也可密封膜上面的空间并连接正压源。在一不同的实施方式中，所述仪器包括离心机。将具有底部膜的容器装入离心机，离心迫使废液滤过膜而排出。此仪器的另一种结构中，样品容器底部为固体。细胞经离心后沉积在底部，用上述液体处理子系统从顶部倒去废液。

此仪器也可执行制备用于最终读数的样品的任务。在用显微镜读数的实施方式中，细胞通常沉积和粘附在平表面上。如果容器为平底，仪器中的离心机可执行此工作。另一方法是，平板在其平面内旋转，此系统可利用液体处理仪将含细胞的液滴滴在旋转平板的中心。使细胞在平板表面均匀分布。

检测：可将本发明的检测组件与系统的其余部分集成安装在一起，或者可与上述子系统的其余部件分开安装。在读数仪是显微镜的实施方式中，可以是摄像或扫描显微镜。在另一实施方式中，该仪器可以是对不同探头具有多种波长激发光和读数波长的荧光成像或扫描显微镜。在一优选实施方式中，读数仪是流式细胞计数仪。优选细胞计数仪，因为它可以多种波长光直接读取液体中的漂浮细胞数从而大大提高了试验效率。

所有上述组件可集成安装在一个仪器中。或者，这些组件可分别装在作为一个系统一起工作进行试验的多个仪器中。图10说明此类结构仪器的一种具体示范性实施方式。在此特定结构中，样品装在底部为膜的容器(样品试管)中。利用泵通过多进口阀门从试管顶部加入试剂。抽真空从底部除去废液。放样品容器的保持件固定在搅动平台上，用温度监控仪控制样品周围空间(温度控制区)。液体处理组件将试剂(固定和渗透试剂、杂交缓冲液、探针组和洗涤缓冲液)加到样品试管中，将废液移入废液容器，并将细胞送入流式细胞仪进行检测。

一类实施方式提供的系统包括：接受样品容器的保持件；能维持样品容器在所选温度(例如，使用者为该系统选择的温度或当前温度，对于试验过程中的不同步骤任选不同的温度)的温度控制仪；与样品容器流体相连并被构造成可在样品容器中加入液体和/或去除液体的液体处理组件；能混合(搅拌或混合)样品诸组分的搅拌组件；以及能检测单细胞中一种或多种信号的检测仪，其中所述检测仪任选与样品容器流体相连。多个液体贮器(例如用于贮存固定或渗透处理试剂、洗涤缓冲液、探针组和/或废液)之一任选与样品容器流体相连。

本发明的系统任选包括计算机。此计算机装有用于接受用户指令的适当软件，以用户输入一组参数字段形式如GUI，或预先设置程序的指令形式，例如为各种不同特定操作预先设置的程序指令。软件任选地将这些指定转换为适当的语言，控制该系统诸组件的运行(如控制液体处理组件和/或激光仪)。此计算机也可接受系统其它组件如检测仪传来的数据并能解释这些数据，将其以人类可阅读形式提供给用户，或利用这些数据按照用户的编程进行下一步操作。

靶核酸

如上所述，靶核酸基本上可以是细胞中所要检测的任何核酸。显然靶核酸的选择取决于所需的应用，如表达的分析、疾病诊断、分期或预后、靶基因的鉴定或验证、通路分析、药物筛选、药效研究、或许多其它应用。本领域已报导了大量合适的靶基因，更多的可用标准技术鉴定。

作为一个例子，对于CTC检测已知有各种合适的靶核酸。例如，检测CTC的多组标志可包括一种或多种以下标志：表皮细胞特异性标志(如CK19、Mucl、EpCAM)、用作阴性选择的血细胞特异性标志(如CD45)、肿瘤来源特异性标志(如前列腺癌的PSA、PSMA、HPN和乳腺癌的mam、mamB、her-2)、增殖能力特异性标志(如Ki-67、CEA、CA15-3)、凋亡标志(如BCL-2、BCL-XL)和其它转移、遗传和后成论变化标志。作为另一实施例，靶基因可包括HOXB13和IL17BRmRNA，已证明原发肿瘤中它们的比率可预示用三苯氧胺治疗的乳腺癌病人的临床结局(MA等，(2004)“二种基因表达的比率可预示用三苯拟胺治疗的癌病人临床结局(A two-gene expression ratio predicts clinical outcome inbreast cancer patients treated with tamoxifen)”，Cancer Cell 5(6)：607-16和Goetz等，2006“Homeobox13与白介素-17B受体二种基因表达的比率可预测接受辅佐剂三苯氧胺治疗妇女的复发和存活(A Two-Gene Expression Ratio ofHomeobox 13and Interleukin-17B Receptor for Prediction of Recurrence andSurvival in Women Receiving Adjuvant Tamoxifen)”Clin Cancer Res 12：2080-2087)。也参见例如Gewanter，RM，AE Katz等，(2003)“PSA的RT-PCR检测可作为放疗治疗临床局部前列腺癌病人的预后因子(RT-PCR for PSA as aprognostic factor for patients with clinically localized prostate cancer treated withradiotherapy)”Urology61(5)：9676-71；Giatromanolaki等，2004“评估乳腺癌病人的高度外周血管生成和弥散可预测对辅佐化疗的抗性和早期复发(Assessment of highly angiogenic and disseminated in the peripheral blood diseasein breast cancer patients predicts for resistance to adjuvant chemotherapy and earlyrelapse)”Int J Cancer 108(4):620-7；Halabi等,(2003)“转移性前列腺癌前列腺特异抗原的逆转录酶链反应的预后意义：CALGB9583内的嵌套式研究(Prognosticsignificance of reverse transcriptase polymerase chain reaction for prostate-specificantigen in metastatic prostate cancer:a nested study within CALGB 9583)”J ClinOncol 21(3):490-5；Hardingham等,(2000)“结直肠癌病人和良性大肠病病人血源表皮细胞的分子检测(Molecular detection of blood-borne epithelial cells incolorectal cancer patients and in patients with benign bowel disease)”Int J Cancer89(1):8-13；Hayer等,(2002)“监测晚期乳腺癌病人循环血表皮细胞的HER-2表达(Monitoring expression of HER-2on circulating epithelial cells in patientswith advanced breast cancer)”Int J Oncol 21(5):1111-7；Jotsuka,等(2004)"用RT-PCR for CEA mRNA检测到循环性肿瘤细胞持续存在的证据可预测早期复发:淋巴结转移阴性乳腺癌的前瞻性研究(Persistent evidence of circulatingtumor cells detected by means of RT-PCR for CEA mRNA predicts early relapse:aprospective study in node-negative breast cancer)"Surgery 135(4):419-26；Allen-Mersh T等.(2003)"RT-PCR检测原发肿瘤切除后24小时循环中的癌细胞可预测结直肠癌复发(Colorectal cancer recurrence is predicted by RT-PCRdetection of circulating cancer cells at 24hours after primary excision)"ASCO会议,芝加哥,2003年5月；Shariat等(2003)"前列腺特异性抗原的术后早期外周血逆转录PCR试验结果与放疗前列腺切除术后病人的前列腺癌发展相关联(Early postoperative peripheral blood reverse transcription PCR assay forprostate-specific antigen is associated with prostate cancer progression in patientsundergoing radical prostatectomy)"Cancer Res 63(18):5874-8；Smith等.(2000)"对转移性乳腺癌病人全身治疗的循环性肿瘤细胞应答:定量聚合酶链反应和免疫细胞化学技术的比较(Response of circulating tumor cells to systemic therapy inpatients with metastatic breast cancer:comparison of quantitative polymerase chainreaction and immunocytochemical techniques)"J CHn Oncol 18(7):1432-9；Stathopoulou等.(2002)"乳腺癌手术病人细胞角蛋白-19-阳性细胞的分子学检测:它们的预后意义评价(Molecular detection of cytokeratin-19-positive cells inthe peripheral blood of patients with operable breast cancer:evaluation of theirprognostic significance)"J Clin Oncol 20(16):3404～12；和Xenidis等.(2003)"乳腺癌手术病人辅佐化疗完成后的外周血循环角蛋白-19mRNA-阳性细胞(Peripheral blood circulating cytokeratin-19mRNA-positive cells after thecompletion of adjuvant chemotherapy in patients with operable breast cancer)"AnnOncol 14(6):849-55。

本文方法中要检测的一类优选靶核酸是涉及癌症的靶核酸。可用本发明方法检测任何与癌症相关的核酸，如编码过度表达或突变的多肽生长因子(如sis)、过度表达或突变的生长因子受体(如erb-B 1)、过度表达或突变的信号转导蛋白如G-蛋白(如Ras)、或非受体酪氨酸激酶(如abl)、或过度表达或突变的调节蛋白(如myc、myb、jun、fos等)等等的核酸。一般而言，癌症常常可牵连到信号转导分子和相应的原癌基因产物如编码Mos、Rsa、Raf和Met的核酸；以及转录活化与抑制蛋白，如p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel和/或其核受体。特别相关的P53俗称细胞的“分子警察”，所有已知癌症中约50％可在p53中找到一个或多个遗传病损。

一类与癌症相关的基因作为讨论的例子，已详细报导了许多激素的核受体，发现这些受体的作用机制改变而赋予了致癌活性。例如，在Yen(2001)"甲状腺激素作用的生理和分子基础(Physiological and Molecular Basis of ThyroidHormone Action)"Physiological Reviews 81(3):1097-1142和其引用的参考文献中回顾了甲状腺激素作用的生理和分子基础。已知且特征鉴定充分的核受体包括糖皮质激素受体(GR)、雄激素受体(AR)、盐皮质激素受体(MR)、孕激素受体(PR)、雌激素受体(ER)、甲状腺激素受体(TR)、维生素D受体(VDR)、视黄醇受体(RAR和RXR)及结合类花生酸的过氧化物酶体增殖剂活化受体(PPAR)。所谓的“孤儿核受体”也是核受体超家族的一部分，它们在结构上与典型的核受体如类固醇和甲状腺受体同源。可用本发明方法检测编码这些受体中任一种或其致癌形式的核酸。目前可得到的所有治疗药物中约40％是核受体和/或其致癌形式的激动剂或拮抗剂，强调了这些受体(和编码它们的核酸)作为用本发明方法分析靶点的相对重要性。

一类示范性靶核酸是用于诊断粪便样品结肠癌的靶核酸。结肠癌是常见病，可散发或遗传。对各种形式的结肠癌分子学基础已有某种详细了解。一般而言，种系突变是遗传性结肠癌综合征的基础，而体细胞突变的累积是散发性结肠癌的基础。在德系犹太人中，早已认为多态性突变可能引起家族性结肠癌。结肠癌病因学已报导至少有三类不同基因：原癌基因、抑制基因和错配修复基因发生了突变。一个例子是编码DCC(与纤连蛋白同源的细胞粘附分子，结肠癌中缺失)的核酸。其它形式的结肠癌是常染色体显性基因hMSH2含有病损。家族性腺瘤息肉病是另一类型的结肠癌，其染色体成员5的MCC基因座中含有病损。关于结肠癌的其它细节可见Calvert等.(2002)"结肠直肠癌的遗传学(The Genetics of Colorectal Cancer)"Annals of Internal Medicine 137(7):603-612及其引用的参考文献。关于可利用粪便检测各种结肠癌和结肠癌标志可见例如Boland(2002)"结直肠癌筛检的进展:结直肠癌粪便DNA检测的分子基础:供临床医师引用(Advances in Colorectal Cancer Screening:Molecular Basis forStool-Based DNA Tests for Colorectal Cancer:A Primer for Clinicans)"Reviews in Gastroenterological Disorders第2卷,增刊1及其中引用的参考文献。关于其它癌症，可利用其它与癌症相关的各种基因，如Ras和p53的突变作为癌症诊断的指标。

宫颈癌是要检测的另一种示范性目标，如检测获自阴道分泌物样品中这类癌症的核酸进行诊断。乳头瘤病毒(如人乳头瘤病毒)和二种原癌基因E6和E7可引起宫颈癌。E6可结合而除去p53，E7可结合而除去PRB。丢失p53和没有PRB调节导致E2F/DP生长因子的作用失控是引起宫颈癌的一种机制。

可用本发明方法检测的另一示范性目标是检测眼泪样品中的视网膜母细胞瘤细胞。视网膜母细胞瘤是一种眼睛肿瘤，因PRB基因失活所致。已发现含有突变PRB基因的病人可遗传传播此癌(当然体细胞突变也可引起非遗传形式的癌症)。

可用本发明方法检测I型神经纤维瘤。此瘤中的NF1基因失活，从而激活ras原癌基因的GTP酶活性。如果NF1丢失，ras过度活化将引起神经肿瘤。可用本发明方法检测中枢神经系统(CSF)中或组织样品中的I型神经纤维瘤。

许多其它类型的癌症是已知的并且可用本发明方法检测相关基因病损而确诊。通过检测相应病损来确诊的癌症包括：淋巴癌、血癌、胃癌、肠癌、结肠癌、睾丸癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、皮肤癌、和基本上所有已知存在基因病损的其它癌症。此方面内容的综述可参见“人癌症的分子基础(The Molecular Basis of Human Cancer)”Coleman和Tsongalis编，Humana Press；ISBN:0896036340；第1版(2001年8月)。

类似地，可用本发明方法检测病原和传染微生物的核酸，如传染性真菌，如曲霉菌或念珠菌属；细菌，特别是作为病原细菌模型的大肠杆菌(其某些菌株为致病性)，以及医学上重要的细菌属，如葡萄球菌(如金黄葡萄球菌)或链球菌(如肺炎链球菌)；原虫，如孢子虫(如疟原虫)、根足虫(如阿米巴原虫)和鞭毛虫(锥虫、利什曼虫、滴虫、贾第鞭毛虫等)；病毒，如(+)RNA病毒(例子包括痘病毒如牛痘病毒、细小病毒如髓灰病毒、披膜病毒如风诊病毒、黄病毒如丙肝病毒、和冠状病毒)；(－)RNA病毒(如弹状病毒如VSV；副粘病毒如RSV；正粘病毒如流感病毒；本雅病毒和沙粒病毒)、双链DNA病毒(如呼肠狐病毒)、RNA->DNA病毒即逆转录病毒如HIV和HTLV，以及某些DNA->RNA病毒如乙肝病毒。

如上所述，可用本发明方法检测染色体水平的基因扩增和缺失，如可检测基因表达水平的改变或异常。可用本发明方法检测的一类优选靶基因包括原癌基因和肿瘤抑制基因，检测其扩增或缺失。示范性的靶基因包括但不限于：整合素(如缺失)、受体酪氨酸激酶(RTK，如其扩增、点突变、转位或表达增加)、NF1(如缺失或点突变)、Akt(如其扩增、点突变、或表达增加)、PTEN(如缺失、点突变)、MDM2(如扩增)、SOX(如扩增)、RAR(如扩增)、CDK2(如扩增、或表达增加)、细胞周期蛋白D(如扩增或转位)、细胞周期蛋白E(如扩增)、Aurora A(如扩增或表达增加)、p53(如缺失或点突变)、NBS1(如缺失或点突变)、Gli(如扩增或转位)、Myc(如扩增或点突变)、HPV-E7(如病毒感染)和HPV-E6(如病毒感染)的基因。

在采用靶核酸作为参比核酸的实施方式中，本领域类似报导了合适的参比核酸或者可以确定。例如，本领域已知在不同肿瘤细胞中维持稳定拷贝数的各种基因。其转录物可作为基因表达分析参比品的管家基因包括例如：18S rRNA、28S rRNA、GAPD、ACTB和PPIB基因。可采纳本领域已有描述的其它类似核酸用于实施本发明。

标记

可采纳本领域熟知各种各样的标记用于实施本发明。例如，已报导的冷光标记、散射光标记(如胶体金颗粒)。参见例如Csaki等.(2002)"金纳米颗粒用作DNA诊断的新型标记(Gold nanoparticles as novel label for DNAdiagnostics)"Expert Rev MoI Diagn 2:187-93。

作为另一实施例，本领域熟知许多荧光标记，包括但不限于：疏水性荧光团(如藻红素、罗丹明、Alexa Fluor488和荧光黄)和荧光量子斑点。各种不同波长发射荧光的描述(包括可促进同时发射和检测多种标记荧光的串联荧光团偶联物)可参见例如“手册:荧光探针和标记技术指南(The Handbook:AGuide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies)”,第10版或Invitrogen(英杰公司)的(2006)Web版(可从万维网站probes.invitrogen.com/handbook下载)。对于采用荧光量子斑点作为生物分子标记可参见例如Dubertret等.(2002)Science 298:1759；Nature Biotechnology(2003)21:41-46；和NatureBiotechnology(2003)21:47-51

可用本领域已建立的技术在合成过程中或合成后反应中将标记掺入分子如多核苷酸中。例如，装有带各种荧光团的荧光标记多核苷酸试剂盒可购自Molecular Probes公司((www.)molecularprobes.com)，也可商品购得核酸合成中使用的荧光亚磷酰胺。类似地，基本上可用本领域已知的方法检测标记物发出的信号(吸收和/或标记物发射的荧光。同样熟知和可购买到检测标记的仪器，如扫描仪、显微镜、流式细胞计数仪等。例如，流式细胞计数仪可购自Becton-Dickinson((www.)bd.com)和BeckmanCoulter((www.)beckman.com)。

分子生物学技术

实施本发明时任选采用分子生物学、微生物学和重组DNA技术中的许多常规技术。这些技术是熟知的，在例如以下文献中有解释：Berger和Kimmel,分子克隆技术指南,酶学方法第152卷Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Sambrook等.,“分子克隆–实验室手册”(第3版),1-3卷,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,New York,2000和“分子生物学当前方法”(Current Protocols in Molecular Biology)F.M.Ausubel等编.,CurrentProtocols,格林出版联合公司(Greene Publishing Associates Inc.)和强生威利父子公司(John Wiley&Sons Inc.)联合出版(2006年增补本)。其它有用的参考文献例如有：“细胞的分离和培养(如核酸亚序列的分离)”包括Freshney(1994)的“动物细胞的培养，基本技术手册”(Culture of Animal Cells,a Manual of BasicTechnique)第3版,Wiley-Liss,New York及其中引用的参考文献；Payne等.(1992)“在液体系统中培养植物细胞和组织”(Plant Cell and Tissue Culture inLiquid Systems)强生威利父子公司，纽约,NY；Gamborg和Phillips编(1995)“植物细胞、组织和器官的培养：基本方法”(Plant Cell,Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods)Springer实验室手册,Springer-Verlag(BerlinHeidelberg New York)以及Atlas和Parks编“微生物培养基手册”(TheHandbook of Microbiological Media)(1993)CRC Press,Boca Raton,FL。

制备多核苷酸

以上参考文献中描述了制备核酸的方法(如细胞体外扩增、纯化或化学合成)、操纵核酸的方法(如限制性酶消化、连接等)以及用于操纵和制备核酸的各种载体、细胞系等。此外在USPN 5,635,352、USPN 5,124,246、USPN5,710,264和USPN 5,849,481及以上提及的其它参考文献中描述了制备分支多核苷酸的方法(如扩增多聚体)。

此外，可从各种商品来源，如中部认证试剂公司(Midland Certified ReagentCompany)((www.)mcrc.com)、美国基因公司(Great American GeneCompany)((www.)genco.com)、表达基因公司(ExpressGen Inc.)((www.)expressgen.com)、前进公司(Qiagen)(oligos.qiagen.com)和许多其它公司定制或按标准定制基本上任何多核苷酸(包括例如标记的或生物素化的多核苷酸)。

可任选在合成时或合成后将标记物、生物素或其它标记分子掺入多核苷酸中。例如，可在化学合成多核苷酸时掺入生物素化亚磷酰胺。或者，可用本领域已知的技术生物素化任何核酸。合适的试剂可从例如穿孔生物技术公司(Pierce Biotechnology)((www.)piercenet.com)购得。类似地，可用荧光标记任何核酸，例如采用从分子探针公司(Molecular Probes,Inc.)((www.)molecularprobes.com)或穿孔生物技术公司((www.)piercenet.com)购得的商品化试剂盒，或在化学合成多核苷酸时掺入荧光标记的亚磷酰胺。

参考文献

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应理解本文描述的实施例和实施方式目的只是为了说明，本领域技术人员可对其提出各种修改和变化，但这些都包括在本申请书的思路和范围内以及所附权利要求书的范围内。

虽然以上已描述了本发明的某些细节，其目的是阐述和使人理解，但本领域技术人员通过阅读此公开内容会明白，可对其形式和细节作出各种修改，但这不脱离本发明的真正范围。例如，可采用上述所有技术和装置的各种组合。本申请书中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其它文件出于所有目的纳入本文作参考，其程度如同各出版物、专利、专利申请和/或其它文件出于所有目的个别单独纳入作参考那样。

Claims (15)

1.一种试剂盒，其包含：

至少一种用于渗透细胞的试剂；

至少一个捕获探针组，其包含两个或多个能与靶核酸序列杂交的捕获探针；

含标记的标记探针，其中所述标记探针能与所述两个或多个捕获探针的组杂交；和

其中每个所述捕获探针包含T区段和L区段，所述T区段能与所述靶核酸序列上的区域互补，所述L区段能与所述标记探针上的区域互补；其中所述捕获探针组中的两个或多个捕获探针的T区段与所述靶核酸序列中的非重叠区域互补，且所述捕获探针组中的两个或多个捕获探针的L区段与所述标记探针的非重叠区域互补。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述标记探针包含：(i)能与所述两个或多个捕获探针的组杂交的标记探针，或(ii)标记探针，与所述标记探针杂交且能与所述两个或多个捕获探针的组杂交的放大核酸，或(iii)标记探针，能与所述标记探针杂交的放大核酸，以及与所述放大核酸杂交且能与所述两个或多个捕获探针的组杂交的辅放大核酸。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述靶核酸包括多个不同的靶核酸；且每个靶核酸具有其关联的标记探针、捕获探针、辅放大核酸和/或放大核酸；且每个标记探针包含标记，其中每个所述标记的信号不可彼此相区别或可以彼此相区别。

4.固定和经渗透处理的细胞的样品，其包含：

a.至少一种含有靶核酸的固定和经渗透处理的细胞，

b.至少一个捕获探针组，其包含两个或多个与所述靶核酸杂交的捕获探针，和

c.标记探针，其与所述两个或多个捕获探针的组杂交，

其中每个所述捕获探针包含T区段和L区段，所述T区段能与所述靶核酸序列上的区域互补，所述L区段能与所述标记探针上的区域互补；其中所述捕获探针组中的两个或多个捕获探针的T区段与所述靶核酸中的非重叠区域互补，且所述组中的两个或多个捕获探针的L区段与所述标记探针的非重叠区域互补。

5.如权利要求4所述的样品，其中所述标记探针包含：(i)能与所述两个或多个捕获探针的组杂交的标记探针，或(ii)标记探针，与所述标记探针杂交且能与所述两个或多个捕获探针的组杂交的放大核酸，或(iii)标记探针，能与所述标记探针杂交的放大核酸，以及与所述放大核酸杂交且能与所述两个或多个捕获探针的组杂交的辅放大核酸。

6.如权利要求4或5所述的样品，其中所述细胞悬浮于溶液中或固定在载玻片上。

7.如权利要求4-6所述的样品，其中所述细胞来自于体液或血液。

8.如权利要求4-7任一项所述的样品，其中所述细胞包含细胞类型的混合物，其中所述混合物包含至少一种特定类型的细胞。

9.如权利要求8所述的样品，其中所述特定类型的细胞与该混合物中所有其它类型细胞的比率低于1:1x10⁴或低于1:1x10⁵。

10.如权利要求4-9任一项所述的样品，其中所述特定类型的细胞是肿瘤细胞，或更具体而言是循环肿瘤细胞或播散肿瘤细胞。

11.组织载玻片，其包含：

a.固定了多种固定和经渗透处理的细胞的载玻片，所述细胞包括至少一种含有靶核酸的固定和经渗透处理的细胞，

b.至少一个捕获探针组，其包含与所述靶核酸杂交的两个或多个捕获探针；和

c.与所述两个或多个捕获探针的组的标记探针，

其中每个所述捕获探针包含T区段和L区段，所述T区段能与所述靶核酸上的区域互补，所述L区段能与所述标记探针上的区域互补；其中所述捕获探针组中的两个或多个捕获探针的T区段与所述靶核酸中的非重叠区域互补，且所述组中的两个或多个捕获探针的L区段与所述标记探针的非重叠区域互补。

12.如权利要求11所述的组织载玻片，其中所述细胞是在来自福尔马林固定和石蜡包埋的组织块的组织切片中。

13.如权利要求11或12所述的组织载玻片，其中所述标记探针包含：(i)能与所述两个或多个捕获探针的组杂交的标记探针，或(ii)标记探针，与所述标记探针杂交且能与所述两个或多个捕获探针的组杂交的放大核酸，或(iii)标记探针，能与所述标记探针杂交的放大核酸，以及与所述放大核酸杂交且能与所述两个或多个捕获探针的组杂交的辅放大核酸。

14.如权利要求11-13任一项所述的组织载玻片，两个或多个不同的捕获探针与该标记探针、放大核酸或辅放大核酸形成的复合物的杂交温度高于每个单独的捕获探针与该标记探针、放大核酸或辅放大核酸之间的复合物的解链温度。

15.如权利要求11-14任一项所述的组织载玻片，其中所述靶核酸包括多个不同的靶核酸；且每个靶核酸具有其关联的标记探针、捕获探针、辅放大核酸和/或放大核酸；且每个标记探针包含标记，其中每个所述标记的信号不可彼此相区别或可以彼此相区别。