CN114807316B

CN114807316B - 一种无核酸扩增可视化的rna定量检测方法

Info

Publication number: CN114807316B
Application number: CN202210239301.4A
Authority: CN
Inventors: 王辉; 李正平; 王洪红
Original assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Current assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Priority date: 2022-03-11
Filing date: 2022-03-11
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2042-03-11
Also published as: CN114807316A

Abstract

本发明提供了一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法，包括：S1：设计制备RNA交联的DNA水凝胶；S2：制备自驱动DNA水凝胶传感器；S3：设计合成的特异性的crRNA；S4：将crRNA、Cas13a蛋白和靶标RNA共同孵育含有已知浓度的靶标RNA分子样品溶液；S5：将自驱动DNA水凝胶传感器水平浸入含有已知浓度的靶标RNA分子样品溶液；S6：通过S5中样品溶液在毛细管中的移动距离，构建靶标RNA分子浓度与移动距离之间的线性对应关系；S7：进行可视化检测及定量分析，本发明利用溶液在毛细管中的距离便可实现无需核酸扩增，可视化的RNA定量检测，为RNA为靶标的分子诊断、疾病检测提供新工具。

Description

一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法

【技术领域】

本发明涉及分子诊断与生化分析方法研究领域，尤其涉及一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法。

【背景技术】

RNA分子作为重要的遗传信息载体，由于它们在众多生物过程中的重要作用，从基础生物化学研究到临床诊断的各个领域，RNA分子的特异性和灵敏检测变得越来越重要。例如，基于新型冠状病毒（SRAS-CoV-2）RNA的核酸检测，作为新型冠状病毒病(COVID-19)诊断的金标准，在COVID-19大流行的预防和控制中发挥着至关重要的作用。

目前RNA检测方法主要分为直接检测和基于核酸扩增的检测。RNA直接检测的主要包括Northern印迹，荧光原位杂交（FISH），DNA微阵列等，这些方法在具有高特异性，但这些方法通常存在繁琐且耗时的实验程序且灵敏度不高。基于核酸扩增的RNA检测方法，包括逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）以及多种等温核酸扩增技术。然而，这些方法通常需要逆转录/连接步骤以将RNA转化为DNA，以及随后的DNA复制步骤以产生可检测的核酸水平。但扩增步骤往往会引入一些比较棘手的问题，例如由于逆转录不完全导致的目标 RNA分子丢失、易错序列复制导致的扩增偏差以及污染导致的假阳性结果。此外，需要精心设计多个靶标特异性探针/引物，严格优化实验条件。

因此，有必要研究一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法来应对现有技术的不足，以解决或减轻上述一个或多个问题。

【发明内容】

鉴于此，本发明提供了一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法，利用溶液在毛细管中的移动距离便可以实现无需核酸扩增，可视化的RNA定量检测，为RNA为靶标的分子诊断、疾病检测提供新工具。

一方面，本发明提供一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法，所述RNA定量检测方法包括：

S1：设计制备CRISPR-Cas13系统响应RNA交联的DNA水凝胶；

S2：将S1制备的DNA水凝胶固定在毛细管末端形成超薄DNA水凝胶薄膜，由超薄DNA水凝胶薄膜与毛细管共同组成自驱动DNA水凝胶传感器；

S3：设计合成与靶标RNA分子特异性的crRNA；

S4：将crRNA、Cas13a蛋白和靶标RNA在适当缓冲溶液中共同孵育后，获得含有已知浓度的靶标RNA分子样品溶液；

S5：将自驱动DNA水凝胶传感器水平浸入含有已知浓度的靶标RNA分子溶液；

S6：通过S5中溶液在毛细管中的移动距离，构建靶标RNA分子浓度与移动距离之间的线性对应关系；

S7：将自驱动DNA水凝胶传感器水平浸入含有靶标RNA分子待测样品溶液，根据S6中线性对应关系对待测样品中靶标RNA分子溶液进行可视化检测及定量分析。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述S1具体包括：

S11：设计合成两条acrydite修饰的DNA链，A-DNA-X和A-DNA-Y；

S12：设计合成双重功能的交联单链RNA，DRCL-ssRNA；

S13：将A-DNA-X和A-DNA-Y分别与丙烯酰胺单体共聚，分别形成直链聚丙烯酰胺-DNA PA-X和PA-Y；

S14：DRCL-ssRNA包含三个序列区域，3'-和5'-末端的两个序列分别与DNA-X和DNA-Y互补配对，在室温下形成具有三维多孔结构的DNA水凝胶。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述S14中DNA水凝胶的中间序列为CRISPR-Cas13系统响应序列，即CRISPR-Cas13系统反式切割反应的底物序列。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述S5具体为：将S4所制备的自驱动DNA水凝胶传感器水平浸入含有已知浓度的靶标RNA分子样品溶液，在毛细作用下，含有靶标RNA分子的溶液通过DNA水凝胶薄膜进入毛细管。

如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述S6毛细管中的移动距离具体为：靶标RNA分子激活CRISPR/Cas13系统的附属酶切活性，使毛细管末端的DNA水凝胶薄膜的通透性增加，靶标RNA分子的浓度越大，溶液在毛细管中移动距离越大，且靶标RNA分子浓度与溶液在毛细管中移动距离成线性关系。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1、本发明无需核酸扩增步骤和昂贵的仪器设备，只需要将末端固定水凝胶薄膜的毛细管浸入含有靶标分子的样品溶液，通过溶液在毛细管中的距离实现对RNA分子定量分析，设计简单，检测方便，分析成本低；

2、本发明检测方式和信号输出模式非常适用于临床快检及家庭化的诊断分析及检测；

3、本发明不仅限于实施例所陈述SARS-CoV-2 RNA的定量检测，可以推广至任何一种RNA分子的定量分析。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

【附图说明】

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明所述CRISPR-Cas13系统响应RNA交联DNA水凝胶示意图；

图2是本发明所述CRISPR-Cas13系统响应的自驱动DNA水凝胶传感器制备示意图；

图3是本发明无核酸扩增可视化RNA定量检测原理示意图；

图4是本发明不同浓度SARS-CoV-2 N基因RNA检测结果；

图5是本发明不同浓度SARS-CoV-2 N基因RNA定量检测效果；

图6是本发明具体实施方案中该方法特异性研究图；

图7是本发明具体实施方式中实际样本中SRAS-CoV-2检测结果图。

【具体实施方式】

为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明实施例进行详细描述。

应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本发明提供一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法，所述RNA定量检测方法包括：

S1：设计制备CRISPR-Cas13系统响应RNA交联的DNA水凝胶；

S3：设计合成与靶标RNA分子特异性的crRNA；

S5：将自驱动DNA水凝胶传感器水平浸入含有已知浓度的靶标RNA分子样品溶液；

S7：将自驱动DNA水凝胶传感器水平浸入含有靶标RNA分子的待测样品溶液，根据S6中线性对应关系对待测样品中靶标RNA分子溶液进行可视化检测及定量分析。

所述S1具体包括：

S11：设计合成两条acrydite修饰的DNA链，A-DNA-X和A-DNA-Y；

S12：设计合成双重功能的交联单链RNA，DRCL-ssRNA；

所述S14中DNA水凝胶的中间序列为CRISPR-Cas13系统响应序列，即CRISPR-Cas13系统反式切割反应的底物序列。

所述S5具体为：将S4所制备的自驱动DNA水凝胶传感器水平浸入含有已知浓度的靶标RNA分子样品溶液，在毛细作用下，含有靶标RNA分子的溶液通过DNA水凝胶薄膜进入毛细管。

所述S6毛细管中的移动距离具体为：靶标RNA分子激活CRISPR/Cas13系统的附属酶切活性，使毛细管末端的DNA水凝胶薄膜的通透性增加，靶标RNA分子的浓度越大，溶液在毛细管中移动距离越大，且靶标RNA分子浓度与溶液在毛细管中移动距离成线性关系。

本发明提供一种高灵敏度、高特异性、无需核酸扩增步骤、无昂贵光学仪器、可视化的RNA定量检测方法并将该方法成功应用于SARS-CoV-2 RNA的可视化定量分析。

实现本发明技术方案由以下步骤组成：

步骤1、设计制备CRISPR-Cas13a响应RNA交联的DNA水凝胶；

步骤2、利用毛细作用和DNA水凝胶热可逆性，将步骤1所制备的DNA水凝胶薄膜固定在毛细管末端，制备得到CRISPR-Cas13a响应的自驱动DNA水凝胶传感器（简称Cas13a-RCSAS）；

步骤3、设计合成与SARS-CoV-2 RNA特异性的crRNA；

步骤4、将步骤2所制备的Cas13a-RCSAS插入含有SARS-CoV-2 RNA、crRNA和Cas13a蛋白样品溶液，在适当温度孕育一定时间后，通过样品溶液在毛细管中移动距离可以实现的SARS-CoV-2 RNA分子的可视化检测及定量分析。

本发明的基本原理及具体步骤如下：

步骤1：设计制备CRISPR-Cas13a响应RNA交联DNA水凝胶

如图1所示，首先设计合成两条acrydite修饰的DNA链（A-DNA-X：和A-DNA-Y）和双重功能的交联单链RNA（DRCL-ssRNA）。A-DNA-X和A-DNA-Y可以与丙烯酰胺单体共聚，分别形成直链聚丙烯酰胺-DNA PA-X和PA-Y。DRCL-ssRNA包含三个序列区域，3'-和5'-末端的两个序列分别与DNA-X和DNA-Y互补配对，可在室温下形成具有三维多孔结构的DNA水凝胶；中间序列为富含U的单链RNA序列，该序列是CRISPR-Cas13a系统响应序列，即CRISPR-Cas13a系统反式切割反应的底物序列。

上述A-DNA-X的碱基序列为5′-TTATTCTTGTCTCCCGAG AT-3′，其中5′-端修饰acrydite；A-DNA-Y的碱基序列为5′-TCACAGAT GGTATCTTATT-3′，其3′-端修饰acrydite；DRCL-ssRNA的碱基序列为5′-rGrArUrArCrUrCrArUrCrUrGrUrGrArUrUrUrUrUrUrArUrCrUrCrGrGrGrArGrArCrArArG-3′。

上述制备CRISPR-Cas13a响应RNA交联DNA水凝胶具体方法如下：

S1：在两个1.5-mL DNA低吸附的离心管中，将100μL 500 μM A-DNA-X和 500 μMA-DNA-Y分别与20 μL 25% (wt/vol)丙烯酰胺和78 μL无核酸酶的水混合；

S2：短暂涡旋并离心后，将两个离心管开盖置于真空干燥器中，在室温下脱气10分钟；

S3：将1.0 μL新鲜制备的20% (wt/vol) APS和1.0 μL 20% (vol/vol)TEMED分别添加到两个离心管中；

S4：短暂涡旋并离心后，立即将离心管置于真空干燥器中，在室温下保持15分钟，以聚合线性链聚丙烯酰胺-DNA，即PA-X和PA-Y）；

S5：用100K NMWL Amicon Ultra-0.5离心过滤装置(Millipore)去除未聚合的DNA-X、DNA-Y和丙烯酰胺单体。

S6：最终，PA-X和PA-Y分别在100 μL无核酸酶的水中回收，其中DNA X和DNA Y的浓度为500 μM；

S7：将10 μL 500 μM PA-X、10 μL 500 μM PA-Y、4 μL 10× NEBbuffer 2.1、4 μL500 μM DRCL-ssRNA（该实施例中最优选量）、0.8 μL RRI和11.2 μL无核酸酶水混合；

S8：在65°C下用移液器的尖端轻轻混合混合物以保证水凝胶的均匀，随后让其自然冷却至室温便可制备得CRISPR-Cas13a响应RNA交联DNA水凝胶。

步骤2：Cas13a-RCSAS制备

基于水凝胶的热可逆性和毛细作用，可以简便快速制备Cas13a-RCSAS。如图2所示，将CRISPR-Cas13a响应RNA交联的DNA水凝胶加热至略低于DNA X和DNA Y的解链温度(Tm)，此时DNA水凝胶变成具有低流动性的溶液状态。当毛细管垂直插入加热的凝胶溶液中时，凝胶溶液可以通过毛细作用注入毛细管中。适当时间后，取出毛细管后，在室温下在毛细管末端形成CRISPR-Cas13a响应RNA交联的DNA水凝胶薄膜，薄膜厚度可以通过毛细管插入凝胶溶液的时间控制。随后，将毛细管固定在有刻度的基板上，获得Cas13a-RCSAS。

Cas13a-RCSAS制备具体步骤如下：

S9：首先对毛细管表面进行羟基化处理，将玻璃毛细管置入食人鱼溶液（7:3(vol/vol) 98% H₂SO₄和30% H₂O₂的混溶液），在90°C下保持2小时；随后将毛细管在乙醇中超声处理10分钟；Milli-Q水冲洗3次并用氮气吹干。

S10：在离心管中，将S8所制备的DNA水凝胶用水浴加热至58°C（该实施例中最优选温度），使DNA水凝胶变成粘度高、流动性小的凝胶溶液；

S11：将S9羟基化处理的毛细管垂直插入S10的凝胶溶液中，通过毛细作用将凝胶溶液吸入毛细管末端；三秒后（该实施例中最优选时间），取出毛细管，吸入毛细管末端的凝胶溶液在室温下在毛细管末端形成DNA水凝胶膜；

S12：将S11末端固定DNA水凝胶薄膜的毛细管固定在带有刻度的基底上制得Cas13a-RCSAS。

步骤3：利用Cas13a-RCSAS检测靶标RNA

如图3所示，将SRAS-CoV-2 N基因特异性的crRNA、含有SRAS-CoV-2 N基因RNA的样品（阴性对照用水作为样品）和Cas13a蛋白在适当缓冲溶液中共同孵育后，将Cas13a-RCSAS插入上述溶液中，由于毛细作用溶液会通过水凝胶薄膜缓慢进入毛细管中，被靶标分子激活的CRISPR-Cas13a系统会剪切水凝胶薄膜中富含U的单链RNA，使水凝胶结构破坏，水凝胶的通透性增加，溶液更容易进入毛细管中，不同浓度的靶标RNA分子会引起不同的通透性变化，从而使溶液在毛细管中进入的距离不同，这样通过肉眼就可以对靶标RNA分子进行识别和定量分析。

步骤4. SARS-CoV-2 N基因RNA分析

为了更好说明Cas13a-RCSAS可视化RNA定量检测原理及论证本发明的可行性和应用价值，利用本发明所述方法对SRAS-CoV-2 N基因RNA进行定量检测。

实施例1：

S1：通过体外转录方法制备SRAS-CoV-2 N基因RNA（SARS-CoV-2-N-RNA），具体步骤如下；

（1）通过PCR扩增从DNA质粒（pUC57-2019-nCov-N，金斯瑞公司）获得体外T7转录DNA模板：

50 μL PCR反应混合物包含 100 ng DNA质粒、1×PCR反应缓冲液、250 μM dNTPs（每种250 μM）、500 nM T7启动子标记的正向引物（T7-FP-SRAS-CoV-2，序列为5′-TAATACGACT CACTATAGGATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCA-3′，上海生工)、500 nM反向引物（RP-SRAS-CoV-2，序列为5′-TTAGGCCTG AGTTGAGTCAGC-3′，上海生工）、5 U TaKaRa Taq HSDNA聚合酶（Sigma）进行PCR扩增。PCR循环包括热启动步骤（95°C 4分钟），热循环过程（40个循环：95°C 20秒；62°C 30秒；72°C 1 分钟），最终延伸（72°5 分钟）。PCR产物用4%琼脂糖凝胶电泳确认后用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（上海生工）纯化获得T7转录DNA模板。

（2）通过T7转录反应制备SARS-CoV-2 N基因RNA：将含有2 μg T7转录DNA 模板、1× T7 RNAPol 反应缓冲液（NEB）、5 mM NTP 和250 U T7 RNA聚合酶（NEB）的转录反应混合物（50 μL）在37 °C下等温孵育5 h。然后将转录产物用DNase I在37°C下处理 1 h，去除T7转录DNA 模板。在通过4%琼脂糖凝胶电泳确认产物后，使用Spin Column RNAclean试剂盒（TIANGEN）纯化转录产物。最后，用Nanodrop One UV-Vis分光光度计定量SARS-CoV-2-N-RNA的浓度，并利用转录物长度和浓度进一步计算拷贝数。

S2：设计合成SARS-CoV-2 N基因RNA特异性的crRNA；

为了构建SARS-CoV-2 N基因RNA激活的CRISPR/Cas13a系统，设计了两条N基因特异性crRNA，分别为US-CDC-N2-crRNA（序列为5′-rGrArUrUrUrArGrArCrUrArCrCrCrCrArArArArArCrGrArArGrG rGrGrArCrUrArArArArCrCrCrGrArArGrArArCrGrCrUrGrArArGrCrGrCrUrGrGrGrGrGrCrArA-3′，由金斯瑞合成）和China-CDC-N-crRNA（序列为5′-rGrArUrUrUrArGrArCrUrArCrCrCrCrArArArArArCrG rArArGrGrGrGrArCrUrArArArArCCAAUCUGUCAAGCAGCAGCAAAGCAAGA-3′，由上海生工合成）靶向SARS-CoV-2的N基因，分别覆盖美国疾病预防控制中心（US-CDC）和中国疾病预防控制中心（China-CDC）公布的SARS-CoV-2 N基因RT-PCR检测的报告探针序列。

S3：SARS-CoV-2-N-RNA检测，具体步骤如下：

IVT SARS-CoV-2-N-RNA检测步骤包括Cas13a/crRNA-靶标RNA组装反应和基于Cas13a-RCSAS的RNA检测。首先，10 μL Cas13a/crRNA-靶标RNA组装混合物（样品溶液），包括1 μM Cas13a蛋白、250 nMUS-CDC-N2-crRNA、250 nM China CDC-N-crRNA、8 U RRI、1×NEBbuffer 2.1和不同量的IVT SARS-CoV-2-N-RNA。将样品溶液在37 ℃孵育5 min后，将Cas13a-RCSAS插入样品溶液中，在37 ℃孵育。然后，45分钟后用肉眼观察毛细管中样品溶液的流过距离或用手机拍照记录。

检测结果如图4所示，随着SARS-CoV-2-N-RNA的浓度从0上升到100 fM（~6.0 ×10⁴ 拷贝/μL，样品溶液在毛细管中流经距离逐渐增加，低至100 aM（~60 拷贝/μL）靶标RNA分子所产生距离可以清楚地与阴性对照区分，表明Cas13a-RCSAS可以通过肉眼可视化检测亚fM浓度的靶标RNA分子。

RNA可视化的定量检测结果如图5所示，样品溶液在毛细管中流经距离(D)与SARS-CoV-2-N-RNA的浓度的负对数量在100 aM至100 fM范围内呈现良好的线性关系，其相关方程为D = 38.75 +2.35lgC _RNA，相关系数为0.9960，说明Cas13a-RCSAS能够无需核酸扩增和特殊设备即可实现可视化的RNA定量检测。

为了进一步验证Cas13a-RCSAS对RNA检测的特异性，利用SARS-CoV-2-N-RNA特异性的crRNA，用Cas13a-RCSAS对多种冠状病毒（包括bat-SL-COVZC45，SRAS-CoV和Human-COV-HKU1）N基因RNA进行检测，结果如图6所示，只有SARS-CoV-2-N-RNA产生明显的响应信号，而其它冠状病毒RNA产生信号和空白对照相同，表明Cas13a-RCSAS在靶标RNA分子的检测上具有高的特异性。

上呼吸道标本，例如鼻咽(NP)拭子通常用于诊断COVID-19。为了评估Cas13a-RCSAS的实用性和可靠性，将SARS-CoV-2-abMEN假病毒（生工生物）加入NP拭子样本溶液中，以模拟一系列SARS-CoV-2阳性NP拭子样本（10³-10⁵拷贝/μL SARS-CoV-2- abMEN假病毒颗粒）。利用标准病毒RNA提取试剂盒（EZ-10 Spin Column Viral Total RNA ExtractionKit，生工生物）病毒RNA提取后，用Cas13a-RCSAS检测这些模拟阳性NP拭子样本（阳性NP1-NP3）和阴性NP拭子样本（阴性NP1-NP3）中的SRAS-CoV-2。如图7所示，与阴性NP样品和空白对照相比，含有10³-10⁵拷贝/μL的SARS-CoV-2-abMEN假病毒颗粒阳性样本的溶液在45分钟后产生明显的移动距离。

根据图5中获得的相关方程和提取步骤中的稀释因子，评估了模拟阳性NP拭子样本中SARS-CoV-2-abMEN假病毒的拷贝数。结果如表1所示，这些阳性样本的所有计算副本约为加标样本的54.6%-76.9%，表明在提取过程中可能会丢失部分RNA分子。为了验证这些结果，模拟的SARS-CoV-2阳性NP样本通过CDC报道的RT-PCR方法进行检测，证实Cas13a-RCSAS和RT-PCR检测结果基本一致。充分证实了Cas13a-RCSAS在临床样本检测方面的实用性和可靠性。

表1 Cas13a-RCSAS和RT-PCR检测模拟NP样本中SARS-CoV-2

Spiked in NPs	Cas13a-RCSAS	RT-PCR
			1000 copies/μL	664 ± 59 copies/μL	451 ± 46 copies/μL
10,000 copies/μL	7,690 ± 561 copies/μL	7,291 ± 698 copies/μL
			100,000 copies/μL	54,581 ± 2,809 copies/μL	52,901 ± 4,975 copies/μL

本发明首先设计CRISPR-Cas13a响应RNA交联的DNA水凝胶，利用水凝胶的热可逆性和毛细作用，将超薄DNA水凝胶薄膜固定在毛细管末端制备CRISPR-Cas13a响应的自驱动DNA水凝胶传感器；将传感器水平浸入含有靶标RNA分子的溶液时，在毛细作用下，样品溶液通过DNA水凝胶薄膜进入毛细管；靶标特异性的crRNA引导Cas131蛋白特异性识别靶标RNA分子并激活CRISPR-Cas13a系统的反式切割活性，激活的CRISPR-Cas13a系统能够高效、快速的剪切毛细管中DNA水凝胶薄膜的交联桥RNA，使水凝胶薄膜的通透性增加，不同浓度的靶标RNA分子会引起不同程度通透性的改变，进而使一定时间内溶液在毛细管中进入的距离不同，利用溶液在毛细管中的距离便可以对靶标RNA分子进行定量检测。本发明可以实现无需核酸扩增、可视化的RNA定量检测，本发明将为RNA为靶标的分子诊断、疾病检测提供新工具。

以上对本申请实施例所提供的一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法，进行了详细介绍。以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

如在说明书及权利要求书当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求书并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求书当中所提及的“包含”、“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含/包括但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求书所界定者为准。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。

应当理解，本文中使用的术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求书的保护范围内。

Claims

1.一种无核酸扩增可视化的RNA定量检测方法，所述RNA定量检测方法用于非疾病诊断治疗方法，其特征在于，所述RNA定量检测方法包括：

S1：设计制备CRISPR-Cas13系统响应的RNA交联DNA水凝胶；

S2：将S1制备的DNA水凝胶固定在毛细管末端形成DNA水凝胶薄膜，由DNA水凝胶薄膜与毛细管共同组成自驱动DNA水凝胶传感器；

S3：设计合成靶标RNA特异性的crRNA；

S4：将crRNA、Cas13蛋白和已知浓度靶标RNA在缓冲溶液中共同孵育后，获得含有已知浓度的靶标RNA分子样品溶液；

S7：将crRNA、Cas13蛋白和未知浓度靶标RNA在缓冲溶液中共同孵育后，获得未知浓度的含有靶标RNA分子的待测样品溶液，将自驱动DNA水凝胶传感器水平浸入含有靶标RNA分子的待测样品溶液，根据S6中线性对应关系对待测样品中靶标RNA分子进行可视化检测及定量分析；

所述S1具体包括：

S11：设计合成两条acrydite修饰的DNA链，A-DNA-X和A-DNA-Y；

S12：设计合成双重功能的交联单链RNA，DRCL-ssRNA；

S13：将A-DNA-X和A-DNA-Y分别与丙烯酰胺单体共聚，分别形成两条直链聚丙烯酰胺-DNA，PA-X和PA-Y；

S14：DRCL-ssRNA包含三个序列区域，其中，3'-和5'-末端的两个序列分别与DNA-X和DNA-Y互补配对，在室温下形成具有三维多孔结构的DNA水凝胶；

所述S14中DNA水凝胶的中间序列为CRISPR-Cas13系统响应序列，即CRISPR-Cas13系统反式切割反应的底物序列；

所述S6中毛细管中的移动距离具体为：靶标RNA分子激活CRISPR/Cas13系统的附属酶切活性，使毛细管末端的DNA水凝胶薄膜的通透性增加，靶标RNA分子的浓度越大，溶液在毛细管中移动距离越大，且靶标RNA分子浓度与溶液在毛细管中移动距离成线性关系。

2.根据权利要求1所述的RNA定量检测方法，其特征在于，所述S5具体为：将S4中所制备的自驱动DNA水凝胶传感器水平浸入含有已知浓度的靶标RNA分子样品溶液，在毛细作用下，含有靶标RNA分子的溶液通过DNA水凝胶薄膜进入毛细管。