CN106536750A

CN106536750A - 确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法及其装置和用途

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Publication number: CN106536750A
Application number: CN201480080645.9A
Authority: CN
Inventors: 吴靓; 李贵波; 杨欢; 吴逵; 侯勇; 徐讯
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2014-08-01
Filing date: 2014-08-01
Publication date: 2017-03-22
Also published as: WO2016015349A1

Abstract

提供了确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法及其装置和用途。其中，确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法包括：(1)在含有核酸的容器中添加荧光标记，并进行实时荧光定量PCR，以便获得所述容器的荧光变化数据；以及(2)基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器中所包含的核酸是否来源于单个细胞。

Description

确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法

及其装置和用途

优先权信息

无技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法及其装置和用途，更具体的，本发明涉及确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法、确定容器中核酸是否来源于单个细胞的装置、获取单细胞核酸的方法、构建单细胞核酸测序文库的方法、构建单细胞核酸测序文库的系统以及确定单细胞核酸的序列的方法。背景技术

生物功能或者疾病的研究需要数以千计的单细胞的信息的累积和分析。然而，目前大量单细胞的测序成本非常高，尤其是样品的前期处理成本一直无法有效降低。

为了降低样品处理费用，减小样品反应体积成为目前采取的主要方法之一，例如，微流控芯片技术。

Fluidigm的 C1平台就是利用微流控芯片和微阀控制自动获取 96个单细胞，并在芯片上完成细胞裂解，反转录及 PCR的过程，获得扩增好的 cDNA,其反应体积为百纳升级，大大的降低了试剂消耗成本，但其成本仍要 20美金 /细胞。

因此，单细胞的处理手段仍有待改进。发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：（1 ) 在含有核酸的容器中添加荧光标记，并进行实时荧光定量 PCR，以便获得所述容器的荧光变化数据；以及（2)基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器中所包含的核酸是否来源于单个细胞。由于实时荧光定量 PCR的结果是与容器中的核酸数目呈正相关的，因此，通过对实时荧光定量 PCR的结果进行分析，能够有效地确定容器中的核酸是否是来源于单个细胞。由此，根据本发明的实施例，能够实现快速地原位确定容器中的核酸是否来源于单个细胞。进而，可以实现同时分析多个容器中的核酸来源，进一步降低容器中核酸悬浮液的体积，从而可以显著降低单细胞核酸分析的成本。根据本发明的实施例，可以同时分析超过 500 个容器，进而可以同时分析超过 500 个单细胞，并且处理对象的体积只需要 200 纳升，显著地降低了单细胞核酸分析例如单细胞核酸测序的成本，例如可以降低至目前成本的十分之一。

根据本发明的实施例，上述确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述荧光标记为 SYBR Gr_eenI。由此可以进一步提高实时荧光定量 PCR的效率，提高确定容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，进而提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，所述核酸为 cDNA。本发明的发明人发现，本发明的确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法能够有效地应用于对 cDNA的分析。

根据本发明具体的实施例，所述核酸是通过下列步骤获得的：提供细胞悬浮液，所述细胞悬浮液含有 2~5个细胞 /微升；在容器中添加 50纳升所述细胞悬浮液；在所述容器中添加细胞裂解液，以便裂解所述容器中的细胞，并释放所述细胞中的 mRNA; 以及在所述容器中添加反转录试剂，以便对所述 mRNA进行反转录，获得 cDNA。由此，本发明确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法能够有效地对 mRNA进行分析，另外，发明人发现，当细胞悬浮液的细胞含量为含有 2~5个细胞 /微升时， 50纳升体积的悬浮液中仅存在一个细胞的概率非常大，可以达到 90%以上，例如当细胞含量不超过 4个细胞 /微升时，该概率超过 98%。由此，可以进一步提高容器中核酸来源于单细胞的概率。

根据本发明的实施例，所述容器为多孔板中的至少一个，优选所述多孔板为 5124孔板。由此，根据本发明的实施例，可以实现同时对多孔板中的多个孔（即将每个孔看作一个容器）进行分析，由此，显著地降低了分析成本，提高了分析通量。

根据本发明的实施例，在步骤（2) 中进一步包括：（2-1 ) 基于所述容器的荧光变化数据，建立扩增曲线，并且基于所述扩增曲线，确定所述容器的 Ct值；以及（2-2)将所述容器的 α值与预定的第一 α阈值进行比较，其中，所述容器的 α值高于所述预定的第一 α 阈值是所述容器中所包含的核酸来源于单个细胞的指示。由此，可以进一步提高确定容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，所述预定的第一 ct 阈值是通过对对照容器进行实时荧光定量

PCR而确定的，其中，所述对照容器含有已知量的核酸，优选地，所述对照容器含有 lOpg 核酸。由此，可以进一步提高确定容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，所述预定的第一 Ct阈值是通过下列步骤确定的：（a) 对多个所述对照容器进行实时荧光定量 PCR，以便确定各所述对照容器的 Ct值；以及（b) 确定这样一个数值作为所述预定的第一 Ct阈值，其中，全部所述多个对照容器的 Ct值中至少 1.75% 小于所述数值。发明人发现，通过这些步骤获得的第一 Ct阈值能够有效地用于判断是否容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，所述预定的第一 Ct阈值是通过下列公式确定的：预定的第一 Ct 阈值 = (平均 Ct值 -a)其中，所述平均 Ct值是所述多个对照容器的 Ct值中至少一部分的平均值， a是在 0.1 1之间的常数，优选 a=0.5。发明人发现，通过这些步骤获得的第一 Ct阈值能够有效地用于判断是否容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。根据本发明的实施例，在步骤（2-2) 中，所述容器的 Ct值高于所述预定的第一 α阈值但小于预定的第二 Ct阈值是所述容器中所包含的核酸来源于单个细胞的指示，其中，所述预定的第二 Ct阈值是通过下列公式确定的：预定的第二 Ct阈值 =预定的第一 Ct阈值 +2a， a是在 0.1~1之间的常数，优选 a=0.5。发明人发现，通过这些步骤获得的第二 Ct阈值结合第一 Ct阈值能够有效地用于判断是否容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，所述预定的第一 Ct 阈值为 12.78，所述预定的第二 Ct 阈值为 13.78。发明人发现，利用由该第二 Ct阈值与第一 Ct阈值限定出的范围，能够有效地通过判断 Ct值是否落入该范围内，来判断是否容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高了单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，进一步包括：（3-1 )基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器的荧光变化曲线；（3-2)将所述容器的荧光变化曲线与预定曲线进行比较，以便确定所述实时荧光定量 PCR是否有效，其中，所述预定曲线是通过对含有已知预定量核酸的容器进行实时荧光定量 PCR而获得的，并且所述容器的荧光变化曲线与所述预定曲线平行表示所述实时荧光定量 PCR是有效的。根据本发明的实施例，进一步包括：（4-1 ) 基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器的熔解曲线；以及（4-2) 基于所述容器的熔解曲线，排除不合格容器，其中，所述不合格容器的熔解曲线中仅有引物二聚体峰，或者存在引物二聚体峰异常。由此，根据本发明的实施例，可以有效地排除容器内存在异常的容器，从而可以有效地改善后续分析核酸的结果。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种确定容器中核酸是否来源于单个细胞的装置。根据本发明的实施例，该装置包括：实时荧光定量 PCR单元，所述实时荧光定量 PCR单元用于在含有核酸的容器中添加荧光标记后，进行实时荧光定量 PCR，以便获得所述容器的荧光变化数据；以及判断单元，所述判断单元与所述实时荧光定量 PCR单元相连，用于基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器中所包含的核酸是否来源于单个细胞。利用该装置，能够有效地分析容器中核酸是否来源于单个细胞。由于实时荧光定量 PCR的结果是与容器中的核酸数目呈正相关的，因此，通过对实时荧光定量 PCR的结果进行分析，能够有效地确定容器中的核酸是否是来源于单个细胞。由此，根据本发明的实施例，能够实现快速地原位确定容器中的核酸是否来源于单个细胞。进而，可以实现同时分析多个容器中的核酸来源，进一步降低容器中核酸悬浮液的体积，从而可以显著降低单细胞核酸分析的成本。根据本发明的实施例，可以同时分析超过 500 个容器，进而可以同时分析超过 500 个单细胞，并且处理对象的体积只需要 200 纳升，显著地降低了单细胞核酸分析例如单细胞核酸测序的成本，例如可以降低至目前成本的十分之一。

根据本发明的实施例，确定容器中核酸是否来源于单个细胞的装置还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述荧光标记为 SYBR GreenL 由此可以进一步提高实时荧光定量 PCR的效率，提高确定容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，进一步包括核酸制备单元，所述核酸制备单元与所述实时荧光定量 PCR单元相连，用于通过下列步骤制备获得所述核酸：提供细胞悬浮液，所述细胞悬浮液含有 2~5个细胞 /微升；在容器中添加 50纳升所述细胞悬浮液；在所述容器中添加细胞裂解液，以便裂解所述容器中的细胞，并释放所述细胞中的 mRNA; 以及在所述容器中添加反转录试剂，以便对所述 mRNA进行反转录，获得 cDNA。由此，本发明确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法能够有效地对 mRNA进行分析，另外，发明人发现，当细胞悬浮液的细胞含量为含有 2~5个细胞 /微升时， 50纳升体积的悬浮液中仅存在一个细胞的概率非常大，可以达到 90%以上，例如当细胞含量不超过 4个细胞 /微升时，超过 98%。由此，可以进一步提高容器中核酸来源于单细胞的概率。

根据本发明的实施例，所述容器为多孔板中的至少一个，优选所述多孔板为 5124孔板。由此，根据本发明的实施例，可以实现同时对多孔板中的多个容器进行分析，由此，显著地降低了分析成本，提高了分析通量。

根据本发明的实施例，所述判断单元进一步包括： ct值确定模块，所述 α值确定模块用于基于所述容器的荧光变化数据，建立扩增曲线，并且基于所述扩增曲线，确定所述容器的 α值；以及第一判断模块，所述第一判断模块中设置有预定的第一 ct阈值，所述第一判断模块与所述 α值确定模块相连，用于将所述容器的 α值与预定的第一 α阈值进行比较，其中，所述容器的 α值高于所述预定的第一 α阈值是所述容器中所包含的核酸来源于单个细胞的指示。由此，可以进一步提高确定容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，所述预定的第一 Ct阈值是通过下列公式确定的：预定的第一 Ct 阈值 = (平均 Ct值 -a)其中，所述平均 Ct值是所述多个对照容器的 Ct值中至少一部分的平均值， a是在 0.1 1之间的常数，优选 a=0.5。发明人发现，通过这些步骤获得的第一 Ct阈值能够有效地用于判断是否容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。根据本发明的实施例，所述容器的 ct值高于所述预定的第一 α阈值但小于预定的第二 ct阈值是所述容器中所包含的核酸来源于单个细胞的指示，其中，所述预定的第二 α阈值是通过下列公式确定的：预定的第二 Ct阈值 =预定的第一 Ct阈值 +2a， a是在 0.1 1之间的常数，优选 a=0.5。发明人发现，通过这些步骤获得的第二 Ct阈值结合第一 Ct阈值能够有效地用于判断是否容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，所述判断单元进一步包括：荧光变化曲线确定模块，所述荧光变化曲线确定模块用于基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器的荧光变化曲线；以及第二判断模块，所述第二判断模块中设置有预定曲线，所述第二判断模块与所述荧光变化曲线确定模块相连，用于将所述容器的荧光变化曲线与预定曲线进行比较，以便确定所述实时荧光定量 PCR是否有效，其中，所述预定曲线是通过对含有已知预定量核酸的容器进行实时荧光定量 PCR而获得的，并且所述容器的荧光变化曲线与所述预定曲线平行表示所述实时荧光定量 PCR是有效的。根据本发明的实施例，所述判断单元进一步包括：熔解曲线确定模块，所述熔解曲线确定模块用于基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器的熔解曲线；以及去杂模块，所述去杂模块与所述熔解曲线确定模块相连，用于基于所述容器的熔解曲线，排除不合格容器，其中，所述不合格容器的熔解曲线中仅有引物二聚体峰，或者存在引物二聚体峰异常。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种获取单细胞核酸的方法。根据本发明的实施例，包括：提供细胞悬浮液，所述细胞悬浮液含有 2~5个细胞 /微升；在容器中添加 50纳升所述细胞悬浮液；在所述容器中添加细胞裂解液，以便裂解所述容器中的细胞，并释放所述细胞中的 mRNA; 在所述容器中添加反转录试剂，以便对所述 mRNA进行反转录，获得 cDNA; 以及根据前面所述的方法，确定所述容器中所包含的 cDNA是否来源于单个细胞。正如前面所述，由于实时荧光定量 PCR的结果是与容器中的核酸数目呈正相关的，因此，通过对实时荧光定量 PCR的结果进行分析，能够有效地确定容器中的核酸是否是来源于单个细胞。由此，根据本发明的实施例，能够实现快速地原位确定容器中的核酸是否来源于单个细胞。进而，可以实现同时分析多个容器中的核酸来源，进一步降低容器中核酸悬浮液的体积，从而可以显著降低单细胞核酸分析的成本。根据本发明的实施例，可以同时分析超过 500个容器，进而可以同时分析超过 500个单细胞，并且处理对象的体积只需要 200 纳升，显著地降低了单细胞核酸分析例如单细胞核酸测序的成本，例如可以降低至目前成本的十分之一。

根据本发明的实施例，在确定所述容器中所包含的 cDNA是否来源于单个细胞之后，进一步包括，利用毛细管获取实时荧光定量 PCR产物。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种构建单细胞核酸测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：根据前面所述的方法获取单细胞核酸；以及针对所述单细胞核酸，构建核酸测序文库。正如前面所述，由于实时荧光定量 PCR的结果是与容器中的核酸数目呈正相关的，因此，通过对实时荧光定量 PCR的结果进行分析，能够有效地确定容器中的核酸是否是来源于单个细胞。由此，根据本发明的实施例，能够实现快速地原位确定容器中的核酸是否来源于单个细胞。进而，可以实现同时分析多个容器中的核酸来源，进一步降低容器中核酸悬浮液的体积，从而可以显著降低单细胞核酸分析的成本。根据本发明的实施例，可以同时分析超过 500个容器，进而可以同时分析超过 500个单细胞，并且处理对象的体积只需要 200 纳升，显著地降低了单细胞核酸分析例如单细胞核酸测序的成本，例如可以降低至目前成本的十分之一。

根据本发明的实施例，可以基于选自 HISEQ2000、 SOLID, 454和单分子测序平台的至少一种构建所述核酸测序文库。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种构建单细胞核酸测序文库的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：前面所述的确定容器中核酸是否来源于单个细胞的装置；以及文库构建装置，所述文库构建装置用于针对所述单细胞核酸，构建核酸测序文库。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种确定单细胞核酸的序列的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：根据前面所述的方法，构建单细胞核酸测序文库；以及对所述单细胞核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果，确定所述单细胞核酸的序列。正如前面所述，由于实时荧光定量 PCR的结果是与容器中的核酸数目呈正相关的，因此，通过对实时荧光定量 PCR的结果进行分析，能够有效地确定容器中的核酸是否是来源于单个细胞。由此，根据本发明的实施例，能够实现快速地原位确定容器中的核酸是否来源于单个细胞。进而，可以实现同时分析多个容器中的核酸来源，进一步降低容器中核酸悬浮液的体积，从而可以显著降低单细胞核酸分析的成本。根据本发明的实施例，可以同时分析超过 500 个容器，进而可以同时分析超过 500个单细胞，并且处理对象的体积只需要 200纳升，显著地降低了单细胞核酸分析例如单细胞核酸测序的成本，例如可以降低至目前成本的十分之一。

根据本发明的实施例，该方法可以利用选自 HISEQ2000、 SOLID, 454和单分子测序平台的至少一种进行所述测序。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明

本发明的上述和 /或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图 1 显示了根据本发明一个实施例的确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法的流程示意图。

图 2 显示了根据本发明一个实施例的确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法的流程示意图。

图 3 显示了根据本发明一个实施例的确定容器中核酸是否来源于单个细胞的装置的结构程示意图。

图 4显示了根据本发明一个实施例的构建单细胞核酸测序文库的系统的结构程示意图。图 5显示了根据本发明一个实施例，不同起始量下的荧光曲线、熔解曲线图。

图 6显示了根据本发明一个实施例，样品孔产物的 Agilent 2100检测结果。

图 7和图 8显示了根据本发明一个实施例，文库测序数据质量检测结果图。

图 9 显示了根据本发明一个实施例，文库测序数据的基因覆盖情况与常规流程的检测结果比较图。

图 10显示了根据本发明一个实施例，文库测序数据的基因组不同碱基位置上的覆盖情况分析图。发明详细描述

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语 "第一"、 "第二"仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有 "第一"、 "第二" 的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明， "多个" 的含义是两个或两个以上。

确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法

在本发明的第一方面，本发明提出了一种确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法。参考图 1，根据本发明的实施例，该方法包括：

S100: 实时荧光定量 PCR

在该步骤中，在含有核酸的容器中添加荧光标记，并进行实时荧光定量 PCR，以便获得所述容器的荧光变化数据。

S200: 确定核酸是否来源于单细胞

基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器中所包含的核酸是否来源于单个细胞。由于实时荧光定量 PCR的结果是与容器中的核酸数目呈正相关的，因此，通过对实时荧光定量 PCR的结果进行分析，能够有效地确定容器中的核酸是否是来源于单个细胞。由此，根据本发明的实施例，能够实现快速地原位确定容器中的核酸是否来源于单个细胞。进而，可以实现同时分析多个容器中的核酸来源，进一步降低容器中核酸悬浮液的体积，从而可以显著降低单细胞核酸分析的成本。根据本发明的实施例，可以同时分析超过 500个容器，进而可以同时分析超过 500个单细胞，并且处理对象的体积只需要 200纳升，显著地降低了单细胞核酸分析例如单细胞核酸测序的成本，例如可以降低至目前成本的十分之一。

根据本发明的实施例，可以应用于本发明的荧光标记的类型并不受特别限制，只要能够与核酸发生非特异性结合，并且能够有效地实施实时荧光定量 PCR即可。根据本发明的实施例，在本发明中所采用的荧光标记为 SYBR Gr_eenI。发明人发现，利用该荧光标记能够有效地针对微量的核酸，例如来自于单细胞的核酸进行实时荧光定量 PCR。由此可以进一步提高实时荧光定量 PCR的效率，提高确定容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，在本发明中，可以应用根据本发明实施例的方法来进行核酸来源判断的核酸类型并不受特别限制。即可以是 DNA也可以是 RNA，只要能够有效地进行实时荧光定量 PCR即可。根据本发明的实施例，所述核酸为 cDNA。本发明的发明人发现，本发明的确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法能够有效地应用于对 cDNA的分析。并且由于 cDNA通常具有相同的核酸序列，例如 polyT序列，因此能够非常方便地实施荧光定量 PCR，从而提高确定核酸是否来源于单个细胞的方法。

参考图 2，根据本发明具体的实施例，核酸是通过下列步骤获得的：

S110: 提供并分配细胞悬浮液

在该步骤中，首先准备细胞悬浮液，并且该细胞悬浮液含有 2~5个细胞 /微升，之后，将所准备的细胞悬浮液添加至有待进行分析的容器中，根据本发明的具体实例，在容器中添加 50纳升细胞悬浮液。

本发明的发明人惊奇地发现，当细胞在液体中均匀分布，将其分成微小体积，则每份微小体积中含有的细胞的个数符合泊松分布。泊松分布的概率质量函数为： P(X=k) = e-V/k!, 其中 k代表细胞个数， λ代表每份小体积包含的细胞数目的期望， Ρ为微小体积中包含的细胞个数为 k时的概率。根据本发明的实施例，当所分配的细胞悬浮液为 50nL时，如果细胞密度为 1~5个细胞 /微升，优选 2~4个细胞 /微升时， 98%以上的微孔中细胞数是不多于 1个。需要说明的是，当细胞密度为 4个 /微升时，由于在细胞进行分离时，每孔的细胞悬浮液的体积是 50nL，所以平均每个孔含有细胞的个数为 4/ ( 1000nL/50nL) =4/20=0. 2个，即 λ =0.2。细胞数是不多于 1个，表示细胞数为 0和 1时的概率和。进而，

该概率 =P(0)+P(l)=e^{- 2}(0.2)⁰/0!+e^-0.²(0.2)Vl= e"⁰'²+e"⁰'²(0.2)= 0.81873075307798

* 1.2=0.982476903693576 >98%。

另夕卜，根据本发明的实施例，配置细胞悬浮液优选采用将 Percoll原液与 10X PBS按照体积比 9: 1的比例所得到的等渗溶液进行配置细胞悬浮液。这是因为， Percoll原液是低渗溶液，如果直接用于悬浮细胞会导致细胞直接破裂，因此需要与 10X PBS按照体积比 9: 1 的比例所得到的等渗溶液，才可用于悬浮细胞。并且，发明人惊奇地发现该等渗溶液的比重适当，能够保证进行分散时细胞是均匀分布的。

根据本发明的实施例，利用等渗溶液配置细胞含量为 1~5个细胞 /微升的细胞悬浮液的方法并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以采用梯度稀释的方法。

根据本发明的具体实施例，可以采用下列步骤进行：

步骤 1 : 根据样品的差异，分别用胰酶对贴壁型细胞，胶原酶对组织进行细胞消化，将已消化的细胞取 lmL，并用 1.5mL EP管装好。步骤 2: 将前面所得到的细胞在 1000 rpm条件下离心 5min，并用 1 X PBS重悬浮，重复一次。

步骤 3 : 用 40/70 μιη的细胞滤网对步骤 2细胞溶液进行过滤以去除细胞团。

步骤 4: 将 Percoll原液（PHARMACIA, 货号 17-0891-01 ) 与 10 X PBS按体积比 9: 1 混合成细胞的等渗溶液。吸取一定量的等渗溶液与步骤 3 所得到的经过过滤的细胞溶液按体积比 1 :4混合成新的细胞悬浮液。

步骤 5 : 按照梯度稀释（例如 1 : 2或者 1 : 10) 将步骤 4中新配置的细胞悬浮液的细胞密度调节至 1~5个细胞 /微升，优选 2~4个细胞 /微升。

确定细胞密度的方法是本领域技术人员公知的，例如可以采用显微镜对 5~10微升细胞悬浮液进行 3次计数来确定细胞密度。

根据本发明的实施例，进行悬浮液分配的方式并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用商用的微量分液平台（ SmartChipTM Multi Sample NanoDispenser(MS D), Wafergen Biosy stems) 进行加样，以微孔芯片 (Smartchip 200nL,Wafergen) 为容器，荧光定量 PCR仪 ( SmartChip™ Real-Time PCR Cycler, Wafergen Biosy stems) 辅助监测，选用合适的细胞密度，配合优化的反应体积，可一次完成 >500个单细胞的处理。

根据本发明的实施例，容器为多孔板中的至少一个，所述多孔板为 5124孔板。由此，根据本发明的实施例，可以实现同时对多孔板中的多个容器进行分析，由于本发明的方法所处理的细胞样品的体积可以非常小，因此，可以采用 5124孔板进行高通量处理。由此，显著地降低了分析成本，提高了分析通量。

S120: 裂解细胞

在将细胞悬浮液分配至相应的容器中后，在容器中添加细胞裂解液，以便裂解容器中的细胞，并释放细胞中的 mRNA。

根据本发明的实施例，可以采用的细胞裂解液并不受特别限制，只要能够裂解细胞同时释放 mRNA即可。根据本发明的具体实例，以 4μί裂解液为例，可以采用的裂解液的组成如下表所示：

S130: 反转录在完成对细胞裂解，并将细胞内所含有的 mRNA释放之后，可以向容器中添加反转录试剂，以便对所述 mRNA进行反转录，获得 cDNA。

根据本发明的实施例，通过上述操作，可以原位直接进行反转录。根据本发明的实施例，进行反转录的条件为： 42 °C 90min, (50 °C 2min, 42 °C 2min) 10个循环， 70 °C 15 min, 4°C保存。由此，本发明确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法能够有效地对 mRNA进行分析。

根据本发明的实施例，可以用于判断核酸是否来源于单个细胞的实时荧光定量 PCR的结果并不受特别限制，只要能够反应荧光的变化即可。根据本发明的实施例，步骤 S200包括：

首先，基于容器的荧光变化数据，建立扩增曲线，并且基于扩增曲线，确定容器的 Ct 值；

接下来，将所述容器的 ct值与预定的第一 α阈值进行比较，其中，所述容器的 α值高于所述预定的第一 α阈值是所述容器中所包含的核酸来源于单个细胞的指示。由此，可以进一步提高确定容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，所述预定的第一 Ct阈值是通过下列公式确定的：预定的第一 Ct 阈值 = (平均 Ct值 -a)其中，所述平均 Ct值是所述多个对照容器的 Ct值中至少一部分的平均值， a是在 0.1 1之间的常数，优选 a=0.5。发明人发现，通过这些步骤获得的第一 Ct阈值能够有效地用于判断是否容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，所述容器的 Ct值高于所述预定的第一 Ct阈值但小于预定的第二 Ct阈值是所述容器中所包含的核酸来源于单个细胞的指示，其中，所述预定的第二 Ct阈值是通过下列公式确定的：预定的第二 Ct阈值 =预定的第一 Ct阈值 +2a， a是在 0.1 1之间的常数，优选 a=0.5。发明人发现，通过这些步骤获得的第二 Ct阈值结合第一 Ct阈值能够有效地用于判断是否容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，还可以通过荧光变化数据来排除异常的容器，例如实时荧光定量 PCR不合格的容器等。具体地，根据本发明的实施例，可以进一步包括：

首先，基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器的荧光变化曲线。

接下来，将所述容器的荧光变化曲线与预定曲线进行比较，以便确定所述实时荧光定量 PCR是否有效，其中，所述预定曲线是通过对含有已知预定量核酸的容器进行实时荧光定量 PCR而获得的，并且所述容器的荧光变化曲线与所述预定曲线平行表示所述实时荧光定量 PCR是有效的。

根据本发明的另一些实施例，还可以进一步包括：

首先，基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器的熔解曲线；以及

接下来，基于所述容器的熔解曲线，排除不合格容器，其中，所述不合格容器的熔解曲线中仅有引物二聚体峰，或者存在引物二聚体峰异常。由此，根据本发明的实施例，可以有效地排除容器内存在异常的容器，从而可以有效地改善后续分析核酸的结果。

需要说明的是，这里所使用的表达方式 "引物二聚体峰异常"是指明显引物二聚体的量超出应有的比例。确定容器中核酸是否来源于单个细胞的装置

在本发明的第二方面，本发明提出了一种确定容器中核酸是否来源于单个细胞的装置。利用该装置，能够有效地分析容器中核酸是否来源于单个细胞。由于实时荧光定量 PCR的结果是与容器中的核酸数目呈正相关的，因此，通过对实时荧光定量 PCR的结果进行分析，能够有效地确定容器中的核酸是否是来源于单个细胞。由此，根据本发明的实施例，能够实现快速地原位确定容器中的核酸是否来源于单个细胞。进而，可以实现同时分析多个容器中的核酸来源，进一步降低容器中核酸悬浮液的体积，从而可以显著降低单细胞核酸分析的成本。根据本发明的实施例，可以同时分析超过 500个容器，进而可以同时分析超过 500个单细胞，并且处理对象的体积只需要 200纳升，显著地降低了单细胞核酸分析例如单细胞核酸测序的成本，例如可以降低至目前成本的十分之一。

根据本发明的实施例，参照图 3，该装置 1000包括：实时荧光定量 PCR单元 100和判断单元 200。具体地：

实时荧光定量 PCR单元 100，用于在含有核酸的容器中添加荧光标记后，进行实时荧光定量 PCR，以便获得所述容器的荧光变化数据。根据本发明的实施例，所述荧光标记为 SYBR Gr_eenl。由此可以进一步提高实时荧光定量 PCR的效率，提高确定容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。根据本发明的实施例，所述核酸为 cDNA。本发明的发明人发现，本发明的确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法能够有效地应用于对 cDNA的分析。

判断单元 200，与所述实时荧光定量 PCR单元 100相连，用于基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器中所包含的核酸是否来源于单个细胞。需要说明的是，判断单元 200 的具体选择不受特别限制，可以设计计算机处理模块，与实时荧光定量 PCR单元 100相连，以便从实时荧光定量 PCR单元 100中接收所述容器的荧光变化数据，并基于计算机处理模块的功能，对所述容器的荧光变化数据进行处理，并作出判断，以便确定所述容器中所包含的核酸是否来源于单个细胞。本领域技术人员可以理解的是，上述的计算机处理模块也可以设置于实时荧光定量 PCR单元 100内，或者当采用实时荧光定量 PCR仪作为实时荧光定量 PCR单元 100时，该实时荧光定量 PCR仪所包含的计算装置，就可以直接或经人工改造后作为判断单元 200。当然，判断单元 200也可以是人工，即不借助机器、装置，而直接由方法实施者作为判断主体，充当判断单元，基于实时荧光定量 PCR单元 100中所述容器的荧光变化数据，人工判断确定所述容器中所包含的核酸是否来源于单个细胞。

根据本发明的实施例，进一步包括核酸制备单元（图中未示出），所述核酸制备单元与所述实时荧光定量 PCR单元 100相连，用于通过下列步骤制备获得所述核酸：提供细胞悬浮液，所述细胞悬浮液含有 2~5个细胞 /微升；在容器中添加 50纳升所述细胞悬浮液；在所述容器中添加细胞裂解液，以便裂解所述容器中的细胞，并释放所述细胞中的 mRNA; 以及在所述容器中添加反转录试剂，以便对所述 mRNA进行反转录，获得 cDNA。由此，本发明确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法能够有效地对 mRNA进行分析，另外，发明人发现，当细胞悬浮液的细胞含量为含有 2~5个细胞 /微升时， 50纳升体积的悬浮液中仅存在一个细胞的概率非常大，可以达到 90%以上，例如当细胞含量不超过 4个细胞 /微升时，超过 98%。由此，可以进一步提高容器中核酸来源于单细胞的概率。

根据本发明的实施例，所述判断单元 200进一步包括： Ct值确定模块（图中未示出），所述 Ct值确定模块用于基于所述容器的荧光变化数据，建立扩增曲线，并且基于所述扩增曲线，确定所述容器的 Ct值；以及第一判断模块（图中未示出），所述第一判断模块中设置有预定的第一 Ct阈值，所述第一判断模块与所述 Ct值确定模块相连，用于将所述容器的 Ct值与预定的第一 Ct阈值进行比较，其中，所述容器的 Ct值高于所述预定的第一 Ct阈值是所述容器中所包含的核酸来源于单个细胞的指示。由此，可以进一步提高确定容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，所述预定的第一 Ct阈值是通过下列步骤确定的：（a) 对多个所述对照容器进行实时荧光定量 PCR，以便确定各所述对照容器的 Ct值；以及（b) 确定这样一个数值作为所述预定的第一 Ct阈值，其中，全部所述多个对照容器的 Ct值中至少 1.75% 小于所述数值。发明人发现，通过这些步骤获得的第一 α阈值能够有效地用于判断是否容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，所述预定的第一 α阈值是通过下列公式确定的：预定的第一 α 阈值 = (平均 α值 -_a)其中，所述平均 α值是所述多个对照容器的 α值中至少一部分的平均值， a是在 0.1 1之间的常数，优选 a=0.5。发明人发现，通过这些步骤获得的第一 Ct阈值能够有效地用于判断是否容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，所述容器的 ct值高于所述预定的第一 α阈值但小于预定的第二 ct阈值是所述容器中所包含的核酸来源于单个细胞的指示，其中，所述预定的第二 α阈值是通过下列公式确定的：预定的第二 Ct阈值 =预定的第一 Ct阈值 +2a， a是在 0.1 1之间的常数，优选 a=0.5。发明人发现，通过这些步骤获得的第二 Ct阈值结合第一 Ct阈值能够有效地用于判断是否容器中核酸是否来源于单个细胞的效率，提高单细胞核酸分析的效率。

根据本发明的实施例，所述判断单元 200进一步包括：荧光变化曲线确定模块（图中未示出），所述荧光变化曲线确定模块用于基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器的荧光变化曲线；以及第二判断模块（图中未示出），所述第二判断模块中设置有预定曲线，所述第二判断模块与所述荧光变化曲线确定模块相连，用于将所述容器的荧光变化曲线与预定曲线进行比较，以便确定所述实时荧光定量 PCR是否有效，其中，所述预定曲线是通过对含有已知预定量核酸的容器进行实时荧光定量 PCR而获得的，并且所述容器的荧光变化曲线与所述预定曲线平行表示所述实时荧光定量 PCR是有效的。根据本发明的实施例，所述判断单元进一步包括：熔解曲线确定模块，所述熔解曲线确定模块用于基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器的熔解曲线；以及去杂模块，所述去杂模块与所述熔解曲线确定模块相连，用于基于所述容器的熔解曲线，排除不合格容器，其中，所述不合格容器的熔解曲线中仅有引物二聚体峰，或者存在引物二聚体峰异常。用途

根据本发明的实施例，核酸文库的构建方法不受特别限制，可以根据后续测序要采用的测序平台选择相应的测序文库构建策略。根据本发明的实施例，可以基于选自 HISEQ2000, SOLID, 454和单分子测序平台的至少一种构建所述核酸测序文库。具体地，例如，当目的核酸测序文库要用于 HISEQ2000测序平台时，则可以根据 HISEQ2000测序仪的文库构建操作规程构建所述核酸测序文库。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种构建单细胞核酸测序文库的系统。根据本发明的实施例，该系统 10000包括：前面所述的确定容器中核酸是否来源于单个细胞的装置 1000；以及文库构建装置 2000，所述文库构建装置用于针对所述单细胞核酸，构建核酸测序文库。

根据本发明的实施例，文库构建装置 2000的种类不受特别显著，可以根据后续要采用的测序平台作出相应选择。根据本发明的具体示例，文库构建装置 2000与选自 HISEQ2000、 SOLID, 454 和单分子测序平台的至少一种相适应，即能够构建适于选自 HISEQ2000、 SOLID, 454和单分子测序平台的至少一种的核酸测序文库。具体地，例如，当目的核酸测序文库要用于 HISEQ2000测序平台时，文库构建装置 2000适于按照 HISEQ2000测序仪的文库构建操作规程构建所述核酸测序文库。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考 J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自 Illumina公司。

实施例 1 :

本实施例利用商用的微量分液平台（ SmartChipTM Multi Sample NanoDispenser(MS D), Wafergen Biosystems)进行加样，以微孔芯片 (Smartchip 200nL， Wafergen)为容器，荧光定量 PCR仪（ SmartChip™ Real-Time PCR Cycler, Wafergen Biosystems)辅助监测，对 Hela S3 细胞进行单细胞核酸处理。具体如下：

1 样品准备

1.1 根据样品的差异，分别用胰酶对贴壁型细胞，胶原酶对组织进行细胞消化，将已消化的细胞取 lmL，并用 1.5mL EP管装好。

1.2 将步骤 1.1中的细胞在 lOOOrpm 条件下离心 5min，并用 1 XPBS重悬浮，重复一次。 1.3 用 40或 70 μιη的细胞滤网对步骤 1.2细胞溶液进行过滤以去除细胞团。

1.4 将 Percoll原液 (PHARMACIA, 货号 17-0891-01 ) 与 10 XPBS按体积比 9: 1混合成细胞的等渗溶液，命名为溶液 1。吸取一定量的溶液 1与经步骤 1.3的细胞溶液按体积比 1 :4混合成新的细胞悬浮液。

1.5将步骤 1.4中新配置的细胞悬浮液的细胞密度调节至 2~4个 L，完成细胞样品制备，称为样品 1。细胞计数的进行是在细胞初步计数后，梯度稀释，并用显微镜对 5~10μί细胞悬浮液进行 3次计数确定细胞密度。

1.6 将溶液 1与 1 XPBS按体积比 1 :4配成阴性对照溶液，称为对照 1 ; 准备好浓度为 0.2 ng L的总 RNA，作为阳性对照，称为对照 2。 2 单细胞 mRNA的处理过程

2.1 将微量加样平台（MS D平台）中的纯水和 0.2%的次氯酸钠置换成无核酸酶水和用其配置的 0.2%的次氯酸钠，并用 RNA Zap擦洗平台，最大限度的减少环境中的 RNA酶对实验造成的影响。

2.2 将要用到物品（如 384孔板等）放入超净台中，打开超净台风机，用 DNA off擦拭超净台桌面及器械， lOmin后关闭风机，开启紫外照射 30min，然后打开风机，并用 RNA Zap 擦拭台面及仪器。

2.3 在经步骤 2.2处理的超净台中准备裂解液，用无核酸酶水、 Oligo-dT Primer, dNTP、 RNA酶抑制剂和 Triton X -100等制备细胞裂解液 750μί，根据实际需求将裂解液分装到 384 孔板对应的位置（以 36个孔位为例，每孔 20μί)，用膜封好，在 2600rcf， 12°C条件下离心 5min，去气泡，并将其放入 MS D平台指定位置。

其中，以 4μί裂解液为例，其组成如下表所示：

2.4 将一张新的 200nL的芯片放置在 MS D平台指定位置，选择并启动对应加样程序 (36sample* 144assay), 该程序会完成将裂解液每孔 50nL的量分装在芯片中（即将 384孔板中的裂解液以每孔 50nL的量分装到芯片中 5124个孔中），该过程耗时 15min。程序完成后，用滤纸将芯片上可能存在的液体吸掉，并封上膜，在 2600rcf， 12°C的条件下离心 5min。

2.5 将 1.5中样品 1、 1.6中准备的对照 1和对照 2，轻柔的颠倒混匀后在超净台中分装在一个新的 384孔板中，样品 1分装在 34个孔中，对照 1和对照 2分别分装在 1个孔中，每孔 20μί。孔位与步骤 2.3提及的 36个孔位置对应。

2.6 将 2.5中准备的 384孔封好膜，移到 MSND仪器中后将膜揭开。将步骤 2.4准备的芯片放置在 MSND芯片区，揭开膜，开启加样程序（36sample* 144assay)，将细胞悬液及对照溶液分到芯片中（每孔 50nL)。

2.7 分液完毕后，用滤纸将芯片上可能存在的液体吸掉封上膜在 2600rcf， 12°C的条件下离心 5min，转移至可放置芯片的热循环仪中， 72°C反应 3min进行细胞裂解。裂解后将芯片在 2600rcf， 12°C条件下离心 5min，去膜后转移到 MSND平台。

2.8 在超净台中配置逆转录混合液（RT Mix), 并分装在 384孔板中如 2.5中涉及的 36 个孔中，每孔 20μί。在 2600rcf， 12°C条件下离心 5min，并将其放入 MSND平台指定位置，将膜撕开，启动加样程序（36sample* 144assay)。 2.9 分液完毕后，用滤纸将芯片上可能存在的液体吸掉封上膜在 2600rcf， 12°C的条件下离心 5min，转移至可放置芯片的热循环仪中， 42°C 90min, (50 °C 2min, 42 °C 2min) 10 个循环， 70°C 15 min, 4°C保存。反应后将芯片在 2600rcf， 12°C条件下离心 5min，去膜后转移到 MSND平台。

2.10 在超净台中配置 PCR反应液（内有 SYBR Green I，其终浓度为 0.5 X )，并分装在

384孔板中如 2.5中涉及的 36个孔中，每孔 20μί。用膜封好，在 2600rcf， 12°C条件下离心 5min，并将其放入 MSND平台指定位置，将膜撕开，启动加样程序（36sample* 144assay)。

2.11 分液完毕后，用滤纸将芯片上可能存在的液体吸掉封上膜在 2600rcf， 12°C的条件下离心 5min，转移至荧光定量 PCR仪中，进行 PCR反应及溶解曲线测定。

3 目标样品的确定及提取

3.1、根据 Smartchip cycling 仪器界面监测的芯片中 5184个孔中的荧光信号， CT值和溶解曲线情况，对比对照 2样品并结合细胞密度分布，确定目标单细胞孔位，并进行记录。

3.2、用酒精灯加热，将巴氏玻璃管吸嘴拉成直径小于 200μιη的毛细管。利用该毛细管的毛细作用将目标孔位的样品吸出，并转移到装有 6μί TE/ddH20的 1.5mL EP管中，混合后，写好标签。反复三次用 ddH₂0清洗毛细管内外壁，进行一个样品的提取。

3.3、从步骤 3.2中的 6μί样品中取出 l μL用 Qubit® 2.0荧光定量仪 (Invitrogen) 或 Agilent 2100生物分析仪进行定量。

3.4、根据定量结果，取 lng产物用 Nextera XT sample Prep Kit或者 5ng产物用 TruePrep Mini DNA Sample Prep Kit进行文库构建。

3.5、将文库用 Agilent 2100 生物分析仪和荧光定量 PCR仪（ SmartChip™ Real-Time PCR Cycler, Wafergen Biosystems) 进行质检，检测其片段分布和浓度是否符合测序上机标准，质控合格后，定量后在 Hiseq 2000上进行测序。

测序后数据可用于单细胞 RNA表达量的分析，细胞异质性的分析及 RNA editing等信息的分析。本实施例获得的数据具有较好的质量，如图 7和图 8所示，不同位置的碱基的波动比较小且 90%以上的数据质量都大于 30，对后期信息分析提供了很好的基础。同时，测序数据分析表明，其结果与常规流程（即手动挑单个细胞，在 PCR管中进行反应的过程）的数据在基因的覆盖情况（如图 9所示）及数据的偏向性上（如图 10所示）都基本一致。说明通过本实施例进行的反应在数据分布与常规流程一致且未引入其他影响反应的因素。且本实施例获得信息覆盖了 11个管家基因，说明信息比较完整。

当细胞密度为 2~4个 /μί时，芯片中 5184个孔中约 470-850个孔中只包含单个细胞，其他的孔中为空或 2个及以上细胞。本实施例采用 SYBR染料法和标准品对照比较法结合来区分哪些孔是需要的含有细胞的孔，并且剔除明显为多个细胞的孔。用于选取目标孔的主要的三个参数为孔内荧光变化情况， CT值及溶解曲线。 Smartchip cycling是一台与本流程中芯片相匹配的 qPCR仪。 SYBR Green I 能够特异性的与双链 DNA结合，定量指示 DNA 含量。在本流程采用 SYBR Green I标记 DNA， Smartchip cycling检测芯片孔中荧光变化情况，该荧光曲线可用于显示芯片孔内 cDNA扩增状况，即 qPCR反应。同时对照 2样品为浓度 0.2ng^L，以每孔 50nL的量分布在 144个微孔，即每孔中平均 RNA含量为 10pg，与一个细胞中 RNA的含量相当。在 SYBR Green I标记的 PCR反应中， CT值可用于表征模板的起始量，也就是 CT值越小，其起始量越大，因此可以将对照 2样品中上百个反应的平均 CT值作为挑选只含有单个细胞的孔的参数之一，同时将溶解曲线用于剔除引物二聚体比较严重的不合格样品，若产物为引物或引物较多，则其溶解曲线中溶解温度的峰出现在 80°C 之前，如图 5 所示。除此之外根据细胞密度能够计算得到芯片中含有单细胞和多细胞的比例，（比如细胞密度为 4个 /μί时，理论上多细胞孔占所有细胞悬浮液样品孔的 1.75%，即其中 CT值最小的 1.75%为多细胞孔。根据实验对单细胞要求的严格程度，可以去除一定比例 CT较高，即多细胞的孔位。

根据孔内荧光变化情况， CT值及溶解曲线 3个参数确定好目标孔位，再用玻璃毛细管将目标孔中的样品提取出来至内有 6μί dd¾0的 EP管中。混合后取其中的 1 用 Qbuit或 2100定量，剩余的标记好浓度即可以用于后期的文库制备等。 2100检测图如图 6所示，其片段主要集中在 500bp-2k之间，且在 1.5-2k之间有个峰，符合常规流程中判断该样品是否完整的要求。

不同起始量下的荧光曲线、熔解曲线如图 5所示。不同起始量的 CT值的情况如表 1所示。

表 1同浓度起始样品的 CT值分布

细胞上清液是指细胞悬浮液离心后上层溶液基本不包含细胞，可能存在一些游离的 RNA。由图 5可以看出对照 1 (阴性对照）和细胞上清液在 22轮扩增下，其荧光变化曲线明显区别于其他 RNA样品起始的荧光变化曲线。而内为细胞悬浮液的孔其荧光变化曲线可以分为两种，一种和细胞上清液的类似，一种与以 RNA为样品的相似，如图 5目标孔曲线所示。按照表 1 结果，我们将细胞悬浮液为样品的孔 CT值按从小到大的顺序排列，选取 CT在 13.28 ±0.5范围内的挑选出来，作为备选目标孔，同时结合荧光曲线及溶解曲线，剔除荧光曲线变化与 RNA起始的荧光曲线不平行的及引物比较明显的孔，剩余的孔被确认为目标孔。反应体系溶液名称加入体积

裂解液 50nL

细胞悬浮液（2~4个 /μΐ) 50nL

反转录反应溶液 50nL

PCR反应溶液 50nL 工业实用性

本发明的确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法及其装置，能够实现快速地原位确定容器中的核酸是否来源于单个细胞，进而，可以实现同时分析多个容器中的核酸来源，进一步降低容器中核酸悬浮液的体积，从而可以显著降低单细胞核酸分析的成本。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、 "一些实施例"、 "示意性实施例"、 "示例"、 "具体示例"、或 "一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims

权利要求书

1、一种确定容器中核酸是否来源于单个细胞的方法，其特征在于，包括：

( 1 )在含有核酸的容器中添加荧光标记，并进行实时荧光定量 PCR，以便获得所述容器的荧光变化数据；以及

(2)基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器中所包含的核酸是否来源于单个细胞。
2、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述荧光标记为 SYBR Gr<sub>een</sub>I。
3、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述核酸为 cDNA。
4、根据权利要求 3所述的方法，其特征在于，所述核酸是通过下列步骤获得的：提供细胞悬浮液，所述细胞悬浮液含有 2~5个细胞 /微升；

在容器中添加 50纳升所述细胞悬浮液；

在所述容器中添加细胞裂解液，以便裂解所述容器中的细胞，并释放所述细胞中的 mRNA; 以及

在所述容器中添加反转录试剂，以便对所述 mRNA进行反转录，获得 cDNA。
5、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述容器为多孔板中的至少一个，优选所述多孔板为 5124孔板。
6、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，在步骤（2) 中进一步包括：

(2-1 ) 基于所述容器的荧光变化数据，建立扩增曲线，并且基于所述扩增曲线，确定所述容器的 Ct值；

(2-2)将所述容器的 α值与预定的第一 α阈值进行比较，其中，所述容器的 ct值高于所述预定的第一 ct阈值是所述容器中所包含的核酸来源于单个细胞的指示。
7、根据权利要求 6所述的方法，其特征在于，所述预定的第一 Ct阈值是通过对对照容器进行实时荧光定量 PCR而确定的，其中，所述对照容器含有已知量的核酸，优选地，所述对照容器含有 10pg核酸。
8、根据权利要求 7所述的方法，其特征在于，所述预定的第一 Ct阈值是通过下列步骤确定的：

(a)对多个所述对照容器进行实时荧光定量 PCR，以便确定各所述对照容器的 Ct值；以及

(b)确定这样一个数值作为所述预定的第一 Ct阈值，其中，全部所述多个对照容器的

Ct值中至少 1.75%小于所述数值。
9、根据权利要求 6所述的方法，其特征在于，所述预定的第一 Ct阈值是通过下列公式确定的：

预定的第一 Ct阈值 = (平均 Ct值 -a)

其中，所述平均 Ct值是所述多个对照容器的 Ct值中至少一部分的平均值， a是在 0.1~1 之间的常数，优选 a=0.5。 10、根据权利要求 9所述的方法，其特征在于，在步骤（2-2) 中，所述容器的 α值高于所述预定的第一 ct阈值但小于预定的第二 α阈值是所述容器中所包含的核酸来源于单个细胞的指示，其中，所述预定的第二 ct阈值是通过下列公式确定的：

预定的第二 Ct阈值 =预定的第一 Ct阈值 +2a， a是在 0.1 1之间的常数，优选 a=0.5。 11、根据权利要求 10所述的方法，其特征在于，所述预定的第一 Ct阈值为 12.78，所述预定的第二 Ct阈值为 13.78。
12、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，进一步包括：

(3-1 ) 基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器的荧光变化曲线；

(3-2) 将所述容器的荧光变化曲线与预定曲线进行比较，以便确定所述实时荧光定量 PCR是否有效，

其中，

所述预定曲线是通过对含有已知预定量核酸的容器进行实时荧光定量 PCR而获得的，并且所述容器的荧光变化曲线与所述预定曲线平行表示所述实时荧光定量 PCR是有效的。
13、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，进一步包括：

(4-1 ) 基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器的熔解曲线；以及

(4-2) 基于所述容器的熔解曲线，排除不合格容器，

其中，所述不合格容器的熔解曲线中仅有引物二聚体峰，或者存在引物二聚体峰异常。
14、一种确定容器中核酸是否来源于单个细胞的装置，其特征在于，包括：

实时荧光定量 PCR单元，所述实时荧光定量 PCR单元用于在含有核酸的容器中添加荧光标记后，进行实时荧光定量 PCR，以便获得所述容器的荧光变化数据；以及

判断单元，所述判断单元与所述实时荧光定量 PCR单元相连，用于基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器中所包含的核酸是否来源于单个细胞。
15、根据权利要求 14所述的装置，其特征在于，所述荧光标记为 SYBR Gr<sub>een</sub>I。
16、根据权利要求 14所述的装置，其特征在于，所述核酸为 cDNA。
17、根据权利要求 16所述的装置，其特征在于，进一步包括核酸制备单元，所述核酸制备单元与所述实时荧光定量 PCR单元相连，用于通过下列步骤制备获得所述核酸：

提供细胞悬浮液，所述细胞悬浮液含有 2~5个细胞 /微升；

在容器中添加 50纳升所述细胞悬浮液；

在所述容器中添加细胞裂解液，以便裂解所述容器中的细胞，并释放所述细胞中的 mRNA; 以及

在所述容器中添加反转录试剂，以便对所述 mRNA进行反转录，获得 cDNA。
18、根据权利要求 14所述的装置，其特征在于，所述容器为多孔板中的至少一个，优选所述多孔板为 5124孔板。
19、根据权利要求 14所述的装置，其特征在于，所述判断单元进一步包括：

Ct值确定模块，所述 Ct值确定模块用于基于所述容器的荧光变化数据，建立扩增曲线，并且基于所述扩增曲线，确定所述容器的 Ct值；以及

第一判断模块，所述第一判断模块中设置有预定的第一 α阈值，所述第一判断模块与所述 α值确定模块相连，用于将所述容器的 α值与预定的第一 α阈值进行比较，其中，所述容器的 ct值高于所述预定的第一 α阈值是所述容器中所包含的核酸来源于单个细胞的指示。
20、根据权利要求 19所述的装置，其特征在于，所述预定的第一 α阈值是通过对对照容器进行实时荧光定量 PCR而确定的，其中，所述对照容器含有已知量的核酸，优选地，所述对照容器含有 10pg核酸。
21、根据权利要求 20所述的装置，其特征在于，所述预定的第一 Ct阈值是通过下列步骤确定的：

(a)对多个所述对照容器进行实时荧光定量 PCR，以便确定各所述对照容器的 Ct值; 以及

(b)确定这样一个数值作为所述预定的第一 Ct阈值，其中，全部所述多个对照容器的 Ct值中至少 1.75%小于所述数值。
22、根据权利要求 19所述的装置，其特征在于，所述预定的第一 Ct阈值是通过下列公式确定的：

预定的第一 Ct阈值 = (平均 Ct值 -a)

其中，所述平均 Ct值是所述多个对照容器的 Ct值中至少一部分的平均值， a是在 0.1~1 之间的常数，优选 a=0.5。
23、根据权利要求 22所述的装置，其特征在于，所述容器的 Ct值高于所述预定的第一

Ct阈值但小于预定的第二 Ct阈值是所述容器中所包含的核酸来源于单个细胞的指示，其中，所述预定的第二 Ct阈值是通过下列公式确定的：

预定的第二 Ct阈值 =预定的第一 Ct阈值 +2a， a是在 0.1 1之间的常数，优选 a=0.5。

24、根据权利要求 23所述的装置，其特征在于，所述预定的第一 Ct阈值为 12.78，所述预定的第二 Ct阈值为 13.78。
25、根据权利要求 14所述的装置，其特征在于，所述判断单元进一步包括：荧光变化曲线确定模块，所述荧光变化曲线确定模块用于基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器的荧光变化曲线；以及

第二判断模块，所述第二判断模块中设置有预定曲线，所述第二判断模块与所述荧光变化曲线确定模块相连，用于将所述容器的荧光变化曲线与预定曲线进行比较，以便确定所述实时荧光定量 PCR是否有效，

其中，

所述预定曲线是通过对含有已知预定量核酸的容器进行实时荧光定量 PCR而获得的，并且所述容器的荧光变化曲线与所述预定曲线平行表示所述实时荧光定量 PCR是有效的。
26、根据权利要求 14所述的装置，其特征在于，所述判断单元进一步包括：熔解曲线确定模块，所述熔解曲线确定模块用于基于所述容器的荧光变化数据，确定所述容器的熔解曲线；以及

去杂模块，所述去杂模块与所述熔解曲线确定模块相连，用于基于所述容器的熔解曲线，排除不合格容器，

其中，所述不合格容器的熔解曲线中仅有引物二聚体峰，或者存在引物二聚体峰异常。
27、一种获取单细胞核酸的方法，其特征在于，包括：

提供细胞悬浮液，所述细胞悬浮液含有 2~5个细胞 /微升；

在容器中添加 50纳升所述细胞悬浮液；

在所述容器中添加细胞裂解液，以便裂解所述容器中的细胞，并释放所述细胞中的 mRNA;

在所述容器中添加反转录试剂，以便对所述 mRNA进行反转录，获得 cDNA; 以及根据权利要求 1-13任一项所述的方法，确定所述容器中所包含的 cDNA是否来源于单个细胞，

任选地，在确定所述容器中所包含的 cDNA是否来源于单个细胞之后，进一步包括，利用毛细管获取实时荧光定量 PCR产物。
28、一种构建单细胞核酸测序文库的方法，其特征在于，包括：

根据权利要求 27所述的方法，获取单细胞核酸；以及

针对所述单细胞核酸，构建核酸测序文库。

29、根据权利要求 28所述的方法，其特征在于，基于选自 HISEQ2000、 SOLID, 454 和单分子测序平台的至少一种构建所述核酸测序文库。
30、一种构建单细胞核酸测序文库的系统，其特征在于，包括：

权利要求 14-26所述的确定容器中核酸是否来源于单个细胞的装置；以及

文库构建装置，所述文库构建装置用于针对所述单细胞核酸，构建核酸测序文库。
31、根据权利要求 30 所述的系统，其特征在于，所述文库构建装置适于基于选自 HISEQ2000、 SOLID 454和单分子测序平台的至少一种构建所述核酸测序文库。
32、一种确定单细胞核酸的序列的方法，其特征在于，包括：根据权利要求 28所述的方法，构建单细胞核酸测序文库；以及

对所述单细胞核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果，确定所述单细胞核酸的序列。

33、根据权利要求 32所述的方法，其特征在于，利用选自 HISEQ2000、 SOLID, 454 和单分子测序平台的至少一种进行所述测序。