CN111286503B - 一种适配体及其在检测pdgf-bb试剂盒中的应用 - Google Patents

一种适配体及其在检测pdgf-bb试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适配体及其在检测PDGF‑BB试剂盒中的应用。本发明通过设计一个基于适配体发卡的指数扩增模板，实现均相溶液中PDGF‑BB蛋白的快速灵敏检测，其反应速度快、特异性好、线性范围宽、准确度高，检测限可达4.9fM，可用于微量PDGF蛋白的的检测。

Description

一种适配体及其在检测PDGF-BB试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种基于适配体的恒温指数扩增技术实现均相溶液中快速灵敏检测PDGF-BB蛋白质的方法。
背景技术
血小板生长因子(PDGF)是一种在人血小板中的生长因子蛋白，在已公开的研究中，PDGF一般有多个亚型，如PDGF-AB、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC等。在这些亚型中，PDGF-BB被证实在癌症中过表达，被认为是一种有效的疾病诊断标志物，因此，PDGF-BB的高灵敏检测具有重要意义。
酶联免疫(ELISA)是传统的PDGF-BB检测方法，然而其操作复杂，需要繁琐冗杂的多次清洗，导致试验时间很长，同时该方法依赖于PDGF-BB抗体，受到抗体本身存在的易失活、保存困难和成本高等问题的限制。近年来，核酸适配体替代抗体作为一种识别手段已被广泛用于蛋白质传感器的构建。核酸适配体是一种采用体外指数富集配体技术筛选得到的寡核苷酸片段，它对小分子、蛋白质、细胞等具有特异性结合的能力，与传统抗体相比，具有高选择性、稳定性高和适用性强等优势。以核酸适配体为基础的PDGF-BB检测方法已在荧光、电化学、化学发光和比色等检测平台上得以建立。其中，基于荧光的方法具有仪器简单、操作简单和响应迅速的优点受到广泛的应用。然而，传统基于适配体的测定PDGF-BB的荧光检测方法存在灵敏度有限的问题。
恒温指数扩增反应(Exponential Amplification Reaction，EXPAR)技术近年来备受关注。该技术基于3′端与5′端序列完全相同，且均与引物序列互补的线性模板，在DNA聚合酶和特殊的切口酶(nicking enzyme)共同作用下，可以在恒温条件下对短链核酸(10～25碱基)进行高效、快速的扩增，一般在几分钟内可对目标核酸放大106～109倍，将恒温指数扩增技术与核酸适配体有机结合可有效实现均相溶液中蛋白质的快速灵敏检测。
近年来，研究者建立了多种基于适配体的核酸信号扩增方法，证实了核酸恒温扩增在PDGF-BB检测中极强的信号扩增能力。然而这些方法大都是非均相检测，需要多次洗涤分离或设计多条核酸探针通过分步操作达到灵敏检测的目的，方法耗时长且灵活度低，限制了其应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于适配体的恒温指数扩增技术实现均相溶液中快速灵敏检测PDGF-BB蛋白质的方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种识别PDGF-BB蛋白的适配体，其碱基序列为：
5’-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’(SEQ ID NO.1)。
本发明的第二个方面，提供：
一种包括上述适配体的扩增模板，其还包括引物识别序列、扩增序列和切口酶序列；
其中，上述扩增模板为发卡结构；
上述引物识别序列与上述适配体序列部分互补。
在本发明实施例中，上述扩增序列数量为2个或以上，且核酸序列完全相同；上述切口酶序列数量为2个或以上。
在本发明实施例中，上述扩增模板的溶解温度>60℃。
在本发明实施例中，上述扩增模板序列选自以下核苷酸序列中任一条：
10nt:5’-TAGGTGAACGTGGAGCTGAGGGCTAGGTGAACGTGGCAGGATCATGCACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGGGG-P-3’(SEQ ID NO.2)；
11nt:5’-TAGGTGAACGTGGAGCTGAGGGCTAGGTGAACGTGGCAGGATCATGGACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGGGG-P-3’(SEQ ID NO.3)；
12nt:5’-TAGGTGAACGTGGAGCTGAGGGCTAGGTGAACGTGGCAGGATCATGGTCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGGGG-P-3’(SEQ ID NO.4)；
13nt:5’-TAGGTGAACGTGGAGCTGAGGGCTAGGTGAACGTGGCAGGATCATGGTGCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGGGG-P-3’(SEQ ID NO.5)；
14nt:5’-TAGGTGAACGTGGAGCTGAGGGCTAGGTGAACGTGGCAGGATCATGGTGACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGGGG-P-3’(SEQ ID NO.6)；
其中，优选为：
12nt:5’-TAGGTGAACGTGGAGCTGAGGGCTAGGTGAACGTGGCAGGATCATGGTCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGGGG-P-3’(SEQ ID NO.4)。
本发明的第三个方面，提供：
一种定性检测PDGF-BB表达的试剂，包括上述的扩增模板、酶、引物探针。
在本发明实施例中，上述酶包括切口酶和聚合酶；
其中，上述聚合酶可与上述引物探针核苷酸链的3'末端或与上述扩增序列互补片段的3'末端连接。
在本发明实施例中，上述切口酶优选为Nt.BbvCI限制性内切酶；上述聚合酶优选为Klenow Fragment聚合酶。
在本发明实施例中，上述Nt.BbvCI限制性内切酶含量为0.05～0.2U/μL；上述Klenow Fragment聚合酶含量为0.1～0.4U/μL；上述扩增模板含量为100～400nM。
上述Nt.BbvCI限制性内切酶含量优选为0.2U/μL；上述Klenow Fragment聚合酶含量优选为0.1U/μL；上述扩增模板含量优选为
本发明的第四个方面，提供：
上述检测PDGF-BB的试剂在制备诊断或辅助诊断癌症的试剂盒中的应用，所述诊断或辅助诊断包括：
1)通过所述检测PDGF-BB的试剂，测定来自受试者样品中是否存在PDGF-BB表达；
2)根据PDGF-BB的表达情况，确定所述受试者是否有患有癌症。
本发明的有益效果是：
1)本发明反应速度更快，反应时间在1h以内，相较酶联免疫缩短了检测的时间。
2)本发明设计的引物特异性好，可以很好的区别同类PDGF蛋白的各种亚型。
3)本发明的线性范围宽，检测限低至4.9fM，可用于微量目标蛋白的检测。
4)本发明的准确度高，拓展了其在市场的推广及未来的发展方向。
附图说明
图1为本发明基于适配体的恒温指数扩增检测PDGF-BB蛋白质技术原理图
图2为分别在正常加入PDGF-BB、缺少扩增模板、缺少primer探针、缺少PDGF-BB蛋白时的PCR扩增曲线图；
图3为不同颈部长度扩增模板溶解曲线(A)以及不同颈部长度模板反应POI变化折线图(B)；
图4为聚合酶含量对本发明扩增反应的影响；
图5为切口酶含量对本发明扩增反应的影响；
图6为不同模板量对本发明扩增反应的影响；
图7为不同PDGF-BB浓度对本发明扩增反应的影响(A)以及基于POI和不同PDGF-BB浓度对数的标准拟合曲线(B)；
图8为PDGF-BB和PDGF亚型的特异性评估比较。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
一、引物设计
经过对所设计的大量引物进行筛选后，本发明中所用的序列信息如下所示，指数扩增所用的聚合酶为Klenow Fragment，切口酶为Nt.BbvCI(核酸序列为5’-GCTGAGG-3’)。
识别PDGF-BB蛋白适配体序列：
5’-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’(SEQ ID NO.1)；
primer引物探针：
5’-ACCATGATCCTGCC-3’(SEQ ID NO.7)；
扩增模板链(10nt)：
5’-TAGGTGAACGTGGAGCTGAGGGCTAGGTGAACGTGGCAGGATCATGCACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGGGG-P-3’(SEQ ID NO.2)；
扩增模板链(11nt)：
5’-TAGGTGAACGTGGAGCTGAGGGCTAGGTGAACGTGGCAGGATCATGGACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGGGG-P-3’(SEQ ID NO.3)；
扩增模板链(12nt)：
5’-TAGGTGAACGTGGAGCTGAGGGCTAGGTGAACGTGGCAGGATCATGGTCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGGGG-P-3’(SEQ ID NO.4)；
扩增模板链(13nt)：
5’-TAGGTGAACGTGGAGCTGAGGGCTAGGTGAACGTGGCAGGATCATGGTGCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGGGG-P-3’(SEQ ID NO.5)；
扩增模板链(14nt)：
5’-TAGGTGAACGTGGAGCTGAGGGCTAGGTGAACGTGGCAGGATCATGGTGACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGGGG-P-3’(SEQ ID NO.6)。
这种扩增模板包括有适配体序列、引物识别序列、扩增序列和切口酶序列。
二、试验方法
1.基于扩增检测PDGF-BB现象的可行性探究
基于设计的方法原理，理论上完整的检测PDGF-BB的指数扩增方法是扩增模板(12nt)、1nM PDGF-BB、引物探针primer、聚合酶、切口等协同作用下进行的(如图1所示)。
如图2，通过分别考察同时存在上述试剂的情况下的扩增情况以及在分别缺少扩增模板、缺少primer探针、缺少PDGF-BB蛋白时的扩增情况，记录实时荧光定量PCR扩增曲线，过比较扩增曲线POI差值，发现仅在上述试剂同时存在时，POI值最小，说明设计的基于指数扩增检测PDGF-BB的原理具备可行性。
2.基于适配体发卡模板颈部长度设计和优化
设计系列颈部碱基长度不同的模板探针10nt～14nt，测定适配体发卡模板探针的溶解曲线如图3A所示。
所有发卡溶解温度均大于60℃，且随着颈部碱基对长度的增加，发卡模板溶解温度升高，表明随着发卡模板颈部碱基对长度的增加，发卡稳定性逐渐增强。
将不同的发卡模板分别用于测定PDGF-BB和空白试验的扩增情况，记录扩增曲线及空白实验实时荧光定量PCR扩增曲线，如图3B，通过考察扩增曲线及空白实验扩增曲线的POI差值，发卡模板颈部碱基长度为12nt时，扩增曲线和空白实验扩增曲线的POI差值最大，表明此时方法信噪比最大，因此选择颈部碱基长度为12nt的模板为实验最佳扩增模板。
三、测定PDGF-BB含量影响因素试验
1.测定条件优化
通过单因素轮换法对PDGF-BB测定条件进行优化，以颈部碱基对长度为12nt适配体发卡探针为扩增模板。
2.聚合酶量对测定PDGF-BB含量的影响
在冰上配制A和B两部分溶液，A溶液包含切Nt.BbvCI缓冲液、发卡扩增模板(12nt)、dNTP、RNase抑制剂、PDGF-BB；B溶液包含聚合酶缓冲溶液、100nM primer探针、0.1、0.2、0.3、0.4U/μL Klenow Fragment聚合酶、切口酶、SYBR Green I荧光染料。将A和B溶液混合，立即利用ABI 7500记录实时荧光定量PCR扩增曲线，求得POI值。如图4所示，当聚合酶含量为0.2U/μL时，PDGF-BB与空白的POI差值最大，背景值最小，故选择聚合酶为0.2U/μL作为此指数扩增反应的最佳条件。
3.切口酶量对测定PDGF-BB含量的影响
同上述方法，固定primer探针，PDGF-BB、发卡扩增模板(12nt)，Klenow Fragment用量，改变Nt.BbvCI切口酶用量为0.05、0.1、0.15、0.2U/μL，实时荧光定量PCR记录扩增曲线，考察扩增曲线及空白实验的POI差值。如图5所示，当Nt.BbvCI切口酶含量为0.1U/μL时，PDGF-BB与空白的POI差值最大，作为指数扩增切口酶的最佳用量。
4.模板量对测定PDGF-BB含量的影响
同上述方法，固定primer探针，PDGF-BB，Klenow Fragment，Nt.BbvCI用量，改变发卡扩增模板(12nt)用量为0.1、0.2、0.3、0.4μM，实时荧光定量PCR记录扩增曲线，考察扩增曲线及空白实验的POI差值。如图6所示，当发卡扩增模板(12nt)含量为0.2μM时，PDGF-BB与空白的POI差值最大，作为指数扩增模板最佳用量。
四、绘制标准曲线
根据最佳反应条件(选用颈部碱基对长度为12nt适配体、0.2U/μL KlenowFragment聚合酶、0.1U/μL Nt.BbvCI切口酶及0.2μM扩增模板量)，在冰上配制一系列不同PDGF-BB浓度的待测溶液。在37℃将A和B溶液混合后定容至20μL，立即利用ABI-7500记录实时荧光定量PCR扩增曲线(图7A)，获得POI值。绘制线性回归曲线(图7B)，PDGF-BB在10fM-10nM之间与POI呈线性关系，线性方程为：POI＝–194.8logAPDGF-BB–625.1(R2＝0.9882)。
五、特异性评估试验
根据最佳反应条件，在冰上配制一系列分别含1nM PDGF-BB、1nM PDGF亚型(PDGF-AB(AB)、PDGF-AA(AA)、PDGF-CC(CC))或1nM PDGF-BB和5nM PDGF-β-receptor(Rec)的混合溶液。在37℃将A和B溶液混合后定容至20μL，立即利用ABI-7500记录实时荧光定量PCR扩增曲线，获得POI值，根据标准曲线及POI值求出各PDGF蛋白序列对PDGF-BB检测的影响，用相对检测值(Relative detection)评估方法特异性，如图8所示，其他蛋白参与反应所测的浓度相对同浓度PDGF-BB蛋白的相对检测值在10％以下，表明方法具有高的检测特异性(图8)。
六、准确度评估试验
获取一定体积不同肺癌病人和正常人血清样品，根据上述最佳反应条件进行检测(选用颈部碱基对长度为12nt适配体、0.2U/μL Klenow Fragment聚合酶、0.1U/μLNt.BbvCI切口酶及0.2μM扩增模板量)，得到POI值。根据此POI值，在标准曲线上查出相应的的浓度。进一步用酶联免疫方法检测上述样品内PDGF-BB的含量。如表1所示，本方法检测和酶联免疫检测的数据均表明，PDGF-BB在病人血清中表达上升，同时两种方法的检测偏差在-9.1％至9.0％之间，表明方法准确度高，可作为血清样本中PDGF-BB蛋白表达水平检测的有效工具。
表1.检测血清样本中PDGF-BB含量(n＝3)
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学
<120> 一种适配体及其在检测PDGF-BB试剂盒中的应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caggctacgg cacgtagagc atcaccatga tcctg 35
<210> 2
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taggtgaacg tggagctgag ggctaggtga acgtggcagg atcatgcaca ggctacggca 60
cgtagagcat caccatgatc ctggggg 87
<210> 3
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taggtgaacg tggagctgag ggctaggtga acgtggcagg atcatggaca ggctacggca 60
cgtagagcat caccatgatc ctggggg 87
<210> 4
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
taggtgaacg tggagctgag ggctaggtga acgtggcagg atcatggtca ggctacggca 60
cgtagagcat caccatgatc ctggggg 87
<210> 5
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taggtgaacg tggagctgag ggctaggtga acgtggcagg atcatggtgc aggctacggc 60
acgtagagca tcaccatgat cctggggg 88
<210> 6
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
taggtgaacg tggagctgag ggctaggtga acgtggcagg atcatggtga caggctacgg 60
cacgtagagc atcaccatga tcctggggg 89
<210> 7
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
accatgatcc tgcc 14

Claims (2)

1.一种检测PDGF-BB的试剂，其特征在于，包括扩增模板、酶、引物探针；
所述扩增模板序列为：
12nt:5’-TAGGTGAACGTGGAGCTGAGGGCTAGGTGAACGTGGCAGGATCATGGTCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGGGG-P-3’；
所述引物探针序列为：5’-ACCATGATCCTGCC-3’；
所述酶包括切口酶和聚合酶；所述切口酶为Nt.BbvCI限制性内切酶；所述聚合酶为Klenow Fragment聚合酶；所述Nt.BbvCI限制性内切酶含量为0.05～0.2U/μL；所述KlenowFragment聚合酶含量为0.1～0.4U/μL；所述扩增模板含量为100～400nM。
2.权利要求1所述检测PDGF-BB的试剂在制备诊断或辅助诊断癌症的试剂盒中的应用，所述诊断或辅助诊断包括：
1)通过所述检测PDGF-BB的试剂，测定来自受试者样品中是否存在PDGF-BB表达；
2)根据PDGF-BB的表达情况，确定所述受试者是否有患有癌症。
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