WO2019166731A1 - Méthode pour génerer un profil des capacités de réparation de l'adn de cellules tumorales et ses applications - Google Patents

Méthode pour génerer un profil des capacités de réparation de l'adn de cellules tumorales et ses applications Download PDF

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Sylvie Sauvaigo
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    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development

Definitions

  • the present invention relates to a method for generating a profile of tumor cell DNA repair capabilities and its applications, in particular for the prognosis of cancer, the choice, the monitoring and / or the prediction of the therapeutic efficacy of a tumor. treatment of cancer in a patient, as well as to screen for anticancer drugs.
  • the present invention also relates to a reference library comprising the profiles of the DNA repair capabilities of different cancer subtypes, obtained by the method of the invention, and its applications for the classification of cancers.
  • Cancer immunotherapy which has revolutionized the management of patients with therapeutic failure, includes the use of monoclonal antibodies, particularly immune checkpoint inhibitors such as anti-CTLA-4, anti-PD-1 , and anti-PD-L1, and bispecific antibodies that bind cancer cells and immune cells.
  • biomarkers are developed to stratify (or classify) patients at different stages of their care, particularly for the diagnosis, prognosis, choice, follow-up and prediction of patients. the therapeutic efficacy of a treatment.
  • Cancers are classified into different subtypes according to the expression of markers by the tumor cells. For example, breast cancers are classified into subtypes based on estrogen receptor (ER) and progesterone (PR) and HER2 / ERB2 / neu receptor expression. Generally ER + and PR + cancers are treated with tamoxifen. However, not all ER + breast cancers respond to treatment and other markers are sought to identify non-responders. Triple negative breast cancers (ER-, PR-, ERB2-) are treated with chemotherapy, but failure and recurrence rates are common. Many biomarkers are being explored to characterize these subtypes, but none has shown clinical utility at this time.
  • Cancers are also classified into different subtypes by the presence of genomic alterations in the tumor DNA, such as mutations in certain key genes, chromosomal rearrangements or gene amplifications, causing pathway activation. proliferation and cell survival.
  • melanomas are classified into subtypes according to mutations in different key genes (BRAF, NRAS), responsible for the constitutive activation of the MAP Kinases pathway.
  • BRAF key genes
  • NRAS NRAS
  • the use of specific inhibitors directed against mutated BRAF proteins for example, is not always associated as expected with the inactivation of signaling pathways (Manzano et al., Ann Med, 2016; , 237). The classification thus obtained is not sufficient to identify the responders and does not allow to administer the right treatment to patients.
  • Cancers are also classified according to genomic alterations in the tumor DNA (mutations, mutation rate, microsatellite instability (MSI), gene amplifications) favoring the appearance of neo-antigens on tumors, which are likely to predict the response to immunotherapies.
  • genomic alterations in the tumor DNA mutations, mutation rate, microsatellite instability (MSI), gene amplifications
  • MSI microsatellite instability
  • gene amplifications amplification technologies used to identify mutations that cause neo-antigens introduce bias and errors, and are unreliable for this application (“The problem with neoantigen prediction", Nat Biotech 2017, 35, 97).
  • the methods that rely on the detection of genomic alterations in the tumor DNA only partially analyze the defects that may occur and above all do not study the causes or consequences at the functional level.
  • BER Base Excision Repair
  • the nucleotide excision repair system (REN or NER for Nucleotide Excision Repair) supports large lesions inducing DNA double-helix distortion (acetylaminofluorene, cisplatin and psoralen adducts, UVB-induced dimers and C, covalent lesions formed between a base of the DNA and another molecule).
  • These two repair systems have common characteristics and include in all cases: (i) an excision step during which the modified nucleotide is eliminated and (ii) a resynthesis step which implements the polymerases present in the medium, during which at least one nucleoside triphosphate (nucleotide) present in the medium is incorporated as a replacement in the DNA strand.
  • US Application 2017/198360 discloses a molecular test that distinguishes cancer subtypes based on genetic defects in DNA repair, leading to overexpression or under-expression of transcripts related to the repair of cancer. DNA. This stratification is used to select the most appropriate chemotherapies among DNA - targeting drugs or DNA repair activities. However, it is well known that the resistance or sensitivity of tumors to treatments directly or indirectly affecting DNA or DNA repair derives from deregulation of DNA repair, but also from dysregulation of signaling called response. damage to the DNA (DNA Damage Response or DDR) and several sensors and molecular effectors that in turn regulate DDR and belong in particular to signaling pathways / cell proliferation.
  • DDR DNA Damage Response
  • DNA defects accumulate when DNA repair systems are functionally deficient. These functional deficiencies can be caused by dysfunctions at different levels of the molecular regulations governing the DNA repair: epigenetic level, DNA, RNA, Proteins, post-translational modifications. It is therefore much more relevant to seek to directly characterize the functionality of repair systems than the mutational status in certain genes or areas of the genome chosen a priori.
  • DNA repair activities are closely associated with cell signaling / proliferation pathways and their functionality. Mutations in signaling pathways / cell proliferation impact DNA repair capabilities (Velic D et al, Biomolecules, 2015, 5, 3204-3259). DNA repair activities are closely associated with mutations, translocations, amplifications, and microsatellite instabilities. Repair capabilities reveal repair defects that have functional consequences.
  • Metastatic melanoma has long had a poor prognosis with 15-20% response rates to chemotherapy and radiotherapy (Quirt et al., Oncologist, 2007, 12, 1114-1123). DNA repair mechanisms are thought to be responsible for this high rate of failure (Sarasin A and Dessen P, Mol Mol Med, 2010, 10, 413-418, Tentori et al., Curr Med Med Chem. 2009, 16, 245-257). More generally, the efficacy of nucleotide excision repair modulates the response of patients to cisplatin (Gavande et al., Pharmacol Ther, 2016, 160, 65-83) and the effectiveness of radiotherapy depends on the ability to repair. Double-strand breaks (Biau et al., Neoplasia, 2014, 16, 835-844).
  • the international application WO 2004/059004 describes a method of quantitative evaluation of the overall and specific DNA repair capabilities of at least one biological medium in which the repair of DNA lesions by the repair enzymes present in the Biological medium to be tested is carried out in the presence of a single labeled nucleotide.
  • the various lesions are formed by chemical or physical reactions from bases or very specific nucleosides (C, G, T or A) and are repaired by ways not leading to the simple replacement of the lesion but to the eventual replacement in addition, nucleotides surrounding the lesion, depending on the nature of the route taken.
  • the BER can intervene by a "short resynthesis" pathway (short patch, replacement of 1 to 3 nucleotides) or a "long resynthesis” pathway (long patch, replacement of about ten nucleotides); NER can also intervene and lead to the replacement of 25 to 30 nucleotides. Sometimes the NER mechanism can replace the BER mechanism.
  • the repair of an L1 lesion borrows a short synthesis BER path, it is mainly the nucleotide at the origin of the formation of L1 which will be incorporated. However, if the repair reaction takes place with a different marked nucleotide, the repair will be poorly evaluated because it is considered ineffective when it has not been quantified under the appropriate conditions.
  • the Applicant has developed a method for generating a profile of DNA tumor cell repair capabilities to overcome these disadvantages.
  • the present invention relates to an in vitro method for generating a profile of tumor cell DNA repair capabilities, comprising at least the following steps:
  • step (b) measuring the amount of each labeled nucleotide incorporated into each damaged DNA molecule that results from the activity of the repair enzymes present in said cell extract in step (a),
  • step (c) determining, from the values measured in step (b), at least one of the following parameters:
  • step (d) profiling the DNA repair capabilities of said tumor cells from the parameters determined in step (c).
  • tumor cells means tumor cells isolated from a biological sample taken from a patient and the tumor cell lines.
  • the tumor cells are isolated from a tumor sample or a blood sample containing circulating tumor cells taken from a patient.
  • the tumor sample is for example obtained by biopsy or surgical excision of the tumor.
  • the tumor cells are generally isolated by dissociation of the tumor tissue, in particular by enzymatic digestion, for example with collagenase. This prior step is not necessary when the biological sample contains circulating tumor cells.
  • tumor means a malignant tumor, that is to say a tumor associated with cancer.
  • a tumor includes a primary tumor and a metastasis.
  • the metastasis can be localized in a lymph draining lymph node (lymph node metastasis) and / or in a different tissue or organ from the primary tumor.
  • Cancers that may be classified by the method of the invention include, in particular, cancers related to exposure to genotoxic agents such as melanoma, in particular metastatic melanoma (related to exposure to ultraviolet radiation), cancer lung (related to tobacco exposure) and head and neck cancer (related to exposure to tobacco and alcohol); other cancers such as breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, sarcomas; and any solid cancer for which an invasive biopsy or ganglion is available.
  • genotoxic agents such as melanoma, in particular metastatic melanoma (related to exposure to ultraviolet radiation), cancer lung (related to tobacco exposure) and head and neck cancer (related to exposure to tobacco and alcohol); other cancers such as breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, sarcomas; and any solid cancer for which an invasive biopsy or ganglion is available.
  • the term "previously characterized tumor” means a tumor characterized by conventional tumor classification methods and possibly new methods of molecular biology or any other method for establishing categories of tumors.
  • Conventional methods of tumor classification include, in particular: histopathological and histological classification which takes into account the organ or tissue of origin and the histological type of the tumor and makes it possible to determine the type of cancer; the classification into grades which makes it possible to evaluate the degree of differentiation of the tumor and its evolution (slow and local or fast); the TNM classification (Tumor, Node, Metastasis) that determines the stage of cancer progression.
  • histopathological and histological classification which takes into account the organ or tissue of origin and the histological type of the tumor and makes it possible to determine the type of cancer
  • the classification into grades which makes it possible to evaluate the degree of differentiation of the tumor and its evolution (slow and local or fast)
  • TNM classification Tuor, Node, Metastasis
  • New methods of tumor classification rely on a division of tumors into subtypes, based on indicative biomarkers, such as genetic, epigenetic, proteomic, glycomic, imaging or other biomarker markers.
  • the biomarkers indicative of the presence of cancer including specific markers of certain types of tumor, are useful for diagnosis.
  • the biomarkers indicative of the future evolution of a cancer are useful for the prognosis, the choice of the treatment, the follow-up and the prediction of the therapeutic effectiveness of a treatment.
  • biomarkers include genes, RNA, proteins, metabolites or biological processes.
  • the types of cancer can be characterized in particular or classified into different subtypes according to the markers expressed by the tumor cells.
  • breast cancer is divided into subtypes based on the expression of estrogen (ER) and progesterone (PR) and HER2 receptors by tumor cells.
  • ER estrogen
  • PR progesterone
  • Cancer types can also be characterized or classified into different subtypes by the presence of genomic alterations in the tumor DNA, such as mutations in certain key genes, chromosomal rearrangements, or gene amplifications, at the origin activation of proliferation pathways and cell survival.
  • genomic alterations include fusion genes, deletions, mutation hot spots, gene variants, high mutation rates, genes with multiple copies (gene amplifications), gene markers.
  • MSI microsatellite instability
  • mutations in DNA repair genes DNA Damage Response, tyrosine kinase receptor, and kinase receptors.
  • EGFR EGFR
  • BRAF PIK3CA
  • AKT1 ERBB2
  • PTEN PTEN
  • MEK MEK
  • MAP2K1 KIT
  • CDKN2A MYC
  • anti-oncogenes such as TP53.
  • the subtypes of cancer are mutated BRAF, mutated NRAS and non-mutated for BRAF and NRAS.
  • Cancers are also classified according to genomic alterations in tumor DNA (mutations, mutation rates, microsatellite instability, gene amplifications) that promote the appearance of neoantigens on tumors and are likely to predict the response to immunotherapies.
  • Genomic alterations are evidenced by "omic” methods (genomics, proteomics, transcriptomics, metabolomics) or any other method allowing the direct or indirect characterization of genomic alterations.
  • the different Cancer subtypes do not respond in the same way to recommended therapeutic treatments.
  • the term "patient” means an individual, human or animal, preferably a human, suffering from cancer.
  • treatment means a therapeutic anti-tumor or anti-cancer treatment. These include chemotherapy, radiotherapy, targeted therapy and immunotherapy.
  • plasmid means a supercoiled plasmid, that is to say without single-strand breaks or double-stranded DNA.
  • Repair means the repair of DNA;
  • Repair signature the signature of the DNA repair capabilities;
  • Repair profile the profile of DNA repair capabilities.
  • damaged DNA means a DNA molecule comprising DNA lesions, preferably a single type of DNA lesion. DNA, or several lesions created by the same genotoxic or chemical agent.
  • said tumor cells are isolated from a tumor sample or blood of a patient.
  • said tumor cells are isolated from at least one previously characterized tumor.
  • the tumor is defined by conventional criteria for classifying tumors as defined above.
  • the tumor is defined by at least one marker of interest for the diagnosis and / or treatment of this type of cancer, in particular a biomarker or a combination of biomarkers specific for a subtype of this type of cancer, possibly associated with one or more biomarkers of the progression, prediction and / or monitoring of the response to a treatment of this type or subtype of cancer.
  • the characterized tumor corresponds in particular to the subtype of the cancer of the patient to be tested or for which new antitumor agents are sought or a more effective treatment.
  • the implementation of the method of the invention on tumor cells isolated from a tumor characterized as defined above makes it possible to obtain a tumor cell repair profile that is specific for a subtype of tumor. particular cancer.
  • a repair profile that is associated with particular cancer subtype is referred to as the referral or reference profile.
  • the method of the invention is advantageously implemented with a set of different tumors of the same type of cancer previously characterized (library or tumor bank), so as to obtain a set of reference profiles called library or reference bank .
  • the method of the invention is implemented with tumors corresponding to different subtypes of a type of cancer including at least the cancer subtypes of the test patients, in particular the subtypes of cancer. which guide or condition the choice of treatment in patients, so as to obtain databases of specific reference profiles of the different subtypes of different types of cancer, in particular subtypes of cancer which condition the choice of treatment in patients. patients.
  • the reference library preferably includes the reference profile of responder and / or non-responder patients for the recommended therapeutic treatment, particularly targeted therapy, including mutation-guided therapy.
  • key genes such as mutations in the BRAF and NRAS genes for melanoma.
  • the patient is suffering from a cancer linked to exposure to genotoxic agents, for example a melanoma, in particular a metastatic melanoma of a given subtype, namely, mutated BRAF. , NRAS mutated or non-mutated for BRAF and NRAS.
  • genotoxic agents for example a melanoma, in particular a metastatic melanoma of a given subtype, namely, mutated BRAF. , NRAS mutated or non-mutated for BRAF and NRAS.
  • the isolated tumor cells are pretreated in order to extract the nuclear proteins which contain the DNA repair enzymes. Extraction of the nuclear proteins from the isolated tumor cells is carried out according to the standard techniques well known to those skilled in the art.
  • the isolated tumor cells are usually lysed to isolate the nuclei and then the nuclei are then lysed to extract the nuclear proteins.
  • To prepare the nuclear protein extract one can use the protocols described for in vitro transcription tests or in vitro DNA repair assays, such as those described by Dignam JD et al. (Nucleic Acids Research, 1983, 11: 1475-1489); Kaw L et al. (Gene Analysis Techniques, 1988, 5, 22-31); Iliakis G et al.
  • the nuclear extracts may further be fractionated or dialyzed according to conventional methods. All steps of preparation of the nuclear protein extract are carried out under conditions which do not denature the enzymatic activities and proteins contained in the tumor cells, so that the DNA repair activity initially present in the the sample of tumor cells is preserved in the cell extract which is analyzed in the method of the invention.
  • the tumor cell extract comprising a DNA repair activity is a cell lysate, preferably a nuclear lysate, so preferred nuclear protein extract of said tumor cells.
  • the damaged DNA which serves as a repair matrix for the DNA repair enzymes present in the tumor cell extract is a linear or circular single or double stranded DNA, short (less than 100 bases) or long (greater than 100 bases).
  • these include short or long DNA fragments as described in Application WO 01/90408 or supercoiled circular double-stranded DNA, in particular a plasmid as described in Application WO 2004/059004, Millau et al. al., Lab. Chip., 2008, 8, 1713-1722; Prunier et al., Mutation Research, 2012, 736, 48-55.
  • the damaged DNA is a damaged plasmid.
  • the damaged DNA comprises lesions induced by a known genotoxic physical or chemical agent, in particular by treatment of an isolated plasmid or cells comprising said plasmid, with the genotoxic agent.
  • a known genotoxic physical or chemical agent in particular by treatment of an isolated plasmid or cells comprising said plasmid, with the genotoxic agent.
  • the lesions present in the damaged or damaged DNA mention may be made especially of the lesions of purine or pyrimidine bases, sugars, the structure of the double helix and the single-strand and double-strand breaks.
  • Lesions of purine or pyrimidine bases include:
  • abasic sites in particular depurinations which can be generated by acid treatment of the DNA at a high temperature as described in Millau et al. and Prunier et al., supra; glycols of thymine and / or cytosine (Glycol), which can be generated by treatment of the DNA with potassium permanganate as described in Millau et al. and Prunier et al., 2008, supra;
  • etheno-bases such as etheno-guanine and / or etheno-adenosine, in particular etheno-guanine, induced in particular by the trans, trans -2 -4 decadienal (DDE), as described in Application WO 2004/059004, Millau et al. and Prunier et al., supra; or the etheno-guanine and etheno-adenosine mixture created by chloroacetaldehyde (B. Tudek, et al., IARC Sci Publ (1999) 279-93).
  • 8-oxo-guanine 8-oxo-G
  • 8-oxo-2'-desoxyguanosine 8-oxo-dG
  • 8-oxo-G is in particular induced by photosensitization in the presence of riboflavin, as described in Millau et al. and Prunier et al.
  • the formation of 8-oxo-dG is in particular induced by treatment with an endoperoxide such as DHPN0 2 , as described in Application WO 2004/059004;
  • photoproducts in particular cyclobutane-type pyrimidine dimers (CPD) and pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproducts 6-4 or 6-4PP), alone or as a mixture, induced by UV B or C, as described in WO 2004/059004; Millau et al. and Prunier et al., supra; pyrimidine dimer formed by UV A photosensitization in the presence of norfloxacin, as described in Sauvaigo S, et al., Photochem. Photobiol. 200, 73, 230-237;
  • PAHs polycyclic aromatic hydrocarbons
  • alkylating agents such as cisplatin, mitomycin and chlorambucil
  • aromatic amines and mycotoxins
  • Lesions in the double-helix structure include the formation of intra- and inter-strand bridging, usually caused by ultraviolet and bifunctional antitumor, such as UV B, cisplatin, psoralen in the presence of UV-A mitomycin and chlorambucil; the intercalating agents form stable covalent bonds between the opposite bases of the DNA strands.
  • Cisplatin lesions predominantly GG and GA intra-strand grafts and inter-strand GG grafts, include generated as described in Millau et al. and Prunier, supra.
  • Lesions of psoralen, in particular intra-strand and interbrid TT bypasses are generated by UV A photosensitization, as described in Millau et al.
  • the lesions of the sugars break the phosphodiester bonds at the site of the lesion, followed by a rupture of the DNA strand.
  • Single-strand and double-strand breaks are notably produced by agents such as ionizing radiation and by the action of free radicals.
  • the damaged DNA comprises lesions of the purine and / or pyrimidine bases or lesions of the structure of the double helix as defined above, that is to say lesions which do not induce breaks single-stranded or double-stranded DNA.
  • each damaged DNA preferably a damaged plasmid
  • the super-coiled fraction of each plasmid is selected after treatment of the DNA with the genotoxic agent or combination of genotoxic agents that induces purine and / or pyrimidine base lesions and / or the double helix as defined above, so as to exclude strand breaks (relaxed structure) and to avoid the action of nucleases.
  • step (a) is carried out with at least two damaged DNAs comprising distinct lesions, preferably selected from the group consisting of:
  • Ethenobases notably Etheno-guanines (Etheno-G) and / or Etheno- Adenines (Etheno-A), especially Etheno-G
  • Etheno-G Etheno-guanines
  • Etheno-A Etheno- Adenines
  • Photoproducts in particular pyrimidine dimers of cyclobutane type (CPD) and pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproducts 6-4 or 6-4PP), alone or as a mixture.
  • CPD cyclobutane type
  • 6-4 pyrimidines
  • pyrimidones photoproducts 6-4 or 6-4PP
  • the damaged DNAs are advantageously damaged plasmids.
  • each damaged DNA carries a single type of lesions as listed above, namely 8-oxo-G, AbaS, Etheno, Glycols or Photoproducts.
  • step (a) is carried out with at least a first DNA, preferably a plasmid, comprising a single type of lesion repaired by the excision repair system. of base (REB or BER for "Base Excision Repair”) and at least a second DNA, preferably a plasmid, comprising a single type of lesions repaired by the nucleotide excision repair system (REN or NER for "Nucleotide Excision Repair” ).
  • base REB or BER for "Base Excision Repair”
  • REN or NER nucleotide Excision Repair
  • the BER repaired lesions are selected from the group consisting of: (1) 8-oxo-G; (2) abasic sites (AbaS); (3) Ethenobases (etheno), especially etheno-guanines (etheno-G) and / or etheno-adenines (etheno-A), in particular etheno-G; (4) Thymine and / or cytosine glycols, and NER repaired lesions are photoproducts, including cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) and pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproducts 6-4 or 6) -4PP), alone or as a mixture, preferably in a mixture.
  • CPD cyclobutane pyrimidine dimers
  • 6-4 pyrimidines
  • pyrimidones photoproducts 6-4 or 6) -4PP
  • step (a) is carried out with at least a first DNA, preferably a plasmid, comprising 8-oxoG lesions and at least one second DNA, preferably a plasmid, comprising pyrimidine dimers of the cyclobutane type (CPD) and pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproducts 6-4 or 6-4PP), alone or as a mixture, preferably in a mixture.
  • a first DNA preferably a plasmid, comprising 8-oxoG lesions
  • at least one second DNA preferably a plasmid, comprising pyrimidine dimers of the cyclobutane type (CPD) and pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproducts 6-4 or 6-4PP)
  • CPD cyclobutane type
  • 6-4 pyrimidines
  • photoproducts 6-4 or 6-4PP pyrimidones
  • step (a) is carried out with:
  • a first DNA preferably a plasmid, comprising 8-oxoG lesions
  • a second DNA preferably a plasmid, comprising abasic sites (AbaS);
  • a third DNA preferably a plasmid, comprising Ethenobases (Etheno), in particular Etheno-guanines (Etheno-G) and / or Etheno-Adenines (Etheno-A), in particular Etheno-G;
  • a fourth DNA preferably a plasmid, comprising thymine and / or cytosine glycols;
  • a fifth DNA preferably a plasmid, comprising cyclobutane-type pyrimidine dimers (CPD); and
  • a sixth DNA preferably a plasmid, comprising a mixture of pyrimidine dimers of cyclobutane type (CPD) and pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproducts 6-4 or 6-4PP).
  • CPD cyclobutane type
  • 6-4 pyrimidines
  • photoproducts 6-4 or 6-4PP photoproducts
  • the damaged or damaged DNA is immobilized on a solid support, thus making it possible to easily remove the labeled nucleotides not incorporated in step (a), by a washing step, before the step (b) of measuring nucleotide incorporation into the damaged DNA.
  • the solid support is a suitable support for the immobilization of nucleic acids and in particular DNA, such as, for example, a support made of glass, polypropylene, polystyrene, silicone, metal, nitrocellulose or nylon, optionally modified with a porous film, in particular a nylon or hydrogel film, for example a polyacrylamide hydrogel. These include a glass slide or silicone covered with a hydrogel.
  • the support is advantageously a miniaturized support of the microchip type.
  • Such supports modified with a porous film are described in particular in Application WO 2006/136686; Millau et al. and Prunier et al., supra.
  • the DNA is deposited on the support, for example in an automated manner using a robot such as a piezoelectric robot.
  • the method of the invention can be carried out in parallel on several tumor cell extracts, with a support on which are immobilized different series of damaged DNA. This is particularly a high-throughput method, partially or fully automated.
  • the nucleosides used as markers are the conventional nucleosides Adenosine, Cytidine, Guanosine, Thymidine or Uracil, in triphosphate form, ie nucleotides.
  • the method is conducted with at least two nucleoside triphosphates (nucleotides) among dCTP, dGTP, dATP and dUTP.
  • dGTP provides more intense signals than other dNTPs for the repair of BER-repaired lesions formed from the guanine base, such as 8-oxo-guanine.
  • the use of another dNTP serves as a point of comparison and ensures that the dGTP is incorporated in majority compared to other dNTPs.
  • dATP provides more intense signals for the repair of lesions repaired by the BER and created from the adenine base such as ethenoadenine and abasic sites.
  • adenine base such as ethenoadenine and abasic sites.
  • another dNTP serves as a point of comparison and makes it possible to make sure that the dATP is incorporated in majority compared to the other dNTPs.
  • the abasic sites are also formed from the depurination of guanosine, so it is interesting to compare the incorporation of dATP, dGTP and another dNTP for the repair of this lesion.
  • Ethenobase lesions are generally composed of a mixture of Etheno-A and Etheno-G, the use of a nucleotide of a different nature from dATP and dGTP serves as a point of comparison and makes it possible to ensure that dATP and the dGTP are incorporated in larger quantity than the other dNTPs.
  • dCTP provides more intense signals for the repair of BER repaired lesions created from the cytosine base such as cytosine glycols.
  • dUTP makes it possible to obtain more intense signals for the repair of lesions repaired by the BER and created from the thymine base, for example thymine glycols.
  • dNTP dNTP other than dCTP or dUTP serves as a reference.
  • the repair aberrations measured by comparison of the signatures obtained in the presence of the different nucleotides make it possible to identify the samples with dysfunctional repair pathways.
  • step (b) of the method of the invention is carried out with at least the labeled dGTP and dCTP nucleotides, preferably the labeled nucleotides dCTP, dGTP, dATP and dUTP.
  • DCTP is preferred for the choice, the follow-up, the prediction of the therapeutic efficacy of a targeted therapy, guided by the presence of mutations in key genes such as mutations in the BRAF and NRAS genes for melanoma.
  • the nucleotides are labeled, which allows them to be detected and quantified when they are incorporated into the damaged DNA as a result of the DNA repair reaction.
  • the tracer or marker that is used for nucleotide labeling is detectable by measuring a signal that is proportional to the amount of nucleotide incorporated into the damaged DNA, including damaged plasmids.
  • tracers or direct labeling agents are in particular radioactive isotopes or luminescent compounds (radioluminescent, chemiluminescent, bioluminescent, fluorescent or phosphorescent), such as fluorophores such as, in a nonlimiting manner, Cyanine 3, and Cyanine 5.
  • Indirect labeling agents include affinity molecules such as biotin (streptavidin / biotin system), digoxigenin or any molecule that can be revealed by a ligand-receptor interaction, in particular using an antibody or by a chemical treatment.
  • the dNTP labeling in particular fluorescent, radioactive, magnetic or colorimetric labeling, is detectable by any technique known to those skilled in the art, such as, but not limited to, fluorescence microscopy, flow cytometry, gamma radiography, magnetic resonance imaging and mass spectrometry.
  • step a) makes it possible to perform a single repair reaction by damaged DNA (step a)) but requires a specific detector for each marker (step (b)).
  • step (b) The use of a single marker for the different nucleotides makes it necessary to perform the repair (step a) in separate reactions for each nucleotide, with each damaged DNA but allows the use of a single detector to measure the repair signal ( step b)).
  • the marking is a fluorescent marking, direct or indirect.
  • the nucleotides are labeled with a fluorophore. Even more preferably, all the nucleotides are labeled with the same fluorophore.
  • the repair reaction (step a)) is carried out under conditions allowing the repair of DNA lesions by the repair enzymes present in the said cell extract and incorporation of each labeled nucleotide into each damaged DNA. These conditions, which are well known to those skilled in the art, are described in application WO 2004/059004; Millau et al. and Prunier et al., 2008, supra.
  • the repair reaction is performed in the presence of ATP, an ATP regeneration system and any other agent necessary for the activity of the DNA repair enzymes present in the tumor cell extract.
  • the repair buffer contains 200 mM Hepes / KOH, pH 7.8; 35 mM MgCl 2; 2.5 mM DTT; 1.25 mM each of the four dNTPs; 1 mM ATP, 17% glycerol; 50 mM phosphocreatinine; 10 mM EDTA; 250 ⁇ g / mL creatine phosphokinase and 0.5 mg / L BSA.
  • the repair reaction is generally performed with a nuclear protein extract containing 0.2 to 2 mg of protein per ml.
  • the reaction is carried out at a temperature promoting the repair reaction, preferably at 30 ° C, for a sufficient time, generally between one and five hours.
  • the reaction is advantageously carried out in the microwells of a miniaturized support of the microchip type as defined above.
  • step (a) are performed in parallel with a non-damaged control DNA which is used to measure the background of the repair reaction (step (b)). Accordingly, step (a) further comprises control reactions for each labeled nucleotide, wherein the cell extract is incubated with an undamaged control DNA and separately with each of the labeled nucleotides.
  • the support on which the DNA is fixed Prior to step (b) of measuring the signal of incorporation of the marker in the damaged DNA (repair signal), the support on which the DNA is fixed is generally washed at least once with the aid of a saline solution containing a nonionic surfactant, especially a 10 mM phosphate buffer, containing 0.05% Tween 20, and is then rinsed with water, at least once.
  • a nonionic surfactant especially a 10 mM phosphate buffer, containing 0.05% Tween 20
  • step (b) comprises measuring the marker incorporation signal in the damaged DNA, preferably the damaged plasmid, for the various repair reactions of step (a).
  • Each reaction of step (a) corresponding to the repair of a DNA comprising a single type of lesions as defined above with a single labeled dNTP as defined above.
  • step (b) also comprises measuring the marker incorporation signal in the non-damaged control DNA, for each of the labeled nucleotides of the step (a), so as to measure the background of the repair reaction for each of the labeled nucleotides.
  • the measurement of the signal is carried out by a method adapted to the marker, using an instrumentation adapted to the support and the marker used.
  • the marker is a fluorophore
  • the fluorescence signals emitted by the different deposits (or spots) of the support are directly measured.
  • a scanner can be used for fluorescence image analysis.
  • An apparatus capable of exciting the fluorophore and measuring the signal emitted by the excitation is preferably used.
  • the enzymatic signature of the DNA repair of the tumor cells corresponds to the set of signals measured in step (b) for the repair of all the lesions present (n lesions in total) by the extract of said tumor cells, with each of the labeled nucleotides (at least two nucleotides X and Y, and optionally a third nucleotide Z and a fourth nucleotide W).
  • the repair signature obtained with the nucleotides X and Y is the set:
  • X is the first nucleotide for which the repair signature of all the lesions is determined
  • I X1 is the signal value measured for the nucleotide X with respect to a first lesion
  • I x2 is the signal value measured for the nucleotide X vis-à-vis a second lesion
  • I Xn is the signal value measured for the nucleotide X vis-a-vis the nth lesion
  • I C / x is the measured signal value for nucleotide X with the control plasmid
  • Y is the second nucleotide for which the repair signature of all the lesions is determined
  • I Y1 is the measured signal value for nucleotide Y vis-à-vis a first lesion
  • I Y2 is the signal value measured for nucleotide Y with respect to a second lesion
  • I Yn is the measured signal value for nucleotide Y vis-à-vis the nth lesion
  • I C / Y is the measured signal value for nucleotide Y with the control plasmid.
  • the repair signature obtained is different and dependent on the labeled nucleotide used ( Figure 1A-1D). It is analyzed by conventional clustering methods that take into account all the signals obtained for a given sample in order to compare the samples with each other and with the reference library ( Figure 2 A to 2E).
  • the repair signature characterizes the overall repair capabilities of a sample and essentially compares the intensity values obtained.
  • the use of at least two different nucleotides makes it possible to compare the sample with the reference library obtained in each of the conditions and to check the consistency of the classification or to highlight the discrepancies.
  • a sample may be in a certain class defined by the repair signature of the library with nucleotide X (corresponding to a subtype), and be in another class defined by the repair signature with nucleotide Y, which reveals an inconsistency in the classification. This inconsistency indicates that the sample is different from other samples in the class and therefore may not respond to the prescribed therapy for that class.
  • This first analysis is particularly suitable for identifying responders to targeted therapies prescribed on the basis of known mutations. Indeed, repair signatures are closely associated with cellular signaling / proliferation pathways and their functionality. In comparison with the reference profiles of the reference libraries, it will be determined whether the profile of the tumor bearing one or more mutations guiding the prescription of targeted therapies corresponds to the reference profile carrying the mutation that responds to the treatment. If discrepancies appear, this indicates that the targeted therapy will not be effective.
  • the repair signature obtained also makes it possible to identify the samples in which the repair activities for a given lesion are absent: this absence can be partial if a signal is measured with at least one nucleotide, total if it is not measured with any nucleotide.
  • This method will characterize tumors with significant mutations or genomic defects that are more likely to respond to immunotherapies.
  • Repair signatures are closely associated with defects in DNA repair mechanisms. Themselves are responsible for sensitivity and resistance to chemotherapy and radiation therapy. The repair signatures can be used to determine the best therapeutic strategy to follow among DNA repair inhibitor, chemotherapy and radiotherapy treatments, or combinations.
  • step (b) The different values obtained in step (b) are subjected to different rankings or calculations, combined or not: repair signature, contribution, relative rate of incorporation of each nucleotide, in order to obtain a repair profile giving the most possible information on the repair capabilities of tumor repair proteins.
  • the repair profile distinguishes the different functional repair mechanisms while quantifying them. More particularly, this profile makes it possible to distinguish:
  • tumors of the same type or subtype of cancer determined on the basis of a mutation in a key gene, or on the basis of other markers determining the choice of a treatment, are placed in the same group (are similar) or in a different group (no similarity);
  • BED Basic Excision Repair
  • REN Nucleotide Excision Repair
  • step (c 1 ) From the repair signature obtained in step (c 1 ), it is possible to determine the contribution of the repair of each of the lesions with respect to the total repair, independently for each of the nucleotides marked step (c 2 )). For example, the contribution (in percentage) of the repair of the first lesion to the total repair (n lesions) for nucleotides X and Y is determined, as a percentage, according to the formula:
  • the contribution makes it possible to determine the relative importance of the different repair paths for each sample ( Figure 3A to 3D).
  • the signature "contribution” allows a precise characterization of the effectiveness of each of the repaired pathways compared to the others.
  • the contribution gives a parameter independent of the absolute value of the measured signals and is therefore complementary to the repair signature.
  • the contribution varies for each sample depending on the nucleotide used.
  • Each sample will be characterized by as many "contribution” profiles as nucleotides used. These “contribution” profiles can be compared to the “contribution” profiles of the reference library to check the consistency of the classification.
  • a sample may be in a certain "contribution" class of the library with nucleotide X (corresponding to one subtype), and be in another “contribution” class with nucleotide Y, which reveals an inconsistency in the classification. This inconsistency indicates that the sample is different from other samples in the class and therefore may not respond to the prescribed therapy for that class.
  • Contribution profiles are closely associated with cellular signaling / proliferation pathways and their functionality.
  • Contribution profiles are closely associated with the ability of tumors to respond to chemotherapy and radiation therapy.
  • step (c 1 ) From the repair signature obtained in step (c 1 ), it is also possible to determine the relative rate of incorporation of each labeled nucleotide for at least two lesions of the DNA, independently for each lesion of the DNA (step (c 3 )).
  • This calculation makes it possible to determine whether the repair mechanisms are functional in the samples, and in particular the step involving polymerases, are those that are expected with respect to the reference library.
  • the interest is to directly identify the dysfunctions responsible for mutations or any other genomic defect favoring the appearance of neo-antigens on the surface of the tumors, associated with a better efficiency of the immunological treatments.
  • the direct detection of the repair profiles and in particular the relative rate of incorporation of each nucleotide avoids the use of PCR amplification methods necessary for the prediction of neo-antigens, which introduce biases (The problem with neoantigen prediction, Nat Biotech., 2017, 35, 97). Tumors for which repair activities are absent or malfunctioning due to mutations or genomic defects are more likely to respond to immunotherapies.
  • the use of two nucleotides overcomes the drawbacks of the use of a single nucleotide which gives only a partial profile of the tumor and partial information on the functional repair pathways.
  • the use of a single nucleotide does not make it possible to know which repair path is sought; what polymerase is involved; if the repair is faithful; if, in the absence of a signal, another route is likely to be used instead; it only allows a partial comparison with a reference library; it does not make it possible to determine which nucleoside is preferentially incorporated for the repair of each lesion.
  • the method of the invention comprises establishing the repair profile of tumor cells isolated from a tumor sample of a patient, and comparing said profile with at least one reference profile obtained for the patient. same subtype of cancer.
  • the reference profile is established simultaneously with or prior to the repair profile of the tumor cells of the patient.
  • the comparison is carried out with a reference library comprising the reference profiles of different subtypes of a cancer including at least the cancer subtypes of the test patients, in particular the cancer subtypes which guide or condition the choice of treatments in patients.
  • the profile of step (d) comprises:
  • the enzymatic signature of the DNA repair of the tumor cells the contribution of the repair of each of the DNA lesions to the total repair, independently for each of the labeled nucleotides, and the relative rate of incorporation of each labeled nucleotide for at least two lesions of the DNA, independently for each lesion of the DNA.
  • the repair signatures, the "contribution” profiles and the relative incorporation rates can be combined for comparison with the reference library processed under the same conditions.
  • repair profiles can be used to predict responses to chemotherapy and radiotherapy or to select patients responding to DNA repair inhibitors.
  • the same repair profile can be used to choose the best treatment among several classes of therapies or combinations of therapies.
  • the method according to the invention is useful for choosing the best therapeutic option for the patient according to the profile of the DNA repair capabilities of the tumor cells of the patient, obtained by the method according to the invention.
  • the best therapeutic option is chosen from among several classes of therapies or from combinations of therapies.
  • step (d) condition the treatment to be given to a patient:
  • tumor repair profile matches the reference library profile for the same types or subtypes of cancer, effective treatments for samples classified the same way in the reference library will be applied;
  • the repair profile shows dysfunctions of the DNA repair (absence of certain activities, polymerase defects, ..)
  • the immunotherapies can be used;
  • the resulting repair profile can be used to choose a treatment by radiotherapy, or chemotherapy or any other treatment damaging the DNA.
  • the repair profile may be used to select a DNA repair inhibitor, for example, to inhibit a specific pathway responsible for tumor resistance to DNA - targeting treatments, or to inhibit a redundant pathway of DNA repair. a way under expressed, so as to create a synthetic lethality;
  • the repair profile can be used to choose combinations of different treatments.
  • a specific high repair activity may be associated with radio or chemoresistance.
  • the inhibitor may be given, in association or not with a radio or chemotherapy creating lesions repaired by another way or the same way.
  • Combinations of complementary pathway inhibitors may also be considered, to avoid compensation compensation due to the activation of redundant pathways.
  • a weak activity can be associated with a radio or chemosensitivity.
  • a treatment which creates lesions repaired by the dysfunctional pathway will preferably be chosen.
  • targeted therapy for signaling pathways regulating DNA repair can be used if an activating target is identified.
  • Tumors for which repair activities are absent or have malfunctions may be treated by immunotherapy.
  • the present invention also relates to the use of the method for generating a profile of the tumor cell DNA repair capabilities according to the invention, for the prognosis of cancer, the choice, the monitoring and / or the prediction of effectiveness Therapeutic treatment of cancer in a patient, based on the profile of DNA repair capabilities of tumor cells obtained in step (d).
  • the present invention also relates to a method of treating a cancer in a patient, comprising:
  • the treatment is especially selected from chemotherapy, radiotherapy and immunotherapy.
  • Chemotherapy affects, directly or indirectly, DNA or DNA repair.
  • the present invention also relates to a method for prognosis of cancer in a patient, comprising:
  • the prognostic method according to the present invention makes it possible in particular to determine the survival of the patient. Indeed, there is a correlation between the intensity of the repair signal measured with the method of profiling the DNA repair capabilities according to the invention and the survival of the patient.
  • the cancer is related to exposure to genotoxic agents, for example a melanoma, especially metastatic melanoma of a subtype, namely, mutated BRAF, mutated or non-mutated NRAS for BRAF and NRAS.
  • the present invention also relates to the use of the tumor cell repair profile isolated from a tumor of a patient, obtained by the method for generating a profile of the tumor cell DNA repair capabilities according to the invention.
  • invention as a biomarker of cancer prognosis, selection, monitoring and / or prediction of the therapeutic efficacy of cancer treatment in a patient.
  • the present invention also relates to reference libraries comprising profiles of characterized tumor repair capabilities (reference profiles), corresponding to different subtypes of different cancers, obtained by the method for generating a profile of the repair capabilities of the tumor. DNA of tumor cells according to the invention.
  • the reference libraries contain the reference profiles of different subtypes of different cancers including at least the cancer subtypes of the patients to be tested, in particular the cancer subtypes that guide or condition the choice of anti-cancer treatments. in patients.
  • the reference library includes the reference profile of responder or non-responder patients for the recommended therapeutic treatment, particularly targeted therapy, including mutated therapy in key genes. , such as mutations in the BRAF and NRAS genes for melanoma.
  • the present invention also relates to a kit for implementing the method according to the invention, comprising:
  • At least two damaged DNAs comprising distinct lesions as defined above, preferably damaged plasmids as defined above, preferably immobilized on a suitable support as defined above; and at least two repair buffers,
  • a repair buffer comprising agents necessary for the activity of the DNA repair enzymes present in the tumor cell extract as defined above and at least two different labeled nucleotides, in a single buffer or in buffers separated for each nucleotide
  • the present invention also relates to a method of classifying a defined type of cancer from a tumor sample of a patient, comprising at least the following steps:
  • the present invention also relates to a method for screening anti-tumor agents, comprising at least the following steps:
  • the screening method is carried out with tumor cells in culture.
  • the anti-tumor agents selected by the screening method according to the invention are useful for the treatment of cancers.
  • FIG. 1 represents the signatures of repair of different DNA lesions by extracts of metastatic melanomas, in the presence of different labeled nucleotides.
  • AbaS abasic sites.
  • CPD pyrimidine dimers cyclobutane type.
  • CPD-64 mixture of pyrimidine dimers of cyclobutane type (CPD) and pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproducts 6-4 or 6-4PP).
  • Etheno a mixture of Etheno-guanines (Etheno-G) and Etheno-Adenines (Etheno-A).
  • Glycols A mixture of thymine glycols and cytosine.
  • FIG. 2 represents the classification of repair signatures by similarity of repair.
  • FIG. 3 represents the contribution of each repair pathway to the total repair for each of the labeled nucleotides.
  • FIG. 4 represents the relative rate of incorporation of each labeled nucleotide for the repair of each of the lesions.
  • AbaS abasic sites.
  • C. CPD pyrimidine dimers cyclobutane type.
  • CPD cyclobutane pyrimidine dimers
  • 6-4 pyrimidines
  • Glycols Thymine Glycols and Cytosine Blend.
  • Etheno Mixture of Etheno-guanines (Etheno-G) and Etheno-Adenines (Etheno-A). *: Only dCTP and dGTP were used.
  • FIG. 5 represents the correlation between the survival (abscissa) and the intensity of the repair signal (ordinate) by mutation group and by dNTP.
  • the samples are derived from patients with metastatic melanoma of known subtype (BRAF, NRAS, WT (not mutated for BRAF and NRAS) whose clinical data are shown in Table I.
  • Tumor or lymph node specimens are removed by surgical excision and prepared as follows. at. Cell dissociation
  • Cell dissociation is performed from a biopsy of lymph nodes or metastatic melanoma tumors.
  • the biopsy about 5 mm 3 , is deposited in a petri dish of diameter 100 mm with a few drops of RPMI-1640 Glutamax (Life Technologies). It is then cut into fragments using a scalpel. These fragments are transferred to a 15 ml centrifuge tube containing 5 ml of digestion medium (1 mg / ml Collagenase D (Roche), 50 IU / ml DNase I (Roche), RPMI-1640 Glutamax (Life Technologies)) . The tube containing the fragments is incubated for 30 minutes at 37 ° C.
  • the cells are then deposited on a 70 ⁇ m cell sieve (Dutscher), positioned on a 50 ml centrifuge tube kept in the ice.
  • the 15 mL tube is rinsed by adding 5 mL of additional cold PBS-EDTA buffer and the remaining fragments are passed through the sieve.
  • a sample is taken to count the cells.
  • the 50 mL tube is centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant is removed and the pellet is taken up in a solution of cryopreservation Albumin / DMSO (90% human albumin, 10% DMSO (Sigma)), at the rate of 4.10 6 cells per cryotube.
  • the cells are gradually frozen at -80 ° C. in a freezing container and then transferred to liquid nitrogen for long-term preservation.
  • the tumor cells are thawed at room temperature and then centrifuged at 500 RCL (Relative Centrifugal Lorce) for 5 minutes at 4 ° C. The supernatant is removed, and cells washed with 1 mL of cold PBS, and then re-centrifuged at 500 RCF, 5 minutes, at 4 ° C.
  • 500 RCL Relative Centrifugal Lorce
  • the cells are taken up in 1 ml of buffer A (10 mM HEPES pH 7.8, 1.5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 0.02% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) and incubated for 10 minutes in Each tube is vortexed for 30 seconds
  • the cells are centrifuged for 5 min at 2300 RCF, the supernatant is removed, and the cells are then taken up in 30 ⁇ l of buffer B (10 mM HEPES pH 7.8, 1.5 mM MgCl 2, 400 mM KC1, 0.2 mM EDTA, 25% glycerol, 0.5mM DTT, 0.5 mM PMSF, 100 ⁇ l 0.7X antiproteases (Complete-mini, Roche) After 20 minutes of incubation on ice, lysis of the nuclear membrane is performed by two cycles of freezing / thawing in liquid nitrogen at -l
  • the tubes are centrifuged at 16,000 RCF for 10 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant is divided into 10 ⁇ l aliquots.
  • a fraction of the supernatant is removed for a protein assay using the micro-BCA method (Interchim) .
  • the aliquots are subject to freezing. n 30 seconds in liquid nitrogen at -80 ° C and stored at -80 ° C.
  • a reaction mixture is prepared for each dNTP-biotin so as to obtain enzymatic signatures for DNA repair in the presence of different biotin-labeled dNTPs.
  • the reaction is carried out for 3 h at 30 ° C. in reaction chambers filled with 12 ⁇ l of medium consisting of 4.8 ⁇ l of 5 ⁇ buffer (200 mM Hepes KOH pH 7.8, 35 mM MgCl 2 , 2.5 mM DTT, 1.25 ⁇ M of each dNTP unlabeled (Perkin Elmer), 17% Glycerol, 50 mM phosphocreatine (Sigma), 10 mM EDTA, 250 ⁇ g / mL creatine phosphokinase, 0.5 mg / mL BSA, 0.5 ⁇ L ATP 100 mM (Amersham) and 1.25 ⁇ M dNTP-biotin (Perkin Elmer)), in the presence of nuclear extracts at a final concentration of 0.2 mg / m
  • the slides are rinsed 2 times 3 minutes with PBS / 0.05% Tween, then 2 times 3 minutes with MilliQ water.
  • the slides are incubated in a Streptavidin-Cy5 bath at 225 ng / ml, in the presence of BSA at 0.1 mg / ml, for 30 min at 30 ° C.
  • the slides are rinsed twice for 3 minutes with PBS / 0.05% Tween, and then twice for 3 minutes with MilliQ water.
  • the slides are centrifuged for 30 seconds and then dried for 10 min at 30 ° C.
  • the slides are scanned at 635 nm (Innoscan Innopsys) for quantification of fluorescence.
  • the fluorescence value of the control plasmid is subtracted from the value of the total intensity obtained for each lesion.
  • the data are normalized as described in Millau et al., Supra.
  • the data are expressed in Fluorescence Intensity (Arbitrary Units) and standard deviation for each sample and each of the tested dNTPs.
  • the fluorescence intensity values obtained are centered-reduced, that is to say that their average is reduced to 0, and their standard deviation to 1.
  • the data are then analyzed by hierarchical classification as described in the publication Forestier et al, using the Euclidean distance (PLoS One 20l2; 7: e5l754).
  • the method according to the invention has been implemented on samples of metastatic melanoma (ganglia or tumors) of patients for whom the mutational status of the BRAF and NRAS genes is known (Table I).
  • the repair reactions were conducted with 0.2 mg / ml of nuclear protein extract in duplicate for 3 h at 30 ° C. Fluorescence intensities were measured with a CT scan to quantify the level of incorporation of each nucleoside triphosphate at each plasmid.
  • the fluorescence intensities obtained at the level of the control plasmid are subtracted (I x1 - I c ) ⁇
  • the different labeled nucleotides reveal different repair value profiles for the same lesion for each mutation group (FIGS. 1A to 1D) thus making it possible to obtain more precise information on the specific repair mechanisms.
  • the BRAF and NRAS mutations affect the DNA repair signature at different levels (globally and on specific activities).
  • the samples showing the mutated BRAF gene have a very low level of repair activity compared to the wild type. Classification of repair signatures all combined data
  • the data is then centered-reduced (mean to zero - standard deviation to 1) for each lesion, so as to allow for unbiased classification.
  • a hierarchical classification is then made, with Euclidean distance.
  • Sufficient samples are used to construct the reference library, which includes the classification of mutations for repair signatures (BRAF, NRAS, for example), and to determine the differences of each sample with respect to its theoretical class.
  • BRAF mutations for repair signatures
  • dCTP analysis shows that mutations in signaling pathways (MAP Kinase) impact the signature of DNA repair. This information is important and confers a particular role to the dCTP analysis, especially if the treatment applied is the targeted therapy (guided by mutations in BRAF and NRAS).
  • Class 1.1 corresponds to the patients who have the longest survival.
  • the 1506_WT sample is classified with a majority of mutated BRAF samples (Figure 2B). It therefore has a similar profile to the BRAF mutated samples of Class 1.1 (1507 and 1514) and not to WT samples.
  • dGTP distinguishes WT samples for BRAF and NRAS from mutated samples for BRAF and NRAS; the use of this nucleotide distinguishes samples with activated signaling pathways from samples with unactivated signaling pathways. Classification of repair signatures obtained with the marked dATP
  • samples 1404_WT and 1407_WT are ranked together, which confirms their profile similarity (Figure 2D).
  • the 1405_BRAF sample is close to mutated NRAS samples in this classification made from the uTP data ( Figure 2E).
  • the method according to the invention reveals standard repair signatures for each of the mutations in the BRAF or NRAS genes and in the group that does not contain mutations in these genes.
  • the dNTP dNTP classifications identify discordant patients for the classification of subtypes by the detection of mutations and accordingly identify dysfunctions in the regulation of DNA repair by signaling pathways. This information can be used when prescribing targeted therapies, for which it is mutations in key genes like BRAF and NRAS that guide the prescription.
  • the dGTP marker makes it possible to distinguish the WT samples from the other samples essentially at the level of its incorporation for the repair of 8oxoG, which is generally higher ( Figure 3B).
  • This calculation requires a combination of the values independently obtained by carrying out the repair reactions in the presence of different dNTPs. For each measured sample, the contribution of each labeled dNTP to the total fluorescence obtained is examined for all 4 dNTPS or 2 dNTPS (in some examples). The information obtained completes the repair signature profile and the contribution profile.
  • the 1514_BRAF and 1402_NRAS samples were characterized only with labeled dCTP and labeled dGTP. All other samples were characterized with the 4 labeled dNTPs. The results are shown in Figures 4A-4F.
  • dGTP is the major nucleotide incorporated for the repair of 8oxoG ( Figure 4A). It should be noted that for the L505_NRAS sample, the other nucleotides are incorporated in a relatively large manner, which signifies the implication of alternative repair pathways, or errors of the polymerases involved in the resynthesis and distinguishes this sample (FIG. 4A). The 1507_BRAF sample differs from the other samples in repairing Abasic sites ( Figure 4B).

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Abstract

L'invention concerne une méthode pour générer un profil des capacités de réparation de l'ADN de cellules tumorales et ses applications pour le pronostic du cancer, le choix, le suivi et/ou la prédiction de l'efficacité thérapeutique d'un traitement du cancer chez un patient, ainsi que pour cribler des médicaments anticancéreux. L'invention concerne également une bibliothèque de référence comprenant les profils des capacités de réparation de l'ADN de différents sous-types d'un cancer, obtenus par la méthode de l'invention, et ses applications pour la classification des cancers.

Description

MÉTHODE POUR GÉNERER UN PROFIL DES CAPACITÉS DE RÉPARATION DE L’ADN DE CELLULES TUMORALES ET SES APPLICATIONS
La présente invention concerne une méthode pour générer un profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales et ses applications, notamment pour le pronostic du cancer, le choix, le suivi et/ou la prédiction de l’efficacité thérapeutique d’un traitement du cancer chez un patient, ainsi que pour cribler des médicaments anticancéreux. La présente invention concerne également une bibliothèque de référence comprenant les profils des capacités de réparation de l' ADN de différents sous-types d’un cancer, obtenus par la méthode de l’invention, et ses applications pour la classification des cancers.
Les traitements conventionnels des cancers (chirurgie, radiothérapie, chimiothérapie) reposent sur des protocoles adaptés à chaque cancer en fonction du stade d’évolution et du type de cancer, déterminés selon les critères standards de classification, tels que la classification TNM ( Tumor , Node, Métastasés ). L’immunothérapie des cancers qui a révolutionné la prise en charge des patients en échec thérapeutique, comprend l' utilisation d’anticorps monoclonaux, en particulier des inhibiteurs de points de contrôle immunitaire tels que des anti-CTLA-4, anti-PD-l, et anti-PD-L1, et des anticorps bispécifiques qui lient les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires.
Pour optimiser la prise en charge thérapeutique des patients, de multiples biomarqueurs sont développés pour stratifier (ou classifier) les patients à différentes étapes de leur prise en charge, en particulier pour le diagnostic, le pronostic, le choix, le suivi et la prédiction de l’efficacité thérapeutique d’un traitement.
Bien qu’elle soit indispensable, la stratification des patients atteints de cancer est très compliquée et implique l’utilisation de nombreux biomarqueurs. Ceci s’explique du fait de l’hétérogénéité de chacun des types et sous-types de cancer et de la complexité des mécanismes d’apparition des cancers et de résistance au traitement. Cette complexité et ses difficultés sont illustrées par quelques exemples.
Les cancers sont notamment classifiés en différents sous-types en fonction de l’expression de marqueurs par les cellules tumorales. Par exemple, les cancers du sein sont classifiés en sous-types en fonction de l’expression des récepteurs aux œstrogènes (ER) et à la progestérone (PR) et de HER2/ERB2/neu. Généralement les cancers ER+ et PR+ sont traités par le tamoxifène. Cependant tous les cancers du sein ER+ ne répondent pas au traitement et d’autres marqueurs sont recherchés pour identifier les non-répondeurs. Les cancers du sein triple négatifs (ER-, PR-, ERB2-) sont traités par chimiothérapie mais les taux d’échec et de récidive sont fréquents. De nombreux biomarqueurs sont explorés pour caractériser ces sous-types, mais aucun n’a montré d’utilité clinique pour le moment.
Les technologies « omiques » ont été utilisées pour caractériser les cancers du sein au niveau ADN, ARN, protéines, carbohydrates (Judes et al., Cancer Lett., 2016, 382, 77- 85 ; WO 2001/075160). Ces marqueurs ne sont pas suffisamment robustes et précis pour être utilisés en clinique.
Les cancers sont également classifiés en différents sous-types par la présence d’altérations génomiques dans l' ADN tumoral, telles que des mutations dans certains gènes clés, des remaniements chromosomiques ou des amplifications de gènes, à l’origine d’activation de voies de prolifération et de survie cellulaire. Par exemple, les mélanomes sont classés en sous-types en fonction des mutations dans différents gènes clés (BRAF, NRAS), responsables de l’activation constitutive de la voie des MAP Kinases. Cependant, l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques dirigés contre les protéines BRAF mutées par exemple, n’est pas toujours associée comme attendu à l’inactivation des voies de signalisation (Manzano et al., Ann. Transl. Med., 2016; 4, 237). La classification ainsi obtenue n’est donc pas suffisante pour identifier les répondeurs et ne permet pas d’administrer le bon traitement aux patients.
Les cancers sont aussi classifiés en fonction d’altérations génomiques dans l' ADN tumoral (mutations, taux de mutation, instabilité micro- satellitaire (MSI), amplifications de gènes) favorisant l’apparition de néo-antigènes sur les tumeurs, qui sont susceptibles de prédire la réponse aux immunothérapies. Toutefois, les technologies d’amplification d’ADN utilisées pour identifier les mutations à l’origine de néo-antigènes introduisent des biais et des erreurs, et ne sont pas fiables pour cette application (« The problem with neoantigen prédiction », Nat. Biotech., 2017, 35, 97). D’une façon générale, les méthodes qui reposent sur la détection d’altération génomiques dans l' ADN tumoral n’analysent que très partiellement les défauts pouvant survenir et surtout n’en étudient ni les causes ni les conséquences au niveau fonctionnel.
En plus des biomarqueurs précédents, les défauts dans les systèmes de réparation de l' ADN sont également utilisés comme biomarqueurs indicatifs du développement, de la progression et de la réponse au traitement des cancers. Six systèmes de réparation ont été identifiés chez l’Homme, dont deux ont pour fonction d’éliminer les bases modifiées de l' ADN. Le système de Réparation par Excision de Bases (REB ou BER pour Base Excision Repair) est plus spécifiquement dédié à la réparation des petites lésions des bases de l' ADN (dommages oxydatifs, sites abasiques, fragmentations, méthylations et Éthéno-bases). Le système de réparation par excision de nucléotide (REN ou NER pour Nucléotide Excision Repair) prend en charge les lésions volumineuses induisant une distorsion de la double-hélice d’ADN (adduits acétylamino- fluorène, cisplatine et psoralène ; dimères induits par les UV B et C ; lésions covalentes formées entre une base de l' ADN et une autre molécule). Ces deux systèmes de réparation présentent des caractéristiques communes et comprennent dans tous les cas : (i) une étape d’excision au cours de laquelle le nucléotide modifié est éliminé et (ii) une étape de resynthèse qui met en œuvre les polymérases présentes dans le milieu, au cours de laquelle au moins un nucléoside triphosphate (nucléotide) présent dans le milieu est incorporé en remplacement dans le brin d’ADN.
La Demande US 2017/198360 décrit un test moléculaire qui permet de distinguer des sous-types de cancers en fonction de défauts génétiques de la réparation de l' ADN, conduisant à la surexpression ou la sous-expression de transcrits liés à la réparation de l' ADN. Cette stratification est utilisée pour sélectionner les chimiothérapies les plus appropriées parmi les drogues ciblant l' ADN ou les activités de réparation de l' ADN. Toutefois, il est bien connu que la résistance ou la sensibilité de tumeurs aux traitements affectant directement ou indirectement l' ADN ou la réparation de l' ADN provient de dérégulation de la réparation de l' ADN, mais également de dérégulation de la signalisation appelée réponse au dommage de l' ADN ( DNA Damage Response ou DDR) et de plusieurs senseurs et effecteurs moléculaires régulant à leur tour la DDR et appartenant notamment aux voies de signalisation /prolifération cellulaire. Ces réseaux complexes font intervenir des réseaux enzymatiques redondants, régulés notamment au niveau post-traductionnel ou par interactions protéines-protéines. Ainsi le dosage des transcrits de gènes n’apporte pas d’information effective sur les activités de réparation réellement fonctionnelles ou réellement inactives. De plus, certains défauts dans les activités peuvent être compensés par l’intervention de protéines/enzymes différentes. Ces mécanismes compensatoires ne peuvent pas être détectés au niveau génétique non plus. Ainsi, le test moléculaire proposé ne peut pas déterminer précisément et avec pertinence, les capacités fonctionnelles de réparation de l' ADN dans les tumeurs. En conséquence, les méthodes de stratification de patient proposées aujourd’hui ne sont pas suffisantes et sont très limitées par rapport au sous-type de cancer qu’elles caractérisent. Elles ne permettent pas de choisir la thérapie la plus appropriée parmi le choix des protocoles proposés aujourd’hui, en fonction de la classe thérapeutique des agents utilisés ou pour des combinaisons d’agents thérapeutiques de classes différentes. Elles ne permettent pas d’identifier les patients qui vont répondre aux différentes thérapies.
En conséquence, il existe un besoin de disposer de méthodes de stratification des patients qui soient plus performantes.
Les défauts de l' ADN s’accumulent lorsque les systèmes de réparation de l' ADN sont déficients au niveau fonctionnel. Ces déficiences fonctionnelles peuvent être causées par des dysfonctionnements à différents niveau des régulations moléculaires régissant la réparation de l' ADN : niveau épigénétique, ADN, ARN, Protéines, modifications post- traductionnelles. Il est donc beaucoup plus pertinent de chercher à caractériser directement la fonctionnalité des systèmes de réparation que le statut mutationnel dans certains gènes ou zones du génome choisis a priori.
Des études ont montré qu’il existe une association entre des types de cancer ou des sous-types de cancer et la capacité de réparation des protéines nucléaires d’une tumeur/d’un cancer (Forestier, et al, PLoS One., 2012, 7, e5l754). En particulier, les activités de réparation de l' ADN sont étroitement associées aux voies de signalisation/prolifération cellulaire et à leur fonctionnalité. Des mutations dans des voies de signalisation/prolifération cellulaire impactent les capacités de réparation de l' ADN (Velic D et al, Biomolecules, 2015, 5, 3204-3259). Les activités de réparation de l' ADN sont étroitement associées à des mutations, des translocations, des amplifications, des instabilités de microsatellites. Les capacités de réparation révèlent des défauts de réparation qui ont des conséquences au niveau fonctionnel.
Le mélanome métastatique a longtemps fait l’objet d’un mauvais pronostic avec des taux de réponse de 15-20% à la chimiothérapie et à la radiothérapie (Quirt et al., Oncologist, 2007, 12, 1114-1123). Les mécanismes de réparation de l' ADN seraient responsables de ce fort taux d’échec (Sarasin A and Dessen P, Curr. Mol. Med., 2010, 10, 413-418 ; Tentori et al., Curr. Med. Chem., 2009, 16, 245-257). Plus généralement l’efficacité de la réparation par excision de nucléotide module la réponse des patients au cisplatine (Gavande et al., Pharmacol. Ther., 2016, 160, 65-83) et l’efficacité de la radiothérapie dépend des capacités de réparation des cassures double -brin (Biau et al, Neoplasia, 2014, 16, 835-844).
La demande internationale WO 2004/059004 décrit un procédé d’évaluation quantitative des capacités globales et spécifiques de réparation de l' ADN d’au moins un milieu biologique dans lequel la réparation de lésions de l' ADN par les enzymes de réparation présentes dans le milieu biologique à tester est réalisé en présence d’un seul nucléotide marqué.
Or, l’utilisation d’un seul nucléotide marqué ne permet pas d’être dans des conditions optimales pour étudier la réparation de chacune des lésions et déterminer quelle voie en particulier la répare.
En effet, les différentes lésions sont formées par des réactions chimiques ou physiques à partir de bases ou nucléosides bien spécifiques (C, G, T ou A) et sont réparées par des voies ne conduisant pas au simple remplacement de la lésion mais au remplacement éventuel en plus, de nucléotides entourant la lésion, en fonction de la nature de la voie empruntée. Le BER peut intervenir par une voie de « resynthèse courte » (short patch ; remplacement de 1 à 3 nucléotides) ou une voie de « resynthèse longue » (long patch ; remplacement d’une dizaine de nucléotides) ; le NER peut également intervenir et conduire au remplacement de 25 à 30 nucléotides. Parfois le mécanisme NER peut se substituer au mécanisme BER.
Si la réparation d’une lésion L1 emprunte une voie BER de synthèse courte, c’est majoritairement le nucléotide à l’origine de la formation de L1 qui sera incorporé. Or si la réaction de réparation a lieu avec un nucléotide marqué différent, la réparation sera mal évaluée car considérée comme inefficace alors qu’elle n’aura pas été quantifiée dans les conditions appropriées.
Si la réaction de réparation de la lésion L1 a lieu avec le nucléotide marqué correspondant mais pas avec d’autres nucléotides on ne pourra pas comparer l’efficacité d’incorporation des différents nucléotides et on ne pourra pas dire si la réparation est fautive ou pas.
Si la réparation d’une lésion L1 emprunte la voie BER avec synthèse longue ou la voie NER, on aura une incorporation statistique identique de tous les nucléotides. Mais il est indispensable de conduire la réaction avec au moins 2 nucléosides différents pour le vérifier.
L’utilisation d’un seul nucléotide peut conduire à des interprétations fausses, ne donne pas d’informations sur la fidélité de la réparation et ne permet pas de conclure quant au mécanisme de réparation par excision resynthèse sollicité.
Il n’existe donc pas dans l’art antérieur de méthode permettant d’établir un profil précis des capacités de réparation de l' ADN d’une tumeur.
La Demanderesse a développé une méthode pour générer un profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales permettant de pallier ces inconvénients.
Ainsi, la présente invention concerne une méthode in vitro pour générer un profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales, comprenant au moins les étapes suivantes:
(a) l’incubation d’un extrait de cellules tumorales comprenant une activité de réparation de l' ADN avec au moins deux molécules d’ADN endommagées comprenant des lésions distinctes de l' ADN et aux moins deux nucléotides différents marqués,
(b) la mesure de la quantité de chaque nucléotide marqué incorporé dans chaque molécule d’ADN endommagée qui résulte de l’activité des enzymes de réparation présentes dans ledit extrait cellulaire à l’étape (a),
(c) la détermination, à partir des valeurs mesurées à l’étape (b), de l’un au moins des paramètres suivants :
(c1) la signature enzymatique de la réparation de l' ADN;
(c2) la contribution de la réparation de chacune des lésions de l' ADN par rapport à la réparation totale, indépendamment pour chacun des nucléotides marqués, et
(c3) le taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide marqué pour au moins deux lésions de l' ADN, indépendamment pour chaque lésion de l' ADN, et
(d) l’établissement du profil des capacités de réparation de l' ADN desdites cellules tumorales à partir des paramètres déterminés à l’étape (c).
Au sens de la présente invention, on entend par « cellules tumorales », les cellules tumorales isolées à partir d’un échantillon biologique prélevé chez un patient et les lignées de cellules tumorales. Les cellules tumorales sont notamment isolées à partir d’un échantillon de tumeur ou d’un échantillon de sang contenant des cellules tumorales circulantes, prélevés chez un patient. L’échantillon de tumeur est par exemple obtenu par biopsie ou exérèse chirurgicale de la tumeur. Les cellules tumorales sont généralement isolées par dissociation du tissu tumoral, notamment par digestion enzymatique, par exemple avec la collagénase. Cette étape préalable n’est pas nécessaire lorsque l’échantillon biologique contient des cellules tumorales circulantes.
Au sens de la présente invention, on entend par « tumeur », une tumeur maligne, c’est-à-dire une tumeur associée à un cancer. Une tumeur inclut une tumeur primitive et une métastase. La métastase peut être localisée dans un ganglion lymphatique drainant la tumeur (métastase ganglionnaire) et/ou dans un tissu ou un organe différent de la tumeur primitive.
Les cancers qui peuvent être classifiés par la méthode de l’invention incluent notamment, les cancers liés à l’exposition à des agents génotoxiques comme le mélanome, en particulier le mélanome métastatique (lié à l’exposition aux ultra- violets), le cancer du poumon (lié à l’exposition au tabac) et le cancer de la tête et du cou (lié à l’exposition au tabac et à l’alcool) ; d’autres cancers comme le cancer du sein, le cancer des ovaires, le cancer de l’endomètre, les sarcomes ; et tout cancer solide pour lesquels une biopsie ou un ganglion envahi est disponible.
Au sens de la présente invention, on entend par « tumeur préalablement caractérisée », une tumeur caractérisée par les méthodes conventionnelles de classification des tumeurs et éventuellement les nouvelles méthodes de biologie moléculaire ou toute autre méthode permettant d’établir des catégories de tumeurs.
Les méthodes conventionnelles de classification des tumeurs incluent en particulier : la classification anatomo-pathologique et histologique qui prend en compte l’organe ou le tissu d’origine et le type histologique de la tumeur et permet de déterminer le type de cancer ; la classification en grades qui permet d’évaluer le degré de différenciation de la tumeur et son évolution (lente et locale ou rapide) ; la classification TNM ( Tumor , Node, Metastasis) qui permet de déterminer le stade d’avancement du cancer.
Les nouvelles méthodes de classification des tumeurs reposent sur une division des tumeurs en sous-types, en fonction de biomarqueurs indicatifs, tels que des marqueurs génétiques, épigénétiques, protéomiques, glycomiques, d’imagerie ou d’autres biomarqueurs. Les biomarqueurs indicatifs de la présence d’un cancer, notamment des marqueurs spécifiques de certains types de tumeur, sont utiles pour le diagnostic. Les biomarqueurs indicatifs de l’évolution future d’un cancer (progression, prédiction et suivi de la réponse à un traitement), sont utiles pour le pronostic, le choix du traitement, le suivi et la prédiction de l’efficacité thérapeutique d’un traitement. A titre d’exemples de biomarqueurs, on peut citer les gènes, ARN, protéines, métabolites ou les processus biologiques.
Les types de cancers peuvent être notamment caractérisés ou classifiés en différents sous-types en fonction des marqueurs exprimés par les cellules tumorales. Par exemple, le cancer du sein est divisé en sous-types en fonction de l’expression des récepteurs aux œstrogènes (ER) et à la progestérone (PR) et de HER2 par les cellules tumorales.
Les types de cancers peuvent également être caractérisés ou classifiés en différents sous-types par la présence d’altérations génomiques dans l' ADN tumoral, telles que des mutations dans certains gènes clés, des remaniements chromosomiques ou des amplifications de gènes, à l’origine d’activation de voies de prolifération et de survie cellulaire. Ces altérations génomiques sont notamment des gènes de fusion, des délétions, des points chauds ( hot-spots ) de mutation, des variants de gènes, des taux de mutations élevés, des gènes avec de multiples copies (amplifications de gènes), des marqueurs d’instabilité des microsatellites (MSI), des mutations dans des gènes clés connus pour être responsables de l’activation de voies de signalisation de prolifération et d’oncogenèse ou des anti-oncogènes, et des combinaisons de ces altérations génomiques. A titre d’exemple des mutations précédentes, on peut citer les mutations dans des gènes de réparation de l' ADN, de la réponse au dommage de l' ADN ( DNA Damage Response), des récepteurs à activité tyrosine kinase, des kinases, en particulier EGFR, BRAF, PIK3CA, AKT1, ERBB2, PTEN, MEK, MAP2K1, KIT, CDKN2A, MYC, ou des anti-oncogènes comme TP53. Par exemple, dans le cadre de la classification du mélanome métastatique, les sous types de cancer sont BRAF muté, NRAS muté et non muté pour BRAF et NRAS.
Les cancers sont également classifiés en fonction d’altérations génomiques dans l' ADN tumoral (mutations, taux de mutation, instabilité microsatellitaire, amplifications de gènes) qui favorisent l’apparition de néoantigènes sur les tumeurs et sont susceptibles de prédire la réponse aux immunothérapies.
Les altérations génomiques sont mises en évidence par des méthodes « omiques » (génomique, protéomique, transcriptomique, métabolomique) ou tout autre méthode permettant la caractérisation directe ou indirecte d’altérations génomiques. Les différents sous-types de cancers ne réagissent pas de la même manière aux traitements thérapeutiques recommandés.
Au sens de la présente invention, on entend par « patient » un individu, humain ou animal, de préférence un humain, atteint de cancer.
On entend par « traitement », un traitement thérapeutique anti-tumoral ou anti cancéreux. Il s’agit notamment de la chimiothérapie, la radiothérapie, la thérapie ciblée et 1’ immunothérapie .
Au sens de la présente invention, on entend par « plasmide », un plasmide superenroulé, c’est-à-dire sans cassure simple-brin ou double-brin de l' ADN.
On entend par « réparation », la réparation de l' ADN ; « signature de réparation », la signature des capacités de réparation de l' ADN ; « profil de réparation », le profil des capacités de réparation de l' ADN.
On entend par « ADN endommagé », « molécule d’ADN endommagée », « ADN lésé » ou « molécule d’ADN lésée », une molécule d’ADN comprenant des lésions de l' ADN, de préférence un seul type de lésions de l' ADN, ou plusieurs lésions créées par un même agent génotoxique ou chimique.
Dans un mode de mise en œuvre de l’invention, lesdites cellules tumorales sont isolées à partir d’un échantillon de tumeur ou de sang d’un patient.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en œuvre, lesdites cellules tumorales sont isolées à partir d’au moins une tumeur préalablement caractérisée.
En particulier, la tumeur est définie par les critères conventionnels de classification des tumeurs tels que définis ci-dessus. En outre, la tumeur est définie par au moins un marqueur d’intérêt pour le diagnostic et/ou le traitement de ce type de cancer, notamment un biomarqueur ou une combinaison de biomarqueurs spécifiques d’un sous-type de ce type de cancer, éventuellement associés à un ou plusieurs biomarqueurs de la progression, de la prédiction et/ou du suivi de la réponse à un traitement de ce type ou sous-type de cancer.
La tumeur caractérisée correspond notamment au sous-type du cancer du patient à tester ou pour lequel on recherche de nouveaux agents antitumoraux ou un traitement plus efficace. La mise en œuvre de la méthode de l’invention sur des cellules tumorales isolées à partir d’une tumeur caractérisée telle que définie ci-dessus permet d’obtenir un profil de réparation de cellules tumorales qui est spécifique d’un sous-type de cancer particulier. Un tel profil de réparation qui est associé à sous-type de cancer particulier est dénommé profil de réparation référence ou profil de référence.
La méthode de l’invention est avantageusement mise en œuvre avec un ensemble de tumeurs différentes d’un même type de cancer préalablement caractérisées (Bibliothèque ou Banque de tumeurs), de façon à obtenir un ensemble de profils de référence dénommé bibliothèque ou banque de référence. De préférence, la méthode de l’invention est mise en œuvre avec des tumeurs correspondants à différents sous-types d’un type de cancer incluant au moins les sous-types de cancer des patients à tester, en particulier les sous-types de cancer qui orientent ou conditionnent le choix du traitement chez les patients, de façon à obtenir des banques de profils de référence spécifiques des différents sous-types de différents types de cancer, en particulier des sous-types de cancer qui conditionnent le choix du traitement chez les patients. Pour chacun de ces sous-types de cancer particuliers, la banque de référence inclut de préférence le profil de référence de patients répondeurs et/ou non-répondeurs pour le traitement thérapeutique recommandé, en particulier une thérapie ciblée, notamment une thérapie guidée par des mutations dans des gènes clés, comme par exemple les mutations dans les gènes BRAF et NRAS pour le mélanome.
Dans un mode de mise en œuvre de l’invention, le patient est atteint d’un cancer lié à l’exposition à des agents génotoxiques, par exemple un mélanome, notamment un mélanome métastatique de sous-type déterminé, à savoir, BRAF muté, NRAS muté ou non muté pour BRAF et NRAS.
Pour la mise en œuvre de la méthode de l’invention, les cellules tumorales isolées sont préalablement traitées de façon à extraire les protéines nucléaires qui contiennent les enzymes de réparation de l' ADN. L’extraction des protéines nucléaires à partir des cellules tumorales isolées est réalisée selon les techniques standards bien connues de l’Homme du métier. Les cellules tumorales isolées sont généralement lysées pour isoler les noyaux puis les noyaux sont ensuite lysés de façon à extraire les protéines nucléaires. Pour préparer l’extrait de protéines nucléaires, on peut utiliser les protocoles décrits pour les tests de transcription in vitro ou les tests de réparation de l' ADN in vitro, comme par exemple ceux décrits par Dignam JD et al. (Nucleic Acids Research, 1983, 11;1475-1489); Kaw L et al. (Gene Analysis Techniques, 1988, 5, 22-31); Iliakis G et al. (Methods Mol. Biol., 2006, 314, 123-31); Luo Y et al. (BMC Immunol., 2014, 15, 586-). Les extraits nucléaires peuvent en outre être fractionnés ou dialysés selon les méthodes conventionnelles. Toutes les étapes de préparation de l’extrait de protéines nucléaires sont réalisées dans des conditions qui ne dénaturent pas les activités enzymatiques et les protéines contenues dans les cellules tumorales, de façon à ce que l’activité de réparation de l' ADN initialement présente dans l’échantillon de cellules tumorales soit préservée dans l’extrait cellulaire qui est analysé dans la méthode de l’invention.
Dans un mode de mise en œuvre de l’étape (a) de la méthode de l’invention, l’extrait de cellules tumorales comprenant une activité de réparation de l' ADN est un lysat cellulaire, de préférence un lysat nucléaire, de manière préférée un extrait de protéines nucléaires desdites cellules tumorales.
Conformément à la méthode de l’invention, l' ADN endommagé qui sert de matrice de réparation pour les enzymes de réparation de l' ADN présentes dans l’extrait de cellules tumorales est un ADN simple brin ou double-brin, linéaire ou circulaire, court (inférieur à 100 bases) ou long (supérieur à 100 bases). Il s’agit notamment de courts ou longs fragments d’ADN tels que décrits dans la Demande WO 01/90408 ou d’un ADN double- brin circulaire superenroulé, notamment un plasmide tel que décrit dans la Demande WO 2004/059004, Millau et al., Lab. Chip., 2008, 8, 1713-1722 ; Prunier et al., Mutation Research, 2012, 736, 48-55. De préférence, l' ADN endommagé est un plasmide endommagé.
Conformément à la méthode de l’invention, l' ADN endommagé comprend des lésions induites par un agent physique ou chimique génotoxique connu, notamment par traitement d’un plasmide isolé ou de cellules comprenant ledit plasmide, par l’agent génotoxique. Parmi les lésions présentes dans l' ADN endommagé ou lésé, on peut citer notamment, les lésions des bases puriques ou pyrimidiques, des sucres, de la structure de la double-hélice et les cassures simple-brin et double -brin.
Les lésions des bases puriques ou pyrimidiques incluent :
- les sites abasiques (AbaS), notamment les dépurinations qui peuvent être générés par traitement acide de l' ADN à une température élevée comme décrit dans Millau et al. et Prunier et al., précités ; - les glycols de thymine et/ou de cytosine (Glycol), qui peuvent être générés par traitement de l' ADN avec du permanganate de potassium comme décrit dans Millau et al. et Prunier et al., 2008, précités ;
- l’alkylation, notamment la formation d’éthéno-bases (Éthéno), telles que l’éthéno-guanine et/ou l’éthéno-adénosine, en particulier l’éthéno-guanine, induites notamment par le trans,trans -2-4 decadiénal (DDE), comme décrit dans la Demande WO 2004/059004, Millau et al. et Prunier et al., précités ; ou le mélange éthéno-guanine et éthéno-adénosine créé par du chloroacétaldéhyde (B. Tudek, et al. IARC Sci Publ (1999) 279-93).
- les lésions oxydatives, notamment la formation de 8-oxo-guanine (8-oxo- G) ou 8-oxo-2’désoxyguanosine (8-oxo-dG); la 8-oxo-G est notamment induite par photosensibilisation en présence de riboflavine, comme décrit dans Millau et al. et Prunier et al. ; la formation de 8-oxo-dG est notamment induite par traitement avec un endoperoxyde tel que DHPN02, comme décrit dans la Demande WO 2004/059004 ;
- les photoproduits, notamment les dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) et les pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproduits 6-4 ou 6-4PP), seuls ou en mélange, induits par les UV B ou C, comme décrit dans la Demande WO 2004/059004 ; Millau et al. et Prunier et al., précités ; les dimères de pyrimidines formés par photosensibilisation aux UV A en présence de norfloxacine, comme décrit dans Sauvaigo S, et al, Photochem. Photobiol. 200l;73, 230-237;
- les adduits chimiques, induits notamment par des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)) tel que le Benzo[a]Pyrène ; des agents alkylants tels que le cisplatine, la mitomycine et le chlorambucil ; des amines aromatiques ; et des mycotoxines ;
- la désamination;
- la méthylation ; et
- la déméthylation.
Les lésions de la structure de la double-hélice incluent la formation de pontages intra-brins et inter-brins, généralement provoqués par les ultraviolets et les antitumoraux bifonctionnels, tels que les UV B, le cisplatine, le psoralène en présence d’UV A, la mitomycine et le chlorambucil ; les agents intercalants forment des liaisons covalentes stables entre les bases opposées des brins d’ADN. Les lésions du cisplatine, en majorité des pontages G-G et G-A intra-brins et des pontages G-G inter-brins, sont notamment générées comme décrit dans Millau et al. et Prunier, précités. Les lésions du psoralène, notamment des pontages T-T intra-brins et inter-brins, sont générés par photosensibilisations aux UV A, comme décrit dans Millau et al.
Les lésions des sucres (désoxyriboses) entraînent une rupture des liaisons phosphodiesters au niveau du site lésé, suivie d’une rupture du brin d’ADN.
Les cassures simple-brin et double-brin sont notamment produites par des agents tels que les radiations ionisantes et par l’action des radicaux libres.
De préférence, l' ADN endommagé comprend des lésions des bases puriques et/ou pyrimidiques ou des lésions de la structure de la double-hélice telles que définies ci-dessus, c’est-à-dire des lésions qui n’induisent pas de cassures simple-brin ou double-brin de l' ADN.
Conformément à la méthode de l’invention, chaque ADN endommagé, de préférence un plasmide endommagé, porte des lésions prédéfinies, distinctes des lésions d’un autre ADN endommagé. En conséquence, les lésions de chaque ADN endommagé sont caractérisées préalablement à la mise en œuvre de l’étape (a), c’est-à-dire que la nature ou le type de lésions et le nombre de lésions présentes sur chaque ADN sont déterminés comme décrit dans la Demande WO 2004/059004 ; Millau et al. et Prunier et al., précités.
En outre, la fraction super-enroulée de chaque plasmide est sélectionnée après le traitement de l' ADN par l’agent génotoxique ou la combinaison d’agents génotoxiques qui induit des lésions des bases puriques et/ou pyrimidiques et/ou de la structure de la double- hélice telles que définies ci-dessus, de façon à exclure les cassures de brin (structure relâchée) et éviter l’action des nucléases.
Dans un mode de mise en œuvre avantageux de la méthode de l’invention, l’étape (a) est réalisée avec au moins deux ADN endommagés comprenant des lésions distinctes, de préférence sélectionnées dans le groupe constitué par :
(1) 8-oxo-G ;
(2) Sites abasiques (AbaS) ;
(3) Éthénobases (Éthéno), notamment Éthéno-guanines (Éthéno-G) et/ou Éthéno- Adénines (Éthéno-A), en particulier Éthéno-G ; (4) Glycols de thymine et/ou de cytosine (Glycols) ; et
(5) Photoproduits, notamment dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) et pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproduits 6-4 ou 6-4PP), seuls ou en mélange.
Les ADN endommagés sont avantageusement des plasmides endommagés.
De préférence, chaque ADN endommagé porte un seul type de lésions telles que listées ci-dessus, à savoir 8-oxo-G, AbaS, Éthéno, Glycols ou Photoproduits.
Dans un mode de mise en œuvre avantageux de la méthode de l’invention, l’étape (a) est réalisée avec au moins un premier ADN, de préférence un plasmide, comprenant un seul type de lésions réparées par le système de réparation par excision de base (REB ou BER pour « Base Excision Repair ») et au moins un second ADN, de préférence un plasmide, comprenant un seul type de lésions réparées par le système de réparation par excision de nucléotides (REN ou NER pour « Nucléotide Excision Repair).
De préférence, les lésions réparées par la BER sont sélectionnées dans le groupe constitué par : (1) 8-oxo-G ; (2) sites abasiques (AbaS) ; (3) Éthénobases (éthéno), notamment Éthéno-guanines (éthéno-G) et/ou Éthéno-Adénines (éthéno-A), en particulier Éthéno-G ; (4) Glycols de thymine et/ou de cytosine, et les lésions réparés par le NER sont des photoproduits, notamment des dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) et des pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproduits 6-4 ou 6-4PP), seuls ou en mélange, de préférence en mélange.
Selon une disposition avantageuse des modes de mise en œuvre précédents, l’étape (a) est réalisée avec au moins un premier ADN, de préférence un plasmide, comprenant des lésions 8-oxoG et au moins un second ADN, de préférence un plasmide, comprenant des dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) et des pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproduits 6-4 ou 6-4PP), seuls ou en mélange, de préférence en mélange.
De préférence, l’étape (a) est réalisée avec :
- un premier ADN, de préférence un plasmide, comprenant des lésions 8- oxoG ;
- un deuxième ADN, de préférence un plasmide, comprenant des sites abasiques (AbaS) ;
- un troisième ADN, de préférence un plasmide, comprenant des Éthénobases (Éthéno), notamment Éthéno-guanines (Éthéno-G) et/ou Éthéno-Adénines (Éthéno-A), en particulier Éthéno-G ; - un quatrième ADN, de préférence un plasmide, comprenant des Glycols de thymine et/ou de cytosine ;
- un cinquième ADN, de préférence un plasmide, comprenant des dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) ; et
- un sixième ADN, de préférence un plasmide, comprenant un mélange de dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) et de pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproduits 6-4 ou 6-4PP).
De préférence, l' ADN endommagé ou lésé (étape (a)) est immobilisé sur un support solide, permettant ainsi d’éliminer facilement les nucléotides marqués non-incorporés à l’étape (a), par une étape de lavage, avant l’étape (b) de mesure de l’incorporation du nucléotide dans l' ADN endommagé. Le support solide est un support approprié à l’immobilisation des acides nucléiques et notamment de l' ADN, tel que par exemple un support en verre, polypropylène, polystyrène, silicone, métal, nitrocellulose ou nylon, optionnellement modifié par un film poreux, notamment un film de nylon ou d’hydrogel, par exemple un hydrogel de polyacrylamide. Il s’agit notamment d’une lame de verre ou de silicone recouverte d’un hydrogel. Le support est avantageusement un support miniaturisé du type micropuce. De tels supports modifiés par un film poreux sont notamment décrits dans la Demande WO 2006/136686 ; Millau et al. et Prunier et al., précités. Pour immobiliser l' ADN sur le support, l' ADN est déposé sur le support, par exemple de façon automatisée à l’aide d’un robot tel qu’un robot piézo-éléctrique.
La méthode de l’invention peut être réalisée en parallèle sur plusieurs extraits de cellules tumorales, avec un support sur lequel sont immobilisées différentes séries d’ADN lésé. Il s’agit notamment d’une méthode à haut-débit, partiellement ou entièrement automatisée.
Conformément à la méthode de l’invention, les nucléosides utilisés comme marqueurs sont les nucléosides classiques Adénosine, Cytidine, Guanosine, Thymidine ou Uracile, sous forme triphosphate, c’est à dire des nucléotides. La méthode est conduite avec au moins deux nucléosides triphosphates (nucléotides) parmi dCTP, dGTP, dATP et dUTP.
L’emploi de dGTP permet d’obtenir des signaux plus intenses qu’avec les autres dNTPs pour la réparation des lésions réparées par la BER et formées à partir de la base guanine comme par exemple la 8-oxo-guanine. L’emploi d’un autre dNTP sert de point de comparaison et permet de bien s’assurer que le dGTP est incorporé en majorité par rapport aux autres dNTPs.
L’emploi de dATP permet d’obtenir des signaux plus intenses pour la réparation des lésions réparées par la BER et créées à partir de la base adénine comme par exemple l’éthénoadenine et les sites abasiques. L’emploi d’un autre dNTP sert de point de comparaison et permet de bien s’assurer que le dATP est incorporé en majorité par rapport aux autres dNTP.
Les sites abasiques sont également formés à partir de la dépurination de la guanosine, il est ainsi intéressant de comparer l’incorporation de dATP, dGTP et d’un autre dNTP pour la réparation de cette lésion.
Les lésions Éthénobases sont généralement constituées d’un mélange d’Éthéno-A et Étheno-G, l’emploi d’un nucléotide de nature différente de dATP et dGTP sert de point de comparaison et permet de bien s’assurer que le dATP et le dGTP sont incorporés en quantité plus importante que les autres dNTP.
L’emploi de dCTP permet d’obtenir des signaux plus intenses pour la réparation des lésions réparées par la BER et créées à partir de la base cytosine comme par exemple les glycols de cytosine.
L’emploi de dUTP permet d’obtenir des signaux plus intenses pour la réparation des lésions réparées par la BER et créées à partir de la base thymine comme par exemple les glycols de thymine.
L’emploi d’un dNTP différent de dCTP ou dUTP sert de référence.
L’emploi d’au moins deux dNTPs différents permet de s’assurer que la réparation des photoproduits est bien conduite par la voie NER. Bien que la formation des photoproduits advienne surtout au niveau des T et des C, leur réparation qui passe par l’élimination et le remplacement d’une trentaine de bases, va conduire à l’incorporation statistiquement équivalente des 2 nucléotides.
Les aberrations de réparation mesurées par comparaison des signatures obtenues en présence des différents nucléotides permettent d’identifier les échantillons aux voies de réparation dysfonctionnelles.
De préférence, l’étape (b) de la méthode de l’invention est mise en œuvre avec au moins les nucléotides dGTP et dCTP marqués, de manière préférée les nucléotides dCTP, dGTP, dATP et dUTP marqués. Le dCTP est préféré pour le choix, le suivi, la prédiction de l’efficacité thérapeutique d’une thérapie ciblée, guidée par la présence de mutations dans des gènes clés comme les mutations dans les gènes BRAF et NRAS pour le mélanome.
Les nucléotides sont marqués, ce qui permet de les détecter et de les quantifier lorsqu’ils sont incorporés à l' ADN endommagé suite à la réaction de réparation de l' ADN. Le traceur ou marqueur qui est utilisé pour le marquage des nucléotides est détectable par la mesure d’un signal qui est proportionnel à la quantité de nucléotide incorporé dans l' ADN endommagé, notamment les plasmides endommagés.
Les moyens et les techniques de marquage des nucléotides sont bien connus de l’Homme du métier et incluent le marquage radioactif, magnétique, fluorescent, colorimétrique ou autre, qui peut être effectué directement ou indirectement. Les traceurs ou agents de marquage direct sont notamment des isotopes radioactifs ou des composés luminescents (radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents ou phosphorescents), tels que les fluorophores comme de façon non-limitative Cyanine 3, et Cyanine 5. Les agents de marquage indirect incluent notamment les molécules d’affinité telles que la biotine (système streptavidine/biotine), la digoxygénine ou toute molécule pouvant être révélée par une interaction ligand-récepteur, notamment à l’aide d’un anticorps ou par un traitement chimique.
Le marquage des dNTP, notamment un marquage fluorescent, radioactif, magnétique ou colorimétrique est détectable par toute technique connue de l’Homme du métier telle que de façon non-limitative, la microscopie de fluorescence, la cytométrie de flux, la gammagraphie, l’imagerie de résonance magnétique et la spectrométrie de masse.
L’utilisation de marqueurs différents permet d’effectuer une seule réaction de réparation par ADN endommagé (étape a)) mais nécessite un détecteur spécifique pour chaque marqueur (étape (b)). L’utilisation d’un seul marqueur pour les différents nucléotides impose d’effectuer la réparation (étape a)) dans des réactions séparées pour chaque nucléotide, avec chaque ADN endommagé mais permet d’utiliser un seul détecteur pour mesurer le signal de réparation (étape b)).
De préférence, le marquage est un marquage fluorescent, direct ou indirect. De manière préférée, les nucléotides sont marqués par un fluorophore. De manière encore plus préférée, tous les nucléotides sont marqués par le même fluorophore.
La réaction de réparation (étape a)) est mise en œuvre dans des conditions permettant la réparation des lésions de l' ADN par les enzymes de réparation présentes dans ledit extrait cellulaire et l’incorporation de chaque nucléotide marqué dans chaque ADN endommagé. Ces conditions qui sont bien connues de l’Homme du métier sont décrites dans la Demande WO 2004/059004 ; Millau et al. et Prunier et al., 2008, précités. La réaction de réparation est réalisée en présence d’ATP, d’un système de régénération de l'ATP et tout autre agent nécessaire à l’activité des enzymes de réparation de l' ADN présentes dans l’extrait de cellules tumorales. Par exemple, le tampon de réparation contient 200 mM Hepes/KOH, pH 7,8 ; 35 mM MgCl2 ; 2,5 mM DTT ; 1,25 mM de chacun des quatre dNTP ; 1 mM ATP, 17 % glycérol ; 50 mM phosphocréatinine ; 10 mM EDTA ; 250 μg/mL créatine phosphokinase et 0,5 mg/L de BSA. La réaction de réparation est généralement réalisée avec un extrait de protéines nucléaires contenant 0,2 à 2 mg de protéines par mL. La réaction est effectuée une température favorisant la réaction de réparation, de préférence à 30°C, pendant un temps suffisant, généralement compris entre une et cinq heures. La réaction est avantageusement réalisée dans les micropuits d’un support miniaturisé du type micropuce tel que défini ci-dessus.
Conformément à l’invention, les réactions de réparation (étape (a)) sont réalisées en parallèle avec un ADN contrôle, non lésé, qui sert à mesurer le bruit de fond de la réaction de réparation (étape (b)). En conséquence, l’étape (a) comprend en outre, des réactions contrôles pour chaque nucléotide marqué, dans lesquelles l’extrait cellulaire est incubé avec un ADN contrôle, non-endommagé et, séparément, avec chacun des nucléotides marqués.
Préalablement à l’étape (b) de mesure du signal d’incorporation du marqueur dans l' ADN lésé (signal de réparation), le support sur lequel est fixé l' ADN, est généralement lavé au moins une fois à l’aide d’une solution saline contenant un tensioactif non ionique, notamment un tampon phosphate 10 mM, contenant 0,05 % de Tween 20, puis est ensuite rincé à l’eau, au moins une fois.
Conformément à l’invention, l’étape (b) comprend la mesure du signal d’incorporation du marqueur dans l' ADN lésé, de préférence le plasmide lésé, pour les différentes réactions de réparation de l’étape (a). Chaque réaction de l’étape (a) correspondant à la réparation d’un ADN comprenant un seul type de lésions telles que définies ci-dessus avec un seul dNTP marqué tel que défini ci-dessus.
En outre, l’étape (b) comprend également la mesure du signal d’incorporation du marqueur dans l' ADN contrôle non-lésé, pour chacun des nucléotides marqués de l’étape (a), de façon à mesurer le bruit de fond de la réaction de réparation pour chacun des nucléotides marqués.
La mesure du signal est réalisée par une méthode adaptée au marqueur, à l’aide d’une instrumentation adaptée au support et au marqueur utilisé. Par exemple, si le marqueur est un fluorophore, on procède à la mesure directe des signaux de fluorescence émis par les différents dépôts (ou spots) du support. On pourra utiliser un scanner pour l’analyse d’image en fluorescence. On utilise de préférence un appareil capable d’exciter le fluorophore et de mesurer le signal émis par l’excitation.
La signature enzymatique de la réparation de l' ADN des cellules tumorales (étape ci)), issues notamment d’une tumeur d’un patient, correspond à l’ensemble des signaux mesurés à l’étape (b) pour la réparation de toutes les lésions présentes (n lésions au total) par l’extrait desdites cellules tumorales, avec chacun des nucléotides marqués (aux moins deux nucléotides X et Y, et éventuellement un troisième nucléotide Z et un quatrième nucléotide W).
La signature de réparation obtenue avec les nucléotides X et Y est l’ensemble :
Figure imgf000020_0001
Où
- X est le premier nucléotide pour lequel on détermine la signature de réparation de toutes les lésions,
IX1 est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide X vis-à-vis d’une première lésion,
Ix2 est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide X vis-à-vis d’une deuxième lésion,
IXn est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide X vis-à-vis d’une énième lésion,
IC/x est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide X avec le plasmide contrôle,
- Y est le deuxième nucléotide pour lequel on détermine la signature de réparation de toutes les lésions,
IY1 est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide Y vis-à-vis d’une première lésion,
IY2 est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide Y vis-à-vis d’une deuxième lésion, IYn est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide Y vis-à-vis d’une énième lésion, et
IC/Y est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide Y avec le plasmide contrôle.
Pour chaque échantillon de cellules tumorales, en particulier isolées à partir d’un échantillon de tumeur d’un patient, la signature de réparation obtenue est différente et dépendante du nucléotide marqué utilisé (Figure 1A à 1D). Elle est analysée par des méthodes classiques de classification (« clustering ») qui prennent en compte l’ensemble des signaux obtenus pour un échantillon donné pour comparer les échantillons entre eux et par rapport à la bibliothèque de référence (Figure 2 A à 2E). La signature de réparation permet de caractériser les capacités de réparation d’un échantillon de façon globale et compare essentiellement les valeurs d’intensités obtenues. L’utilisation d’au moins deux nucléotides différents permet de comparer l’échantillon à la bibliothèque de référence obtenue dans chacune des conditions et de vérifier la cohérence de la classification ou de mettre en évidence les discordances. Par exemple, un échantillon peut être dans une certaine classe définie par la signature de réparation de la bibliothèque avec le nucléotide X (correspondant à un sous-type), et être dans une autre classe définie par la signature de réparation avec le nucléotide Y, ce qui révèle une incohérence dans la classification. Cette incohérence indique que l’échantillon est différent des autres échantillons de la classe et donc risque de ne pas répondre à la thérapie prescrite pour cette classe.
Cette première analyse est particulièrement adaptée pour identifier les répondeurs aux thérapies ciblées prescrites sur la base de mutations connues. En effet, les signatures de réparation sont étroitement associées aux voies de signalisation/prolifération cellulaires et à leur fonctionnalité. Par comparaison avec les profils de référence des bibliothèques de référence, on déterminera si le profil de la tumeur portant une ou des mutations guidant la prescription de thérapies ciblées, correspond au profil de référence portant la mutation qui répond au traitement. Si des discordances apparaissent, cela indique que la thérapie ciblée ne sera pas efficace.
La signature de réparation obtenue permet également d’identifier les échantillons dans lesquels les activités de réparation pour une lésion donnée sont absentes : cette absence peut être partielle si un signal est mesuré avec au moins un nucléotide, totale si elle n’est mesurée avec aucun nucléotide. L’absence de certaines activités révélée par la méthode va caractériser des tumeurs présentant des mutations ou des défauts génomiques importants qui sont plus favorablement susceptibles de répondre aux immunothérapies.
Les signatures de réparation sont étroitement associées aux défauts de mécanismes de réparation de l' ADN. Eux-mêmes sont responsables de la sensibilité et résistance aux chimiothérapies et radiothérapies. Les signatures de réparation peuvent permettre de déterminer la meilleure stratégie thérapeutique à suivre parmi des traitements par inhibiteurs de la réparation de l' ADN, par chimiothérapie et radiothérapie, ou combinaisons.
Les différentes valeurs obtenues à l’étape (b) sont soumises à différents classements ou calculs, combinés ou pas : signature de réparation, contribution, taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide, afin d’obtenir un profil de réparation donnant le plus d’informations possibles sur les capacités de réparation des protéines de réparation de la tumeur.
Le profil de réparation distingue les différents mécanismes de réparation fonctionnels tout en les quantifiant. Plus particulièrement, ce profil permet de distinguer :
Si des tumeurs d’un même type ou sous-type de cancer, déterminé sur la base d’une mutation dans un gène clé, ou sur la base d’autres marqueurs déterminant le choix d’un traitement, sont rangées dans le même groupe (sont similaires) ou dans un groupe différent (pas de similarité) ;
Si au moins une activité de réparation prenant en charge une lésion donnée est bien fonctionnelle ;
Si une lésion donnée est réparée par plusieurs activités de réparation ;
Si une lésion donnée est réparée par la réparation par excision de base (REB) ou la réparation par excision de nucléotide (REN) ;
Si lorsqu’une lésion est réparée par la BER, c’est le « short patch repair » (resynthèse courte) ou le « long patch repair » (resynthèse longue) qui fonctionne et donc quelle polymérase intervient (beta ou delta/epsilon) ;
Si la réparation est fidèle ;
A partir de la signature de réparation obtenue à l’étape (c1), on peut déterminer la contribution de la réparation de chacune des lésions par rapport à la réparation totale, indépendamment pour chacun des nucléotides marqués étape (c2)). Par exemple, la contribution (en pourcentage) de la réparation de la première lésion par rapport à la réparation totale (n lésions), pour les nucléotides X et Y est déterminée, sous la forme d’un pourcentage, en suivant la formule :
Figure imgf000023_0001
La contribution permet de déterminer l’importance relative des différentes voies de réparation pour chaque échantillon (Figure 3A à 3D). La signature « contribution» permet une caractérisation précise de l’efficacité de chacune des voies de réparation dosée par rapport aux autres. La contribution donne un paramètre indépendant de la valeur absolue des signaux mesurés et est donc complémentaire de la signature de réparation. La contribution varie pour chaque échantillon en fonction du nucléotide utilisé. Chaque échantillon sera caractérisé par autant de profils « contribution » que de nucléotides utilisés. Ces profils « contribution » pourront être comparés aux profils « contribution » de la bibliothèque de référence pour vérifier la cohérence de la classification.
Par exemple, un échantillon peut être dans une certaine classe « contribution » de la bibliothèque avec le nucléotide X (correspondant à un sous-type), et être dans une autre classe « contribution » avec le nucléotide Y, ce qui révèle une incohérence dans la classification. Cette incohérence indique que l’échantillon est différent des autres échantillons de la classe et donc risque de ne pas répondre à la thérapie prescrite pour cette classe.
Les profils « contribution » sont étroitement associées aux voies de signalisation/prolifération cellulaires et à leur fonctionnalité.
Les profils « contribution » sont étroitement associés aux capacités de tumeurs à répondre à la chimiothérapie et à la radiothérapie.
A partir de la signature de réparation obtenue à l’étape (c1), on peut également déterminer le taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide marqué pour au moins deux lésions de l' ADN, indépendamment pour chaque lésion de l' ADN (étape (c3)).
Par exemple, dans une réaction de réparation réalisée avec 4 nucléotides marqués différents (X, Y, Z et W), le taux relatif d’incorporation du nucléotide X pour la réparation de deux lésions (première et deuxième lésion) est déterminé, indépendamment pour chacune des lésions, en suivant la formule suivante :
Taux relatif d’incorporation du nucléotide X pour la réparation de la première lésion :
Figure imgf000024_0001
Taux relatif d’incorporation du nucléotide X pour la réparation de la deuxième lésion :
Figure imgf000024_0002
Ce calcul, illustré à la Figures 4A à 4D, permet de déterminer si les mécanismes de réparation sont fonctionnels dans les échantillons, et en particulier l’étape faisant intervenir des polymérases, sont bien ceux attendus par rapport à la bibliothèque de référence. L’intérêt est d’identifier directement les dysfonctionnements responsables de mutations ou de tout autre défaut génomique favorisant l’apparition de néo-antigènes à la surface des tumeurs, associés à une meilleure efficacité des traitements immunologiques. La détection directe des profils de réparation et en particulier du taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide évite l’utilisation de méthodes d’amplification PCR nécessaire à la prédiction des néo-antigènes, qui introduisent des biais (The problem with neoantigen prédiction, Nat. Biotech., 2017, 35, 97). Les tumeurs pour lesquelles des activités de réparation sont absentes ou présentent des dysfonctionnements à cause de mutations ou des défauts génomiques sont plus favorablement susceptibles de répondre aux immunothérapies.
Ainsi, l’utilisation de deux nucléotides pallie aux inconvénients de l’utilisation d’un seul nucléotide qui ne donne qu’un profil partiel de la tumeur et qu’une information partielle sur les voies de réparations fonctionnelles. En particulier, l’utilisation d’un seul nucléotide ne permet pas de savoir quelle voie de réparation est sollicitée ; quelle polymérase est impliquée ; si la réparation est fidèle ; si, en cas d’absence de signal, une autre voie est susceptible d’intervenir en remplacement ; elle ne permet qu’une comparaison partielle avec une bibliothèque de référence ; elle ne permet pas de déterminer quel est le nucléoside préférentiellement incorporé pour la réparation de chaque lésion. De préférence, la méthode de l’invention comprend l’établissement du profil de réparation de cellules tumorales isolées à partir d’un échantillon de tumeur d’un patient, et la comparaison dudit profil avec au moins un profil de référence, obtenu pour le même sous-type de cancer. Le profil de référence est établi, simultanément ou préalablement au profil de réparation des cellules de la tumeur du patient. De préférence, la comparaison est effectuée avec une bibliothèque de référence comprenant les profils de référence de différents sous-types d’un cancer incluant au moins les sous- types de cancer des patients à tester, en particulier les sous-types de cancer qui orientent ou conditionnent le choix des traitements chez les patients.
De préférence, le profil de l’étape (d) comprend:
La signature enzymatique de la réparation de l' ADN des cellules tumorales, la contribution de la réparation de chacune des lésions de l' ADN par rapport à la réparation totale, indépendamment pour chacun des nucléotides marqués, et le taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide marqué pour au moins deux lésions de l' ADN, indépendamment pour chaque lésion de l' ADN.
On pourra combiner les signatures de réparation, les profils de « contribution » et les taux relatifs d’incorporation pour la comparaison avec la bibliothèque de référence traitée dans les mêmes conditions.
Les profils de réparation peuvent en outre être utilisés pour prédire les réponses aux chimio- et radio-thérapies ou pour sélectionner les patients répondeurs aux inhibiteurs de la réparation de l' ADN. Le même profil de réparation pourra ainsi être utilisé pour choisir le meilleur traitement parmi plusieurs classes de thérapies ou parmi des combinaisons de thérapies.
La méthode selon l’invention est utile pour choisir la meilleure option thérapeutique pour le patient en fonction du profil des capacités de réparation de l' ADN des cellules de la tumeur du patient, obtenu par la méthode selon l’invention. La meilleure option thérapeutique est choisie parmi plusieurs classes de thérapies ou parmi des combinaisons de thérapies.
Les profils de réparation obtenus à l’étape (d) conditionnent le traitement à donner à un patient :
Si le profil de réparation de la tumeur correspond au profil de la bibliothèque de référence pour les mêmes types ou sous-types de cancer, les traitements efficaces pour les échantillons classifiés de la même façon dans la bibliothèque de référence seront appliqués ;
Si le profil de réparation montre des dysfonctionnements de la réparation de l' ADN (absence de certaines activités, défauts de polymérases,..) les immunothérapies pourront être utilisées ;
Le profil de réparation obtenu pourra être utilisé pour choisir un traitement par radiothérapie, ou chimiothérapie ou tout autre traitement endommageant l' ADN.
Le profil de réparation pourra être utilisé pour choisir un inhibiteur de la réparation de l' ADN par exemple pour inhiber une voie spécifique à l’origine de la résistance de la tumeur aux traitements ciblant l' ADN, ou bien pour inhiber une voie redondante d’une voie sous exprimée, de façon à créer une létalité synthétique ;
Le profil de réparation pourra être utilisé pour choisir des combinaisons de différents traitements.
Une activité spécifique de réparation élevée peut être associée à une radio ou chimiorésistance. On pourra dans ce cas utiliser un inhibiteur de la réparation spécifique de cette voie. L’inhibiteur pourra être donné, en association ou pas avec une radio ou chimiothérapie créant des lésions réparées par une autre voie ou la même voie. Des combinaisons d’inhibiteurs de voies complémentaires peuvent également être envisagées, pour éviter des compensations de réparation dues à l’activation de voies redondantes.
A l’inverse une activité faible peut être associée à une radio ou chimiosensibilité. On choisira de préférence un traitement qui crée des lésions réparées par la voie dysfonctionnelle.
Lorsque toutes les activités de réparation sont élevées, on pourra utiliser une thérapie ciblée visant les voies de signalisation régulant la réparation de l' ADN, si une cible activatrice est identifiée.
Les tumeurs pour lesquelles des activités de réparation sont absentes ou présentent des dysfonctionnements pourront être traitées par immunothérapie.
Dans tous les cas on peut combiner des traitements de classe différente (radio ou chimiothérapie, thérapie ciblée et immunothérapie).
La présente invention a également pour objet l’utilisation de la méthode pour générer un profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales selon l’invention, pour le pronostic du cancer, le choix, le suivi et/ou la prédiction de l’efficacité thérapeutique d’un traitement du cancer chez un patient, en fonction du profil des capacités de réparation de l' ADN des cellules tumorales obtenu à l’étape (d).
La présente invention a également pour objet une méthode de traitement d’un cancer chez un patient, comprenant :
l’établissement du profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales issues dudit patient selon la méthode de l’invention ;
le choix du traitement le plus approprié pour le patient en fonction du profil de réparation obtenu ; et
l’administration du traitement au patient.
Le traitement est notamment sélectionné parmi la chimiothérapie, la radiothérapie et l’immunothérapie. La chimiothérapie affecte, directement ou indirectement, l' ADN ou la réparation de l' ADN.
La présente invention a également pour objet une méthode de pronostic d’un cancer chez un patient, comprenant :
l’établissement du profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales issues dudit patient selon la méthode de l’invention ;
la détermination du pronostic du cancer du patient en fonction du profil de réparation obtenu.
La méthode de pronostic selon la présente invention permet notamment de déterminer la survie du patient. En effet, il existe une corrélation entre l’intensité du signal de réparation mesuré avec la méthode d’établissement du profil des capacités de réparation de l' ADN selon l’invention et la survie du patient. De préférence, le cancer est lié à l’exposition à des agents génotoxiques, par exemple un mélanome, notamment un mélanome métastatique de sous-type déterminé, à savoir, BRAF muté, NRAS muté ou non muté pour BRAF et NRAS.
La présente invention a également pour objet l’utilisation du profil de réparation de cellules tumorales isolées à partir d’une tumeur d’un patient, obtenu par la méthode pour générer un profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales selon l’invention, comme biomarqueur du pronostic du cancer, du choix, du suivi et/ou de la prédiction de l’efficacité thérapeutique d’un traitement du cancer chez un patient. La présente invention concerne également les bibliothèques de référence comprenant les profils des capacités de réparation de tumeurs caractérisées (profils de référence), correspondants à différents sous-types de différents cancers, obtenus par la méthode pour générer un profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales selon l’invention.
Les bibliothèques de référence contiennent les profils de référence de différents sous-types de différents cancers incluant au moins les sous-types de cancer des patients à tester, en particulier les sous-types de cancer qui orientent ou conditionnent le choix des traitements anti-cancéreux chez les patients. Pour chacun de ces sous-types de cancer particuliers, la banque de référence inclut le profil de référence de patients répondeurs ou non-répondeurs pour le traitement thérapeutique recommandé, en particulier une thérapie ciblée, notamment une thérapie guidée par des mutations dans des gènes clés, comme par exemple les mutations dans les gènes BRAF et NRAS pour le mélanome.
La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en œuvre de la méthode selon l’invention, comprenant :
au moins deux ADN endommagés comprenant des lésions distinctes tels que définis ci-dessus, de préférence des plasmides endommagés tels que définis ci- dessus, de manière préférée immobilisés sur un support approprié tel que défini ci- dessus ; et au moins deux tampons de réparation,
un tampon de réparation comprenant les agents nécessaires à l’activité des enzymes de réparation de l' ADN présentes dans l’extrait de cellules tumorales tels que définis ci-dessus et au moins deux nucléotides différents marqués, dans un seul tampon ou dans des tampons séparés pour chaque nucléotide
La présente invention concerne également une méthode de classification d’un cancer de type défini, à partir d’un échantillon de tumeur d’un patient, comprenant au moins les étapes suivantes :
(i) l’établissement du profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales isolées à partir dudit échantillon, selon la méthode de l’invention ;
(ii) la comparaison du profil des capacités de réparation obtenu à l’étape précédente avec une bibliothèque de référence contenant les profils des capacités de réparation de différents sous-types du cancer; et (iii) la détermination du sous type de cancer affectant le patient par similitude du profil des capacités de réparation obtenu chez le patient avec un profil de référence d’un sous type de cancer de la bibliothèque de référence.
La présente invention concerne également une méthode de criblage d’agents anti tumoraux, comprenant au moins les étapes suivantes :
la mise en contact de cellules tumorales avec au moins un agent à tester ;
l’établissement du profil des capacités de réparation de l' ADN des cellules tumorales traitées par ledit agent et de cellules tumorales non-traitées, par la méthode de l’invention, et
la sélection des agents capables de moduler le profil de réparation de l' ADN desdites cellules tumorales.
De préférence, la méthode de criblage est mise en œuvre avec des cellules tumorales en culture.
Les agents anti-tumoraux sélectionnés par la méthode de criblage selon l’invention sont utiles pour le traitement des cancers.
Outre les dispositions qui précèdent, l’invention comprend encore d’autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l’objet de la présente invention qui ne sont nullement limitatifs, avec référence aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1 représente les signatures de réparation de différentes lésions de l' ADN par des extraits de mélanomes métastatiques, en présence de différents nucléotides marqués. A. dCTP. B. dGTP. C. dATP. D. dUTP. 8oxoG : 8-oxo-guanine. AbaS : sites abasiques. CPD : dimères de pyrimidine de type cyclobutane. CPD-64 : mélange de dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) et de pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproduits 6-4 ou 6-4PP). Éthéno : mélange d’Éthéno-guanines (Éthéno-G) et Éthéno- Adénines (Éthéno-A). Glycols : Mélange de Glycols de thymine et de cytosine .
- la figure 2 représente la classification des signatures de réparation par similarité de réparation. A. Toutes données confondues. B. dCTP. C. dGTP. D. dATP. E. dUTP.
- la figure 3 représente la contribution de chaque voie de réparation à la réparation totale pour chacun des nucléotides marqués. A. dCTP. B. dGTP. C. dATP. D. dUTP. X : non testé. - la figure 4 représente le taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide marqué pour la réparation de chacune des lésions. A. 8oxoG : 8-oxo-guanine. B. AbaS : sites abasiques. C. CPD : dimères de pyrimidine de type cyclobutane. D. CPD-64 : mélange de dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) et de pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproduits 6-4 ou 6-4PP). E. Glycols : Mélange de Glycols de thymine et de cytosine. F. Éthéno : Mélange d’Éthéno-guanines (Éthéno-G) et Éthéno-Adénines (Éthéno-A). * : seuls dCTP et dGTP ont été utilisés.
- la figure 5 représente la corrélation entre la survie (abscisse) et l’intensité du signal de réparation (ordonnée)) par groupe de mutation et par dNTP. A. WT-dCTP. B. NRAS-dCTP. C. BRAF-dCTP. D. WT-dGTP. E. NRAS-dGTP. F. BRAF. dGTP. G. WT- dATP. H. BRAF-dATP. I. WT-dUTP. J. BRAF-dUTP.
EXEMPLE : Etablissement des signatures et profils de réparation d’échantillons de mélanomes métastatiques
1. Matériels et méthodes
1.1 Patients
Les échantillons (ganglion ou tumeur) sont issus de patients atteints de mélanome métastatique de sous-type connu (BRAF ; NRAS ; WT (non muté pour BRAF et NRAS) dont les données cliniques sont présentées dans le Tableau I.
Les différents types de traitement administrés aux patients de l’étude sont présentés dans le Tableau II ci-dessous.
Tableau : Traitements administrés aux patients
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1.2 Préparation des échantillons
Les échantillons de tumeur ou de ganglions sont prélevés par exérèse chirurgicale puis préparés comme suit. a. Dissociation cellulaire
La dissociation cellulaire est réalisée à partir d’une biopsie de ganglions ou de tumeurs de mélanome métastatique. La biopsie, d’environ 5 mm3, est déposée dans une boîte de pétri de diamètre 100 mm avec quelques gouttes de RPMI-1640 Glutamax (Life Technologies). Elle est ensuite découpée en fragments à l’aide d’un scalpel. Ces fragments sont transférés dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 5 mL de milieu de digestion (1 mg/mL Collagénase D (Roche) ; 50 U I/m L DNase I (Roche), RPMI-1640 Glutamax (Life technologies)). Le tube contenant les fragments est incubé 30 minutes à 37°C dans une étuve et les fragments sont remis en suspension toutes les 10 minutes à l’aide d’une pipette de 10 mL. A la fin de l’incubation, un volume de 2.5 mL de milieu de digestion conservé à température ambiante est ajouté. Les fragments sont de nouveau incubés 30 minutes à 37°C dans une étuve et remis en suspension toutes les 10 minutes à l’aide d’une pipette 10 mL. A la fin de l’incubation, le tube est centrifugé à 1200 rpm, pendant 10 minutes, à 4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est repris dans 10 mL de tampon PBS- EDTA froid (10 mM EDTA (Sigma), IX D-PBS (Life Technologies)). Les cellules sont ensuite déposées sur un tamis cellulaire 70 μm (Dutscher), positionné sur un tube à centrifuger de 50 mL conservé dans la glace. Le tube de 15 mL est rincé par ajout de 5 mL de tampon PBS-EDTA froid supplémentaires et les fragments résiduels sont passés sur le tamis. Un prélèvement est réalisé afin de dénombrer les cellules. Le tube de 50 mL est centrifugé à 1200 rpm, pendant 10 minutes, à 4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est repris dans une solution de cryopréservation Albumine/DMSO (90% Albumine Humaine, 10% DMSO (Sigma)), à raison de 4.106 cellules par cryotube. Les cellules sont congelées progressivement à -80°C dans un container de congélation puis transférées en azote liquide pour une conservation de longue durée. b. Préparation d’extraits nucléaires
Les cellules tumorales sont décongelées à température ambiante, puis centrifugées à 500 RCL (Relative Centrifugal Lorce), pendant 5 minutes, à 4°C. Le surnageant est éliminé, et les cellules lavées avec 1 mL de PBS froid, puis re-centrifugées à 500 RCF, 5 minutes, à 4°C. Les cellules sont reprises dans 1 mL de tampon A (10 mM HEPES pH 7,8, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KC1, 0.02% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) et incubées 10 minutes dans la glace. Chaque tube est vortexé durant 30 secondes. Les cellules sont centrifugées 5 min à 2300 RCF, le surnageant est éliminé, puis les cellules sont reprises dans 30 μL de tampon B (10 mM HEPES pH 7.8, 1,5 mM MgCl2, 400 mM KC1, 0.2 mM EDTA, 25% glycérol, 0.5mM DTT, 0.5 mM PMSF, 100 μL antiprotéases 0.7X (Complete-mini, Roche). Après 20 minutes d’incubation sur glace, la lyse de la membrane nucléaire est réalisée par deux cycles de congélation/décongélation dans de l’azote liquide à -l80°C et à 4°C. Les tubes sont centrifugés à 16000 RCF, 10 minutes, à 4°C. Le surnageant est réparti en aliquots de 10 μL. Une fraction du surnageant est prélevée pour un dosage protéique en utilisant la méthode micro-BCA (Interchim). Les aliquots sont soumis à une congélation rapide de 30 secondes dans de l’azote liquide à -l80°C puis stockés à -80°C.
1.3 Analyse des activités enzymatiques de réparation de l' ADN
L’analyse a été réalisée sur des puces comprenant des plasmides lésés, préparées comme décrit précédemment (Millau et al., Prunier et al., précités).
Un mélange réactionnel est préparé pour chaque dNTP-biotine, de façon à obtenir des signatures enzymatiques de réparation de l' ADN en présence de différents dNTP marqués à la biotine. La réaction a lieu 3h à 30°C dans des chambres réactionnelles remplies avec 12 μL de milieu constitué de 4,8 μL de tampon 5X (200 mM Hepes KOH pH 7.8, 35 mM MgCl2, 2.5 mM DTT, 1.25 pM de chaque dNTP non marqué (Perkin Elmer), 17% Glycérol, 50 mM phosphocréatine (Sigma), 10 mM EDTA, 250 pg/mL créatine phosphokinase, 0.5 mg/mL BSA, 0.5 μL ATP 100 mM (Amersham) et 1.25 pM de dNTP-biotin (Perkin Elmer)), en présence d’extraits nucléaires à une concentration finale de 0.2 mg/mL, la solution étant complétée à 24 μL avec H2O. Chaque échantillon est testé sur deux puces (dans deux chambres réactionnelles) pour chacun des dNTP-biotine.
Après l’incubation les lames sont rincées 2 fois 3 minutes avec du PBS/Tween 0.05%, puis 2 fois 3 minutes à l’eau MilliQ. Les lames sont incubées dans un bain de Streptavidine-Cy5 à 225 ng/mL, en présence de BSA à 0.1 mg/mL, durant 30 min à 30°C. Les lames sont rincées 2 fois 3 minutes avec du PBS/Tween 0.05%, puis 2 fois 3 minutes à l’eau MilliQ. Enfin les lames sont centrifugées 30 secondes, puis séchées 10 min à 30°C. Les lames sont scannées à 635 nm (Innoscan Innopsys) pour la quantification de la fluorescence. La valeur de fluorescence du plasmide contrôle (pas de lésions) est soustraite à la valeur de l’intensité totale obtenue pour chaque lésion. Les données sont normalisées comme décrit dans Millau et al., précité. Les données sont exprimées en Intensité de Fluorescences (Unités arbitraires) et déviation standard pour chaque échantillon et chacun des dNTPs testés.
1.4 Analyses statistiques
Les valeurs d’intensité de fluorescence obtenues sont centrées-réduites, c’est-à-dire que leur moyenne est ramenée à 0, et leur écart-type à 1.
Les données sont ensuite analysées par classification hiérarchique tel que décrit dans la publication Forestier et al, en utilisant la distance euclidienne (PLoS One. 20l2;7:e5l754).
2. Résultats
2.1 Signatures de réparation
La méthode selon l’invention a été mise en œuvre sur des échantillons de mélanome métastatique (ganglions ou tumeurs) de patients pour lesquels le statut mutationnel des gènes BRAF et NRAS est connu (Tableau I). Les réactions de réparation ont été conduites avec 0.2 mg/ml d’extrait de protéines nucléaire en dupliqua pendant 3h à 30°C. Les intensités de fluorescence ont été mesurées avec un scanner pour quantifier le niveau d’incorporation de chaque nucléoside triphosphate au niveau de chaque plasmide. Les intensités de fluorescence obtenues au niveau du plasmide-contrôle sont soustraites (Ix1 - Ic)·
- Signatures de réparation avec les différents dNTP
Les différents nucléotides marqués révèlent des profils de valeurs de réparation différents pour une même lésion pour chaque groupe de mutation (Figures 1A à 1D) permettant ainsi d’obtenir des informations plus précises sur les mécanismes de réparation spécifiques
Les mutations BRAF et NRAS affectent la signature de réparation de l' ADN à différents niveaux (de manière globale et sur des activités spécifiques). En particulier, les échantillons présentant le gène BRAF muté présentent une très faible activité de réparation en comparaison au sauvage. Classification des signatures de réparation toutes données combinées
Les données sont ensuite centrées-réduites (moyenne à zéro - écart- type à 1) pour chaque lésion, de façon à permettre une classification sans biais.
On réalise ensuite une classification hiérarchique, avec distance euclidienne. Les échantillons, en nombre suffisant, servent à la fois à constituer la bibliothèque de référence comprenant le classement des signatures de réparation en fonction des mutations (BRAF, NRAS, par exemple), et à déterminer les différences de chacun des échantillons par rapport à sa classe théorique.
Les échantillons sont classés par similarité de signatures de réparation. Les résultats montrent que les différents dNTPs déterminent des classes différentes à quelques exceptions près (Figure 2A). Cela indique que chaque dNTP apporte des informations distinctes et complémentaires sur les échantillons.
En particulier, lorsque tous les résultats sont considérés et classés ensemble, on voit que les échantillons analysés avec dCTP restent groupés mais séparés par groupe de mutation. Cela montre que les mutations BRAF et NRAS exercent un effet dominant sur la signature de réparation de l' ADN.
Cela confirme que l’analyse par dCTP montre que les mutations dans les voies de signalisation (MAP Kinase) impactent la signature de réparation de l' ADN. Cette information est importante et confère un rôle particulier à l'analyse par dCTP, surtout si le traitement appliqué est la thérapie ciblée (guidée par les mutations dans BRAF et NRAS).
Lorsque dGTP est utilisé, les WT sont d’un côté, et les BRAFm et NRASm sont dans une autre classe. Deux catégories d’échantillons de BRAFm sont identifiées : un premier groupe présentant une faible activité de réparation et un deuxième groupe regroupé avec les NRASm présentant une forte activité de réparation (Figure 2C).
Les résultats obtenus avec dATP et surtout dUTP, sont plus éclatés.
Les analyses individuelles par dNTP, apportent des informations complémentaires (Figures 2B, C, D, E). Classification des signatures de réparation obtenues avec le dCTP marqué
L’utilisation de dCTP discrimine les BRAF mutés des autres catégories d’échantillon (Figure 2B). Tous les échantillons BRAF mutés sont dans une classe commune. Elle est cependant séparée en 2 sous-classes, ce qui distingue 2 catégories d’échantillons BRAF mutés (Classe 1.1. contient 1507 et 1514 ; et Classe 1.2 contient 1405, 1502 et 1401).
La Classe 1.1. correspond aux patients qui ont la plus longue survie.
Les échantillons 1404_WT et 1407_WT sont classés ensemble (Figure 2B).
En revanche, l’échantillon 1506_WT est classé avec une majorité d’échantillons BRAF muté (Figure 2B). Il a donc un profil similaire aux échantillons BRAF mutés de la Classe 1.1 (1507 et 1514) et pas aux échantillons WT.
Les échantillons NRAS mutés sont dans un groupe commun (Figure 2B). On distingue cependant l’échantillon 1402_NRAS qui est à part avec un profil particulier (Figure 2B) et qui a une survie très faible. Classification des signatures de réparation obtenues avec le dGTP marqué
Pour dGTP, comme pour dCTP, les échantillons 1404_WT et 1407_WT sont classés ensemble, ce qui confirme leur similarité de profil (Figure 2C). De même, 1506_WT est classé à part, avec des échantillons BRAF mutés (1502, 1507 et 1514),
(Figure 2C).
Tous les échantillons BRAF mutés et NRAS mutés sont classés dans un même groupe, séparé en 2 sous-groupes (Figure 2C). Les échantillons 1405_BRAF et 1401_BRAF sont proches des NRAS mutés dans cette classification (Figure 2C).
dGTP distingue les échantillons WT pour BRAF et NRAS des échantillons mutés pour BRAF et NRAS ; l’utilisation de ce nucléotide permet de distinguer les échantillons ayant des voies de signalisation activées des échantillons ayant des voies de signalisation non activées. Classification des signatures de réparation obtenues avec le dATP marqué
Pour dATP, comme pour dCTP et dGTP, les échantillons 1404_WT et 1407_WT sont classés ensemble, ce qui confirme leur similarité de profil (Figure 2D).
Tous les BRAF mutés sont classés dans le même groupe, qui inclut à nouveau 1506_WT, confirmant que cet échantillon a un profil similaire aux échantillons BRAF mutés (Figure 2D).
L’utilisation de dATP ne discrimine pas les 2 WT (1404 et 1506) des NRAS (1505 et 1511) exception faite de 1408_NRAS qui révèle un profil particulier (Figure 2D). Classification des signatures de réparation obtenues avec le dUTP marqué Pour dUTP, comme pour dCTP, dGTP et dATP, les échantillons 1404_WT et l407_WT sont classés ensemble, ce qui confirme leur très forte similarité de profil (Figure 2E).
L’utilisation de dUTP révèle une similarité des échantillons 1404_WT et 1407_WT avec le 1505_NRAS (Figure 2E).
L’ensemble des autres échantillons est dans une classe divisée en 2, où les groupes de mutation sont mélangés mais où on retrouve l506_WT avec les BRAF mutés et en particulier 1507_BRAF, 1502_BRAF et 1401_BRAF (Figure 2E).
Comme avec dGTP, l’échantillon 1405_BRAF est proche d’échantillons NRAS mutés dans cette classification réalisée à partir des données dUTP (Figure 2E).
En conclusion, malgré la diversité génomique reconnue des mélanomes métastatiques, la méthode selon l’invention fait apparaître des signatures de réparation type pour chacune des mutations dans les gènes BRAF ou NRAS et dans le groupe ne comportant pas de mutations dans ces gènes.
L’utilisation de différents dNTPs marqués permet d’identifier des similarités de profils qui ne peuvent pas être déterminés en se basant sur la détection des seules mutations et d’établir des classes au-delà de la classification par type de mutations, qui n’est pas suffisante pour prédire la réponse aux thérapies. Une analyse combinée des résultats obtenus avec les différents dNTPs révèle des informations inattendues et fait apparaître des nouveaux sous-groupes.
Les classifications dNTP par dNTP identifient les patients discordant pour la classification des sous-types par la détection des mutations et en conséquence identifient les dysfonctionnements dans la régulation de la réparation de F ADN par les voies de signalisation. On peut utiliser ces informations dans le cas de prescription de thérapies ciblées, pour lesquelles ce sont les mutations dans les gènes clés comme BRAF et NRAS qui guident la prescription.
On compare les différents profils de réparation observés dans chaque sous-type de mélanome (WT, BRAF mutés, NRAS) avec les profils de réparation de la bibliothèque de référence, afin de déterminer les profils qui correspondent aux patients répondeurs aux thérapies ciblées. Cette comparaison permet ainsi d’administrer le bon traitement au bon groupe de patients.
2.2 Contribution de chaque voie de réparation à la réparation totale 1 Pour le calcul de la contribution, les données négatives sont ajustées à 0, à savoir ((Ix i— Ic) = zéro, si négatif). Ce paramètre quantifie les activités de réparation spécifiques les unes par rapport aux autres pour un même échantillon, et identifie les activités manquantes.
Par comparaison avec la bibliothèque de référence constituée de types et/ou sous- types de cancers, il identifie les activités de réparation spécifiques dérégulées (augmentées ou réduites ou absentes) par rapport aux autres.
- Marqueur dCTP
L’analyse de la contribution de chaque voie de réparation à la réparation totale, pour les réactions de réparation effectuées avec dCTP, révèle une différence entre les échantillons BRAF mutés et les autres catégories, essentiellement au niveau de la réparation de la 8oxoG et des Éthénobases (Éthéno), (Figure 3A). Les échantillons BRAF ont des profils très particuliers par rapport aux autres échantillons NRAS ou WT
Concernant la 8oxoG, pour 4 échantillons sur 5, l’incorporation relative de dCTP est soit plus faible que pour les autres échantillons (pour 1405, 1502 et 1401) soit nulle (pour 1514).
Il en est de même au niveau de l’incorporation de dCTP pour la réparation d’Éthéno (diminuée pour 1405 et 1502, nulle pour 1514).
Inversement pour l’échantillon 1507, l’incorporation de dCTP est élevée par rapport aux autres échantillons pour la réparation de 8oxoG et Éthéno et relativement faible pour Glycols ; ce qui distingue cet échantillon BRAF muté des autres.
- Marqueur dGTP
Au niveau de l’analyse « contribution », le marqueur dGTP permet de distinguer les échantillons WT des autres échantillons essentiellement au niveau de son incorporation pour la réparation de la 8oxoG, qui est en général plus élevée (Figure 3B).
Inversement les BRAF mutés sont distingués des autres échantillons par un niveau d’incorporation de dGTP plus faible au niveau de 8oxoG (Figure 3B).
On note l’absence de réparation des Glycols avec ce marqueur pour l506_WT, ce qui distingue cet échantillon des 2 autres WT (Figure 3B).
On note également l’absence de réparation des CPD-64 avec ce marqueur pour l402_NRAS (Figure 3B), qui a une survie très faible.
- Marqueur dATP La contribution de dATP à la réparation de CPD-64 pour les 2 échantillons BRAF où elle est mesurable (1502 et 1401), est très faible par rapport aux autres échantillons (Figure 3C)._Ce marqueur n’est pas incorporé par l’échantillon l507_BRAF, quelle que soit la lésion considérée (Figure 3C). Marqueur dUTP
Ce marqueur n’est pas incorporé par l’échantillon l507_BRAF, quelle que soit la lésion considérée (Figure 3D). La contribution de dUTP à la réparation de CPD-64 est nulle pour l’échantillon BRAF 1401 (Figure 3D).
En conclusion, les calculs de la contribution font apparaître des profils spécifiques qui caractérisent les échantillons indépendamment de l’intensité de fluorescence. Cela permet une comparaison quantitative de l’importance relative de chaque voie de réparation par rapport à toutes les activités de réparations fonctionnelles dosées en même temps.
Malgré la diversité génomique reconnue des mélanomes métastatiques, des profils de réparations types peuvent être associés à chacune des mutations dans les gènes BRAF ou NRAS et dans le groupe ne comportant pas de mutations dans ces gènes. Ainsi il est nécessaire de prendre en considération cette information lorsque l’on veut identifier l’ensemble des défauts de réparation.
2.3 Taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide pour la réparation de chacune des lésions
Ce calcul nécessite de faire une combinaison des valeurs obtenues indépendamment en réalisant les réactions de réparation en présence des différents dNTPs. On examine pour chaque échantillon dosé, quelle est la contribution de chaque dNTP marqué à la fluorescence totale obtenue, pour l’ensemble des 4 dNTPS ou des 2 dNTPS (dans certains exemples). L’information obtenue complète le profil de signature de réparation et le profil « contribution ». Les échantillons l5l4_BRAF et l402_NRAS ont été caractérisés uniquement avec dCTP marqué et dGTP marqué. Tous les autres échantillons ont été caractérisés avec les 4 dNTP marqués. Les résultats sont présentés aux Figures 4A à 4F.
dGTP est le nucléotide majoritaire incorporé pour la réparation de 8oxoG (Figure 4A). On note que pour l’échantillon l505_NRAS, les autres nucléotides sont incorporés de façon relativement importante, ce qui signe l’implication de voies de réparation alternative, ou des erreurs des polymérases intervenant dans la resynthèse et distingue cet échantillon (Figure 4A). L’échantillon 1507_BRAF se distingue des autres échantillons pour la réparation des sites Abasiques (Figure 4B).
Si aucun défaut de la réparation n’est présent, pour la réparation d’une lésion donnée, on s’attend à une contribution identique de chaque dNTP. En effet, pour une lésion donnée, les systèmes de réparation, grâce à leur spécificité, devraient être identiques entre échantillons. Or on observe des disparités entre les échantillons, permettant de mettre en évidence des défauts de la réparation. Les profils non conformes au profil attendu pour chaque groupe de mutation peuvent signer des altérations d’un ou plusieurs mécanismes de réparation ce qui conduisent à l’incorporation de certains nucléotides à la place de ceux attendus, et favorisent l’apparition de mutations.
2.4 Corrélation entre la signature de réparation et la survie des patients
La capacité de la signature enzymatique de réparation à prédire la survie a été analysée à partir des données centrées réduites regroupant le patient décédé 18 mois après le prélèvement de l’échantillon de tumeur (1514) et des patients non décédés après 24 mois (M24) ; les patients perdus de vue non pas été incorporés dans l’étude. Quatre groupes de survie ont été définis :
- M3 : décès à 3 mois post-prélèvement
- M7 : décès à 7 mois post-prélèvement
- M9 : décès à 9 mois post-prélèvement
- Ml 8 : décès à 18 mois post-prélèvement
- M24 : survie minimum de 24 mois post-prélèvement.
Les résultats sont à distinguer selon le groupe de Mutation considéré :
- Patients WT pour BR AF et NRAS- dCTP : Une très mauvaise survie est associée à de très faibles capacités de réparation de l' ADN (Figure 5A). Les mesures de réparation les plus discriminantes sont CPD-64, Glycols, AbaS, et CPD (Figure 5A).
- dGTP : De même que pour dCTP, une très mauvaise survie est associée à de très faibles capacités de réparation de l' ADN (Figure 5D). Les mesures de réparation les plus discriminantes sont 8oxoG, CPD, CPD-64 et AbaS (Figure 5D).
- dATP : De même que pour les nucléotides précédents, une très mauvaise survie est associée à de très faibles capacités de réparation de l' ADN (Figure 5G). Deux lésions sont discriminantes : Éthéno et AbaS (Figure 5G). - dUTP : De même que pour les nucléotides précédents, une très mauvaise survie est associée à de très faibles capacités de réparation de l' ADN (Figure 51). Deux lésions sont discriminantes : Glycols et AbaS (Figure 51).
- Patients BRAF mutés
- dCTP : La survie est inversement proportionnelle à certaines activités de réparation de l' ADN (Figure 5C). En particulier, on observe une relation linéaire inverse entre le niveau de la réparation de CPD-64 et la survie. Pour les patients décédés à 3 ou 9 mois post-prélèvement, le niveau de réparation est plus fort que pour les patients décédés ou encore en vie à 18 ou 24 mois pour CPD-64, AbaS, CPD, et Glycols (Figure 5C).
- dGTP : On observe une relation linéaire inverse entre le niveau de la réparation de certaines activités de réparation de l' ADN, en particulier AbaS et la survie (Figure 5F). Pour les patients décédés à 3 ou 9 mois post-prélèvement, le niveau de réparation est plus fort que pour les patients décédés ou encore en vie à 18 ou 24 mois pour AbaS, 8oxoG, CPD, et CPD-64 (Figure 5F).
- dATP : On observe une relation linéaire inverse entre le niveau de la réparation de AbaS, Éthéno, et la survie (Figure 5H). Pour les patients décédés à 3 mois post prélèvement, le niveau de réparation est plus fort que pour les patients décédé ou encore en vie à 24 mois pour AbaS, Éthéno, CPD et CPD-64 (Figure 5H).
- dUTP : On observe une relation linéaire inverse entre le niveau de la réparation de Glycols, AbaS, et la survie (Figure 5J). Pour les patients décédés à 3 mois post prélèvement, le niveau de réparation est plus fort que pour les patients décédés ou encore en vie à 24 mois pour Glycols, AbaS, CPD-64 et 8oxoG.
- Patients NRAS mutés- dCTP : On observe une relation proportionnelle entre la survie et le niveau de réparation de l' ADN pour CPD-64 et Glycols et une relation inverse pour Éthéno et 8oxoG (Figure 5B).
- dGTP : On observe une relation proportionnelle entre la survie et le niveau de réparation de l' ADN pour CPD-64 et AbaS et une relation inverse pour Éthéno et 8oxoG
(Figure 5E).
Tableau III : Corrélation entre l’intensité du signal de réparation
et la survie du patient
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Cette étude montre que la signature de réparation prédit la survie du patient ; certaines activités sont plus prédictives que d’autres (Figure 5). De façon intéressante, la relation intensité du signal de réparation / survie des patients varie en fonction du groupe de mutations (Tableau III).
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Tableau I : Données cliniques relatives aux patients testés

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode in vitro pour générer un profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales, comprenant au moins les étapes suivantes:
(a) l’incubation d’un extrait de cellules tumorales comprenant une activité de réparation de l' ADN avec au moins deux molécules d’ADN endommagées comprenant des lésions distinctes de l' ADN et aux moins deux nucléotides différents marqués,
(b) la mesure de la quantité de chaque nucléotide marqué incorporé dans chaque molécule d’ADN endommagée qui résulte de l’activité des enzymes de réparation présentes dans ledit extrait cellulaire à l’étape (a),
(c) la détermination, à partir des valeurs mesurées à l’étape (b), de l’un au moins des paramètres suivants :
(ci) la signature enzymatique de la réparation de l' ADN;
(c2) la contribution de la réparation de chacune des lésions de l' ADN par rapport à la réparation totale, indépendamment pour chacun des nucléotides marqués, et
(c3) le taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide marqué pour au moins deux lésions de l' ADN, indépendamment pour chaque lésion de l' ADN, et
(d) l’établissement du profil des capacités de réparation de l' ADN desdites cellules tumorales à partir des paramètres déterminés à l’étape (c).
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites cellules tumorales sont isolées à partir d’échantillons de différentes tumeurs préalablement caractérisées, de façon à obtenir au moins une bibliothèque de référence comprenant les profils de référence de différents sous-types d’un cancer incluant au moins les sous-types de cancer des patients à tester, en particulier les sous-types qui orientent le choix du traitement chez les patients.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la tumeur est un mélanome métastatique dont le statut mutationnel des gènes BRAF et NRAS est déterminé.
4. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l’étape (a) est réalisée avec : - au moins une première molécule d’ADN comprenant un seul type de lésions réparées par le système de réparation par excision de base, sélectionné dans le groupe constitué par : 8-oxo-G ; sites abasiques ; Éthénobases, notamment Éthéno-guanines et/ou Éthéno-Adénines ; Glycols de thymine et/ou de cytosine, et
- au moins une seconde molécule d’ADN comprenant un type de lésions réparées par le système de réparation par excision de nucléotides, sélectionné dans le groupe constitué par : les photoproduits, notamment un mélange de dimères de pyrimidine de type cyclobutane et de pyrimidines (6-4) pyrimidones.
5. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que lesdites molécules d’ADN endommagées sont des plasmides superenroulés, de préférence immobilisés sur un support solide.
6. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l’étape (a) est réalisée avec au moins les nucléotides dGTP et dCTP marqués, de préférence les nucléotides dCTP, dGTP, dATP et dUTP marqués.
7. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le profil de l’étape (d) comprend :
- la signature enzymatique de la réparation de l' ADN,
- la contribution de la réparation de chacune des lésions par rapport à la réparation totale, indépendamment pour chacun des nucléotides marqués, et
- le taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide marqué pour au moins deux lésions de l' ADN, indépendamment pour chaque lésion de l' ADN.
8. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le profil de l’étape (d) est comparé avec une bibliothèque de référence telle que définie à la revendication 2.
9. Utilisation de la méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes pour le pronostic du cancer, le choix, le suivi et/ou la prédiction de l’efficacité thérapeutique d’un traitement du cancer chez un patient.
10. Bibliothèque de référence contenant des échantillons de mélanome métastatique de sous-type BRAF muté, NRAS muté, ou non muté pour BRAF et NRAS et les profils des capacités de réparation desdits différents sous-types dudit type de cancer obtenus par la méthode selon l’une quelconque des revendications 3 à 7, correspondants aux profils de référence des sous-types de cancer des patients à tester, en particulier les sous-types qui orientent le choix du traitement chez les patients.
11. Méthode de classification d’un cancer de type défini, comprenant au moins les étapes suivantes, à partir d’un échantillon de tumeur d’un patient:
(i) l’établissement du profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales isolées à partir dudit échantillon, par la méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 ;
(ii) la comparaison du profil des capacités de réparation obtenu à l’étape précédente avec une bibliothèque de référence contenant les profils des capacités de réparation de différents sous-types dudit type de cancer telle que définie à la revendication 2; et
(iii) la détermination du sous type de cancer affectant le patient par similitude du profil des capacités de réparation obtenu chez le patient avec un profil de référence d’un sous type de cancer de la bibliothèque de référence.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022222936A1 (fr) * 2021-04-20 2022-10-27 Hangzhou Matridx Biotechnology Co., Ltd. Procédés, supports lisibles par ordinateur et systèmes pour filtrer le bruit pour des données de séquençage d'adn

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001075160A1 (fr) 2000-03-31 2001-10-11 Vysis, Inc. Stratification de patients a des fins de therapie du cancer sur la base de l'analyse de micro-reseaux d'adn genomique
WO2001090408A2 (fr) 2000-05-24 2001-11-29 Commissariat A L'energie Atomique Detection et caracterisation de l'activite de proteines impliquees dans la reparation de lesions de l'adn
FR2849058A1 (fr) * 2002-12-20 2004-06-25 Commissariat Energie Atomique Procede d'evaluation quantitative des capacites globales et specifiques de reparation de l'adn d'au moins un milieu biologique, ainsi que ses applications
WO2006136686A1 (fr) 2005-06-20 2006-12-28 Commissariat A L'energie Atomique Procede d'immobilisation de l'adn superenroule et utilisation pour analyser la reparation de l'adn
US20170198360A1 (en) 2010-09-15 2017-07-13 Almac Diagnostics Limited Molecular diagnostic test for cancer

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016183289A1 (fr) * 2015-05-12 2016-11-17 Wake Forest University Health Services Identification de modifications génétiques

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001075160A1 (fr) 2000-03-31 2001-10-11 Vysis, Inc. Stratification de patients a des fins de therapie du cancer sur la base de l'analyse de micro-reseaux d'adn genomique
WO2001090408A2 (fr) 2000-05-24 2001-11-29 Commissariat A L'energie Atomique Detection et caracterisation de l'activite de proteines impliquees dans la reparation de lesions de l'adn
FR2849058A1 (fr) * 2002-12-20 2004-06-25 Commissariat Energie Atomique Procede d'evaluation quantitative des capacites globales et specifiques de reparation de l'adn d'au moins un milieu biologique, ainsi que ses applications
WO2004059004A2 (fr) 2002-12-20 2004-07-15 Commissariat A L'energie Atomique Procede d'evaluation quantitative des capacites globales et specifiques de reparation de l'adn d'au moins un milieu biologique, ainsi que ses applications
WO2006136686A1 (fr) 2005-06-20 2006-12-28 Commissariat A L'energie Atomique Procede d'immobilisation de l'adn superenroule et utilisation pour analyser la reparation de l'adn
US20170198360A1 (en) 2010-09-15 2017-07-13 Almac Diagnostics Limited Molecular diagnostic test for cancer

Non-Patent Citations (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"The problem with neoantigen prédiction", NAT. BIOTECH., vol. 35, 2017, pages 97
ANNE FORESTIER ET AL: "Functional DNA Repair Signature of Cancer Cell Lines Exposed to a Set of Cytotoxic Anticancer Drugs Using a Multiplexed Enzymatic Repair Assay on Biochip", PLOS ONE, vol. 7, no. 12, 31 December 2012 (2012-12-31), pages e51754, XP055498095, DOI: 10.1371/journal.pone.0051754 *
B. TUDEK ET AL., IARC SCI PUBL, 1999, pages 279 - 93
BIAU ET AL., NEOPLASIA, vol. 16, 2014, pages 835 - 844
DIGNAM JD ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 11, 1983, pages 1475,1489
FORESTIER ET AL., PLOS ONE, vol. 7, 2012, pages e51754
FORESTIER ET AL.: "en utilisant la distance euclidienne", PLOS ONE, vol. 7, 2012, pages e51754
GAVANDE ET AL., PHARMACOL. THER., vol. 160, 2016, pages 65 - 83
GIOVANNA MUGGIOLU ET AL: "A DNA Repair Enzyme Signature to characterize the DNA Damage Response of patients treated for Head and Neck Cancer", EACR 2018, 26 June 2018 (2018-06-26), XP055498106, Retrieved from the Internet <URL:https://www.lxrepair.com/all-publications/cancer> [retrieved on 20180807] *
ILIAKIS G ET AL., METHODS MOL. BIOL., vol. 314, 2006, pages 123 - 31
JUDES ET AL., CANCER LETT., vol. 382, 2016, pages 77 - 85
KAW L ET AL., GENE ANALYSIS TECHNIQUES, vol. 5, 1988, pages 22 - 31
LUO Y ET AL., BMC IMMUNOL., vol. 15, 2014, pages 586
MANZANO ET AL., ANN. TRANSI. MED., vol. 4, 2016, pages 237
MARISSA MATTAR ET AL: "Establishing and Maintaining an Extensive Library of Patient-Derived Xenograft Models", FRONTIERS IN ONCOLOGY, vol. 8, 19 February 2018 (2018-02-19), XP055498080, DOI: 10.3389/fonc.2018.00019 *
MILLAU ET AL., LAB. CHIP., vol. 8, 2008, pages 1713 - 1722
PRUNIER ET AL., MUTATION RESEARCH, vol. 736, 2012, pages 48 - 55
QUIRT ET AL., ONCOLOGIST, vol. 12, 2007, pages 1114 - 1123
S. UGUREL ET AL: "A multicenter DeCOG study on predictors of vemurafenib therapy outcome in melanoma: pretreatment impacts survival", ANNALS OF ONCOLOGY., vol. 26, no. 3, 18 December 2014 (2014-12-18), NL, pages 573 - 582, XP055579285, ISSN: 0923-7534, DOI: 10.1093/annonc/mdu573 *
S. VENDERBOSCH ET AL: "Mismatch Repair Status and BRAF Mutation Status in Metastatic Colorectal Cancer Patients: A Pooled Analysis of the CAIRO, CAIRO2, COIN, and FOCUS Studies", CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 20, no. 20, 19 August 2014 (2014-08-19), US, pages 5322 - 5330, XP055579279, ISSN: 1078-0432, DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-14-0332 *
SARASIN A; DESSEN P, CURR. MOL. MED., vol. 10, 2010, pages 413 - 418
SAUVAIGO S ET AL., PHOTOCHEM. PHOTOBIOL., vol. 73, 2001, pages 230 - 237
SYLVIE SAUVAIGO ET AL: "DNA Repair Enzyme Signature as a biomarker of MAPK pathway inhibition by targeted therapies in melanoma cell lines", CLARA 2018, 12 April 2018 (2018-04-12), XP055498110, Retrieved from the Internet <URL:https://www.lxrepair.com/all-publications/cancer> [retrieved on 20180807] *
TENTORI ET AL., CURR. MED. CHEM., vol. 16, 2009, pages 245 - 257
VELIC D ET AL., BIOMOLECULES, vol. 5, 2015, pages 3204 - 3259
Z. D. NAGEL ET AL: "Multiplexed DNA repair assays for multiple lesions and multiple doses via transcription inhibition and transcriptional mutagenesis", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 111, no. 18, 22 April 2014 (2014-04-22), US, pages E1823 - E1832, XP055498099, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.1401182111 *

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