JP2023520754A - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの迅速で現場配備可能な検出 - Google Patents
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの迅速で現場配備可能な検出 Download PDFInfo
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Abstract
本開示は、増強した特異性および感度でサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの存在を検出および定量するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃｒＲＮＡガイドＲＮＡと複合体化されているＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３酵素を使用する方法に関する。これらの方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を診断するため、サンプル中に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの濃度を定量するため、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスプライスバリアント、サブタイプ、または突然変異の存在を同定するため、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の転写の再活性化をモニタリングするために使用することができる。
Description
本願発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの迅速で現場配備可能な検出に関連する。
ＣＯＶＩＤ－１９という疾患の原因である、正式にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と呼ばれる高感染性コロナウイルスの検出は、医療支援を必要とする場所の的を絞るために重要である。例えば、２０２０年３月の半ばまでに、疾病予防管理センター（ＣＤＣ）および米国公衆衛生研究所では、その検出のためにわずか約１７０００回の検査が行われたにすぎない。２０２０年９月までに、またさらには２０２１年３月までに、ＣＯＶＩＤ－１９感染の数は依然として増大しており、ＣＯＶＩＤ－１９は米国において制御されていない状態である。
しかし、無症候の個体は、確認された感染の４２％をも占め（ラヴェッツォ（Ｌａｖｅｚｚｏ）ら、２０２０）、このような無症候の個体もまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を広げ得る。ＣＯＶＩＤ－１９はまた、症候が現れる前にも広がる。したがって、体温チェックによる症候のスクリーニングでは、感染した個体を確実に同定することもパンデミックを阻止することもできていない。
加えて、新たなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントおよび突然変異が生じており、一部は、感染性がさらに高いだけではなく、死亡または重篤な病気のリスクを増大させ得る。例えば、研究者は、少なくとも１４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を同定した。
最近のウイルスダイナミクスモデリングは、ＣＯＶＩＤ－１９の伝染を制御下に置くには、結果までのターンアラウンドタイムが短い頻繁な検査が必要であることを示している（ラレーモア（Ｌａｒｒｅｍｏｒｅ）ら、２０２０）。ＰＣＲによるウイルスＲＮＡの検出は、現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２診断のゴールドスタンダードであるが、この方法は、検査室へのアクセスおよび数日間のターンアラウンドタイムを伴う。この方法ではもちろん、極めて重要な、人々が集中する地点、例えば、空港、介護施設、または学校で、タイムリーな結果を得ることはできない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを検出するための迅速で扱いやすい新規な技術の開発が、強く必要とされている。この必要性に対処できなければ、現在のアウトブレイクの効果的な阻止が遅れ、人から人への拡大が米国で指数関数的に増える可能性が増し、数千の米国民、特に高齢者および医学的状態を既に有している人々の生命が奪われるであろう（ヤン（Ｙｏｕｎｇ）ら（２０２０年３月）、ワン（Ｗａｎｇ）ら（２０２０年２月）、ウー（Ｗｕ）ら（２０２０年２月））。
したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している人々を同定するための、より速く、そしてより効果的な検査手順が必要とされている。
現在利用可能な方法および装置よりも速く、かつ迅速に現場配備される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出および定量するための方法、組成物、および装置が、本明細書において記載される。加えて、本方法、組成物、および装置はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異体およびバリアントを容易に検出および区別することができる。
本明細書において記載される方法は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプルを、Ｃａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、およびレポータＲＮＡと、１つまたは複数のレポータＲＮＡ切断産物が形成されるために十分な時間にわたりインキュベートする工程、ならびに（ｂ）レポータＲＮＡ切断産物のレベルをディテクターで検出する工程を含み得る。一部の場合では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡおよび／またはレポータＲＮＡ切断産物は、検出工程の前に逆転写されていない。このような方法は、サンプルがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの１つまたは複数のコピーを含有するかどうかを検出するために有用である。本方法はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の不存在の検出にも有用である。さらに、本明細書において記載される方法および組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアント株または突然変異株がサンプル中に存在するかどうか、およびバリアントまたは突然変異が何であるかを容易に同定することもできる。
一部の態様では、本開示は、（ａ）サンプルを、Ｃａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および少なくとも１つのレポータＲＮＡと、１つまたは複数のレポータＲＮＡ切断産物が形成されるために十分な時間にわたりインキュベートする工程、ならびに（ｂ）レポータＲＮＡ切断産物の量または濃度をディテクターで分析する工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの濃度を定量するための方法を提供する。一部の場合では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡおよび／またはレポータＲＮＡ切断産物は、検出工程の前に逆転写されていない。
単一のタイプのレポータＲＮＡが使用され得る。レポータＲＮＡは、切断されると検出可能なシグナルを生じさせるように構成されていてよい。例えば、レポータＲＮＡは、１つの位置（例えば、一方の末端）にフルオロフォアを、また別の位置（例えば、他方の末端）にクエンチャーを有し得る。別の例では、レポータＲＮＡは、Ｃａｓ１３タンパク質によって切断されると酸化還元プローブまたはトランスデューサーへの電子移動を生じさせ得る、電気化学的部分（例えば、フェロセンまたは色素）を有し得る。別の例では、レポータＲＮＡは色素を有し得、そのため、レポータＲＮＡが切断されると、色素がトランスデューサーによって検出される。一部の場合では、レポータＲＮＡの一方の末端は固体表面に結合していてよい。例えば、レポータＲＮＡは、切断されるとシグナルを放出するカンチレバーとして構成され得る。アッセイ容器またはアッセイ材料の表面は、シグナルの放出を感知するためのディテクターを有し得る。シグナルは、光シグナル（例えば、蛍光または検出可能な色素）、電子的シグナル、電気化学的シグナル、静電気的シグナル、立体的シグナル、ファンデルワールス相互作用シグナル、水和シグナル、共鳴周波数シフトシグナル、またはこれらの組み合わせであり得るか、またはこれらを含み得る。一部の場合では、レポータＲＮＡを固体表面に付着させることが都合が良い場合がある。しかし、他の場合では、シグナルは、付着していないレポータＲＮＡ（例えば、固体表面に共有結合していない）の使用によって改善することがある。
一部の場合では、ディテクターは、蛍光ディテクター、必要に応じて、短鎖クエンチ型蛍光ＲＮＡディテクター、または全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）ディテクターである。例えば、蛍光ディテクターは、アレクサ（Ａｌｅｘａ）４３０、ＳＴＡＲ ５２０、ブリリアントバイオレット５１０、ブリリアントバイオレット６０５、ブリリアントバイオレット６１０、またはこれらの組み合わせなどの蛍光染料からの蛍光を検出することができる。
一部の態様では、本開示は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプル、Ｃａｓ１３タンパク質、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む混合物を、１つまたは複数のＲＮＡ切断産物が形成されるために十分な時間にわたりインキュベートする工程、ならびに（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡにおける全てのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スプライスバリアントおよび／または突然変異を、全てのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ切断産物をディテクターで分析することによって検出する工程を含む、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスプライスバリアントおよび／または突然変異の存在または不存在を同定するための方法を提供する。一部の場合では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡは、検出工程の前に逆転写されていない。
一部の態様では、本開示は、（ａ）ＲＮＡを含有することが疑われるサンプルを、Ｃａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、およびレポータＲＮＡと、全てのレポータＲＮＡ切断産物が形成されるために十分な時間にわたりインキュベートする工程、ならびに（ｂ）サンプル中の全ての量のレポータＲＮＡ切断産物をディテクターで検出する工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写の再活性化をモニタリングするための方法を提供する。一部の場合では、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および／またはレポータＲＮＡ切断産物は、インキュベーション工程または検出工程の前に逆転写されていない。
通常、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、レポータＲＮＡ切断産物からのシグナルが、コントロールアッセイのシグナルから区別可能である場合に、サンプルにおいて検出される。このようなコントロールアッセイは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＲＮＡを含有していなくてよい。
一部の場合では、本方法は、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを増幅する工程、または、形成され得る全てのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２もしくはレポータＲＮＡ切断産物を増幅する工程をさらに含む。例えば、ＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡを複製し得る、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ポリメラーゼ、またはＲＮＡレプリカーゼ（ＥＣ ２．７．７．４８）を使用して増幅させることができる。このようなＲＮＡレプリカーゼの例としては、Ｑβレプリカーゼ、ウサギ出血病ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：１ＫＨＶ）、サッポロウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：２ＣＫＷ）、Ｃ型肝炎のＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：２Ｄ４１）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＣｒａｓｓａのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：２Ｊ７Ｎ）、ビルナウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：２ＰＧＧ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：２ＰＵＳ）、ロタウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｔ）、伝染性膵臓壊死症ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：２ＹＩ８）、サイポウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：３ＪＡ４）、エンテロウイルスＡのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：３Ｎ６Ｌ）、ノーウォークウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：３ＵＱＳ）、ロタウイルスＡのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：４ＡＵ６）、Ｔｈｏｓｅａ ＡｓｓｉｇｎｓウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：４ＸＨＡ）、ライノウイルスＡのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：１ＸＲ７）、エンテロウイルスＣのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：３ＯＬ６）、手足口病ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：１Ｕ０９）、カルジオウイルスＡのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：４ＮＺ０）、日本脳炎ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：４ＨＤＨ）、ウシウイルス性下痢ウイルス１のＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：１Ｓ４８）、ＱｂｅｔａウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：３ＭＭＰ）、レオウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＤＢ：１ＭＵＫ）、およびＬａ ＣｒｏｓｓｅブニヤウイルスのＲＮＡポリメラーゼが含まれる。一部の場合では、増幅は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｑβレプリカーゼ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ポリメラーゼ、またはこれらの組み合わせによるものであり得る。
一部の場合では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の切断産物、および／またはレポータＲＮＡの切断産物は、増幅されない。
単一のガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を、本明細書において記載される方法および組成物において使用することができるが、本方法および組成物の検出の感度および／または限界は、２つ以上のｃｒＲＮＡを使用することによって向上し得る。採用される１つまたは複数のｃｒＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの一部分に相補的な配列を有し得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡは、野生型、バリアント、または突然変異体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡであり得る。一部の場合では、少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、または少なくとも３つ、または少なくとも８つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が使用される。
単一のガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を、本明細書において記載される方法および組成物において使用することができるが、本方法および組成物の検出の感度および／または限界は、２つ以上のｃｒＲＮＡを使用することによって向上し得る。採用される１つまたは複数のｃｒＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの一部分に相補的な配列を有し得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡは、野生型、バリアント、または突然変異体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡであり得る。一部の場合では、少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、または少なくとも３つ、または少なくとも８つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が使用される。
ｃｒＲＮＡはＣａｓ１３タンパク質と複合体を形成し、この複合体をＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のＲＮＡへ誘導する。ｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ１３複合体がＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のＲＮＡと接触することによって活性化されると、Ｃａｓ１３タンパク質はＲＮＡをある程度無差別に切断し得、これによってシグナルが放出され、このシグナルは、レポータＲＮＡにおいてマスキングまたはクエンチングされる。使用されるＣａｓ１３タンパク質の１つまたは複数は、Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質であり得る。一部の場合では、採用されるＣａｓ１３タンパク質は、配列番号３６～４８のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列の１つまたは複数を有する。例えば、配列番号４３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、４３６位にリジンを有する、Ｃａｓ１３タンパク質を使用することができる。このようなＣａｓ１３タンパク質は、例えば、配列番号４３を有し得る。
一部の場合では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、配列番号１～３５または５８～１４７のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する。一部の場合では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、配列番号１～３５のいずれかなどの配列を有し、または一部の場合では、ｃｒＲＮＡは、配列番号１～１５もしくは３５を有する配列を含み得る。一部の場合では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、配列番号２７～３５のいずれかなどの配列またはこれらの組み合わせを有する。一部の場合では、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、配列番号５８～１４７のいずれかなどの配列またはこれらのあらゆる組み合わせを有する。一部の場合では、サンプルは、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも７つ、または少なくとも８つ、または少なくとも９つ、または少なくとも９つ、または少なくとも１０個の、またはそれを超えるｃｒＲＮＡとインキュベートされる。
検出されるレポータＲＮＡ切断産物の量は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの量と直接的に相関している。一部の場合では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ切断産物の濃度は、レポータＲＮＡ切断産物の標準曲線の使用によって定量または決定することができる。
ＲＮＡを含有することが疑われるサンプルとしては、例えば、唾液、喀痰、粘液、鼻咽頭材料、血液、血清、血漿、尿、吸引液、生検組織、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。一部の場合では、本明細書において記載される方法は、他の工程の前にサンプルの一部分を枯渇する工程、または他の工程の前にサンプル中のヌクレアーゼを阻害する工程を含み得る。例えば、サンプルは、タンパク質、酵素、脂質、核酸、またはこれらの組み合わせが枯渇されていてよい。一部の場合では、サンプルの枯渇される部分は、ヒト核酸部分である。しかし、サンプルのＲＮＡ抽出は好ましくは行われない。
一部の場合では、方法は、サンプルからリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を除去する工程を含み得る。一部の場合では、ＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ阻害剤および／または熱を使用してサンプルから除去される。
一部の場合では、Ｃａｓ１３タンパク質および／またはｃｒＲＮＡは、サンプルとのインキュベーションの前に凍結乾燥される。一部の場合では、Ｃａｓ１３タンパク質、ｃｒＲＮＡ、および／またはレポータＲＮＡは、サンプルとのインキュベーションの前に凍結乾燥される。
一部の場合では、本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が検出されているまたはモニタリングしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２レベルが増大している対象において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を処置する工程を含み得る。このような方法は、検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有する患者への治療剤の投与を含み得る。このような処置は、抗ウイルス療法、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）、呼吸の補助（酸素、気管挿管）、炎症を低減させるためのステロイド、肺炎症を低減させるためのステロイド、血漿の輸血、またはこれらの組み合わせを伴い得る。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している患者には、デキサメタゾン、レムデシビル（ベクルリー）、バムラニビマブ、カシリビマブ、イムデビマブ、またはこれらの組み合わせを投与することができる。バムラニビマブ、カシリビマブ、およびイムデビマブでの治療法は、疾患の進行および重度の病気のリスクが高い患者に、ＦＤＡのＥＵＡの下で利用可能である。一部の患者はまた、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体の投与の利益を受け得る。
配列番号１～３５、５８～１４６、または１４７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含み得る組成物が、本明細書において記載される。組成物は、少なくとも１つのＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質を含み得る。このようなＣａｓ１３タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡのいずれかと複合体化し得、これによって、リボヌクレオタンパク質複合体を形成する。例えば、本明細書において記載されるＣａｓ１３タンパク質のいずれか、例えば、配列番号３６～４８のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有するＣａｓ１３タンパク質のいずれかを使用することができる。
加えて、対応する未改変のＣａｓ１３タンパク質と比較してインビボでのエンドヌクレアーゼ活性が増大しており、野生型Ｃａｓ１３タンパク質の４３６位に対応する位置にリジン（Ｋ）を有する、改変Ｃａｓ１３タンパク質が、本明細書において記載されている。
また、少なくとも１つのＣａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、少なくとも１つのレポータＲＮＡ、ならびにサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出および／または定量するための指示を含むパッケージを含み得るキットも、本明細書において記載される。
第１の周波数のシグナルを使用してサンプルを励起させるためのシグナル生成システム、
サンプル中の蛍光を検出するためのカメラシステム、および
蛍光に基づいてサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出するための処理回路
を含み得る、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出および／または定量するためのシステムもまた、本明細書において記載される。
サンプル中の蛍光を検出するためのカメラシステム、および
蛍光に基づいてサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出するための処理回路
を含み得る、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出および／または定量するためのシステムもまた、本明細書において記載される。
例えば、
システム筐体、
システム筐体内の、励起照明を生じさせるように構成された励起源、
１つまたは複数のサンプルをその中に保持するように構成された１つまたは複数のカートリッジチャンバを有するサンプルカートリッジ、
サンプルカートリッジを受けるように構成されたカートリッジソケット、
を含み得る、蛍光イメージングシステムであって、
カートリッジソケットがサンプルカートリッジを受けることで、１つまたは複数のカートリッジチャンバが励起方向および観察方向にされ、
励起方向では、カートリッジチャンバは励起源の励起照明と整列しており、かつ、
観察方向では、カートリッジチャンバおよびカートリッジチャンバからの蛍光は光学センサーに向けられている、
蛍光イメージングシステムが、本明細書において記載される。
システム筐体、
システム筐体内の、励起照明を生じさせるように構成された励起源、
１つまたは複数のサンプルをその中に保持するように構成された１つまたは複数のカートリッジチャンバを有するサンプルカートリッジ、
サンプルカートリッジを受けるように構成されたカートリッジソケット、
を含み得る、蛍光イメージングシステムであって、
カートリッジソケットがサンプルカートリッジを受けることで、１つまたは複数のカートリッジチャンバが励起方向および観察方向にされ、
励起方向では、カートリッジチャンバは励起源の励起照明と整列しており、かつ、
観察方向では、カートリッジチャンバおよびカートリッジチャンバからの蛍光は光学センサーに向けられている、
蛍光イメージングシステムが、本明細書において記載される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＲＮＡを検出するための装置もまた、本明細書においてより詳細に記載されている。
本開示の多くの態様は、以下の図面を参照してより良く理解することができる。図面の構成要素は必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではない。むしろ、本開示の原理を明確に説明することに重点が置かれている。さらに、構成要素は図を明確にするためだけのために、特定の図では透明として示され、これは図示された構成要素が必ずしも透明であることを示すものではない。
本開示の多くの態様は、以下の図面を参照してより良く理解することができる。図面の構成要素は必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではない。むしろ、本開示の原理を明確に説明することに重点が置かれている。さらに、構成要素は図を明確にするためだけのために、特定の図では透明として示され、これは図示された構成要素が必ずしも透明であることを示すものではない。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染を検出および／または定量するための方法、キット、組成物、および装置が、本明細書において記載される。中国、湖北省の武漢市で２０１９年１２月の後半にそれが出現してから、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、世界的に２１万４８９４人を超える人々に感染している（ドン（Ｄｏｎｇ）ら（２０２０年２月））。新たな原因ウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属に属することが判定されており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶにゲノムレベルで７０％の類似性を有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同様に、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２は、アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を細胞受容体として使用する（ヤン（Ｙａｎ）ら（２０２０年３月）、ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）ら（２０２０年３月）、ウォールス（Ｗａｌｌｓ）ら（２０２０年３月））。
このウイルスは世界的におよび米国で広がり続けているため、患者を診断するための迅速で正確な検査法が必須となっている。ＣＯＶＩＤ－１９の現在の検査法は、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイに基づくものである。世界保健機関によって、中国、ドイツ、香港、タイ、および米国の政府による様々なプライマーセットが発表された。米国では特に、ＣＤＣによって開発された最初の検査法での技術的課題によって、パンデミックの最初の１週間の国の診断能力は最低であった（シャーフスタイン（Ｓｈａｒｆｓｔｅｉｎ）ら（２０２０年３月））。扱いやすく現場配備可能な、ＳＡＲｓ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの定性的検査法は、診断能力を迅速に増大させ得、空港、国境、およびクリニックでのスクリーニングを可能にし得る。
ＳＡＲｓ－ＣｏＶ－２を迅速に検出および／または定量するための方法、キット、および装置が、本明細書において記載されている。本方法は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプルを、Ｃａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、およびレポータＲＮＡと、１つまたは複数のレポータＲＮＡ切断産物が形成されるために十分な時間にわたりインキュベートする工程、ならびに（ｂ）レポータＲＮＡ切断産物のレベルをディテクターで検出する工程を含み得る。このような方法は、サンプルがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの１つまたは複数のコピーを含有するかどうかを検出するために有用である。本方法はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の不存在の検出にも有用である。
一部の態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプル、Ｃａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、およびレポータＲＮＡを含む混合物を、混合物中に存在し得る全てのレポータＲＮＡ切断産物が形成されるための時間にわたりインキュベートする工程、ならびに、混合物中に存在し得るレポータＲＮＡ切断産物のレベルをディテクターで検出する工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の存在または不存在を診断するための方法が、本明細書において提供される。一部の場合では、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡおよび／またはＲＮＡ切断産物は、検出工程の前に逆転写されていない。患者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の存在または不存在は、混合物中に存在し得るレポータＲＮＡ切断産物のレベルを定性的または定量的に検出することによって検出される。
本明細書において記載される方法は、様々な利点を有し得る。例えば、本明細書において記載される方法は、追加の操作を伴うことなく、ＲＮＡを直接検出することができる。ＲＮＡ増幅は一般に不要であり、一方、現在利用可能な方法（例えばＳＨＥＲＬＯＣＫ）では、ＲＮＡ増幅の感度が十分に高いことが必要である。本明細書において記載される方法、キット、および装置は迅速であり、３０分以内に結果を提供する。高価な実験設備および専門的技術は不要である。本明細書において記載される方法は、多くの異なるサンプルタイプ（血液、鼻／口腔スワブなど）に適している。本明細書において記載される方法、キット、および装置は、現場（空港でのスクリーニング、国境、資源不足の地域）での配備が容易であり、そのため、感染の可能性のある人々は、未感染の患者、感染リスクの高い人、および高度に訓練を受けた緊急に必要とされた医療従事者がいる可能性がある病院およびクリニックへ行く必要がなくなる。検査は医療施設またはクリニックで広く行われているが、本明細書において開示されている方法の容易な配置は、現場での迅速な検査を容易にする。検査はまた、感染リスクの高い集団に必要な施設に隔離された人々、および緊急かつ複雑な医療処置に必要な訓練された人々の範囲を超え得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３は、ＲＴ－ＰＣＲによってＲＮＡを検出および定量する従来の方法に対する実行可能な代替案として見出された。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３を使用する利点は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の診断に生かすことができる。Ｃａｓ１３タンパク質はＲＮＡを直接標的化し、またこれは、ｃｒＲＮＡと共に、特異的なＲＮＡ認識のためのプラットフォームを提供するようにプログラムされ得る。Ｃａｓ１３タンパク質をＲＮＡベースのレポータに結合することによって、Ｃａｓ１３タンパク質の副次的なまたは非特異的なＲＮａｓｅ活性を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に利用することができる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出限界は完全には明らかにされていないが、最近の報告は、咽頭のウイルス排出が症候の最初の１週間に非常に高いことを示している（ピークで、７．１１×１０８コピー／喉スワブ）。ウイルスのＲＮＡ負荷の平均は、症候の５日目までで６．７６×１０５コピー／スワブであった（ウォールフェル（Ｗｏｅｌｆｅｌ）（２０２０年３月））。過去、２０１７年および２０１８年に、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ博士の研究所は、ジカウイルスのアトモル濃度およびゼプトモル濃度での検出感度を達成したＣａｓ１３ベースの検出システムを報告したが、これは、ジカウイルスのｃＤＮＡを等温増幅するための追加の逆転写工程を含んでおり、このｃＤＮＡは最終的には、ＳＨＥＲＬＯＣＫ（特異的高感度酵素レポータＵｎＬＯＣＫｉｎｇ）と呼ばれる方法であるＲＮＡベースの検出のために、ＲＮＡに戻し転写（ｂａｃｋ－ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）された（グッテンベルク（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６（６３３６）：４３８～４２（２０１７）、グッテンベルク（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６０（６３８７）：４３９～４４（２０１８））。この方法はＣａｓ１３の感度を向上させたが、この方法は、現場配備可能なかつポイントオブケアのための装置としてのその可能性を最小にする、逆転写およびインビトロ転写を伴う２つの望ましくない工程を導入した。
本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を診断する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの濃度を定量する、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スプライスバリアントおよび／もしくは突然変異の存在を同定する、ならびに／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写の再活性化をモニタリングのための方法および組成物を提供する。
一部の場合では、本方法は、単一の試験管、例えば、回収およびＲＮＡ抽出に使用される同一の試験管で行うことができる。この方法は、単一工程のポイントオブケア診断方法を提供する。他の場合では、本方法は、２チャンバシステムで行うことができる。例えば、生体サンプルを含有する回収スワブを、このような２チャンバシステムのチャンバ１に直接挿入することができる。撹拌、スワブの除去、およびサンプル中の生物学的材料の溶解の後、２つチャンバの間の仕切りを破壊するかまたは取り外し、第１のチャンバの内容物を第２のチャンバに流し込むことができる。第２のチャンバは、Ｃａｓ１３タンパク質、選択されたｃｒＲＮＡ、およびレポータＲＮＡを含有し得、その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアッセイを行うことができる。
チャンバ１は、ウイルス粒子の溶解およびゲノム材料の放出を促進するバッファーを含有し得る。使用可能な溶解バッファーの例としては、限定はしないが、ＰＢＳ、Ｑｉａｇｅｎ ＲＬＴ＋バッファーまたはＱｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔなどの市販の溶解バッファー、ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｈｉｅｌｄ、およびトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ－１００、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、ＮＰ－４０、またはオレス（Ｏｌｅｔｈ）－８などの様々な濃度の界面活性剤が含まれる。
撹拌およびその後のスワブの除去の後、チャンバを簡単に（例えば２～５分間）加熱して（例えば５５℃または９５℃）、溶解をさらに促進してもよい。次いで、２つのチャンバの間の仕切りを破壊するかまたは取り外して、鼻抽出物バッファーを第２のチャンバに流し込み、Ｃａｓ１３のアッセイのための凍結乾燥試薬（Ｃａｓ１３ ＲＮＰおよびレポータＲＮＡ分子）を含有しているこの第２のチャンバを再構成させる。
このようなアッセイ用試験管の使用は、単一工程のポイントオブケア診断方法および装置を提供し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を診断するための、本明細書において記載される方法、装置、および組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプル、Ｃａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、およびレポータＲＮＡを有する混合物を、混合物中に存在し得るレポータＲＮＡ切断産物が形成されるための時間にわたりインキュベートすること、ならびに全てのこのようなレポータＲＮＡ切断産物のレベルをディテクターで検出することを伴い得る。ディテクターは、短鎖クエンチ型蛍光ＲＮＡディテクターまたは全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）ディテクターなどの蛍光ディテクターであり得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を診断するための、本明細書において記載される方法、装置、および組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプル、Ｃａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、およびレポータＲＮＡを有する混合物を、混合物中に存在し得るレポータＲＮＡ切断産物が形成されるための時間にわたりインキュベートすること、ならびに全てのこのようなレポータＲＮＡ切断産物のレベルをディテクターで検出することを伴い得る。ディテクターは、短鎖クエンチ型蛍光ＲＮＡディテクターまたは全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）ディテクターなどの蛍光ディテクターであり得る。
レポータＲＮＡは、例えば、少なくとも１つのクエンチ型蛍光ＲＮＡレポータであり得る。このようなクエンチ型蛍光ＲＮＡレポータは、蛍光の検出を最適化することができる。クエンチ型蛍光ＲＮＡレポータとしては、フルオロフォアおよびフルオロフォアのクエンチャーの両方を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドが含まれる。クエンチャーは、フルオロフォアの蛍光を減少または消失させる。Ｃａｓ１３タンパク質がＲＮＡレポータを切断すると、フルオロフォアが、結び付いているクエンチャーから分離し、その結果、蛍光シグナルが検出可能となる。
このようなフルオロフォアクエンチャー標識型のＲＮＡレポータの一例は、ＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（ＩＤＴ）である。ＲＮａｓｅＡｌｅｒｔは、検査室でのＲＮａｓｅコンタミネーションを検出するために開発され、基質の配列は、ＲＮａｓｅ Ａ種に最適化されている。別のアプローチは、ラテラルフローストリップを使用してＦＡＭ－ビオチンレポータを検出することであり、このレポータは、Ｃａｓ１３によって切断されると、ストリップ上の抗ＦＡＭ抗体－金ナノ粒子コンジュゲートによって検出される。これは、機器を使用しない検出を可能とするが、ほとんどの蛍光ベースのアッセイでは３０分未満であるのに対し、読み出しに９０～１２０分間を要する（グッテンベルク（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．３６０（６３８７）：４３９～４４（２０１８年４月））。
レポータＲＮＡの配列は、Ｃａｓ１３の切断に最適化することができる。異なるＣａｓ１３ホモログは、切断部位で、異なる配列優先性を有し得る。一部の場合では、Ｃａｓ１３は、露出したウリジン部位またはアデノシン部位で、ＲＮａｓｅ切断活性を優先的に発揮する。非常に活性なホモログでは、第２の優先性も存在する。
フルオロフォアクエンチャー標識型のＲＮＡレポータに使用されるフルオロフォアとしては、アレクサ（Ａｌｅｘａ）４３０、ＳＴＡＲ ５２０、ブリリアントバイオレット５１０、ブリリアントバイオレット６０５、ブリリアントバイオレット６１０、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。
フルオロフォアクエンチャー標識型のＲＮＡレポータに使用されるフルオロフォアとしては、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１、ＱＳＹ３５、アイオワブラッククエンチャー（ＩＤＴ）、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手される、多くのクエンチャー部分が利用可能である。
本発明者らは、５ｍｅｒのホモポリマーを全てのリボヌクレオチドについて試験した。これらの優先性に基づいて、様々なＲＮＡオリゴヌクレオチドを、このオリゴヌクレオチドの５’および３’末端でアイオワブラッククエンチャー（ＩＤＴ）およびＦＡＭフルオロフォアを使用して標識し、実施例に記載するトランス－ｓｓＲＮＡ切断アッセイで、これらの配列を体系的に試験した。最良の配列を、本明細書において記載される方法および装置において使用することができる。このようなレポータＲＮＡはまた、キットにおいて、および可動装置での検査に、使用することができる。
様々なメカニズムおよび装置を、蛍光の検出に利用することができる。一部のメカニズムまたは装置は、バックグラウンド蛍光の消失を促進するために使用され得る。例えば、検出のフォーカルプレーンの外側からの蛍光が低減すると、シグナル－ノイズ比が、ひいては、目的のＲＮＡ切断産物からのシグナルの解像度が向上し得る。全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）は、十分に感度の高いカメラでの、非常に低いバックグラウンド蛍光および単一分子感度を可能にする。本明細書において記載されるように、携帯電話は今や、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを検出するために十分な感度を有している。
一部の場合では、Ｃａｓ１３およびレポータＲＮＡの両方が固体表面に繋がれており、ｃｒＲＮＡおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡサンプルを添加すると、活性化したＣａｓ１３は、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）を使用してイメージングすると、小さな蛍光スポットを固体表面上に生じさせ得る。この事例を最適化するためには、レポータＲＮＡのフルオロフォア側を固体表面に繋ぐ方が良く、その結果、切断によって、レポータＲＮＡのクエンチャー部分が拡散される。Ｃａｓ１３タンパク質は、これが複数のＲＮＡレポータ分子を切断できるように十分長いテザーで、固体表面に繋がれ得る。固体表面上に現れた明るいスポットを数えることで、ウイルス量を定量することができる。ポータブルシステムにおけるＴＩＲＦの使用は、検出を容易にし、バックグラウンドを低減させ、その結果、ＲＮＡ切断産物のシグナルが容易に検出され得る。
一部の場合では、Ｃａｓ１３タンパク質およびｃｒＲＮＡのリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を、固体表面に繋いでもよい。ｃｒＲＮＡはしたがって、後に添加する必要はない。逆に、固体表面と接触させる必要があるのは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプルのみである。
一部の場合では、生体サンプルは、患者から単離される。適切な生体サンプルの非限定的な例としては、唾液、喀痰、粘液、鼻咽頭サンプル、血液、血清、血漿、尿、吸引液、および生検サンプルが含まれる。したがって、患者に関する用語「サンプル」としては、ＲＮＡが含まれ得る。生体サンプルは、唾液、喀痰、粘液、および生物由来の他の液体サンプル、生検標本もしくは組織培養物またはこれらに由来する細胞およびこれらの子孫などの固体組織サンプルを包含する。本定義としてはまた、それらを調達した後に、試薬での処理、洗浄、またはある特定の細胞集団の濃縮などの何らかの方法で操作されているサンプルも含まれる。本定義としてはまた、特定のタイプの分子、例えばＲＮＡが濃縮されているサンプルも含まれる。用語「サンプル」は、唾液、喀痰、粘液、鼻咽頭サンプル、血液、血漿、血清、吸引液、脳脊髄液（ＣＳＦ）などの臨床サンプルなどの生体サンプルを包含し、また、外科的切除によって得られた組織、生検によって得られた組織、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、組織サンプル、器官、骨髄、およびそれに類するものも含む。「生体サンプル」としては、細胞に由来する生体液および／またはウイルス（例えば、感染細胞から得られる）が含まれる。ＲＮＡを含有するサンプルは、このような細胞（例えば、細胞溶解物、またはＲＮＡを含む他の細胞抽出物）から得ることができる。サンプルは、様々な体液（例えば、唾液、粘液、もしくは喀痰）、細胞、組織、器官、または無細胞液のいずれかを含み得るか、またはこれから得ることができる。
一部の場合では、生体サンプルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有することが分かっているまたは有することが疑われる患者から単離される。他の場合では、生体サンプルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有するかどうか不明の患者から単離される。他の場合では、生体サンプルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有することが分かっているまたは有さないことが疑われる患者から単離される。換言すると、本明細書において記載される方法および装置は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を同定するため、および対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡへの感染を有さないことを確認するために使用することができる。
一部の場合では、生体サンプルがＲＮＡを含有しているかどうかは不明であってよい。しかし、このような生体サンプルもやはり、本明細書において記載される方法を使用して検査することができる。例えば、生体サンプルは、これがＲＮＡを実際に含有していようがいまいが、またこれがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有していようがいまいが、溶解、ＲＮＡ抽出、Ｃａｓ１３およびｃｒＲＮＡとのインキュベーションなどにかけることができる。
一部の場合では、ＲＮＡを含有し得るサンプルは、Ｃａｓ１３タンパク質（一部は以前にはＣ２ｃ２として知られていた）とインキュベートされる。ｃｒＲＮＡが存在する場合、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ９が結合し得るＤＮＡ基質よりも、ＲＮＡ基質を結合し、切断する。Ｃａｓ１３は、ＲＮＡ切断のために、２つの高等真核生物および原核生物ヌクレオチド結合（ＨＥＰＮ）ドメインを有し、これは、他のタンパク質におけるＨＥＰＮドメインの既知の役割と一致している。一部の場合では、Ｃａｓ１３タンパク質は、配列バリエーションを有し得、および／または他の生物に由来し得る。例えば、Ｃａｓ１３タンパク質は、前述のＣａｓ１３配列のいずれかに対して、または、細菌：Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｈｅｒｂｉｎｉｘ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ｒｅｃｔａｌｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ、および／またはＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉのＣａｓ１３に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
例えば、以下の配列（配列番号３６；ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０３６０５９６７８．１）を有するＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼを使用することができる。
Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼの他の配列、例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＢＢＭ４６７５９．１、ＢＢＭ４８６１６．１、ＢＢＭ４８９７４．１、ＢＢＭ４８９７５．１、およびＷＰ＿０２１７４６００３．１の配列もまた、利用可能である。
別の例において、以下の配列（配列番号３７；ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿１０３２０３６３２．１）を有するＨｅｒｂｉｎｉｘ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼを使用することができる。
しかし、一部の場合では、配列番号３７の配列を有するＣａｓ１３タンパク質は使用されない。
別の例において、以下の配列（配列番号３８；ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０１５７７０００４．１）を有するＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼを使用することができる。
別の例において、以下の配列（配列番号３８；ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０１５７７０００４．１）を有するＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼを使用することができる。
しかし、一部の場合では、配列番号３８の配列を有するＣａｓ１３タンパク質は使用されない。
別の例において、以下の配列（配列番号３９；ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０１２９８５４７７．１）を有するＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼを使用することができる。
別の例において、以下の配列（配列番号３９；ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０１２９８５４７７．１）を有するＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼを使用することができる。
例えば、以下の配列（配列番号４８；ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０１３４４３７１０．１）を有するＰａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼを使用することができる。
例えば、以下の配列（配列番号４０；ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０２２７８５４４３．１）を有するＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼを使用することができる。
例えば、以下の配列（配列番号４１；ＮＣＢＩ受託番号ＢＢＭ３９９１１．１）を有するＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼを使用することができる。
別の例において、以下の配列（配列番号４２；ＮＣＢＩ受託番号Ｃ７ＮＢＹ４；別名ＬｂｕＣ２ｃ２）を有するＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ Ｃ－１０１３－ｂのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼを使用することができる。
一部の場合では、改変Ｃａｓ１３タンパク質が使用され得る。このような改変Ｃａｓ１３タンパク質は、対応する未改変のＣａｓ１３タンパク質と比較して、インビボでのエンドヌクレアーゼ活性が増大している場合がある。例えば、このような改変Ｃａｓ１３タンパク質は、野生型Ｃａｓ１３タンパク質の４３６位に対応する位置にリジン（Ｋ）を有し得る。４３６位のリジン（Ｋ）は、対応する野生型Ｃａｓ１３タンパク質におけるグルタミン酸（Ｅ）を置換し得る。
そのような改変Ｃａｓ１３タンパク質の一例は、Ｅ４３６Ｋ変異および以下の配列（配列番号４３）を有するＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼである。
Ｅ４３６Ｋ突然変異を有する、改変Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼは、未改変のＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼと比較して、インビボでのエンドヌクレアーゼ活性が増大している。Ｅ４３６Ｋを有するＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ（例えば配列番号４３）の使用は、したがって、バックグラウンドよりも感度を約１０～１００倍増大させる。したがって、レポータＲＮＡは、改変Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼによってより速く切断され、これにより、アッセイの感度が増大する。
このような改変は、様々なＣａｓ１３タンパク質に存在し得る。例えば、改変Ｃａｓ１３タンパク質は、配列番号４２または４３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、４３６位にリジンを有する、配列を有し得る。
少なくとも１つのレポータＲＮＡを検出する感度を約１０倍～１００倍増大させ得る改変Ｃａｓ１３タンパク質が、例えば、本明細書において記載される方法、キット、システム、および装置において、有用である。
本発明者らは、他のＣａｓ１３ａおよびＣａｓ１３ｂタンパク質の動態を評価した。このような研究は、一部の場合では、Ｃａｓ１３ｂがＣａｓ１３ａよりも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ検出アッセイにおいて、より速く機能することを示している。
例えば、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｅからのＣａｓ１３ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ検出方法、組成物および装置に使用することができる。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｅのＣａｓ１３ｂタンパク質の配列（ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿００４３４３９７３．１）は、配列番号４４として下記に示される。
このようなＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｅのＣａｓ１３ｂタンパク質は、約２０マイクロモルのＫｍ（ミカエリス定数）基質濃度および約９８７／秒のＫｃａｔを有し得る（例えば、スレイメイカー（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ）ら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２６（１３）：３７４１～３７５１（２０１９）を参照されたい）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ検出方法、組成物および装置に使用することができる別のＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｅのＣａｓ１３ｂタンパク質（ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿００４３４３５８１．１）は、配列番号４５として下記に示される配列を有する。
Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍのＣａｓ１３ｂ（Ｒ１１７７Ａ）変異配列（ＮＣＢＩ受託番号６ＡＡＹ＿Ａ）の一例は、配列番号４６として下記に示される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ検出方法、組成物および装置に使用することができるＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ． ＭＳＸ７３からのＣａｓ１３ｂタンパク質配列（ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿００７４１２１６３．１）の別の例は、配列番号４７として下記に示される。
したがって、サンプルは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および少なくとも１つのＣａｓ１３タンパク質とインキュベートすることができる。Ｃａｓ１３タンパク質は、例えば、Ｃａｓ１３ａタンパク質、Ｃａｓ１３ｂタンパク質、またはこれらの組み合わせであり得る。
ｃｒＲＮＡおよびＣａｓ１３タンパク質が複合体を形成できるように、サンプルを伴わないｃｒＲＮＡおよびＣａｓ１３タンパク質のプレインキュベーションが好ましい。
一部の場合では、ｃｒＲＮＡおよびＣａｓ１３タンパク質が複合体を形成している間、レポータＲＮＡが存在し得る。しかし、他の場合では、レポータＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびＣａｓ１３タンパク質が既に複合体を形成した後に添加され得る。また、ｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ１３複合体の形成後に、サンプルＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ）を次いで添加してもよい。サンプルＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ）は、活性化ＲＮＡとして作用する。活性化ＲＮＡによって活性化されると、ｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ１３複合体は非特異的なＲＮａｓｅとなって、レポータＲＮＡ、例えば短鎖クエンチ型蛍光ＲＮＡを使用して検出され得るＲＮＡ切断産物を生じさせる。
一部の場合では、ｃｒＲＮＡおよびＣａｓ１３タンパク質が複合体を形成している間、レポータＲＮＡが存在し得る。しかし、他の場合では、レポータＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびＣａｓ１３タンパク質が既に複合体を形成した後に添加され得る。また、ｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ１３複合体の形成後に、サンプルＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ）を次いで添加してもよい。サンプルＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ）は、活性化ＲＮＡとして作用する。活性化ＲＮＡによって活性化されると、ｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ１３複合体は非特異的なＲＮａｓｅとなって、レポータＲＮＡ、例えば短鎖クエンチ型蛍光ＲＮＡを使用して検出され得るＲＮＡ切断産物を生じさせる。
例えば、Ｃａｓ１３およびｃｒＲＮＡは、不活性複合体が形成されるための時間にわたりインキュベートされる。一部の場合では、Ｃａｓ１３およびｃｒＲＮＡ複合体は、３７℃で３０分間、１時間、または２時間（例えば０．５～２時間）、共にインキュベートすることによって形成されて、不活性複合体を形成する。不活性複合体は次いで、レポータＲＮＡとインキュベートされ得る。レポータＲＮＡの一例は、ＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔシステムによって提供される。サンプルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡは、ｓｓＲＮＡアクチベータであり得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡサンプルを伴うＣａｓ１３／ｃｒＲＮＡは、シスおよびトランスで切断する活性化型複合体となる。シスで切断すると、例えば、活性化型複合体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを切断し得る。トランスで切断すると、活性化型複合体はレポータＲＮＡを切断し得、これによって、レポータＲＮＡからフルオロフォアなどのシグナルを放出させる。
少なくとも１つのｃｒＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡゲノム内の領域に結合し得る。一部の場合では、領域は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡゲノムの一本鎖の領域である。他の場合では、領域は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのヘアピン領域である。
一部の場合では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｃｒＲＮＡは、配列番号１～３５、５８～１４７のいずれか１つである。一部の場合では、少なくとも１つのｃｒＲＮＡは、配列番号１～３５、５８～１４７のいずれかに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、またはそれを超える配列同一性を有する。
一部の場合では、ｃｒＲＮＡは、スペーサ配列などのさらなる配列を含み得る。表１および表５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃｒＲＮＡ配列の例を示している。表５はまた、スペーサ配列の例も含んでいる。
本明細書において説明するように、ｃｒＲＮＡ２、３、４、７、８、９、および１４（配列番号２、３、４、７、８、９、および１４）は、ｃｒＲＮＡ１、１３、または１５よりも良好なシグナルを示す。さらに、８Ｇ ｃｒＲＮＡ（配列番号２７～３４）の組み合わせは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を大きく向上させる。
一部の場合では、サンプルは、単一のｃｒＲＮＡとインキュベートされる。他の場合では、サンプルは、異なる配列を有する２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれを超えるｃｒＲＮＡとインキュベートされる。
一部の場合では、少なくとも１つのｃｒＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスプライスバリアントおよび／または突然変異を認識する。
一部の場合では、Ｃａｓ１３タンパク質および／またはｃｒＲＮＡは、サンプルとのインキュベーションの前に凍結乾燥される。
一部の場合では、Ｃａｓ１３タンパク質および／またはｃｒＲＮＡは、サンプルとのインキュベーションの前に凍結乾燥される。
一部の場合では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプルは、Ｃａｓ１３タンパク質、ｃｒＲＮＡ、およびレポータＲＮＡと、レポータＲＮＡ切断産物が形成されるために十分な時間にわたりインキュベートされる。一部の場合では、インキュベーションの時間は、約５時間以下、約４時間以下、約３時間以下、約２時間以下、約１．５時間以下、約１時間以下、約４０分間以下、約３５分間以下、約３０分間以下、約２５分間以下、約２０分間以下、約１５分間以下、約１０分間以下、約５分間以下、または約１分間以下である。
一部の場合では、ＲＮＡ切断産物（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの切断産物を含み得る）は、蛍光発光色素対、すなわち、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対および／またはクエンチャー／フルオロフォア対を有する、レポータＲＮＡを使用して検出される。
一部の場合では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡおよび／またはＲＮＡ切断産物は、非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）と共に、サンプルまたは混合物中に存在する。
一部の場合では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡは、１０１０個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーから、１０個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーで、１０９個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーから、１０２個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーで、１０８個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーから、１０３個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーで、１０７個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーから、１０４個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーで、１０６個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーから、１０５個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーで、１０１０個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーから、１００個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーで、１０９個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーから、１００個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーで、１０８個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーから、１００個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーで、１０７個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーから、１００個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーで、１０６個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーから、１００個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーで、１０５個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーから、１００個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーで、１０４個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーから、１００個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーで、または１０３個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーから、１００個の非標的ＲＮＡ（例えば、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ）当たり約１個のコピーで存在する。
一部の場合では、本明細書において記載および開示されている方法は、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約０．５ｎＭ以下、約０．１ｎＭ以下、約０．０５ｎＭ以下、約０．０１ｎＭ以下、約０．００５ｎＭ以下、約０．００１ｎＭ以下、約０．０００５ｎＭ以下、約０．０００１ｎＭ以下、約０．００００５ｎＭ以下、または約０．００００１ｎＭ以下の量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの量を検出することができる。一部の場合では、本明細書において記載および開示されている方法は、約１０ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約１ｐＭ以下、約０．５ｐＭ以下、約０．１ｐＭ以下、約０．０５ｐＭ以下、約０．０１ｐＭ以下、約０．００５ｐＭ以下、約０．００１ｐＭ以下、約０．０００５ｐＭ以下、約０．０００１ｐＭ以下、約０．００００５ｐＭ以下、または約０．００００１ｐＭ以下の量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの量を検出することができる。一部の場合では、本明細書において記載および開示されている方法は、約１００ｆＭ以下、約５０ｆＭ以下、約２５ｆＭ以下、約２０ｆＭ以下、約１５ｆＭ以下、約１０ｆＭ以下、約５ｆＭ以下、または約１ｆＭ以下の量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の量を検出することができる。
一部の場合では、本明細書において記載および開示されている方法は、約１ｆＭ以上、約５ｆＭ以上、約１０ｆＭ以上、約１５ｆＭ以上、約２０ｆＭ以上、約２５ｆＭ以上、約５０ｆＭ以上、約１００ｆＭ以上の量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの量を検出することができる。一部の場合では、本明細書において記載および開示されている方法は、約０．００００１ｐＭ以上、約０．００００５ｐＭ以上、約０．０００１ｐＭ以上、約０．０００５ｐＭ以上、約０．００１ｐＭ以上、約０．００５ｐＭ以上、約０．０１ｐＭ以上、約０．０５ｐＭ以上、約０．１ｐＭ以上、約０．５ｐＭ以上、約１ｐＭ以上、約５ｐＭ以上、または約１０ｐＭ以上の量のＲＮＡ切断産物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ切断産物）の量を検出することができる。一部の場合では、本明細書において記載および開示されている方法は、約０．００００１ｎＭ以上、約０．００００５ｎＭ以上、約０．０００１ｎＭ以上、約０．０００５ｎＭ以上、約０．００１ｎＭ以上、約０．００５ｎＭ以上、約０．０１ｎＭ以上、約０．０５ｎＭ以上、約０．１ｎＭ以上、約０．５ｎＭ以上、約１ｎＭ以上、約５ｎＭ以上、または約１０ｎＭ以上の量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの量を検出することができる。
一部の場合では、本明細書において記載および開示されている方法は、約１０６ｎＭ～約１ｎＭ、約１０６ｎＭ～約５×１０６ｎＭ、約５×１０６ｎＭ～約１０５ｎＭ、約１０５ｎＭ～約５×１０５ｎＭ、約５×１０５ｎＭ～約１０４ｎＭ、約１０４ｎＭ～約５×１０４ｎＭ、約５×１０４ｎＭ～約１０３ｎＭ、約１０３ｎＭ～約５×１０３ｎＭ、約５×１０３ｎＭ～約１０２ｎＭ、約１０２ｎＭ～約５×１０２ｎＭ、約５×１０２ｎＭ～約０．１ｎＭ、約０．１ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．５ｎＭ～約１ｎＭ、約１ｎＭ～約５ｎＭ、または約５ｎＭ～約１０ｎＭの量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの量を検出することができる。
一部の場合では、本方法は、レポータＲＮＡ切断産物のレベル（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを報告する）をディテクターで検出する工程を含む。ＲＮＡ切断産物の検出は、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。適切なディテクターの非限定的な例としては、金ナノ粒子ベースのディテクター、蛍光偏光、コロイド相移動／分散、電気化学的検出、半導体ベースの感知、および標識されたディテクターＲＮＡの検出が含まれる。一部の場合では、標識されたディテクターは、蛍光ディテクター、必要に応じて、短鎖クエンチ型蛍光ＲＮＡである。このようなディテクターの読み出しは、検出可能な蛍光シグナルの測定量を読むための、携帯電話ベースのディテクターを含む、任意の都合の良い読み出し、ゲル上のバンド（例えば、切断されていない基質に対する切断産物を表すバンド）の視覚的分析、着色の存在または不存在の視覚的またはセンサーベースの検出（すなわち、着色検出法）、および電気的シグナルの存在または不存在（または特定の量）であり得る。
一部の場合では、ＲＮＡ切断産物の濃度は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡのレベルと相関するＲＮＡ切断産物のレベルの標準曲線を使用して決定される。このような標準曲線は、過剰であるが一定量のレポータＲＮＡを各々が伴う、量が分かっているが様々な量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ（標的）を含有する一連のアッセイからのシグナルの量を観察することによって作成することができる。このような一連のアッセイからの蛍光は次いで、一定時間にわたり、例えば、約１０分間、約２０分間、約３０分間、約４５分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、またはそれを超えて追跡され得る。一部の場合では、蛍光は、約２時間超追跡される。各反応の初速度が次いで決定され、プロットされて、線形の標準曲線が作成される。並行して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ濃度が未知のサンプルもランされる。未知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡサンプルについての蛍光曲線の初速度（例えば、２時間の蛍光曲線）が、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの濃度を内挿するために標準曲線にプロットされる。
一部の場合では、ＲＮＡは、検出工程の前に逆転写されていない。一部の場合では、本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプルのＲＮＡを増幅する工程、および／またはＲＮＡ切断産物を増幅する工程をさらに含む。他の場合では、本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプルのＲＮＡおよび／またはＲＮＡ切断産物を増幅する工程を含まない。一部の場合では、本方法は、検出工程の前に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプルのＲＮＡを逆転写する工程を含まず、また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプルのＲＮＡおよび／またはＲＮＡ切断産物を増幅しない。
一部の場合では、サンプルまたは反応混合物の１部分が、検出工程の前に枯渇される。適切な枯渇方法の非限定的な例は、その全体が本願明細書に援用される米国出願公開第２０１８／００５１３２０号において記載されている、ハイブリダイゼーションによる豊富な配列の枯渇（ＤＡＳＨ）である。一部の場合では、枯渇されるサンプルの部分は、ヒト核酸部分、例えばヒトＲＮＡである。
一部の場合では、ＲＮａｓｅがサンプルから除去される。一部の場合では、ＲＮａｓｅの機能が、ＲＮａｓｅ阻害剤および／または熱を使用してサンプルから除去される。
ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）はアレイで提供され得、このアレイにおいて、各ｃｒＲＮＡはマイクロアレイのウェル内に存在しているか、または各タイプのｃｒＲＮＡが固体表面上の個別の位置に付着している。ｃｒＲＮＡには、少なくとも１つのＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質が供給され得る。あるいは、ｃｒＲＮＡは、少なくとも１つのＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質との複合体の形成を可能にするまたは容易にする形態で供給され得る。固体表面に付着している全てのｃｒＲＮＡは、少なくとも１つのＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質との複合体の形成に干渉しない様式で提供される。
ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）はアレイで提供され得、このアレイにおいて、各ｃｒＲＮＡはマイクロアレイのウェル内に存在しているか、または各タイプのｃｒＲＮＡが固体表面上の個別の位置に付着している。ｃｒＲＮＡには、少なくとも１つのＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質が供給され得る。あるいは、ｃｒＲＮＡは、少なくとも１つのＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質との複合体の形成を可能にするまたは容易にする形態で供給され得る。固体表面に付着している全てのｃｒＲＮＡは、少なくとも１つのＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質との複合体の形成に干渉しない様式で提供される。
一部の場合では、アッセイは、少量の液体中で行うことができる。例えば、液滴アッセイシステムを使用することができる。用語「液滴アッセイ」は、例えばウェル内の水滴中で行われる反応を指す。好ましくは、液滴アッセイシステムは、反応区域が、水－油エマルジョン中で形成される水滴である、エマルジョン液滴アッセイシステムであり得る。液滴アッセイを行うための技術は、例えば、ハインドソン（Ｈｉｎｄｓｏｎ）ら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、８３：８６０４～８６１０（２０１１）；ピニェイロ（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ）ら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、８４：１００３～１０１１（２０１２）；およびジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２：４６～５３（２０１４）において記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用される液滴アッセイシステムおよびエマルジョン液滴アッセイシステムは、例えば供給元から市販されており、例えば、ＱＸ２００（商標）ＤＲＯＰＬＥＴ ＤＩＧＩＴＡＬ（商標）ＰＣＲシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）である。
切断されたフルオロフォアを大量のサンプルに拡散させるよりもむしろ、油－水エマルジョンを、平均して１つのＣａｓ１３分子（または幾つかの小さな数）を含有する液滴で形成させることができる。液滴中のｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ１３がウイルスＲＮＡに結合している場合（例えば、液滴形成の前の規定のインキュベーション時間の後）、これは液滴中の全てのＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔを切断し、大量の暗い液滴に対して１つの明るい液滴を生じさせる。したがって、エマルジョンは、標的（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡの添加の後または最中に形成され得、そのため、ｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ１３および標的（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡの複合体は、異なる液滴内のｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ１３および標的（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＲＮＡの他の複合体から分離される。十分なレポータＲＮＡが提供され、そのため、実質的に全ての液滴がレポータＲＮＡを有する。
液滴アッセイを使用する場合、蛍光イメージングを（時系列ではなくむしろ）規定の反応時間の後に使用することができ、明るい液滴の数を単純に数えて、サンプル中に存在するウイルスＲＮＡの数を決定することができる。これは液滴ＰＣＲに類似しているが、Ｃａｓ１３に関連するアッセイの診断の感度の増大に有利である。
液滴アッセイには、従来の定量ＰＣＲシステムなどの従来のアッセイと比較して、幾つかの固有の利点がある（ハインドソン（Ｈｉｎｄｓｏｎ）、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｏｃｔ、１０（１０）：１００３～５（２０１３）；Ｄｏｉ、２０１５；ハジェット（Ｈｕｇｇｅｔｔ）、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（９）：ｅ７５２９６（２０１３）；ラチュキ（Ｒａｃｋｉ）、Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０（１）：４２，０１４－００４２－６（２０１４））。
第１に、液滴アッセイによって、正規化、キャリブレータ、または外部参照を必要とすることなく、絶対的な定量が可能となる（ザオ（Ｚｈａｏ）ら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１（７）：ｅ０１５９００４（２０１６））。これは、ポワソン統計によって、鋳型ＲＮＡまたはＤＮＡのコピーの直接的な推定が可能となるためである。第２に、液滴アッセイは、反応物１マイクロリットル当たりの標的コピー数として表される直接的な測定値を提供する（信頼区間と共に）（ハインドソン（Ｈｉｎｄｓｏｎ）、２０１３）。第３に、液滴アッセイはエンドポイント２値アッセイであるため、ＰＣＲ阻害剤などの技術的問題の影響を比較的受けにくい（Ｄｏｉ、２０１５；ハジェット（Ｈｕｇｇｅｔｔ）、２０１３；ラチュキ（Ｒａｃｋｉ）、２０１４）。第４に、根底にある２項分布が、信頼区間を直接計算するために使用され得るため、液滴アッセイは技術的な測定誤差が予測可能である（デュベ（Ｄｕｂｅ）ら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、３（８）：ｅ２８７６（２００８））。第５に、液滴アッセイは、少ない鋳型コピーの検出の精度および感度が増大していることが示されている（ブルネットー（Ｂｒｕｎｅｔｔｏ）、Ｊ Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．２０（４）：３４１～５１（２０１４）；サンダース（Ｓａｎｄｅｒｓ）、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（９）：ｅ７５２９６（２０１３）；ザオ（Ｚｈａｏ）ら、Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２７（６）：７８４～８（２０１５））。第６に、液滴アッセイは、マルチプレックスアッセイとして予測通りにかつ確実にランされ得る。様々な刊行物が、この非常に感度の高い技術の良好なデータの質、精度、および再現性の獲得を容易にするためのガイドラインを提供している（ハジェット（Ｈｕｇｇｅｔｔ）、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（９）：ｅ７５２９６（２０１３））。
キット
本明細書において詳述される方法を行うために有用なキットもまた、本明細書において記載されている。このようなキットは、少なくとも１つのＣａｓ１３タンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質）、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、少なくとも１つのＲＮＡレポータ、および本明細書において記載される方法を行うための指示を有するパッケージを含み得る。一部の場合では、Ｃａｓ１３タンパク質およびｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ１３複合体として提供される。レポータＲＮＡは、別個にパッケージされ得るか、または、少なくとも１つのＣａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、もしくはこれらの複合体と共にパッケージされ得る。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの各々は、配列番号１～３５、５８～１４７のいずれかに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を有し得る。
本明細書において詳述される方法を行うために有用なキットもまた、本明細書において記載されている。このようなキットは、少なくとも１つのＣａｓ１３タンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質）、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、少なくとも１つのＲＮＡレポータ、および本明細書において記載される方法を行うための指示を有するパッケージを含み得る。一部の場合では、Ｃａｓ１３タンパク質およびｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ１３複合体として提供される。レポータＲＮＡは、別個にパッケージされ得るか、または、少なくとも１つのＣａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、もしくはこれらの複合体と共にパッケージされ得る。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの各々は、配列番号１～３５、５８～１４７のいずれかに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を有し得る。
ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）またはＣａｓ１３タンパク質は、アレイで提供され得る。例えば、各ｃｒＲＮＡはマイクロアレイのウェル内に存在していてよいか、または各ｃｒＲＮＡは固体表面上の個別の位置に付着していてよい。Ｃａｓ１３タンパク質は、アレイされたｃｒＲＮＡの各々との複合体として提供され得る。あるいは、Ｃａｓ１３タンパク質はマイクロアレイのウェル内に存在し得、かつ異なるｃｒＲＮＡがマイクロアレイの異なるウェル内に存在し得るか、または、異なるｃｒＲＮＡが、固体表面上の個別の位置に付着しているＣａｓ１３タンパク質と複合体化し得る。本明細書において記載されるように、固体表面に付着している全てのｃｒＲＮＡまたはＣａｓ１３タンパク質は、ｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ１３複合体の形成、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡによる活性化、およびレポータＲＮＡの切断に干渉しない様式で提供される。
キットはまた、１つまたは複数の蛍光色素、蛍光クエンチャー、ヌクレアーゼを含有しない水、溶液のｐＨを調整するためのバッファー構成要素、ヌクレアーゼ阻害剤（例えばＲＮａｓｅ阻害剤）、反応容器、細胞／ウイルス溶解試薬、サンプルを安定化させるための構成要素、ＲＮＡを安定化させるための構成要素、グローブ、マスク、患者からサンプルを回収するための道具、またはこれらの組み合わせなどの構成要素も含み得る。例えば、キットは、アレクサ（Ａｌｅｘａ）４３０、ＳＴＡＲ ５２０、ブリリアントバイオレット５１０、６０５、および６１０、またはこれらの組み合わせなどの蛍光色素を含み得る。蛍光色素はフルオロフォアとして使用され得、また、アイオワブラックＦＱおよびＲＱ（ＩＤＴ）はクエンチャーとして使用され得る。フルオロフォアおよびクエンチャーの選択は、どちらが励起光からのあらゆるバックグラウンドシグナルを最小にしながら最適なシグナルを生じさせるかに基づいて行うことができる。
サンプルを回収するための道具は、少なくとも１つのスワブ、サンプル用の容器、アルコールスワブ、ヌクレアーゼ阻害剤（例えばＲＮａｓｅ阻害剤）、またはこれらの組み合わせを含み得る。
キットはまた、蛍光を検出するための装置または構成要素も含み得る。蛍光ベースの読み出し技術は、アッセイの感度を増大させ、可動検出技術と組み合わせると、診断の現場配備可能な特徴を可能にする。携帯電話は、検査室のプレートリーダーとは異なる方法で光を検出するが、照明光学系および集光光学系を適正に設計することで、蛍光の検出に適合させることができる。例えば、キットは、蛍光シグナルの検出および／または定量を可能にするために可動装置（例えば携帯電話）と組み合わせることができる、米国特許第１０，５７８，８５１号において記載されているスライドスキャンシステムのためのハードウェアおよび／またはソフトウェアを含み得る。
検査室外での検査を可能にするために、革新的な携帯電話ベースの検出を使用することができる。携帯電話のカメラは、先進世界および開発途上世界において最も至る所にある光学センサーであり、顕微鏡および分光器として使用されてきている（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ．６（３）：ｅ１７１５０（２０１１年３月）；バーグ（Ｂｅｒｇ）ら、ＡＣＳ Ｎａｎｏ．９（８）：７８５７～６６（２０１５）；スカンダラジャ（Ｓｋａｎｄａｒａｊａｈ）（２０１５））。加えて、コアプロセッサー、データ・コネクティビティー、および帯域幅を有する携帯電話は、高度な診断適用に利用することができる計算能力を提供する。本明細書において記載される方法と携帯電話ベースの技術とを組み合わせることによって、検査サンプルを検査機関に送ることなくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することが可能となり、むしろ、ＣｏＶＩＤ－１９の感染を、研究室、クリニック、および病院ではなく遠隔地で検出することが可能となる。したがって、本明細書において記載されるアッセイと感度の高い蛍光ベースのアウトリードとを組み合わせる方法およびキットは、根本的に新規なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２診断法への具体的なトランスレーショナルな進歩をもたらす。
本方法、キット、および装置はまた、検出手順の結果を、検査対象のサンプルを提供した対象に、１人もしくは複数人の医療関係者に、１つもしくは複数の政府当局に、データベースに、またはこれらの組み合わせに報告するための、指示および／または構成要素も含み得る。本方法、キット、および装置はまた、検査対象のサンプルを提供した対象の位置を報告することも含み得る。報告される結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の陽性または陰性の報告を含み得る。
必要に応じて、本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が検出されているまたはモニタリングしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２レベルが増大している対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を処置するさらなる工程を含む。このような方法は、検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有する患者への治療剤の投与を含み得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が検出されている場合のこのような処置は、抗ウイルス療法、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）、呼吸の補助（酸素、気管挿管）、炎症を低減させるためのステロイド、肺炎症を低減させるためのステロイド、血漿の輸血、またはこれらの組み合わせを含み得る。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者には、デキサメタゾン、レムデシビル（ベクルリー）、バムラニビマブ、カシリビマブ、イムデビマブ、またはこれらの組み合わせを投与することができる。バムラニビマブ、カシリビマブ、およびイムデビマブでの治療法は、疾患の進行および重度の病気のリスクが高い患者に、ＦＤＡのＥＵＡの下で利用可能である。一部の患者はまた、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体の投与の利益を受け得る。
一部の場合では、本明細書において記載されるキットはまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を処置するための治療剤も含み得る。
ＳＡＲＡ－ＣｏＶ－２の配列
コード領域を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩウェブサイトから受託番号ＮＣ＿０４５５１２．２として入手可能である（本明細書において配列番号５５として提供される）。
ＳＡＲＡ－ＣｏＶ－２の配列
コード領域を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩウェブサイトから受託番号ＮＣ＿０４５５１２．２として入手可能である（本明細書において配列番号５５として提供される）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルスゲノムはＲＮＡである。したがって、一部の場合では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルスゲノムは、チミン（Ｔ）残基がウラシル（Ｕ）残基である、前述のＤＮＡ配列のコピーであり得る。一部の場合では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムは、前述のＤＮＡ配列の相補体であり得る。
しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムはまた、配列バリエーションも有し得る。例えば、本明細書において記載される方法、組成物、および装置によって検出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の配列番号５５の核酸のＲＮＡコピーまたはＲＮＡ相補体に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、配列番号５５の配列の１～２６５位に、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ、リーダー配列またはリーダーＲＮＡとしても知られている）を有し得る。このような５’ＵＴＲは、開始コドンのすぐ上流にあるｍＲＮＡ領域を含み得る。同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２９６７５～２９９０３位に３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を有し得る。プラス鎖ＲＮＡウイルスでは、３’ＵＴＲはウイルスＲＮＡ複製の役割を有し得、それは、マイナス鎖ＲＮＡの複製中間体の起点がゲノムの３’末端にあるためである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムは、幾つかの主要な構造タンパク質：スパイク（Ｓ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする。これらのタンパク質の一部は、配列番号５５の配列の２６６～２１５５５位にある、大きなポリプロテイン部分である。
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列番号５５の核酸の１３４４２～１３４６８位および１３４６８～１６２３６位でコードされる。このＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ＮＣＢＩ受託番号ＹＰ＿００９７２５３０７が割り当てられており、以下の配列（配列番号５６）を有する。
このようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを増幅させるために使用することができる。
装置
図１０は、光学的方法に従ってフルオロフォアを検出するための可動装置を含む、ポイントオブケア（ＰＯＣ）システムを示している。ＰＯＣシステムは、組み込まれた携帯電話および特定のカートリッジを含み、当該カートリッジは、スワブ用のインサート、アッセイ、蛍光を励起させ測定するためのレーザおよびキャピラリーを有する。携帯電話は、検査室の蛍光光度計およびプレートリーダーと異なる方法で光を検出するが、照明光学系および集光光学系を適合させることによって、蛍光検出に適合させることができる。携帯電話のカメラは、波長を選択し、カラーイメージをキャプチャーするための、交互のピクセル（ベイヤーフィルターモザイクまたは関連するパターンで）の上を覆って位置するカラーフィルタを有する、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサーを使用し得、その一方、蛍光光度計およびプレートリーダーは、検出のための波長および光電子増倍管を選択するために回折格子を使用することが多い。
装置
図１０は、光学的方法に従ってフルオロフォアを検出するための可動装置を含む、ポイントオブケア（ＰＯＣ）システムを示している。ＰＯＣシステムは、組み込まれた携帯電話および特定のカートリッジを含み、当該カートリッジは、スワブ用のインサート、アッセイ、蛍光を励起させ測定するためのレーザおよびキャピラリーを有する。携帯電話は、検査室の蛍光光度計およびプレートリーダーと異なる方法で光を検出するが、照明光学系および集光光学系を適合させることによって、蛍光検出に適合させることができる。携帯電話のカメラは、波長を選択し、カラーイメージをキャプチャーするための、交互のピクセル（ベイヤーフィルターモザイクまたは関連するパターンで）の上を覆って位置するカラーフィルタを有する、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサーを使用し得、その一方、蛍光光度計およびプレートリーダーは、検出のための波長および光電子増倍管を選択するために回折格子を使用することが多い。
上記のように、携帯電話のカメラを蛍光検出に適合させるために、リボオリゴヌクレオチドを、本明細書において先に記載したフルオロフォアおよびクエンチャーの両方と共に含む、新規なレポータＲＮＡを使用することができる。本明細書において同様に先に記載した選択過程に従うと、１０の候補ＲＮＡオリゴヌクレオチドが選択および検査され、フルオロフォアおよびクエンチャーが結び付いている最良のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの検出のための可動装置（例えば、図１０の携帯電話）と共に使用することができる。
どの色素、クエンチャー、またはこれらの組み合わせが、励起光（例えば、４８５ナノメートル（ｎｍ）のレーザであり得るが、この場合に限定されない、図１０に示すレーザ）からのあらゆるバックグラウンドシグナルを最小にしながら最適なシグナルをもたらすかを決定するために、アレクサ（Ａｌｅｘａ）４３０、ＳＴＡＲ ５２０、ブリリアントバイオレット５１０、６０５、および６１０、またはこれらの組み合わせを含む蛍光色素をフルオロフォアとして使用することができ、また、アイオワブラックＦＱおよびＲＱ（ＩＤＴ）をクエンチャーとして使用することができる。検査用の電話、例えば、図１０に示す携帯電話または他の可動装置は、キャピラリーで励起光によって生じた発光を検出することができ、ここで、キャピラリーには、Ｃａｓ１３アッセイのためのアッセイ試薬がロードされている。カラーフィルタの透過スペクトルおよび相対的感度が、センサーの特徴付けに適合した蛍光光度計を使用して決定され得る。考えられるフルオロフォア／クエンチャーの組み合わせのパネルの蛍光シグナルおよびバックグラウンドシグナルは、同一の蛍光光度計で特徴付けすることができ、検査用の電話および利用可能な最善の励起ＬＥＤまたはレーザおよび干渉フィルター対と組み合わせると、シグナルおよびバックグラウンドの全体を計算することができる。上位３つの候補フルオロフォア／クエンチャーの組み合わせが、キャピラリーにロードされた２０μｌのサンプル体積からの蛍光を測定するように設定された携帯電話ベースの逆レンズ顕微鏡システムを用いて実験的に検査される。フルオロフォア／クエンチャーの組み合わせを選択するための基準としては、検査サンプル（標的アクチベータ）の不存在下でのバックグラウンド蛍光の低減、および、標的アクチベータが存在する場合の、選択されたＣａｓ１３酵素による最大の切断が含まれる。蛍光の変化は経時的に測定され、センサーの積分時間は、露出設定を最適化するように変化してよい。フルオロフォア／クエンチャーの組み合わせの濃度は、Ｃａｓ１３ａ ＲＮＰとの複合体におけるアクチベータＲＮＡの濃度（合成の、または感染したサンプルから単離された）の変化に伴って変化して、サンプル調製の制約を決定し、アッセイの検出限界を同定する。幾つかのｃｒＲＮＡおよびＣａｓ１３タンパク質の選択が記載されているが、これらの場合に限定されず、他のタンパク質が選択されてもよい。
他の場合では、光学的ではなく機械的なプロセスが検出に使用され得る。１つのこのような場合では、微細作製されたカンチレバーベースのセンサーは、リファレンスカンチレバーおよびセンサーカンチレバーを含む。センサーカンチレバーのトランスデューサー表面で検出される標的種の存在は、カンチレバーの質量を増大させ、静電気的な反発、立体的障害、ファンデルワールス相互作用、または水和力などの分子相互作用に起因する屈曲を生じさせる。共鳴周波数シフトもまた生じる。
一部の場合では、リファレンスカンチレバーと異なる、センサーカンチレバーの屈曲は、例えば、図１０または機械７００（図１１）の処理回路または他の構成要素によって検出される。活性化されると、Ｃａｓ１３は、センサーカンチレバーへの結合分子であるＲＮＡを切断し得、センサーカンチレバーの曲げ剛性を変化させて、共鳴周波数のシフトを生じさせる。あるいは、活性なＣａｓ１３は、カンチレバーに結合している分子を放出し得、また、カンチレバーの屈曲および／または共鳴周波数を変化させる。カンチレバーへのこのような結合または未結合は、カンチレバーの質量の変化に加えて、屈曲が促進されるように非対称的に行うことができる。検出は、例えば屈曲の程度に基づいて行うことができる。
カンチレバーは、標的分子の存在によって生じる質量負荷および表面の弾性の変化に対して感度が高い場合がある。これは、カンチレバーの剛性力の変化を生じさせ得る。したがって、ヤング率が高い材料を、カンチレバーでの使用に検討するべきである。このような材料としては、ダイアモンドが含まれる。さらに、ダイアモンドの炭素終端表面は、感度の高い層として使用される有機化合物の共有結合によって容易に修飾され得る。
カンチレバーの共鳴周波数の測定は、機械７００（図１１）の装置に含まれ得る、ドップラーレーザ干渉装置などの機器で行うことができる。少なくともこれらの場合では、６２０～６９０ｎｍの範囲で発光するコヒーレントレーザ源は、ビームスプリッターを通過する。ビームの半分は、共振性のカンチレバー表面に送られ、ここでビームは反射して、カンチレバーの共鳴周波数を検出するための干渉計およびデモジュレーターに戻る。ビームの残り半分は、参照のために干渉計に直接送られる。他の場合では、検出のために別の電気的プロセスが行われる。１つのこのような場合では、電気化学的なＲＮＡアプタマーベースのバイオセンサーが使用される。ＲＮＡアプタマー配列は電極（例えば金で構成される）に固定され得、また、電極の一端は、フェロセン（Ｆｃ）酸化還元プローブとコンジュゲートしていてよい。荷電した基が導電性表面に結合しているＲＮＡアプタマーは、活性なＣａｓ１３によって切断され（または、Ｃａｓ１３の切断によって放出されるものによって結合され）、電子移動を阻害し、導電性表面への酸化還元電流を変化させる。この電流の測定は、例えば、図１０または機械７００（図１１）の処理回路または他の構成要素によって行われる。
上記のキャピラリーを有するカートリッジを含むアダプターが、図１１で示されているＰＯＣシステムで提供され得るか、これに含まれ得る。ＰＯＣシステム（例えば、携帯電話の、以下の図１１で記載されている処理回路）は、検出結果を測定および送信するためのソフトウェアを含み得る。検出結果は、携帯電話のＧＰＳシステムまたは他の位置ベースのシステムに基づいて、コンタクト・トレーシングに使用され得る。検出結果は、キーベースのハンドシェイク、パスコードなどの使用を介して、匿名のまたは安全な方法で保存または取得され得、結果は、生物監視における使用のために集められ得る。
図５６は、例示的な蛍光イメージングシステム１０の透視図である。この例において、システム１０は、限定はしないが携帯電話、タブレットｐｃ、ノートパソコン、またはそれに類するものを含む可動装置１４を連結し、これらと協働するように構成されている。図５６で提供されている例で示されている可動装置１４は、カメラ（例えば、ビデオカメラまたはスチルカメラの１つまたは複数）などの光学センサーを含んでおり、一部の例では、取り付けられた可動装置光学系を含んでいる。
蛍光イメージングシステム１０は、励起源（例えば光源）、光学系、フィルター、およびサンプル保持機構を有する、システム筐体１２を含む。本明細書において論じられる蛍光イメージングシステム１０は、アッセイ混合物などの検査サンプル中の抗原を蛍光によって検出し、必要に応じて定量するように構成されている。本明細書において論じられるように、可動装置１４を含む例示的なシステム１００において、装置１４は、例えば、携帯電話カメラなどの可動装置の光学センサーで、アッセイ混合物（および必要に応じてコントロール混合物）からの蛍光を受け取る。可動装置１４は、受け取った蛍光を解読し、アッセイ混合物中の１つまたは複数の抗原の指標、１つまたは複数の抗原の量または濃度、またはそれに類するものを提供する、オンボード・コントローラ（例えば、プロセッサ、プログラムされたロジックコントローラ、回路、機械判読可能なメディア、ソフトウェアモジュール、またはこれらに類するもの）を必要に応じて含む。例えば、可動装置１４は、１つまたは複数の静的または動的な閾値を有するコンパレータを含み、コンパレータは、閾値と比較した、アッセイ混合物からの蛍光を分析して、抗原の存在を示す。別の例では、蛍光の強度（例えば、吸光度、減衰、輝度、これらの測定値の勾配、これらの変化率、またはこれらに類するもの）が解読されて、抗原の存在、量、または濃度の１つまたは複数が示される。別の例では、閾値は、アッセイ混合物のように同様に励起照明を受けている１つまたは複数のコントロール混合物に基づくものであり、コントロール混合物の蛍光は、アッセイ混合物の蛍光と比較するためのベース閾値として使用される。例えば、コントロール混合物の蛍光よりも強いアッセイ混合物の蛍光（例えば、コンパレータでの分析を介する）は、一例では、抗原の存在を示している。別の例では、アッセイ混合物の蛍光は、特定の一定値または関数ベースの値によって修正されたコントロール混合物の蛍光よりも強い場合、抗原の存在を示す。プロットされた、時間に対するアッセイ混合物の蛍光（単独の、またはコントロール混合物と比較した）は、別の例では、抗原の量または濃度に対応している（例えば、ルックアップテーブル、数学的関数、またはそれに類するものでの比較による）。
図５６にさらに示すように、システム１００は、１つまたは複数のカートリッジチャンバ１８（例えば、キャピラリー、チャネル、溝、通路、またはこれらに類するもの）を有する、サンプルカートリッジ１６を含む。カートリッジチャンバ１８は、システム１００での検査のために、限定はしないがアッセイ混合物、コントロール混合物、またはそれに類するものを含むサンプルを保持するように構成されている。カートリッジチャンバ１８は、一例では、ＬＥＤジェネレータ、レーザジェネレータ、またはそれに類するものなどの励起源からの励起照明と相補的に整列するように構成されている。例えば、カートリッジチャンバ１８は、励起照明と一列になる（例えば、励起照明に沿う、励起照明と平行になる、またはそれに類する）方向にされて、さもなければ蛍光を人為的に絞り得るカートリッジチャンバ１８の部分の影の形成または遮蔽を最小にしながら、カートリッジチャンバ１８の体積（およびその中のサンプル）を励起照明に露出する。励起照明およびカートリッジチャンバ１８（およびその中のサンプル）の方向の一例が、図５８Ｂの右側の構成画像で示されている。
カートリッジチャンバ１８を有するサンプルカートリッジ１６は、蛍光イメージングシステム１０のカートリッジポート１７にロードされる。カートリッジ１６のロードによって、カートリッジチャンバ１８は、蛍光のための励起照明に対して相補的な励起方向（整列している、並行の、方向が同じである、またはそれに類する）に位置付けられる。例えば、システム筐体１２は、サンプルカートリッジ１６を受けるように構成されたカートリッジソケット１９を含む。相補的なカートリッジソケット１９およびサンプルカートリッジ１６（例えば、両者の相補的プロフィール）は、カートリッジチャンバ１８およびそれらに付随するサンプルの位置を、励起源および光学センサーと相補的な方向に自動的に位置付ける。例えば、励起源からの照明は、カートリッジチャンバの方向と共通の少なくとも１つの共通ベクトルに沿って伝搬される（図５８Ｂに示すように、励起照明の構成ベクトル３１は、カートリッジチャンバ１８と方向が同じである）。同様に、ロードされた、カートリッジチャンバ１８を有するサンプルカートリッジ１６は、観察方向にあり、また、そこからの蛍光はしたがって、光学センサーに向けられている。サンプルカートリッジおよび相補的なカートリッジソケット１９は、サンプルのロード、検査、および取り出しを容易にする。追加のサンプルカートリッジ１６を用いてのこれらの手順の反復は、こうして、カートリッジチャンバ１８が励起方向および観察方向に自動的に向けられることを介して、容易に行われる。
図５７は、（この例では）可動装置１４を含む蛍光イメージングシステム１０の一例の概略図である。システム１０は、励起源２０、例えば、レーザジェネレータ、および一例では４８８ナノメートル（ｎｍ）のレーザジェネレータを含む。必要に応じた励起フィルター２２は、励起源２０に近接しており、アウトプット励起照明を、カートリッジチャンバ１８への伝搬の前にフィルタリングする。例えば、励起フィルター２２は、励起照明を、およそ４５０～４７０ｎｍの間の波長に、またはサンプル（例えば、アッセイ混合物、コントロール混合物、もしくはそれに類するもの）での蛍光を促進する波長に、フィルター処理する。
図５７にさらに示すように、励起照明に対して斜角の方向にされたカートリッジチャンバ１８が、概略的に示されている（記載を容易にするために、サンプルカートリッジの残り部分は図５７では除かれている）。一例では、カートリッジチャンバ１８およびその中のサンプルは、励起照明に対して斜め方向にされているが、照明の１つまたは複数の構成ベクトルが、励起方向のカートリッジチャンバと同じ方向である。例えば、図５８Ｂに示すように、励起照明の構成ベクトル３１は、細長いプロフィールのカートリッジチャンバ１８と方向が同じである（例えば、平行である、整列している、またはそれと同様）。一例では、この方向は励起方向５１と呼ばれ、蛍光または蛍光の観察を妨げ得る照明の遮蔽、影、光の散乱、またはこれらに類するものを最小にしながら、カートリッジチャンバのかなりの部分の照明を容易にする。
励起照明での、カートリッジチャンバ１８およびその中のサンプルの照明は、例えば、Ｃａｓ１３アッセイ試薬またはそれに類するものが存在している場合に、蛍光を生じさせる。蛍光は、図５７において、カートリッジチャンバ１８から全体的に放射しているものとして示されている。少なくとも一部の量の蛍光は、カメラを有し、光学センサーが取り付けられている、可動装置１４に向けられている。示されているように、１つまたは複数の追加の構成要素が、蛍光の観察、および付随する、抗原の量または濃度の検出、同定、または決定を容易にするために、カートリッジチャンバと可動装置１４との間に必要に応じて挟まれている。
一例として、構成要素としては開口部２３が含まれ、これは、カートリッジチャンバ１８のプロフィール（例えば、形状、サイズ、またはそれに類するもの）に対応して光学センサーでの光の散乱を最小化し、照明を形作るように構成された、開口部口を有する。別の例では、イメージング光学系２８が、カートリッジチャンバ１８と可動装置１４の光学センサーとの間に挟まれている。イメージング光学系２８は、一例では、蛍光照明を光学センサーに集める。別の例では、イメージング光学系２８は、可動装置の光学系４０などの光学系と協働して（図５８Ａを参照されたい）、蛍光照明を可動装置１４の光学センサーに集合的に集める。例えば、イメージング光学系２８は、カートリッジチャンバ１８および付随するサンプルのクローズアップ観察またはマクロ観察のために、逆レンズまたは可動装置の光学センサー４２を適合させる逆レンズモジュール、および可動装置の光学系４０を含む。
本明細書において記載されるように、イメージング光学系２８（または図５９Ａ、図６０における１１６）は、必要に応じてテレセントリックであり、視野（ＦＯＶ）内の１つまたは複数の位置のフィルター性能の変化を最小にすることによって発光フィルターの性能を増強させる。逆に、テレセントリックなイメージング光学系２８（または１１６）は、ＦＯＶ全体での性能の一貫性（同一性を含む）を増強させ、ＦＯＶ内の１つまたは複数の位置での不特定の色へのシフト（ブルーシフトなど）を最小にし、光学センサーでの観察および分析のための一貫した蛍光出力を提供する。
図５８Ａは、蛍光イメージングシステム１０の１組の概略図を含んでいる。図５８Ａの左側の図はシステム１０の側面からの図であり、構成要素を見るためにシステム筐体１２が開かれており、一方、右側の図は、可動装置の光学センサー４２およびサンプルカートリッジ１６に近接した、システム１０の端面図であり、サンプルカートリッジ１６から可動装置の光学センサー４２への蛍光の伝搬を示している。
システム１０の一方の（左側の）図において、励起照明は励起源２０から生じ、励起フィルター２２で必要に応じてフィルター処理される。励起照明は、システム筐体１２を通って、その中にサンプルを有するカートリッジチャンバ１８を有するサンプルカートリッジ１６に向けられる。図５８Ａに示すように、励起照明は１つまたは複数のミラーを有する支持筐体１２を通って導かれて、照明をサンプルカートリッジ１６に再び向ける。必要に応じて、開口部口２６を有する開口部２４が、励起源２０とサンプルカートリッジ１６との間に挟まれている。開口部２４は光の散乱を最小にし、照明をカートリッジチャンバ１８に対応するプロフィール（例えば、形状、サイズ、またはそれに類するもの）で向けて、光学センサーを飽和させ得るかまたはカートリッジチャンバ１８内のサンプルで生じる蛍光の検出を不明瞭にし得る光の散乱を生じさせる外部からの照明を最小にしながら、カートリッジチャンバ１８の照明を確実にする。
ここで図５８Ａおよび図５８Ｂを参照すると、励起源２０から、サンプルカートリッジ１６のカートリッジチャンバ１８への、励起照明の伝搬が示されている。図５８Ａに示すように、励起照明は、カートリッジチャンバ１８に対して斜めの励起照明の構成照明ベクトル２９（励起照明の構成ベクトルとも呼ばれる）を含む。例えば、示されている構成照明ベクトル２９はカートリッジチャンバ１８に向けられているが、その点以外では、カートリッジチャンバ１８と整列してもおらず、同じ方向でもなく、平行でもなく、またはそれと同様である。励起照明は、カートリッジチャンバ１８内のサンプルと相互作用して蛍光を生成し（例えば、サンプルに蛍光を生じさせ）、また、蛍光は、可動装置の光学センサー４２などの光学センサーで観察され、必要に応じて定量される。図５８Ａおよび図５８Ｂにおける散乱光３３で示されるように、構成ベクトル２９の斜めの方向は、励起照明を散乱させて光学センサー４２から遠ざけて、センサー４２での蛍光の不明瞭さを最小にする。
図５８Ｂの右側の構成図は、励起照明５２に対するカートリッジチャンバ１８の励起方向５１の詳細な図を提供している。示されているように、この例でのカートリッジチャンバ１８は、その中にサンプル（例えば、アッセイ混合物、コントロール混合物、またはそれに類するもの）を有する、細長いプロフィールを有する。図５８Ｂでさらに示すように、励起照明５２は、別の構成照明ベクトル３１（励起照明の構成ベクトルとも呼ばれる）を含む。示されている構成ベクトル３１は、カートリッジチャンバ１８（例えば、チャンバ壁２１およびその中のサンプル）と方向が同じであるか、または逆に、カートリッジチャンバ１８は、構成ベクトル３１と方向が同じである。例えば、ベクトル３１は、チャンバ壁２１に対応する細長いプロフィールのカートリッジチャンバ１８と整列しているか、平行であるか、または方向が同じである。励起方向５１を有する励起照明はこれによって、カートリッジチャンバ１８の大部分に向けられ（例えば、細長いプロフィールまたは寸法に沿って）て、チャンバ中のサンプルの対応する大部分を照明する。カートリッジチャンバ１８およびその中のサンプルは励起照明の構成ベクトル３１と方向が同じであるため、照明の遮蔽、カートリッジチャンバに落ちる影、またはそれに類するものが最少となる。逆に、カートリッジチャンバ１８の大部分（例えば、サンプルの表面からチャンバの底までの、チャンバ体積全体、体積の大部分、または体積のほとんど大部分）が照明され、照明された部分は、抗原および適切な試薬の存在に基づいて蛍光を発する。逆に、さもなければ蛍光が乏しいかまたは蛍光を発することができない、カートリッジチャンバ１８の遮蔽されたまたは影が形成された部分は、これによって最小となる。図５８Ｂに示すように、蛍光を発しているアッセイ混合物５４および蛍光を発しているコントロール混合物５６はそれぞれ、それらのそれぞれのプロフィールの大部分で、例えばサンプル表面でおよびサンプル体積の全体にわたって、例えばチャンバ１８の底に向かって（例えば、ページの向こう側に向かって）、蛍光を発する。
図５８Ａ（両構成図）は、可動装置１４の可動装置光学センサー４２などの光学センサーに対する、カートリッジチャンバ１８およびその中のサンプルの観察方向２７の一例を示す。示されているように、カートリッジチャンバ１８と、その中のサンプルからの蛍光（励起照明によって生じる）とは、光学センサー４２に向けられている。例えば、カートリッジチャンバ１８のチャンバ壁２１は、カートリッジチャンバ１８から光学センサー４２への蛍光（図５８Ａの両構成図において垂直な点線矢印で示されている）と方向が同じである（例えば、整列している、平行である、またはそれと同様）。したがって、サンプルによってカートリッジチャンバ１８内で生じた蛍光は、サンプルカートリッジ１６から光学センサー４２まで遮蔽が最少の状態で伝搬されて、蛍光の検出が容易になる。逆に、励起照明からの散乱光３３は光学センサー４２から離れる方に向けられており、蛍光の検出に対する散乱光の影響はこれによって最小となる。
カートリッジチャンバ１８で励起照明で生じた蛍光は、光学センサー４２に対する観察方向２７（例えば、カートリッジ１６およびそのチャンバ１８の位置付け）に従って光学センサー４２に向けられる。図５８Ａに示すように、蛍光は、光をフィルター処理し、蛍光を光学センサー４２まで優先的に通過させるための、発光フィルター３０を通過する。必要に応じて、イメージング光学系２８（上記の）が、サンプルカートリッジ１６と可動装置の光学系４０との間に挟まれており、可動装置の光学系４０と協働して、可動装置の光学センサー４２への蛍光の伝搬を増強させる。別の選択肢では、光学センサー４２への散乱光の通過を最小にし、光学センサー４２に伝搬される蛍光をカートリッジチャンバ１８のプロフィールに対応して形作る（例えば、また、センサーへの散乱光の伝搬を最小にする）ために、開口部２３が提供されている。
図５８Ｂの左側の構成図は、右側の構成図で示されている蛍光を発しているアッセイ混合物５４および蛍光を発しているコントロール混合物５６に対応する、サンプル蛍光プロフィール５０の一例を示している。この例において、蛍光プロフィール５０は、可動装置１４のディスプレイで示されている。蛍光プロフィール５０の中心部分は、蛍光を発しているアッセイ混合物５４に対応しており、また、定性的な、蛍光を発しているコントロール混合物５６に対応するプロフィール５０の左側（および／または右側）部分と比較して高い吸光度（ａｕ）を有している。必要に応じて、蛍光イメージングシステム１０は、可動装置１４または付随するコントローラを介して、アッセイ混合物およびコントロール混合物の吸光度の間の差を定量する（例えばコンパレータで）ように構成されており、これによって、蛍光を発しているアッセイ混合物から抗原の存在またはその欠如を検出し、必要に応じて、抗原の量または濃度を決定する。
例えば、可動装置１４（またはコントローラ）は、１つまたは複数の静的または動的な閾値を有するコンパレータを含み、コンパレータは、閾値に対するアッセイ混合物（および一例ではコントロール混合物）からの蛍光を分析して、抗原の存在を示す。別の例では、強度（例えば、吸光度、減衰、これらの測定値の勾配、これらの変化率、またはこれらに類するもの）が解読されて、抗原の存在、量、または濃度の１つまたは複数が示される。さらに別の例では、閾値は、アッセイ混合物のように励起照明を受けている他のカートリッジチャンバ１８内のコントロール混合物に基づくものであり、コントロール混合物の蛍光は、アッセイ混合物の蛍光と比較するためのベース閾値として使用される。例えば、蛍光を発しているコントロール混合物５６よりも強い、蛍光を発しているアッセイ混合物５４の蛍光（例えば、コンパレータでの分析を介して）は、一例では、抗原の存在を示している。別の例では、アッセイ混合物の蛍光は、特定の一定値または関数ベースの値によって修正されたコントロール混合物の蛍光よりも強い場合、抗原の存在を示す。変化率または勾配としての、時間に対するアッセイ混合物のプロットされた蛍光（単独のまたはコントロール混合物と比較した）が必要に応じて解読されて、抗原の量または濃度が決定される（例えば、ルックアップテーブル、数学的関数、またはそれに類するものでの比較による）。
可動装置１４は、蛍光イメージングシステム１０を制御するまたは作動させる、例えば、励起照明を制御する、サンプルカートリッジ１６の設置（例えば、励起方向および観察方向で設置されている、完全に設置されている、整列している、もしくはそれと同様）をチェックする、抗原の濃度を同定、定量、もしくは決定するために蛍光を分析する、またはそれと同様のことを行うように構成されたコントローラ（例えば、プロセッサ、プログラムされたロジックコントローラ、回路、機械判読可能なメディア、ソフトウェアモジュール、またはこれらに類するもの）を必要に応じて提供する。別の例では、蛍光イメージングシステム１０の制御は、プロセッサ、プログラムされたロジックコントローラ、回路、機械判読可能なメディア、ソフトウェアモジュール、またはこれらに類するものなどの、搭載されたまたはリモートのコントローラ（例えば、ワイアレスまたは有線の）で行われ、コントローラは、励起源２０、光学センサー４２、またはそれに類するものなどの、システム１０の特徴と相互接続している。コントローラは、サンプルで生成され光学センサー４２で検出される蛍光などのサンプルの分析を必要に応じて行って、抗原の存在、その量、濃度、またはそれに類するものの１つまたは複数を決定する。
図５６～図５８Ｂは、蛍光イメージングシステム１０の一例を示している。システム１０の例示的な設計の詳細が、本明細書において提供されている。システムは、およそ０．０４～０．０８の間の集光開口数（ＮＡ）を有し、一例では、およそ０．０６のＮＡ、およそ１０×１０ｍｍ～２０×２０ｍｍ、また一例ではおよそ１５×１５ｍｍの視野（ＦＯＶ）を有し、また、最大ＦＯＶでおよそ１５～２５ｍＷの間、また一例では２０ｍＷの出力の、レーザベースの斜めの照明での蛍光励起を採用する。
例えば、サンプルカートリッジ１６、付随するカートリッジチャンバ１８、またはサンプル自体の、サンプルの特徴としては、例えばカートリッジチャンバ１８のおよそ４０μｌのサンプルウェル体積（すなわち、およそ４０ｍｍ３の体積、または１辺がおよそ３．３ｍｍの立方体；実際には、体積は、異なる縦横比を有し得る）が含まれる。カートリッジチャンバ１８に保持されるサンプル混合物は、限定はしないが、水性バッファー中のおよそ４００ｎＭの濃度のクエンチャー結合型フルオロフォア（例えば、限定はしないが、フルオレセインタイプを含む）を含み、前記バッファー中で、クエンチャーは、生化学的アッセイの一部としての蛍光体から遊離している（蛍光体への結合が切断されている）。結合が切断される前は、クエンチングは不完全であり、通常のおよそ２パーセントの、有効フルオロフォア量子収量（ＱＹ）である。
蛍光イメージングシステム１０は、限定はしないが、視野（ＦＯＶ）、開口部数（ＮＡ）、集光効率（ＣＥ）、励起照明強度、励起照明の均一性、またはこれらに類するものを含む、１つまたは複数のシステム特徴を含む。一例では、システム１０は、およそ１５ｍｍ直径の、１辺が１５×１５ｍｍの、またはそれと同様の、比較的大きなＦＯＶを含む。ＦＯＶは、サンプルカートリッジ１６のカートリッジチャンバ１８などの、複数のサンプルウェルおよびコントロールウェルのイメージングを容易にする。
蛍光イメージングシステム１０のシステム特徴は、携帯電話カメラなどの取り付けられている可動装置の１つまたは複数の特徴を必要に応じて含む。一例では、取り付けられている携帯電話カメラは、非テレセントリックであり、かなり広い視野のレンズを含み、最大およそ３０度（半角）の主光線角度（ＣＲＡ）を有する。
別の例では、可動装置を含むかまたは可動装置（例えば可動装置１４）と使用するように構成されたシステム１０は、開口数（ＮＡ）、およびその結果得られる、蛍光イメージングの集光効率（ＣＥ）を含む。より高いＮＡは、通常、より高い集光効率に、または励起照明によってサンプルで生じた蛍光などの観察された光を検出する能力に対応する。一部の例では、焦点が外れている光が、深い（例えば、上記のように２～３ｍｍの）サンプルウェル（カートリッジチャンバ１８）内のフォーカルプレーンから出ているため、ＮＡが高いほど、集光された光が、ピントが合っているサンプルウェルイメージの境界を越えて、より多く漏出してくる。漏出は、近くにあるカートリッジチャンバの蛍光との間で不明瞭または混同を生じさせ得る。漏出は、ウェルの中間点に集めることによって必要に応じて最少化され、被写界深度（ＤＯＦ）がそれに対応して減少する。一部の例では、ＮＡが高まったことに起因するＣＥの増大と、ＮＡが高まった結果生じる被写界深度（ＤＯＦ）の低下との間のトレードオフが存在し得、その結果、焦点が外れているウェルの光が隣接したウェルのイメージに漏出する。一部の例では、漏出は、カートリッジチャンバ間の間隔を広げることで最小化される。
励起強度は、蛍光イメージングシステム１０のシステム特徴の別の例である。一例では、シグナル－ノイズ比（ＳＮＲ）は、集められた光子の数の平方根におよそ従って向上する（シグナルはＣＥに比例し、一方、ショットノイズは√ＣＥに比例するため）。蛍光体からの光子の抽出を最大にすることが有利である。比較的高い励起強度はしたがって、集光効率（ＣＥ）をより高め、一部の例では、生化学的蛍光アッセイに使用される典型的な分子（例えばＦＩＴＣ）の小さな励起断面積（およそ１Å２）、光退色の前の典型的な最大蛍光光子発光（生物学的／生化学的アッセイにおける典型的なフルオロフォアでおよそ１０５～１０７の発光）、および、今回の場合ではおよそ３０分間にもなる総照明時間の３０秒前後の総アッセイ時間を考慮すると、有用である。励起源２０は、一例では、最大およそ０．１～１０Ｗ／ｍｍ２の強度で照明を発し、この範囲の下の方の部分は、退色がさらに容易なフルオロフォアとの使用に対応している。一例では、励起源２０は、サンプルでおよそ２０ｍＷ、およそ０．２ｍＷ／ｍｍ２を生じさせるＤＴＲレーザ５５ｍＷブルー（シャープ株式会社のレーザダイオードＧＨ０４８５０Ｂ２Ｇを使用、最大５５ｍＷでおよそ４９０ｎｍの出力）ダイレクトダイオードレーザに基づくレーザ照明システムを含む。
本明細書において先に論じたように、可動装置１４の設定は、システム特徴の一例である。一例では、蛍光イメージングシステム１０の設定は、４００ ＩＳＯのカメラゲイン（ＩＳＯ）の設定および２０００ミリ秒の露出時間を有する、可動装置１４の光学センサー４２を含む。
サンプルウェルの長軸に平行な入射角を伴う、励起源２０を有する斜めのレーザ照明の使用が、図５８Ａ、図５８Ｂに示されている。励起照明がカートリッジチャンバのプロフィール（例えば、チャンバ壁、チャンバの長さ、またはそれに類するもの）と方向が同じであるため、斜めの照明は、カートリッジチャンバ１８内の影を最小にする。加えて、斜めの照明は、光学センサー４２でのバックグラウンド散乱光の発生を最小にする。逆に、図５８Ａ、図５８Ｂにおいて概略的な散乱光３３で示されているように、鏡面反映で、散乱光は光学センサー４２に当たらない。
励起源２０としてのレーザジェネレータを伴う他の例では、高価な励起フィルターは必要に応じて回避され、それは、レーザ発光の波長が狭く、蛍光発光波長とのオーバーラップが最小であるためである。加えて、レーザビームは非常に指向性であるため、レーザビームを、例えば、光をサンプルカートリッジ１６の斜めの照明に向けるための１つまたは複数のミラーを有するシステム筐体１２内の、システム１０の内部に、容易に向けることができる。さらに、励起源としてのレーザジェネレータは、他の例では、照明の均一性を提供する。例えば、レーザビームは、おおよそのガウシアン強度プロフィールを有する。蛍光イメージングシステム１０において、励起源２０のレーザビームは、必要に応じて、サンプルウェル（カートリッジチャンバ１８）の周辺を超えて広がり（例えば、およそ１０度の発散半角で）、その結果、おおよそのガウシアンプロフィールの中心部分がウェルに投射されて、ウェルおよびその中のサンプルの照明の増強を促進する。
必要に応じて、広がったレーザビームは、開口部口２６を有する開口部２４などの開口部でさらに調節される。一例では、レーザビームを広げてサンプル（例えばカートリッジチャンバ１８）での照明の均一性を増大させることで、各段に広い視野を照明することができる。より広い視野の照明は、光学センサー４２への照明の散乱を増大させ得る。拡大したレーザビームからの散乱を最小にするために、開口部２４がビーム経路内に提供され、ガウシアンビームのプロフィールを中心部分にトランケートする。その結果生じた、サンプルカートリッジ１６での照明は、こうして、外部からの照明散乱を伴わずにガウシアンの中心部分から提供される均一な照明を伴って、カートリッジチャンバ１８に対応する所望の視野に広がる。
別の例では、開口部２４を使用することで、照明力と照明の均一性とのトレードオフが存在し得る。必要に応じて、システム１０の別の例では、サンプルでのフラットトップなレーザビームプロフィールを増強させるために、設計された（潜在的に回折性の）拡散器が含まれる。
フィルターおよびフィルターの位置は、蛍光イメージングシステム１０のシステム特徴の他の例である。上記で論じたように、一例では、システム１０は、必要に応じて、励起源２０に取り付けられる励起フィルターを含まない。他の例では、図５８Ａに示すように、励起フィルター２２が提供される。別の選択肢では、励起照明としての斜めのレーザ照明および光学センサー４２から外れている外部からの照明の散乱を理由として、ダイクロイックまたは２色性のフィルターはシステム１０に含まれない。システム１００は、図５９Ａ、図６０に示すように、２色性ミラー１２２（フィルターの別の例）を含む。さらに別の例では、発光フィルター３０などの発光フィルターは、可動装置１４（例えば、可動装置の光学センサー４２）とシステム１０のイメージング光学系２８との間に挟まれている。図５８Ａに示すように、発光フィルターは、可動装置の光学系４０と開口部２３またはイメージング光学系２８の１つまたは複数（例えば、ＴＲＨ１２７－０２０－Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓなどのｆ＝２０ｍｍの小型のトリプレットレンズ）との間に挟まれている。この位置で、任意の所与のサンプル点からの（光）線の束またはクラスタはほぼ平行であるが、光線束の入射角は視野全体で大きく変化し（０度から最大およそ３０度まで）、例えば、照射野の位置が高まると増大する。これは、視野の端に向かって、性能（フィルター透過のブルーシフトを含む）のある程度の低下を生じさせ得る。システム１０の別の例では、フィルター位置は、この問題を避けるまたは最小にするために調整される。
蛍光イメージングシステム１０の１つの検査用設定が、特定のシステム特徴に基づいて、本明細書において記載されている。およそ１５μｌのカートリッジチャンバ１８のイメージングについて、隣接したカートリッジチャンバ１８のイメージのオーバーラップを伴うことなく大きな焦点深度をもたらす適度な開口数（ＮＡ）で、極めて広い視野（ＦＯＶ）が特定されている。蛍光イメージングシステム１０は、これらの特定された特徴を含み、また、１バリエーションでは（モバイル接続機能、処理能力、および感度の高いカラーカメラを提供する）可動装置１４などの取り付けられたコントローラを含む、費用対効果の高い小型装置である。システム１０のイメージング光学系２８（図５８Ａを参照されたい）は、一例では、焦点深度をもたらすｆ＝２０ｍｍの小型のトリプレットレンズ（ＴＲＨ１２７－０２０－Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を含む。例示的なシステム１０は、イメージング光学系２８と可動装置の光学系４０との間に挟まれたＣｈｒｏｍａ ５３５／４０フィルターなどの発光フィルター３０を含む。この配置によって、小型のイメージングシステム１０が提供される。本明細書において論じられるように、斜めのレーザ照明は１つの例示的な励起源２０であり、光の、サンプルへの指向、サンプルでの妥当な強度、ならびに、可動装置の光学センサー４２などの光学センサーによって集光されない（光学センサーに「当たらない」）（ビームの指向性および斜めの入射に起因する）サンプルからの鏡面反映を促進し、これによって、バックグラウンド散乱を最小にする。
図５９Ａ、図５９Ｂに示されている蛍光イメージングシステム１００は、およそ０．０９の集光開口数（ＮＡ）、およそ１２ｍｍ直径の視野（ＦＯＶ）、および最大ＦＯＶでおよそ２２５ｍＷの出力での落射照明蛍光の励起を有する、別の例示的なシステムである。サンプル、例えば、アッセイ混合物、コントロール混合物、液体、またはこれらに類するものの１つまたは複数は、サンプルカートリッジ１０４内に入れられる。サンプルカートリッジは、一例では、１つまたは複数のカートリッジチャンバ１０６（キャピラリー、通路、溝、チャネル、またはこれらに類するもの）を含み、当該チャンバは、その中にサンプル（例えば、アッセイ混合物、コントロール混合物、またはそれに類するもの）を保持し、流体用通路２００（図６０で示されている）などのポートを介して満たされる。本明細書において記載されるように、カートリッジチャンバ１０６およびその中のサンプルは、システム１００で照明される。チャンバ１０６内のサンプルから生じた光（蛍光）の比較によって、限定はしないが抗原の存在を含む１つまたは複数の特徴の検出が可能となる。
一例では、サンプルの特徴（例えば、カートリッジチャンバ、その中のサンプル、またはそれに類するものの特徴）としては、およそ１５μｌのサンプルウェル体積（すなわち、≧１５ｍｍ３の体積、またはおよそ２．５ｍｍの辺を有する立方体、しかし実際には、体積は、異なる縦横比を有し得る）が含まれる。１つの例示的なサンプルは、水性バッファー中のおよそ１００ｎＭ濃度のクエンチャー結合型フルオロフォア（限定はしないが、フルオレセインタイプを含む）を含み、前記バッファー中で、クエンチャーは、生化学的アッセイの一部としての蛍光体から遊離している（蛍光体への結合が切断されている）。結合が切断される前は、クエンチングは不完全であり、通常のおよそ１パーセントの有効フルオロフォア量子収量（ＱＹ）である。
図５９Ａに示す蛍光イメージングシステム１００は、（例えば、構成要素、構成要素の相互関係、またはそれに類するものを介して）抗原の存在などの、サンプルにおける１つまたは複数の特徴の検出を容易にする様々なシステム特徴をもたらすように構成されている。システム特徴としては、一例では、カートリッジチャンバ１０６などの複数のサンプルウェルおよびコントロールウェルの照明およびイメージングを容易にするための、視野、例えば、およそ１２ｍｍ直径、およそ１０ｍｍ～２０ｍｍの間の直径、またはそれと同様のＦＯＶが含まれる。
別の例では、蛍光イメージングシステム１００は、サンプル（例えば、カートリッジチャンバ１０６内のサンプル）から発散されたシグナル光子の集光効率（ＣＥ）を増強させる、別のシステム特徴である開口数（ＮＡ）を含む。システムのための例示的なＮＡとしては、限定はしないが、０．０７５～０．１０、０．０９、またはそれと同様のものが含まれる。
一例では、焦点が外れている光が、本明細書において記載される例えば２～３ｍｍ（２．５ｍｍ）の深さを有するサンプルウェル内のフォーカルプレーンから反射しているため、ＮＡが高い（例えば、０．０７５を超える、０．０９を超える、またはそれと同様の）ほど、集光された光が、ピントが合っている、カートリッジチャンバ（またはチャンバ）１０６などのサンプルウェルのイメージの境界を越えて、より多く漏出してくる。光の漏出は、１つのウェルの中間点（カートリッジチャンバ１０６）での集光、複数のウェルの複数の中間点（複数のカートリッジチャンバまたはそれに類するもの）での集光を含む、システムの１つまたは複数の特徴で最少化される。
したがって、一部の例では、ＮＡが高くなったことに起因するＣＥの増大と、ＮＡが高くなった結果生じる被写界深度（ＤＯＦ）の低下との間のトレードオフ、および、隣接するウェル、カートリッジチャンバ１０６、またはそれに類するもののイメージへの、焦点が外れているウェル光の潜在的な関連する漏出が存在し得る。別の例では、漏出を解消する（最少化する）ために、カートリッジチャンバ１０６の間の間隔が広げられる。
図５９Ａの蛍光イメージングシステム１００は、１つまたは複数のサンプルを抗原の存在、量、または濃度の１つまたは複数について分析するように構成されている。図５９Ａで示されているシステム１００は、図に示すように、およそ７５ｍｍの光路長（落射照明のＫｏｈｌｅｒ幾何を伴う）を有する、比較的小型の装置である。一例では、光路長は、他のＫｏｈｌｅｒ幾何システムよりも少なくとも１桁小さい。示されているように、励起源１１０は、２色性ミラー１２２に向けられている。励起源１１０としては、限定はしないが、ＬＥＤジェネレータ、レーザジェネレータ、スクランブルレーザジェネレータ、またはそれに類するものが含まれる。必要に応じて、励起源１１０は、励起照明をフィルター処理してサンプルからの蛍光を促進する波長とするように構成された励起フィルターを含む。
図５９Ａの略図は、例示的な光路を破線で示している。図５９Ａは、図６０においてほぼ同様の位置で示されているシステム１００の構成要素の例を含む。図５９Ａは、ＬｂｕＣａｓ１３－ＴｔＣｓｍ６アッセイのための小型でかつ感度の高い蛍光ディテクターである、蛍光イメージングシステム１００の例である。加熱モジュール（Ｉ）（アッセイ混合物およびコントロール混合物を加熱するためのサンプル加熱モジュール１０８）、サンプルカートリッジ（ＩＩ）１０４、対物光学系（ＩＩＩ）１１２、ならびにカメラ（ＩＶ）（光学センサー１１４）がローマ数字で示されている。
図５９Ａでさらに示すように、励起照明は、２色性ミラー１２２から、その中にサンプル（例えば、アッセイ混合物、コントロール混合物、またはそれに類するもの）を有する１つまたは複数のカートリッジチャンバ１０６を有するサンプルカートリッジ１０４に向け直される。励起照明の散乱は、２色性ミラー１２２で、光学センサー１１４に当たらない向きにされて、光学センサー１１４で検出される蛍光の不明瞭さが最小となる。
励起照明は、対物光学系１１２を介して向けられ、カートリッジチャンバ１０６およびその中のサンプルに伝搬される。一例では、対物光学系１１２（例えば、１つまたは複数のレンズ、複合レンズ、またはそれに類するもの）は、（照明を集光するのではなく）励起照明をカートリッジチャンバ１０６にテレセントリックに伝搬する。カートリッジチャンバは、励起照明と方向が同じである（例えば励起方向である）。
図５９Ａおよび図６１における光学的軌跡で示されているように、励起照明は、カートリッジチャンバ１０６および付随するサンプルのかなりの部分（例えば、全ての部分、実質的に大部分、またはそれと同様）を照明する。図６１に示すように、クラスタの各々の中心光線は、カートリッジチャンバ１０６に対応する照明プロフィール３０２全体にわたり分布した位置で生じる。加えて、中心光線は、照明プロフィール３０２（およびカートリッジチャンバ１０６）に対して横方向（例えば垂直）である。逆に、照明（図６１における中心光線など）は、チャンバ壁１０７と方向が同じであり（例えば、平行である、整列している、またはそれと同様）、これによって、チャンバ１０６内のサンプルを、例えば、対物光学系１１２に近いサンプル表面から、チャンバウェル１０９などのチャンバ１０６の低部までを、均一に照明する（図５９Ａを参照されたい）。テレセントリックな均一の照明（例えば、穴の底を目標としたフラッシュライトのような）は、遮蔽、影、またはそれに類するものによって生じる励起照明の中断を最小にする。照明は、サンプルの大部分（サンプル全体、サンプルのかなりの部分、またはそれと同様のものを含む）とそれ相応に相互作用して、特定の抗原が本明細書において記載される試薬と共に存在する場合には、蛍光を引き起こす。
別の例では、サンプルカートリッジ１０４は、システム筐体１０２の対応するカートリッジソケットによって受けられて、カートリッジチャンバを励起照明に対して相補的な位置に置く、例えば、カートリッジチャンバを励起照明と整列させる励起方向にする。例えば、システム筐体１０２は、サンプルカートリッジ１０４のカートリッジプロフィールに相補的なソケットプロフィールを有するカートリッジソケットを含み、ソケットとカートリッジとの間の結び付きによって、サンプルカートリッジが励起方向にされる（例えば、図５６に示すカートリッジソケット１０およびサンプルカートリッジ１６と同様の様式で）。図５９Ａに示すように、カートリッジチャンバ１０６での照明の光学的軌跡（水平な破線）は、チャンバ壁１０７と方向が同じであり（例えば、整列している、平行である、またはそれと同様）、照明はチャンバ１０６のかなりの部分に伝搬されて、その中のサンプルを適宜照明する。別の例では、例えばチャンバを励起照明内に置くために、サンプルカートリッジ１０４を励起方向にすることで、カートリッジチャンバ１０６は示されているような方向にされ、また、カートリッジチャンバはテレセントリックな均一の照明と整列する（例えば、チャンバ１０６、チャンバ壁１０７を、照明と整列している、照明に平行である、またはそれと同様の向きにする）。
本明細書において記載されるように、カートリッジチャンバ１０６におけるサンプルの照明は、１つまたは複数の試薬、抗原、またはそれに類するものと相互作用して、蛍光照明（蛍光）を生じさせる。蛍光照明は、図５９Ａにおいて、サンプルカートリッジ１０４から延びて光学センサー１１４に向かう、戻ってくる光学的軌跡で示されている。対物光学系１１２は、蛍光照明を、２色性ミラー１２２を介して光学センサー１１４に向かって透過させる。
一例では、システム１００と結び付けられた、例えば、システム筐体１０２を介して提供されたカートリッジソケットに結びつけられた、サンプルカートリッジ１０４は、カートリッジ１０４、付随するカートリッジチャンバ１０６（例えば、チャンバ壁１０７もしくはそれに類するもの）、その中のサンプル、またはそこから生じる蛍光を、光学センサー１１４、対物光学系１１２、イメージング光学系１１６、またはこれらに類するものの１つまたは複数と同じ方向にする。例えば、カートリッジ１０４、カートリッジチャンバ１０６、またはその中のサンプルの方向は、観察方向にされ、また一例では、カートリッジソケットのソケットプロフィールに相補的なカートリッジプロフィールを有するサンプルカートリッジ１０４が受けると、サンプルカートリッジおよびそのサンプルは観察方向に向けられる（図５６のカートリッジソケット１０およびサンプルカートリッジ１６と同様）。システム１００の、サンプルカートリッジ１０４および付随するカートリッジチャンバ１０６と、光学センサー１１４および付随する光学系との観察方向は、サンプルで生じた蛍光を光学センサー１１４に向けることを容易にする。一例では、観察方向は、カートリッジチャンバ１０６および付随するサンプルからの蛍光の、発光フィルター１２０へのテレセントリックな方向付けを容易にする（例えば、イメージング光学系１１６と光学センサー１１４との間に挟まれた発光フィルター１２０を有する図５９Ａに示すように）。
一例では、発光フィルター１２０は、対物光学系１１２と光学センサー１１４との間に挟まれている。発光フィルターは、抗原の検出、および必要に応じてサンプル中の抗原の量または濃度の決定のために、蛍光からの入射散乱光をフィルター処理し、蛍光を光学センサー１１４に優先的に通過させる。図５６Ａに示すように、発光フィルター１２０は、必要に応じて、イメージング光学系１１６と２色性ミラー１２２との間、またはイメージング光学系１１６と光学センサー１１４との間に置かれる。一例では、イメージング光学系１１６は、蛍光を光学センサー１１４にテレセントリックに伝搬する。図６１における光学的レイアウト３００の観察プロフィール３０４で示されているように、光線クラスタの中心光線は、観察プロフィール３０４に対して横方向であり（例えば、垂直である、または０度に近い画角を有する）、したがって、光学系１１６と光学センサー１１４との間に挟まれている場合、発光フィルター１２０に対して横方向である。発光フィルター１２０は、一部の例では、収束する蛍光照明が角度を有するまたはそれと同様であることと比較して、テレセントリックな蛍光を均一にフィルター処理する。例えば、視野（ＦＯＶ）内の１つまたは複数の位置の発光フィルター１２０の性能は一貫しており、イメージング光学系１１６からのテレセントリックな蛍光と同様である。テレセントリックなイメージング光学系１１６は、発光フィルター１２０でＦＯＶ全体での性能の一貫性（同一性を含む）を増強させ、ＦＯＶ内の１つまたは複数の位置での不特定の色へのシフト（ブルーシフトなど）を最小にする。逆に、テレセントリックなイメージング光学系１１６および発光フィルター１２０は協働して、光学センサー１１４での観察および分析のための一貫した蛍光出力を提供する。
図５９Ａ、５９Ｂ、および６０に示される例示システム１００において、テレセントリック性は、０度に近い対物視野角および画像視野角での結像など、光学系の物体側および画像側の両方に提供される（２重テレセントリック）。２重テレセントリックシステムは、サンプルウェル（サンプル、サンプルを含むカートリッジチャンバ１０６など）間のクロストークと、集光された光が焦点の合ったサンプルウェル画像の境界を越える漏出を最小限に抑える。図６１に提供される光学レイアウト３００に示されるように、蛍光イメージングシステム１００は、照明プロファイル３０２（物体）および観察プロファイル３０４（画像）のそれぞれにおいて２重にテレセントリックである。
別の例では、光学センサー１１４のようなシステム１００ディテクターは、比較的高い量子効率（ＱＥ）（システム特性の別の例）を含み、低い読み出しノイズおよび暗電流でシグナル収集を最大化し、ノイズを最小化する。しかし、試験されたサンプルの一例では、完全にクエンチされない蛍光からの有意なバックグラウンドフィルターによるノイズが発生する。例えば、主な理論上のノイズ制限は、バックグラウンド蛍光の光子ショットノイズによるものであり、画像露光中の暗電流の読み出しノイズおよびショットノイズよりも優位である可能性がある。例えば、光学センサー１１４の例（例えば、Ｔｈｏｒｌａｂｓ社のＣＳ１６５ＭＵ１のようなカメラ）では、ピクセルの全ウェル容量（ＦＷＣ）は約１１，０００個の光電子（ｅ－）であり、読み取りノイズは４ｅ－二乗平均平方根（ｒｍｓ）未満である。収集されたシグナルの大部分が、完全にクエンチされていない蛍光体からのバックグラウンド光であると仮定すると、ショットノイズは約√１１，０００、もしくは約１００ｅ－≫４ｅ－読み取りノイズであるか、または読み取りノイズよりも大幅に大きくなる。したがって、システム１００の少なくとも１つの例において、より低い読み取りノイズおよび暗フィルターは、他の低バックグラウンド蛍光測定よりも低い優先度を有する。場合によっては、読み取りノイズおよび暗フィルターのこの比較的低い優先度は、本明細書で説明される例示的な蛍光イメージングシステム１００のような、ポイントオブケア診断での配備に適したより安価なカメラの使用を容易にする。
励起強度は、蛍光イメージングシステム１００のシステム特性の別の例である。一例において、シグナル対雑音比（ＳＮＲ）は、大まかには収集された光子の数の平方根として改善される（シグナルはＣＥに比例するため、ショットノイズは√ＣＥに比例する）。そのような例では、蛍光体から全ての光子を抽出することが有利な場合があり得る。生化学的蛍光アッセイに使用される典型的な分子（例えば、ＦＩＴＣ）の小さい（約１Å２）励起断面積、光退色前の典型的な最大蛍光光子放出（生物学的／生化学的アッセイでの典型的なフルオロフォアについては約１０５～１０７放出）、および総アッセイ時間（約３０秒の総照明時間、現事例では約３０分にわたって広がっている）を考慮して、システム１００では比較的高い励起強度が使用される。したがって、より簡単に光退色されるフルオロフォアの使用に対応して、約０．１～１０Ｗ／ｍｍ２程度以下の強度で、サンプル（例えば、アッセイ混合物、コントロール混合物、それらを含むカートリッジチャンバ１０６など）を照射するのが望ましい。例示システム１００において蛍光を誘発するための励起源１１０は、限定されるものではないが、例えばＴｈｏｒｌａｂｓのＭ４７０Ｌ４高出力ＬＥＤに基づくＬＥＤシステムを含む光源であり、約２ｍＷ／ｍｍ２の強度のためにサンプルにおいて約０．２２５Ｗを生成する。
上述のように、励起源１１０は任意に、照明時空間ノイズが比較的低いＬＥＤシステムである（システム特性の別の例）。別の例では、励起源１１０はレーザジェネレータを含む。半導体レーザのようなレーザジェネレータは、約１％のレーザ出力ノイズを有する。加えて、半導体レーザ（および特に安価な多重モードのダイレクトダイオードレーザ）では、出力ビームの空間的変動が大きくなる可能性がある（ガスレーザのポインティング不安定性に幾分類似する）。アッセイの２つ（またはそれ以上）のサンプルウェルおよびコントロールウェル（例えば、カートリッジチャンバ１０６）との間で照度変化の差を引き起こす変動は、アッセイの検出閾値を、照明の不安定性による変化の差よりも十分に大きいシグナルを生成するサンプルに限定する。したがって、安定した照明が望ましく、実施例の蛍光イメージングシステム１００では、レーザジェネレータを使用することもできるが、励起源１１０としてＬＥＤを使用した。一例においては、対応するスクランブル照明を備えたスクランブルレーザジェネレータが機能する。
蛍光イメージングシステム１００の例においては、ＬＥＤシステムからのより安定した（そしてより安価な）照明のために、シグナル対雑音比（ＳＮＲ）が、サンプルフルオロフォアからの潜在的な全光子抽出（例えば、レーザを使用する）から任意にトレードオフされた。別の例において、ＬＥＤシステムは、光退色効果の低減によりデータ分析がより単純になるという、さらなる潜在的利点を提供する。
図５９Ａおよび６０を再度参照すると、約１５μＬの容積を有するサンプルチャンバ（例えば、カートリッジチャンバ１０６）のイメージングは、かなり大きな視野（ＦＯＶ）および適度な開口数（ＮＡ）を含み、隣接するサンプルウェル重なりの画像を伴わない有意な焦点深度を提供する。蛍光イメージングシステム１００は、これらの目的を比較的低コスト且つコンパクトな装置で達成する。本蛍光イメージングシステム１００は、１対の接眼レンズ（例えば、ＥｄｍｕｎｄＯｐｔｉｃｓのＰＮ＃６６－２０８および６６－２１０）を含み、開口数（ＮＡ）０．０９、視野（ＦＯＶ）直径１２．０ｍｍ、および倍率（Ｍ）０．５４の、全ての例示システム特性を備えたシステムをもたらす。Ｔｈｏｒｌａｂｓ社ＣＳ１６５ＭＵ１カメラのような光学センサー１１４のセンサーサイズをＦＯＶに一致させるために、０．５４の倍率が選択される。蛍光イメージングシステム１００では、この「ライトバケツ」用途において（例えば、光学センサー１１４の）ナイキスト限界以上でサンプリングする必要はない。システム１００全体はコンパクトであり、公称トラック長（サンプルからカメラまで、またはサンプルから光学センサー１１４まで）は約７５ｍｍである。
蛍光イメージングシステム１００の一例において、クロマティックフィルター１２０、１２４および２色性ミラー１２２などの蛍光フィルターは、ＣｈｒｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＥＴ４７０／４０ｘ（励起フィルター１２４として）、Ｔ４９５ｌｐｘｒ（２色性ミラー１２２として）、およびＥＴ５３５／７０ｍ（発光フィルター１２０として）を含んでいるが、これらに限定されない。この例示システムでは、励起は例えば９６５ｍＷ、４７０ｎｍＬＥＤシステム（ＴｈｏｒｌａｂｓのＭ４７０Ｌ４など）のような光ジェネレータによって提供され、これは落射照明ケーラージオメトリ（図５９Ａ、図６０に示すようなもの）において、直径１２ｍｍのサンプルＦＯＶの中に約２２５ｍＷを与える。
システム１００の制御、例えばイメージングハードウェアは、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（２０２０ａ）の中に実装され、Ｔｈｏｒｌａｂｓ社のドライバーおよびＳＤＫ（ＴｈｏｒＣａｍ）を使用して光学センサー１１４のカメラ取得を制御し、Ａｒｄｕｉｎｏ Ｂｌｕｅｆｒｕｉｔ Ｆｅａｔｈｅｒボードへのシリアル通信を使用して、励起源１１０を介してＬＥＤ照明を電子的にトリガーする。任意に、システム１００の制御は、コントローラ（例えば、プロセッサ、プログラムされた論理コントローラ、回路、マシン可読媒体、またはシステム１００による実装のためのマシン可読媒体のような命令を含むソフトウェアモジュールなど）によって提供され、これらはシステム１００のシステム筐体１０２に関連付けられるか、またはシステム１００と遠隔接続される（例えば有線または無線接続によって、例えば図５６に示される可動装置１４に）。
蛍光イメージングシステム１００は、蛍光イメージングシステム１００を制御または操作するように構成されたコントローラ（例えば、プロセッサ、プログラムされたロジックコントローラ、マシン可読媒体、ソフトウェアモジュールなど）を任意に含み、例えば、励起照明を制御し、サンプルカートリッジ１０６のインストール（例えば、取り付けられ、完全に取り付けられ、励起方向および観察方向などに整列された）をチェックし、光学センサー１１４で検出された蛍光を分析して、抗原などの濃度を特定、定量、または決定する。別の例では、蛍光イメージングシステム１００の制御は、プロセッサ、プログラムされたロジックコントローラ、回路、マシン可読媒体、ソフトウェアモジュールのような、オンボードまたはリモートのコントローラ（例えば、無線または有線接続）で行われ、当該コントローラは、励起源１１０、光学センサー１１４のようなシステム１００の機能部と相互接続される。コントローラは、サンプルで発生して光学センサー１１４で検出される蛍光のような、サンプルの分析を任意に行って抗原の存在、その量、濃度などの１つまたは複数を決定する。
図６０は、例示的な蛍光イメージングシステム１００における、コンポーネントの例示的配置を示す。幾つかの例において、当該配置はケーラー落射照明ジオメトリと呼ばれる。この例では、対物光学系１１２は左レンズ対、例えば焦点距離２１ｍｍのエドモンドＲＫＥ接眼レンズなような、１つまたは複数のコンポーネントレンズを含む。さらに示すように、結像光学系１１６（例えば、チューブレンズ、結像レンズなど）は、１つまたは複数のコンポーネントレンズを含む。例えば、図６０に示される結像光学系１１６には、焦点距離１２ｍｍのＲＫＥ接眼レンズのようなマルチコンポーネントレンズセットが含まれている。例示システム１００の光学センサー１１４は、Ｔｈｏｒｌａｂｓ社のＣＳ１６５ＭＵ１カメラである。クロマテクノロジーズ社（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＥＴ５３５／７０ｍ放出フィルターのような放出フィルター１２０は、光学センサー１１４の前方に配置される。例えば、放出フィルター１２０は、結像光学系１１６と２色性ミラー１２２の間にある。別の例では、放出フィルター１２０は、結像光学系１１６と光学センサー１１４の間にある（例えば、本明細書で説明するテレセントリックセットアップから利益を得るために）。２色性ミラー１２２（例えば、図６０の対角要素）はフィルターの別の例であり、１０．２×１９．２ｍｍのクロマテクノロジーズ（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社のＴ４９５ｌｐｘｒ２色性フィルターを含んでいる。本明細書に記載のコンポーネントは、システム１００のコンポーネントの一例である。他の例において、システム１００のコンポーネントには、異なる光ジェネレータ１００、発光フィルター１２０、励起フィルター１２４、ミラーまたはフィルター１２２、光学センサー１１４、光学系１１２、１１６などが含まれ、これらは、本明細書で議論される１つまたは複数の抗原およびそれらの等価物の存在を評価および検出するように構成される。
図６１は、アッセイ混合物およびコントロール混合物を有するサンプルカートリッジ１０４のようなサンプルと、光学センサー１１４との間のレイアウトを示す蛍光イメージングシステム１００のための例示的光学レイアウト３００（例えば、ＺＥＭＡＸモデリングプログラムで生成される）である。図６１に示されるように、光学レイアウト３００は、サンプルカートリッジ１０４に近接する照明プロファイル３０２と、光学センサー１１４に近接する観察プロファイル３０４とを含む。例示レイアウト３００においては、（図５９Ａに示されるように）光学トラックの全長は約７５ｍｍである。収集側の開口数（ＮＡ）は約０．０９、合計倍率は約－０．５３である。一例において、システム１００は半径２ｍｍの円形であるシステム絞り（中心の瞳孔）を提供する。図６１に示されるコンポーネントは、図５９Ａおよび図６０に同様に示されている。光線クラスタおよび各光線クラスタの中心光線でさらに示されるように、図６１において、蛍光イメージングシステム１００は２重テレセントリックであり、例えば、中心光線は無限遠に延び（集束されない）、それぞれの照明および観察プロファイル３０２、３０４に対して横方向であり、約０度の視野角を有するなどである。本明細書で説明するように、テレセントリック性は、カートリッジチャンバ１０６のようなサンプルの照明、発光フィルター１２０による蛍光のフィルタリング、および光学センサー１１４における蛍光シグナルの画像化を向上させる。
図６２Ａ、Ｂは、本明細書に記載の蛍光イメージングシステム１００の感度の予測例を示している。外部で検証されたＢＥＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ（ＢＥＩリソースリポジトリ）サンプルを使用して感度を評価した。２５ｃｐ／μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含む（アッセイ混合物用）またはＲＮＡを含まない（コントロール混合物例用）ＬｂｕＣａｓ１３反応を、サンプルカートリッジ１０４のそれぞれのカートリッジチャンバ１０６にロードした。カートリッジチャンバ１０６を、蛍光シグナルについて１時間モニタリングした。
図６２Ａ、６２Ｂに示すように、時間に対する蛍光シグナルの勾配は、３０分（図６２Ａ）または１時間（図６２Ｂ、勾配が１０－３の単位であることに注意）の期間のシグナルに対して線形回帰を実行することにより、９５パーセント信頼区間まで計算された。両方の期間について、陽性反応の勾配（図６２Ａのサンプル１および図６２Ｂの２５ｃｐ／μＬ、ＲＮＡサンプルあり）は、コントロール（ＲＮＰのみ、ＲＮＡサンプルなし）の勾配よりも、有意に且つ検出可能に大きかった。したがって図６２Ａ、６２Ｂに示すように、２５コピー／μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含むか、またはＲＮＡを含まない例示ＬｂｕＣａｓ１３反応を３０分または１時間実行し、提示された対応する勾配は、システム１００の実現可能性および操作性を示す対応の勾配を示した。２５ｃｐ／μＬの両方の繰り返しの勾配は、対応する時点での対応するリボ核タンパク質のみ（ＲＮＰ）の勾配よりも有意に高い（分離＞不確実性）ことに留意されたい。図６２Ａ～６２Ｂに示されるプロットは、蛍光プロファイルの追加の例である。
蛍光イメージングシステム１００（または本明細書に記載の１０）は、可動装置または付随するコントローラを介して、アッセイ混合物とコントロール混合物の吸光度の差を定量し（例えば、コンパレータを用いて）、それによって蛍光アッセイ混合物から抗原の存在、またはその欠如を検出し、任意には抗原の量または濃度を決定するように構成される。
例えば、コントローラは、１つまたは複数の静的または動的閾値を有するコンパレータを含み、このコンパレータは、アッセイ混合物（および一例では、コントロール混合物）からの蛍光を閾値と比較して分析し、抗原の存在を示す。別の例では、蛍光（例えば、吸光度、減衰、図６２Ａ～６２Ｂに示されるものと同様の測定値の勾配、それらの変化率など）は、１つまたは複数の抗原の存在、量または濃度を示すと解釈される。さらに別の例では、比較のための閾値は、アッセイ混合物のように、励起照明を受ける他のカートリッジチャンバ１０６内のコントロール混合物に基づいており、それらの蛍光は、アッセイ混合物の蛍光と比較するための基本閾値として使用される。例えば、蛍光アッセイ混合物の蛍光（図６２Ａ、Ｂの吸光度および吸光度勾配で示す）は、蛍光コントロール混合物よりも大きく、したがって抗原の存在を示す。別の例では、アッセイ混合物の蛍光は、指定された定数または関数ベースの値により変更されたコントロール混合物の蛍光よりも大きい場合に抗原の存在を示す。別の例において、変化率または勾配としての時間に対するアッセイ混合物のプロットされた蛍光（単独またはコントロール混合物に対して）は、抗原の量または濃度を決定するために解釈される（例えば、ルックアップテーブルまたは数学的関数などとの比較により）。
図１１は、本明細書で説明する技術（例えば、方法論）のうちの任意の１つまたは複数を実行できる、マシンの一例７００のブロック図を示す。代替の実装では、マシン７００はスタンドアロン装置として動作してもよく、または他のマシンに接続（例えば、ネットワーク化）されてもよい。例えば、マシン７００は本明細書に記載のコントローラの一例であり、蛍光イメージングシステム１０、１００などのうちの１つまたは複数と共に使用される。
ネットワーク展開において、マシン７００は、サーバークライアントネットワーク環境において、サーバーマシン、クライアントマシン、またはその両方の能力で動作することができる。一例において、マシン７００は、ピアツーピア（Ｐ２Ｐ）（または他の分散型）ネットワーク環境でのピアマシンとして機能できる。マシン７００は、通信ネットワークデバイス、クラウドサービス、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）、タブレットＰＣ、携帯情報端末（ＰＤＡ）、携帯電話、スマートフォン、もしくは当該マシンにより実行されるアクションを指定する命令（シーケンシャルまたはその他）を実行できる任意のマシンであるか、またはそれらの一部であり得る。マシン７００の幾つかのコンポーネント（例えば、処理回路７０２）は、可動装置１１００（図１１）からの要素を含み得る。
幾つかの態様において、機械７００は、本明細書で論じた方法の一部を実施するように構成することができる。さらに、単一のマシンのみが示されているが、「マシン」の用語は、クラウドコンピューティング、サービスとしてのソフトウェア（ＳａａＳ）、その他のコンピュータークラスター構成のような、本明細書で述べる方法論のいずれか１つまたは複数を実行するための命令セット（または複数のセット）を、個別にまたは共同で実行するマシンの任意の集合を含むと解釈されるべきものである。
本明細書で説明する例は、ロジックまたは多数のコンポーネント、モジュール、または機構を含み得るか、またはそれらの上で動作し得る。モジュールは、特定の操作を実行できる有体物（ハードウェアなど）であり、特定の方法で構成または配置できる。一例において、回路は、モジュールとして指定された方法で（例えば、内部的に、または他の回路などの外部エンティティに対して）配置され得る。一例において、１つまたは複数のコンピュータシステム（例えば、スタンドアロン、クライアントまたはサーバコンピュータシステム）の全体または一部、または１つもしくは複数のハードウェアプロセッサは、指定された操作を実行するために動作するモジュールとしてのファームウェアまたはソフトウェア（例えば、命令、アプリケーション部分、またはアプリケーション）によって構成できる。一例において、当該ソフトウェアは機械可読媒体に常駐することができる。一例において、当該ソフトウェアは、モジュールの基礎となるハードウェアにより実行されたときに、指定された操作をハードウェアに実行させる。
したがって、「モジュール」または「エンジン」の用語は、指定された方法で動作するか、またはここに記載する動作の一部または全てを実行するように物理的に構築され、特別に構成され（例えば、配線された）、または一時的に（例えば、短時間だけ）構成された（例えば、プログラムされた）有体物を包含するものと理解される。モジュールが一時的に構成されている例を考えると、各モジュールは、任意の時点でインスタンス化される必要はない。例えば、モジュールがソフトウェアを使用して構成された汎用ハードウェアプロセッサを含む場合、この汎用ハードウェアプロセッサは、異なる時点でそれぞれの異なるモジュールとして構成され得る。したがって、ソフトウェアは、例えばある時点ではモジュールを構成し、別の時点では別のモジュールを構成するように、ハードウェアプロセッサを構成することができる。モジュールまたはエンジンは、その動作を実行するように構成された処理回路を使用して実装することができる。
マシン（例えば、コンピュータシステム）７００は、ハードウェア処理回路７０２（例えば、中央処理装置（ＣＰＵ）、グラフィック処理装置（ＧＰＵ）、ハードウェアプロセッサコア、またはそれらの任意の組み合わせ）、メインメモリ７０４およびスタティックメモリ７０６を含み、それらの一部または全部は互いにインターリンク（例えば、バス）７０８を介して通信することができる。回路はさらに、共鳴周波数測定値を取得するために、ドップラーレーザ干渉計装置または上記の他の装置を含むことができる。
マシン７００は、ディスプレイユニット７１０、英数字入力デバイス７１２（例えば、キーボード）、およびユーザインターフェイス（ＵＩ）ナビゲーションデバイス７１４（例えば、マウス）をさらに含むことができる。一例において、ディスプレイユニット７１０、入力デバイス７１２、およびＵＩナビゲーションデバイス７１４は、タッチスクリーンディスプレイであってよい。ディスプレイユニット７１０は、図１～１１に関して上述したように、アッセイの結果を示すように構成することができる。表示ユニット７１０は、光、警告記号などを含む視覚的インジケータを使用して、感染が検出されたかどうかを示すことができる。表示ユニット７１０は、発光ダイオード（ＬＥＤ）のようなインジケータ回路を備えることができる。マシン７００は、記憶装置（例えばドライブユニット）７１６、シグナル発生装置７１８（例えばスピーカ）、ネットワークインターフェイス装置７２０、および全地球測位システム（ＧＰＳ）センサー、コンパス、加速度計、または本明細書で前述した別のセンサー（例えば、診断センサーおよびデバイス）のような１つまたは複数のセンサー７２１をさらに含むことができる。ＧＰＳは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染が検出された場合などに、生物監視を支援するために使用できる。マシン７００は、１つまたは複数の周辺機器（プリンタ、カードリーダー等）と通信し、またはこれを制御するために、シリアル（例えば、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ））、パラレル、または他の有線または無線（例えば、赤外線（ＩＲ）、近距離無線通信（ＮＦＣ）等）接続のような、出力コントローラ７２８を含むことができる。
記憶装置７１６は機械可読媒体７２２を含むことができ、そこには本明細書に記載の技術または機能のいずれか１つまたは複数を具現化または利用するデータ構造または命令７２４（例えば、ソフトウェア）の１つまたは複数のセットが記憶される。例えば、この機能には感染、特にＣＯＶＩＤ－１９感染が存在するかどうかを評価し、クラウドやエッジコンピューティング装置のような別の場所に結果を送る（例えば送信など）機能を含めることができる。命令７２４はまた、マシン７００によるその実行中に、メインメモリ７０４内、スタティックメモリ７０６内、またはハードウェア処理回路７０２内に、完全にまたは少なくとも部分的に常駐することができる。一例では、ハードウェア処理回路７０２、メインメモリ７０４、スタティックメモリ７０６、または記憶装置７１６の１つまたは任意の組み合わせは、機械可読媒体を構成することができる。
機械可読媒体７２２は単一の媒体として示されているが、「機械可読媒体」の用語は、１つまたは複数の命令７２４を格納するように構成された単一の媒体または複数の媒体（例えば、集中型または分散型データベース、および／または付随するキャッシュおよびサーバ）を含むことができる。
「機械可読媒体」の用語は、マシン７００による実行のために命令を格納、符号化、または運ぶことができ、本開示の技法のうちの任意の１つまたは複数をマシン７００に実行させ、またはそのような命令によって使用される、または関連するデータ構造を格納、エンコード、または運ぶことができる任意の媒体を含み得る。非限定的な機械可読媒体の例には、ソリッドステートメモリ、ならびに光学および磁気媒体が含まれ得る。機械可読媒体の特定の例には、半導体メモリデバイス（例えば、電気的にプログラム可能な読み取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）、電気的に消去可能でプログラム可能な読み取り専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ））およびフラッシュメモリデバイスなどの不揮発性メモリ、内蔵ハードディスクやリムーバブルディスクなどの磁気ディスク、光磁気ディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、ソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）、ＣＤ－ＲＯＭおよびＤＶＤ－ＲＯＭディスクが含まれ得る。幾つかの例において、機械可読媒体は非一時的なコンピュータ可読媒体を含み得る。幾つかの例において、機械可読媒体は、一時的な伝播シグナルではない機械可読媒体を含み得る。
命令７２４はさらに、ネットワークインターフェイスデバイス７２０を介して伝送媒体を使用することにより、通信ネットワーク７２６上で送信または受信されてもよい。マシン７００は、多数の転送プロトコル（例えば、フレームリレー、インターネットプロトコル（ＩＰ）、伝送制御プロトコル（ＴＣＰ）、ユーザデータグラムプロトコル（ＵＤＰ）、ハイパーテキスト転送プロトコル（ＨＴＴＰ）等）のうちの任意の一つを利用する、一つまたは複数の他のマシンを用いて通信してもよい。例示的な通信ネットワークには、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、パケットデータネットワーク（例えば、インターネット）、携帯電話ネットワーク（例えば、セルラーネットワーク）、基本電話サービス（ＰＯＴＳ）ネットワーク、無線データネットワーク（例えば、Ｗｉ－Ｆｉ［登録商標］として知られる米国電気電子技術者協会（ＩＥＥＥ）８０２．１１規格ファミリー、ＷｉＭａｘ［登録商標］として知られるＩＥＥＥ８０２．１６規格ファミリー、ＩＥＥＥ８０２．１５．４規格ファミリー、ロングタームエボリューション（ＬＴＥ）規格群、ユニバーサルモバイル遠隔通信システム（ＵＭＴＳ）規格群、ピアツーピア（Ｐ２Ｐ）ネットワーク等）が含まれる。一例では、ネットワークインターフェイスデバイス７２０は、通信ネットワーク７２６に接続するために、１つまたは複数の物理ジャック（例えば、イーサネット（登録商標）、同軸、または電話ジャック）または１つまたは複数のアンテナを含むことができる。一例において、ネットワークインターフェイスデバイス７２０は、無線通信用の複数のアンテナを含む。
上記の詳細な説明には、当該詳細な説明の一部を形成する添付の図面への参照を含まれる。当該図面は、本開示を実施できる特定の実装を、限定ではなく例示として示している。これらの実装は、本明細書では「実施例」とも呼ばれる。そのような例は、図示または説明したものに加えて、要素を含むことができる。しかし、本発明者らは、図示または説明された要素のみが提供される実施例も想定している。さらに、本発明者らは、特定の実施例（またはその１つまたは複数の実装）に関して、または本明細書に示し、または説明した他の実施例（またはその１つまたは複数の実装）に関して、図示または説明した要素（またはその１つまたは複数の実装）の任意の組み合わせまたは順列を使用する実施例も想定している。
本文書で参照される全ての刊行物、特許、および特許文書は、参照により個別に組み込まれたかのように、その全体が参照により本明細書に援用される。本文書と参照により組み込まれた文書との間で使用法が矛盾する場合、組み込まれた参照における使用法は、この文書の使用法を補足するものと見なされるべきものである。和解できない不一致については、この文書での使用法が優先される。
本文書において、用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、特許文書では一般的であるように、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」の他の例または使用法とは無関係に、本開示の実施の要素を導入するときに、１つもしくは複数またはより多くの要素を含めるために使用される。この文書において、「または」の用語は、「ＡまたはＢ」が「ＡであるがＢではない」、「ＢであるがＡではない」、および「ＡおよびＢ」を含むように、特に明記しない限りは非排他的な「または」を意味するために使用される。
添付の特許請求の範囲において、「含む」および「ここで」の用語は、それぞれ「具備する」および「ここにおいて」の用語に対する平易な英語の等価物として使用される。また、以下の特許請求の範囲において、「具備する」、「含む」、および「有する」との用語は、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味するように、制限のないものであることが意図されているので、特許請求の範囲においてそのような用語（例えば、具備する、含む、有する）の後のものは、依然としてその請求項の範囲内にあると見なされる。さらに、以下の特許請求の範囲において、用語「第１」、「第２」、および「第３」などは、単にラベルとして使用されるもので、それらの対象に数値要件を課すことを意図していない。
本開示の実装は、コンピュータ実行可能な命令で実装され得る。コンピュータ実行可能な命令（例えば、ソフトウェアコード）は、１つまたは複数のコンピュータ実行可能なコンポーネントまたはモジュールに編成され得る。本開示の態様は、そのようなコンポーネントまたはモジュールの任意の数および編成で実装され得る。例えば、本開示の実装は、特定のコンピュータ実行可能な命令、または図に示され且つ本明細書で説明される特定のコンポーネントまたはモジュールに限定されない。本開示の他の実装は、本明細書で図示および説明したものよりも多いかまたは少ない機能をもった、異なるコンピュータ実行可能な命令またはコンポーネントを含み得る。
本明細書に記載の方法の例（例えば、動作および機能）は、少なくとも部分的に、マシンまたはコンピュータで実施することができる（例えば、ソフトウェアコードまたは命令として実施される）。幾つかの例は、上記の例で説明した方法を実行するように電子デバイスを構成するために、動作可能な命令でエンコードされたコンピュータ可読媒体または機械可読媒体を含むことができる。そのような方法の実装には、マイクロコード、アセンブリ言語コード、高水準言語コードなど（例えば「ソースコード」）のような、ソフトウェアコードを含めることができる。そのようなソフトウェアコードは、様々な方法を実行するためのコンピュータ可読命令（例えば、「オブジェクト」または「実行可能コード」）を含むことができる。ソフトウェアコードは、コンピュータプログラム製品の複数の部分を形成することができる。本明細書で説明される実装のソフトウェア実装は、コードまたは命令が格納された製品を介して、または通信インターフェイスを介して（例えば、無線で、インターネットを介して、衛星通信を介して等）、データを送信するように通信インターフェイスを動作させる方法を介して提供され得る。
さらに、ソフトウェアコードは、実行中またはそれ以外の時に、１つまたは複数の揮発性または不揮発性のコンピュータ可読記憶媒体に確実に格納することができる。これらのコンピュータ可読記憶媒体は、マシン（例えば、計算装置、電子システムなど）によりアクセス可能な形式で情報を記憶する任意の機構を含むことができ、これはフロッピーディスク、ハードディスク、リムーバブル磁気ディスク、任意の形式の磁気ディスク記憶媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、光磁気ディスク、リムーバブル光ディスク（例えばコンパクトディスクおよびデジタルビデオディスク）、フラッシュメモリデバイス、磁気カセット、メモリカードもしくはスティック（セキュアデジタルカードなど）、ＲＡＭ（ＣＭＯＳ・ＲＡＭなど）、記録可能／記録不可能な媒体（読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）など）、ＥＰＲＯＭＳ、ＥＥＰＲＯＭ、または電子命令を格納するのに適した任意のタイプのメディアのようなものであるが、それらに限定されない。そのようなコンピュータ可読記憶媒体はコンピュータシステムバスに結合され、プロセッサおよびＯＩＳの他の部分によってアクセス可能である。
本開示は様々な形態で具現化することができるが、幾つかの実施形態についての以下の説明は、本開示が本発明の例示と見なされるべきであり、示された特定の実施形態に本発明を限定することを意図しないとの理解に基づいて行われる。見出しは、便宜上のみで提供されており、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。任意の見出しの下に示された実施形態は、任意の他の見出しの下に示された実施形態と組み合わせることができる。
範囲を含む全ての数値指定、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量などは、適切な場合には、０．１または１．０の増分で、例えば（＋）または（－）に変化する近似値である。常に明確に述べられている訳ではないが、全ての数値指定の前に、「約」の用語が付けられることは理解されるべきである。また、常に明確に述べられているわけではないが、本明細書に記載の試薬は単なる例示であり、幾つかの場合には同等物が当該技術分野で入手可能であることも理解されるべきである。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形（冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば「細胞」への言及は複数の細胞を含むものである。
「約」の用語は、例えば、温度、時間、量、濃度、および範囲を含むその他の数値指定の前に使用される場合、（＋）または（－）２０％、１０％、５％、または１％で変化し得る近似を示す。
また、本明細書で使用する場合、「および／または」は、１つまたは複数の関連する列挙された項目の任意および全ての可能な組み合わせ、ならびに選択的に解釈される場合の組み合わせの欠如（「または」）を意味し、包含するものである。
所与の疾患または障害に関して「処置」または「処置すること」の用語には、疾患もしくは障害を阻害すること、例えば、疾患または障害の発症を阻止すること、疾患または障害を緩和すること、例えば、疾患または障害の退行を引き起こすこと、或いは、疾患または障害によって引き起こされる、または結果として生じる状態を緩和すること、例えば、疾患または障害の症状を緩和、予防、または処置することが含まれるが、これらに限定されない。所与の疾患または障害に関する「予防」の用語は、何も生じていないときに疾患発症の開始を予防すること、疾患または疾患の素因となる可能性があるが、まだ疾患または障害を有すると診断されていない対象に疾患または障害が発症するのを予防すること、および／または既に障害または疾患が存在する場合には、さらなる疾患／障害の発症またはさらなる疾患／障害の進行を予防することを意味する。
以下の実施例は、本発明の開発において使用される材料および実験の幾つかを記載するものである。ここに含まれる付録Ａは、追加情報を提供し得るものである。
実施例
実施例１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写産物のＣａｓ１３ａ検出
ＣＲＩＳＰＲ・ＲＮＡガイド（ｃｒＲＮＡ）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について設計および検証された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに対応する２０ｎｔスペーサを使用して、１５個のｃｒＲＮＡが最初に設計された。その後、追加のｃｒＲＮＡが設計され、ｃｒＲＮＡの数は２６になった。各ｃｒＲＮＡには細菌配列に由来するｃｒＲＮＡステムが含まれ、スペーサ配列はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム（逆補体）に由来する。ｃｒＲＮＡ配列については、表１（以下に再掲）を参照されたい。
実施例
実施例１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写産物のＣａｓ１３ａ検出
ＣＲＩＳＰＲ・ＲＮＡガイド（ｃｒＲＮＡ）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について設計および検証された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに対応する２０ｎｔスペーサを使用して、１５個のｃｒＲＮＡが最初に設計された。その後、追加のｃｒＲＮＡが設計され、ｃｒＲＮＡの数は２６になった。各ｃｒＲＮＡには細菌配列に由来するｃｒＲＮＡステムが含まれ、スペーサ配列はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム（逆補体）に由来する。ｃｒＲＮＡ配列については、表１（以下に再掲）を参照されたい。
複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを用いてｃｒＲＮＡを試験した。最初に、ｃｒＲＮＡは、精製されたレプトトリキア・バカリス（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ））のＣａｓ１３ａ（Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）およびＲＮＡレポータクエンチ蛍光を用いた直接検出アッセイで評価された。
簡単に言えば、配列番号２または４の配列を有するｃｒＲＮＡをＴＥ緩衝液、ｐＨ８で２８μＭに希釈し、Ｃａｓ１３ａタンパク質と組み合わせてリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。次いで、Ｃａｓ１３ａタンパク質－ｃｒＲＮＡ複合体混合物を室温で１５分間インキュベートした。７×１０６または７×１０７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｓｓＲＮＡ標的を含む試験サンプルを、ＤＥＰＣ水で１００μＭに調製し、５×バッファー、ＤＥＰＣ水と混合した。凍結乾燥したＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））にＤＥＰＣ水を加えて再懸濁した。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｓｓＲＮＡサンプルをＲＮａｓｅＡｌｅｒｔおよびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体と混合した。Ｃａｓ１３ａタンパク質を含まないコントロールも作製した。ＲＮＡ切断産物の形成は、蛍光光度計でモニタリングした。図１～３を参照されたい。
図４Ａ～４Ｂは、検出された蛍光レベルが、異なる反応混合物中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの量と直接相関することを示している。
実施例２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写産物のＣａｓ１３ａ検出の検証
この実施例は、検出方法およびｃｒＲＮＡガイドＲＮＡがヒト細胞ＲＮＡと交差反応せず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的に検出できることを示している。
実施例２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写産物のＣａｓ１３ａ検出の検証
この実施例は、検出方法およびｃｒＲＮＡガイドＲＮＡがヒト細胞ＲＮＡと交差反応せず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的に検出できることを示している。
Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ複合体およびＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ検出試薬を実施例１に記載のように調製し、７×１０５コピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡまたはヒト肺上皮細胞（Ａ５４９細胞株）由来のＲＮＡと混合した。
図５に示すように、本明細書に記載の方法は、７×１０６コピー未満のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ（すなわち、７×１０５以下のコピー数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ）を検出することができる。さらに、図５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイが、Ａ５４８ヒト肺上皮細胞株由来の上皮ヒト細胞ＲＮＡと交差反応しないことを示している。
図６Ａは、複数のｃｒＲＮＡの使用によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイの感度を改善できることを示している。図示のように、約７×１０５コピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は容易に検出できるが、７×１０２コピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２も検出可能である。
例えば、Ｃａｓ１３タンパク質は、配列番号３６～４８のいずれかの配列を有することができる。
Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼの一例は、以下の配列（配列番号３８；ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０１５７７０００４．１）を有することができる。
Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼの一例は、以下の配列（配列番号３８；ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０１５７７０００４．１）を有することができる。
例えば、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼは、以下の配列（配列番号３９；ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０１２９８５４７７．１）を有することができる。
例えば、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼは、以下の配列（配列番号４８；ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０１３４４３７１０．１）を有することができる。
例えば、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼは、以下の配列（配列番号４０；ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０２２７８５４４３．１）を有することができる。
例えば、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉのＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼは、以下の配列（配列番号４１；ＮＣＢＩ受託番号ＢＢＭ３９９１１．１）を有することができる。
Ｃａｓ１３ａのインビボ活性を高めるために、レプトトリキア・バッカリス（Ｌｂｕ）Ｃａｓ１３ａのランダム突然変異誘発ライブラリーを作製し、このライブラリーを大腸菌における翻訳抑制についてスクリーニングした。抑制を増大することができる上位のバリアントには、３元複合体形成時に大きなコンフォメーション変化を受ける領域に局在する一連の突然変異が含まれていた。単一点突然変異の分析により、Ｅ４３６Ｋ（例えば、配列番号４３）が同定され、これはＬｂｕＣａｓ１３ａの非活性化因子依存性のＨＥＰＮ活性化を劇的に低下させ、その結果、感度をバックグラウンドよりも約１０～１００倍増加させる（図６Ｂ～６Ｄ）。Ｅ４３６Ｋ突然変異を有する改変レプトトリキア・バッカリスＣａｓ１３ａエンドヌクレアーゼは、以下の配列（配列番号４３）を有する。
Ｅ４３６残基は、ヘリックスのヒンジ領域に局在し、触媒残基と水素結合してバイナリコンフォメーションを形成し、それらを不活性状態にロックする可能性がある。Ｅ４３６Ｋ突然変異は、活性化因子の非存在下でヘリックスの動きを制限し、バックグラウンドシグナルを低下させると考えられている。これにより、バックグラウンドよりも低い濃度の活性化因子の検出が可能になる。
他の改変Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載の方法で生成および評価することができる。例えば、精製されたタンパク質は、レポータＲＮＡを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ｃｒＲＮＡによるトランスｓｓＲＮＡ切断率について最初にアッセイされる。このようなレポータＲＮＡは、フルオロフォアクエンチャー標識ｓｓＲＮＡであることができる。レポータＲＮＡの切断は、複雑な活性化のアウトリードとして、またＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの存在の代用として機能する。特に、トランス切断が飽和に達する速度は、Ｃａｓ１３ホモログ間で大きく異なる。トランスレートが低すぎると、特にラベルのないヒトＲＮＡが過剰に存在する状況では、蛍光アウトリードが検出できなくなる。この文脈でトランス切断の速度を体系的に研究するために、Ｃａｓ１３：ｃｒＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体と結合した合成ｓｓＲＮＡ活性化因子を含む事前に組み立てられた３元複合体の能力を、ｔＲＮＡまたは精製されたヒト非標的化ＲＮＡの量の増加の有無にかかわらず、フルオロフォアクエンチャー標識ＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ基質のトランス分解を観察することによって試験する。時間の経過とともにトランス切断の速度がどのように飽和に達するかをモニタリングして、最速の速度で理想的な同族体を特定する。このアッセイで試験される変数には、最適化された速度を達成するための、Ｃａｓ１３：ｃｒＲＮＡ ＲＮＰの濃度およびレポータＲＮＡの濃度が含まれる。
次に、競合ＲＮＡの文脈における活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｓｓＲＮＡのシス切断に対するホモログの感度を分析する。分離されたばかりのアクチベータＲＮＡの文脈において、これらのホモログに対しては幅広い感度（～１０７倍）が存在するが、シス切断率に対する追加の非標的化ＲＮＡの影響は不明である。バックグラウンドＲＮＡは、特に高濃度においては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡへのアクセスを阻害し、Ｃａｓ１３：ｃｒＲＮＡ複合体の活性化および下流のトランス切断を排除する。バックグラウンドＲＮＡがｃｉｓ切断に及ぼす影響を試験するには、ハイスループットスクリーンを使用する。Ｃａｓ１３ホモログについて、相補的蛍光ｓｓＲＮＡアクチベータの希釈液を、ｔＲＮＡまたは精製ヒトｍＲＮＡの量を漸増する状態および漸増しない状態で体系的に添加し、レポータのｃｉｓ切断率を経時的に分析する。得られた各時間経過により、定義された競合ＲＮＡバックグラウンドの文脈で計算されるべき相補的標的感度の見かけの速度が可能になる。
ホモログの特異性はまた、関連のＲＮＡ配列がＣａｓ１３：ｃｒＲＮＡ複合体を異常または非特異的に活性化できないことを確かめるために、バックグラウンド競合ＲＮＡとの関連でも試験される。
異なるＣａｓ１３ホモログは、ｃｒＲＮＡ－標的二本鎖における異なる数のミスマッチを許容する。例えば、レプトトリキア・シャヒイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）由来のＣａｓ１３ａ（ＬｓｈＣａｓ１３ａ）は、ｃｒＲＮＡ標的２重鎖の単一ミスマッチではなく、２重ミスマッチに敏感である。さらに、スペーサ配列内でのこれらのミスマッチの位置が重要である。例えば、ＬｓｈＣａｓ１３ａは、ｃｒＲＮＡ標的２重鎖の中央または「シード領域」における２重ミスマッチには敏感であるが、５’または３’末端においては敏感ではない。最近になって、ＬｂｕＣａｓ１３ａには、ＬｓｈＣａｓ１３ａの観察結果およびＬｂｕＣａｓ１３ａの構造とよく相関するミスマッチ感受性シード領域が存在すること、また活性化因子ＲＮＡ結合を、高等真核生物および原核生物ヌクレオチド結合（ＨＥＰＮ）ヌクレアーゼへと活性化のために効果的に伝達するミスマッチ感受性スイッチ領域を有することが見いだされた。本発明者らは、ＬｂｕＣａｓ１３ａの包括的なミスマッチ感受性プロファイルを作成した。
データは、ホモログのミスマッチ感受性プロファイルが非常に多様であることを示唆している。これを全てのホモログにわたって包括的に試験するために、各ホモログは、既知の相補的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の標的配列に対するミスマッチの体系的バリエーションを有するｃｒＲＮＡで試験される。ここでは、スペーサの中心位置（６～１６位）が注目されるであろう。ｃｒＲＮＡのこの領域での２重、３重、および４重の連続および非連続ミスマッチは、塩基をそれぞれの相補的塩基に突然変異させることによって生成される（例えば、ＡからＵ）。５０ヌクレオチドの相補的標的ＲＮＡもまた、ミスマッチのないｃｒＲＮＡ配列に基づいて合成される。ハイスループットスクリーニングが使用され、スクリーニング混合物は蛍光モニタリングされて、ミスマッチに対する許容度を決定されるであろう。相補的な標的ＲＮＡのみを使用して各ホモログの許容レベルが決定されたら、ｔＲＮＡまたはヒト細胞ＲＮＡの希釈液の存在下でアッセイを繰り返して、他のＲＮＡ配列による複合体の非特異的活性化を試験する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ配列の配列バリエーションを許容するために、標的ＲＮＡに対する塩基対の少数のミスマッチに対してある程度の柔軟性を持ったホモログが許容されるが、我々は、一緒になって競合ＲＮＡによる最も低い異常活性を示すｃｒＲＮＡ配列およびＣａｓ１３ホモログを特定することを目指している。
実施例３：ポイントオブケア試験用に最適化されたＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂアッセイ
現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検査には幾つかの制限がある。１）結果を得るのに長時間を要する。２）ＲＮＡ増幅の使用、これにより検査が複雑になり、結果を得るのに時間がかかる。３）複雑な実験装置を要する。残りの懸念は、体液に存在するＲＮａｓｅが読み取り技術を非特異的に活性化することである。
現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検査には幾つかの制限がある。１）結果を得るのに長時間を要する。２）ＲＮＡ増幅の使用、これにより検査が複雑になり、結果を得るのに時間がかかる。３）複雑な実験装置を要する。残りの懸念は、体液に存在するＲＮａｓｅが読み取り技術を非特異的に活性化することである。
ここでは、病院、検査室、および診療所から離れた遠隔地での使用に適合できる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ検出方法のための高感度の１段階試験が記載される。
Ｃａｓ１３およびｃｒＲＮＡサンプルは、アッセイの電気非依存性を可能にするために凍結乾燥することができる。
Ｃａｓ１３およびｃｒＲＮＡサンプルは、アッセイの電気非依存性を可能にするために凍結乾燥することができる。
簡単に言えば、蛍光色素を含む１つまたは複数のＲＮａｓｅレポータオリゴヌクレオチドを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的Ｃａｓ１３：ｃｒＲＮＡ ＲＮＰの希釈物を含むサンプルおよび含まないサンプルに直接添加する。幾つかの場合には、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の定量を容易にするために、既知の濃度の精製ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の希釈物をコントロールと同じアッセイ方法で試験することができる。追加のコントロールは、感染していないサンプル（感染していない唾液、喀痰、粘液、または鼻咽頭サンプルなど）を含めることができる。
一部のＲＮａｓｅＡ阻害剤はＲＮａｓｅＡを阻害するが、Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂは阻害しないと考えられる。ＲＮａｓｅＡはＨＥＰＮヌクレアーゼではないため、その特異的阻害剤が、Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂのＨＥＰＮヌクレアーゼを阻害する可能性は低い。あるいは、サンプルを加熱してＲＮＡｓｅ活性を除去する。
以前の研究では、他のＲＮＡウイルス（ジカ熱およびデング熱）由来のビリオンをヒト血清にスパイクし、９５℃で１～２分間加熱して、検出のためのウイルスＲＮＡの放出を増加させ得ることが示された。加熱ステップがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの検出を容易にするかどうか、およびバックグラウンドＲＮａｓｅを減少させるかどうかは決定できるが、特定のＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂ活性を減少させるかどいうかは決定できない。他の方法（例えば、機械的または化学的溶解）の追加の試験も実行できる。読み出し蛍光は、ＣｅｌｌＳｃｏｐｅ（米国特許第１０，５７８，８５２号および同第１０，５４２，８８５号を参照のこと。これらは、その全体が本明細書に具体的に組み込まれる）、プレートリーダー、サンプルチャンバリーダー、またはチップリーダー、またはそれらの組み合わせを使用してモニタリングできる。
図１２は、鼻咽頭スワブ（ＲＮａｓｅ阻害剤を含む）を加熱して内因性ＲＮａｓｅを有意に減少させた後の、アッセイからのシグナルを描いたグラフを提供する。図１２のグラフの頂部のプロットは、ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅＡ）が存在する場合に観察されるシグナルを示す。しかし、ＲＮａｓｅ活性が阻害されると（例えば、７９℃または８４℃の熱によって）、サンプル中のＲＮａｓｅに起因したアッセイ混合物中のバックグラウンドシグナルは大幅に減少または排除される。
図１３は、Ｔｗｅｅｎ２０の添加が検出を改善し、バックグラウンド蛍光を増加させることなく、Ｃａｓ１３ａアッセイと適合することをグラフで示している。図１３の頂部のプロットは、標的６ＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１３ａＲＮＰ、および１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むアッセイ混合物からのシグナルを示す。図１３の頂部のプロットの直ぐ下のプロットは、標的６ＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１３ａＲＮＰを含み、Ｔｗｅｅｎ－２０を含まないアッセイ混合物からのシグナルを示す。２つのプロットが図１３の底部に示されており、これらはＴｗｅｅｎ２０を含む場合および含まない場合の、ＲＮＰ単独（標的ＲＮＡなし）からのシグナルを示す。
図１４は、熱（８５℃、５分）および１％Ｔｗｅｅｎ２０の添加が、ＲＮａｓｅ汚染を最小化することをグラフで示す。図１７は、１％Ｔｗｅｅｎ２０および溶解のための熱のみを使用して、Ｃａｓ１３ａがＮＰスワブのバックグラウンドと共にＮＬ６３ウイルスＲＮＡを検出できることをグラフで示す。
実施例４：読み出しクエンチ型蛍光ＲＮＡマーカー／レポータ
蛍光検出を最適化するために、蛍光体とクエンチャーの両方を備えたリボオリゴヌクレオチドを含む新しいレポータＲＮＡを使用できる。レポータＲＮＡの配列は、Ｃａｓ１３切断用に最適化される。Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂホモログに応じて、露出したウリジンまたはアデノシン部位で、ＲＮａｓｅ切断活性を優先的に発揮する。活性の高いホモログに対する２次的な優先性も存在する。本発明者らは、全てのリボヌクレオチドについて５量体ホモポリマーを試験した。これらの優先性に基づき、１０の候補ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、アイオワブラッククエンチャー（ＩＤＴ）およびＦＡＭフルオロフォアを使用して、当該オリゴヌクレオチドの５’および３’末端で標識し、図４～６に示すように、ｓｓＲＮＡ切断アッセイで体系的に試験する。
蛍光検出を最適化するために、蛍光体とクエンチャーの両方を備えたリボオリゴヌクレオチドを含む新しいレポータＲＮＡを使用できる。レポータＲＮＡの配列は、Ｃａｓ１３切断用に最適化される。Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂホモログに応じて、露出したウリジンまたはアデノシン部位で、ＲＮａｓｅ切断活性を優先的に発揮する。活性の高いホモログに対する２次的な優先性も存在する。本発明者らは、全てのリボヌクレオチドについて５量体ホモポリマーを試験した。これらの優先性に基づき、１０の候補ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、アイオワブラッククエンチャー（ＩＤＴ）およびＦＡＭフルオロフォアを使用して、当該オリゴヌクレオチドの５’および３’末端で標識し、図４～６に示すように、ｓｓＲＮＡ切断アッセイで体系的に試験する。
付随するフルオロフォアおよびクエンチャーを有する最良のＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ検出のための可動装置で使用することができる。
一般に、電話機の赤－緑－青（ＲＧＢ）スペクトル窓で発光する任意のフルオロフォアを検出することができ、これには殆どのフルオロフォアが含まれる（遠赤色で発光するものを除く）。ＣｅｌｌＳｃｏｐｅデバイスで使用される逆レンズモジュールの非テレセントリック性および高開口数により、蛍光収集に使用される干渉フィルターの高角度でのバンドパスシフトを考慮して、長いストークスシフトを備えた蛍光体が好ましい。
一般に、電話機の赤－緑－青（ＲＧＢ）スペクトル窓で発光する任意のフルオロフォアを検出することができ、これには殆どのフルオロフォアが含まれる（遠赤色で発光するものを除く）。ＣｅｌｌＳｃｏｐｅデバイスで使用される逆レンズモジュールの非テレセントリック性および高開口数により、蛍光収集に使用される干渉フィルターの高角度でのバンドパスシフトを考慮して、長いストークスシフトを備えた蛍光体が好ましい。
市販のクエンチャーと組み合わせることができる長いストークスシフトを有する幾つかのフルオロフォアが同定された。異なる濃度のＡｌｅｘａ４３０（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）およびＳＴＡＲ５２０（Ａｂｂｅｒｉｏｒ）を、ＣｅｌｌＳｃｏｐｅを使用してキャピラリーにロードされた２０μＬのサンプル容量で試験した。予備的な検出下限は、Ａｌｅｘａ４３０では約２．５ｎＭ、ＳＴＡＲ５２０では約１ｎＭあると決定された（図７）。長いストークスシフトを有する他の潜在的なフルオロフォアは、ブリリアントバイオレット（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ）ファミリーシリーズ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）である。
幾つかの場合には、ブリリアントバイオレット５１０、ブリリアントバイオレット６０５、および／またはブリリアントバイオレット６１０を使用することができる。それらの量子収率は当該シリーズの他のものよりも高かった。全体として、ＲＮＡオリゴヌクレオチドベースのレポータで使用できる５つの可能な蛍光体と、２つの可能なクエンチャーが同定された。
図１９は、ＦＡＭフルオロフォアのｐＨ選好性に向けてｐＨを調節すると、検出が改善されることを示している。
実施例５：試験前のＲＮＡの増幅
この実施例では、例えば、バクテリオファージ由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるＱβレプリカーゼ（例えば、シャーら（Ｓｈａｈ ｅｔ．ａｌ）（１９９４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３２（１１）：２７１８を参照のこと）またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いた、試験前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの増幅を記載する。
実施例５：試験前のＲＮＡの増幅
この実施例では、例えば、バクテリオファージ由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるＱβレプリカーゼ（例えば、シャーら（Ｓｈａｈ ｅｔ．ａｌ）（１９９４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３２（１１）：２７１８を参照のこと）またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いた、試験前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの増幅を記載する。
本発明者らは、原核細胞および真核細胞から最小ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡポリメラーゼ複合体（Ｎｓｐ１２、Ｎｓｐ７およびＮｓｐ８）を単離している。この最小ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡポリメラーゼ複合体は、ウイルスＲＮＡを増幅し、超高感度Ｃａｓ１３ａアッセイの感度を高めることができる。したがって、そのような最小ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡポリメラーゼ複合体は、本明細書に記載の方法、組成物、および装置に含めることができる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡは、ヌクレオチド（ＮＴＰ）と共に、ＱβレプリカーゼまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ポリメラーゼを含むかまたは含まずに、反応緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および１ｍＭのＥＤＴＡ）中でのインキュベーションによりサンプル中で増幅することができる。増幅されたＲＮＡはフェノールを使用して精製し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｃａｓ１３アッセイに加えることができる。幾つかの例では、「クリーンアップなし」と指定されており、増幅された混合物をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｃａｓ１３アッセイに直接加えることができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｃａｓ１３アッセイでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－ＲＮＡの濃度を測定する前に、増幅産物のクリーンアップが必要ない場合がある。
幾つかの場合に、増幅されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｃａｓ１３アッセイにおいて改善された感度を提供することができる。
実施例６：サンプルＲＮＡ抽出
アッセイの使用を容易にするために、スワブ採取とスワブ材料への侵入との間の最小工程を採用することができる。２室システムのうち１室にスワブを直接挿入するシステムを使用することができる。
実施例６：サンプルＲＮＡ抽出
アッセイの使用を容易にするために、スワブ採取とスワブ材料への侵入との間の最小工程を採用することができる。２室システムのうち１室にスワブを直接挿入するシステムを使用することができる。
チャンバ１は、ウイルス粒子の溶解およびゲノム物質の放出を促進する緩衝液を含むことができる。溶解バッファーのオプションには、ＰＢＳ、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＬＴ＋バッファーまたはクイックエクストラクト（Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ）、ＤＮＡ／ＲＮＡシールド（Ｓｈｉｅｌｄ）などの市販の溶解バッファー、およびトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ－１００、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、ＮＰ－４０、またはオレス（Ｏｌｅｔｈ）－８などの様々な濃度の界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
撹拌およびその後のスワブ取り出しに続いて、チャンバを短時間（５分）加熱（５５℃または９５℃）し、溶解をさらに促進することができる。次に、２つのチャンバ間の分割を解除または除去し、鼻抽出バッファーを２番目のチャンバに流入させて再構成する。このチャンバには、Ｃａｓ１３アッセイ用の凍結乾燥試薬（Ｃａｓ１３ＲＮＰおよびレポータ分子）が含まれている。
図１５は、従来のＲＮＡ抽出と比較したとき、低レベルのＮＬ６３のＲＮＡが１段階溶解で効率的に検出されることを示し、また図１８は、従来のＲＮＡ抽出と比較した場合に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡが１段階溶解で効率的に検出されることをグラフで示す。
実施例７：異なるｃｒＲＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対してより高い感度を示す
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを検出するための幾つかのｃｒＲＮＡが、他のｃｒＲＮＡよりも良好なシグナルを提供することを示している。
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを検出するための幾つかのｃｒＲＮＡが、他のｃｒＲＮＡよりも良好なシグナルを提供することを示している。
Ｃａｓ１３ａタンパク質およびｃｒＲＮＡ１～９、１３、１４を含むアッセイ混合物、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含む１５．Ａ５４９ＲＮＡ、およびＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔを添加した。反応混合物を１２０分間インキュベートし、蛍光を経時的にモニタリングした。反応は、殆どのｃｒＲＮＡについて３０～４５分以内にほぼ完了した。
図８は、試験されたｃｒＲＮＡのバックグラウンド補正蛍光を示す。図示のように、ｃｒＲＮＡ２、３、４、７、８、９、および１４は、有用なバックグラウンド補正された蛍光レベルを示した。ただし、ｃｒＲＮＡ１、１３、および１５の有用なバックグラウンド補正蛍光レベルは最適ではなかった。
図２０は、ガイド２＋４＋２１が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全長ウイルスの確実な検出を可能にすることをグラフで示している。図２１は、３０ヌクレオチド（ｃｒＲＮＡ＿２）から３２ヌクレオチド（ｃｒＲＮＡ＿２ＸＬ）へのステム長の延長が、検出に影響を及ぼさないことを示している。図２２は、ＮＬ６３またはＯＣ４３を効率的に検出する複数のｃｒＲＮＡの同定をグラフで示している。さらに、ガイドの組み合わせにより、（陽性患者サンプルの特異性および信頼性のある検出を維持しながら）アッセイの感度が向上／ブーストされる。
実施例８：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出の感度
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出方法で得ることができる感度、およびその方法が患者のＣｏｖｉｄ－１９感染を検出するのに有効であることを示す。
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出方法で得ることができる感度、およびその方法が患者のＣｏｖｉｄ－１９感染を検出するのに有効であることを示す。
Ｃａｓ１３ａタンパク質および選択されたｃｒＲＮＡを含むアッセイ混合物を調製する。ｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ１３ａ混合物をインキュベートした後、被検ＲＮＡ（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ）をＲＮａｓｅＡｌｅｒｔディテクターに加える。この混合物をインキュベートする。
図９Ａ～９Ｄは、Ｃａｓ１３ａのＫｃａｔに基づく異なるＣａｓ１３ａおよびＲＮＡアラート濃度における活性の速度のシミュレーションを示す（約２０μＭの基質でＫｃａｔ５００／秒、イースト－セレツキーら（Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．６６：３７３－３８３（２０１７））。本発明者らは、Ｃａｓ１３ｂ（約２０μＭ基質でＫｃａｔ９８７／秒、スレイメイカーら（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２６（１３）：３７４１－３７５１（２０１９））速度がこれらの速度の２倍になると計算した。
本明細書に記載の方法を用いて評価するために、Ｃｏｖｉｄ－１９感染患者から陽性が確認された３つの鼻咽頭サンプルを得た。これらの鼻咽頭サンプルがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡに対して陽性であることを確認するために、ＣＤＣＮ１およびＮ２プライマーを使用して定量的ＰＣＲを実行した（ウェブページｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／Ｌｉｓｔ－ｏｆ－Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ－Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ－Ｐｒｉｍｅｒｓ－Ｐｒｏｂｅｓ．ｐｄｆを参照のこと）。平均Ｃｔ（サイクル閾値）を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコピー数／ｍＬを取得した。
本明細書に記載の方法を用いて、これら陽性が確認された鼻咽頭サンプルを評価するために、各アッセイ混合物は、鼻咽頭スワブからの抽出物ｃｒＲＮＡ、ｃａｓ１３ａ、およびＲＮａｓｅＡｌｅｒｔを含んでいた。陰性が確認されたサンプルも、反応混合物のバックグラウンドレベルを示すために、コントロールとして評価した。バックグラウンド減算は、バッファーを伴ったＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ基質の読み取り値を差し引くことにより実行された。
図９Ｅ～９Ｆは、実際のＣｏｖｉｄ－１９患者サンプルの試験結果を示している。図９Ｅは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを３人の感染患者からの鼻咽頭スワブ（陽性スワブ１～３）で検出するときの、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａＲＮＰアッセイの経時変化を、非感染患者（陰性スワブ＃１）に対して行われた同じアッセイと比較して示す。図９Ｆは、３人の感染患者（陽性スワブ１～３）からのサンプルのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａＲＮＰアッセイについての３０分後のエンドポイントとしての蛍光を、感染していない患者（陰性スワブ＃１）に対して、ならびにサンプルを含まないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ、ｃｒＲＮＡ、およびＲＮＡ－Ａｌｅｒｔ試薬を含むアッセイ混合物（ＲＮＰのみ）に対して実施された同じアッセイと比較してグラフで示す。
以下の表は、本明細書に記載のＣａｓ１３－ｃｒＲＮＡ法および定量的ＰＣＲにより、３人の感染患者（陽性スワブ１～３）について検出されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡのコピー数を示す。定量的ＰＣＲによって検出されたコピー数は、２番目および３番目の列（平均Ｃｔおよびコピー数／ｍＬ）に示されるのに対して、本明細書に記載されているＣａｓ１３－ｃｒＲＮＡ法によって検出されたコピー数は４番目および５番目の列（反応液２０μＬ中のコピー数と、１μＬ当りのコピー数）に示されている。
実施例９：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出のための液滴ベースのアッセイ
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出の感度を向上させることができる液滴ベースのＣａｓ１３アッセイを説明する。
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出の感度を向上させることができる液滴ベースのＣａｓ１３アッセイを説明する。
切断されたフルオロフォアはバルクサンプル中で拡散するのではなく、平均して１つ（または幾つか少数）のＣａｓ１３分子を含む液滴で、油－水エマルジョンが形成され得る。液滴内のＣａｓ１３がウイルスＲＮＡに結合した場合（液滴形成前の定義されたインキュベーション時間の後）、それは液滴内の全てのＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔを切断し、暗い液滴の海に対して明るい液滴を形成する。
蛍光イメージングは、定義された反応時間（時系列ではなく）の後に使用することができ、サンプル中に存在するウイルスＲＮＡの数を決定するために明るい液滴の数を単純に数えることができる。これは液滴ＰＣＲに似ているが、Ｃａｓ１３関連アッセイの診断感度を高めるのに役立つ。
実施例１０：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用の可動装置
一例において、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡを検出および／または定量するためのシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ａおよび携帯電話によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の直接検出）は、第１の周波数のシグナルを使用してサンプルを励起するためのシグナル生成システム、サンプル内の蛍光を検出するためのカメラシステム、当該蛍光に基づいてサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを検出するための処理回路を含んでいる。カメラシステムは、可動装置（例えば、顕微鏡（例えば、「セルスコープ（Ｃｅｌｌｓｃｏｐｅ）」）を含むことができる携帯電話など）内に含めることができる。システムは、通信インターフェイスを含むことができ、処理回路は、通信インターフェイスを介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡがサンプル中で検出されたかどうかの表示を提供するように構成される。カメラシステムは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサーを含むことができ、ＣＭＯＳセンサーは少なくとも１つのカラーフィルタを含むことができる。カラーフィルタは、パターン内の交互のピクセルを覆って配置される。
一例において、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡを検出および／または定量するためのシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ａおよび携帯電話によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の直接検出）は、第１の周波数のシグナルを使用してサンプルを励起するためのシグナル生成システム、サンプル内の蛍光を検出するためのカメラシステム、当該蛍光に基づいてサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを検出するための処理回路を含んでいる。カメラシステムは、可動装置（例えば、顕微鏡（例えば、「セルスコープ（Ｃｅｌｌｓｃｏｐｅ）」）を含むことができる携帯電話など）内に含めることができる。システムは、通信インターフェイスを含むことができ、処理回路は、通信インターフェイスを介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡがサンプル中で検出されたかどうかの表示を提供するように構成される。カメラシステムは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサーを含むことができ、ＣＭＯＳセンサーは少なくとも１つのカラーフィルタを含むことができる。カラーフィルタは、パターン内の交互のピクセルを覆って配置される。
本開示の様々な実装において、コンポーネントまたはモジュールを作成する方法は、ソフトウェア、ハードウェア、またはそれらの組み合わせで実装することができる。例えば、本開示の様々な実装によって提供される方法は、例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ、Ｐｙｔｈｏｎなど、およびそれらの組み合わせのような標準のプログラミング言語を使用することによって、ソフトウェアで実装することができる。本明細書で使用される「ソフトウェア」および「ファームウェア」の用語は互換可能であり、コンピュータによる実行のためにメモリに格納された任意のコンピュータプログラムを含む。
通信インターフェイスには、メモリバスインターフェイス、プロセッサバスインターフェイス、インターネット接続、ディスクコントローラなどのような、別のデバイスと通信するための有線、無線、光などの媒体のいずれかにインターフェイスする任意のメカニズムが含まれる。通信インターフェイスは、構成パラメータを提供すること、および／またはシグナルを送信して、通信インターフェイスがソフトウェアコンテンツを記述するデータシグナルを提供するように準備することによって構成することができる。通信インターフェイスは、当該通信インターフェイスに送信される１つまたは複数のコマンドまたはシグナルを介してアクセスできる。
本開示は、本明細書における動作を実行するためのシステムにも関する。このシステムは、必要な目的のために特別に構築されるか、コンピュータに格納されたコンピュータプログラムによって選択的に起動または再構成される汎用コンピュータで構成される。本明細書に示され、説明される開示の実装における操作の実行または遂行の順序は、別段の指定がない限り必須ではない。すなわち、操作は、別段の指定がない限り、任意の順序で遂行されてよく、本開示の実装は、本明細書に開示されたものよりも追加または少ない操作を含んでもよい。例えば、別の操作の前、それと同時、またはその後に特定の操作を実行または遂行することは、本開示の実装の範囲内であることが意図されている。
実施例１１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイの改善
切断プローブと未切断プローブのサイズに基づく分離によるバックグラウンド減算
ＲＮａｓｅ酵素活性は、一般に蛍光ＲＮａｓｅプローブによって検出され、これは、一方の末端のフルオロフォアを他方の末端のクエンチャーから分離するＲＮＡの切断時に蛍光シグナルを発する。これら蛍光プローブの感度は、バックグラウンド蛍光の原因となる未切断状態での不完全な蛍光クエンチによって制限される可能性がある。本明細書において提供されるのは、蛍光、即ちプローブの切断部分（シグナル）を、未切断の構築物（バックグラウンド）から物理的に分離する方法であり、これによってバックグラウンドが大幅に低減されたシグナルのモニタリングが可能になり、感度が向上する。このシステムは、半透膜またはゲルによって分離された２つのリザーバと、新しい蛍光ＲＮａｓｅプローブで構成される。その蛍光ドメインは、分離膜またはゲルを通過できるクエンチャードメインと比較して十分に小さい。小さな蛍光ドメインのサイズと、プローブの大きなクエンチャードメインとの間の膜透過性閾値を選択することにより、未切断の蛍光プローブ（バックグラウンドを生成する）が、リザーバ、即ち、その中に切断された蛍光ドメインが拡散してシグナルがモニタリングされる場所に入るのを防ぐことができる。
切断プローブと未切断プローブのサイズに基づく分離によるバックグラウンド減算
ＲＮａｓｅ酵素活性は、一般に蛍光ＲＮａｓｅプローブによって検出され、これは、一方の末端のフルオロフォアを他方の末端のクエンチャーから分離するＲＮＡの切断時に蛍光シグナルを発する。これら蛍光プローブの感度は、バックグラウンド蛍光の原因となる未切断状態での不完全な蛍光クエンチによって制限される可能性がある。本明細書において提供されるのは、蛍光、即ちプローブの切断部分（シグナル）を、未切断の構築物（バックグラウンド）から物理的に分離する方法であり、これによってバックグラウンドが大幅に低減されたシグナルのモニタリングが可能になり、感度が向上する。このシステムは、半透膜またはゲルによって分離された２つのリザーバと、新しい蛍光ＲＮａｓｅプローブで構成される。その蛍光ドメインは、分離膜またはゲルを通過できるクエンチャードメインと比較して十分に小さい。小さな蛍光ドメインのサイズと、プローブの大きなクエンチャードメインとの間の膜透過性閾値を選択することにより、未切断の蛍光プローブ（バックグラウンドを生成する）が、リザーバ、即ち、その中に切断された蛍光ドメインが拡散してシグナルがモニタリングされる場所に入るのを防ぐことができる。
原理の証明として、ＬｂｕＣａｓ１３ａ－ＲＮａｓｅ酵素を使用し、いずれかの端にＦＡＭフルオロフォアおよびアイオワブラックＦＱ（ＩＢＦＱ）が隣接する８ＫＤａ（１８ヌクレオチド）ＲＮａｓｅプローブを切断した。ＦＡＭの次の短い５Ｕ配列とＩＢＦＱの次の長い１３Ｃ配列が追加された。ＬｂｕＣａｓ１３ａの配列優先性のために、酵素は主にＦＡＭ近くの５Ｕ配列を切断し、それを残りのプローブから解放すると推論された。分子量カットオフ１０ＫＤａの透析膜を使用することにより、未切断のプローブの移動が大幅に減少した小さなＦＡＭ部分の選択的移動が実証された。同じ原則は、さまざまな他のメカニズムで実装できる。たとえば、金ナノ粒子や量子ドットなどの大きなクエンチャーを使用して、ＲＮＡのサイズを大きくすることなく未切断プローブのサイズを大きくすることができる。これにより、ＲＮａｓｅ基質が増加してシグナルが減少する。別の実施では、切断されたプローブと未切断プローブとの能動的分離が電気泳動によって達成され、分離速度および効率を改善することができる。
切断されたプローブのビーズベースでの濃度に伴った反応シグナルの増加
ＲＮａｓｅ酵素活性が非常に低い場合は、蛍光ＲＮａｓｅプローブのシグナルが非常に小さいため、それを検出するために特殊なセンサー（たとえば、ＰＭＴまたはＡＰＤ）が必要となる。分子結合に基づいてプローブをビーズに濃縮することにより、プローブシグナルを増加させる簡単で安価な方法が開発された。ビオチンをＲＮａｓｅプローブに含め、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを使用することにより、ビーズ表面での蛍光シグナルの濃縮が実証された。この濃縮方法は、上記の分離方法と容易に組み合わせることができ、バックグラウンドを低く保ちながら、濃度によってシグナルを選択的に増加させることができる。
ＲＮａｓｅ酵素活性が非常に低い場合は、蛍光ＲＮａｓｅプローブのシグナルが非常に小さいため、それを検出するために特殊なセンサー（たとえば、ＰＭＴまたはＡＰＤ）が必要となる。分子結合に基づいてプローブをビーズに濃縮することにより、プローブシグナルを増加させる簡単で安価な方法が開発された。ビオチンをＲＮａｓｅプローブに含め、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを使用することにより、ビーズ表面での蛍光シグナルの濃縮が実証された。この濃縮方法は、上記の分離方法と容易に組み合わせることができ、バックグラウンドを低く保ちながら、濃度によってシグナルを選択的に増加させることができる。
原理の証明として、ビオチンをＦＡＭの次に添加し、ＲＮａｓｅ酵素反応が起こるリザーバとは別のリザーバにストレプトアビジンビーズを添加した。プローブの切断された部分は、半透膜を自由に通過した後、ビーズ表面に急速に濃縮されることが観察されたが、切断されていない構築物は濃縮されなかった（図２３）。同じ原理をさまざまなメカニズムで実装できる。たとえば、ビオチン－ストレプトアビジンの代わりに、小分子と抗体の間の結合を使用できる。シグナルの選択的濃縮は、分子ケージングのメカニズムによって達成できる。この場合、ケージ結合リガンドはＲＮＡ切断時に露出することができ、基質への結合を可能にする。
多分散液滴を使用した少量の反応シグナルの液滴ベースの濃度
活性ＲＮａｓｅ酵素濃度が低いか、ウイルスなどのＣａｓ１３標的が低濃度で存在する場合、バルク反応におけるＲＮａｓｅレポータシグナルは、酵素反応が低いために非常に遅くなり得る。効果的な酵素濃度を増加させる小さな体積の液滴内に単一の活性酵素を閉じ込めることにより、反応を促進する簡単な方法が創作された。この方法では、１つのバルク反応を多数の小さな反応に分割することで、ウイルスを迅速かつ高感度に検出できる。発明者らは、複雑な機器により生成される均一な液滴形状に依存する従来の液滴ベースの反応ではなく、単純な攪拌により形成される多分散液滴を使用して、ウイルスゲノムを高感度で検出できることを示した。
活性ＲＮａｓｅ酵素濃度が低いか、ウイルスなどのＣａｓ１３標的が低濃度で存在する場合、バルク反応におけるＲＮａｓｅレポータシグナルは、酵素反応が低いために非常に遅くなり得る。効果的な酵素濃度を増加させる小さな体積の液滴内に単一の活性酵素を閉じ込めることにより、反応を促進する簡単な方法が創作された。この方法では、１つのバルク反応を多数の小さな反応に分割することで、ウイルスを迅速かつ高感度に検出できる。発明者らは、複雑な機器により生成される均一な液滴形状に依存する従来の液滴ベースの反応ではなく、単純な攪拌により形成される多分散液滴を使用して、ウイルスゲノムを高感度で検出できることを示した。
原理の証明として、フッ素化油（ＨＦＥ７５００）および２％ＰＥＧベースのフルオロ界面活性剤（００８界面活性剤）を使用して、Ｃａｓ１３反応を油中水滴にカプセル化した。水と油の界面にＰＥＧベースの界面活性剤を含めると、フッ素化油または炭化水素油の液滴内でＣａｓ１３反応が成功するのに役立つが、他の一般的に使用される非イオン性界面活性剤は当該反応を阻害する。また、炭化水素油と比較してフッ素化油の粘度が低いため、単純な攪拌により狭いサイズ分布内での多分散液滴を形成できることも分かった（図２４）。液滴の生成前に０．５％のＩＧＥＰＡＬを水相に含めることにより、小さく不均一なサイズの液滴が生成された。極めて少量のＳＡＲＳ－ＣＯＶ２ゲノムが水性混合物にロードされ、各液滴に０または１コピーのウイルスが含まれるようになった。３７°Ｃで１時間インキュベーションした後、ウイルスを含む液滴は、他のブランクの液滴よりも著しく明るい蛍光シグナルを示した（図２５）。さらに、液滴内の蛍光強度は、液滴サイズに反比例した。この観察結果は、ウイルスを十分に少量の液滴（＜１ｐＬ）にロードすることにより、非常に低レベルのウイルスを迅速かつ高感度に検出できることを示唆している。不均一なサイズ分布を持った液滴に基づいて、サンプルコピー数の計算を可能にする統計モデルも開発された。
実施例１２：Ｃａｓ１３ａによるウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの定量的直接検出
この実施例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの直接検出を定量することと、Ｃａｓ１３ａアッセイの開発に関する実験について説明する。最初に、個々のｃｒＲＮＡまたはガイドを、精製したレプトトリキア・ブッカリス（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ））のＣａｓ１３ａを含むアッセイ混合物で試験した。Ｃａｓ１３：ｃｒＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオキャプシド（Ｎ）遺伝子の異なる２０ヌクレオチド領域を検出するように設計された。これらの幾つかによって検出された、Ｎ遺伝子に沿った位置の例を図４３Ａに示す。最初に、疾病管理予防センター（ＣＤＣ）のＮプライマーセットおよびパンデミックの初期に中国の武漢で開発されたＮプライマーセット（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）の幾つかの位置に対応して、Ｎ遺伝子に沿った１２のガイドが設計された。ＬｂｕＣａｓ１３にはプロトスペーサフランキング部位（ＰＦＳ）優先度がないため（Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、各プライマーセットに対応するｃｒＲＮＡが設計された。
この実施例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの直接検出を定量することと、Ｃａｓ１３ａアッセイの開発に関する実験について説明する。最初に、個々のｃｒＲＮＡまたはガイドを、精製したレプトトリキア・ブッカリス（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ））のＣａｓ１３ａを含むアッセイ混合物で試験した。Ｃａｓ１３：ｃｒＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオキャプシド（Ｎ）遺伝子の異なる２０ヌクレオチド領域を検出するように設計された。これらの幾つかによって検出された、Ｎ遺伝子に沿った位置の例を図４３Ａに示す。最初に、疾病管理予防センター（ＣＤＣ）のＮプライマーセットおよびパンデミックの初期に中国の武漢で開発されたＮプライマーセット（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）の幾つかの位置に対応して、Ｎ遺伝子に沿った１２のガイドが設計された。ＬｂｕＣａｓ１３にはプロトスペーサフランキング部位（ＰＦＳ）優先度がないため（Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、各プライマーセットに対応するｃｒＲＮＡが設計された。
ウイルスＮ遺伝子（ヌクレオチド位置２８２７４～２９５３１）に対応するインビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡを標的／活性化因子として使用して、各ガイドを個別に試験した。４８０ｆＭ（２．８９×１０５コピー／μＬ）の標的／活性化剤濃度で、ＲＮＰコントロールを超えた反応性を有する１０のガイドが特定された。ＲＮＰコントロールは同じ反応混合物（同じＲＮＰ）を有していたが、標的／活性化剤ＲＮＡはなかった（図４３Ｂ）。ＲＮａｓｅを含まないバッファーを使用することは、バックグラウンドの蛍光を最小限に抑え、プレートリーダーのゲインおよびフィルター帯域幅の設定を最適化して、低レベルのレポータ切断を捕捉した。活性化剤として完全長のウイルスＲＮＡを使用した場合にも、同様の結果が得られた。これらの最初の研究では、低レベルの標的非依存性蛍光を維持しながら、蛍光レポータによって決定される最大のＣａｓ１３ａ活性化を生じる２つのガイド（ｃｒＲＮＡ２（配列番号２）およびｃｒＲＮＡ４（配列番号４））が選択された。
ＬｂｕＣａｓ１３ａは、僅か１０ｆＭ（約６０００コピー／μＬ）の相補的活性化剤ＲＮＡの存在下においても、検出可能なレポータ切断を示す（Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙら、２０１７）。一連の希釈したインビトロ転写ウイルスＲＮＡに対して個々のアッセイ試験を使用したときに、ｃｒＲＮＡ２（配列番号２）およびｃｒＲＮＡ４（配列番号４）は、同様の範囲での検出限界でウイルスＲＮＡを検出できた（図４３Ｃ）。図４３Ｃに示される結果を定量するために、各曲線の勾配を経時的に決定した。直接検出アッセイからのシグナルはＣａｓ１３ａのＲＮａｓｅ活性のみに依存するので、それはＣａｓ１３ａについて報告されている速度で、ミカエリス－メンテン酵素動態に従うはずである。低濃度の標的ＲＮＡにおいては、経時的な蛍光変化は線形であり、ウイルスＲＮＡの検出限界を決定できるように、異なる標的ＲＮＡ濃度についての線形回帰による勾配の比較を決定した（図４３Ｄ）。これらのデータは、ｃｒＲＮＡ２およびｃｒＲＮＡ４が、それぞれインビトロで転写されたＮ遺伝子ＲＮＡの少なくとも１０，０００コピー／μＬの検出を容易にすることを確認した。測定された勾配は活性化Ｃａｓ１３ａの濃度に比例したので、活性化Ｃａｓ１３ａは、標的ＲＮＡの濃度でスケーリングできた（図４３Ｅ）。したがって、標的ＲＮＡ濃度は、検出アッセイ中に測定された蛍光生成の勾配から推定でき、それによって未知のサンプル中のウイルス量を直接定量できる。
実施例１３：ガイドＲＮＡを組み合わせるとＣａｓ１３ａの感度が向上する
この実施例は、２つ以上のｃｒＲＮＡの使用によりＣａｓ１３ａ活性化が増強し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの検出感度を改善できることを示している。本発明者らは、ウイルスＲＮＡ上の２つの異なる位置で２つのｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１３ａ酵素ＲＮＰを使用すると、酵素活性が少なくとも２倍になり、感度が向上すると仮定した（図４４Ａ）。さらに、ガイドＲＮＡの組み合わせは、ウイルスゲノムの進化に伴って生じる配列バリエーションに関する懸念を軽減する可能性がある。
この実施例は、２つ以上のｃｒＲＮＡの使用によりＣａｓ１３ａ活性化が増強し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの検出感度を改善できることを示している。本発明者らは、ウイルスＲＮＡ上の２つの異なる位置で２つのｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１３ａ酵素ＲＮＰを使用すると、酵素活性が少なくとも２倍になり、感度が向上すると仮定した（図４４Ａ）。さらに、ガイドＲＮＡの組み合わせは、ウイルスゲノムの進化に伴って生じる配列バリエーションに関する懸念を軽減する可能性がある。
ｃｒＲＮＡ２およびｃｒＲＮＡ４のガイドＲＮＡの組み合わせを試験して、それらが一緒になって、単一のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡサンプル検出を増強できるかどうかを確認した。反応混合物中のＣａｓ１３ａＲＮＰの総濃度は１００ｎＭで均一に保たれ、ｃｒＲＮＡ２およびｃｒＲＮＡ４ガイドＲＮＡの濃度は同等に保たれた（それぞれ５０ｎＭ）。
図４４Ｂに示されるように、ｃｒＲＮＡ２および４を組み合わせると、検出反応の勾配が著しく増加し、従って、一定の活性化因子ＲＮＡ濃度（４８０ｆＭ）で測定したときに反応の感度が増大した。勾配は、２１３ＡＵ／分（ＳＥ±１．６）（ｃｒＲＮＡ２）および１５９ＡＵ／分（ＳＥ±１．７）（ｃｒＲＮＡ±４）から個別に増加し、２つのｃｒＲＮＡを組み合わせて使用したときには３８３ＡＵ／分（ＳＥ±３．０）に増加した。この増加した感度は、ＲＮＰコントロール反応の勾配を増加させることなく得られた（図４４Ｂ）。したがって、２つのｃｒＲＮＡを組み合わせて使用すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを検出する平均勾配（または速度）を２倍にすることができ、それによってＣｏｖｉｄ－１９検査に必要な時間を短縮できる。
組み合わせが検出限界にどのように影響するかを決定するために、組み合わせガイド反応を一連の希釈したＮ遺伝子ＲＮＡで評価した。図４４Ｃに示すように、ｃｒＲＮＡ２およびｃｒＲＮＡ４の組み合わせの使用は、標的ＲＮＡのないｃｒＲＮＡ２およびｃｒＲＮＡ４を含有するＲＮＰのコントロールシグナルと比較した場合に、検出限界をインビトロで転写された標的Ｎ遺伝子ＲＮＡの１０００倍未満にシフトさせた。
ｃｒＲＮＡ２およびｃｒＲＮＡ４のガイドＲＮＡの両方を用いた同じアッセイを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ＶｅｒｏＣＣＬ８１細胞の上清から単離された全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを用いて行った。図４４Ｄに示すように、ガイドの組み合わせの検出限界は、２７０全長ウイルスコピー／μＬであった。標的間での検出限界の違い（インビトロで転写されたＮ遺伝子と完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ）は、標的ＲＮＡに使用される異なる定量技術に起因するか、またはガイドの親和性を低下させ得る（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６）ウイルスＲＮＡについて予測される顕著な二次構造に起因する可能性がある（Ｍａｎｆｒｅｄｏｎｉａ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。
ＣＲＩＳＰＲベースの診断は高度に特異的であることができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するガイドＲＮＡの特異性を確認するために、ヒトサンプルに存在する可能性のある他の呼吸器ウイルスを含むアッセイで評価した。アルファコロナウイルスＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ベータコロナウイルスＨＣｏＶ－ＯＣ４３、および中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）は、ヒト宿主に感染して呼吸器疾患を引き起こすことが知られている７つのコロナウイルスの１つである（Ｆｕｎｇ ａｎｄ Ｌｉｕ，２０１９）。ｃｒＲＮＡガイドがこれらのコロナウイルスと交差反応しないことを確認するために、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３またはＨＣｏＶ－ＯＣ４３にそれぞれ感染したＨｕｈ７．５．１－ＡＣＥ２またはＶｅｒｏＥ６細胞の上清からＲＮＡを抽出した。加えて、インビトロで転写されたＮ遺伝子ＲＮＡが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶから生成された。
図４５Ａに示すように、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３またはＭＥＲＳ－ＣｏＶウイルスＲＮＡのいずれについても、ガイドｃｒＲＮＡ２および４では、ＲＮＰバックグラウンドを超えるシグナルは検出されなかった。同様に、図４５Ｂに示すように、Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡまたはインフルエンザＢウイルスのＲＮＡ、または一次ヒト気道オルガノイドから抽出されたＲＮＡではシグナルが検出されなかった。
以前に公開されたＰＣＲプライマーまたはＣａｓ１２ガイドセット（Ｃｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）（Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）に基づいて、感度および特異性をさらに高めるために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＥ遺伝子の検出のために追加のガイドを試験した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＥ遺伝子上のｃｒＲＮＡ１９～２２によって検出された位置を図４５Ｃ－１に示す。単一濃度の完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡについて試験した場合、ｃｒＲＮＡ２１（配列番号２３）は個別に、ならびにガイドｃｒＲＮＡ２およびｃｒＲＮＡ４と組み合わせて、最もよく機能した（図４５Ｃ－２）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性であることが確認された５つの鼻スワブサンプル由来のＲＮＡで試験した場合、ｃｒＲＮＡの３重の組み合わせ（ＲＮＰ２＋４＋２１）もまた、ＲＮＰコントロール反応を超えるシグナルを示さなかった（図４５Ｃ～３）。
実施例１４：Ｃａｓ１３ａは、患者サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを直接検出する
この実施例は、患者サンプルを用いた検出アッセイの試験結果を示す。
この実施例は、患者サンプルを用いた検出アッセイの試験結果を示す。
ｃｒＲＮＡ２１の添加がＣａｓ１３ａアッセイの検出限界を改善するかどうかを決定するために、ｃｒＲＮＡ２＋４＋２１と、バイオ防御新興感染症研究資源リポジトリ（Ｂｉｏｄｅｆｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）（ＢＥＩリソース）から得た正確に滴定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡとを含む組み合わせ反応を試験した。
２０回の反復反応を用いて２時間にわたり行われた一連の希釈実験において、この３重の組み合わせでは、デジタル液滴（ｄｄ）ＰＣＲを用いたＢＥＩにより独立に決定されたウイルスコピー数に基づいて、僅か３１コピー／μＬしか検出されなかった（図４５Ｄ）。個別反応の勾配の不確実性を分析することにより、９５％信頼区間を適用した場合に、各希釈についての２０の個々の試験の１００％が、この感度で陽性であると正しく同定された（図４５Ｄ）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性の個体から採取した鼻スワブ由来の、５つのＲＮＡサンプルを精製した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性のスワブサンプルを、陽性サンプルと同じ方法で処理した。ＲＴ－ｑＰＣＲ測定を実施したところ、患者サンプルのＣｔ値は１４．３７～２２．１３の範囲であり、３．２×１０５～１．６５×１０３コピー／μＬの範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコピー数と相関していた。
図４５Ｅに示すように、直接検出アッセイは５つの陽性試料を正確に同定し、これらは全て、陰性スワブまたは標的なしのＲＮＰ反応により誘発されたシグナルを有意に上回っていた。
実施例１５：携帯電話のカメラをポータブルアッセイリーダーとして活用する
実験室外でのアッセイの測定を可能にするために、発明者らは、セルスコープ技術（その全体を本明細書で具体的に援用する米国特許第１０，５７８，８５２号および同第１０，５４２，８８５号を参照のこと）に関する専門知識に基づいて、Ｃａｓ１３直接検出アッセイにより放出される蛍光シグナルの検出および定量のための、携帯電話ベースの蛍光顕微鏡を構築し設計した（図４６Ａ）。この装置は、グーグルピクセル４ＸＬ（Ｇｏｏｇｌｅ Ｐｉｘｅｌ ４ＸＬ）フォンの電話カメラ、ｆ＝２０ｍｍ接眼レンズ、および画像収集用の干渉フィルターに基づいていた。当該装置には、４８８ｎｍダイオードレーザ、ガラスコリメーションレンズ、および照明用ミラーとして使用される２つのＮＤ４フィルターも含まれていた。全ての光学部品および照明部品は、光学絶縁用カスタムメイドの黒いアクリルボックスに収納された。当該装置でアッセイ反応を分析するために、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）をアクリル型にキャストすることにより、特注のイメージングサンプルチャンバを作製した。このイメージングチャンバには、４０μＬの反応量で個別に充填できる３つの独立したチャネルが含まれている。自動タイムラプスイメージングは、カスタムアンドロイドアプリケーションと、レーザのトリガーおよび画像取得を制御するブルートゥース（Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ）受信機によって制御される。その後、画像は電話から取得され、カスタムＭａｔｌａｂ（登録商標）コードを使用してオフラインで分析される。
実験室外でのアッセイの測定を可能にするために、発明者らは、セルスコープ技術（その全体を本明細書で具体的に援用する米国特許第１０，５７８，８５２号および同第１０，５４２，８８５号を参照のこと）に関する専門知識に基づいて、Ｃａｓ１３直接検出アッセイにより放出される蛍光シグナルの検出および定量のための、携帯電話ベースの蛍光顕微鏡を構築し設計した（図４６Ａ）。この装置は、グーグルピクセル４ＸＬ（Ｇｏｏｇｌｅ Ｐｉｘｅｌ ４ＸＬ）フォンの電話カメラ、ｆ＝２０ｍｍ接眼レンズ、および画像収集用の干渉フィルターに基づいていた。当該装置には、４８８ｎｍダイオードレーザ、ガラスコリメーションレンズ、および照明用ミラーとして使用される２つのＮＤ４フィルターも含まれていた。全ての光学部品および照明部品は、光学絶縁用カスタムメイドの黒いアクリルボックスに収納された。当該装置でアッセイ反応を分析するために、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）をアクリル型にキャストすることにより、特注のイメージングサンプルチャンバを作製した。このイメージングチャンバには、４０μＬの反応量で個別に充填できる３つの独立したチャネルが含まれている。自動タイムラプスイメージングは、カスタムアンドロイドアプリケーションと、レーザのトリガーおよび画像取得を制御するブルートゥース（Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ）受信機によって制御される。その後、画像は電話から取得され、カスタムＭａｔｌａｂ（登録商標）コードを使用してオフラインで分析される。
携帯電話ベースの検出システムは市販の実験用プレートリーダーよりも感度が低いとの予想に反して、本発明者らは、測定ノイズの減少および多くの時点で収集する能力（これは勾配の不確実性を減少させた）に起因して、当該装置の感度はほぼ一桁高いことを発見した。
３重ガイドＣａｓ１３アッセイによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの検出において、当該装置の性能を、ウイルス感染ＶｅｒｏＥ６細胞の上清から単離されたウイルスＲＮＡの希釈アッセイで評価した（図４６Ｂ～４６Ｄ）。
３重ガイドｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ２（配列番号２）、ｃｒＲＮＡ４（配列番号４）およびｃｒＲＮＡ２１（配列番号２３）ガイドＲＮＡを含んでいた。元のウイルス株の１：１０、１：２５、１：５０、および１：１００の希釈が試験され、これはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ遺伝子の異なる（増加する）コピー数に対応し、ここでのＣｏＶ・ＲＮＡのコピー数はＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された。各希釈の幾つかの反復が当該装置で試験され、それぞれがウイルスＲＮＡを含まない３重ガイド多重化ＲＮＰからなるコントロール反応を伴った。
プレートリーダーと同様に、各反応チャンバで生成された蛍光を経時的に収集し、３０秒ごとに測定したときに、ＲＮＰコントロールと比較して、５００～２００コピー／μＬの全長ウイルス濃度で蛍光が安定して増加することが示された（図４６Ｂ）。各反復は、サンプルチャンバにロードした直後に６０分間撮像され、勾配が計算され、勾配がコントロールチャネルの勾配と比較された。勾配、および各勾配の９５％信頼区間は、単純な線形回帰によるシグナルの線形適合を使用して決定された（図４６Ｃ）。サンプルの勾配がコントロール反応の勾配と９５％信頼区間内で重ならない場合、サンプルは陽性と見なされた。検出限界を決定するために、ＲＴ－ｑＰＣＲにより決定したときに、５００、２００、１００、および５０コピー／μＬに対応するウイルス希釈のそれぞれを測定した。勾配は、アッセイの最初の３０、２０、および１０分間のデータに基づいて計算され、各勾配が、同じ時間にわたって計算されたＲＮＰコントロールの勾配と比較された。各希釈およびアッセイ時間について、ＲＮＰコントロールと比較した標的ＲＮＡを検出するアッセイの能力は、１００％の精度に対応する全てのアッセイ時間につき、１：１０希釈の５つの反復のうち５つの陽性試験を用いて、％精度として定量された（図４６Ｄ）。全ての希釈に対する結果は、検出限界が３０分未満では約２５０コピー／μＬであり、精度は５０コピー／μＬでは５０％に低下したことを示している。
次いで、同じ患者試料を分析して、プレートリーダーと携帯電話装置を対比させて検出を比較した。各反応は、ＲＮＰコントロールと共に６０分間撮像された。Ｃｔ＝１７．６５（陽性スワブ＃３）の患者の勾配は、Ｃｔ＝２０．３７（陽性スワブ＃４）の患者の勾配よりも有意に大きかった（図４６Ｅ～４６Ｆ）。図４６Ｅは、ｃｒＲＮＡ２、ｃｒＲＮＡ４およびｃｒＲＮＡ２１のガイドの組み合わせを使用し、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して各々がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して陽性であると確認されたヒト患者由来の２つの異なる鼻咽頭サンプルを用いて、可動装置上で実行されたＣａｓ１３アッセイからの結果をグラフで示す。ＲＮＰのみのコントロールには鼻咽頭サンプルがなかった。図４６Ｆは、アッセイ混合物を６０分間インキュベートした後に、４６Ｅに記載のアッセイから決定された最終シグナル勾配値をグラフで示す。
検出精度を評価するために、実験開始から最初の５分、１０分、１５分および２０分のデータを使用して線形適合を行い、各サンプルの勾配をＲＮＰコントロールと比較した。図４６Ｇに示すように、５つのサンプル全てを検証し、装置を使用した場合にアッセイの最初の５分以内に陽性と特定することに成功した。したがって、本明細書に記載の可動装置検出システムおよび反応アッセイは、臨床的に関連したウイルス量を有する患者サンプルの結果を取得するための、非常に短い検査所用時間を提供した。高いウイルス量は、高いシグナルがコントロールを超えたと迅速に判断できるので非常に迅速に検出ができるのに対して、低いウイルス量は、そのシグナルがコントロールを超えて区別可能であればより長時間で検出できる。本明細書に記載されているアッセイは、スクリーニングアプリケーションと、より感度の高い診断アプリケーションの両方に対応するように調整できる時間依存的な感度を備えている。
携帯電話ベースの検出システムは、市販の実験用プレートリーダーよりも感度が低いとの一部の予想に反して、本発明者らは、我々の装置では測定ノイズが減少し、またより多くの時点での収集能力があり、これが勾配の不確実性を減少させるため、ほぼ一桁感度が高いことを発見した（図４７Ａ～４７Ｂ）。
実施例１６：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の８つのガイドの組み合わせにより、ウイルスＲＮＡの検出が向上し、且つＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを特異的に検出する
この実施例は、８ＧのｃｒＲＮＡ（配列番号２７～３４）の組み合わせの使用が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの検出を改善することを示している。
この実施例は、８ＧのｃｒＲＮＡ（配列番号２７～３４）の組み合わせの使用が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの検出を改善することを示している。
ガイドＲＮＡの組み合わせをさらに評価するために、３つのｃｒＲＮＡを含むアッセイ混合物を、８つのｃｒＲＮＡを含むアッセイ混合物と比較した。当該３つのｃｒＲＮＡガイドの組み合わせは、ｃｒＲＮＡ２＋４＋２１（配列番号２７、２８、２３または３５）、下記の表３に示される配列を含んでいた。
８つのｃｒＲＮＡの組み合わせは、８ＧのｃｒＲＮＡの組み合わせ（配列番号２７～３４）であり、配列は以下の表４に示されている。
ｃｒＲＮＡ組み合わせの特異性を試験するために、異なる標的ＲＮＡを使用して、３Ｇおよび８ＧのｃｒＲＮＡ組み合わせを評価した。したがって、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、ＨＩＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡからのウイルスＲＮＡを、３ＧのｃｒＲＮＡ組み合わせまたは８ＧのｃｒＲＮＡ組み合わせのいずれかのアリコートと混合した。本明細書に記載の方法を用いて実施されたアッセイおよび各アッセイ混合物からの蛍光シグナルが検出された。
図４８に示すように、ｃｒＲＮＡ（配列番号２７～３４）の８Ｇ組み合わせの使用は、３ＧのｃｒＲＮＡ組み合わせ（配列番号２７、２８、２３または３５）と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡ検出を改善した。さらに、ｃｒＲＮＡの８Ｇの組み合わせは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して非常に特異的であった。インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ヒトコロナウイルスＮＬ６３およびＯＣ４３、またはＨＩＶウイルスＲＮＡアッセイからのシグナルは、ウイルス標的ＲＮＡを含まないアッセイ混合物（例えば、ＲＮＰ単独アッセイ）とは検出可能なほどに異ならなかった（図４８参照）。
次いで、ｃｒＲＮＡガイドの８Ｇ組み合わせによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出限界を、ＦＤＡガイドラインに従って検出限界法により評価した。アッセイ混合物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡの１μＬ当り１００、５０、または１０コピーを使用して、３０分、６０分、または１２０分間インキュベートして調製した。ＦＤＡガイドラインに従って、２０個の反復を個別に比較した（図４９参照）。
図４９Ａ～４９Ｃは、ｃｒＲＮＡ（配列番号２７～３４）の８Ｇ組み合わせの検出限界を示す。図４９に示すように、ｃｒＲＮＡガイドの８Ｇ組み合わせを使用した場合、特にアッセイを３０分以上インキュベートした場合には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡのマイクロリットル当り僅か１０コピーしか検出できなかった。
本明細書に記載の方法をさらに評価するために、（野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を検出するように設計された）ｃｒＲＮＡガイドの８Ｇ組み合わせを含むアッセイ混合物を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異型およびバリアント型を検出する能力について試験した。図５０に示すように、ｃｒＲＮＡガイドの８Ｇ組み合わせは、武漢、英国、南アフリカ、カリフォルニアのバリアントを含む様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を検出する。
実施例１７：異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株、突然変異体およびバリアントの検出
この実施例は、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株、突然変異体およびバリアントを検出および区別できることを示している。
この実施例は、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株、突然変異体およびバリアントを検出および区別できることを示している。
以下に提供される表５は、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の突然変異体およびバリアントを検出するための、ｃｒＲＮＡガイド配列（配列番号５８～１４７）を示す。特に有用なｃｒＲＮＡは、＊＊により特定される。
野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株（ＷＡ１ｃｒＲＮＡ）を検出するため、または英国、カリフォルニア（ＣＡ）、南アフリカ（ＳＡ）、およびブラジル株などのバリアントおよび突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を検出するために、異なるｃｒＲＮＡガイドＲＮＡを設計した。この異なるｃｒＲＮＡガイドＲＮＡを本明細書に記載の方法を使用して試験し、それらが株特異的であるかどうか、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タイプを別のタイプと区別できるかどうかを確認した。
ＷＡ１ガイド（例えば、野生型（ＷＴ）、ＵＳ株を検出するように設計された）およびバリアントガイド（例えば、カリフォルニア（ＣＡ）、ＵＫなどの株を検出するように設計された）を、ＷＡ１、または様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ株由来のゲノムＲＮＡ、インビトロ転写ＲＮＡ、合成ＲＮＡなどを含むバリアント標的ＲＮＡに対して試験した。野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２反応（野生型ｃｒＲＮＡを使用）からのシグナルを測定することによって、およびバリアントＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株（表５に記載のバリアントｃｒＲＮＡを使用）からのシグナルを２時間にわたって測定することによって、図５１Ａに示されるアルゴリズムが決定され、また経時的な勾配が計算された。勾配比は、ガイドＲＮＡ＋標的（即ち、ＲＮＰ＋標的ＲＮＡ）反応の勾配を、ガイドＲＮＡ＋標的なし（即ち、ＲＮＰのみ）反応の勾配で除算することによって計算された。図５１Ｂに示すグラフキーを作成するために、ＷＡ１（ＷＴ）株の勾配比をバリアント株の勾配比で除算して、ＷＴおよびバリアント検出の間の比較比率を決定した。図５１Ｂに示すグラフキーのＹ軸は、ｌｏｇ２スケールである。比較比率が高い（１より大きい）場合、アッセイ混合物で使用されるガイドＲＮＡは、野生型（ＷＡ１）株をより効率的に検出する。しかし、比較比率が低い（１未満）場合、アッセイ混合物で使用されるガイドＲＮＡは、バリアント株をより効率的に検出する。
ｃｒＲＮＡをさらに評価するために、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株または突然変異／バリアントＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のいずれかを検出できる、表５に記載のｃｒＲＮＡの幾つかを含むアッセイ混合物を調製した。
図５２Ａ～５２Ｂに示すように、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を検出するように設計されたＷＡ１ｃｒＲＮＡと、ブラジルＰ．１（ＢＺ（Ｐ．１））バリアントＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を検出するために設計されたｃｒＲＮＡは、標的として合成ＲＮＡを使用して試験したときに、野生型と、ブラジルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株におけるバリアントＫ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、およびＮ５０１Ｙ突然変異とを区別することができた（図５２Ａ）。ｃｒＲＮＡはまた、全長ウイルスＲＮＡに対して試験した場合に、Ｅ４８４Ｋ突然変異を効率的に検出した（図５２Ｂ）。したがって、ＷＡ１のｃｒＲＮＡを使用すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在することを同定でき、特定の突然変異を標的とするガイドＲＮＡを使用すると、いずれのバリアントＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株が感染の原因であるか、さらにはどのタイプのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異が存在するかを同定することができる。
図５３Ａ～５３Ｂは、突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を検出するために特別に設計されたガイドｃｒＲＮＡが、突然変異カリフォルニア（ＣＡ Ｂ．１．４２９）株をそれらの野生型親株から区別できることを示す。ｃｒＲＮＡは、シャーロック法（図５３Ａ）またはセントラルシード法（ＣＳ、図５３Ｂ）法によって設計された。図示されているデータは、ＪＳ＿ｃｒ０３４ｃｒＲＮＡがＷＡ１固有のガイドＲＮＡであるのに対して、ＪＳ＿ｃｒ０３７、ＪＳ＿ｃｒ０４３、ＪＳ＿ｃｒ０４５、ＪＳ＿ｃｒ０４７ガイドは、ＣＡ固有のガイドＲＮＡであることを示している。ｃｒＲＮＡによって検出されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型と、突然変異の位置がグラフの下に示されている。野生株のＯＲＦ１ＡＢ：Ｉ４２０５＿ｗｔ突然変異を検出するための特に有望なガイドは、ＪＳ＿ｃｒ０３４＿Ｉ４２０５Ｖ＿ｗｔＡのｃｒＲＮＡガイドであると特定された。ＣＡクレード２０Ｃで見つかったＳｐｉｋｅ Ｓ１３Ｉ＿ｍｕｔ突然変異を検出するための特に有望なガイドは、ＪＳ＿ｃｒ０３７＿Ｓ１３Ｉ＿ｍｕｔＡのｃｒＲＮＡおよびＪＳ＿ｃｒ０４５＿Ｓ１３１＿ｍｕｔＢのｃｒＲＮＡであると特定された。ＣＡクレード２０Ｃで見つかったＯＲＦ１ＡＢ：Ｄ１１８３Ｙ＿ｍｕｔ突然変異を検出するための有望なガイドは、ＪＳ＿ｃｒ０４３＿Ｄ１１８３Ｙ＿ｍｕｔＢのｃｒＲＮＡであると特定された。ＣＡクレード２０Ｃで見つかったＳｐｉｋｅ：Ｗ１５２Ｃ＿ｍｕｔ突然変異を検出するための有望なガイドは、ＪＳ＿ｃｒ０４７＿Ｗ１５２Ｃ＿ｍｕｔＢのｃｒＲＮＡであると特定された。
図５４Ａ～５４Ｂは、カリフォルニア（ＣＡ）クレードの２０Ｃ ＣＡ／Ｂ．１．４２９突然変異体および野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の、そのようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を検出するように設計された様々なｃｒＲＮＡを使用した検出を示す。図５４Ａに示すグラフキーは、ｌｏｇ２スケールを使用した、Ｙ軸上の野生型とバリアントカリフォルニア（ＣＡ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株との間の比較比率を示す。比較比率が高い（１より大きい）場合、アッセイ混合物で使用されるガイドＲＮＡは野生型（ＷＡ１など）株をより効率的に検出する。しかし、比較比率が低い場合（１未満）には、アッセイ混合物で使用されるガイドＲＮＡは、バリアント株（例えば、ＣＡバリアント株）をより効率的に検出する。この実験は、ＪＳｃｒ５６、ＪＳｃｒ５７、ＪＳｃｒ５８、ＪＳｃｒ４６のガイドがＷＡ１（ｗｔ）に特異的であり、ＪＳｃｒ３７、ＪＳｃｒ４５がＣＡ株に特異的なガイドであることを示している（図５４Ｂ）。
図５５は、表５に記載された幾つかのｃｒＲＮＡを使用した、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（スパイクタンパク質にＤ６１４アミノ酸を有するＷＡ１）およびバリアントＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（スパイクタンパク質にＧ６１４アミノ酸を有するＵＫおよび他の幾つか）における特定の突然変異（Ｄ６１４Ｇ）を示す。図に示すように、様々なｃｒＲＮＡが、武漢参照株の２３位，４０３位におけるＡからＧへのヌクレオチド突然変異により引き起こされるスパイクＤ６１４Ｇアミノ酸突然変異をもった株を検出できる。元の分離株にはＤ６１４があり、時間の経過とともにＧ６１４が集団を引き継ぎ、現在では基本的に野生型配列になっている。
図５５のデータを得るために、幾つかのｃｒＲＮＡが、新たに循環している株で対象とする突然変異を備えたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して試験された。図５５は、いずれのガイドＲＮＡがＤ６１４突然変異とＧ６１４突然変異を区別するのに優れているかを示す（それぞれＪＳｃｒ４対ＪＳｃｒ１２を使用）。
参考文献
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Ｃｏｒｍａｎ， Ｖ．Ｍ．， Ｌａｎｄｔ， Ｏ．， Ｋａｉｓｅｒ， Ｍ．， Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ， Ｒ．， Ｍｅｉｊｅｒ， Ａ．， Ｃｈｕ， Ｄ．Ｋ．， Ｂｌｅｉｃｋｅｒ， Ｔ．， Ｂｒｕｎｉｎｋ， Ｓ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｊ．， Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｍ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ （２０１９－ｎＣｏＶ） ｂｙ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ． Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ． ２５（３）． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０１／３０ ＤＯＩ： １０．２８０７／１５６０－７９１７．ＥＳ．２０２０．２５．３．２００００４５。
Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏ， Ｍ．Ｖ．， Ｂａｋａｌａｒ， Ｍ．， Ｂｅｎｎｕｒｕ， Ｓ．， Ｒｅｂｅｒ， Ｃ．， Ｓｋａｎｄａｒａｊａｈ， Ａ．， Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｌ．， Ｓｗｉｔｚ， Ｎ．， Ｋａｍｇｎｏ， Ｊ．， Ｐｉｏｎ， Ｓ．， Ｂｏｕｓｓｉｎｅｓｑ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ－ｂｏｒｎｅ ｆｉｌａｒｉａｌ ｐａｒａｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈｏｎｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ７（２８６）， ２８６ｒｅ２８４． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１５／０５／０８ ＤＯＩ： １０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａａ３４８０。
Ｄｏｎｇ， Ｅ．， Ｄｕ， Ｈ．， ａｎｄ Ｇａｒｄｎｅｒ， Ｌ． （２０２０）． Ａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ ｄａｓｈｂｏａｒｄ ｔｏ ｔｒａｃｋ ＣＯＶＩＤ－１９ ｉｎ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ． Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． ２０（５）， ５３３－５３４。
Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ， Ａ．， Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ， Ｍ．Ｒ．， Ｂｕｒｓｔｅｉｎ， Ｄ．， Ｋｎｏｔｔ， Ｇ．Ｊ．， ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ， Ｊ．Ａ． （２０１７）． ＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｙ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｅｎｚｙｍｅｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． ６６（３）， ３７３－３８３ ｅ３７３。
Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ， Ａ．， Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ， Ｍ．Ｒ．， Ｋｎｉｇｈｔ， Ｓ．Ｃ．， Ｂｕｒｓｔｅｉｎ， Ｄ．， Ｃａｔｅ， Ｊ．Ｈ．， Ｔｊｉａｎ， Ｒ．， ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ， Ｊ．Ａ． （２０１６）． Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＲＮａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２ｃ２ ｅｎａｂｌｅ ｇｕｉｄｅ－ＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ． ５３８（７６２４）， ２７０－２７３。
Ｆｕｎｇ， Ｔ．Ｓ．， ａｎｄ Ｌｉｕ， Ｄ．Ｘ． （２０１９）． Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ： Ｈｏｓｔ－Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｍｉｃｒｏ－０２０５１８－１１５７５９． ＤＯＩ： １０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｍｉｃｒｏ－０２０５１８－１１５７５９。
Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｓ．， Ａｂｕｄａｙｙｅｈ， Ｏ．Ｏ．， Ｋｅｌｌｎｅｒ， Ｍ．Ｊ．， Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．， Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｊ．Ｊ．， ａｎｄ Ｚｈａｎｇ， Ｆ． （２０１８）． Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｎｄ ｐｏｒｔａｂｌｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｗｉｔｈ Ｃａｓ１３， Ｃａｓ１２ａ， ａｎｄ Ｃｓｍ６． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３６０（６３８７）， ４３９－４４４。
Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｓ．， Ａｂｕｄａｙｙｅｈ， Ｏ．Ｏ．， Ｌｅｅ， Ｊ．Ｗ．， Ｅｓｓｌｅｔｚｂｉｃｈｌｅｒ， Ｐ．， Ｄｙ， Ａ．Ｊ．， Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．， Ｖｅｒｄｉｎｅ， Ｖ．， Ｄｏｎｇｈｉａ， Ｎ．， Ｄａｒｉｎｇｅｒ， Ｎ．Ｍ．， Ｆｒｅｉｊｅ， Ｃ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３５６（６３３６）， ４３８－４４２。
Ｇｒｅｅｎ， Ｄ．Ａ．， ａｎｄ ＳｔＧｅｏｒｇｅ， Ｋ． （２０１８）． Ｒａｐｉｄ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ： Ｒａｔｉｏｎａｌｅ ａｎｄ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＦＤＡ Ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５６（１０）． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１８／０６／１５ ＤＯＩ： １０．１１２８／ＪＣＭ．００７１１－１８。
Ｇｕ Ｗ， Ｃｒａｗｆｏｒｄ ＥＤ， Ｏ’Ｄｏｎｏｖａｎ ＢＤ， Ｗｉｌｓｏｎ ＭＲ， Ｃｈｏｗ ＥＤ， Ｒｅｔａｌｌａｃｋ Ｈ， ＤｅＲｉｓｉ ＪＬ． Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ａｂｕｎｄａｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｙ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （ＤＡＳＨ）： ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ９ ｔｏ ｒｅｍｏｖｅ ｕｎｗａｎｔｅｄ ｈｉｇｈ－ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ＢｉｏＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ； ２０１６ Ｍａｒ ４；１７（１）：４１。
Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｍ， Ｋｌｅｉｎｅ－Ｗｅｂｅｒ Ｈ， Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ｓ， Ｋｒｕｅｇｅｒ Ｎ， Ｈｅｒｒｌｅｒ Ｔ， Ｅｒｉｃｈｓｅｎ Ｓ， Ｓｃｈｉｅｒｇｅｎｓ ＴＳ， Ｈｅｒｒｌｅｒ Ｇ， Ｗｕ Ｎ－Ｈ， Ｎｉｔｓｃｈｅ Ａ， Ｍｕｅｌｌｅｒ ＭＡ， Ｄｒｏｓｔｅｎ Ｃ， Ｐｏｅｈｌｍａｎｎ Ｓ． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｒｙ Ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ＡＣＥ２ ａｎｄ ＴＭＰＲＳＳ２ ａｎｄ Ｉｓ Ｂｌｏｃｋｅｄ ｂｙ ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ Ｐｒｏｖｅｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｃｅｌｌ． ２０２０ Ｍａｒ ４。
Ｈｏｕ， Ｔ．， Ｚｅｎｇ， Ｗ．， Ｙａｎｇ， Ｍ．， Ｃｈｅｎ， Ｗ．， Ｒｅｎ， Ｌ．， Ａｉ， Ｊ．， Ｗｕ， Ｊ．， Ｌｉａｏ， Ｙ．， Ｇｏｕ， Ｘ．， Ｌｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒａｐｉｄ ＣＲＩＳＰＲ－ｂａｓｅｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｆｏｒ ＣＯＶＩＤ－１９． ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ． １６（８）， ｅ１００８７０５． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０８／２８ ＤＯＩ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００８７０５。
Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．， Ｌａｄｈａ， Ａ．， Ｓａｉｔｏ， Ｍ．， Ｓｅｇｅｌ， Ｍ．， Ｂｒｕｎｅａｕ， Ｒ．， Ｈｕａｎｇ， Ｍ．Ｗ．， Ｋｉｍ， Ｎ．Ｇ．， Ｙｕ， Ｘ．， Ｌｉ， Ｊ．， Ｗａｌｋｅｒ， Ｂ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ＣＯＶＩＤ－１９ ｕｓｉｎｇ ＳＨＥＲＬＯＣＫ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ． ｍｅｄＲｘｉｖ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０６／０９ ＤＯＩ： １０．１１０１／２０２０．０５．０４．２００９１２３１。
Ｋａｍｇｎｏ Ｊ， Ｐｉｏｎ ＳＤ， Ｃｈｅｓｎａｉｓ ＣＢ， Ｂａｋａｌａｒ ＭＨ， Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏ ＭＶ， Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ＣＤ， Ｎａｎａ－Ｄｊｅｕｎｇａ ＨＣ， Ｇｏｕｎｏｕｅ－Ｋａｍｋｕｍｏ Ｒ， Ｎｊｉｔｃｈｏｕａｎｇ Ｇ－Ｒ， Ｎｗａｎｅ Ｐ， Ｔｃｈａｔｃｈｕｅｎｇ－Ｍｂｏｕｇａ ＪＢ， Ｗａｎｊｉ Ｓ， Ｓｔｏｌｋ ＷＡ， Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＤＡ， Ｋｌｉｏｎ ＡＤ， Ｎｕｔｍａｎ ＴＢ， Ｂｏｕｓｓｉｎｅｓｑ Ｍ． Ａ Ｔｅｓｔ－ａｎｄ－Ｎｏｔ－Ｔｒｅａｔ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃｉａｓｉｓ ｉｎ Ｌｏａ ｌｏａ－Ｅｎｄｅｍｉｃ Ａｒｅａｓ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１７ Ｎｏｖ ２３；３７７（２１）：２０４４－５２。
Ｋａｎｇ Ｈ， Ｆｅｎｇ Ｍ， Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＭＥ， Ｇｉｅｄｒｏｃ ＤＰ， Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ ＪＬ． Ｐｕｔａｔｉｖｅ ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐｓ ｉｎ ｔｈｅ ５’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｃａｎ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｍｏｕｓｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２００６ Ｎｏｖ；８０（２１）：１０６００－１４。
Ｌａ Ｓｃｏｌａ， Ｂ．， Ｌｅ Ｂｉｄｅａｕ， Ｍ．， Ａｎｄｒｅａｎｉ， Ｊ．， Ｈｏａｎｇ， Ｖ．Ｔ．， Ｇｒｉｍａｌｄｉｅｒ， Ｃ．， Ｃｏｌｓｏｎ， Ｐ．， Ｇａｕｔｒｅｔ， Ｐ．， ａｎｄ Ｒａｏｕｌｔ， Ｄ． （２０２０）． Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｓ ａ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｗａｒｄｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． ３９（６）， １０５９－１０６１． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０４／２９ ＤＯＩ： １０．１００７／ｓ１００９６－０２０－０３９１３－９。
Ｌａｒｒｅｍｏｒｅ， Ｄ．Ｂ．， Ｗｉｌｄｅｒ， Ｂ．， Ｌｅｓｔｅｒ， Ｅ．， Ｓｈｅｈａｔａ， Ｓ．， Ｂｕｒｋｅ， Ｊ．Ｍ．， Ｈａｙ， Ｊ．Ａ．， Ｔａｍｂｅ， Ｍ．， Ｍｉｎａ， Ｍ．Ｊ．， ａｎｄ Ｐａｒｋｅｒ， Ｒ． （２０２０）． Ｔｅｓｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｔｏ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｔｕｒｎａｒｏｕｎｄ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ＣＯＶＩＤ－１９ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ． ｍｅｄＲｘｉｖ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０７／０２ ＤＯＩ： １０．１１０１／２０２０．０６．２２．２０１３６３０９。
Ｌａｖｅｚｚｏ， Ｅ．， Ｆｒａｎｃｈｉｎ， Ｅ．， Ｃｉａｖａｒｅｌｌａ， Ｃ．， Ｃｕｏｍｏ－Ｄａｎｎｅｎｂｕｒｇ， Ｇ．， Ｂａｒｚｏｎ， Ｌ．， Ｖｅｃｃｈｉｏ， Ｃ．Ｄ．， Ｒｏｓｓｉ， Ｌ．， Ｍａｎｇａｎｅｌｌｉ， Ｒ．， Ｌｏｒｅｇｉａｎ， Ａ．， Ｎａｖａｒｉｎ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｔａｌｉａｎ ｍｕｎｉｃｉｐａｌｉｔｙ ｏｆ Ｖｏ’． Ｎａｔｕｒｅ． １－５． ＤＯＩ： ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２４８８－１。
ＬｅＤｕｃ， Ｊ．Ｗ．， ａｎｄ Ｂａｒｒｙ， Ｍ．Ａ． （２００４）． ＳＡＲＳ， ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｐａｎｄｅｍｉｃ ｏｆ ｔｈｅ ２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ１． Ｉｎ： Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ｐ． ｅ２６。
Ｌｅｅ， Ｓ．， Ｋｉｍ， Ｔ．， Ｌｅｅ， Ｅ．， Ｌｅｅ， Ｃ．， Ｋｉｍ， Ｈ．， Ｒｈｅｅ， Ｈ．， Ｐａｒｋ， Ｓ．Ｙ．， Ｓｏｎ， Ｈ．Ｊ．， Ｙｕ， Ｓ．， Ｐａｒｋ， Ｊ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｕｒｓｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒａｌ Ｓｈｅｄｄｉｎｇ Ａｍｏｎｇ Ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ． ＪＡＭＡ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０８／１２ ＤＯＩ： １０．１００１／ｊａｍａｉｎｔｅｒｎｍｅｄ．２０２０．３８６２。
Ｌｉｎ Ｒ， Ｓｋａｎｄａｒａｊａｈ Ａ， Ｇｅｒｖｅｒ ＲＥ， Ｎｅｉｒａ ＨＤ， Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＤＡ， Ｈｅｒｒ ＡＥ． Ａ ｌａｔｅｒａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｆｌｏｗ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｓｓａｙ． Ｌａｂ Ｃｈｉｐ． Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ； ２０１５ Ｍａｒ ２１；１５（６）：１４８８－９６。
Ｍａｎｆｒｅｄｏｎｉａ， Ｉ．， Ｎｉｔｈｉｎ， Ｃ．， Ｐｏｎｃｅ－Ｓａｌｖａｔｉｅｒｒａ， Ａ．， Ｇｈｏｓｈ， Ｐ．， Ｗｉｒｅｃｋｉ， Ｔ．Ｋ．， Ｍａｒｉｎｕｓ， Ｔ．， Ｏｇａｎｄｏ， Ｎ．Ｓ．， Ｓｎｉｄｅｒ， Ｅ．Ｊ．， Ｈｅｍｅｒｔ， Ｍ．Ｊ．ｖ．， Ｂｕｊｎｉｃｋｉ， Ｊ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ－ｒｅｌｅｖａｎｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． ＤＯＩ： １０．１１０１／２０２０．０６．１５．１５１６４７。
Ｍｙｈｒｖｏｌｄ， Ｃ．， Ｆｒｅｉｊｅ， Ｃ．Ａ．， Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｓ．， Ａｂｕｄａｙｙｅｈ， Ｏ．Ｏ．， Ｍｅｔｓｋｙ， Ｈ．Ｃ．， Ｄｕｒｂｉｎ， Ａ．Ｆ．， Ｋｅｌｌｎｅｒ， Ｍ．Ｊ．， Ｔａｎ， Ａ．Ｌ．， Ｐａｕｌ， Ｌ．Ｍ．， Ｐａｒｈａｍ， Ｌ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｆｉｅｌｄ－ｄｅｐｌｏｙａｂｌｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３６０（６３８７）， ４４４－４４８． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１８／０４／２８ ＤＯＩ： １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｓ８８３６。
Ｏｓｏｒｉｏ， Ｎ．Ｓ．， ａｎｄ Ｃｏｒｒｅｉａ－Ｎｅｖｅｓ， Ｍ． （２０２０）． Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＲＴ－ｑＰＣＲ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｓｓａｙｓ． Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０６／０１ ＤＯＩ： １０．１０１６／Ｓ１４７３－３０９９（２０）３０４３５－７。
Ｑｕｉｃｋｅ， Ｋ．， Ｇａｌｌｉｃｈｏｔｅ， Ｅ．， Ｓｅｘｔｏｎ， Ｎ．， Ｙｏｕｎｇ， Ｍ．， Ｊａｎｉｃｈ， Ａ．， Ｇａｈｍ， Ｇ．， Ｃａｒｌｔｏｎ， Ｅ．Ｊ．， Ｅｈｒｈａｒｔ， Ｎ．， ａｎｄ Ｅｂｅｌ， Ｇ．Ｄ． （２０２０）． Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｆｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ Ａｍｏｎｇ Ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ Ｓｔａｆｆ ｉｎ Ｆｉｖｅ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｋｉｌｌｅｄ Ｎｕｒｓｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ： Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ， Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ． ｍｅｄＲｘｉｖ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０６／２５ ＤＯＩ： １０．１１０１／２０２０．０６．０８．２０１２５９８９。
Ｒｉｃｈａｒｄ， Ｍ．， Ｋｏｋ， Ａ．， ｄｅ Ｍｅｕｌｄｅｒ， Ｄ．， Ｂｅｓｔｅｂｒｏｅｒ， Ｔ．Ｍ．， Ｌａｍｅｒｓ， Ｍ．Ｍ．， Ｏｋｂａ， Ｎ．Ｍ．Ａ．， Ｆｅｎｔｅｎｅｒ ｖａｎ Ｖｌｉｓｓｉｎｇｅｎ， Ｍ．， Ｒｏｃｋｘ， Ｂ．， Ｈａａｇｍａｎｓ， Ｂ．Ｌ．， Ｋｏｏｐｍａｎｓ， Ｍ．Ｐ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｓ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｖｉａ ｃｏｎｔａｃｔ ａｎｄ ｖｉａ ｔｈｅ ａｉｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ｆｅｒｒｅｔｓ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． １１（１）， ３４９６． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０７／１０ ＤＯＩ： １０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１７３６７－２。
Ｓａｎｄｅｒｓ， Ｗ．， Ｆｒｉｔｃｈ， Ｅ．Ｊ．， Ｍａｄｄｅｎ， Ｅ．Ａ．， Ｇｒａｈａｍ， Ｒ．Ｌ．， Ｖｉｎｃｅｎｔ， Ｈ．Ａ．， Ｈｅｉｓｅ， Ｍ．Ｔ．， Ｂａｒｉｃ， Ｒ．Ｓ．， ａｎｄ Ｍｏｏｒｍａｎ， Ｎ．Ｊ． （２０２０）． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ ＳＡＲＳ－ｌｉｋｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ． ｂｉｏＲｘｉｖ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０６／２７ ＤＯＩ： １０．１１０１／２０２０．０６．１５．１５３１９７。
Ｓｈａｒｆｓｔｅｉｎ ＪＭ， Ｂｅｃｋｅｒ ＳＪ， Ｍｅｌｌｏ ＭＭ． Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ． ＪＡＭＡ． ２０２０ Ｍａｒ ９。
Ｓｋａｎｄａｒａｊａｈ Ａ， Ｒｅｂｅｒ ＣＤ， Ｓｗｉｔｚ ＮＡ， Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＤＡ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈｏｎｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ． ２０１４；９（５）：ｅ９６９０６。
Ｓｍｉｔｈ ＺＪ， Ｃｈｕ Ｋ， Ｅｓｐｅｎｓｏｎ ＡＲ， Ｒａｈｉｍｚａｄｅｈ Ｍ， Ｇｒｙｓｈｕｋ Ａ， Ｍｏｌｉｎａｒｏ Ｍ， Ｄｗｙｒｅ ＤＭ， Ｌａｎｅ Ｓ， Ｍａｔｔｈｅｗｓ Ｄ， Ｗａｃｈｓｍａｎｎ－Ｈｏｇｉｕ Ｓ． Ｃｅｌｌ－ｐｈｏｎｅ－ｂａｓｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ． ２０１１ Ｍａｒ ２；６（３）：ｅ１７１５０。
Ｓｍｉｔｈ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｐｅｒｅｌｓｏｎ， Ａ．Ｓ． （２０１１）． Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ： ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄａｔａ ａｎｄ ｍｏｄｅｌｓ． Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ． ３（４）， ４２９－４４５． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１１／０１／０５ ＤＯＩ： １０．１００２／ｗｓｂｍ．１２９。
Ｖａｎａｅｒｓｃｈｏｔ， Ｍ．， Ｍａｎｎ， Ｓ．Ａ．， Ｗｅｂｂｅｒ， Ｊ．Ｔ．， Ｋａｍｍ， Ｊ．， Ｂｅｌｌ， Ｓ．Ｍ．， Ｂｅｌｌ， Ｊ．， Ｈｏｎｇ， Ｓ．Ｎ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｍ．Ｐ．， Ｃｈａｎ， Ｌ．Ｙ．， Ｂｈａｔｔ， Ｋ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ Ｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｔｈａｔ ａｄｖｅｒｓｅｌｙ ｉｍｐａｃｔｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｗｉｄｅｌｙ－ｕｓｅｄ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ． ｂｉｏＲｘｉｖ。
Ｖｏｇｅｌｓ， Ｃ．Ｂ．Ｆ．， Ｂｒｉｔｏ， Ａ．Ｆ．， Ｗｙｌｌｉｅ， Ａ．Ｌ．， Ｆａｕｖｅｒ， Ｊ．Ｒ．， Ｏｔｔ， Ｉ．Ｍ．， Ｋａｌｉｎｉｃｈ， Ｃ．Ｃ．， Ｐｅｔｒｏｎｅ， Ｍ．Ｅ．， Ｃａｓａｎｏｖａｓ－Ｍａｓｓａｎａ， Ａ．， Ｍｕｅｎｋｅｒ， Ｍ．Ｃ．， Ｍｏｏｒｅ， Ａ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ｑＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ－ｐｒｏｂｅ ｓｅｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． １－７． ＤＯＩ： ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５６４－０２０－０７６１－６。
Ｗａｎｇ， Ｃ．， Ｈｏｒｂｙ， Ｐ．Ｗ．， Ｈａｙｄｅｎ， Ｆ．Ｇ．， ａｎｄ Ｇａｏ， Ｇ．Ｆ． （２０２０）． Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｇｌｏｂａｌ ｈｅａｌｔｈ ｃｏｎｃｅｒｎ． Ｌａｎｃｅｔ． ３９５（１０２２３）， ４７０－４７３． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０１／２８ ＤＯＩ： １０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（２０）３０１８５－９。
Ｗａｎｇ， Ｗ．， Ｘｕ， Ｙ．， Ｇａｏ， Ｒ．， Ｌｕ， Ｒ．， Ｈａｎ， Ｋ．， Ｗｕ， Ｇ．， ａｎｄ Ｔａｎ， Ｗ． （２０２０）． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ． ＪＡＭＡ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０３／１２ ＤＯＩ： １０．１００１／ｊａｍａ．２０２０．３７８６。
Ｗａｎｇ Ｄ， Ｈｕ Ｂ， Ｈｕ Ｃ， Ｚｈｕ Ｆ， Ｌｉｕ Ｘ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ｗａｎｇ Ｂ， Ｘｉａｎｇ Ｈ， Ｃｈｅｎｇ Ｚ， Ｘｉｏｎｇ Ｙ， Ｚｈａｏ Ｙ， Ｌｉ Ｙ， Ｗａｎｇ Ｘ， Ｐｅｎｇ Ｚ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ １３８ Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ ２０１９ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｉｎ Ｗｕｈａｎ， Ｃｈｉｎａ． ＪＡＭＡ． ２０２０ Ｆｅｂ ７。
Ｗａｌｌｓ ＡＣ， Ｐａｒｋ Ｙ－Ｊ， Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉ ＭＡ， Ｗａｌｌ Ａ， ＭｃＧｕｉｒｅ ＡＴ， Ｖｅｅｓｌｅｒ Ｄ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃｅｌｌ． （Ｍａｒ． ６， ２０２０）。
Ｗｉｅｒｓｉｎｇａ， Ｗ．Ｊ．， Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｄ．ｏ．Ｍ．， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ＵＭＣ， ｌｏｃａｔｉｏｎ ＡＭＣ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ， Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （ＣＥＭＭ）， Ａ．Ｕ．， ｌｏｃａｔｉｏｎ ＡＭＣ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ， Ｒｈｏｄｅｓ， Ａ．， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｓ．Ｇ．ｓ．Ｕ．Ｈ．Ｆ．Ｔ．， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ， Ｃｈｅｎｇ， Ａ．Ｃ．， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｔ， Ａ．Ｈ．， Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｍ．Ｕ．， Ｍｏｎａｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ， Ｐｅａｃｏｃｋ， Ｓ．Ｊ．， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｐ．Ｈ．Ｅ．， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ， Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ （ＣＯＶＩＤ－１９）： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ． ＪＡＭＡ． ３２４（８）， ７８２－７９３． ＤＯＩ： １０．１００１／ｊａｍａ．２０２０．１２８３９。
Ｗｏｌｆｅｌ， Ｒ．， Ｃｏｒｍａｎ， Ｖ．Ｍ．， Ｇｕｇｇｅｍｏｓ， Ｗ．， Ｓｅｉｌｍａｉｅｒ， Ｍ．， Ｚａｎｇｅ， Ｓ．， Ｍｕｌｌｅｒ， Ｍ．Ａ．， Ｎｉｅｍｅｙｅｒ， Ｄ．， Ｊｏｎｅｓ， Ｔ．Ｃ．， Ｖｏｌｌｍａｒ， Ｐ．， Ｒｏｔｈｅ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－２０１９． Ｎａｔｕｒｅ． ５８１（７８０９）， ４６５－４６９。
Ｗｏｅｌｆｅｌ Ｒ， Ｃｏｒｍａｎ ＶＭ， Ｇｕｇｇｅｍｏｓ Ｗ， Ｓｅｉｌｍａｉｅｒ Ｍ， Ｚａｎｇｅ Ｓ， Ｍｕｅｌｌｅｒ ＭＡ， Ｎｉｅｍｅｙｅｒ Ｄ， Ｖｏｌｌｍａｒ Ｐ， Ｒｏｔｈｅ Ｃ， Ｈｏｅｌｓｃｈｅｒ Ｍ， Ｂｌｅｉｃｋｅｒ Ｔ， Ｂｒｕｅｎｉｎｋ Ｓ， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｊ， Ｅｈｍａｎｎ Ｒ， Ｚｗｉｒｇｌｍａｉｅｒ Ｋ， Ｄｒｏｓｔｅｎ Ｃ， Ｗｅｎｄｔｎｅｒ Ｃ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ ｉｎ ａ ｔｒａｖｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒ． ｍｅｄＲｘｉｖ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； ２０２０ Ｍａｒ ５：１－１６。
Ｗｏｏｄ， Ｃ．Ｓ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｍ．Ｒ．， Ｂｕｄｄ， Ｊ．， Ｍａｓｈａｍｂａ－Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｔ．Ｐ．， Ｈｅｒｂｓｔ， Ｋ．， Ｐｉｌｌａｙ， Ｄ．， Ｐｅｅｌｉｎｇ， Ｒ．Ｗ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ａ．Ｍ．， ＭｃＫｅｎｄｒｙ， Ｒ．Ａ．， ａｎｄ Ｓｔｅｖｅｎｓ， Ｍ．Ｍ． （２０１９）． Ｔａｋｉｎｇ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｍｏｂｉｌｅ－ｈｅａｌｔｈ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ． Ｎａｔｕｒｅ． ５６６（７７４５）， ４６７－４７４． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１９／０３／０１ ＤＯＩ： １０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－０９５６－２。
Ｗｕ Ｚ， ＭｃＧｏｏｇａｎ ＪＭ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｄ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｌｅｓｓｏｎｓ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ （ＣＯＶＩＤ－１９） Ｏｕｔｂｒｅａｋ ｉｎ Ｃｈｉｎａ： Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ａ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ７２３１４ Ｃａｓｅｓ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． ＪＡＭＡ． ２０２０ Ｆｅｂ ２４。
Ｙａｎ Ｒ， Ｚｈａｎｇ Ｙ， Ｌｉ Ｙ， Ｘｉａ Ｌ， Ｇｕｏ Ｙ， Ｚｈｏｕ Ｑ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｂｙ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０２０ Ｍａｒ ４；：ｅａｂｂ２７６２。
Ｙａｎｇ Ｄ， Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ ＪＬ． Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ３’ ａｎｄ ５’ ｅｎｄｓ． Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２０１５ Ａｕｇ ３；２０６：１２０－３３。
Ｙｏｕｎｇ ＢＥ， Ｏｎｇ ＳＷＸ， Ｋａｌｉｍｕｄｄｉｎ Ｓ， Ｌｏｗ ＪＧ， Ｔａｎ ＳＹ， Ｌｏｈ Ｊ， Ｎｇ ＯＴ， Ｍａｒｉｍｕｔｈｕ Ｋ， Ａｎｇ ＬＷ， Ｍａｋ ＴＭ， Ｌａｕ ＳＫ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＤＥ， Ｃｈａｎ ＫＳ， Ｔａｎ ＴＹ， Ｎｇ ＴＹ， Ｃｕｉ Ｌ， Ｓａｉｄ Ｚ， Ｋｕｒｕｐａｔｈａｍ Ｌ， Ｃｈｅｎ ＭＩ－Ｃ， Ｃｈａｎ Ｍ， Ｖａｓｏｏ Ｓ， Ｗａｎｇ Ｌ－Ｆ， Ｔａｎ ＢＨ， Ｌｉｎ ＲＴＰ， Ｌｅｅ ＶＪＭ， Ｌｅｏ ＹＳ， Ｌｙｅ ＤＣ， ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ ２０１９ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｏｕｔｂｒｅａｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅａｍ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｗｉｔｈ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ． ＪＡＭＡ． ２０２０ Ｍａｒ ３；：１－７。
Ｚａｐｐａ， Ａ．， Ａｍｅｎｄｏｌａ， Ａ．， Ｒｏｍａｎｏ， Ｌ．， ａｎｄ Ｚａｎｅｔｔｉ， Ａ． （２００９）． Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ａｎｄ ｒｅ－ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｒａ ｏｆ ｇｌｏｂａｌｉｓａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓ． ７（３）， １６７－１７１． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２００９／０８／０７ ＤＯＩ： １０．２４５０／２００９．００７６－０８。
Ｚｅｔｓｃｈｅ， Ｂ．， Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｓ．， Ａｂｕｄａｙｙｅｈ， Ｏ．Ｏ．， Ｓｌａｙｍａｋｅｒ， Ｉ．Ｍ．， Ｍａｋａｒｏｖａ， Ｋ．Ｓ．， Ｅｓｓｌｅｔｚｂｉｃｈｌｅｒ， Ｐ．， Ｖｏｌｚ， Ｓ．Ｅ．， Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｏｏｓｔ， Ｊ．， Ｒｅｇｅｖ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｃｐｆ１ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｃｅｌｌ． １６３（３）， ７５９－７７１． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１５／１０／０１ ＤＯＩ： １０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０９．０３８。
Ｚｈａｎｇ Ｆ， Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ＯＯ， Ｊｏｎａｔｈａｎ ＳＧ． Ａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ。
Ｚｈｕ， Ｎ．， Ｚｈａｎｇ， Ｄ．， Ｗａｎｇ， Ｗ．， Ｌｉ， Ｘ．， Ｙａｎｇ， Ｂ．， Ｓｏｎｇ， Ｊ．， Ｚｈａｏ， Ｘ．， Ｈｕａｎｇ， Ｂ．， Ｓｈｉ， Ｗ．， Ｌｕ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｉｎ Ｃｈｉｎａ， ２０１９． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３８２（８）， ７２７－７３３． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０１／２５ ＤＯＩ： １０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ２００１０１７。
Ｚｏｕ Ｌ， Ｒｕａｎ Ｆ， Ｈｕａｎｇ Ｍ， Ｌｉａｎｇ Ｌ， Ｈｕａｎｇ Ｈ， Ｈｏｎｇ Ｚ， Ｙｕ Ｊ， Ｋａｎｇ Ｍ， Ｓｏｎｇ Ｙ， Ｘｉａ Ｊ， Ｇｕｏ Ｑ， Ｓｏｎｇ Ｔ， Ｈｅ Ｊ， Ｙｅｎ Ｈ－Ｌ， Ｐｅｉｒｉｓ Ｍ， Ｗｕ Ｊ． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｖｉｒａｌ Ｌｏａｄ ｉｎ Ｕｐｐｅｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０２０ Ｆｅｂ １９。
Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ＯＯ， Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ＪＳ， Ｅｓｓｌｅｔｚｂｉｃｈｌｅｒ Ｐ， Ｈａｎ Ｓ， Ｊｏｕｎｇ Ｊ， Ｂｅｌａｎｔｏ ＪＪ， Ｖｅｒｄｉｎｅ Ｖ， Ｃｏｘ ＤＢＴ， Ｋｅｌｌｎｅｒ ＭＪ， Ｒｅｇｅｖ Ａ， Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ， Ｖｏｙｔａｓ ＤＦ， Ｔｉｎｇ ＡＹ， Ｚｈａｎｇ Ｆ． ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３． Ｎａｔｕｒｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ； ２０１７ Ｏｃｔ １２；５５０（７６７５）：２８０－４。
Ａｂｕｄａｙｙｅｈ， Ｏ．Ｏ．， Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｓ．， Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ， Ｓ．， Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．， Ｓｌａｙｍａｋｅｒ， Ｉ．Ｍ．， Ｃｏｘ， Ｄ．Ｂ．， Ｓｈｍａｋｏｖ， Ｓ．， Ｍａｋａｒｏｖａ， Ｋ．Ｓ．， Ｓｅｍｅｎｏｖａ， Ｅ．， Ｍｉｎａｋｈｉｎ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３５３（６２９９）： ３５３， ａａｆ５５７３。
Ａｌｅｘａｎｄｅｒｓｅｎ， Ｓ．， Ｃｈａｍｉｎｇｓ， Ａ．， ａｎｄ Ｂｈａｔｔａ， Ｔ．Ｒ． （２０２０）． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡｓ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｓａｍｐｌｅｓ ａｒｅ ｎｏｔ ａｎ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． ｍｅｄＲｘｉｖ。
Ａｒｉｚｔｉ－Ｓａｎｚ， Ｊ．， Ｆｒｅｉｊｅ， Ｃ．Ａ．， Ｓｔａｎｔｏｎ， Ａ．Ｃ．， Ｂｏｅｈｍ， Ｃ．Ｋ．， Ｐｅｔｒｏｓ， Ｂ．Ａ．， Ｓｉｄｄｉｑｕｉ， Ｓ．， Ｓｈａｗ， Ｂ．Ｍ．， Ａｄａｍｓ， Ｇ．， Ｋｏｓｏｋｏ－Ｔｈｏｒｏｄｄｓｅｎ， Ｔ．Ｆ．， Ｋｅｍｂａｌｌ， Ｍ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｓａｍｐｌｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｃａｓ１３－ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２． ｂｉｏＲｘｉｖ。
Ｂａｂｉｎ， Ｓ．Ｍ．， Ｈｓｉｅｈ， Ｙ．Ｈ．， Ｒｏｔｈｍａｎ， Ｒ．Ｅ．， ａｎｄ Ｇａｙｄｏｓ， Ｃ．Ａ． （２０１１）． Ａ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ２００９ ｓｗｉｎｅ－ｌｉｎｅａｇｅ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ （Ｈ１Ｎ１）． Ｄｉａｇｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． ６９（４）， ４１０－４１８。
Ｂａｉ， Ｙ．， Ｙａｏ， Ｌ．， Ｗｅｉ， Ｔ．， Ｔｉａｎ， Ｆ．， Ｊｉｎ， Ｄ．Ｙ．， Ｃｈｅｎ， Ｌ．， ａｎｄ Ｗａｎｇ， Ｍ． （２０２０）． Ｐｒｅｓｕｍｅｄ Ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９． ＪＡＭＡ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０２／２３ ＤＯＩ： １０．１００１／ｊａｍａ．２０２０．２５６５。
Ｂｅｒｇ Ｂ， Ｃｏｒｔａｚａｒ Ｂ， Ｔｓｅｎｇ Ｄ， Ｏｚｋａｎ Ｈ， Ｆｅｎｇ Ｓ， Ｗｅｉ Ｑ， Ｃｈａｎ ＲＹ－Ｌ， Ｂｕｒｂａｎｏ Ｊ， Ｆａｒｏｏｑｕｉ Ｑ， Ｌｅｗｉｎｓｋｉ Ｍ， Ｄｉ Ｃａｒｌｏ Ｄ， Ｇａｒｎｅｒ ＯＢ， Ｏｚｃａｎ Ａ． Ｃｅｌｌｐｈｏｎｅ－Ｂａｓｅｄ Ｈａｎｄ－Ｈｅｌｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ｆｏｒ Ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙｓ． ＡＣＳ Ｎａｎｏ． ２０１５ Ａｕｇ ２５；９（８）：７８５７－６６。
Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ ＤＮ， Ｍａａｍａｒｉ ＲＮ， Ｓｗｉｔｚ ＮＡ， Ｌａｍ ＷＡ， Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＤＡ． Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈｏｎｅ ｂａｓｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ ｇｌｏｂａｌ ｈｅａｌｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ． ２００９ Ｊｕｌ ２２；４（７）：ｅ６３２０。
Ｂｒｉａｎ ＤＡ， Ｂａｒｉｃ ＲＳ． Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｂｅｒｌｉｎ／Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ； ２００５；２８７（Ｓｕｐｐｌ）：１－３０。
Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ， Ｊ．Ｐ．， Ｄｅｎｇ， Ｘ．， Ｙｕ， Ｇ．， Ｆａｓｃｈｉｎｇ， Ｃ．Ｌ．， Ｓｅｒｖｅｌｌｉｔａ， Ｖ．， Ｓｉｎｇｈ， Ｊ．， Ｍｉａｏ， Ｘ．， Ｓｔｒｅｉｔｈｏｒｓｔ， Ｊ．Ａ．， Ｇｒａｎａｄｏｓ， Ａ．， Ｓｏｔｏｍａｙｏｒ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２－ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ３８（７）， ８７０－８７４． ＤＯＩ： ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２０－０５１３－４。
Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ ＪＰ， Ｄｅｎｇ Ｘ， Ｙｕ Ｇ， Ｆａｓｃｈｉｎｇ ＣＬ， ｍｅｄＲｘｉｖ ＪＳ， ２０２０． Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２０１９ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ－ｂａｓｅｄ ＤＥＴＥＣＴＲ Ｌａｔｅｒａｌ Ｆｌｏｗ Ａｓｓａｙ． ｍｅｄｒｘｉｖ．ｏｒｇ。
Ｃｈａｎ， Ｊ．Ｆ．， Ｙｕａｎ， Ｓ．， Ｋｏｋ， Ｋ．Ｈ．， Ｔｏ， Ｋ．Ｋ．， Ｃｈｕ， Ｈ．， Ｙａｎｇ， Ｊ．， Ｘｉｎｇ， Ｆ．， Ｌｉｕ， Ｊ．， Ｙｉｐ， Ｃ．Ｃ．， Ｐｏｏｎ， Ｒ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ａ ｆａｍｉｌｉａｌ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｐｅｒｓｏｎ－ｔｏ－ｐｅｒｓｏｎ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ： ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｃｌｕｓｔｅｒ． Ｌａｎｃｅｔ． ３９５（１０２２３）， ５１４－５２３． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０１／２８ ＤＯＩ： １０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（２０）３０１５４－９。
Ｃｈａｒｔｒａｎｄ， Ｃ．， Ｌｅｅｆｌａｎｇ， Ｍ．Ｍ．， Ｍｉｎｉｏｎ， Ｊ．， Ｂｒｅｗｅｒ， Ｔ．， ａｎｄ Ｐａｉ， Ｍ． （２０１２）． Ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｒａｐｉｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔｓ： ａ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ． Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． １５６（７）， ５００－５１１． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１２／０３／０１ ＤＯＩ： １０．７３２６／０００３－４８１９－１５６－７－２０１２０４０３０－００４０３。
Ｃｈｅｎ， Ｊ．Ｓ．， Ｍａ， Ｅ．， Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｌ．Ｂ．， Ｄａ Ｃｏｓｔａ， Ｍ．， Ｔｉａｎ， Ｘ．， Ｐａｌｅｆｓｋｙ， Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ， Ｊ．Ａ． （２０１８）． ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ ｔａｒｇｅｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｕｎｌｅａｓｈｅｓ ｉｎｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３６０（６３８７）， ４３６－４３９． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１８／０２／１７ ＤＯＩ： １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｒ６２４５。
Ｃｈｅｎ Ｓ－Ｃ， Ｏｌｓｔｈｏｏｒｎ ＲＣＬ． Ｇｒｏｕｐ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ５’－ｐｒｏｘｉｍａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２０１０ Ｍａｙ ２５；４０１（１）：２９－４１。
Ｃｈｅｒｒｙ， Ｊ．Ｄ．， ａｎｄ Ｋｒｏｇｓｔａｄ， Ｐ． （２００４）． ＳＡＲＳ： ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｏｆ ｔｈｅ ２１ｓｔ ｃｅｎｔｕｒｙ． Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ． ５６（１）， １－５． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２００４／０５／２１ ＤＯＩ： １０．１２０３／０１．ＰＤＲ．００００１２９１８４．８７０４２．ＦＣ。
Ｃｈａｉｓｓｏｎ ＬＨ， Ｒｅｂｅｒ Ｃ， Ｐｈａｎ Ｈ， Ｓｗｉｔｚ Ｎ， Ｎｉｌｓｓｏｎ ＬＭ， Ｍｙｅｒｓ Ｆ， Ｎｈｕｎｇ ＮＶ， Ｌｕｕ Ｌ， Ｐｈａｍ Ｔ， Ｖｕ Ｃ， Ｎｇｕｙｅｎ Ｈ， Ｎｇｕｙｅｎ Ａ， Ｄｉｎｈ Ｔ， Ｎａｈｉｄ Ｐ， Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＤＡ， Ｃａｔｔａｍａｎｃｈｉ Ａ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｂｉｌｅ ｄｉｇｉｔａｌ ｌｉｇｈｔ－ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｄｉｏｄｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ Ｈａｎｏｉ， Ｖｉｅｔ Ｎａｍ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｔｕｂｅｒｃ． Ｌｕｎｇ Ｄｉｓ． ２０１５ Ｓｅｐ；１９（９）：１０６８－７２。
Ｃｈｕ， Ｈ．， Ｌｏｆｇｒｅｎ， Ｅ．Ｔ．， Ｈａｌｌｏｒａｎ， Ｍ．Ｅ．， Ｋｕａｎ， Ｐ．Ｆ．， Ｈｕｄｇｅｎｓ， Ｍ．， ａｎｄ Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｒ． （２０１２）． Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｒａｐｉｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｈ１Ｎ１ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔｓ： ａ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ． ６（２）， ８０－８６． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１１／０９／０３ ＤＯＩ： １０．１１１１／ｊ．１７５０－２６５９．２０１１．００２８４．ｘ。
Ｃｏｒｍａｎ， Ｖ．Ｍ．， Ｌａｎｄｔ， Ｏ．， Ｋａｉｓｅｒ， Ｍ．， Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ， Ｒ．， Ｍｅｉｊｅｒ， Ａ．， Ｃｈｕ， Ｄ．Ｋ．， Ｂｌｅｉｃｋｅｒ， Ｔ．， Ｂｒｕｎｉｎｋ， Ｓ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｊ．， Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｍ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ （２０１９－ｎＣｏＶ） ｂｙ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ． Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ． ２５（３）． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０１／３０ ＤＯＩ： １０．２８０７／１５６０－７９１７．ＥＳ．２０２０．２５．３．２００００４５。
Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏ， Ｍ．Ｖ．， Ｂａｋａｌａｒ， Ｍ．， Ｂｅｎｎｕｒｕ， Ｓ．， Ｒｅｂｅｒ， Ｃ．， Ｓｋａｎｄａｒａｊａｈ， Ａ．， Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｌ．， Ｓｗｉｔｚ， Ｎ．， Ｋａｍｇｎｏ， Ｊ．， Ｐｉｏｎ， Ｓ．， Ｂｏｕｓｓｉｎｅｓｑ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ－ｂｏｒｎｅ ｆｉｌａｒｉａｌ ｐａｒａｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈｏｎｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ７（２８６）， ２８６ｒｅ２８４． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１５／０５／０８ ＤＯＩ： １０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａａ３４８０。
Ｄｏｎｇ， Ｅ．， Ｄｕ， Ｈ．， ａｎｄ Ｇａｒｄｎｅｒ， Ｌ． （２０２０）． Ａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ ｄａｓｈｂｏａｒｄ ｔｏ ｔｒａｃｋ ＣＯＶＩＤ－１９ ｉｎ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ． Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． ２０（５）， ５３３－５３４。
Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ， Ａ．， Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ， Ｍ．Ｒ．， Ｂｕｒｓｔｅｉｎ， Ｄ．， Ｋｎｏｔｔ， Ｇ．Ｊ．， ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ， Ｊ．Ａ． （２０１７）． ＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｙ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｅｎｚｙｍｅｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． ６６（３）， ３７３－３８３ ｅ３７３。
Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ， Ａ．， Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ， Ｍ．Ｒ．， Ｋｎｉｇｈｔ， Ｓ．Ｃ．， Ｂｕｒｓｔｅｉｎ， Ｄ．， Ｃａｔｅ， Ｊ．Ｈ．， Ｔｊｉａｎ， Ｒ．， ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ， Ｊ．Ａ． （２０１６）． Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＲＮａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２ｃ２ ｅｎａｂｌｅ ｇｕｉｄｅ－ＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ． ５３８（７６２４）， ２７０－２７３。
Ｆｕｎｇ， Ｔ．Ｓ．， ａｎｄ Ｌｉｕ， Ｄ．Ｘ． （２０１９）． Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ： Ｈｏｓｔ－Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｍｉｃｒｏ－０２０５１８－１１５７５９． ＤＯＩ： １０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｍｉｃｒｏ－０２０５１８－１１５７５９。
Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｓ．， Ａｂｕｄａｙｙｅｈ， Ｏ．Ｏ．， Ｋｅｌｌｎｅｒ， Ｍ．Ｊ．， Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．， Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｊ．Ｊ．， ａｎｄ Ｚｈａｎｇ， Ｆ． （２０１８）． Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｎｄ ｐｏｒｔａｂｌｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｗｉｔｈ Ｃａｓ１３， Ｃａｓ１２ａ， ａｎｄ Ｃｓｍ６． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３６０（６３８７）， ４３９－４４４。
Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｓ．， Ａｂｕｄａｙｙｅｈ， Ｏ．Ｏ．， Ｌｅｅ， Ｊ．Ｗ．， Ｅｓｓｌｅｔｚｂｉｃｈｌｅｒ， Ｐ．， Ｄｙ， Ａ．Ｊ．， Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．， Ｖｅｒｄｉｎｅ， Ｖ．， Ｄｏｎｇｈｉａ， Ｎ．， Ｄａｒｉｎｇｅｒ， Ｎ．Ｍ．， Ｆｒｅｉｊｅ， Ｃ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３５６（６３３６）， ４３８－４４２。
Ｇｒｅｅｎ， Ｄ．Ａ．， ａｎｄ ＳｔＧｅｏｒｇｅ， Ｋ． （２０１８）． Ｒａｐｉｄ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ： Ｒａｔｉｏｎａｌｅ ａｎｄ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＦＤＡ Ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５６（１０）． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１８／０６／１５ ＤＯＩ： １０．１１２８／ＪＣＭ．００７１１－１８。
Ｇｕ Ｗ， Ｃｒａｗｆｏｒｄ ＥＤ， Ｏ’Ｄｏｎｏｖａｎ ＢＤ， Ｗｉｌｓｏｎ ＭＲ， Ｃｈｏｗ ＥＤ， Ｒｅｔａｌｌａｃｋ Ｈ， ＤｅＲｉｓｉ ＪＬ． Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ａｂｕｎｄａｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｙ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （ＤＡＳＨ）： ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ９ ｔｏ ｒｅｍｏｖｅ ｕｎｗａｎｔｅｄ ｈｉｇｈ－ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ＢｉｏＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ； ２０１６ Ｍａｒ ４；１７（１）：４１。
Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｍ， Ｋｌｅｉｎｅ－Ｗｅｂｅｒ Ｈ， Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ｓ， Ｋｒｕｅｇｅｒ Ｎ， Ｈｅｒｒｌｅｒ Ｔ， Ｅｒｉｃｈｓｅｎ Ｓ， Ｓｃｈｉｅｒｇｅｎｓ ＴＳ， Ｈｅｒｒｌｅｒ Ｇ， Ｗｕ Ｎ－Ｈ， Ｎｉｔｓｃｈｅ Ａ， Ｍｕｅｌｌｅｒ ＭＡ， Ｄｒｏｓｔｅｎ Ｃ， Ｐｏｅｈｌｍａｎｎ Ｓ． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｒｙ Ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ＡＣＥ２ ａｎｄ ＴＭＰＲＳＳ２ ａｎｄ Ｉｓ Ｂｌｏｃｋｅｄ ｂｙ ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ Ｐｒｏｖｅｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｃｅｌｌ． ２０２０ Ｍａｒ ４。
Ｈｏｕ， Ｔ．， Ｚｅｎｇ， Ｗ．， Ｙａｎｇ， Ｍ．， Ｃｈｅｎ， Ｗ．， Ｒｅｎ， Ｌ．， Ａｉ， Ｊ．， Ｗｕ， Ｊ．， Ｌｉａｏ， Ｙ．， Ｇｏｕ， Ｘ．， Ｌｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒａｐｉｄ ＣＲＩＳＰＲ－ｂａｓｅｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｆｏｒ ＣＯＶＩＤ－１９． ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ． １６（８）， ｅ１００８７０５． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０８／２８ ＤＯＩ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００８７０５。
Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．， Ｌａｄｈａ， Ａ．， Ｓａｉｔｏ， Ｍ．， Ｓｅｇｅｌ， Ｍ．， Ｂｒｕｎｅａｕ， Ｒ．， Ｈｕａｎｇ， Ｍ．Ｗ．， Ｋｉｍ， Ｎ．Ｇ．， Ｙｕ， Ｘ．， Ｌｉ， Ｊ．， Ｗａｌｋｅｒ， Ｂ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ＣＯＶＩＤ－１９ ｕｓｉｎｇ ＳＨＥＲＬＯＣＫ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ． ｍｅｄＲｘｉｖ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０６／０９ ＤＯＩ： １０．１１０１／２０２０．０５．０４．２００９１２３１。
Ｋａｍｇｎｏ Ｊ， Ｐｉｏｎ ＳＤ， Ｃｈｅｓｎａｉｓ ＣＢ， Ｂａｋａｌａｒ ＭＨ， Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏ ＭＶ， Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ＣＤ， Ｎａｎａ－Ｄｊｅｕｎｇａ ＨＣ， Ｇｏｕｎｏｕｅ－Ｋａｍｋｕｍｏ Ｒ， Ｎｊｉｔｃｈｏｕａｎｇ Ｇ－Ｒ， Ｎｗａｎｅ Ｐ， Ｔｃｈａｔｃｈｕｅｎｇ－Ｍｂｏｕｇａ ＪＢ， Ｗａｎｊｉ Ｓ， Ｓｔｏｌｋ ＷＡ， Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＤＡ， Ｋｌｉｏｎ ＡＤ， Ｎｕｔｍａｎ ＴＢ， Ｂｏｕｓｓｉｎｅｓｑ Ｍ． Ａ Ｔｅｓｔ－ａｎｄ－Ｎｏｔ－Ｔｒｅａｔ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃｉａｓｉｓ ｉｎ Ｌｏａ ｌｏａ－Ｅｎｄｅｍｉｃ Ａｒｅａｓ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１７ Ｎｏｖ ２３；３７７（２１）：２０４４－５２。
Ｋａｎｇ Ｈ， Ｆｅｎｇ Ｍ， Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＭＥ， Ｇｉｅｄｒｏｃ ＤＰ， Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ ＪＬ． Ｐｕｔａｔｉｖｅ ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐｓ ｉｎ ｔｈｅ ５’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｃａｎ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｍｏｕｓｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２００６ Ｎｏｖ；８０（２１）：１０６００－１４。
Ｌａ Ｓｃｏｌａ， Ｂ．， Ｌｅ Ｂｉｄｅａｕ， Ｍ．， Ａｎｄｒｅａｎｉ， Ｊ．， Ｈｏａｎｇ， Ｖ．Ｔ．， Ｇｒｉｍａｌｄｉｅｒ， Ｃ．， Ｃｏｌｓｏｎ， Ｐ．， Ｇａｕｔｒｅｔ， Ｐ．， ａｎｄ Ｒａｏｕｌｔ， Ｄ． （２０２０）． Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｓ ａ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｗａｒｄｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． ３９（６）， １０５９－１０６１． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０４／２９ ＤＯＩ： １０．１００７／ｓ１００９６－０２０－０３９１３－９。
Ｌａｒｒｅｍｏｒｅ， Ｄ．Ｂ．， Ｗｉｌｄｅｒ， Ｂ．， Ｌｅｓｔｅｒ， Ｅ．， Ｓｈｅｈａｔａ， Ｓ．， Ｂｕｒｋｅ， Ｊ．Ｍ．， Ｈａｙ， Ｊ．Ａ．， Ｔａｍｂｅ， Ｍ．， Ｍｉｎａ， Ｍ．Ｊ．， ａｎｄ Ｐａｒｋｅｒ， Ｒ． （２０２０）． Ｔｅｓｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｔｏ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｔｕｒｎａｒｏｕｎｄ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ＣＯＶＩＤ－１９ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ． ｍｅｄＲｘｉｖ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０７／０２ ＤＯＩ： １０．１１０１／２０２０．０６．２２．２０１３６３０９。
Ｌａｖｅｚｚｏ， Ｅ．， Ｆｒａｎｃｈｉｎ， Ｅ．， Ｃｉａｖａｒｅｌｌａ， Ｃ．， Ｃｕｏｍｏ－Ｄａｎｎｅｎｂｕｒｇ， Ｇ．， Ｂａｒｚｏｎ， Ｌ．， Ｖｅｃｃｈｉｏ， Ｃ．Ｄ．， Ｒｏｓｓｉ， Ｌ．， Ｍａｎｇａｎｅｌｌｉ， Ｒ．， Ｌｏｒｅｇｉａｎ， Ａ．， Ｎａｖａｒｉｎ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｔａｌｉａｎ ｍｕｎｉｃｉｐａｌｉｔｙ ｏｆ Ｖｏ’． Ｎａｔｕｒｅ． １－５． ＤＯＩ： ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２４８８－１。
ＬｅＤｕｃ， Ｊ．Ｗ．， ａｎｄ Ｂａｒｒｙ， Ｍ．Ａ． （２００４）． ＳＡＲＳ， ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｐａｎｄｅｍｉｃ ｏｆ ｔｈｅ ２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ１． Ｉｎ： Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ｐ． ｅ２６。
Ｌｅｅ， Ｓ．， Ｋｉｍ， Ｔ．， Ｌｅｅ， Ｅ．， Ｌｅｅ， Ｃ．， Ｋｉｍ， Ｈ．， Ｒｈｅｅ， Ｈ．， Ｐａｒｋ， Ｓ．Ｙ．， Ｓｏｎ， Ｈ．Ｊ．， Ｙｕ， Ｓ．， Ｐａｒｋ， Ｊ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｕｒｓｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒａｌ Ｓｈｅｄｄｉｎｇ Ａｍｏｎｇ Ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ． ＪＡＭＡ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０８／１２ ＤＯＩ： １０．１００１／ｊａｍａｉｎｔｅｒｎｍｅｄ．２０２０．３８６２。
Ｌｉｎ Ｒ， Ｓｋａｎｄａｒａｊａｈ Ａ， Ｇｅｒｖｅｒ ＲＥ， Ｎｅｉｒａ ＨＤ， Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＤＡ， Ｈｅｒｒ ＡＥ． Ａ ｌａｔｅｒａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｆｌｏｗ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｓｓａｙ． Ｌａｂ Ｃｈｉｐ． Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ； ２０１５ Ｍａｒ ２１；１５（６）：１４８８－９６。
Ｍａｎｆｒｅｄｏｎｉａ， Ｉ．， Ｎｉｔｈｉｎ， Ｃ．， Ｐｏｎｃｅ－Ｓａｌｖａｔｉｅｒｒａ， Ａ．， Ｇｈｏｓｈ， Ｐ．， Ｗｉｒｅｃｋｉ， Ｔ．Ｋ．， Ｍａｒｉｎｕｓ， Ｔ．， Ｏｇａｎｄｏ， Ｎ．Ｓ．， Ｓｎｉｄｅｒ， Ｅ．Ｊ．， Ｈｅｍｅｒｔ， Ｍ．Ｊ．ｖ．， Ｂｕｊｎｉｃｋｉ， Ｊ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ－ｒｅｌｅｖａｎｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． ＤＯＩ： １０．１１０１／２０２０．０６．１５．１５１６４７。
Ｍｙｈｒｖｏｌｄ， Ｃ．， Ｆｒｅｉｊｅ， Ｃ．Ａ．， Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｓ．， Ａｂｕｄａｙｙｅｈ， Ｏ．Ｏ．， Ｍｅｔｓｋｙ， Ｈ．Ｃ．， Ｄｕｒｂｉｎ， Ａ．Ｆ．， Ｋｅｌｌｎｅｒ， Ｍ．Ｊ．， Ｔａｎ， Ａ．Ｌ．， Ｐａｕｌ， Ｌ．Ｍ．， Ｐａｒｈａｍ， Ｌ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｆｉｅｌｄ－ｄｅｐｌｏｙａｂｌｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３６０（６３８７）， ４４４－４４８． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１８／０４／２８ ＤＯＩ： １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｓ８８３６。
Ｏｓｏｒｉｏ， Ｎ．Ｓ．， ａｎｄ Ｃｏｒｒｅｉａ－Ｎｅｖｅｓ， Ｍ． （２０２０）． Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＲＴ－ｑＰＣＲ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｓｓａｙｓ． Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０６／０１ ＤＯＩ： １０．１０１６／Ｓ１４７３－３０９９（２０）３０４３５－７。
Ｑｕｉｃｋｅ， Ｋ．， Ｇａｌｌｉｃｈｏｔｅ， Ｅ．， Ｓｅｘｔｏｎ， Ｎ．， Ｙｏｕｎｇ， Ｍ．， Ｊａｎｉｃｈ， Ａ．， Ｇａｈｍ， Ｇ．， Ｃａｒｌｔｏｎ， Ｅ．Ｊ．， Ｅｈｒｈａｒｔ， Ｎ．， ａｎｄ Ｅｂｅｌ， Ｇ．Ｄ． （２０２０）． Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｆｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ Ａｍｏｎｇ Ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ Ｓｔａｆｆ ｉｎ Ｆｉｖｅ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｋｉｌｌｅｄ Ｎｕｒｓｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ： Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ， Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ． ｍｅｄＲｘｉｖ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０６／２５ ＤＯＩ： １０．１１０１／２０２０．０６．０８．２０１２５９８９。
Ｒｉｃｈａｒｄ， Ｍ．， Ｋｏｋ， Ａ．， ｄｅ Ｍｅｕｌｄｅｒ， Ｄ．， Ｂｅｓｔｅｂｒｏｅｒ， Ｔ．Ｍ．， Ｌａｍｅｒｓ， Ｍ．Ｍ．， Ｏｋｂａ， Ｎ．Ｍ．Ａ．， Ｆｅｎｔｅｎｅｒ ｖａｎ Ｖｌｉｓｓｉｎｇｅｎ， Ｍ．， Ｒｏｃｋｘ， Ｂ．， Ｈａａｇｍａｎｓ， Ｂ．Ｌ．， Ｋｏｏｐｍａｎｓ， Ｍ．Ｐ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｓ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｖｉａ ｃｏｎｔａｃｔ ａｎｄ ｖｉａ ｔｈｅ ａｉｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ｆｅｒｒｅｔｓ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． １１（１）， ３４９６． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０７／１０ ＤＯＩ： １０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１７３６７－２。
Ｓａｎｄｅｒｓ， Ｗ．， Ｆｒｉｔｃｈ， Ｅ．Ｊ．， Ｍａｄｄｅｎ， Ｅ．Ａ．， Ｇｒａｈａｍ， Ｒ．Ｌ．， Ｖｉｎｃｅｎｔ， Ｈ．Ａ．， Ｈｅｉｓｅ， Ｍ．Ｔ．， Ｂａｒｉｃ， Ｒ．Ｓ．， ａｎｄ Ｍｏｏｒｍａｎ， Ｎ．Ｊ． （２０２０）． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ ＳＡＲＳ－ｌｉｋｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ． ｂｉｏＲｘｉｖ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０６／２７ ＤＯＩ： １０．１１０１／２０２０．０６．１５．１５３１９７。
Ｓｈａｒｆｓｔｅｉｎ ＪＭ， Ｂｅｃｋｅｒ ＳＪ， Ｍｅｌｌｏ ＭＭ． Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ． ＪＡＭＡ． ２０２０ Ｍａｒ ９。
Ｓｋａｎｄａｒａｊａｈ Ａ， Ｒｅｂｅｒ ＣＤ， Ｓｗｉｔｚ ＮＡ， Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＤＡ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈｏｎｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ． ２０１４；９（５）：ｅ９６９０６。
Ｓｍｉｔｈ ＺＪ， Ｃｈｕ Ｋ， Ｅｓｐｅｎｓｏｎ ＡＲ， Ｒａｈｉｍｚａｄｅｈ Ｍ， Ｇｒｙｓｈｕｋ Ａ， Ｍｏｌｉｎａｒｏ Ｍ， Ｄｗｙｒｅ ＤＭ， Ｌａｎｅ Ｓ， Ｍａｔｔｈｅｗｓ Ｄ， Ｗａｃｈｓｍａｎｎ－Ｈｏｇｉｕ Ｓ． Ｃｅｌｌ－ｐｈｏｎｅ－ｂａｓｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ． ２０１１ Ｍａｒ ２；６（３）：ｅ１７１５０。
Ｓｍｉｔｈ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｐｅｒｅｌｓｏｎ， Ａ．Ｓ． （２０１１）． Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ： ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄａｔａ ａｎｄ ｍｏｄｅｌｓ． Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ． ３（４）， ４２９－４４５． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１１／０１／０５ ＤＯＩ： １０．１００２／ｗｓｂｍ．１２９。
Ｖａｎａｅｒｓｃｈｏｔ， Ｍ．， Ｍａｎｎ， Ｓ．Ａ．， Ｗｅｂｂｅｒ， Ｊ．Ｔ．， Ｋａｍｍ， Ｊ．， Ｂｅｌｌ， Ｓ．Ｍ．， Ｂｅｌｌ， Ｊ．， Ｈｏｎｇ， Ｓ．Ｎ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｍ．Ｐ．， Ｃｈａｎ， Ｌ．Ｙ．， Ｂｈａｔｔ， Ｋ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ Ｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｔｈａｔ ａｄｖｅｒｓｅｌｙ ｉｍｐａｃｔｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｗｉｄｅｌｙ－ｕｓｅｄ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ． ｂｉｏＲｘｉｖ。
Ｖｏｇｅｌｓ， Ｃ．Ｂ．Ｆ．， Ｂｒｉｔｏ， Ａ．Ｆ．， Ｗｙｌｌｉｅ， Ａ．Ｌ．， Ｆａｕｖｅｒ， Ｊ．Ｒ．， Ｏｔｔ， Ｉ．Ｍ．， Ｋａｌｉｎｉｃｈ， Ｃ．Ｃ．， Ｐｅｔｒｏｎｅ， Ｍ．Ｅ．， Ｃａｓａｎｏｖａｓ－Ｍａｓｓａｎａ， Ａ．， Ｍｕｅｎｋｅｒ， Ｍ．Ｃ．， Ｍｏｏｒｅ， Ａ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ｑＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ－ｐｒｏｂｅ ｓｅｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． １－７． ＤＯＩ： ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５６４－０２０－０７６１－６。
Ｗａｎｇ， Ｃ．， Ｈｏｒｂｙ， Ｐ．Ｗ．， Ｈａｙｄｅｎ， Ｆ．Ｇ．， ａｎｄ Ｇａｏ， Ｇ．Ｆ． （２０２０）． Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｇｌｏｂａｌ ｈｅａｌｔｈ ｃｏｎｃｅｒｎ． Ｌａｎｃｅｔ． ３９５（１０２２３）， ４７０－４７３． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０１／２８ ＤＯＩ： １０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（２０）３０１８５－９。
Ｗａｎｇ， Ｗ．， Ｘｕ， Ｙ．， Ｇａｏ， Ｒ．， Ｌｕ， Ｒ．， Ｈａｎ， Ｋ．， Ｗｕ， Ｇ．， ａｎｄ Ｔａｎ， Ｗ． （２０２０）． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ． ＪＡＭＡ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０３／１２ ＤＯＩ： １０．１００１／ｊａｍａ．２０２０．３７８６。
Ｗａｎｇ Ｄ， Ｈｕ Ｂ， Ｈｕ Ｃ， Ｚｈｕ Ｆ， Ｌｉｕ Ｘ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ｗａｎｇ Ｂ， Ｘｉａｎｇ Ｈ， Ｃｈｅｎｇ Ｚ， Ｘｉｏｎｇ Ｙ， Ｚｈａｏ Ｙ， Ｌｉ Ｙ， Ｗａｎｇ Ｘ， Ｐｅｎｇ Ｚ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ １３８ Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ ２０１９ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｉｎ Ｗｕｈａｎ， Ｃｈｉｎａ． ＪＡＭＡ． ２０２０ Ｆｅｂ ７。
Ｗａｌｌｓ ＡＣ， Ｐａｒｋ Ｙ－Ｊ， Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉ ＭＡ， Ｗａｌｌ Ａ， ＭｃＧｕｉｒｅ ＡＴ， Ｖｅｅｓｌｅｒ Ｄ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃｅｌｌ． （Ｍａｒ． ６， ２０２０）。
Ｗｉｅｒｓｉｎｇａ， Ｗ．Ｊ．， Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｄ．ｏ．Ｍ．， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ＵＭＣ， ｌｏｃａｔｉｏｎ ＡＭＣ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ， Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （ＣＥＭＭ）， Ａ．Ｕ．， ｌｏｃａｔｉｏｎ ＡＭＣ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ， Ｒｈｏｄｅｓ， Ａ．， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｓ．Ｇ．ｓ．Ｕ．Ｈ．Ｆ．Ｔ．， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ， Ｃｈｅｎｇ， Ａ．Ｃ．， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｔ， Ａ．Ｈ．， Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｍ．Ｕ．， Ｍｏｎａｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ， Ｐｅａｃｏｃｋ， Ｓ．Ｊ．， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｐ．Ｈ．Ｅ．， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ， Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ （ＣＯＶＩＤ－１９）： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ． ＪＡＭＡ． ３２４（８）， ７８２－７９３． ＤＯＩ： １０．１００１／ｊａｍａ．２０２０．１２８３９。
Ｗｏｌｆｅｌ， Ｒ．， Ｃｏｒｍａｎ， Ｖ．Ｍ．， Ｇｕｇｇｅｍｏｓ， Ｗ．， Ｓｅｉｌｍａｉｅｒ， Ｍ．， Ｚａｎｇｅ， Ｓ．， Ｍｕｌｌｅｒ， Ｍ．Ａ．， Ｎｉｅｍｅｙｅｒ， Ｄ．， Ｊｏｎｅｓ， Ｔ．Ｃ．， Ｖｏｌｌｍａｒ， Ｐ．， Ｒｏｔｈｅ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－２０１９． Ｎａｔｕｒｅ． ５８１（７８０９）， ４６５－４６９。
Ｗｏｅｌｆｅｌ Ｒ， Ｃｏｒｍａｎ ＶＭ， Ｇｕｇｇｅｍｏｓ Ｗ， Ｓｅｉｌｍａｉｅｒ Ｍ， Ｚａｎｇｅ Ｓ， Ｍｕｅｌｌｅｒ ＭＡ， Ｎｉｅｍｅｙｅｒ Ｄ， Ｖｏｌｌｍａｒ Ｐ， Ｒｏｔｈｅ Ｃ， Ｈｏｅｌｓｃｈｅｒ Ｍ， Ｂｌｅｉｃｋｅｒ Ｔ， Ｂｒｕｅｎｉｎｋ Ｓ， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｊ， Ｅｈｍａｎｎ Ｒ， Ｚｗｉｒｇｌｍａｉｅｒ Ｋ， Ｄｒｏｓｔｅｎ Ｃ， Ｗｅｎｄｔｎｅｒ Ｃ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ ｉｎ ａ ｔｒａｖｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒ． ｍｅｄＲｘｉｖ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； ２０２０ Ｍａｒ ５：１－１６。
Ｗｏｏｄ， Ｃ．Ｓ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｍ．Ｒ．， Ｂｕｄｄ， Ｊ．， Ｍａｓｈａｍｂａ－Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｔ．Ｐ．， Ｈｅｒｂｓｔ， Ｋ．， Ｐｉｌｌａｙ， Ｄ．， Ｐｅｅｌｉｎｇ， Ｒ．Ｗ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ａ．Ｍ．， ＭｃＫｅｎｄｒｙ， Ｒ．Ａ．， ａｎｄ Ｓｔｅｖｅｎｓ， Ｍ．Ｍ． （２０１９）． Ｔａｋｉｎｇ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｍｏｂｉｌｅ－ｈｅａｌｔｈ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ． Ｎａｔｕｒｅ． ５６６（７７４５）， ４６７－４７４． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１９／０３／０１ ＤＯＩ： １０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－０９５６－２。
Ｗｕ Ｚ， ＭｃＧｏｏｇａｎ ＪＭ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｄ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｌｅｓｓｏｎｓ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ （ＣＯＶＩＤ－１９） Ｏｕｔｂｒｅａｋ ｉｎ Ｃｈｉｎａ： Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ａ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ７２３１４ Ｃａｓｅｓ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． ＪＡＭＡ． ２０２０ Ｆｅｂ ２４。
Ｙａｎ Ｒ， Ｚｈａｎｇ Ｙ， Ｌｉ Ｙ， Ｘｉａ Ｌ， Ｇｕｏ Ｙ， Ｚｈｏｕ Ｑ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｂｙ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０２０ Ｍａｒ ４；：ｅａｂｂ２７６２。
Ｙａｎｇ Ｄ， Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ ＪＬ． Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ３’ ａｎｄ ５’ ｅｎｄｓ． Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２０１５ Ａｕｇ ３；２０６：１２０－３３。
Ｙｏｕｎｇ ＢＥ， Ｏｎｇ ＳＷＸ， Ｋａｌｉｍｕｄｄｉｎ Ｓ， Ｌｏｗ ＪＧ， Ｔａｎ ＳＹ， Ｌｏｈ Ｊ， Ｎｇ ＯＴ， Ｍａｒｉｍｕｔｈｕ Ｋ， Ａｎｇ ＬＷ， Ｍａｋ ＴＭ， Ｌａｕ ＳＫ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＤＥ， Ｃｈａｎ ＫＳ， Ｔａｎ ＴＹ， Ｎｇ ＴＹ， Ｃｕｉ Ｌ， Ｓａｉｄ Ｚ， Ｋｕｒｕｐａｔｈａｍ Ｌ， Ｃｈｅｎ ＭＩ－Ｃ， Ｃｈａｎ Ｍ， Ｖａｓｏｏ Ｓ， Ｗａｎｇ Ｌ－Ｆ， Ｔａｎ ＢＨ， Ｌｉｎ ＲＴＰ， Ｌｅｅ ＶＪＭ， Ｌｅｏ ＹＳ， Ｌｙｅ ＤＣ， ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ ２０１９ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｏｕｔｂｒｅａｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅａｍ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｗｉｔｈ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ． ＪＡＭＡ． ２０２０ Ｍａｒ ３；：１－７。
Ｚａｐｐａ， Ａ．， Ａｍｅｎｄｏｌａ， Ａ．， Ｒｏｍａｎｏ， Ｌ．， ａｎｄ Ｚａｎｅｔｔｉ， Ａ． （２００９）． Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ａｎｄ ｒｅ－ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｒａ ｏｆ ｇｌｏｂａｌｉｓａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓ． ７（３）， １６７－１７１． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２００９／０８／０７ ＤＯＩ： １０．２４５０／２００９．００７６－０８。
Ｚｅｔｓｃｈｅ， Ｂ．， Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｓ．， Ａｂｕｄａｙｙｅｈ， Ｏ．Ｏ．， Ｓｌａｙｍａｋｅｒ， Ｉ．Ｍ．， Ｍａｋａｒｏｖａ， Ｋ．Ｓ．， Ｅｓｓｌｅｔｚｂｉｃｈｌｅｒ， Ｐ．， Ｖｏｌｚ， Ｓ．Ｅ．， Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｏｏｓｔ， Ｊ．， Ｒｅｇｅｖ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｃｐｆ１ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｃｅｌｌ． １６３（３）， ７５９－７７１． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１５／１０／０１ ＤＯＩ： １０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０９．０３８。
Ｚｈａｎｇ Ｆ， Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ＯＯ， Ｊｏｎａｔｈａｎ ＳＧ． Ａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ。
Ｚｈｕ， Ｎ．， Ｚｈａｎｇ， Ｄ．， Ｗａｎｇ， Ｗ．， Ｌｉ， Ｘ．， Ｙａｎｇ， Ｂ．， Ｓｏｎｇ， Ｊ．， Ｚｈａｏ， Ｘ．， Ｈｕａｎｇ， Ｂ．， Ｓｈｉ， Ｗ．， Ｌｕ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｉｎ Ｃｈｉｎａ， ２０１９． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３８２（８）， ７２７－７３３． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０２０／０１／２５ ＤＯＩ： １０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ２００１０１７。
Ｚｏｕ Ｌ， Ｒｕａｎ Ｆ， Ｈｕａｎｇ Ｍ， Ｌｉａｎｇ Ｌ， Ｈｕａｎｇ Ｈ， Ｈｏｎｇ Ｚ， Ｙｕ Ｊ， Ｋａｎｇ Ｍ， Ｓｏｎｇ Ｙ， Ｘｉａ Ｊ， Ｇｕｏ Ｑ， Ｓｏｎｇ Ｔ， Ｈｅ Ｊ， Ｙｅｎ Ｈ－Ｌ， Ｐｅｉｒｉｓ Ｍ， Ｗｕ Ｊ． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｖｉｒａｌ Ｌｏａｄ ｉｎ Ｕｐｐｅｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０２０ Ｆｅｂ １９。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、あたかも個別の参照によって本明細書に組み込まれるのと同じ範囲で、それらの全体が明示的に本明細書に援用される。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先する。
以下の付記は、本明細書に記載される本発明の核酸および方法の幾つかの態様の要約を提供する。
付記：
１． （ａ）ＲＮＡを含有することが疑われるサンプルを、Ｃａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、およびレポータＲＮＡと、少なくとも１つのＲＮＡ切断産物が形成されるために十分な時間にわたりインキュベートする工程、ならびに
（ｂ）任意のＲＮＡ切断産物レベルをディテクターで検出する工程
を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の存在または不存在を診断するための方法。
付記：
１． （ａ）ＲＮＡを含有することが疑われるサンプルを、Ｃａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、およびレポータＲＮＡと、少なくとも１つのＲＮＡ切断産物が形成されるために十分な時間にわたりインキュベートする工程、ならびに
（ｂ）任意のＲＮＡ切断産物レベルをディテクターで検出する工程
を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の存在または不存在を診断するための方法。
２． ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルが、溶解した生体サンプルである、陳述１に記載の方法。
３． ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルが、溶解した生体サンプルから抽出されたＲＮＡである、陳述１または２に記載の方法。
３． ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルが、溶解した生体サンプルから抽出されたＲＮＡである、陳述１または２に記載の方法。
４． リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するためにＣａｓ１３タンパク質および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）がプレインキュベートされ、また、ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルが該リボヌクレオタンパク質複合体に添加される、陳述１～３のいずれか１項に記載の方法。
５． 前記レポータＲＮＡの切断によって、光シグナル（例えば、蛍光または検出可能な色素）、電子的シグナル、電気化学的シグナル、静電気的シグナル、立体的シグナル、ファンデルワールス相互作用シグナル、水和シグナル、共鳴周波数シフトシグナル、またはこれらの組み合わせが生じる、陳述１～４のいずれか１項に記載の方法。
６． 前記レポータＲＮＡが固体表面に付着している、陳述１～５のいずれか１項に記載の方法。
７． 前記レポータＲＮＡが固体表面に付着していない（例えば、固体表面に共有結合していない）、陳述１～５のいずれか１項に記載の方法。
７． 前記レポータＲＮＡが固体表面に付着していない（例えば、固体表面に共有結合していない）、陳述１～５のいずれか１項に記載の方法。
８． 前記レポータＲＮＡのレポータが、少なくとも１つのフルオロフォアおよび少なくとも１つの蛍光クエンチャーを含む、陳述１～７のいずれか１項に記載の方法。
９． 少なくとも１つのフルオロフォアが、アレクサ（Ａｌｅｘａ）４３０、ＳＴＡＲ ５２０、ブリリアントバイオレット５１０、ブリリアントバイオレット６０５、ブリリアントバイオレット６１０、またはこれらの組み合わせである、陳述８に記載の方法。
９． 少なくとも１つのフルオロフォアが、アレクサ（Ａｌｅｘａ）４３０、ＳＴＡＲ ５２０、ブリリアントバイオレット５１０、ブリリアントバイオレット６０５、ブリリアントバイオレット６１０、またはこれらの組み合わせである、陳述８に記載の方法。
１０． ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプル中のＲＮＡおよび／または前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ切断産物が増幅されない、陳述１～９のいずれか１項に記載の方法。
１１． ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプル中のＲＮＡおよび／または前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ切断産物が、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｑβレプリカーゼ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ポリメラーゼ、またはこれらの組み合わせを使用して増幅される、陳述１～９のいずれか１項に記載の方法。
１２． ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルをインキュベートする工程の前に、Ｃａｓ１３タンパク質および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を各々が含むウェルを含むアレイにおいて行われる、陳述１～１１のいずれか１項に記載の方法。
１３． 液滴アッセイにおいて行われる、陳述１～１２のいずれか１項に記載の方法。
１４． ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルが、唾液、喀痰、粘液、鼻咽頭材料、血液、血清、血漿、尿、吸引液、生検組織、またはこれらの組み合わせである、陳述１～１３のいずれか１項に記載の方法。
１４． ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルが、唾液、喀痰、粘液、鼻咽頭材料、血液、血清、血漿、尿、吸引液、生検組織、またはこれらの組み合わせである、陳述１～１３のいずれか１項に記載の方法。
１５． 前記ディテクターが、光ディテクター、蛍光ディテクター、カラーフィルタ、電子的ディテクター、電気化学的シグナルディテクター、静電気的シグナルディテクター、立体的シグナルディテクター、ファンデルワールス相互作用シグナルディテクター、水和シグナルディテクター、共鳴周波数シフトシグナルディテクター、または組み合わせを含む、陳述１～１４のいずれか１項に記載の方法。
１６． 前記ディテクターが蛍光ディテクターである、陳述１～１５のいずれか１項に記載の方法。
１７． 前記ディテクターが、短鎖クエンチ型蛍光ＲＮＡディテクター、または全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）ディテクターである、陳述１～１６のいずれか１項に記載の方法。
１７． 前記ディテクターが、短鎖クエンチ型蛍光ＲＮＡディテクター、または全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）ディテクターである、陳述１～１６のいずれか１項に記載の方法。
１８． 前記ディテクターが可動装置である、陳述１～１７のいずれか１項に記載の方法。
１９． 前記サンプルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在または不存在を、ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルを提供した対象に、１人または複数人の医療関係者に、１つまたは複数の政府当局に、データベースに、またはこれらの組み合わせに報告する工程をさらに含む、陳述１～１８のいずれか１項に記載の方法。
１９． 前記サンプルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在または不存在を、ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルを提供した対象に、１人または複数人の医療関係者に、１つまたは複数の政府当局に、データベースに、またはこれらの組み合わせに報告する工程をさらに含む、陳述１～１８のいずれか１項に記載の方法。
２０． ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルを提供した前記対象の位置を、１人または複数人の医療関係者に、１つまたは複数の政府当局に、データベースに、またはこれらの組み合わせに報告する工程をさらに含む、陳述１～１９のいずれか１項に記載の方法。
２１． 前記ｃｒＲＮＡの少なくとも１つが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡに相補的なセグメントを含む、陳述１～２０のいずれか１項に記載の方法。
２２． 前記ｃｒＲＮＡの少なくとも１つが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡに相補的でないセグメントを含む、陳述１～２１のいずれか１項に記載の方法。
２２． 前記ｃｒＲＮＡの少なくとも１つが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡに相補的でないセグメントを含む、陳述１～２１のいずれか１項に記載の方法。
２３． 前記ｃｒＲＮＡの少なくとも１つが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡに相補的なセグメントおよびスペーサ配列を含む、陳述１～２２のいずれか１項に記載の方法。
２４． 前記少なくとも１つのｃｒＲＮＡが、配列番号１～３５のいずれか１つを含む、陳述１～２３のいずれか１項に記載の方法。
２４． 前記少なくとも１つのｃｒＲＮＡが、配列番号１～３５のいずれか１つを含む、陳述１～２３のいずれか１項に記載の方法。
２５． 前記少なくとも１つのｃｒＲＮＡが、配列番号２、３、４、７、８、９、１４、２３、またはこれらの組み合わせのいずれかに対応する配列を有するセグメントであるか、またはこれを有する、陳述１～２４のいずれか１項に記載の方法。
２６． 前記少なくとも１つのｃｒＲＮＡが、配列番号２７～３４のいずれかに対応する配列を有するセグメントであるか、またはこれを有する、陳述１～２５のいずれか１項に記載の方法。
２７． 前記少なくとも１つのｃｒＲＮＡが、表５に示すｃｒＲＮＡ配列のいずれかに対応する配列（配列番号５８～１４７）を含むセグメントを有する、陳述１～２６のいずれか１項に記載の方法。
２８． 前記サンプルが、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれを超えるｃｒＲＮＡとインキュベートされる、陳述１～２７のいずれか１項に記載の方法。
２９． 検出工程の前に、前記サンプルの一部を枯渇させる工程をさらに含む、陳述１～２８のいずれか１項に記載の方法。
３０． 前記サンプルの前記部分が、核酸またはタンパク質である、陳述２９に記載の方法。
３０． 前記サンプルの前記部分が、核酸またはタンパク質である、陳述２９に記載の方法。
３１． ＲＮａｓｅを前記サンプルから除去する工程をさらに含む、陳述１～３０のいずれか１項に記載の方法。
３２． Ｃａｓ１３タンパク質と共にＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルが、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む（例えば、回収後に添加される）、陳述１～３１のいずれか１項に記載の方法。
３２． Ｃａｓ１３タンパク質と共にＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルが、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む（例えば、回収後に添加される）、陳述１～３１のいずれか１項に記載の方法。
３３． 前記Ｃａｓ１３タンパク質および／またはｃｒＲＮＡが、前記サンプルとのインキュベーションの前に凍結乾燥される、陳述１～３２のいずれか１項に記載の方法。
３４． 前記Ｃａｓ１３タンパク質が、Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質である、陳述１～３３のいずれか１項に記載の方法。
３４． 前記Ｃａｓ１３タンパク質が、Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質である、陳述１～３３のいずれか１項に記載の方法。
３５． ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの濃度を定量する工程をさらに含む、陳述１～３４のいずれか１項に記載の方法。
３６． 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの濃度または量が、既知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの濃度または量に対するＲＮＡレポータシグナルの標準曲線を使用して決定される、陳述１～３５のいずれか１項に記載の方法。
３６． 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの濃度または量が、既知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの濃度または量に対するＲＮＡレポータシグナルの標準曲線を使用して決定される、陳述１～３５のいずれか１項に記載の方法。
３７． 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの濃度または量が、コントロールシグナルの勾配に対する、検出されたシグナルの勾配の比率を使用して決定される、陳述１～３６のいずれか１項に記載の方法。
３８． 検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、サンプル１μｌ当たり少なくとも２つのコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、サンプル１μｌ当たり少なくとも５つのコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１μｌ当たり少なくとも１０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１μｌ当たり少なくとも２０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１μｌ当たり少なくとも３０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１μｌ当たり少なくとも４０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１μｌ当たり少なくとも５０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、陳述１～３７のいずれか１項に記載の方法。
３９． 検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、サンプル１ｍｌ当たり少なくとも２つのコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、サンプル１ｍｌ当たり少なくとも５個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１ｍｌ当たり少なくとも１０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１ｍｌ当たり少なくとも２０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１ｍｌ当たり少なくとも３０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１ｍｌ当たり少なくとも４０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１ｍｌ当たり少なくとも５０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、陳述１～３８のいずれか１項に記載の方法。
４０． アトモル濃度およびゼプトモル濃度の感度を有する、陳述１～３９のいずれか１項に記載の方法。
４１． 検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを有するサンプルで患者を処置する工程をさらに含む、陳述１～４０のいずれか１項に記載の方法。
４１． 検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを有するサンプルで患者を処置する工程をさらに含む、陳述１～４０のいずれか１項に記載の方法。
４２． 陳述１～４１のいずれか１項に記載の方法によって検出された検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有する対象を処置する工程を含む方法。
４３． （ａ）前記患者から得たＲＮＡサンプルとＣａｓ１３タンパク質とを含む反応混合物、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および少なくとも１つのＲＮＡレポータを、少なくとも１つのＲＮＡ切断産物が形成されるために十分な時間にわたりインキュベートする工程、
（ｂ）前記混合物中の全てのＲＮＡ切断産物のレベルをディテクターで検出する工程、ならびに
（ｃ）前記サンプル中に検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有する対象を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２療法で処置する工程
を含む、陳述４２に記載の方法。
４３． （ａ）前記患者から得たＲＮＡサンプルとＣａｓ１３タンパク質とを含む反応混合物、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および少なくとも１つのＲＮＡレポータを、少なくとも１つのＲＮＡ切断産物が形成されるために十分な時間にわたりインキュベートする工程、
（ｂ）前記混合物中の全てのＲＮＡ切断産物のレベルをディテクターで検出する工程、ならびに
（ｃ）前記サンプル中に検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有する対象を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２療法で処置する工程
を含む、陳述４２に記載の方法。
４４． 検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、サンプル１μｌ当たり少なくとも２つのコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、サンプル１μｌ当たり少なくとも５つのコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１μｌ当たり少なくとも１０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１μｌ当たり少なくとも２０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１μｌ当たり少なくとも３０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１μｌ当たり少なくとも４０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１μｌ当たり少なくとも５０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、陳述４３に記載の方法。
４５． 検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、サンプル１ｍｌ当たり少なくとも２つのコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、サンプル１ｍｌ当たり少なくとも５つのコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１ｍｌ当たり少なくとも１０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１ｍｌ当たり少なくとも２０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１ｍｌ当たり少なくとも３０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１ｍｌ当たり少なくとも４０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはサンプル１ｍｌ当たり少なくとも５０個のコピーのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、陳述４３に記載の方法。
４６． 処置が、１つまたは複数の抗ウイルス剤、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）、抗ウイルス抗体療法、呼吸の補助、炎症を低減させるためのステロイド、肺炎症を低減させるためのステロイド、血漿の輸血、またはこれらの組み合わせを前記対象に投与する工程を含む、陳述４３～４５のいずれか１項に記載の方法。
４７． 前記反応混合物が、少なくとも２つの、または少なくとも３つの、または少なくとも４つの、または少なくとも５つの、または少なくとも６つの、または少なくとも７つの、または少なくとも８つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む、陳述４３～４６のいずれか１項に記載の方法。
４８． 前記溶解バッファーが、８５℃以上で５分間の加熱を伴うＰＢＳ＋１％Ｔｗｅｅｎ－２０であるかまたはこれを含む、陳述１～４７のいずれか１項に記載の方法。
４９． 前記バッファーが、約７．２のｐＨである（または約６．０～８．０のｐＨ範囲である）、陳述１～４８のいずれか１項に記載の方法。
４９． 前記バッファーが、約７．２のｐＨである（または約６．０～８．０のｐＨ範囲である）、陳述１～４８のいずれか１項に記載の方法。
５０． Ｎ遺伝子を標的化する２つのガイド（ｃｒＲＮＡ＿２およびｃｒＲＮＡ＿４）ならびにＥ遺伝子を標的化する１つのガイド（ｃｒＲＮＡ＿２１）が共に複合体化されている（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの検出において使用するために）、陳述１～４９のいずれか１項に記載の方法。
５１． 前記ガイドの長さが、約３０ヌクレオチド（ｎｔ）および３２ｎｔのステム長である（全部で５０または５２ｎｔである）、陳述１～５０のいずれか１項に記載の方法。
５２． バックグラウンドシグナルが、切断されたおよび切断されていないプローブのサイズベースの分離で低減する、陳述１～５１のいずれか１項に記載の方法。
５３． 反応シグナルの増大が、前記切断されたプローブのビーズベースの濃度で達成される、陳述１～５２のいずれか１項に記載の方法。
５３． 反応シグナルの増大が、前記切断されたプローブのビーズベースの濃度で達成される、陳述１～５２のいずれか１項に記載の方法。
５４． 反応シグナルの増大が、多分散液滴を使用する小さな体積での反応シグナルの液滴ベースの濃度で達成される、陳述１～５３のいずれか１項に記載の方法。
５５． ＳＡＲＳ－ＶｏＶ－２の検出がガイド特異的である、陳述１～５４のいずれか１項に記載の方法。
５５． ＳＡＲＳ－ＶｏＶ－２の検出がガイド特異的である、陳述１～５４のいずれか１項に記載の方法。
５６． アッセイが、単一のガイドを用いて行われる、陳述１～５５のいずれか１項に記載の方法。
５７． 前記アッセイが、複数のガイド／ガイドの組み合わせを用いて行われる、陳述１～５６のいずれか１項に記載の方法。
５７． 前記アッセイが、複数のガイド／ガイドの組み合わせを用いて行われる、陳述１～５６のいずれか１項に記載の方法。
５８． 少なくとも１つのＣａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、少なくとも１つのレポータＲＮＡ、ならびに（例えば、陳述１～３５のいずれか１項に記載の方法に従って）サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出および／または定量するための指示を含むパッケージを含むキットであって、該ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの各々が、配列番号１～３５のいずれか１つ（例えば、配列番号１～１５、２３、または３５のいずれか）に対して少なくとも７０％の配列同一性、または表５に示す該ｃｒＲＮＡ配列（配列番号５８～１４７）のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有し得る、キット。
５９． 前記レポータＲＮＡが、フルオロフォア、蛍光クエンチャー、検出可能な色素、電気化学的部分、荷電した部分、立体的に妨げられる部分、立体的に妨げられる立体構造、またはこれらの組み合わせを含む、陳述５８に記載のキット。
６０． 前記レポータＲＮＡが切断されると、光シグナル（例えば、蛍光または検出可能な色素）、電子的シグナル、電気化学的シグナル、静電気的シグナル、立体的シグナル、ファンデルワールス相互作用シグナル、水和シグナル、共鳴周波数シフトシグナル、またはこれらの組み合わせが生じる、陳述５８または５９に記載のキット。
６１． 前記レポータＲＮＡが、少なくとも１つの、少なくとも２つの、または少なくとも３つの短鎖クエンチ型蛍光ＲＮＡレポータである、陳述５８～６０のいずれか１項に記載のキット。
６２． 少なくとも１つのフルオロフォアが、アレクサ（Ａｌｅｘａ）４３０、ＳＴＡＲ ５２０、ブリリアントバイオレット５１０、ブリリアントバイオレット６０５、ブリリアントバイオレット６１０、またはこれらの組み合わせである、陳述５９～６１のいずれか１項に記載のキット。
６３． ヌクレアーゼを含有しない水、ＲＮａｓｅ、溶液のｐＨを調整するためのバッファー、反応容器、患者からサンプルを回収するための１つまたは複数の道具をさらに含む、陳述５８～６２のいずれか１項に記載のキット。
６４． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を処置するための治療剤をさらに含む、陳述５８～６３のいずれか１項に記載のキット。
６５． 前記サンプルを回収するための構成要素をさらに含む、陳述５８～６４のいずれか１項に記載のキット。
６５． 前記サンプルを回収するための構成要素をさらに含む、陳述５８～６４のいずれか１項に記載のキット。
６６． 前記サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを報告するための構成要素または指示をさらに含む、陳述５８～６５のいずれか１項に記載のキット。
６７． 蛍光を検出するためのハードウェアをさらに含む、陳述５８～６６のいずれか１項に記載のキット。
６７． 蛍光を検出するためのハードウェアをさらに含む、陳述５８～６６のいずれか１項に記載のキット。
６８． 前記ハードウェアが、可動装置、反応チャンバ、励起源、励起フィルター、またはこれらの組み合わせを含む、陳述６７に記載のキット。
６９． 蛍光シグナルを評価するためのソフトウェア、前記サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを報告するためのソフトウェア、またはこれらの組み合わせをさらに含む、陳述５８～６８のいずれか１項に記載のキット。
６９． 蛍光シグナルを評価するためのソフトウェア、前記サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを報告するためのソフトウェア、またはこれらの組み合わせをさらに含む、陳述５８～６８のいずれか１項に記載のキット。
７０． 配列番号１～３５のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む配列、または表５に示す前記ｃｒＲＮＡ配列（配列番号５８～１４７）のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む配列を含む１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含む組成物。
７１． 少なくとも１つのＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質をさらに含む、陳述７０に記載の組成物。
７２． 少なくとも１つのレポータＲＮＡをさらに含む、陳述７０または７１に記載の組成物。
７２． 少なくとも１つのレポータＲＮＡをさらに含む、陳述７０または７１に記載の組成物。
７３． 前記１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡが少なくとも１つのＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質と複合体を形成するように製剤された、陳述７０～７２のいずれか１項に記載の組成物。
７４． 前記１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡが、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ、バリアントＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ、または突然変異体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡのセグメントに相補的である、陳述７０～７３のいずれか１項に記載の組成物。
７５． サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出および／または定量するためのシステムであって、
第１の周波数の光シグナルを使用して該サンプルを励起させるためのシグナル生成システム、
該サンプル中の蛍光を検出するためのカメラシステム、および
該蛍光に基づいて該サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出するための処理回路
を含む、システム。
第１の周波数の光シグナルを使用して該サンプルを励起させるためのシグナル生成システム、
該サンプル中の蛍光を検出するためのカメラシステム、および
該蛍光に基づいて該サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出するための処理回路
を含む、システム。
７６． 前記カメラシステムが可動装置内に含まれる（１実施形態では、該可動装置は電話であり、１実施形態では、該電話はカメラを有しており、別の実施形態では、顕微鏡が該カメラと共に使用される）、陳述７５に記載のシステム。
７７． 通信インターフェイスをさらに含み、前記処理回路が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡが前記サンプルにおいて検出されたかどうかの指定を該通信インターフェイスを通して提供するように構成された、陳述７５または７６に記載のシステム。
７８． 前記カメラシステムが相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサーを含む、陳述７５～７７のいずれか１項に記載のシステム。
７９． 前記センサーが少なくとも１色のカラーフィルタを含む、陳述７８に記載のシステム。
７９． 前記センサーが少なくとも１色のカラーフィルタを含む、陳述７８に記載のシステム。
８０． 前記カラーフィルタが、パターンになっている交互のピクセルの上を覆って位置している、陳述７８に記載のシステム。
８１． リファレンスカンチレバーおよびセンサーカンチレバーを含む、カンチレバーセンサーアセンブリ、
該カンチレバーセンサーアセンブリに結びつけられ、該センサーカンチレバーへの分子の結合によって生じる該センサーカンチレバーの共鳴周波数のシフトを検出するように構成された、回路
を含む、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出および／または定量するためのシステム。
８１． リファレンスカンチレバーおよびセンサーカンチレバーを含む、カンチレバーセンサーアセンブリ、
該カンチレバーセンサーアセンブリに結びつけられ、該センサーカンチレバーへの分子の結合によって生じる該センサーカンチレバーの共鳴周波数のシフトを検出するように構成された、回路
を含む、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出および／または定量するためのシステム。
８２． 前記分子の結合によって前記センサーカンチレバーの剛性が変化する、陳述８１に記載のシステム。
８３． 前記センサーカンチレバーがダイアモンドを含む、陳述８２に記載のシステム。
８３． 前記センサーカンチレバーがダイアモンドを含む、陳述８２に記載のシステム。
８４． 通信インターフェイスをさらに含み、前記処理回路が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡが前記サンプルにおいて検出されたかどうかの指定を該通信インターフェイスを通して提供するように構成された、陳述８１～８３のいずれか１項に記載のシステム。
８５． 前記回路が干渉装置を含む、陳述８１～８４のいずれか１項に記載のシステム。
本発明を上記の実施形態と併せて記載してきたが、先の記載および実施例は説明を意図したものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および本発明の範囲内の修正は、本発明が関連する技術分野の当業者には自明であろう。
本発明を上記の実施形態と併せて記載してきたが、先の記載および実施例は説明を意図したものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および本発明の範囲内の修正は、本発明が関連する技術分野の当業者には自明であろう。
いかなる状況下でも、本特許は、本明細書において具体的に開示されている特定の実施例または実施形態または方法に限定されると解釈されない。いかなる状況下でも、本特許は、特許庁のいずれかの審査官またはあらゆる他の公務員もしくは従業員による何らかの陳述が出願人による応答書類において具体的にかつ無制限または無条件に明示的に採用されていない限り、このような陳述によって限定されると解釈されない。
加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュグループの形式で記載されている場合、当業者は、これによって本発明がマーカッシュグループの全ての個々のメンバーまたはサブグループメンバーに関しても記載されていることを認識であろう。
Claims (77)
- （ａ）１つまたは複数のＣａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および少なくとも１つのレポータＲＮＡと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプルとを、少なくとも１つのＲＮＡ切断産物が形成されるために十分な時間にわたりインキュベートする工程、ならびに
（ｂ）レポータＲＮＡ切断産物をディテクターで検出する工程
を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の存在または不存在を診断するための方法。 - 前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡに結合する、請求項１に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が、バリアントまたは突然変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡに結合する、請求項１に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が、配列番号１～３５、５８～１４６、または１４７のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列セグメントを有する、請求項１に記載の方法。
- 複数の前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）のうちの少なくとも１つが、配列番号１～３５、５８～１４６、または１４７の配列の１つを有する、請求項１に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が、少なくとも２つの、または少なくとも３つの、または少なくとも８つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
- 前記Ｃａｓ１３タンパク質、前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および前記レポータＲＮＡと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルとを、インキュベートする前に、該Ｃａｓ１３タンパク質が少なくともＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と複合体化される、請求項１に記載の方法。
- 前記Ｃａｓ１３タンパク質の１つまたは複数が、Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質である、請求項１に記載の方法。
- 前記Ｃａｓ１３タンパク質の１つまたは複数が、配列番号３６～４８のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を有する、請求項１に記載の方法。
- 前記Ｃａｓ１３タンパク質の１つまたは複数が、配列番号３６～４８のいずれか１つを有する、請求項１に記載の方法。
- 前記Ｃａｓ１３タンパク質の１つまたは複数が、配列番号４３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、該Ｃａｓ１３タンパク質が４３６位にリジンを有する、請求項１に記載の方法。
- 前記Ｃａｓ１３タンパク質が配列番号４３を有する、請求項１に記載の方法。
- ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルが、唾液、喀痰、粘液、鼻咽頭材料、血液、血清、血漿、尿、吸引液、生検組織、またはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
- ＲＮＡを含有することが疑われる前記サンプルが、溶解した生体サンプルである、請求項１に記載の方法。
- 前記レポータＲＮＡの切断が、光シグナル、電子的シグナル、電気化学的シグナル、静電気的シグナル、立体的シグナル、ファンデルワールス相互作用シグナル、水和シグナル、共鳴周波数シフトシグナル、またはこれらの組み合わせを生じさせる、請求項１に記載の方法。
- 前記レポータＲＮＡのレポータが、少なくとも１つのフルオロフォアおよび少なくとも１つの蛍光クエンチャーを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのフルオロフォアが、アレクサ（Ａｌｅｘａ）４３０、ＳＴＡＲ ５２０、ブリリアントバイオレット５１０、ブリリアントバイオレット６０５、ブリリアントバイオレット６１０、またはこれらの組み合わせである、請求項１６に記載の方法。
- 前記ディテクターが、光ディテクター、蛍光ディテクター、カラーフィルタ、電子的ディテクター、電気化学的シグナルディテクター、静電気的シグナルディテクター、立体的シグナルディテクター、ファンデルワールス相互作用シグナルディテクター、水和シグナルディテクター、共鳴周波数シフトシグナルディテクター、または組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記レポータＲＮＡ切断産物からのシグナルがコントロールアッセイのシグナルと区別可能である場合に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡが検出される、請求項１に記載の方法。
- 前記コントロールアッセイが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＲＮＡを含有しない、請求項１９に記載の方法。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡが請求項１に記載の方法によって検出された対象を処置する工程を含む方法。
- 処置が、抗ウイルス療法、抗レトロウイルス療法、呼吸の補助、ステロイド、血漿の輸血、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、またはこれらの組み合わせを前記対象に投与する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
- 少なくとも１つのＣａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、少なくとも１つのレポータＲＮＡ、ならびにサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出および／または定量するための指示を含むパッケージを含むキット。
- 前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が、配列番号１～３５、５８～１４６、または１４７のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する、請求項２３に記載のキット。
- 複数の前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）のうちの少なくとも１つが、配列番号１～３５、５８～１４６、または１４７の配列を有する、請求項２３に記載のキット。
- 少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が、少なくとも２つの、または少なくとも３つの、または少なくとも８つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である、請求項２３に記載のキット。
- 前記Ｃａｓ１３タンパク質が前記少なくともＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と複合体化される、請求項２３に記載のキット。
- 前記Ｃａｓ１３タンパク質が、Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質である、請求項２３に記載のキット。
- 前記Ｃａｓ１３タンパク質の少なくとも１つが、配列番号３６～４８のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を有する、請求項２３に記載のキット。
- 前記Ｃａｓ１３タンパク質の少なくとも１つが、配列番号４３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、該Ｃａｓ１３タンパク質が４３６位にリジンを有する、請求項２３に記載のキット。
- 前記Ｃａｓ１３タンパク質の少なくとも１つが、配列番号３６～４８のタンパク質配列の１つを有する、請求項２３に記載のキット。
- 前記レポータＲＮＡのレポータが、少なくとも１つのフルオロフォアおよび少なくとも１つの蛍光クエンチャーを含む、請求項２３に記載のキット。
- 前記少なくとも１つのフルオロフォアが、アレクサ（Ａｌｅｘａ）４３０、ＳＴＡＲ ５２０、ブリリアントバイオレット５１０、ブリリアントバイオレット６０５、ブリリアントバイオレット６１０、またはこれらの組み合わせである、請求項２３に記載のキット。
- サンプルチャンバ、アッセイ混合物反応チャンバ、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項２３に記載のキット。
- ディテクターをさらに含む、請求項２３に記載のキット。
- サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出および／または定量するためのシステムであって、
第１の周波数のシグナルを使用して該サンプルを励起させるためのシグナル生成システム、
該サンプル中の蛍光を検出するためのカメラシステム、および
該蛍光に基づいて該サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出するための処理回路
を含むシステム。 - 配列番号１～３５、５８～１４６、または１４７のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をさらに含む、請求項３６に記載のシステム。
- 配列番号１～３５、５８～１４６、または１４７の配列の１つを含むＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の少なくとも１つをさらに含む、請求項３６に記載のシステム。
- 少なくとも１つのＣａｓ１３タンパク質をさらに含む、請求項３６に記載のシステム。
- 配列番号３６～４８のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を有する少なくとも１つのＣａｓ１３タンパク質をさらに含む、請求項３６に記載のシステム。
- 配列番号４３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する前記Ｃａｓ１３タンパク質の少なくとも１つをさらに含み、該Ｃａｓ１３タンパク質が４３６位にリジンを有する、請求項３６に記載のシステム。
- システム筐体、
該システム筐体内の、励起照明を生じさせるように構成された励起源、
１つまたは複数のサンプルをその中に保持するように構成された１つまたは複数のカートリッジチャンバを有するサンプルカートリッジ、
該サンプルカートリッジを受けるように構成されたカートリッジソケット
を含む、蛍光イメージングシステムであって、
該カートリッジソケットが該サンプルカートリッジを受けることで、該１つまたは複数のカートリッジチャンバが励起方向および観察方向にされ、
該励起方向では、該カートリッジチャンバは該励起源の該励起照明と整列しており、また
該観察方向では、該カートリッジチャンバおよび該カートリッジチャンバからの蛍光は光学センサーに向けられている、
蛍光イメージングシステム。 - 前記サンプルカートリッジが、少なくとも１つのＣａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、少なくとも１つのレポータＲＮＡ、またはこれらの組み合わせを含有している、請求項４２に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が、配列番号１～３５、５８～１４６、または１４７のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する、請求項４３に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の少なくとも１つが、配列番号１～３５、５８～１４６、または１４７の配列の１つを含む、請求項４３に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記サンプルカートリッジが、配列番号３６～４８のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を有する少なくとも１つのＣａｓ１３タンパク質を含む、請求項４３に記載の蛍光イメージングシステム。
- 少なくとも１つのＣａｓ１３タンパク質が、配列番号４３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、該Ｃａｓ１３タンパク質が４３６位にリジンを有する、請求項４６に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記カートリッジソケットが、前記サンプルカートリッジのカートリッジ形状に相補的なソケット形状を有し、該カートリッジ形状と該相補的なソケット形状との結合が、前記１つまたは複数のカートリッジチャンバを前記励起方向および前記観察方向にする、請求項４２に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記１つまたは複数のカートリッジチャンバがそれぞれ、細長い形状を有し、前記励起方向では、該１つまたは複数のカートリッジチャンバの該細長い形状が、前記励起照明の構成ベクトルと整列している、請求項４２に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記サンプルカートリッジが、前記カートリッジチャンバを囲んでいるチャンバ壁を含み、
前記励起方向では、前記励起照明と整列している該カートリッジチャンバが、該チャンバ壁と整列している該励起照明を含む、
請求項４２に記載の蛍光イメージングシステム。 - 前記励起方向では、前記励起照明と整列している前記カートリッジチャンバが、該励起照明と平行の該カートリッジチャンバを含む、請求項４２に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記観察方向では、前記サンプルカートリッジから散乱した照明が前記光学センサーと整列していない、請求項４２に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記光学センサーを含む、請求項４２に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記光学センサーを有する可動装置を含む、請求項５３に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記サンプルカートリッジと前記光学センサーとの間に挟まれた、およそ５００～５７０ナノメートルの間の波長を有する光を透過させるように構成された発光フィルターを含む、請求項４２に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記サンプルカートリッジに近接し、前記光学センサーからは離れている、１つまたは複数の構成対物レンズを有する対物光学系、および
該光学センサーに近接し、該サンプルカートリッジからは離れている、１つまたは複数の構成イメージングレンズを有する、イメージング光学系
を含む、請求項４２に記載の蛍光イメージングシステム。 - 前記励起方向では、前記対物光学系が、前記カートリッジチャンバを前記励起照明でテレセントリックに照明するように構成されている、請求項５６に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記観察方向では、前記対物光学系および前記イメージング光学系が、前記蛍光を前記光学センサーにテレセントリックに向けるように構成されている、請求項５６に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記イメージング光学系と前記光学センサーとの間に挟まれた発光フィルターを含み、
前記観察方向では、該イメージング光学系が、前記蛍光を該発光フィルターにテレセントリックに向けるように構成されている、
請求項５６に記載の蛍光イメージングシステム。 - 前記対物光学系と前記イメージング光学系との間に挟まれた２色性ミラーを含み、２色性フィルターが、前記励起照明を前記カートリッジチャンバに向け、該カートリッジチャンバからの前記蛍光を前記光学センサーに向かって透過させるように構成されている、請求項５６に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記対物光学系およびイメージング光学系が、およそ０．０７５～０．１０の開口数（ＮＡ）、およそ１０ｍｍ～２０ｍｍ直径の視野（ＦＯＶ）、およびおよそ７０ｍｍ～８０ｍｍの光路長をもたらす、請求項５６に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記対物光学系およびイメージング光学系が、０．０９の開口数（ＮＡ）、１２ｍｍ直径の視野（ＦＯＶ）、および７５ｍｍの光路長をもたらす、請求項６１に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記１つまたは複数のカートリッジチャンバの各々が、前記ＦＯＶ内にある、請求項６２に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記光学センサーと前記サンプルカートリッジとの間に挟まれた、１つまたは複数の構成イメージングレンズを有するイメージング光学系を含む、請求項４２に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記イメージング光学系が、０．０６の開口数（ＮＡ）、１５×１５ｍｍの視野（ＦＯＶ）、および２０ｍＷの励起照明力をもたらす、請求項６４に記載の蛍光イメージングシステム。
- 可動装置光学系および前記光学センサーを有する可動装置を含み、前記イメージング光学系が該可動装置光学系を含む、請求項６４に記載の蛍光イメージングシステム。
- 前記励起源が、ＬＥＤジェネレータまたはレーザジェネレータの１つまたは複数を含む、請求項４２に記載の蛍光イメージングシステム。
- 配列番号１～３５、５８～１４６、または１４７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含む組成物。
- 配列番号１～３５、５８～１４６、または１４７のいずれか１つを含む１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含む、請求項６８に記載の組成物。
- 少なくとも１つのＣａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ｂタンパク質をさらに含む、請求項６８に記載の組成物。
- 前記Ｃａｓ１３タンパク質の少なくとも１つが、配列番号３６～４８のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を有する、請求項７０に記載の組成物。
- 前記Ｃａｓ１３タンパク質の少なくとも１つが、配列番号４３を含むタンパク質配列を有し、該Ｃａｓ１３タンパク質が４３６位にリジンを有する、請求項７０に記載の組成物。
- 対応する未改変のＣａｓ１３タンパク質と比較してインビボでのエンドヌクレアーゼ活性が増大しており、野生型Ｃａｓ１３タンパク質の４３６位に対応する位置にリジン（Ｋ）を有する、改変Ｃａｓ１３タンパク質。
- 前記野生型Ｃａｓ１３タンパク質が、４３６位にグルタミン酸（Ｅ）を有する、請求項７３に記載の改変Ｃａｓ１３タンパク質。
- （ａ）前記改変Ｃａｓ１３タンパク質、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および少なくとも１つのレポータＲＮＡと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを含有することが疑われるサンプルとを、少なくとも１つのＲＮＡ切断産物が形成されるために十分な時間にわたりインキュベートする工程、ならびに
（ｂ）レポータＲＮＡ切断産物をディテクターで検出する工程
を含む方法において、前記少なくとも１つのレポータＲＮＡを検出する感度を約１０倍～１００倍増大させ得る、請求項７３に記載の改変Ｃａｓ１３タンパク質。 - 前記改変Ｃａｓ１３タンパク質が、配列番号４３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、４３６位にリジンを有する、請求項７３に記載の改変Ｃａｓ１３タンパク質。
- 前記改変Ｃａｓ１３タンパク質が、配列番号４３の配列を有する、請求項７３に記載の改変Ｃａｓ１３タンパク質。
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